抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体
【課題】ジンセノシドＲｅに対する高い特異性を有し、ジンセノシド化合物の単離や検出等に有用な手段を提供すること。
【解決手段】式（１）：
【化１】
に示されるジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８のハイブリドーマ、該モノクローナル抗体又はその断片と、被検試料とを接触させ、該モノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成の有無を測定する、ジンセノシド化合物の検出方法、該ジンセノシドＲｅと、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンとの複合体を用いて、動物を免疫し、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る、モノクローナル抗体の製造方法。
【解決手段】式（１）：
【化１】
に示されるジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８のハイブリドーマ、該モノクローナル抗体又はその断片と、被検試料とを接触させ、該モノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成の有無を測定する、ジンセノシド化合物の検出方法、該ジンセノシドＲｅと、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンとの複合体を用いて、動物を免疫し、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る、モノクローナル抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ジンセノシド化合物の検出方法及び該モノクローナル抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬用人参は、和名をオタネニンジン、学名をパナックスジンセン（Ｐａｎａｘ Ｇｉｎｓｅｎｇ）と称し、ウコギ科に属する多年生植物であり、その根は古くから優れた生薬として知られている。現在、生薬として最も多用されている薬用人参としては、白参（ハクジン：Ｗｈｉｔｅ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ）と、それを蒸して乾燥した紅参（コウジン：Ｒｅｄ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ Ｒｕｂｒａ）が挙げられる。また、前記白参及び紅参に類似するものとして、西洋人参（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｉｎｓｅｎｇ：アメリカ人参）、田七人参（Ｓａｎ−ｃｈｉ Ｇｉｎｓｅｎｇ：三七人参）及び竹節人参（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｐａｎａｃｉｓ Ｊａｐｏｎｉｃｉ Ｒｈｉｚｏｍａ）及び毛人参（Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｇｉｎｓｅｎｇ）が知られている。
【０００３】
前記のように、薬用人参は、優れた薬理活性を有する重要な生薬として経験的に多用されてきたが、人参の構成成分を特異的、網羅的に定量することができるアッセイ系の確立が困難であったため、その薬理学的品質評価は必ずしも充分に行われていないのが現状である。
【０００４】
具体的には、薬用人参に微量に含有することが知られている薬理活性成分である「ジンセノシド化合物」は、従来、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により分析されていた。
【０００５】
しかしながら、従来のＨＰＬＣ等による分析においては、前処理（予備的精製）が必要であり、一つの資料の分析に時間が多大な時間を要するという欠点がある。
【０００６】
一方、特定の抗原で免疫した哺乳動物の脾細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させたハイブリドーマは、特定の抗原に対する抗体の産生能を有する。種々のタンパク質、ペプチド等の高分子化合物について、特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマにより得られたモノクローナル抗体を用いてそれらのタンパク質等のアッセイ系を構築することが試みられている〔非特許文献１等を参照のこと〕。
【０００７】
しかしながら、低分子化合物に対する抗体の作製は、困難であるのが現状である。
【非特許文献１】ケーラーら、Ｎａｔｕｒｅ、４９５−４９７頁、１９７５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、１つの側面では、ジンセノシドＲｅに対する高い特異性を有し、ジンセノシド化合物の単離や検出等に用いうる、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体若しくはその一部を提供することに関する。本発明は、他の側面では、前記モノクローナル抗体を、効率よく、安価に、簡便に供給すること等を可能にするハイブリドーマを提供することに関する。本発明は、さらに他の側面では、高い感度でジンセノシド化合物を検出すること、簡便にジンセノシド化合物を検出すること等の少なくとも１つを達成しうる、ジンセノシド化合物の検出方法を提供することに関する。本発明は、別の側面では、前記モノクローナル抗体を、効率よく、安価に、簡便に供給すること等を可能にする、モノクローナル抗体の製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
〔１〕 式（１）：
【００１０】
【化１】
【００１１】
に示されるジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体、
〔２〕 ジンセノシドＲｅと式（２）：
【００１２】
【化２】
【００１３】
に示されるジンセノシドＲｇ１と式（３）：
【００１４】
【化３】
【００１５】
に示されるジンセノシドＲｄとに対して少なくとも反応し、かつ
式（６）：
【００１６】
【化４】
【００１７】
に示されるグリチルリチンとは少なくとも反応しないものである、前記〔１〕記載のモノクローナル抗体、
〔３〕 ジンセノシドＲｇ１及びジンセノシドＲｄに対する交差反応性が、ジンセノシドＲｅに対する反応性を１００％として、少なくとも７０％である、前記〔１〕又は〔２〕記載のモノクローナル抗体、
〔４〕 受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマにより産生される、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその一部、
〔５〕 受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体、
〔６〕 前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の抗体断片、
〔７〕 受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８のハイブリドーマ、
〔８〕 前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は前記〔６〕記載の抗体断片と、被検試料とを接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成の有無を測定することを特徴とする、ジンセノシド化合物の検出方法、
〔９〕 ジンセノシド化合物が、式（１）：
【００１８】
【化５】
【００１９】
に示されるジンセノシドＲｅ、式（２）：
【００２０】
【化６】
【００２１】
に示されるジンセノシドＲｇ１、式（３）：
【００２２】
【化７】
【００２３】
に示されるジンセノシドＲｄ、式（４）：
【００２４】
【化８】
【００２５】
に示されるジンセノシドＲｃ、又は式（５）：
【００２６】
【化９】
【００２７】
に示されるジンセノシドＲｂ１である、前記〔８〕記載の検出方法、並びに
〔１０〕 （Ａ）式（１）：
【００２８】
【化１０】
【００２９】
に示されるジンセノシドＲｅと、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンとの複合体を形成させる工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた複合体を用いて、動物を免疫し、抗体産生細胞を得る工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る工程、及び
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る工程、
を含む、前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片によれば、ジンセノシド化合物の単離や検出を行なうことができ、特に、ジンセノシドＲｅを高い特異性で単離や検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のハイブリドーマによれば、前記モノクローナル抗体を、効率よく、安価に、簡便に供給することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のジンセノシド化合物の検出方法によれば、高い感度でジンセノシド化合物を簡便に検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のモノクローナル抗体の製造方法によれば、前記モノクローナル抗体を簡便に、効率よく安価に製造することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、１つの側面では、式（１）：
【００３２】
【化１１】
【００３３】
に示されるジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体に関する。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、ジンセノシドＲｅに反応するモノクローナル抗体であり、いいかえれば、ジンセノシドＲｅに高い親和性で結合するモノクローナル抗体である。また、本発明のモノクローナル抗体は、他の側面では、ジンセノシド化合物に対して、高い特異性で結合するモノクローナル抗体である。
【００３４】
また、本発明のモノクローナル抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１であり、軽鎖は、κ鎖である。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、ジンセノシド化合物に対し、交差反応性を示すが、ジンセノシド化合物以外の化合物には、交差反応性を示さないという優れた効果を発揮する。したがって、本発明のモノクローナル抗体によれば、ジンセノシド化合物の単離や検出を行なうことができ、特に、ジンセノシドＲｅを高い特異性で単離や検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体により認識されるジンセノシド化合物としては、下記式（７）：
【００３７】
【化１２】
【００３８】
に示されるプロトパナクサトリオールをアグリコンの基本骨格とするジンセノシド化合物及び下記式（８）：
【００３９】
【化１３】
【００４０】
に示されるプロトパナクサジオールをアグリコンの基本骨格とするジンセノシド化合物が挙げられる。
【００４１】
前記ジンセノシド化合物としては、具体的には、例えば、下記式（１）：
【００４２】
【化１４】
【００４３】
により示されるジンセノシドＲｅ、式（２）：
【００４４】
【化１５】
【００４５】
に示されるジンセノシドＲｇ１、式（３）：
【００４６】
【化１６】
【００４７】
に示されるジンセノシドＲｄ、式（４）：
【００４８】
【化１７】
【００４９】
に示されるジンセノシドＲｃ、式（５）：
【００５０】
【化１８】
【００５１】
に示されるジンセノシドＲｂ１等が挙げられる。
【００５２】
前記「特異性」は、例えば、抗原に対する交差反応性及び抗原との親和性により評価される。前記「抗原に対する交差反応性」は、各種糖化合物、例えば、ジンセノシド化合物、他の化合物等を抗原として用い、ＥＬＩＳＡ法、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法、免疫電気泳動法等により、評価されうる。また、前記「抗原との親和性」は、モノクローナル抗体と抗原との結合速度定数、解離速度定数等により評価されうる。
【００５３】
本発明のモノクローナル抗体は、さらに他の側面では、ジンセノシド化合物、具体的には、例えば、ジンセノシドＲｅとジンセノシドＲｇ１とジンセノシドＲｄとに対して少なくとも反応し、かつ式（６）：
【００５４】
【化１９】
【００５５】
に示されるグリチルリチンとは少なくとも反応しないモノクローナル抗体である。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体は、別の側面では、ジンセノシドＲｅに対する反応性を１００％とした場合、例えば、ジンセノシドＲｇ１及びジンセノシドＲｄに対する交差反応性が、少なくとも７０％である。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ジンセノシドＲｅに対する反応性を１００％とした場合、例えば、ジンセノシドＲｃ及びジンセノシドＲｂ１それぞれに対する交差反応性が、少なくとも０．０４５％であり、サイコサポニンａ、ジギトニン、ソラソニン、デオキシコール酸、グリチルリチン、エルゴステロール、ソラマルジン、コレステトール、β−シトステロール及びチクセツサポニンそれぞれに対する交差反応性は、０．００９％未満である。
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、
（Ａ）ジンセノシドＲｅと、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンとの複合体を形成させる工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた複合体を用いて、動物を免疫し、抗体産生細胞を得る工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る工程、及び
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る工程、
を行なうことにより得られうる。
【００５８】
したがって、本発明は、別の側面では、前記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、本発明のモノクローナル抗体の製造方法に関する。
【００５９】
前記工程（Ａ）において、抗原としてジンセノシドＲｅを用い、該抗原と血清アルブミンとの複合体を形成させる。かかる複合体の形成には、例えば、ジンセノシドＲｅを、該ジンセノシドＲｅの糖部分を開環するに適した試薬を用いて処理して、糖部分を開環し、アルデヒド基とし、該糖部分に血清アルブミンを結合させることにより、前記複合体を形成させることができる。本発明においては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル測定により、ＢＳＡ又はＨＳＡの１分子当たり２〜８分子のジンセノシドＲｅが結合されていることを確認したジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ（又はＨＳＡ）複合体（図１参照）を用いることが望ましい。
【００６０】
前記試薬としては、過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００６１】
ついで、前記工程（Ａ）で得られた複合体を用いて、動物を免疫し、抗体産生細胞を得る〔工程（Ｂ）〕。
【００６２】
前記工程（Ｂ）において、動物の免疫法としては、例えば、フロイントの完全アジュバントを併用する手法等が挙げられる。
【００６３】
前記動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ等が挙げられる。
【００６４】
前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓、リンパ節、末梢血液等から分離した細胞が挙げられる。かかる抗体産生細胞は、慣用の手法により単離されうる。
【００６５】
その後、前記工程（Ｂ）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る〔工程（Ｃ）〕。
【００６６】
前記工程（Ｃ）では、具体的には、例えば、
（１）骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）を培養増殖し、調製する工程、
（２）前記工程（Ｂ）得られた抗体産生細胞と前記工程（１）で得られた骨髄腫細胞とを、ポリエチレングリコール等の融合促進剤を媒体として融合させ、ハイブリドーマを得る工程、
（３）前記工程（２）で得られたハイブリドーマを、ＨＡＴ培地等の選択培地にて培養（増殖）する工程、
（４）得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、
（５）選抜されたハイブリドーマをクローニングする工程、及び
（７）得られたハイブリドーマをインビトロ又は動物腹腔内で培養（増殖）して、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る工程、
が行なわれうる。
【００６７】
前記骨髄腫細胞としては、各種の哺乳動物の細胞株が利用可能であり、特に限定されないが、抗体産生細胞の調製に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが好ましい。本発明のモノクローナル抗体を作製するのに好ましい組み合わせとしては、マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞との組み合わせが挙げられる。なお、用いる細胞は、未融合細胞と融合細胞とを区別化する観点から、好ましくは、細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマのみが増殖可能である細胞、例えば、特定の薬剤抵抗性を有する細胞が望ましい。例えば、８−アザグアニン抵抗性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有するため、有利である。前記骨髄腫細胞としては、具体的には、マウス骨髄腫細胞株、ＰＡＩ、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩ、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＦＯ、Ｓ１９４／５ＸＸＯ、ＢＵ．１、ＭＰＣ１１−４５．６．、ＴＧ．１．７等が挙げられる。
【００６８】
細胞融合は、通常ＭＥＭ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＩＭＤＭ培地等のＥ−ＲＤＦ培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合促進剤の存在下に混合（混合比は、通常１：４〜１：１０）することにより行なわれうる。好ましい融合促進剤としては、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。前記ＰＥＧは、通常、使用濃度：３０〜５０％で用いられうる。
【００６９】
細胞融合後の細胞は、１０重量％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有Ｅ−ＲＤＦ培地等で適当に希釈し、遠心分離する。沈殿した細胞を、選択培地（例えば、ＨＡＴ培地等）で浮遊し、９６穴ウェルマイクロプレートに接種した後に、５体積％ 炭酸ガス培養装置で培養する。選択培地で生育してくる細胞がハイブリドーマである。
【００７０】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、常法により行なうことができ、特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマの増殖した培養液を採取し、該培養液とジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ（又はＨＳＡ）複合体とを反応させ、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識した２次抗体と反応させるＥＬＩＳＡ法により目的の抗ジンセノシドＲｅ抗体産生能を有するハイブリドーマを選抜することができる。
【００７１】
抗体産生ハイブリドーマを含むことが確認された培養ウェル中の細胞を限界希釈法等によりクローニングを行ない、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。
【００７２】
得られたハイブリドーマを、無血清培地のような適切な培地中でインビトロ培養することにより、その培養上清から、本発明のモノクローナル抗体が得られる。ここで、本発明のモノクローナル抗体は、前記培養上清を、例えば、飽和硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー（例えば、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリンカラムプロテインＡカラム等）等により精製することにより得られうる。なお、本発明のモノクローナル抗体を、大量に生産する場合には骨髄腫細胞由来動物と同種の動物にプリスタン等の鉱物油を腹腔内投与し、ハイブリドーマを接種し、その後、腹水を採取し、通常の抗体分離操作を行なうことにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に得ることができる。
【００７３】
得られたモノクローナル抗体は、例えば、免疫グロブリンクラス、軽鎖、分子量、その他の特性等について、通常の方法（例えば、オクタロニー法）で決定することにより評価されうる。また、分子量は、例えば、シナピン酸をマトリックスとするＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル測定により評価されうる。
【００７４】
なお、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ４Ｇ１０と命名・表示され、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８（寄託日：２００４年８月２７日）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されているハイブリドーマより、慣用の方法により、安定に、効率よく製造されうる。
【００７５】
したがって、本発明は、さらに他の側面では、本発明のモノクローナル抗体を産生する前記寄託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８（プライベートネーム：ハイブリドーマ４Ｇ１０）のハイブリドーマに関する。
【００７６】
本発明のハイブリドーマは、例えば、１チューブあたり４．０×１０6細胞となるように、無血清Ｅ−ＲＤＦ培地〔組成：１Ｌあたり商品名：極東Ｅ−ＲＤＦ培地 １７．７ｇ［極東製薬工業株式会社（製品コード２６５００）］、１００μｇ／ｍｌ インスリン、３５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、２０μＭ エタノールアミン、２５ｎＭ セレニウム〕：ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製、ＳＨ３００８０．０２）：ＤＭＳＯ（７：２：１）に懸濁し、１℃／１分の冷却速度で−８０℃まで凍結し、液体窒素中で保管されうる。
【００７７】
また、凍結保存された前記ハイブリドーマは、３７℃の水浴中、浸透させながら融解し、完全融解直前に氷中に移す。融解細胞懸濁液を、１０ｍｌの培地に移し、４℃で１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を捨て、残った細胞に１０ｍｌの培地を加え、４℃で１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、細胞を洗浄する。得られた細胞を通常どおり培養することにより、適宜使用されうる。
【００７８】
また、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、前記受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８のハイブリドーマを、適切な培地中、５体積％ ＣＯ2、３７℃の条件下に培養して、培養上清を得、該培養上清から、モノクローナル抗体を精製することにより得られうる。
【００７９】
前記培地としては、本発明のハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるに適した慣用の栄養培地又は慣用の基本培地の改変培地等が挙げられる。前記基本培地としては、例えば、前記無血清Ｅ−ＲＤＦ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地等のＥ−ＲＤＦ培地等が挙げられる。また、培地のｐＨは、７〜８、好ましくは、約７．４であることが望ましい。
【００８０】
なお、本発明のモノクローナル抗体には、前記受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体も含まれる。
【００８１】
また、本発明においては、前記モノクローナル抗体と同等の反応性を示すものであれば、本発明のモノクローナル抗体の一部、すなわち、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｄ等が挙げられる。かかる抗体断片は、例えば、ペプチダーゼ等により、モノクローナル抗体を消化することにより得られうる。例えば、Ｆａｂフラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をパパインにより処理することにより得られ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をペプシンにより処理することにより得られうる。
【００８２】
本発明は，別の側面では、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片と、被検試料とを接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成の有無を測定することを特徴とする、ジンセノシド化合物の検出方法に関する。
【００８３】
本発明の検出方法によれば、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片が用いられているため、ジンセノシド化合物を、高い感度で、簡便に検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００８４】
なお、本発明の検出方法は、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の量を測定することにより、ジンセノシド化合物を、定量的に検出することもできる。
【００８５】
本発明の検出方法においては、まず、被検試料とモノクローナル抗体又は抗体断片とを接触させる。
【００８６】
前記被検試料としては、例えば、薬用人参、ハリギリ等に代表されるウコギ科植物等の植物の抽出物、薬用人参配合漢方製剤、ヒト又は非ヒト動物の血清等が挙げられる。
【００８７】
前記薬用人参としては、特に限定されないが、例えば、白参（Ｗｈｉｔｅ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ）、紅参（Ｒｅｄ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ Ｒｕｂｒａ）、西洋人参（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｉｎｓｅｎｇ）、田七人参（Ｓａｎ−ｃｈｉ Ｇｉｎｓｅｎｇ）、竹節人参（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｐａｎａｃｉｓ Ｊａｐｏｎｉｃｉ Ｒｈｉｚｏｍａ）、毛人参（Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｇｉｎｓｅｎｇ）等が挙げられる。
【００８８】
本発明の検出方法により検出しうるジンセノシド化合物としては、ジンセノシドＲｅ、ジンセノシドＲｇ１、ジンセノシドＲｄ、ジンセノシドＲｃ、ジンセノシドＲｂ１等が挙げられる。
【００８９】
操作の簡便性、感度の向上等の観点から、本発明の検出方法に用いられるモノクローナル抗体又は抗体断片は、標識物質で標識されていることが望ましい。
【００９０】
前記標識物質としては、例えば、酵素、ＦＩＴＣ、ビオチン、金コロイド等が挙げられる。
【００９１】
本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、免疫沈降法等で検出されうる。
【００９２】
なお、本発明の検出方法は、他の実施態様では、
１） 被検試料を、親水性ポリエーテルスルホン膜上に展開して、それにより、試料中のジンセノシド化合物が存在する場合、試料中の他の化合物とジンセノシド化合物とを分離するステップ、
２） 該ジンセノシド化合物を、該膜上に固定化するステップ、
３） 該膜上に固定化されたジンセノシド化合物を、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片により検出するステップ、及び
４） 検出されたジンセノシド化合物に対応するスポットの面積を測定するステップ、
を含む検出方法が挙げられる。
【００９３】
前記親水性ポリエーテルスルホン膜は、孔サイズが、例えば、０．３〜１．０μｍのものであればよい。かかる親水性ポリエーテルスルホン膜は、例えば、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、商品名：ＭｕｓｔａｎｇTMＥを、適切な手段により正に荷電するように処理し、シート状に加工することにより得られる。なお、本発明の分析方法においては、前記親水性ポリエーテルスルホン膜と同等の性質を有する膜、例えば、イオン交換能を有し、正に荷電し、孔サイズが、０．３〜１．０μｍの膜を用いてもよい
【００９４】
試料中に含まれる配糖体を展開するための展開液としては、高極性溶媒であればよく、アセトニトリル、メタノール系溶媒が挙げられ、逆相クロマトグラフィー、分離（溶出）力の観点から、特にアセトニトリル系溶媒が好ましい。
【００９５】
親水性ポリエーテルスルホン膜へのジンセノシド化合物の固定化は、ジンセノシド化合物の糖部分を開環させうる試薬、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム等の過ヨウ素酸塩等が挙げられる。固定化は、例えば、前記親水性ポリエーテルスルホン膜を、親水性ポリエーテルスルホン膜が浸る程度（例えば、２０〜３０ｍｌ）の量の過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）に浸漬し、室温（２５℃）で１時間インキュベーションすることにより行なわれうる。
【００９６】
検出されたジンセノシド化合物に対応するスポットの面積は、例えば、画像解析手段により分析し、かかる分析結果に基づき、スポット面積を数値化し、適切な計算手段、例えば、表計算ソフトを用いて、標準品の濃度、エリア面積をＸ軸及びＹ軸にとり、Ｘ軸のみ対数の検量線を作成することにより解析されうる。前記画像解析手段は、例えば、
− 膜（６．３×９．０ｃｍ）を、２００ｄｐｉ、ＰＩＣＴファイル（保存形態）、８ビットグレイスケールで画像として取りこみ、
− 該画像について、Ｕｎｄｏ ＆ Ｃｌｉｐｂｏａｒｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｉｚｅで内部画像バッファーの大きさを３００Ｋに設定し、
− 得られた画像データについて、Ｆｌｏｙｄ−Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇのエラー拡散アルゴリズムのデフォルトパラメータで、画像全体のヒストグラムから閾値を設定して、画像中のスポットに対応する部分及びそれ以外の部分、すなわち、閾値以上の部分と、閾値以下の部分とに分離させ、
− Ｓｍｏｏｔｈ機能により、画像のノイズを減少させ、
− Ｍｉｎｉ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅを設定せず、面積（Ａｒｅａ）、各スポットの長径（Ｅｌｌｉｐｓｅ Ｍａｊｏｒ Ａｘｉｓ）及び短径（Ｅｌｌｉｐｓｅ Ｍｉｎｏｒ Ａｘｉｓ）を選択するよう設定し、画像上の発色スポットを選択して、Ｐｉｘｅｌで、測定する
ことにより、発色スポットの数値化を行ない得る手段、例えば、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ、ＬＩＡ３２、Ｉｍａｇｅ Ｊ、これらと同様の機能を有する汎用ソフトウェア等が挙げられる。前記計算手段は、前記画像解析手段により得られた数値を元に、検量線を作成できる手段であればよく、例えば、マイクロソフト社製、商品名：Ｅｘｃｅｌ、ヒューリンクス社製、商品名：Ｋａｌｅｉｄａ Ｇｒａｐｈ等又はそれらと同等の機能を有する手段が挙げられる。
【００９７】
また、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片は、ジンセノシド化合物のアフィニティー精製に用いることもできる。例えば、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片を、慣用の支持体（例えば、セルロース、ポリスチレンビーズ等）に結合させて得られる担体として、ジンセノシド化合物のアフィニティー精製に用いることができる。本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片に特異的に吸着したジンセノシド化合物の溶出は、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との間のイオン結合、水素結合、疎水結合等を解離させる試薬、例えば、酢酸アンモニウム、ブタノール等により行なわれうる。
【００９８】
以下、下記実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００９９】
（１）抗原の調製
ジンセノシドＲｅ溶液〔ジンセノシドＲｅ（和光純薬株式会社製） １０ｍｇを、８０体積％メタノール １．０ｍｌに溶かした溶液〕を、過ヨウ素酸ナトリウム溶液〔過ヨウ素酸ナトリウム ４ｍｇを、水 ０．５ｍｌに溶かした溶液〕に攪拌しながら添加し、１時間反応させた。得られた産物に、１．０重量％ ＢＳＡ〔ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕含有炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）を添加して５時間攪拌し、反応させた。反応後、得られた産物を、水に対して、透析し、ジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体 １０ｍｇを得た。なお、ＨＳＡ〔ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕を用いて、同様にジンセノシドＲｅ−ＨＳＡ複合体を調製した。
【０１００】
（２）抗原中のハプテン数の検討
前記（１）で得られたジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体 ２μｇ相当量に、過剰量のシナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）を添加して混合した。得られた混合物 ２μｇを、ＪＥＯＬ社製、商品名：ＪＭＳ−ＥＬＩＴＥ ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにて測定した。得られたスペクトラムを図１に示す。
【０１０１】
図１に示されるスペクトログラムから、ＢＳＡ１分子に対して平均５分子のジンセノシドＲｅが結合していることが確認された。
【０１０２】
（３）免疫脾細胞の調製
前記（１）で得られたジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体 ５０μｇを、フロイントの完全アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５０μｇのジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体のみ １００μｇを、前記マウスに投与し免疫を完了した。３日後にマウスを、麻酔下安楽殺し、脾臓を摘出した。脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網でろ過し、脾臓の単離細胞を得た。
【０１０３】
（４）ハイブリドーマの調製
前記（３）で単離した免疫脾細胞に、低張液（１５５ｍＭ 塩化アンモニウム）を添加し、赤血球を溶出させた。Ｅ−ＲＤＦ培地〔商品名：極東Ｅ−ＲＤＦ培地 １７．７ｇ［極東製薬工業株式会社（製品コード２６５００）]〕で脾細胞を３回洗浄した。
【０１０４】
一方、マウス骨髄腫細胞を、前記Ｅ−ＲＤＦ培地で３回洗浄した。脾細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞数を計測し、脾細胞と骨髄腫細胞とを１０：１の割合に混合し、得られた混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、４℃）した。
【０１０５】
上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、該細胞に、５０％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００溶液〔ＰＥＧ４０００（シグマ社製）を、前記Ｅ−ＲＤＦ培地で希釈した溶液〕 １．０ｍｌを滴下し、融合を行なった。細胞を、３７℃、３０秒間静置した後、前記Ｅ−ＲＤＦ培地 ５ｍｌを５分間かけて添加した。得られた産物を、１０００ｒｐｍ（４００×ｇ）で１０分間遠心分離した。得られた沈殿を、１０重量％ ＦＣＳ添加ＩＭＤＭで洗浄し、遠心分離（４００×ｇ、１０分間、４℃）して、上清を捨てた。ヒポキサンチン１０-2Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ及びチミジン１．５×１０-5Ｍを添加した（ＨＡＴ）１０重量％ ＦＣＳ添加Ｅ−ＲＤＦ培地（以下、ＨＡＴ−ＦＣＳ含有Ｅ−ＲＤＦ培地） １００ｍｌを用いて、沈殿した細胞を再び懸濁した。得られた細胞懸濁液 １００μｌを、９６ウェルマイクロプレートに分注し、３７℃、５体積％ ＣＯ2でインキュベートした。３日毎に、１ウェルあたり、ＨＡＴ−ＦＣＳ含有Ｅ−ＲＤＦ培地 ５０μｌを前記９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに追加し、細胞の増殖を確認した。
【０１０６】
（５）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマが増殖したウェル中の培養上清を採取した。前記培養上清を、ジンセノシドＲｅ−ＨＳＡ複合体を結合させた別のウェルに添加し、直接ＥＬＩＳＡによりジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行なった。すなわち、９６ウェルマイクロプレートに、ジンセノシドＲｅ−ＨＳＡ複合体 ０．１μｇ／１００μｌ／ウェルを分注し、３７℃で１時間インキュベートしてウェルに吸着させた。前記ウェルに、培養上清を１００μｌずつ分注し、３７℃で６０分間インキュベートして、抗原抗体反応を行なった。
【０１０７】
その後、ウェルを、０．０５重量％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）含有リン酸緩衝食塩水（Ｔ‐ＰＢＳ）で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）１０００倍希釈液をウェルあたり１００μｌ添加し、１時間後にＴ−ＰＢＳで洗浄した。０．００３体積％ 過酸化水素、ＡＢＴＳ〔２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）〕 ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。２０分後、プレートリーダー〔ヌンク社製、商品名：ＩｍｍｕｎｏＭｉｎｉ ＮＪ−２３００〕を用いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウェルの細胞を採取した。
【０１０８】
（６）抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのクローニング
抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウェルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリドーマを同様に３回クローニングして所望のクローン、すなわち、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ４Ｇ１０を得た。
【０１０９】
（７）抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体の調製
前記抗体産生ハイブリドーマ４Ｇ１０を無血清培地（１００μｇ／ｍｌ インスリン、３５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、２０μＭ エタノールアミン、２５ｎＭ セレニウム添加Ｅ−ＲＤＦ培地）で、３７℃、５％ ＣＯ2の炭酸ガス培養器〔ＳＡＮＹＯ社製、商品名：ＣＯ2インキュベータ[ＭＣＯ−１８ＡＩＣ（ＵＶ）］〕中で培養した。上清を、トリス−塩酸緩衝液でｐＨ７に調整した。得られた産物を、プロテインＧアフィニティカラム〔アマシャム バイオ社製、商品名：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ〕に供した。カラムを１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、吸着した抗体を、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ２．７）で溶出した。得られた抗体溶液を、ＰＢＳに対して３回透析し、最後に凍結乾燥して、精製抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体（モノクローナル抗体４Ｇ１０）を得た。
【０１１０】
（８）モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスと分子量
精製モノクローナル抗体４Ｇ１０について、オクタロニー法により免疫グロブリンクラスを調べた。その結果、モノクローナル抗体４Ｇ１０は、ＩｇＧ１のサブクラスに属し、κ軽鎖を保有するものであることが示された。
【０１１１】
また、精製モノクローナル抗体４Ｇ１０と、シナピン酸とを混合して、得られた試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（ＪＥＯＬ社製、商品名：商品名：ＪＭＳ−ＥＬＩＴＥ ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）により、純度を確認するとともに分子量を調べた。図２にモノクローナル抗体４Ｇ１０について測定したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトラムを示す。その結果、精製モノクローナル抗体４Ｇ１０は、分子量約１４７５００であった。また、純度は、総凍結乾燥物に対して、７０重量％であった。
【実施例２】
【０１１２】
実施例１で作製したモノクローナル抗体４Ｇ１０の性質を調べるため、以下のように、競合的ＥＬＩＳＡ法による定量試験を行なった。ジンセノシドＲｅ−ＨＳＡ複合体溶液（１μｇ／ｍｌ） １００μｌを各ウェルに添加し、１時間インキュベートして、吸着させた。非特異的結合を除去するために、各ウェルに、スキンミルク添加ＰＢＳ溶液 ３００μｌを添加し、１時間インキュベートしてブロッキングした。その後、各ウェルに、各種濃度のジンセノシドＲｅの２０％メタノール溶液 ５０μｌを添加し、さらに、モノクローナル抗体４Ｇ１０溶液（０．１８７μｇ／ｍｌ） ５０μｌを添加して１時間インキュベートした。ウェルを、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、１０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＩＣＮ社製、商品名：ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ−ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＤ ＧＯＡＴ ＩＧＧ ＦＲＡＣＴＩＯＮ ＴＯ ＭＯＵＳＥ ＩＧＧ ＦＣ−２ＭＬ） １００μｌを添加した。
【０１１３】
１時間インキュベートした後、ウェルをＴ−ＰＢＳで洗浄した。ウェルに、０．００３％ 過酸化水素、ＡＢＴＳ ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。１５分後、４０５ｎｍにおける発色の吸光度を測定した。各濃度のジンセノシドＲｅの吸光度から検量線を作成した。その結果を図３に示す。
【０１１４】
図３に示されるように、ジンセノシドＲｅの濃度は、２０〜４００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲において吸光度と良い相関を有していた。したがって、モノクローナル抗体４Ｇ１０により、ジンセノシドＲｅに対する優れた定量手段が提供されることが示された。
【実施例３】
【０１１５】
実施例１で得られたモノクローナル抗体４Ｇ１０の特異性を確かめるために、ジンセノシド、各種ステロイド及びトリテルペン化合物に対する交差反応性を調べた。
【０１１６】
各化合物（１ｍｇ）を正確に秤り、該化合物に、２０体積％ メタノール溶液 １ｍｌに懸濁し、１０分間超音波処理した。上清を、２０体積％ メタノール溶液で希釈し、各種濃度の検液を調製した。１ウェルあたり１００μｌの検液スタンダードであるジンセノシドＲｅ溶液を、イムノプレートに分注し１時間インキュベートした。
【０１１７】
プレートの各ウェルをブロッキング後、一次抗体溶液〔モノクローナル抗体４Ｇ１０（０．１８７μｇ／ｍｌ）を添加し、１時間インキュベートした。次に、二次抗体溶液〔前記ペルオキシダ−ゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体〕を添加し、１時間インキュベートした。その後、各ウェルに、基質溶液を添加し、発色強度を測定した。
【０１１８】
交差反応性ＣＲは、式：ＣＲ（％）＝〔（Ａ／Ａｏ＝０．５となるジンセノシドＲｅの濃度）／（Ａ／Ａｏ＝０．５となる検液の濃度）〕×１００
（式中、Ａは、サンプルの吸光度、Ａｏは、２０体積％ メタノール溶液の吸光度を表わす）
により算出した。その結果を表１に示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
表１に示されるように、モノクローナル抗体４Ｇ１０は、ジンセノシドＲｅをはじめ、ジンセノシドＲｇ１、ジンセノシドＲｄ等のプロトパナクサトリオール系ジンセノシド化合物及びプロトパナクサジオール系ジンセノシド化合物に幅広く親和性を有し、ジンセノシド類以外の化合物には殆ど交差反応性を示さないことがわかった。
【実施例４】
【０１２１】
実施例１で得られたモノクローナル抗体４Ｇ１０を用いるＥＬＩＳＡ法により各種人参中の総ジンセノシド含有量を測定した。測定は、各種人参の粉末５０ｍｇを、１００体積％ メタノール １ｍｌで５回抽出し、抽出液を合わせて遠心分離に供し、その上清を２０体積％メタノールで適切な濃度に希釈して実施例２に準じて定量することにより行なった。
【０１２２】
結果を表２に示す。表中、「ＥＬＩＳＡ」は、試料について、前記抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体を用いて分析した結果を示し、「ＨＰＬＣ」は、試料を、「ＨＰＬＣ」で分析した結果を示す。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
なお、ＨＰＬＣ条件は、ジンセノシドＲｂ１、ジンセノシドＲｃ及びジンセノシドＲｄの場合、カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（商品名）５Ｃ１８（４．５×１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4含有３０％（体積）ＣＨ3ＣＮ（水：アセトニトリル＝７０：３０）、流速：１．０ｍｌ／分、検出：ＵＶ２０２ｎｍ、リテンションタイム：ジンセノシドＲｂ１について、１３分、ジンセノシドＲｃについて、１７分、ジンセノシドＲｄについて、３７分であり、ジンセノシドＲｅ及びジンセノシドＲｇ１の場合、カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（商品名）５Ｃ１８（４．５×１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：０．５％（体積）Ｈ3ＰＯ4含有２０％（体積）ＣＨ3ＣＮ（リン酸：水：アセトニトリル＝０．５：８０：２０）、流速：１．０ｍｌ／分、検出：ＵＶ２０２ｎｍ、リテンションタイム：ジンセノシドＲｅについて、１９分、ジンセノシドＲｇ１について、２２分である。
【０１２５】
その結果、表２に示されるように、「ＥＬＩＳＡ」及び「ＨＰＬＣ」両方の数値が近似していた。したがって、モノクローナル抗体４Ｇ１０を用いる「ＥＬＩＳＡ」は、人参中に微量に含有されているジンセノシド化合物を特異的に定量分析できることがわかった。
【実施例５】
【０１２６】
実施例１で得られたモノクローナル抗体４Ｇ１０を用いて、以下のように、各種人参中のジンセノシドＲｅ含有量を測定した。
【０１２７】
各種人参の粉末５０ｍｇをメタノール１ｍｌで５回抽出し、抽出液を合わせて遠心分離に供し、その上清 １μｌを、親水性ポリエーテルスルホン膜（商品名：ＭｕｓｔａｎｇTMＥ、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、大きさ：６．３ ｃｍ×９．０ｃｍ、厚さ１４０μｍ、孔サイズ０．４５μｍ）にスポットした。その後、ポリエーテルスルホン膜上の試料を、水：メタノール：酢酸（体積比）＝５５：４５：１で４５分間展開した。その後、ポリエーテルスルホン膜を、過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ） ３０ｍｌ中に１時間浸漬させ、酸化反応を行なった。反応後、膜を水洗いし、１重量％ＢＳＡ含有炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に移し、３時間、ジンセノシドＲｅの糖部分とＢＳＡとを反応させた。
【０１２８】
反応後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で洗浄した。非特異的結合を避けるために、膜をスキンミルク−ＰＢＳ ３０ｍｌで、３時間ブロッキングした。ついで、ポリエーテルスルホン膜と、抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体溶液（０．１８７μｇ／ｍｌ）とを３時間反応させた。反応後の膜を、Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄し、該膜を、１０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体と、１時間反応させた。反応後、膜を、Ｔ−ＰＢＳで２回、水で１回洗浄し、基質の４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素とを用いて、４０分間維持して染色した。
【０１２９】
その後、展開した膜を抗体染色した。結果を図４に示す。図中、白参は、レーンＩ、紅参は、レーンＩＩ、毛人参は、レーンＩＩＩ、田七人参は、レーンＩＶ、西洋人参は、レーンＶ、竹節人参は、レーンＶＩに示し、レーン１〜５は、ジンセノシドＲｅ標品を示す。
【０１３０】
その結果、図４に示されるようなスポットが得られた。かかる結果より、人参に固有なジンセノシドＲｅが感度よく検出されていることがわかる。
【０１３１】
検出されたスポットについて、画像スキャナー（ＥＰＳＯＮ社製、商品名：ＧＴ−９７００Ｆ）を用いて、スキャン条件：白黒写真モード、解像度２００ｄｐｉでスキャンして、データをコンピューターに入力した。その後、各画像について、画像解析ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）を用いて、単位をミリメーターとし、面積測定用の設定で、面積（Ａｒｅａ）、スポットの長径（Ｅｌｌｉｐｓｅ Ｍａｊｏｒ Ａｘｉｓ）及び短径（Ｅｌｌｉｐｓｅ Ｍｉｎｏｒ Ａｘｉｓ）の条件で数値化した。数値化されたデータについて、表計算ソフト（マイクロソフト社製、商品名：Ｅｘｃｅｌ）を用いて、Ｙ軸をＡｒｅａ、Ｘ軸を標品量（μｇ）の対数表示として、検量線を作成し、定量値を算出した。また、対照として、ＨＰＬＣにより定量した結果を示す。結果を表３に示す。表中、「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ」は、試料について、前記ポリエーテルスルホン膜を用いた検出とＮＩＨ Ｉｍａｇｅによる数値化とＥｘｃｅｌによる算出とにより分析した結果を示し、「ＨＰＬＣ」は、試料を、「ＨＰＬＣ」で分析した結果を示す。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
その結果、「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ」及び「ＨＰＬＣ」両方の数値が近似していた。したがって、本発明のモノクローナル抗体を用いる「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ」は、人参中に微量含有されているジンセノシドＲｅを定量分析できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明により、「ＥＬＩＳＡ」、「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ」の通常の免疫測定法に適用すれば、前処理が不要な簡便かつ高感度で再現性の優れたジンセノシド化合物の分析が可能となり、各種の人参及びその他の植物、それらの諸器官、各種の漢方製剤等に含有されるジンセノシド化合物を定量することにより、薬理学的品質評価を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、ジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体の形成を確認するために測定したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのスペクトラムの１例を示す。
【０１３６】
【図２】図２は、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体の純度を確認し分子量を調べるために測定したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの１例を示す。
【０１３７】
【図３】図３は、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法におけるＧＲｇ１濃度と吸光度の関係を示すグラフである。
【０１３８】
【図４】図４は、人参抽出物のジンセノシドＲｅの検出結果である。図中、白参は、レーンＩ、紅参は、レーンＩＩ、毛人参は、レーンＩＩＩ、田七人参は、レーンＩＶ、西洋人参は、レーンＶ、竹節人参は、レーンＶＩに示し、レーン１〜５は、ジンセノシドＲｅ標品を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ジンセノシド化合物の検出方法及び該モノクローナル抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬用人参は、和名をオタネニンジン、学名をパナックスジンセン（Ｐａｎａｘ Ｇｉｎｓｅｎｇ）と称し、ウコギ科に属する多年生植物であり、その根は古くから優れた生薬として知られている。現在、生薬として最も多用されている薬用人参としては、白参（ハクジン：Ｗｈｉｔｅ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ）と、それを蒸して乾燥した紅参（コウジン：Ｒｅｄ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ Ｒｕｂｒａ）が挙げられる。また、前記白参及び紅参に類似するものとして、西洋人参（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｉｎｓｅｎｇ：アメリカ人参）、田七人参（Ｓａｎ−ｃｈｉ Ｇｉｎｓｅｎｇ：三七人参）及び竹節人参（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｐａｎａｃｉｓ Ｊａｐｏｎｉｃｉ Ｒｈｉｚｏｍａ）及び毛人参（Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｇｉｎｓｅｎｇ）が知られている。
【０００３】
前記のように、薬用人参は、優れた薬理活性を有する重要な生薬として経験的に多用されてきたが、人参の構成成分を特異的、網羅的に定量することができるアッセイ系の確立が困難であったため、その薬理学的品質評価は必ずしも充分に行われていないのが現状である。
【０００４】
具体的には、薬用人参に微量に含有することが知られている薬理活性成分である「ジンセノシド化合物」は、従来、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により分析されていた。
【０００５】
しかしながら、従来のＨＰＬＣ等による分析においては、前処理（予備的精製）が必要であり、一つの資料の分析に時間が多大な時間を要するという欠点がある。
【０００６】
一方、特定の抗原で免疫した哺乳動物の脾細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させたハイブリドーマは、特定の抗原に対する抗体の産生能を有する。種々のタンパク質、ペプチド等の高分子化合物について、特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマにより得られたモノクローナル抗体を用いてそれらのタンパク質等のアッセイ系を構築することが試みられている〔非特許文献１等を参照のこと〕。
【０００７】
しかしながら、低分子化合物に対する抗体の作製は、困難であるのが現状である。
【非特許文献１】ケーラーら、Ｎａｔｕｒｅ、４９５−４９７頁、１９７５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、１つの側面では、ジンセノシドＲｅに対する高い特異性を有し、ジンセノシド化合物の単離や検出等に用いうる、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体若しくはその一部を提供することに関する。本発明は、他の側面では、前記モノクローナル抗体を、効率よく、安価に、簡便に供給すること等を可能にするハイブリドーマを提供することに関する。本発明は、さらに他の側面では、高い感度でジンセノシド化合物を検出すること、簡便にジンセノシド化合物を検出すること等の少なくとも１つを達成しうる、ジンセノシド化合物の検出方法を提供することに関する。本発明は、別の側面では、前記モノクローナル抗体を、効率よく、安価に、簡便に供給すること等を可能にする、モノクローナル抗体の製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
〔１〕 式（１）：
【００１０】
【化１】
【００１１】
に示されるジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体、
〔２〕 ジンセノシドＲｅと式（２）：
【００１２】
【化２】
【００１３】
に示されるジンセノシドＲｇ１と式（３）：
【００１４】
【化３】
【００１５】
に示されるジンセノシドＲｄとに対して少なくとも反応し、かつ
式（６）：
【００１６】
【化４】
【００１７】
に示されるグリチルリチンとは少なくとも反応しないものである、前記〔１〕記載のモノクローナル抗体、
〔３〕 ジンセノシドＲｇ１及びジンセノシドＲｄに対する交差反応性が、ジンセノシドＲｅに対する反応性を１００％として、少なくとも７０％である、前記〔１〕又は〔２〕記載のモノクローナル抗体、
〔４〕 受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマにより産生される、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその一部、
〔５〕 受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体、
〔６〕 前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の抗体断片、
〔７〕 受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８のハイブリドーマ、
〔８〕 前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は前記〔６〕記載の抗体断片と、被検試料とを接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成の有無を測定することを特徴とする、ジンセノシド化合物の検出方法、
〔９〕 ジンセノシド化合物が、式（１）：
【００１８】
【化５】
【００１９】
に示されるジンセノシドＲｅ、式（２）：
【００２０】
【化６】
【００２１】
に示されるジンセノシドＲｇ１、式（３）：
【００２２】
【化７】
【００２３】
に示されるジンセノシドＲｄ、式（４）：
【００２４】
【化８】
【００２５】
に示されるジンセノシドＲｃ、又は式（５）：
【００２６】
【化９】
【００２７】
に示されるジンセノシドＲｂ１である、前記〔８〕記載の検出方法、並びに
〔１０〕 （Ａ）式（１）：
【００２８】
【化１０】
【００２９】
に示されるジンセノシドＲｅと、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンとの複合体を形成させる工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた複合体を用いて、動物を免疫し、抗体産生細胞を得る工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る工程、及び
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る工程、
を含む、前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片によれば、ジンセノシド化合物の単離や検出を行なうことができ、特に、ジンセノシドＲｅを高い特異性で単離や検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のハイブリドーマによれば、前記モノクローナル抗体を、効率よく、安価に、簡便に供給することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のジンセノシド化合物の検出方法によれば、高い感度でジンセノシド化合物を簡便に検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のモノクローナル抗体の製造方法によれば、前記モノクローナル抗体を簡便に、効率よく安価に製造することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、１つの側面では、式（１）：
【００３２】
【化１１】
【００３３】
に示されるジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体に関する。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、ジンセノシドＲｅに反応するモノクローナル抗体であり、いいかえれば、ジンセノシドＲｅに高い親和性で結合するモノクローナル抗体である。また、本発明のモノクローナル抗体は、他の側面では、ジンセノシド化合物に対して、高い特異性で結合するモノクローナル抗体である。
【００３４】
また、本発明のモノクローナル抗体のサブクラスは、ＩｇＧ１であり、軽鎖は、κ鎖である。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、ジンセノシド化合物に対し、交差反応性を示すが、ジンセノシド化合物以外の化合物には、交差反応性を示さないという優れた効果を発揮する。したがって、本発明のモノクローナル抗体によれば、ジンセノシド化合物の単離や検出を行なうことができ、特に、ジンセノシドＲｅを高い特異性で単離や検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体により認識されるジンセノシド化合物としては、下記式（７）：
【００３７】
【化１２】
【００３８】
に示されるプロトパナクサトリオールをアグリコンの基本骨格とするジンセノシド化合物及び下記式（８）：
【００３９】
【化１３】
【００４０】
に示されるプロトパナクサジオールをアグリコンの基本骨格とするジンセノシド化合物が挙げられる。
【００４１】
前記ジンセノシド化合物としては、具体的には、例えば、下記式（１）：
【００４２】
【化１４】
【００４３】
により示されるジンセノシドＲｅ、式（２）：
【００４４】
【化１５】
【００４５】
に示されるジンセノシドＲｇ１、式（３）：
【００４６】
【化１６】
【００４７】
に示されるジンセノシドＲｄ、式（４）：
【００４８】
【化１７】
【００４９】
に示されるジンセノシドＲｃ、式（５）：
【００５０】
【化１８】
【００５１】
に示されるジンセノシドＲｂ１等が挙げられる。
【００５２】
前記「特異性」は、例えば、抗原に対する交差反応性及び抗原との親和性により評価される。前記「抗原に対する交差反応性」は、各種糖化合物、例えば、ジンセノシド化合物、他の化合物等を抗原として用い、ＥＬＩＳＡ法、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法、免疫電気泳動法等により、評価されうる。また、前記「抗原との親和性」は、モノクローナル抗体と抗原との結合速度定数、解離速度定数等により評価されうる。
【００５３】
本発明のモノクローナル抗体は、さらに他の側面では、ジンセノシド化合物、具体的には、例えば、ジンセノシドＲｅとジンセノシドＲｇ１とジンセノシドＲｄとに対して少なくとも反応し、かつ式（６）：
【００５４】
【化１９】
【００５５】
に示されるグリチルリチンとは少なくとも反応しないモノクローナル抗体である。
【００５６】
本発明のモノクローナル抗体は、別の側面では、ジンセノシドＲｅに対する反応性を１００％とした場合、例えば、ジンセノシドＲｇ１及びジンセノシドＲｄに対する交差反応性が、少なくとも７０％である。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ジンセノシドＲｅに対する反応性を１００％とした場合、例えば、ジンセノシドＲｃ及びジンセノシドＲｂ１それぞれに対する交差反応性が、少なくとも０．０４５％であり、サイコサポニンａ、ジギトニン、ソラソニン、デオキシコール酸、グリチルリチン、エルゴステロール、ソラマルジン、コレステトール、β−シトステロール及びチクセツサポニンそれぞれに対する交差反応性は、０．００９％未満である。
【００５７】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、
（Ａ）ジンセノシドＲｅと、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンとの複合体を形成させる工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた複合体を用いて、動物を免疫し、抗体産生細胞を得る工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る工程、及び
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る工程、
を行なうことにより得られうる。
【００５８】
したがって、本発明は、別の側面では、前記工程（Ａ）〜（Ｃ）を含む、本発明のモノクローナル抗体の製造方法に関する。
【００５９】
前記工程（Ａ）において、抗原としてジンセノシドＲｅを用い、該抗原と血清アルブミンとの複合体を形成させる。かかる複合体の形成には、例えば、ジンセノシドＲｅを、該ジンセノシドＲｅの糖部分を開環するに適した試薬を用いて処理して、糖部分を開環し、アルデヒド基とし、該糖部分に血清アルブミンを結合させることにより、前記複合体を形成させることができる。本発明においては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル測定により、ＢＳＡ又はＨＳＡの１分子当たり２〜８分子のジンセノシドＲｅが結合されていることを確認したジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ（又はＨＳＡ）複合体（図１参照）を用いることが望ましい。
【００６０】
前記試薬としては、過ヨウ素酸塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００６１】
ついで、前記工程（Ａ）で得られた複合体を用いて、動物を免疫し、抗体産生細胞を得る〔工程（Ｂ）〕。
【００６２】
前記工程（Ｂ）において、動物の免疫法としては、例えば、フロイントの完全アジュバントを併用する手法等が挙げられる。
【００６３】
前記動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ等が挙げられる。
【００６４】
前記抗体産生細胞としては、例えば、脾臓、リンパ節、末梢血液等から分離した細胞が挙げられる。かかる抗体産生細胞は、慣用の手法により単離されうる。
【００６５】
その後、前記工程（Ｂ）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る〔工程（Ｃ）〕。
【００６６】
前記工程（Ｃ）では、具体的には、例えば、
（１）骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）を培養増殖し、調製する工程、
（２）前記工程（Ｂ）得られた抗体産生細胞と前記工程（１）で得られた骨髄腫細胞とを、ポリエチレングリコール等の融合促進剤を媒体として融合させ、ハイブリドーマを得る工程、
（３）前記工程（２）で得られたハイブリドーマを、ＨＡＴ培地等の選択培地にて培養（増殖）する工程、
（４）得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする工程、
（５）選抜されたハイブリドーマをクローニングする工程、及び
（７）得られたハイブリドーマをインビトロ又は動物腹腔内で培養（増殖）して、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る工程、
が行なわれうる。
【００６７】
前記骨髄腫細胞としては、各種の哺乳動物の細胞株が利用可能であり、特に限定されないが、抗体産生細胞の調製に用いた動物と同種の細胞株を使用するのが好ましい。本発明のモノクローナル抗体を作製するのに好ましい組み合わせとしては、マウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞との組み合わせが挙げられる。なお、用いる細胞は、未融合細胞と融合細胞とを区別化する観点から、好ましくは、細胞融合の後に、未融合の骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマのみが増殖可能である細胞、例えば、特定の薬剤抵抗性を有する細胞が望ましい。例えば、８−アザグアニン抵抗性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有するため、有利である。前記骨髄腫細胞としては、具体的には、マウス骨髄腫細胞株、ＰＡＩ、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩ、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３．、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＦＯ、Ｓ１９４／５ＸＸＯ、ＢＵ．１、ＭＰＣ１１−４５．６．、ＴＧ．１．７等が挙げられる。
【００６８】
細胞融合は、通常ＭＥＭ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＩＭＤＭ培地等のＥ−ＲＤＦ培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合促進剤の存在下に混合（混合比は、通常１：４〜１：１０）することにより行なわれうる。好ましい融合促進剤としては、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。前記ＰＥＧは、通常、使用濃度：３０〜５０％で用いられうる。
【００６９】
細胞融合後の細胞は、１０重量％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有Ｅ−ＲＤＦ培地等で適当に希釈し、遠心分離する。沈殿した細胞を、選択培地（例えば、ＨＡＴ培地等）で浮遊し、９６穴ウェルマイクロプレートに接種した後に、５体積％ 炭酸ガス培養装置で培養する。選択培地で生育してくる細胞がハイブリドーマである。
【００７０】
抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、常法により行なうことができ、特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマの増殖した培養液を採取し、該培養液とジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ（又はＨＳＡ）複合体とを反応させ、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識した２次抗体と反応させるＥＬＩＳＡ法により目的の抗ジンセノシドＲｅ抗体産生能を有するハイブリドーマを選抜することができる。
【００７１】
抗体産生ハイブリドーマを含むことが確認された培養ウェル中の細胞を限界希釈法等によりクローニングを行ない、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。
【００７２】
得られたハイブリドーマを、無血清培地のような適切な培地中でインビトロ培養することにより、その培養上清から、本発明のモノクローナル抗体が得られる。ここで、本発明のモノクローナル抗体は、前記培養上清を、例えば、飽和硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー（例えば、プロテインＧカラム、抗イムノグロブリンカラムプロテインＡカラム等）等により精製することにより得られうる。なお、本発明のモノクローナル抗体を、大量に生産する場合には骨髄腫細胞由来動物と同種の動物にプリスタン等の鉱物油を腹腔内投与し、ハイブリドーマを接種し、その後、腹水を採取し、通常の抗体分離操作を行なうことにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に得ることができる。
【００７３】
得られたモノクローナル抗体は、例えば、免疫グロブリンクラス、軽鎖、分子量、その他の特性等について、通常の方法（例えば、オクタロニー法）で決定することにより評価されうる。また、分子量は、例えば、シナピン酸をマトリックスとするＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル測定により評価されうる。
【００７４】
なお、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ４Ｇ１０と命名・表示され、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８（寄託日：２００４年８月２７日）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１−１）に寄託されているハイブリドーマより、慣用の方法により、安定に、効率よく製造されうる。
【００７５】
したがって、本発明は、さらに他の側面では、本発明のモノクローナル抗体を産生する前記寄託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８（プライベートネーム：ハイブリドーマ４Ｇ１０）のハイブリドーマに関する。
【００７６】
本発明のハイブリドーマは、例えば、１チューブあたり４．０×１０6細胞となるように、無血清Ｅ−ＲＤＦ培地〔組成：１Ｌあたり商品名：極東Ｅ−ＲＤＦ培地 １７．７ｇ［極東製薬工業株式会社（製品コード２６５００）］、１００μｇ／ｍｌ インスリン、３５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、２０μＭ エタノールアミン、２５ｎＭ セレニウム〕：ＦＣＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製、ＳＨ３００８０．０２）：ＤＭＳＯ（７：２：１）に懸濁し、１℃／１分の冷却速度で−８０℃まで凍結し、液体窒素中で保管されうる。
【００７７】
また、凍結保存された前記ハイブリドーマは、３７℃の水浴中、浸透させながら融解し、完全融解直前に氷中に移す。融解細胞懸濁液を、１０ｍｌの培地に移し、４℃で１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を捨て、残った細胞に１０ｍｌの培地を加え、４℃で１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、細胞を洗浄する。得られた細胞を通常どおり培養することにより、適宜使用されうる。
【００７８】
また、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、前記受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８のハイブリドーマを、適切な培地中、５体積％ ＣＯ2、３７℃の条件下に培養して、培養上清を得、該培養上清から、モノクローナル抗体を精製することにより得られうる。
【００７９】
前記培地としては、本発明のハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるに適した慣用の栄養培地又は慣用の基本培地の改変培地等が挙げられる。前記基本培地としては、例えば、前記無血清Ｅ−ＲＤＦ培地、ＲＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地等のＥ−ＲＤＦ培地等が挙げられる。また、培地のｐＨは、７〜８、好ましくは、約７．４であることが望ましい。
【００８０】
なお、本発明のモノクローナル抗体には、前記受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体も含まれる。
【００８１】
また、本発明においては、前記モノクローナル抗体と同等の反応性を示すものであれば、本発明のモノクローナル抗体の一部、すなわち、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｄ等が挙げられる。かかる抗体断片は、例えば、ペプチダーゼ等により、モノクローナル抗体を消化することにより得られうる。例えば、Ｆａｂフラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をパパインにより処理することにより得られ、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をペプシンにより処理することにより得られうる。
【００８２】
本発明は，別の側面では、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片と、被検試料とを接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成の有無を測定することを特徴とする、ジンセノシド化合物の検出方法に関する。
【００８３】
本発明の検出方法によれば、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片が用いられているため、ジンセノシド化合物を、高い感度で、簡便に検出することができるという優れた効果を発揮する。
【００８４】
なお、本発明の検出方法は、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の量を測定することにより、ジンセノシド化合物を、定量的に検出することもできる。
【００８５】
本発明の検出方法においては、まず、被検試料とモノクローナル抗体又は抗体断片とを接触させる。
【００８６】
前記被検試料としては、例えば、薬用人参、ハリギリ等に代表されるウコギ科植物等の植物の抽出物、薬用人参配合漢方製剤、ヒト又は非ヒト動物の血清等が挙げられる。
【００８７】
前記薬用人参としては、特に限定されないが、例えば、白参（Ｗｈｉｔｅ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ）、紅参（Ｒｅｄ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｇｉｎｓｅｎｇ Ｒａｄｉｘ Ｒｕｂｒａ）、西洋人参（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｉｎｓｅｎｇ）、田七人参（Ｓａｎ−ｃｈｉ Ｇｉｎｓｅｎｇ）、竹節人参（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｇｉｎｓｅｎｇ、Ｐａｎａｃｉｓ Ｊａｐｏｎｉｃｉ Ｒｈｉｚｏｍａ）、毛人参（Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｇｉｎｓｅｎｇ）等が挙げられる。
【００８８】
本発明の検出方法により検出しうるジンセノシド化合物としては、ジンセノシドＲｅ、ジンセノシドＲｇ１、ジンセノシドＲｄ、ジンセノシドＲｃ、ジンセノシドＲｂ１等が挙げられる。
【００８９】
操作の簡便性、感度の向上等の観点から、本発明の検出方法に用いられるモノクローナル抗体又は抗体断片は、標識物質で標識されていることが望ましい。
【００９０】
前記標識物質としては、例えば、酵素、ＦＩＴＣ、ビオチン、金コロイド等が挙げられる。
【００９１】
本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、免疫沈降法等で検出されうる。
【００９２】
なお、本発明の検出方法は、他の実施態様では、
１） 被検試料を、親水性ポリエーテルスルホン膜上に展開して、それにより、試料中のジンセノシド化合物が存在する場合、試料中の他の化合物とジンセノシド化合物とを分離するステップ、
２） 該ジンセノシド化合物を、該膜上に固定化するステップ、
３） 該膜上に固定化されたジンセノシド化合物を、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片により検出するステップ、及び
４） 検出されたジンセノシド化合物に対応するスポットの面積を測定するステップ、
を含む検出方法が挙げられる。
【００９３】
前記親水性ポリエーテルスルホン膜は、孔サイズが、例えば、０．３〜１．０μｍのものであればよい。かかる親水性ポリエーテルスルホン膜は、例えば、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、商品名：ＭｕｓｔａｎｇTMＥを、適切な手段により正に荷電するように処理し、シート状に加工することにより得られる。なお、本発明の分析方法においては、前記親水性ポリエーテルスルホン膜と同等の性質を有する膜、例えば、イオン交換能を有し、正に荷電し、孔サイズが、０．３〜１．０μｍの膜を用いてもよい
【００９４】
試料中に含まれる配糖体を展開するための展開液としては、高極性溶媒であればよく、アセトニトリル、メタノール系溶媒が挙げられ、逆相クロマトグラフィー、分離（溶出）力の観点から、特にアセトニトリル系溶媒が好ましい。
【００９５】
親水性ポリエーテルスルホン膜へのジンセノシド化合物の固定化は、ジンセノシド化合物の糖部分を開環させうる試薬、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム等の過ヨウ素酸塩等が挙げられる。固定化は、例えば、前記親水性ポリエーテルスルホン膜を、親水性ポリエーテルスルホン膜が浸る程度（例えば、２０〜３０ｍｌ）の量の過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）に浸漬し、室温（２５℃）で１時間インキュベーションすることにより行なわれうる。
【００９６】
検出されたジンセノシド化合物に対応するスポットの面積は、例えば、画像解析手段により分析し、かかる分析結果に基づき、スポット面積を数値化し、適切な計算手段、例えば、表計算ソフトを用いて、標準品の濃度、エリア面積をＸ軸及びＹ軸にとり、Ｘ軸のみ対数の検量線を作成することにより解析されうる。前記画像解析手段は、例えば、
− 膜（６．３×９．０ｃｍ）を、２００ｄｐｉ、ＰＩＣＴファイル（保存形態）、８ビットグレイスケールで画像として取りこみ、
− 該画像について、Ｕｎｄｏ ＆ Ｃｌｉｐｂｏａｒｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｉｚｅで内部画像バッファーの大きさを３００Ｋに設定し、
− 得られた画像データについて、Ｆｌｏｙｄ−Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇのエラー拡散アルゴリズムのデフォルトパラメータで、画像全体のヒストグラムから閾値を設定して、画像中のスポットに対応する部分及びそれ以外の部分、すなわち、閾値以上の部分と、閾値以下の部分とに分離させ、
− Ｓｍｏｏｔｈ機能により、画像のノイズを減少させ、
− Ｍｉｎｉ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅを設定せず、面積（Ａｒｅａ）、各スポットの長径（Ｅｌｌｉｐｓｅ Ｍａｊｏｒ Ａｘｉｓ）及び短径（Ｅｌｌｉｐｓｅ Ｍｉｎｏｒ Ａｘｉｓ）を選択するよう設定し、画像上の発色スポットを選択して、Ｐｉｘｅｌで、測定する
ことにより、発色スポットの数値化を行ない得る手段、例えば、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ、ＬＩＡ３２、Ｉｍａｇｅ Ｊ、これらと同様の機能を有する汎用ソフトウェア等が挙げられる。前記計算手段は、前記画像解析手段により得られた数値を元に、検量線を作成できる手段であればよく、例えば、マイクロソフト社製、商品名：Ｅｘｃｅｌ、ヒューリンクス社製、商品名：Ｋａｌｅｉｄａ Ｇｒａｐｈ等又はそれらと同等の機能を有する手段が挙げられる。
【００９７】
また、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片は、ジンセノシド化合物のアフィニティー精製に用いることもできる。例えば、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片を、慣用の支持体（例えば、セルロース、ポリスチレンビーズ等）に結合させて得られる担体として、ジンセノシド化合物のアフィニティー精製に用いることができる。本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片に特異的に吸着したジンセノシド化合物の溶出は、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との間のイオン結合、水素結合、疎水結合等を解離させる試薬、例えば、酢酸アンモニウム、ブタノール等により行なわれうる。
【００９８】
以下、下記実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００９９】
（１）抗原の調製
ジンセノシドＲｅ溶液〔ジンセノシドＲｅ（和光純薬株式会社製） １０ｍｇを、８０体積％メタノール １．０ｍｌに溶かした溶液〕を、過ヨウ素酸ナトリウム溶液〔過ヨウ素酸ナトリウム ４ｍｇを、水 ０．５ｍｌに溶かした溶液〕に攪拌しながら添加し、１時間反応させた。得られた産物に、１．０重量％ ＢＳＡ〔ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕含有炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）を添加して５時間攪拌し、反応させた。反応後、得られた産物を、水に対して、透析し、ジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体 １０ｍｇを得た。なお、ＨＳＡ〔ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕を用いて、同様にジンセノシドＲｅ−ＨＳＡ複合体を調製した。
【０１００】
（２）抗原中のハプテン数の検討
前記（１）で得られたジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体 ２μｇ相当量に、過剰量のシナピン酸（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸）を添加して混合した。得られた混合物 ２μｇを、ＪＥＯＬ社製、商品名：ＪＭＳ−ＥＬＩＴＥ ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにて測定した。得られたスペクトラムを図１に示す。
【０１０１】
図１に示されるスペクトログラムから、ＢＳＡ１分子に対して平均５分子のジンセノシドＲｅが結合していることが確認された。
【０１０２】
（３）免疫脾細胞の調製
前記（１）で得られたジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体 ５０μｇを、フロイントの完全アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与した。以後、２週間の間隔で５０μｇのジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体のみ １００μｇを、前記マウスに投与し免疫を完了した。３日後にマウスを、麻酔下安楽殺し、脾臓を摘出した。脾臓を細断した後、１００メッシュのナイロン網でろ過し、脾臓の単離細胞を得た。
【０１０３】
（４）ハイブリドーマの調製
前記（３）で単離した免疫脾細胞に、低張液（１５５ｍＭ 塩化アンモニウム）を添加し、赤血球を溶出させた。Ｅ−ＲＤＦ培地〔商品名：極東Ｅ−ＲＤＦ培地 １７．７ｇ［極東製薬工業株式会社（製品コード２６５００）]〕で脾細胞を３回洗浄した。
【０１０４】
一方、マウス骨髄腫細胞を、前記Ｅ−ＲＤＦ培地で３回洗浄した。脾細胞とマウス骨髄腫細胞との細胞数を計測し、脾細胞と骨髄腫細胞とを１０：１の割合に混合し、得られた混合物を遠心分離（４００×ｇ、１０分間、４℃）した。
【０１０５】
上清を捨て、沈殿した細胞を充分解きほぐし、該細胞に、５０％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００溶液〔ＰＥＧ４０００（シグマ社製）を、前記Ｅ−ＲＤＦ培地で希釈した溶液〕 １．０ｍｌを滴下し、融合を行なった。細胞を、３７℃、３０秒間静置した後、前記Ｅ−ＲＤＦ培地 ５ｍｌを５分間かけて添加した。得られた産物を、１０００ｒｐｍ（４００×ｇ）で１０分間遠心分離した。得られた沈殿を、１０重量％ ＦＣＳ添加ＩＭＤＭで洗浄し、遠心分離（４００×ｇ、１０分間、４℃）して、上清を捨てた。ヒポキサンチン１０-2Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ及びチミジン１．５×１０-5Ｍを添加した（ＨＡＴ）１０重量％ ＦＣＳ添加Ｅ−ＲＤＦ培地（以下、ＨＡＴ−ＦＣＳ含有Ｅ−ＲＤＦ培地） １００ｍｌを用いて、沈殿した細胞を再び懸濁した。得られた細胞懸濁液 １００μｌを、９６ウェルマイクロプレートに分注し、３７℃、５体積％ ＣＯ2でインキュベートした。３日毎に、１ウェルあたり、ＨＡＴ−ＦＣＳ含有Ｅ−ＲＤＦ培地 ５０μｌを前記９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに追加し、細胞の増殖を確認した。
【０１０６】
（５）抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマが増殖したウェル中の培養上清を採取した。前記培養上清を、ジンセノシドＲｅ−ＨＳＡ複合体を結合させた別のウェルに添加し、直接ＥＬＩＳＡによりジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行なった。すなわち、９６ウェルマイクロプレートに、ジンセノシドＲｅ−ＨＳＡ複合体 ０．１μｇ／１００μｌ／ウェルを分注し、３７℃で１時間インキュベートしてウェルに吸着させた。前記ウェルに、培養上清を１００μｌずつ分注し、３７℃で６０分間インキュベートして、抗原抗体反応を行なった。
【０１０７】
その後、ウェルを、０．０５重量％ Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）含有リン酸緩衝食塩水（Ｔ‐ＰＢＳ）で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（２次抗体）１０００倍希釈液をウェルあたり１００μｌ添加し、１時間後にＴ−ＰＢＳで洗浄した。０．００３体積％ 過酸化水素、ＡＢＴＳ〔２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）〕 ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。２０分後、プレートリーダー〔ヌンク社製、商品名：ＩｍｍｕｎｏＭｉｎｉ ＮＪ−２３００〕を用いて４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。発色したウェルの細胞を採取した。
【０１０８】
（６）抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのクローニング
抗体産生ハイブリドーマを限界希釈してウェルに分注した。抗体産生能を持ち、かつ増殖したハイブリドーマを同様に３回クローニングして所望のクローン、すなわち、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ４Ｇ１０を得た。
【０１０９】
（７）抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体の調製
前記抗体産生ハイブリドーマ４Ｇ１０を無血清培地（１００μｇ／ｍｌ インスリン、３５μｇ／ｍｌ トランスフェリン、２０μＭ エタノールアミン、２５ｎＭ セレニウム添加Ｅ−ＲＤＦ培地）で、３７℃、５％ ＣＯ2の炭酸ガス培養器〔ＳＡＮＹＯ社製、商品名：ＣＯ2インキュベータ[ＭＣＯ−１８ＡＩＣ（ＵＶ）］〕中で培養した。上清を、トリス−塩酸緩衝液でｐＨ７に調整した。得られた産物を、プロテインＧアフィニティカラム〔アマシャム バイオ社製、商品名：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ〕に供した。カラムを１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、吸着した抗体を、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ２．７）で溶出した。得られた抗体溶液を、ＰＢＳに対して３回透析し、最後に凍結乾燥して、精製抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体（モノクローナル抗体４Ｇ１０）を得た。
【０１１０】
（８）モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスと分子量
精製モノクローナル抗体４Ｇ１０について、オクタロニー法により免疫グロブリンクラスを調べた。その結果、モノクローナル抗体４Ｇ１０は、ＩｇＧ１のサブクラスに属し、κ軽鎖を保有するものであることが示された。
【０１１１】
また、精製モノクローナル抗体４Ｇ１０と、シナピン酸とを混合して、得られた試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（ＪＥＯＬ社製、商品名：商品名：ＪＭＳ−ＥＬＩＴＥ ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）により、純度を確認するとともに分子量を調べた。図２にモノクローナル抗体４Ｇ１０について測定したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトラムを示す。その結果、精製モノクローナル抗体４Ｇ１０は、分子量約１４７５００であった。また、純度は、総凍結乾燥物に対して、７０重量％であった。
【実施例２】
【０１１２】
実施例１で作製したモノクローナル抗体４Ｇ１０の性質を調べるため、以下のように、競合的ＥＬＩＳＡ法による定量試験を行なった。ジンセノシドＲｅ−ＨＳＡ複合体溶液（１μｇ／ｍｌ） １００μｌを各ウェルに添加し、１時間インキュベートして、吸着させた。非特異的結合を除去するために、各ウェルに、スキンミルク添加ＰＢＳ溶液 ３００μｌを添加し、１時間インキュベートしてブロッキングした。その後、各ウェルに、各種濃度のジンセノシドＲｅの２０％メタノール溶液 ５０μｌを添加し、さらに、モノクローナル抗体４Ｇ１０溶液（０．１８７μｇ／ｍｌ） ５０μｌを添加して１時間インキュベートした。ウェルを、Ｔ−ＰＢＳで３回洗浄し、１０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＩＣＮ社製、商品名：ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ−ＣＯＮＪＵＧＡＴＥＤ ＧＯＡＴ ＩＧＧ ＦＲＡＣＴＩＯＮ ＴＯ ＭＯＵＳＥ ＩＧＧ ＦＣ−２ＭＬ） １００μｌを添加した。
【０１１３】
１時間インキュベートした後、ウェルをＴ−ＰＢＳで洗浄した。ウェルに、０．００３％ 過酸化水素、ＡＢＴＳ ０．３ｍｇ／ｍｌ含有クエン酸緩衝液を添加して発色させた。１５分後、４０５ｎｍにおける発色の吸光度を測定した。各濃度のジンセノシドＲｅの吸光度から検量線を作成した。その結果を図３に示す。
【０１１４】
図３に示されるように、ジンセノシドＲｅの濃度は、２０〜４００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲において吸光度と良い相関を有していた。したがって、モノクローナル抗体４Ｇ１０により、ジンセノシドＲｅに対する優れた定量手段が提供されることが示された。
【実施例３】
【０１１５】
実施例１で得られたモノクローナル抗体４Ｇ１０の特異性を確かめるために、ジンセノシド、各種ステロイド及びトリテルペン化合物に対する交差反応性を調べた。
【０１１６】
各化合物（１ｍｇ）を正確に秤り、該化合物に、２０体積％ メタノール溶液 １ｍｌに懸濁し、１０分間超音波処理した。上清を、２０体積％ メタノール溶液で希釈し、各種濃度の検液を調製した。１ウェルあたり１００μｌの検液スタンダードであるジンセノシドＲｅ溶液を、イムノプレートに分注し１時間インキュベートした。
【０１１７】
プレートの各ウェルをブロッキング後、一次抗体溶液〔モノクローナル抗体４Ｇ１０（０．１８７μｇ／ｍｌ）を添加し、１時間インキュベートした。次に、二次抗体溶液〔前記ペルオキシダ−ゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体〕を添加し、１時間インキュベートした。その後、各ウェルに、基質溶液を添加し、発色強度を測定した。
【０１１８】
交差反応性ＣＲは、式：ＣＲ（％）＝〔（Ａ／Ａｏ＝０．５となるジンセノシドＲｅの濃度）／（Ａ／Ａｏ＝０．５となる検液の濃度）〕×１００
（式中、Ａは、サンプルの吸光度、Ａｏは、２０体積％ メタノール溶液の吸光度を表わす）
により算出した。その結果を表１に示す。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
表１に示されるように、モノクローナル抗体４Ｇ１０は、ジンセノシドＲｅをはじめ、ジンセノシドＲｇ１、ジンセノシドＲｄ等のプロトパナクサトリオール系ジンセノシド化合物及びプロトパナクサジオール系ジンセノシド化合物に幅広く親和性を有し、ジンセノシド類以外の化合物には殆ど交差反応性を示さないことがわかった。
【実施例４】
【０１２１】
実施例１で得られたモノクローナル抗体４Ｇ１０を用いるＥＬＩＳＡ法により各種人参中の総ジンセノシド含有量を測定した。測定は、各種人参の粉末５０ｍｇを、１００体積％ メタノール １ｍｌで５回抽出し、抽出液を合わせて遠心分離に供し、その上清を２０体積％メタノールで適切な濃度に希釈して実施例２に準じて定量することにより行なった。
【０１２２】
結果を表２に示す。表中、「ＥＬＩＳＡ」は、試料について、前記抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体を用いて分析した結果を示し、「ＨＰＬＣ」は、試料を、「ＨＰＬＣ」で分析した結果を示す。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
なお、ＨＰＬＣ条件は、ジンセノシドＲｂ１、ジンセノシドＲｃ及びジンセノシドＲｄの場合、カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（商品名）５Ｃ１８（４．５×１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4含有３０％（体積）ＣＨ3ＣＮ（水：アセトニトリル＝７０：３０）、流速：１．０ｍｌ／分、検出：ＵＶ２０２ｎｍ、リテンションタイム：ジンセノシドＲｂ１について、１３分、ジンセノシドＲｃについて、１７分、ジンセノシドＲｄについて、３７分であり、ジンセノシドＲｅ及びジンセノシドＲｇ１の場合、カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ（商品名）５Ｃ１８（４．５×１５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、溶離液：０．５％（体積）Ｈ3ＰＯ4含有２０％（体積）ＣＨ3ＣＮ（リン酸：水：アセトニトリル＝０．５：８０：２０）、流速：１．０ｍｌ／分、検出：ＵＶ２０２ｎｍ、リテンションタイム：ジンセノシドＲｅについて、１９分、ジンセノシドＲｇ１について、２２分である。
【０１２５】
その結果、表２に示されるように、「ＥＬＩＳＡ」及び「ＨＰＬＣ」両方の数値が近似していた。したがって、モノクローナル抗体４Ｇ１０を用いる「ＥＬＩＳＡ」は、人参中に微量に含有されているジンセノシド化合物を特異的に定量分析できることがわかった。
【実施例５】
【０１２６】
実施例１で得られたモノクローナル抗体４Ｇ１０を用いて、以下のように、各種人参中のジンセノシドＲｅ含有量を測定した。
【０１２７】
各種人参の粉末５０ｍｇをメタノール１ｍｌで５回抽出し、抽出液を合わせて遠心分離に供し、その上清 １μｌを、親水性ポリエーテルスルホン膜（商品名：ＭｕｓｔａｎｇTMＥ、ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、大きさ：６．３ ｃｍ×９．０ｃｍ、厚さ１４０μｍ、孔サイズ０．４５μｍ）にスポットした。その後、ポリエーテルスルホン膜上の試料を、水：メタノール：酢酸（体積比）＝５５：４５：１で４５分間展開した。その後、ポリエーテルスルホン膜を、過ヨウ素酸ナトリウム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ） ３０ｍｌ中に１時間浸漬させ、酸化反応を行なった。反応後、膜を水洗いし、１重量％ＢＳＡ含有炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に移し、３時間、ジンセノシドＲｅの糖部分とＢＳＡとを反応させた。
【０１２８】
反応後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で洗浄した。非特異的結合を避けるために、膜をスキンミルク−ＰＢＳ ３０ｍｌで、３時間ブロッキングした。ついで、ポリエーテルスルホン膜と、抗ジンセノシドＲｅモノクローナル抗体溶液（０．１８７μｇ／ｍｌ）とを３時間反応させた。反応後の膜を、Ｔ−ＰＢＳで２回洗浄し、該膜を、１０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体と、１時間反応させた。反応後、膜を、Ｔ−ＰＢＳで２回、水で１回洗浄し、基質の４−クロロ−１−ナフトールと過酸化水素とを用いて、４０分間維持して染色した。
【０１２９】
その後、展開した膜を抗体染色した。結果を図４に示す。図中、白参は、レーンＩ、紅参は、レーンＩＩ、毛人参は、レーンＩＩＩ、田七人参は、レーンＩＶ、西洋人参は、レーンＶ、竹節人参は、レーンＶＩに示し、レーン１〜５は、ジンセノシドＲｅ標品を示す。
【０１３０】
その結果、図４に示されるようなスポットが得られた。かかる結果より、人参に固有なジンセノシドＲｅが感度よく検出されていることがわかる。
【０１３１】
検出されたスポットについて、画像スキャナー（ＥＰＳＯＮ社製、商品名：ＧＴ−９７００Ｆ）を用いて、スキャン条件：白黒写真モード、解像度２００ｄｐｉでスキャンして、データをコンピューターに入力した。その後、各画像について、画像解析ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ）を用いて、単位をミリメーターとし、面積測定用の設定で、面積（Ａｒｅａ）、スポットの長径（Ｅｌｌｉｐｓｅ Ｍａｊｏｒ Ａｘｉｓ）及び短径（Ｅｌｌｉｐｓｅ Ｍｉｎｏｒ Ａｘｉｓ）の条件で数値化した。数値化されたデータについて、表計算ソフト（マイクロソフト社製、商品名：Ｅｘｃｅｌ）を用いて、Ｙ軸をＡｒｅａ、Ｘ軸を標品量（μｇ）の対数表示として、検量線を作成し、定量値を算出した。また、対照として、ＨＰＬＣにより定量した結果を示す。結果を表３に示す。表中、「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ」は、試料について、前記ポリエーテルスルホン膜を用いた検出とＮＩＨ Ｉｍａｇｅによる数値化とＥｘｃｅｌによる算出とにより分析した結果を示し、「ＨＰＬＣ」は、試料を、「ＨＰＬＣ」で分析した結果を示す。
【０１３２】
【表３】
【０１３３】
その結果、「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ」及び「ＨＰＬＣ」両方の数値が近似していた。したがって、本発明のモノクローナル抗体を用いる「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ」は、人参中に微量含有されているジンセノシドＲｅを定量分析できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明により、「ＥＬＩＳＡ」、「ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ」の通常の免疫測定法に適用すれば、前処理が不要な簡便かつ高感度で再現性の優れたジンセノシド化合物の分析が可能となり、各種の人参及びその他の植物、それらの諸器官、各種の漢方製剤等に含有されるジンセノシド化合物を定量することにより、薬理学的品質評価を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、ジンセノシドＲｅ−ＢＳＡ複合体の形成を確認するために測定したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳのスペクトラムの１例を示す。
【０１３６】
【図２】図２は、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体の純度を確認し分子量を調べるために測定したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの１例を示す。
【０１３７】
【図３】図３は、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法におけるＧＲｇ１濃度と吸光度の関係を示すグラフである。
【０１３８】
【図４】図４は、人参抽出物のジンセノシドＲｅの検出結果である。図中、白参は、レーンＩ、紅参は、レーンＩＩ、毛人参は、レーンＩＩＩ、田七人参は、レーンＩＶ、西洋人参は、レーンＶ、竹節人参は、レーンＶＩに示し、レーン１〜５は、ジンセノシドＲｅ標品を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
に示されるジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ジンセノシドＲｅと式（２）：
【化２】
に示されるジンセノシドＲｇ１と式（３）：
【化３】
に示されるジンセノシドＲｄとに対して少なくとも反応し、かつ
式（６）：
【化４】
に示されるグリチルリチンとは少なくとも反応しないものである、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ジンセノシドＲｇ１及びジンセノシドＲｄに対する交差反応性が、ジンセノシドＲｅに対する反応性を１００％として、少なくとも７０％である、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマにより産生される、請求項１〜３いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその一部。
【請求項５】
受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の抗体断片。
【請求項７】
受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は請求項６記載の抗体断片と、被検試料とを接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成の有無を測定することを特徴とする、ジンセノシド化合物の検出方法。
【請求項９】
ジンセノシド化合物が、式（１）：
【化５】
に示されるジンセノシドＲｅ、式（２）：
【化６】
に示されるジンセノシドＲｇ１、式（３）：
【化７】
に示されるジンセノシドＲｄ、式（４）：
【化８】
に示されるジンセノシドＲｃ、又は式（５）：
【化９】
に示されるジンセノシドＲｂ１である、請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
（Ａ）式（１）：
【化１０】
に示されるジンセノシドＲｅと、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンとの複合体を形成させる工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた複合体を用いて、動物を免疫し、抗体産生細胞を得る工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る工程、及び
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る工程、
を含む、請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１】
式（１）：
【化１】
に示されるジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ジンセノシドＲｅと式（２）：
【化２】
に示されるジンセノシドＲｇ１と式（３）：
【化３】
に示されるジンセノシドＲｄとに対して少なくとも反応し、かつ
式（６）：
【化４】
に示されるグリチルリチンとは少なくとも反応しないものである、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
ジンセノシドＲｇ１及びジンセノシドＲｄに対する交差反応性が、ジンセノシドＲｅに対する反応性を１００％として、少なくとも７０％である、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマにより産生される、請求項１〜３いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその一部。
【請求項５】
受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８であるハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体と同一のエピトープを認識するモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の抗体断片。
【請求項７】
受領番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１８８のハイブリドーマ。
【請求項８】
請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体又は請求項６記載の抗体断片と、被検試料とを接触させ、ついで、該モノクローナル抗体又は抗体断片とジンセノシド化合物との複合体の形成の有無を測定することを特徴とする、ジンセノシド化合物の検出方法。
【請求項９】
ジンセノシド化合物が、式（１）：
【化５】
に示されるジンセノシドＲｅ、式（２）：
【化６】
に示されるジンセノシドＲｇ１、式（３）：
【化７】
に示されるジンセノシドＲｄ、式（４）：
【化８】
に示されるジンセノシドＲｃ、又は式（５）：
【化９】
に示されるジンセノシドＲｂ１である、請求項８記載の検出方法。
【請求項１０】
（Ａ）式（１）：
【化１０】
に示されるジンセノシドＲｅと、ウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンとの複合体を形成させる工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた複合体を用いて、動物を免疫し、抗体産生細胞を得る工程、
（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る工程、及び
（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られたハイブリドーマから、ジンセノシドＲｅに対するモノクローナル抗体を得る工程、
を含む、請求項１〜５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−７６８９６（Ｐ２００６−７６８９６Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６００２８（Ｐ２００４−２６００２８）
【出願日】平成１６年９月７日（２００４．９．７）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月７日（２００４．９．７）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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