抗体可変領域をコードするＤＮＡ
【課題】新規な感染症治療薬として使用可能なポリペプチドを提供すること。
【解決手段】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡを含有するベクター、当該組換えＤＮＡ又はベクターを含有する形質転換体、当該形質転換体を培養し、該培養物からＳ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドを採取する工程を含む、ポリペプチドの製造方法、前記ＤＮＡにコードされるポリペプチド。
【解決手段】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡを含有するベクター、当該組換えＤＮＡ又はベクターを含有する形質転換体、当該形質転換体を培養し、該培養物からＳ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドを採取する工程を含む、ポリペプチドの製造方法、前記ＤＮＡにコードされるポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症治療に有用な機能性抗体の可変領域をコードするＤＮＡに関する。更に詳しくは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡに関する。本発明は、また、当該抗体の可変領域を含有するポリペプチドの工業的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原核生物のプラスミドの中には、宿主でのプラスミドを維持するためにプラスミドが脱落した宿主を殺すｐｏｓｔ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｋｉｌｌｉｎｇ（ＰＳＫ）の機能を有するものが報告されている。これらのプラスミドにはトキシン−アンチトキシン系（以下、ＴＡ系と記載する。また、ＴＡモジュール、ＴＡ複合体、アディクションモジュールと称されていることがある）をコードする遺伝子が存在している。アンチトキシンは細胞内でトキシンと結合して複合体を形成することによってトキシンを不活化しているが、アンチトキシンはトキシンに比べて細胞内で不安定であり、アンチトキシンがプロテアーゼにより分解されることによってより安定なトキシンが活性化される（非特許文献１）。
【０００３】
このようなＴＡ系のひとつとして多数のバクテリアのクロモソームに存在するＭａｚＥ−ＭａｚＦ系がある。井上らは、トキシンであるＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）はリボソーム非依存的に特定の塩基配列を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを証明している。ＭａｚＦは、大腸菌、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（ＤＲ０６６２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ（Ｍｂ２０１４ｃ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどでホモログが見つかっている（非特許文献２）。
【０００４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦは、ＵＡＣＡＵの塩基配列を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦを認識し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦの相互作用を阻害する抗体は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ネイチャー・レビューズ・マイクロバイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第３巻、第３７１〜３８２頁（２００５）
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１８９巻、第８８７１〜８８７９頁（２００７）
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１９１巻、第３２４８〜３２５５頁（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、多剤耐性菌の出現は医療現場の大きな問題となっており、特定の細胞機能を標的とした新規な感染症治療薬の開発が望まれている。
したがって、本発明は上記のような問題を解決し、新規な感染症治療薬として使用可能なポリペプチドを提供すべくなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに特異的に結合する抗体を検索したところ、それらの中に、ＭａｚＦのエンドリボヌクレアーゼ活性を保持したまま、ＭａｚＥとの複合体形成を阻害する機能性抗体を見出し、当該抗体の活性断片及びこれらをコードするＤＮＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦを認識する抗体の製造に有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明を概説すれば、
［１］Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、
［２］重鎖可変領域をコードする塩基配列中に配列表の配列番号１１、１２及び１３で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含み、軽鎖可変領域をコードする塩基配列中に配列表の配列番号１４、１５及び１６で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含む［１］記載のＤＮＡ、
［３］配列表の配列番号８、１０に示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含む［２］記載のＤＮＡ、
［４］配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸に、１〜数個の欠失、置換、挿入、転置又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合してＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、
［６］［１］〜［５］いずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
［７］［６］記載の組換えＤＮＡを含有するベクター、
［８］［６］記載の組換えＤＮＡ又は［７］記載のベクターを含有する形質転換体、
［９］［８］記載の形質転換体を培養し、該培養物からＳ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドを採取する工程を含む、ポリペプチドの製造方法、
［１０］［１］〜［５］いずれか１項に記載のＤＮＡにコードされるポリペプチド、
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、トキシン又はアンチトキシンに特異的に結合し、かつトキシン−アンチトキシン間の相互作用を阻害することにより、トキシン−アンチトキシン複合体形成を妨害し、もって細菌の増殖を抑制もしくは細菌を死滅させる効果を発揮する抗体又は当該抗体の可変領域を含む断片あるいはそれらをコードする遺伝子を有効成分とする細菌感染症の予防・治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例２に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。
【図２】本発明の実施例２に係るＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を示す図である。
【図３】本発明の実施例３に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。
【図４】本発明の実施例３に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、「抗体」とは免疫原（抗原）を特異的に認識し結合する免疫グロブリン及び抗原結合部位を含むその断片を意味する。抗原結合部位を含むその断片としては、重鎖（Ｈ鎖、Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）、軽鎖（Ｌ鎖、Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域（ＶＨ、ＶＬ）又は定常領域などを単独で、あるいは組み合わせて使用することができる。一般的に重鎖には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖の５種類があり、軽鎖にはλ鎖とκ鎖の２種類が存在する。これらの分子の組み合わせによって、サブクラスがＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各抗体分子が形成される。本発明において使用する抗体としては、ヒト、あるいはマウスのような非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体を含むヒト化抗体、完全ヒト抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体（例えば、バイバレント抗体）、マルチ特異性抗体（例えば、バイスペシフィック抗体）又は１本鎖抗体（単鎖抗体、ｓｃＦｖ）、更にラクダやラマの持つＨ鎖のみからなる抗体から開発されたナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）やサメのＩｇＮＡＲなどの抗体様分子などが例示される。
【００１２】
本発明において、「抗体の可変領域」とは抗体のポリペプチド鎖内で極めて多様な配列を示す領域を意味し、Ｖ領域とも呼ばれる。可変領域は、４つのフレーム領域及び超可変領域である３つの抗原相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）から構成される。重鎖及び軽鎖とも、４つのフレームワーク配列の間に３つのＣＤＲが挿入された配置を有している。
【００１３】
本発明において、「ＭａｚＦ」及び「ＭａｚＥ」とは、それぞれ大腸菌が有しているタンパク質性毒素（トキシン）であるＭａｚＦタンパク質、及び抗毒素（アンチトキシン）であるＭａｚＥタンパク質、並びにこれらのホモログを意味する。細菌細胞内でＭａｚＦはＭａｚＥと安定なＴＡ複合体を形成し、そのためにＭａｚＦは細胞に対して毒性を発揮することがないが、細胞に対する様々なストレスに応答して、不安定なＭａｚＥがプロテアーゼによって分解を受けるとＭａｚＦがその毒性を発揮して、ＤＮＡ複製やタンパク質合成を制御する。本明細書ではＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＭａｚＦ及びＭａｚＥのホモログをそれぞれＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と記載する。
【００１４】
（１）本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡ
本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡは、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、当該タンパク質のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との相互作用を阻害する抗体である抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の可変領域をコードするＤＮＡである。前記抗体として、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆが例示される。抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの重鎖の可変領域をコードするＤＮＡは配列番号７に示される塩基配列を含み、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードする。軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは配列番号９に示される塩基配列を含み、配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードする。
【００１５】
ここで、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との相互作用を阻害するとは、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との結合によって阻害されているＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のエンドリボヌクレアーゼ活性を回復させることを意味し、必ずしもＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）複合体を解離させることを意味しない。
【００１６】
また、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ．ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８７）あるいは／及び、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１９６巻、第９０１頁（１９８７）を参照することにより、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの抗体活性を決定する可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）の配列を同定することができる。抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号１１に、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号１２に、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１３に、軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号１４に、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号１５に、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。これらのＣＤＲをコードする塩基配列を含むＤＮＡも本発明の抗体可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
【００１７】
本発明においては、配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸に、１〜数個の欠失、置換、挿入、転置又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、かつ、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害するポリペプチドをコードするＤＮＡをも含むものである。
【００１８】
本発明においては、更に配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害するポリペプチドをコードするＤＮＡをも含むものである。前記の「厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡ」は、例えば以下の方法により確認することができる。
【００１９】
まずＤＮＡをニトロセルロースやナイロンの膜に、変性処理により固定する。この膜をあらかじめ適当な化合物で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号８又は配列番号９の塩基配列に相補的なＤＮＡ、又は当該ＤＮＡの配列の連続した１２塩基以上からなるその一部を使用することができる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。
【００２０】
具体的には、例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したＤＮＡを同定する。前記の洗浄について、例えば０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃という条件が例示される。こうして得られたクローンは、本発明のＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡが保持されていると予想される。このクローンから得られたＤＮＡは、例えば公知の方法によりその塩基配列を決定し、適当な宿主−ベクター系を使用してこのＤＮＡがコードしているポリペプチドを発現させ、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−Ｍａｚ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｆ間相互作用を阻害する活性を有するかどうかを調べることができる。
【００２１】
本発明のＤＮＡがコードする抗体の可変領域のうち、ヒト以外の動物を免疫して得られた抗体由来のものについては、ヒトに投与する場合の免疫原性の軽減のために、当該抗体の可変領域（例えば配列番号８又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する領域）をヒト由来の定常領域に接合した「ヒト化キメラ抗体」を作成することができる（特開平７−１９４３８４号公報）。また、可変部領域の抗原性をアミノ酸置換・ヒト化によりヒトの抗原性に変換し、リガンド結合性は損なうことなく免疫原性を低下させることもできる（特開平８−２８０３８７公報）。更に、ＣＤＲ部分（例えば配列番号１１〜１６のアミノ酸配列を有するフラグメント）のみをヒト由来の抗体（アクセプター）に移植する方法（再構成）によってヒト化抗体を製造することができる。ＣＤＲのみならずフレームワーク部分の一部のアミノ酸を、ドナーの由来の配列とすることによってより抗原性を低めつつ、元の抗体の反応性を維持したヒト化抗体を作成することもできる（特許２８２８３４０号公報、特開平１１−４６９４号公報、特開平１１−２４３９５５号公報）。これらの「ヒト化キメラ抗体」の可変領域をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２２】
更に、Ｆａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体の二量体（Ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖抗体の三量体（Ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はミニボディー（Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などの抗体の可変領域を含む低分子化抗体をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２３】
（２）本発明のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、発現ベクター、組換え体、ポリペプチドの製造方法、本発明のＤＮＡにコードされるポリペプチド
本発明のＤＮＡは、後述のＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドの製造に使用することを目的として、適切なプロモーターの下流に接続した組換えＤＮＡとすることができる。プロモーターは使用しようとする宿主に応じたものを選択すればよい。更に、こうして得られた組換えＤＮＡを挿入した発現ベクターを作製することもでき、本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドを発現させることができる。例えば大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等において発現できるような発現ベクターがすでに多数知られており、本発明に使用することができる。前記の発現ベクターは公知のベクター、例えば市販のベクターに本発明のＤＮＡを挿入することでも作製してもよい。
【００２４】
次に、本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドを遺伝子工学的に製造する方法について説明する。まず前記のような本発明の組換えＤＮＡや発現ベクターを適当な宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等に導入して作製された形質転換体を作製する。この形質転換体を培養することにより、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドを生産させることができる。本発明には、前記（１）に記載した本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドが含まれる。当該ポリペプチドとしては、本発明を特に限定するものではないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、双特異性抗体、Ｆａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｔ−ｂｏｄｙやこれらの改変物が例示される。
【００２５】
ポリペプチドの発現は、後述の実施例１−（４）のような方法によりＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との結合や、実施例３のような方法によりＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用の阻害活性を測定することにより確認できる。また、形質転換体から本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドを精製するには、通常のタンパク質精製の手法を用いることができる。例えば、培養菌体を破砕し、目的のポリペプチドが可溶化していればその上清を直接、もしくは適切な前処理（塩析や限外ろ過等）を施した後にアフィニティー、疎水、イオン交換、ゲル濾過等のクロマトグラフィーに供することによって目的のポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドが培地中に分泌されている場合も同様に精製すればよい。
【００２６】
本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドは、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドである。更に、ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性に影響を全く及ぼさないか、影響を及ぼすとしても５０％程度まで、好ましくは２０％程度までの阻害効果を示す抗体が本発明の抗体としては好ましい。抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆは、ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を促進するため、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症の治療及び予防に極めて有用である。ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性は、例えば合成オリゴＲＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドを基質として、文献［モレキュラー・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）、第１２巻、第９１３〜９２３頁（２００３）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７１巻、第１７３〜１８３頁（２００７）］に記載された方法に従って測定することができる。また、ＭａｚＦによる切断位置の５’側にリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの５’末端を蛍光物質ＲＯＸで、３’末端を消光物質Ｅｃｌｉｐｓｅでそれぞれ標識した合成基質を使用してＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を高感度に測定する方法が国際公開第２００７／１０９７８１号パンフレットに記載されている。更に、ＭａｚＦの活性を、無細胞タンパク質合成系を用いて測定する方法がモレキュラー・セル、第１２巻、第９１３〜９２３頁（２００３）に記載されている。
【００２７】
ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性は、以下の方法によって測定することができる。ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）もしくはＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を容器に固相化し、ＢＳＡやミルクカゼインなどでブロッキングした後、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を固相化した場合はタグ配列を付加したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を固相化した場合はタグ配列を付加したＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を加える。室温あるいは３７℃で適当な時間インキュベーションした後、容器を洗浄し、次いで容器表面に結合したＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）あるいはＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をそれぞれに付加されたタグ配列に対する抗体を用いて検出する。この目的のために、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）には精製用のタグ配列（例えばＨｉｓタグ配列）の他にそれぞれ異なるタグ配列、例えばＭｙｃタグ配列やＨＡタグ配列などを付加しておくことが望ましい。例えば、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を固相化したプレートに本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドを添加してＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性を測定する場合、一定量のＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と濃度を変化させたポリペプチドの混合物を前記プレートにそれぞれ添加し、固相上のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合するＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を検出することによって複合体形成阻害活性を測定する事ができる。逆に、濃度を変化させたＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と競合するポリペプチド量を抗マウス標識抗体などで検出定量することによっても、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性を測定する事ができる。更に、前記測定系のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を交換してもよい。
【００２８】
本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドは、トキシンであるＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を活性化し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖抑制又はプログラム細胞死誘導などを引き起こす。したがって、当該ポリペプチドは、感染症治療剤として細菌感染、特にＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の治療において有用であり、場合により細菌の感染予防にも使用できる。当該ポリペプチドは、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、注射剤、坐剤又は徐放剤等の医薬製剤として安全に投与することができる。
【００２９】
本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを発現可能な形態で含む組換えＤＮＡを有効成分として含有する感染症治療剤は、前記組換えＤＮＡを含むネーキッド型、ベクター型等の核酸として含有させた任意の剤形とすることができる。ここで、ネーキッド型とは前記組換えＤＮＡの発現システムの他に核酸自体の自己複製機能や粒子（ファージ又はウイルス）への組み込み機能を有しない核酸を指す。ベクター型の感染症治療剤に使用できるベクターは、遺伝子の安定性、細菌への遺伝子導入効率により適宜選択すればよく、具体的にはプラスミドベクター、ウイルスベクター、又はファージベクターである。
【００３０】
本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを有効成分とする細菌感染症治療剤に用いられるベクターとして、ファージベクター又はファージミドベクターが好適に用いられる。これらのファージベクターあるいはファージミドベクターに本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを挿入することによって、効率よく目的の細菌内に導入し、本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを目的細菌内で発現させることができる。本発明で用いられるファージは特に限定されるものではないが、例えばブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）に感染するＰｈａｇｅ Ｋ［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１８６巻、第２８６２頁（２００４）］などを含めて多数のバクテリオファージが報告されており、これらのファージあるいはファージミドベクターを標的の細菌に合わせて適宜用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例により、更に詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲内に限定されるものではない。
【００３２】
参考例１ Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦ［ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］及びＭａｚＥ［ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］の発現、精製
ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の発現プラスミドベクターの構築とタンパク質発現・精製は以下のようにして行った。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１８９巻、第８８７１〜８８７９頁（２００７）の記載を参考にして、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１）を合成し、これを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターの制限酵素サイトＮｄｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ間にクローニングしたＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発現プラスミドベクター、ｐＥＴ２８ｍａｚＦｓａを構築した。また、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号２）を合成し、これを制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社製）ベクターの制限酵素サイトＮｃｏ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ間にクローニングしたＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発現プラスミドベクター、ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａを構築した。ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａは、そのＮ末端側からヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓのプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが２つ（国際公開第２００７／１０９６９７号パンフレット）、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が順に並んだ形のキメラタンパク質の発現ベクターである。
【００３３】
これら２種類のプラスミドベクターでそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体を３ＬのＬＢ培地中でＪａｒ培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、引き続き４時間培養を続けた。得られた菌体を４００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳに懸濁後、超音波処理して無細胞抽出液を調製し、これからＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を精製した。
【００３４】
実施例１ 抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体
（１）抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の作製
参考例１で調製したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液とした。この抗原溶液をＢＡＬＢ／ｃマウス４匹に投与し、メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１８２巻（１９９０）及びモノクローナル アンタイボディーズ：プリンシプル アンド プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）アカデミックプレス（１９９６）に記載の方法に従って、抗血清及びハイブリドーマを得た。この抗血清又はハイブリドーマ培養上清について、参考例１で調製したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を定法に従って固相化した９６−ウェル マイクロプレート［ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレート］を用いてＥＬＩＳＡを行うことによってＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特異的に結合する抗体を選択した。このモノクローナル抗体を抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆ、当該抗体を産生するハイブリドーマ細胞を７Ｂ−７Ｆ、とそれぞれ命名した。
【００３５】
このようにして、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを取得した。
【００３６】
（２）抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７ＦをコードするＤＮＡの遺伝子配列決定方法
実施例１−（１）で得られた抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの重鎖、並びに軽鎖の可変領域の遺伝子配列を決定するため、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１７８巻、第２４１−２５１貢（１９９５）を参照し、前記両鎖のｃＤＮＡのクローニングを実施した。ＳＭＡＲＴ（商標） ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クロンテック社製）及び表１に記載する抗体の重鎖、軽鎖それぞれの定常領域をコードする塩基配列に特異的なプライマーを用いることによって重鎖、軽鎖をコードするＤＮＡそれぞれの完全な可変領域の配列を決定した。下記実施例１−（３）に具体的な操作手順を示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
（３）抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７ＦをコードするＤＮＡの遺伝子配列決定
ハイブリドーマ細胞７Ｂ−７Ｆの１０ｍＬ培養分の細胞を３００μＬのＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）に懸濁した後、遠心分離し上清を完全に取り除いた。沈殿として回収した細胞を６００μＬのＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）添付のＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓに懸濁し溶解させ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社製）に通した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、当該キットのマニュアルに従いトータルＲＮＡの抽出を行った。
【００３９】
回収したトータルＲＮＡの０．５μｇを鋳型とし、逆転写反応のプライマーとして抗体の重鎖、軽鎖の定常領域にそれぞれ特異的なプライマーＲＣＧＮ１４２Ｂ（配列番号３）又はＨＲＣＫ１３６Ｂ（配列番号４）を１２ｐｍｏｌ及び２００Ｕｎｉｔ／ｍＬ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（タカラバイオ社製）を使用し、ＳＭＡＲＴ（商標） ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔのマニュアルに従って、ＳＭＡＲＴオリゴと呼ばれるオリゴヌクレオチドが連結した逆転写反応産物を調製した。
【００４０】
得られた逆転写反応産物２．５μＬ、２倍濃度のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を２５μＬ、ＳＭＡＲＴオリゴにアニールするＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘを５μＬ及び抗体の重鎖、軽鎖の定常領域にそれぞれ特異的なプライマーＲＣＧＮ１１８（配列番号５）又はＲＣＫＮ１２７（配列番号６）１０ｐｍｏｌを含む溶液を全量５０μＬに調製した。調製した溶液を９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で５秒を１サイクルとする反応を３０サイクル行いＰＣＲ産物とした。
【００４１】
ＴａＫａＲａ ＢＫＬ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用い、得られたＰＣＲ産物の５’末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩで切断したｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）に挿入した。得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体より抗体をコードする遺伝子を含むプラスミドを取得した。
【００４２】
Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（タカラバイオ社製）とＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（タカラバイオ社製）の２種類のプライマーを用いて、サンガー法の原理で得られたプラスミド内の抗体をコードする遺伝子配列情報を取得した。その重鎖可変領域の塩基配列を配列番号７に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を８に示す。また、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号９に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を１０に示す。更に、重鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３に示す。同様に、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６に示す。
【００４３】
（４）組換えファージの製造
配列番号７の塩基配列及びマウス抗体定常領域ＣＨ１領域の塩基配列を有する遺伝子と、配列番号９の塩基配列及びマウス抗体定常領域ＣＬ領域の塩基配列を有する遺伝子を、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ＧＥヘルスケア社製）を基に作製したファージミドベクターのＬａｃプロモーターの下流に作動可能になるように挿入し、発現用ファージミドベクターを作製した。この発現用ファージミドベクターとＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いて抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７ＦのＦａｂフラグメントを提示したファージを作製した。
【００４４】
実施例１と同様に作製したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０（シグマ社製）及び１％のＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳ溶液でブロッキングした。作製したファージをＭａｚＦ固相化プレートに添加し室温、６０分間インキュベーションし、その後プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。その後、０．５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗Ｍ１３ファージ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を添加し室温、６０分間反応させ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した後、基質である３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ、シグマ社製）を添加して発色させ、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００４５】
陰性のコントロールとして調製した大腸菌由来のＭａｚＦ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＭａｚＦホモログを固相化したプレートで同様の操作を行ったところ、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートでのみ結合活性が確認された。このことより、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの組換えＦａｂフラグメントは、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して特異的結合活性を示すことが確認された。
【００４６】
実施例２
（１）抗体によるＭａｚＥ−ＭａｚＦ相互作用阻害の高感度測定方法
ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を高感度に測定するため、蛍光物質と消光物質で標識されたキメラオリゴヌクレオチドを用いた活性測定系を以下の文献を参考にして構築した。
【００４７】
国際公開第２００７／１０９７８１号パンフレット
アナリティカル・バイオケミストリー、第３７１巻、第１７３〜１８３頁（２００７）
モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第６９巻、第５５９〜５６９頁（２００８）
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ ｏｎ ２７ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９
【００４８】
このアッセイ系では、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性によって二重標識キメラオリゴヌクレオチドが切断される結果、蛍光物質と消光物質の距離が離れ蛍光が生じる。活性測定系にＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とともにＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が共存する場合は、両者間で複合体が形成されるためにＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性は抑制され基質は分解されないが、反応系にＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用を阻害する抗体が共存する場合は複合体の解離もしくは不安定化が起こり、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性が発揮される結果、基質が分解されて蛍光強度が観測される。
ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性測定用基質として、上記文献を参考にして表２に記載する二重標識キメラオリゴヌクレオチド基質を用いた。表２において、ｒＵはリボヌクレオチド（ウラシル）を表す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
（２）ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用に対する抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の影響
実施例２−（１）の方法を用いた抗体によるＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性の測定は以下のようにして行った。
蛍光測定用マイクロプレートを用いて、参考例１で調製した０．５μＭのＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）１０μＬと、抗体溶液２５μＬ（２５ｐｍｏｌ）を混合して３７℃で１５分間反応させた後、参考例１で調製した０．５μＭのＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を５μＬ加えて４℃で６０分間反応させた。その後、基質溶液、１０μＬを加えて３７℃で９０分間反応させ、励起波長：４８５ｎｍ；蛍光波長：５３５ｎｍでの蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した。基質溶液の組成は３１２．５ｎＭの基質、１６．７５Ｕ／ｍＬのＲＮａｓｅインヒビター及び２．５倍濃度のｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅプロテアーゼインヒビターカクテルを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸バッファーｐＨ７．５である。
【００５１】
抗体溶液として、実施例１で作成した抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを使用した結果を図１に示す。図１中、基質、抗体溶液、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を混合した結果を黒丸で示す。コントロールとしては抗体溶液の代わりに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸バッファーｐＨ７．５を使用し、白三角で示す。
【００５２】
コントロール溶液を添加した場合、蛍光強度の増加は見られず、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性はＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）によって抑制されたままであるのに対し、モノクローナル抗体７Ｂ−７Ｆを添加した場合、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性によって基質が分解され反応時間とともに蛍光強度が増加した。
【００５３】
同様にして、基質及びＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を混合した場合（白丸）、基質、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを混合した場合（黒丸）、基質及び抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを混合した場合（白三角）を比較した結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を単独で加えた場合に比べて、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを加えた場合、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性が増強し、蛍光強度が増加した。
【００５４】
実施例３ ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用に対する抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の影響
抗体によるＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性の測定は抗原固相化プレートを用いた競合アッセイ法でも行った。９６ウェル マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに、参考例１のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）又はＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をそれぞれ２μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ添加して固相化した。固相化は４℃で１４時間行った。
まず、固相化したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に相互作用するＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して、実施例１で調製した抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの濃度を変化させて添加する競合アッセイを行った。ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳ溶液でブロッキングした。０〜１２５０ｎｇの抗体と２ｎｇのＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を含む混合液５０μＬをＭａｚＦ固相化プレートに添加し、更に４℃、６０分間インキュベーションし、その後プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。固相プレート上に結合しているＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を検出するために、ＭａｚＥに付加したＰｒｏｔｅｉｎＳに対する抗体を用いた。ＨＲＰ標識抗ＰｒｏｔｅｉｎＳ抗体の反応は濃度０．２μｇ／ｍＬの抗体溶液を５０μＬ加えて室温、６０分間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した後、基質である３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ、シグマ社製）を５０μＬ添加して発色させ、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５５】
結果を図３に示す。図３から明らかなように、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの濃度に依存してプレートに固相化したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合するＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）量が減少した。
【００５６】
次に、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の濃度を変化させて添加する競合アッセイを行った。ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でブロッキングを行った。２５ｎｇの抗体と０〜５μｇのＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を含む混合液５０μＬを、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートに添加し、更に４℃、６０分間インキュベーションし、その後プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。固相プレート上に結合している抗体は、０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μＬ添加して検出した。２次抗体の反応は室温、６０分間である。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液でプレートを洗浄した後、ＴＭＢを５０μＬ添加して発色させ、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５７】
結果を図４に示す。図４から明らかなように、プレートに固相化したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合する抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）モノクローナル抗体７Ｂ−７Ｆは、添加したＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）量に依存して減少した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特異的に結合し、かつＭａｚＦ−ＭａｚＥの相互作用を阻害することにより、病原性細菌の増殖を抑制もしくは細菌を死滅させる効果を発揮する抗体の可変領域をコードするＤＮＡが提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
SEQ ID NO:1: Nucleic acid sequence containing MazF (S.aureus).
SEQ ID NO:2: Nucleic acid sequence containing MazE (S.aureus).
SEQ ID NO:3: Primer RCGN142B
SEQ ID NO:4: Primer HRCK136B
SEQ ID NO:5: Primer RCGN118
SEQ ID NO:6: Primer RCKN127
SEQ ID NO:7: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain variable region.
SEQ ID NO:8: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain variable region.
SEQ ID NO:9: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain variable region.
SEQ ID NO:10: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain variable region.
SEQ ID NO:11: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain CDR1.
SEQ ID NO:12: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain CDR2.
SEQ ID NO:13: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain CDR3.
SEQ ID NO:14: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain CDR1.
SEQ ID NO:15: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain CDR2.
SEQ ID NO:16: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain CDR3.
SEQ ID NO:17: Substrate for MazF ribonuclease assay. nucleotides 6 is ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症治療に有用な機能性抗体の可変領域をコードするＤＮＡに関する。更に詳しくは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡに関する。本発明は、また、当該抗体の可変領域を含有するポリペプチドの工業的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
原核生物のプラスミドの中には、宿主でのプラスミドを維持するためにプラスミドが脱落した宿主を殺すｐｏｓｔ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｋｉｌｌｉｎｇ（ＰＳＫ）の機能を有するものが報告されている。これらのプラスミドにはトキシン−アンチトキシン系（以下、ＴＡ系と記載する。また、ＴＡモジュール、ＴＡ複合体、アディクションモジュールと称されていることがある）をコードする遺伝子が存在している。アンチトキシンは細胞内でトキシンと結合して複合体を形成することによってトキシンを不活化しているが、アンチトキシンはトキシンに比べて細胞内で不安定であり、アンチトキシンがプロテアーゼにより分解されることによってより安定なトキシンが活性化される（非特許文献１）。
【０００３】
このようなＴＡ系のひとつとして多数のバクテリアのクロモソームに存在するＭａｚＥ−ＭａｚＦ系がある。井上らは、トキシンであるＭａｚＦ（ＣｈｐＡＫ）はリボソーム非依存的に特定の塩基配列を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることを証明している。ＭａｚＦは、大腸菌、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（ＤＲ０６６２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ（Ｍｂ２０１４ｃ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどでホモログが見つかっている（非特許文献２）。
【０００４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦは、ＵＡＣＡＵの塩基配列を認識してｍＲＮＡを切断するエンドリボヌクレアーゼであることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦを認識し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦの相互作用を阻害する抗体は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ネイチャー・レビューズ・マイクロバイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第３巻、第３７１〜３８２頁（２００５）
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第１８９巻、第８８７１〜８８７９頁（２００７）
【非特許文献３】ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１９１巻、第３２４８〜３２５５頁（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、多剤耐性菌の出現は医療現場の大きな問題となっており、特定の細胞機能を標的とした新規な感染症治療薬の開発が望まれている。
したがって、本発明は上記のような問題を解決し、新規な感染症治療薬として使用可能なポリペプチドを提供すべくなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに特異的に結合する抗体を検索したところ、それらの中に、ＭａｚＦのエンドリボヌクレアーゼ活性を保持したまま、ＭａｚＥとの複合体形成を阻害する機能性抗体を見出し、当該抗体の活性断片及びこれらをコードするＤＮＡは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦを認識する抗体の製造に有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明を概説すれば、
［１］Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、
［２］重鎖可変領域をコードする塩基配列中に配列表の配列番号１１、１２及び１３で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含み、軽鎖可変領域をコードする塩基配列中に配列表の配列番号１４、１５及び１６で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含む［１］記載のＤＮＡ、
［３］配列表の配列番号８、１０に示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含む［２］記載のＤＮＡ、
［４］配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸に、１〜数個の欠失、置換、挿入、転置又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合してＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ、
［６］［１］〜［５］いずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
［７］［６］記載の組換えＤＮＡを含有するベクター、
［８］［６］記載の組換えＤＮＡ又は［７］記載のベクターを含有する形質転換体、
［９］［８］記載の形質転換体を培養し、該培養物からＳ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドを採取する工程を含む、ポリペプチドの製造方法、
［１０］［１］〜［５］いずれか１項に記載のＤＮＡにコードされるポリペプチド、
である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、トキシン又はアンチトキシンに特異的に結合し、かつトキシン−アンチトキシン間の相互作用を阻害することにより、トキシン−アンチトキシン複合体形成を妨害し、もって細菌の増殖を抑制もしくは細菌を死滅させる効果を発揮する抗体又は当該抗体の可変領域を含む断片あるいはそれらをコードする遺伝子を有効成分とする細菌感染症の予防・治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例２に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。
【図２】本発明の実施例２に係るＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を示す図である。
【図３】本発明の実施例３に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。
【図４】本発明の実施例３に係る細菌ＴＡ系の相互作用阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、「抗体」とは免疫原（抗原）を特異的に認識し結合する免疫グロブリン及び抗原結合部位を含むその断片を意味する。抗原結合部位を含むその断片としては、重鎖（Ｈ鎖、Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）、軽鎖（Ｌ鎖、Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域（ＶＨ、ＶＬ）又は定常領域などを単独で、あるいは組み合わせて使用することができる。一般的に重鎖には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖の５種類があり、軽鎖にはλ鎖とκ鎖の２種類が存在する。これらの分子の組み合わせによって、サブクラスがＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各抗体分子が形成される。本発明において使用する抗体としては、ヒト、あるいはマウスのような非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体を含むヒト化抗体、完全ヒト抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体（例えば、バイバレント抗体）、マルチ特異性抗体（例えば、バイスペシフィック抗体）又は１本鎖抗体（単鎖抗体、ｓｃＦｖ）、更にラクダやラマの持つＨ鎖のみからなる抗体から開発されたナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）やサメのＩｇＮＡＲなどの抗体様分子などが例示される。
【００１２】
本発明において、「抗体の可変領域」とは抗体のポリペプチド鎖内で極めて多様な配列を示す領域を意味し、Ｖ領域とも呼ばれる。可変領域は、４つのフレーム領域及び超可変領域である３つの抗原相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）から構成される。重鎖及び軽鎖とも、４つのフレームワーク配列の間に３つのＣＤＲが挿入された配置を有している。
【００１３】
本発明において、「ＭａｚＦ」及び「ＭａｚＥ」とは、それぞれ大腸菌が有しているタンパク質性毒素（トキシン）であるＭａｚＦタンパク質、及び抗毒素（アンチトキシン）であるＭａｚＥタンパク質、並びにこれらのホモログを意味する。細菌細胞内でＭａｚＦはＭａｚＥと安定なＴＡ複合体を形成し、そのためにＭａｚＦは細胞に対して毒性を発揮することがないが、細胞に対する様々なストレスに応答して、不安定なＭａｚＥがプロテアーゼによって分解を受けるとＭａｚＦがその毒性を発揮して、ＤＮＡ複製やタンパク質合成を制御する。本明細書ではＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＭａｚＦ及びＭａｚＥのホモログをそれぞれＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と記載する。
【００１４】
（１）本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡ
本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡは、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、当該タンパク質のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との相互作用を阻害する抗体である抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の可変領域をコードするＤＮＡである。前記抗体として、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆが例示される。抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの重鎖の可変領域をコードするＤＮＡは配列番号７に示される塩基配列を含み、配列番号８に示されるアミノ酸配列をコードする。軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは配列番号９に示される塩基配列を含み、配列番号１０に示されるアミノ酸配列をコードする。
【００１５】
ここで、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との相互作用を阻害するとは、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との結合によって阻害されているＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のエンドリボヌクレアーゼ活性を回復させることを意味し、必ずしもＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）複合体を解離させることを意味しない。
【００１６】
また、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ．ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９８７）あるいは／及び、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１９６巻、第９０１頁（１９８７）を参照することにより、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの抗体活性を決定する可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）の配列を同定することができる。抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号１１に、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号１２に、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１３に、軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号１４に、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号１５に、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。これらのＣＤＲをコードする塩基配列を含むＤＮＡも本発明の抗体可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。
【００１７】
本発明においては、配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸に、１〜数個の欠失、置換、挿入、転置又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、かつ、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害するポリペプチドをコードするＤＮＡをも含むものである。
【００１８】
本発明においては、更に配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害するポリペプチドをコードするＤＮＡをも含むものである。前記の「厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡ」は、例えば以下の方法により確認することができる。
【００１９】
まずＤＮＡをニトロセルロースやナイロンの膜に、変性処理により固定する。この膜をあらかじめ適当な化合物で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号８又は配列番号９の塩基配列に相補的なＤＮＡ、又は当該ＤＮＡの配列の連続した１２塩基以上からなるその一部を使用することができる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。
【００２０】
具体的には、例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中、６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したＤＮＡを同定する。前記の洗浄について、例えば０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃という条件が例示される。こうして得られたクローンは、本発明のＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡが保持されていると予想される。このクローンから得られたＤＮＡは、例えば公知の方法によりその塩基配列を決定し、適当な宿主−ベクター系を使用してこのＤＮＡがコードしているポリペプチドを発現させ、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−Ｍａｚ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｆ間相互作用を阻害する活性を有するかどうかを調べることができる。
【００２１】
本発明のＤＮＡがコードする抗体の可変領域のうち、ヒト以外の動物を免疫して得られた抗体由来のものについては、ヒトに投与する場合の免疫原性の軽減のために、当該抗体の可変領域（例えば配列番号８又は配列番号１０のアミノ酸配列を有する領域）をヒト由来の定常領域に接合した「ヒト化キメラ抗体」を作成することができる（特開平７−１９４３８４号公報）。また、可変部領域の抗原性をアミノ酸置換・ヒト化によりヒトの抗原性に変換し、リガンド結合性は損なうことなく免疫原性を低下させることもできる（特開平８−２８０３８７公報）。更に、ＣＤＲ部分（例えば配列番号１１〜１６のアミノ酸配列を有するフラグメント）のみをヒト由来の抗体（アクセプター）に移植する方法（再構成）によってヒト化抗体を製造することができる。ＣＤＲのみならずフレームワーク部分の一部のアミノ酸を、ドナーの由来の配列とすることによってより抗原性を低めつつ、元の抗体の反応性を維持したヒト化抗体を作成することもできる（特許２８２８３４０号公報、特開平１１−４６９４号公報、特開平１１−２４３９５５号公報）。これらの「ヒト化キメラ抗体」の可変領域をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２２】
更に、Ｆａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体の二量体（Ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖抗体の三量体（Ｔｒｉａｂｏｄｙ）又はミニボディー（Ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などの抗体の可変領域を含む低分子化抗体をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２３】
（２）本発明のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、発現ベクター、組換え体、ポリペプチドの製造方法、本発明のＤＮＡにコードされるポリペプチド
本発明のＤＮＡは、後述のＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドの製造に使用することを目的として、適切なプロモーターの下流に接続した組換えＤＮＡとすることができる。プロモーターは使用しようとする宿主に応じたものを選択すればよい。更に、こうして得られた組換えＤＮＡを挿入した発現ベクターを作製することもでき、本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドを発現させることができる。例えば大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等において発現できるような発現ベクターがすでに多数知られており、本発明に使用することができる。前記の発現ベクターは公知のベクター、例えば市販のベクターに本発明のＤＮＡを挿入することでも作製してもよい。
【００２４】
次に、本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドを遺伝子工学的に製造する方法について説明する。まず前記のような本発明の組換えＤＮＡや発現ベクターを適当な宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等に導入して作製された形質転換体を作製する。この形質転換体を培養することにより、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドを生産させることができる。本発明には、前記（１）に記載した本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドが含まれる。当該ポリペプチドとしては、本発明を特に限定するものではないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、双特異性抗体、Ｆａｂ、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｔ−ｂｏｄｙやこれらの改変物が例示される。
【００２５】
ポリペプチドの発現は、後述の実施例１−（４）のような方法によりＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）との結合や、実施例３のような方法によりＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用の阻害活性を測定することにより確認できる。また、形質転換体から本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドを精製するには、通常のタンパク質精製の手法を用いることができる。例えば、培養菌体を破砕し、目的のポリペプチドが可溶化していればその上清を直接、もしくは適切な前処理（塩析や限外ろ過等）を施した後にアフィニティー、疎水、イオン交換、ゲル濾過等のクロマトグラフィーに供することによって目的のポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドが培地中に分泌されている場合も同様に精製すればよい。
【００２６】
本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドは、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合し、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドである。更に、ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性に影響を全く及ぼさないか、影響を及ぼすとしても５０％程度まで、好ましくは２０％程度までの阻害効果を示す抗体が本発明の抗体としては好ましい。抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆは、ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を促進するため、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染症の治療及び予防に極めて有用である。ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性は、例えば合成オリゴＲＮＡあるいはＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドを基質として、文献［モレキュラー・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）、第１２巻、第９１３〜９２３頁（２００３）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３７１巻、第１７３〜１８３頁（２００７）］に記載された方法に従って測定することができる。また、ＭａｚＦによる切断位置の５’側にリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの５’末端を蛍光物質ＲＯＸで、３’末端を消光物質Ｅｃｌｉｐｓｅでそれぞれ標識した合成基質を使用してＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を高感度に測定する方法が国際公開第２００７／１０９７８１号パンフレットに記載されている。更に、ＭａｚＦの活性を、無細胞タンパク質合成系を用いて測定する方法がモレキュラー・セル、第１２巻、第９１３〜９２３頁（２００３）に記載されている。
【００２７】
ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性は、以下の方法によって測定することができる。ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）もしくはＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を容器に固相化し、ＢＳＡやミルクカゼインなどでブロッキングした後、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を固相化した場合はタグ配列を付加したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を固相化した場合はタグ配列を付加したＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を加える。室温あるいは３７℃で適当な時間インキュベーションした後、容器を洗浄し、次いで容器表面に結合したＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）あるいはＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をそれぞれに付加されたタグ配列に対する抗体を用いて検出する。この目的のために、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）には精製用のタグ配列（例えばＨｉｓタグ配列）の他にそれぞれ異なるタグ配列、例えばＭｙｃタグ配列やＨＡタグ配列などを付加しておくことが望ましい。例えば、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を固相化したプレートに本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドを添加してＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性を測定する場合、一定量のＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と濃度を変化させたポリペプチドの混合物を前記プレートにそれぞれ添加し、固相上のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合するＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を検出することによって複合体形成阻害活性を測定する事ができる。逆に、濃度を変化させたＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と競合するポリペプチド量を抗マウス標識抗体などで検出定量することによっても、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性を測定する事ができる。更に、前記測定系のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を交換してもよい。
【００２８】
本発明のＤＮＡにコードされる抗体の可変領域を含有するポリペプチドは、トキシンであるＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を活性化し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖抑制又はプログラム細胞死誘導などを引き起こす。したがって、当該ポリペプチドは、感染症治療剤として細菌感染、特にＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症の治療において有用であり、場合により細菌の感染予防にも使用できる。当該ポリペプチドは、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、注射剤、坐剤又は徐放剤等の医薬製剤として安全に投与することができる。
【００２９】
本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを発現可能な形態で含む組換えＤＮＡを有効成分として含有する感染症治療剤は、前記組換えＤＮＡを含むネーキッド型、ベクター型等の核酸として含有させた任意の剤形とすることができる。ここで、ネーキッド型とは前記組換えＤＮＡの発現システムの他に核酸自体の自己複製機能や粒子（ファージ又はウイルス）への組み込み機能を有しない核酸を指す。ベクター型の感染症治療剤に使用できるベクターは、遺伝子の安定性、細菌への遺伝子導入効率により適宜選択すればよく、具体的にはプラスミドベクター、ウイルスベクター、又はファージベクターである。
【００３０】
本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを有効成分とする細菌感染症治療剤に用いられるベクターとして、ファージベクター又はファージミドベクターが好適に用いられる。これらのファージベクターあるいはファージミドベクターに本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを挿入することによって、効率よく目的の細菌内に導入し、本発明の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを目的細菌内で発現させることができる。本発明で用いられるファージは特に限定されるものではないが、例えばブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）に感染するＰｈａｇｅ Ｋ［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１８６巻、第２８６２頁（２００４）］などを含めて多数のバクテリオファージが報告されており、これらのファージあるいはファージミドベクターを標的の細菌に合わせて適宜用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例により、更に詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲内に限定されるものではない。
【００３２】
参考例１ Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦ［ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］及びＭａｚＥ［ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）］の発現、精製
ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の発現プラスミドベクターの構築とタンパク質発現・精製は以下のようにして行った。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１８９巻、第８８７１〜８８７９頁（２００７）の記載を参考にして、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号１）を合成し、これを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ベクターの制限酵素サイトＮｄｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ間にクローニングしたＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発現プラスミドベクター、ｐＥＴ２８ｍａｚＦｓａを構築した。また、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をコードする遺伝子を含むＤＮＡ（配列番号２）を合成し、これを制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＢａｍＨ Ｉで消化した。このＤＮＡをｐＥＴ２８ａ（ノバジェン社製）ベクターの制限酵素サイトＮｃｏ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ間にクローニングしたＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）発現プラスミドベクター、ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａを構築した。ｐＨｉｓＰｒＳ２ＭａｚＥｓａは、そのＮ末端側からヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｘａｎｔｈｕｓのプロテインＳのＮ末端ポリペプチドが２つ（国際公開第２００７／１０９６９７号パンフレット）、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が順に並んだ形のキメラタンパク質の発現ベクターである。
【００３３】
これら２種類のプラスミドベクターでそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られた形質転換体を３ＬのＬＢ培地中でＪａｒ培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、引き続き４時間培養を続けた。得られた菌体を４００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳに懸濁後、超音波処理して無細胞抽出液を調製し、これからＨｉｓ Ｔｒａｐ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を精製した。
【００３４】
実施例１ 抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体
（１）抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の作製
参考例１で調製したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液とした。この抗原溶液をＢＡＬＢ／ｃマウス４匹に投与し、メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１８２巻（１９９０）及びモノクローナル アンタイボディーズ：プリンシプル アンド プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）アカデミックプレス（１９９６）に記載の方法に従って、抗血清及びハイブリドーマを得た。この抗血清又はハイブリドーマ培養上清について、参考例１で調製したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を定法に従って固相化した９６−ウェル マイクロプレート［ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレート］を用いてＥＬＩＳＡを行うことによってＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特異的に結合する抗体を選択した。このモノクローナル抗体を抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆ、当該抗体を産生するハイブリドーマ細胞を７Ｂ−７Ｆ、とそれぞれ命名した。
【００３５】
このようにして、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを取得した。
【００３６】
（２）抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７ＦをコードするＤＮＡの遺伝子配列決定方法
実施例１−（１）で得られた抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの重鎖、並びに軽鎖の可変領域の遺伝子配列を決定するため、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１７８巻、第２４１−２５１貢（１９９５）を参照し、前記両鎖のｃＤＮＡのクローニングを実施した。ＳＭＡＲＴ（商標） ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クロンテック社製）及び表１に記載する抗体の重鎖、軽鎖それぞれの定常領域をコードする塩基配列に特異的なプライマーを用いることによって重鎖、軽鎖をコードするＤＮＡそれぞれの完全な可変領域の配列を決定した。下記実施例１−（３）に具体的な操作手順を示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
（３）抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７ＦをコードするＤＮＡの遺伝子配列決定
ハイブリドーマ細胞７Ｂ−７Ｆの１０ｍＬ培養分の細胞を３００μＬのＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）に懸濁した後、遠心分離し上清を完全に取り除いた。沈殿として回収した細胞を６００μＬのＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）添付のＢｕｆｆｅｒ ＲＬＴ Ｐｌｕｓに懸濁し溶解させ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社製）に通した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、当該キットのマニュアルに従いトータルＲＮＡの抽出を行った。
【００３９】
回収したトータルＲＮＡの０．５μｇを鋳型とし、逆転写反応のプライマーとして抗体の重鎖、軽鎖の定常領域にそれぞれ特異的なプライマーＲＣＧＮ１４２Ｂ（配列番号３）又はＨＲＣＫ１３６Ｂ（配列番号４）を１２ｐｍｏｌ及び２００Ｕｎｉｔ／ｍＬ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（タカラバイオ社製）を使用し、ＳＭＡＲＴ（商標） ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔのマニュアルに従って、ＳＭＡＲＴオリゴと呼ばれるオリゴヌクレオチドが連結した逆転写反応産物を調製した。
【００４０】
得られた逆転写反応産物２．５μＬ、２倍濃度のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を２５μＬ、ＳＭＡＲＴオリゴにアニールするＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘを５μＬ及び抗体の重鎖、軽鎖の定常領域にそれぞれ特異的なプライマーＲＣＧＮ１１８（配列番号５）又はＲＣＫＮ１２７（配列番号６）１０ｐｍｏｌを含む溶液を全量５０μＬに調製した。調製した溶液を９８℃で１０秒、５５℃で５秒、７２℃で５秒を１サイクルとする反応を３０サイクル行いＰＣＲ産物とした。
【００４１】
ＴａＫａＲａ ＢＫＬ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用い、得られたＰＣＲ産物の５’末端をリン酸化し、ＨｉｎｃＩＩで切断したｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）に挿入した。得られた組換えＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体より抗体をコードする遺伝子を含むプラスミドを取得した。
【００４２】
Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（タカラバイオ社製）とＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（タカラバイオ社製）の２種類のプライマーを用いて、サンガー法の原理で得られたプラスミド内の抗体をコードする遺伝子配列情報を取得した。その重鎖可変領域の塩基配列を配列番号７に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を８に示す。また、軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号９に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を１０に示す。更に、重鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３に示す。同様に、軽鎖可変領域中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３をそれぞれ配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６に示す。
【００４３】
（４）組換えファージの製造
配列番号７の塩基配列及びマウス抗体定常領域ＣＨ１領域の塩基配列を有する遺伝子と、配列番号９の塩基配列及びマウス抗体定常領域ＣＬ領域の塩基配列を有する遺伝子を、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（ＧＥヘルスケア社製）を基に作製したファージミドベクターのＬａｃプロモーターの下流に作動可能になるように挿入し、発現用ファージミドベクターを作製した。この発現用ファージミドベクターとＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いて抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７ＦのＦａｂフラグメントを提示したファージを作製した。
【００４４】
実施例１と同様に作製したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０（シグマ社製）及び１％のＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳ溶液でブロッキングした。作製したファージをＭａｚＦ固相化プレートに添加し室温、６０分間インキュベーションし、その後プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。その後、０．５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗Ｍ１３ファージ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を添加し室温、６０分間反応させ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した後、基質である３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ、シグマ社製）を添加して発色させ、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００４５】
陰性のコントロールとして調製した大腸菌由来のＭａｚＦ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＭａｚＦホモログを固相化したプレートで同様の操作を行ったところ、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートでのみ結合活性が確認された。このことより、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの組換えＦａｂフラグメントは、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して特異的結合活性を示すことが確認された。
【００４６】
実施例２
（１）抗体によるＭａｚＥ−ＭａｚＦ相互作用阻害の高感度測定方法
ＭａｚＦのリボヌクレアーゼ活性を高感度に測定するため、蛍光物質と消光物質で標識されたキメラオリゴヌクレオチドを用いた活性測定系を以下の文献を参考にして構築した。
【００４７】
国際公開第２００７／１０９７８１号パンフレット
アナリティカル・バイオケミストリー、第３７１巻、第１７３〜１８３頁（２００７）
モレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第６９巻、第５５９〜５６９頁（２００８）
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ ｏｎ ２７ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９
【００４８】
このアッセイ系では、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性によって二重標識キメラオリゴヌクレオチドが切断される結果、蛍光物質と消光物質の距離が離れ蛍光が生じる。活性測定系にＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とともにＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が共存する場合は、両者間で複合体が形成されるためにＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性は抑制され基質は分解されないが、反応系にＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用を阻害する抗体が共存する場合は複合体の解離もしくは不安定化が起こり、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性が発揮される結果、基質が分解されて蛍光強度が観測される。
ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性測定用基質として、上記文献を参考にして表２に記載する二重標識キメラオリゴヌクレオチド基質を用いた。表２において、ｒＵはリボヌクレオチド（ウラシル）を表す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
（２）ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用に対する抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の影響
実施例２−（１）の方法を用いた抗体によるＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性の測定は以下のようにして行った。
蛍光測定用マイクロプレートを用いて、参考例１で調製した０．５μＭのＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）１０μＬと、抗体溶液２５μＬ（２５ｐｍｏｌ）を混合して３７℃で１５分間反応させた後、参考例１で調製した０．５μＭのＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を５μＬ加えて４℃で６０分間反応させた。その後、基質溶液、１０μＬを加えて３７℃で９０分間反応させ、励起波長：４８５ｎｍ；蛍光波長：５３５ｎｍでの蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した。基質溶液の組成は３１２．５ｎＭの基質、１６．７５Ｕ／ｍＬのＲＮａｓｅインヒビター及び２．５倍濃度のｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅプロテアーゼインヒビターカクテルを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸バッファーｐＨ７．５である。
【００５１】
抗体溶液として、実施例１で作成した抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを使用した結果を図１に示す。図１中、基質、抗体溶液、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を混合した結果を黒丸で示す。コントロールとしては抗体溶液の代わりに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸バッファーｐＨ７．５を使用し、白三角で示す。
【００５２】
コントロール溶液を添加した場合、蛍光強度の増加は見られず、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性はＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）によって抑制されたままであるのに対し、モノクローナル抗体７Ｂ−７Ｆを添加した場合、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性によって基質が分解され反応時間とともに蛍光強度が増加した。
【００５３】
同様にして、基質及びＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を混合した場合（白丸）、基質、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを混合した場合（黒丸）、基質及び抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを混合した場合（白三角）を比較した結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を単独で加えた場合に比べて、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆを加えた場合、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のリボヌクレアーゼ活性が増強し、蛍光強度が増加した。
【００５４】
実施例３ ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用に対する抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体の影響
抗体によるＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）−ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相互作用阻害活性の測定は抗原固相化プレートを用いた競合アッセイ法でも行った。９６ウェル マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに、参考例１のＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）又はＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をそれぞれ２μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ添加して固相化した。固相化は４℃で１４時間行った。
まず、固相化したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に相互作用するＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対して、実施例１で調製した抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの濃度を変化させて添加する競合アッセイを行った。ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡ（シグマ社製）を含むＰＢＳ溶液でブロッキングした。０〜１２５０ｎｇの抗体と２ｎｇのＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を含む混合液５０μＬをＭａｚＦ固相化プレートに添加し、更に４℃、６０分間インキュベーションし、その後プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。固相プレート上に結合しているＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を検出するために、ＭａｚＥに付加したＰｒｏｔｅｉｎＳに対する抗体を用いた。ＨＲＰ標識抗ＰｒｏｔｅｉｎＳ抗体の反応は濃度０．２μｇ／ｍＬの抗体溶液を５０μＬ加えて室温、６０分間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した後、基質である３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ、シグマ社製）を５０μＬ添加して発色させ、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５５】
結果を図３に示す。図３から明らかなように、抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体７Ｂ−７Ｆの濃度に依存してプレートに固相化したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合するＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）量が減少した。
【００５６】
次に、ＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の濃度を変化させて添加する競合アッセイを行った。ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でブロッキングを行った。２５ｎｇの抗体と０〜５μｇのＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を含む混合液５０μＬを、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）固相化プレートに添加し、更に４℃、６０分間インキュベーションし、その後プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄した。固相プレート上に結合している抗体は、０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μＬ添加して検出した。２次抗体の反応は室温、６０分間である。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液でプレートを洗浄した後、ＴＭＢを５０μＬ添加して発色させ、１Ｎの硫酸を等量加えて反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
【００５７】
結果を図４に示す。図４から明らかなように、プレートに固相化したＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合する抗ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）モノクローナル抗体７Ｂ−７Ｆは、添加したＭａｚＥ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）量に依存して減少した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、ＭａｚＦ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特異的に結合し、かつＭａｚＦ−ＭａｚＥの相互作用を阻害することにより、病原性細菌の増殖を抑制もしくは細菌を死滅させる効果を発揮する抗体の可変領域をコードするＤＮＡが提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
SEQ ID NO:1: Nucleic acid sequence containing MazF (S.aureus).
SEQ ID NO:2: Nucleic acid sequence containing MazE (S.aureus).
SEQ ID NO:3: Primer RCGN142B
SEQ ID NO:4: Primer HRCK136B
SEQ ID NO:5: Primer RCGN118
SEQ ID NO:6: Primer RCKN127
SEQ ID NO:7: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain variable region.
SEQ ID NO:8: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain variable region.
SEQ ID NO:9: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain variable region.
SEQ ID NO:10: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain variable region.
SEQ ID NO:11: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain CDR1.
SEQ ID NO:12: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain CDR2.
SEQ ID NO:13: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F heavy chain CDR3.
SEQ ID NO:14: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain CDR1.
SEQ ID NO:15: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain CDR2.
SEQ ID NO:16: Anti-MazF(S.aureus) antibody 7B-7F light chain CDR3.
SEQ ID NO:17: Substrate for MazF ribonuclease assay. nucleotides 6 is ribonucleotides-other nucleotides are deoxyribonucleotides.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
重鎖可変領域をコードする塩基配列中に配列表の配列番号１１、１２及び１３で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含み、軽鎖可変領域をコードする塩基配列中に配列表の配列番号１４、１５及び１６で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含む請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号８、１０に示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含む請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸に、１〜数個の欠失、置換、挿入、転置又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合してＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載の組換えＤＮＡを含有するベクター。
【請求項８】
請求項６記載の組換えＤＮＡ又は請求項７記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養し、該培養物からＳ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドを採取する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜５いずれか１項に記載のＤＮＡにコードされるポリペプチド。
【請求項１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
重鎖可変領域をコードする塩基配列中に配列表の配列番号１１、１２及び１３で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含み、軽鎖可変領域をコードする塩基配列中に配列表の配列番号１４、１５及び１６で示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含む請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号８、１０に示されるアミノ酸配列のそれぞれをコードする塩基配列を含む請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸に、１〜数個の欠失、置換、挿入、転置又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合してＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載の組換えＤＮＡを含有するベクター。
【請求項８】
請求項６記載の組換えＤＮＡ又は請求項７記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を培養し、該培養物からＳ．ａｕｒｅｕｓのＭａｚＦに結合し、ＭａｚＥ−ＭａｚＦ間相互作用を阻害する抗体の可変領域を含有するポリペプチドを採取する工程を含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜５いずれか１項に記載のＤＮＡにコードされるポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−８７５７４（Ｐ２０１１−８７５７４Ａ）
【公開日】平成２３年５月６日（２０１１．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１３３４２（Ｐ２０１０−２１３３４２）
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月６日（２０１１．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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