抗アドヘシンに基づく受動免疫予防物
【課題】ＥＴＥＣ感染症に対する予防的保護を提供することのできる免疫グロブリンサプリメント、および抗アドヘシン免疫グロブリンを含む、ＥＴＥＣに対する受動予防処方物を製造する方法の提供。
【解決手段】エンテロトキシン生成大腸菌アドヘシン分子に対する初乳または乳免疫グロブリンからなる製薬組成物；並びに１つ以上のクラス５大腸菌采（ｆｉｍｂｒｉａｅ）アドヘシンまたはそのフラグメントからなる免疫原を牛乳生成家畜動物に投与する工程、該家畜動物から免疫グロブリン含有の初乳または乳を集める工程からなる該組成物の製造方法。
【解決手段】エンテロトキシン生成大腸菌アドヘシン分子に対する初乳または乳免疫グロブリンからなる製薬組成物；並びに１つ以上のクラス５大腸菌采（ｆｉｍｂｒｉａｅ）アドヘシンまたはそのフラグメントからなる免疫原を牛乳生成家畜動物に投与する工程、該家畜動物から免疫グロブリン含有の初乳または乳を集める工程からなる該組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロトキシン生成大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）により引き起こされる下痢に対して受動保護を付与するのに有用な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロトキシン生成大腸菌（ＥＴＥＣ）は、資源が限られた国々の乳幼児そしてまたこれらの地域への旅行者の下痢の主な原因である（非特許文献１および２）。ＥＴＥＣは、小腸の上皮細胞への付着並びに熱不安定性（ＬＴ）および／または熱安定性（ＳＴ）のエンテロトキシンの発現により病気を引き起こす（非特許文献３）。ＥＴＥＣは、典型的に、コロニー化ファクター（ＣＦ）として知られている繊維状の細菌の表面構造物をへて宿主細胞に付着する。２０を超える異なるＣＦが明らかになっており、それらに含まれるものは、疑う余地なく病理発生の原因とみなされている（非特許文献４）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｌａｃｋ， Ｒ． Ｅ． １９９０． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｒａｖｅｌｅｒｓ’ ｄｉａｒｒｈｅａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ． Ｒｅｖ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １２ （Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ７３−Ｓ７９．
【非特許文献２】Ｈｕｉｌａｎ， Ｓ．， Ｌ． Ｇ． Ｚｈｅｎ， Ｍ． Ｍ． Ｍａｔｈａｎ， Ｍ． Ｍ． Ｍａｔｈｅｗ， Ｊ． Ｏｌａｒｔｅ， Ｒ． Ｅｓｐｅｊｏ， Ｕ． Ｋｈｉｎ Ｍａｕｎｇ， Ｍ． Ａ．Ｇｈａｆｏｏｒ， Ｍ． Ａ． Ｋｈａｎ， Ｚ． Ｓａｍｉ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９１． Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ： ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｆｉｖｅ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ． Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ ６９：５４９−５５．
【非特許文献３】Ｎａｔａｒｏ， Ｊ． Ｐ．， ａｎｄ Ｊ． Ｂ． Ｋａｐｅｒ． １９９８． Ｄｉａｒｒｈｅａｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １１：１４２−２０１．
【非特許文献４】Ｇａａｓｔｒａ， Ｗ．， ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ． １９９６． Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （ＥＴＥＣ）． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：４４４−４５２．
【０００４】
コロニー化ファクター抗原Ｉ（ＣＦＡ／Ｉ）について、病原性の役割に関する明確な証拠が存在しており、最初のヒト特異的なＥＴＥＣ ＣＦとされる。ＣＦＡ／Ｉは、遺伝的そして生化学的な特徴をともにする８つのＥＴＥＣ采（ＥＴＥＣ ｆｉｍｂｒｉａｅ）の群の原型である（非特許文献５，４，６，７）この群は、ｃｏｌｉ表面抗原Ｉ（ＣＳ１）、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９および推定コロニー化ファクターＯ７１（ＰＣＦＯ７１）を含む。ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳＩ及びＣＳ２をエンコードする遺伝子群の完全なＤＮＡ配列は、発表されている（非特許文献８，９，１０，１１，１２）。他の関連する采の２つのメジャーサブユニットに関する遺伝子が報告されている（非特許文献１３、６）。ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１およびＣＳ２の４つの遺伝子バイオアセンブリオペロンは、同様に構成され、ペリプラズムシャペロン、メジャー采サブユニット、外側の膜のアッシャー蛋白およびマイナーの采サブユニットを（この順で）エンコードする。ＣＦＡ／Ｉアセンブリは、交替するシャペロン経路を経て生じ、その経路は、タイプ１の采形成の古典的なシャペロン・アッシャー経路、および他の繊維状の構造例えばタイプＩＶピリ線毛のそれとは異なる（非特許文献１４、１５）。メジャー采サブユニットの主要な配列に基づいて、ＣＦＡ／Ｉおよび関連する采は、クラス５采と分類されている（非特許文献１６）。
【０００５】
【非特許文献５】Ｅｖａｎｓ， Ｄ． Ｇ．， Ｒ． Ｐ． Ｓｉｌｖｅｒ， Ｄ． Ｊ． Ｅｖａｎｓ， Ｊｒ．， Ｄ． Ｇ． Ｃｈａｓｅ， ａｎｄ Ｓ． Ｌ． Ｇｏｒｂａｃｈ． １９７５． Ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １２：６５６−６６７．
【非特許文献６】Ｇｒｅｗａｌ， Ｈ． Ｍ．， Ｈ． Ｖａｌｖａｔｎｅ， Ｍ． Ｋ． Ｂｈａｎ， Ｌ． ｖａｎ Ｄｉｊｋ， Ｗ． Ｇａａｓｔｒａ， ａｎｄ Ｈ． Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ． １９９７． Ａ ｎｅｗ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ， ＣＳ １９， ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：５０７−５１３
【非特許文献７】Ｋｈａｌｉｌ， Ｓ． Ｂ．， Ｆ． Ｊ． Ｃａｓｓｅｌｓ， Ｈ． Ｉ． Ｓｈａｈｅｅｎ， Ｌ． Ｋ． Ｐａｎｎｅｌｌ， Ｋ． Ａ． Ｋａｍａｌ， Ｂ． Ｔ． Ｐｉｔｔｎｅｒ， Ｍ． Ｍａｎｓｏｕｒ， Ｒ． Ｆｒｅｎｃｋ， Ｓ． Ｊ． Ｓａｖａｒｉｎｏ， ａｎｄ Ｐ． Ｌ． Ｆ． ２０００． Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ １００ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ．
【非特許文献８】Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ， Ｂ． Ｊ．， Ａ． Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ， Ｌ． Ｒ． Ｍｅｌｓｅｎ， Ｊ． Ｃ． Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９４． ＣｏｏＣ ａｎｄ ＣｏｏＤ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ． ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２：３８７−４０１．
【非特許文献９】Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ， Ｂ． Ｊ．， Ａ． Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ， Ｈ． Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９５． Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ＣＳ２ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｏｒ ＣＳｌ ｐｉｌｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４８４９−５６．
【非特許文献１０】Ｊｏｒｄｉ， Ｂ． Ｊ． Ａ． Ｍ．， Ｇ． Ａ． Ｗｉｌｌｓｈａｗ， Ａ． Ｍ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ， ａｎｄ Ｗ． Ｇａａｓｔｒａ． １９９２． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦ Ａ／Ｉ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ＤＮＡ Ｓｅｑ ２：２５７−２６３．
【非特許文献１１】Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｓａｌ， Ｊ．， Ｊ． Ｓ． Ｓｗａｒｔｌｅｙ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９０． Ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５８：３５９４−３６００．
【非特許文献１２】Ｓｃｏｔｔ， Ｊ． Ｒ．， Ｊ． Ｃ． Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ， Ｐ． Ｗ． Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｐ． Ｅ． Ｏｒｎｄｏｒｆｆ， ａｎｄ Ｂ． Ｊ． Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ． １９９２． ＣｏｏＢ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉｎ． ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２９３−３００
【非特許文献１３】Ｇａａｓｔｒａ， Ｗ．， Ｈ． Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ， Ｌ． ｖａｎＤｉｊｋ， Ｊ． Ｇ． Ｋｕｓｔｅｒｓ， Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ， ａｎｄ Ｈ． Ｍ． Ｇｒｅｗａｌ． ２００２． Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９２：４３−５０．
【非特許文献１４】Ｒａｍｅｒ， Ｓ． Ｗ．， Ｇ． Ｋ． Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ， Ｃ． Ｙ． Ｗｕ， Ｊ． Ｈｗａｎｇ， Ｓ． Ａ． Ｓｃｈｍｉｄｔ， ａｎｄ Ｄ． Ｂｉｅｂｅｒ． ２００２． Ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｕｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘ： Ｂｉｏｇｅｎｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｂｕｎｄｌｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｉｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８４：３４５７−６５．
【非特許文献１５】Ｓｏｔｏ， Ｇ． Ｅ．， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｈｕｌｔｇｒｅｎ． １９９９． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ： ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｅｍｅｓ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１０５９−１０７１．
【非特許文献１６】Ｌｏｗ， Ｄ．， Ｂ． Ｂｒａａｔｅｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ． １９９６． Ｆｉｍｂｒｉａｅ， ｐ． １４６−１５７． Ｉｎ Ｆ． Ｃ． Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， Ｒ． Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ， Ｊ． Ｌ． Ｉｎｇｒａｈａｍ， Ｅ． Ｃ． Ｃ． Ｌｉｎ， Ｋ． Ｂ． Ｌｏｗ， Ｂ． Ｍａｇａｓａｎｉｋ， Ｗ． Ｓ． Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ， Ｍ． Ｒｉｌｅｙ， Ｍ． Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ， ａｎｄ Ｈ． Ｅ． Ｕｍｂａｒｇｅｒ （ｅｄ．）， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ： Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ， ｖｏｌ． Ｖｏｌｕｍｅ １． ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ． Ｃ．
【０００６】
ＣＳ１の研究は、クラス５采の組成および機能の特徴の詳細を明らかにした（非特許文献１７）。ＣＳ１の采の柄は、反復ＣｏｏＡメジャーサブユニットからなる。ＣｏｏＤマイナーサブユニットは、采の先端に局在しているといわれ、采全体の極めて小さい部分を占め、そして采の形成の開始を必要とする（非特許文献１８）。メジャーサブユニットが結合を媒介することを示唆している初期の証拠（非特許文献１９）とは逆に、最近の発見は、アドヘシンとしてマイナーサブユニットを意味ししかもＣＳ１およびＣＦＡ／１采の生体外アドヘシンに必要な特異的アミノ酸残基を同定した（非特許文献２０）。配列を決定されたこれらのメジャーサブユニットの推測された主なアミノ酸構造は、広範囲な類似性を共有する。しかし、未変性の采の血清学的交差反応性は制限されており、そして交差反応性のパターンは、メジャーサブユニットの系統発生的に規定された下位分類群と相関する（非特許文献１３）。
【０００７】
【非特許文献１７】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ， Ｈ．， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９８． Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ａｎ ｏｌｄ ｔｒａｄｅ： ＣＳｌ ｐｉｌｕｓ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３０：６８１−７．
【非特許文献１８】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ， Ｈ．， Ｖ． Ｒ． Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９９． Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｏｒ ｐｉｌｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ， ＣｏｏＤ， ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献１９】Ｂｕｈｌｅｒ， Ｔ．， Ｈ． Ｈｏｓｃｈｕｔｚｋｙ， ａｎｄ Ｋ． Ｊａｎｎ． １９９１． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ， ａｎ ａｄｈｅｓｉｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０７８ ：Ｈ１１ ： ｆｉｒｎｂｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：３８７６−３８８２．
【非特許文献２０】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ， Ｈ．， Ｇ． Ｐ． Ｍｕｎｓｏｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９９． Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｐ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＳｌ ａｎｄ ＣＦ Ａ／Ｉ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｈａｔ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９６：１２８２８−１２８３２．
【０００８】
実際のアドヘシンとしてのクラス５采のマイナーサブユニットが意味するところにより、メジャーサブユニットのそれに関連する保存の程度に関して精査を行わねばならなくなる。ＣｏｏＤおよびそのホモログが、リガンド結合の必要性および／またはその免疫劣性（それ自体、采の組成によってメジャーサブユニット対マイナーサブユニットの極めて大きな比に起因する）により課される機能的な制約によって大きな類似性を維持することが推定された。クラス５ＥＴＥＣ采のマイナーおよびメジャーのサブユニット並びに２つのアセンブリ蛋白の進化的関係を調べる研究がなされた（非特許文献２１）。進化的区別がクラス５のメジャー采サブユニットとマイナー采サブユニットとの間に存在すること、そしてマイナーサブユニットがアドヘシンとして機能することが立証された。これらの発見は、ワクチンに関連する研究に実際的な示唆をもたらすことになる。
【０００９】
【非特許文献２１】Ａｎａｎｔｈａ， Ｒａｖｉ Ｐ．， Ａ． Ｌ． ＭｃＶｅｉｇｈ， Ｌ．Ｈ． Ｌｅｅ， Ｍ． Ｋ． Ａｇｎｅｗ， Ｆ．Ｊ． Ｃａｓｓｅｌｓ， Ｄ． Ａ． Ｓｃｏｔｔ， Ｔ Ｓ． Ｗｈｉｔｔａｍ， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｓａｖａｒｉｎｏ． ２００４． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎｆ ａｎｄ ｌｍｍ． ７２： ７１９０−７２０１．
【００１０】
ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９およびＰＣＦＯ７１をエンコードする遺伝子群のヌクレオチド配列は、モノクローナル抗体に基づく検出によりそれぞれの采について陽性とテストされたＥＴＥＣの野生型下痢関連単離物から決定された（非特許文献２１）。新しく配列決定されたＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７およびＣＳ１９遺伝子群のメジャーサブユニット対立遺伝子は、それぞれ、遺伝子バンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に既に寄託された対応する遺伝子配列の１つ以上と９９−１００％のヌクレオチド配列の同一性を示したが、１対立遺伝子あたり４以下のヌクレオチドの相違があった。それぞれの遺伝子座は、ＣＦＡ／Ｉクラスシャペロン、メジャーサブユニット、アシャーおよびマイナーサブユニットに相同性を有する蛋白をエンコードする４つのオープンリーディングフレームを有した。既に報告された（非特許文献１３）ように、１つの例外は、ＣＳ１４遺伝子群であり、それはシャペロン遺伝子の下流で２つのタンデムオープンリーディングフレームを含んだ。それらの予想された蛋白配列は、互いに９４％のアミノ酸の同一性があり、そしてともに他のクラス５の采メジャーサブユニットに相同する。
【００１１】
クラス５の采生合成に関係するすべての蛋白ホモログの推定アミノ酸配列の検討は、多くの基本的な類似性を明らかにしている。属全体で、ホモログのそれぞれの組み合わせは、一般に、ポリペプチドの長さ、質量および理論的等電点に関する物理化学的性質が類似している。関連する蛋白のすべては、タイプＩＩ分泌経路を経てペリプラスムへの転位を助けるアミノ末端シグナルペプチドを含む。メジャーサブユニット蛋白のいずれも、システィン残基を含まないが、６つのシスティン残基の数および位置は、マイナーサブユニットのすべてについて保存されるが、ただしこれら６つの残基の４つのみを含むＹ．ｐｅｓｔｉｓホモログ３８０２を除く。
【００１２】
タイプＩおよびＰ采は、古典的なシャペロン・アッシャー経路により構成される遺伝子的および構造的な詳細を明らかにするのに有用なモデルを有している（非特許文献２３、２４、２５）。この研究で得られたものは、ドナー鎖相補性の原則の開発であり、そのプロセスでは、采サブユニットが、必須の消失したβ鎖の反復するサブユニット間の共有により相接するサブユニットと非共有結合的に結合する（非特許文献２２、２６）。証拠は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ血液凝固ピリ線毛の折り畳みおよび４基立体配座の完全性（非特許文献２８）そしてＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ被膜蛋白、非采蛋白ポリマー（非特許文献２９）においてこの同じメカニズムを示唆している。これらの構造の両者は、古典的なシャペロン・アッシャー経路により構成されるタイプ１およびＰ采の遠いクラス１関連物である。進化的見地から、これは、ドナー鎖相補性のメカニズムが、それからこのクラスの現存の采が誘導された原始的な采システムで生じたことを示唆している。ドナー鎖相補性は、非共有結合的に結合したポリマー性の表面蛋白に関する蛋白折り畳みの問題に賢明な生物学的答えをもたらすが、古典的なアッシャー・シャペロン経路のそれら以外のアドヘシン采によるその応用は、立証されていない。
【００１３】
【非特許文献２２】Ｖｉｂｏｕｄ， Ｇ． Ｌ， Ｍ． Ｍ． ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ａ． Ｈｅｌａｎｄｅｒ， ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ． １９９６． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃａｃｏ−２ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ２１：１３９ １４７．
【非特許文献２３】Ｋｕｅｈｎ ＭＪ， Ｊ． Ｈｅｕｓｅｒ， Ｓ． Ｎｏｒｍａｒｋ ａｎｄ ＳＪ． Ｈｕｌｔｇｒｅｎ． １９９２． Ｐ ｐｉｌｉ ｉｎ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｒｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｆｉｂｒｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｔｉｐｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３５６：２５２−５．
【非特許文献２４】Ｓａｕｅｒ ＦＧ， Ｋ． Ｆｕｔｔｅｒｅｒ， Ｊ．Ｓ． Ｐｉｎｋｎｅｒ， Ｋ．Ｗ． Ｄｏｄｓｏｎ， ＳＪ． Ｈｕｌｔｇｒｅｎ ａｎｄ Ｇ． Ｗａｋｓｍａｎ． １９９９． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｉｌｕｓ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１０５８−６１．
【非特許文献２５】Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｄ， Ａ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｖ． Ｓｔｏｊａｎｏｆｆ， ｅｔ ａｌ． Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｄｈｅｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ９９９；２８５：１０６１ ６．
【非特許文献２６】Ｂａｒｎｈａｒｔ ＭＭ， Ｐｉｎｋｎｅｒ ＪＳ， Ｓｏｔｏ ＧＥ， ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｖｅｒ： ＰａｐＤ−ｌｉｋｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｉｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２０００；９７：７７０９−１４．
【非特許文献２７】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ Ｈ， Ｄ．Ｐ． Ｂａｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｊ．Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９６． Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２１ ：５２９−４１．
【非特許文献２８】Ｋｒａｓａｎ ＧＰ， Ｓａｕｅｒ ＦＧ， Ｃｕｔｔｅｒ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｐｉｌｉ． ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０００；３５：１３３５−４７．
【非特許文献２９】Ｚａｖｉａｌｏｖ ＡＶ， Ｋｅｒｓｌｅｙ Ｊ， Ｋｏｒｐｅｌａ Ｔ， Ｚａｖ’ｙａｌｏｖ ＶＰ， Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ Ｓ ａｎｄ Ｋｎｉｇｈｔ ＳＤ． Ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｐｉｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２；４５：９８３−９９５．
【００１４】
別のシャペロン経路および古典的なシャペロン・アッシャー経路により構成される采に共通なのは、サブユニットの間違った折り畳みおよび外側の膜における重合を行うアッシャー蛋白を排除するためのペリプラスムシャペロンの必要性である。これらの異なる経路の采アセンブリおよび構造成分が配列の類似性をもたないことは、それらが収斂進化の経路を経て生じてきたことを示す。それにもかかわらず、ＣＦＡ／Ｉ構造サブユニットのコンピューターによる分析は、ドナー鎖相補性がまたシャペロンサブユニットおよびサブユニット・サブユニット相互作用を支配しているかもしれない可能性を示唆している。
【００１５】
８つのＥＴＥＣクラス５采は、３つ（ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４およびＣＳ１４）、４つ（ＣＳ１、ＰＣＦＯ７１、ＣＳ１７およびＣＳ１９）および１つ（ＣＳ２）のメンバーの３つのサブクラスに分類された（それぞれ、サブクラス５ａ、５ｂおよび５ｃとする）（非特許文献２１）。従来の報告は、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４およびＣＳ１９を有するＥＴＥＣが、培養されたＣａｃｏ−２細胞に付着性を有することを立証した（非特許文献６，２２）。しかしながら、ＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１のサブユニットのどの成分が付着を媒介するかについて、相反するデータが発表されている（非特許文献１９、２０）。
【００１６】
どの采成分が付着を媒介するのに関係しているかというこの疑問へのアプローチは、２つの異なる生体外の付着モデルにおける、未変性のＣＦＡ／Ｉ采、ＣｆａＢ（メジャーサブユニット）に対する抗体の付着阻害活性、そしてＣｆａＥ（マイナーサブユニット）の重複しないアミノ末端（残基２３−２１１）およびカルボキシ末端（残基２１２−３６０）の半分に対する抗体の付着阻害活性を評価することであった。ＣＦＡ／Ｉ付着の最も重要なドメインがアドヘシンＣｆａＥのアミノ末端の半分にあることが立証された（非特許文献２１）。
【００１７】
上記に簡単に記載された研究は、ＣＦＡ／Ｉおよび他のクラス５采のマイナーサブユニットが、受容体結合部分である証拠を提供している（非特許文献２０，２１）。これらの観察と一致して、采サブクラス５ａおよび５ｂ内で観察されるマイナーサブユニットの配列のダイバージェンスが低いレベルであるため（非特許文献２０）、進化の関係は、これらの２つのサブクラスのそれぞれを現すマイナーサブユニットのアミノ末端の半分に対する抗体の交差反応性と相関した（非特許文献２１）。これらの研究は、クラス５采のマイナーサブユニットが、抗付着免疫性を誘導するのに遙かに有効であり、そのため保護的抗体を誘導する重要な免疫原であることを強く示唆している（非特許文献２１）。
【００１８】
抗下痢ワクチンは、ＥＴＥＣにより生ずる下痢を含む下痢疾患に対する保護を付与する好ましい方法であろう。しかし、有効なワクチンを構築し承認することの複雑さのために、体内に保護を生ずる他の方法が探索されてきている。下痢の予防にかなり有望であるとされた手段は、下痢を起こす腸管病原体に対する免疫グロブリンの受動かつ経口の投与である。ＥＴＥＣ、Ｓｈｉｇｅｌｌａおよびロタウイルスに対する活性を有する製品は、抗クリプトスポリジウム症牛乳免疫グロブリン（ＢＩｇＧ）製品によるコントロールスタディで下痢を予防することを示している（非特許文献３０−３３）。その上、好ましい有望な結果は、抗クリプトスポリジウム症ＢＩｇＧ製品によるこのアプローチを使用して観察されている（非特許文献３４、３５）。
【００１９】
【非特許文献３０】Ｔａｃｋｅｔ， ＣＯ．， Ｇ． Ｌｏｓｏｎｓｋｙ， Ｈ． Ｌｉｎｋ， ａｎｄ Ｍ．Ｍ． Ｌｅｖｉｎｅ． １９８８． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｌｋ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ ｏｒａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ． Ｍｅｄ． ３１８： １２４０−１２４３．
【非特許文献３１】Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｇ．Ｐ．， Ｐ．Ｂ． Ｗｈｙｔｅ， Ｅ． Ｄａｎｉｅｌｓ， ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｌｏｓｔｒｕｍｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ． Ｌａｎｃｅｔ ２： ７０９−７１２．
【非特許文献３２】Ｔａｃｋｅｔ， ＣＯ．， Ｓ． Ｂ． Ｂｉｎｉｏｎ， Ｅ． Ｂｏｓｔｗｉｃｋ， Ｇ． Ｌｏｓｏｎｓｋｙ， ＭＪ． Ｒｏｙ ａｎｄ Ｒ． Ｅｄｅｌｍａｎ． １９９２． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｉｌｌｎｅｓｓ ａｆｔｅｒ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ａｍ Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ４７：２７６−２８３．
【非特許文献３３】Ｆｒｅｅｄｍａｎ， ＤＪ． ＣＯ． Ｔａｃｋｅｔ， Ａ． Ｄｅｌｅｈａｎｔｙ， Ｄ．Ｒ． Ｍａｎｅｖａｌ， Ｊ． Ｎａｔａｒｏ， ａｎｄ Ｊ．Ｈ． Ｃｒａｂｂ． １９９８． Ｍｉｌｋ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｃａｎ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｒａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７７：６６２−６６７．
【非特許文献３４】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｐ．Ｄ．， Ｊ．Ｐ． Ｃｅｌｌｏ． １９９６． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｄｉａｒｒｈｅａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｗｉｔｈ ｏｒａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ． Ｊ． Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ １３：３４８−３５４．
【非特許文献３５】Ｏｋｈｕｙｓｅｎ， Ｐ．Ｃ． ＣＬ． Ｃｈａｐｐｅｌｌ， Ｊ． Ｃｒａｂｂ， Ｌ．Ｍ． Ｖａｌｄｅｚ， Ｅ．Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓｓ ａｎｄ Ｈ．Ｌ． ＤｕＰｏｎｔ． １９９８． Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ａｎｔｉ−Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ ｃｏｌｏｓｔｒｕｍｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ ２６：１３２４−１３２９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、本発明の目的は、ＥＴＥＣ感染症に対する予防的保護を提供することのできる免疫グロブリンサプリメントである。マイナーサブユニット（アドヘシン）が、付着に直接関係のある采成分であることから、抗アドヘシン抗体の投与は、未変性の采または未変性の細菌に対して生じた抗体よりも明らかに大きな保護を付与するものと思われる。その上、本発明の他の目的は、抗アドヘシン免疫グロブリンを含む、ＥＴＥＣに対する受動予防処方物を製造する方法である。免疫グロブリンの製法における組み換えマイナー采サブユニットポリペプチドの使用は、未変性の采または細胞全体の使用よりも抗体の収量の増加並びに標準化をもたらすだろう。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
ワクチンは、潜在的に下痢の脅威にさらされる人々に抗下痢保護を付与する好ましい方法である。しかし、ＥＴＥＣに対して現在承認された有効なワクチンは存在しない。そのため、体内の保護手段は、ワクチンが開発されるまで、ウシまたは他の乳生産動物の初乳または乳から誘導された抗アドヘシン免疫グロブリンサプリメントの形の経口受動保護の投与である。
【００２２】
本発明の目的は、クラス５エンテロトキシン生成大腸菌采アドヘシンに特異的な抗大腸菌抗体予防処方物である。
【００２３】
本発明の他の目的は、ＣｆａＥおよびＣｓｂＤを含むクラス５大腸菌采アドヘシンに特異的な抗大腸菌抗体予防処方物を使用して受動免疫を付与する方法である。
【００２４】
本発明の他の目的は、クラス５采アドヘシンに特異的な抗大腸菌抗体を含む食品サプリメントを投与することにより、エンテロトキシン生成大腸菌に対する受動免疫を付与する方法である。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、家畜動物例えばウシに組み換えアドヘシンポリペプチドを投与することによって抗大腸菌アドヘシン乳抗体を製造する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ワクチンは、ＥＴＥＣにより生ずる下痢に対する長期の保護のための好ましい予防手段である。しかし、有効なワクチンの開発は、典型的に難しくそして時間が要する。その上、有効なＥＴＥＣワクチンが開発された後でも、ＥＴＥＣにより生ずる下痢に対する保護は、適切な投与方法が完成するまで、付与されない。それゆえ、受動予防手段をとるのに有効、安全かつ容易である必要がある。例えば、特に有望なアプローチは、牛乳免疫グロブリン（ＢＩｇＧ）製品の使用である（非特許文献３０−３３）。
【００２７】
ＣＦＡ／Ｉ構造サブユニットのコンピューターによる分析は、ドナー鎖相補性が、シャペロン・サブユニットおよびサブユニット・サブユニットの相互作用を支配することを示唆している。クラス５采のメジャーサブユニットは、β鎖を形成すると予想される非常に保存されたアミノ末端全体と共通する（図１）。その予想された構造および位置に基づいて、β鎖様構造は、アルファ鎖の軸に沿う隣接したメジャーサブユニット（例えばＣｆａＢ）、および采の先端のアドヘシン（例えばＣｆａＥ）に寄与する。ＣｆａＢおよびそのホモログのアミノ末端β鎖の非常に保存された性質は、タイプＩ采サブユニットのアミノ末端が、フィラメントのアセンブリの交換されたドナー鎖として機能する先例とともに、非共有結合的にＣＦＡ／Ｉサブユニットを結合するドナーβ鎖の良い候補として、これを示唆した。
【００２８】
ＥＴＥＣ采（ＥＴＥＣ ｆｉｍｂｒｉａｅ）は、遺伝子的および構造的な分析に基づいて分類され、そして疾患に関連する多くの采は、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１７およびＣＳ２を含むクラス５采の群に入る。クラス５采のアドヘシンは、それぞれ、認識可能な属に属するものとしてこれらのメンバーを明らかに区別する顕著な特徴を共有する。クラス５采は血清学的に区別可能であるが、それらは、それらがメジャーの柄形成サブユニット（例えばＣＦＡ／ＩのＣｆａＢ）およびマイナーの先端に位置するサブユニット（例えばＣＦＡ／ＩのＣｆａＥ）（われわれが小腸のアドヘシンとして働くことを見いだした）からなることで、同様なアーキテクチャーを有する。メジャーサブユニットおよびマイナーサブユニット（例えば采アドヘシン）のアミン酸配列の比較は、メジャーサブユニットに関する表１およびアドヘシン分子に関する表２に示されているように、強いアミノ酸配列の相関並びに配列の相同関係を明らかに示す。表１および表２において、影の領域は残基の類似性を示し、そして影のない領域は、残基の同一性を示す。表２に示されているように、采アドヘシンは、メジャーサブユニットと同じく、４７％から９８％に及ぶ高いレベルの残基の同一性を示す。さらに、采アドヘシンは、顕著なアミノ酸配列の保存を有し、メジャーサブユニットおよびマイナーサブユニットの両者のカルボキシ末端ドメインにおいて保存された構造モチーフ（すなわちベータ−ジッパーモチーフ）を含む。この構造は、これらの蛋白のＣ末端ドメインがサブユニット・サブユニットの相互作用に含まれることを示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
ＥＴＥＣ抗原の開発において、われわれは、立体配座が安定なコンストラクトを提供し、その場合ＣｆａＢのアミノ末端ドナーβ鎖がＣｆａＥのシス（ｉｎ ｃｉｓ）カルボキシ末端エクステンションを提供してこの分子に立体配座の安定性およびプロテアーゼ抵抗性をもたらし、ヒト赤血球を結合できる可溶性のモノマーを形成する。共通の構造モチーフを同定するために、クラス５ＥＴＥＣ采のメジャーおよびマイナーのサブユニットの８つのホモログのアミノ酸配列の複数の列を生じさせた。二次構造の予想アルゴリズムは、両方のサブユニットがそれらの長さに沿ってβ鎖の分布に富む両性の構造を形成することを指示する。共通マイナーサブユニット配列の２６％は、１７の散在するβ鎖からなるβ立体配座に折り畳まれるものと推測され、それは疎水性の芯を形成するものと予想されるだろう。サケラリス（Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ）らは、アミノ酸の全体が、采のサブユニット・シャペロンの相互作用に役割をはたすクラスＩ采サブユニットのそれに類似するβ−ジッパーモチーフを形成することを既に示唆している（非特許文献２７）。
【００３２】
以下の例では、ＣｆａＢからのドナー鎖を使用してＣｆａＥ免疫原の生成を開示している。しかし、当業者は、この記述に従ってコンストラクトを操作して、他のアドヘシンコンストラクト例えばＣｓｂＤ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤおよびＣｏｔＤと関連する他のクラス５メジャーサブユニットからのドナー鎖を使用して免疫原として働かせるものと思われる。メジャークラス５采サブユニットは、サブユニットのアミノ酸配列ドナーサブユニットに相当する対応する配列番号とともに表３にリストされる。表４は、クラス５アドヘシンのアミノ酸配列およびそれらのそれぞれの配列番号をリストする。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
本発明の態様の１つは、ＥＴＥＣ細菌のクラス５采アドヘシンに対する受動予防物の製造方法である。特定のクラス５采アドヘシンを使用する実施例は、本発明を説明するために提供される。しかし、他のクラス５采アドヘシンおよびそれらの関連するメジャーサブユニットも当業者により利用できる。
【実施例１】
【００３６】
（抗ＣｆａＥウシ免疫グロブリンの製造）
上記のように、ＣｆａＢおよびそのホモログのアミノ末端β鎖の非常に保存された性質は、タイプＩ采サブユニットにおける他の構造／機能の研究とともに、ＣＦＡ／Ｉサブユニットを結合するドナーβ鎖の良い候補としてこの構造を示唆していた。マイナーアドヘシンサブユニットに関するこの仮説をテストするために、プラスミドは操作されて、可撓性のヘアピンリンカー（ＤＮＫＱ 配列番号１０）次にＣｆａＢのアミノ酸配列からなるＣ末端エクステンションを含むＣｆａＥ変異型を発現した（図２）。少なくとも１２から約１９のアミノ酸のＣｆａＢドナー鎖の長さが、ＣｆａＥの測定可能な回収を得る必要があることが分かった。突然変異がβ鎖を破壊するために導入される１２−１９アミノ酸ドナー鎖を含むコンストラクトを使用する研究において、β鎖がＣ末端アミノ酸エクステンションにより達成される観察された安定性に重要であることが立証された。シスのＣｆａＢによるＣ末端β鎖がシャペロン（例えばＣｆａＡ）アドヘシンコンプレックスの形成を除外することがさらに分かった。
【００３７】
この例では、組み換えＣｆａＥ抗原は、ＣｆａＥポリペプチド配列（配列番号１１）を融合し、配列番号１のアミノ酸１−１９に相当する１９アミノ酸ＣｆａＢドナー鎖にそのＣ末端で次に結合されるリンカーポリペプチド（配列番号１０）のＮ末端アミノ酸配列へ配列番号１８のヌクレオチド配列をエンコードすることによって、構築された。配列番号１０がリンカーとして利用されたが、配列番号１２および１３を含む他のアミノ酸配列も使用できることが分かった。この例では、使用されるＣｆａＢメジャーサブユニットドナー鎖は、配列番号２０のヌクレオチド配列によりエンコードされる配列番号１に示される。しかし、１２−１９アミノ酸のドナー鎖が有意なＣｆａＥ回収に好適であるという観察に基づいて、１２−１９アミノ酸を含む組み換え抗原が利用できる。同様に、アミノ酸配列が抗ＣｆａＢ采法エピトープを含む限り、配列番号１１のすべてまたは一部を含む組み換えペプチドが構成できる。
【００３８】
１９アミノ酸メジャーサブユニット鎖を含むＣｆａＥコンストラクトは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、生体外組み換えによりまずＣｆａＥをプラスミドベクター中に挿入することによって構成された。以下の配列を有するプライマーは、ｐＤＯＮＲ２０７（商標）；ｄｓｃ−ＣｆａＥ１３−１（前方）、５′−ＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＴＡＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣ−３′（配列番号１４）；およびｄｓｃ−ＣｆａＥ１３−２（逆）、５′−ＴＣＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＴＡＧＣＴＧＴＴＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧ−３′（配列番号１５）中への最初のクローニングに使用された。ａｔｔＢ組み換え部位を隣接するＰＣＲ生成物は、ＧａｔｅｗａｙＢＰ（商標）反応を使用してドナーベクターｐＤＯＮＲ２０１（商標）（Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）中にクローンされて、エントリーベクターｐＲＡ１３．２を生じた。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ（商標）反応では、遺伝子配列は、ｐＲＡ１３．２から、変性された発現ベクターｐＤＥＳＴ１４−Ｋｎ′（Ｔ７プロモーターからの未変性発現のためのベクター）中にさらにサブクローンされて、プラスミドｐＲＡ１４．２を生じた。ｐＤＥＳＴ１４−Ｋｎ′ベクターは、カナマイシン抵抗によりアンピシリンを置換することによりｐＤＥＳＴ１４（商標）（Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を変性することにより構成された。正確なＣｆａＥの存在は、配列の分析によって確認された。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＳＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）を、ｐＲＡ１４．１および関連するＣｆａＥドナーサブユニット相補性コンストラクトの発現に使用した。
【００３９】
上記の方法は、ＣｆａＥ／ドナー鎖組み換えコンストラクトを構成するのに利用された。しかし、他のアドヘシン分子を含むコンストラクトも構築でき、表１にリストされたメジャーサブユニットから適切なドナー鎖と関連して、マイナーサブユニットＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ，ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤを含む。例えば、組み換えＣｓｂＤコンストラクトは、配列番号２１のヌクレオチド配列をエンコードするポリペプチド配列配列番号６のＣｓｂＡメジャーサブユニットドナー鎖に、配列番号１０のリンカーポリペプチドを経て、Ｃ末端で融合した配列番号２２のすべてまたは一部からなるＣｓｂＤポリペプチド配列からなるようにデザインされた。
【００４０】
（大きなスケールによる抗原生産のためのｐＥＴ／アドヘシンコンストラクトの開発）
ｄｓｃ１９ＣｆａＥをエンコードするＤＮＡコンストラクトは、ＣｆａＢドナー鎖の後にカルボキシ末端ポリヒスチジン尾部を配合する変異型ＣｆａＥコンストラクトをエンコードするために、次にｐＤＥＳＴ１４（商標）ベクターから除去され、そしてｐＥＴ２４（ａ）（商標）中に挿入された。このコンストラクトは、配列番号２４のポリペプチド配列を有し、ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６と命名され、そして配列番号２３のヌクレオチド配列によりエンコードされる。
【００４１】
ｄｓｃ１９ＣｆａＥ挿入断片の構築は、Ｎｄｅｌ含有前方プライマーおよびＸｈｏｌ含有逆プライマー（それぞれ、配列番号１６および１７）を使用してポリメラーゼ鎖反応によりｐＤＥＳＴ１４ベクターを増幅することにより実施された。ｄｓｃ１９ＣｆａＥコード領域は、Ｎｄｅｌ／Ｘｈｏｌ制限ｐＥＴ２４ａプラスミド中に指向して連結された。ｐＥＴ２４ａ（商標）プラスミドを含む挿入断片は、ＮｏｖａＢｌｕｅ−３（商標）ＢＬ２１（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）Ｂｒａｎｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）細菌を形質転換するのに使用された。形質転換されたコロニーは、次にプラスミド含有細菌を増殖するために選択かつ再培養された。選択されたコロニーからのプラスミド挿入断片を次に配列決定した。これらのプラスミドを次にＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）Ｂｒａｎｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）感応細胞中に挿入しそしてＤＮＡ挿入断片の配列を確認した。
【００４２】
コンストラクトｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６に使用された方法と同様に、ｄｓｃ１９ＣｓｂＤをエンコードするＤＮＡコンストラクトを、またｐＥＴ２４ｇ（商標）中にＣｓｂＤおよびＣｓｂＡドナー鎖配列に挿入することにより行った。このコンストラクトは、配列番号２６のポリペプチド配列を有しそして配列番号２５のヌクレオチド配列によりエンコードされる。コンストラクトをデザインするのに使用されるＣｓｂＡからのドナー鎖配列は、配列番号６として開示されている。ＣｆａＥコンストラクトと同様に、配列番号６のアミノ酸１−１９に相当するＣｓｂＡからの１９アミノ酸配列を使用した。しかし、１２アミノ酸から１９アミノ酸に及ぶドナー鎖配列も使用できる。
【００４３】
（ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６の生成）
多数の成長条件および培地を、（ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６または他のアドヘシン／ドナー鎖コンストラクトの大きな生成のために利用する。例えば、培養の開始は、１−４時間、３２−２５℃の誘導温度で１．０μＭから１．０ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して行うことができる。この実施例では、ＬＢ培地は、３時間３２℃で１．０μＭ ＩＰＴＧの濃度で利用された。しかしながら、ＡＰＳ（商標）および他の培地の処方も使用できる。ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６または他の組み換えアドヘシンコンストラクトは、Ｎｉカラムで精製される。コンストラクトの収量は、培地１Ｌあたり少なくとも０．４５−０．９ｍｇの蛋白である。
【００４４】
（ＢＩｇＧの製造）
組み換え抗原に対する抗体は、ホルスタインを含む家畜の初乳または乳で精製される。それぞれ５００μｇの抗原を含む２ｍＬの量での合計３つの筋肉内ワクチン接種は、単一の部位で投与される。ワクチン接種は、分娩１−２週間前の最後の接種とは互いに約３週間離れて行われる。分娩時に、初めの４つの搾乳を集め、量を計りそしてサンプルを酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）により抗アドヘシン抗体についてテストした。図３は、抗ＣＦＡ／Ｉ ＢＩｇＧおよび抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧ製品の反応性を示す。ＣＦＡ／Ｉ ＢＩｇＧは、ＥＬＩＳＡにより抗ＣｆａＥよりも高いレベルのＣＦＡ／Ｉ抗原に対する反応性を生ずる（図３Ａ）。これは、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するのに使用されるＣＦＡ／Ｉ抗原が主としてＣｆａＢメジャーサブユニットから作られそしてＣｆａＢマイナーサブユニットはマイナー成分としてのみ存在するという事実による。予想されるように、抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧ製品は、ＡＥＭＩまたは抗ＣＦＡ／ＩＢＩｇＧに比べてＣｆａＥと遙かに強い反応性を有する（図３Ｂ）。これは、ＣｆａＥによるウシの免疫化がアドヘシンＣｆａＥに対する抗体の発生を極めて増大させることを確認させる。
【００４５】
集めた生成物のさらなる処理を行うことができる。例えば、凍結した乳をチーズ製造工程により分画してカゼインを除く。最も免疫グロブリンを含む乳清区分を次にチーズカードから取りだしそして標準の乳製品製造の条件下で殺菌する。免疫グロブリンに富む乳清を次に濃縮しそして残存する乳脂肪を室温で遠心分離により除く。次に、リン脂質および非免疫グロブリン蛋白を取り出す（特許文献１）。最終の生成物を次に固体分１５−２０％に濃縮しそして塩を３回の緩衝液の交換に対する連続的透析濾過により除く。最終の生成物を次にＥＬＩＳＡによりテストする。
【００４６】
【特許文献１】Ｒｕｃｈ， Ｆ．Ｅ．， Ｅ．Ａ． Ａｃｋｅｒ． １９９８． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７４７，０３１ ｔｏ ＩｍｍｕＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．
【００４７】
ＥＴＥＣ抗原に対するＢＩｇＧの抗体反応性の特徴を現すことに加えて、抗体の機能的活性を評価した。ＣＦＡ／Ｉに関する１つ以上の受容体が規定されていないため、生体外での標的細胞に対するＥＴＥＣのアドヘシンに関する代理アッセイを使用した。或る采（ＣＦＡ／Ｉを含む）を発現するＥＴＥＣは、マンノース抵抗性血液凝集アッセイ（ＭＲＨＡ）においてヒトおよび／またはウシの赤血球に付着しそして凝集する。これを、標的の真核生物の上皮細胞に対するＥＴＥＣの細胞全体、采または采の精製したマイナーサブユニットのアドヘシンのための代替マーカーとして使用される。血液凝集阻害（ＨＡＩ）として記述されるこの現象は、標的細胞へのＥＴＥＣのアドヘシンを中和できる抗体のインディケーターである。
【００４８】
図４では、ヒトの赤血球は、マンノース抵抗性方法（ＭＲＨＡ）においてＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４またはＣＳ１４を発現するＥＴＥＣにより凝集された。このＭＲＨＡは、抗ＣＦＡ／Ｉ ＢＩｇＧまたは抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧにより細菌の前インキュベーションにより阻害できる。図４に示されるように、抗ＣＦＡ／Ｉ ＢＩｇＧまたは抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧの両者は、凝集するヒト赤血球から相同の采を発現するＥＴＥＣの能力を阻害できる抗体を含んだ。図４は、異なるコロニー化ファクターを発現するＥＴＥＣによりウシ赤血球の中和する凝集に必要なＢＩｇＧの力価（ｍｇ ＩｇＧ／ｍＬとして示される）を示す。テストされたＢＩｇＧ生成物の濃度は、ＩｇＧの最低の濃度が両方の生成物で等しいように調節された。そのため、データは、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４またはＣＳ１４采を発現するＥＴＥＣによりＭＲＨＡを阻害するのに必要なＩｇＧの濃度として示される。ＢＩｇＧ粉末に存在するウシＩｇＧの約１４−１７μｇ／ｍＬが、ＭＲＨＡを阻害するのに生体外で必要である。
【００４９】
強い阻害活性は、予想されるように抗ＣＦＡ／Ｉによりもたらせられ、同等のレベルの阻害は、抗ＣｆａＥによりもたらせられる。重要なのは、抗ＣＦＡ／Ｉおよび抗ＣｆａＥの両者が、ＣＳ４およびＣＳ１４に対する結合阻害の交差反応性を示すことである。これは、抗ＣｆａＥ予防抗体が他の関連する抗原に対する保護を付与するのに有用性を有することを説明する。
【実施例２】
【００５０】
（抗ＣｆａＤ（ＣＳ１７）ウシ免疫グロブリンの製造）
他のクラス５采アドヘシンの使用は、また顕在化する保護的受動抗体の生成として考えられる。さらなる説明として、ＣＳ１７（すなわちＣｓｂＤ）に対する抗体による阻害の結果が図５に示される。抗体を顕在化するのに使用される抗原は、ＣｓｂＤポリペプチド（配列番号２２）発現コンストラクトであった。コンストラクトは、上記の実施例１のＣｆａＥに関するそれと同様に操作されたが、ＣｓｂＤ（配列番号１９）をエンコードするヌクレオチド配列を用いた。コンストラクトは、ｄｓｃ１９ＣｓｂＤ［Ｈｉｓ］６と命名された。ドナー鎖は、ＣｓｂＡ（配列番号７）の１９アミノ酸からなった。
【００５１】
図５で分かるように、ＣｆａＥに関するそれと同様に、ＣｓｂＤに対する抗体は、ＭＲＨＡを阻害するのに非常に能率的であった。また、ＣｆａＥについて観察されたそれと同様に、抗ＣｓｂＤ抗体もＣＳ４およびＣＳ２に対して交差保護をあたえる。
ＣＳ１７およびＣｓｂＤに対するＢＩｇＧの機能的活性も、図４におけるように、評価された。これらの結果は、図６に画かれる。抗ＣｆａＥおよび抗ＣＦＡ／Ｉについて観察されるそれと同様に、ＣＳ１７およびＣｓｂＤの両者に対するＢＩｇＧは、顕著な阻害活性を示した。
【００５２】
しかし、抗ＣＳ１７ＢＩｇＧに比べて、抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧ、抗ＣｓｂＤについて異型の抗原に対してもさらに顕著な阻害活性が示された。これらの観察は、ＣｆａＥについて観察されたそれとともに、クラス５アドヘシン属内の制限された数の種のみが、有効な受動保護に必要であると思われる。
【実施例３】
【００５３】
（ＥＴＥＣ采アドヘシンの特異的な域が免疫活性および安定性に重要である）
ｄｓｃＣｆａＥの結晶学的分析は、２つのドメイン、すなわちアドヘシン分子のアミノ末端セグメントにより形成されたアドヘシンドメインおよびＣ末端ピリ線毛ドメインからなる。２つのドメインは、３つのアミノ酸リンカーにより分離されている。采アドヘシンのこれらの域を理解する試みにおいて、アミノ酸置換の所在そして次の免疫反応性を分析した。ＣｆａＥにおけるアラニンによるアルギニン６７またはアルギニン１８１の置換が分子の生体外の付着表現型を排除することが分かった。これらのアミノ酸の位置は、ドメインのアミノ末端の遠位の位置に存在する残基Ａｒｇ１８１を有する分子の暴露された域にある。従って、ＣｆａＥのこの域および他の采アドヘシンの対応する域は、有効な免疫の誘導に重要である。表３は、８つのアドヘシンの位置を要約する。また表３に示されているのは、采アドヘシン分子の構造的安定性を付与するのに、結晶学的分析に基づいて重要性を増すドメインのその域である。
【００５４】
【表５】
【００５５】
未変性采アドヘシン分子のアドヘシンドメインの安定化は、メジャーサブユニットにより提供される。しかしながら、ピリ線毛のドメインなしに、采アドヘシンは、免疫反応性の随伴する保持により未変性分子よりも大きな立体配座の安定性を示す。未変性アドヘシン分子の投与の代わりに、アドヘシンドメインのみの投与は、抗采アドヘシン抗体のための別の免疫原である。それゆえ、例として、ＣｆａＥ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤアドヘシンドメインをエンコードするがピリ線毛ドメインを含まない組み換えアドヘシンドメインコンストラクトは、アドヘシンドメインのポリメラーゼ鎖反応増幅により構築されそしてｐＥＴ２４ａ（商標）中に挿入された。組み換え生成物のアミノ酸配列は、配列番号３５，３６および３７に示されている。実施例１および２におけるようにポリヒスチジン尾部の配合は、次の発現された生成物の精製を助ける。
【実施例４】
【００５６】
（ＥＴＥＣに対する予防としての抗采アドヘシンの投与）
クラス５采アドヘシンは、ＥＴＥＣ感染に対する予防保護の開発に使用できる。保護は、采アドヘシンそして未変性または組み換え大腸菌アドヘシンのいずれかの免疫ウシから初乳または乳製品を集めることによりもたらさられる。免疫化は、任意の数の方法によることができる。しかし、最良の方法は、それぞれ５００μｇ以下の該アドヘシンを含む１−２ｍＬの量を用いて、分娩１−２週間前の最後の投与から互いに３週間隔てた３回の筋肉内投与である。乳または初乳の採取は、任意のときでよいが、しかし、最適な結果を得るのは、採取が分娩１−２週間前になされたものである。
【００５７】
予防としての抗アドヘシンウシ免疫グロブリンの投与は、０．１ｇのＩｇＧ／投与から２０．０ｇのＩｇＧ／投与の摂取である。抗アドヘシンウシ初乳または乳の免疫グロブリンは、単独でまたは多数の飲料または食品例えばキャンディーと混合されて摂取される。免疫グロブリンは、また錠剤またはカプセルの形にされそして摂取できる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】クラス５采のメジャー構造サブユニットにおける非常に保存されたβ鎖モチーフを示す。これは、以下に示される共通配列を有するメジャーサブユニットの成熟型のアミノ末端の複数の配列である。この範囲は、中断されたβ鎖モチーフを含む残基５−１９を形成するものと予想される。また示されているのは、関連するポリペプチドの配列番号である。略称、Ｂｃｅｐ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ；Ｓｔｙｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ；Ｕ、疎水性残基；ｘ、任意の残基；Ｚ、ＥまたはＱ。
【図２】パネルＡ、長さが１０−１９残基変化するＣｆａＢのＮ末端β鎖範囲からなるＣ末端エクステンションを有する独立したＣｆａＥ変異型コンストラクトのドメインを示す概略ダイアグラムである。それぞれのコンストラクトは、未変性のＣｆａＥ配列のＣ末端とドナーβ鎖との間に挿入された短い可撓性のリンカーペプチド（ＤＮＫＱ）を含む。垂直の矢印は、プロリン（Ｖ７Ｐ）の何れかに変性されて二次β鎖モチーフを中断したドナー鎖バリンを示す。パネルＢ、ＣｆａＥを発現するように操作された一連の種および成熟ＣｆａＢのアミノ末端範囲の異なる長さを有するシスに相補された変異型からのペリプラスム濃縮物のウエスタンブロット分析である。使用された一次抗体製品は、ＣｆａＥに対するポリクローナルウサギ抗体であった。レーンは以下のコンストラクトからの製品に相当する。レーン１、ｄｓｃ１０ＣｆａＥ；２，ｄｓｃ１１ＣｆａＥ；３、ｄｓｃ１２ＣｆａＥ；４、ｄｓｃ１３ＣｆａＥ；５、ｄｓｃ１３ＣｆａＥ［Ｖ７Ｐ］；６、ｄｓｃ１４ＣｆａＥ；７、ｄｓｃ１６ＣｆａＥ；８、ｄｓｃ１９ＣｆａＥ；９，ＣｆａＥ。分子量マーカー（ｋＤ）は、左に示されている。パネルＣ、短いリンカー配列（すなわちＤＮＫＱ）、成熟ＣｆａＢのＮ末端からの１９残基ドナー鎖および末端６ヒスチジンアフィニティタグからなるそのＣ末端でのエクステンションを有する、未変性ＣｆａＥ配列（Ｓｅｃ依存Ｎ末端シグナル配列を含む）を含有するｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６の操作された成分の概略図である。
【図３Ａ】ＥＬＩＳＡによるＣＦＡ／Ｉ関連抗原のパネルを有する生成物の反応性を示す。
【図３Ｂ】ＥＬＩＳＡによるＣＦＡ／Ｉ関連抗原のパネルを有する生成物の反応性を示す。
【図４】ＢＩｇＧ抗ＳｆａＥに対する抗体の生体外の機能的活性を示す。
【図５Ａ】ＥＬＩＳＡによるＣＳ１７関連抗原のパネルを有する生成物の反応性を示す。
【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡによるＣＳ１７関連抗原のパネルを有する生成物の反応性を示す。
【図６】ＢＩｇＧ抗ＣｓｂＤの生体外の機能的活性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンテロトキシン生成大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）により引き起こされる下痢に対して受動保護を付与するのに有用な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンテロトキシン生成大腸菌（ＥＴＥＣ）は、資源が限られた国々の乳幼児そしてまたこれらの地域への旅行者の下痢の主な原因である（非特許文献１および２）。ＥＴＥＣは、小腸の上皮細胞への付着並びに熱不安定性（ＬＴ）および／または熱安定性（ＳＴ）のエンテロトキシンの発現により病気を引き起こす（非特許文献３）。ＥＴＥＣは、典型的に、コロニー化ファクター（ＣＦ）として知られている繊維状の細菌の表面構造物をへて宿主細胞に付着する。２０を超える異なるＣＦが明らかになっており、それらに含まれるものは、疑う余地なく病理発生の原因とみなされている（非特許文献４）。
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｌａｃｋ， Ｒ． Ｅ． １９９０． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｒａｖｅｌｅｒｓ’ ｄｉａｒｒｈｅａ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ． Ｒｅｖ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １２ （Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ７３−Ｓ７９．
【非特許文献２】Ｈｕｉｌａｎ， Ｓ．， Ｌ． Ｇ． Ｚｈｅｎ， Ｍ． Ｍ． Ｍａｔｈａｎ， Ｍ． Ｍ． Ｍａｔｈｅｗ， Ｊ． Ｏｌａｒｔｅ， Ｒ． Ｅｓｐｅｊｏ， Ｕ． Ｋｈｉｎ Ｍａｕｎｇ， Ｍ． Ａ．Ｇｈａｆｏｏｒ， Ｍ． Ａ． Ｋｈａｎ， Ｚ． Ｓａｍｉ， ａｎｄ ｅｔ ａｌ． １９９１． Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ： ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｆｉｖｅ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ． Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ ６９：５４９−５５．
【非特許文献３】Ｎａｔａｒｏ， Ｊ． Ｐ．， ａｎｄ Ｊ． Ｂ． Ｋａｐｅｒ． １９９８． Ｄｉａｒｒｈｅａｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １１：１４２−２０１．
【非特許文献４】Ｇａａｓｔｒａ， Ｗ．， ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ． １９９６． Ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （ＥＴＥＣ）． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：４４４−４５２．
【０００４】
コロニー化ファクター抗原Ｉ（ＣＦＡ／Ｉ）について、病原性の役割に関する明確な証拠が存在しており、最初のヒト特異的なＥＴＥＣ ＣＦとされる。ＣＦＡ／Ｉは、遺伝的そして生化学的な特徴をともにする８つのＥＴＥＣ采（ＥＴＥＣ ｆｉｍｂｒｉａｅ）の群の原型である（非特許文献５，４，６，７）この群は、ｃｏｌｉ表面抗原Ｉ（ＣＳ１）、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９および推定コロニー化ファクターＯ７１（ＰＣＦＯ７１）を含む。ＣＦＡ／Ｉ，ＣＳＩ及びＣＳ２をエンコードする遺伝子群の完全なＤＮＡ配列は、発表されている（非特許文献８，９，１０，１１，１２）。他の関連する采の２つのメジャーサブユニットに関する遺伝子が報告されている（非特許文献１３、６）。ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１およびＣＳ２の４つの遺伝子バイオアセンブリオペロンは、同様に構成され、ペリプラズムシャペロン、メジャー采サブユニット、外側の膜のアッシャー蛋白およびマイナーの采サブユニットを（この順で）エンコードする。ＣＦＡ／Ｉアセンブリは、交替するシャペロン経路を経て生じ、その経路は、タイプ１の采形成の古典的なシャペロン・アッシャー経路、および他の繊維状の構造例えばタイプＩＶピリ線毛のそれとは異なる（非特許文献１４、１５）。メジャー采サブユニットの主要な配列に基づいて、ＣＦＡ／Ｉおよび関連する采は、クラス５采と分類されている（非特許文献１６）。
【０００５】
【非特許文献５】Ｅｖａｎｓ， Ｄ． Ｇ．， Ｒ． Ｐ． Ｓｉｌｖｅｒ， Ｄ． Ｊ． Ｅｖａｎｓ， Ｊｒ．， Ｄ． Ｇ． Ｃｈａｓｅ， ａｎｄ Ｓ． Ｌ． Ｇｏｒｂａｃｈ． １９７５． Ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｓ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １２：６５６−６６７．
【非特許文献６】Ｇｒｅｗａｌ， Ｈ． Ｍ．， Ｈ． Ｖａｌｖａｔｎｅ， Ｍ． Ｋ． Ｂｈａｎ， Ｌ． ｖａｎ Ｄｉｊｋ， Ｗ． Ｇａａｓｔｒａ， ａｎｄ Ｈ． Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ． １９９７． Ａ ｎｅｗ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ， ＣＳ １９， ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：５０７−５１３
【非特許文献７】Ｋｈａｌｉｌ， Ｓ． Ｂ．， Ｆ． Ｊ． Ｃａｓｓｅｌｓ， Ｈ． Ｉ． Ｓｈａｈｅｅｎ， Ｌ． Ｋ． Ｐａｎｎｅｌｌ， Ｋ． Ａ． Ｋａｍａｌ， Ｂ． Ｔ． Ｐｉｔｔｎｅｒ， Ｍ． Ｍａｎｓｏｕｒ， Ｒ． Ｆｒｅｎｃｋ， Ｓ． Ｊ． Ｓａｖａｒｉｎｏ， ａｎｄ Ｐ． Ｌ． Ｆ． ２０００． Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ １００ｔｈ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ．
【非特許文献８】Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ， Ｂ． Ｊ．， Ａ． Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ， Ｌ． Ｒ． Ｍｅｌｓｅｎ， Ｊ． Ｃ． Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９４． ＣｏｏＣ ａｎｄ ＣｏｏＤ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ． ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２：３８７−４０１．
【非特許文献９】Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ， Ｂ． Ｊ．， Ａ． Ｋａｒａｋａｓｈｉａｎ， Ｈ． Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９５． Ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ＣＳ２ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｏｒ ＣＳｌ ｐｉｌｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：４８４９−５６．
【非特許文献１０】Ｊｏｒｄｉ， Ｂ． Ｊ． Ａ． Ｍ．， Ｇ． Ａ． Ｗｉｌｌｓｈａｗ， Ａ． Ｍ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｉｊｓｔ， ａｎｄ Ｗ． Ｇａａｓｔｒａ． １９９２． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｇｉｏｎ １ ｏｆ ｔｈｅ ＣＦ Ａ／Ｉ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ＤＮＡ Ｓｅｑ ２：２５７−２６３．
【非特許文献１１】Ｐｅｒｅｚ−Ｃａｓａｌ， Ｊ．， Ｊ． Ｓ． Ｓｗａｒｔｌｅｙ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９０． Ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５８：３５９４−３６００．
【非特許文献１２】Ｓｃｏｔｔ， Ｊ． Ｒ．， Ｊ． Ｃ． Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ， Ｐ． Ｗ． Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｐ． Ｅ． Ｏｒｎｄｏｒｆｆ， ａｎｄ Ｂ． Ｊ． Ｆｒｏｅｈｌｉｃｈ． １９９２． ＣｏｏＢ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉｎ． ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２９３−３００
【非特許文献１３】Ｇａａｓｔｒａ， Ｗ．， Ｈ． Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ， Ｌ． ｖａｎＤｉｊｋ， Ｊ． Ｇ． Ｋｕｓｔｅｒｓ， Ａ．Ｍ．Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ， ａｎｄ Ｈ． Ｍ． Ｇｒｅｗａｌ． ２００２． Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｆｉｍｂｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９２：４３−５０．
【非特許文献１４】Ｒａｍｅｒ， Ｓ． Ｗ．， Ｇ． Ｋ． Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ， Ｃ． Ｙ． Ｗｕ， Ｊ． Ｈｗａｎｇ， Ｓ． Ａ． Ｓｃｈｍｉｄｔ， ａｎｄ Ｄ． Ｂｉｅｂｅｒ． ２００２． Ｔｈｅ Ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｕｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘ： Ｂｉｏｇｅｎｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｂｕｎｄｌｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｉｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８４：３４５７−６５．
【非特許文献１５】Ｓｏｔｏ， Ｇ． Ｅ．， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｈｕｌｔｇｒｅｎ． １９９９． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｄｈｅｓｉｎｓ： ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｅｍｅｓ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１０５９−１０７１．
【非特許文献１６】Ｌｏｗ， Ｄ．， Ｂ． Ｂｒａａｔｅｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ． １９９６． Ｆｉｍｂｒｉａｅ， ｐ． １４６−１５７． Ｉｎ Ｆ． Ｃ． Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ， Ｒ． Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ， Ｊ． Ｌ． Ｉｎｇｒａｈａｍ， Ｅ． Ｃ． Ｃ． Ｌｉｎ， Ｋ． Ｂ． Ｌｏｗ， Ｂ． Ｍａｇａｓａｎｉｋ， Ｗ． Ｓ． Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ， Ｍ． Ｒｉｌｅｙ， Ｍ． Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ， ａｎｄ Ｈ． Ｅ． Ｕｍｂａｒｇｅｒ （ｅｄ．）， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ： Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ， ｖｏｌ． Ｖｏｌｕｍｅ １． ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ． Ｃ．
【０００６】
ＣＳ１の研究は、クラス５采の組成および機能の特徴の詳細を明らかにした（非特許文献１７）。ＣＳ１の采の柄は、反復ＣｏｏＡメジャーサブユニットからなる。ＣｏｏＤマイナーサブユニットは、采の先端に局在しているといわれ、采全体の極めて小さい部分を占め、そして采の形成の開始を必要とする（非特許文献１８）。メジャーサブユニットが結合を媒介することを示唆している初期の証拠（非特許文献１９）とは逆に、最近の発見は、アドヘシンとしてマイナーサブユニットを意味ししかもＣＳ１およびＣＦＡ／１采の生体外アドヘシンに必要な特異的アミノ酸残基を同定した（非特許文献２０）。配列を決定されたこれらのメジャーサブユニットの推測された主なアミノ酸構造は、広範囲な類似性を共有する。しかし、未変性の采の血清学的交差反応性は制限されており、そして交差反応性のパターンは、メジャーサブユニットの系統発生的に規定された下位分類群と相関する（非特許文献１３）。
【０００７】
【非特許文献１７】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ， Ｈ．， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９８． Ｎｅｗ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ａｎ ｏｌｄ ｔｒａｄｅ： ＣＳｌ ｐｉｌｕｓ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． ＭｏＩ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３０：６８１−７．
【非特許文献１８】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ， Ｈ．， Ｖ． Ｒ． Ｐｅｎｕｍａｌｌｉ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９９． Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｎｏｒ ｐｉｌｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ， ＣｏｏＤ， ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８１：１６９４−７．
【非特許文献１９】Ｂｕｈｌｅｒ， Ｔ．， Ｈ． Ｈｏｓｃｈｕｔｚｋｙ， ａｎｄ Ｋ． Ｊａｎｎ． １９９１． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ， ａｎ ａｄｈｅｓｉｎ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０７８ ：Ｈ１１ ： ｆｉｒｎｂｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９：３８７６−３８８２．
【非特許文献２０】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ， Ｈ．， Ｇ． Ｐ． Ｍｕｎｓｏｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９９． Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｉｐ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＳｌ ａｎｄ ＣＦ Ａ／Ｉ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｈａｔ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９６：１２８２８−１２８３２．
【０００８】
実際のアドヘシンとしてのクラス５采のマイナーサブユニットが意味するところにより、メジャーサブユニットのそれに関連する保存の程度に関して精査を行わねばならなくなる。ＣｏｏＤおよびそのホモログが、リガンド結合の必要性および／またはその免疫劣性（それ自体、采の組成によってメジャーサブユニット対マイナーサブユニットの極めて大きな比に起因する）により課される機能的な制約によって大きな類似性を維持することが推定された。クラス５ＥＴＥＣ采のマイナーおよびメジャーのサブユニット並びに２つのアセンブリ蛋白の進化的関係を調べる研究がなされた（非特許文献２１）。進化的区別がクラス５のメジャー采サブユニットとマイナー采サブユニットとの間に存在すること、そしてマイナーサブユニットがアドヘシンとして機能することが立証された。これらの発見は、ワクチンに関連する研究に実際的な示唆をもたらすことになる。
【０００９】
【非特許文献２１】Ａｎａｎｔｈａ， Ｒａｖｉ Ｐ．， Ａ． Ｌ． ＭｃＶｅｉｇｈ， Ｌ．Ｈ． Ｌｅｅ， Ｍ． Ｋ． Ａｇｎｅｗ， Ｆ．Ｊ． Ｃａｓｓｅｌｓ， Ｄ． Ａ． Ｓｃｏｔｔ， Ｔ Ｓ． Ｗｈｉｔｔａｍ， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｓａｖａｒｉｎｏ． ２００４． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ Ｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｌａｓｓ ５ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｉｎｆ ａｎｄ ｌｍｍ． ７２： ７１９０−７２０１．
【００１０】
ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９およびＰＣＦＯ７１をエンコードする遺伝子群のヌクレオチド配列は、モノクローナル抗体に基づく検出によりそれぞれの采について陽性とテストされたＥＴＥＣの野生型下痢関連単離物から決定された（非特許文献２１）。新しく配列決定されたＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７およびＣＳ１９遺伝子群のメジャーサブユニット対立遺伝子は、それぞれ、遺伝子バンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に既に寄託された対応する遺伝子配列の１つ以上と９９−１００％のヌクレオチド配列の同一性を示したが、１対立遺伝子あたり４以下のヌクレオチドの相違があった。それぞれの遺伝子座は、ＣＦＡ／Ｉクラスシャペロン、メジャーサブユニット、アシャーおよびマイナーサブユニットに相同性を有する蛋白をエンコードする４つのオープンリーディングフレームを有した。既に報告された（非特許文献１３）ように、１つの例外は、ＣＳ１４遺伝子群であり、それはシャペロン遺伝子の下流で２つのタンデムオープンリーディングフレームを含んだ。それらの予想された蛋白配列は、互いに９４％のアミノ酸の同一性があり、そしてともに他のクラス５の采メジャーサブユニットに相同する。
【００１１】
クラス５の采生合成に関係するすべての蛋白ホモログの推定アミノ酸配列の検討は、多くの基本的な類似性を明らかにしている。属全体で、ホモログのそれぞれの組み合わせは、一般に、ポリペプチドの長さ、質量および理論的等電点に関する物理化学的性質が類似している。関連する蛋白のすべては、タイプＩＩ分泌経路を経てペリプラスムへの転位を助けるアミノ末端シグナルペプチドを含む。メジャーサブユニット蛋白のいずれも、システィン残基を含まないが、６つのシスティン残基の数および位置は、マイナーサブユニットのすべてについて保存されるが、ただしこれら６つの残基の４つのみを含むＹ．ｐｅｓｔｉｓホモログ３８０２を除く。
【００１２】
タイプＩおよびＰ采は、古典的なシャペロン・アッシャー経路により構成される遺伝子的および構造的な詳細を明らかにするのに有用なモデルを有している（非特許文献２３、２４、２５）。この研究で得られたものは、ドナー鎖相補性の原則の開発であり、そのプロセスでは、采サブユニットが、必須の消失したβ鎖の反復するサブユニット間の共有により相接するサブユニットと非共有結合的に結合する（非特許文献２２、２６）。証拠は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ血液凝固ピリ線毛の折り畳みおよび４基立体配座の完全性（非特許文献２８）そしてＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ被膜蛋白、非采蛋白ポリマー（非特許文献２９）においてこの同じメカニズムを示唆している。これらの構造の両者は、古典的なシャペロン・アッシャー経路により構成されるタイプ１およびＰ采の遠いクラス１関連物である。進化的見地から、これは、ドナー鎖相補性のメカニズムが、それからこのクラスの現存の采が誘導された原始的な采システムで生じたことを示唆している。ドナー鎖相補性は、非共有結合的に結合したポリマー性の表面蛋白に関する蛋白折り畳みの問題に賢明な生物学的答えをもたらすが、古典的なアッシャー・シャペロン経路のそれら以外のアドヘシン采によるその応用は、立証されていない。
【００１３】
【非特許文献２２】Ｖｉｂｏｕｄ， Ｇ． Ｌ， Ｍ． Ｍ． ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ａ． Ｈｅｌａｎｄｅｒ， ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ． １９９６． Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃａｃｏ−２ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ． Ｍｉｃｒｏｂ Ｐａｔｈｏｇｅｎ ２１：１３９ １４７．
【非特許文献２３】Ｋｕｅｈｎ ＭＪ， Ｊ． Ｈｅｕｓｅｒ， Ｓ． Ｎｏｒｍａｒｋ ａｎｄ ＳＪ． Ｈｕｌｔｇｒｅｎ． １９９２． Ｐ ｐｉｌｉ ｉｎ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｒｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｆｉｂｒｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｔｉｐｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３５６：２５２−５．
【非特許文献２４】Ｓａｕｅｒ ＦＧ， Ｋ． Ｆｕｔｔｅｒｅｒ， Ｊ．Ｓ． Ｐｉｎｋｎｅｒ， Ｋ．Ｗ． Ｄｏｄｓｏｎ， ＳＪ． Ｈｕｌｔｇｒｅｎ ａｎｄ Ｇ． Ｗａｋｓｍａｎ． １９９９． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｉｌｕｓ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１０５８−６１．
【非特許文献２５】Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｄ， Ａ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｖ． Ｓｔｏｊａｎｏｆｆ， ｅｔ ａｌ． Ｘ−ｒａｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｄｈｅｓｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｒｏｍ ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ９９９；２８５：１０６１ ６．
【非特許文献２６】Ｂａｒｎｈａｒｔ ＭＭ， Ｐｉｎｋｎｅｒ ＪＳ， Ｓｏｔｏ ＧＥ， ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｖｅｒ： ＰａｐＤ−ｌｉｋｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｉｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ２０００；９７：７７０９−１４．
【非特許文献２７】Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ Ｈ， Ｄ．Ｐ． Ｂａｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｊ．Ｒ． Ｓｃｏｔｔ． １９９６． Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＳｌ ｐｉｌｉ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２１ ：５２９−４１．
【非特許文献２８】Ｋｒａｓａｎ ＧＰ， Ｓａｕｅｒ ＦＧ， Ｃｕｔｔｅｒ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｐｉｌｉ． ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０００；３５：１３３５−４７．
【非特許文献２９】Ｚａｖｉａｌｏｖ ＡＶ， Ｋｅｒｓｌｅｙ Ｊ， Ｋｏｒｐｅｌａ Ｔ， Ｚａｖ’ｙａｌｏｖ ＶＰ， Ｍａｃｌｎｔｙｒｅ Ｓ ａｎｄ Ｋｎｉｇｈｔ ＳＤ． Ｄｏｎｏｒ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｎｏｎ−ｐｉｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． ＭｏＩ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２；４５：９８３−９９５．
【００１４】
別のシャペロン経路および古典的なシャペロン・アッシャー経路により構成される采に共通なのは、サブユニットの間違った折り畳みおよび外側の膜における重合を行うアッシャー蛋白を排除するためのペリプラスムシャペロンの必要性である。これらの異なる経路の采アセンブリおよび構造成分が配列の類似性をもたないことは、それらが収斂進化の経路を経て生じてきたことを示す。それにもかかわらず、ＣＦＡ／Ｉ構造サブユニットのコンピューターによる分析は、ドナー鎖相補性がまたシャペロンサブユニットおよびサブユニット・サブユニット相互作用を支配しているかもしれない可能性を示唆している。
【００１５】
８つのＥＴＥＣクラス５采は、３つ（ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４およびＣＳ１４）、４つ（ＣＳ１、ＰＣＦＯ７１、ＣＳ１７およびＣＳ１９）および１つ（ＣＳ２）のメンバーの３つのサブクラスに分類された（それぞれ、サブクラス５ａ、５ｂおよび５ｃとする）（非特許文献２１）。従来の報告は、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４およびＣＳ１９を有するＥＴＥＣが、培養されたＣａｃｏ−２細胞に付着性を有することを立証した（非特許文献６，２２）。しかしながら、ＣＦＡ／ＩおよびＣＳ１のサブユニットのどの成分が付着を媒介するかについて、相反するデータが発表されている（非特許文献１９、２０）。
【００１６】
どの采成分が付着を媒介するのに関係しているかというこの疑問へのアプローチは、２つの異なる生体外の付着モデルにおける、未変性のＣＦＡ／Ｉ采、ＣｆａＢ（メジャーサブユニット）に対する抗体の付着阻害活性、そしてＣｆａＥ（マイナーサブユニット）の重複しないアミノ末端（残基２３−２１１）およびカルボキシ末端（残基２１２−３６０）の半分に対する抗体の付着阻害活性を評価することであった。ＣＦＡ／Ｉ付着の最も重要なドメインがアドヘシンＣｆａＥのアミノ末端の半分にあることが立証された（非特許文献２１）。
【００１７】
上記に簡単に記載された研究は、ＣＦＡ／Ｉおよび他のクラス５采のマイナーサブユニットが、受容体結合部分である証拠を提供している（非特許文献２０，２１）。これらの観察と一致して、采サブクラス５ａおよび５ｂ内で観察されるマイナーサブユニットの配列のダイバージェンスが低いレベルであるため（非特許文献２０）、進化の関係は、これらの２つのサブクラスのそれぞれを現すマイナーサブユニットのアミノ末端の半分に対する抗体の交差反応性と相関した（非特許文献２１）。これらの研究は、クラス５采のマイナーサブユニットが、抗付着免疫性を誘導するのに遙かに有効であり、そのため保護的抗体を誘導する重要な免疫原であることを強く示唆している（非特許文献２１）。
【００１８】
抗下痢ワクチンは、ＥＴＥＣにより生ずる下痢を含む下痢疾患に対する保護を付与する好ましい方法であろう。しかし、有効なワクチンを構築し承認することの複雑さのために、体内に保護を生ずる他の方法が探索されてきている。下痢の予防にかなり有望であるとされた手段は、下痢を起こす腸管病原体に対する免疫グロブリンの受動かつ経口の投与である。ＥＴＥＣ、Ｓｈｉｇｅｌｌａおよびロタウイルスに対する活性を有する製品は、抗クリプトスポリジウム症牛乳免疫グロブリン（ＢＩｇＧ）製品によるコントロールスタディで下痢を予防することを示している（非特許文献３０−３３）。その上、好ましい有望な結果は、抗クリプトスポリジウム症ＢＩｇＧ製品によるこのアプローチを使用して観察されている（非特許文献３４、３５）。
【００１９】
【非特許文献３０】Ｔａｃｋｅｔ， ＣＯ．， Ｇ． Ｌｏｓｏｎｓｋｙ， Ｈ． Ｌｉｎｋ， ａｎｄ Ｍ．Ｍ． Ｌｅｖｉｎｅ． １９８８． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｌｋ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ ｏｒａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ． Ｍｅｄ． ３１８： １２４０−１２４３．
【非特許文献３１】Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｇ．Ｐ．， Ｐ．Ｂ． Ｗｈｙｔｅ， Ｅ． Ｄａｎｉｅｌｓ， ｅｔ ａｌ． １９８９． Ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｂｏｖｉｎｅ ｃｏｌｏｓｔｒｕｍｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ． Ｌａｎｃｅｔ ２： ７０９−７１２．
【非特許文献３２】Ｔａｃｋｅｔ， ＣＯ．， Ｓ． Ｂ． Ｂｉｎｉｏｎ， Ｅ． Ｂｏｓｔｗｉｃｋ， Ｇ． Ｌｏｓｏｎｓｋｙ， ＭＪ． Ｒｏｙ ａｎｄ Ｒ． Ｅｄｅｌｍａｎ． １９９２． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｉｌｌｎｅｓｓ ａｆｔｅｒ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ａｍ Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ． ４７：２７６−２８３．
【非特許文献３３】Ｆｒｅｅｄｍａｎ， ＤＪ． ＣＯ． Ｔａｃｋｅｔ， Ａ． Ｄｅｌｅｈａｎｔｙ， Ｄ．Ｒ． Ｍａｎｅｖａｌ， Ｊ． Ｎａｔａｒｏ， ａｎｄ Ｊ．Ｈ． Ｃｒａｂｂ． １９９８． Ｍｉｌｋ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｃａｎ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｒａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７７：６６２−６６７．
【非特許文献３４】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， Ｐ．Ｄ．， Ｊ．Ｐ． Ｃｅｌｌｏ． １９９６． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ｄｉａｒｒｈｅａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ ｗｉｔｈ ｏｒａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＩＤＳ． Ｊ． Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ １３：３４８−３５４．
【非特許文献３５】Ｏｋｈｕｙｓｅｎ， Ｐ．Ｃ． ＣＬ． Ｃｈａｐｐｅｌｌ， Ｊ． Ｃｒａｂｂ， Ｌ．Ｍ． Ｖａｌｄｅｚ， Ｅ．Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓｓ ａｎｄ Ｈ．Ｌ． ＤｕＰｏｎｔ． １９９８． Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ａｎｔｉ−Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅ ｃｏｌｏｓｔｒｕｍｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ ２６：１３２４−１３２９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、本発明の目的は、ＥＴＥＣ感染症に対する予防的保護を提供することのできる免疫グロブリンサプリメントである。マイナーサブユニット（アドヘシン）が、付着に直接関係のある采成分であることから、抗アドヘシン抗体の投与は、未変性の采または未変性の細菌に対して生じた抗体よりも明らかに大きな保護を付与するものと思われる。その上、本発明の他の目的は、抗アドヘシン免疫グロブリンを含む、ＥＴＥＣに対する受動予防処方物を製造する方法である。免疫グロブリンの製法における組み換えマイナー采サブユニットポリペプチドの使用は、未変性の采または細胞全体の使用よりも抗体の収量の増加並びに標準化をもたらすだろう。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
ワクチンは、潜在的に下痢の脅威にさらされる人々に抗下痢保護を付与する好ましい方法である。しかし、ＥＴＥＣに対して現在承認された有効なワクチンは存在しない。そのため、体内の保護手段は、ワクチンが開発されるまで、ウシまたは他の乳生産動物の初乳または乳から誘導された抗アドヘシン免疫グロブリンサプリメントの形の経口受動保護の投与である。
【００２２】
本発明の目的は、クラス５エンテロトキシン生成大腸菌采アドヘシンに特異的な抗大腸菌抗体予防処方物である。
【００２３】
本発明の他の目的は、ＣｆａＥおよびＣｓｂＤを含むクラス５大腸菌采アドヘシンに特異的な抗大腸菌抗体予防処方物を使用して受動免疫を付与する方法である。
【００２４】
本発明の他の目的は、クラス５采アドヘシンに特異的な抗大腸菌抗体を含む食品サプリメントを投与することにより、エンテロトキシン生成大腸菌に対する受動免疫を付与する方法である。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、家畜動物例えばウシに組み換えアドヘシンポリペプチドを投与することによって抗大腸菌アドヘシン乳抗体を製造する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ワクチンは、ＥＴＥＣにより生ずる下痢に対する長期の保護のための好ましい予防手段である。しかし、有効なワクチンの開発は、典型的に難しくそして時間が要する。その上、有効なＥＴＥＣワクチンが開発された後でも、ＥＴＥＣにより生ずる下痢に対する保護は、適切な投与方法が完成するまで、付与されない。それゆえ、受動予防手段をとるのに有効、安全かつ容易である必要がある。例えば、特に有望なアプローチは、牛乳免疫グロブリン（ＢＩｇＧ）製品の使用である（非特許文献３０−３３）。
【００２７】
ＣＦＡ／Ｉ構造サブユニットのコンピューターによる分析は、ドナー鎖相補性が、シャペロン・サブユニットおよびサブユニット・サブユニットの相互作用を支配することを示唆している。クラス５采のメジャーサブユニットは、β鎖を形成すると予想される非常に保存されたアミノ末端全体と共通する（図１）。その予想された構造および位置に基づいて、β鎖様構造は、アルファ鎖の軸に沿う隣接したメジャーサブユニット（例えばＣｆａＢ）、および采の先端のアドヘシン（例えばＣｆａＥ）に寄与する。ＣｆａＢおよびそのホモログのアミノ末端β鎖の非常に保存された性質は、タイプＩ采サブユニットのアミノ末端が、フィラメントのアセンブリの交換されたドナー鎖として機能する先例とともに、非共有結合的にＣＦＡ／Ｉサブユニットを結合するドナーβ鎖の良い候補として、これを示唆した。
【００２８】
ＥＴＥＣ采（ＥＴＥＣ ｆｉｍｂｒｉａｅ）は、遺伝子的および構造的な分析に基づいて分類され、そして疾患に関連する多くの采は、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１７およびＣＳ２を含むクラス５采の群に入る。クラス５采のアドヘシンは、それぞれ、認識可能な属に属するものとしてこれらのメンバーを明らかに区別する顕著な特徴を共有する。クラス５采は血清学的に区別可能であるが、それらは、それらがメジャーの柄形成サブユニット（例えばＣＦＡ／ＩのＣｆａＢ）およびマイナーの先端に位置するサブユニット（例えばＣＦＡ／ＩのＣｆａＥ）（われわれが小腸のアドヘシンとして働くことを見いだした）からなることで、同様なアーキテクチャーを有する。メジャーサブユニットおよびマイナーサブユニット（例えば采アドヘシン）のアミン酸配列の比較は、メジャーサブユニットに関する表１およびアドヘシン分子に関する表２に示されているように、強いアミノ酸配列の相関並びに配列の相同関係を明らかに示す。表１および表２において、影の領域は残基の類似性を示し、そして影のない領域は、残基の同一性を示す。表２に示されているように、采アドヘシンは、メジャーサブユニットと同じく、４７％から９８％に及ぶ高いレベルの残基の同一性を示す。さらに、采アドヘシンは、顕著なアミノ酸配列の保存を有し、メジャーサブユニットおよびマイナーサブユニットの両者のカルボキシ末端ドメインにおいて保存された構造モチーフ（すなわちベータ−ジッパーモチーフ）を含む。この構造は、これらの蛋白のＣ末端ドメインがサブユニット・サブユニットの相互作用に含まれることを示す。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
ＥＴＥＣ抗原の開発において、われわれは、立体配座が安定なコンストラクトを提供し、その場合ＣｆａＢのアミノ末端ドナーβ鎖がＣｆａＥのシス（ｉｎ ｃｉｓ）カルボキシ末端エクステンションを提供してこの分子に立体配座の安定性およびプロテアーゼ抵抗性をもたらし、ヒト赤血球を結合できる可溶性のモノマーを形成する。共通の構造モチーフを同定するために、クラス５ＥＴＥＣ采のメジャーおよびマイナーのサブユニットの８つのホモログのアミノ酸配列の複数の列を生じさせた。二次構造の予想アルゴリズムは、両方のサブユニットがそれらの長さに沿ってβ鎖の分布に富む両性の構造を形成することを指示する。共通マイナーサブユニット配列の２６％は、１７の散在するβ鎖からなるβ立体配座に折り畳まれるものと推測され、それは疎水性の芯を形成するものと予想されるだろう。サケラリス（Ｓａｋｅｌｌａｒｉｓ）らは、アミノ酸の全体が、采のサブユニット・シャペロンの相互作用に役割をはたすクラスＩ采サブユニットのそれに類似するβ−ジッパーモチーフを形成することを既に示唆している（非特許文献２７）。
【００３２】
以下の例では、ＣｆａＢからのドナー鎖を使用してＣｆａＥ免疫原の生成を開示している。しかし、当業者は、この記述に従ってコンストラクトを操作して、他のアドヘシンコンストラクト例えばＣｓｂＤ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤおよびＣｏｔＤと関連する他のクラス５メジャーサブユニットからのドナー鎖を使用して免疫原として働かせるものと思われる。メジャークラス５采サブユニットは、サブユニットのアミノ酸配列ドナーサブユニットに相当する対応する配列番号とともに表３にリストされる。表４は、クラス５アドヘシンのアミノ酸配列およびそれらのそれぞれの配列番号をリストする。
【００３３】
【表３】
【００３４】
【表４】
【００３５】
本発明の態様の１つは、ＥＴＥＣ細菌のクラス５采アドヘシンに対する受動予防物の製造方法である。特定のクラス５采アドヘシンを使用する実施例は、本発明を説明するために提供される。しかし、他のクラス５采アドヘシンおよびそれらの関連するメジャーサブユニットも当業者により利用できる。
【実施例１】
【００３６】
（抗ＣｆａＥウシ免疫グロブリンの製造）
上記のように、ＣｆａＢおよびそのホモログのアミノ末端β鎖の非常に保存された性質は、タイプＩ采サブユニットにおける他の構造／機能の研究とともに、ＣＦＡ／Ｉサブユニットを結合するドナーβ鎖の良い候補としてこの構造を示唆していた。マイナーアドヘシンサブユニットに関するこの仮説をテストするために、プラスミドは操作されて、可撓性のヘアピンリンカー（ＤＮＫＱ 配列番号１０）次にＣｆａＢのアミノ酸配列からなるＣ末端エクステンションを含むＣｆａＥ変異型を発現した（図２）。少なくとも１２から約１９のアミノ酸のＣｆａＢドナー鎖の長さが、ＣｆａＥの測定可能な回収を得る必要があることが分かった。突然変異がβ鎖を破壊するために導入される１２−１９アミノ酸ドナー鎖を含むコンストラクトを使用する研究において、β鎖がＣ末端アミノ酸エクステンションにより達成される観察された安定性に重要であることが立証された。シスのＣｆａＢによるＣ末端β鎖がシャペロン（例えばＣｆａＡ）アドヘシンコンプレックスの形成を除外することがさらに分かった。
【００３７】
この例では、組み換えＣｆａＥ抗原は、ＣｆａＥポリペプチド配列（配列番号１１）を融合し、配列番号１のアミノ酸１−１９に相当する１９アミノ酸ＣｆａＢドナー鎖にそのＣ末端で次に結合されるリンカーポリペプチド（配列番号１０）のＮ末端アミノ酸配列へ配列番号１８のヌクレオチド配列をエンコードすることによって、構築された。配列番号１０がリンカーとして利用されたが、配列番号１２および１３を含む他のアミノ酸配列も使用できることが分かった。この例では、使用されるＣｆａＢメジャーサブユニットドナー鎖は、配列番号２０のヌクレオチド配列によりエンコードされる配列番号１に示される。しかし、１２−１９アミノ酸のドナー鎖が有意なＣｆａＥ回収に好適であるという観察に基づいて、１２−１９アミノ酸を含む組み換え抗原が利用できる。同様に、アミノ酸配列が抗ＣｆａＢ采法エピトープを含む限り、配列番号１１のすべてまたは一部を含む組み換えペプチドが構成できる。
【００３８】
１９アミノ酸メジャーサブユニット鎖を含むＣｆａＥコンストラクトは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、生体外組み換えによりまずＣｆａＥをプラスミドベクター中に挿入することによって構成された。以下の配列を有するプライマーは、ｐＤＯＮＲ２０７（商標）；ｄｓｃ−ＣｆａＥ１３−１（前方）、５′−ＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＴＡＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣ−３′（配列番号１４）；およびｄｓｃ−ＣｆａＥ１３−２（逆）、５′−ＴＣＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＴＡＧＣＴＧＴＴＡＣＡＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧ−３′（配列番号１５）中への最初のクローニングに使用された。ａｔｔＢ組み換え部位を隣接するＰＣＲ生成物は、ＧａｔｅｗａｙＢＰ（商標）反応を使用してドナーベクターｐＤＯＮＲ２０１（商標）（Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）中にクローンされて、エントリーベクターｐＲＡ１３．２を生じた。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ（商標）反応では、遺伝子配列は、ｐＲＡ１３．２から、変性された発現ベクターｐＤＥＳＴ１４−Ｋｎ′（Ｔ７プロモーターからの未変性発現のためのベクター）中にさらにサブクローンされて、プラスミドｐＲＡ１４．２を生じた。ｐＤＥＳＴ１４−Ｋｎ′ベクターは、カナマイシン抵抗によりアンピシリンを置換することによりｐＤＥＳＴ１４（商標）（Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を変性することにより構成された。正確なＣｆａＥの存在は、配列の分析によって確認された。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＳＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｂａｄ、ＣＡ）を、ｐＲＡ１４．１および関連するＣｆａＥドナーサブユニット相補性コンストラクトの発現に使用した。
【００３９】
上記の方法は、ＣｆａＥ／ドナー鎖組み換えコンストラクトを構成するのに利用された。しかし、他のアドヘシン分子を含むコンストラクトも構築でき、表１にリストされたメジャーサブユニットから適切なドナー鎖と関連して、マイナーサブユニットＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ，ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤを含む。例えば、組み換えＣｓｂＤコンストラクトは、配列番号２１のヌクレオチド配列をエンコードするポリペプチド配列配列番号６のＣｓｂＡメジャーサブユニットドナー鎖に、配列番号１０のリンカーポリペプチドを経て、Ｃ末端で融合した配列番号２２のすべてまたは一部からなるＣｓｂＤポリペプチド配列からなるようにデザインされた。
【００４０】
（大きなスケールによる抗原生産のためのｐＥＴ／アドヘシンコンストラクトの開発）
ｄｓｃ１９ＣｆａＥをエンコードするＤＮＡコンストラクトは、ＣｆａＢドナー鎖の後にカルボキシ末端ポリヒスチジン尾部を配合する変異型ＣｆａＥコンストラクトをエンコードするために、次にｐＤＥＳＴ１４（商標）ベクターから除去され、そしてｐＥＴ２４（ａ）（商標）中に挿入された。このコンストラクトは、配列番号２４のポリペプチド配列を有し、ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６と命名され、そして配列番号２３のヌクレオチド配列によりエンコードされる。
【００４１】
ｄｓｃ１９ＣｆａＥ挿入断片の構築は、Ｎｄｅｌ含有前方プライマーおよびＸｈｏｌ含有逆プライマー（それぞれ、配列番号１６および１７）を使用してポリメラーゼ鎖反応によりｐＤＥＳＴ１４ベクターを増幅することにより実施された。ｄｓｃ１９ＣｆａＥコード領域は、Ｎｄｅｌ／Ｘｈｏｌ制限ｐＥＴ２４ａプラスミド中に指向して連結された。ｐＥＴ２４ａ（商標）プラスミドを含む挿入断片は、ＮｏｖａＢｌｕｅ−３（商標）ＢＬ２１（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）Ｂｒａｎｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）細菌を形質転換するのに使用された。形質転換されたコロニーは、次にプラスミド含有細菌を増殖するために選択かつ再培養された。選択されたコロニーからのプラスミド挿入断片を次に配列決定した。これらのプラスミドを次にＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｇｅｎ（商標）Ｂｒａｎｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）感応細胞中に挿入しそしてＤＮＡ挿入断片の配列を確認した。
【００４２】
コンストラクトｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６に使用された方法と同様に、ｄｓｃ１９ＣｓｂＤをエンコードするＤＮＡコンストラクトを、またｐＥＴ２４ｇ（商標）中にＣｓｂＤおよびＣｓｂＡドナー鎖配列に挿入することにより行った。このコンストラクトは、配列番号２６のポリペプチド配列を有しそして配列番号２５のヌクレオチド配列によりエンコードされる。コンストラクトをデザインするのに使用されるＣｓｂＡからのドナー鎖配列は、配列番号６として開示されている。ＣｆａＥコンストラクトと同様に、配列番号６のアミノ酸１−１９に相当するＣｓｂＡからの１９アミノ酸配列を使用した。しかし、１２アミノ酸から１９アミノ酸に及ぶドナー鎖配列も使用できる。
【００４３】
（ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６の生成）
多数の成長条件および培地を、（ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６または他のアドヘシン／ドナー鎖コンストラクトの大きな生成のために利用する。例えば、培養の開始は、１−４時間、３２−２５℃の誘導温度で１．０μＭから１．０ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して行うことができる。この実施例では、ＬＢ培地は、３時間３２℃で１．０μＭ ＩＰＴＧの濃度で利用された。しかしながら、ＡＰＳ（商標）および他の培地の処方も使用できる。ｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６または他の組み換えアドヘシンコンストラクトは、Ｎｉカラムで精製される。コンストラクトの収量は、培地１Ｌあたり少なくとも０．４５−０．９ｍｇの蛋白である。
【００４４】
（ＢＩｇＧの製造）
組み換え抗原に対する抗体は、ホルスタインを含む家畜の初乳または乳で精製される。それぞれ５００μｇの抗原を含む２ｍＬの量での合計３つの筋肉内ワクチン接種は、単一の部位で投与される。ワクチン接種は、分娩１−２週間前の最後の接種とは互いに約３週間離れて行われる。分娩時に、初めの４つの搾乳を集め、量を計りそしてサンプルを酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）により抗アドヘシン抗体についてテストした。図３は、抗ＣＦＡ／Ｉ ＢＩｇＧおよび抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧ製品の反応性を示す。ＣＦＡ／Ｉ ＢＩｇＧは、ＥＬＩＳＡにより抗ＣｆａＥよりも高いレベルのＣＦＡ／Ｉ抗原に対する反応性を生ずる（図３Ａ）。これは、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するのに使用されるＣＦＡ／Ｉ抗原が主としてＣｆａＢメジャーサブユニットから作られそしてＣｆａＢマイナーサブユニットはマイナー成分としてのみ存在するという事実による。予想されるように、抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧ製品は、ＡＥＭＩまたは抗ＣＦＡ／ＩＢＩｇＧに比べてＣｆａＥと遙かに強い反応性を有する（図３Ｂ）。これは、ＣｆａＥによるウシの免疫化がアドヘシンＣｆａＥに対する抗体の発生を極めて増大させることを確認させる。
【００４５】
集めた生成物のさらなる処理を行うことができる。例えば、凍結した乳をチーズ製造工程により分画してカゼインを除く。最も免疫グロブリンを含む乳清区分を次にチーズカードから取りだしそして標準の乳製品製造の条件下で殺菌する。免疫グロブリンに富む乳清を次に濃縮しそして残存する乳脂肪を室温で遠心分離により除く。次に、リン脂質および非免疫グロブリン蛋白を取り出す（特許文献１）。最終の生成物を次に固体分１５−２０％に濃縮しそして塩を３回の緩衝液の交換に対する連続的透析濾過により除く。最終の生成物を次にＥＬＩＳＡによりテストする。
【００４６】
【特許文献１】Ｒｕｃｈ， Ｆ．Ｅ．， Ｅ．Ａ． Ａｃｋｅｒ． １９９８． Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７４７，０３１ ｔｏ ＩｍｍｕＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．
【００４７】
ＥＴＥＣ抗原に対するＢＩｇＧの抗体反応性の特徴を現すことに加えて、抗体の機能的活性を評価した。ＣＦＡ／Ｉに関する１つ以上の受容体が規定されていないため、生体外での標的細胞に対するＥＴＥＣのアドヘシンに関する代理アッセイを使用した。或る采（ＣＦＡ／Ｉを含む）を発現するＥＴＥＣは、マンノース抵抗性血液凝集アッセイ（ＭＲＨＡ）においてヒトおよび／またはウシの赤血球に付着しそして凝集する。これを、標的の真核生物の上皮細胞に対するＥＴＥＣの細胞全体、采または采の精製したマイナーサブユニットのアドヘシンのための代替マーカーとして使用される。血液凝集阻害（ＨＡＩ）として記述されるこの現象は、標的細胞へのＥＴＥＣのアドヘシンを中和できる抗体のインディケーターである。
【００４８】
図４では、ヒトの赤血球は、マンノース抵抗性方法（ＭＲＨＡ）においてＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４またはＣＳ１４を発現するＥＴＥＣにより凝集された。このＭＲＨＡは、抗ＣＦＡ／Ｉ ＢＩｇＧまたは抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧにより細菌の前インキュベーションにより阻害できる。図４に示されるように、抗ＣＦＡ／Ｉ ＢＩｇＧまたは抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧの両者は、凝集するヒト赤血球から相同の采を発現するＥＴＥＣの能力を阻害できる抗体を含んだ。図４は、異なるコロニー化ファクターを発現するＥＴＥＣによりウシ赤血球の中和する凝集に必要なＢＩｇＧの力価（ｍｇ ＩｇＧ／ｍＬとして示される）を示す。テストされたＢＩｇＧ生成物の濃度は、ＩｇＧの最低の濃度が両方の生成物で等しいように調節された。そのため、データは、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ４またはＣＳ１４采を発現するＥＴＥＣによりＭＲＨＡを阻害するのに必要なＩｇＧの濃度として示される。ＢＩｇＧ粉末に存在するウシＩｇＧの約１４−１７μｇ／ｍＬが、ＭＲＨＡを阻害するのに生体外で必要である。
【００４９】
強い阻害活性は、予想されるように抗ＣＦＡ／Ｉによりもたらせられ、同等のレベルの阻害は、抗ＣｆａＥによりもたらせられる。重要なのは、抗ＣＦＡ／Ｉおよび抗ＣｆａＥの両者が、ＣＳ４およびＣＳ１４に対する結合阻害の交差反応性を示すことである。これは、抗ＣｆａＥ予防抗体が他の関連する抗原に対する保護を付与するのに有用性を有することを説明する。
【実施例２】
【００５０】
（抗ＣｆａＤ（ＣＳ１７）ウシ免疫グロブリンの製造）
他のクラス５采アドヘシンの使用は、また顕在化する保護的受動抗体の生成として考えられる。さらなる説明として、ＣＳ１７（すなわちＣｓｂＤ）に対する抗体による阻害の結果が図５に示される。抗体を顕在化するのに使用される抗原は、ＣｓｂＤポリペプチド（配列番号２２）発現コンストラクトであった。コンストラクトは、上記の実施例１のＣｆａＥに関するそれと同様に操作されたが、ＣｓｂＤ（配列番号１９）をエンコードするヌクレオチド配列を用いた。コンストラクトは、ｄｓｃ１９ＣｓｂＤ［Ｈｉｓ］６と命名された。ドナー鎖は、ＣｓｂＡ（配列番号７）の１９アミノ酸からなった。
【００５１】
図５で分かるように、ＣｆａＥに関するそれと同様に、ＣｓｂＤに対する抗体は、ＭＲＨＡを阻害するのに非常に能率的であった。また、ＣｆａＥについて観察されたそれと同様に、抗ＣｓｂＤ抗体もＣＳ４およびＣＳ２に対して交差保護をあたえる。
ＣＳ１７およびＣｓｂＤに対するＢＩｇＧの機能的活性も、図４におけるように、評価された。これらの結果は、図６に画かれる。抗ＣｆａＥおよび抗ＣＦＡ／Ｉについて観察されるそれと同様に、ＣＳ１７およびＣｓｂＤの両者に対するＢＩｇＧは、顕著な阻害活性を示した。
【００５２】
しかし、抗ＣＳ１７ＢＩｇＧに比べて、抗ＣｆａＥ ＢＩｇＧ、抗ＣｓｂＤについて異型の抗原に対してもさらに顕著な阻害活性が示された。これらの観察は、ＣｆａＥについて観察されたそれとともに、クラス５アドヘシン属内の制限された数の種のみが、有効な受動保護に必要であると思われる。
【実施例３】
【００５３】
（ＥＴＥＣ采アドヘシンの特異的な域が免疫活性および安定性に重要である）
ｄｓｃＣｆａＥの結晶学的分析は、２つのドメイン、すなわちアドヘシン分子のアミノ末端セグメントにより形成されたアドヘシンドメインおよびＣ末端ピリ線毛ドメインからなる。２つのドメインは、３つのアミノ酸リンカーにより分離されている。采アドヘシンのこれらの域を理解する試みにおいて、アミノ酸置換の所在そして次の免疫反応性を分析した。ＣｆａＥにおけるアラニンによるアルギニン６７またはアルギニン１８１の置換が分子の生体外の付着表現型を排除することが分かった。これらのアミノ酸の位置は、ドメインのアミノ末端の遠位の位置に存在する残基Ａｒｇ１８１を有する分子の暴露された域にある。従って、ＣｆａＥのこの域および他の采アドヘシンの対応する域は、有効な免疫の誘導に重要である。表３は、８つのアドヘシンの位置を要約する。また表３に示されているのは、采アドヘシン分子の構造的安定性を付与するのに、結晶学的分析に基づいて重要性を増すドメインのその域である。
【００５４】
【表５】
【００５５】
未変性采アドヘシン分子のアドヘシンドメインの安定化は、メジャーサブユニットにより提供される。しかしながら、ピリ線毛のドメインなしに、采アドヘシンは、免疫反応性の随伴する保持により未変性分子よりも大きな立体配座の安定性を示す。未変性アドヘシン分子の投与の代わりに、アドヘシンドメインのみの投与は、抗采アドヘシン抗体のための別の免疫原である。それゆえ、例として、ＣｆａＥ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤアドヘシンドメインをエンコードするがピリ線毛ドメインを含まない組み換えアドヘシンドメインコンストラクトは、アドヘシンドメインのポリメラーゼ鎖反応増幅により構築されそしてｐＥＴ２４ａ（商標）中に挿入された。組み換え生成物のアミノ酸配列は、配列番号３５，３６および３７に示されている。実施例１および２におけるようにポリヒスチジン尾部の配合は、次の発現された生成物の精製を助ける。
【実施例４】
【００５６】
（ＥＴＥＣに対する予防としての抗采アドヘシンの投与）
クラス５采アドヘシンは、ＥＴＥＣ感染に対する予防保護の開発に使用できる。保護は、采アドヘシンそして未変性または組み換え大腸菌アドヘシンのいずれかの免疫ウシから初乳または乳製品を集めることによりもたらさられる。免疫化は、任意の数の方法によることができる。しかし、最良の方法は、それぞれ５００μｇ以下の該アドヘシンを含む１−２ｍＬの量を用いて、分娩１−２週間前の最後の投与から互いに３週間隔てた３回の筋肉内投与である。乳または初乳の採取は、任意のときでよいが、しかし、最適な結果を得るのは、採取が分娩１−２週間前になされたものである。
【００５７】
予防としての抗アドヘシンウシ免疫グロブリンの投与は、０．１ｇのＩｇＧ／投与から２０．０ｇのＩｇＧ／投与の摂取である。抗アドヘシンウシ初乳または乳の免疫グロブリンは、単独でまたは多数の飲料または食品例えばキャンディーと混合されて摂取される。免疫グロブリンは、また錠剤またはカプセルの形にされそして摂取できる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】クラス５采のメジャー構造サブユニットにおける非常に保存されたβ鎖モチーフを示す。これは、以下に示される共通配列を有するメジャーサブユニットの成熟型のアミノ末端の複数の配列である。この範囲は、中断されたβ鎖モチーフを含む残基５−１９を形成するものと予想される。また示されているのは、関連するポリペプチドの配列番号である。略称、Ｂｃｅｐ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ；Ｓｔｙｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ；Ｕ、疎水性残基；ｘ、任意の残基；Ｚ、ＥまたはＱ。
【図２】パネルＡ、長さが１０−１９残基変化するＣｆａＢのＮ末端β鎖範囲からなるＣ末端エクステンションを有する独立したＣｆａＥ変異型コンストラクトのドメインを示す概略ダイアグラムである。それぞれのコンストラクトは、未変性のＣｆａＥ配列のＣ末端とドナーβ鎖との間に挿入された短い可撓性のリンカーペプチド（ＤＮＫＱ）を含む。垂直の矢印は、プロリン（Ｖ７Ｐ）の何れかに変性されて二次β鎖モチーフを中断したドナー鎖バリンを示す。パネルＢ、ＣｆａＥを発現するように操作された一連の種および成熟ＣｆａＢのアミノ末端範囲の異なる長さを有するシスに相補された変異型からのペリプラスム濃縮物のウエスタンブロット分析である。使用された一次抗体製品は、ＣｆａＥに対するポリクローナルウサギ抗体であった。レーンは以下のコンストラクトからの製品に相当する。レーン１、ｄｓｃ１０ＣｆａＥ；２，ｄｓｃ１１ＣｆａＥ；３、ｄｓｃ１２ＣｆａＥ；４、ｄｓｃ１３ＣｆａＥ；５、ｄｓｃ１３ＣｆａＥ［Ｖ７Ｐ］；６、ｄｓｃ１４ＣｆａＥ；７、ｄｓｃ１６ＣｆａＥ；８、ｄｓｃ１９ＣｆａＥ；９，ＣｆａＥ。分子量マーカー（ｋＤ）は、左に示されている。パネルＣ、短いリンカー配列（すなわちＤＮＫＱ）、成熟ＣｆａＢのＮ末端からの１９残基ドナー鎖および末端６ヒスチジンアフィニティタグからなるそのＣ末端でのエクステンションを有する、未変性ＣｆａＥ配列（Ｓｅｃ依存Ｎ末端シグナル配列を含む）を含有するｄｓｃ１９ＣｆａＥ（Ｈｉｓ）６の操作された成分の概略図である。
【図３Ａ】ＥＬＩＳＡによるＣＦＡ／Ｉ関連抗原のパネルを有する生成物の反応性を示す。
【図３Ｂ】ＥＬＩＳＡによるＣＦＡ／Ｉ関連抗原のパネルを有する生成物の反応性を示す。
【図４】ＢＩｇＧ抗ＳｆａＥに対する抗体の生体外の機能的活性を示す。
【図５Ａ】ＥＬＩＳＡによるＣＳ１７関連抗原のパネルを有する生成物の反応性を示す。
【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡによるＣＳ１７関連抗原のパネルを有する生成物の反応性を示す。
【図６】ＢＩｇＧ抗ＣｓｂＤの生体外の機能的活性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロトキシン生成大腸菌アドヘシン分子に対する初乳または乳免疫グロブリンからなることを特徴とする製薬組成物。
【請求項２】
該アドヘシン分子がクラス５采から誘導される請求項１の製薬組成物。
【請求項３】
該アドヘシン分子が、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤからなる群から選ばれる１つ以上の采マイナーサブユニットである請求項１の製薬組成物。
【請求項４】
ａ．１つ以上のクラス５大腸菌采アドヘシンまたはそのフラグメントからなる免疫原を牛乳生成家畜動物に投与する工程、
ｂ．該家畜動物から免疫グロブリン含有初乳または乳を集める工程
からなることを特徴とする請求項１の抗エンテロトキシン生成大腸菌組成物を製造する方法。
【請求項５】
該採集初乳または乳中の抗アドヘシン免疫グロブリンの濃度が、該受動予防の１投与あたり０．１ｇから２０．０ｇのＩｇＧに調節される請求項４の方法。
【請求項６】
該家畜がウシまたはヤギである請求項４の方法。
【請求項７】
該アドヘシンが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤからなる群から選ばれる請求項４の方法。
【請求項８】
該免疫原が、またＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡおよびＣｏｔＢからなる群から選ばれる１つ以上の大腸菌メジャー采サブユニットからなる請求項４の方法。
【請求項９】
該免疫原が、大腸菌采アドヘシンドメイン、並びに配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるポリヒスチジン尾部融合ポリペプチドである請求項４の方法。
【請求項１０】
該大腸菌采アドヘシンが、該大腸菌メジャー采サブユニットにそのＣ末端で操作可能に結合しているリンカーにそのＣ末端で結合している請求項８の方法。
【請求項１１】
該大腸菌采アドヘシンが、アドヘシンポリペプチドのモノマーまたはポリマーである請求項１０の方法。
【請求項１２】
該リンカーが、配列番号１０、１２および１３からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる請求項１０の方法。
【請求項１３】
該采アドヘシンが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤから選ばれる請求項１０の方法。
【請求項１４】
該メジャー采サブユニットが、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｓｄＡおよびＣｏｔＢからなる群から選ばれる請求項１０の方法。
【請求項１５】
該免疫原が、該大腸菌メジャー采サブユニットのＣ−末端で結合したポリヒスチジン尾部を含む請求項１０の方法。
【請求項１６】
該采アドヘシンが、配列番号１１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２またはこれらのフラグメントから選ばれるアミノ酸配列である請求項１３の方法。
【請求項１７】
該ＣｆａＥが、配列番号１８のヌクレオチド配列のすべてまたは一部によりエンコードされた配列番号１１のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる請求項１３の方法。
【請求項１８】
該ＣｓｂＤが、配列番号１９のヌクレオチド配列によりエンコードされた配列番号２２のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる請求項１３の方法。
【請求項１９】
該ＣｏｔＤが、配列番号３２のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる請求項１３の方法。
【請求項２０】
該大腸菌采アドヘシンが、配列番号１１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２からなる群から選ばれる配列のアミノ酸５８−１８５からなる請求項１３の方法。
【請求項２１】
該大腸菌采アドヘシンが、配列番号１１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２からなる群から選ばれる配列のアミノ酸１４−２０５からなる請求項１３の方法。
【請求項２２】
該メジャー采サブユニットが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選ばれるアミノ酸配列である請求項１４の方法。
【請求項２３】
該免疫原が、配列番号２３によりエンコードされた配列番号２４並びに配列番号２５および配列番号３４によりエンコードされた配列番号２６からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるポリヒスチジン尾部を含む融合ポリペプチドである請求項１５の方法。
【請求項２４】
該メジャー采サブユニットが、ヌクレオチド配列配列番号２０によりエンコードされた配列番号１のポリペプチド配列を有するＣｆａＢである請求項１７の方法。
【請求項２５】
該メジャー采サブユニットが、ヌクレオチド配列配列番号２１によりエンコードされた配列番号７のポリペプチド配列を有するＣｓｂＡである請求項１８の方法。
【請求項２６】
該メジャー采サブユニットが、配列番号９のポリペプチド配列を有するＣｏｔＡである請求項１９の方法。
【請求項２７】
ａ．乳産出動物の初乳または乳にアドヘシン特異性抗体を誘導するように未変性または組み換え大腸菌アドヘシンからなる免疫原を該乳産出動物に投与し、
ｂ．該アドヘシン特異性抗体を含む該初乳または乳を集め、
ｃ．１投与あたり０．１ｇから２０．０ｇのＩｇＧの投与量で、該牛乳抗アドヘシン免疫グロブリンの投与物を経口投与する
ことを特徴とするエンテロトキシン生成大腸菌に受動免疫を付与する方法。
【請求項２８】
該投与物が、飲料または食品中で該初乳または乳の抗アドヘシン免疫グロブリンを混合することにより投与される請求項２７の方法。
【請求項２９】
該投与物がカプセルまたは錠剤の形で投与される請求項２７の方法。
【請求項１】
エンテロトキシン生成大腸菌アドヘシン分子に対する初乳または乳免疫グロブリンからなることを特徴とする製薬組成物。
【請求項２】
該アドヘシン分子がクラス５采から誘導される請求項１の製薬組成物。
【請求項３】
該アドヘシン分子が、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤからなる群から選ばれる１つ以上の采マイナーサブユニットである請求項１の製薬組成物。
【請求項４】
ａ．１つ以上のクラス５大腸菌采アドヘシンまたはそのフラグメントからなる免疫原を牛乳生成家畜動物に投与する工程、
ｂ．該家畜動物から免疫グロブリン含有初乳または乳を集める工程
からなることを特徴とする請求項１の抗エンテロトキシン生成大腸菌組成物を製造する方法。
【請求項５】
該採集初乳または乳中の抗アドヘシン免疫グロブリンの濃度が、該受動予防の１投与あたり０．１ｇから２０．０ｇのＩｇＧに調節される請求項４の方法。
【請求項６】
該家畜がウシまたはヤギである請求項４の方法。
【請求項７】
該アドヘシンが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤからなる群から選ばれる請求項４の方法。
【請求項８】
該免疫原が、またＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＡ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡおよびＣｏｔＢからなる群から選ばれる１つ以上の大腸菌メジャー采サブユニットからなる請求項４の方法。
【請求項９】
該免疫原が、大腸菌采アドヘシンドメイン、並びに配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるポリヒスチジン尾部融合ポリペプチドである請求項４の方法。
【請求項１０】
該大腸菌采アドヘシンが、該大腸菌メジャー采サブユニットにそのＣ末端で操作可能に結合しているリンカーにそのＣ末端で結合している請求項８の方法。
【請求項１１】
該大腸菌采アドヘシンが、アドヘシンポリペプチドのモノマーまたはポリマーである請求項１０の方法。
【請求項１２】
該リンカーが、配列番号１０、１２および１３からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる請求項１０の方法。
【請求項１３】
該采アドヘシンが、ＣｆａＥ、ＣｓｆＤ、ＣｓｕＤ、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＤ、ＣｓｄＤ、ＣｓｂＤおよびＣｏｔＤから選ばれる請求項１０の方法。
【請求項１４】
該メジャー采サブユニットが、ＣｆａＢ、ＣｓｆＡ、ＣｓｕＡ１、ＣｓｕＡ２、ＣｏｏＤ、ＣｏｓＡ、ＣｓｂＡ、ＣｓｄＡおよびＣｏｔＢからなる群から選ばれる請求項１０の方法。
【請求項１５】
該免疫原が、該大腸菌メジャー采サブユニットのＣ−末端で結合したポリヒスチジン尾部を含む請求項１０の方法。
【請求項１６】
該采アドヘシンが、配列番号１１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２またはこれらのフラグメントから選ばれるアミノ酸配列である請求項１３の方法。
【請求項１７】
該ＣｆａＥが、配列番号１８のヌクレオチド配列のすべてまたは一部によりエンコードされた配列番号１１のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる請求項１３の方法。
【請求項１８】
該ＣｓｂＤが、配列番号１９のヌクレオチド配列によりエンコードされた配列番号２２のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる請求項１３の方法。
【請求項１９】
該ＣｏｔＤが、配列番号３２のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる請求項１３の方法。
【請求項２０】
該大腸菌采アドヘシンが、配列番号１１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２からなる群から選ばれる配列のアミノ酸５８−１８５からなる請求項１３の方法。
【請求項２１】
該大腸菌采アドヘシンが、配列番号１１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２からなる群から選ばれる配列のアミノ酸１４−２０５からなる請求項１３の方法。
【請求項２２】
該メジャー采サブユニットが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選ばれるアミノ酸配列である請求項１４の方法。
【請求項２３】
該免疫原が、配列番号２３によりエンコードされた配列番号２４並びに配列番号２５および配列番号３４によりエンコードされた配列番号２６からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるポリヒスチジン尾部を含む融合ポリペプチドである請求項１５の方法。
【請求項２４】
該メジャー采サブユニットが、ヌクレオチド配列配列番号２０によりエンコードされた配列番号１のポリペプチド配列を有するＣｆａＢである請求項１７の方法。
【請求項２５】
該メジャー采サブユニットが、ヌクレオチド配列配列番号２１によりエンコードされた配列番号７のポリペプチド配列を有するＣｓｂＡである請求項１８の方法。
【請求項２６】
該メジャー采サブユニットが、配列番号９のポリペプチド配列を有するＣｏｔＡである請求項１９の方法。
【請求項２７】
ａ．乳産出動物の初乳または乳にアドヘシン特異性抗体を誘導するように未変性または組み換え大腸菌アドヘシンからなる免疫原を該乳産出動物に投与し、
ｂ．該アドヘシン特異性抗体を含む該初乳または乳を集め、
ｃ．１投与あたり０．１ｇから２０．０ｇのＩｇＧの投与量で、該牛乳抗アドヘシン免疫グロブリンの投与物を経口投与する
ことを特徴とするエンテロトキシン生成大腸菌に受動免疫を付与する方法。
【請求項２８】
該投与物が、飲料または食品中で該初乳または乳の抗アドヘシン免疫グロブリンを混合することにより投与される請求項２７の方法。
【請求項２９】
該投与物がカプセルまたは錠剤の形で投与される請求項２７の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５４５６９８（Ｐ２００８−５４５６９８Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１３６６２（Ｐ２００８−５１３６６２）
【出願日】平成１８年５月２３日（２００６．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２００６４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２７７９８
【国際公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（５０７３８６１３９）アメリカ合衆国 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２３日（２００６．５．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２００６４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２７７９８
【国際公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【出願人】（５０７３８６１３９）アメリカ合衆国 (6)
【Ｆターム（参考）】
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