抗ストレス剤
本発明は、乳酸菌の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用抗ストレス剤であり、この抗ストレス剤は、魚介類のストレスを予防又は治療するのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ストレスによる悪影響に対して魚介類に抵抗性を付与する抗ストレス剤に関する。本発明はまた、それを使用する養殖方法にも関する。
【背景技術】
従来、各種魚介類の養殖や観賞用水生動物の飼育を行なう場合、飼育育成環境の過密、温度の変化又は水質悪化、或いは輸送等のストレスによって、これら水生動物は体調を崩し、退色や変色、疾病に対する抵抗力の低下、摂餌の悪化、体格の貧弱化、肉質や脂乗りの低下等の弊害が生じることは知られている（特開平０９−３０８４４０号公報）。このようなストレスによる弊害を下記に例示する。
ブリの稚魚については、飼育水槽内に攻撃する個体（攻撃個体）と攻撃される個体（劣位個体）とがあり、劣位個体は強度のストレス状態におかれ、体重増加に支障がでる（平成８年度日本水産学会春季大会講演要旨集、ｐ６４、１９９６）。
アユについては、なわばりを持つことのできない非なわばり個体では、移動範囲が狭く、摂餌頻度が低いことから、なわばり個体と比較して成長率が低いとの報告（平成８年度日本水産学会春季大会講演要旨集、ｐ４３、１９９６）がある。ストレスのかかった劣位個体で、非なわばりアユと同様成長率が低くなると考えられる。
また、ヒラメのように神経質な魚では、選別のための池替えや池の掃除などの後には、そのストレスによって摂餌が悪くなる。トラフグでもヒラメと同様、池替えの後には摂餌が悪くなる。
さらに、観賞魚は、ストレスによって皮膚が退色及び変色し、本来鮮やかな色彩が消失する。
これらの悪影響を防止するため、抗生物質等の薬剤が汎用された。しかしながら、抗生物質等の薬剤はある程度の効果はあるが、動物体内への残留、環境汚染等の安全性の問題や、耐性菌の出現による弊害があり、現在は薬剤の使用を差し控える方向に向かっている。また、抗生物質製剤以外に生菌剤も知られている。生菌剤としては、光合成細菌（ＰＳＢ）、混合微生物（商品名「サイクル」：（株）スドー製、商品名「スーパーバイオ」：（株）トモフジ製）等が挙げられる。しかしながら、これら生菌剤の多くは、常温保存液体タイプであり、使用前の生菌保持率が概して悪い。そのため、使用に際しての生菌数が不充分であったり、使用環境条件が少しでも過酷になると効果が認められなかったりして、適性条件での使用が困難である場合が多く、目に見えて体質を改善し得るものは、未だ実用化に至っていないのが現状である。生菌である以上その生菌数の維持には、注意を払わなくてはならないから、その取り扱いが困難であり、工程管理が容易ではなかった。
【発明の開示】
本発明は、魚介類のストレスを有効に予防又は治療する製剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討した結果、乳酸菌の生菌体ではなく、予想外かつ驚くべきことに、乳酸菌の死菌体又はその処理物が魚介類用のストレスの予防又は治療に優れた効果を奏することを知見した。また、本発明者らは、乳酸菌の生菌体ではなく、有効成分として死菌体を使用する場合は、抗ストレス剤の製造に際して、有効成分が取り扱いやすく、工程管理が容易であり、製造された製剤中の有効成分が保存時並びに水中で安定性に富むことをも知見した。
すなわち、本発明は、
（１） 乳酸菌の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用抗ストレス剤、
（２）乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）又はビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレービ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）である上記（１）記載の魚介類用抗ストレス剤、
（３） 乳酸菌の死菌体が乳酸菌の加熱処理により得られる死菌体であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の魚介類用抗ストレス剤、
（４） 乳酸菌の死菌体がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）の加熱処理死菌体であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（５） 魚介類が養殖魚類又は観賞魚類であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（６） 魚介類が、海水魚又は淡水魚であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（７） 魚介類が、仔稚魚であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（８） 乳酸菌の死菌体又はその処理物の配合割合が、全体量に対して０．１〜５０質量％であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（９） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を含有する魚介類用飼料、
（１０） 飼料中の乳酸菌の死菌体又はその処理物の濃度が、０を超え２０００ｐｐｍ以下であることを特徴とする上記（９）記載の魚介類用飼料、
（１１） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を魚介類に給餌することを特徴とする魚介類のストレスの予防又は治療方法、
（１２） 乳酸菌の死菌体又はその処理物を魚介類に魚介類体重１ｋｇ当たり１日０．０００５〜７５ｍｇ給餌することを特徴とする魚介類のストレスの予防又は治療方法、
（１３） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を使用することを特徴とする魚介類の血清コルチゾール上昇抑制方法、
（１４） 上記（１）記載の魚介類用抗ストレス剤を使用することを特徴とする魚介類の養殖方法、
（１５） 魚介類の味質が改善される上記（１４）記載の養殖方法、及び
（１６） 養殖魚介類の生残率が改善される上記（１４）又は（１５）に記載の養殖方法、
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明において乳酸菌としては、公知の乳酸菌、例えば、ラクトバチルス属、ストレプトコックス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属又はビフィズス属する乳酸菌のいずれをも用いることができる。さらに詳しくは、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）又はビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレービ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）などが挙げられる。これら各種乳酸菌のうち、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が好ましい。
本発明に用いられるラクトバチルス・プランタラムに属する菌の代表的なものとしてラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を挙げることができるが、この菌は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７号（平成７年１１月３０日に寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−１５３１７号より移管）として寄託されている。本発明で用いられるラクトバチルス・プランタラムには、さらにラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＪＣＭ １１４９基準株およびラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１（微工研菌寄第１１９１２号）が含まれる。ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が最も好ましい。
上記の本発明に用いる菌は天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することにより得ることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としてはたとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等であり、炭素源としては、たとえば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデンなどを添加することができ、更に各種ビタミン類その他を添加することができる。培養温度は約２５〜４０℃、好ましくは約２７〜３５℃であり、培養時間は約１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。培地のｐＨは約３〜６、好ましくは約４〜６である。
培養終了後、菌体を採取した後、死菌体を調製してもよいし、又は菌体を培養液から一旦分離することなく、培養液中の菌体を死菌体にし、その死菌体を採取してもよい。菌体を採取する方法としては、例えば培養液に蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採取する方法がある。死菌体は、採取された生菌あるいは生菌を含んだ培養液ごと、たとえば加熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化することにより得られる。加熱処理により死菌体を得る場合、加熱温度は通常約６０〜１００℃、好ましくは約７０〜９０℃である。加熱手段としては、ヒーターを用いる公知の手段であってよい。加熱時間は所望の温度に達した後、通常約５〜４０分、好ましくは約１０〜３０分である。死菌体の処理物は、例えば、死菌体を凍結乾燥や噴霧乾燥することによって得られる。また、死菌体にデキストリンやセルロースなどの適当な賦形剤を加えて、これを凍結乾燥や噴霧乾燥することによっても得られる。死菌体の処理物はまた、死菌体の抽出物であってもよい。
本発明における魚介類としては、特に限定されず、淡水魚、海水魚、甲殻類のいずれであってもよく、また、養殖魚類、観賞魚類のいずれであってもよい。淡水魚としては、ウナギ、コイ、ニジマス、アユ、ティラピア、フナ、金魚類（例えば、ランチュウ、和金、コメット、朱文金、オランダシシガシラ、出目金等）、グッピー、アピストグラマ、ディスカス等が挙げられ、海水魚としては、クロマグロ、ブリ、タイ、ギンザケ、マアジ、ヒラメ、カレイ、クロソイ、トラフグ、カンパチ等が挙げられる。また、淡水魚及び海水魚のいずれにも属するものとして、サケ・マス類等が挙げられる。甲殻類としては、クルマエビ、ブラックタイガー、ウシエビ、コウライエビ、ガザミ等が挙げられる。
上記のような魚介類は、仔稚魚（小魚、子魚、稚魚、幼魚を含む）、成魚のいずれであってもよい。
本発明の抗ストレス剤は、乳酸菌の死菌体又はその処理物そのものであってよいし、死菌体又はその処理物を賦形剤又は希釈剤と混合した製剤であってもよい。製剤全体に対する死菌体又はその処理物の配合割合は好ましくは約０．０１〜９５質量％であり、より好ましくは約０．１〜５０質量％である。剤型としては、ペレット剤、錠剤、液剤、粉剤、粒剤、ペースト剤などが挙げられる。そのような製剤は魚介類に接触させたり、経口で与えることができる。
固状の賦形剤又は希釈剤としては、例えば、魚粉、骨粉、スキムミルク、綿実粕、小麦粉、小麦胚芽、米ぬか、ビール酵母、セルロース、ビタミン類（例えばβ−カロチン、ビタミンＤ３、メナジオン−亜硫酸水素ナトリウム、α−トコフェロール、チアミン−硝酸塩、リボフラビン、ピリドキシン−塩酸塩、シアノコバラミン、ビオチン、イノシトール、ニコチン酸、パントテン酸カルシウム、葉酸、塩化コリン、パラアミノ安息香酸又はビタミンＣ等）、ミネラルミックス類（例えば硫酸マグネシウム、リン酸２ナトリウム、リン酸２ナトリウムカリウム、クエン酸鉄、乳酸カルシウム、水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、ヨウ素酸カルシウム又は硫酸コバルト等）などのいわゆる飼料原料が挙げられる。液状の賦形剤又は希釈剤としては、水あるいは水とアルコールとの混合物などが挙げられる。本発明の抗ストレス剤は、ラクトバチルス・プランタムの死菌体又はその処理物を上記した賦形剤又は希釈剤と混合することによって容易に製造できる。混合に際して、所望により加熱し、フレーク状製剤を得ることもできる。このようにして製造された本発明の製剤は、魚介類用の飼料として使用されてよい。飼料として使用される場合、飼料中の死菌体又はその処理物の濃度は、好ましくは約０ｐｐｍを超え２０００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは約０．１〜２００ｐｐｍである。
本発明の魚介類用抗ストレス剤の給餌量は、上記乳酸菌の死菌体又はその処理物に換算して、魚介類の体重１ｋｇ当たり１日０．０００５〜７５ｍｇであるのが好ましく、０．００５〜７．５ｍｇであるのがより好ましい。
本発明製剤の魚介類に対する抗ストレス作用のメカニズムは、その一つとして、血清コルチゾール上昇抑制によるものが考えられる。ストレスを受けた場合、まずストレスに対して神経・内分泌系が反応し、神経伝達物質やホルモンを分泌する。分泌された神経伝達物質やホルモンの持つ生理作用によって体内で生理的な変化が起こり、その生理的変化に伴い、成長の阻害、生殖機能低下及び病気に対する抵抗性の低下が生じ得る。これらストレスの影響は、神経伝達物質、ホルモンなどいろいろな物質の統合による結果であるが、その主役を演じているのはコルチゾールであるといわれている（養殖 ２００１．Ｎｏ．１１、５６−５９）。ゆえに、前述したようなストレスによる悪影響に抵抗するためには、コルチゾールの上昇を抑制することによって可能である。
本発明の魚介類用抗ストレス剤は、魚介類のコルチゾールの上昇を抑制する作用があり、魚介類に投与すると魚介類のストレスを有効に予防又は治療することができる。この結果、魚介類の体重が増加し、魚介類の成長が増進され、生存率がアップし、魚介類の味質（例えば食感、風味等）が改善される。
【実施例１】
［ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の死菌体を含むペレット剤の製造］
（菌の培養）
グルコース１％、酵母エキス１％、ポリペプトン０．５％、肉エキス０．２％、酢酸ナトリウム０．２％、硫酸マンガン・４水和物０．００１％、硫酸鉄・７水和物０．００１％、食塩０．００１％、ショ糖脂肪酸エステル０．０５％含む培地６Ｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）株を接種し、３２℃で２４時間培養した。培養後、培養液を５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離し菌体を集めた。得られた菌体を生理食塩水によく分散し、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した後、上清を除き、菌体を集めた。この操作を３回繰り返した後、菌体をイオン交換水に分散し、７０℃１０分間加熱した後、凍結乾燥することにより加熱死菌体を約７ｇ得た。
（死菌体からペレット剤の製造）
ブラウンフィッシュミール６５．６質量部、α−スターチ３．４質量部、デキストリン３．４質量部、ダイズレシチン４．２質量部、メナジオン一亜硫酸水素ナトリウム０．０１４２８質量部、チアミン一硝酸塩０．０１７９７質量部、リボフラビン０．０５９８１質量部、ピリドキシン一塩酸塩０．０１４２８質量部、シアノコバラミン０．００００２質量部、セルロース０．５９８６９質量部、ビオチン０．００１８１質量部、イノシトール１．１９７６９質量部、ニコチン酸０．２３９５４質量部、パントテン酸カルシウム０．０８３８６質量部、葉酸０．００４５質量部、塩化コリン２．４４８５５質量部、パラアミノ安息香酸０．１１９２９質量部、ビタミンＣ０．０４６８１質量部、ミネラルミックス４．３質量部、イノシン酸０．１質量部、ベタイン０．６質量部、アラニン０．４質量部及び活性化グルテン５．０質量部からなる飼料原料をよく混合し、キッチンエンドで１０分間混合した。これに、ビタミン含有鱈肝油（鱈肝油７質量部に、β−カロチン０．０２９９６質量部、ビタミンＤ３０．００３０１質量部、α−トコフェロール０．１１９９３質量部を加え、超音波洗浄機を用いて混合したもの）を加えた。これに、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７加熱死菌体を所定濃度となるように加えた後、α−セルロースを加え、全量を１００質量部に調整して死菌体含有飼料とした。加熱死菌体の添加濃度は、死菌体含有飼料中、それぞれ０、０．２、２、２０、２００ｐｐｍの５水準とした。
上記で得られた死菌体含有飼料に水を該飼料に対して４０質量％となるように加え１０分間混ぜ合わせた。得られた混合物をチョッパーで２回ひき、直径１．２ｍｍのペレット状飼料を作製した。それをオーブンで乾燥させ、水分含量が全体の１０％以下にしたものを試験飼料とした。なお、上記ミネラルミックスの組成を下記第１表に示す。
マダイ稚魚（体重：０．９±０．１ｇ）を、循環式３０Ｌ円形ポリカーボネートタンクに１５尾ずつ収容し、これを各試験飼料当たり３タンクずつセットし、試験飼料を朝夕の一日二回、体重の５〜７％を与え、換水率２．４Ｌ／分、水温２０．０℃で飼育した。３０日間飼育後、尾部毛細血管から血液を採取した。この血液から血清を調整した後、血清中のコルチゾール量をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を第２表に示した。
第２表からわかるように、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の加熱死菌体を０．２ｐｐｍ以上含有した飼料を与えた試験群では、該加熱死菌体を含有しない飼料を与えた対照群に比べ、マダイ血清中のコルチゾールが著しく低値であった。
【実施例２】
１．死菌体処理物の製造
マルトース４％、ポリヘプトン２％、酵母エキス２％、酢酸ナトリウム０．５％、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート０．０５％、硫酸マンガン０．００２％を含有する培地にて、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）を３２℃で２４時間培養し、培養液を８０℃で２０分間加熱処理した。その後、加水しながら濾過濃縮装置にて培養液を洗浄・濃縮し、加熱死菌体溶液を得た。得られた加熱死菌体溶液にデキストリンを加え、噴霧乾燥し、加熱死菌体を１８％含む死菌体処理物を得た。
２．ペレット剤の製造
１００ｇ当たり、ブラウンフィッシュミール６５．６ｇ、α−スターチ５．８ｇ、デキストリン３．４ｇ、タラ肝油５．２ｇ、大豆レシチン２．０ｇ、高度不飽和脂肪酸１．０ｇ、ビタミンミックス３．０ｇ、ミネラルミックス３．０ｇ、ベタイン０．５ｇ、アラニン０．５ｇ、カルボキシメルセルロースナトリウム塩５．０ｇ、上記１で作製した死菌体処理物を０．０１ｇ（菌体含量として約０．００１８ｇ）及びα−セルロース４．９９ｇ含有する混合物に水道水を適当量加えさらによく混合し、ペレッターにて、直径２．５ｍｍの飼料を作製した。得られた飼料を５０℃に設定したオーブン中で水分含量が１０％になるまで乾燥させ、これを試験飼料とした。また、死菌体処理物をα−セルロースに置き換えて用いたこと以外、上記試験飼料を製造する方法と同様の方法で対照飼料を調製した。
なお、ビタミンミックスの組成を第３表に示し、ミネラルミックスの組成を第４表に示した。
４５Ｌ水槽中にヒラメ稚魚（体重：２〜３．５ｇ）を５匹ずつ収容し、１週間飼育した。飼育に際し、対照群（水槽数＝２）には、対照飼料を与え、試験群（水槽数＝２）には、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体量に換算して、０．０３６ｍｇ／ｋｇ／日こなるように試験飼料を与えた。
飼育後、ヒラメ稚魚を室温２０℃、湿度７０％の室内で、空気中に２０分間露出することにより、ストレスを負荷した後、回復水槽（１Ｌ）に移し、安定状態（稚魚が正常に泳ぐ状態）に回復するまでの時間を測定した。
その結果、対照群での回復時間は平均２６．２分であったのに対し、試験群（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体摂取群）での回復時間は平均１８．９分であった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体を給餌することにより、回復時間が著しく短縮され、稚魚のストレスに対する抵抗性が高まったことがわかる。
【実施例３】
１００ｇ当たり、ブラウンフィッシュミール７０ｇ、α−スターチ３．８ｇ、デキストリン３．５ｇ、タラ肝油５．７ｇ、ビタミンミックス３．０ｇ、ミネラルミックス３．０ｇ、ベタイン０．５ｇ、アラニン０．５ｇ、カルボキシメルセルロースナトリウム塩５．０ｇ、実施例２で作製した死菌体処理物を０．０１ｇ（菌体含量として０．００１８ｇ）及びα−セルロース４．９９ｇ含有する混合物に水道水を適当量加えさらによく混合し、ペレッターにて、直径３．５ｍｍ飼料を作製した。得られた飼料を５０℃に設定したオーブン中で水分含量が１０％になるまで乾燥させ、これを試験飼料とした。また、死菌体処理物をα−セルロースに置き換えて用いたこと以外、上記試験飼料を製造する方法と同様の方法で対照飼料を調製した。
なお、ミネラルミックスおよびビタミンミックスについては、それぞれ実施例２と同様のものを用いた。
カンパチ稚魚（体重：３００〜６００ｇ）を１トン水槽に７匹ずつ収容して１週間飼育した。飼育の際に、対照群（水槽数＝２）には、対照飼料を、試験群（水槽数＝２）には、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体量に換算して０．０３６ｍｇ／ｋｇ／日になるように試験飼料を与えた。
飼育後、各水槽から無作為に３匹ずつ取り出し、刺身にした。この刺身の味質（食感、外観及び風味）を１５人のパネラーで評価した。結果を第５表に示す。
外観に関しては、両群に差は認められないが、食感、風味、並びに食感、外観及び風味を総合的に判断した総合評価に関しては、試験群の方が圧倒的に好まれることが示された。特に食感に関しては、試験群の方が弾力があり、おいしいとの評価が多く、また、試験群の方がコリコリ感があり、おいしいとの評価も多かった。風味に関しても、試験群の方が生臭みがないといった評価が多かった。
カンパチのような回遊性の魚を水槽内で密集して飼育するとストレス負荷は強くなり、味質の低下が予想される。しかしながら、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７加熱死菌体を摂取させた場合、摂取時間が１週間でも味質を大きく改善することが可能であることが示された。このことから、短期間の魚介類の飼育（活け魚料理店等の生け簀での飼育あるいは養殖魚介類等を出荷する前の飼育等）において、魚介類の味質を改善できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
本発明の抗ストレス剤は、魚介類のストレスを有効に予防又は治療することができる。
【技術分野】
本発明は、ストレスによる悪影響に対して魚介類に抵抗性を付与する抗ストレス剤に関する。本発明はまた、それを使用する養殖方法にも関する。
【背景技術】
従来、各種魚介類の養殖や観賞用水生動物の飼育を行なう場合、飼育育成環境の過密、温度の変化又は水質悪化、或いは輸送等のストレスによって、これら水生動物は体調を崩し、退色や変色、疾病に対する抵抗力の低下、摂餌の悪化、体格の貧弱化、肉質や脂乗りの低下等の弊害が生じることは知られている（特開平０９−３０８４４０号公報）。このようなストレスによる弊害を下記に例示する。
ブリの稚魚については、飼育水槽内に攻撃する個体（攻撃個体）と攻撃される個体（劣位個体）とがあり、劣位個体は強度のストレス状態におかれ、体重増加に支障がでる（平成８年度日本水産学会春季大会講演要旨集、ｐ６４、１９９６）。
アユについては、なわばりを持つことのできない非なわばり個体では、移動範囲が狭く、摂餌頻度が低いことから、なわばり個体と比較して成長率が低いとの報告（平成８年度日本水産学会春季大会講演要旨集、ｐ４３、１９９６）がある。ストレスのかかった劣位個体で、非なわばりアユと同様成長率が低くなると考えられる。
また、ヒラメのように神経質な魚では、選別のための池替えや池の掃除などの後には、そのストレスによって摂餌が悪くなる。トラフグでもヒラメと同様、池替えの後には摂餌が悪くなる。
さらに、観賞魚は、ストレスによって皮膚が退色及び変色し、本来鮮やかな色彩が消失する。
これらの悪影響を防止するため、抗生物質等の薬剤が汎用された。しかしながら、抗生物質等の薬剤はある程度の効果はあるが、動物体内への残留、環境汚染等の安全性の問題や、耐性菌の出現による弊害があり、現在は薬剤の使用を差し控える方向に向かっている。また、抗生物質製剤以外に生菌剤も知られている。生菌剤としては、光合成細菌（ＰＳＢ）、混合微生物（商品名「サイクル」：（株）スドー製、商品名「スーパーバイオ」：（株）トモフジ製）等が挙げられる。しかしながら、これら生菌剤の多くは、常温保存液体タイプであり、使用前の生菌保持率が概して悪い。そのため、使用に際しての生菌数が不充分であったり、使用環境条件が少しでも過酷になると効果が認められなかったりして、適性条件での使用が困難である場合が多く、目に見えて体質を改善し得るものは、未だ実用化に至っていないのが現状である。生菌である以上その生菌数の維持には、注意を払わなくてはならないから、その取り扱いが困難であり、工程管理が容易ではなかった。
【発明の開示】
本発明は、魚介類のストレスを有効に予防又は治療する製剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討した結果、乳酸菌の生菌体ではなく、予想外かつ驚くべきことに、乳酸菌の死菌体又はその処理物が魚介類用のストレスの予防又は治療に優れた効果を奏することを知見した。また、本発明者らは、乳酸菌の生菌体ではなく、有効成分として死菌体を使用する場合は、抗ストレス剤の製造に際して、有効成分が取り扱いやすく、工程管理が容易であり、製造された製剤中の有効成分が保存時並びに水中で安定性に富むことをも知見した。
すなわち、本発明は、
（１） 乳酸菌の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用抗ストレス剤、
（２）乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）又はビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレービ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）である上記（１）記載の魚介類用抗ストレス剤、
（３） 乳酸菌の死菌体が乳酸菌の加熱処理により得られる死菌体であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の魚介類用抗ストレス剤、
（４） 乳酸菌の死菌体がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）の加熱処理死菌体であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（５） 魚介類が養殖魚類又は観賞魚類であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（６） 魚介類が、海水魚又は淡水魚であることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（７） 魚介類が、仔稚魚であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（８） 乳酸菌の死菌体又はその処理物の配合割合が、全体量に対して０．１〜５０質量％であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤、
（９） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を含有する魚介類用飼料、
（１０） 飼料中の乳酸菌の死菌体又はその処理物の濃度が、０を超え２０００ｐｐｍ以下であることを特徴とする上記（９）記載の魚介類用飼料、
（１１） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を魚介類に給餌することを特徴とする魚介類のストレスの予防又は治療方法、
（１２） 乳酸菌の死菌体又はその処理物を魚介類に魚介類体重１ｋｇ当たり１日０．０００５〜７５ｍｇ給餌することを特徴とする魚介類のストレスの予防又は治療方法、
（１３） 上記（１）〜（８）のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を使用することを特徴とする魚介類の血清コルチゾール上昇抑制方法、
（１４） 上記（１）記載の魚介類用抗ストレス剤を使用することを特徴とする魚介類の養殖方法、
（１５） 魚介類の味質が改善される上記（１４）記載の養殖方法、及び
（１６） 養殖魚介類の生残率が改善される上記（１４）又は（１５）に記載の養殖方法、
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明において乳酸菌としては、公知の乳酸菌、例えば、ラクトバチルス属、ストレプトコックス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属又はビフィズス属する乳酸菌のいずれをも用いることができる。さらに詳しくは、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）又はビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレービ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）などが挙げられる。これら各種乳酸菌のうち、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が好ましい。
本発明に用いられるラクトバチルス・プランタラムに属する菌の代表的なものとしてラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を挙げることができるが、この菌は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７号（平成７年１１月３０日に寄託されたＦＥＲＭ Ｐ−１５３１７号より移管）として寄託されている。本発明で用いられるラクトバチルス・プランタラムには、さらにラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＪＣＭ １１４９基準株およびラクトバチルス・プランタラムＬ−０５１（微工研菌寄第１１９１２号）が含まれる。ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が最も好ましい。
上記の本発明に用いる菌は天然培地、合成培地、半合成培地などの培地に培養することにより得ることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としてはたとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等であり、炭素源としては、たとえば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデンなどを添加することができ、更に各種ビタミン類その他を添加することができる。培養温度は約２５〜４０℃、好ましくは約２７〜３５℃であり、培養時間は約１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。培地のｐＨは約３〜６、好ましくは約４〜６である。
培養終了後、菌体を採取した後、死菌体を調製してもよいし、又は菌体を培養液から一旦分離することなく、培養液中の菌体を死菌体にし、その死菌体を採取してもよい。菌体を採取する方法としては、例えば培養液に蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過等により菌体を採取する方法がある。死菌体は、採取された生菌あるいは生菌を含んだ培養液ごと、たとえば加熱、紫外線照射、ホルマリン処理などにより不活性化することにより得られる。加熱処理により死菌体を得る場合、加熱温度は通常約６０〜１００℃、好ましくは約７０〜９０℃である。加熱手段としては、ヒーターを用いる公知の手段であってよい。加熱時間は所望の温度に達した後、通常約５〜４０分、好ましくは約１０〜３０分である。死菌体の処理物は、例えば、死菌体を凍結乾燥や噴霧乾燥することによって得られる。また、死菌体にデキストリンやセルロースなどの適当な賦形剤を加えて、これを凍結乾燥や噴霧乾燥することによっても得られる。死菌体の処理物はまた、死菌体の抽出物であってもよい。
本発明における魚介類としては、特に限定されず、淡水魚、海水魚、甲殻類のいずれであってもよく、また、養殖魚類、観賞魚類のいずれであってもよい。淡水魚としては、ウナギ、コイ、ニジマス、アユ、ティラピア、フナ、金魚類（例えば、ランチュウ、和金、コメット、朱文金、オランダシシガシラ、出目金等）、グッピー、アピストグラマ、ディスカス等が挙げられ、海水魚としては、クロマグロ、ブリ、タイ、ギンザケ、マアジ、ヒラメ、カレイ、クロソイ、トラフグ、カンパチ等が挙げられる。また、淡水魚及び海水魚のいずれにも属するものとして、サケ・マス類等が挙げられる。甲殻類としては、クルマエビ、ブラックタイガー、ウシエビ、コウライエビ、ガザミ等が挙げられる。
上記のような魚介類は、仔稚魚（小魚、子魚、稚魚、幼魚を含む）、成魚のいずれであってもよい。
本発明の抗ストレス剤は、乳酸菌の死菌体又はその処理物そのものであってよいし、死菌体又はその処理物を賦形剤又は希釈剤と混合した製剤であってもよい。製剤全体に対する死菌体又はその処理物の配合割合は好ましくは約０．０１〜９５質量％であり、より好ましくは約０．１〜５０質量％である。剤型としては、ペレット剤、錠剤、液剤、粉剤、粒剤、ペースト剤などが挙げられる。そのような製剤は魚介類に接触させたり、経口で与えることができる。
固状の賦形剤又は希釈剤としては、例えば、魚粉、骨粉、スキムミルク、綿実粕、小麦粉、小麦胚芽、米ぬか、ビール酵母、セルロース、ビタミン類（例えばβ−カロチン、ビタミンＤ３、メナジオン−亜硫酸水素ナトリウム、α−トコフェロール、チアミン−硝酸塩、リボフラビン、ピリドキシン−塩酸塩、シアノコバラミン、ビオチン、イノシトール、ニコチン酸、パントテン酸カルシウム、葉酸、塩化コリン、パラアミノ安息香酸又はビタミンＣ等）、ミネラルミックス類（例えば硫酸マグネシウム、リン酸２ナトリウム、リン酸２ナトリウムカリウム、クエン酸鉄、乳酸カルシウム、水酸化アルミニウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸マンガン、ヨウ素酸カルシウム又は硫酸コバルト等）などのいわゆる飼料原料が挙げられる。液状の賦形剤又は希釈剤としては、水あるいは水とアルコールとの混合物などが挙げられる。本発明の抗ストレス剤は、ラクトバチルス・プランタムの死菌体又はその処理物を上記した賦形剤又は希釈剤と混合することによって容易に製造できる。混合に際して、所望により加熱し、フレーク状製剤を得ることもできる。このようにして製造された本発明の製剤は、魚介類用の飼料として使用されてよい。飼料として使用される場合、飼料中の死菌体又はその処理物の濃度は、好ましくは約０ｐｐｍを超え２０００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは約０．１〜２００ｐｐｍである。
本発明の魚介類用抗ストレス剤の給餌量は、上記乳酸菌の死菌体又はその処理物に換算して、魚介類の体重１ｋｇ当たり１日０．０００５〜７５ｍｇであるのが好ましく、０．００５〜７．５ｍｇであるのがより好ましい。
本発明製剤の魚介類に対する抗ストレス作用のメカニズムは、その一つとして、血清コルチゾール上昇抑制によるものが考えられる。ストレスを受けた場合、まずストレスに対して神経・内分泌系が反応し、神経伝達物質やホルモンを分泌する。分泌された神経伝達物質やホルモンの持つ生理作用によって体内で生理的な変化が起こり、その生理的変化に伴い、成長の阻害、生殖機能低下及び病気に対する抵抗性の低下が生じ得る。これらストレスの影響は、神経伝達物質、ホルモンなどいろいろな物質の統合による結果であるが、その主役を演じているのはコルチゾールであるといわれている（養殖 ２００１．Ｎｏ．１１、５６−５９）。ゆえに、前述したようなストレスによる悪影響に抵抗するためには、コルチゾールの上昇を抑制することによって可能である。
本発明の魚介類用抗ストレス剤は、魚介類のコルチゾールの上昇を抑制する作用があり、魚介類に投与すると魚介類のストレスを有効に予防又は治療することができる。この結果、魚介類の体重が増加し、魚介類の成長が増進され、生存率がアップし、魚介類の味質（例えば食感、風味等）が改善される。
【実施例１】
［ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の死菌体を含むペレット剤の製造］
（菌の培養）
グルコース１％、酵母エキス１％、ポリペプトン０．５％、肉エキス０．２％、酢酸ナトリウム０．２％、硫酸マンガン・４水和物０．００１％、硫酸鉄・７水和物０．００１％、食塩０．００１％、ショ糖脂肪酸エステル０．０５％含む培地６Ｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）株を接種し、３２℃で２４時間培養した。培養後、培養液を５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離し菌体を集めた。得られた菌体を生理食塩水によく分散し、５０００ｒｐｍで３５分間遠心分離した後、上清を除き、菌体を集めた。この操作を３回繰り返した後、菌体をイオン交換水に分散し、７０℃１０分間加熱した後、凍結乾燥することにより加熱死菌体を約７ｇ得た。
（死菌体からペレット剤の製造）
ブラウンフィッシュミール６５．６質量部、α−スターチ３．４質量部、デキストリン３．４質量部、ダイズレシチン４．２質量部、メナジオン一亜硫酸水素ナトリウム０．０１４２８質量部、チアミン一硝酸塩０．０１７９７質量部、リボフラビン０．０５９８１質量部、ピリドキシン一塩酸塩０．０１４２８質量部、シアノコバラミン０．００００２質量部、セルロース０．５９８６９質量部、ビオチン０．００１８１質量部、イノシトール１．１９７６９質量部、ニコチン酸０．２３９５４質量部、パントテン酸カルシウム０．０８３８６質量部、葉酸０．００４５質量部、塩化コリン２．４４８５５質量部、パラアミノ安息香酸０．１１９２９質量部、ビタミンＣ０．０４６８１質量部、ミネラルミックス４．３質量部、イノシン酸０．１質量部、ベタイン０．６質量部、アラニン０．４質量部及び活性化グルテン５．０質量部からなる飼料原料をよく混合し、キッチンエンドで１０分間混合した。これに、ビタミン含有鱈肝油（鱈肝油７質量部に、β−カロチン０．０２９９６質量部、ビタミンＤ３０．００３０１質量部、α−トコフェロール０．１１９９３質量部を加え、超音波洗浄機を用いて混合したもの）を加えた。これに、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７加熱死菌体を所定濃度となるように加えた後、α−セルロースを加え、全量を１００質量部に調整して死菌体含有飼料とした。加熱死菌体の添加濃度は、死菌体含有飼料中、それぞれ０、０．２、２、２０、２００ｐｐｍの５水準とした。
上記で得られた死菌体含有飼料に水を該飼料に対して４０質量％となるように加え１０分間混ぜ合わせた。得られた混合物をチョッパーで２回ひき、直径１．２ｍｍのペレット状飼料を作製した。それをオーブンで乾燥させ、水分含量が全体の１０％以下にしたものを試験飼料とした。なお、上記ミネラルミックスの組成を下記第１表に示す。
マダイ稚魚（体重：０．９±０．１ｇ）を、循環式３０Ｌ円形ポリカーボネートタンクに１５尾ずつ収容し、これを各試験飼料当たり３タンクずつセットし、試験飼料を朝夕の一日二回、体重の５〜７％を与え、換水率２．４Ｌ／分、水温２０．０℃で飼育した。３０日間飼育後、尾部毛細血管から血液を採取した。この血液から血清を調整した後、血清中のコルチゾール量をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を第２表に示した。
第２表からわかるように、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）の加熱死菌体を０．２ｐｐｍ以上含有した飼料を与えた試験群では、該加熱死菌体を含有しない飼料を与えた対照群に比べ、マダイ血清中のコルチゾールが著しく低値であった。
【実施例２】
１．死菌体処理物の製造
マルトース４％、ポリヘプトン２％、酵母エキス２％、酢酸ナトリウム０．５％、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート０．０５％、硫酸マンガン０．００２％を含有する培地にて、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７）を３２℃で２４時間培養し、培養液を８０℃で２０分間加熱処理した。その後、加水しながら濾過濃縮装置にて培養液を洗浄・濃縮し、加熱死菌体溶液を得た。得られた加熱死菌体溶液にデキストリンを加え、噴霧乾燥し、加熱死菌体を１８％含む死菌体処理物を得た。
２．ペレット剤の製造
１００ｇ当たり、ブラウンフィッシュミール６５．６ｇ、α−スターチ５．８ｇ、デキストリン３．４ｇ、タラ肝油５．２ｇ、大豆レシチン２．０ｇ、高度不飽和脂肪酸１．０ｇ、ビタミンミックス３．０ｇ、ミネラルミックス３．０ｇ、ベタイン０．５ｇ、アラニン０．５ｇ、カルボキシメルセルロースナトリウム塩５．０ｇ、上記１で作製した死菌体処理物を０．０１ｇ（菌体含量として約０．００１８ｇ）及びα−セルロース４．９９ｇ含有する混合物に水道水を適当量加えさらによく混合し、ペレッターにて、直径２．５ｍｍの飼料を作製した。得られた飼料を５０℃に設定したオーブン中で水分含量が１０％になるまで乾燥させ、これを試験飼料とした。また、死菌体処理物をα−セルロースに置き換えて用いたこと以外、上記試験飼料を製造する方法と同様の方法で対照飼料を調製した。
なお、ビタミンミックスの組成を第３表に示し、ミネラルミックスの組成を第４表に示した。
４５Ｌ水槽中にヒラメ稚魚（体重：２〜３．５ｇ）を５匹ずつ収容し、１週間飼育した。飼育に際し、対照群（水槽数＝２）には、対照飼料を与え、試験群（水槽数＝２）には、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体量に換算して、０．０３６ｍｇ／ｋｇ／日こなるように試験飼料を与えた。
飼育後、ヒラメ稚魚を室温２０℃、湿度７０％の室内で、空気中に２０分間露出することにより、ストレスを負荷した後、回復水槽（１Ｌ）に移し、安定状態（稚魚が正常に泳ぐ状態）に回復するまでの時間を測定した。
その結果、対照群での回復時間は平均２６．２分であったのに対し、試験群（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体摂取群）での回復時間は平均１８．９分であった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体を給餌することにより、回復時間が著しく短縮され、稚魚のストレスに対する抵抗性が高まったことがわかる。
【実施例３】
１００ｇ当たり、ブラウンフィッシュミール７０ｇ、α−スターチ３．８ｇ、デキストリン３．５ｇ、タラ肝油５．７ｇ、ビタミンミックス３．０ｇ、ミネラルミックス３．０ｇ、ベタイン０．５ｇ、アラニン０．５ｇ、カルボキシメルセルロースナトリウム塩５．０ｇ、実施例２で作製した死菌体処理物を０．０１ｇ（菌体含量として０．００１８ｇ）及びα−セルロース４．９９ｇ含有する混合物に水道水を適当量加えさらによく混合し、ペレッターにて、直径３．５ｍｍ飼料を作製した。得られた飼料を５０℃に設定したオーブン中で水分含量が１０％になるまで乾燥させ、これを試験飼料とした。また、死菌体処理物をα−セルロースに置き換えて用いたこと以外、上記試験飼料を製造する方法と同様の方法で対照飼料を調製した。
なお、ミネラルミックスおよびビタミンミックスについては、それぞれ実施例２と同様のものを用いた。
カンパチ稚魚（体重：３００〜６００ｇ）を１トン水槽に７匹ずつ収容して１週間飼育した。飼育の際に、対照群（水槽数＝２）には、対照飼料を、試験群（水槽数＝２）には、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株加熱死菌体量に換算して０．０３６ｍｇ／ｋｇ／日になるように試験飼料を与えた。
飼育後、各水槽から無作為に３匹ずつ取り出し、刺身にした。この刺身の味質（食感、外観及び風味）を１５人のパネラーで評価した。結果を第５表に示す。
外観に関しては、両群に差は認められないが、食感、風味、並びに食感、外観及び風味を総合的に判断した総合評価に関しては、試験群の方が圧倒的に好まれることが示された。特に食感に関しては、試験群の方が弾力があり、おいしいとの評価が多く、また、試験群の方がコリコリ感があり、おいしいとの評価も多かった。風味に関しても、試験群の方が生臭みがないといった評価が多かった。
カンパチのような回遊性の魚を水槽内で密集して飼育するとストレス負荷は強くなり、味質の低下が予想される。しかしながら、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７加熱死菌体を摂取させた場合、摂取時間が１週間でも味質を大きく改善することが可能であることが示された。このことから、短期間の魚介類の飼育（活け魚料理店等の生け簀での飼育あるいは養殖魚介類等を出荷する前の飼育等）において、魚介類の味質を改善できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
本発明の抗ストレス剤は、魚介類のストレスを有効に予防又は治療することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用抗ストレス剤。
【請求項２】
乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）又はビフィドバクテリウム・ブレービ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項３】
乳酸菌の死菌体が乳酸菌の加熱処理により得られる死菌体であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項４】
乳酸菌の死菌体がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）の加熱処理死菌体であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項５】
魚介類が養殖魚類又は観賞魚類であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項６】
魚介類が、海水魚又は淡水魚であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項７】
魚介類が、仔稚魚であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項８】
乳酸菌の死菌体又はその処理物の配合割合が、全体量に対して０．０１〜９５質量％であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項９】
請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を含有する魚介類用飼料。
【請求項１０】
飼料中の乳酸菌の死菌体又はその処理物の濃度が、０を超え２０００ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の魚介類用飼料。
【請求項１１】
請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を魚介類に給餌することを特徴とする魚介類のストレスの予防又は治療方法、
【請求項１２】
乳酸菌の死菌体又はその処理物を魚介類に魚介類の体重１ｋｇ当たり１日０．０００５〜７５ｍｇ給餌することを特徴とする魚介類のストレスの予防又は治療方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を使用することを特徴とする魚介類の血清コルチゾール上昇抑制方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載の魚介類用抗ストレス剤を使用することを特徴とする魚介類の養殖方法。
【請求項１５】
魚介類の味質が改善される請求の範囲第１４項に記載の養殖方法。
【請求項１６】
養殖魚介類の生残率が改善される請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の養殖方法。
【請求項１】
乳酸菌の死菌体又はその処理物を含有することを特徴とする魚介類用抗ストレス剤。
【請求項２】
乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチラス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）又はビフィドバクテリウム・ブレービ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項３】
乳酸菌の死菌体が乳酸菌の加熱処理により得られる死菌体であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項４】
乳酸菌の死菌体がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌ−１３７、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７）の加熱処理死菌体であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項５】
魚介類が養殖魚類又は観賞魚類であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項６】
魚介類が、海水魚又は淡水魚であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項７】
魚介類が、仔稚魚であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項８】
乳酸菌の死菌体又はその処理物の配合割合が、全体量に対して０．０１〜９５質量％であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤。
【請求項９】
請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を含有する魚介類用飼料。
【請求項１０】
飼料中の乳酸菌の死菌体又はその処理物の濃度が、０を超え２０００ｐｐｍ以下であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の魚介類用飼料。
【請求項１１】
請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を魚介類に給餌することを特徴とする魚介類のストレスの予防又は治療方法、
【請求項１２】
乳酸菌の死菌体又はその処理物を魚介類に魚介類の体重１ｋｇ当たり１日０．０００５〜７５ｍｇ給餌することを特徴とする魚介類のストレスの予防又は治療方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の魚介類用抗ストレス剤を使用することを特徴とする魚介類の血清コルチゾール上昇抑制方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載の魚介類用抗ストレス剤を使用することを特徴とする魚介類の養殖方法。
【請求項１５】
魚介類の味質が改善される請求の範囲第１４項に記載の養殖方法。
【請求項１６】
養殖魚介類の生残率が改善される請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の養殖方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８４９２３
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４０４７（Ｐ２００５−５０４０４７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３８９８
【国際出願日】平成１６年３月２２日（２００４．３．２２）
【出願人】（０００２３８５１１）武田食品工業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３８９８
【国際出願日】平成１６年３月２２日（２００４．３．２２）
【出願人】（０００２３８５１１）武田食品工業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]