抗ヒドロキシラーゼ抗体およびその使用
アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼに対する抗体、またはその抗原結合部分を提供する。アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ抗体またはその抗原結合部分は、アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼの活性を調節することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年４月１９日出願の米国出願番号６０／５６３，５１４および２００３年１１月１４日出願の米国出願番号６０／５２０，１１４の利点を請求するものである。両先行出願の内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の資金による研究に関する記述
本明細書に記載の研究は、部分的に、国立化学財団からの助成金（認可番号９８４３３４２）により資金を提供されたものである。従って、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼを認識する抗体ならびに、例えばアスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼを検出および／またはその活性を調節するための、これらの抗体の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景技術
アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）は、細胞外基質蛋白、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）受容体、ノッチ相同体およびノッチリガンド相同体を含む多数の蛋白質の上皮成長因子様ドメインにおいて、特定のアスパラギン酸塩およびアスパラギン残基のβ炭素の翻訳後ヒドロキシル化に対し触媒作用を及ぼす（Ｊｉａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１５）：７２２７‐７２３１、１９９４年；Ｊｉａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２０）：１４３２２‐１４３２７、１９９２年；Ｇｒｏｎｋｅ等、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８６（１０）：３６０９‐１３、１９８９年）。この膜貫通酵素は、プロリルおよびリシルヒドロキシラーゼのα‐ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ族の一部である。ヒトＡＡＨ（ＨＡＡＨ）の過剰発現は、肝細胞癌、胆管癌、および神経外胚葉性腫瘍を含む多くのヒト癌において検出されている（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．９８：１３１３‐１３２３、１９９６年；Ｓｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｔｓｉｇ．８２（７）：８１‐８９１、２００２年）。ＡＡＨが多くの腫瘍において過剰発現すること、および強制発現が細胞運動および生存を向上させることの発見は、ＡＡＨが生体内における悪性の形質転換を助長しうることを示している（Ｓｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８２（７）：８８１‐８９１、２００２年）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本発明は、部分的に、当方によるアスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）を結合するヒト一本鎖抗体の発見に基づく。従って、本発明は、完全な多量体抗体（Ｇクラスのヒト四量体抗体（ＩｇＧ））、および特異的にＡＡＨ蛋白を結合する断片またはその他の変異形を含む抗体を特色とする。これらの断片および変異体は、一本鎖抗ＡＡＨ抗体、多重（例えば、四重）ＡＡＨ抗体の断片または部分、および特異的にＡＡＨ蛋白を結合するその他の変異形を含む。抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片または変異形のいずれかは、例えば親和性成熟過程によって突然変異した可能性がある。
【０００６】
本発明の組成物は、抗ＡＡＨ抗体（例えば、ヒト単クローン抗体）、その断片またはその他の変異形、それらを含む薬剤組成物、およびそれらを含むキットを含む。抗体、その断片またはその他の変異形は、１つ以上のＡＡＨ生物活性（例えば、適合する基質のヒドロキシル化であり、生体内、細胞または組織培養、もしくは生体外において、自然的にまたは非自然的に発生したもの）および／またはＡＡＨに仲介される１つ以上の細胞的事象（例えば、細胞成長または増殖、もしくは細胞運動性）を抑制する可能性があるが、必ずしもこの限りではない。望ましくない細胞増殖および運動性は、ＡＡＨが過剰に活動しているか過剰発現している病態（例えば癌等）に関連して発生するため、本発明の組成物は、そのような症状を有する患者を識別、その予後を評価、および／またはそのような症状（例えば、癌またはＡＡＨ発現または活性の上昇に関連するその他の疾患）を有するか、発症するリスクが高い患者を治療するために使用することができる。
【０００７】
より具体的には、本発明は治療に適している患者（例えば、ＡＡＨが過剰に活動または過剰発現した細胞を有する患者）を識別する方法および効果的な量の抗ＡＡＨ抗体（もしくはその断片またはその他の変異形）を患者（例えば、特異的にＨＡＡＨを結合するヒト単クローン抗体またはヒト一本鎖抗体（ｓｃＦｖ））に投与することによってそのような患者を治療する治療法または予防法を特色とする。本発明の抗体を発現するのに使用できる核酸、それらの核酸を含む病毒媒介体、それらの核酸または病毒媒介体を含む細胞、抗ＡＡＨ抗体および／またはその断片またはその他の変異形を含む医薬的に許容可能な組成物を製剤する方法、抗ＡＡＨ抗体（例えば、抗ＨＡＡＨ抗体）および／またはその断片またはその他の変異形の特性を識別および／または評価する方法、ならびに抗ＡＡＨ抗体（例えば、ヒト抗ＨＡＡＨ抗体）および／またはその断片またはその他の変異形の特性を親和性成熟する方法も提供される。
【０００８】
読みやすくするため、すべての「抗体」の後にくる「および／またはその断片またはその他の変異形」という句を反復しない。抗ＡＡＨ抗体が使用できるところであれば、特異的にＡＡＨ蛋白を任意の有用な程度まで結合するその断片またはその他の変異形も使用できることを理解されたい。ＡＡＨを「ＡＡＨ蛋白」と称する場合がある。明らかに逆の意味で解釈されるべき場合を除いて、「蛋白」「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は同義的に２つ以上のアミノ残基の鎖を意味する。同様に、抗ＡＡＨ抗体をエンコードする核酸が使用できるところであれば、抗ＡＡＨ抗体の機能的断片またはその他の変異形をエンコードする核酸が使用でき、抗ＡＡＨ抗体を備える細胞が使用できるところであれば、抗ＡＡＨ抗体の機能的断片またはその他の変異形を備える細胞を使用できる、等がいえる。抗ＡＡＨ抗体の断片は、断片が特異的にＡＡＨ抗原を結合する抗ＡＡＨ抗体の一部である場合があるため、抗ＡＡＨ抗体の「抗原結合部分」とも称されてよい。断片および異性体についてはさらに以下で説明するが、それらはｓｃＦｖに加えてＦａｂ、Ｆａｂ´およびＦ（ａｂ´）２断片も含む（例えば、特異的にＨＡＡＨを結合するヒトｓｃＦｖ）ことをここで留意されたい。
【０００９】
抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の異性体は、図３４乃至３８の表中のアミノ酸配列からなる、またはそれを含むことができる。あるいは、抗ＡＡＨ抗体は、図３４乃至３８の表中のアミノ酸配列に対するある程度の同一性を提示する配列からなる、またはそれを含むことができる。例えば、前記抗体は、図３４および３５に示されるＶＨ配列の１つと少なくとも８０％同一（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％同一）の重鎖の可変領域（ＶＨ）を含むことができる。あるいは、前記抗体は、図３６に示されるｓｃＦｖの１つと少なくとも８０％同一（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％同一）のｓｃＦｖであってよい。あるいは、前記抗体もしくはその断片またはその他の変異形は、図３７および３８に示されるＣＤＲと少なくとも４０％同一（例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでよい。その他の断片および変異形については以下でさらに説明する。
【００１０】
前記抗体は、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ／Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ／Ｈｉｓ−（Ｘａａ）−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列ＩＤ番号：３２０）を含む（または、それからなる）第１のＣＤＲ、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列ＩＤ番号：３２１）を含む（または、それからなる）第２のＣＤＲ、およびアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（配列ＩＤ番号：３２２）を含む（または、それからなる）第３のＣＤＲを含む可変軽鎖（ＶＬまたはＶＬＣ）を含むことができる。特に指示がない場合、これらの配列および以下の配列において「Ｘａａ」は任意のアミノ酸残基、またはアミノ酸残基がないことを示す。あるいは、または追加で、前記抗体は、アミノ酸配列Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ／Ｇｌｙ（配列ＩＤ番号：３２３）を含む（または、それからなる）第１のＣＤＲおよびアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３２４）を含む（または、それからなる）第２のＣＤＲを含むＶＨＣを含むことができる。別の実施形態において、前記抗体は、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ／Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ／Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｔｙｒ（配列ＩＤ番号：３２５）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第１のＣＤＲ）を含むＶＬＣを含むことができる。あるいは、または追加で、前記抗体は、アミノ酸配列Ｓｅｒ／Ｇｌｙ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｓｅｒ／Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ／Ａｓｎ（配列ＩＤ番号：３２６）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第１のＣＤＲ）およびアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｉｌｅ／Ｔｈｒ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｔｒｐ／Ａｒｇ−Ｔｙｒ／Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｙ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ／Ａｌａ−Ｐｒｏ／Ｓｅｒ−Ｖａｌ／Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３２７）を含む（または、それからなる）第２のＣＤＲを含むＶＨＣを含むことができる。その他の実施形態において、前記抗体は、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３２８）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第２のＣＤＲ）を含むＶＬＣを含むことができる。あるいは、前記抗体は、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｔｙｒ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３２９）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第２のＣＤＲ）および、任意で、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３３０）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第３のＣＤＲ）を含むことができる。例えば、第３のＣＤＲは配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ（配列ＩＤ番号：５１）からなることができる。前記抗体は、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ／Ｇｌｙ（配列ＩＤ番号：３３１）を含む（例えば、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列ＩＤ番号：９６））（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第３のＣＤＲ）を含むＶＨＣも含むことができる。
【００１１】
本発明の抗体はいずれも、その配列にかかわらず、単クローン性（例えば、単一特異性）または多クローン性の抗体であってよく、前記抗体のいずれもヒトあるいはヒト化抗体であってよく、前記抗体のいずれも親和性成熟されてよく、前記抗体のいずれも単離（例えば、それらが生み出される動物または細胞からある程度精製）されてよい。ヒト抗体は、生殖系免疫グロブリン配列が提供する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。そのような抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖のすべてまたは一部、および、ヒト免疫グロブリン軽鎖のすべてまたは一部を有してよい。本発明の抗体（ヒトまたは非ヒト）が自然発生的な配列を含まなくてはならないというわけではない。本発明の抗体は、ヒト免疫グロブリン核酸配列によってエンコードされていないアミノ酸残基（例えば、生体外における無作為または部位特異的な突然変異誘発により導入された突然変異体）を含んでよい。突然変異または親和性成熟した抗体については以下でさらに説明する。
【００１２】
抗体は、ＡＡＨを特定の様式で結合するものに限定されないが、前記抗体はＡＡＨの触媒ドメイン（例えば、ＨＡＡＨの触媒ドメイン）を結合してよく、触媒ドメインの立体構造を修正する、またはそうでなければその活性を低くさせるような方法でＡＡＨを結合してよい。結合したＡＡＨ抗原の活性がどの程度抑制されるかは可変である。本発明の範囲内の有用な抗体（もしくはその断片またはその他の変異形）は、ＡＡＨの活性（例えば、ＨＡＡＨの触媒活性）を、患者への投与時に臨床的に有益な程度まで、または生体外アッセイにおいて有用である程度まで抑制するものを含む。例えば、前記抗体は、ＡＡＨまたはＨＡＡＨの酵素活性を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、約９５％、９８％、または９９％）を超えて抑制することができる。抑制は、対照または基準試料、もしくは標準と比較して評価されることができる。あるいは、抗ＡＡＨ抗体は、ＡＡＨ蛋白の活性を抑制することなく、特異的にＡＡＨ蛋白を結合することができる。そのような抗体は、ＡＡＨの検出において有用であり、ＡＡＨが過剰発現している細胞を有する患者を識別するために使用することができる。識別過程は、例えば、ＡＡＨの生物活性（例えば、触媒活性）を抑制する抗ＡＡＨ抗体を患者に投与する前に行うことができる。
【００１３】
本発明の抗体は、さらにその細胞培養における腫瘍細胞成長または腫瘍細胞増殖を抑制および／または生体内における腫瘍細胞成長または転移を抑制する能力の観点において特徴付けられる、または評価されることができる。親和性も測定することができる。例えば、本発明の抗体は、約１μＭ以下のＡＡＡ蛋白（例えば、ＨＡＡＨ）に対する親和性を有することができる。本発明の抗体は、他の抗体との競争を評価されることもできる。例えば、本発明の抗体（ヒトまたはヒト化抗体）は、抗ＡＡＨマウス抗体（例えば、単クローン性抗体ＦＢ５０または単クローン性抗体１５Ｃ７）とマウス抗体により結合されたエピトープを結合するために競争してよい。ＦＢ５０および１５Ｃ７は、本発明の範囲から明白に除外される。本発明の抗体は、そのクローン１１抗体（本明細書に記載（図３４を参照））とクローン１１抗体により結合されたエピトープを結合するために競争する能力を評価されることもできる。クローン１１抗体と効果的に競争する抗体は、本発明の範囲内である。
【００１４】
前述の観点から、抗体の（１）有用な親和性（例えば、少なくとも１ｘ１０６Ｍ−１）を持つＡＡＨに結合する、または（２）非特異性抗原に対する親和性より大きい（少なくとも２倍大きい）親和性を持つＡＡＨに結合する、または（３）臨床的に望ましい結果（例えば、治療の必要がある対象（例えば、癌またはその他の望ましくない細胞増殖を有する対象）の徴候または症候における改善）を生み出すのに十分な親和性を持つＡＡＨに結合する能力を意味する「特異結合」または「特異的に結合する」という用語を使用する場合がある。
【００１５】
前記抗体は、１つ以上のＦｃドメイン（例えば、ガンマアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１）のＦｃドメイン）を含むことができる。「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってエンコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ１）を意味する従来の意味において使用する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプであってよい。あるいは、または追加で、前記抗体は、標識（例えば、マーカーまたはレポーターとしての役割を果たす、もしくは付着している抗体配列の精製を促進するポリペプチド）を含むことができる。適合する標識は、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ、または酵素的に活性または蛍光性の蛋白を含む。あるいは、または追加で、前記抗体は毒素を含むことができる。
【００１６】
その他の側面において、本発明は、本発明の抗体（例えば、抗ＡＡＨｓｃＦｖ）をエンコードする配列を含む単離された核酸分子、本発明の抗体をエンコードする核酸配列を含む発現ベクター（例えば、プラスミド）、およびそれらの核酸分子または発現ベクター（酵母または哺乳類の細胞のような原核細胞または真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または腫瘍細胞（例えば、骨髄腫細胞）））のうち１種類以上を含む宿主細胞を特色とする。抗ＡＡＨｓｃＦｖは、多重結合の抗ＡＡＨ抗体（例えば、ＩｇＧ）へ容易に変換されることができる。より具体的には、本発明は、細胞表面において発現される（例えば、酵母細胞に表示される）抗体を特色とする。組み替え手段により調製された抗体（例えば、宿主細胞をトランスフェクションした組み換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組み換え型から単離された抗体、組み合わせの抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴うその他任意の手段により調製された抗体）を意味する「組み換え型」という用語を使用することがある。組み換え抗体は、ヒト化またはＣＤＲ移植抗体、キメラ抗体、および生体外において（例えば、ファージ提示法によって）生成された抗体を含む。前記抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列から派生した定常領域を含んでよい。
【００１７】
本発明は、上記に掲載された１つ以上の組成物を含むキットおよび使用説明書（印刷物、音声、視覚等、その形状を問わず）も特色とする。例えば、本発明のキットは、抗ＡＡＨ抗体を（凍結乾燥または濃縮された形状で、または使用に適した濃度（例えば、診断分析または患者への投与の実施に適した濃度）の生理学的に許容可能な希釈液に懸濁されて）含むことができる。前記キットは、本明細書に記載のように、核酸、ベクター、および／または宿主細胞も含むことができる。任意で、本明細書のキットのいずれかは、抗ＡＡＨ抗体を投与するための道具（例えば、針、注射器、アルコール綿、および包帯）、またはそれを診断分析に使用するための道具（例えば、対照として有用な試薬）を含むことができる。
【００１８】
本発明の方法は、細胞内におけるＡＡＨ発現を評価する方法を含む。前記細胞はヒトまたは非ヒト細胞および／またはＡＡＨが過剰に活動または過剰発現している細胞であってよく、前記細胞は生体内の細胞または組織培養内に維持されたものであってよく、前記細胞は癌性（例えば、腫瘍細胞）であってよく、前記細胞はほぼすべての組織タイプ（例えば、肺、肝臓、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、胆管、脳、または乳房の細胞）から得られる。前記細胞は、無傷であってもなくてもよい（例えば、前記細胞から生成された蛋白のように、組織ホモジネートが使用できる）。前記方法は、抗ＡＡＨ抗体（本明細書に記載のもののいずれかが使用されうる）を提供するステップと、前記抗体に前記細胞により発現したＡＡＨを結合させるのに一時的に十分な条件下において、前記抗体を用いて前記細胞（もしくは組織ホモジネートまたは前記細胞から生成された蛋白）に接触するステップと、前記抗体またはその抗原接続部位を（例えば、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学、またはその他の抗体に基づいた検出方法によって）検出するステップと、を含むことができる。前記検出ステップは、ＡＡＨ発現の定性的または定量的評価を提供してよく、その結果を対照試料から得られたもの、または基準試料や標準と比較してよい。そのような方法は、特異的にＡＡＨを結合するがＡＡＨの活性には影響を及ぼさない抗体を用いて効果的に実行されうる。前記方法は、本発明のＡＡＨ抑制性抗体を用いて治療する必要がある患者を診断するための取り組みの一部として実施されてよい。
【００１９】
本発明の方法は、細胞内におけるＡＡＨ蛋白の活性を調節（例えば、抑制）する方法も含む。上述の評価方法と同様に、前記細胞はヒトまたは非ヒト細胞および／またはＡＡＨが過剰に活動または過剰発現している細胞であってよく、前記細胞は生体内の細胞または組織培養内に維持されたものであってよく、前記細胞は癌性（例えば、腫瘍細胞）であってよく、前記細胞はほぼすべての組織タイプ（例えば、肺、肝臓、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、胆管、脳、または乳房の細胞）から得られる。前記方法は、細胞を提供するステップと、前記細胞内におけるＡＡＨ活性を調節（例えば、抑制）するのに十分な条件下において、当該細胞を一時的に本明細書に記載の抗体（または断片またはその他の変異形）にさらすステップを含んでよい。細胞が生体内において抗ＡＡＨ抗体にさらされる場合、前記方法は、疾患（例えば、癌またはその他の望ましくない細胞増殖）を有する患者、またはそのような疾患を発症するリスクが高い患者（例えば、ＡＡＨが過剰に活動または過剰発現しているがまだ検出可能な腫瘍もその他の癌の徴候も有していない患者）を治療する方法として記載できる。前記方法は、本明細書に記載の抗体（もしくはその断片またはその他の変異形）を、抗体が患者の体内において癌性細胞の増殖または転移を抑制するのに十分な量と時間で、患者に投与するステップを含むことができる。治療方法は以下でさらに説明するが、抗ＡＡＨ抗体を含む組成物は局所的に（例えば、腫瘍の部位または腫瘍が外科的に除去された後に残留している組織へ）または全身的に（例えば、静脈注射によって）投与されることができることに留意されたい。患者は単一タイプの抗ＡＡＨ抗体または抗体の組み合わせを受け取り、抗体は第２の薬剤（例えば、化学療法薬、鎮痛剤、または制吐剤）と組み合わせて投与されることができる。
【００２０】
治療に関連する用語は、患者または患者から提供される細胞に対する本発明の組成物の適用または投与を意味する。前記組成物は、抗ＡＡＨ抗体、同一物をエンコードする核酸分子もしくは発現ベクター、または同一物を発現する宿主細胞であってよい（いずれも生理学的に許容可能な希釈液を配合される）。前記組成物は、生体外で対象から、好ましくは治療が必要な患者から単離された（例えば、除去された）細胞に投与されてよい。治療終了時、前記細胞は患者に戻されてよい。さらに、前記治療方法は予防法であってよい。例えば、それらの方法は癌を発症するリスクの高い患者（十分に確立したリスクの指標（例えば、ＰＳＡおよび上述のとおりＡＡＨ自体のような癌関連抗原の濃度）がある）に適用されてよい。前記治療は、前記患者を治すまたは治癒するものであってよいが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明の方法は、癌の徴候または症候もしくは患者の癌に対する素因を緩和し、軽減し、修正し、改善し、和らげ、または改良することができる。
【００２１】
抗ＡＡＨ抗体の「治療効果のある量」は、疾患（例えば癌、例えば腫瘍またはその他の新生物もしくは異形成症候群）の徴候または症候を治療するのに効果的な抗ＡＡＨ抗体の量である。抗ＡＡＨ抗体の「予防効果のある量」は、発病の発生または疾病（例えば癌）の再発を遅らせるのに、もしくはその徴候または症候の重篤性を低減するのに効果的な抗ＡＡＨ抗体の量である。
【００２２】
治療に適した患者については以下でさらに説明するが、ここで前記患者は過剰に活動するまたは過剰発現したＡＡＨに関連する任意の増殖性疾患を有する可能性があることに留意されたい。例えば、前記患者は、ＡＡＨ陽性細胞を含む肺、肝臓、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、胆管、脳、または乳房内に腫瘍を有することがある。
【００２３】
別の側面において、本発明は、ＡＡＨに特異的に結合する抗体を識別する方法を特色とする。前記方法は、例えば、（ａ）抗体（例えば、ヒト抗体であり、ｓｃＦｖであってよい）のライブラリーを提供するステップと、（ｂ）前記抗体にポリペプチドを結合させる条件下において、前記ライブラリーの一部をＡＡＨ蛋白またはその断片と接触させるステップと、（ｃ）ＡＡＨ蛋白（またはＡＡＨ断片）に結合する抗体を選択するステップと、を含むことができる。前記方法は、前記選択された抗体を親和性成熟させるステップをさらに含むことができる。成熟は、例えば、変異性ＰＣＲのような方法、抗体をエンコードする核酸が、例えばＣＤＲシャッフリングまたは鎖シャッフリング技術を使用して、ライブラリーの核酸方法による組み換えを受ける方法によって実現されうる。本発明は、ＡＡＨに特異的に結合するヒト単クローン性抗体を作成する方法も特色とする。前記方法は、ＡＡＨ蛋白に特異的に結合する抗体を認識するステップと、細胞内において前記抗体をエンコードする核酸配列を発現するステップと、前記発現した抗体を前記細胞から単離するステップと、を含むことができる。これらの方法を産生方法と称することができ、これらの方法で作成された抗ＡＡＨ抗体は本発明の範囲内である。
【００２４】
本発明の抗体は、様々な理由で好都合でありうる。例えば、完全長に満たない抗体が使用される場合、抗体断片または変異体はより容易に腫瘍へ侵入できる。ヒトまたはヒト化抗体がヒト患者に投与される場合、非ヒト蛋白により誘発される可能性と同じくらい、それらが望ましくない免疫応答を刺激する可能性は低い。ＨＡＡＨ発現はきわめて低く、非癌性組織内で検出できないため、本発明の抗体がその他の望ましくない副作用を生成する可能性も低く、ＨＡＡＨを対象とする抗体は、非癌性組織に対する特異性の低い治療よりも毒性が低くてよい。当方の知る限りにおいて、当方はＨＡＡＨに結合する最初のヒト抗体を有する。
【００２５】
本明細書で述べたすべての公告、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照することによりその全体が組み込まれる。本発明のその他の特色および利点は、以下の詳しい説明および特許請求の範囲より明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
詳細な説明
アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）は、細胞外基質蛋白、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）受容体、ノッチ相同体およびノッチリガンド相同体を含む上皮成長因子のような各蛋白ドメインにおいて、特定のアスパラギン酸塩およびアスパラギン残基のβ炭素の翻訳後ヒドロキシル化に対し触媒作用を及ぼす（Ｊｉａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１５）：７２２７‐７２３１、１９９４年；Ｊｉａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２０）：１４３２２‐１４３２７、１９９２年；Ｇｒｏｎｋｅ等、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８６（１０）：３６０９‐１３、１９８９年）、高度に保存されたアルファケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼである。ヒトＡＡＨ（ＨＡＡＨ）の過剰発現は、肝細胞癌、胆管癌、および神経外胚葉性腫瘍を含む多くのヒト癌において検出されている（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．９８：１３１３‐１３２３、１９９６年；Ｓｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｔｓｉｇ．８２（７）：８１‐８９１、２００２年）。ＡＡＨが多くの腫瘍において過剰発現すること、および強制発現が細胞運動および生存を向上させることの発見は、ＡＡＨが生体内における悪性の形質転換を助長しうることを示している（Ｓｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８２（７）：８８１‐８９１、２００２年）。癌の診断または治療へのＨＡＡＨ使用に関する発明が記載されている（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ、米国特許番号６，１６６，１７６；Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ、米国特許番号６，７２７，０８０；Ｗａｎｄｓ等、米国特許番号６，７８３，７５８；Ｗａｎｄｓ等、米国特許番号６，７９７，６９６；Ｗａｎｄｓ等、米国特許番号６，８１２，２０６；Ｗａｎｄｓ等、米国特許番号６，８１５，４１５）。
【００２７】
本発明は、抗体およびそのＡＡＨまたはＡＡＨの一部に対する結合特異性を有する抗原結合部分に関する。特に、本発明は、特異的にＡＡＨに結合するヒト単クローン性抗体に関する。一実施形態において、抗体またはその結合部分はヒトＡＡＨ（ＨＡＡＨ）に対する特異性を有する。ＡＡＨを特徴付ける１つ以上の機能を抑制する抗体は、その機能が酵素活性（例えば、水酸化酵素活性）であっても細胞の段階で現れる機能（例えば、腫瘍細胞の促進運動）であっても、本発明の範囲内である。従って、例えば、抗ＡＡＨ抗体は、腫瘍細胞の運動性を抑制するものであってよい。あるいは、または追加で、本発明の抗体は、ＥＧＦ様ドメインを含む蛋白（例えば、細胞外基質蛋白）等の天然リガンドとのＡＡＨの相互作用を抑制（低減または阻止）してよい。ＡＡＨを対象とするヒト単クローン性抗体（例えば、特異的に結合する抗体）は、ヒドロキシル化による基質活性の変調を含む、ＡＡＨにより仲介された機能を抑制できる。好ましくは、抗体およびその抗原結合部分は、ＡＡＨを１ｘ１０６Ｍ−１より大きい親和性で結合することができる。
【００２８】
ＨＡＡＨアミノ酸配列は、ジンバンク（登録商標）のアクセッション番号Ｉ３８４２３（ＧＩ：７４３３２４５）の項目に記載されている。当業者の１人が容易にジンバンク（登録商標）またはその他の資料から配列を検索することができる。ＨＡＡＨの膜貫通ドメインは、ジンバンク（登録商標）配列のアミノ酸３４１乃至３７４の間にあるよう指定されている。分子の細胞外（または内腔）部分は、Ｃ末端に対応する。抗ＡＡＨ抗体は、完全長であってもなくても、ＡＡＨまたはその蛋白の断片と相互に作用（例えば、結合）する（例えば、抗ＨＡＡＨ抗体はＨＡＡＨに結合する）。抗体はＡＡＨのエピトープ（例えば、立体構造または直線状エピトープ）または完全長ＡＡＨ蛋白の断片と結合してよい。立体構造エピトープは、一般的に変性溶剤にさらされると失われる。
【００２９】
抗体：本発明の抗体は、様々な構成をとることができる。例えば、抗体は四量体（例えば、２本の重鎖および２本の軽鎖を有する抗体）または一本鎖抗体であってよい。従って、本発明の抗体は、１本または２本の重（Ｈ）鎖可変領域および１本または２本の軽鎖可変領域を有する蛋白を含む。ＶＨＣおよびＶＬＣ領域は、さらに、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超過変性領域に細分され、「骨格領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が組み入れられることができる。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、国立衛星研究所出版番号９１−３２４２、１９９１年、および、Ｃｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、１９８７年、を参照。これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。本発明の抗体が１つ以上のＶＨＣおよび／または１つ以上のＶＬＣを含む場合、各ＶＨＣおよびＶＬＣは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなることができ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置されることができる。
【００３０】
本発明の抗体のＶＨＣまたはＶＬＣ鎖は、重鎖または軽鎖定常領域のすべてまたは一部をさらに含むことができる。一実施形態において、抗体は２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、ここで免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、例えばジスルフィド結合によって相互接続している。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインを含む。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互に作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、一般的に、免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および典型的な補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への抗体の結合を仲介する。「抗体」という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭタイプの無傷免疫グロブリン（そのサブタイプ（例えば、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）も同様）を含み、ここで免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダのタイプであってよい。
【００３１】
抗体は、「免疫グロブリン」と称されてもよい（実質的に免疫グロブリン遺伝子によりエンコードされる１つ以上のポリペプチドからなる蛋白、本発明の抗ＡＡＨ抗体は、抗ＡＡＨ免疫グロブリンと称されてもよく、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子によりエンコードされた配列を含んでよい）。存在が認められているヒト免疫グロブリン遺伝子は、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子とともに、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、エプシロン、およびミュー定常領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａおよび２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）の可変領域遺伝子およびＣＯＯＨ末端のカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によりエンコードされる。完全長免疫グロブリン重鎖（約５０ｋＤａおよび４４６アミノ酸）は、同様に可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）およびその他の上記定常領域の１つ、例えばガンマ（約３３０アミノ酸をエンコード）によりエンコードされる。
【００３２】
本発明の抗体または免疫グロブリンは、ヒトまたは非ヒト資源のＣＤＲ（これについては本明細書にてさらに説明する）を含んでよい。免疫グロブリンの骨格は、例えばヒトにおいて抗原性を低下させるよう修正されたマウス骨格のような、ヒト、ヒト化、または非ヒト、または、例えば共通配列のような合成骨格であってよい。
【００３３】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」または「部分」）という用語は、本明細書で使用される場合、特異的にＡＡＨ（例えば、ＨＡＡＨ）に結合する抗体の部分、例えば１つ以上の免疫グロブリン鎖が完全長でないが特異的にＡＡＨに結合する分子を意味する。抗体の「断片（または抗原結合部分）またはその他の変異形内」に包含される結合部位の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨＣおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一腕部のＶＬＣおよびＶＨＣドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨＣドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６、１９８９年）、および（ｖｉ）特異的に結合するのに十分な骨格、例えば可変領域の抗原結合部分を有する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。軽鎖可変領域の抗原結合部分および重鎖可変領域の抗原結合部分、例えばＦｖ断片の２つのドメイン、ＶＬＣおよびＶＨＣは、ＶＬＣおよびＶＨＣ領域が一価の分子を形成するために組み合わさっている単一蛋白鎖としてそれらを作成できるようにする合成リンカーにより、組み換え法を使用して接合されることができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として周知のものとしては、例えば、Ｂｉｒｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、１９８８年、および、Ｈｕｓｔｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３、１９８８年を参照）。そのような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるよう意図されてもよい。これらの抗体部分は、当業者に周知の従来技術を使用して得られ、これらの部分は実用のため無傷の抗体と同じ様式でスクリーニングされる。Ｆａｂ断片は、四量体抗体の分裂によって生じることができる。Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片は、ペプシンとの分裂により生成されることができる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、骨格残基がヒト生殖系配列に対応し、ＣＤＲがＶ（Ｄ）Ｊ組み換えおよび体細胞変異により生じる任意の抗体を含む。しかしながら、ヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン核酸配列においてエンコードされないアミノ酸残基（例えば、生体外における無作為または部位特異的な突然変異誘発により導入された突然変異体）も含んでよい。生体内におけるヒト可変遺伝子の体細胞変異は、骨格残基の特別変異を引き起こすことが実証されている（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５３７、２００１年、を参照）。そのような抗体は、骨格突然変異にかかわりなく、その資源を考慮して、「ヒト」と称される場合がある。マウス抗体可変ドメインが骨格残基における体細胞変異を含むこともできる（Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ８：１５９、１９９６年、を参照）。その結果、ヒトＩｇ遺伝子座を含むトランスジェニックマウスは、平均４．５の骨格突然変異を保有するにもかかわらず、一般に「完全ヒト」と称される抗体を生み出す（この研究においては１乃至８の範囲：Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９７年２月、１５（２）：１４６−５６）。そのため一般に認められた語法では、生殖系配列に基づくが例えば生体内体細胞異変によって導入された骨格突然変異過程を保有する抗体可変ドメイン遺伝子は、「ヒト」と呼ばれる。従って、本発明は、特異的にＡＡＨ（例えば、ＨＡＡＨ、それらの抗体が突然変異体（例えば、ＦＲ内の突然変異体）を含んでいる場合でも）およびその断片またはその他の変異形を結合するヒト抗体（例えば、多量体ヒト抗体のＶＬＣおよびＶＨＣを含む一本鎖抗体）を包含する。例えば、本発明のヒト抗体は、１乃至８の骨格突然変異（例えば、約２、４、６、または８の置換、追加、または削除）を有することができる。原型ヒト抗体の配列はヒト生殖系配列であることが好ましい。
【００３５】
ＨＡＡＨに対して特異的なヒト一本鎖抗体は、本明細書で記載されているように生み出される。特定の実施形態において、本発明は、ＨＡＡＨに対し特異性を有し、本明細書に記載の抗体により結合されたエピトープに結合する抗体（例えば、クローン１１によりエンコードされた抗体または親和性成熟されたクローン１１の派生物）を提供する。本明細書に記載の抗体により結合されたエピトープと重複するエピトープを結合する抗体は、ＨＡＡＨと結合するためにＥＧＦ様ドメインと競争するその能力により識別されることができる（例えば、ＨＡＡＨ形質転換体のようなＨＡＡＨを運ぶ細胞、またはＨ４６０腫瘍細胞）。抗ＡＡＨ抗体の結合部位は、ＨＡＡＨの触媒ドメイン内にあってよい。
【００３６】
抗ＡＡＨ抗体は、多クローン性または単クローン性であってよい。本明細書に記載の抗体およびその抗原結合部分は、治療用組成物および処方計画、診断用組成物および処方計画、ならびにＡＡＨ蛋白を識別または抑制できる薬剤を必要とするアッセイにおいて有用である。本発明は、治療（予防を含む）または診断（例えば、癌など特定の疾病または症状の）において使用するための、抗体またはその抗原結合部分、ならびに、本明細書に記載されるような疾病および症状の治療に使用する薬品製造のための、そのような抗体またはその抗原結合部分の使用を包含する。
【００３７】
異なる種から派生した部分を備えるキメラまたはＣＤＲ移植一本鎖抗体と同様に、一本鎖抗体、およびキメラヒト化またはＣＤＲ移植抗体も本発明によって、また「抗体」という用語によって包含される。これらの抗体の様々な部分は、従来技術により化学的に接合されるか、遺伝子操作技術を使用して連続したポリペプチドとして調製されることができる。例えば、キメラまたはヒト化鎖をエンコードする核酸は、連続するポリペプチドを生み出すために発現することができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ等、米国特許番号４，８１６，５６７；Ｃａｂｉｌｌｙ等、ヨーロッパ特許番号０，１２５，０２３Ｂ１；Ｂｏｓｓ等、米国特許番号４，８１６，３９７；Ｂｏｓｓ等、ヨーロッパ特許番号０，１２０，６９４Ｂ１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．等、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．等、ヨーロッパ特許番号０，１９４，２７６Ｂｌ；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許番号５，２２５，５３９；および、Ｗｉｎｔｅｒ、ヨーロッパ特許番号０，２３９，４００Ｂｌを参照のこと。また、ＣＤＲ移植抗体に関する、Ｎｅｗｍａｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１４５５−１４６０、１９９２年、および、Ｌａｄｎｅｒ等、米国特許番号４，９４６，７７８、ならびに、一本鎖抗体に関するＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、１９８８年、も参照のこと。
【００３８】
また、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、または一本鎖抗体の断片を含む抗体の抗原結合部分を生み出すこともでき、これは本発明の範囲内である。抗体の抗原結合部分は、それらが派生した完全長抗体の結合機能を少なくとも１つ保持する。好適な抗原結合部分は、完全長抗体に相当する抗原結合機能（例えば、ＡＡＨに対する特異性）を保持する。機能的断片は、ＡＡＨヒドロキシラーゼ活性のようなＡＡＨを特徴付ける１つ以上の機能を抑制する完全長抗体の能力を保持することができる。例えば、機能的断片はＥＧＦ様ドメインのヒドロキシル化を抑制することができる。これらのＥＧＦ様ドメインは、凝固因子、細胞外基質蛋白、低密度リポ蛋白受容体、ノッチ相同体、またはノッチリガンド相同体のような多様な蛋白において反復配列を形成する保存モチーフを含む。今述べたものを含む任意のＡＡＨ基質は、抗ＡＡＨ抗体を評価するアッセイにおいて使用できる。典型的なＡＡＨアッセイ基質は、ＥＧＦ−ＩＸ１Ｈ（Ｇｒｏｎｋｅ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８６（１０）：３６０９−１３、１９８９年）、ＥＧＦ−Ｘ１Ｈ（Ｇｒｏｎｋｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５５８−８５６５、１９９０年）、およびＥＧＦ−Ａｓｎ（Ｇｒｏｎｋｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５５８−８５６５、１９９０年；Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４００４−１４０１０、１９９１年）を含む。
【００３９】
例えば、ＡＡＨに結合できる抗体部分またはその断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を含む。そのような部分は、酵素的切断または組み換え技術により生み出されることができる。例えば、パパインまたはペプシン切断は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片をそれぞれ生成することができる。抗体は、１つ以上の終止コドンが天然終止部位の上流へ導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切断型で生み出すこともできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をエンコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をエンコードするＤＮＡ配列を含むよう設計されることができる。
【００４０】
本発明は、遺伝子操作技術を使用して連続したポリペプチドとして調製されうるキメラ抗体を提供する（例えば、キメラ抗体の蛋白部分をエンコードするＤＮＡは連続するポリペプチド鎖を生み出すために発現できる）。本発明のキメラ抗体の一例は、ＣＤＲ（例えば、本明細書に記載されている抗体のＣＤＲのうち１つ以上）を備える１つ以上の抗体鎖を含む抗体および第２の抗体の軽鎖および／重鎖から派生した骨格領域である（例えば、ヒト由来のもの、例えば骨格変化の有無を問わずＣＤＲ移植抗体）。一実施形態において、キメラ抗体は、ＨＡＡＨに結合するためにマウス１５Ｃ７またはＦＢ５０単クローン性抗体と競争することができる。キメラ抗体の抗原結合領域は、本明細書に記載の抗体クローン（例えば、クローン１１、またはクローン１１の突然変異体、例えば、クローン１１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにクローン１１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を備えるキメラ抗体におけるもの等）から派生することができる。キメラまたはＣＤＲ移植一本鎖抗体は、ヒト化免疫グロブリンも含む。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ等、米国特許番号４，８１６，５６７；Ｃａｂｉｌｌｙ等、ヨーロッパ特許番号０，１２５，０２３Ｂ１；Ｑｕｅｅｎ等、ヨーロッパ特許番号０，４５１，２１６Ｂ１；Ｂｏｓｓ等、米国特許番号４，８１６，３９７；Ｂｏｓｓ等、ヨーロッパ特許番号０，１２０，６９４Ｂ１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．等、ヨーロッパ特許番号０，１９４，２７６Ｂ１；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許番号５，２２５，５３９；Ｗｉｎｔｅｒ、ヨーロッパ特許番号０，２３９，４００Ｂ１；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．等、ヨーロッパ特許出願番号０，５１９，５９６Ａｌを参照。また、一本鎖抗体については、Ｌａｄｎｅｒ等、米国特許番号４，９４６，７７８；Ｈｕｓｔｏｎ、米国特許番号５，４７６，７８６；およびＢｉｒｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、１９８８年）も参照のこと。
【００４１】
キメラ抗体は、望ましいキメラ鎖をエンコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を調整するため、合成および／または組み換え核酸を使用して生み出すことができる。例えば、可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列は、抗体鎖をエンコードするＤＮＡ配列を修正するためのＰＣＲ突然変異誘発法、例えばヒト化抗体を生成するために採用される方法を使用して構築される（例えば、Ｋａｎｕｎａｎ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５４０４、１９８９年；Ｓａｔｏ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：８５１−８５６、１９９３年；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（９）：２４７１−２４７６、１９９１年；およびＬｅｗｉｓとＣｒｏｗｅ、Ｇｅｎｅ１０１：２９７−３０２、１９９１年、を参照のこと）。これらの、またはその他適合する方法を使用して、変異形も容易に産出できる。一実施形態において、クローン化可変領域は突然変異することがあり、望ましい特異性で変異形をエンコードする配列が選択されることができる（例えば、ファージライブラリーから、例えばＫｒｅｂｂｅｒ等、米国特許番号５，５１４，５４８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、ＷＯ９３／０６２１３、１９９３年４月１日公告、を参照のこと））。
【００４２】
ＡＡＨ抗体を産生または単離するその他の適合する方法は、例えば、ヒト抗体の完全なレパートリーを生み出すことができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫に依存する方法を含む（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１−２５５５、１９９３年；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５−２５８、１９９３年；Ｌｏｎｂｅｒｇ等、米国特許番号５，５４５，８０６；Ｓｕｒａｎｉ等、米国特許番号５，５４５，８０７を参照のこと）。
【００４３】
特異的にＡＡＨに結合する抗体は、ライブラリーにおいて組み換え抗体を発現することおよびＡＡＨを結合するライブラリーのメンバーを選択することによって識別できる。選択された抗体のＡＡＨに対する親和性は、これらの抗体を、例えば本明細書に記載のとおり１サイクル以上のスクリーニングと併せてＰＣＲ突然変異誘発、鎖シャッフリング、またはＣＤＲシャッフリング技術を使用し親和性成熟することによってさらに高めることができる。抗ＡＡＨ抗体を生成するためにその他の方法も使用できる。例えば、抗ＡＡＨ抗体は動物に免疫性を与えることによって生み出すことができる。免疫性を求めて抗原を調製するための、および免疫動物から単クローン性抗体を生成するための様々な方法が記載されている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７、１９７５年；Ｋｏｈｌｅｒａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６年、；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ２６６：５５０−５５２、１９７７年；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ等、米国特許番号４，１７２，１２４；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．とＤ．Ｌａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻（１９９４年春、付録２７）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等、Ｅｄｓ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、第１１章、（１９９１年）を参照のこと）。概して、ハイブリドーマは、適合する不死の細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）を抗体産生細胞と融合させることによって生み出されることができる。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節のそれらは、免疫動物から得られる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離され、限界希釈によりクローン化されることができる。望ましい特異性を持つ抗体を生み出す細胞は、適合するアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により選択できる。
【００４４】
抗体またはその抗原結合部分は、例えば、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：１１９、配列ＩＤ番号：１２１、配列ＩＤ番号：１２３、配列ＩＤ番号：１２５、配列ＩＤ番号：１２７、配列ＩＤ番号：１２９、配列ＩＤ番号：１３１、配列ＩＤ番号：１３３、配列ＩＤ番号：１３５、配列ＩＤ番号：１３７、配列ＩＤ番号：１３９、配列ＩＤ番号：１４１、配列ＩＤ番号：１４３、配列ＩＤ番号：１４５、配列ＩＤ番号：１４７、配列ＩＤ番号：２５４、配列ＩＤ番号：２５６、配列ＩＤ番号：２５８、配列ＩＤ番号：２６０；配列ＩＤ番号：２６２、配列ＩＤ番号：２６４、配列ＩＤ番号：２６６、配列ＩＤ番号：２６８、および配列ＩＤ番号：２７０の配列のいずれか１つに対し、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域を含む。
【００４５】
抗体またはその抗原結合部分は、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：１２０、配列ＩＤ番号：１２２、配列ＩＤ番号：１２４、配列ＩＤ番号：１２６、配列ＩＤ番号：１２８、配列ＩＤ番号：１３０、配列ＩＤ番号：１３２、配列ＩＤ番号：１３４、配列ＩＤ番号：１３６、配列ＩＤ番号：１３８、配列ＩＤ番号：１４０、配列ＩＤ番号：１４２、配列ＩＤ番号：１４４、配列ＩＤ番号：１４６、配列ＩＤ番号：１４８、配列ＩＤ番号：２５５、配列ＩＤ番号：２５７、配列ＩＤ番号：２５９、配列ＩＤ番号：２６１、配列ＩＤ番号：２６３、配列ＩＤ番号：２６５、配列ＩＤ番号：２６７、配列ＩＤ番号：２６９、および配列ＩＤ番号：２７１の配列のいずれか１つに対し、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域を含む。
【００４６】
抗体またはその抗原結合部分は、例えば、配列ＩＤ番号：１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：３０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１１９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２５５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２５７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２５９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、または、配列ＩＤ番号：２７０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２７１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域を含む。
【００４７】
様々な実施形態において、抗体およびその抗原結合部分は配列ＩＤ番号４６乃至８１または２８１乃至３１３のいずれか１つに対し、少なくとも４０％（例えば、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％）同一である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００４８】
様々な実施形態において、抗体もしくはその断片またはその他変異形は、配列ＩＤ番号４６乃至５１、５４、５６、８２乃至１１７、１６４乃至２５０、または３１４乃至３１９のいずれか１つに対し、少なくとも４０％（例えば、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％）同一である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体もしくはその断片またはその他変異形は、配列ＩＤ番号：１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：３０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１１９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域配列ＩＤ番号：１３７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５４に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２５５に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５６に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２５７に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５８に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２５９に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６０に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６１に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域配列ＩＤ番号：２６２に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６３に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６４に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６５に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６６に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６７に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６８に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６９に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、または、配列ＩＤ番号：２７０に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２７１に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域であってよく、またはそれを含んでもよい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「実質的に同一」（または「実質的に相同」）という用語は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が同様の活性を有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対し同一あるいは同等な（例えば、同様の側鎖、例えば保存されたアミノ酸置換を持つ）十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。抗体の場合、第２の抗体は同じ特異性を有し、第１の抗体の親和性を少なくとも５０％有する。
【００５０】
２つの配列間の「相同性」または「同一性」の計算は、以下のように実施できる。配列を最適な比較のため１列に並べる（例えば、最適な配置のため第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または両方にギャップを導入してよく、比較目的のため非相同性配列は無視してよい）。異なる実施形態において、比較目的のために１列に並べられた基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも５０％である。次いで、アミノ酸位置またはヌクレオチド位置に対応するアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における位置に対応するものと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドに占められる場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一度は、２つの配列の最適な配置のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れると、それらの配列に共有される同一位置の数の関数である。
【００５１】
配列の比較および２つの配列間の相同度決定は、数学アルゴリズムを使用して遂行できる。２つのアミノ酸配列間の相同度は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ延長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを持つマトリックスを記録するＢＬＯＳＵＭ６２を使用してＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３、１９７０年、アルゴリズムを使用することにより決定される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「低ストリジェンシー、中ストリジェンシー、高ストリジェンシー、または超高ストリジェンシー条件下においてハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を表す。ハイブリダイゼーション反応を実施するための手引きは、参照することで本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．６．３．１−６．３．６、１９８９年、に見ることができる。当該参考文献には水性および非水性の方法が記載されており、いずれも使用可能である。本明細書でいわれる特定のハイブリダイゼーション条件は、１）６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃の低ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、少なくとも５０°で２回洗浄（低ストリジェンシー条件の場合、洗浄液の温度は５５℃まで上げることができる）、２）６Ｘ ＳＳＣ中、約４５℃の中ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で１回以上洗浄、３）６Ｘ ＳＳＣ中、約４５℃の高ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１回以上洗浄、および４）超高ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、６５℃、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で１回以上洗浄である。
【００５３】
本発明の抗体およびその抗原接続部分は、追加の保存または非必須アミノ酸置換を有してもよいと理解されている（「非必須」アミノ酸残基は、例えば抗体等の結合剤のように、実質的に生物活性を修正することなくポリペプチドの野生型配列から修正できる残基であり、一方「必須」アミノ酸残基はそのような変化を生じさせる）。
【００５４】
例えば、特定の置換は耐容されてもされなくても、Ｂｏｗｉｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６−１３１０、１９９０年、に記載のように決定されうる結合活性のような望ましい生物特性に悪影響を与えないであろう。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基の族は、当技術分野で定義されている。これらの族は、塩基側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００５５】
本明細書に記載されているように、本発明の抗体は、ＡＡＨのヒドロキシナーゼ活性を抑制および／または細胞運動等のヒドロキシナーゼ活性と関連する機能を抑制することができる。以下に説明するように、ＡＡＨ活性および／または活性に関連する機能の抑制をｋ評価するために様々な方法が使用できる。
【００５６】
結合アッセイ
本明細書で使用される場合、「哺乳類ＡＡＨ蛋白」は、自然発生的または内因性の哺乳類ＡＡＨ蛋白および哺乳類ＡＡＨ蛋白に対応する自然発生的または内因性のものと同じアミノ酸配列を有する蛋白（例えば、組み換え蛋白）を意味する。従って、本明細書で定義するように、この用語は、多様型または対立遺伝子多型、もしくは哺乳類ＡＡＨのその他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたはその他の細胞過程により生み出されたもの）、および前述のものの修正型または非修正型（例えば、グリコシル化、非グリコシル化）を含む。ＡＡＨ蛋白は単離したものおよび／または組み換え蛋白（合成的に生み出された蛋白を含む）であってよい。自然発生的または内因性の哺乳類ＡＡＨは、修復されるか自然に例えば腫瘍細胞のようなＡＡＨを生み出す資源から単離されることができる。
【００５７】
ＡＡＨ蛋白の「機能的変異形」は、機能的断片、機能的変異蛋白、および／または機能的融合蛋白（例えば、突然変異誘発および／または組み換え技術により生み出されたもの）を含む。概して、ＡＡＨ蛋白の断片または部分は、成熟した哺乳類ＡＡＨに関連するアミノ酸（すなわち、１つ以上のアミノ酸）の欠損（すなわち１つ以上の欠損）を有するものを含む（Ｎ端、Ｃ端または内部欠損等）。
【００５８】
概して、ＡＡＨ蛋白の突然変異体は、１つ以上の連続する、または連続しないアミノ酸残基の追加、欠損および／または置換で異なるＡＡＨ蛋白の天然または人工の変異形を含む。そのような突然変異体は、例えば保存領域または非保存領域、細胞外、細胞質内、もしくは膜貫通領域にあってよい。
【００５９】
ＡＡＨ蛋白の「機能的断片または部分」「機能的突然変異体」および／または「機能的融合蛋白」は、ヒドロキシラーゼ活性等、本明細書に記載するようなＡＡＨ蛋白を特徴付ける少なくとも１つの機能を有する単離した、および／または組み換え蛋白もしくはポリペプチドを意味する。
【００６０】
単離された、および／または組み換え哺乳類ＡＡＨまたはその部分を備える組成物は、結合に適合する条件下で維持することができ、受容体はテストされる抗体に接触し、結合が検出または測定される。一実施形態において、受容体蛋白は、ＡＡＨを発現する細胞内またはＡＡＨまたはその部分をエンコードする核酸配列を備える構造を持つ安定してまたは一時的にトランスフェクションされる細胞内で発現されることができる。細胞は、受容体の発現に適切な条件下で維持される。細胞は結合に適合する条件下（例えば、適合する結合バッファー内）で抗体に接触し、結合は標準的な技術により検出される。結合を測定するために、結合の範囲は適合する対照に対して決定される（例えば、抗体がない場合に決定されるバックグラウンドと比較、第２の抗体（すなわち、標準）と比較、トランスフェクションされていない細胞に対する抗体の結合と比較等）。膜画分等のＡＡＨを含む細胞分画は、全細胞の代わりに使用できる。
【００６１】
一実施形態において、抗体には適合する標識（例えば、蛍光標識、同位体標識、酵素標識）で標識され、結合はその標識の検出により決定される。別の実施形態において、結合された抗体は標識された第２の抗体により検出されうる。結合の特異性は、例えば標識されていない抗体またはリガンドを競争相手として使用し、競争または変位により評価されることができる。
【００６２】
結合抑制アッセイはＡＡＨを結合しＥＧＦ様ドメインのような別の化合物の結合を抑制する抗体を識別するためにも使用できる。例えば、結合アッセイは、抗体がある場合のリガンドと比較して、ＥＧＦ様ドメインの結合の減少が検出および測定される場合において実施されうる（抗体がない場合）。ＡＡＨはＥＧＦ様ドメインおよび抗体を同時に、または交互に、いずれかの順序で含む蛋白と接触できる。抗体がある場合における蛋白の結合範囲の縮小は、抗体による結合の抑制を示す。例えば、ＥＧＦ様ドメインの結合は減少もしくは根絶する場合がある。
【００６３】
その他の適合する結合アッセイ、もしくは例えば細胞形質転換または細胞運動等のＡＡＨ活性によって事象を監視する方法のような、ＡＡＨを結合する抗体の存在を識別するその他の方法が使用可能である。
【００６４】
本発明の抗体の抑制効果は結合抑制アッセイにおいて評価されることが理解されるであろう。結合する抗体間の競争もこの方法で評価することができる。この様式で識別される抗体は、結合に続いてＡＡＨのその他の機能を抑制する役割を果たす、および／またはその治療的有用性を評価するか否かを決定するためにさらに評価されることができる。
【００６５】
抗体活性を決定するためのアッセイ
ＡＡＨは、第１鉄がある場合において、蛋白の上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン内のアスパラギン酸またはアスパラギン残基のβ炭素にヒドロキシル基を導入する。保存されたＣＸ７ＣＸ４ＣＸ１０ＣＸＣＸ８Ｃ配列を含むＥＧＦ様ドメインは、凝固因子、細胞外基質蛋白、低密度リポ蛋白受容体、ノッチ相同体、およびノッチリガンド相同体のような多くの多様な蛋白内に存在する。ＡＡＨ基質のヒドロキシル化は、ヒドロキシラーゼ活性の直接検出を含むことができる、または、例えばヒドロキシル化の生物活性を検出するアッセイを使用して間接的に測定されることができる。
【００６６】
ヒト抗ＡＡＨ抗体がＡＡＨ活性を抑制するか否かを決定するアッセイは、テスト抗体が存在する酵素反応におけるヒドロキシル化のレベルを化合物がない場合の併発反応と、または所定の対照値と比較することによって実施できる。標準的なヒドロキシラーゼアッセイが周知である。例えば、Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１３１３−１３２３、１９９６年；Ｊｉａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３２２−１４３２７、１９９２年、；Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４００４−１４０１０、１９９１年；またはＧｒｏｎｋｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５５８−８５６５、１９９０年、を参照のこと。ヒドロキシラーゼ活性は、マイクロタイタープレート中の二酸化炭素（１４ＣＯ２キャプチャーアッセイ）を使用して測定することができる（Ｚｈａｎｇ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：１３７−１４２、１９９９年）。
【００６７】
ＡＡＨ活性の変調は、特異的基質における影響を含むヒドロキシル化下流の生化学的影響および細胞過程における影響により判断できる。ＡＡＨ活性は細胞運動、増殖、生存、および細胞周期の進行を向上させる。抗体によるＡＡＨ活性の抑制は、抗体がある場合のこれらの過程いずれか１つの減少を検出することにより判断できる。
【００６８】
細胞運動の変調は、例えば運動アッセイを使用してアッセイすることができる。概して、運動アッセイは、障壁（例えば、フィルター）内でまたは介して、適合する細胞（腫瘍細胞等）の、障壁の第２の表面と対立する第１の表面から化合物の上昇レベル（例えば、成長因子またはその他のポリペプチド）への方向性または移動を監視する。膜またはフィルターは、フィルター内のまたは介する適合する細胞の、障壁の第２の表面と対立する第１の表面からから化合物の上昇レベルへ向かう方向性または移動が監視されるよう、都合のよい障壁を提供する。適合する容器内において、第１室から微多孔膜内に入るかそれを通過してテストする抗体を含み、膜により第１室から分割される第２室へ向かう細胞の移動を検出または測定することができる。特異的移動の監視に適合する膜孔サイズを有する適合する膜は、例えばニトロセルロース、ポリカーボネートを含む化合物に対応して選択される。例えば、約３乃至８ミクロンの膜孔サイズを使用することができる。
【００６９】
移動および移動の抑制を評価するために、フィルターの第２の表面に接着したフィルターを通過する細胞の数および／または第２室中に蓄積する細胞の数を、標準的技術（例えば、顕微鏡検査）を使用して判断することができる。一実施形態において、細胞は検出可能な標識（例えば、放射性同位体、蛍光標識、抗原またはエピトープ標識）で標識されており、移動は、適切な方法を用いて膜に接着する標識の存在および／または第２室の存在を判断することにより（例えば、放射活性、蛍光性、免疫学的検定を検出することにより）、抗体がある場合およびない場合において評価されうる。抗体アゴニストにより誘発される移動の範囲は、適合する対照に対して決定できる（例えば、抗体がない場合に決定されるバックグラウンドの移動と比較、第２の抗体（すなわち、標準）とにより誘発される移動の範囲と比較、抗体により誘発された拡散を入れられていない細胞の移動と比較）。抗体がある場合における化合物（例えば、ウシ血清）により誘発された移動の範囲の縮小は、阻害活性を示す。
【００７０】
一実施形態において、細胞は、無血清培地内に挿入するＢｏｙｄｅｎ室タイプの培養物の上室内に置かれる。１％乃至２％のウシ胎仔血清が添加された培地は、移動のための刺激物を提供するため、下室に置かれる。細胞は約４時間培養され、移動を生じさせる。上室および下室内の細胞数が定量化される。各室内の生存細胞は、ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）のようなＡＴＰ監視システムを使用して定量化されることができる（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）；例えば、運動アッセイを説明するＳｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：８８１−８９１、２００２年、を参照のこと）。
【００７１】
ＡＡＨ過剰発現は、細胞増殖および悪質形質転換に連鎖している。ＡＡＨ活性の抑制は、ヌードマウスにおける形質転換、足場依存性細胞成長、および腫瘍原性のような、悪性の表現型の細胞特性を測定することによってアッセイされることができる。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞をＡＡＨでトランスフェクションし、形質転換焦点を観測することにより形質転換にアクセスできる（ＣｏｐｅｌａｎｄとＣｏｏｐｅｒ、Ｃｅｌｌ１６（２）：３４７−５６、１９７９年）。足場依存性細胞成長は、細胞をＡＡＨでトランスフェクションし、形質転換体を単離し、０．５３％の低融点アガロースを含む培地の下層を覆う、形質転換体を０．４％の低融点アガロースを含む完全培地に懸濁させることでアッセイできる。
【００７２】
腫瘍原性を生体内においてアッセイするため、ＡＡＨ形質転換クローン（またはＡＡＨ発現腫瘍細胞）をヌードマウスに注入する。一般的なアッセイにおいては、約百万乃至１千万の細胞が同時に注入される。１週間から１ヵ月間成長させた後、マウスを犠牲死させ、腫瘍を除去して重さを量る。抗体は、ＡＡＨ形質転換体または腫瘍細胞が埋め込まれた動物への注入および埋め込まれた細胞の成長を対照注入（例えば、生理食塩水または非特異的抗体）を受けた動物の細胞の成長と比較することによりテストできる。
【００７３】
抑制活性を持つ抗体は、これらのアッセイにおける細胞成長、形質転換および腫瘍原性の効率を下げることがある。
【００７４】
診断および治療への応用
本発明の抗体は、研究、診断および治療への応用を含む様々な用途において有用である。一実施形態において、抗体は適合する標識（例えば、蛍光標識、化学発光標識、同位体標識、エピトープまたは酵素標識）で標識される。
【００７５】
ＨＡＡＨの過剰発現は、悪性形質転換に関連する。ＨＡＡＨの活性を阻害および／または抑制する抗体またはその抗原結合部分は、細胞形質転換を抑制および／または形質転換した細胞を診断するために使用できる。従って、本発明は、細胞をＡＡＨまたはＡＡＨの一部を結合させる効果的な量の抗体またはその抗原結合部分に接触させるステップを含む、ＡＡＨまたはその部分を発現する細胞のＡＡＨ活性を抑制する方法を提供する。細胞は、対象の細胞（例えば、腫瘍細胞）であってよく、抗体またはその抗原結合部分は対象の生体内に投与されてよい。抗体またはその抗原結合部分の治療的使用は、予防的使用（例えば、癌を発症するリスクの高い患者の治療のため）を含む。
【００７６】
抗ＡＡＨ抗体またはその抗原結合部分は、抗癌剤等、１つ以上のその他の治療用薬剤と組み合わせて投与してもよい。抗癌剤の限定されない例としては、例えば抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、分裂抑制剤、アルキル化剤、挿入剤、信号変改経路を妨害できる薬剤、アポトーシス（細胞死遺伝子を含む）を促進する薬剤、放射性化合物、およびその他の腫瘍関連抗原（裸抗体、免疫毒素および放射性接合体を含む）が挙げられる。抗癌剤の特定クラスの詳細な例は、例えばパクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、酒石酸ビノレルビン、タキソテール等の抗チューブリン／抗微小管；例えばトポテカン、カンプトセシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン、ピロキサントロン塩酸塩等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキサート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホラセチル−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ペントスタチン、５−アゼチジン、５−Ａｚａ２’−デオキシシチジン、ａｒａ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸等の代謝拮抗剤；例えばシスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール等のアルキル化剤；例えばジヒドロレンペロン、スピロムスチン、およびデシペプチド等の、作用のその他のメカニズムを介して作用する薬剤；例えばインターフェロンのような抗腫瘍反応を高めるための生物反応修飾物質；アクチノマイシンＤのようなアポトーシス剤；例えばタモキシフェンのような抗エストロゲン、または、例えば４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルフォニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオナニリドのような抗アンドロゲン等の抗ホルモンである。
【００７７】
本発明の抗ＡＡＨ抗体は、診断への応用においても価値を有する。抗ＡＡＨ抗体は、生体内における腫瘍の成長および／または転移を監視するために使用でき、病期の診断上の指標として使用されてもよい。ヒト抗体は、ヒトにおいては免疫原性でなく、従ってヒト抗体はマウス抗体よりも生体内における診断への応用に適切であると思われる。
【００７８】
診断目的のためには、抗体または抗原結合部分は標識されてもされなくてもよい。一般的に、診断アッセイは、抗体または部分をＡＡＨへ結合した結果生じる合成物の形成を検出することを必要とする。抗体または部分は、直接標識されてよい。放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン等）を含むがそれらに限定されない様々な標識を採用することができる。当業者には多数の適切な免疫学的検定が周知である（例えば、米国特許番号３，８１７，８２７、３，８５０，７５２、３，９０１，６５４、および４，０９８，８７６を参照のこと）。標識されていない抗体または断片は、第１の抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体または標識されていない免疫グロブリンに対して特異的なその他の抗体）と反応する標識された抗体（例えば、第２の抗体）等、抗体を検出するために使用できる別の（すなわち、１つ以上の）適合する試薬またはその他の適合する試薬（例えば、標識された蛋白Ａ）と組み合わせて使用することもできる。
【００７９】
生体試料におけるＡＡＨの存在の検出に使用するキットも調製できる。そのようなキットは、抗体または部分およびＡＡＨまたはその部分の間にある合成物の存在の検出に適合する１つ以上の補助試薬に加えて、前記受容体のＡＡＨ蛋白または部分に結合する抗体またはその抗原結合部分を含むことになる。本発明の抗体の組成物は、単独で、またはその他のエピトープに対して特異的な追加の抗体と組み合わせて、凍結乾燥形状で提供される場合がある。抗体は、標識されていてもいなくても、付属材料（例えば、トリス、リン酸塩および炭酸塩のような緩衝剤、安定剤、賦形剤、殺生剤および／または例えばウシ血清アルブミン等の不活性蛋白）とともにキットに含まれることができる。例えば、抗体は付属材料を持つ冷凍乾燥された混合物として提供されることができるか、付属材料を持つ冷凍乾燥された混合物が、使用者が組み合わせるように個別に提供されることができる。単クローン性抗体に結合できる第２の抗体が採用され、そのような抗体がキット内において、例えば別個のバイアルまたは容器中に供される。第２の抗体が存在する場合、一般的に標識されており、上述の抗体製剤を用いて類似の様式で製剤することができる。
【００８０】
同様に、本発明は、細胞またはその画分（例えば、膜画分）を含む組成物が、抗体の結合に適切な条件下においてＡＡＨまたはＡＡＨの一部（例えば、触媒ドメイン）と結合する抗体またはその機能部分と接触し、抗体結合が監視される、ＡＡＨまたは酵素の部分の発現を細胞ごとに検出および／または定量化する方法にも関する。抗体とＡＡＨまたはその部分の間にある合成物の形成を示す抗体の検出は、ＡＡＨの存在を示す。例えば細胞への抗体の結合は、上記のように「結合アッセイ」に該当する。前記方法は、個体から細胞内における（例えば、腫瘍生検標本内の）ＡＡＨの発現を検出するために使用できる。腫瘍細胞の表面におけるＡＡＨの定量的発現は、例えばフローサイトメトリーによって検討することができ、染色度は疾患の進行または危険性と相関関係を持つ場合がある。
【００８１】
ＡＡＨは細胞運動の役割を有し、そのためＡＡＨ抗体を腫瘍の成長または転移を抑制（低減または阻止）するために使用することができる。従って、本発明の抗体は、研究および治療への応用においてＡＡＨ機能を調節するためにも使用できる。例えば、本明細書に記載の抗体は、（ａ）ＡＡＨへの（例えば、蛋白のＥＧＦ様ドメインの）結合、（ｂ）ＡＡＨにより仲介される受容体シグナル伝達機能、および／または（ｃ）（例えば、ＡＡＨの基質またはＡＡＨ経路等の）刺激性機能を抑制（低減または阻止）するための抑制剤として作用することができる。受容体機能の抑制剤として採用する抗体は、ＡＡＨ結合を直接的または間接的に阻害することができる（例えば、構造変化を起こすことによって）。従って、本発明は、ＡＡＨまたはＡＡＨの部分と結合する抗体またはその抗原結合部分を効果的な量で哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類（例えば、ヒト患者）における細胞運動を抑制する方法を提供する。前記方法に従って治療できる疾患は、癌を含み、病状の改善がもたらされうる。治療可能な癌は、充実性腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移病巣を含むがそれらに限定されない。充実性腫瘍の例は、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、神経外胚葉性腫瘍その他のような悪性腫瘍を含む腺癌に加えて、例えば、肺、乳房、リンパ、胃腸管（例えば、結腸）および尿生殖路（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、肝臓、咽頭、前立腺、卵巣に影響を及ぼすような様々な臓器系の非上皮性悪性腫瘍、腺癌、上皮性悪性腫瘍等の悪性腫瘍や胆管癌を含む。上記の癌の転移病巣は、本発明の方法または組成物を使用して治療または防止することもできる。
【００８２】
対象方法は、ほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌、および食道の癌のような悪性腫瘍を含む腺癌に加えて、例えば、肺、乳房、リンパ、胃腸管（例えば、結腸）および尿生殖路（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、前立腺、卵巣、咽頭に影響を及ぼすような様々な臓器系の悪性腫瘍治療において有用である。治療可能な典型的な充実性腫瘍としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫が挙げられる。
【００８３】
本明細書に記載の抗ＡＡＨ抗体を用いた治療に適する患者は、癌または「上皮性悪性腫瘍」を有するとされてよい。「上皮性悪性腫瘍」は、呼吸器系癌、胃腸系癌、非尿生殖器系癌、精巣癌、乳房癌、前立腺癌、内分泌系癌および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍として当業者に認識されている。典型的な上皮性悪性腫瘍としては、頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成したものが挙げられる。この用語は、例えば癌性組織および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織から派生した、または腫瘍細胞が認識できる腺状構造を形成する上皮性悪性腫瘍を意味する。「非上皮性悪性腫瘍」という用語は、当業者に認識されており、間葉系由来の悪性腫瘍を意味する。
【００８４】
本発明の方法は、例えば骨髄性、リンパまたは赤血球系、またはその前駆細胞から生じたもの等、造血由来の増殖性／腫瘍性細胞の増殖を抑制するために使用することもできる。例えば、本発明は、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含むがこれらに限定されない、様々な脊髄疾患の治療を意図している（Ｖａｉｃｋｕｓ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔｏｌ．１１：２６７−９７、１９９１年、に掲載）。対象方法により治療されうるリンパ性悪性腫瘍は、Ｂ系ＡＬＬおよびＴ系ＡＬＬを含む急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含むがこれらに限定されない。本発明の治療方法により意図される悪性リンパ腫の追加の形状は、非ホジキンリンパ腫およびその変異形、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）およびホジキン病を含むがこれらに限定されない。
【００８５】
投与の様態
本方法によると、１つ以上の抗体またはその抗原結合部分を、単独でまたは別の薬物と組み合わせて（前、同時、または後に）適切な経路により宿主に投与することができる。例えば、本発明の抗体は、別の単クローン性または多クローン性の抗体もしくは化学療法と組み合わせて使用することもできる。
【００８６】
効果的な量の抗体（すなわち、１つ以上の抗体または断片）を投与する。効果的な量は、ＡＡＨ機能の、また結果として腫瘍細胞の抑制に十分な量等、投与条件下において望ましい治療効果を実現するために十分な量である。
【００８７】
治療すべき疾病または症状に応じて、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、経口、食餌、局所、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、または経口吸入、鼻腔内滴下）を含むがこれらに限定されない、様々な投与経路が可能である。その他の適合する投与方法としては、充電式または生分解性のデバイスおよび除放性高分子デバイスも挙げられる。本明細書に記載の医薬組成物は、その他の薬剤との組み合わせ治療の一部として投与してもよい。
【００８８】
投与される抗体またはその一部の剤形は、選択される投与経路に応じて変わるであろう（例えば、液剤、乳剤、カプセル）。投与される抗体またはその抗原結合部分を含む適切な医薬組成物は、生理学的に許容可能な媒介体または担体に入れて調製してよい。抗体および／または部分の混合物も使用してよい。液剤または乳剤の場合、適合する担体は、例えば、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水性またはアルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含む。非口径の媒介体は、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油を含む場合がある。水、緩衝用水、緩衝生理食塩水、ポリオール類（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、ブドウ糖溶液およびグリシンを含む多種の適切な水性担体が当業者に周知されている。静脈の媒介体は、様々な添加物、保存料、もしくは流動体、栄養または電解質の補給液を含む場合がある（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０年、を参照のこと）。この組成物は、生理学的条件に近づける必要が有るため、任意で、ｐＨ調整および緩衝薬剤ならびに毒性調整薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムのような薬学的に許容可能な補助剤を含んでもよい。抗体は、分野にて周知の凍結乾燥および再構成技術に従って、保存のために凍結乾燥され、使用前に適合する担体内で再構成される場合がある。選んだ媒体内における活性成分の最適濃度は、当業者に周知の手順に従って実験的に決定してよく、望まれる最終的な製剤処方次第であろう。吸入の場合、化合物は投与のため可溶化し適合するディスペンサー（例えば、アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアゾールディスペンサー）に装填される場合がある。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例において本発明をさらに説明するが、これらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００９０】
実施例１ 抗ＨＡＡＨ抗体のライブラリースクリーニング
酵母表面提示技術（ＢｏｄｅｒとＷｉｔｔｒｕｐ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（６）：５５３−７、１９９７年）を使用し、抗ＨＡＡＨ Ｆｖ断片を得るため、実験未使用のヒト一本鎖Ｆｖライブラリーのスクリーニングを行った。このライブラリーは、Ｆｅｌｄｈａｕｓ等（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：１６３−１７０、２００３年）に記載のとおり調製を行った。つまり、ヒト抗体可変遺伝子を、５８の成体からプールした市販の脾臓およびリンパ節ポリ（Ａ）ｍＲＮＡのＰＣＲでクローン化した。ＩｇＧ、ＩｇＭ、κおよびλのプライマーを第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。別個のＶＨおよびＶＬライブラリーを構築し、次いでオーバーラップエクステンションＰＣＲによって１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォーマット内に集めた。次いで、酵母表面上にＡｇａ２ｐ融合体として発現させるため、ｓｃＦｖライブラリーをサブクローン化した。Ａｇａ２ｐ−ｓｃＦｖ融合蛋白を概略的に図１に描写する。約１０９のｓｃＦｖ断片が酵母に発現した。
【００９１】
ＢｏｄｅｒとＷｉｔｔｒｕｐ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．１４（１）：５５−６２、１９９８年）に記載されているような細胞外ドメインを含むＨＡＡＨの組み換え型に結合するため、ライブラリーのスクリーニングを行った。つまり、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって蛍光ＨＡＡＨに結合するため、Ａｇａ２ｐ−ｓｃＦｖ融合体を発現している酵母細胞をアッセイする。選別により結合剤を選択し、再分析する。３００ｎＭのＨＡＡＨ中で結合のスクリーニングを６回行うと、１６の特異クローンが識別できる。３つの特異クローンの、ＨＡＡＨへの結合のＦＡＣＳ分析を、図２に描写する。８つの特異クローンの、ＨＡＡＨの触媒ドメインへの結合のＦＡＣＳ分析を、図３に描写する。これらのクローンのうち、８つがＨＡＡＨの触媒ドメインに結合した。
【００９２】
実施例２ 抗ＨＡＡＨ抗体の結合活性
様々なｓｃＦｖクローンのＨＡＡＨに対する親和性を、あるｓｃＦｖを提示している細胞が、標識されていないＨＡＡＨの濃度を変え、次いで標識されたＨＡＡＨの濃度を変え、ＦＡＣＳによって標識度を検出しながら標識される滴定を実施することにより決定した。２つの代表的な抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖクローンを、図４に描写する。クローン５‐２は、約５００ｎｍのＨＡＡＨに対する親和性を提示した。クローン６‐１２は、約１５０ｎｍのＨＡＡＨに対する親和性を提示した。
【００９３】
１つの抗体クローン、クローン２７は、完全長ＨＡＡＨには結合したがＨＡＡＨの触媒ドメインには結合せず、単離された。このｓｃＦｖクローンの、ＨＡＡＨの触媒ドメインおよび完全長ＨＡＡＨへの結合のＦＡＣＳ分析を、図５に示す。
【００９４】
実施例３ 可溶性抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片による結合
触媒ドメインに結合したクローンを、可溶性形状で発現させ、結合およびその他の生物活性のために分析した。６つの特異クローンの可溶性ｓｃＦｖ断片を、ＨＡＡＨの触媒ドメイン（図６）および完全長ＨＡＡＨ（図７）への結合のために分析した。ｓｃＦｖ断片は１乃至２μＭで存在した。これらのアッセイにおいて、クローン１１が最高レベルの非特異結合を示した。
【００９５】
次に、３つの特異ｓｃＦｖクローンの、ＨＡＡＨを発現しているＨ４６０ヒト肺癌細胞への結合を評価した。ｓｃＦｖ断片を約１μＭでテストした。これらの実験の結果を、図８に描写する。クローン１１は、これらのアッセイにおいても最高レベルの結合を示した。クローン１２もＨ４６０細胞に結合した。
【００９６】
実施例４ 可溶性抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片による細胞運動の抑制
５つの可溶性ｓｃＦｖクローンおよび１つのマウスＩｇＧ、１５Ｃ７の、Ｈ４６０細胞運動の抑制をテストした（図９）。細胞を膜孔サイズ約８ミクロンのフィルターカップ内の無血清培地に入れた。フィルターカップを、血清を含む培地に入れ、細胞をインキュベートしてフィルターごしに移動させる。インキュベーション後、クリスタルバイオレットで染色し、顕微鏡および血球計算板を使用して数えてフィルターの各面の細胞数を測定した。抗体がない場合、Ｈ４６０細胞の６０％が運動性であった。抗体は、運動性アッセイにおいて、２μＭで存在した。１５Ｃ７は運動性を１００％阻害した。クローン１１ｓｃＦｖが存在した場合、細胞の約１０％のみが運動性であった。クローン１０および１３も適度な細胞運動の抑制を示した。クローン１１による細胞成長の抑制のアッセイも行った。クローン１１は２μＭでＨ４６０成長の抑制を示さなかった（データは図示せず）。
【００９７】
実施例５ 抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片の親和性成熟のための変異性ＰＣＲ
次に、ＨＡＡＨ結合ｓｃＦｖをエンコードする核酸に突然変異を起こさせ、生体外において「親和性成熟」抗体を生み出すための結合に再選択した。Ｚａｃｃｏｌｏ等（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：５８９−６０３、１９９６年）およびＺａｃｃｏｌｏ等（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３、１９９９年）に記載されているヌクレオチド類似体を使用して、ｓｃＦｖを変異性ＰＣＲにエンコードするＤＮＡを支配することにより、突然変異誘発を実施した。突然変異後初期（親和性選択前）ライブラリーは、約３ｘ１０６メンバーを有していた。突然変異後にライブラリーから単離され、完全長読み取り枠を含む選択したクローンの配列を決定した。クローン１１から派生したクローンにおけるアミノ酸配列変化の平均数は、入力配列と比較して７±８であった（合計２６６のアミノ酸中）。
【００９８】
突然変異を起こした核酸を、酵母表面提示を使用して再発現させ、上述のＦＡＣＳを使用して結合のスクリーニングを行った。結合剤をエンコードするＤＮＡを単離し、再度突然変異を起こし、再発現させ、スクリーニングその他を６回行った。６回のうち５回は、順次ＨＡＡＨの濃度を下げながら実施し、１μＭから始めて２００ｍＭで終了した。１回は、検出抗体に結合するクローンを使い果たすため、ＨＡＡＨを除外して検出抗体で実施した。この選別段階の後にこのクローン１１から派生した７つのクローンにおけるアミノ酸配列変化の平均数は、入力配列と比較して２３±１６であった。生殖細胞系にエンコードされた骨格領域における突然変異体の数は、原型クローンにおける４つの突然変異体と比較して（生殖細胞系配列と比較して）、８から３５の範囲であった。
【００９９】
ＨＡＡＨ（０．５μＭ）の触媒ドメインに結合するため、改良型クローン１１ｓｃＦｖ突然変異体の結合のアッセイを行った（図１０）。この改良型クローンのアミノ酸配列を図１１に示す。原型クローン１１と比較したアミノ酸変化を、太字活字および下線で示す。突然変異誘発の連続する回のクローン１１突然変異体のＨＡＡＨ結合を、上述のようにＦＡＣＳによってアッセイした。並行して酵母細胞におけるｓｃＦｖ発現のレベルの分析を行った。これらの実験の結果を図１２に示す。図１２に示すように、スクリーニングを４回行った後に生み出される突然変異体（第１回突然変異体）は、原型クローン１１よりも高いレベルのＨＡＡＨへの結合を提示した。１つのクローン、１１ｍ１‐２も、一様に原型クローン１１よりも高いレベルの結合を提示した。親和性成熟したその他のクローン１１突然変異体を図１３に示す。最改良型クローン（例えば、１１ｍ１‐２）の解離速度定数は、初期の、派生元である突然変異していないｓｃＦｖより２桁大きい改良である２２０±６０ｎＭと測定された。
【０１００】
クローン１１から派生した親和性成熟クローン７つのうち５つは、重鎖における位置Ｈ２２（Ｋａｂａｔの分類による）にシステインからアルギニンまたはチロシンまでの突然変異体を有していた。このシステインは、イントラドメインジスルフィド結合を形成する。この突然変異体を持つ５つのクローンのうち、３つが重鎖骨格領域３（ＦＷ３）または軽鎖ＣＤＲ３いずれかにおけるシステイン残基の発生とともにシステイン添加を有する。システインＨ２２突然変異体を有していなかった２つのクローンのうち、１つがシステイン添加を欠いていた。もう１つは、重鎖ＣＤＲ３ループにおけるチロシンとシステインの交換、システインＨ２２から離れた４つの残基を有していた。システイン突然変異体の頻出は、重鎖構造の弛緩が結合の改良を導くことを示している可能性がある。
【０１０１】
親和性成熟をクローン１３でも実施した。クローン突然変異体１３ｍ１の、ＨＡＡＨの触媒ドメインへの結合を図１４に示す。１３ｍ１は、突然変異誘発／スクリーニングを５サイクル行った後に生み出されたものである。この突然変異体のアミノ酸配列を、図１５に描写する。原型クローン１３と比較したアミノ酸変化は太字および下線で示されている。クローン１３の連続した突然変異体の結合のアッセイを、クローン１１突然変異体について説明したように行った。図１６に示すように、クローン１３ｍ１および１３ｍ１から生み出されたクローン１２ｍ２‐３は、双方とも原型クローン１３と比較して高められたレベルの結合を提示した。
【０１０２】
実施例６ 抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片の親和性成熟のための鎖シャッフリング
鎖シャッフリングは、抗体鎖全体または鎖の一部その他の鎖と再結合する突然変異誘発技術である。ＨＡＡＨに対する親和性が高められた抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片を生み出すために、実験未使用のライブラリーの重鎖を野生型抗ＨＡＡＨ軽鎖へシャッフリングすることによってライブラリーを構築した（軽鎖配列を保存し、それを異なる重鎖配列と連結させるため）。具体的には、図１７に描写するように、ヒト実験未使用ライブラリーの重鎖断片をＮｈｅｌおよびＢａｍＨＩによる制限消化により抽出し、野生型ｓｃＦｖの軽鎖を含むプラスミドを提示するＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ−消化酵母に結紮した。この過程によって生み出された初期ライブラリーは、１．２ｘ１０５のメンバーを有していた。初期ライブラリーの５つのクローンが配列決定され、すべてが初期重鎖と異なる重鎖を有していた。図１８Ａは、各クローンにおける重鎖および軽鎖を記載したチャートを含む。
【０１０３】
次に、改良型結合剤をスクリーニングするため、抗原濃度が低下している状態で（８００ｎＭから５００ｎＭのＨＡＡＨ）ＦＡＣＳスクリーニングを６回実施した。検出抗体に結合しているクローンを除去するため、追加でＨＡＡＨがない場合のスクリーニングステップを実施した。突然変異細胞のプールからの酵母細胞のｓｃＦｖ提示レベル（ｘ軸）およびＨＡＡＨ結合（ｙ軸）を、ＦＡＣＳによって分析した。図１８Ｂは、高親和性ｓｃＦｖ断片を高レベルで有するクローンがプールに存在していたことを示す。
【０１０４】
６回のスクリーニング後、２０個のクローンの配列を決定した。配列決定したクローンのうち１１個は特異であり、それぞれが野生型ｓｃＦｖと異なる重鎖を含んでいた。これらのクローンのｓｃＦｖ提示レベル（ｘ軸）およびＨＡＡＨ結合（ｙ軸）を図１９Ａ乃至１９Ｋに示す。２つの選択したクローンＬＬｍ１１およびＬＬｍ１３の解離定数は、それぞれ野生型より２桁大きい改良である２４０±７０ｎＭおよび１６０±５０ｎＭと測定された。
【０１０５】
この技術により生み出されたクローンの骨格配列は、骨格突然変異体の数が多いクローンよりも免疫原性である可能性を低くする、生殖系骨格配列からの最小変位（重鎖生殖系骨格から平均４±２の突然変異体）を有していた。これらのクローンはすべて異なる重鎖ＣＤＲ３を有しており、それらはわずかに異なる結合特異性を有する場合がある。同じ標的に対して異なる特異性を有する多数の結合剤は、容易に特定のヒト組織への最小結合のような２次的に望ましい特性のスクリーニングができる。
【０１０６】
実施例７ ＣＤＲシャッフリングを使用した抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片の親和性成熟
第３の技術、ＣＤＲシャッフリング（ドメインシャッフリングとも呼ばれる）を使用してＨＡＡＨに対して親和性を高められたｓｃＦｖクローンを生み出した。ＣＤＲシャッフリングを実施するために、酵母細胞を受容体ベクターおよび複数の線形挿入配列と同時形質転換する。受容体ベクターおよび挿入配列は、５’端および３’端の一方または両方に相同配列を有するよう設計されている。これらの部位間および利子（例えば、抗体鎖）遺伝子内の無作為な部位の相同的組み換えは、「シャッフルされた」産生物を生成する。ＣＤＲシャッフリングについては、Ｓｗｅｒｓ等（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３２（３）：ｅ３６、２００４年）でさらに詳しく記述されている。
【０１０７】
野生型クローン１１ｓｃＦｖ断片をエンコードするＤＮＡを受容体ベクターとして、またヒトｓｃＦｖライブラリーの配列を挿入配列として使用し、ＣＤＲシャッフリングを実施した（図２１）。挿入配列は、クローン１１軽鎖と同一の軽鎖を有し、３つの各ライブラリーの挿入配列は、原型クローンとして同じＶＨ族の実験未使用の重鎖遺伝子配列で置き換えられたＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ１、ＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ２、またはＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ３に対応する領域を含んでいた。ＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ１およびＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ２の交換を含むライブラリーは、生体内のＢ細胞に自然発生するレセプター編集と同様の突然変異誘発事象を引き起こした。
【０１０８】
ＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ１、ＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ２、またはＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ３が挿入されたライブラリーは、それぞれ１．１ｘ１０４、１．２ｘ１０４、および１．１ｘ１０４のメンバーを含んでいた。これらのライブラリーを、スクリーニングのためにプールした。抗原濃度をＨＡＡＨの５００ｎＭから１６０ｎＭの範囲で下げながら、ＦＡＣＳによるスクリーニングを６回実施した。検出抗体に結合するクローンを除去するため、追加でＨＡＡＨがない場合のステップを実施した。
【０１０９】
１０個のクローンを単離して配列決定すると、それらのクローンのうち４つが特異であった。ｓｃＦｖ提示レベル（ｘ軸）およびこれらのクローンのＨＡＡＨ結合（ｙ軸）を図２２Ａ乃至２２Ｄに示す。野生型クローンのＣＤＲのアミノ酸配列および４つの突然変異クローンを図２３に示す。４つの特異配列のうち、３つがＦＷ１乃至ＣＤＲ３の範囲で実験未使用のライブラリー配列との置き換えを有していた。４番目のクローンは、ＦＷ１乃至ＣＤＲ２の実験未使用のライブラリー配列との置き換えを有していた。この突然変異体の解離定数は、原型野生型クローンより１桁の大きい改良である１μＭ乃至２μＭであった。この突然変異体の骨格領域において、２つのアミノ酸位置のみが生殖系骨格領域と異なっていた。
【０１１０】
様々なクローンの解離定数を測定した。各クローンの結合と濃度の対比を図２４に示す。グラフ中で比較される各クローンのＫＤ寸法は以下のとおりである。
野生型クローン６乃至２２＞１０μＭ
クローンＬＬｍ１３： ２６±８ｎＭ
クローンＣＭ４： １７乃至５ｎＭ
クローンＣ４ｍ１８： ０．６±０．１ｎＭ
【０１１１】
実施例８ ＩｇＧ抗体として選択されたｓｃＦｖ断片の発現
単離した可変重鎖および可変軽鎖配列を重ＩｇＧ鎖および軽ＩｇＧ鎖の定常領域をエンコードする配列を含む発現ベクターに挿入し、得られたベクターに完全長ＩｇＧ抗体を発現させることにより、ｓｃＦｖ断片から完全長ＩｇＧ抗体を作成した（図２５）。つまり、選択したｓｃＦｖ断片の重鎖および軽鎖配列を、ＰＣＲで別個に増幅した。次いで、結果として生じた断片を発現ベクターｐＰＮＬ５０１の適切な位置へ結紮した（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。正しい配列が挿入されたことを確かめるため、結果として生じたベクターをクローン化し、単離し、配列決定を行った。次いでそれらのベクターを、標準的方法によってＣＯＳ‐７Ｌ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にトランスフェクションした。結果として生じたこれらのＣＯＳ‐７Ｌ細胞が発現し、培養基中にＩｇＧを分泌する。次いで培地を単離し、標準的方法により蛋白Ａ樹脂を使用してＩｇＧを精製する。
【０１１２】
完全長ＩｇＧ抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡおよびＨＡＡＨを発現している腫瘍細胞への結合により測定した。ＥＬＩＳＡによる結合特異性の測定では、ＨＡＡＨまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかをＥＬＩＳＡウェルに塗布し、異なる量のＩｇＧを各ウェル内において結合させた。ヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシターゼ共役および化学発光基質を使用して検出を実施した。ＩｇＧ６−２２、６−２３、６−２５、および６−２８に関するこの実験の結果を図２６に示す。ＨＡＡＨ発現腫瘍細胞への結合特異性の測定では、異なる量のＩｇＧ抗体を、高レベルのＨＡＡＨを発現するＨ４６０腫瘍細胞に結合させた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ‐ＦＩＴＣ共役を使用し、ＦＡＣＳによる検出で細胞に対するＩｇＧ抗体の結合を検出した。ＩｇＧ６‐２２および６‐２３に関する結果を図２７に、ＩｇＧ ＬＬｍ１１、ＬＬｍ１３、ＬＬｍ１５、およびＣＤＲｍ４に関する結果を図２８に示す。ＩｇＧ６‐２２およびＣＤＲｍ４の解離定数を測定した。異なる濃度のＩｇＧを、４℃でＨ４６０またはＦＯＣＵＳ細胞のいずれかに結合させた。ＦＯＣＵＳ細胞は、ＨＡＡＨも発現するヒト肝細胞癌株である。ＩｇＧに結合させた後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ‐フィコエリトリン共役で細胞を標識し、ＦＡＣＳにより蛍光性を検出した。６‐２２ＩｇＧに関する結合と濃度の対比を図２９に、ＣＤＲｍ４に関する結合と濃度の対比を図３０に示す。測定したＫＤ寸法は以下のとおりである。
【０１１３】
Ｈ４６０ ＦＯＣＵＳ
６−２２ ＩｇＧ １．３±０．２ｎＭ １．１±０．２ｎＭ
ＣＤＲｍ４ ＩｇＧ １．０±０．１ｎＭ ０．７０±０．１ｎＭ
【０１１４】
抗ＨＡＡＨｓｃＦｖ断片および派生したＩｇＧ抗体がＨＡＡＨ上の同様のエピトープに結合するか否かを測定するため、実験を実施した。６‐２２ＩｇＧまたは対照ＩｇＧがある状態で、ＦＬＡＧタグ付きｓｃＦｖ断片６‐２２をＨ４６０細胞に結合させた。ｓｃＦｖ６‐２２にのみ存在するＦＬＡＧタグをビオチン化マウス抗ＦＬＡＧ抗体で標識し、続いてストレプトアビジン‐フィコエリトリン共役に結合させることにより、タグ付きｓｃＦｖ６‐２２の結合を測定した。対照ＩｇＧではなくＩｇＧ６‐２２がｓｃＦｖ６‐２２の結合のために競争し、ｓｃＦｖ６‐２２のＩｇＧ形状が同様のエピトープをｓｃＦｖ６‐２２としてＨＡＡＨに結合することを示した（図３１）。
【０１１５】
ｓｃＦｖ断片およびＩｇＧ抗体が同様のＨＡＡＨエピトープに結合することをさらに実証するため、競争するＣＤＲｍ４ＩｇＧ、競争するＬＬｍＩｇＧ、またはバッファーが単独で存在する状態で、異なるｓｃＦｖ断片を提示する酵母細胞を１５ｎＭのＨＡＡＨに結合させた。ｓｃＦｖ断片を提示する細胞へのＨＡＡＨの結合を、上述のとおりＦＡＣＳによって検出した。図３２に示す結果は、ＩｇＧ抗体はＨＡＡＨへ結合するために競争することができること、さらにＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖ断片が同様のエピトープに結合することを示している。
【０１１６】
実施例９ 変異性ＰＣＲによる抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片の第２世代親和性成熟
第２世代突然変異体Ｃ４ｍ８およびＣ４ｍ１８を生成するため、ＣＤＲ４ｍ突然変異ｓｃＦｖに親和性成熟を実施した。上述のように、ヌクレオチド類似体を使用して、ＣＤＲ４ｍｓｃＦｖを変異性ＰＣＲにエンコードするＤＮＡを支配することにより、突然変異誘発を実施した。突然変異した核酸を酵母表面提示で最発現させ、上述のようにＦＡＣＳを使用して結合のスクリーニングを行った。上述のように、結合剤をエンコードするＤＮＡを単離し、再度突然変異を起こし、再発現させ、スクリーニングその他を４回行った。この過程から、改良型第２世代ｓｃＦｖクローンが単離された。
【０１１７】
上述のように、ＨＡＡＨに結合するため、酵母に提示された改良型クローンＣ４ｍ１８ｓｃＦｖ突然変異体の結合のアッセイを行った。この改良型突然変異体は、ＣＤＲｍ４上での結合および提示の両方において、約倍数に改良された（図３３）。
【０１１８】
本発明の多くの実施形態を説明してきた。しかしながら、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更が可能であることを理解されたい。従って、以下の特許請求の範囲内にはその他の実施形態も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、酵母表面提示技術を用いてスクリーニングおよび結合試験を実施するために酵母細胞上に提示された融合蛋白質を描写した概略図である。検出のために採用されうる様々なエピトープタグおよび抗原も描写されている。本明細書に記載の実験に使用される蛍光性抗原は、図のように、完全長または触媒ドメインのみに対応する組み替えＨＡＡＨ蛋白であった。
【図２】図２は、酵母細胞に発現した３つの独自のｓｃＦｖクローンを蛍光性ＨＡＡＨでインキュベートした実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。
【図３】図３は、酵母細胞に発現した８つの独自のｓｃＦｖクローンを、触媒ドメインを含む蛍光的に標識されたＨＡＡＨの断片でインキュベートした実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。
【図４】図４は、２つの抗ＨＡＡＨｓｃＦｖ抗体クローンの親和性測定を描写した一連のグラフである。
【図５】図５は、酵母細胞に発現した１つのｓｃＦｖクローンを、蛍光的に標識されたＨＡＡＨの触媒ドメインまたは共役完全長ＨＡＡＨでインキュベートした実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。前記共役完全長ＨＡＡＨ蛋白は、図のように、ＦＢ５０ＩｇＧまたは１５Ｃ７ＩｇＧを用いて検出した。
【図６】図６は、６つの独自クローンの可溶性ｓｃＦｖ断片がＨＡＡＨの触媒ドメインに結合するのを描写した棒グラフである。
【図７】図７は、６つの独自のクローンの可溶性ｓｃＦｖ断片が完全長ＨＡＡＨに結合するのを描写した棒グラフである。
【図８】図８は、３つの独自のクローンのｓｃＦｖ断片がＨ６４０腫瘍細胞に結合した実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。
【図９】図９は、５つの独自のクローンのｓｃＦＶ断片の存在、１５Ｃ７（マウスＩｇＧ）、および抗体の不在（第１の棒）における運動性Ｈ４６０腫瘍細胞のパーセンテージを描写した棒グラフである。
【図１０】図１０は、クローン１１から派生した親和性成熟したｓｃＦｖ断片がＨＡＡＨの触媒ドメインに結合した実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写したグラフである。
【図１１】図１１は、親和性成熟したクローン１１ｓｃＦｖ断片のアミノ酸配列の描写である。クローン１１に関連して変化したアミノ酸残基は、太字体および下線で示す。
【図１２】図１２は、原型クローン１１ｓｃＦｖ断片、変異体クローン１１ｓｃＦｖ断片の第１ラウンド、および変異体の第１ラウンドから派生したクローンを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図１３】図１３は、変異体クローン１１ｓｃＦｖ断片を分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図１４】図１４は、クローン１３から派生した親和性成熟したｓｃＦｖ断片がＨＡＡＨの触媒ドメインに結合したにおいて、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。
【図１５】図１５は、親和性成熟したクローン１３ｓｃＦｖ断片１３ｍｌのアミノ酸配列の描写である。クローン１３に関連して変化したアミノ酸残基は、太字体および下線で示す。
【図１６】図１６は、原型クローン１３ｓｃＦｖ断片、変異体クローン１３ｓｃＦｖ断片の第１ラウンド、および変異体クローン１３の第２ラウンドから派生したクローンを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図１７】図１７は、鎖シャッフリングのための制限酵素部位を持つＤＮＡプラスミドの概略描写である。
【図１８】図１８Ａは、野生型クローンおよび鎖シャッフリングにより前記野生型クローンから生成された５つのクローンにおけるＶＨおよびＶＬ領域を記載したチャート図である。図１８Ｂは、鎖シャッフリングにより野生型クローンから派生した変異体クローンプールを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図１９】図１９は、鎖シャッフリングにより生み出されたクローンを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである（図１９Ａ、クローンＬＬｍ１；図１９Ｂ、クローンＬＬｍ３；図１９Ｃ、クローンＬＬｍ５；図１９Ｄ、クローンＬＬｍ６；図１９Ｅ、クローンＬＬｍ７；図１９Ｆ、クローンＬＬｍ８；図１９Ｇ、クローンＬＬｍ９；図１９Ｈ、クローンＬＬｍ１１；図１９Ｉ、クローンＬＬｍｌ４；図１９Ｊ、クローンＬＬｍｌ５（３）；図１９Ｋ、クローンＬＬｍ２０（８））。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図２０】図２０は、野生型ｓｃＦｖクローンおよび鎖シャッフリングにより派生した１１のクローンのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列の描写である。
【図２１】図２１は、野生型クローン１１ｓｃＦｖをエンコードする受容体ＤＮＡプラスミドおよびＣＤＲシャッフリングのためプラスミドと再結合されるヒトライブラリー挿入配列の概略描写である。
【図２２】図２２Ａ乃至Ｄは、鎖シャッフリングにより生み出されたクローンを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである（図２２Ａ、ＣＭ１；図２２Ｂ、ＣＭ２；図２２Ｃ、ＣＭ３；図２２Ｄ、ＣＭ４）。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図２３】図２３は、野生型ｓｃＦｖクローンおよびＣＤＲシャッフリングにより派生した４つのクローンのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列の描写である。
【図２４】図２４は、選択された抗ＨＡＡＨｓｃＦｖ断片対抗ＨＡＡＨ結合活性濃度を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。
【図２５】図２５は、ｓｃＦｖ断片の完全長ＩｇＧ抗体への変換を描写した概略図である。
【図２６】図２６Ａ乃至Ｂは、野生型抗ＨＡＡＨ ＩｇＧ抗体のＨＡＡＨへの結合を、ＥＬＩＳＡにより決定されたとおりに描写したグラフである。各抗体に使用される濃度は、グラフの下に示す。
【図２７】図２７は、抗ＨＡＡＨ ＩｇＧ抗体のＨ４６０腫瘍細胞への結合を、ＦＡＣＳにより決定されたとおりに描写したグラフである。抗体の濃度は、グラフに示す。
【図２８】図２８は、選択された抗ＨＡＡＨ ＩｇＧ変異体抗体のＨ４６０腫瘍細胞への結合を、ＦＡＣＳにより決定されたとおりに描写したグラフである。使用した抗体の濃度は、グラフに示す。
【図２９】図２９Ａは、６‐２２ＩｇＧ抗体とＨ４６０細胞への結合の濃度比較を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。図２９Ｂは、６‐２２ＩｇＧ抗体とＦＯＣＵＳ細胞への結合の濃度比較を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。
【図３０】図３０Ａは、ＣＤＲｍ４ＩｇＧ抗体とＨ４６０細胞への結合の濃度比較を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。図３０Ｂは、ＣＤＲｍ４ＩｇＧ抗体とＦＯＣＵＳ細胞への結合の濃度比較を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。
【図３１】図３１は、ｓｃＦｖ６‐２２の、６‐２２ＩｇＧ抗体との競争の存在または不在においてＨ４６０細胞への結合を描写したグラフである。
【図３２】図３２Ａは、ＨＡＡＨの、ＣＤＲｍ４ＩｇＧ抗体による競争の存在または不在において異なるｓｃＦｖ断片を発現する酵母への結合を描写したグラフである。図３２Ｂは、ＨＡＡＨの、ＬＬｍ１１ＩｇＧ抗体による競争の存在または不在において異なるｓｃＦｖ断片を発現する酵母への結合を描写したグラフである。
【図３３】図３３Ａは、ＨＡＡＨの、ｓｃＦｖ ＣＤＲ４ｍおよび第２世代変異体ｓｃＦｖＣ４ｍ８を提示する酵母への結合を描写したグラフである。解離定数は、グラフに示す。図３３Ｂは、酵母上における第１および第２世代ｓｃＦｖ異性体の提示レベルを描写したグラフである。
【図３４】図３４は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形として使用されうる、またはそれに含まれうるアミノ酸配列を含む表である。
【図３５】図３５は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形として使用されうる、またはそれに含まれうるアミノ酸配列を含む表である（例えば、親和性成熟した抗ＨＡＡＨ、突然変異抗体領域）。
【図３６】図３６は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形として使用されうる、またはそれに含まれうるアミノ酸配列を含む表である（例えば、抗ＨＡＡＨｓｃＦｖ抗体）。
【図３７】図３７は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形に含まれうるアミノ酸配列（抗ＡＡＨ抗体ＣＤＲ）を含む表である。
【図３８】図３８は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形に含まれうるアミノ酸配列（親和性成熟した突然変異抗ＨＡＡＨ抗体ＣＤＲ）を含む表である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年４月１９日出願の米国出願番号６０／５６３，５１４および２００３年１１月１４日出願の米国出願番号６０／５２０，１１４の利点を請求するものである。両先行出願の内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の資金による研究に関する記述
本明細書に記載の研究は、部分的に、国立化学財団からの助成金（認可番号９８４３３４２）により資金を提供されたものである。従って、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼを認識する抗体ならびに、例えばアスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼを検出および／またはその活性を調節するための、これらの抗体の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景技術
アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）は、細胞外基質蛋白、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）受容体、ノッチ相同体およびノッチリガンド相同体を含む多数の蛋白質の上皮成長因子様ドメインにおいて、特定のアスパラギン酸塩およびアスパラギン残基のβ炭素の翻訳後ヒドロキシル化に対し触媒作用を及ぼす（Ｊｉａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１５）：７２２７‐７２３１、１９９４年；Ｊｉａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２０）：１４３２２‐１４３２７、１９９２年；Ｇｒｏｎｋｅ等、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８６（１０）：３６０９‐１３、１９８９年）。この膜貫通酵素は、プロリルおよびリシルヒドロキシラーゼのα‐ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ族の一部である。ヒトＡＡＨ（ＨＡＡＨ）の過剰発現は、肝細胞癌、胆管癌、および神経外胚葉性腫瘍を含む多くのヒト癌において検出されている（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．９８：１３１３‐１３２３、１９９６年；Ｓｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｔｓｉｇ．８２（７）：８１‐８９１、２００２年）。ＡＡＨが多くの腫瘍において過剰発現すること、および強制発現が細胞運動および生存を向上させることの発見は、ＡＡＨが生体内における悪性の形質転換を助長しうることを示している（Ｓｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８２（７）：８８１‐８９１、２００２年）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本発明は、部分的に、当方によるアスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）を結合するヒト一本鎖抗体の発見に基づく。従って、本発明は、完全な多量体抗体（Ｇクラスのヒト四量体抗体（ＩｇＧ））、および特異的にＡＡＨ蛋白を結合する断片またはその他の変異形を含む抗体を特色とする。これらの断片および変異体は、一本鎖抗ＡＡＨ抗体、多重（例えば、四重）ＡＡＨ抗体の断片または部分、および特異的にＡＡＨ蛋白を結合するその他の変異形を含む。抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片または変異形のいずれかは、例えば親和性成熟過程によって突然変異した可能性がある。
【０００６】
本発明の組成物は、抗ＡＡＨ抗体（例えば、ヒト単クローン抗体）、その断片またはその他の変異形、それらを含む薬剤組成物、およびそれらを含むキットを含む。抗体、その断片またはその他の変異形は、１つ以上のＡＡＨ生物活性（例えば、適合する基質のヒドロキシル化であり、生体内、細胞または組織培養、もしくは生体外において、自然的にまたは非自然的に発生したもの）および／またはＡＡＨに仲介される１つ以上の細胞的事象（例えば、細胞成長または増殖、もしくは細胞運動性）を抑制する可能性があるが、必ずしもこの限りではない。望ましくない細胞増殖および運動性は、ＡＡＨが過剰に活動しているか過剰発現している病態（例えば癌等）に関連して発生するため、本発明の組成物は、そのような症状を有する患者を識別、その予後を評価、および／またはそのような症状（例えば、癌またはＡＡＨ発現または活性の上昇に関連するその他の疾患）を有するか、発症するリスクが高い患者を治療するために使用することができる。
【０００７】
より具体的には、本発明は治療に適している患者（例えば、ＡＡＨが過剰に活動または過剰発現した細胞を有する患者）を識別する方法および効果的な量の抗ＡＡＨ抗体（もしくはその断片またはその他の変異形）を患者（例えば、特異的にＨＡＡＨを結合するヒト単クローン抗体またはヒト一本鎖抗体（ｓｃＦｖ））に投与することによってそのような患者を治療する治療法または予防法を特色とする。本発明の抗体を発現するのに使用できる核酸、それらの核酸を含む病毒媒介体、それらの核酸または病毒媒介体を含む細胞、抗ＡＡＨ抗体および／またはその断片またはその他の変異形を含む医薬的に許容可能な組成物を製剤する方法、抗ＡＡＨ抗体（例えば、抗ＨＡＡＨ抗体）および／またはその断片またはその他の変異形の特性を識別および／または評価する方法、ならびに抗ＡＡＨ抗体（例えば、ヒト抗ＨＡＡＨ抗体）および／またはその断片またはその他の変異形の特性を親和性成熟する方法も提供される。
【０００８】
読みやすくするため、すべての「抗体」の後にくる「および／またはその断片またはその他の変異形」という句を反復しない。抗ＡＡＨ抗体が使用できるところであれば、特異的にＡＡＨ蛋白を任意の有用な程度まで結合するその断片またはその他の変異形も使用できることを理解されたい。ＡＡＨを「ＡＡＨ蛋白」と称する場合がある。明らかに逆の意味で解釈されるべき場合を除いて、「蛋白」「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は同義的に２つ以上のアミノ残基の鎖を意味する。同様に、抗ＡＡＨ抗体をエンコードする核酸が使用できるところであれば、抗ＡＡＨ抗体の機能的断片またはその他の変異形をエンコードする核酸が使用でき、抗ＡＡＨ抗体を備える細胞が使用できるところであれば、抗ＡＡＨ抗体の機能的断片またはその他の変異形を備える細胞を使用できる、等がいえる。抗ＡＡＨ抗体の断片は、断片が特異的にＡＡＨ抗原を結合する抗ＡＡＨ抗体の一部である場合があるため、抗ＡＡＨ抗体の「抗原結合部分」とも称されてよい。断片および異性体についてはさらに以下で説明するが、それらはｓｃＦｖに加えてＦａｂ、Ｆａｂ´およびＦ（ａｂ´）２断片も含む（例えば、特異的にＨＡＡＨを結合するヒトｓｃＦｖ）ことをここで留意されたい。
【０００９】
抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の異性体は、図３４乃至３８の表中のアミノ酸配列からなる、またはそれを含むことができる。あるいは、抗ＡＡＨ抗体は、図３４乃至３８の表中のアミノ酸配列に対するある程度の同一性を提示する配列からなる、またはそれを含むことができる。例えば、前記抗体は、図３４および３５に示されるＶＨ配列の１つと少なくとも８０％同一（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％同一）の重鎖の可変領域（ＶＨ）を含むことができる。あるいは、前記抗体は、図３６に示されるｓｃＦｖの１つと少なくとも８０％同一（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％同一）のｓｃＦｖであってよい。あるいは、前記抗体もしくはその断片またはその他の変異形は、図３７および３８に示されるＣＤＲと少なくとも４０％同一（例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでよい。その他の断片および変異形については以下でさらに説明する。
【００１０】
前記抗体は、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ／Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ／Ｈｉｓ−（Ｘａａ）−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ（配列ＩＤ番号：３２０）を含む（または、それからなる）第１のＣＤＲ、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列ＩＤ番号：３２１）を含む（または、それからなる）第２のＣＤＲ、およびアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ（配列ＩＤ番号：３２２）を含む（または、それからなる）第３のＣＤＲを含む可変軽鎖（ＶＬまたはＶＬＣ）を含むことができる。特に指示がない場合、これらの配列および以下の配列において「Ｘａａ」は任意のアミノ酸残基、またはアミノ酸残基がないことを示す。あるいは、または追加で、前記抗体は、アミノ酸配列Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ／Ｇｌｙ（配列ＩＤ番号：３２３）を含む（または、それからなる）第１のＣＤＲおよびアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３２４）を含む（または、それからなる）第２のＣＤＲを含むＶＨＣを含むことができる。別の実施形態において、前記抗体は、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ／Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ／Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｔｙｒ（配列ＩＤ番号：３２５）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第１のＣＤＲ）を含むＶＬＣを含むことができる。あるいは、または追加で、前記抗体は、アミノ酸配列Ｓｅｒ／Ｇｌｙ−Ａｓｐ／Ａｓｎ−Ｓｅｒ／Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ／Ａｓｎ（配列ＩＤ番号：３２６）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第１のＣＤＲ）およびアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｉｌｅ／Ｔｈｒ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｔｒｐ／Ａｒｇ−Ｔｙｒ／Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｙ−Ｔｙｒ／Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ／Ａｌａ−Ｐｒｏ／Ｓｅｒ−Ｖａｌ／Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３２７）を含む（または、それからなる）第２のＣＤＲを含むＶＨＣを含むことができる。その他の実施形態において、前記抗体は、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３２８）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第２のＣＤＲ）を含むＶＬＣを含むことができる。あるいは、前記抗体は、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ−Ｈｉｓ／Ｔｙｒ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３２９）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第２のＣＤＲ）および、任意で、アミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列ＩＤ番号：３３０）を含む（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第３のＣＤＲ）を含むことができる。例えば、第３のＣＤＲは配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ（配列ＩＤ番号：５１）からなることができる。前記抗体は、アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ／Ｇｌｙ（配列ＩＤ番号：３３１）を含む（例えば、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列ＩＤ番号：９６））（または、それからなる）ＣＤＲ（例えば、第３のＣＤＲ）を含むＶＨＣも含むことができる。
【００１１】
本発明の抗体はいずれも、その配列にかかわらず、単クローン性（例えば、単一特異性）または多クローン性の抗体であってよく、前記抗体のいずれもヒトあるいはヒト化抗体であってよく、前記抗体のいずれも親和性成熟されてよく、前記抗体のいずれも単離（例えば、それらが生み出される動物または細胞からある程度精製）されてよい。ヒト抗体は、生殖系免疫グロブリン配列が提供する可変領域および定常領域を有する抗体を含む。そのような抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖のすべてまたは一部、および、ヒト免疫グロブリン軽鎖のすべてまたは一部を有してよい。本発明の抗体（ヒトまたは非ヒト）が自然発生的な配列を含まなくてはならないというわけではない。本発明の抗体は、ヒト免疫グロブリン核酸配列によってエンコードされていないアミノ酸残基（例えば、生体外における無作為または部位特異的な突然変異誘発により導入された突然変異体）を含んでよい。突然変異または親和性成熟した抗体については以下でさらに説明する。
【００１２】
抗体は、ＡＡＨを特定の様式で結合するものに限定されないが、前記抗体はＡＡＨの触媒ドメイン（例えば、ＨＡＡＨの触媒ドメイン）を結合してよく、触媒ドメインの立体構造を修正する、またはそうでなければその活性を低くさせるような方法でＡＡＨを結合してよい。結合したＡＡＨ抗原の活性がどの程度抑制されるかは可変である。本発明の範囲内の有用な抗体（もしくはその断片またはその他の変異形）は、ＡＡＨの活性（例えば、ＨＡＡＨの触媒活性）を、患者への投与時に臨床的に有益な程度まで、または生体外アッセイにおいて有用である程度まで抑制するものを含む。例えば、前記抗体は、ＡＡＨまたはＨＡＡＨの酵素活性を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、約９５％、９８％、または９９％）を超えて抑制することができる。抑制は、対照または基準試料、もしくは標準と比較して評価されることができる。あるいは、抗ＡＡＨ抗体は、ＡＡＨ蛋白の活性を抑制することなく、特異的にＡＡＨ蛋白を結合することができる。そのような抗体は、ＡＡＨの検出において有用であり、ＡＡＨが過剰発現している細胞を有する患者を識別するために使用することができる。識別過程は、例えば、ＡＡＨの生物活性（例えば、触媒活性）を抑制する抗ＡＡＨ抗体を患者に投与する前に行うことができる。
【００１３】
本発明の抗体は、さらにその細胞培養における腫瘍細胞成長または腫瘍細胞増殖を抑制および／または生体内における腫瘍細胞成長または転移を抑制する能力の観点において特徴付けられる、または評価されることができる。親和性も測定することができる。例えば、本発明の抗体は、約１μＭ以下のＡＡＡ蛋白（例えば、ＨＡＡＨ）に対する親和性を有することができる。本発明の抗体は、他の抗体との競争を評価されることもできる。例えば、本発明の抗体（ヒトまたはヒト化抗体）は、抗ＡＡＨマウス抗体（例えば、単クローン性抗体ＦＢ５０または単クローン性抗体１５Ｃ７）とマウス抗体により結合されたエピトープを結合するために競争してよい。ＦＢ５０および１５Ｃ７は、本発明の範囲から明白に除外される。本発明の抗体は、そのクローン１１抗体（本明細書に記載（図３４を参照））とクローン１１抗体により結合されたエピトープを結合するために競争する能力を評価されることもできる。クローン１１抗体と効果的に競争する抗体は、本発明の範囲内である。
【００１４】
前述の観点から、抗体の（１）有用な親和性（例えば、少なくとも１ｘ１０６Ｍ−１）を持つＡＡＨに結合する、または（２）非特異性抗原に対する親和性より大きい（少なくとも２倍大きい）親和性を持つＡＡＨに結合する、または（３）臨床的に望ましい結果（例えば、治療の必要がある対象（例えば、癌またはその他の望ましくない細胞増殖を有する対象）の徴候または症候における改善）を生み出すのに十分な親和性を持つＡＡＨに結合する能力を意味する「特異結合」または「特異的に結合する」という用語を使用する場合がある。
【００１５】
前記抗体は、１つ以上のＦｃドメイン（例えば、ガンマアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１）のＦｃドメイン）を含むことができる。「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってエンコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＧ１）を意味する従来の意味において使用する。本発明の抗体は、任意のアイソタイプであってよい。あるいは、または追加で、前記抗体は、標識（例えば、マーカーまたはレポーターとしての役割を果たす、もしくは付着している抗体配列の精製を促進するポリペプチド）を含むことができる。適合する標識は、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ、または酵素的に活性または蛍光性の蛋白を含む。あるいは、または追加で、前記抗体は毒素を含むことができる。
【００１６】
その他の側面において、本発明は、本発明の抗体（例えば、抗ＡＡＨｓｃＦｖ）をエンコードする配列を含む単離された核酸分子、本発明の抗体をエンコードする核酸配列を含む発現ベクター（例えば、プラスミド）、およびそれらの核酸分子または発現ベクター（酵母または哺乳類の細胞のような原核細胞または真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または腫瘍細胞（例えば、骨髄腫細胞）））のうち１種類以上を含む宿主細胞を特色とする。抗ＡＡＨｓｃＦｖは、多重結合の抗ＡＡＨ抗体（例えば、ＩｇＧ）へ容易に変換されることができる。より具体的には、本発明は、細胞表面において発現される（例えば、酵母細胞に表示される）抗体を特色とする。組み替え手段により調製された抗体（例えば、宿主細胞をトランスフェクションした組み換え発現ベクターを使用して発現される抗体、組み換え型から単離された抗体、組み合わせの抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴うその他任意の手段により調製された抗体）を意味する「組み換え型」という用語を使用することがある。組み換え抗体は、ヒト化またはＣＤＲ移植抗体、キメラ抗体、および生体外において（例えば、ファージ提示法によって）生成された抗体を含む。前記抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列から派生した定常領域を含んでよい。
【００１７】
本発明は、上記に掲載された１つ以上の組成物を含むキットおよび使用説明書（印刷物、音声、視覚等、その形状を問わず）も特色とする。例えば、本発明のキットは、抗ＡＡＨ抗体を（凍結乾燥または濃縮された形状で、または使用に適した濃度（例えば、診断分析または患者への投与の実施に適した濃度）の生理学的に許容可能な希釈液に懸濁されて）含むことができる。前記キットは、本明細書に記載のように、核酸、ベクター、および／または宿主細胞も含むことができる。任意で、本明細書のキットのいずれかは、抗ＡＡＨ抗体を投与するための道具（例えば、針、注射器、アルコール綿、および包帯）、またはそれを診断分析に使用するための道具（例えば、対照として有用な試薬）を含むことができる。
【００１８】
本発明の方法は、細胞内におけるＡＡＨ発現を評価する方法を含む。前記細胞はヒトまたは非ヒト細胞および／またはＡＡＨが過剰に活動または過剰発現している細胞であってよく、前記細胞は生体内の細胞または組織培養内に維持されたものであってよく、前記細胞は癌性（例えば、腫瘍細胞）であってよく、前記細胞はほぼすべての組織タイプ（例えば、肺、肝臓、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、胆管、脳、または乳房の細胞）から得られる。前記細胞は、無傷であってもなくてもよい（例えば、前記細胞から生成された蛋白のように、組織ホモジネートが使用できる）。前記方法は、抗ＡＡＨ抗体（本明細書に記載のもののいずれかが使用されうる）を提供するステップと、前記抗体に前記細胞により発現したＡＡＨを結合させるのに一時的に十分な条件下において、前記抗体を用いて前記細胞（もしくは組織ホモジネートまたは前記細胞から生成された蛋白）に接触するステップと、前記抗体またはその抗原接続部位を（例えば、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学、またはその他の抗体に基づいた検出方法によって）検出するステップと、を含むことができる。前記検出ステップは、ＡＡＨ発現の定性的または定量的評価を提供してよく、その結果を対照試料から得られたもの、または基準試料や標準と比較してよい。そのような方法は、特異的にＡＡＨを結合するがＡＡＨの活性には影響を及ぼさない抗体を用いて効果的に実行されうる。前記方法は、本発明のＡＡＨ抑制性抗体を用いて治療する必要がある患者を診断するための取り組みの一部として実施されてよい。
【００１９】
本発明の方法は、細胞内におけるＡＡＨ蛋白の活性を調節（例えば、抑制）する方法も含む。上述の評価方法と同様に、前記細胞はヒトまたは非ヒト細胞および／またはＡＡＨが過剰に活動または過剰発現している細胞であってよく、前記細胞は生体内の細胞または組織培養内に維持されたものであってよく、前記細胞は癌性（例えば、腫瘍細胞）であってよく、前記細胞はほぼすべての組織タイプ（例えば、肺、肝臓、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、胆管、脳、または乳房の細胞）から得られる。前記方法は、細胞を提供するステップと、前記細胞内におけるＡＡＨ活性を調節（例えば、抑制）するのに十分な条件下において、当該細胞を一時的に本明細書に記載の抗体（または断片またはその他の変異形）にさらすステップを含んでよい。細胞が生体内において抗ＡＡＨ抗体にさらされる場合、前記方法は、疾患（例えば、癌またはその他の望ましくない細胞増殖）を有する患者、またはそのような疾患を発症するリスクが高い患者（例えば、ＡＡＨが過剰に活動または過剰発現しているがまだ検出可能な腫瘍もその他の癌の徴候も有していない患者）を治療する方法として記載できる。前記方法は、本明細書に記載の抗体（もしくはその断片またはその他の変異形）を、抗体が患者の体内において癌性細胞の増殖または転移を抑制するのに十分な量と時間で、患者に投与するステップを含むことができる。治療方法は以下でさらに説明するが、抗ＡＡＨ抗体を含む組成物は局所的に（例えば、腫瘍の部位または腫瘍が外科的に除去された後に残留している組織へ）または全身的に（例えば、静脈注射によって）投与されることができることに留意されたい。患者は単一タイプの抗ＡＡＨ抗体または抗体の組み合わせを受け取り、抗体は第２の薬剤（例えば、化学療法薬、鎮痛剤、または制吐剤）と組み合わせて投与されることができる。
【００２０】
治療に関連する用語は、患者または患者から提供される細胞に対する本発明の組成物の適用または投与を意味する。前記組成物は、抗ＡＡＨ抗体、同一物をエンコードする核酸分子もしくは発現ベクター、または同一物を発現する宿主細胞であってよい（いずれも生理学的に許容可能な希釈液を配合される）。前記組成物は、生体外で対象から、好ましくは治療が必要な患者から単離された（例えば、除去された）細胞に投与されてよい。治療終了時、前記細胞は患者に戻されてよい。さらに、前記治療方法は予防法であってよい。例えば、それらの方法は癌を発症するリスクの高い患者（十分に確立したリスクの指標（例えば、ＰＳＡおよび上述のとおりＡＡＨ自体のような癌関連抗原の濃度）がある）に適用されてよい。前記治療は、前記患者を治すまたは治癒するものであってよいが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明の方法は、癌の徴候または症候もしくは患者の癌に対する素因を緩和し、軽減し、修正し、改善し、和らげ、または改良することができる。
【００２１】
抗ＡＡＨ抗体の「治療効果のある量」は、疾患（例えば癌、例えば腫瘍またはその他の新生物もしくは異形成症候群）の徴候または症候を治療するのに効果的な抗ＡＡＨ抗体の量である。抗ＡＡＨ抗体の「予防効果のある量」は、発病の発生または疾病（例えば癌）の再発を遅らせるのに、もしくはその徴候または症候の重篤性を低減するのに効果的な抗ＡＡＨ抗体の量である。
【００２２】
治療に適した患者については以下でさらに説明するが、ここで前記患者は過剰に活動するまたは過剰発現したＡＡＨに関連する任意の増殖性疾患を有する可能性があることに留意されたい。例えば、前記患者は、ＡＡＨ陽性細胞を含む肺、肝臓、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、胆管、脳、または乳房内に腫瘍を有することがある。
【００２３】
別の側面において、本発明は、ＡＡＨに特異的に結合する抗体を識別する方法を特色とする。前記方法は、例えば、（ａ）抗体（例えば、ヒト抗体であり、ｓｃＦｖであってよい）のライブラリーを提供するステップと、（ｂ）前記抗体にポリペプチドを結合させる条件下において、前記ライブラリーの一部をＡＡＨ蛋白またはその断片と接触させるステップと、（ｃ）ＡＡＨ蛋白（またはＡＡＨ断片）に結合する抗体を選択するステップと、を含むことができる。前記方法は、前記選択された抗体を親和性成熟させるステップをさらに含むことができる。成熟は、例えば、変異性ＰＣＲのような方法、抗体をエンコードする核酸が、例えばＣＤＲシャッフリングまたは鎖シャッフリング技術を使用して、ライブラリーの核酸方法による組み換えを受ける方法によって実現されうる。本発明は、ＡＡＨに特異的に結合するヒト単クローン性抗体を作成する方法も特色とする。前記方法は、ＡＡＨ蛋白に特異的に結合する抗体を認識するステップと、細胞内において前記抗体をエンコードする核酸配列を発現するステップと、前記発現した抗体を前記細胞から単離するステップと、を含むことができる。これらの方法を産生方法と称することができ、これらの方法で作成された抗ＡＡＨ抗体は本発明の範囲内である。
【００２４】
本発明の抗体は、様々な理由で好都合でありうる。例えば、完全長に満たない抗体が使用される場合、抗体断片または変異体はより容易に腫瘍へ侵入できる。ヒトまたはヒト化抗体がヒト患者に投与される場合、非ヒト蛋白により誘発される可能性と同じくらい、それらが望ましくない免疫応答を刺激する可能性は低い。ＨＡＡＨ発現はきわめて低く、非癌性組織内で検出できないため、本発明の抗体がその他の望ましくない副作用を生成する可能性も低く、ＨＡＡＨを対象とする抗体は、非癌性組織に対する特異性の低い治療よりも毒性が低くてよい。当方の知る限りにおいて、当方はＨＡＡＨに結合する最初のヒト抗体を有する。
【００２５】
本明細書で述べたすべての公告、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、参照することによりその全体が組み込まれる。本発明のその他の特色および利点は、以下の詳しい説明および特許請求の範囲より明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
詳細な説明
アスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）は、細胞外基質蛋白、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）受容体、ノッチ相同体およびノッチリガンド相同体を含む上皮成長因子のような各蛋白ドメインにおいて、特定のアスパラギン酸塩およびアスパラギン残基のβ炭素の翻訳後ヒドロキシル化に対し触媒作用を及ぼす（Ｊｉａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１５）：７２２７‐７２３１、１９９４年；Ｊｉａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２０）：１４３２２‐１４３２７、１９９２年；Ｇｒｏｎｋｅ等、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８６（１０）：３６０９‐１３、１９８９年）、高度に保存されたアルファケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼである。ヒトＡＡＨ（ＨＡＡＨ）の過剰発現は、肝細胞癌、胆管癌、および神経外胚葉性腫瘍を含む多くのヒト癌において検出されている（Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．９８：１３１３‐１３２３、１９９６年；Ｓｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｔｓｉｇ．８２（７）：８１‐８９１、２００２年）。ＡＡＨが多くの腫瘍において過剰発現すること、および強制発現が細胞運動および生存を向上させることの発見は、ＡＡＨが生体内における悪性の形質転換を助長しうることを示している（Ｓｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．８２（７）：８８１‐８９１、２００２年）。癌の診断または治療へのＨＡＡＨ使用に関する発明が記載されている（Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ、米国特許番号６，１６６，１７６；Ｒａｄｏｓｅｖｉｃｈ、米国特許番号６，７２７，０８０；Ｗａｎｄｓ等、米国特許番号６，７８３，７５８；Ｗａｎｄｓ等、米国特許番号６，７９７，６９６；Ｗａｎｄｓ等、米国特許番号６，８１２，２０６；Ｗａｎｄｓ等、米国特許番号６，８１５，４１５）。
【００２７】
本発明は、抗体およびそのＡＡＨまたはＡＡＨの一部に対する結合特異性を有する抗原結合部分に関する。特に、本発明は、特異的にＡＡＨに結合するヒト単クローン性抗体に関する。一実施形態において、抗体またはその結合部分はヒトＡＡＨ（ＨＡＡＨ）に対する特異性を有する。ＡＡＨを特徴付ける１つ以上の機能を抑制する抗体は、その機能が酵素活性（例えば、水酸化酵素活性）であっても細胞の段階で現れる機能（例えば、腫瘍細胞の促進運動）であっても、本発明の範囲内である。従って、例えば、抗ＡＡＨ抗体は、腫瘍細胞の運動性を抑制するものであってよい。あるいは、または追加で、本発明の抗体は、ＥＧＦ様ドメインを含む蛋白（例えば、細胞外基質蛋白）等の天然リガンドとのＡＡＨの相互作用を抑制（低減または阻止）してよい。ＡＡＨを対象とするヒト単クローン性抗体（例えば、特異的に結合する抗体）は、ヒドロキシル化による基質活性の変調を含む、ＡＡＨにより仲介された機能を抑制できる。好ましくは、抗体およびその抗原結合部分は、ＡＡＨを１ｘ１０６Ｍ−１より大きい親和性で結合することができる。
【００２８】
ＨＡＡＨアミノ酸配列は、ジンバンク（登録商標）のアクセッション番号Ｉ３８４２３（ＧＩ：７４３３２４５）の項目に記載されている。当業者の１人が容易にジンバンク（登録商標）またはその他の資料から配列を検索することができる。ＨＡＡＨの膜貫通ドメインは、ジンバンク（登録商標）配列のアミノ酸３４１乃至３７４の間にあるよう指定されている。分子の細胞外（または内腔）部分は、Ｃ末端に対応する。抗ＡＡＨ抗体は、完全長であってもなくても、ＡＡＨまたはその蛋白の断片と相互に作用（例えば、結合）する（例えば、抗ＨＡＡＨ抗体はＨＡＡＨに結合する）。抗体はＡＡＨのエピトープ（例えば、立体構造または直線状エピトープ）または完全長ＡＡＨ蛋白の断片と結合してよい。立体構造エピトープは、一般的に変性溶剤にさらされると失われる。
【００２９】
抗体：本発明の抗体は、様々な構成をとることができる。例えば、抗体は四量体（例えば、２本の重鎖および２本の軽鎖を有する抗体）または一本鎖抗体であってよい。従って、本発明の抗体は、１本または２本の重（Ｈ）鎖可変領域および１本または２本の軽鎖可変領域を有する蛋白を含む。ＶＨＣおよびＶＬＣ領域は、さらに、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超過変性領域に細分され、「骨格領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が組み入れられることができる。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、国立衛星研究所出版番号９１−３２４２、１９９１年、および、Ｃｈｏｔｈｉａ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、１９８７年、を参照。これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。本発明の抗体が１つ以上のＶＨＣおよび／または１つ以上のＶＬＣを含む場合、各ＶＨＣおよびＶＬＣは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなることができ、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置されることができる。
【００３０】
本発明の抗体のＶＨＣまたはＶＬＣ鎖は、重鎖または軽鎖定常領域のすべてまたは一部をさらに含むことができる。一実施形態において、抗体は２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖の四量体であり、ここで免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、例えばジスルフィド結合によって相互接続している。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインを含む。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互に作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、一般的に、免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および典型的な補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への抗体の結合を仲介する。「抗体」という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭタイプの無傷免疫グロブリン（そのサブタイプ（例えば、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）も同様）を含み、ここで免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダのタイプであってよい。
【００３１】
抗体は、「免疫グロブリン」と称されてもよい（実質的に免疫グロブリン遺伝子によりエンコードされる１つ以上のポリペプチドからなる蛋白、本発明の抗ＡＡＨ抗体は、抗ＡＡＨ免疫グロブリンと称されてもよく、１つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子によりエンコードされた配列を含んでよい）。存在が認められているヒト免疫グロブリン遺伝子は、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子とともに、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、エプシロン、およびミュー定常領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａおよび２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）の可変領域遺伝子およびＣＯＯＨ末端のカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によりエンコードされる。完全長免疫グロブリン重鎖（約５０ｋＤａおよび４４６アミノ酸）は、同様に可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）およびその他の上記定常領域の１つ、例えばガンマ（約３３０アミノ酸をエンコード）によりエンコードされる。
【００３２】
本発明の抗体または免疫グロブリンは、ヒトまたは非ヒト資源のＣＤＲ（これについては本明細書にてさらに説明する）を含んでよい。免疫グロブリンの骨格は、例えばヒトにおいて抗原性を低下させるよう修正されたマウス骨格のような、ヒト、ヒト化、または非ヒト、または、例えば共通配列のような合成骨格であってよい。
【００３３】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」または「部分」）という用語は、本明細書で使用される場合、特異的にＡＡＨ（例えば、ＨＡＡＨ）に結合する抗体の部分、例えば１つ以上の免疫グロブリン鎖が完全長でないが特異的にＡＡＨに結合する分子を意味する。抗体の「断片（または抗原結合部分）またはその他の変異形内」に包含される結合部位の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬＣ、ＶＨＣ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨＣおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一腕部のＶＬＣおよびＶＨＣドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨＣドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６、１９８９年）、および（ｖｉ）特異的に結合するのに十分な骨格、例えば可変領域の抗原結合部分を有する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。軽鎖可変領域の抗原結合部分および重鎖可変領域の抗原結合部分、例えばＦｖ断片の２つのドメイン、ＶＬＣおよびＶＨＣは、ＶＬＣおよびＶＨＣ領域が一価の分子を形成するために組み合わさっている単一蛋白鎖としてそれらを作成できるようにする合成リンカーにより、組み換え法を使用して接合されることができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として周知のものとしては、例えば、Ｂｉｒｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、１９８８年、および、Ｈｕｓｔｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３、１９８８年を参照）。そのような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるよう意図されてもよい。これらの抗体部分は、当業者に周知の従来技術を使用して得られ、これらの部分は実用のため無傷の抗体と同じ様式でスクリーニングされる。Ｆａｂ断片は、四量体抗体の分裂によって生じることができる。Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片は、ペプシンとの分裂により生成されることができる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、骨格残基がヒト生殖系配列に対応し、ＣＤＲがＶ（Ｄ）Ｊ組み換えおよび体細胞変異により生じる任意の抗体を含む。しかしながら、ヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン核酸配列においてエンコードされないアミノ酸残基（例えば、生体外における無作為または部位特異的な突然変異誘発により導入された突然変異体）も含んでよい。生体内におけるヒト可変遺伝子の体細胞変異は、骨格残基の特別変異を引き起こすことが実証されている（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５３７、２００１年、を参照）。そのような抗体は、骨格突然変異にかかわりなく、その資源を考慮して、「ヒト」と称される場合がある。マウス抗体可変ドメインが骨格残基における体細胞変異を含むこともできる（Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ８：１５９、１９９６年、を参照）。その結果、ヒトＩｇ遺伝子座を含むトランスジェニックマウスは、平均４．５の骨格突然変異を保有するにもかかわらず、一般に「完全ヒト」と称される抗体を生み出す（この研究においては１乃至８の範囲：Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９７年２月、１５（２）：１４６−５６）。そのため一般に認められた語法では、生殖系配列に基づくが例えば生体内体細胞異変によって導入された骨格突然変異過程を保有する抗体可変ドメイン遺伝子は、「ヒト」と呼ばれる。従って、本発明は、特異的にＡＡＨ（例えば、ＨＡＡＨ、それらの抗体が突然変異体（例えば、ＦＲ内の突然変異体）を含んでいる場合でも）およびその断片またはその他の変異形を結合するヒト抗体（例えば、多量体ヒト抗体のＶＬＣおよびＶＨＣを含む一本鎖抗体）を包含する。例えば、本発明のヒト抗体は、１乃至８の骨格突然変異（例えば、約２、４、６、または８の置換、追加、または削除）を有することができる。原型ヒト抗体の配列はヒト生殖系配列であることが好ましい。
【００３５】
ＨＡＡＨに対して特異的なヒト一本鎖抗体は、本明細書で記載されているように生み出される。特定の実施形態において、本発明は、ＨＡＡＨに対し特異性を有し、本明細書に記載の抗体により結合されたエピトープに結合する抗体（例えば、クローン１１によりエンコードされた抗体または親和性成熟されたクローン１１の派生物）を提供する。本明細書に記載の抗体により結合されたエピトープと重複するエピトープを結合する抗体は、ＨＡＡＨと結合するためにＥＧＦ様ドメインと競争するその能力により識別されることができる（例えば、ＨＡＡＨ形質転換体のようなＨＡＡＨを運ぶ細胞、またはＨ４６０腫瘍細胞）。抗ＡＡＨ抗体の結合部位は、ＨＡＡＨの触媒ドメイン内にあってよい。
【００３６】
抗ＡＡＨ抗体は、多クローン性または単クローン性であってよい。本明細書に記載の抗体およびその抗原結合部分は、治療用組成物および処方計画、診断用組成物および処方計画、ならびにＡＡＨ蛋白を識別または抑制できる薬剤を必要とするアッセイにおいて有用である。本発明は、治療（予防を含む）または診断（例えば、癌など特定の疾病または症状の）において使用するための、抗体またはその抗原結合部分、ならびに、本明細書に記載されるような疾病および症状の治療に使用する薬品製造のための、そのような抗体またはその抗原結合部分の使用を包含する。
【００３７】
異なる種から派生した部分を備えるキメラまたはＣＤＲ移植一本鎖抗体と同様に、一本鎖抗体、およびキメラヒト化またはＣＤＲ移植抗体も本発明によって、また「抗体」という用語によって包含される。これらの抗体の様々な部分は、従来技術により化学的に接合されるか、遺伝子操作技術を使用して連続したポリペプチドとして調製されることができる。例えば、キメラまたはヒト化鎖をエンコードする核酸は、連続するポリペプチドを生み出すために発現することができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ等、米国特許番号４，８１６，５６７；Ｃａｂｉｌｌｙ等、ヨーロッパ特許番号０，１２５，０２３Ｂ１；Ｂｏｓｓ等、米国特許番号４，８１６，３９７；Ｂｏｓｓ等、ヨーロッパ特許番号０，１２０，６９４Ｂ１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．等、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．等、ヨーロッパ特許番号０，１９４，２７６Ｂｌ；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許番号５，２２５，５３９；および、Ｗｉｎｔｅｒ、ヨーロッパ特許番号０，２３９，４００Ｂｌを参照のこと。また、ＣＤＲ移植抗体に関する、Ｎｅｗｍａｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１４５５−１４６０、１９９２年、および、Ｌａｄｎｅｒ等、米国特許番号４，９４６，７７８、ならびに、一本鎖抗体に関するＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、１９８８年、も参照のこと。
【００３８】
また、キメラ、ヒト化、ＣＤＲ移植、または一本鎖抗体の断片を含む抗体の抗原結合部分を生み出すこともでき、これは本発明の範囲内である。抗体の抗原結合部分は、それらが派生した完全長抗体の結合機能を少なくとも１つ保持する。好適な抗原結合部分は、完全長抗体に相当する抗原結合機能（例えば、ＡＡＨに対する特異性）を保持する。機能的断片は、ＡＡＨヒドロキシラーゼ活性のようなＡＡＨを特徴付ける１つ以上の機能を抑制する完全長抗体の能力を保持することができる。例えば、機能的断片はＥＧＦ様ドメインのヒドロキシル化を抑制することができる。これらのＥＧＦ様ドメインは、凝固因子、細胞外基質蛋白、低密度リポ蛋白受容体、ノッチ相同体、またはノッチリガンド相同体のような多様な蛋白において反復配列を形成する保存モチーフを含む。今述べたものを含む任意のＡＡＨ基質は、抗ＡＡＨ抗体を評価するアッセイにおいて使用できる。典型的なＡＡＨアッセイ基質は、ＥＧＦ−ＩＸ１Ｈ（Ｇｒｏｎｋｅ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８６（１０）：３６０９−１３、１９８９年）、ＥＧＦ−Ｘ１Ｈ（Ｇｒｏｎｋｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５５８−８５６５、１９９０年）、およびＥＧＦ−Ａｓｎ（Ｇｒｏｎｋｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５５８−８５６５、１９９０年；Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４００４−１４０１０、１９９１年）を含む。
【００３９】
例えば、ＡＡＨに結合できる抗体部分またはその断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を含む。そのような部分は、酵素的切断または組み換え技術により生み出されることができる。例えば、パパインまたはペプシン切断は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片をそれぞれ生成することができる。抗体は、１つ以上の終止コドンが天然終止部位の上流へ導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切断型で生み出すこともできる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をエンコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をエンコードするＤＮＡ配列を含むよう設計されることができる。
【００４０】
本発明は、遺伝子操作技術を使用して連続したポリペプチドとして調製されうるキメラ抗体を提供する（例えば、キメラ抗体の蛋白部分をエンコードするＤＮＡは連続するポリペプチド鎖を生み出すために発現できる）。本発明のキメラ抗体の一例は、ＣＤＲ（例えば、本明細書に記載されている抗体のＣＤＲのうち１つ以上）を備える１つ以上の抗体鎖を含む抗体および第２の抗体の軽鎖および／重鎖から派生した骨格領域である（例えば、ヒト由来のもの、例えば骨格変化の有無を問わずＣＤＲ移植抗体）。一実施形態において、キメラ抗体は、ＨＡＡＨに結合するためにマウス１５Ｃ７またはＦＢ５０単クローン性抗体と競争することができる。キメラ抗体の抗原結合領域は、本明細書に記載の抗体クローン（例えば、クローン１１、またはクローン１１の突然変異体、例えば、クローン１１軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにクローン１１重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を備えるキメラ抗体におけるもの等）から派生することができる。キメラまたはＣＤＲ移植一本鎖抗体は、ヒト化免疫グロブリンも含む。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ等、米国特許番号４，８１６，５６７；Ｃａｂｉｌｌｙ等、ヨーロッパ特許番号０，１２５，０２３Ｂ１；Ｑｕｅｅｎ等、ヨーロッパ特許番号０，４５１，２１６Ｂ１；Ｂｏｓｓ等、米国特許番号４，８１６，３９７；Ｂｏｓｓ等、ヨーロッパ特許番号０，１２０，６９４Ｂ１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．等、ヨーロッパ特許番号０，１９４，２７６Ｂ１；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許番号５，２２５，５３９；Ｗｉｎｔｅｒ、ヨーロッパ特許番号０，２３９，４００Ｂ１；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．等、ヨーロッパ特許出願番号０，５１９，５９６Ａｌを参照。また、一本鎖抗体については、Ｌａｄｎｅｒ等、米国特許番号４，９４６，７７８；Ｈｕｓｔｏｎ、米国特許番号５，４７６，７８６；およびＢｉｒｄ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、１９８８年）も参照のこと。
【００４１】
キメラ抗体は、望ましいキメラ鎖をエンコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を調整するため、合成および／または組み換え核酸を使用して生み出すことができる。例えば、可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列は、抗体鎖をエンコードするＤＮＡ配列を修正するためのＰＣＲ突然変異誘発法、例えばヒト化抗体を生成するために採用される方法を使用して構築される（例えば、Ｋａｎｕｎａｎ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５４０４、１９８９年；Ｓａｔｏ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：８５１−８５６、１９９３年；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（９）：２４７１−２４７６、１９９１年；およびＬｅｗｉｓとＣｒｏｗｅ、Ｇｅｎｅ１０１：２９７−３０２、１９９１年、を参照のこと）。これらの、またはその他適合する方法を使用して、変異形も容易に産出できる。一実施形態において、クローン化可変領域は突然変異することがあり、望ましい特異性で変異形をエンコードする配列が選択されることができる（例えば、ファージライブラリーから、例えばＫｒｅｂｂｅｒ等、米国特許番号５，５１４，５４８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、ＷＯ９３／０６２１３、１９９３年４月１日公告、を参照のこと））。
【００４２】
ＡＡＨ抗体を産生または単離するその他の適合する方法は、例えば、ヒト抗体の完全なレパートリーを生み出すことができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫に依存する方法を含む（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１−２５５５、１９９３年；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５−２５８、１９９３年；Ｌｏｎｂｅｒｇ等、米国特許番号５，５４５，８０６；Ｓｕｒａｎｉ等、米国特許番号５，５４５，８０７を参照のこと）。
【００４３】
特異的にＡＡＨに結合する抗体は、ライブラリーにおいて組み換え抗体を発現することおよびＡＡＨを結合するライブラリーのメンバーを選択することによって識別できる。選択された抗体のＡＡＨに対する親和性は、これらの抗体を、例えば本明細書に記載のとおり１サイクル以上のスクリーニングと併せてＰＣＲ突然変異誘発、鎖シャッフリング、またはＣＤＲシャッフリング技術を使用し親和性成熟することによってさらに高めることができる。抗ＡＡＨ抗体を生成するためにその他の方法も使用できる。例えば、抗ＡＡＨ抗体は動物に免疫性を与えることによって生み出すことができる。免疫性を求めて抗原を調製するための、および免疫動物から単クローン性抗体を生成するための様々な方法が記載されている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７、１９７５年；Ｋｏｈｌｅｒａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６年、；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ２６６：５５０−５５２、１９７７年；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ等、米国特許番号４，１７２，１２４；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．とＤ．Ｌａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻（１９９４年春、付録２７）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等、Ｅｄｓ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、第１１章、（１９９１年）を参照のこと）。概して、ハイブリドーマは、適合する不死の細胞系（例えば、骨髄腫細胞系）を抗体産生細胞と融合させることによって生み出されることができる。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節のそれらは、免疫動物から得られる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離され、限界希釈によりクローン化されることができる。望ましい特異性を持つ抗体を生み出す細胞は、適合するアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により選択できる。
【００４４】
抗体またはその抗原結合部分は、例えば、配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：３、配列ＩＤ番号：５、配列ＩＤ番号：７、配列ＩＤ番号：９、配列ＩＤ番号：１１、配列ＩＤ番号：１３、配列ＩＤ番号：１５、配列ＩＤ番号：１７、配列ＩＤ番号：１９、配列ＩＤ番号：２１、配列ＩＤ番号：２３、配列ＩＤ番号：２５、配列ＩＤ番号：２７、配列ＩＤ番号：２９、配列ＩＤ番号：１１９、配列ＩＤ番号：１２１、配列ＩＤ番号：１２３、配列ＩＤ番号：１２５、配列ＩＤ番号：１２７、配列ＩＤ番号：１２９、配列ＩＤ番号：１３１、配列ＩＤ番号：１３３、配列ＩＤ番号：１３５、配列ＩＤ番号：１３７、配列ＩＤ番号：１３９、配列ＩＤ番号：１４１、配列ＩＤ番号：１４３、配列ＩＤ番号：１４５、配列ＩＤ番号：１４７、配列ＩＤ番号：２５４、配列ＩＤ番号：２５６、配列ＩＤ番号：２５８、配列ＩＤ番号：２６０；配列ＩＤ番号：２６２、配列ＩＤ番号：２６４、配列ＩＤ番号：２６６、配列ＩＤ番号：２６８、および配列ＩＤ番号：２７０の配列のいずれか１つに対し、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域を含む。
【００４５】
抗体またはその抗原結合部分は、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：４、配列ＩＤ番号：６、配列ＩＤ番号：８、配列ＩＤ番号：１０、配列ＩＤ番号：１２、配列ＩＤ番号：１４、配列ＩＤ番号：１６、配列ＩＤ番号：１８、配列ＩＤ番号：２０、配列ＩＤ番号：２２、配列ＩＤ番号：２４、配列ＩＤ番号：２６、配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：３０、配列ＩＤ番号：１２０、配列ＩＤ番号：１２２、配列ＩＤ番号：１２４、配列ＩＤ番号：１２６、配列ＩＤ番号：１２８、配列ＩＤ番号：１３０、配列ＩＤ番号：１３２、配列ＩＤ番号：１３４、配列ＩＤ番号：１３６、配列ＩＤ番号：１３８、配列ＩＤ番号：１４０、配列ＩＤ番号：１４２、配列ＩＤ番号：１４４、配列ＩＤ番号：１４６、配列ＩＤ番号：１４８、配列ＩＤ番号：２５５、配列ＩＤ番号：２５７、配列ＩＤ番号：２５９、配列ＩＤ番号：２６１、配列ＩＤ番号：２６３、配列ＩＤ番号：２６５、配列ＩＤ番号：２６７、配列ＩＤ番号：２６９、および配列ＩＤ番号：２７１の配列のいずれか１つに対し、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域を含む。
【００４６】
抗体またはその抗原結合部分は、例えば、配列ＩＤ番号：１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：３０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１１９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１２８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１３８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：１４８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２５５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２５７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２５９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６２に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６３に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６４に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６５に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６６に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６７に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６８に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２６９に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域、または、配列ＩＤ番号：２７０に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変重鎖領域、および配列ＩＤ番号：２７１に対し少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％）同一の可変軽鎖領域を含む。
【００４７】
様々な実施形態において、抗体およびその抗原結合部分は配列ＩＤ番号４６乃至８１または２８１乃至３１３のいずれか１つに対し、少なくとも４０％（例えば、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％）同一である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００４８】
様々な実施形態において、抗体もしくはその断片またはその他変異形は、配列ＩＤ番号４６乃至５１、５４、５６、８２乃至１１７、１６４乃至２５０、または３１４乃至３１９のいずれか１つに対し、少なくとも４０％（例えば、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％）同一である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体もしくはその断片またはその他変異形は、配列ＩＤ番号：１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：３０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１１９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１２８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１２９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域配列ＩＤ番号：１３７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１３８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１３９に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４０に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４１に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４２に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４３に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４４に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４５に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４６に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：１４７に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：１４８に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５４に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２５５に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５６に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２５７に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２５８に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２５９に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６０に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６１に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域配列ＩＤ番号：２６２に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６３に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６４に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６５に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６６に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６７に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、配列ＩＤ番号：２６８に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２６９に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域、または、配列ＩＤ番号：２７０に対し少なくとも８０％同一の可変重鎖領域および配列ＩＤ番号：２７１に対し少なくとも８０％同一の可変軽鎖領域であってよく、またはそれを含んでもよい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「実質的に同一」（または「実質的に相同」）という用語は、第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が同様の活性を有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対し同一あるいは同等な（例えば、同様の側鎖、例えば保存されたアミノ酸置換を持つ）十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する。抗体の場合、第２の抗体は同じ特異性を有し、第１の抗体の親和性を少なくとも５０％有する。
【００５０】
２つの配列間の「相同性」または「同一性」の計算は、以下のように実施できる。配列を最適な比較のため１列に並べる（例えば、最適な配置のため第１および第２のアミノ酸または核酸配列の片方または両方にギャップを導入してよく、比較目的のため非相同性配列は無視してよい）。異なる実施形態において、比較目的のために１列に並べられた基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも５０％である。次いで、アミノ酸位置またはヌクレオチド位置に対応するアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が第２の配列における位置に対応するものと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドに占められる場合、分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一度は、２つの配列の最適な配置のために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れると、それらの配列に共有される同一位置の数の関数である。
【００５１】
配列の比較および２つの配列間の相同度決定は、数学アルゴリズムを使用して遂行できる。２つのアミノ酸配列間の相同度は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ延長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティを持つマトリックスを記録するＢＬＯＳＵＭ６２を使用してＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３、１９７０年、アルゴリズムを使用することにより決定される。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「低ストリジェンシー、中ストリジェンシー、高ストリジェンシー、または超高ストリジェンシー条件下においてハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を表す。ハイブリダイゼーション反応を実施するための手引きは、参照することで本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．６．３．１−６．３．６、１９８９年、に見ることができる。当該参考文献には水性および非水性の方法が記載されており、いずれも使用可能である。本明細書でいわれる特定のハイブリダイゼーション条件は、１）６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃の低ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、少なくとも５０°で２回洗浄（低ストリジェンシー条件の場合、洗浄液の温度は５５℃まで上げることができる）、２）６Ｘ ＳＳＣ中、約４５℃の中ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で１回以上洗浄、３）６Ｘ ＳＳＣ中、約４５℃の高ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１回以上洗浄、および４）超高ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件は、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、６５℃、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃で１回以上洗浄である。
【００５３】
本発明の抗体およびその抗原接続部分は、追加の保存または非必須アミノ酸置換を有してもよいと理解されている（「非必須」アミノ酸残基は、例えば抗体等の結合剤のように、実質的に生物活性を修正することなくポリペプチドの野生型配列から修正できる残基であり、一方「必須」アミノ酸残基はそのような変化を生じさせる）。
【００５４】
例えば、特定の置換は耐容されてもされなくても、Ｂｏｗｉｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６−１３１０、１９９０年、に記載のように決定されうる結合活性のような望ましい生物特性に悪影響を与えないであろう。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基の族は、当技術分野で定義されている。これらの族は、塩基側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００５５】
本明細書に記載されているように、本発明の抗体は、ＡＡＨのヒドロキシナーゼ活性を抑制および／または細胞運動等のヒドロキシナーゼ活性と関連する機能を抑制することができる。以下に説明するように、ＡＡＨ活性および／または活性に関連する機能の抑制をｋ評価するために様々な方法が使用できる。
【００５６】
結合アッセイ
本明細書で使用される場合、「哺乳類ＡＡＨ蛋白」は、自然発生的または内因性の哺乳類ＡＡＨ蛋白および哺乳類ＡＡＨ蛋白に対応する自然発生的または内因性のものと同じアミノ酸配列を有する蛋白（例えば、組み換え蛋白）を意味する。従って、本明細書で定義するように、この用語は、多様型または対立遺伝子多型、もしくは哺乳類ＡＡＨのその他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシングまたはその他の細胞過程により生み出されたもの）、および前述のものの修正型または非修正型（例えば、グリコシル化、非グリコシル化）を含む。ＡＡＨ蛋白は単離したものおよび／または組み換え蛋白（合成的に生み出された蛋白を含む）であってよい。自然発生的または内因性の哺乳類ＡＡＨは、修復されるか自然に例えば腫瘍細胞のようなＡＡＨを生み出す資源から単離されることができる。
【００５７】
ＡＡＨ蛋白の「機能的変異形」は、機能的断片、機能的変異蛋白、および／または機能的融合蛋白（例えば、突然変異誘発および／または組み換え技術により生み出されたもの）を含む。概して、ＡＡＨ蛋白の断片または部分は、成熟した哺乳類ＡＡＨに関連するアミノ酸（すなわち、１つ以上のアミノ酸）の欠損（すなわち１つ以上の欠損）を有するものを含む（Ｎ端、Ｃ端または内部欠損等）。
【００５８】
概して、ＡＡＨ蛋白の突然変異体は、１つ以上の連続する、または連続しないアミノ酸残基の追加、欠損および／または置換で異なるＡＡＨ蛋白の天然または人工の変異形を含む。そのような突然変異体は、例えば保存領域または非保存領域、細胞外、細胞質内、もしくは膜貫通領域にあってよい。
【００５９】
ＡＡＨ蛋白の「機能的断片または部分」「機能的突然変異体」および／または「機能的融合蛋白」は、ヒドロキシラーゼ活性等、本明細書に記載するようなＡＡＨ蛋白を特徴付ける少なくとも１つの機能を有する単離した、および／または組み換え蛋白もしくはポリペプチドを意味する。
【００６０】
単離された、および／または組み換え哺乳類ＡＡＨまたはその部分を備える組成物は、結合に適合する条件下で維持することができ、受容体はテストされる抗体に接触し、結合が検出または測定される。一実施形態において、受容体蛋白は、ＡＡＨを発現する細胞内またはＡＡＨまたはその部分をエンコードする核酸配列を備える構造を持つ安定してまたは一時的にトランスフェクションされる細胞内で発現されることができる。細胞は、受容体の発現に適切な条件下で維持される。細胞は結合に適合する条件下（例えば、適合する結合バッファー内）で抗体に接触し、結合は標準的な技術により検出される。結合を測定するために、結合の範囲は適合する対照に対して決定される（例えば、抗体がない場合に決定されるバックグラウンドと比較、第２の抗体（すなわち、標準）と比較、トランスフェクションされていない細胞に対する抗体の結合と比較等）。膜画分等のＡＡＨを含む細胞分画は、全細胞の代わりに使用できる。
【００６１】
一実施形態において、抗体には適合する標識（例えば、蛍光標識、同位体標識、酵素標識）で標識され、結合はその標識の検出により決定される。別の実施形態において、結合された抗体は標識された第２の抗体により検出されうる。結合の特異性は、例えば標識されていない抗体またはリガンドを競争相手として使用し、競争または変位により評価されることができる。
【００６２】
結合抑制アッセイはＡＡＨを結合しＥＧＦ様ドメインのような別の化合物の結合を抑制する抗体を識別するためにも使用できる。例えば、結合アッセイは、抗体がある場合のリガンドと比較して、ＥＧＦ様ドメインの結合の減少が検出および測定される場合において実施されうる（抗体がない場合）。ＡＡＨはＥＧＦ様ドメインおよび抗体を同時に、または交互に、いずれかの順序で含む蛋白と接触できる。抗体がある場合における蛋白の結合範囲の縮小は、抗体による結合の抑制を示す。例えば、ＥＧＦ様ドメインの結合は減少もしくは根絶する場合がある。
【００６３】
その他の適合する結合アッセイ、もしくは例えば細胞形質転換または細胞運動等のＡＡＨ活性によって事象を監視する方法のような、ＡＡＨを結合する抗体の存在を識別するその他の方法が使用可能である。
【００６４】
本発明の抗体の抑制効果は結合抑制アッセイにおいて評価されることが理解されるであろう。結合する抗体間の競争もこの方法で評価することができる。この様式で識別される抗体は、結合に続いてＡＡＨのその他の機能を抑制する役割を果たす、および／またはその治療的有用性を評価するか否かを決定するためにさらに評価されることができる。
【００６５】
抗体活性を決定するためのアッセイ
ＡＡＨは、第１鉄がある場合において、蛋白の上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン内のアスパラギン酸またはアスパラギン残基のβ炭素にヒドロキシル基を導入する。保存されたＣＸ７ＣＸ４ＣＸ１０ＣＸＣＸ８Ｃ配列を含むＥＧＦ様ドメインは、凝固因子、細胞外基質蛋白、低密度リポ蛋白受容体、ノッチ相同体、およびノッチリガンド相同体のような多くの多様な蛋白内に存在する。ＡＡＨ基質のヒドロキシル化は、ヒドロキシラーゼ活性の直接検出を含むことができる、または、例えばヒドロキシル化の生物活性を検出するアッセイを使用して間接的に測定されることができる。
【００６６】
ヒト抗ＡＡＨ抗体がＡＡＨ活性を抑制するか否かを決定するアッセイは、テスト抗体が存在する酵素反応におけるヒドロキシル化のレベルを化合物がない場合の併発反応と、または所定の対照値と比較することによって実施できる。標準的なヒドロキシラーゼアッセイが周知である。例えば、Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１３１３−１３２３、１９９６年；Ｊｉａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３２２−１４３２７、１９９２年、；Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４００４−１４０１０、１９９１年；またはＧｒｏｎｋｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５５８−８５６５、１９９０年、を参照のこと。ヒドロキシラーゼ活性は、マイクロタイタープレート中の二酸化炭素（１４ＣＯ２キャプチャーアッセイ）を使用して測定することができる（Ｚｈａｎｇ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：１３７−１４２、１９９９年）。
【００６７】
ＡＡＨ活性の変調は、特異的基質における影響を含むヒドロキシル化下流の生化学的影響および細胞過程における影響により判断できる。ＡＡＨ活性は細胞運動、増殖、生存、および細胞周期の進行を向上させる。抗体によるＡＡＨ活性の抑制は、抗体がある場合のこれらの過程いずれか１つの減少を検出することにより判断できる。
【００６８】
細胞運動の変調は、例えば運動アッセイを使用してアッセイすることができる。概して、運動アッセイは、障壁（例えば、フィルター）内でまたは介して、適合する細胞（腫瘍細胞等）の、障壁の第２の表面と対立する第１の表面から化合物の上昇レベル（例えば、成長因子またはその他のポリペプチド）への方向性または移動を監視する。膜またはフィルターは、フィルター内のまたは介する適合する細胞の、障壁の第２の表面と対立する第１の表面からから化合物の上昇レベルへ向かう方向性または移動が監視されるよう、都合のよい障壁を提供する。適合する容器内において、第１室から微多孔膜内に入るかそれを通過してテストする抗体を含み、膜により第１室から分割される第２室へ向かう細胞の移動を検出または測定することができる。特異的移動の監視に適合する膜孔サイズを有する適合する膜は、例えばニトロセルロース、ポリカーボネートを含む化合物に対応して選択される。例えば、約３乃至８ミクロンの膜孔サイズを使用することができる。
【００６９】
移動および移動の抑制を評価するために、フィルターの第２の表面に接着したフィルターを通過する細胞の数および／または第２室中に蓄積する細胞の数を、標準的技術（例えば、顕微鏡検査）を使用して判断することができる。一実施形態において、細胞は検出可能な標識（例えば、放射性同位体、蛍光標識、抗原またはエピトープ標識）で標識されており、移動は、適切な方法を用いて膜に接着する標識の存在および／または第２室の存在を判断することにより（例えば、放射活性、蛍光性、免疫学的検定を検出することにより）、抗体がある場合およびない場合において評価されうる。抗体アゴニストにより誘発される移動の範囲は、適合する対照に対して決定できる（例えば、抗体がない場合に決定されるバックグラウンドの移動と比較、第２の抗体（すなわち、標準）とにより誘発される移動の範囲と比較、抗体により誘発された拡散を入れられていない細胞の移動と比較）。抗体がある場合における化合物（例えば、ウシ血清）により誘発された移動の範囲の縮小は、阻害活性を示す。
【００７０】
一実施形態において、細胞は、無血清培地内に挿入するＢｏｙｄｅｎ室タイプの培養物の上室内に置かれる。１％乃至２％のウシ胎仔血清が添加された培地は、移動のための刺激物を提供するため、下室に置かれる。細胞は約４時間培養され、移動を生じさせる。上室および下室内の細胞数が定量化される。各室内の生存細胞は、ＡＴＰＬｉｔｅ（商標）のようなＡＴＰ監視システムを使用して定量化されることができる（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）；例えば、運動アッセイを説明するＳｅｐｅ等、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２：８８１−８９１、２００２年、を参照のこと）。
【００７１】
ＡＡＨ過剰発現は、細胞増殖および悪質形質転換に連鎖している。ＡＡＨ活性の抑制は、ヌードマウスにおける形質転換、足場依存性細胞成長、および腫瘍原性のような、悪性の表現型の細胞特性を測定することによってアッセイされることができる。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞をＡＡＨでトランスフェクションし、形質転換焦点を観測することにより形質転換にアクセスできる（ＣｏｐｅｌａｎｄとＣｏｏｐｅｒ、Ｃｅｌｌ１６（２）：３４７−５６、１９７９年）。足場依存性細胞成長は、細胞をＡＡＨでトランスフェクションし、形質転換体を単離し、０．５３％の低融点アガロースを含む培地の下層を覆う、形質転換体を０．４％の低融点アガロースを含む完全培地に懸濁させることでアッセイできる。
【００７２】
腫瘍原性を生体内においてアッセイするため、ＡＡＨ形質転換クローン（またはＡＡＨ発現腫瘍細胞）をヌードマウスに注入する。一般的なアッセイにおいては、約百万乃至１千万の細胞が同時に注入される。１週間から１ヵ月間成長させた後、マウスを犠牲死させ、腫瘍を除去して重さを量る。抗体は、ＡＡＨ形質転換体または腫瘍細胞が埋め込まれた動物への注入および埋め込まれた細胞の成長を対照注入（例えば、生理食塩水または非特異的抗体）を受けた動物の細胞の成長と比較することによりテストできる。
【００７３】
抑制活性を持つ抗体は、これらのアッセイにおける細胞成長、形質転換および腫瘍原性の効率を下げることがある。
【００７４】
診断および治療への応用
本発明の抗体は、研究、診断および治療への応用を含む様々な用途において有用である。一実施形態において、抗体は適合する標識（例えば、蛍光標識、化学発光標識、同位体標識、エピトープまたは酵素標識）で標識される。
【００７５】
ＨＡＡＨの過剰発現は、悪性形質転換に関連する。ＨＡＡＨの活性を阻害および／または抑制する抗体またはその抗原結合部分は、細胞形質転換を抑制および／または形質転換した細胞を診断するために使用できる。従って、本発明は、細胞をＡＡＨまたはＡＡＨの一部を結合させる効果的な量の抗体またはその抗原結合部分に接触させるステップを含む、ＡＡＨまたはその部分を発現する細胞のＡＡＨ活性を抑制する方法を提供する。細胞は、対象の細胞（例えば、腫瘍細胞）であってよく、抗体またはその抗原結合部分は対象の生体内に投与されてよい。抗体またはその抗原結合部分の治療的使用は、予防的使用（例えば、癌を発症するリスクの高い患者の治療のため）を含む。
【００７６】
抗ＡＡＨ抗体またはその抗原結合部分は、抗癌剤等、１つ以上のその他の治療用薬剤と組み合わせて投与してもよい。抗癌剤の限定されない例としては、例えば抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、分裂抑制剤、アルキル化剤、挿入剤、信号変改経路を妨害できる薬剤、アポトーシス（細胞死遺伝子を含む）を促進する薬剤、放射性化合物、およびその他の腫瘍関連抗原（裸抗体、免疫毒素および放射性接合体を含む）が挙げられる。抗癌剤の特定クラスの詳細な例は、例えばパクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、酒石酸ビノレルビン、タキソテール等の抗チューブリン／抗微小管；例えばトポテカン、カンプトセシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン、ピロキサントロン塩酸塩等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキサート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホラセチル−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ペントスタチン、５−アゼチジン、５−Ａｚａ２’−デオキシシチジン、ａｒａ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸等の代謝拮抗剤；例えばシスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール等のアルキル化剤；例えばジヒドロレンペロン、スピロムスチン、およびデシペプチド等の、作用のその他のメカニズムを介して作用する薬剤；例えばインターフェロンのような抗腫瘍反応を高めるための生物反応修飾物質；アクチノマイシンＤのようなアポトーシス剤；例えばタモキシフェンのような抗エストロゲン、または、例えば４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルフォニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオナニリドのような抗アンドロゲン等の抗ホルモンである。
【００７７】
本発明の抗ＡＡＨ抗体は、診断への応用においても価値を有する。抗ＡＡＨ抗体は、生体内における腫瘍の成長および／または転移を監視するために使用でき、病期の診断上の指標として使用されてもよい。ヒト抗体は、ヒトにおいては免疫原性でなく、従ってヒト抗体はマウス抗体よりも生体内における診断への応用に適切であると思われる。
【００７８】
診断目的のためには、抗体または抗原結合部分は標識されてもされなくてもよい。一般的に、診断アッセイは、抗体または部分をＡＡＨへ結合した結果生じる合成物の形成を検出することを必要とする。抗体または部分は、直接標識されてよい。放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン等）を含むがそれらに限定されない様々な標識を採用することができる。当業者には多数の適切な免疫学的検定が周知である（例えば、米国特許番号３，８１７，８２７、３，８５０，７５２、３，９０１，６５４、および４，０９８，８７６を参照のこと）。標識されていない抗体または断片は、第１の抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体または標識されていない免疫グロブリンに対して特異的なその他の抗体）と反応する標識された抗体（例えば、第２の抗体）等、抗体を検出するために使用できる別の（すなわち、１つ以上の）適合する試薬またはその他の適合する試薬（例えば、標識された蛋白Ａ）と組み合わせて使用することもできる。
【００７９】
生体試料におけるＡＡＨの存在の検出に使用するキットも調製できる。そのようなキットは、抗体または部分およびＡＡＨまたはその部分の間にある合成物の存在の検出に適合する１つ以上の補助試薬に加えて、前記受容体のＡＡＨ蛋白または部分に結合する抗体またはその抗原結合部分を含むことになる。本発明の抗体の組成物は、単独で、またはその他のエピトープに対して特異的な追加の抗体と組み合わせて、凍結乾燥形状で提供される場合がある。抗体は、標識されていてもいなくても、付属材料（例えば、トリス、リン酸塩および炭酸塩のような緩衝剤、安定剤、賦形剤、殺生剤および／または例えばウシ血清アルブミン等の不活性蛋白）とともにキットに含まれることができる。例えば、抗体は付属材料を持つ冷凍乾燥された混合物として提供されることができるか、付属材料を持つ冷凍乾燥された混合物が、使用者が組み合わせるように個別に提供されることができる。単クローン性抗体に結合できる第２の抗体が採用され、そのような抗体がキット内において、例えば別個のバイアルまたは容器中に供される。第２の抗体が存在する場合、一般的に標識されており、上述の抗体製剤を用いて類似の様式で製剤することができる。
【００８０】
同様に、本発明は、細胞またはその画分（例えば、膜画分）を含む組成物が、抗体の結合に適切な条件下においてＡＡＨまたはＡＡＨの一部（例えば、触媒ドメイン）と結合する抗体またはその機能部分と接触し、抗体結合が監視される、ＡＡＨまたは酵素の部分の発現を細胞ごとに検出および／または定量化する方法にも関する。抗体とＡＡＨまたはその部分の間にある合成物の形成を示す抗体の検出は、ＡＡＨの存在を示す。例えば細胞への抗体の結合は、上記のように「結合アッセイ」に該当する。前記方法は、個体から細胞内における（例えば、腫瘍生検標本内の）ＡＡＨの発現を検出するために使用できる。腫瘍細胞の表面におけるＡＡＨの定量的発現は、例えばフローサイトメトリーによって検討することができ、染色度は疾患の進行または危険性と相関関係を持つ場合がある。
【００８１】
ＡＡＨは細胞運動の役割を有し、そのためＡＡＨ抗体を腫瘍の成長または転移を抑制（低減または阻止）するために使用することができる。従って、本発明の抗体は、研究および治療への応用においてＡＡＨ機能を調節するためにも使用できる。例えば、本明細書に記載の抗体は、（ａ）ＡＡＨへの（例えば、蛋白のＥＧＦ様ドメインの）結合、（ｂ）ＡＡＨにより仲介される受容体シグナル伝達機能、および／または（ｃ）（例えば、ＡＡＨの基質またはＡＡＨ経路等の）刺激性機能を抑制（低減または阻止）するための抑制剤として作用することができる。受容体機能の抑制剤として採用する抗体は、ＡＡＨ結合を直接的または間接的に阻害することができる（例えば、構造変化を起こすことによって）。従って、本発明は、ＡＡＨまたはＡＡＨの部分と結合する抗体またはその抗原結合部分を効果的な量で哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類（例えば、ヒト患者）における細胞運動を抑制する方法を提供する。前記方法に従って治療できる疾患は、癌を含み、病状の改善がもたらされうる。治療可能な癌は、充実性腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移病巣を含むがそれらに限定されない。充実性腫瘍の例は、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、神経外胚葉性腫瘍その他のような悪性腫瘍を含む腺癌に加えて、例えば、肺、乳房、リンパ、胃腸管（例えば、結腸）および尿生殖路（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、肝臓、咽頭、前立腺、卵巣に影響を及ぼすような様々な臓器系の非上皮性悪性腫瘍、腺癌、上皮性悪性腫瘍等の悪性腫瘍や胆管癌を含む。上記の癌の転移病巣は、本発明の方法または組成物を使用して治療または防止することもできる。
【００８２】
対象方法は、ほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌、および食道の癌のような悪性腫瘍を含む腺癌に加えて、例えば、肺、乳房、リンパ、胃腸管（例えば、結腸）および尿生殖路（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、前立腺、卵巣、咽頭に影響を及ぼすような様々な臓器系の悪性腫瘍治療において有用である。治療可能な典型的な充実性腫瘍としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫が挙げられる。
【００８３】
本明細書に記載の抗ＡＡＨ抗体を用いた治療に適する患者は、癌または「上皮性悪性腫瘍」を有するとされてよい。「上皮性悪性腫瘍」は、呼吸器系癌、胃腸系癌、非尿生殖器系癌、精巣癌、乳房癌、前立腺癌、内分泌系癌および黒色腫を含む上皮または内分泌組織の悪性腫瘍として当業者に認識されている。典型的な上皮性悪性腫瘍としては、頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成したものが挙げられる。この用語は、例えば癌性組織および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫も含む。「腺癌」は、腺組織から派生した、または腫瘍細胞が認識できる腺状構造を形成する上皮性悪性腫瘍を意味する。「非上皮性悪性腫瘍」という用語は、当業者に認識されており、間葉系由来の悪性腫瘍を意味する。
【００８４】
本発明の方法は、例えば骨髄性、リンパまたは赤血球系、またはその前駆細胞から生じたもの等、造血由来の増殖性／腫瘍性細胞の増殖を抑制するために使用することもできる。例えば、本発明は、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含むがこれらに限定されない、様々な脊髄疾患の治療を意図している（Ｖａｉｃｋｕｓ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔｏｌ．１１：２６７−９７、１９９１年、に掲載）。対象方法により治療されうるリンパ性悪性腫瘍は、Ｂ系ＡＬＬおよびＴ系ＡＬＬを含む急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）を含むがこれらに限定されない。本発明の治療方法により意図される悪性リンパ腫の追加の形状は、非ホジキンリンパ腫およびその変異形、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）およびホジキン病を含むがこれらに限定されない。
【００８５】
投与の様態
本方法によると、１つ以上の抗体またはその抗原結合部分を、単独でまたは別の薬物と組み合わせて（前、同時、または後に）適切な経路により宿主に投与することができる。例えば、本発明の抗体は、別の単クローン性または多クローン性の抗体もしくは化学療法と組み合わせて使用することもできる。
【００８６】
効果的な量の抗体（すなわち、１つ以上の抗体または断片）を投与する。効果的な量は、ＡＡＨ機能の、また結果として腫瘍細胞の抑制に十分な量等、投与条件下において望ましい治療効果を実現するために十分な量である。
【００８７】
治療すべき疾病または症状に応じて、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、経口、食餌、局所、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、または経口吸入、鼻腔内滴下）を含むがこれらに限定されない、様々な投与経路が可能である。その他の適合する投与方法としては、充電式または生分解性のデバイスおよび除放性高分子デバイスも挙げられる。本明細書に記載の医薬組成物は、その他の薬剤との組み合わせ治療の一部として投与してもよい。
【００８８】
投与される抗体またはその一部の剤形は、選択される投与経路に応じて変わるであろう（例えば、液剤、乳剤、カプセル）。投与される抗体またはその抗原結合部分を含む適切な医薬組成物は、生理学的に許容可能な媒介体または担体に入れて調製してよい。抗体および／または部分の混合物も使用してよい。液剤または乳剤の場合、適合する担体は、例えば、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水性またはアルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含む。非口径の媒介体は、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油を含む場合がある。水、緩衝用水、緩衝生理食塩水、ポリオール類（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、ブドウ糖溶液およびグリシンを含む多種の適切な水性担体が当業者に周知されている。静脈の媒介体は、様々な添加物、保存料、もしくは流動体、栄養または電解質の補給液を含む場合がある（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０年、を参照のこと）。この組成物は、生理学的条件に近づける必要が有るため、任意で、ｐＨ調整および緩衝薬剤ならびに毒性調整薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムのような薬学的に許容可能な補助剤を含んでもよい。抗体は、分野にて周知の凍結乾燥および再構成技術に従って、保存のために凍結乾燥され、使用前に適合する担体内で再構成される場合がある。選んだ媒体内における活性成分の最適濃度は、当業者に周知の手順に従って実験的に決定してよく、望まれる最終的な製剤処方次第であろう。吸入の場合、化合物は投与のため可溶化し適合するディスペンサー（例えば、アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアゾールディスペンサー）に装填される場合がある。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例において本発明をさらに説明するが、これらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００９０】
実施例１ 抗ＨＡＡＨ抗体のライブラリースクリーニング
酵母表面提示技術（ＢｏｄｅｒとＷｉｔｔｒｕｐ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（６）：５５３−７、１９９７年）を使用し、抗ＨＡＡＨ Ｆｖ断片を得るため、実験未使用のヒト一本鎖Ｆｖライブラリーのスクリーニングを行った。このライブラリーは、Ｆｅｌｄｈａｕｓ等（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：１６３−１７０、２００３年）に記載のとおり調製を行った。つまり、ヒト抗体可変遺伝子を、５８の成体からプールした市販の脾臓およびリンパ節ポリ（Ａ）ｍＲＮＡのＰＣＲでクローン化した。ＩｇＧ、ＩｇＭ、κおよびλのプライマーを第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。別個のＶＨおよびＶＬライブラリーを構築し、次いでオーバーラップエクステンションＰＣＲによって１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フォーマット内に集めた。次いで、酵母表面上にＡｇａ２ｐ融合体として発現させるため、ｓｃＦｖライブラリーをサブクローン化した。Ａｇａ２ｐ−ｓｃＦｖ融合蛋白を概略的に図１に描写する。約１０９のｓｃＦｖ断片が酵母に発現した。
【００９１】
ＢｏｄｅｒとＷｉｔｔｒｕｐ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．１４（１）：５５−６２、１９９８年）に記載されているような細胞外ドメインを含むＨＡＡＨの組み換え型に結合するため、ライブラリーのスクリーニングを行った。つまり、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって蛍光ＨＡＡＨに結合するため、Ａｇａ２ｐ−ｓｃＦｖ融合体を発現している酵母細胞をアッセイする。選別により結合剤を選択し、再分析する。３００ｎＭのＨＡＡＨ中で結合のスクリーニングを６回行うと、１６の特異クローンが識別できる。３つの特異クローンの、ＨＡＡＨへの結合のＦＡＣＳ分析を、図２に描写する。８つの特異クローンの、ＨＡＡＨの触媒ドメインへの結合のＦＡＣＳ分析を、図３に描写する。これらのクローンのうち、８つがＨＡＡＨの触媒ドメインに結合した。
【００９２】
実施例２ 抗ＨＡＡＨ抗体の結合活性
様々なｓｃＦｖクローンのＨＡＡＨに対する親和性を、あるｓｃＦｖを提示している細胞が、標識されていないＨＡＡＨの濃度を変え、次いで標識されたＨＡＡＨの濃度を変え、ＦＡＣＳによって標識度を検出しながら標識される滴定を実施することにより決定した。２つの代表的な抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖクローンを、図４に描写する。クローン５‐２は、約５００ｎｍのＨＡＡＨに対する親和性を提示した。クローン６‐１２は、約１５０ｎｍのＨＡＡＨに対する親和性を提示した。
【００９３】
１つの抗体クローン、クローン２７は、完全長ＨＡＡＨには結合したがＨＡＡＨの触媒ドメインには結合せず、単離された。このｓｃＦｖクローンの、ＨＡＡＨの触媒ドメインおよび完全長ＨＡＡＨへの結合のＦＡＣＳ分析を、図５に示す。
【００９４】
実施例３ 可溶性抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片による結合
触媒ドメインに結合したクローンを、可溶性形状で発現させ、結合およびその他の生物活性のために分析した。６つの特異クローンの可溶性ｓｃＦｖ断片を、ＨＡＡＨの触媒ドメイン（図６）および完全長ＨＡＡＨ（図７）への結合のために分析した。ｓｃＦｖ断片は１乃至２μＭで存在した。これらのアッセイにおいて、クローン１１が最高レベルの非特異結合を示した。
【００９５】
次に、３つの特異ｓｃＦｖクローンの、ＨＡＡＨを発現しているＨ４６０ヒト肺癌細胞への結合を評価した。ｓｃＦｖ断片を約１μＭでテストした。これらの実験の結果を、図８に描写する。クローン１１は、これらのアッセイにおいても最高レベルの結合を示した。クローン１２もＨ４６０細胞に結合した。
【００９６】
実施例４ 可溶性抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片による細胞運動の抑制
５つの可溶性ｓｃＦｖクローンおよび１つのマウスＩｇＧ、１５Ｃ７の、Ｈ４６０細胞運動の抑制をテストした（図９）。細胞を膜孔サイズ約８ミクロンのフィルターカップ内の無血清培地に入れた。フィルターカップを、血清を含む培地に入れ、細胞をインキュベートしてフィルターごしに移動させる。インキュベーション後、クリスタルバイオレットで染色し、顕微鏡および血球計算板を使用して数えてフィルターの各面の細胞数を測定した。抗体がない場合、Ｈ４６０細胞の６０％が運動性であった。抗体は、運動性アッセイにおいて、２μＭで存在した。１５Ｃ７は運動性を１００％阻害した。クローン１１ｓｃＦｖが存在した場合、細胞の約１０％のみが運動性であった。クローン１０および１３も適度な細胞運動の抑制を示した。クローン１１による細胞成長の抑制のアッセイも行った。クローン１１は２μＭでＨ４６０成長の抑制を示さなかった（データは図示せず）。
【００９７】
実施例５ 抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片の親和性成熟のための変異性ＰＣＲ
次に、ＨＡＡＨ結合ｓｃＦｖをエンコードする核酸に突然変異を起こさせ、生体外において「親和性成熟」抗体を生み出すための結合に再選択した。Ｚａｃｃｏｌｏ等（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：５８９−６０３、１９９６年）およびＺａｃｃｏｌｏ等（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３、１９９９年）に記載されているヌクレオチド類似体を使用して、ｓｃＦｖを変異性ＰＣＲにエンコードするＤＮＡを支配することにより、突然変異誘発を実施した。突然変異後初期（親和性選択前）ライブラリーは、約３ｘ１０６メンバーを有していた。突然変異後にライブラリーから単離され、完全長読み取り枠を含む選択したクローンの配列を決定した。クローン１１から派生したクローンにおけるアミノ酸配列変化の平均数は、入力配列と比較して７±８であった（合計２６６のアミノ酸中）。
【００９８】
突然変異を起こした核酸を、酵母表面提示を使用して再発現させ、上述のＦＡＣＳを使用して結合のスクリーニングを行った。結合剤をエンコードするＤＮＡを単離し、再度突然変異を起こし、再発現させ、スクリーニングその他を６回行った。６回のうち５回は、順次ＨＡＡＨの濃度を下げながら実施し、１μＭから始めて２００ｍＭで終了した。１回は、検出抗体に結合するクローンを使い果たすため、ＨＡＡＨを除外して検出抗体で実施した。この選別段階の後にこのクローン１１から派生した７つのクローンにおけるアミノ酸配列変化の平均数は、入力配列と比較して２３±１６であった。生殖細胞系にエンコードされた骨格領域における突然変異体の数は、原型クローンにおける４つの突然変異体と比較して（生殖細胞系配列と比較して）、８から３５の範囲であった。
【００９９】
ＨＡＡＨ（０．５μＭ）の触媒ドメインに結合するため、改良型クローン１１ｓｃＦｖ突然変異体の結合のアッセイを行った（図１０）。この改良型クローンのアミノ酸配列を図１１に示す。原型クローン１１と比較したアミノ酸変化を、太字活字および下線で示す。突然変異誘発の連続する回のクローン１１突然変異体のＨＡＡＨ結合を、上述のようにＦＡＣＳによってアッセイした。並行して酵母細胞におけるｓｃＦｖ発現のレベルの分析を行った。これらの実験の結果を図１２に示す。図１２に示すように、スクリーニングを４回行った後に生み出される突然変異体（第１回突然変異体）は、原型クローン１１よりも高いレベルのＨＡＡＨへの結合を提示した。１つのクローン、１１ｍ１‐２も、一様に原型クローン１１よりも高いレベルの結合を提示した。親和性成熟したその他のクローン１１突然変異体を図１３に示す。最改良型クローン（例えば、１１ｍ１‐２）の解離速度定数は、初期の、派生元である突然変異していないｓｃＦｖより２桁大きい改良である２２０±６０ｎＭと測定された。
【０１００】
クローン１１から派生した親和性成熟クローン７つのうち５つは、重鎖における位置Ｈ２２（Ｋａｂａｔの分類による）にシステインからアルギニンまたはチロシンまでの突然変異体を有していた。このシステインは、イントラドメインジスルフィド結合を形成する。この突然変異体を持つ５つのクローンのうち、３つが重鎖骨格領域３（ＦＷ３）または軽鎖ＣＤＲ３いずれかにおけるシステイン残基の発生とともにシステイン添加を有する。システインＨ２２突然変異体を有していなかった２つのクローンのうち、１つがシステイン添加を欠いていた。もう１つは、重鎖ＣＤＲ３ループにおけるチロシンとシステインの交換、システインＨ２２から離れた４つの残基を有していた。システイン突然変異体の頻出は、重鎖構造の弛緩が結合の改良を導くことを示している可能性がある。
【０１０１】
親和性成熟をクローン１３でも実施した。クローン突然変異体１３ｍ１の、ＨＡＡＨの触媒ドメインへの結合を図１４に示す。１３ｍ１は、突然変異誘発／スクリーニングを５サイクル行った後に生み出されたものである。この突然変異体のアミノ酸配列を、図１５に描写する。原型クローン１３と比較したアミノ酸変化は太字および下線で示されている。クローン１３の連続した突然変異体の結合のアッセイを、クローン１１突然変異体について説明したように行った。図１６に示すように、クローン１３ｍ１および１３ｍ１から生み出されたクローン１２ｍ２‐３は、双方とも原型クローン１３と比較して高められたレベルの結合を提示した。
【０１０２】
実施例６ 抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片の親和性成熟のための鎖シャッフリング
鎖シャッフリングは、抗体鎖全体または鎖の一部その他の鎖と再結合する突然変異誘発技術である。ＨＡＡＨに対する親和性が高められた抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片を生み出すために、実験未使用のライブラリーの重鎖を野生型抗ＨＡＡＨ軽鎖へシャッフリングすることによってライブラリーを構築した（軽鎖配列を保存し、それを異なる重鎖配列と連結させるため）。具体的には、図１７に描写するように、ヒト実験未使用ライブラリーの重鎖断片をＮｈｅｌおよびＢａｍＨＩによる制限消化により抽出し、野生型ｓｃＦｖの軽鎖を含むプラスミドを提示するＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ−消化酵母に結紮した。この過程によって生み出された初期ライブラリーは、１．２ｘ１０５のメンバーを有していた。初期ライブラリーの５つのクローンが配列決定され、すべてが初期重鎖と異なる重鎖を有していた。図１８Ａは、各クローンにおける重鎖および軽鎖を記載したチャートを含む。
【０１０３】
次に、改良型結合剤をスクリーニングするため、抗原濃度が低下している状態で（８００ｎＭから５００ｎＭのＨＡＡＨ）ＦＡＣＳスクリーニングを６回実施した。検出抗体に結合しているクローンを除去するため、追加でＨＡＡＨがない場合のスクリーニングステップを実施した。突然変異細胞のプールからの酵母細胞のｓｃＦｖ提示レベル（ｘ軸）およびＨＡＡＨ結合（ｙ軸）を、ＦＡＣＳによって分析した。図１８Ｂは、高親和性ｓｃＦｖ断片を高レベルで有するクローンがプールに存在していたことを示す。
【０１０４】
６回のスクリーニング後、２０個のクローンの配列を決定した。配列決定したクローンのうち１１個は特異であり、それぞれが野生型ｓｃＦｖと異なる重鎖を含んでいた。これらのクローンのｓｃＦｖ提示レベル（ｘ軸）およびＨＡＡＨ結合（ｙ軸）を図１９Ａ乃至１９Ｋに示す。２つの選択したクローンＬＬｍ１１およびＬＬｍ１３の解離定数は、それぞれ野生型より２桁大きい改良である２４０±７０ｎＭおよび１６０±５０ｎＭと測定された。
【０１０５】
この技術により生み出されたクローンの骨格配列は、骨格突然変異体の数が多いクローンよりも免疫原性である可能性を低くする、生殖系骨格配列からの最小変位（重鎖生殖系骨格から平均４±２の突然変異体）を有していた。これらのクローンはすべて異なる重鎖ＣＤＲ３を有しており、それらはわずかに異なる結合特異性を有する場合がある。同じ標的に対して異なる特異性を有する多数の結合剤は、容易に特定のヒト組織への最小結合のような２次的に望ましい特性のスクリーニングができる。
【０１０６】
実施例７ ＣＤＲシャッフリングを使用した抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片の親和性成熟
第３の技術、ＣＤＲシャッフリング（ドメインシャッフリングとも呼ばれる）を使用してＨＡＡＨに対して親和性を高められたｓｃＦｖクローンを生み出した。ＣＤＲシャッフリングを実施するために、酵母細胞を受容体ベクターおよび複数の線形挿入配列と同時形質転換する。受容体ベクターおよび挿入配列は、５’端および３’端の一方または両方に相同配列を有するよう設計されている。これらの部位間および利子（例えば、抗体鎖）遺伝子内の無作為な部位の相同的組み換えは、「シャッフルされた」産生物を生成する。ＣＤＲシャッフリングについては、Ｓｗｅｒｓ等（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３２（３）：ｅ３６、２００４年）でさらに詳しく記述されている。
【０１０７】
野生型クローン１１ｓｃＦｖ断片をエンコードするＤＮＡを受容体ベクターとして、またヒトｓｃＦｖライブラリーの配列を挿入配列として使用し、ＣＤＲシャッフリングを実施した（図２１）。挿入配列は、クローン１１軽鎖と同一の軽鎖を有し、３つの各ライブラリーの挿入配列は、原型クローンとして同じＶＨ族の実験未使用の重鎖遺伝子配列で置き換えられたＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ１、ＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ２、またはＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ３に対応する領域を含んでいた。ＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ１およびＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ２の交換を含むライブラリーは、生体内のＢ細胞に自然発生するレセプター編集と同様の突然変異誘発事象を引き起こした。
【０１０８】
ＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ１、ＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ２、またはＨＣ ＦＷ１乃至ＣＤＲ３が挿入されたライブラリーは、それぞれ１．１ｘ１０４、１．２ｘ１０４、および１．１ｘ１０４のメンバーを含んでいた。これらのライブラリーを、スクリーニングのためにプールした。抗原濃度をＨＡＡＨの５００ｎＭから１６０ｎＭの範囲で下げながら、ＦＡＣＳによるスクリーニングを６回実施した。検出抗体に結合するクローンを除去するため、追加でＨＡＡＨがない場合のステップを実施した。
【０１０９】
１０個のクローンを単離して配列決定すると、それらのクローンのうち４つが特異であった。ｓｃＦｖ提示レベル（ｘ軸）およびこれらのクローンのＨＡＡＨ結合（ｙ軸）を図２２Ａ乃至２２Ｄに示す。野生型クローンのＣＤＲのアミノ酸配列および４つの突然変異クローンを図２３に示す。４つの特異配列のうち、３つがＦＷ１乃至ＣＤＲ３の範囲で実験未使用のライブラリー配列との置き換えを有していた。４番目のクローンは、ＦＷ１乃至ＣＤＲ２の実験未使用のライブラリー配列との置き換えを有していた。この突然変異体の解離定数は、原型野生型クローンより１桁の大きい改良である１μＭ乃至２μＭであった。この突然変異体の骨格領域において、２つのアミノ酸位置のみが生殖系骨格領域と異なっていた。
【０１１０】
様々なクローンの解離定数を測定した。各クローンの結合と濃度の対比を図２４に示す。グラフ中で比較される各クローンのＫＤ寸法は以下のとおりである。
野生型クローン６乃至２２＞１０μＭ
クローンＬＬｍ１３： ２６±８ｎＭ
クローンＣＭ４： １７乃至５ｎＭ
クローンＣ４ｍ１８： ０．６±０．１ｎＭ
【０１１１】
実施例８ ＩｇＧ抗体として選択されたｓｃＦｖ断片の発現
単離した可変重鎖および可変軽鎖配列を重ＩｇＧ鎖および軽ＩｇＧ鎖の定常領域をエンコードする配列を含む発現ベクターに挿入し、得られたベクターに完全長ＩｇＧ抗体を発現させることにより、ｓｃＦｖ断片から完全長ＩｇＧ抗体を作成した（図２５）。つまり、選択したｓｃＦｖ断片の重鎖および軽鎖配列を、ＰＣＲで別個に増幅した。次いで、結果として生じた断片を発現ベクターｐＰＮＬ５０１の適切な位置へ結紮した（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。正しい配列が挿入されたことを確かめるため、結果として生じたベクターをクローン化し、単離し、配列決定を行った。次いでそれらのベクターを、標準的方法によってＣＯＳ‐７Ｌ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にトランスフェクションした。結果として生じたこれらのＣＯＳ‐７Ｌ細胞が発現し、培養基中にＩｇＧを分泌する。次いで培地を単離し、標準的方法により蛋白Ａ樹脂を使用してＩｇＧを精製する。
【０１１２】
完全長ＩｇＧ抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡおよびＨＡＡＨを発現している腫瘍細胞への結合により測定した。ＥＬＩＳＡによる結合特異性の測定では、ＨＡＡＨまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかをＥＬＩＳＡウェルに塗布し、異なる量のＩｇＧを各ウェル内において結合させた。ヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシターゼ共役および化学発光基質を使用して検出を実施した。ＩｇＧ６−２２、６−２３、６−２５、および６−２８に関するこの実験の結果を図２６に示す。ＨＡＡＨ発現腫瘍細胞への結合特異性の測定では、異なる量のＩｇＧ抗体を、高レベルのＨＡＡＨを発現するＨ４６０腫瘍細胞に結合させた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ‐ＦＩＴＣ共役を使用し、ＦＡＣＳによる検出で細胞に対するＩｇＧ抗体の結合を検出した。ＩｇＧ６‐２２および６‐２３に関する結果を図２７に、ＩｇＧ ＬＬｍ１１、ＬＬｍ１３、ＬＬｍ１５、およびＣＤＲｍ４に関する結果を図２８に示す。ＩｇＧ６‐２２およびＣＤＲｍ４の解離定数を測定した。異なる濃度のＩｇＧを、４℃でＨ４６０またはＦＯＣＵＳ細胞のいずれかに結合させた。ＦＯＣＵＳ細胞は、ＨＡＡＨも発現するヒト肝細胞癌株である。ＩｇＧに結合させた後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ‐フィコエリトリン共役で細胞を標識し、ＦＡＣＳにより蛍光性を検出した。６‐２２ＩｇＧに関する結合と濃度の対比を図２９に、ＣＤＲｍ４に関する結合と濃度の対比を図３０に示す。測定したＫＤ寸法は以下のとおりである。
【０１１３】
Ｈ４６０ ＦＯＣＵＳ
６−２２ ＩｇＧ １．３±０．２ｎＭ １．１±０．２ｎＭ
ＣＤＲｍ４ ＩｇＧ １．０±０．１ｎＭ ０．７０±０．１ｎＭ
【０１１４】
抗ＨＡＡＨｓｃＦｖ断片および派生したＩｇＧ抗体がＨＡＡＨ上の同様のエピトープに結合するか否かを測定するため、実験を実施した。６‐２２ＩｇＧまたは対照ＩｇＧがある状態で、ＦＬＡＧタグ付きｓｃＦｖ断片６‐２２をＨ４６０細胞に結合させた。ｓｃＦｖ６‐２２にのみ存在するＦＬＡＧタグをビオチン化マウス抗ＦＬＡＧ抗体で標識し、続いてストレプトアビジン‐フィコエリトリン共役に結合させることにより、タグ付きｓｃＦｖ６‐２２の結合を測定した。対照ＩｇＧではなくＩｇＧ６‐２２がｓｃＦｖ６‐２２の結合のために競争し、ｓｃＦｖ６‐２２のＩｇＧ形状が同様のエピトープをｓｃＦｖ６‐２２としてＨＡＡＨに結合することを示した（図３１）。
【０１１５】
ｓｃＦｖ断片およびＩｇＧ抗体が同様のＨＡＡＨエピトープに結合することをさらに実証するため、競争するＣＤＲｍ４ＩｇＧ、競争するＬＬｍＩｇＧ、またはバッファーが単独で存在する状態で、異なるｓｃＦｖ断片を提示する酵母細胞を１５ｎＭのＨＡＡＨに結合させた。ｓｃＦｖ断片を提示する細胞へのＨＡＡＨの結合を、上述のとおりＦＡＣＳによって検出した。図３２に示す結果は、ＩｇＧ抗体はＨＡＡＨへ結合するために競争することができること、さらにＩｇＧ抗体およびｓｃＦｖ断片が同様のエピトープに結合することを示している。
【０１１６】
実施例９ 変異性ＰＣＲによる抗ＨＡＡＨ ｓｃＦｖ断片の第２世代親和性成熟
第２世代突然変異体Ｃ４ｍ８およびＣ４ｍ１８を生成するため、ＣＤＲ４ｍ突然変異ｓｃＦｖに親和性成熟を実施した。上述のように、ヌクレオチド類似体を使用して、ＣＤＲ４ｍｓｃＦｖを変異性ＰＣＲにエンコードするＤＮＡを支配することにより、突然変異誘発を実施した。突然変異した核酸を酵母表面提示で最発現させ、上述のようにＦＡＣＳを使用して結合のスクリーニングを行った。上述のように、結合剤をエンコードするＤＮＡを単離し、再度突然変異を起こし、再発現させ、スクリーニングその他を４回行った。この過程から、改良型第２世代ｓｃＦｖクローンが単離された。
【０１１７】
上述のように、ＨＡＡＨに結合するため、酵母に提示された改良型クローンＣ４ｍ１８ｓｃＦｖ突然変異体の結合のアッセイを行った。この改良型突然変異体は、ＣＤＲｍ４上での結合および提示の両方において、約倍数に改良された（図３３）。
【０１１８】
本発明の多くの実施形態を説明してきた。しかしながら、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更が可能であることを理解されたい。従って、以下の特許請求の範囲内にはその他の実施形態も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、酵母表面提示技術を用いてスクリーニングおよび結合試験を実施するために酵母細胞上に提示された融合蛋白質を描写した概略図である。検出のために採用されうる様々なエピトープタグおよび抗原も描写されている。本明細書に記載の実験に使用される蛍光性抗原は、図のように、完全長または触媒ドメインのみに対応する組み替えＨＡＡＨ蛋白であった。
【図２】図２は、酵母細胞に発現した３つの独自のｓｃＦｖクローンを蛍光性ＨＡＡＨでインキュベートした実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。
【図３】図３は、酵母細胞に発現した８つの独自のｓｃＦｖクローンを、触媒ドメインを含む蛍光的に標識されたＨＡＡＨの断片でインキュベートした実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。
【図４】図４は、２つの抗ＨＡＡＨｓｃＦｖ抗体クローンの親和性測定を描写した一連のグラフである。
【図５】図５は、酵母細胞に発現した１つのｓｃＦｖクローンを、蛍光的に標識されたＨＡＡＨの触媒ドメインまたは共役完全長ＨＡＡＨでインキュベートした実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。前記共役完全長ＨＡＡＨ蛋白は、図のように、ＦＢ５０ＩｇＧまたは１５Ｃ７ＩｇＧを用いて検出した。
【図６】図６は、６つの独自クローンの可溶性ｓｃＦｖ断片がＨＡＡＨの触媒ドメインに結合するのを描写した棒グラフである。
【図７】図７は、６つの独自のクローンの可溶性ｓｃＦｖ断片が完全長ＨＡＡＨに結合するのを描写した棒グラフである。
【図８】図８は、３つの独自のクローンのｓｃＦｖ断片がＨ６４０腫瘍細胞に結合した実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。
【図９】図９は、５つの独自のクローンのｓｃＦＶ断片の存在、１５Ｃ７（マウスＩｇＧ）、および抗体の不在（第１の棒）における運動性Ｈ４６０腫瘍細胞のパーセンテージを描写した棒グラフである。
【図１０】図１０は、クローン１１から派生した親和性成熟したｓｃＦｖ断片がＨＡＡＨの触媒ドメインに結合した実験において、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写したグラフである。
【図１１】図１１は、親和性成熟したクローン１１ｓｃＦｖ断片のアミノ酸配列の描写である。クローン１１に関連して変化したアミノ酸残基は、太字体および下線で示す。
【図１２】図１２は、原型クローン１１ｓｃＦｖ断片、変異体クローン１１ｓｃＦｖ断片の第１ラウンド、および変異体の第１ラウンドから派生したクローンを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図１３】図１３は、変異体クローン１１ｓｃＦｖ断片を分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図１４】図１４は、クローン１３から派生した親和性成熟したｓｃＦｖ断片がＨＡＡＨの触媒ドメインに結合したにおいて、フローサイトメトリーにより検出された蛍光性を描写した一連のグラフである。
【図１５】図１５は、親和性成熟したクローン１３ｓｃＦｖ断片１３ｍｌのアミノ酸配列の描写である。クローン１３に関連して変化したアミノ酸残基は、太字体および下線で示す。
【図１６】図１６は、原型クローン１３ｓｃＦｖ断片、変異体クローン１３ｓｃＦｖ断片の第１ラウンド、および変異体クローン１３の第２ラウンドから派生したクローンを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図１７】図１７は、鎖シャッフリングのための制限酵素部位を持つＤＮＡプラスミドの概略描写である。
【図１８】図１８Ａは、野生型クローンおよび鎖シャッフリングにより前記野生型クローンから生成された５つのクローンにおけるＶＨおよびＶＬ領域を記載したチャート図である。図１８Ｂは、鎖シャッフリングにより野生型クローンから派生した変異体クローンプールを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図１９】図１９は、鎖シャッフリングにより生み出されたクローンを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである（図１９Ａ、クローンＬＬｍ１；図１９Ｂ、クローンＬＬｍ３；図１９Ｃ、クローンＬＬｍ５；図１９Ｄ、クローンＬＬｍ６；図１９Ｅ、クローンＬＬｍ７；図１９Ｆ、クローンＬＬｍ８；図１９Ｇ、クローンＬＬｍ９；図１９Ｈ、クローンＬＬｍ１１；図１９Ｉ、クローンＬＬｍｌ４；図１９Ｊ、クローンＬＬｍｌ５（３）；図１９Ｋ、クローンＬＬｍ２０（８））。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図２０】図２０は、野生型ｓｃＦｖクローンおよび鎖シャッフリングにより派生した１１のクローンのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列の描写である。
【図２１】図２１は、野生型クローン１１ｓｃＦｖをエンコードする受容体ＤＮＡプラスミドおよびＣＤＲシャッフリングのためプラスミドと再結合されるヒトライブラリー挿入配列の概略描写である。
【図２２】図２２Ａ乃至Ｄは、鎖シャッフリングにより生み出されたクローンを分析した実験において、フローサイトメトリーにより検出された２タイプの蛍光性を描写した一連のドットプロットグラフである（図２２Ａ、ＣＭ１；図２２Ｂ、ＣＭ２；図２２Ｃ、ＣＭ３；図２２Ｄ、ＣＭ４）。ｘ軸に描写された蛍光性強度は、酵母細胞に提示されたｓｃＦｖ断片のレベルに対応している。ｙ軸の蛍光性強度は、前記細胞のＨＡＡＨに結合するレベルに対応している。
【図２３】図２３は、野生型ｓｃＦｖクローンおよびＣＤＲシャッフリングにより派生した４つのクローンのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列の描写である。
【図２４】図２４は、選択された抗ＨＡＡＨｓｃＦｖ断片対抗ＨＡＡＨ結合活性濃度を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。
【図２５】図２５は、ｓｃＦｖ断片の完全長ＩｇＧ抗体への変換を描写した概略図である。
【図２６】図２６Ａ乃至Ｂは、野生型抗ＨＡＡＨ ＩｇＧ抗体のＨＡＡＨへの結合を、ＥＬＩＳＡにより決定されたとおりに描写したグラフである。各抗体に使用される濃度は、グラフの下に示す。
【図２７】図２７は、抗ＨＡＡＨ ＩｇＧ抗体のＨ４６０腫瘍細胞への結合を、ＦＡＣＳにより決定されたとおりに描写したグラフである。抗体の濃度は、グラフに示す。
【図２８】図２８は、選択された抗ＨＡＡＨ ＩｇＧ変異体抗体のＨ４６０腫瘍細胞への結合を、ＦＡＣＳにより決定されたとおりに描写したグラフである。使用した抗体の濃度は、グラフに示す。
【図２９】図２９Ａは、６‐２２ＩｇＧ抗体とＨ４６０細胞への結合の濃度比較を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。図２９Ｂは、６‐２２ＩｇＧ抗体とＦＯＣＵＳ細胞への結合の濃度比較を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。
【図３０】図３０Ａは、ＣＤＲｍ４ＩｇＧ抗体とＨ４６０細胞への結合の濃度比較を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。図３０Ｂは、ＣＤＲｍ４ＩｇＧ抗体とＦＯＣＵＳ細胞への結合の濃度比較を（蛍光性により測定されたとおり）描写したグラフである。
【図３１】図３１は、ｓｃＦｖ６‐２２の、６‐２２ＩｇＧ抗体との競争の存在または不在においてＨ４６０細胞への結合を描写したグラフである。
【図３２】図３２Ａは、ＨＡＡＨの、ＣＤＲｍ４ＩｇＧ抗体による競争の存在または不在において異なるｓｃＦｖ断片を発現する酵母への結合を描写したグラフである。図３２Ｂは、ＨＡＡＨの、ＬＬｍ１１ＩｇＧ抗体による競争の存在または不在において異なるｓｃＦｖ断片を発現する酵母への結合を描写したグラフである。
【図３３】図３３Ａは、ＨＡＡＨの、ｓｃＦｖ ＣＤＲ４ｍおよび第２世代変異体ｓｃＦｖＣ４ｍ８を提示する酵母への結合を描写したグラフである。解離定数は、グラフに示す。図３３Ｂは、酵母上における第１および第２世代ｓｃＦｖ異性体の提示レベルを描写したグラフである。
【図３４】図３４は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形として使用されうる、またはそれに含まれうるアミノ酸配列を含む表である。
【図３５】図３５は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形として使用されうる、またはそれに含まれうるアミノ酸配列を含む表である（例えば、親和性成熟した抗ＨＡＡＨ、突然変異抗体領域）。
【図３６】図３６は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形として使用されうる、またはそれに含まれうるアミノ酸配列を含む表である（例えば、抗ＨＡＡＨｓｃＦｖ抗体）。
【図３７】図３７は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形に含まれうるアミノ酸配列（抗ＡＡＨ抗体ＣＤＲ）を含む表である。
【図３８】図３８は、抗ＡＡＨ抗体もしくはその断片またはその他の変異形に含まれうるアミノ酸配列（親和性成熟した突然変異抗ＨＡＡＨ抗体ＣＤＲ）を含む表である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたヒト抗体もしくはその断片またはその他の変異形を含む組成物であって、前記抗体、前記断片または前記その他の変異形がアスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）に特異的に結合する、組成物。
【請求項２】
前記その他の変異形が一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、前記ＨＡＡＨの触媒ドメインに特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、患者への投与時に、ＨＡＡＨの酵素活性を臨床的に有益な程度まで抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、ＨＡＡＨが過剰に活動または過剰発現している増殖中の細胞に接触するように置かれた際、前記細胞の増殖を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、ＨＡＡＨが過剰に活動または過剰発現している運動性細胞に接触するよう置かれた際、前記細胞の運動性を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、ＨＡＡＨに対して約１μＭ以下の親和性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が突然変異している、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、もしくはＣＤＲまたはドメインシャッフリングによって突然変異している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、配列ＩＤ番号３１乃至４５、１４９乃至１６３、または２７２乃至２８０の範囲にあるＣＤＲのいずれか１つに対し、少なくとも４０％同一である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、図３７または図３８に示されるＣＤＲのいずれか１つに対し、少なくとも４０％同一であるＣＤＲを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、クローン１１により結合されるエピトープに結合するため、クローン１１と効果的に競争する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、アミノ酸配列：Ｓ−Ｑ−Ｓ／Ｎ−Ｖ−Ｓ−Ｓ／Ｈ−（Ｘ）−Ｙ／Ｈ−Ｌ−Ａ；Ｄ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｘ−Ａ−Ａ；Ｑ−Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｎ−Ｗ−Ｐ−Ｑ；Ｙ／Ｈ−Ａ−Ｍ−Ｈ／Ｇ；Ｙ−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ／Ｓ；Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｎ−Ｉ−Ｇ／Ｅ−Ｓ−Ｎ−Ｈ／Ｙ−Ｖ−Ｈ／Ｙ；Ｓ／Ｇ−Ｄ／Ｎ−Ｓ／Ｇ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｓ／Ｎ；Ｒ−Ｉ／Ｔ−Ｙ／Ｈ−Ｙ／Ｈ−Ｇ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｗ／Ｒ−Ｙ／Ｒ−Ｎ−Ｄ／Ｇ−Ｙ／Ｈ−Ａ−Ｖ／Ａ−Ｐ／Ｓ−Ｖ／Ａ−Ｋ−Ｓ；Ｄ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｐ−Ｓ；Ｌ−Ｆ／Ｌ−Ｉ／Ｖ−Ｈ／Ｙ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｎ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｓ；Ａ−Ｗ−Ｄ−Ｄ−Ｓ；またはＳ−Ｓ−Ｓ−Ｗ−Ｖ−Ｖ−Ｘ−Ｆ−Ｄ／Ｇを含むＣＤＲを含み、
ここでＸは任意のアミノ酸残基である、またはアミノ酸残基がないことを示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ｓｃＦｖが、配列ＩＤ番号３１乃至４５、１４９乃至１６３、または２７２乃至２８０のいずれか１つに対し、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容可能な希釈液をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、標識または毒素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が前記抗体もしくはその断片またはその他の変異形からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
ヒト抗体もしくはその断片または変異形をエンコードする配列を含み、前記抗体、前記断片、または前記その他の変異形がＡＡＨに特異的に結合する、単離した核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記哺乳類細胞が腫瘍細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１の組成物と使用説明書とを含む、診断的または治療的使用のためのキット。
【請求項２５】
細胞におけるＡＡＨ活性を調節する方法であって、
前記細胞内におけるＡＡＨ活性を調節するのに十分な条件下において、前記細胞を、請求項１の組成物にさらすステップを含む、前記方法。
【請求項２６】
過剰に活動するまたは過剰発現したＨＡＡＨに関連する癌を有する患者を治療する方法であって、前記患者の体内において癌性細胞の増殖または転移を抑制するのに十分な量と時間で、請求項１の組成物を前記患者に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記組成物が全身的に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌性細胞が、肺、肝臓、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、胆管、脳、または乳房の腫瘍細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＡＨに特異的に結合する抗体もしくはその断片またはその他の変異形を識別するための方法であって、
抗体もしくはその断片またはその他の変異形のメンバーであるライブラリーを提供するステップと、
前記抗体または前記その断片またはその他の変異形をポリペプチドに結合させる条件下において、前記ライブラリーのメンバーをＡＡＨまたはそのドメインを含むポリペプチドと接触させ、それによって合成物を形成するステップと、
いずれかが前記ＡＡＨと結合する抗体もしくはその断片またはその他の変位形を含む合成物を識別するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項３０】
前記抗体または前記その断片またはその他の変異形がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記その他の変異形がｓｃＦｖである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ライブラリーが酵母細胞の表面に発現している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
識別した抗体を親和性成熟するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３０の方法によって作成される、抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３５】
ＡＡＨに特異的に結合するヒト単クローン性抗体もしくはその断片またはその他の変異形を作成する方法であって、
前記ＡＡＨに特異的に結合する抗体もしくはその断片またはその他の変異形を認識するステップと、
発現した抗体または発現したその断片またはその他の変異形を生成するため、細胞内において前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形をエンコードする核酸配列を発現するステップと、
前記発現した抗体または前記発現したその断片またはその他の変異形を精製するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項１】
単離されたヒト抗体もしくはその断片またはその他の変異形を含む組成物であって、前記抗体、前記断片または前記その他の変異形がアスパルチル（アスパラギニル）β‐ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）に特異的に結合する、組成物。
【請求項２】
前記その他の変異形が一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、前記ＨＡＡＨの触媒ドメインに特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、患者への投与時に、ＨＡＡＨの酵素活性を臨床的に有益な程度まで抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、ＨＡＡＨが過剰に活動または過剰発現している増殖中の細胞に接触するように置かれた際、前記細胞の増殖を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、ＨＡＡＨが過剰に活動または過剰発現している運動性細胞に接触するよう置かれた際、前記細胞の運動性を抑制する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、ＨＡＡＨに対して約１μＭ以下の親和性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が突然変異している、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、もしくはＣＤＲまたはドメインシャッフリングによって突然変異している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、配列ＩＤ番号３１乃至４５、１４９乃至１６３、または２７２乃至２８０の範囲にあるＣＤＲのいずれか１つに対し、少なくとも４０％同一である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、図３７または図３８に示されるＣＤＲのいずれか１つに対し、少なくとも４０％同一であるＣＤＲを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、クローン１１により結合されるエピトープに結合するため、クローン１１と効果的に競争する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、アミノ酸配列：Ｓ−Ｑ−Ｓ／Ｎ−Ｖ−Ｓ−Ｓ／Ｈ−（Ｘ）−Ｙ／Ｈ−Ｌ−Ａ；Ｄ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｘ−Ａ−Ａ；Ｑ−Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｎ−Ｗ−Ｐ−Ｑ；Ｙ／Ｈ−Ａ−Ｍ−Ｈ／Ｇ；Ｙ−Ａ−Ｘ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ／Ｓ；Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｎ−Ｉ−Ｇ／Ｅ−Ｓ−Ｎ−Ｈ／Ｙ−Ｖ−Ｈ／Ｙ；Ｓ／Ｇ−Ｄ／Ｎ−Ｓ／Ｇ−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｓ／Ｎ；Ｒ−Ｉ／Ｔ−Ｙ／Ｈ−Ｙ／Ｈ−Ｇ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｗ／Ｒ−Ｙ／Ｒ−Ｎ−Ｄ／Ｇ−Ｙ／Ｈ−Ａ−Ｖ／Ａ−Ｐ／Ｓ−Ｖ／Ａ−Ｋ−Ｓ；Ｄ−Ｖ−Ｘ−Ｘ−Ｒ−Ｐ−Ｓ；Ｌ−Ｆ／Ｌ−Ｉ／Ｖ−Ｈ／Ｙ−Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｎ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｓ；Ａ−Ｗ−Ｄ−Ｄ−Ｓ；またはＳ−Ｓ−Ｓ−Ｗ−Ｖ−Ｖ−Ｘ−Ｆ−Ｄ／Ｇを含むＣＤＲを含み、
ここでＸは任意のアミノ酸残基である、またはアミノ酸残基がないことを示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ｓｃＦｖが、配列ＩＤ番号３１乃至４５、１４９乃至１６３、または２７２乃至２８０のいずれか１つに対し、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容可能な希釈液をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形が、標識または毒素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が前記抗体もしくはその断片またはその他の変異形からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
ヒト抗体もしくはその断片または変異形をエンコードする配列を含み、前記抗体、前記断片、または前記その他の変異形がＡＡＨに特異的に結合する、単離した核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主細胞が哺乳類細胞である、請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記哺乳類細胞が腫瘍細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１の組成物と使用説明書とを含む、診断的または治療的使用のためのキット。
【請求項２５】
細胞におけるＡＡＨ活性を調節する方法であって、
前記細胞内におけるＡＡＨ活性を調節するのに十分な条件下において、前記細胞を、請求項１の組成物にさらすステップを含む、前記方法。
【請求項２６】
過剰に活動するまたは過剰発現したＨＡＡＨに関連する癌を有する患者を治療する方法であって、前記患者の体内において癌性細胞の増殖または転移を抑制するのに十分な量と時間で、請求項１の組成物を前記患者に投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記組成物が全身的に投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌性細胞が、肺、肝臓、結腸、膵臓、前立腺、卵巣、胆管、脳、または乳房の腫瘍細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＡＨに特異的に結合する抗体もしくはその断片またはその他の変異形を識別するための方法であって、
抗体もしくはその断片またはその他の変異形のメンバーであるライブラリーを提供するステップと、
前記抗体または前記その断片またはその他の変異形をポリペプチドに結合させる条件下において、前記ライブラリーのメンバーをＡＡＨまたはそのドメインを含むポリペプチドと接触させ、それによって合成物を形成するステップと、
いずれかが前記ＡＡＨと結合する抗体もしくはその断片またはその他の変位形を含む合成物を識別するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項３０】
前記抗体または前記その断片またはその他の変異形がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記その他の変異形がｓｃＦｖである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ライブラリーが酵母細胞の表面に発現している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
識別した抗体を親和性成熟するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
請求項３０の方法によって作成される、抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３５】
ＡＡＨに特異的に結合するヒト単クローン性抗体もしくはその断片またはその他の変異形を作成する方法であって、
前記ＡＡＨに特異的に結合する抗体もしくはその断片またはその他の変異形を認識するステップと、
発現した抗体または発現したその断片またはその他の変異形を生成するため、細胞内において前記抗体もしくは前記その断片またはその他の変異形をエンコードする核酸配列を発現するステップと、
前記発現した抗体または前記発現したその断片またはその他の変異形を精製するステップと、
を含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４−１】
【図３４−２】
【図３５−１】
【図３５−２】
【図３５−３】
【図３５−４】
【図３６−１】
【図３６−２】
【図３６−３】
【図３６−４】
【図３６−５】
【図３７−１】
【図３７−２】
【図３７−３】
【図３８−１】
【図３８−２】
【図３８−３】
【図３８−４】
【図３８−５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４−１】
【図３４−２】
【図３５−１】
【図３５−２】
【図３５−３】
【図３５−４】
【図３６−１】
【図３６−２】
【図３６−３】
【図３６−４】
【図３６−５】
【図３７−１】
【図３７−２】
【図３７−３】
【図３８−１】
【図３８−２】
【図３８−３】
【図３８−４】
【図３８−５】
【公表番号】特表２００７−５３５９０７（Ｐ２００７−５３５９０７Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３９９８５（Ｐ２００６−５３９９８５）
【出願日】平成１６年１１月１５日（２００４．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８１９７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９８０２
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１５日（２００４．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８１９７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４９８０２
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】
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