抗原蛋白質を発現した細胞を利用する抗体測定方法
【課題】迅速かつ安全なｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定法を提供する。
【解決手段】ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現した宿主細胞を担体に固定化し、該宿主細胞を固定化した担体と検体と接触させ、該宿主細胞が発現する蛋白質と検体の抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の抗原−抗体反応を利用した、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法、測定試薬等。
【解決手段】ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現した宿主細胞を担体に固定化し、該宿主細胞を固定化した担体と検体と接触させ、該宿主細胞が発現する蛋白質と検体の抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の抗原−抗体反応を利用した、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法、測定試薬等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・メタニューモウイルス（ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ、以下ｈＭＰＶと略称する）のＦ蛋白質を発現した宿主細胞を利用する、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｈＭＰＶは２００１年にオランダで小児呼吸器感染症患者の鼻咽腔吸引液から単離され、その存在が明らかにされた新しいウイルスである。ｈＭＰＶはその後もオーストラリア、カナダ、イギリス、フランス、香港などでも急性呼吸器感染症患者から分離されている。
【０００３】
ｈＭＰＶは小児、高齢者及び免疫障害を持つ患者において、上気道ウイルス感染症やインフルエンザに似た病気を引き起こすとともに、気管支炎、気管支梢炎、及び肺炎といった下気道ウイルス感染症にも関連している（非特許文献１、２）。ｈＭＰＶは２００１年に初めて発見された新しいウイルスであるが、血清疫学調査結果から少なくとも５０年以上前から人間で流行していたウイルスであると考えられている。ｈＭＰＶの小児における感染頻度については、急性呼吸器症状を示す小児の５〜４０％程度にｈＭＰＶが検出されたことが報告されている。また、血清疫学調査からは５〜１０歳以上の急性呼吸器症状を示す小児は、ほぼ１００％がｈＭＰＶに感染している可能性があることが示されている。
【０００４】
これらのことから、ｈＭＰＶは従来その存在が明らかにされていなかっただけであって、小児においては一般的な呼吸器感染症の１つであると考えられる。さらにｈＭＰＶ感染症は、小児だけでなく高齢者においても高率に検出されたとする報告もある。現在、ｈＭＰＶの検出には逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、生ウイルスに感染した動物細胞を用いた蛍光抗体法が開発されている（特許文献１、２）。しかしながら、簡便かつ安全な検出方法は確立されていない。
【０００５】
ｈＭＰＶはエンベロープ型のウイルスであり、約１３Ｋｂｐのマイナスセンス１本鎖ＲＮＡから成り立つ。ｈＭＰＶの遺伝子構造は３´−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｍ２−ＳＨ−Ｇ−Ｌ−５´となっており、鳥類メタニューモウイルス（ａｖｉａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ 、以下ａＭＰＶと略称する）と遺伝子配列が類似している。各遺伝子の機能についてはまだ明らかにされていないが、ｈＭＰＶとａＭＰＶはパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのニューモウイルス（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）サブファミリーに属している（非特許文献３）。このサブファミリーには呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ、以下ＲＳＶと略称する）のようなニューモウイルスも含まれる。
【０００６】
ｈＭＰＶは、構造蛋白質として、主要な膜糖蛋白質であるＦ蛋白質（Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＧ蛋白質（Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、小膜蛋白質であるＳＨ蛋白質（Smallhydrophobic protein）およびＭ２蛋白質、核蛋白質であるＮ蛋白質（Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またマトリックス蛋白質であるＭ蛋白質（Ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）をエンコードしている。さらにこれらの構造蛋白質以外に、ウイルスの複製に関与する蛋白質として、Ｐ蛋白質（phosphoprotein）、また転写酵素であるＬ蛋白質（largepolymeraseprotein）をエンコードしている。構造蛋白質のうち、Ｆ蛋白質はウイルス膜と細胞膜の融合を促進し、ウイルス性リボヌクレオ蛋白質を細胞の細胞質に侵入させる。また、Ｇ蛋白質はウイルスと細胞の受容体の結合を仲介する吸着蛋白質である。ＲＳＶ感染において、免疫原性及び防護抗原の多くはＦ蛋白質であり、Ｆ蛋白質は強い免疫応答を引き起こし、細胞障害性Ｔ細胞の標的となる。また、Ｎ蛋白質はゲノムRNAの保護、さらに、Ｍ蛋白質はビリオンのコアの安定性を保つ（非特許文献４）。
【０００７】
バキュロウイルス発現系は、生物学的活性が非常に高い、抗原性の真核生物の蛋白質を生産するのに適した方法であり、酵素抗体法、免疫ブロット法及び免疫蛍光検査法などに用いられている（非特許文献５）。特許文献２には、バキュロウイルス発現系を用いて作製したｈＭＰＶのＮ蛋白質発現細胞の破砕液を抗原として用いる、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検出について記載されている。また、特許文献２には組換えＮ蛋白質を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）についての記載があり、Ｇ蛋白質及びＦ蛋白質についても抗原として酵素免疫測定法に使用できる可能性についても述べられているが、具体的なデータは示されていない。本願発明の特徴はｈＭＰＶの構造蛋白質であるＦ蛋白質を発現させた宿主細胞そのものを担体に固定して抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検出に用いることであり、本願発明は公知の発明に比べ感度、迅速性、安全性等の点で大変優れている。また、ｈＭＰＶ以外のウイルスに関しては、その構造蛋白質を発現させた宿主細胞そのものを担体に固定して抗ウイルス蛋白質抗体を検出する方法は公知であった（非特許文献６）が、この方法がｈＭＰＶ抗体の検出に適用できるのかどうか、またｈＭＰＶの蛋白質のうちＦ蛋白質のみがこの検出方法に用いて高感度の結果が得られることは知られておらず、かかる検出方法とｈＭＰＶのＦ蛋白質の組合わせを提供することには大きな意義がある。
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ０２／０５７３０２。
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ０３／０７２７１９。
【非特許文献１】Ebihara, T., R. Endo, H. Kikuta, N. Ishiguro, H. Ishiko, M.Hara, Y. Takahashi ,and K. Kobayashi. (2004) J.Clin.Microbiol.42:126-132.
【非特許文献２】Ebihara, T., R. Endo, H. Kikuta, N. Ishiguro, M. Yoshioka, X. Ma, and K.Kobayashi.(2003)J. Med. Virol.70: 281-3.
【非特許文献３】van den Hoogen, B. G., J. C. de Jong, J. Groen, T. Kuiken, R. deGroot, R. A. Fouchier, and A. D. Osterhaus.(2001)Nat.Med. 7: 719-24
【非特許文献４】Easton, A. J., J. B. Domachowske and H. F.Rosenberg.(2004) Clin.Microbiol.Rev.,17: 390-412.
【非特許文献５】Smith, G. E., M. D. Summers and M. J. Fraser. (1983) Mol. Cell.Biol., 3: 2156-2165.
【非特許文献６】Pereira, R. F., W. N. Paula, C.Cubel Rde, and J. P. Nascimento. (2001)Mem. Inst. OswaldoCruz.96:507-13.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、迅速、高感度かつ安全な抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、生ウイルス感染細胞を使用すると感染の危険性が非常に高いが、抗原性を有していると思われる構造蛋白質のうち、Ｆ蛋白質を発現させた宿主細胞を使用することにより、ヒトには無害で生ウイルス感染細胞を用いた方法と同等以上の高感度な蛍光抗体法が実施可能であることが判明し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、
１．以下の工程を含む、抗ヒト・メタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）蛋白質抗体の測定方法；
１）ｈＭＰＶのＦ蛋白質をコードする遺伝子領域を蛋白質発現ベクターに組み込み、組換え蛋白質発現ベクターを作製する工程、
２）工程１）において得られた組換え蛋白質発現ベクターを宿主細胞に導入しｈＭＰＶのＦ蛋白質の発現を行う工程、
３）工程２）においてｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞を担体に固定化する工程、
４）工程３）において担体上に固定化した宿主細胞が発現するｈＭＰＶのＦ蛋白質と、検体を接触させる工程、
５）工程４）において得られた担体上のｈＭＰＶのＦ蛋白質と検体における抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の抗原−抗体反応の結果を、測定系に導き、検体における抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を検出および／または定量する工程、
２．ｈＭＰＶのＦ蛋白質が以下に示すいずれか１のポリペプチドである、前項１に記載の測定方法；
１）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち１ないし数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたポリペプチド、
３）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと８０％以上の相同性を有するポリペプチド、
３．ｈＭＰＶのＦ蛋白質をコードする遺伝子が以下に示すいずれか１のポリヌクレオチドである前項１に記載の測定方法；
１）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖、
２）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１ないし数個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入または付加された配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖、
３）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
４．組換え蛋白質発現ベクターが組換えバキュロウイルスである前項１〜３のいずれか１に記載の方法、
５．宿主細胞が昆虫細胞である前項１〜４のいずれか１に記載の方法、
６．担体が、合成高分子、天然高分子、又は金属高分子である前項１〜５のいずれか１に記載の方法、
７．測定系が免疫学的測定法を用いた系である、前項１〜６のいずれか１に記載の方法、
８．免疫学的測定法が蛍光抗体法である前項７に記載の方法、
９．前項１〜８のいずれか１に記載の方法を用いる、ｈＭＰＶ感染の検出方法、
１０．前項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬、
１１．前項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬キット、
からなる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法は、生ｈＭＰＶ感染細胞ではなく、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現した宿主細胞を用いることにより、操作の危険性を除去し、手技的容易性を確保できるだけでなく、高感度を備えたｈＭＰＶの検出が可能となる。また、本発明のＦ蛋白質を発現した宿主細胞を使用することで、他の抗体測定法も実施することが可能と考えられる。本発明により、これまでに実施が困難であった抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検査が可能となり、迅速な診断、疫学調査において非常に意義があると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現した宿主細胞を担体に固定化し、該宿主細胞を固定化した担体と検体を接触させ、該宿主細胞が発現する蛋白質と検体の抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の抗原−抗体反応を利用した、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法、測定試薬等を提供する。
以下、本発明について詳細に説明するが、これらの記載は本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明の範囲を限定するものではない。また、本発明において、ｈＭＰＶのＦ蛋白質の発現に必要な組換えウイルスの製造方法は公知の方法に準じて行われるものであり、以下に代表的な製造方法を例示するが、例示した方法に限定されるものではない。
【００１３】
１）本発明で用いられる蛋白質をコードする遺伝子領域の取得
この工程では、ｈＭＰＶのｍＲＮＡを生物材料から抽出し、該ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成し、クローニングベクターに組み込む。生物材料はｈＭＰＶの遺伝子を担持するものが好適に用いられ、具体例としては、ｈＭＰＶ感染患者の血液、血漿、血清、便、唾液等の体液や患者の生体組織等が挙げられる。
【００１４】
遺伝子の抽出法は、自体公知の可溶化、分離、核酸抽出等の工程を経て達成される。ＲＮＡの抽出方法としては、フェノール抽出法、ＮＰ−４０法、セシウム−超遠心法等が挙げられる。ＲＮＡの抽出には市販のキットを用いることもでき、具体例として、スマイテストＲキット（ゲノムサイエンス研究所）やＲＮｅａｓｙ＿Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）等が挙げられる。
【００１５】
ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの合成は、例えば逆転写酵素を用いる公知の常法により行うことができる。具体的には、ランダムプライマーやＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８等をプライマーに、ＭＭＬＶ逆転写酵素（インビトロジェン社製）等を用いてｃＤＮＡを合成することができる。
【００１６】
合成されたｃＤＮＡのクローニングベクターへの挿入方法は公知の常法に従えばよい。クローニングベクターの構築にあたっては、遺伝子操作を容易に行うことができる大腸菌系を使用する事が望ましい。また、クローニングベクターは特に限定されるものではなく、大腸菌に代表される原核細胞を宿主細胞とするプラスミド、及び、λファージ等に代表されるバクテリオファージ由来のベクター等公知のものを用いることができる。クローニングベクターはその宿主細胞と適宜組み合わせて使用する事が望ましい。クローニングベクターの具体例として、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００１７】
合成したｃＤＮＡを鋳型として、必要に応じて制限酵素サイトを付加したプライマーセットを用い、ｈＭＰＶの抗原性を有する蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅し、ＴＡクローニング（野島博、1991年、高効率コンピタントセル調製法[村松正実、岡山博人（編）]、遺伝子工学ハンドブック（実験医学別冊）（羊土社）、ｐ45−51）を行い、プラスミドクローンを得ることができる。必要に応じてプライマーセットに付加される主な制限酵素サイトとして、公知の制限酵素サイトを適宜用いることができ、制限酵素が認識するように制限酵素サイトとしての塩基をプライマーに付加することができる。特定の制限酵素を認識する配列を含むプライマーは、必ずしも必要というわけではない。
【００１８】
遺伝子の増幅手段は、今日多様な方法が確立され、今後も開発されていくであろうが、本発明は特に限定されるものではない。具体的には、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）(Science230:1350-1354,1985)やＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法）（Nature350:91−92, 1991； 特許第２６４８８０２号公報；特許第２６５０１９５号公報）、およびＬＡＭＰ法(Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ＤＮＡ増幅法)（特開２００１−２４２１６９号公報）などの核酸増幅方法を適用することができる。
【００１９】
前記のように、ｈＭＰＶの蛋白質には、Ｆ蛋白質、Ｇ蛋白質、ＳＨ蛋白質、Ｍ２蛋白質、Ｎ蛋白質、Ｍ蛋白質、Ｐ蛋白質、Ｌ蛋白質があるが、本発明で好適に用いら入れるのはＦ蛋白質である。Ｆ蛋白質は配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、ウイルス膜と細胞膜の融合を促進し、ウイルス性リボヌクレオ蛋白質を細胞の細胞質に侵入させる役割を果たす（非特許文献４）。また、本発明で用いられる蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるものだけでなく、抗ｈＭＰＶ抗体と抗原−抗体反応を示すポリペプチドを含んでいれば良く、例えば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加といった変異を有するアミノ酸配列ポリペプチドや、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列と相同性を有するポリペプチド等も含まれる。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上であることが望ましい。
【００２０】
本発明で用いられる蛋白質を調製するためには、以下の（１）〜（３）の何れかに示すポリペプチドからなる蛋白質を宿主細胞に発現させることができれば良い。
（１）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加といった変異を有するアミノ酸配列ポリペプチド。変異を有するペプチドは天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。
（３）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列と相同性を有するポリペプチド。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上であることが望ましい。
【００２１】
アミノ酸配列に変異を導入する手段は自体公知であり、例えば部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。例えば成書に記載の方法（Campbell,H. D. et. al. (2000) Genomics 68, p5463-5467.； Ebihara,T., R. et. al. (2004) J. Clin.Microbiol.42:126-132.）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（Ulmer, K. M..(1983) Science 219,p666-671.）を利用することもできる。
【００２２】
また、本発明で用いられる蛋白質をコードする遺伝子としては、以下の（１）から（４）の何れかに示すポリヌクレオチドを用いることができる。
（１）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖。
（２）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１ないし数個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入または付加といった変異を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖。変異の程度およびそれらの位置などは、該変異を有するポリヌクレオチドが配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドと同質のものである限り、特に制限されない。かかる変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入したものであってもよい。
（３）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（Sambrook, et. al., Molecular Cloning, Laboratory Manual 2th, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.）などに従うことができる。
【００２３】
ポリヌクレオチドとは、ＤＮＡやＲＮＡのようにヌクレオチドの重合した高分子物質をいう。本発明で用いられるポリヌクレオチドは、天然のものであることもできるし、化学的に合成されたものであることもできる。あるいはまた、鋳型となるＤＮＡをもとにＰＣＲのような酵素的な反応によって合成されたものであっても良い。天然物としてはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）があり、広く生体細胞中に分布している。また、公知の手法により、これらの核酸に類似したポリヌクレオチドを酵素的に合成することができる（Ochoa,S. et. al. (1955) Science 122: 907-910.； Kornberg, A.et. al. (1956) Biochim BiophysActa. 1000: 57-8.）。本発明において、単にポリヌクレオチドと記載するときには、１本鎖ポリヌクレオチドのみならず２本鎖ポリヌクレオチドをも指すものとする。２本鎖ポリヌクレオチドを意味するときには、一方の鎖のみについての塩基配列が記載されることになるが、センス鎖の塩基配列に基づいてその相補鎖の塩基配列は必然的に規定される。
【００２４】
塩基配列に変異を導入する手段は自体公知であり、例えば部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。例えば成書に記載の方法（Campbell,H. D. et. al. (2000) Genomics 68, p5463-5467.； Ebihara, T., R. et. al. (2004) J. Clin.Microbiol.42:126-132.）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（Ulmer,K.M.(1983) Science , 219, p666-671.）を利用することもできる。
【００２５】
２）組換え蛋白質発現ベクターの作製
この工程では、前記１）で調製されたプラスミドベクターに組込まれた本発明で用いられる蛋白質をコードする遺伝子領域を、蛋白質発現ベクターに組み込む。ベクターは蛋白質発現系に応じて自体公知の方法が確立しており、格別の限定はない。組込み手段は、各ベクター・蛋白質発現系の推奨手段に準ずれば十分である。
【００２６】
蛋白質を発現するためのベクターとしては、これを導入する宿主細胞内で、本発明で用いられる蛋白質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド若しくはそれを含むポリヌクレオチドが発現されるものであれば特に制限はないが、通常宿主細胞に適したプロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現ベクターを用いることができる。
【００２７】
目的とする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主細胞が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、限定されない。ベクターへの目的遺伝子の挿入は、該ポリヌクレオチドまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下に置かれるように連結して行う。また、プロモーターとポリヌクレオチドとの間に、コザック配列（Kozak, M., Gene, 234, 187 (1999)）を挿入したり、ポリヌクレオチドの下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとして特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（Biotechniques, 7, 580, (1989)）等が挙げられる。このようにして得られた本発明の組換え蛋白質発現ベクターは、公知の遺伝子導入法により適当な宿主細胞に導入される。遺伝子導入法の好適な例としては、ウイルスベクター法（Cell,37,1053(1984)）が挙げられる。
【００２８】
３）宿主細胞における本発明で用いられる蛋白質の発現および同定
前記２）で調製された組換え蛋白質発現ベクターを導入する宿主細胞としては、該ベクターが体内で複製可能であり、かつ目的遺伝子のポリヌクレオチドがコードする蛋白質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば、昆虫細胞、動物細胞、大腸菌、酵母等が挙げられ、昆虫細胞が好適に挙げられる。具体的には、昆虫細胞としてＳｆ９細胞（インビトロジェン社）、Ｔｎ５（インビトロジェン社）細胞等が挙げられ、またその蛋白質発現ベクターとしてバキュロウイルス等が、より具体的にはＢａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ（PHAMINGE社）等が挙げられる。
【００２９】
組換えベクターの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用され、例えば成書に記載されている標準的な方法（Sambrook,et.al.(1989)Molecular Cloning, Laboratory Manual 2nd, Cold Spring HarborLaboratory）により実施できる。より好ましい方法としては、遺伝子の安静を考慮するならば染色体へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。
【００３０】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターの導入方法としては、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。トランスファーベクターに前記ポリヌクレオチドを組込んだ組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞内に導入し、昆虫細胞内で相同組換えを起こさせることにより、組換えバキュロウイルスを作製することができる。野生株バキュロウイルスは市販のものを広く利用することができ、例えばバキュロウイルスＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ、PHAMINGEN社）等を用いることができる。
【００３１】
また、宿主細胞が発現する蛋白質が、ｈＭＰＶの蛋白質であるか否かの確認は、公知の常法により行うことができ、例えばウエスタンブロッティング法などにより確認することができる。ウエスタンブロッティング法とは、本発明で用いられる蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した宿主細胞の細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識を施した抗ＩｇＧ抗体あるいは結合断片と反応させて確認する方法である。本発明に用いる蛋白質が宿主細胞に発現していれば、該宿主細胞を本発明の測定方法に使用することができるが、本発明に用いる蛋白質は、例えば前記のウエスタンブロッティング法で確認できる程度に宿主細胞に発現しているのが好ましい。
【００３２】
４）宿主細胞の担体への固定化
宿主細胞を固定化する担体としては、例えばスライドガラス、マイクロタイトレーションプレート、ラッテクス粒子等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、金コロイド粒子等の金属高分子を例示することができるが、使用する担体の材質は特に限定されない。すなわち、宿主細胞が担体から脱離しなければどのような材質の担体を用いることも可能である。６）で後述するように、検体中の抗体の検出および／または定量を蛍光物質等の色原体を用いて行う場合には、色原体を含まないスライドガラス等が好適に用いられる。宿主細胞を担体に固定化する固定方法としては、宿主細胞を適当な固定化剤で処理するのが好適である。本発明で用いられる蛋白質のエピトープを破壊しない固定化剤が好適である。そのような固定化剤の具体例としては、アセトン、ホルムアルデヒド、エタノール、グリセリルアルデヒドまたはホルマリン等が、好ましくはアセトン等が挙げられる。また、宿主細胞を固定化した担体と検体を接触させる工程ならびにそれに続く抗原抗体反応による抗ｈＭＰＶ蛋白質検出および／または定量する工程において、宿主細胞が担体から脱離しなければ、担体に固定化する細胞数は特に限定されないが、宿主細胞が均一な層、好ましくは一層となるように担体に固定化するのが好適である。具体的には、スライドグラスを用いる場合、細胞数約７．５×１０３／ウェルの細胞をスライドグラスに分注し風乾、固定すれば良い。
【００３３】
５）宿主細胞を固定化した担体と検体の接触
検体とは、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を含有している可能性のある生物材料をいい、具体例としてヒト血清が好適に挙げられる。接触とは、前記４）で調製された宿主細胞の固定化されている担体に検体を適量添加することにより行われる。この操作により、前記宿主細胞により発現された担体上の本発明で用いられる蛋白質と検体とを接触させることができる。担体に添加する担体の量は宿主細胞および検体の条件に応じて適宜調整することができる。
【００３４】
６）抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検出および／または定量
上記５）によって、担体上の本発明で用いられる蛋白質と検体との接触が起こり、抗原−抗体反応が達成され、抗原−抗体反応の結果が得られる。抗原−抗体反応の結果が得られれば、当該結果を観察または測定する手段を選択すればよい。測定系により得られた観察結果または測定値に基づき、例えば対照との対比によって、検体に含まれる抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の存在の有無または当該抗体量が判定可能となる。
【００３５】
測定系とは、色原体等による検出および／または定量を可能にすることを意味し、免疫学的測定法を用いた系が好適である。免疫学的測定法の具体例として、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）等が挙げられる。
【００３６】
蛍光抗体法とは、組織標本中の酵素、構造蛋白質等の抗原性物質を、蛍光標識抗体と結合させ、蛍光顕微鏡下に検出する方法をいう。抗体の蛍光標識には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等が用いられる。具体例の一つとして、担体上の本発明で用いられる蛋白質に、検体に含まれる抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を反応させ、さらに蛍光標識でラベルした抗ＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する。
【００３７】
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）とは、抗体の特異性を利用して抗原物質を検出・定量する方法で、酵素標識した抗体を利用する方法をいう。抗原に結合した標識抗体の量を、酵素反応を行わせることにより測定する。酵素標識に使われる主な酵素に、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼが挙げられる。具体例の一つとして、担体上の本発明で用いられる蛋白質に、検体に含まれる抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を反応させ、酵素標識した抗ＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【００３８】
なお、本発明は、前記抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法を用いる、ｈＭＰＶ感染の検出方法にも及ぶものである。
【００３９】
また、本発明は、前記抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法もしくはｈＭＰＶ感染の検出方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬にも及ぶものである。
【００４０】
さらに、本発明は、前記抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法もしくはｈＭＰＶ感染の検出方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬キットに及ぶものである。
【００４１】
本発明の理解を助ける為に、以下、実施例および実験例を設けて詳述するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
ｈＭＰＶウイルスのｃＤＮＡクローニング
ウイルスＲＮＡを、インフォームドコンセントを得た後に採取したｈＭＰＶ患者血清、組織等からスマイテストＲキット（ゲノムサイエンス研究所）を用いて製造元キットのプロトコールに従い抽出・精製した。次に、得られた精製ウイルスＲＮＡを鋳型として、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー、ＭＭＬＶ（インビトロジェン社製）逆転写酵素を用いて製造元キットのプロトコールに従いｈＭＰＶウイルスｃＤＮＡを合成した。合成したｈＭＰＶウイルスｃＤＮＡを次の手順でクローニングベクターにクローニングした。
【００４３】
ｈＭＰＶの各蛋白質をコードする遺伝子領域は、Ｆｉｒｓｔ ｓｔａｒｔ ｔａｑ（ロシュ・ダイアグノスティック社）を使用し、ＰＣＲ法によりそれぞれ増幅した。ｈＭＰＶのＦ蛋白質（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ６２２３８１）をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号５（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号６（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、N蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号７（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号８（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号９（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１０（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号１１（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１２（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、Ｐ蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号１３（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１４（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、それぞれプライマーセットとして使用した。
ｈＭＰＶ−Ｆ−Ｆ ５´−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣ−３´（配列番号５）
ｈＭＰＶ−Ｆ−Ｒ ５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＴＴＴＧ−３´（配列番号６）
ｈＭＰＶ−Ｎ−Ｆ ５´−ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴ−３´（配列番号７）
ｈＭＰＶ−Ｎ−Ｒ ５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＣＡＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧ−３´（配列番号８）
ｈＭＰＶ−Ｇ−Ｆ ５´−ＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＴ−３´（配列番号９）
ｈＭＰＶ−Ｇ−Ｒ ５´−ＴＴＡＡＣＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴ−３´（配列番号１０）
ｈＭＰＶ−Ｍ−Ｆ ５´−ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＴＣＣＴＡＣＣＴＡＧＴＡＧＡ−３´（配列番号１１）
ｈＭＰＶ−Ｍ−Ｒ ５´−ＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＴＡＣＧＴ−３´（配列番号１２）
ｈＭＰＶ−Ｐ−Ｆ ５´−ＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡ−３´（配列番号１３）
ｈＭＰＶ−Ｐ−Ｒ ５´−ＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＡＡ−３´（配列番号１４）
ここにおいて、各配列中下線を施した配列の部分は、特定の制限酵素が認識する配列であり、その配列の３´末端側に蛋白質の翻訳開始領域又は、蛋白質発現終止領域を認識する配列を含む配列を示す。特定の制限酵素が認識する配列が必ずしも必要という訳ではない。
【００４４】
ＰＣＲ法の条件は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用い、９５℃、１０分保温後、９５℃３０秒で変性、５５℃３０秒でアニーリング、７２℃１２０秒で伸長を５０サイクル行った。次に、増幅産物について１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出し、切り出したアガロースゲルをＵｌｔｒａｆｒｅｅＴＭ−ＤＡ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて５，０００×ｇで１０分遠心し、ゲル中よりＰＣＲ増幅産物を抽出した。抽出したＰＣＲ増幅産物はＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して１，０００×ｇで１５分遠心し精製濃縮した。その後、クローニングベクターｐＣＲ２．１（インビトロジェン社製）に精製濃縮して得た増幅産物を組み込み、ＴＡクローニングによりプラスミドクローンを得た。得られたプラスミドクローンについて、定法に従ってＤＮＡ塩基配列を解析し、ｈＭＰＶのＦ蛋白質（配列番号１）をコードする遺伝子領域（配列番号３）、Ｎ蛋白質（配列番号２）をコードする遺伝子領域（配列番号４）、Ｇ蛋白質（配列番号１５）をコードする遺伝子領域（配列番号１８）、Ｍ蛋白質（配列番号１６）をコードする遺伝子領域（配列番号１９）およびＰ蛋白質（配列番号１７）をコードする遺伝子領域（配列番号２０）がそれぞれクローニングできたことを確認した。
【実施例２】
【００４５】
ｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質の発現
実施例１において得られたｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をコードする遺伝子領域をクローニングしたプラスミドクローンを用いて、ｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をコードする遺伝子領域をバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３にそれぞれ組み込み、バキュロウイルスＤＮＡと共に昆虫細胞内へコ・トランスフェクションし、相同的組換えにより遺伝子組換えバキュロウイルスをそれぞれ作製した。
【００４６】
まず、クローンを組み込んだトランスファーベクターと野生株バキュロウイルスをＳｆ９細胞（インビトロジェン社）内にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて導入し、Ｓｆ９細胞内でおこる相同組換えにより組換えバキュロウイルスを作製した。０．５μｇの直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ ＰＨＡＭＩＮＧＥＮ社）と１μｇのクローンを組み込んだトランスファーベクターを８μｌの蒸留水に溶解し、２倍希釈した等量のリポフェクチンと混合して室温で１５分間静置した。Ｅｘ ｃｅｌｌ ４０５（ＪＲＨ社）培養液に懸濁した１×１０５個のＳｆ９細胞を２６．５℃で３０分間プラスティックシャーレ（直径３．５ｃｍ）内に吸着後、ＤＮＡ混合液をＳｆ９細胞に滴下し２６．５℃で培養した。２４時間後、培養液に１０％牛胎児血清含ＴＣ１００（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）培地を添加し、更に３日間培養した。その後、プラスティックシャーレに培養したＳｆ９細胞全てを２５ｃｍ２のフラスコに移し、１０％牛胎児血清含ＴＣ１００培地で３日間培養し、その上清を種ウイルスとした。
【００４７】
次に、宿主細胞であるＴｎ５細胞に対して前記組換えバキュロウイルスをＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１０で感染させた。その後、３日間、２６．５℃で昆虫細胞を培養して蛋白質の発現を行い、組換えウイルス感染培養細胞を３日後に採取した。採取した組換えウイルス感染培養細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した後、蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色で検出し、予想される分子量の妥当性を検討した。
【００４８】
また、感染培養細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した後、ニトロセルロース膜に常法により転写し、抗ｈＭＰＶ抗体陽性血清（蛍光抗体法によりｈＭＰＶを検出した力価１：１２８０）又はｈＭＰＶ抗体陰性血清（蛍光抗体法によりｈＭＰＶを検出した力価＜１：１０）によるウエスタンブロッティング法を実施した。各活性は２００分の１に希釈し、ニトロセルロース膜に結合させた後、抗ヒトＩｇＧヤギペルオキシダーゼ標識抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を反応させた。その後、化学発光法によりｈＭＰＶ蛋白質を検出した（ＥＣＬ Ｂｌｏｔｔｈｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）。
【００４９】
図１に示したように、組換えウイルス感染細胞ではｈＭＰＶのＦ蛋白質の予想分子量である６０ｋＤａ付近に発現蛋白質バンドが少量確認された。同様にＮ蛋白質の予想分子量である４３ｋＤａ付近に発現蛋白質バンドも微少ながら確認された。図２に示したように、ｈＭＰＶのＦ蛋白質と予測される６０ｋＤａ付近に抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体陽性ヒト血清と反応する蛋白質が検出された。
【実施例３】
【００５０】
ｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をそれぞれ発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法（以下、Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡおよびＢａｃ−Ｎ−ＩＦＡとそれぞれ略称する場合がある。）
組換えバキュロウイルスを感染させることにより、ｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をそれぞれ発現させたＴｎ５細胞を用いて、蛍光抗体法により抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を検出した。
実施例２と同様の方法により、２５ｃｍ２フラスコで当該遺伝子組換えバキュロウイルスを感染させｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をそれぞれ発現させた。Ｔｎ５細胞を５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄後、細胞数約７．５×１０３／ウェルのＴｎ５細胞を蛍光抗体用スライドガラスに分注し風乾した後、アセトンで１０分間固定し風乾した。スライドガラスに希釈血清（１０分の１希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳでスライドガラスを１０分間３回洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社製）（４０分の１希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで１０分間３回洗浄、風乾し、ＰＢＳ−グリセリン（１：１）を添加した。染色プレパラートは蛍光顕微鏡下で解析した。１０分の１以上の希釈でｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質と反応する血清は、ｈＭＰＶ抗体陽性であると判定した。
【００５１】
図３および図４に示したように、ｈＭＰＶ感染患者血清中のＩｇＧはＦ蛋白質およびＮ蛋白質発現昆虫細胞と特異的に反応し、Ｆ蛋白質およびＮ蛋白質発現昆虫細胞が抗原性を有していること、抗ｈＭＰＶＩｇＧ特異抗体の検出が可能であることを確認した。また、図３に示したように、Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡの結果は、生ウイルスを使用した蛍光抗体法と比較して感度が同等以上であることも確認した。図４に示したようにＢａｃ−Ｎ−ＩＦＡでも抗ｈＭＰＶＩｇＧ特異抗体の検出が可能であるが、Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡよりも感度が低くBac−F−IFAがより優れた抗ｈＭＰＶＩｇＧ特異抗体の検出法であることを確認した。
【実施例４】
【００５２】
ｈＭＰＶのＧ蛋白質、Ｍ蛋白質およびＰ蛋白質をそれぞれ発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法
実施例１において得られたｈＭＰＶのＧ蛋白質、Ｍ蛋白質およびＰ蛋白質をコードする遺伝子領域をクローニングしたプラスミドクローンを用いて、実施例２および実施例３と同様の方法により、ｈＭＰＶのＧ蛋白質、Ｍ蛋白質およびＰ蛋白質をそれぞれ発現させたＴｎ５細胞を用いて、蛍光抗体法により抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を検出した。ｈＭＰＶ感染患者血清中のＩｇＧは、Ｇ蛋白質、Ｍ蛋白質およびＰ蛋白質を発現させたそれぞれの昆虫細胞と特異的に反応したが、いずれもＢａｃ−Ｆ−ＩＦＡよりも感度が低く、Bac−F−IFAが最も優れた抗ｈＭＰＶ ＩｇＧ特異抗体の検出法であることを確認した。
【００５３】
（実験例１）
ｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いた蛍光抗体法（以下、ｈＭＰＶ−ＩＦＡと略称する場合がある。）
ｈＭＰＶをＬＬＣ−ＭＫ２細胞（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＨＹＢＲＩＤＳ）に接種し、感染後２〜３週間のｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を蛍光抗体法のｈＭＰＶ抗体陽性細胞として用いた。ｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を蛍光抗体用スライドガラスのウェルに分注し風乾した後、細胞を風乾し、アセトンで１０分間固定化し風乾した。スライドガラスに希釈血清（１０分の１希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳでスライドガラスを１０分間３回洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社）（４０分の１希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで１０分間３回洗浄、風乾し、ＰＢＳ−グリセリン（１：１）を添加した。染色プレパラートは蛍光顕微鏡下で解析した。１０分の１以上の希釈でｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞と反応する血清は、ｈＭＰＶ抗体陽性であると判定した（Ebihara, T., R. et. al. (2004) J. Clin.Microbiol.42:126-132.； Ebihara,T., R. et. al. (2003) J Med Virol 70: 281-3.）。
【００５４】
（実験例２）
ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法（Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡ）とｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いた蛍光抗体法（ｈＭＰＶ−ＩＦＡ）の比較
実施例３におけるＢａｃ−Ｆ−ＩＦＡ、および実験例１におけるｈＭＰＶ−ＩＦＡによる抗体力価の比較を行った。ここで、抗体力価とは、抗体の比活性に相当し、血清反応で抗血清の単位用量中に含まれている抗体量の測定値をいう。抗体力価は一般に、抗血清の希釈系列に対し一定量の抗原を加えて、反応の生じる終末点における希釈倍数の逆数で表される。
Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡは実施例３と同様の方法で、ｈＭＰＶ−ＩＦＡは実験例１と同様の方法でインフォームドコンセントを得た後に採取したｈＭＰＶ患者血清について行った。これらの２種類の蛍光抗体法により測定された血清試料中の抗体力価の対比をピアソンの相関係数により評価したところ、２種類の方法におけるコンコーダンス度（陽性とされた１０以上の血清及び陰性とされた１０以下の血清の力価）は偶然を超えた良いアグリーメントを示した。
また、実施例３に供した大部分の血清試料において、Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡにより得られた力価は、ｈＭＰＶ−ＩＦＡにより得られた力価と同等以上であった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
上記のように、本発明の抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法により、操作の危険性の除去、手技的容易性の確保が可能となり、高感度を備えたｈＭＰＶの検出が可能である。本発明により、これまで実施することができなかった抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検査が可能となり、本発明は迅速診断、疫学調査において非常に有意義であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ｈＭＰＶのＦ蛋白質をバキュロウイルス発現系で発現させた細胞をSDS-PAGEで展開し、クマシーブリリアントブルー染色した。左レーンはコントロールの昆虫細胞Ｔｎ５であり、右レーンが蛋白質発現昆虫細胞Ｔｎ５である。
【図２】ｈＭＰＶのＦ蛋白質をバキュロウイルス発現系で発現させた細胞を用いてウエスタンブロッティング法によりｈＭＰＶのＦ蛋白質を検出した。レーン１及び３がコントロールの昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示し、レーン２及び４が組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示す。ｈＭＰＶのＦ蛋白質は陽性血清（レーン３、４）及び陰性血清（レーン１、２）を用いて解析した。矢印はｈＭＰＶのＦ蛋白質を示す。
【図３】ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法（Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡ）によりｈＭＰＶ感染患者血清中の抗ｈＭＰＶ Ｆ蛋白質ＩｇＧ抗体を検出した結果を示す。上のレーンはコントロールの昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示し、下のレーンがｈＭＰＶのＦ蛋白質発現昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示す。また、左から１番目〜３番目のレーンは陽性血清（４０分の１希釈）を用いた結果を示し、左から４番目のレーンは陰性血清（１０分の１希釈）を用いた結果を示す。（ ）内はｈＭＰＶ−ＩＦＡの結果を示す。
【図４】ｈＭＰＶのＮ蛋白質を発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法（Ｂａｃ−Ｎ−ＩＦＡ）によりｈＭＰＶ感染患者血清中の抗ｈＭＰＶ Ｎ蛋白質ＩｇＧ抗体を検出した結果を示す。上のレーンはコントロールの昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示し、下のレーンがｈＭＰＶのＮ蛋白質発現昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示す。また、左から１番目〜３番目のレーンは陽性血清（４０分の１希釈）を用いた結果を示し、左から４番目のレーンは陰性血清（４０分の１希釈）を用いた結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・メタニューモウイルス（ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ、以下ｈＭＰＶと略称する）のＦ蛋白質を発現した宿主細胞を利用する、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｈＭＰＶは２００１年にオランダで小児呼吸器感染症患者の鼻咽腔吸引液から単離され、その存在が明らかにされた新しいウイルスである。ｈＭＰＶはその後もオーストラリア、カナダ、イギリス、フランス、香港などでも急性呼吸器感染症患者から分離されている。
【０００３】
ｈＭＰＶは小児、高齢者及び免疫障害を持つ患者において、上気道ウイルス感染症やインフルエンザに似た病気を引き起こすとともに、気管支炎、気管支梢炎、及び肺炎といった下気道ウイルス感染症にも関連している（非特許文献１、２）。ｈＭＰＶは２００１年に初めて発見された新しいウイルスであるが、血清疫学調査結果から少なくとも５０年以上前から人間で流行していたウイルスであると考えられている。ｈＭＰＶの小児における感染頻度については、急性呼吸器症状を示す小児の５〜４０％程度にｈＭＰＶが検出されたことが報告されている。また、血清疫学調査からは５〜１０歳以上の急性呼吸器症状を示す小児は、ほぼ１００％がｈＭＰＶに感染している可能性があることが示されている。
【０００４】
これらのことから、ｈＭＰＶは従来その存在が明らかにされていなかっただけであって、小児においては一般的な呼吸器感染症の１つであると考えられる。さらにｈＭＰＶ感染症は、小児だけでなく高齢者においても高率に検出されたとする報告もある。現在、ｈＭＰＶの検出には逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、生ウイルスに感染した動物細胞を用いた蛍光抗体法が開発されている（特許文献１、２）。しかしながら、簡便かつ安全な検出方法は確立されていない。
【０００５】
ｈＭＰＶはエンベロープ型のウイルスであり、約１３Ｋｂｐのマイナスセンス１本鎖ＲＮＡから成り立つ。ｈＭＰＶの遺伝子構造は３´−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｍ２−ＳＨ−Ｇ−Ｌ−５´となっており、鳥類メタニューモウイルス（ａｖｉａｎ Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ 、以下ａＭＰＶと略称する）と遺伝子配列が類似している。各遺伝子の機能についてはまだ明らかにされていないが、ｈＭＰＶとａＭＰＶはパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのニューモウイルス（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）サブファミリーに属している（非特許文献３）。このサブファミリーには呼吸器合胞体ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ、以下ＲＳＶと略称する）のようなニューモウイルスも含まれる。
【０００６】
ｈＭＰＶは、構造蛋白質として、主要な膜糖蛋白質であるＦ蛋白質（Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＧ蛋白質（Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、小膜蛋白質であるＳＨ蛋白質（Smallhydrophobic protein）およびＭ２蛋白質、核蛋白質であるＮ蛋白質（Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またマトリックス蛋白質であるＭ蛋白質（Ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）をエンコードしている。さらにこれらの構造蛋白質以外に、ウイルスの複製に関与する蛋白質として、Ｐ蛋白質（phosphoprotein）、また転写酵素であるＬ蛋白質（largepolymeraseprotein）をエンコードしている。構造蛋白質のうち、Ｆ蛋白質はウイルス膜と細胞膜の融合を促進し、ウイルス性リボヌクレオ蛋白質を細胞の細胞質に侵入させる。また、Ｇ蛋白質はウイルスと細胞の受容体の結合を仲介する吸着蛋白質である。ＲＳＶ感染において、免疫原性及び防護抗原の多くはＦ蛋白質であり、Ｆ蛋白質は強い免疫応答を引き起こし、細胞障害性Ｔ細胞の標的となる。また、Ｎ蛋白質はゲノムRNAの保護、さらに、Ｍ蛋白質はビリオンのコアの安定性を保つ（非特許文献４）。
【０００７】
バキュロウイルス発現系は、生物学的活性が非常に高い、抗原性の真核生物の蛋白質を生産するのに適した方法であり、酵素抗体法、免疫ブロット法及び免疫蛍光検査法などに用いられている（非特許文献５）。特許文献２には、バキュロウイルス発現系を用いて作製したｈＭＰＶのＮ蛋白質発現細胞の破砕液を抗原として用いる、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検出について記載されている。また、特許文献２には組換えＮ蛋白質を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）についての記載があり、Ｇ蛋白質及びＦ蛋白質についても抗原として酵素免疫測定法に使用できる可能性についても述べられているが、具体的なデータは示されていない。本願発明の特徴はｈＭＰＶの構造蛋白質であるＦ蛋白質を発現させた宿主細胞そのものを担体に固定して抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検出に用いることであり、本願発明は公知の発明に比べ感度、迅速性、安全性等の点で大変優れている。また、ｈＭＰＶ以外のウイルスに関しては、その構造蛋白質を発現させた宿主細胞そのものを担体に固定して抗ウイルス蛋白質抗体を検出する方法は公知であった（非特許文献６）が、この方法がｈＭＰＶ抗体の検出に適用できるのかどうか、またｈＭＰＶの蛋白質のうちＦ蛋白質のみがこの検出方法に用いて高感度の結果が得られることは知られておらず、かかる検出方法とｈＭＰＶのＦ蛋白質の組合わせを提供することには大きな意義がある。
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ０２／０５７３０２。
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ０３／０７２７１９。
【非特許文献１】Ebihara, T., R. Endo, H. Kikuta, N. Ishiguro, H. Ishiko, M.Hara, Y. Takahashi ,and K. Kobayashi. (2004) J.Clin.Microbiol.42:126-132.
【非特許文献２】Ebihara, T., R. Endo, H. Kikuta, N. Ishiguro, M. Yoshioka, X. Ma, and K.Kobayashi.(2003)J. Med. Virol.70: 281-3.
【非特許文献３】van den Hoogen, B. G., J. C. de Jong, J. Groen, T. Kuiken, R. deGroot, R. A. Fouchier, and A. D. Osterhaus.(2001)Nat.Med. 7: 719-24
【非特許文献４】Easton, A. J., J. B. Domachowske and H. F.Rosenberg.(2004) Clin.Microbiol.Rev.,17: 390-412.
【非特許文献５】Smith, G. E., M. D. Summers and M. J. Fraser. (1983) Mol. Cell.Biol., 3: 2156-2165.
【非特許文献６】Pereira, R. F., W. N. Paula, C.Cubel Rde, and J. P. Nascimento. (2001)Mem. Inst. OswaldoCruz.96:507-13.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、迅速、高感度かつ安全な抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、生ウイルス感染細胞を使用すると感染の危険性が非常に高いが、抗原性を有していると思われる構造蛋白質のうち、Ｆ蛋白質を発現させた宿主細胞を使用することにより、ヒトには無害で生ウイルス感染細胞を用いた方法と同等以上の高感度な蛍光抗体法が実施可能であることが判明し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、
１．以下の工程を含む、抗ヒト・メタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）蛋白質抗体の測定方法；
１）ｈＭＰＶのＦ蛋白質をコードする遺伝子領域を蛋白質発現ベクターに組み込み、組換え蛋白質発現ベクターを作製する工程、
２）工程１）において得られた組換え蛋白質発現ベクターを宿主細胞に導入しｈＭＰＶのＦ蛋白質の発現を行う工程、
３）工程２）においてｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞を担体に固定化する工程、
４）工程３）において担体上に固定化した宿主細胞が発現するｈＭＰＶのＦ蛋白質と、検体を接触させる工程、
５）工程４）において得られた担体上のｈＭＰＶのＦ蛋白質と検体における抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の抗原−抗体反応の結果を、測定系に導き、検体における抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を検出および／または定量する工程、
２．ｈＭＰＶのＦ蛋白質が以下に示すいずれか１のポリペプチドである、前項１に記載の測定方法；
１）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち１ないし数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたポリペプチド、
３）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと８０％以上の相同性を有するポリペプチド、
３．ｈＭＰＶのＦ蛋白質をコードする遺伝子が以下に示すいずれか１のポリヌクレオチドである前項１に記載の測定方法；
１）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖、
２）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１ないし数個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入または付加された配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖、
３）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、
４．組換え蛋白質発現ベクターが組換えバキュロウイルスである前項１〜３のいずれか１に記載の方法、
５．宿主細胞が昆虫細胞である前項１〜４のいずれか１に記載の方法、
６．担体が、合成高分子、天然高分子、又は金属高分子である前項１〜５のいずれか１に記載の方法、
７．測定系が免疫学的測定法を用いた系である、前項１〜６のいずれか１に記載の方法、
８．免疫学的測定法が蛍光抗体法である前項７に記載の方法、
９．前項１〜８のいずれか１に記載の方法を用いる、ｈＭＰＶ感染の検出方法、
１０．前項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬、
１１．前項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬キット、
からなる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法は、生ｈＭＰＶ感染細胞ではなく、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現した宿主細胞を用いることにより、操作の危険性を除去し、手技的容易性を確保できるだけでなく、高感度を備えたｈＭＰＶの検出が可能となる。また、本発明のＦ蛋白質を発現した宿主細胞を使用することで、他の抗体測定法も実施することが可能と考えられる。本発明により、これまでに実施が困難であった抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検査が可能となり、迅速な診断、疫学調査において非常に意義があると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現した宿主細胞を担体に固定化し、該宿主細胞を固定化した担体と検体を接触させ、該宿主細胞が発現する蛋白質と検体の抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の抗原−抗体反応を利用した、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法、測定試薬等を提供する。
以下、本発明について詳細に説明するが、これらの記載は本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明の範囲を限定するものではない。また、本発明において、ｈＭＰＶのＦ蛋白質の発現に必要な組換えウイルスの製造方法は公知の方法に準じて行われるものであり、以下に代表的な製造方法を例示するが、例示した方法に限定されるものではない。
【００１３】
１）本発明で用いられる蛋白質をコードする遺伝子領域の取得
この工程では、ｈＭＰＶのｍＲＮＡを生物材料から抽出し、該ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成し、クローニングベクターに組み込む。生物材料はｈＭＰＶの遺伝子を担持するものが好適に用いられ、具体例としては、ｈＭＰＶ感染患者の血液、血漿、血清、便、唾液等の体液や患者の生体組織等が挙げられる。
【００１４】
遺伝子の抽出法は、自体公知の可溶化、分離、核酸抽出等の工程を経て達成される。ＲＮＡの抽出方法としては、フェノール抽出法、ＮＰ−４０法、セシウム−超遠心法等が挙げられる。ＲＮＡの抽出には市販のキットを用いることもでき、具体例として、スマイテストＲキット（ゲノムサイエンス研究所）やＲＮｅａｓｙ＿Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）等が挙げられる。
【００１５】
ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの合成は、例えば逆転写酵素を用いる公知の常法により行うことができる。具体的には、ランダムプライマーやＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８等をプライマーに、ＭＭＬＶ逆転写酵素（インビトロジェン社製）等を用いてｃＤＮＡを合成することができる。
【００１６】
合成されたｃＤＮＡのクローニングベクターへの挿入方法は公知の常法に従えばよい。クローニングベクターの構築にあたっては、遺伝子操作を容易に行うことができる大腸菌系を使用する事が望ましい。また、クローニングベクターは特に限定されるものではなく、大腸菌に代表される原核細胞を宿主細胞とするプラスミド、及び、λファージ等に代表されるバクテリオファージ由来のベクター等公知のものを用いることができる。クローニングベクターはその宿主細胞と適宜組み合わせて使用する事が望ましい。クローニングベクターの具体例として、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００１７】
合成したｃＤＮＡを鋳型として、必要に応じて制限酵素サイトを付加したプライマーセットを用い、ｈＭＰＶの抗原性を有する蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅し、ＴＡクローニング（野島博、1991年、高効率コンピタントセル調製法[村松正実、岡山博人（編）]、遺伝子工学ハンドブック（実験医学別冊）（羊土社）、ｐ45−51）を行い、プラスミドクローンを得ることができる。必要に応じてプライマーセットに付加される主な制限酵素サイトとして、公知の制限酵素サイトを適宜用いることができ、制限酵素が認識するように制限酵素サイトとしての塩基をプライマーに付加することができる。特定の制限酵素を認識する配列を含むプライマーは、必ずしも必要というわけではない。
【００１８】
遺伝子の増幅手段は、今日多様な方法が確立され、今後も開発されていくであろうが、本発明は特に限定されるものではない。具体的には、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法）(Science230:1350-1354,1985)やＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法）（Nature350:91−92, 1991； 特許第２６４８８０２号公報；特許第２６５０１９５号公報）、およびＬＡＭＰ法(Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ＤＮＡ増幅法)（特開２００１−２４２１６９号公報）などの核酸増幅方法を適用することができる。
【００１９】
前記のように、ｈＭＰＶの蛋白質には、Ｆ蛋白質、Ｇ蛋白質、ＳＨ蛋白質、Ｍ２蛋白質、Ｎ蛋白質、Ｍ蛋白質、Ｐ蛋白質、Ｌ蛋白質があるが、本発明で好適に用いら入れるのはＦ蛋白質である。Ｆ蛋白質は配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなり、ウイルス膜と細胞膜の融合を促進し、ウイルス性リボヌクレオ蛋白質を細胞の細胞質に侵入させる役割を果たす（非特許文献４）。また、本発明で用いられる蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるものだけでなく、抗ｈＭＰＶ抗体と抗原−抗体反応を示すポリペプチドを含んでいれば良く、例えば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加といった変異を有するアミノ酸配列ポリペプチドや、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列と相同性を有するポリペプチド等も含まれる。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上であることが望ましい。
【００２０】
本発明で用いられる蛋白質を調製するためには、以下の（１）〜（３）の何れかに示すポリペプチドからなる蛋白質を宿主細胞に発現させることができれば良い。
（１）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入または付加といった変異を有するアミノ酸配列ポリペプチド。変異を有するペプチドは天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。
（３）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列と相同性を有するポリペプチド。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上であることが望ましい。
【００２１】
アミノ酸配列に変異を導入する手段は自体公知であり、例えば部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。例えば成書に記載の方法（Campbell,H. D. et. al. (2000) Genomics 68, p5463-5467.； Ebihara,T., R. et. al. (2004) J. Clin.Microbiol.42:126-132.）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（Ulmer, K. M..(1983) Science 219,p666-671.）を利用することもできる。
【００２２】
また、本発明で用いられる蛋白質をコードする遺伝子としては、以下の（１）から（４）の何れかに示すポリヌクレオチドを用いることができる。
（１）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖。
（２）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１ないし数個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入または付加といった変異を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖。変異の程度およびそれらの位置などは、該変異を有するポリヌクレオチドが配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドと同質のものである限り、特に制限されない。かかる変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入したものであってもよい。
（３）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（Sambrook, et. al., Molecular Cloning, Laboratory Manual 2th, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.）などに従うことができる。
【００２３】
ポリヌクレオチドとは、ＤＮＡやＲＮＡのようにヌクレオチドの重合した高分子物質をいう。本発明で用いられるポリヌクレオチドは、天然のものであることもできるし、化学的に合成されたものであることもできる。あるいはまた、鋳型となるＤＮＡをもとにＰＣＲのような酵素的な反応によって合成されたものであっても良い。天然物としてはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）があり、広く生体細胞中に分布している。また、公知の手法により、これらの核酸に類似したポリヌクレオチドを酵素的に合成することができる（Ochoa,S. et. al. (1955) Science 122: 907-910.； Kornberg, A.et. al. (1956) Biochim BiophysActa. 1000: 57-8.）。本発明において、単にポリヌクレオチドと記載するときには、１本鎖ポリヌクレオチドのみならず２本鎖ポリヌクレオチドをも指すものとする。２本鎖ポリヌクレオチドを意味するときには、一方の鎖のみについての塩基配列が記載されることになるが、センス鎖の塩基配列に基づいてその相補鎖の塩基配列は必然的に規定される。
【００２４】
塩基配列に変異を導入する手段は自体公知であり、例えば部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲなどを単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。例えば成書に記載の方法（Campbell,H. D. et. al. (2000) Genomics 68, p5463-5467.； Ebihara, T., R. et. al. (2004) J. Clin.Microbiol.42:126-132.）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（Ulmer,K.M.(1983) Science , 219, p666-671.）を利用することもできる。
【００２５】
２）組換え蛋白質発現ベクターの作製
この工程では、前記１）で調製されたプラスミドベクターに組込まれた本発明で用いられる蛋白質をコードする遺伝子領域を、蛋白質発現ベクターに組み込む。ベクターは蛋白質発現系に応じて自体公知の方法が確立しており、格別の限定はない。組込み手段は、各ベクター・蛋白質発現系の推奨手段に準ずれば十分である。
【００２６】
蛋白質を発現するためのベクターとしては、これを導入する宿主細胞内で、本発明で用いられる蛋白質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド若しくはそれを含むポリヌクレオチドが発現されるものであれば特に制限はないが、通常宿主細胞に適したプロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現ベクターを用いることができる。
【００２７】
目的とする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主細胞が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、限定されない。ベクターへの目的遺伝子の挿入は、該ポリヌクレオチドまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下に置かれるように連結して行う。また、プロモーターとポリヌクレオチドとの間に、コザック配列（Kozak, M., Gene, 234, 187 (1999)）を挿入したり、ポリヌクレオチドの下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとして特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（Biotechniques, 7, 580, (1989)）等が挙げられる。このようにして得られた本発明の組換え蛋白質発現ベクターは、公知の遺伝子導入法により適当な宿主細胞に導入される。遺伝子導入法の好適な例としては、ウイルスベクター法（Cell,37,1053(1984)）が挙げられる。
【００２８】
３）宿主細胞における本発明で用いられる蛋白質の発現および同定
前記２）で調製された組換え蛋白質発現ベクターを導入する宿主細胞としては、該ベクターが体内で複製可能であり、かつ目的遺伝子のポリヌクレオチドがコードする蛋白質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば、昆虫細胞、動物細胞、大腸菌、酵母等が挙げられ、昆虫細胞が好適に挙げられる。具体的には、昆虫細胞としてＳｆ９細胞（インビトロジェン社）、Ｔｎ５（インビトロジェン社）細胞等が挙げられ、またその蛋白質発現ベクターとしてバキュロウイルス等が、より具体的にはＢａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ（PHAMINGE社）等が挙げられる。
【００２９】
組換えベクターの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用され、例えば成書に記載されている標準的な方法（Sambrook,et.al.(1989)Molecular Cloning, Laboratory Manual 2nd, Cold Spring HarborLaboratory）により実施できる。より好ましい方法としては、遺伝子の安静を考慮するならば染色体へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。
【００３０】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターの導入方法としては、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。トランスファーベクターに前記ポリヌクレオチドを組込んだ組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞内に導入し、昆虫細胞内で相同組換えを起こさせることにより、組換えバキュロウイルスを作製することができる。野生株バキュロウイルスは市販のものを広く利用することができ、例えばバキュロウイルスＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ、PHAMINGEN社）等を用いることができる。
【００３１】
また、宿主細胞が発現する蛋白質が、ｈＭＰＶの蛋白質であるか否かの確認は、公知の常法により行うことができ、例えばウエスタンブロッティング法などにより確認することができる。ウエスタンブロッティング法とは、本発明で用いられる蛋白質を細胞内あるいは細胞外に発現した宿主細胞の細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜あるいはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣ等の蛍光物質、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識を施した抗ＩｇＧ抗体あるいは結合断片と反応させて確認する方法である。本発明に用いる蛋白質が宿主細胞に発現していれば、該宿主細胞を本発明の測定方法に使用することができるが、本発明に用いる蛋白質は、例えば前記のウエスタンブロッティング法で確認できる程度に宿主細胞に発現しているのが好ましい。
【００３２】
４）宿主細胞の担体への固定化
宿主細胞を固定化する担体としては、例えばスライドガラス、マイクロタイトレーションプレート、ラッテクス粒子等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子、金コロイド粒子等の金属高分子を例示することができるが、使用する担体の材質は特に限定されない。すなわち、宿主細胞が担体から脱離しなければどのような材質の担体を用いることも可能である。６）で後述するように、検体中の抗体の検出および／または定量を蛍光物質等の色原体を用いて行う場合には、色原体を含まないスライドガラス等が好適に用いられる。宿主細胞を担体に固定化する固定方法としては、宿主細胞を適当な固定化剤で処理するのが好適である。本発明で用いられる蛋白質のエピトープを破壊しない固定化剤が好適である。そのような固定化剤の具体例としては、アセトン、ホルムアルデヒド、エタノール、グリセリルアルデヒドまたはホルマリン等が、好ましくはアセトン等が挙げられる。また、宿主細胞を固定化した担体と検体を接触させる工程ならびにそれに続く抗原抗体反応による抗ｈＭＰＶ蛋白質検出および／または定量する工程において、宿主細胞が担体から脱離しなければ、担体に固定化する細胞数は特に限定されないが、宿主細胞が均一な層、好ましくは一層となるように担体に固定化するのが好適である。具体的には、スライドグラスを用いる場合、細胞数約７．５×１０３／ウェルの細胞をスライドグラスに分注し風乾、固定すれば良い。
【００３３】
５）宿主細胞を固定化した担体と検体の接触
検体とは、抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を含有している可能性のある生物材料をいい、具体例としてヒト血清が好適に挙げられる。接触とは、前記４）で調製された宿主細胞の固定化されている担体に検体を適量添加することにより行われる。この操作により、前記宿主細胞により発現された担体上の本発明で用いられる蛋白質と検体とを接触させることができる。担体に添加する担体の量は宿主細胞および検体の条件に応じて適宜調整することができる。
【００３４】
６）抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検出および／または定量
上記５）によって、担体上の本発明で用いられる蛋白質と検体との接触が起こり、抗原−抗体反応が達成され、抗原−抗体反応の結果が得られる。抗原−抗体反応の結果が得られれば、当該結果を観察または測定する手段を選択すればよい。測定系により得られた観察結果または測定値に基づき、例えば対照との対比によって、検体に含まれる抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の存在の有無または当該抗体量が判定可能となる。
【００３５】
測定系とは、色原体等による検出および／または定量を可能にすることを意味し、免疫学的測定法を用いた系が好適である。免疫学的測定法の具体例として、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）等が挙げられる。
【００３６】
蛍光抗体法とは、組織標本中の酵素、構造蛋白質等の抗原性物質を、蛍光標識抗体と結合させ、蛍光顕微鏡下に検出する方法をいう。抗体の蛍光標識には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等が用いられる。具体例の一つとして、担体上の本発明で用いられる蛋白質に、検体に含まれる抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を反応させ、さらに蛍光標識でラベルした抗ＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメーターで測定する。
【００３７】
免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）とは、抗体の特異性を利用して抗原物質を検出・定量する方法で、酵素標識した抗体を利用する方法をいう。抗原に結合した標識抗体の量を、酵素反応を行わせることにより測定する。酵素標識に使われる主な酵素に、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼが挙げられる。具体例の一つとして、担体上の本発明で用いられる蛋白質に、検体に含まれる抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を反応させ、酵素標識した抗ＩｇＧ抗体あるいは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。
【００３８】
なお、本発明は、前記抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法を用いる、ｈＭＰＶ感染の検出方法にも及ぶものである。
【００３９】
また、本発明は、前記抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法もしくはｈＭＰＶ感染の検出方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬にも及ぶものである。
【００４０】
さらに、本発明は、前記抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法もしくはｈＭＰＶ感染の検出方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬キットに及ぶものである。
【００４１】
本発明の理解を助ける為に、以下、実施例および実験例を設けて詳述するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
ｈＭＰＶウイルスのｃＤＮＡクローニング
ウイルスＲＮＡを、インフォームドコンセントを得た後に採取したｈＭＰＶ患者血清、組織等からスマイテストＲキット（ゲノムサイエンス研究所）を用いて製造元キットのプロトコールに従い抽出・精製した。次に、得られた精製ウイルスＲＮＡを鋳型として、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー、ＭＭＬＶ（インビトロジェン社製）逆転写酵素を用いて製造元キットのプロトコールに従いｈＭＰＶウイルスｃＤＮＡを合成した。合成したｈＭＰＶウイルスｃＤＮＡを次の手順でクローニングベクターにクローニングした。
【００４３】
ｈＭＰＶの各蛋白質をコードする遺伝子領域は、Ｆｉｒｓｔ ｓｔａｒｔ ｔａｑ（ロシュ・ダイアグノスティック社）を使用し、ＰＣＲ法によりそれぞれ増幅した。ｈＭＰＶのＦ蛋白質（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＹ６２２３８１）をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号５（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号６（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、N蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号７（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号８（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、Ｇ蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号９（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１０（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号１１（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１２（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、Ｐ蛋白質をコードする遺伝子領域を増幅するために配列番号１３（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）及び配列番号１４（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を、それぞれプライマーセットとして使用した。
ｈＭＰＶ−Ｆ−Ｆ ５´−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣ−３´（配列番号５）
ｈＭＰＶ−Ｆ−Ｒ ５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＧＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＴＴＴＧ−３´（配列番号６）
ｈＭＰＶ−Ｎ−Ｆ ５´−ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＴＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴ−３´（配列番号７）
ｈＭＰＶ−Ｎ−Ｒ ５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＣＡＴＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＡＣＴＧ−３´（配列番号８）
ｈＭＰＶ−Ｇ−Ｆ ５´−ＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＡＧＴ−３´（配列番号９）
ｈＭＰＶ−Ｇ−Ｒ ５´−ＴＴＡＡＣＴＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴ−３´（配列番号１０）
ｈＭＰＶ−Ｍ−Ｆ ５´−ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＴＣＣＴＡＣＣＴＡＧＴＡＧＡ−３´（配列番号１１）
ｈＭＰＶ−Ｍ−Ｒ ５´−ＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＴＡＣＧＴ−３´（配列番号１２）
ｈＭＰＶ−Ｐ−Ｆ ５´−ＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＡ−３´（配列番号１３）
ｈＭＰＶ−Ｐ−Ｒ ５´−ＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＡＡ−３´（配列番号１４）
ここにおいて、各配列中下線を施した配列の部分は、特定の制限酵素が認識する配列であり、その配列の３´末端側に蛋白質の翻訳開始領域又は、蛋白質発現終止領域を認識する配列を含む配列を示す。特定の制限酵素が認識する配列が必ずしも必要という訳ではない。
【００４４】
ＰＣＲ法の条件は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００（ＰＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）を用い、９５℃、１０分保温後、９５℃３０秒で変性、５５℃３０秒でアニーリング、７２℃１２０秒で伸長を５０サイクル行った。次に、増幅産物について１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドを切り出し、切り出したアガロースゲルをＵｌｔｒａｆｒｅｅＴＭ−ＤＡ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて５，０００×ｇで１０分遠心し、ゲル中よりＰＣＲ増幅産物を抽出した。抽出したＰＣＲ増幅産物はＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して１，０００×ｇで１５分遠心し精製濃縮した。その後、クローニングベクターｐＣＲ２．１（インビトロジェン社製）に精製濃縮して得た増幅産物を組み込み、ＴＡクローニングによりプラスミドクローンを得た。得られたプラスミドクローンについて、定法に従ってＤＮＡ塩基配列を解析し、ｈＭＰＶのＦ蛋白質（配列番号１）をコードする遺伝子領域（配列番号３）、Ｎ蛋白質（配列番号２）をコードする遺伝子領域（配列番号４）、Ｇ蛋白質（配列番号１５）をコードする遺伝子領域（配列番号１８）、Ｍ蛋白質（配列番号１６）をコードする遺伝子領域（配列番号１９）およびＰ蛋白質（配列番号１７）をコードする遺伝子領域（配列番号２０）がそれぞれクローニングできたことを確認した。
【実施例２】
【００４５】
ｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質の発現
実施例１において得られたｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をコードする遺伝子領域をクローニングしたプラスミドクローンを用いて、ｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をコードする遺伝子領域をバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３にそれぞれ組み込み、バキュロウイルスＤＮＡと共に昆虫細胞内へコ・トランスフェクションし、相同的組換えにより遺伝子組換えバキュロウイルスをそれぞれ作製した。
【００４６】
まず、クローンを組み込んだトランスファーベクターと野生株バキュロウイルスをＳｆ９細胞（インビトロジェン社）内にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて導入し、Ｓｆ９細胞内でおこる相同組換えにより組換えバキュロウイルスを作製した。０．５μｇの直鎖状バキュロウイルスＤＮＡ（Ｂａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ ＰＨＡＭＩＮＧＥＮ社）と１μｇのクローンを組み込んだトランスファーベクターを８μｌの蒸留水に溶解し、２倍希釈した等量のリポフェクチンと混合して室温で１５分間静置した。Ｅｘ ｃｅｌｌ ４０５（ＪＲＨ社）培養液に懸濁した１×１０５個のＳｆ９細胞を２６．５℃で３０分間プラスティックシャーレ（直径３．５ｃｍ）内に吸着後、ＤＮＡ混合液をＳｆ９細胞に滴下し２６．５℃で培養した。２４時間後、培養液に１０％牛胎児血清含ＴＣ１００（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）培地を添加し、更に３日間培養した。その後、プラスティックシャーレに培養したＳｆ９細胞全てを２５ｃｍ２のフラスコに移し、１０％牛胎児血清含ＴＣ１００培地で３日間培養し、その上清を種ウイルスとした。
【００４７】
次に、宿主細胞であるＴｎ５細胞に対して前記組換えバキュロウイルスをＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１０で感染させた。その後、３日間、２６．５℃で昆虫細胞を培養して蛋白質の発現を行い、組換えウイルス感染培養細胞を３日後に採取した。採取した組換えウイルス感染培養細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した後、蛋白質をクマシーブリリアントブルー染色で検出し、予想される分子量の妥当性を検討した。
【００４８】
また、感染培養細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した後、ニトロセルロース膜に常法により転写し、抗ｈＭＰＶ抗体陽性血清（蛍光抗体法によりｈＭＰＶを検出した力価１：１２８０）又はｈＭＰＶ抗体陰性血清（蛍光抗体法によりｈＭＰＶを検出した力価＜１：１０）によるウエスタンブロッティング法を実施した。各活性は２００分の１に希釈し、ニトロセルロース膜に結合させた後、抗ヒトＩｇＧヤギペルオキシダーゼ標識抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を反応させた。その後、化学発光法によりｈＭＰＶ蛋白質を検出した（ＥＣＬ Ｂｌｏｔｔｈｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）。
【００４９】
図１に示したように、組換えウイルス感染細胞ではｈＭＰＶのＦ蛋白質の予想分子量である６０ｋＤａ付近に発現蛋白質バンドが少量確認された。同様にＮ蛋白質の予想分子量である４３ｋＤａ付近に発現蛋白質バンドも微少ながら確認された。図２に示したように、ｈＭＰＶのＦ蛋白質と予測される６０ｋＤａ付近に抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体陽性ヒト血清と反応する蛋白質が検出された。
【実施例３】
【００５０】
ｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をそれぞれ発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法（以下、Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡおよびＢａｃ−Ｎ−ＩＦＡとそれぞれ略称する場合がある。）
組換えバキュロウイルスを感染させることにより、ｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をそれぞれ発現させたＴｎ５細胞を用いて、蛍光抗体法により抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を検出した。
実施例２と同様の方法により、２５ｃｍ２フラスコで当該遺伝子組換えバキュロウイルスを感染させｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質をそれぞれ発現させた。Ｔｎ５細胞を５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄後、細胞数約７．５×１０３／ウェルのＴｎ５細胞を蛍光抗体用スライドガラスに分注し風乾した後、アセトンで１０分間固定し風乾した。スライドガラスに希釈血清（１０分の１希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳでスライドガラスを１０分間３回洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社製）（４０分の１希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで１０分間３回洗浄、風乾し、ＰＢＳ−グリセリン（１：１）を添加した。染色プレパラートは蛍光顕微鏡下で解析した。１０分の１以上の希釈でｈＭＰＶのＦ蛋白質およびＮ蛋白質と反応する血清は、ｈＭＰＶ抗体陽性であると判定した。
【００５１】
図３および図４に示したように、ｈＭＰＶ感染患者血清中のＩｇＧはＦ蛋白質およびＮ蛋白質発現昆虫細胞と特異的に反応し、Ｆ蛋白質およびＮ蛋白質発現昆虫細胞が抗原性を有していること、抗ｈＭＰＶＩｇＧ特異抗体の検出が可能であることを確認した。また、図３に示したように、Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡの結果は、生ウイルスを使用した蛍光抗体法と比較して感度が同等以上であることも確認した。図４に示したようにＢａｃ−Ｎ−ＩＦＡでも抗ｈＭＰＶＩｇＧ特異抗体の検出が可能であるが、Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡよりも感度が低くBac−F−IFAがより優れた抗ｈＭＰＶＩｇＧ特異抗体の検出法であることを確認した。
【実施例４】
【００５２】
ｈＭＰＶのＧ蛋白質、Ｍ蛋白質およびＰ蛋白質をそれぞれ発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法
実施例１において得られたｈＭＰＶのＧ蛋白質、Ｍ蛋白質およびＰ蛋白質をコードする遺伝子領域をクローニングしたプラスミドクローンを用いて、実施例２および実施例３と同様の方法により、ｈＭＰＶのＧ蛋白質、Ｍ蛋白質およびＰ蛋白質をそれぞれ発現させたＴｎ５細胞を用いて、蛍光抗体法により抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を検出した。ｈＭＰＶ感染患者血清中のＩｇＧは、Ｇ蛋白質、Ｍ蛋白質およびＰ蛋白質を発現させたそれぞれの昆虫細胞と特異的に反応したが、いずれもＢａｃ−Ｆ−ＩＦＡよりも感度が低く、Bac−F−IFAが最も優れた抗ｈＭＰＶ ＩｇＧ特異抗体の検出法であることを確認した。
【００５３】
（実験例１）
ｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いた蛍光抗体法（以下、ｈＭＰＶ−ＩＦＡと略称する場合がある。）
ｈＭＰＶをＬＬＣ−ＭＫ２細胞（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＨＹＢＲＩＤＳ）に接種し、感染後２〜３週間のｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を蛍光抗体法のｈＭＰＶ抗体陽性細胞として用いた。ｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を蛍光抗体用スライドガラスのウェルに分注し風乾した後、細胞を風乾し、アセトンで１０分間固定化し風乾した。スライドガラスに希釈血清（１０分の１希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳでスライドガラスを１０分間３回洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社）（４０分の１希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。ＰＢＳで１０分間３回洗浄、風乾し、ＰＢＳ−グリセリン（１：１）を添加した。染色プレパラートは蛍光顕微鏡下で解析した。１０分の１以上の希釈でｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞と反応する血清は、ｈＭＰＶ抗体陽性であると判定した（Ebihara, T., R. et. al. (2004) J. Clin.Microbiol.42:126-132.； Ebihara,T., R. et. al. (2003) J Med Virol 70: 281-3.）。
【００５４】
（実験例２）
ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法（Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡ）とｈＭＰＶ感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いた蛍光抗体法（ｈＭＰＶ−ＩＦＡ）の比較
実施例３におけるＢａｃ−Ｆ−ＩＦＡ、および実験例１におけるｈＭＰＶ−ＩＦＡによる抗体力価の比較を行った。ここで、抗体力価とは、抗体の比活性に相当し、血清反応で抗血清の単位用量中に含まれている抗体量の測定値をいう。抗体力価は一般に、抗血清の希釈系列に対し一定量の抗原を加えて、反応の生じる終末点における希釈倍数の逆数で表される。
Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡは実施例３と同様の方法で、ｈＭＰＶ−ＩＦＡは実験例１と同様の方法でインフォームドコンセントを得た後に採取したｈＭＰＶ患者血清について行った。これらの２種類の蛍光抗体法により測定された血清試料中の抗体力価の対比をピアソンの相関係数により評価したところ、２種類の方法におけるコンコーダンス度（陽性とされた１０以上の血清及び陰性とされた１０以下の血清の力価）は偶然を超えた良いアグリーメントを示した。
また、実施例３に供した大部分の血清試料において、Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡにより得られた力価は、ｈＭＰＶ−ＩＦＡにより得られた力価と同等以上であった。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
上記のように、本発明の抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の測定方法により、操作の危険性の除去、手技的容易性の確保が可能となり、高感度を備えたｈＭＰＶの検出が可能である。本発明により、これまで実施することができなかった抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の検査が可能となり、本発明は迅速診断、疫学調査において非常に有意義であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】ｈＭＰＶのＦ蛋白質をバキュロウイルス発現系で発現させた細胞をSDS-PAGEで展開し、クマシーブリリアントブルー染色した。左レーンはコントロールの昆虫細胞Ｔｎ５であり、右レーンが蛋白質発現昆虫細胞Ｔｎ５である。
【図２】ｈＭＰＶのＦ蛋白質をバキュロウイルス発現系で発現させた細胞を用いてウエスタンブロッティング法によりｈＭＰＶのＦ蛋白質を検出した。レーン１及び３がコントロールの昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示し、レーン２及び４が組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示す。ｈＭＰＶのＦ蛋白質は陽性血清（レーン３、４）及び陰性血清（レーン１、２）を用いて解析した。矢印はｈＭＰＶのＦ蛋白質を示す。
【図３】ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法（Ｂａｃ−Ｆ−ＩＦＡ）によりｈＭＰＶ感染患者血清中の抗ｈＭＰＶ Ｆ蛋白質ＩｇＧ抗体を検出した結果を示す。上のレーンはコントロールの昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示し、下のレーンがｈＭＰＶのＦ蛋白質発現昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示す。また、左から１番目〜３番目のレーンは陽性血清（４０分の１希釈）を用いた結果を示し、左から４番目のレーンは陰性血清（１０分の１希釈）を用いた結果を示す。（ ）内はｈＭＰＶ−ＩＦＡの結果を示す。
【図４】ｈＭＰＶのＮ蛋白質を発現するバキュロウイルス発現系を用いた蛍光抗体法（Ｂａｃ−Ｎ−ＩＦＡ）によりｈＭＰＶ感染患者血清中の抗ｈＭＰＶ Ｎ蛋白質ＩｇＧ抗体を検出した結果を示す。上のレーンはコントロールの昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示し、下のレーンがｈＭＰＶのＮ蛋白質発現昆虫細胞Ｔｎ５を用いた結果を示す。また、左から１番目〜３番目のレーンは陽性血清（４０分の１希釈）を用いた結果を示し、左から４番目のレーンは陰性血清（４０分の１希釈）を用いた結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、抗ヒト・メタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）蛋白質抗体の測定方法；
１）ｈＭＰＶのＦ蛋白質をコードする遺伝子領域を蛋白質発現ベクターに組み込み、組換え蛋白質発現ベクターを作製する工程、
２）工程１）において得られた組換え蛋白質発現ベクターを宿主細胞に導入しｈＭＰＶのＦ蛋白質の発現を行う工程、
３）工程２）においてｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞を担体に固定化する工程、
４）工程３）において担体上に固定化した宿主細胞が発現するｈＭＰＶのＦ蛋白質と、検体を接触させる工程、
５）工程４）において得られた担体上のｈＭＰＶのＦ蛋白質と検体における抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の抗原−抗体反応の結果を、測定系に導き、検体における抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を検出および／または定量する工程。
【請求項２】
ｈＭＰＶのＦ蛋白質が以下に示すいずれか１のポリペプチドである、請求項１に記載の測定方法；
１）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち１ないし数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたポリペプチド、
３）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと８０％以上の相同性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ｈＭＰＶのＦ蛋白質をコードする遺伝子が以下に示すいずれか１のポリヌクレオチドである請求項１に記載の測定方法；
１）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖、
２）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１ないし数個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入または付加された配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖、
３）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項４】
組換え蛋白質発現ベクターが組換えバキュロウイルスである請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が昆虫細胞である請求項１〜４のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
担体が、合成高分子、天然高分子、又は金属高分子である請求項１〜５のいずれか１に記載の方法。
【請求項７】
測定系が免疫学的測定法を用いた系である、請求項１〜６のいずれか１に記載の方法。
【請求項８】
免疫学的測定法が蛍光抗体法である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１に記載の方法を用いる、ｈＭＰＶ感染の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬キット。
【請求項１】
以下の工程を含む、抗ヒト・メタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）蛋白質抗体の測定方法；
１）ｈＭＰＶのＦ蛋白質をコードする遺伝子領域を蛋白質発現ベクターに組み込み、組換え蛋白質発現ベクターを作製する工程、
２）工程１）において得られた組換え蛋白質発現ベクターを宿主細胞に導入しｈＭＰＶのＦ蛋白質の発現を行う工程、
３）工程２）においてｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞を担体に固定化する工程、
４）工程３）において担体上に固定化した宿主細胞が発現するｈＭＰＶのＦ蛋白質と、検体を接触させる工程、
５）工程４）において得られた担体上のｈＭＰＶのＦ蛋白質と検体における抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体の抗原−抗体反応の結果を、測定系に導き、検体における抗ｈＭＰＶ蛋白質抗体を検出および／または定量する工程。
【請求項２】
ｈＭＰＶのＦ蛋白質が以下に示すいずれか１のポリペプチドである、請求項１に記載の測定方法；
１）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
２）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち１ないし数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたポリペプチド、
３）配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと８０％以上の相同性を有するポリペプチド。
【請求項３】
ｈＭＰＶのＦ蛋白質をコードする遺伝子が以下に示すいずれか１のポリヌクレオチドである請求項１に記載の測定方法；
１）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖、
２）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドのうち１ないし数個のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入または付加された配列からなるポリヌクレオチド及び／又はその相補鎖、
３）配列表の配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド。
【請求項４】
組換え蛋白質発現ベクターが組換えバキュロウイルスである請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が昆虫細胞である請求項１〜４のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
担体が、合成高分子、天然高分子、又は金属高分子である請求項１〜５のいずれか１に記載の方法。
【請求項７】
測定系が免疫学的測定法を用いた系である、請求項１〜６のいずれか１に記載の方法。
【請求項８】
免疫学的測定法が蛍光抗体法である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１に記載の方法を用いる、ｈＭＰＶ感染の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１に記載の方法に用いる試薬であり、ｈＭＰＶのＦ蛋白質を発現させた宿主細胞または該宿主細胞を固定化した担体を含むことを特徴とする測定用試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１１８９７０（Ｐ２００６−１１８９７０Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３０６７２０（Ｐ２００４−３０６７２０）
【出願日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５９１１２２９５６）株式会社三菱化学ビーシーエル (45)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５９１１２２９５６）株式会社三菱化学ビーシーエル (45)
【Ｆターム（参考）】
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