抗体フォーマットの生産および前記抗体フォーマットの免疫学的用途
本発明は抗体フォーマットに関し、該抗体フォーマットは、ＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨまたはヒトＶＨドメインの全体または一部がヒト抗体の定常領域に融合されていることを特徴とする。本発明はさらに、前記抗体フォーマットの免疫診断および免疫治療における用途に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体フォーマットの生産およびそれらの免疫学的用途、より具体的には免疫療法および免疫診断における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、抗体分子は５つのクラス、すなわち：ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＡに属する免疫グロブリン（Ｉｇ）であると認識している。一般に、これらの分子は重鎖（Ｈ）と、κ鎖（κ）またはλ鎖（λ）のいずれかである軽鎖（Ｌ）とを含んでなる。
【０００３】
各クラスの免疫グロブリンは特定のタイプの重鎖、すなわちＩｇＭはμ鎖、ＩｇＧはγ鎖、ＩｇＤはδ鎖、ＩｇＥはε鎖、およびＩｇＡはα鎖を含む。
各鎖は、それぞれ内部にジスルフィド結合を備えたドメインより形成される。軽鎖は２つのドメインを有し、重鎖は４つのドメインを有する。各鎖のアミノ末端を含むドメインの配列は可変的であり（ＶＨおよびＶＬ領域）、他のドメインの配列は一定である（重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、ならびに軽鎖のＣＬ）。
【０００４】
可変領域Ｖは、ともに相補性を決定するＣＤＲと呼ばれる超可変配列の領域を含む。
重鎖では、最初の２つのドメイン（ＶＨ−ＣＨ１）に続いてヒンジ領域がある。免疫グロブリンでは、軽鎖はジスルフィド結合によって重鎖に接続されてヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマーがヒンジ領域でいくつかのジスルフィド結合によって同じヘテロダイマーに接続され、免疫グロブリンを形成する。ヒンジ領域のレベルでプロテアーゼにより分割すると、２つのフラグメント、すなわち：Ｆａｂフラグメント（ＶＬ−ＣＬおよびＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む、抗原を結合するドメイン）およびＦｃフラグメント（（ＣＨ２−ＣＨ３）２ドメインを含むエフェクタ・ドメイン）が得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗体フォーマットの生産およびそれらの免疫学的用途、より具体的には免疫療法および免疫診断における用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、より具体的には、抗体フラグメントおよびこれらのフラグメントから創出された種々の抗体フォーマット、特にキメラ化またはヒト化された、多重特異性または多価のうち少なくともいずれか一方である抗体について述べる。
【０００７】
本発明において「抗体フォーマット」とは、上述のタイプのドメインおよび領域の種々の組合せに相当する。
本発明者らは、用語「キメラ化抗体」により、動物起原のＶＨドメインがヒト免疫グロブリンの定常領域へ融合されたものを意味する。
【０００８】
本発明者らは、用語「ヒト化抗体」により、動物起原のＶＨから超可変領域（ＣＤＲ）が移植されたヒトのＶＨドメインが、ヒトＩｇの定常領域へ融合されたものを意味する。
これらの抗体は、所与の分子に対応する標的のエピトープを認識する。これらのエピトープは様々であり、異なる標的に属していても同じ標的に属していてもよい。よって用語「二重特異性抗体」とは、２つの異なる標的を結合する２つの異なるＶＨを備えたフォーマットを意味し、「二重エピトープ抗体」とは、同じ標的上の２つの異なるエピトープに
結合する２つの異なるＶＨを備えたフォーマットを意味する。
【０００９】
「価数」は、同じＶＨがそのフラグメント上で見つかる回数に相当する。
所定の標的に到達する抗体の認識特異性は、様々な疾病、特に腫瘍学上の診断および治療に使用されており、腫瘍学では、標的は腫瘍関連抗原でも、成長因子レセプターでも、がん遺伝子もしくは変異した「腫瘍抑制」遺伝子の産物でも、あるいは血管形成に関連した分子または非腫瘍細胞上で発現するが前駆細胞には存在しない（ＣＤ２０の場合のような）分子であってもよい。
【００１０】
２０年間以上の実験研究の後、モノクローナル抗体による腫瘍の免疫ターゲティングは現在では相当に発展している。
その結果として、種々の臨床研究の結果から、最近ではある種の抗体の治療上の可能性が実証されており、また該抗体がＦＤＡの承認を受け、また欧州でのＡＭＭを受けている。
【００１１】
こうした進展は、主にいわゆる「第二世代」の組換え抗体、すなわち：
− ヒト化抗体、例えば、ある種の乳癌の化学療法に使用される抗ＨＥＲ２／Ｎｅｕ抗体であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎｅ）、
− キメラ抗体、例えば、濾胞Ｂ細胞リンパ腫の治療に使用される抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）
の使用によるものである。
【００１２】
遺伝子工学によって、マウス抗体の可変領域または超可変領域をヒトのＩｇ分子上に「移植する」ことが可能である。
現在、新しい技術を用いて、ファージ上で発現させた（いわゆる「ファージディスプレイ」技術）ヒト可変ドメインの選択によって、あるいはヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの使用によって、完全なヒト抗体を得ることが可能である。
【００１３】
さらに、二重特異性抗体の概念は、免疫系を刺激することにより標的の腫瘍細胞とエフェクタ細胞との間の接触を容易にするために使用されてきた。この概念は、二重の特異性を賦与された抗体の構築にある。この抗体は、腫瘍細胞の表面で生産された分子（ＣＥＡ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＧＤ２など）と、免疫のエフェクタ細胞であるナチュラルキラー細胞、キラーＴ細胞もしくはＣＴＬ、多核性好中球、単球およびマクロファージの表面で発現された分子（Ｆｃ受容体など）を結合させることができなければならない。この戦略の変形は、腫瘍細胞の表面で生産された分子と、直接的または間接的な細胞毒性（放射性元素、毒素、プロドラッグ）を示す分子とを連結させる抗体の構築である。
【００１４】
今まで、ほとんどの二重特異性抗体は抗体の２つのフラグメントを生化学的にカップリングすることにより開発されたものである。しかしながら、この技術は、工業規模ではほとんど展開されていない。いくつかの二重特異性抗体、例えばｓｃＦｖタイプの二重特異性抗体（「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」）は、遺伝学的に開発されている。不運にも、該抗体は大腸菌で可溶性の形態で生産するのが依然難しく、またＡＤＣＣの点においてもあまり有効ではない。
【００１５】
免疫療法のための抗体フォーマットを生成し、特に多重特異性抗体を得るための候補抗体の探索において、本発明者らは、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ）に確認された軽鎖を有しない特異抗体（ハマース‐キャスターマン（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ）ら、１９９３年）に着目した。
【００１６】
一種類の抗原を特異的に認識するラクダ科由来の一本鎖重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨ
Ｈ）を、免疫した動物から選択し、プラスミド構築物から生産可能なキメラ化抗体あるいはヒト化抗体の様々なフォーマットを開発するために使用した。任意の他のＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨ、あるいはヒトＶＨの生産を可能にするために、様々なフォーマットが適合することが判明した。
【００１７】
本発明は、探索の対象となる標的およびエピトープを認識する特性を備えた、ＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨあるいはヒトＶＨドメインの全体のうち一部を含む抗体フォーマットを提供することを目的とする。
【００１８】
さらに本発明は、これらの様々な構築物の生産のための方法を提供することを目的とする。
別の態様によれば、本発明は、作製した利用可能な種々のフォーマットの免疫治療および免疫診断における適用を目的とする。
【００１９】
本発明はまた、ラクダ科、特にラマのＶＨＨおよび／またはヒトＶＨのドメインの一部または全体を、ヒト化抗体の定常領域に融合された状態で含む抗体フォーマットに関する。
【００２０】
本発明を達成する第１の手段によれば、抗体フォーマットはＦａｂタイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨドメインまたは２つのヒトＶＨドメイン、あるいはＶＨＨのＣＤＲが移植された２つのヒトＶＨドメインが結合し、該ドメインのうちの一方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣκまたはＣλに融合し、他方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣＨ１に融合していることを特徴とする。
【００２１】
本発明を達成する第２の手段によれば、抗体フォーマットはＦａｂ’タイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨドメインまたは２つのヒトＶＨドメイン、あるいはＶＨＨのＣＤＲが移植された２つのヒトＶＨドメインが結合し、該ドメインのうちの一方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣκまたはＣλに融合し、他方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣＨ１および後続するヒンジ領域Ｈに融合していることを特徴とする。
【００２２】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットは、単一特異性／二価、二重特異性／一価、および二重エピトープ性／一価のタイプである。
本発明を達成する第３の手段によれば、抗体フォーマットはＦ（ａｂ’）２タイプであり、上に定義されるようなＦａｂ’タイプが２つ結合したものとして特徴づけられる。
【００２３】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットは、ヒト免疫グロブリン由来のヒンジ領域Ｈを有するため、単一特異性／四価、二重特異性／二価、および二重エピトープ性／二価の組合せが可能である。
【００２４】
本発明を達成する第４の手段によれば、抗体フォーマットはＦ（ａｂ’）２タイプであり、上記のＦ（ａｂ’）２タイプのフォーマットの還元によって得られた２つのＦａｂ’が結合したものとして特徴づけられる。
【００２５】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットは、ヒト免疫グロブリン由来のヒンジ領域Ｈを有するため、単一特異性／四価から四重特異性／一価または四重エピトープ性／一価まで、その中間の可能な組合せを全て含んだ組合せが可能である。
【００２６】
本発明を達成する第５の手段によれば、抗体フォーマットは（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプ（Ｈはヒト免疫グロブリンのヒンジ領域を表し、ＣＨ２およびＣＨ３はヒトＩｇ重鎖の二番目および三番目の定常領域を表す）であり、２つの同一のＶＨＨまたはヒトＶＨ、あ
るいはＶＨＨの超可変領域が移植された２つのヒトＶＨが結合したものであって、各々がヒトＩｇのＨ−ＣＨ２−ＣＨ３領域で融合されていることを特徴とする。
【００２７】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットにより、単一特異性／二価の組合せが可能である。
本発明を達成する第６の手段によれば、抗体フォーマットは、ｍＡｂ＊タイプ（このタイプは、元の可変ドメインがＶＨＨもしくはヒト化ＶＨＨ、またはヒトＶＨドメインの全体または一部で置き換えられて、ヒト抗体の定常領域と融合されているものを指す）であり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨまたは２つのヒトＶＨ、あるいはＶＨＨの超可変領域が移植された２つのヒトＶＨが結合したものであって、一方がヒトのＣκまたはＣλ領域に融合し、他方がヒトＩｇのＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に融合していることを特徴とする。
【００２８】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットにより、単一特異性／四価でおよび二重特異性／二価および二重エピトープ性／二価の組合せが可能である。
これらの種々のフォーマットでは、免疫グロブリンは、ヒトのアイソフォームＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に相当するＩｇＧ、あるいはアイソフォームＩｇＡ１、ＩｇＡ２に相当するＩｇＡ、あるいはその他のヒトＩｇである。
【００２９】
ＶＨＨは、ヒトＶＨで置き換えられてもよいし、またはＶＨＨからヒトＶＨ上へのＣＤＲの移植によるヒト化ＶＨＨで置き換えられてもよい。
本発明を達成する上記手段の例では、ＶＨＨは、ラクダ科、特にラマ由来のＶＨＨ抗体のフラグメントに相当するかまたは該フラグメントを含む。特に該ＶＨＨは、抗癌胎児性抗原（略して抗ＣＥＡ）抗体フラグメントまたは抗ＦｃγＲＩＩＩレセプター（略して抗ＣＤ１６）抗体フラグメントの一部または全体で構成されるという点で特徴的なフラグメントを含む。
【００３０】
抗ＣＥＡ抗体フラグメントは、より具体的には、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．（配列番号）７７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０５の配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に従うものである。
【００３１】
好ましい形態における抗ＣＤ１６抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０４の配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に相当する。
【００３２】
これらのフラグメントは新たな産物を形成し、このように本発明の範囲内にある。
本発明は、これらのＶＨＨフラグメントのＣＤＲも含む。
本発明は、免疫療法または免疫診断のための、キメラ化またはヒト化された多重特異性および／または多価抗体を生産する方法も含み、該方法は上記に定義された抗体フォーマットの使用を含むことを特徴とする。
【００３３】
本発明は具体的には、抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ラクダ科ＶＨＨ、特にラマＶＨＨを含む上記フォーマットの方法を目指す。
より具体的には、本発明は、抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ＶＨＨの可変ドメインであって、
− ラクダ科動物、特にラマを、免疫原としてＣＥＡまたはＣＤ１６を用いて免疫することと、
− 血液から得られたＢリンパ球を精製することと、
− ＶＨＨバンクを構築することと、
− 該バンクからＶＨＨを単離することと
を含むプロトコールによって有利に生産されたものを指す。前記バンクの構築は：
− Ｂリンパ球からの全ＲＮＡの抽出と、
− 対応するｃＤＮＡを得るためのＲＮＡの逆転写と、
− 一本鎖重鎖の抗ＣＤ１６および抗ＣＥＡ抗体の可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲによる増幅と、
− ファージミドで増幅させたＤＮＡの酵素切断によって得られたＶＨＨ ＤＮＡフラグメントのライゲーションと
を含む。
【００３４】
ＶＨＨはファージディスプレイ技術によってバンクから単離され、精製される。
抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨの前記可変ドメインは、
− ラクダ科動物、特にラマを、免疫原としてＣＥＡまたはＣＤ１６を用いて免疫することと、
− 血液から回収されたＢリンパ球を精製することと、
− ＶＨＨバンクを構築することと、
− 該バンクからＶＨＨを単離することと
を含むプロトコールによって有利に生産される。
【００３５】
有利な方法において、前記バンクの構築は：
− Ｂリンパ球からの全ＲＮＡの抽出と、
− 対応するｃＤＮＡを得るためのＲＮＡの逆転写と、
− 一本鎖重鎖の抗ＣＤ１６および抗ＣＥＡ抗体の可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲによる増幅と、
− ファージミドで増幅させたＤＮＡの酵素切断によって得られたＶＨＨ ＤＮＡフラグメントのライゲーションと
を含む。
【００３６】
ＶＨＨはファージディスプレイ技術によってバンクから単離され、精製される。
種々のＶＨＨについて、実施例に例証するようにして特異性および親和性について検証した。
【００３７】
本発明によれば、次いで、選択されたＶＨＨの遺伝子を発現ベクター、特にプラスミドに導入し、種々の多重特異性および／または多価（抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６）キメラ化抗体であって、表面にＣＥＡを発現している腫瘍細胞に結合し、かつＣＤ１６を発現する免疫系由来のエフェクタ細胞（単球、マクロファージ、ＮＫ、多核性好中球など）を動員することのできる抗体を生産する。
【００３８】
本発明はまた、上記に定義された抗体フォーマットの発現ベクターにも言及する。
より具体的には本発明は、発現ベクター、特にプラスミドに言及し、該発現ベクターは２つのユニークな制限酵素切断部位の間に、プロモータと、シグナル配列と、上記に定義されたＶＨＨドメイン、ヒトＩｇの定常領域をコードしうる、またはヒトＶＨドメイン、ＶＨＨのＣＤＲ領域、ヒトＩｇの定常領域をコードしうるヌクレオチド配列とを含んでいる。
【００３９】
本発明によるプラスミドは、上記に定義された抗体フォーマットを細菌において可溶性の形態で大量に発現することが可能であり、抗体ドメインをコードする領域は、原核生物または真核生物の他の発現システムにも容易に移入可能である。
【００４０】
したがって、本発明は、上記に定義された抗体フォーマットを達成するための第１の手段によるＦａｂタイプの抗体の生産を可能にするプラスミドｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１２）およびｐＣκＣＨ１γ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１００およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１４）に言及する。
【００４１】
これらのプラスミドは、より具体的には、プラスミドｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９４およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１０）の中に、Ｉｇの軽鎖Ｃκおよび重鎖定常領域ＣＨ１をコードするヌクレオチド配列が挿入されたものとして特徴づけられる。
【００４２】
本発明はまた、上記に定義された抗体フォーマットを達成するための第２、第３および第４の手段によるＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２タイプの抗体の生産を可能にするプラスミドｐＣκＣＨ１Ｈγｌ−ＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９９およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１３）およびｐＣκＣＨ１Ｈγｌ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０１およびＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１１５）にも関する。
【００４３】
これらのプラスミドは、より具体的には、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１１）の中に、Ｉｇの重鎖ＣＨ１およびヒンジ領域（Ｈ）をコードするヌクレオチド配列が挿入されたものとして特徴づけられる。
【００４４】
本発明はさらに、上記に定義された抗体フォーマットを達成するための第５の手段による（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプの抗体の生産を可能にするプラスミドｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１−ＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９５）およびｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９６）にも言及する。
【００４５】
これらのプラスミドは、より具体的には、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳの中に、Ｉｇのヒンジ領域（Ｈ）ならびに定常領域ＣＨ２およびＣＨ３をコードするヌクレオチド配列が挿入されたものとして特徴づけられる。
【００４６】
本発明はまた、本発明を達成するための第６の手段によるｍＡｂ＊タイプの抗体の生産を可能にするプラスミドｐＭａｂγｌ＊（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０２およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１６）にも言及する。
【００４７】
このプラスミドは、より具体的には、ｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧの中に、Ｉｇの重鎖定常領域ＣＨ１、ヒンジ領域および定常領域ＣＨ２およびＣＨ３をコードするヌクレオチド配列が挿入されたものとして特徴づけられる。
【００４８】
これらのプラスミドの略図を図１０Ｂに、そのヌクレオチド配列を図１１に示す。上記プラスミドの構築に使用された中間体プラスミドも本発明の範囲内にある。より具体的には、上記に定義されたプラスミドを開発するために構築された、プラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８９）、ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９０）、ｐ５５／ＭＣＳ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９２）、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０９）、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９４およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１０）およびｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＥＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１１）が含まれる。
【００４９】
これらのプラスミド中のＩｇのドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｈは、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはＩｇＡ、またはその他のＩｇに属する。
ＶＨＨまたはヒトＶＨをコードする遺伝子を、種々のプラスミドのユニークな部位の間に導入する。これらの遺伝子を、ＶＨＨのＣＤＲをヒトＶＨ上に移植することによりヒト化ＶＨＨをコードする遺伝子に置き換えてもよい。
【００５０】
より一般的には、本発明によって使用されるプラスミドは、抗ＣＥＡまたは抗ＣＤ１６ＶＨＨ以外のＶＨＨ、他のヒトＶＨ、あるいは他のヒト化ＶＨＨであって任意の分子上に結合しうるものをコードするヌクレオチド配列を含むように設計可能である。
【００５１】
本発明はさらに、プラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ−（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．９１）に関し、該プラスミドは、図１０Ａおよび１１の略図に従ってアルカリホスファターゼに融合したヒトＶＨドメインを生産するためのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００５２】
免疫グロブリン重鎖の可変領域ヒトフラグメント（ＶＨ）を選択し、かつ該フラグメントが最も良好に生産され最も良く分泌されるクローンを分離するための方法が開発されている。
【００５３】
有利には、これらのヒトＶＨを、可変領域をヒト化するために、予め選択されたＶＨＨからＣＤＲを移植するための母体として使用する。
上記に定義された抗体フォーマットは、免疫療法および免疫診断において非常に興味深いものである。該抗体フォーマットは、異なる分子を認識し、または同じ分子上の２つの異なるエピトープに結合することが可能であり、さらに、従来の抗体によって認識されない新しいエピトープにアクセスすることも可能である。該抗体フォーマットはヒト化することも可能であり、ヒト化することにより、ヒトに注射された後の免疫原性が低い抗体を得るという有利な見通しが得られることになる。該抗体フォーマットが可溶形態で得られるという事実は、これらの抗体のさらなる興味深い特性である。免疫診断および免疫療法における該抗体フォーマットの適用も本発明の一部である。
【００５４】
本発明のその他の特性および利点は以下の実施例において提示される。該実施例では図１〜１３が参照される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
実施例１
ラマの免疫化、血清の抗体価測定およびＢリンパ球の精製
ヒト組換えレセプターＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）の細胞外領域で雌のラマを免疫化した（タイロード シー（Ｔｅｉｌｌａｕｄ Ｃ）ら、１９９３を参照）。
【００５６】
ヒト組換え癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の細胞外領域で雄のラマを免疫化した（タースキク（Ｔｅｒｓｋｉｋｈ）らの文献（１９９３）およびタースキク（Ｔｅｒｓｋｉｋｈ）らの特許文献（１９９３）を参照）。
【００５７】
各５００μｇの免疫原で動物を毎月免疫化した。１００ｍｌの血液を各免除化の１５日後に採取した。得られた各サンプルについて、血清および精製抗体（ＩｇＧ１、２および３）の抗体価測定を実施し、種々の免疫原に対する抗体の存在を検出した。その後、Ｂリンパ球をＦｉｃｏｌｌ（Ｒ）の勾配（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｒ）−１０７７、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で精製し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。
【００５８】
ＶＨＨバンクの構築：全ＲＮＡの精製、逆転写、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２およびファージミ
ドｐＨｅｎ１へのクローニング
ＶＨＨバンクの構築：
全ＲＮＡの精製：
Ｂリンパ球の全ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアナートを使用する方法によって抽出する（チョムツィンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）およびサッキ（Ｓａｃｃｈｉ）、１９８７年参照）。酸性媒体中でフェノール／クロロホルム抽出した後、全ＲＮＡをエタノールで沈殿させる。ＲＮＡの品質および定量は１％アガロースゲル上で評価する。その後、逆転写によってｃＤＮＡに変換する。
【００５９】
逆転写およびＰＣＲ：
使用したＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜９の配列のオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。
【００６０】
【化１】
【００６１】
５μｇの全ＲＮＡを、１ｐｍｏｌｅ（ピコモル）のオリゴヌクレオチド３’ＣＨ２ＦＯＲＴＡ４（アルバビ ガーロウディ（Ａｒｂａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ）ら、１９９７年）またはラマＩｇＧの一本鎖重鎖のＣＨ２ドメインに特異的なＣＨ２−２とハイブリダイズさせ、１５０Ｕのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）ＩＩ（ＢＲＬ）を用いて５０℃で３０分間逆転写する。ＩｇＧ２および３のヒンジ領域の特異的オリゴヌクレオチドである３’ＲＣ−ＩｇＧ２および３’ＲＣ−ＩｇＧ３も使用可能である。一本鎖ｃＤＮＡをビーズ（ＢｉｏＭａｇ（Ｒ）カルボキシルターミネータ、ポリサイエンス・インコーポレイテッド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ））で精製し、１７μｌの１０ｍＭトリス・アセタートｐＨ７．８で溶出させる。
【００６２】
ＰＣＲ１の条件：
４μｌのｃＤＮＡを、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅ（ＴＭ）Ｅｘｔｅｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ））、１０ｐｍｏｌｅの同じプライマー３’ＣＨ２ＦＯＲＴＡ４またはＣＨ２−２、および１０ｐｍｏｌｅの、ヒトＩｇＧのＶＨドメインに特異的な４種のプライマー５’ＶＨ１−４ Ｓｆｉを用いて、容量５０μｌ中でＰＣＲによって増幅させる（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１分間；を３７サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【００６３】
３つのＤＮＡフラグメントが増幅され、１つはＩｇＧ１のＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２ドメインをコードする約９００ｂｐのフラグメント；２つはＩｇＧ２および３のＶＨＨ−ＣＨ２ドメインをコードする約６００ｂｐのフラグメントである。
【００６４】
ＰＣＲ２の条件：
前記６００ｂｐのフラグメントを１％アガロースゲルで精製し（「Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｒ）ゲル抽出」キット、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、次いで１ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｒ）（バイオラボ（Ｂｉｏｌａｂｓ））、ならびにヒトＩｇＧのＶＨドメインに特異的な４つのプライマー５’ＶＨ１−４ Ｓｆｉ １０ｐｍｏｌｅおよび３’ＶＨＨ−ＮｏｔＩプライマー１０ｐｍｏｌｅを用いてＰＣＲによって増幅させる（９４℃、３分間；９４℃、４５秒；６５℃、４５秒；７２℃、４５秒；を１５サイクル、次いで、９４℃、４５秒；６０℃、４５秒；７２℃、４５秒；をさらに１５サイクル、その後７２℃、１０分間）。
【００６５】
ＶＨＨをコードする約４００ｂｐのフラグメントを、１％アガロースゲルで精製し（「Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出」キット、キアゲン）、回収し、エタノールで沈殿させる。次いで該フラグメントを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ、あるいはＢｇｌＩおよびＮｏｔＩ（バイオラボ）で切断して、ファージミドｐＨｅｎ１（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら、１９９１参照）のＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位、あるいはＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングする。
【００６６】
ベクターの準備：
２０μｇのファージミドｐＨｅｎ１を、容量３００μｌ中で、５０ＵのＳｆｉＩを用いてＢＳＡ存在下にて５０℃で１６時間；あるいは５０ＵのＮｃｏＩを用いてＢＳＡ存在下にて３７℃で１６時間消化する。直線状となったファージミドを０．７％アガロースゲルで精製する（「Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出」キット、キアゲン）。溶出させたＤＮＡを、次に、容量２００μｌ中で５０ＵのＮｏｔＩを用いて３７℃で１６時間切断する。酵素を６５℃で１５分間加熱して失活させ、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出してエタノールで沈殿させる。切断したｐＨｅｎ１を０．７％アガロースゲルで確認し、定量し、２００ｎｇ／μｌに調節する。
【００６７】
ＶＨＨ ＤＮＡフラグメントの準備：
５μｇのＶＨＨフラグメントを、容量３００μｌ中で、５０ＵのＢｇｌＩおよびＮｏｔＩを用いてＢＳＡ存在下にて３７℃で１６時間；あるいは５０ＵのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いてＢＳＡ存在下にて３７℃で１６時間切断する。酵素を６５℃で１５分間変性させ；その後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、１０μｇのグリコーゲン（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））存在下にてエタノールで沈殿させる。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩによって切断したＶＨＨフラグメントを１％アガロースゲルで精製し、次に２％アガロースゲルで確認し、定量し、１００ｎｇ／μｌに調節する。
【００６８】
ライゲーション：
ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩによって消化した１５０ｎｇのｐＨｅｎ１を、ＢｇｌＩおよびＮｏｔＩによって消化した６０ｎｇのＶＨＨフラグメントと、容量２０μｌ中で、２００
０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）を用いて１６℃で１７時間ライゲーションする。
【００６９】
リガーゼを６５℃で１５分間不活性化し、ライゲーション産物を２０ＵのＸｈｏＩ（バイオラボ）で３７℃にて４時間切断し、連結されずに残ったベクターを除去する。こうして６種のライゲーションを実施する。その後、ライゲーション産物を２本のチューブに回収し、フェノール／クロロホルムで抽出し、１０μｇのグリコーゲンの存在下で沈殿させ、２×１８μｌの超高純度Ｈ２Ｏに溶解させる。２μｌをエレクトロポレーションに使用する。
【００７０】
雄のラマ由来のＶＨＨバンク（参照番号：０８０１０１）は５．４ １０６クローンに相当し、雌のラマ由来のＶＨＨバンク（参照番号：０１０３０１）は１０６クローンに相当する。
【００７１】
ファージディスプレイ技術によるバンクからのＶＨＨの単離
抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨの選択：
種々のＶＨＨをファージディスプレイ技術によって単離する。
【００７２】
ファージバンクの作製：
バンク０８０１０１または０１０３０１（ファージミドで形質転換したＴＧ１細胞）からのストック１０μｌを、５０ｍｌの（２ＴＹ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２％グルコース）に接種し、ＯＤ６００が０．５になるまで３７℃でインキュベートする。その後、５ｍｌの培養物を、５ｍｌのＭ１３ＫＯ７（１０１３ｐｆｕ／ｍｌ）を用いて３７℃で３０分間、撹拌せずに感染させる。遠心分離の後、ファージ堆積物を２５ｍｌの（２ＴＹ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン）に入れる。この培養物を撹拌しながら３０℃で１６時間インキュベートする。その後、１／５容の２．５Ｍ ＮａＣｌ／２０％ＰＥＧ６０００でファージを沈殿させ、ＰＢＳ中で２５倍に濃縮する。
【００７３】
ＶＨＨの選択：
ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）Ｍ−２８０、ダイナル（Ｄｙｎａｌ））２００μｌを、１ｍｌの２％ミルク／ＰＢＳを用いて周囲温度で４５分間、回転式振とう器で撹拌しながら平衡化する。上記生成物からの１０１２個のファージについても、２％ミルク／ＰＢＳを用いて最終容量５００μｌ中で、周囲温度で６０分間、回転式振とう器で撹拌しながら平衡化する。
【００７４】
ビーズを磁石で圧縮し、２５０μｌの２％ミルク／ＰＢＳに再懸濁させ、２００μｌのビオチン化抗原とともに周囲温度で３０分間、回転式振とう器でインキュベートする。それぞれ終濃度１５０、７５および２５ｎＭのビオチン化抗原を、第１、第２および第３回目に使用する。
【００７５】
ビーズ／ビオチン化抗原４５０μｌをとり、ファージ５００μｌを加えて周囲温度で３時間、回転式振とう器で撹拌しながら処理する。このビーズ／ビオチン化抗原／ファージ混合物を、８００μｌの４％ミルク−ＰＢＳで５回洗浄し、次いで新しいエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移す。８００μｌのＰＢＳ−０．１％トゥイーンでさらに５回の洗浄を行い、次いで混合物を別のエッペンドルフチューブに移す。最後に、８００μｌのＰＢＳで５回洗浄する。
【００７６】
ビーズ／ビオチン化抗原上に結合した抗体ファージを２００μｌのＰＢＳで再懸濁させ、線毛にファージが結合するようにコンピテント状態にした１ｍｌのＴＧ１（コンピテントセル：２ＹＴで一晩培養したＴＧ１培養物から１／１００希釈物を作製し、５０ｍｌの
２ＹＴに植菌してＯＤ６００が０．５付近になるまで３７℃で撹拌する）と共に、撹拌せずに３７℃で３０分間インキュベートする。各選択作業において、ファージを計数し、さらなる選択のために増幅させる。
【００７７】
選択物の計数：
ファージ（上記参照）でトランスフェクトされたＴＧ１細胞１μｌの１０−２〜１０−５希釈物を、２ＹＴで作製する。各希釈物の１、１０および１００μｌを、ペトリ皿（２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコース）に広げる。該ペトリ皿を３０℃で１６時間インキュベートする。
【００７８】
コロニー単離のための選択物の播種：
５ｍｌのトランスフェクトされたＴＧ１を３０００ｇで１０分間遠心分離して細胞を集め、沈殿物を１ｍｌの２ＹＴに懸濁させる。１枚のペトリ皿（１２ｃｍ×１２ｃｍ）（２ＴＹ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコース）当たり２５０μｌを使用し、３０℃で１６時間インキュベートする。
【００７９】
この方法を使用して、次のＶＨＨが単離された。すなわち：４つの抗ＣＥＡ ＶＨＨ（クローン：３、１７、２５、４３）および４つの抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（クローン：ｃ１３、ｃ２１、ｃ２８、ｃ７２）が得られた。これらのアミノ酸およびヌクレオチド配列を図１および２に示す。
【００８０】
ＶＨＨおよび二重特異性抗体の再クローニング、生産および精製
ＶＨＨのクローニング：
ＶＨＨを、プラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−（構造は第１．３．６項に記載、図１０Ａおよび１１を参照）の制限酵素ＳｆｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの切断部位の間にクローニングした。
【００８１】
ＰＣＲ条件：
５０ｎｇのＶＨＨを、１ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ（バイオラボ）、１０ｐｍｏｌｅのプライマー５’ｐＪＦ−ＶＨ３−Ｓｆｉおよび３’ｃｍｙｃ−６Ｈｉｓ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、５０μｌの最終容量でＰＣＲにて増幅した（９４℃、３分間；９４℃、４５秒；５２℃、４５秒；７２℃、４５秒；で３０サイクル、その後、７２℃、５分間）。
【００８２】
次のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１の配列のオリゴヌクレオチドを使用する：
【００８３】
【化２】
【００８４】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製し（「Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出」キット、キアゲン）、２０ＵのＢｇｌＩおよび２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩ（バイオラボ）を用いて３７
℃で１６時間切断処理する。１０μｇのｐ５５ＰｈｏＡ／ＮＡＢ−を、最初に５０ＵのＳｆｉＩで５０℃にて１６時間、次いで２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩで３７℃にて１２時間切断処理する。切断産物（ベクターおよびＰＣＲフラグメント）をエタノール中で沈殿させる。このＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、０．７％アガロースゲルで定量する。
【００８５】
ライゲーションは、２００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ、ＳｆｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した５０ｎｇのｐ５５ＰｈｏＡ／ＮＡＢ−、ならびにＢｇｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した１０ｎｇのＰＣＲフラグメントを用いて、容量２０μｌとして１６℃で１６時間実施する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを６５℃で１５分間不活性化させた後、１０ＵのＸｈｏＩを用いた３７℃で２時間の酵素消化によって非組換えベクターを除去する。
【００８６】
ライゲーション反応物による形質転換およびいくつかの組換えコロニーの分析の後、目的のＶＨＨを大腸菌中で生産させる。
ＶＨＨの生産：
単離されたコロニーを、３ｍｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコース中に接種し、撹拌しながら３７℃でインキュベートする。次いで５０ｍｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコースに上記培養物の希釈物を植え、撹拌しながら３０℃で１６時間インキュベートする。４００ｍｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリンにＯＤ６００として０．１ユニット相当物を植え、ＯＤ６００が０．５〜０．７になるまで撹拌しながら３０℃でインキュベートする。その後、該培養物を、４００μｌのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で終濃度０．１ｍＭとして誘導し、３０℃で１６時間培養する。
【００８７】
二重特異性抗体の生産：
大腸菌株ＤＨ５αをプラスミドで形質転換して得られた単離コロニーを、３ｍｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコースに接種し、撹拌しながら３０℃でインキュベートする。その後、５０ｍｌのＬＢ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコースに先述の培養物の希釈物を植え、撹拌しながら３０℃で１６時間インキュベートする。４００ｍｌのＬＢ／１００μｇ／ｍｌアンピシリンにＯＤ６００として０．１ユニット相当物を接種し、撹拌しながら３０℃で２．５時間インキュベートし、次にＯＤ６００が０．５〜０．７になるまで撹拌しながら２０℃でインキュベートする。その後、該培養物を、４００μｌのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で終濃度０．１ｍＭとして誘導し、２０℃で７２時間培養する。
【００８８】
ペリプラズムの可溶性画分の抽出：
ＶＨＨまたは二重特異性抗体を生産するために用いた培養物を、４２００ｇ、４℃で４０分間遠心分離する。沈殿物を、４ｍｌの氷結ＴＥＳ（０．２Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５Ｍスクロース）中に取る。その後、リゾチーム（ＴＥＳ中に１０ｍｇ／ｍｌ、新たに調製したもの）１６０μｌを加え、次いでＨ２Ｏ中１／２に希釈した２４ｍｌの冷ＴＥＳを加える。該混合物を氷中で３０分間インキュベートする。
【００８９】
４２００ｇ、４℃で４０分間の遠心分離の後に、上清を回収し（ペリプラズム画分に相当）、１５０μｌのＤＮＡｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）および終濃度５ｍＭのＭｇＣｌ２を添加し、周囲温度で３０分間処理する。該溶液を、平衡化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０）に対して１６時間透析する。
【００９０】
ＶＨＨの精製：
カラム（ＢＤ ＴＡＬＯＮ（ＴＭ）金属親和性カラム（ＢＤバイオサイエンシズクロンテック（BD Biosciences Clontech ））を平衡化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムお
よび０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０）で平衡化する。ペリプラズム画分をカラムに載せる。５倍容量の平衡化バッファーでカラムを洗浄した後に、ＶＨＨをｐＨ勾配またはイミダゾール（平衡化バッファーｐＨ７．０と５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５．０との間の勾配あるいは２００ｍＭイミダゾール溶液）によって溶出させる。各フラクションをクマシーブルーで染色してからＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（１５％アクリルアミド）で確認する。目的のフラクションを合わせてＰＢＳに対して透析する。ＶＨＨをメンブレン（アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）５０００ＭＷＣＯ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で濃縮し、バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）のタンパク質アッセイキットを使用してローリー（Ｌｏｗｒｙ）の熱量測定法で分析する。
【００９１】
二重特異性抗体の精製：
二重特異性抗体は、ペリプラズム画分（「ペリプラズムの可溶性画分の抽出」を参照されたい）から２ステップで精製する。最初にＢＤ ＴＡＬＯＮカラム（「ＶＨＨの精製」を参照）、その後プロテインＧ（ＨｉＴｒａｐ（ＴＭ）プロテインＧ ５ｍｌ、アマシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。
【００９２】
「ＨｉＴｒａｐプロテインＧ」カラムをＰＢＳ（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．６７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．２ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．７６ｍＭ ｐＨ７．４）で平衡化する。ＢＤ ＴＡＬＯＮカラム上で溶出させ、ＰＢＳに対して透析したタンパク質をプロテインＧに載せる。５倍容のＰＢＳでカラムを洗浄した後で、二重特異性抗体を０．１ＭグリシンｐＨ２．７で溶出させてから１Ｍのｈｅｐｅｓ ｐＨ８で緩衝化する。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）で確認した後、二重特異性抗体を０．１×ＰＢＳ中で透析し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥して１０倍に濃縮する。最後に、ＰＢＳで平衡化したＴｒｉｃｏｒｎ（ＴＭ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（ＴＭ）２００ １０／３００
ＧＬカラム（アマシャム・バイオサイエンシズ）でＦ（ａｂ’）２をＦａｂ’から分離する。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｒ）、免疫蛍光法（フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ）およびＣＤ１６の活性化試験によるＶＨＨおよび二重特異性抗体の機能的な特性解析
ＥＬＩＳＡによる抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６抗体の特性解析：
ファージ−ＶＨＨのＥＬＩＳＡ：
５μｇ／ｍｌのビオチン化抗原（ＣＥＡまたはＣＤ１６）を、予め２％ミルク−ＰＢＳで飽和させたストレプトアビジンプレート（ＢｉｏＢｉｎｄ（ＴＭ）Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ストレプトアビジンコーティング型、サーモラボシステム（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ））に結合させる。５×１０１０ファージ‐抗体を抗原に接触させる。抗原／抗体結合を、ファージのタンパク質Ｐ８に対するモノクローナル抗体（ＨＲＰ／抗Ｍ１３モノクローナル抗体コンジュゲート、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を含むＥＬＩＳＡによって検出する。２０ｍｌの検出バッファー（１８ｍｌのＰＢＳ、１ｍｌの１Ｍクエン酸、１ｍｌの１Ｍクエン酸ナトリウム、１０ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２）に、基質として１０ｍｇのＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルホン酸、ジアンモニウム塩）を添加して、４０５ｎｍ（テカン（Ｔｅｃａｎ））で反応を読みとる。
【００９４】
ＶＨＨのＥＬＩＳＡ：
５μｇ／ｍｌビオチン化抗体を、予め２％ミルク−ＰＢＳで飽和させたストレプトアビジンプレート（ＢｉｏＢｉｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ストレプトアビジンコーティング型、サーモラボシステム）に結合させる。各ＶＨＨ（０．００１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）をマイクロウェル中に吸着させた抗原に結合させる。この結合を、１／１０００に希釈したｃ−ｍｙｃラベルに対するモノクローナル抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎ
ｃ））と、１／５０００に希釈した抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体ペルオキシダーゼ連結物（参照番号５５５５６、ＩＣＮ）とを用いて、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩）、ロッシュ）の存在下で検出する。
【００９５】
二重特異性抗体のＥＬＩＳＡ：
１０μｇ／ｍｌの抗原（ｒｈＣＤ１６またはｒｈＣＥＡ）を用いて、ＭａｘｉＳｏｒｐ（ＴＭ）プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））を受動的にコーティングする。ＰＢＳ／４％ミルク中でプレートを飽和させた後、該マイクロウェル中に吸着した抗原に、二重特異性抗体（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ）（８００〜０．４ｎＭ）を結合させる。結合を以下のいずれかの条件で検出する：
− １／５０００に希釈したＦｌａｇタグに対するモノクローナル抗体（抗ＦｌａｇＭ２ ｍＡＢ、シグマ）と、１／５０００に希釈した抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体アルカリホスファターゼ連結物（参照番号１１５−０５５−００３（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））とを用いて、ＤＮＰＰ（４‐ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物）の存在下。
【００９６】
− １／５００に希釈したｃ−ｍｙｃタグに対するモノクローナル抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー）と、１／５０００に希釈した抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体アルカリホスファターゼ連結物（参照番号１１５−０５５−００３（ジャクソン・イムノリサーチ））とを用いて、ＤＮＰＰの存在下。
【００９７】
− １／５００に希釈した抗ヒト軽鎖（κ）ヤギポリクローナル抗体アルカリホスファターゼ連結物（参照番号２０６０−０４、サザンバイオテク（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ））を用いて、ＤＮＰＰの存在下。
【００９８】
ＶＨＨ ＣＤ１６ ｃ２１がマイクロウェル中に吸着したｒｈＣＤ１６に結合したときの、ＶＨＨ ＣＥＡ１７の接近可能性を、ビオチン化ｒｈＣＥＡおよび１／５００希釈されたストレプトアビジン・アルカリホスファターゼ連結物（ＤＡＫＯ（カタログ番号Ｄ０３９６））を用いて実証する。
【００９９】
Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｒ）による抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６抗体の結合定数：
ＢＩＡＣＯＲＥは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の原理を用いて、分子を標識することなく分子間の相互作用をリアルタイムでモニターする。相互作用のパートナーのうちの一方は共有結合によりバイオセンサ上に固定化され、他方は連続的な流れの中に注入される。ＳＰＲによる検出の原理は、分子複合体の形成および解離によるバイオセンサ表面での分子量の変化をモニターすることを可能にする。レスポンスは共鳴ユニット（ＲＵ）として定量され、屈折率の変化の測定により分析物の結合速度を直接的に示すものである。記録されたシグナル（センサーグラム）は数学的に処理され、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、結合定数ＫＡ（ＫＡ＝ｋａ／ｋｄ）および平衡時の解離定数ＫＤ（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）が得られる。
【０１００】
ＣＥＡまたはＣＤ１６とＶＨＨ（モノクローナル抗体９Ｅ１０（サンタクルーズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド）によって認識されるｃ−ｍｙｃタグを有する）との間の相互作用について、モノクローナル抗体９Ｅ１０がＢＩＡＣＯＲＥ提案のアミンによる標準的カップリング手法（ＮＨＳ／ＥＤＣによる活性化）に従って共有結合で固定化されたＣＭ５バイオセンサを装備したＢＩＡＣＯＲＥ ３０００で調べた。その後、ＶＨＨ（バッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；１５０ｍＭ ＮａＣ１；３ｍＭ ＥＤＴＡ；０．００５％界面活性剤Ｐ２０；に溶解したもの）を注入し、次に、一連のＣＥＡまたはＣＤ１６を、９Ｅ１０上に固定化されたＶＨＨ上に注入する。並行して、タンパク質は注
入せずに同じカップリング手法に供した対照チャネルについても同様に注入を実施する。ＶＨＨの親和性を以下の表１に示す。二重特異性抗体の種々のフォーマットから同等の親和性が得られる。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨならびに対応する二重特異性抗体の特異性のＦＡＣＳによる分析：
ＣＥＡに対する特異性：
（有効な免疫ターゲティングのためには、抗ＣＥＡ抗体がＮＣＡ（顆粒球の表面で発現される、ＣＥＡに非常に相同性の高い分子）を認識しないことが極めて重要である。）
抗原抗体結合の検出は、トランスフェクションしていないＭＣ３８株（ネズミ結腸がんの細胞株）、同細胞株をＣＥＡでトランスフェクションしたもの（ＭＣ３８／ＣＥＡ＋）またはＮＣＡでトランスフェクションしたもの（ＭＣ３８／ＮＣＡ＋）、ヒト腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔ（表面にＣＥＡを発現するヒト結腸腺癌の細胞株）、および表面にＮＣＡを発現する顆粒球について実施する。
【０１０３】
顆粒球は、２種類の密度のＦｉｃｏｌｌ勾配（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｒ）１１１９および１０７７）でヘパリン存在下の新鮮血から抽出する。顆粒球は、２つのｈｉｓｔｏｐａｑｕｅの境界面に見いだされる。
【０１０４】
細胞への結合に使用された抗体は：
− ３５Ａ７、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＣＥＡに特異的）；
− １９２、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＮＣＡと交差反応する）；
− ７．５．４および３Ｇ８抗ＣＤ１６モノクローナル抗体；
− 抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（ｃ１３、ｃ２１、ｃ２８、ｃ７２）；
− 抗ＣＥＡ ＶＨＨ（３、１７、２５、４３）；
− 抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体であって、８つの単離ＶＨＨから構築したもの；である。
【０１０５】
検出に使用された抗体は：
− ９Ｅ１０、マウス抗ｃｍｙｃモノクローナル抗体（２００μｇ／ｍｌ、１／１０希釈して使用）であって、精製ＶＨＨのｃ−ｍｙｃ標識に結合；
− ＡＰ３２６Ｆ、ヒツジの抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体のＦＩＴＣ連結物（シーレーノス（Ｓｉｌｅｎｕｓ）、１／１００希釈して使用）；
である。
【０１０６】
１回のテスト当たり細胞０．５×１０６個を使用する。ＶＨＨおよびモノクローナル抗体は１００μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で希釈する。
細胞０．５×１０６個（細胞の自己蛍光測定）。
【０１０７】
細胞０．５×１０６個＋抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ ２０μｇ／ｍｌ。
細胞０．５×１０６個＋抗９Ｅ１０ ２０μｇ／ｍｌ、その後、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ ２０μｇ／ｍｌ。
【０１０８】
細胞０．５×１０６個＋抗ＣＥＡまたは抗ＣＤ１６ ＶＨＨ １〜５μｇ／ｍｌ、次に９Ｅ１０ ２０μｇ／ｍｌ、次に抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ ２０μｇ／ｍｌ。
細胞０．５×１０６個＋モノクローナル抗体（３５Ａ７、１９２、７．５．４）２０μｇ／ｍｌ、その後、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ ２０μｇ／ｍｌ。
【０１０９】
各ステップにおいて、サンプルを暗所にて４℃で４５分間インキュベートする。
各反応の間では、２ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄を実施する。最後のステップでは、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ中に入れる。
【０１１０】
ＦＡＣＳによる結果は、分析した４種の抗ＣＥＡ ＶＨＨならびにＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体の特異性を実証している。これらはＣＥＡ特異的であり、ＮＣＡとは交差反応しない。１例を図３に示す。この例において、対照のモノクローナル抗体であるｍＡｂ ３５Ａ７および１９２は、ＣＥＡを発現しないＭＣ３８細胞には結合せず、表面上にＣＥＡを発現するＭＣ３８ ＣＥＡ＋およびＬＳ１７４Ｔ ＣＥＡ＋細胞には結合する。ｍＡｂ １９２はさらに、表面上にＮＣＡを発現するＭＣ３８ ＮＣＡ＋細胞および顆粒球にも結合する。ＣＥＡ１７ ＶＨＨは、表面にＣＥＡを発現する細胞にのみ結合する。その他の抗ＣＥＡ ＶＨＨ抗体（クローン３、２５および４３）でも同等の結果が得られる。ＣＥＡ１７ ＶＨＨ／ＣＤ１６ ｃ２１ ＶＨＨ二重特異性抗体は、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２いずれの形態でも腫瘍細胞に特異的である。
Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態のその他の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体（８種の抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨ由来）でも同等の結果が得られる。
【０１１１】
ＣＤ１６に対する特異性：
免疫系がエフェクタ細胞を有効に認識するためには、ＣＤ１６Ｂから選ばれた抗ＣＤ１６抗体がさらにＣＤ１６Ａをも認識しなければならない。さらに、該抗体はＣＤ３２（ＲＦｃγＩＩＡおよびＲＦｃγＩＩＢ）とは交差反応してはならない。
【０１１２】
実験は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株由来の細胞株；ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、該細胞をＣＤ１６Ａをコードする遺伝子でトランスフェクションした株（表面にＣＤ１６Ａを発現する安定な細胞株；ビビエ（Ｖｉｖｉｅｒ）ら、１９９２年）、ＣＤ１６Ｂを発現する顆粒球、ＣＤ３２Ａのみを発現するＫ５６２細胞、およびＣＤ３２Ｂのみを発現するＩＩＡ ６ｈｕＩＩＢ１細胞を用いて実施する。
【０１１３】
細胞への結合に使用された抗体は：
− ３Ｇ８、抗ＣＤ１６（ヒトＲＦｃγＩＩＩＡ／ＩＩＩＢ）モノクローナル抗体であって、エピトープのコンホメーションを認識し、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６ＢへのＩｇＧの結合をブロックする部位認識抗体；
− ７．５．４、抗ＣＤ１６（ヒトＲＦｃγＩＩＩＡ／ＩＩＩＢ）モノクローナル抗体であって、ＣＤ１６のＩｇＧ結合部位の外側に局在する線形のエピトープを認識し、かつ競合テスト（ヴェリィ（Ｖｅｌｙ）ら、１９９７年）において高濃度でも前記ＩｇＧ結合への影響がごくわずかである抗体；
− ＡＴ１０、抗ＣＤ３２（ヒトＲＦｃγＩＩＡ／ＩＩＢ）モノクローナル抗体；
− ＩＶ．３、抗ＣＤ３２（ヒトＲＦｃγＩＩＡ）モノクローナル抗体；
− 抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（ｃ１３、ｃ２１、ｃ２８、ｃ７２）；
− 抗ＣＥＡ ＶＨＨ（３、１７、２５、４３）；
− ３５Ａ７、抗ＣＥＡモノクローナル抗体；
− １９２、抗ＮＣＡモノクローナル抗体（ＣＥＡと交差反応する）；
− 抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体、８つの単離ＶＨＨから構築されたもの
である。
【０１１４】
検出に使用された抗体は：
− ９Ｅ１０、マウス抗ｃｍｙｃモノクローナル抗体（２００μｇ／ｍｌ、１／１０希釈して使用）であって、精製ＶＨＨのｃ−ｍｙｃ標識に結合；
− ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体のＦａｂ’２であって、ＦＩＴＣとの連結物（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）、２０μｇ／ｍｌで使用（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）、１１５−０９６−００３）。
【０１１５】
１回のテスト当たり細胞０．５×１０６個を使用する。ＶＨＨおよびモノクローナル抗体は１００μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で希釈する。
細胞０．５×１０６個（細胞の自己蛍光測定）
細胞０．５×１０６個＋（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）２０μｇ／ｍｌ
細胞０．５×１０６個＋抗９Ｅ１０ ２０μｇ／ｍｌ、その後（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）２０μｇ／ｍｌ
細胞０．５×１０６個＋ＶＨＨ １〜５μｇ、次に９Ｅ１０ ２０μｇ／ｍｌ、次に（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）２０μｇ／ｍｌ
細胞０．５×１０６個＋モノクローナル抗体（３５Ａ７、１９２、３Ｇ８、７．５．４、ＡＴ１０、ＩＶ．３）２０μｇ／ｍｌ、その後（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）２０μｇ／ｍｌ。
【０１１６】
各ステップにおいて、サンプルを暗所にて４℃で４５分間インキュベートする。
各反応の間では、２ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄を実施する。最後のステップでは、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ中に入れる。
【０１１７】
ＦＡＣＳによる結果は、分析した４種の抗ＣＤ１６ ＶＨＨならびにＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体の特異性を実証するものである。これらの抗体はＣＤ１６特異的であり、ＣＤ３２とは交差反応しない。１例を図４に示す。この例において、対照のモノクローナル抗体であるｍＡｂ ３Ｇ８は、ＣＤ１６を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２ ＣＤ３２Ａ＋およびＩＩＡ．１．６ｈｕＩＩＢ１ ＣＤ３２Ｂ＋には結合せず、表面にＣＤ１６を発現するＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋細胞および顆粒球には結合する。ＣＤ１６ ｃ２１ ＶＨＨは、表面にＣＤ１６を発現する細胞に結合しない。その他の抗ＣＤ１６ ＶＨＨ抗体（クローンｃ１３、ｃ２８およびｃ７２）でも同等の結果が得られる。二重特異性抗体であるＶＨＨ ＣＥＡ１７／ＶＨＨ ＣＤ１６ ｃ２１は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のいずれの形態でもＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋およびＮＫＬ細胞に特異的である。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態のその他の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体（８つの抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨ由来）でも同等の結果が得られる。
【０１１８】
二重特異性抗体の細胞上への接近可能性に関するＦＡＣＳ分析：
抗ＣＤ１６ ＶＨＨドメインの接近可能性：
５×１０５個のＬＳ１７４Ｔ細胞を、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２の存在下（１０μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌの範囲）で、氷中のＰＢＳ−１％ＢＳＡの中で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ１％で洗浄する。その後、種々の抗体フラグメントの抗ＣＤ１６ ＶＨＨドメイン上へのｒｈＣＤ１６（１０μｇ／ｍｌ）の結合を２ステップで検出する。該検出は、モノクローナル抗体７．５．４あるいは３Ｇ８（３μｇ／ｍｌ）を細胞と共に氷中で３０分間インキュベートし、次いで細胞をＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＦ（ａｂ’）２（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、カタログ番号：１１５−０９６−００３）と共に、氷中で３０分間インキュベートすることにより行われる。数回の洗浄の後、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ（ＴＭ）プログラムを使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＴＭ）４Ｃ４（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いたフローサイトメトリー法によって免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ）を分析する。
【０１１９】
抗ＣＥＡ ＶＨＨドメインの接近可能性：
５×１０５個のＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋細胞を、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２の存在下（１０μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌの範囲）で、氷中のＰＢＳ―ＢＳＡ１％中で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ１％で洗浄する。その後、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２の抗ＣＥＡ ＶＨＨドメイン上へのｒｈＣＥＡ（１０μｇ／ｍｌ）の結合を２ステップで検出する。該検出は、モノクローナル抗体１９２（３μｇ／ｍｌ）を細胞と共に氷中で３０分間インキュベートし、次いで細胞をＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＦ（ａｂ’）２（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー、カタログ番号：１１５−０９６−００３）と共に、氷中で３０分間インキュベートすることにより行われる。数回の洗浄の後、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ（ＴＭ）プログラムを使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＴＭ）４Ｃ４（ベクトン・ディキンソン）を用いたフローサイトメトリー法によって免疫蛍光を分析する。
【０１２０】
１例を図５に示す。二重特異性抗体であるＶＨＨ ＣＥＡ１７／ＶＨＨ ＣＤ１６ ｃ２１は、ＬＳ１７４ＴおよびＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋細胞のいずれにも結合する。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態のその他の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体（８つの抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨ由来）でも同等の結果が得られる。
【０１２１】
抗ＣＤ１６ ＶＨＨとモノクローナル抗体３Ｇ８および７．５．４との間の競合テスト：
ＥＬＩＳＡ：
５μｇ／ｍｌのビオチン化ＶＨＨ（ｃ２１、ｃ２８）を、予め２％ミルク−ＰＢＳで飽和させたストレプトアビジン吸着プレート（ＢｉｏＢｉｎｄ（ＴＭ）Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ストレプトアビジンコーティング型、サーモラボシステム）のウェルに結合させる。その後、０．０７〜２０μｇ／ｍｌの濃度範囲のＣＤ１６Ｂを添加する。第２に、５μｇ／ｍｌの一定濃度のモノクローナル抗体（３Ｇ８または７．５．４）を添加する。ＣＤ１６Ｂとモノクローナル抗体との結合を、抗マウスＩｇＧヤギＦ（ａｂ’）２のアルカリホスファターゼ連結物（サザン・バイオテクノロジー、１０３０−０４）を用いて、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ（シグマ、Ｎ９３８９）の存在下で検出する。
【０１２２】
ＥＬＩＳＡにおける競合曲線を図６に示す。ＣＤ１６ ｃ２１ ＶＨＨは、モノクローナル抗体７．５．４によってシフトする。ＣＤ１６ ｃ２８ ＶＨＨは、モノクローナル抗体３Ｇ８によってシフトする。
【０１２３】
間接免疫蛍光法（ＦＲＣＳ）
５×１０５個のＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６Ａ細胞を、ＣＤ１６ ｃ２１またはｃ２８ ＶＨＨ（１〜１００μｇ／ｍｌ）の存在下、氷中のＰＢＳ−５％ＢＳＡの中で３０分間インキュベートする。その後、細胞を、０．１μｇ／ｍｌの３Ｇ８または１μｇ／ｍｌの７．５．４と共に同じ条件で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ−５％ＢＳＡ中で洗浄する。その後、３Ｇ８または７．５．４の結合を検出する。該検出は、細胞を、ＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体Ｆ（ａｂ’）２（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）米国ペンシルバニア州ウエストグローブ所在、カタログ番号：１１５−０９６−００３）とともに氷中で３０分間インキュベートすることにより行われる。数回の洗浄の後、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ（ＴＭ）プログラムを使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＴＭ）４Ｃ４（ベクトン・ディキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンビュー所在）を用いたフローサイトメトリー法によって免疫蛍光を分析する。
【０１２４】
細胞上での競合プロファィルを図７に示す。ＣＤ１６ ｃ２１ ＶＨＨはモノクローナル抗体７．５．４によってシフトする。ＣＤ１６ ｃ２８ ＶＨＨはモノクローナル抗体３Ｇ８によってシフトする。高用量のＣＤ１６ ｃ２８ ＶＨＨもモノクローナル抗体７．５．４によってシフトする。
【０１２５】
抗ＣＤ１６ ＶＨＨおよび二重特異性抗体によるＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞の活性化：
この実験は、ＣＤ１６Ａをコードする遺伝子でトランスフェクションされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）を用いて実施する。該細胞は、１０％のＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＲＰＭＩ １６４０で培養する。
【０１２６】
その後、５×１０５個の細胞をマイクロプレートウェル中（１０％のＦＣＳ、１％のＰＳ、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する２５０μｌのＲＰＭＩ）で１８時間培養する。
【０１２７】
その後、１０ｎｇ／ｍｌのフォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（それ自体ではＩＬ２の産生および分泌を誘導しないがＩＬ２産生の「第２のシグナル」として必要な濃度）を添加し、続いて０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのビオチン化ＶＨＨおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＶＨＨの架橋を可能にする）または非ビオチン化二重特異性抗体を添加する。
【０１２８】
細胞上清中に産生されたヒトＩＬ２を、Ｒ＆Ｄキット（Ｄｕｏｓｅｔ（Ｒ）ヒトＩＬ２；参照番号：ＤＹ２０２）の抗体およびストレプトアビジンのアルカリホスファターゼ連結物（ＤＡＫＯ、Ｄ０３９６）を使用して、ｐ−ニトロフェニルホスファート（シグマ、カタログ番号１０４−４０５）の存在下でＥＬＩＳＡによって測定する。
【０１２９】
ＣＤ１６Ａの活性化（インターロイキン２の産生および分泌）の結果を図８に示す。２種の抗ＣＤ１６ ｃ２１およびｃ２８ ＶＨＨは、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋細胞のＩＬ２産生を活性化する。ｃ２１によって誘導されたのと同様のＩＬ２の産生および分泌を誘導するためには、ｃ２８ではより多くの量が必要である。Ｆ（ａｂ’）２の形態の抗ＣＥＡ１７／抗ＣＤ１６ ｃ２１二重特異性抗体は、ストレプトアビジンによる架橋がなくても、Ｊｕｒｋａｔ細胞がその表面でＣＤ１６Ａを発現する場合はＩＬ２の産生を活性化する。その他の抗ＣＤ１６ ＶＨＨおよび抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体からも同
等の結果が得られる。
【０１３０】
二重特異性抗体存在下におけるＮＫＬ細胞による腫瘍細胞の溶解：
ナチュラルキラー細胞の細胞毒性テストについては、顆粒性大リンパ球を伴う白血病から得られた細胞株としてＮＫＬ細胞（ロバートソンら、１９９６（１２））を使用する。該細胞の機能的特性はＮＫに類似しており、またＣＤ１６の発現についてはフローサイトメトリー法によって最初に確認した。使用した標的細胞は、ヒトの白血病から得られたまさにＮＫ感受性のＨｅＬａ細胞、ネズミ結腸Ｃ１５．４．３ ＡＰ由来のＮＫ感受性細胞（ＭＣ３８）、ならびにヒトＣＥＡでトランスフェクションされた、本来ＮＫ耐性であるＭＣ３８細胞である。
【０１３１】
培養物中の標的細胞を懸濁させ（ＨｅＬａ細胞についてはトリプシン反応により、ＭＣ３８細胞とＮＫＬ細胞については機械的に懸濁）、トリパンブルーを使用してＭａｌａｓｓａｙセル中で計数する。１ウェル当たり２０００個の細胞を、３．７×１０６Ｂｑの５１Ｃｒおよび種々の抗体フォーマット（２００、１００または５０μｇ／ｍｌ）を含んだ１００μｌ中で３７℃にて１時間インキュベートする。その後、細胞を数回洗浄して、培地に残っている５１Ｃｒならびに非結合の抗体を除去する。懸濁させたＮＫＬ細胞を計数し、エフェクタ／標的比を６０：１〜０．２：１として標的細胞に添加する。３７℃で４時間インキュベーションした後、培地中に放出されたＣｒの放射活性を、γカウンターを使用して測定する。Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態の抗ＣＥＡ１７／抗ＣＤ１６ ｃ２１および抗ＣＥＡ１７／抗ＣＤ１６ ｃ２８二重特異性抗体を用いて得られた細胞溶解を示す例を図９に示す。
【０１３２】
種々のプラスミドの構築（図１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２Ａおよび１２Ｂを参照）
− プロトコールの概要はすべて、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリーズ・プレス、１９８９年に記述されている。
【０１３３】
− 制限酵素による消化は供給業者の推奨に従って実施する。
挿入したヒト起源の遺伝子：領域Ｃκ、ＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２およびＣＨ３をコードする遺伝子はそれぞれ、ヒト免疫グロブリンの軽鎖（κ鎖）の定常領域、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１の重鎖の第１の定常領域、ヒンジ領域、第２の定常領域、および第３の定常領域をコードする遺伝子のドメインに相当する。これらの遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲによってＬＦＢ（フランス分画生物工学研究所）のポケット試料（ｐｏｃｈｅ）から得た。この材料は法的な認可を受けており、記載された実験に使用可能である。
【０１３４】
− 各プラスミドの配列決定は、ＡＢＩ３１０型シーケンサを用いて、以下のオリゴヌクレオチド：
ＥｃｏＲＩ−９０、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２：ＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣ
ＨｉｎｄＩＩＩ＋８８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３：ＣＧＣＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣ
を使用して実施する。
【０１３５】
− すべてのベクターは、２つのユニークな制限酵素切断部位の間に：種々のプロモータ、ＰｅｌＢ型（またはその他の）種々のシグナル配列、種々のＲＢＳ配列、任意のＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨドメイン、任意のＣλドメイン、あるいは任意のタイプの免疫グロブリンのＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、を導入可能なように設計される。
【０１３６】
ｐＭＣＳＰｈｏＡ’ （図１０Ａ）
このプラスミドの構築については、ル・カルベス（Ｌｅ Ｃａｌｖｅｚ）ら（１９９５）の参照文献に記述されている。
【０１３７】
このプラスミドは、６番目の残基（プロリン）から始まる成熟型アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）をコードする。
ｐ３５ＰｈｏＡ’ （図１０Ａ）
このプラスミドの構築についてはル・カルベス（Ｌｅ Ｃａｌｖｅｚ）（１９９６）に記述されている。
【０１３８】
遺伝子断片（ＰｅｌＢのシグナル配列をコードする２〜１４コドンの３番目の塩基を縮重させたオリゴヌクレオチドによって形成）を、プラスミドｐＭＣＳＰｈｏＡ’のＮｄｅＩ部位とＥａｇＩ部位との間に挿入する。その後、最も高いアルカリホスファターゼ活性を示すクローン（１〜６０）を選択した。
【０１３９】
ｐ３５ＰｈｏＡ’／Ｎ− （図１０Ａおよび１１）
ｐｈｏＡ遺伝子中のＮｃｏＩ部位の抑制。
オリゴヌクレオチド：上流−ＲｓｒＩＩ、ＮｃｏＩ−ｓｕｐ、ＮｃｏＩ−ｉｎｆおよび下流−ＥｃｏＮＩを用いてｐＭＣＳＰｈｏＡ’からオーバーラップＰＣＲを実施する。
【０１４０】
使用したオリゴヌクレオチドの配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４〜１７は以下のとおりである。
【０１４１】
【化３】
【０１４２】
ＰＣＲ１およびＰＣＲ２の条件：
１μｌのプラスミド（５ｎｇ）、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド（ＰＣＲ１については上流−ＲｓｒＩＩおよびＮｃｏＩ−ｉｎｆ、ＰＣＲ２についてはＮｃｏＩ−ｓｕｐおよび下流−ＥｃｏＮＩ）、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅ（ＴＭ）、最終容量５０μｌ（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、次いで７２℃、１０分間）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１４３】
オーバーラップＰＣＲ３の条件：
ＰＣＲ１および２をそれぞれ１μｌ、ならびに０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ、最終容量５０μｌ。５サイクル（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間）の反応の後、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド（上流−ＲｓｒＩＩお
よび下流−ＥｃｏＮＩ）を添加し、ＰＣＲを３５サイクル続けた後、７２℃、１０分間。ＰＣＲ３の産物を、２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１４４】
ＰＣＲフラグメントの配列決定は、オリゴヌクレオチド５’ＥｃｏＲＩ−９０を使用して、ＡＢＩ３１０型シーケンサで実施する。
プラスミドｐ３５ＰｈｏＡ’中へのＰＣＲ３フラグメントのクローニング：
３５μｌのＰＣＲ３フラグメントおよび５μｌ（２．５μｇ）のｐ３５ＰｈｏＡ’を、１０ＵのＲｓｒＩＩおよびＥｃｏＮＩで消化する。１６時間インキュベーションした後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、各ＤＮＡを沈殿させて２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。
【０１４５】
ライゲーションは、ＰＣＲフラグメント５μｌ、ベクター０．５μｌおよび３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ（Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いて、最終容量１０μｌ中で、１６℃で１６時間実施する。細菌ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）をライゲーション反応物５μｌで形質転換する。
【０１４６】
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ− （図１０Ａおよび１１）
６ヒスチジン−グリシン−セリンモチーフの挿入
オリゴヌクレオチドＸｈｏＩ−ＳａｃＩおよび６ＨｉｓＧＳ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐ３５ＰｈｏＡ’／Ｎ−からＰＣＲを実施する。
【０１４７】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８および１９の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１４８】
【化４】
【０１４９】
ＰＣＲの条件：
ＰＣＲは、最終容量５０μｌ中に、５ｎｇのｐ３５ＰｈｏＡ’／Ｎ−ベクター、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチドおよび０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；７０℃、１分間；７２℃、１分間を３５サイクル、その後、７２℃、１０分間）。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１５０】
ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのクローニング
２０μｌのＰＣＲフラグメントおよび５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５ＰｈｏＡ’ベクター（ル・カルベス（Ｌｅ Ｃａｌｖｅｚ）ら、Ｇｅｎｅ（１９９６）、第１７０巻、ｐ．５１−５５）を、ＢＳＡ存在下で１０ＵのＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。１６時間インキュベーションした後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、各ＤＮＡを沈殿させて２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。ライゲーションは、最終容量１０μｌ中にＰＣＲフラグメント５μｌ、ベクター０．５μｌおよび３ＷｅｉｓｓＵのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）として１６℃で１６時間実施する。ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）をライゲーション反応物５μｌで形質転換する。
【０１５１】
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ− （図１０Ａおよび１１）
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−のＡｐａＩ部位およびＢｓｔＥＩＩ部位の抑制
１回のオーバーラップＰＣＲを、オリゴヌクレオチド：上流−ＥｃｏＲＶ、ＡｐａＩ−ＢｓｔＥＩＩ−ｓｕｐ、ＢｓｔＥＩＩ−ＡｐａＩ−ｉｎｆおよび下流−ＭｌｕＩを用いて、ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−から実施する。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０〜２３の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１５２】
【化５】
【０１５３】
ＰＣＲ１およびＰＣＲ２の条件：
１μｌ（５ｎｇ）のプラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド（ＰＣＲ１については上流−ＥｃｏＲＶおよびＢｓｔＥＩＩ−ＡｐａＩ−ｉｎｆ、ＰＣＲ２についてはＡｐａＩ−ＢｓｔＥＩＩ−ｓｕｐおよび下流−ＭｌｕＩ）、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅ（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後７２℃、１０分間）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１５４】
オーバーラップＰＣＲ３の条件：
ＰＣＲ１および２をそれぞれ１μｌ、ならびに０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ、最終容量５０μｌ。５サイクル（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間）の後、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド（上流−ＥｃｏＲＶおよび下流−ＭｌｕＩ）を添加し、ＰＣＲを３５サイクル続けてから、７２℃、１０分間。ＰＣＲ３の産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１５５】
ＰＣＲフラグメントの配列決定は、オリゴヌクレオチド５’ＥｃｏＲＩ−９０を使用して、ＡＢＩ３１０型シーケンサで実施する。
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−プラスミド中へのＰＣＲ３フラグメントのクローニング：
３５μｌのＰＣＲ３フラグメントおよび５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−を、１０ＵのＥｃｏＲＶおよびＭｌｕＩで消化する。１６時間インキュベーションした後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、各ＤＮＡを沈殿させ、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。
【０１５６】
ライゲーションは、最終容量１０μｌ中に、ＰＣＲフラグメント５μｌ、ベクター０．
５μｌおよび３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）として１６℃で１６時間実施する。ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）をライゲーション反応物５μｌで形質転換する。
【０１５７】
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ− （図１０Ａおよび１１）
ＰｈｏＡ遺伝子のＥａｇＩ部位における位相シフト
この位相シフトにより単一のＦｓｅＩ部位を作出する。
【０１５８】
５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−を１０ＵのＥａｇＩで消化する。１６時間インキュベーションした後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、反応混合物を沈殿処理し、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの等モル濃度混合物（終濃度３３μＭ）および２．５Ｕのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ｅｘｏフラグメント（バイオラボ）を添加して最終容量５０μｌとし、２５℃で１５分間処理する。５００ｍＭのＥＤＴＡを２μｌ加え、７５℃で２０分間処理して反応を停止させる。反応混合物をエタノール沈殿し、５μｌのＨ２Ｏ中に入れ、最終容量１０μｌとして３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）を用いてライゲーションする。細菌ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）をライゲーション反応物５μｌで形質転換する。
【０１５９】
このプラスミドにより、ヒト抗体ＶＨのフラグメントをクローニングして最も良く分泌されるものを選択することが可能となる。
ｐ５５／ＭＣＳ１ （図１０Ａおよび１１）
１対のオリゴヌクレオチド５’ＭＣＳ１および３’ＭＣＳ１を使用した、ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−のＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間へのＭＣＳ Ｉの挿入。
【０１６０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４および２５の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１６１】
【化６】
【０１６２】
５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−ベクターを、各１０ＵのＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素によって１６時間消化する。各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’ＭＣＳ１および３’ＭＣＳ１を８０℃で５分間インキュベーションし、その後、該溶液を周囲温度までゆっくり冷却する。
【０１６３】
５μｌのベクターと１．２μｌのハイブリッドカセット（５’ＭＣＳＩ＋３’ＭＣＳＩ）とを、３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）の存在下で周囲温度にて１時間ライゲーションする。リガーゼを６５℃で１０分間インキュベーションして失活させ
る。１０ＵのＥａｇＩを含有する９０μｌの反応混合物を加え（２ｈ）、元のベクターを破壊する。この混合物をエタノール沈殿処理し、１０μｌのＨ２Ｏ中に入れる。細菌ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）を該混合物５μｌで形質転換する。
【０１６４】
ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ （図１０Ａおよび１１）
１対のオリゴヌクレオチド５’Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５‐ｓｕｐおよび３’Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５‐ｉｎｆを使用した、ｐ５５／ＭＣＳ１のＳｆｉＩ部位およびＳａｃ２部位の間へのＦｌａｇ／ＲＢＳ／ＰｅｌＢ３５モチーフの挿入。
【０１６５】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６および２７の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１６６】
【化７】
【０１６７】
クローニングは、ＭＣＳ Ｉの挿入について先述した条件のとおりに実施する。ライゲーションの後、反応混合物を１０ＵのＸｈｏＩ酵素で消化する。
ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ （図１０Ｂおよび１１）
１対のオリゴヌクレオチド５’ｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳおよび３’ｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳを使用した、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５のＮｏｔＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間へのｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳモチーフの挿入。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８および２９の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１６８】
【化８】
【０１６９】
クローニングは、ＭＣＳ Ｉの挿入について先述した条件のとおりに実施する。ライゲーション混合物を１０ＵのＸｂａＩ酵素で消化する。
Ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ （図１０Ｂおよび１１）
ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳへの免疫グロブリン軽鎖Ｃκ定常領域の挿入。
【０１７０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０および３１の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１７１】
【化９】
【０１７２】
Ｃκドメインの増幅：
ＬＦＢ提供のポケット試料からＦｉｃｏｌｌ勾配によってヒトＢリンパ球を精製する。その後、全ＲＮＡを第１．３．２項に記載のプロトコールに従って調製する。
【０１７３】
ハイブリダイゼーション：
全ＤＮＡ１μｌを、１ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド３’Ｃκとともに最終容量８μｌとして７０℃で１０分間プレインキュベーションする。温度を徐々に（４５分間）３７℃まで低下させる。
【０１７４】
逆転写：
８μｌをとり、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎｅ（２０Ｕ）、３μｌの５×バッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）ＩＩ、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、１μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）、２μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）を加え、５０℃で１０分間インキュベーションする。その後、０．７５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（１５０Ｕ）を加え、インキュベーションを５０℃で３０分間継続し、７０℃で１５分間処理する。
【０１７５】
得られたｃＤＮＡは、ビーズ（ＢｉｏＭａｇ（Ｒ）カルボキシル基結合型、ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて供給業者の推奨に従って精製する。最終的な溶離は、１５μｌの１０ｍＭトリス・アセタートｐＨ７．８で実施する。
【０１７６】
ＰＣＲ１および２の条件：
ＰＣＲ１は、１μｌのｃＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’Ｃκおよび３’Ｃκ、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて、最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【０１７７】
ＰＣＲ２は、１μｌのＰＣＲ１から、０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔを用いて最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後７２℃、５分間）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１７８】
ＰＣＲフラグメントは、クローニングの前にオリゴヌクレオチド５’Ｃκおよび３’Ｃκを用いてＡＢＩ３１０型シーケンサで配列決定する。
Ｃκドメインのクローニングは、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＢｓｔＥＩＩ部位およびＳａｃＩＩ部位の間で行う：
２０μｌのＰＣＲ２フラグメントおよび５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳを、１０ＵのＢｓｔＥＩＩおよびＳａｃＩＩで消化する。１６時間のインキュベーションの後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、各ＤＮＡを沈殿処理し、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。
【０１７９】
ライゲーションは、最終容量１０μｌ中で、５μｌのＰＣＲ２フラグメント、０．５μｌのベクターおよび３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）を用いて１６℃で１６時間実施する。ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）を５μｌのライゲーション反応物で形質転換する。
【０１８０】
ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧ）
ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳへの、ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンの重鎖定常領域ＣＨ１の挿入。
【０１８１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２〜３５の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１８２】
【化１０】
【０１８３】
ＣＨ１γ１ドメインの増幅は、ＢｓｔＥＩＩ部位を消失させるオーバーラップＰＣＲにより実施される。
逆転写は、Ｃκについて上述した通りに、ただしオリゴヌクレオチド３’ＣＨ１γ１を使用して実施する。
【０１８４】
ＲＴの後のＰＣＲ１は、１μｌのｃＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１γ１、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて、最終容量を５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【０１８５】
ＰＣＲ２ａは、１μｌのＰＣＲ１と、オリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１およびＢｓｔＥＩＩ‐ｉｎｆとから、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて最終容量を５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後、７２℃、５分間）。
【０１８６】
ＰＣＲ２ｂは、１μｌのＰＣＲ１と、オリゴヌクレオチドＢｓｔＥＩＩ‐ｓｕｐおよび３’ＣＨ１γ１とから、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて最終容量を５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後、７２℃、５分間）。
【０１８７】
ＰＣＲ３は、各１μｌのＰＣＲ２ａおよびＰＣＲ２ｂと、オリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１γ１とから、０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔを用いて最終容量を５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後、７２℃、５分間）。
【０１８８】
ＰＣＲ３の産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。ＰＣＲ３フラグメントの配列決定はオリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１γ１を使用して、ＡＢＩ３１０型シーケンサで実施する。
【０１８９】
クローニングは、Ｃκドメインについて記載したように実施するが、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＳｆｉＩ部位とＮｏｔＩ部位の間とする。
得られたプラスミドを通称ｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧとし、該プラスミドにより、各鎖に標識を有するＦａｂタイプの抗体フラグメント（図１２Ａ）の生産が可能となる。
【０１９０】
ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ｐＣ５κＣＨ１Ｈγ１−ＴＡＧ） （図１０Ｂおよび１１）
ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンの重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域（Ｈ）の、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳへの挿入
ＰＣＲ１、２ａ、２ｂおよび３は、ＣＨ１ドメインの増幅について上述したとおりに実施するが、オリゴヌクレオチド３’Ｃγ１をオリゴヌクレオチド３’ＣＨ１Ｈγ１に置き換えて行う。３’ＣＨ１Ｈγ１の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６は以下のとおりである：
【０１９１】
【化１１】
【０１９２】
クローニングは、ＣＨ１γ１ドメインについて記述したように、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＳｆｉＩ部位とＮｏｔＩ部位の間で行う。
得られたプラスミドを通称ｐＣκＣＨ１Ｈγ１−ＴＡＧとし、該プラスミドにより、各鎖に標識を有するＦ（ａｂ’）２タイプの抗体フラグメント（図１２Ａ）の生産が可能となる。
【０１９３】
ｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１（ｐＣκＣＨ１γ１） （図１０Ｂおよび１１）
ＳａｃＩＩおよびＳｆｉＩの間に含まれるＤＮＡフラグメントを、１対のオリゴヌクレオチド５’ＲＢＳ／３５‐ｓｕｐおよび３’ＲＢＳ／３５‐ｉｎｆを使用して新たなカセットに置き換えることによる、プラスミドｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳからのＦｌａｇ標識およびｃ−ｍｙｃ−６ｈｉｓＧＳ標識の除去。
【０１９４】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７および３８の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１９５】
【化１２】
【０１９６】
クローニングは、ＭＣＳＩの挿入について記述した条件に従って正確に実施する。得られた中間体プラスミドをｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳと称する。
【０１９７】
ｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳモチーフは、ＣＨ１γ１ドメインをｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳに再クローニングすることにより除去される。
１回のＰＣＲにより、５ｎｇのプラスミドｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳから、オリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１γ１−ＳＴＯＰを用いてＣＨ１γ１ドメインを増幅する。
【０１９８】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１９９】
【化１３】
【０２００】
ＰＣＲフラグメントのクローニングは、Ｃκドメインについて記載したようにして実施するが、プラスミドｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＳｆｉＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間で行う。
【０２０１】
得られたプラスミドを通称ｐＣκＣＨ１γ１とし、該プラスミドにより、Ｆａｂタイプの抗体フラグメント（図１２Ａ）の生産が可能となる。
ｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１（ｐＣκＣＨ１Ｈγ１） （図１０Ｂおよび１１）
ＳａｃＩＩおよびＳｆｉＩの間に含まれるＤＮＡフラグメントを、１対のオリゴヌクレオチド５’ＲＢＳ／３５‐ｓｕｐおよび３’ＲＢＳ／３５‐ｉｎｆを使用して新たなカセットに置き換えることによる、プラスミドｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳからのＦｌａｇ標識およびｃ−ｍｙｃ−６ｈｉｓＧＳ標識の除去
クローニングは、ＭＣＳＩの挿入について記述された条件に従って正確に実施する。得られた中間体プラスミドをｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳと称する。
【０２０２】
ｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳモチーフは、ＣＨ１Ｈγ１ドメインをｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳに再クローニングすることにより除去される。
１回のＰＣＲにより、５ｎｇのプラスミドｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳから、オリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１Ｈγ１−ＳＴＯＰを用いてＣＨ１Ｈγ１ドメインを増幅する。
【０２０３】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２０４】
【化１４】
【０２０５】
ＰＣＲフラグメントのクローニングは、上述のようにＳｆｉＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間で、ただしプラスミドｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳから実施する。
【０２０６】
得られたプラスミドを通称ｐＣκＣＨ１Ｈγ１とし、該プラスミドは、Ｆ（ａｂ’）２タイプの抗体フラグメント（図１２Ａ）の生産を可能にする。
ｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１ＨＣＨ２ＣＨ３γ１（ｐＭａｂγ１＊） （図１０Ｂおよび１１）
ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンの重鎖定常領域ＣＨ１、ヒンジ領域（Ｈ）および定常領域ＣＨ２およびＣＨ３の、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳへの挿入
ＰＣＲ１、２ａ、２ｂおよび３は、上述のＣＨ１ドメインの増幅と同じように、ただしオリゴヌクレオチド３’ＣＨ１γ１をオリゴヌクレオチド３’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３に置き換えて実施する。オリゴヌクレオチド３’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１を以下に示す：
【０２０７】
【化１５】
【０２０８】
クローニングは、ＣＨ１γドメインについて記述したように、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＳｆｉＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間で
行う。
【０２０９】
得られたプラスミドを通称ｐＭＡｂγ１＊とし、該プラスミドは、ｍＡｂ＊タイプの抗体フラグメント（図１２Ｂ）の生産を可能にする。
ｐ５５ＨＣＨ２ＣＨ３γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１−ＴＡＧ）
（図１０Ｂおよび１１）
ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンのヒンジ領域（Ｈ）ならびに定常領域ＣＨ２およびＣＨ３の、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＢｓｔＥＩＩ部位とＮｏｔＩ部位の間への挿入
逆転写はＣκについて記載したとおりに、ただしオリゴヌクレオチド３’ＮｏｔＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３を用いて行う。
【０２１０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２および４３の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２１１】
【化１６】
【０２１２】
ＲＴ後のＰＣＲは、１μｌのｃＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’ＢｓｔＥ２／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３および３’ＮｏｔＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【０２１３】
得られたプラスミドを通称ｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１−ＴＡＧとし、該プラスミドは、ＣＨ３の末端に標識を備えた（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプの抗体フラグメント（図１２Ｂ）の生産を可能にする。
【０２１４】
ｐ５５ＨＣＨ２ＣＨ３γ１（ｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１） （図１０Ｂおよび１１）
ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンのヒンジ領域（Ｈ）ならびに定常領域ＣＨ２およびＣＨ３の、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＢｓｔＥＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間への挿入
逆転写はＣκについて記載したとおりに、ただしオリゴヌクレオチド３’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３を使用して行う。
【０２１５】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４および４５の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２１６】
【化１７】
【０２１７】
ＲＴ後のＰＣＲは、１μｌのｃＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’ＢｓｔＥ２／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３および３’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【０２１８】
得られたプラスミドを通称ｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１とし、該プラスミドは、（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプの抗体フラグメント（図１２Ｂ）の生産を可能にする。
ＶＨＨのクローニング
種々のフォーマットにおいて、任意のＶＨＨをユニークな部位の間に導入可能である。
【０２１９】
Ｃκの上流：ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩ（またはＫｐｎｌ）の間、
ＣＨ１の上流：ＳｆｉＩとＮｈｅ１の間、
Ｈの上流：ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩ。
【０２２０】
このようにして、本発明者らは以下の５’および３’オリゴヌクレオチドの対を用いたＰＣＲによって種々のＶＨＨを増幅する。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４６〜５２の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２２１】
【化１８】
【０２２２】
生体特異抗体の生産、精製および特性解析
６ＨｉｓＧＳ標識を備えた種々の抗体フラグメントを、上述のように生産および精製する。標識のない抗体フラグメントの精製については、塩基に基づいたクロマトグラフィー工程を、抗体フラグメントの特性に応じた特性（陰イオンまたは陽イオン）のイオン交換カラムに置き換える。
【０２２３】
電気泳動ゲルを図１３に示す。Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２は、コバルトカラムとその後のプロテインＧカラムで精製する。その後、種々の抗体フラグメントをｓｕｐｅｒｄｅｘ（Ｒ）２００（またはｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でもよい）で分離する。
【０２２４】
ヒトＶＨの単離方法およびベクターの構築
方法の原理は、ヒトＶＨドメイン（ＬＦＢポケット試料からＲＴ−ＰＣＲによって単離
されたもの）を、プラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ−中にクローニングすることから成る（図１０Ａおよび１１）。このプラスミドには、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子が、発現不可能な読み枠として含まれている。ＶＨをクローニングすることによりアルカリホスファターゼの読み枠が回復し、アルカリホスファターゼの上流にＶＨが融合したものを生産することが可能となる（細菌ＴＧ１株にクローニングされたＶＨ−ＰｈｏＡバンク）。その後、種々のクローンを９６ウェルマイクロプレート中で作製し、該クローンの増殖速度を３０分ごとにマイクロプレートから直接測定する（ＯＤ６２０ｎｍ）。このようにして、増殖がＶＨの存在によって変化しないクローンを選択する。マイクロプレートから得たクローンを複製し、−８０℃に保存する。３７℃で２時間の誘導、または３０℃、２４℃もしくは１８℃などでの１６時間の誘導の後、増殖を停止させ、培地の上澄みから直接ホスファターゼ活性を測定する。ホスファターゼ活性は、各マイクロプレートのウェルに見出だされる細菌数と比例する。
【０２２５】
アルカリホスファターゼは、細菌ペリプラズム中に分泌される場合、ジスルフィド架橋が正確に形成された二量体の形態においてのみ活性を有する。この手法は、大部分の融合タンパク質ＶＨ−ＰｈｏＡを細菌培地中に分泌させて生産するクローンの選択を可能にする。このようにして、正確に複製され、かつジスルフィド架橋が正確に形成され、したがって可溶性のＶＨを選択することが可能である。選択されたＶＨは、ヒトＶＨのＣＤＲを前述のラマＶＨＨ由来のＣＤＲに交換するための母体として使用される。ＶＨは、そのＣＤＲ接合部のアミノ酸がＶＨＨのアミノ酸と同等のＶＨを選択することにより選ばれる。
【０２２６】
ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲの条件
ハイブリダイゼーション：
１μｌの全ＲＮＡ（第１．３．２項に記載の精製）を、１ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド（３’ＪＨ１−４−５；３’ＪＨ２；３’ＪＨ３および３’ＪＨ６の混合物）とともに最終容量８μｌとして７０℃で１０分間プレインキュベーションする。温度を徐々に（４５分間）３７℃まで低下させる。
【０２２７】
逆転写：
８μｌをとり、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎｅ（２０Ｕ）、３μｌの５×バッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ、インビトロゲン）、１μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）、２μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）を加え、５０℃で１０分間インキュベーションする。次に、０．７５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（１５０Ｕ）を加え、インキュベーションを５０℃で３０分間続け、さらに７０℃で１５分間行う。
【０２２８】
得られたｃＤＮＡを、ビーズ（ＢｉｏＭａｇ、カルボキシル結合型、ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて供給業者の推奨に従って精製する。最終的な溶離は１５μｌの１０ｍＭトリス・アセタートｐＨ７．８で実施する。
【０２２９】
ＰＣＲ１は、１μｌのｃＤＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲによって得られたもの）、１０ｐｍｏｌｅの５’オリゴヌクレオチド（以下に配列を示す５’オリゴヌクレオチド各０．６２５ｐｍｏｌｅ）および３’オリゴヌクレオチド（以下に配列を示す３’オリゴヌクレオチド各２．５ｐｍｏｌｅ）、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて実施する（９５℃、３分間；次いで９５℃、１分間；５８℃、１分間；７２℃、１分間；を３５サイクル、次いで７２℃、１０分間）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルに供し、ＶＨに相当するバンドを精製する（キアゲンのゲル抽出キット）。
【０２３０】
ＰＣＲ２は、１／１０００に希釈したＰＣＲ１を１μｌ、上記の同量のオリゴヌクレオチド、０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔを用いて、最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；次いで９４℃、１分間；７０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を４０サイ
クル、次いで７２℃、１０分間）。フラグメントを上述のように２％アガロースゲルから精製する。
【０２３１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５３〜７２の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２３２】
【化１９】
【０２３３】
種々の精製ＰＣＲフラグメントを、１０ＵのＮｃｏＩおよびＸｍａＩによって消化し、ライゲーションによってクローニングベクターｐ５５／ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ−に挿入する。ライゲーション混合物をＦｓｅＩで消化してから細菌を形質転換する。形質転換は、エレクトロコンピテントな細菌ＴＧ１を用いてエレクトロポレーションによって実施する。ＶＨドメインが挿入されたクローンではホスファターゼ活性が回復する（青色コロニー）。
【０２３４】
９６または３８４ウェルのマイクロプレートにおける生産：
対照：陰性対照の培地（２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン）、陰性対照のベクターｐ５５／ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ−、陽性対照のベクターｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−。
【０２３５】
１ウェル（Ｎｕｎｃｌｏｎ（ＴＭ）ｓｕｒｆａｃｅ、ヌンク（Ｎｕｎｃ））あたり１５０または４０μｌの培地（２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を分配する。各ウェルに、小楊枝または細胞用ピック（Ｑｐｉｘ）を用いて単離された青色コロニーを接種し、次いでプレートを無菌接着シートで密閉する。９００ｒｐｍで稼動するＩＥＭＳ（Ｒ）Ｔｈｅｒｍｏプレート・インキュベータ中に、３７℃または３０℃で１６時間置き、次に、９６または３８４ウェルのレプリケータを用いて、１５０または４０μｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリンが入ったマイクロプレートに前記「母親」マイクロプレートのレプリカを作製する。次いで、無菌接着シートで密閉する。（レプリカ作製後、「母親」マイクロプレートには１ウェルあたり３７．５または１０μｌの８０％のグリセロールを加え、−８０℃に保存する）。３時間の培養（ＯＤ ６２０ｎｍでおよそ０．５）の後に、終濃度１００μＭのＩＴＰＧを用いて１６時間誘導する。６２０ｎｍにおけるＯＤを誘導の終了時に測定する。
【０２３６】
アルカリホスファターゼ活性の分析：
培養物全体（細胞＋培地）を１０μｌ、培養上清（これについては９１０ｇで３分間遠心分離する）を１０μｌとる。各サンプルに、６５μｌの１０ｍＭトリス‐ＨＣｌ ｐＨ８．０を加え、また２５μｌのＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸、（ジエタノールアミンｐＨ９．８（ＨＣｌ）； ＭｇＣｌ２ ０．５ｍＭ）中に１ｍｇ／ｍｌ）を加える。撹拌しながら３０分間反応させた後、４０５ｎｍでＯＤを測定する。
【０２３７】
４０５ｎｍで測定されたアルカリホスファターゼ活性を、誘導の終了時に各ウェルに含まれていた細胞数（６２０ｎｍでのＯＤ測定値）で補正する。アルカリホスファターゼに融合したＶＨを発現するクローンのホスファターゼ活性をそれぞれ、陽性対照（ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−によって生産された非融合型のアルカリホスファターゼ）の活性と比較する。対照と同等またはより高い活性を有するクローンだけを考慮し、オリゴヌクレオチド５’ＥｃｏＲＩ−９０および３’ｉｎｆ−ＰｓｔＩ＋７１（３’ｉｎｆ−ＰｓｔＩ＋７１オリゴヌクレオチドの配列はＧＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＡＧＣＡＣＣＧ）を用いて配列決定する。
【０２３８】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】本発明によって単離された４つの抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（VHH ANTI-CD16 ）クローンのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３〜７６、１０３および１０４）ならびに４つの抗ＣＥＡ ＶＨＨ（VHH ANTI-CEA）クローンのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７７〜８０および１０５）を示す図。
【図２】本発明によって単離された４つの抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（VHH anti-CD16 ）クローンのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１〜８４、１０６および１０７）ならびに４つの抗ＣＥＡ ＶＨＨ（VHH anti-CEA）クローンのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８５〜８８および１０８）を示す図。
【図３】分析した８種のＶＨＨおよび対応する二重特異性抗体の特異性を実証するＦＡＣＳの結果を示す図。縦軸：細胞数、横軸：ＦＬ−１蛍光強度。（Gr anulocytes：顆粒球）
【図４】分析した８種のＶＨＨおよび対応する二重特異性抗体の特異性を実証するＦＡＣＳの結果を示す図。縦軸：細胞数、横軸：ＦＬ−１蛍光強度。（Granulocytes：顆粒球）
【図５】二重特異性抗体の細胞上への接近可能性を実証するＦＡＣＳの結果を示す図。縦軸：細胞数、横軸：ＦＬ−１蛍光強度。
【図６】２種の抗ＣＤ１６ ＶＨＨと抗ＣＤ１６モノクローナル抗体との間のＥＬＩＳＡによる競合テストの結果を示す図。
【図７】２種の抗ＣＤ１６ ＶＨＨと抗ＣＤ１６モノクローナル抗体との間のＦＡＣＳによる細胞上での競合プロファィルを示す図。縦軸：細胞数、横軸：ＦＬ−１蛍光強度。
【図８】２種の抗ＣＤ１６ ＶＨＨ、およびタイプＦ（ａｂ’）２の抗ＣＥＡ１７／抗ＣＤ１６ ｃ２１二重特異性抗体による、ＣＤ１６Ａの活性化の結果を示す図。
【図９】二重特異性抗体によって活性化されたナチュラルキラー細胞による細胞溶解の結果を示す図。
【図１０Ａ】本発明によるプラスミドの構築を示す図。
【図１０Ｂ】本発明によるプラスミドの構築を示す図。
【図１１】本発明のプラスミドの配列を示す図。
【図１２Ａ】Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、（ＨＣＨ２ＣＨ３）２およびｍＡｂ＊タイプの抗体フォーマットを示す図。
【図１２Ｂ】Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、（ＨＣＨ２ＣＨ３）２およびｍＡｂ＊タイプの抗体フォーマットを示す図。
【図１３】Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２タイプの抗体フラグメントを精製する種々の工程における該フラグメントの電気泳動ゲルを示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体フォーマットの生産およびそれらの免疫学的用途、より具体的には免疫療法および免疫診断における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、抗体分子は５つのクラス、すなわち：ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＡに属する免疫グロブリン（Ｉｇ）であると認識している。一般に、これらの分子は重鎖（Ｈ）と、κ鎖（κ）またはλ鎖（λ）のいずれかである軽鎖（Ｌ）とを含んでなる。
【０００３】
各クラスの免疫グロブリンは特定のタイプの重鎖、すなわちＩｇＭはμ鎖、ＩｇＧはγ鎖、ＩｇＤはδ鎖、ＩｇＥはε鎖、およびＩｇＡはα鎖を含む。
各鎖は、それぞれ内部にジスルフィド結合を備えたドメインより形成される。軽鎖は２つのドメインを有し、重鎖は４つのドメインを有する。各鎖のアミノ末端を含むドメインの配列は可変的であり（ＶＨおよびＶＬ領域）、他のドメインの配列は一定である（重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、ならびに軽鎖のＣＬ）。
【０００４】
可変領域Ｖは、ともに相補性を決定するＣＤＲと呼ばれる超可変配列の領域を含む。
重鎖では、最初の２つのドメイン（ＶＨ−ＣＨ１）に続いてヒンジ領域がある。免疫グロブリンでは、軽鎖はジスルフィド結合によって重鎖に接続されてヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマーがヒンジ領域でいくつかのジスルフィド結合によって同じヘテロダイマーに接続され、免疫グロブリンを形成する。ヒンジ領域のレベルでプロテアーゼにより分割すると、２つのフラグメント、すなわち：Ｆａｂフラグメント（ＶＬ−ＣＬおよびＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む、抗原を結合するドメイン）およびＦｃフラグメント（（ＣＨ２−ＣＨ３）２ドメインを含むエフェクタ・ドメイン）が得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、抗体フォーマットの生産およびそれらの免疫学的用途、より具体的には免疫療法および免疫診断における用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、より具体的には、抗体フラグメントおよびこれらのフラグメントから創出された種々の抗体フォーマット、特にキメラ化またはヒト化された、多重特異性または多価のうち少なくともいずれか一方である抗体について述べる。
【０００７】
本発明において「抗体フォーマット」とは、上述のタイプのドメインおよび領域の種々の組合せに相当する。
本発明者らは、用語「キメラ化抗体」により、動物起原のＶＨドメインがヒト免疫グロブリンの定常領域へ融合されたものを意味する。
【０００８】
本発明者らは、用語「ヒト化抗体」により、動物起原のＶＨから超可変領域（ＣＤＲ）が移植されたヒトのＶＨドメインが、ヒトＩｇの定常領域へ融合されたものを意味する。
これらの抗体は、所与の分子に対応する標的のエピトープを認識する。これらのエピトープは様々であり、異なる標的に属していても同じ標的に属していてもよい。よって用語「二重特異性抗体」とは、２つの異なる標的を結合する２つの異なるＶＨを備えたフォーマットを意味し、「二重エピトープ抗体」とは、同じ標的上の２つの異なるエピトープに
結合する２つの異なるＶＨを備えたフォーマットを意味する。
【０００９】
「価数」は、同じＶＨがそのフラグメント上で見つかる回数に相当する。
所定の標的に到達する抗体の認識特異性は、様々な疾病、特に腫瘍学上の診断および治療に使用されており、腫瘍学では、標的は腫瘍関連抗原でも、成長因子レセプターでも、がん遺伝子もしくは変異した「腫瘍抑制」遺伝子の産物でも、あるいは血管形成に関連した分子または非腫瘍細胞上で発現するが前駆細胞には存在しない（ＣＤ２０の場合のような）分子であってもよい。
【００１０】
２０年間以上の実験研究の後、モノクローナル抗体による腫瘍の免疫ターゲティングは現在では相当に発展している。
その結果として、種々の臨床研究の結果から、最近ではある種の抗体の治療上の可能性が実証されており、また該抗体がＦＤＡの承認を受け、また欧州でのＡＭＭを受けている。
【００１１】
こうした進展は、主にいわゆる「第二世代」の組換え抗体、すなわち：
− ヒト化抗体、例えば、ある種の乳癌の化学療法に使用される抗ＨＥＲ２／Ｎｅｕ抗体であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎｅ）、
− キメラ抗体、例えば、濾胞Ｂ細胞リンパ腫の治療に使用される抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）
の使用によるものである。
【００１２】
遺伝子工学によって、マウス抗体の可変領域または超可変領域をヒトのＩｇ分子上に「移植する」ことが可能である。
現在、新しい技術を用いて、ファージ上で発現させた（いわゆる「ファージディスプレイ」技術）ヒト可変ドメインの選択によって、あるいはヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの使用によって、完全なヒト抗体を得ることが可能である。
【００１３】
さらに、二重特異性抗体の概念は、免疫系を刺激することにより標的の腫瘍細胞とエフェクタ細胞との間の接触を容易にするために使用されてきた。この概念は、二重の特異性を賦与された抗体の構築にある。この抗体は、腫瘍細胞の表面で生産された分子（ＣＥＡ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＧＤ２など）と、免疫のエフェクタ細胞であるナチュラルキラー細胞、キラーＴ細胞もしくはＣＴＬ、多核性好中球、単球およびマクロファージの表面で発現された分子（Ｆｃ受容体など）を結合させることができなければならない。この戦略の変形は、腫瘍細胞の表面で生産された分子と、直接的または間接的な細胞毒性（放射性元素、毒素、プロドラッグ）を示す分子とを連結させる抗体の構築である。
【００１４】
今まで、ほとんどの二重特異性抗体は抗体の２つのフラグメントを生化学的にカップリングすることにより開発されたものである。しかしながら、この技術は、工業規模ではほとんど展開されていない。いくつかの二重特異性抗体、例えばｓｃＦｖタイプの二重特異性抗体（「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」）は、遺伝学的に開発されている。不運にも、該抗体は大腸菌で可溶性の形態で生産するのが依然難しく、またＡＤＣＣの点においてもあまり有効ではない。
【００１５】
免疫療法のための抗体フォーマットを生成し、特に多重特異性抗体を得るための候補抗体の探索において、本発明者らは、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ）に確認された軽鎖を有しない特異抗体（ハマース‐キャスターマン（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ）ら、１９９３年）に着目した。
【００１６】
一種類の抗原を特異的に認識するラクダ科由来の一本鎖重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨ
Ｈ）を、免疫した動物から選択し、プラスミド構築物から生産可能なキメラ化抗体あるいはヒト化抗体の様々なフォーマットを開発するために使用した。任意の他のＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨ、あるいはヒトＶＨの生産を可能にするために、様々なフォーマットが適合することが判明した。
【００１７】
本発明は、探索の対象となる標的およびエピトープを認識する特性を備えた、ＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨあるいはヒトＶＨドメインの全体のうち一部を含む抗体フォーマットを提供することを目的とする。
【００１８】
さらに本発明は、これらの様々な構築物の生産のための方法を提供することを目的とする。
別の態様によれば、本発明は、作製した利用可能な種々のフォーマットの免疫治療および免疫診断における適用を目的とする。
【００１９】
本発明はまた、ラクダ科、特にラマのＶＨＨおよび／またはヒトＶＨのドメインの一部または全体を、ヒト化抗体の定常領域に融合された状態で含む抗体フォーマットに関する。
【００２０】
本発明を達成する第１の手段によれば、抗体フォーマットはＦａｂタイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨドメインまたは２つのヒトＶＨドメイン、あるいはＶＨＨのＣＤＲが移植された２つのヒトＶＨドメインが結合し、該ドメインのうちの一方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣκまたはＣλに融合し、他方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣＨ１に融合していることを特徴とする。
【００２１】
本発明を達成する第２の手段によれば、抗体フォーマットはＦａｂ’タイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨドメインまたは２つのヒトＶＨドメイン、あるいはＶＨＨのＣＤＲが移植された２つのヒトＶＨドメインが結合し、該ドメインのうちの一方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣκまたはＣλに融合し、他方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣＨ１および後続するヒンジ領域Ｈに融合していることを特徴とする。
【００２２】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットは、単一特異性／二価、二重特異性／一価、および二重エピトープ性／一価のタイプである。
本発明を達成する第３の手段によれば、抗体フォーマットはＦ（ａｂ’）２タイプであり、上に定義されるようなＦａｂ’タイプが２つ結合したものとして特徴づけられる。
【００２３】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットは、ヒト免疫グロブリン由来のヒンジ領域Ｈを有するため、単一特異性／四価、二重特異性／二価、および二重エピトープ性／二価の組合せが可能である。
【００２４】
本発明を達成する第４の手段によれば、抗体フォーマットはＦ（ａｂ’）２タイプであり、上記のＦ（ａｂ’）２タイプのフォーマットの還元によって得られた２つのＦａｂ’が結合したものとして特徴づけられる。
【００２５】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットは、ヒト免疫グロブリン由来のヒンジ領域Ｈを有するため、単一特異性／四価から四重特異性／一価または四重エピトープ性／一価まで、その中間の可能な組合せを全て含んだ組合せが可能である。
【００２６】
本発明を達成する第５の手段によれば、抗体フォーマットは（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプ（Ｈはヒト免疫グロブリンのヒンジ領域を表し、ＣＨ２およびＣＨ３はヒトＩｇ重鎖の二番目および三番目の定常領域を表す）であり、２つの同一のＶＨＨまたはヒトＶＨ、あ
るいはＶＨＨの超可変領域が移植された２つのヒトＶＨが結合したものであって、各々がヒトＩｇのＨ−ＣＨ２−ＣＨ３領域で融合されていることを特徴とする。
【００２７】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットにより、単一特異性／二価の組合せが可能である。
本発明を達成する第６の手段によれば、抗体フォーマットは、ｍＡｂ＊タイプ（このタイプは、元の可変ドメインがＶＨＨもしくはヒト化ＶＨＨ、またはヒトＶＨドメインの全体または一部で置き換えられて、ヒト抗体の定常領域と融合されているものを指す）であり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨまたは２つのヒトＶＨ、あるいはＶＨＨの超可変領域が移植された２つのヒトＶＨが結合したものであって、一方がヒトのＣκまたはＣλ領域に融合し、他方がヒトＩｇのＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に融合していることを特徴とする。
【００２８】
これらのキメラ化またはヒト化抗体フォーマットにより、単一特異性／四価でおよび二重特異性／二価および二重エピトープ性／二価の組合せが可能である。
これらの種々のフォーマットでは、免疫グロブリンは、ヒトのアイソフォームＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に相当するＩｇＧ、あるいはアイソフォームＩｇＡ１、ＩｇＡ２に相当するＩｇＡ、あるいはその他のヒトＩｇである。
【００２９】
ＶＨＨは、ヒトＶＨで置き換えられてもよいし、またはＶＨＨからヒトＶＨ上へのＣＤＲの移植によるヒト化ＶＨＨで置き換えられてもよい。
本発明を達成する上記手段の例では、ＶＨＨは、ラクダ科、特にラマ由来のＶＨＨ抗体のフラグメントに相当するかまたは該フラグメントを含む。特に該ＶＨＨは、抗癌胎児性抗原（略して抗ＣＥＡ）抗体フラグメントまたは抗ＦｃγＲＩＩＩレセプター（略して抗ＣＤ１６）抗体フラグメントの一部または全体で構成されるという点で特徴的なフラグメントを含む。
【００３０】
抗ＣＥＡ抗体フラグメントは、より具体的には、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．（配列番号）７７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０５の配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に従うものである。
【００３１】
好ましい形態における抗ＣＤ１６抗体フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０４の配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に相当する。
【００３２】
これらのフラグメントは新たな産物を形成し、このように本発明の範囲内にある。
本発明は、これらのＶＨＨフラグメントのＣＤＲも含む。
本発明は、免疫療法または免疫診断のための、キメラ化またはヒト化された多重特異性および／または多価抗体を生産する方法も含み、該方法は上記に定義された抗体フォーマットの使用を含むことを特徴とする。
【００３３】
本発明は具体的には、抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ラクダ科ＶＨＨ、特にラマＶＨＨを含む上記フォーマットの方法を目指す。
より具体的には、本発明は、抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ＶＨＨの可変ドメインであって、
− ラクダ科動物、特にラマを、免疫原としてＣＥＡまたはＣＤ１６を用いて免疫することと、
− 血液から得られたＢリンパ球を精製することと、
− ＶＨＨバンクを構築することと、
− 該バンクからＶＨＨを単離することと
を含むプロトコールによって有利に生産されたものを指す。前記バンクの構築は：
− Ｂリンパ球からの全ＲＮＡの抽出と、
− 対応するｃＤＮＡを得るためのＲＮＡの逆転写と、
− 一本鎖重鎖の抗ＣＤ１６および抗ＣＥＡ抗体の可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲによる増幅と、
− ファージミドで増幅させたＤＮＡの酵素切断によって得られたＶＨＨ ＤＮＡフラグメントのライゲーションと
を含む。
【００３４】
ＶＨＨはファージディスプレイ技術によってバンクから単離され、精製される。
抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨの前記可変ドメインは、
− ラクダ科動物、特にラマを、免疫原としてＣＥＡまたはＣＤ１６を用いて免疫することと、
− 血液から回収されたＢリンパ球を精製することと、
− ＶＨＨバンクを構築することと、
− 該バンクからＶＨＨを単離することと
を含むプロトコールによって有利に生産される。
【００３５】
有利な方法において、前記バンクの構築は：
− Ｂリンパ球からの全ＲＮＡの抽出と、
− 対応するｃＤＮＡを得るためのＲＮＡの逆転写と、
− 一本鎖重鎖の抗ＣＤ１６および抗ＣＥＡ抗体の可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲによる増幅と、
− ファージミドで増幅させたＤＮＡの酵素切断によって得られたＶＨＨ ＤＮＡフラグメントのライゲーションと
を含む。
【００３６】
ＶＨＨはファージディスプレイ技術によってバンクから単離され、精製される。
種々のＶＨＨについて、実施例に例証するようにして特異性および親和性について検証した。
【００３７】
本発明によれば、次いで、選択されたＶＨＨの遺伝子を発現ベクター、特にプラスミドに導入し、種々の多重特異性および／または多価（抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６）キメラ化抗体であって、表面にＣＥＡを発現している腫瘍細胞に結合し、かつＣＤ１６を発現する免疫系由来のエフェクタ細胞（単球、マクロファージ、ＮＫ、多核性好中球など）を動員することのできる抗体を生産する。
【００３８】
本発明はまた、上記に定義された抗体フォーマットの発現ベクターにも言及する。
より具体的には本発明は、発現ベクター、特にプラスミドに言及し、該発現ベクターは２つのユニークな制限酵素切断部位の間に、プロモータと、シグナル配列と、上記に定義されたＶＨＨドメイン、ヒトＩｇの定常領域をコードしうる、またはヒトＶＨドメイン、ＶＨＨのＣＤＲ領域、ヒトＩｇの定常領域をコードしうるヌクレオチド配列とを含んでいる。
【００３９】
本発明によるプラスミドは、上記に定義された抗体フォーマットを細菌において可溶性の形態で大量に発現することが可能であり、抗体ドメインをコードする領域は、原核生物または真核生物の他の発現システムにも容易に移入可能である。
【００４０】
したがって、本発明は、上記に定義された抗体フォーマットを達成するための第１の手段によるＦａｂタイプの抗体の生産を可能にするプラスミドｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１２）およびｐＣκＣＨ１γ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１００およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１４）に言及する。
【００４１】
これらのプラスミドは、より具体的には、プラスミドｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９４およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１０）の中に、Ｉｇの軽鎖Ｃκおよび重鎖定常領域ＣＨ１をコードするヌクレオチド配列が挿入されたものとして特徴づけられる。
【００４２】
本発明はまた、上記に定義された抗体フォーマットを達成するための第２、第３および第４の手段によるＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）２タイプの抗体の生産を可能にするプラスミドｐＣκＣＨ１Ｈγｌ−ＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９９およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１３）およびｐＣκＣＨ１Ｈγｌ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０１およびＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１１５）にも関する。
【００４３】
これらのプラスミドは、より具体的には、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１１）の中に、Ｉｇの重鎖ＣＨ１およびヒンジ領域（Ｈ）をコードするヌクレオチド配列が挿入されたものとして特徴づけられる。
【００４４】
本発明はさらに、上記に定義された抗体フォーマットを達成するための第５の手段による（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプの抗体の生産を可能にするプラスミドｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１−ＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９５）およびｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９６）にも言及する。
【００４５】
これらのプラスミドは、より具体的には、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳの中に、Ｉｇのヒンジ領域（Ｈ）ならびに定常領域ＣＨ２およびＣＨ３をコードするヌクレオチド配列が挿入されたものとして特徴づけられる。
【００４６】
本発明はまた、本発明を達成するための第６の手段によるｍＡｂ＊タイプの抗体の生産を可能にするプラスミドｐＭａｂγｌ＊（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０２およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１６）にも言及する。
【００４７】
このプラスミドは、より具体的には、ｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧの中に、Ｉｇの重鎖定常領域ＣＨ１、ヒンジ領域および定常領域ＣＨ２およびＣＨ３をコードするヌクレオチド配列が挿入されたものとして特徴づけられる。
【００４８】
これらのプラスミドの略図を図１０Ｂに、そのヌクレオチド配列を図１１に示す。上記プラスミドの構築に使用された中間体プラスミドも本発明の範囲内にある。より具体的には、上記に定義されたプラスミドを開発するために構築された、プラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８９）、ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９０）、ｐ５５／ＭＣＳ１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９２）、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０９）、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９４およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１０）およびｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＥＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１１）が含まれる。
【００４９】
これらのプラスミド中のＩｇのドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｈは、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはＩｇＡ、またはその他のＩｇに属する。
ＶＨＨまたはヒトＶＨをコードする遺伝子を、種々のプラスミドのユニークな部位の間に導入する。これらの遺伝子を、ＶＨＨのＣＤＲをヒトＶＨ上に移植することによりヒト化ＶＨＨをコードする遺伝子に置き換えてもよい。
【００５０】
より一般的には、本発明によって使用されるプラスミドは、抗ＣＥＡまたは抗ＣＤ１６ＶＨＨ以外のＶＨＨ、他のヒトＶＨ、あるいは他のヒト化ＶＨＨであって任意の分子上に結合しうるものをコードするヌクレオチド配列を含むように設計可能である。
【００５１】
本発明はさらに、プラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ−（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．９１）に関し、該プラスミドは、図１０Ａおよび１１の略図に従ってアルカリホスファターゼに融合したヒトＶＨドメインを生産するためのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００５２】
免疫グロブリン重鎖の可変領域ヒトフラグメント（ＶＨ）を選択し、かつ該フラグメントが最も良好に生産され最も良く分泌されるクローンを分離するための方法が開発されている。
【００５３】
有利には、これらのヒトＶＨを、可変領域をヒト化するために、予め選択されたＶＨＨからＣＤＲを移植するための母体として使用する。
上記に定義された抗体フォーマットは、免疫療法および免疫診断において非常に興味深いものである。該抗体フォーマットは、異なる分子を認識し、または同じ分子上の２つの異なるエピトープに結合することが可能であり、さらに、従来の抗体によって認識されない新しいエピトープにアクセスすることも可能である。該抗体フォーマットはヒト化することも可能であり、ヒト化することにより、ヒトに注射された後の免疫原性が低い抗体を得るという有利な見通しが得られることになる。該抗体フォーマットが可溶形態で得られるという事実は、これらの抗体のさらなる興味深い特性である。免疫診断および免疫療法における該抗体フォーマットの適用も本発明の一部である。
【００５４】
本発明のその他の特性および利点は以下の実施例において提示される。該実施例では図１〜１３が参照される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
実施例１
ラマの免疫化、血清の抗体価測定およびＢリンパ球の精製
ヒト組換えレセプターＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）の細胞外領域で雌のラマを免疫化した（タイロード シー（Ｔｅｉｌｌａｕｄ Ｃ）ら、１９９３を参照）。
【００５６】
ヒト組換え癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の細胞外領域で雄のラマを免疫化した（タースキク（Ｔｅｒｓｋｉｋｈ）らの文献（１９９３）およびタースキク（Ｔｅｒｓｋｉｋｈ）らの特許文献（１９９３）を参照）。
【００５７】
各５００μｇの免疫原で動物を毎月免疫化した。１００ｍｌの血液を各免除化の１５日後に採取した。得られた各サンプルについて、血清および精製抗体（ＩｇＧ１、２および３）の抗体価測定を実施し、種々の免疫原に対する抗体の存在を検出した。その後、Ｂリンパ球をＦｉｃｏｌｌ（Ｒ）の勾配（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｒ）−１０７７、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で精製し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。
【００５８】
ＶＨＨバンクの構築：全ＲＮＡの精製、逆転写、ＰＣＲ１、ＰＣＲ２およびファージミ
ドｐＨｅｎ１へのクローニング
ＶＨＨバンクの構築：
全ＲＮＡの精製：
Ｂリンパ球の全ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアナートを使用する方法によって抽出する（チョムツィンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）およびサッキ（Ｓａｃｃｈｉ）、１９８７年参照）。酸性媒体中でフェノール／クロロホルム抽出した後、全ＲＮＡをエタノールで沈殿させる。ＲＮＡの品質および定量は１％アガロースゲル上で評価する。その後、逆転写によってｃＤＮＡに変換する。
【００５９】
逆転写およびＰＣＲ：
使用したＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１〜９の配列のオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。
【００６０】
【化１】
【００６１】
５μｇの全ＲＮＡを、１ｐｍｏｌｅ（ピコモル）のオリゴヌクレオチド３’ＣＨ２ＦＯＲＴＡ４（アルバビ ガーロウディ（Ａｒｂａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ）ら、１９９７年）またはラマＩｇＧの一本鎖重鎖のＣＨ２ドメインに特異的なＣＨ２−２とハイブリダイズさせ、１５０Ｕのｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（Ｒ）ＩＩ（ＢＲＬ）を用いて５０℃で３０分間逆転写する。ＩｇＧ２および３のヒンジ領域の特異的オリゴヌクレオチドである３’ＲＣ−ＩｇＧ２および３’ＲＣ−ＩｇＧ３も使用可能である。一本鎖ｃＤＮＡをビーズ（ＢｉｏＭａｇ（Ｒ）カルボキシルターミネータ、ポリサイエンス・インコーポレイテッド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ））で精製し、１７μｌの１０ｍＭトリス・アセタートｐＨ７．８で溶出させる。
【００６２】
ＰＣＲ１の条件：
４μｌのｃＤＮＡを、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅ（ＴＭ）Ｅｘｔｅｎｄ ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ））、１０ｐｍｏｌｅの同じプライマー３’ＣＨ２ＦＯＲＴＡ４またはＣＨ２−２、および１０ｐｍｏｌｅの、ヒトＩｇＧのＶＨドメインに特異的な４種のプライマー５’ＶＨ１−４ Ｓｆｉを用いて、容量５０μｌ中でＰＣＲによって増幅させる（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１分間；を３７サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【００６３】
３つのＤＮＡフラグメントが増幅され、１つはＩｇＧ１のＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２ドメインをコードする約９００ｂｐのフラグメント；２つはＩｇＧ２および３のＶＨＨ−ＣＨ２ドメインをコードする約６００ｂｐのフラグメントである。
【００６４】
ＰＣＲ２の条件：
前記６００ｂｐのフラグメントを１％アガロースゲルで精製し（「Ｑｉａｑｕｉｃｋ（Ｒ）ゲル抽出」キット、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、次いで１ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｒ）（バイオラボ（Ｂｉｏｌａｂｓ））、ならびにヒトＩｇＧのＶＨドメインに特異的な４つのプライマー５’ＶＨ１−４ Ｓｆｉ １０ｐｍｏｌｅおよび３’ＶＨＨ−ＮｏｔＩプライマー１０ｐｍｏｌｅを用いてＰＣＲによって増幅させる（９４℃、３分間；９４℃、４５秒；６５℃、４５秒；７２℃、４５秒；を１５サイクル、次いで、９４℃、４５秒；６０℃、４５秒；７２℃、４５秒；をさらに１５サイクル、その後７２℃、１０分間）。
【００６５】
ＶＨＨをコードする約４００ｂｐのフラグメントを、１％アガロースゲルで精製し（「Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出」キット、キアゲン）、回収し、エタノールで沈殿させる。次いで該フラグメントを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ、あるいはＢｇｌＩおよびＮｏｔＩ（バイオラボ）で切断して、ファージミドｐＨｅｎ１（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら、１９９１参照）のＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ部位、あるいはＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングする。
【００６６】
ベクターの準備：
２０μｇのファージミドｐＨｅｎ１を、容量３００μｌ中で、５０ＵのＳｆｉＩを用いてＢＳＡ存在下にて５０℃で１６時間；あるいは５０ＵのＮｃｏＩを用いてＢＳＡ存在下にて３７℃で１６時間消化する。直線状となったファージミドを０．７％アガロースゲルで精製する（「Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出」キット、キアゲン）。溶出させたＤＮＡを、次に、容量２００μｌ中で５０ＵのＮｏｔＩを用いて３７℃で１６時間切断する。酵素を６５℃で１５分間加熱して失活させ、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出してエタノールで沈殿させる。切断したｐＨｅｎ１を０．７％アガロースゲルで確認し、定量し、２００ｎｇ／μｌに調節する。
【００６７】
ＶＨＨ ＤＮＡフラグメントの準備：
５μｇのＶＨＨフラグメントを、容量３００μｌ中で、５０ＵのＢｇｌＩおよびＮｏｔＩを用いてＢＳＡ存在下にて３７℃で１６時間；あるいは５０ＵのＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いてＢＳＡ存在下にて３７℃で１６時間切断する。酵素を６５℃で１５分間変性させ；その後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、１０μｇのグリコーゲン（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））存在下にてエタノールで沈殿させる。ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩによって切断したＶＨＨフラグメントを１％アガロースゲルで精製し、次に２％アガロースゲルで確認し、定量し、１００ｎｇ／μｌに調節する。
【００６８】
ライゲーション：
ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩによって消化した１５０ｎｇのｐＨｅｎ１を、ＢｇｌＩおよびＮｏｔＩによって消化した６０ｎｇのＶＨＨフラグメントと、容量２０μｌ中で、２００
０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）を用いて１６℃で１７時間ライゲーションする。
【００６９】
リガーゼを６５℃で１５分間不活性化し、ライゲーション産物を２０ＵのＸｈｏＩ（バイオラボ）で３７℃にて４時間切断し、連結されずに残ったベクターを除去する。こうして６種のライゲーションを実施する。その後、ライゲーション産物を２本のチューブに回収し、フェノール／クロロホルムで抽出し、１０μｇのグリコーゲンの存在下で沈殿させ、２×１８μｌの超高純度Ｈ２Ｏに溶解させる。２μｌをエレクトロポレーションに使用する。
【００７０】
雄のラマ由来のＶＨＨバンク（参照番号：０８０１０１）は５．４ １０６クローンに相当し、雌のラマ由来のＶＨＨバンク（参照番号：０１０３０１）は１０６クローンに相当する。
【００７１】
ファージディスプレイ技術によるバンクからのＶＨＨの単離
抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨの選択：
種々のＶＨＨをファージディスプレイ技術によって単離する。
【００７２】
ファージバンクの作製：
バンク０８０１０１または０１０３０１（ファージミドで形質転換したＴＧ１細胞）からのストック１０μｌを、５０ｍｌの（２ＴＹ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２％グルコース）に接種し、ＯＤ６００が０．５になるまで３７℃でインキュベートする。その後、５ｍｌの培養物を、５ｍｌのＭ１３ＫＯ７（１０１３ｐｆｕ／ｍｌ）を用いて３７℃で３０分間、撹拌せずに感染させる。遠心分離の後、ファージ堆積物を２５ｍｌの（２ＴＹ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン）に入れる。この培養物を撹拌しながら３０℃で１６時間インキュベートする。その後、１／５容の２．５Ｍ ＮａＣｌ／２０％ＰＥＧ６０００でファージを沈殿させ、ＰＢＳ中で２５倍に濃縮する。
【００７３】
ＶＨＨの選択：
ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）Ｍ−２８０、ダイナル（Ｄｙｎａｌ））２００μｌを、１ｍｌの２％ミルク／ＰＢＳを用いて周囲温度で４５分間、回転式振とう器で撹拌しながら平衡化する。上記生成物からの１０１２個のファージについても、２％ミルク／ＰＢＳを用いて最終容量５００μｌ中で、周囲温度で６０分間、回転式振とう器で撹拌しながら平衡化する。
【００７４】
ビーズを磁石で圧縮し、２５０μｌの２％ミルク／ＰＢＳに再懸濁させ、２００μｌのビオチン化抗原とともに周囲温度で３０分間、回転式振とう器でインキュベートする。それぞれ終濃度１５０、７５および２５ｎＭのビオチン化抗原を、第１、第２および第３回目に使用する。
【００７５】
ビーズ／ビオチン化抗原４５０μｌをとり、ファージ５００μｌを加えて周囲温度で３時間、回転式振とう器で撹拌しながら処理する。このビーズ／ビオチン化抗原／ファージ混合物を、８００μｌの４％ミルク−ＰＢＳで５回洗浄し、次いで新しいエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに移す。８００μｌのＰＢＳ−０．１％トゥイーンでさらに５回の洗浄を行い、次いで混合物を別のエッペンドルフチューブに移す。最後に、８００μｌのＰＢＳで５回洗浄する。
【００７６】
ビーズ／ビオチン化抗原上に結合した抗体ファージを２００μｌのＰＢＳで再懸濁させ、線毛にファージが結合するようにコンピテント状態にした１ｍｌのＴＧ１（コンピテントセル：２ＹＴで一晩培養したＴＧ１培養物から１／１００希釈物を作製し、５０ｍｌの
２ＹＴに植菌してＯＤ６００が０．５付近になるまで３７℃で撹拌する）と共に、撹拌せずに３７℃で３０分間インキュベートする。各選択作業において、ファージを計数し、さらなる選択のために増幅させる。
【００７７】
選択物の計数：
ファージ（上記参照）でトランスフェクトされたＴＧ１細胞１μｌの１０−２〜１０−５希釈物を、２ＹＴで作製する。各希釈物の１、１０および１００μｌを、ペトリ皿（２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコース）に広げる。該ペトリ皿を３０℃で１６時間インキュベートする。
【００７８】
コロニー単離のための選択物の播種：
５ｍｌのトランスフェクトされたＴＧ１を３０００ｇで１０分間遠心分離して細胞を集め、沈殿物を１ｍｌの２ＹＴに懸濁させる。１枚のペトリ皿（１２ｃｍ×１２ｃｍ）（２ＴＹ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコース）当たり２５０μｌを使用し、３０℃で１６時間インキュベートする。
【００７９】
この方法を使用して、次のＶＨＨが単離された。すなわち：４つの抗ＣＥＡ ＶＨＨ（クローン：３、１７、２５、４３）および４つの抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（クローン：ｃ１３、ｃ２１、ｃ２８、ｃ７２）が得られた。これらのアミノ酸およびヌクレオチド配列を図１および２に示す。
【００８０】
ＶＨＨおよび二重特異性抗体の再クローニング、生産および精製
ＶＨＨのクローニング：
ＶＨＨを、プラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−（構造は第１．３．６項に記載、図１０Ａおよび１１を参照）の制限酵素ＳｆｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの切断部位の間にクローニングした。
【００８１】
ＰＣＲ条件：
５０ｎｇのＶＨＨを、１ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ（バイオラボ）、１０ｐｍｏｌｅのプライマー５’ｐＪＦ−ＶＨ３−Ｓｆｉおよび３’ｃｍｙｃ−６Ｈｉｓ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて、５０μｌの最終容量でＰＣＲにて増幅した（９４℃、３分間；９４℃、４５秒；５２℃、４５秒；７２℃、４５秒；で３０サイクル、その後、７２℃、５分間）。
【００８２】
次のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１の配列のオリゴヌクレオチドを使用する：
【００８３】
【化２】
【００８４】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製し（「Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出」キット、キアゲン）、２０ＵのＢｇｌＩおよび２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩ（バイオラボ）を用いて３７
℃で１６時間切断処理する。１０μｇのｐ５５ＰｈｏＡ／ＮＡＢ−を、最初に５０ＵのＳｆｉＩで５０℃にて１６時間、次いで２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩで３７℃にて１２時間切断処理する。切断産物（ベクターおよびＰＣＲフラグメント）をエタノール中で沈殿させる。このＤＮＡを２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、０．７％アガロースゲルで定量する。
【００８５】
ライゲーションは、２００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ、ＳｆｉＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した５０ｎｇのｐ５５ＰｈｏＡ／ＮＡＢ−、ならびにＢｇｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した１０ｎｇのＰＣＲフラグメントを用いて、容量２０μｌとして１６℃で１６時間実施する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを６５℃で１５分間不活性化させた後、１０ＵのＸｈｏＩを用いた３７℃で２時間の酵素消化によって非組換えベクターを除去する。
【００８６】
ライゲーション反応物による形質転換およびいくつかの組換えコロニーの分析の後、目的のＶＨＨを大腸菌中で生産させる。
ＶＨＨの生産：
単離されたコロニーを、３ｍｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコース中に接種し、撹拌しながら３７℃でインキュベートする。次いで５０ｍｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコースに上記培養物の希釈物を植え、撹拌しながら３０℃で１６時間インキュベートする。４００ｍｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリンにＯＤ６００として０．１ユニット相当物を植え、ＯＤ６００が０．５〜０．７になるまで撹拌しながら３０℃でインキュベートする。その後、該培養物を、４００μｌのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で終濃度０．１ｍＭとして誘導し、３０℃で１６時間培養する。
【００８７】
二重特異性抗体の生産：
大腸菌株ＤＨ５αをプラスミドで形質転換して得られた単離コロニーを、３ｍｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコースに接種し、撹拌しながら３０℃でインキュベートする。その後、５０ｍｌのＬＢ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン／２％グルコースに先述の培養物の希釈物を植え、撹拌しながら３０℃で１６時間インキュベートする。４００ｍｌのＬＢ／１００μｇ／ｍｌアンピシリンにＯＤ６００として０．１ユニット相当物を接種し、撹拌しながら３０℃で２．５時間インキュベートし、次にＯＤ６００が０．５〜０．７になるまで撹拌しながら２０℃でインキュベートする。その後、該培養物を、４００μｌのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で終濃度０．１ｍＭとして誘導し、２０℃で７２時間培養する。
【００８８】
ペリプラズムの可溶性画分の抽出：
ＶＨＨまたは二重特異性抗体を生産するために用いた培養物を、４２００ｇ、４℃で４０分間遠心分離する。沈殿物を、４ｍｌの氷結ＴＥＳ（０．２Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；０．５Ｍスクロース）中に取る。その後、リゾチーム（ＴＥＳ中に１０ｍｇ／ｍｌ、新たに調製したもの）１６０μｌを加え、次いでＨ２Ｏ中１／２に希釈した２４ｍｌの冷ＴＥＳを加える。該混合物を氷中で３０分間インキュベートする。
【００８９】
４２００ｇ、４℃で４０分間の遠心分離の後に、上清を回収し（ペリプラズム画分に相当）、１５０μｌのＤＮＡｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）および終濃度５ｍＭのＭｇＣｌ２を添加し、周囲温度で３０分間処理する。該溶液を、平衡化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０）に対して１６時間透析する。
【００９０】
ＶＨＨの精製：
カラム（ＢＤ ＴＡＬＯＮ（ＴＭ）金属親和性カラム（ＢＤバイオサイエンシズクロンテック（BD Biosciences Clontech ））を平衡化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムお
よび０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．０）で平衡化する。ペリプラズム画分をカラムに載せる。５倍容量の平衡化バッファーでカラムを洗浄した後に、ＶＨＨをｐＨ勾配またはイミダゾール（平衡化バッファーｐＨ７．０と５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５．０との間の勾配あるいは２００ｍＭイミダゾール溶液）によって溶出させる。各フラクションをクマシーブルーで染色してからＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（１５％アクリルアミド）で確認する。目的のフラクションを合わせてＰＢＳに対して透析する。ＶＨＨをメンブレン（アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）５０００ＭＷＣＯ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で濃縮し、バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）のタンパク質アッセイキットを使用してローリー（Ｌｏｗｒｙ）の熱量測定法で分析する。
【００９１】
二重特異性抗体の精製：
二重特異性抗体は、ペリプラズム画分（「ペリプラズムの可溶性画分の抽出」を参照されたい）から２ステップで精製する。最初にＢＤ ＴＡＬＯＮカラム（「ＶＨＨの精製」を参照）、その後プロテインＧ（ＨｉＴｒａｐ（ＴＭ）プロテインＧ ５ｍｌ、アマシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。
【００９２】
「ＨｉＴｒａｐプロテインＧ」カラムをＰＢＳ（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．６７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．２ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．７６ｍＭ ｐＨ７．４）で平衡化する。ＢＤ ＴＡＬＯＮカラム上で溶出させ、ＰＢＳに対して透析したタンパク質をプロテインＧに載せる。５倍容のＰＢＳでカラムを洗浄した後で、二重特異性抗体を０．１ＭグリシンｐＨ２．７で溶出させてから１Ｍのｈｅｐｅｓ ｐＨ８で緩衝化する。ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（１０％アクリルアミド）で確認した後、二重特異性抗体を０．１×ＰＢＳ中で透析し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥して１０倍に濃縮する。最後に、ＰＢＳで平衡化したＴｒｉｃｏｒｎ（ＴＭ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（ＴＭ）２００ １０／３００
ＧＬカラム（アマシャム・バイオサイエンシズ）でＦ（ａｂ’）２をＦａｂ’から分離する。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｒ）、免疫蛍光法（フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ）およびＣＤ１６の活性化試験によるＶＨＨおよび二重特異性抗体の機能的な特性解析
ＥＬＩＳＡによる抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６抗体の特性解析：
ファージ−ＶＨＨのＥＬＩＳＡ：
５μｇ／ｍｌのビオチン化抗原（ＣＥＡまたはＣＤ１６）を、予め２％ミルク−ＰＢＳで飽和させたストレプトアビジンプレート（ＢｉｏＢｉｎｄ（ＴＭ）Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ストレプトアビジンコーティング型、サーモラボシステム（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ））に結合させる。５×１０１０ファージ‐抗体を抗原に接触させる。抗原／抗体結合を、ファージのタンパク質Ｐ８に対するモノクローナル抗体（ＨＲＰ／抗Ｍ１３モノクローナル抗体コンジュゲート、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を含むＥＬＩＳＡによって検出する。２０ｍｌの検出バッファー（１８ｍｌのＰＢＳ、１ｍｌの１Ｍクエン酸、１ｍｌの１Ｍクエン酸ナトリウム、１０ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２）に、基質として１０ｍｇのＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾ−チアゾリン−６−スルホン酸、ジアンモニウム塩）を添加して、４０５ｎｍ（テカン（Ｔｅｃａｎ））で反応を読みとる。
【００９４】
ＶＨＨのＥＬＩＳＡ：
５μｇ／ｍｌビオチン化抗体を、予め２％ミルク−ＰＢＳで飽和させたストレプトアビジンプレート（ＢｉｏＢｉｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ストレプトアビジンコーティング型、サーモラボシステム）に結合させる。各ＶＨＨ（０．００１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）をマイクロウェル中に吸着させた抗原に結合させる。この結合を、１／１０００に希釈したｃ−ｍｙｃラベルに対するモノクローナル抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎ
ｃ））と、１／５０００に希釈した抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体ペルオキシダーゼ連結物（参照番号５５５５６、ＩＣＮ）とを用いて、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩）、ロッシュ）の存在下で検出する。
【００９５】
二重特異性抗体のＥＬＩＳＡ：
１０μｇ／ｍｌの抗原（ｒｈＣＤ１６またはｒｈＣＥＡ）を用いて、ＭａｘｉＳｏｒｐ（ＴＭ）プレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））を受動的にコーティングする。ＰＢＳ／４％ミルク中でプレートを飽和させた後、該マイクロウェル中に吸着した抗原に、二重特異性抗体（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ）（８００〜０．４ｎＭ）を結合させる。結合を以下のいずれかの条件で検出する：
− １／５０００に希釈したＦｌａｇタグに対するモノクローナル抗体（抗ＦｌａｇＭ２ ｍＡＢ、シグマ）と、１／５０００に希釈した抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体アルカリホスファターゼ連結物（参照番号１１５−０５５−００３（ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））とを用いて、ＤＮＰＰ（４‐ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物）の存在下。
【００９６】
− １／５００に希釈したｃ−ｍｙｃタグに対するモノクローナル抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー）と、１／５０００に希釈した抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体アルカリホスファターゼ連結物（参照番号１１５−０５５−００３（ジャクソン・イムノリサーチ））とを用いて、ＤＮＰＰの存在下。
【００９７】
− １／５００に希釈した抗ヒト軽鎖（κ）ヤギポリクローナル抗体アルカリホスファターゼ連結物（参照番号２０６０−０４、サザンバイオテク（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ））を用いて、ＤＮＰＰの存在下。
【００９８】
ＶＨＨ ＣＤ１６ ｃ２１がマイクロウェル中に吸着したｒｈＣＤ１６に結合したときの、ＶＨＨ ＣＥＡ１７の接近可能性を、ビオチン化ｒｈＣＥＡおよび１／５００希釈されたストレプトアビジン・アルカリホスファターゼ連結物（ＤＡＫＯ（カタログ番号Ｄ０３９６））を用いて実証する。
【００９９】
Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｒ）による抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６抗体の結合定数：
ＢＩＡＣＯＲＥは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の原理を用いて、分子を標識することなく分子間の相互作用をリアルタイムでモニターする。相互作用のパートナーのうちの一方は共有結合によりバイオセンサ上に固定化され、他方は連続的な流れの中に注入される。ＳＰＲによる検出の原理は、分子複合体の形成および解離によるバイオセンサ表面での分子量の変化をモニターすることを可能にする。レスポンスは共鳴ユニット（ＲＵ）として定量され、屈折率の変化の測定により分析物の結合速度を直接的に示すものである。記録されたシグナル（センサーグラム）は数学的に処理され、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ、結合定数ＫＡ（ＫＡ＝ｋａ／ｋｄ）および平衡時の解離定数ＫＤ（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）が得られる。
【０１００】
ＣＥＡまたはＣＤ１６とＶＨＨ（モノクローナル抗体９Ｅ１０（サンタクルーズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド）によって認識されるｃ−ｍｙｃタグを有する）との間の相互作用について、モノクローナル抗体９Ｅ１０がＢＩＡＣＯＲＥ提案のアミンによる標準的カップリング手法（ＮＨＳ／ＥＤＣによる活性化）に従って共有結合で固定化されたＣＭ５バイオセンサを装備したＢＩＡＣＯＲＥ ３０００で調べた。その後、ＶＨＨ（バッファー：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ；１５０ｍＭ ＮａＣ１；３ｍＭ ＥＤＴＡ；０．００５％界面活性剤Ｐ２０；に溶解したもの）を注入し、次に、一連のＣＥＡまたはＣＤ１６を、９Ｅ１０上に固定化されたＶＨＨ上に注入する。並行して、タンパク質は注
入せずに同じカップリング手法に供した対照チャネルについても同様に注入を実施する。ＶＨＨの親和性を以下の表１に示す。二重特異性抗体の種々のフォーマットから同等の親和性が得られる。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨならびに対応する二重特異性抗体の特異性のＦＡＣＳによる分析：
ＣＥＡに対する特異性：
（有効な免疫ターゲティングのためには、抗ＣＥＡ抗体がＮＣＡ（顆粒球の表面で発現される、ＣＥＡに非常に相同性の高い分子）を認識しないことが極めて重要である。）
抗原抗体結合の検出は、トランスフェクションしていないＭＣ３８株（ネズミ結腸がんの細胞株）、同細胞株をＣＥＡでトランスフェクションしたもの（ＭＣ３８／ＣＥＡ＋）またはＮＣＡでトランスフェクションしたもの（ＭＣ３８／ＮＣＡ＋）、ヒト腫瘍細胞株ＬＳ１７４Ｔ（表面にＣＥＡを発現するヒト結腸腺癌の細胞株）、および表面にＮＣＡを発現する顆粒球について実施する。
【０１０３】
顆粒球は、２種類の密度のＦｉｃｏｌｌ勾配（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｒ）１１１９および１０７７）でヘパリン存在下の新鮮血から抽出する。顆粒球は、２つのｈｉｓｔｏｐａｑｕｅの境界面に見いだされる。
【０１０４】
細胞への結合に使用された抗体は：
− ３５Ａ７、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＣＥＡに特異的）；
− １９２、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ＮＣＡと交差反応する）；
− ７．５．４および３Ｇ８抗ＣＤ１６モノクローナル抗体；
− 抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（ｃ１３、ｃ２１、ｃ２８、ｃ７２）；
− 抗ＣＥＡ ＶＨＨ（３、１７、２５、４３）；
− 抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体であって、８つの単離ＶＨＨから構築したもの；である。
【０１０５】
検出に使用された抗体は：
− ９Ｅ１０、マウス抗ｃｍｙｃモノクローナル抗体（２００μｇ／ｍｌ、１／１０希釈して使用）であって、精製ＶＨＨのｃ−ｍｙｃ標識に結合；
− ＡＰ３２６Ｆ、ヒツジの抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体のＦＩＴＣ連結物（シーレーノス（Ｓｉｌｅｎｕｓ）、１／１００希釈して使用）；
である。
【０１０６】
１回のテスト当たり細胞０．５×１０６個を使用する。ＶＨＨおよびモノクローナル抗体は１００μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で希釈する。
細胞０．５×１０６個（細胞の自己蛍光測定）。
【０１０７】
細胞０．５×１０６個＋抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ ２０μｇ／ｍｌ。
細胞０．５×１０６個＋抗９Ｅ１０ ２０μｇ／ｍｌ、その後、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ ２０μｇ／ｍｌ。
【０１０８】
細胞０．５×１０６個＋抗ＣＥＡまたは抗ＣＤ１６ ＶＨＨ １〜５μｇ／ｍｌ、次に９Ｅ１０ ２０μｇ／ｍｌ、次に抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ ２０μｇ／ｍｌ。
細胞０．５×１０６個＋モノクローナル抗体（３５Ａ７、１９２、７．５．４）２０μｇ／ｍｌ、その後、抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ ２０μｇ／ｍｌ。
【０１０９】
各ステップにおいて、サンプルを暗所にて４℃で４５分間インキュベートする。
各反応の間では、２ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄を実施する。最後のステップでは、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ中に入れる。
【０１１０】
ＦＡＣＳによる結果は、分析した４種の抗ＣＥＡ ＶＨＨならびにＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体の特異性を実証している。これらはＣＥＡ特異的であり、ＮＣＡとは交差反応しない。１例を図３に示す。この例において、対照のモノクローナル抗体であるｍＡｂ ３５Ａ７および１９２は、ＣＥＡを発現しないＭＣ３８細胞には結合せず、表面上にＣＥＡを発現するＭＣ３８ ＣＥＡ＋およびＬＳ１７４Ｔ ＣＥＡ＋細胞には結合する。ｍＡｂ １９２はさらに、表面上にＮＣＡを発現するＭＣ３８ ＮＣＡ＋細胞および顆粒球にも結合する。ＣＥＡ１７ ＶＨＨは、表面にＣＥＡを発現する細胞にのみ結合する。その他の抗ＣＥＡ ＶＨＨ抗体（クローン３、２５および４３）でも同等の結果が得られる。ＣＥＡ１７ ＶＨＨ／ＣＤ１６ ｃ２１ ＶＨＨ二重特異性抗体は、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２いずれの形態でも腫瘍細胞に特異的である。
Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態のその他の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体（８種の抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨ由来）でも同等の結果が得られる。
【０１１１】
ＣＤ１６に対する特異性：
免疫系がエフェクタ細胞を有効に認識するためには、ＣＤ１６Ｂから選ばれた抗ＣＤ１６抗体がさらにＣＤ１６Ａをも認識しなければならない。さらに、該抗体はＣＤ３２（ＲＦｃγＩＩＡおよびＲＦｃγＩＩＢ）とは交差反応してはならない。
【０１１２】
実験は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株由来の細胞株；ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、該細胞をＣＤ１６Ａをコードする遺伝子でトランスフェクションした株（表面にＣＤ１６Ａを発現する安定な細胞株；ビビエ（Ｖｉｖｉｅｒ）ら、１９９２年）、ＣＤ１６Ｂを発現する顆粒球、ＣＤ３２Ａのみを発現するＫ５６２細胞、およびＣＤ３２Ｂのみを発現するＩＩＡ ６ｈｕＩＩＢ１細胞を用いて実施する。
【０１１３】
細胞への結合に使用された抗体は：
− ３Ｇ８、抗ＣＤ１６（ヒトＲＦｃγＩＩＩＡ／ＩＩＩＢ）モノクローナル抗体であって、エピトープのコンホメーションを認識し、ＣＤ１６ＡおよびＣＤ１６ＢへのＩｇＧの結合をブロックする部位認識抗体；
− ７．５．４、抗ＣＤ１６（ヒトＲＦｃγＩＩＩＡ／ＩＩＩＢ）モノクローナル抗体であって、ＣＤ１６のＩｇＧ結合部位の外側に局在する線形のエピトープを認識し、かつ競合テスト（ヴェリィ（Ｖｅｌｙ）ら、１９９７年）において高濃度でも前記ＩｇＧ結合への影響がごくわずかである抗体；
− ＡＴ１０、抗ＣＤ３２（ヒトＲＦｃγＩＩＡ／ＩＩＢ）モノクローナル抗体；
− ＩＶ．３、抗ＣＤ３２（ヒトＲＦｃγＩＩＡ）モノクローナル抗体；
− 抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（ｃ１３、ｃ２１、ｃ２８、ｃ７２）；
− 抗ＣＥＡ ＶＨＨ（３、１７、２５、４３）；
− ３５Ａ７、抗ＣＥＡモノクローナル抗体；
− １９２、抗ＮＣＡモノクローナル抗体（ＣＥＡと交差反応する）；
− 抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体、８つの単離ＶＨＨから構築されたもの
である。
【０１１４】
検出に使用された抗体は：
− ９Ｅ１０、マウス抗ｃｍｙｃモノクローナル抗体（２００μｇ／ｍｌ、１／１０希釈して使用）であって、精製ＶＨＨのｃ−ｍｙｃ標識に結合；
− ヤギの抗マウスＩｇＧ抗体のＦａｂ’２であって、ＦＩＴＣとの連結物（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）、２０μｇ／ｍｌで使用（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）、１１５−０９６−００３）。
【０１１５】
１回のテスト当たり細胞０．５×１０６個を使用する。ＶＨＨおよびモノクローナル抗体は１００μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で希釈する。
細胞０．５×１０６個（細胞の自己蛍光測定）
細胞０．５×１０６個＋（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）２０μｇ／ｍｌ
細胞０．５×１０６個＋抗９Ｅ１０ ２０μｇ／ｍｌ、その後（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）２０μｇ／ｍｌ
細胞０．５×１０６個＋ＶＨＨ １〜５μｇ、次に９Ｅ１０ ２０μｇ／ｍｌ、次に（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）２０μｇ／ｍｌ
細胞０．５×１０６個＋モノクローナル抗体（３５Ａ７、１９２、３Ｇ８、７．５．４、ＡＴ１０、ＩＶ．３）２０μｇ／ｍｌ、その後（Ｆ（ａｂ’）２／ＦＩＴＣ）２０μｇ／ｍｌ。
【０１１６】
各ステップにおいて、サンプルを暗所にて４℃で４５分間インキュベートする。
各反応の間では、２ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄を実施する。最後のステップでは、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ中に入れる。
【０１１７】
ＦＡＣＳによる結果は、分析した４種の抗ＣＤ１６ ＶＨＨならびにＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体の特異性を実証するものである。これらの抗体はＣＤ１６特異的であり、ＣＤ３２とは交差反応しない。１例を図４に示す。この例において、対照のモノクローナル抗体であるｍＡｂ ３Ｇ８は、ＣＤ１６を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞、Ｋ５６２ ＣＤ３２Ａ＋およびＩＩＡ．１．６ｈｕＩＩＢ１ ＣＤ３２Ｂ＋には結合せず、表面にＣＤ１６を発現するＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋細胞および顆粒球には結合する。ＣＤ１６ ｃ２１ ＶＨＨは、表面にＣＤ１６を発現する細胞に結合しない。その他の抗ＣＤ１６ ＶＨＨ抗体（クローンｃ１３、ｃ２８およびｃ７２）でも同等の結果が得られる。二重特異性抗体であるＶＨＨ ＣＥＡ１７／ＶＨＨ ＣＤ１６ ｃ２１は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のいずれの形態でもＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋およびＮＫＬ細胞に特異的である。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態のその他の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体（８つの抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨ由来）でも同等の結果が得られる。
【０１１８】
二重特異性抗体の細胞上への接近可能性に関するＦＡＣＳ分析：
抗ＣＤ１６ ＶＨＨドメインの接近可能性：
５×１０５個のＬＳ１７４Ｔ細胞を、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２の存在下（１０μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌの範囲）で、氷中のＰＢＳ−１％ＢＳＡの中で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ１％で洗浄する。その後、種々の抗体フラグメントの抗ＣＤ１６ ＶＨＨドメイン上へのｒｈＣＤ１６（１０μｇ／ｍｌ）の結合を２ステップで検出する。該検出は、モノクローナル抗体７．５．４あるいは３Ｇ８（３μｇ／ｍｌ）を細胞と共に氷中で３０分間インキュベートし、次いで細胞をＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＦ（ａｂ’）２（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、カタログ番号：１１５−０９６−００３）と共に、氷中で３０分間インキュベートすることにより行われる。数回の洗浄の後、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ（ＴＭ）プログラムを使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＴＭ）４Ｃ４（ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いたフローサイトメトリー法によって免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ）を分析する。
【０１１９】
抗ＣＥＡ ＶＨＨドメインの接近可能性：
５×１０５個のＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋細胞を、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２の存在下（１０μｇ／ｍｌ〜０．１μｇ／ｍｌの範囲）で、氷中のＰＢＳ―ＢＳＡ１％中で３０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ１％で洗浄する。その後、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２の抗ＣＥＡ ＶＨＨドメイン上へのｒｈＣＥＡ（１０μｇ／ｍｌ）の結合を２ステップで検出する。該検出は、モノクローナル抗体１９２（３μｇ／ｍｌ）を細胞と共に氷中で３０分間インキュベートし、次いで細胞をＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＦ（ａｂ’）２（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリー、カタログ番号：１１５−０９６−００３）と共に、氷中で３０分間インキュベートすることにより行われる。数回の洗浄の後、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ（ＴＭ）プログラムを使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＴＭ）４Ｃ４（ベクトン・ディキンソン）を用いたフローサイトメトリー法によって免疫蛍光を分析する。
【０１２０】
１例を図５に示す。二重特異性抗体であるＶＨＨ ＣＥＡ１７／ＶＨＨ ＣＤ１６ ｃ２１は、ＬＳ１７４ＴおよびＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋細胞のいずれにも結合する。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態のその他の抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体（８つの抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨ由来）でも同等の結果が得られる。
【０１２１】
抗ＣＤ１６ ＶＨＨとモノクローナル抗体３Ｇ８および７．５．４との間の競合テスト：
ＥＬＩＳＡ：
５μｇ／ｍｌのビオチン化ＶＨＨ（ｃ２１、ｃ２８）を、予め２％ミルク−ＰＢＳで飽和させたストレプトアビジン吸着プレート（ＢｉｏＢｉｎｄ（ＴＭ）Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ストレプトアビジンコーティング型、サーモラボシステム）のウェルに結合させる。その後、０．０７〜２０μｇ／ｍｌの濃度範囲のＣＤ１６Ｂを添加する。第２に、５μｇ／ｍｌの一定濃度のモノクローナル抗体（３Ｇ８または７．５．４）を添加する。ＣＤ１６Ｂとモノクローナル抗体との結合を、抗マウスＩｇＧヤギＦ（ａｂ’）２のアルカリホスファターゼ連結物（サザン・バイオテクノロジー、１０３０−０４）を用いて、ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ（シグマ、Ｎ９３８９）の存在下で検出する。
【０１２２】
ＥＬＩＳＡにおける競合曲線を図６に示す。ＣＤ１６ ｃ２１ ＶＨＨは、モノクローナル抗体７．５．４によってシフトする。ＣＤ１６ ｃ２８ ＶＨＨは、モノクローナル抗体３Ｇ８によってシフトする。
【０１２３】
間接免疫蛍光法（ＦＲＣＳ）
５×１０５個のＪｕｒｋａｔ−ＣＤ１６Ａ細胞を、ＣＤ１６ ｃ２１またはｃ２８ ＶＨＨ（１〜１００μｇ／ｍｌ）の存在下、氷中のＰＢＳ−５％ＢＳＡの中で３０分間インキュベートする。その後、細胞を、０．１μｇ／ｍｌの３Ｇ８または１μｇ／ｍｌの７．５．４と共に同じ条件で３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ−５％ＢＳＡ中で洗浄する。その後、３Ｇ８または７．５．４の結合を検出する。該検出は、細胞を、ＦＩＴＣ標識された抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギ抗体Ｆ（ａｂ’）２（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）米国ペンシルバニア州ウエストグローブ所在、カタログ番号：１１５−０９６−００３）とともに氷中で３０分間インキュベートすることにより行われる。数回の洗浄の後、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ（ＴＭ）プログラムを使用して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＴＭ）４Ｃ４（ベクトン・ディキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンビュー所在）を用いたフローサイトメトリー法によって免疫蛍光を分析する。
【０１２４】
細胞上での競合プロファィルを図７に示す。ＣＤ１６ ｃ２１ ＶＨＨはモノクローナル抗体７．５．４によってシフトする。ＣＤ１６ ｃ２８ ＶＨＨはモノクローナル抗体３Ｇ８によってシフトする。高用量のＣＤ１６ ｃ２８ ＶＨＨもモノクローナル抗体７．５．４によってシフトする。
【０１２５】
抗ＣＤ１６ ＶＨＨおよび二重特異性抗体によるＪｕｒｋａｔ ＣＤ１６＋細胞の活性化：
この実験は、ＣＤ１６Ａをコードする遺伝子でトランスフェクションされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）を用いて実施する。該細胞は、１０％のＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＲＰＭＩ １６４０で培養する。
【０１２６】
その後、５×１０５個の細胞をマイクロプレートウェル中（１０％のＦＣＳ、１％のＰＳ、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する２５０μｌのＲＰＭＩ）で１８時間培養する。
【０１２７】
その後、１０ｎｇ／ｍｌのフォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（それ自体ではＩＬ２の産生および分泌を誘導しないがＩＬ２産生の「第２のシグナル」として必要な濃度）を添加し、続いて０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのビオチン化ＶＨＨおよび１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（ＶＨＨの架橋を可能にする）または非ビオチン化二重特異性抗体を添加する。
【０１２８】
細胞上清中に産生されたヒトＩＬ２を、Ｒ＆Ｄキット（Ｄｕｏｓｅｔ（Ｒ）ヒトＩＬ２；参照番号：ＤＹ２０２）の抗体およびストレプトアビジンのアルカリホスファターゼ連結物（ＤＡＫＯ、Ｄ０３９６）を使用して、ｐ−ニトロフェニルホスファート（シグマ、カタログ番号１０４−４０５）の存在下でＥＬＩＳＡによって測定する。
【０１２９】
ＣＤ１６Ａの活性化（インターロイキン２の産生および分泌）の結果を図８に示す。２種の抗ＣＤ１６ ｃ２１およびｃ２８ ＶＨＨは、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６Ａ＋細胞のＩＬ２産生を活性化する。ｃ２１によって誘導されたのと同様のＩＬ２の産生および分泌を誘導するためには、ｃ２８ではより多くの量が必要である。Ｆ（ａｂ’）２の形態の抗ＣＥＡ１７／抗ＣＤ１６ ｃ２１二重特異性抗体は、ストレプトアビジンによる架橋がなくても、Ｊｕｒｋａｔ細胞がその表面でＣＤ１６Ａを発現する場合はＩＬ２の産生を活性化する。その他の抗ＣＤ１６ ＶＨＨおよび抗ＣＥＡ／抗ＣＤ１６二重特異性抗体からも同
等の結果が得られる。
【０１３０】
二重特異性抗体存在下におけるＮＫＬ細胞による腫瘍細胞の溶解：
ナチュラルキラー細胞の細胞毒性テストについては、顆粒性大リンパ球を伴う白血病から得られた細胞株としてＮＫＬ細胞（ロバートソンら、１９９６（１２））を使用する。該細胞の機能的特性はＮＫに類似しており、またＣＤ１６の発現についてはフローサイトメトリー法によって最初に確認した。使用した標的細胞は、ヒトの白血病から得られたまさにＮＫ感受性のＨｅＬａ細胞、ネズミ結腸Ｃ１５．４．３ ＡＰ由来のＮＫ感受性細胞（ＭＣ３８）、ならびにヒトＣＥＡでトランスフェクションされた、本来ＮＫ耐性であるＭＣ３８細胞である。
【０１３１】
培養物中の標的細胞を懸濁させ（ＨｅＬａ細胞についてはトリプシン反応により、ＭＣ３８細胞とＮＫＬ細胞については機械的に懸濁）、トリパンブルーを使用してＭａｌａｓｓａｙセル中で計数する。１ウェル当たり２０００個の細胞を、３．７×１０６Ｂｑの５１Ｃｒおよび種々の抗体フォーマット（２００、１００または５０μｇ／ｍｌ）を含んだ１００μｌ中で３７℃にて１時間インキュベートする。その後、細胞を数回洗浄して、培地に残っている５１Ｃｒならびに非結合の抗体を除去する。懸濁させたＮＫＬ細胞を計数し、エフェクタ／標的比を６０：１〜０．２：１として標的細胞に添加する。３７℃で４時間インキュベーションした後、培地中に放出されたＣｒの放射活性を、γカウンターを使用して測定する。Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２の形態の抗ＣＥＡ１７／抗ＣＤ１６ ｃ２１および抗ＣＥＡ１７／抗ＣＤ１６ ｃ２８二重特異性抗体を用いて得られた細胞溶解を示す例を図９に示す。
【０１３２】
種々のプラスミドの構築（図１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２Ａおよび１２Ｂを参照）
− プロトコールの概要はすべて、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリーズ・プレス、１９８９年に記述されている。
【０１３３】
− 制限酵素による消化は供給業者の推奨に従って実施する。
挿入したヒト起源の遺伝子：領域Ｃκ、ＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２およびＣＨ３をコードする遺伝子はそれぞれ、ヒト免疫グロブリンの軽鎖（κ鎖）の定常領域、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１の重鎖の第１の定常領域、ヒンジ領域、第２の定常領域、および第３の定常領域をコードする遺伝子のドメインに相当する。これらの遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲによってＬＦＢ（フランス分画生物工学研究所）のポケット試料（ｐｏｃｈｅ）から得た。この材料は法的な認可を受けており、記載された実験に使用可能である。
【０１３４】
− 各プラスミドの配列決定は、ＡＢＩ３１０型シーケンサを用いて、以下のオリゴヌクレオチド：
ＥｃｏＲＩ−９０、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２：ＧＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣ
ＨｉｎｄＩＩＩ＋８８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３：ＣＧＣＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣ
を使用して実施する。
【０１３５】
− すべてのベクターは、２つのユニークな制限酵素切断部位の間に：種々のプロモータ、ＰｅｌＢ型（またはその他の）種々のシグナル配列、種々のＲＢＳ配列、任意のＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨドメイン、任意のＣλドメイン、あるいは任意のタイプの免疫グロブリンのＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、を導入可能なように設計される。
【０１３６】
ｐＭＣＳＰｈｏＡ’ （図１０Ａ）
このプラスミドの構築については、ル・カルベス（Ｌｅ Ｃａｌｖｅｚ）ら（１９９５）の参照文献に記述されている。
【０１３７】
このプラスミドは、６番目の残基（プロリン）から始まる成熟型アルカリホスファターゼ（ＰｈｏＡ）をコードする。
ｐ３５ＰｈｏＡ’ （図１０Ａ）
このプラスミドの構築についてはル・カルベス（Ｌｅ Ｃａｌｖｅｚ）（１９９６）に記述されている。
【０１３８】
遺伝子断片（ＰｅｌＢのシグナル配列をコードする２〜１４コドンの３番目の塩基を縮重させたオリゴヌクレオチドによって形成）を、プラスミドｐＭＣＳＰｈｏＡ’のＮｄｅＩ部位とＥａｇＩ部位との間に挿入する。その後、最も高いアルカリホスファターゼ活性を示すクローン（１〜６０）を選択した。
【０１３９】
ｐ３５ＰｈｏＡ’／Ｎ− （図１０Ａおよび１１）
ｐｈｏＡ遺伝子中のＮｃｏＩ部位の抑制。
オリゴヌクレオチド：上流−ＲｓｒＩＩ、ＮｃｏＩ−ｓｕｐ、ＮｃｏＩ−ｉｎｆおよび下流−ＥｃｏＮＩを用いてｐＭＣＳＰｈｏＡ’からオーバーラップＰＣＲを実施する。
【０１４０】
使用したオリゴヌクレオチドの配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４〜１７は以下のとおりである。
【０１４１】
【化３】
【０１４２】
ＰＣＲ１およびＰＣＲ２の条件：
１μｌのプラスミド（５ｎｇ）、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド（ＰＣＲ１については上流−ＲｓｒＩＩおよびＮｃｏＩ−ｉｎｆ、ＰＣＲ２についてはＮｃｏＩ−ｓｕｐおよび下流−ＥｃｏＮＩ）、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅ（ＴＭ）、最終容量５０μｌ（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、次いで７２℃、１０分間）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１４３】
オーバーラップＰＣＲ３の条件：
ＰＣＲ１および２をそれぞれ１μｌ、ならびに０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ、最終容量５０μｌ。５サイクル（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間）の反応の後、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド（上流−ＲｓｒＩＩお
よび下流−ＥｃｏＮＩ）を添加し、ＰＣＲを３５サイクル続けた後、７２℃、１０分間。ＰＣＲ３の産物を、２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１４４】
ＰＣＲフラグメントの配列決定は、オリゴヌクレオチド５’ＥｃｏＲＩ−９０を使用して、ＡＢＩ３１０型シーケンサで実施する。
プラスミドｐ３５ＰｈｏＡ’中へのＰＣＲ３フラグメントのクローニング：
３５μｌのＰＣＲ３フラグメントおよび５μｌ（２．５μｇ）のｐ３５ＰｈｏＡ’を、１０ＵのＲｓｒＩＩおよびＥｃｏＮＩで消化する。１６時間インキュベーションした後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、各ＤＮＡを沈殿させて２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。
【０１４５】
ライゲーションは、ＰＣＲフラグメント５μｌ、ベクター０．５μｌおよび３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ（Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いて、最終容量１０μｌ中で、１６℃で１６時間実施する。細菌ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）をライゲーション反応物５μｌで形質転換する。
【０１４６】
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ− （図１０Ａおよび１１）
６ヒスチジン−グリシン−セリンモチーフの挿入
オリゴヌクレオチドＸｈｏＩ−ＳａｃＩおよび６ＨｉｓＧＳ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐ３５ＰｈｏＡ’／Ｎ−からＰＣＲを実施する。
【０１４７】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８および１９の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１４８】
【化４】
【０１４９】
ＰＣＲの条件：
ＰＣＲは、最終容量５０μｌ中に、５ｎｇのｐ３５ＰｈｏＡ’／Ｎ−ベクター、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチドおよび０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；７０℃、１分間；７２℃、１分間を３５サイクル、その後、７２℃、１０分間）。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１５０】
ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのクローニング
２０μｌのＰＣＲフラグメントおよび５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５ＰｈｏＡ’ベクター（ル・カルベス（Ｌｅ Ｃａｌｖｅｚ）ら、Ｇｅｎｅ（１９９６）、第１７０巻、ｐ．５１−５５）を、ＢＳＡ存在下で１０ＵのＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。１６時間インキュベーションした後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、各ＤＮＡを沈殿させて２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。ライゲーションは、最終容量１０μｌ中にＰＣＲフラグメント５μｌ、ベクター０．５μｌおよび３ＷｅｉｓｓＵのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）として１６℃で１６時間実施する。ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）をライゲーション反応物５μｌで形質転換する。
【０１５１】
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ− （図１０Ａおよび１１）
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−のＡｐａＩ部位およびＢｓｔＥＩＩ部位の抑制
１回のオーバーラップＰＣＲを、オリゴヌクレオチド：上流−ＥｃｏＲＶ、ＡｐａＩ−ＢｓｔＥＩＩ−ｓｕｐ、ＢｓｔＥＩＩ−ＡｐａＩ−ｉｎｆおよび下流−ＭｌｕＩを用いて、ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−から実施する。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０〜２３の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１５２】
【化５】
【０１５３】
ＰＣＲ１およびＰＣＲ２の条件：
１μｌ（５ｎｇ）のプラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド（ＰＣＲ１については上流−ＥｃｏＲＶおよびＢｓｔＥＩＩ−ＡｐａＩ−ｉｎｆ、ＰＣＲ２についてはＡｐａＩ−ＢｓｔＥＩＩ−ｓｕｐおよび下流−ＭｌｕＩ）、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅ（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後７２℃、１０分間）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１５４】
オーバーラップＰＣＲ３の条件：
ＰＣＲ１および２をそれぞれ１μｌ、ならびに０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ、最終容量５０μｌ。５サイクル（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間）の後、１０ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド（上流−ＥｃｏＲＶおよび下流−ＭｌｕＩ）を添加し、ＰＣＲを３５サイクル続けてから、７２℃、１０分間。ＰＣＲ３の産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１５５】
ＰＣＲフラグメントの配列決定は、オリゴヌクレオチド５’ＥｃｏＲＩ−９０を使用して、ＡＢＩ３１０型シーケンサで実施する。
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−プラスミド中へのＰＣＲ３フラグメントのクローニング：
３５μｌのＰＣＲ３フラグメントおよび５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／Ｎ−を、１０ＵのＥｃｏＲＶおよびＭｌｕＩで消化する。１６時間インキュベーションした後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、各ＤＮＡを沈殿させ、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。
【０１５６】
ライゲーションは、最終容量１０μｌ中に、ＰＣＲフラグメント５μｌ、ベクター０．
５μｌおよび３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）として１６℃で１６時間実施する。ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）をライゲーション反応物５μｌで形質転換する。
【０１５７】
ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ− （図１０Ａおよび１１）
ＰｈｏＡ遺伝子のＥａｇＩ部位における位相シフト
この位相シフトにより単一のＦｓｅＩ部位を作出する。
【０１５８】
５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−を１０ＵのＥａｇＩで消化する。１６時間インキュベーションした後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、反応混合物を沈殿処理し、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの等モル濃度混合物（終濃度３３μＭ）および２．５Ｕのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ｅｘｏフラグメント（バイオラボ）を添加して最終容量５０μｌとし、２５℃で１５分間処理する。５００ｍＭのＥＤＴＡを２μｌ加え、７５℃で２０分間処理して反応を停止させる。反応混合物をエタノール沈殿し、５μｌのＨ２Ｏ中に入れ、最終容量１０μｌとして３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）を用いてライゲーションする。細菌ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）をライゲーション反応物５μｌで形質転換する。
【０１５９】
このプラスミドにより、ヒト抗体ＶＨのフラグメントをクローニングして最も良く分泌されるものを選択することが可能となる。
ｐ５５／ＭＣＳ１ （図１０Ａおよび１１）
１対のオリゴヌクレオチド５’ＭＣＳ１および３’ＭＣＳ１を使用した、ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−のＮｃｏＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間へのＭＣＳ Ｉの挿入。
【０１６０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４および２５の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１６１】
【化６】
【０１６２】
５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−ベクターを、各１０ＵのＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ酵素によって１６時間消化する。各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’ＭＣＳ１および３’ＭＣＳ１を８０℃で５分間インキュベーションし、その後、該溶液を周囲温度までゆっくり冷却する。
【０１６３】
５μｌのベクターと１．２μｌのハイブリッドカセット（５’ＭＣＳＩ＋３’ＭＣＳＩ）とを、３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）の存在下で周囲温度にて１時間ライゲーションする。リガーゼを６５℃で１０分間インキュベーションして失活させ
る。１０ＵのＥａｇＩを含有する９０μｌの反応混合物を加え（２ｈ）、元のベクターを破壊する。この混合物をエタノール沈殿処理し、１０μｌのＨ２Ｏ中に入れる。細菌ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）を該混合物５μｌで形質転換する。
【０１６４】
ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ （図１０Ａおよび１１）
１対のオリゴヌクレオチド５’Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５‐ｓｕｐおよび３’Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５‐ｉｎｆを使用した、ｐ５５／ＭＣＳ１のＳｆｉＩ部位およびＳａｃ２部位の間へのＦｌａｇ／ＲＢＳ／ＰｅｌＢ３５モチーフの挿入。
【０１６５】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６および２７の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１６６】
【化７】
【０１６７】
クローニングは、ＭＣＳ Ｉの挿入について先述した条件のとおりに実施する。ライゲーションの後、反応混合物を１０ＵのＸｈｏＩ酵素で消化する。
ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ （図１０Ｂおよび１１）
１対のオリゴヌクレオチド５’ｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳおよび３’ｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳを使用した、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５のＮｏｔＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間へのｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳモチーフの挿入。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２８および２９の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１６８】
【化８】
【０１６９】
クローニングは、ＭＣＳ Ｉの挿入について先述した条件のとおりに実施する。ライゲーション混合物を１０ＵのＸｂａＩ酵素で消化する。
Ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ （図１０Ｂおよび１１）
ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳへの免疫グロブリン軽鎖Ｃκ定常領域の挿入。
【０１７０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３０および３１の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１７１】
【化９】
【０１７２】
Ｃκドメインの増幅：
ＬＦＢ提供のポケット試料からＦｉｃｏｌｌ勾配によってヒトＢリンパ球を精製する。その後、全ＲＮＡを第１．３．２項に記載のプロトコールに従って調製する。
【０１７３】
ハイブリダイゼーション：
全ＤＮＡ１μｌを、１ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド３’Ｃκとともに最終容量８μｌとして７０℃で１０分間プレインキュベーションする。温度を徐々に（４５分間）３７℃まで低下させる。
【０１７４】
逆転写：
８μｌをとり、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎｅ（２０Ｕ）、３μｌの５×バッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（ＴＭ）ＩＩ、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、１μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）、２μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）を加え、５０℃で１０分間インキュベーションする。その後、０．７５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（１５０Ｕ）を加え、インキュベーションを５０℃で３０分間継続し、７０℃で１５分間処理する。
【０１７５】
得られたｃＤＮＡは、ビーズ（ＢｉｏＭａｇ（Ｒ）カルボキシル基結合型、ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて供給業者の推奨に従って精製する。最終的な溶離は、１５μｌの１０ｍＭトリス・アセタートｐＨ７．８で実施する。
【０１７６】
ＰＣＲ１および２の条件：
ＰＣＲ１は、１μｌのｃＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’Ｃκおよび３’Ｃκ、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて、最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【０１７７】
ＰＣＲ２は、１μｌのＰＣＲ１から、０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔを用いて最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後７２℃、５分間）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。
【０１７８】
ＰＣＲフラグメントは、クローニングの前にオリゴヌクレオチド５’Ｃκおよび３’Ｃκを用いてＡＢＩ３１０型シーケンサで配列決定する。
Ｃκドメインのクローニングは、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＢｓｔＥＩＩ部位およびＳａｃＩＩ部位の間で行う：
２０μｌのＰＣＲ２フラグメントおよび５μｌ（２．５μｇ）のｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳを、１０ＵのＢｓｔＥＩＩおよびＳａｃＩＩで消化する。１６時間のインキュベーションの後、酵素を６５℃で１０分間処理して失活させる。その後、各ＤＮＡを沈殿処理し、２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁させる。
【０１７９】
ライゲーションは、最終容量１０μｌ中で、５μｌのＰＣＲ２フラグメント、０．５μｌのベクターおよび３ＷｅｉｓｓＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラボ）を用いて１６℃で１６時間実施する。ＴＧ１コンピテントセル（ＣａＣｌ２法）を５μｌのライゲーション反応物で形質転換する。
【０１８０】
ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧ）
ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳへの、ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンの重鎖定常領域ＣＨ１の挿入。
【０１８１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３２〜３５の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１８２】
【化１０】
【０１８３】
ＣＨ１γ１ドメインの増幅は、ＢｓｔＥＩＩ部位を消失させるオーバーラップＰＣＲにより実施される。
逆転写は、Ｃκについて上述した通りに、ただしオリゴヌクレオチド３’ＣＨ１γ１を使用して実施する。
【０１８４】
ＲＴの後のＰＣＲ１は、１μｌのｃＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１γ１、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて、最終容量を５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【０１８５】
ＰＣＲ２ａは、１μｌのＰＣＲ１と、オリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１およびＢｓｔＥＩＩ‐ｉｎｆとから、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて最終容量を５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後、７２℃、５分間）。
【０１８６】
ＰＣＲ２ｂは、１μｌのＰＣＲ１と、オリゴヌクレオチドＢｓｔＥＩＩ‐ｓｕｐおよび３’ＣＨ１γ１とから、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて最終容量を５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後、７２℃、５分間）。
【０１８７】
ＰＣＲ３は、各１μｌのＰＣＲ２ａおよびＰＣＲ２ｂと、オリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１γ１とから、０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔを用いて最終容量を５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、４５秒間；６０℃、４５秒間；７２℃、４５秒間；を２５サイクル、その後、７２℃、５分間）。
【０１８８】
ＰＣＲ３の産物を２％アガロースゲルで精製する（キアゲンのゲル抽出キット、最終容量５０μｌ）。ＰＣＲ３フラグメントの配列決定はオリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１γ１を使用して、ＡＢＩ３１０型シーケンサで実施する。
【０１８９】
クローニングは、Ｃκドメインについて記載したように実施するが、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＳｆｉＩ部位とＮｏｔＩ部位の間とする。
得られたプラスミドを通称ｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧとし、該プラスミドにより、各鎖に標識を有するＦａｂタイプの抗体フラグメント（図１２Ａ）の生産が可能となる。
【０１９０】
ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ｐＣ５κＣＨ１Ｈγ１−ＴＡＧ） （図１０Ｂおよび１１）
ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンの重鎖定常領域ＣＨ１およびヒンジ領域（Ｈ）の、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳへの挿入
ＰＣＲ１、２ａ、２ｂおよび３は、ＣＨ１ドメインの増幅について上述したとおりに実施するが、オリゴヌクレオチド３’Ｃγ１をオリゴヌクレオチド３’ＣＨ１Ｈγ１に置き換えて行う。３’ＣＨ１Ｈγ１の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３６は以下のとおりである：
【０１９１】
【化１１】
【０１９２】
クローニングは、ＣＨ１γ１ドメインについて記述したように、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＳｆｉＩ部位とＮｏｔＩ部位の間で行う。
得られたプラスミドを通称ｐＣκＣＨ１Ｈγ１−ＴＡＧとし、該プラスミドにより、各鎖に標識を有するＦ（ａｂ’）２タイプの抗体フラグメント（図１２Ａ）の生産が可能となる。
【０１９３】
ｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１（ｐＣκＣＨ１γ１） （図１０Ｂおよび１１）
ＳａｃＩＩおよびＳｆｉＩの間に含まれるＤＮＡフラグメントを、１対のオリゴヌクレオチド５’ＲＢＳ／３５‐ｓｕｐおよび３’ＲＢＳ／３５‐ｉｎｆを使用して新たなカセットに置き換えることによる、プラスミドｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳからのＦｌａｇ標識およびｃ−ｍｙｃ−６ｈｉｓＧＳ標識の除去。
【０１９４】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３７および３８の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１９５】
【化１２】
【０１９６】
クローニングは、ＭＣＳＩの挿入について記述した条件に従って正確に実施する。得られた中間体プラスミドをｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳと称する。
【０１９７】
ｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳモチーフは、ＣＨ１γ１ドメインをｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳに再クローニングすることにより除去される。
１回のＰＣＲにより、５ｎｇのプラスミドｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳから、オリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１γ１−ＳＴＯＰを用いてＣＨ１γ１ドメインを増幅する。
【０１９８】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３９の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０１９９】
【化１３】
【０２００】
ＰＣＲフラグメントのクローニングは、Ｃκドメインについて記載したようにして実施するが、プラスミドｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＳｆｉＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間で行う。
【０２０１】
得られたプラスミドを通称ｐＣκＣＨ１γ１とし、該プラスミドにより、Ｆａｂタイプの抗体フラグメント（図１２Ａ）の生産が可能となる。
ｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１（ｐＣκＣＨ１Ｈγ１） （図１０Ｂおよび１１）
ＳａｃＩＩおよびＳｆｉＩの間に含まれるＤＮＡフラグメントを、１対のオリゴヌクレオチド５’ＲＢＳ／３５‐ｓｕｐおよび３’ＲＢＳ／３５‐ｉｎｆを使用して新たなカセットに置き換えることによる、プラスミドｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳからのＦｌａｇ標識およびｃ−ｍｙｃ−６ｈｉｓＧＳ標識の除去
クローニングは、ＭＣＳＩの挿入について記述された条件に従って正確に実施する。得られた中間体プラスミドをｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳと称する。
【０２０２】
ｃ−ｍｙｃ−６ＨｉｓＧＳモチーフは、ＣＨ１Ｈγ１ドメインをｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳに再クローニングすることにより除去される。
１回のＰＣＲにより、５ｎｇのプラスミドｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳから、オリゴヌクレオチド５’ＣＨ１γ１および３’ＣＨ１Ｈγ１−ＳＴＯＰを用いてＣＨ１Ｈγ１ドメインを増幅する。
【０２０３】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４０の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２０４】
【化１４】
【０２０５】
ＰＣＲフラグメントのクローニングは、上述のようにＳｆｉＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間で、ただしプラスミドｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１Ｈγ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳから実施する。
【０２０６】
得られたプラスミドを通称ｐＣκＣＨ１Ｈγ１とし、該プラスミドは、Ｆ（ａｂ’）２タイプの抗体フラグメント（図１２Ａ）の生産を可能にする。
ｐ５５Ｃκ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１ＨＣＨ２ＣＨ３γ１（ｐＭａｂγ１＊） （図１０Ｂおよび１１）
ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンの重鎖定常領域ＣＨ１、ヒンジ領域（Ｈ）および定常領域ＣＨ２およびＣＨ３の、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳへの挿入
ＰＣＲ１、２ａ、２ｂおよび３は、上述のＣＨ１ドメインの増幅と同じように、ただしオリゴヌクレオチド３’ＣＨ１γ１をオリゴヌクレオチド３’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３に置き換えて実施する。オリゴヌクレオチド３’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３の配列ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４１を以下に示す：
【０２０７】
【化１５】
【０２０８】
クローニングは、ＣＨ１γドメインについて記述したように、ｐ５５ＣκＦｌａｇ／ＲＢＳ／３５ＣＨ１γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＳｆｉＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間で
行う。
【０２０９】
得られたプラスミドを通称ｐＭＡｂγ１＊とし、該プラスミドは、ｍＡｂ＊タイプの抗体フラグメント（図１２Ｂ）の生産を可能にする。
ｐ５５ＨＣＨ２ＣＨ３γ１ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳ（ｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１−ＴＡＧ）
（図１０Ｂおよび１１）
ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンのヒンジ領域（Ｈ）ならびに定常領域ＣＨ２およびＣＨ３の、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＢｓｔＥＩＩ部位とＮｏｔＩ部位の間への挿入
逆転写はＣκについて記載したとおりに、ただしオリゴヌクレオチド３’ＮｏｔＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３を用いて行う。
【０２１０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４２および４３の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２１１】
【化１６】
【０２１２】
ＲＴ後のＰＣＲは、１μｌのｃＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’ＢｓｔＥ２／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３および３’ＮｏｔＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【０２１３】
得られたプラスミドを通称ｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１−ＴＡＧとし、該プラスミドは、ＣＨ３の末端に標識を備えた（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプの抗体フラグメント（図１２Ｂ）の生産を可能にする。
【０２１４】
ｐ５５ＨＣＨ２ＣＨ３γ１（ｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１） （図１０Ｂおよび１１）
ＩｇＧ１タイプ免疫グロブリンのヒンジ領域（Ｈ）ならびに定常領域ＣＨ２およびＣＨ３の、ｐ５５Ｆｌａｇ／ＲＢＳ／３５ｃｍｙｃ６ＨｉｓＧＳのＢｓｔＥＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間への挿入
逆転写はＣκについて記載したとおりに、ただしオリゴヌクレオチド３’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３を使用して行う。
【０２１５】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４４および４５の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２１６】
【化１７】
【０２１７】
ＲＴ後のＰＣＲは、１μｌのｃＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド５’ＢｓｔＥ２／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３および３’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を３０サイクル、その後、７２℃、１０分間）。
【０２１８】
得られたプラスミドを通称ｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１とし、該プラスミドは、（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプの抗体フラグメント（図１２Ｂ）の生産を可能にする。
ＶＨＨのクローニング
種々のフォーマットにおいて、任意のＶＨＨをユニークな部位の間に導入可能である。
【０２１９】
Ｃκの上流：ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩ（またはＫｐｎｌ）の間、
ＣＨ１の上流：ＳｆｉＩとＮｈｅ１の間、
Ｈの上流：ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩ。
【０２２０】
このようにして、本発明者らは以下の５’および３’オリゴヌクレオチドの対を用いたＰＣＲによって種々のＶＨＨを増幅する。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４６〜５２の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２２１】
【化１８】
【０２２２】
生体特異抗体の生産、精製および特性解析
６ＨｉｓＧＳ標識を備えた種々の抗体フラグメントを、上述のように生産および精製する。標識のない抗体フラグメントの精製については、塩基に基づいたクロマトグラフィー工程を、抗体フラグメントの特性に応じた特性（陰イオンまたは陽イオン）のイオン交換カラムに置き換える。
【０２２３】
電気泳動ゲルを図１３に示す。Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２は、コバルトカラムとその後のプロテインＧカラムで精製する。その後、種々の抗体フラグメントをｓｕｐｅｒｄｅｘ（Ｒ）２００（またはｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でもよい）で分離する。
【０２２４】
ヒトＶＨの単離方法およびベクターの構築
方法の原理は、ヒトＶＨドメイン（ＬＦＢポケット試料からＲＴ−ＰＣＲによって単離
されたもの）を、プラスミドｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ−中にクローニングすることから成る（図１０Ａおよび１１）。このプラスミドには、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子が、発現不可能な読み枠として含まれている。ＶＨをクローニングすることによりアルカリホスファターゼの読み枠が回復し、アルカリホスファターゼの上流にＶＨが融合したものを生産することが可能となる（細菌ＴＧ１株にクローニングされたＶＨ−ＰｈｏＡバンク）。その後、種々のクローンを９６ウェルマイクロプレート中で作製し、該クローンの増殖速度を３０分ごとにマイクロプレートから直接測定する（ＯＤ６２０ｎｍ）。このようにして、増殖がＶＨの存在によって変化しないクローンを選択する。マイクロプレートから得たクローンを複製し、−８０℃に保存する。３７℃で２時間の誘導、または３０℃、２４℃もしくは１８℃などでの１６時間の誘導の後、増殖を停止させ、培地の上澄みから直接ホスファターゼ活性を測定する。ホスファターゼ活性は、各マイクロプレートのウェルに見出だされる細菌数と比例する。
【０２２５】
アルカリホスファターゼは、細菌ペリプラズム中に分泌される場合、ジスルフィド架橋が正確に形成された二量体の形態においてのみ活性を有する。この手法は、大部分の融合タンパク質ＶＨ−ＰｈｏＡを細菌培地中に分泌させて生産するクローンの選択を可能にする。このようにして、正確に複製され、かつジスルフィド架橋が正確に形成され、したがって可溶性のＶＨを選択することが可能である。選択されたＶＨは、ヒトＶＨのＣＤＲを前述のラマＶＨＨ由来のＣＤＲに交換するための母体として使用される。ＶＨは、そのＣＤＲ接合部のアミノ酸がＶＨＨのアミノ酸と同等のＶＨを選択することにより選ばれる。
【０２２６】
ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲの条件
ハイブリダイゼーション：
１μｌの全ＲＮＡ（第１．３．２項に記載の精製）を、１ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチド（３’ＪＨ１−４−５；３’ＪＨ２；３’ＪＨ３および３’ＪＨ６の混合物）とともに最終容量８μｌとして７０℃で１０分間プレインキュベーションする。温度を徐々に（４５分間）３７℃まで低下させる。
【０２２７】
逆転写：
８μｌをとり、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎｅ（２０Ｕ）、３μｌの５×バッファー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ、インビトロゲン）、１μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）、２μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）を加え、５０℃で１０分間インキュベーションする。次に、０．７５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（１５０Ｕ）を加え、インキュベーションを５０℃で３０分間続け、さらに７０℃で１５分間行う。
【０２２８】
得られたｃＤＮＡを、ビーズ（ＢｉｏＭａｇ、カルボキシル結合型、ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて供給業者の推奨に従って精製する。最終的な溶離は１５μｌの１０ｍＭトリス・アセタートｐＨ７．８で実施する。
【０２２９】
ＰＣＲ１は、１μｌのｃＤＮＡ（ＲＴ−ＰＣＲによって得られたもの）、１０ｐｍｏｌｅの５’オリゴヌクレオチド（以下に配列を示す５’オリゴヌクレオチド各０．６２５ｐｍｏｌｅ）および３’オリゴヌクレオチド（以下に配列を示す３’オリゴヌクレオチド各２．５ｐｍｏｌｅ）、０．５ＵのＤｙｎａｚｙｍｅを用いて実施する（９５℃、３分間；次いで９５℃、１分間；５８℃、１分間；７２℃、１分間；を３５サイクル、次いで７２℃、１０分間）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルに供し、ＶＨに相当するバンドを精製する（キアゲンのゲル抽出キット）。
【０２３０】
ＰＣＲ２は、１／１０００に希釈したＰＣＲ１を１μｌ、上記の同量のオリゴヌクレオチド、０．５ＵのＤｅｅｐ Ｖｅｎｔを用いて、最終容量５０μｌとして実施する（９４℃、３分間；次いで９４℃、１分間；７０℃、１分間；７２℃、１．５分間；を４０サイ
クル、次いで７２℃、１０分間）。フラグメントを上述のように２％アガロースゲルから精製する。
【０２３１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５３〜７２の配列のオリゴヌクレオチドを使用：
【０２３２】
【化１９】
【０２３３】
種々の精製ＰＣＲフラグメントを、１０ＵのＮｃｏＩおよびＸｍａＩによって消化し、ライゲーションによってクローニングベクターｐ５５／ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ−に挿入する。ライゲーション混合物をＦｓｅＩで消化してから細菌を形質転換する。形質転換は、エレクトロコンピテントな細菌ＴＧ１を用いてエレクトロポレーションによって実施する。ＶＨドメインが挿入されたクローンではホスファターゼ活性が回復する（青色コロニー）。
【０２３４】
９６または３８４ウェルのマイクロプレートにおける生産：
対照：陰性対照の培地（２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン）、陰性対照のベクターｐ５５／ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ−／ＮＡＢ−、陽性対照のベクターｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−。
【０２３５】
１ウェル（Ｎｕｎｃｌｏｎ（ＴＭ）ｓｕｒｆａｃｅ、ヌンク（Ｎｕｎｃ））あたり１５０または４０μｌの培地（２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリン）を分配する。各ウェルに、小楊枝または細胞用ピック（Ｑｐｉｘ）を用いて単離された青色コロニーを接種し、次いでプレートを無菌接着シートで密閉する。９００ｒｐｍで稼動するＩＥＭＳ（Ｒ）Ｔｈｅｒｍｏプレート・インキュベータ中に、３７℃または３０℃で１６時間置き、次に、９６または３８４ウェルのレプリケータを用いて、１５０または４０μｌの２ＹＴ／１００μｇ／ｍｌアンピシリンが入ったマイクロプレートに前記「母親」マイクロプレートのレプリカを作製する。次いで、無菌接着シートで密閉する。（レプリカ作製後、「母親」マイクロプレートには１ウェルあたり３７．５または１０μｌの８０％のグリセロールを加え、−８０℃に保存する）。３時間の培養（ＯＤ ６２０ｎｍでおよそ０．５）の後に、終濃度１００μＭのＩＴＰＧを用いて１６時間誘導する。６２０ｎｍにおけるＯＤを誘導の終了時に測定する。
【０２３６】
アルカリホスファターゼ活性の分析：
培養物全体（細胞＋培地）を１０μｌ、培養上清（これについては９１０ｇで３分間遠心分離する）を１０μｌとる。各サンプルに、６５μｌの１０ｍＭトリス‐ＨＣｌ ｐＨ８．０を加え、また２５μｌのＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸、（ジエタノールアミンｐＨ９．８（ＨＣｌ）； ＭｇＣｌ２ ０．５ｍＭ）中に１ｍｇ／ｍｌ）を加える。撹拌しながら３０分間反応させた後、４０５ｎｍでＯＤを測定する。
【０２３７】
４０５ｎｍで測定されたアルカリホスファターゼ活性を、誘導の終了時に各ウェルに含まれていた細胞数（６２０ｎｍでのＯＤ測定値）で補正する。アルカリホスファターゼに融合したＶＨを発現するクローンのホスファターゼ活性をそれぞれ、陽性対照（ｐ５５ＰｈｏＡ６ＨｉｓＧＳ／ＮＡＢ−によって生産された非融合型のアルカリホスファターゼ）の活性と比較する。対照と同等またはより高い活性を有するクローンだけを考慮し、オリゴヌクレオチド５’ＥｃｏＲＩ−９０および３’ｉｎｆ−ＰｓｔＩ＋７１（３’ｉｎｆ−ＰｓｔＩ＋７１オリゴヌクレオチドの配列はＧＴＴＡＡＡＣＧＧＣＧＡＧＣＡＣＣＧ）を用いて配列決定する。
【０２３８】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】本発明によって単離された４つの抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（VHH ANTI-CD16 ）クローンのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３〜７６、１０３および１０４）ならびに４つの抗ＣＥＡ ＶＨＨ（VHH ANTI-CEA）クローンのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７７〜８０および１０５）を示す図。
【図２】本発明によって単離された４つの抗ＣＤ１６ ＶＨＨ（VHH anti-CD16 ）クローンのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１〜８４、１０６および１０７）ならびに４つの抗ＣＥＡ ＶＨＨ（VHH anti-CEA）クローンのヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８５〜８８および１０８）を示す図。
【図３】分析した８種のＶＨＨおよび対応する二重特異性抗体の特異性を実証するＦＡＣＳの結果を示す図。縦軸：細胞数、横軸：ＦＬ−１蛍光強度。（Gr anulocytes：顆粒球）
【図４】分析した８種のＶＨＨおよび対応する二重特異性抗体の特異性を実証するＦＡＣＳの結果を示す図。縦軸：細胞数、横軸：ＦＬ−１蛍光強度。（Granulocytes：顆粒球）
【図５】二重特異性抗体の細胞上への接近可能性を実証するＦＡＣＳの結果を示す図。縦軸：細胞数、横軸：ＦＬ−１蛍光強度。
【図６】２種の抗ＣＤ１６ ＶＨＨと抗ＣＤ１６モノクローナル抗体との間のＥＬＩＳＡによる競合テストの結果を示す図。
【図７】２種の抗ＣＤ１６ ＶＨＨと抗ＣＤ１６モノクローナル抗体との間のＦＡＣＳによる細胞上での競合プロファィルを示す図。縦軸：細胞数、横軸：ＦＬ−１蛍光強度。
【図８】２種の抗ＣＤ１６ ＶＨＨ、およびタイプＦ（ａｂ’）２の抗ＣＥＡ１７／抗ＣＤ１６ ｃ２１二重特異性抗体による、ＣＤ１６Ａの活性化の結果を示す図。
【図９】二重特異性抗体によって活性化されたナチュラルキラー細胞による細胞溶解の結果を示す図。
【図１０Ａ】本発明によるプラスミドの構築を示す図。
【図１０Ｂ】本発明によるプラスミドの構築を示す図。
【図１１】本発明のプラスミドの配列を示す図。
【図１２Ａ】Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、（ＨＣＨ２ＣＨ３）２およびｍＡｂ＊タイプの抗体フォーマットを示す図。
【図１２Ｂ】Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、（ＨＣＨ２ＣＨ３）２およびｍＡｂ＊タイプの抗体フォーマットを示す図。
【図１３】Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２タイプの抗体フラグメントを精製する種々の工程における該フラグメントの電気泳動ゲルを示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨまたはヒトＶＨドメインの全体または一部がヒト抗体の定常領域に融合されていることを特徴とする抗体フォーマット。
【請求項２】
前記抗体フォーマットはＦａｂタイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨドメインまたは２つのヒトＶＨドメイン、あるいはＶＨＨのＣＤＲが移植された２つのヒトＶＨドメインが結合したものからなり、該ドメインのうちの一方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣκまたはＣλに融合し、他方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣＨ１に融合していることを特徴とする、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項３】
前記抗体フォーマットはＦａｂ’タイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨドメインまたは２つのヒトＶＨドメイン、あるいはＶＨＨのＣＤＲが移植された２つのヒトＶＨドメインが結合したものからなり、該ドメインのうちの一方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣκまたはＣλに融合し、他方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣＨ１および後続するヒンジ領域Ｈに融合していることを特徴とする、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項４】
前記抗体フォーマットはＦ（ａｂ’）２タイプであり、請求項３に記載のＦａｂ’タイプの２つの抗体フォーマットが結合したものからなる、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項５】
前記抗体フォーマットはＦ（ａｂ’）２タイプであり、前記Ｆ（ａｂ’）２タイプのフォーマットを還元して得られた２つの同一もしくは異なるＦａｂ’が結合したものからなる、請求項４に記載の抗体フォーマット。
【請求項６】
前記抗体フォーマットは（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプであり、Ｈはヒト免疫グロブリンのヒンジ領域を表し、ＣＨ２およびＣＨ３はヒトＩｇの二番目および三番目のドメインを表し、前記抗体フォーマットは、２つの同一のＶＨＨまたはヒトＶＨ、あるいはＶＨＨの超可変領域が移植された２つのヒトＶＨが結合したものであって、各々がヒトのＩｇＧまたは他の任意のＩｇのＨ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に融合されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項７】
前記抗体フォーマットはｍＡｂ＊タイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨまたは２つのヒトＶＨ、あるいはＶＨＨの超可変領域が移植された２つのヒトＶＨが結合したものであって、一方がヒトのＣκまたはＣλ領域に融合し、他方がヒトＩｇのＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に融合していることを特徴とする、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項８】
免疫グロブリンは、ヒトのアイソフォームＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に相当するＩｇＧ、あるいはアイソフォームＩｇＡ１、ＩｇＡ２に相当するヒトのＩｇＡである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体フォーマット。
【請求項９】
ＶＨＨは、ヒトＶＨ、またはＶＨＨからヒトＶＨ上へのＣＤＲの移植によるヒト化ＶＨＨで置き換えられている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体フォーマット。
【請求項１０】
前記抗体フォーマットは抗ＣＤ１６または抗ＣＥＡ抗体フラグメントを含んでなり、前記フラグメントはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０４の配列またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７７、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．７８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８０およびＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１０５の配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に従うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体フォーマット。
【請求項１１】
ラクダ科、特にラマ由来のＶＨＨ抗体のフラグメントであって、前記フラグメントは抗ＣＤ１６または抗ＣＥＡ抗体フラグメントで構成されており、前記フラグメントはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０４の配列またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０５の配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に従うか、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０６およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０７の配列またはＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．８５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０８の配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列に従うことを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項１２】
ＶＨＨのＣＤＲで構成されることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１３】
キメラ化またはヒト化された、多重特異性または多価のうち少なくともいずれか一方である抗体を生産する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体フォーマットを使用することを含む、方法。
【請求項１４】
前記抗体フォーマットは、ラクダ科、特にラマ由来の抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨの可変ドメインが、
− ラクダ科動物、特にラマを、免疫原としてＣＥＡまたはＣＤ１６を用いて免疫することと、
− 血液から得られたＢリンパ球を精製することと、
− ＶＨＨバンクを構築することと、
− 該バンクからＶＨＨを単離することと
を含むプロトコールによって有利に生産されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記バンクの構築は、
− Ｂリンパ球からの全ＲＮＡの抽出と、
− 対応するｃＤＮＡを得るためのＲＮＡの逆転写と、
− 一本鎖重鎖の抗ＣＤ１６および抗ＣＥＡ抗体の可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲによる増幅と、
− ファージミドで増幅させたＤＮＡの酵素切断によって得られたＶＨＨ ＤＮＡフラグメントのライゲーションと
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＶＨＨはファージディスプレイ技術によってバンクから単離され、精製される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
選択されたＶＨＨの遺伝子を、発現ベクター、特にプラスミドに導入し、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体フォーマットを生産する、請求項１５〜１７のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体フォーマットの発現ベクター、特にプラスミドであって、２つのユニークな制限酵素切断部位の間に、プロモータと、シグナル配列と、前記抗体フォーマットをコードしうるヌクレオチド配列とを含んでなることを特徴とする発現ベクター。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１２の配列のプラスミドｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１００およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１４の配列のプラスミドｐＣκＣＨ１γ１であって、請求項２に記載のＦａｂタイプの抗体の生産を可能にするプラスミド。
【請求項２１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９９およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１３の配列のプラスミドｐＣκＣＨ１Ｈγ１−ＴＡＧならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０１およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１５の配列のプラスミドｐＣκＣＨ１Ｈγ１であって、請求項３および４に記載のＦａｂ’またはＦ（ａｂ’）２タイプの抗体の生産を可能にするプラスミド。
【請求項２２】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９５の配列のプラスミドｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１−ＴＡＧならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９６の配列のプラスミドｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１であって、請求項６に記載の（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプの抗体の生産を可能にするプラスミド。
【請求項２３】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０２およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１６の配列のプラスミドｐＭａｂγ１＊であって、請求項７に記載のｍＡｂ＊タイプの抗体の生産を可能にするプラスミド。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体フォーマットのうち少なくとも１つを含んでなる医薬組成物。
【請求項２５】
インビトロの免疫診断法であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体フォーマットを使用することを含む方法。
【請求項１】
ＶＨＨまたはヒト化ＶＨＨまたはヒトＶＨドメインの全体または一部がヒト抗体の定常領域に融合されていることを特徴とする抗体フォーマット。
【請求項２】
前記抗体フォーマットはＦａｂタイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨドメインまたは２つのヒトＶＨドメイン、あるいはＶＨＨのＣＤＲが移植された２つのヒトＶＨドメインが結合したものからなり、該ドメインのうちの一方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣκまたはＣλに融合し、他方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣＨ１に融合していることを特徴とする、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項３】
前記抗体フォーマットはＦａｂ’タイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨドメインまたは２つのヒトＶＨドメイン、あるいはＶＨＨのＣＤＲが移植された２つのヒトＶＨドメインが結合したものからなり、該ドメインのうちの一方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣκまたはＣλに融合し、他方がヒト免疫グロブリンの定常領域ＣＨ１および後続するヒンジ領域Ｈに融合していることを特徴とする、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項４】
前記抗体フォーマットはＦ（ａｂ’）２タイプであり、請求項３に記載のＦａｂ’タイプの２つの抗体フォーマットが結合したものからなる、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項５】
前記抗体フォーマットはＦ（ａｂ’）２タイプであり、前記Ｆ（ａｂ’）２タイプのフォーマットを還元して得られた２つの同一もしくは異なるＦａｂ’が結合したものからなる、請求項４に記載の抗体フォーマット。
【請求項６】
前記抗体フォーマットは（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプであり、Ｈはヒト免疫グロブリンのヒンジ領域を表し、ＣＨ２およびＣＨ３はヒトＩｇの二番目および三番目のドメインを表し、前記抗体フォーマットは、２つの同一のＶＨＨまたはヒトＶＨ、あるいはＶＨＨの超可変領域が移植された２つのヒトＶＨが結合したものであって、各々がヒトのＩｇＧまたは他の任意のＩｇのＨ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に融合されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項７】
前記抗体フォーマットはｍＡｂ＊タイプであり、２つの同一もしくは異なるＶＨＨまたは２つのヒトＶＨ、あるいはＶＨＨの超可変領域が移植された２つのヒトＶＨが結合したものであって、一方がヒトのＣκまたはＣλ領域に融合し、他方がヒトＩｇのＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に融合していることを特徴とする、請求項１に記載の抗体フォーマット。
【請求項８】
免疫グロブリンは、ヒトのアイソフォームＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に相当するＩｇＧ、あるいはアイソフォームＩｇＡ１、ＩｇＡ２に相当するヒトのＩｇＡである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体フォーマット。
【請求項９】
ＶＨＨは、ヒトＶＨ、またはＶＨＨからヒトＶＨ上へのＣＤＲの移植によるヒト化ＶＨＨで置き換えられている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体フォーマット。
【請求項１０】
前記抗体フォーマットは抗ＣＤ１６または抗ＣＥＡ抗体フラグメントを含んでなり、前記フラグメントはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０４の配列またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７７、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．７８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８０およびＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１０５の配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に従うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体フォーマット。
【請求項１１】
ラクダ科、特にラマ由来のＶＨＨ抗体のフラグメントであって、前記フラグメントは抗ＣＤ１６または抗ＣＥＡ抗体フラグメントで構成されており、前記フラグメントはそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０４の配列またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７８、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７９、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８０およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０５の配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に従うか、あるいは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０６およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０７の配列またはＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．８５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８７、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０８の配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列に従うことを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項１２】
ＶＨＨのＣＤＲで構成されることを特徴とする、請求項１１に記載の抗体フラグメント。
【請求項１３】
キメラ化またはヒト化された、多重特異性または多価のうち少なくともいずれか一方である抗体を生産する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体フォーマットを使用することを含む、方法。
【請求項１４】
前記抗体フォーマットは、ラクダ科、特にラマ由来の抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＣＥＡおよび抗ＣＤ１６ ＶＨＨの可変ドメインが、
− ラクダ科動物、特にラマを、免疫原としてＣＥＡまたはＣＤ１６を用いて免疫することと、
− 血液から得られたＢリンパ球を精製することと、
− ＶＨＨバンクを構築することと、
− 該バンクからＶＨＨを単離することと
を含むプロトコールによって有利に生産されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記バンクの構築は、
− Ｂリンパ球からの全ＲＮＡの抽出と、
− 対応するｃＤＮＡを得るためのＲＮＡの逆転写と、
− 一本鎖重鎖の抗ＣＤ１６および抗ＣＥＡ抗体の可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲによる増幅と、
− ファージミドで増幅させたＤＮＡの酵素切断によって得られたＶＨＨ ＤＮＡフラグメントのライゲーションと
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＶＨＨはファージディスプレイ技術によってバンクから単離され、精製される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
選択されたＶＨＨの遺伝子を、発現ベクター、特にプラスミドに導入し、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体フォーマットを生産する、請求項１５〜１７のいずれか１
項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体フォーマットの発現ベクター、特にプラスミドであって、２つのユニークな制限酵素切断部位の間に、プロモータと、シグナル配列と、前記抗体フォーマットをコードしうるヌクレオチド配列とを含んでなることを特徴とする発現ベクター。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１２の配列のプラスミドｐＣκＣＨ１γ１−ＴＡＧならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１００およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１４の配列のプラスミドｐＣκＣＨ１γ１であって、請求項２に記載のＦａｂタイプの抗体の生産を可能にするプラスミド。
【請求項２１】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９９およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１３の配列のプラスミドｐＣκＣＨ１Ｈγ１−ＴＡＧならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０１およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１５の配列のプラスミドｐＣκＣＨ１Ｈγ１であって、請求項３および４に記載のＦａｂ’またはＦ（ａｂ’）２タイプの抗体の生産を可能にするプラスミド。
【請求項２２】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９５の配列のプラスミドｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１−ＴＡＧならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９６の配列のプラスミドｐＨＣＨ２ＣＨ３γ１であって、請求項６に記載の（ＨＣＨ２ＣＨ３）２タイプの抗体の生産を可能にするプラスミド。
【請求項２３】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０２およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１６の配列のプラスミドｐＭａｂγ１＊であって、請求項７に記載のｍＡｂ＊タイプの抗体の生産を可能にするプラスミド。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体フォーマットのうち少なくとも１つを含んでなる医薬組成物。
【請求項２５】
インビトロの免疫診断法であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体フォーマットを使用することを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５２３７９５（Ｐ２００８−５２３７９５Ａ）
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４６１１９（Ｐ２００７−５４６１１９）
【出願日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００３１５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６４１３６
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０５０４５６１０）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ スィヤンティフィック（セーエヌエルエス） (41)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ（ＣＮＲＳ）
【出願人】（５９１０６０６１４）アンスチチュ ナショナル ド ラ サント エ ド ラ ルシェルシュ メディカル （アンセルム） (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００３１５１
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６４１３６
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（５０５０４５６１０）サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ スィヤンティフィック（セーエヌエルエス） (41)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ（ＣＮＲＳ）
【出願人】（５９１０６０６１４）アンスチチュ ナショナル ド ラ サント エ ド ラ ルシェルシュ メディカル （アンセルム） (2)
【Ｆターム（参考）】
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