抗口蹄疫ワクチン組成物並びにその調製及び使用
本発明は、免疫学及び遺伝子工学の分野に関連する。特に、本発明は、口蹄疫ウイルスに対する組換えワクチンの構築、調製及び使用に関する。該ワクチンは、口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートと、免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片と、口蹄疫ウイルス３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学及び遺伝子工学の分野に関連する。特に、本発明は、口蹄疫ウイルスに対する組換えワクチン組成物並びにその調製及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫（ＦＭＤ）は、動物におけるＡ類感染症の中で最も深刻な疾患であり、ブタ、ウシ、ヒツジ等の偶蹄類動物に深刻に影響を与える劇症の感染症である。近年、多くの国々の畜産業が、ＦＭＤの発生及び流行によって引き起こされる、大きな経済的損失を被っている。今までのところ、７つの血清型の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（ヨーロッパＡ、Ｏ及びＣ、アフリカＳＡＴ１、ＳＡＴ２及びＳＡＴ３、並びにアジア１血清型）及び多くのサブタイプ（例えば、Ｋｌｅｉｄら、１９８１、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４：１１２５〜１１２９ページ参照）が公知であり、Ｏ血清型ＦＭＤＶが、最も広範囲に広がった血清型である。
【０００３】
ＦＭＤＶは、ピコナウイルス科のアフトウイルス属に属する。ＦＭＤＶは、６０コピーの３つのカプシドウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）に囲まれたプラスセンスの一本鎖ＲＮＡゲノム（約８．５ｋｂ）からなる。研究から、ＦＭＤＶ血清型Ｏにおいて、これらの３つのウイルスタンパク質のＶＰ１が、ウイルスの感染性に最も関連があることが示されている。ＶＰ１タンパク質中の２つの免疫原性領域、すなわちアミノ酸残基１４１〜１６０及び残基２００〜２１３の部分がある。それらの領域はそれぞれ、２つの突出し、スクランブルした、可動性の高いループ構造中にある。残基１４５〜１５７の領域のループ構造は、細胞表面受容体への付着に関与する保存構造Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ領域）を含む（Ｂｅｌｓｈａｍ ＧＪ及びＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ Ｅ、Ｇｅｎｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ、１９〜５２ページ、２００４、Ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ、Ｓｏｂｒｉｎｏ Ｆ及びＤｏｍｉｎｇｏ Ｅ編）。タンパク質３Ｄは、ＦＭＤＶ中のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、ブタＴ細胞によって認識される抗原性エピトープを有する（Ｂｅｌｓｈａｍ ＧＪ及びＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ Ｅ、Ｇｅｎｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ、１９〜５２ページ、２００４、Ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ、Ｓｏｂｒｉｎｏ Ｆ及びＤｏｍｉｎｇｏ Ｅ編）。
【０００４】
予防的免疫化によって、ＦＭＤＶの感染を制御することができる。既存の抗ＦＭＤＶワクチンにおいては、死滅ウイルスが使用される。実際には、かかるワクチンは、ウイルスＲＮＡのインビボ組換えのために、疾患の伝染を引き起こすことがある（Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＭＤＶ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｗｈｅｎ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ １９９１；７５：３７〜４１ページ）。その一方で、化学的不活化剤を使用して、かかるワクチン中のウイルスが不活化され、送達の間に低温コールドチェーン輸送及び冷凍庫保存が必要とされる。いくつかの発展途上国の農村部においては、冷凍庫が入手可能できず、結果的に、ワクチンが注射の時点で実質的に効能を失っていることがある。さらに、製造プロセスの間の生きたＦＭＤＶウイルスの漏出の可能性によって、かかるワクチンの製造が環境にとって危険因子になることがある。
【０００５】
本発明のエピトープ特異的ワクチンは、ワクチン接種された動物において、ＦＭＤＶに対する抗体応答を誘発することができる。本発明のワクチンは、使用及び製造において非常に安全なだけでなく、操作、保存及び輸送において非常に便利である。その一方で、本発明のワクチンを設計して、特定の用件を満たすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＦＭＤＶに対する安全で有効な組換えワクチン並びにその調製及び使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、
ＦＭＤＶカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、
免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片、及び、
ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片
を含む組換えタンパク質を含む、動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端に、
ＦＭＤＶカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、及び
免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片
を含む組換えタンパク質と、
（ｉｉ）ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片と
を含む、動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。
【０００９】
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態において、組換えタンパク質が抗原性エピトープの２〜５回のタンデムリピートを含み、より好ましくは、組換えタンパク質が抗原性エピトープの３回タンデムリピートを含む。
【００１０】
本発明のワクチン組成物の一実施形態において、繰り返された抗原性エピトープは、ペプチドリンカーを介して互いに連結されている、及び／又は抗原性エピトープのタンデムリピートが、ペプチドリンカーを介して免疫グロブリン重鎖の定常領域に連結されている。
【００１１】
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態において、抗原性エピトープは、ＦＭＤＶカプシドタンパク質に由来する。抗原性エピトープは、例えば、ヨーロッパＡ、Ｏ及びＣ血清型；アフリカＳＡＴ１、ＳＡＴ２及びＳＡＴ３血清型；並びにアジア１血清型に由来し得る。より好ましくは、抗原性エピトープは、ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質に由来する。本発明の上述のワクチン組成物の一実施形態において、タンデムリピートはＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の２つの抗原性エピトープのタンデムリピートであり、該２つの２つの抗原性エピトープのタンデムリピートは、それぞれ配列番号９若しくは配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、又はそれぞれ配列番号９若しくは配列番号１０のアミノ酸配列からなる。本発明の上述のワクチン組成物のさらなる実施形態において、タンデムリピートはアジア１血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の２つの抗原性エピトープのタンデムリピートであり、該２つの抗原性エピトープのタンデムリピートは、それぞれ配列番号２５若しくは配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、又はそれぞれ配列番号２５若しくは配列番号２６のアミノ酸配列からなる。本発明の上述のワクチン組成物のさらなる実施形態において、タンデムリピートはＡ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の２つの抗原性エピトープのタンデムリピートであり、該２つの抗原性エピトープのタンデムリピートは、それぞれ配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、又はそれぞれ配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列からなる。本発明の上述のワクチン組成物のさらなる実施形態において、タンデムリピートはウシＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の３つの抗原性エピトープのタンデムリピートであり、該３つの抗原性エピトープのタンデムリピートは、それぞれ配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、又はそれぞれ配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列からなる。
【００１２】
本発明のワクチン組成物を、ブタ、ウシ、又はヒツジ等の偶蹄類動物に投与して、ＦＭＤＶ感染に対する免疫応答を誘導することができる。好ましくは、本発明のワクチン組成物において、組換えタンパク質中に含まれる免疫グロブリン重鎖の定常領域は、ワクチン接種される動物と同じ種に由来する。本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容され得る担体及び／又はアジュバントをさらに含み得る。
【００１３】
本発明は、上述のような組換えタンパク質もまた、包含する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、本発明のワクチン組成物中に含まれる組換えタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明は、
組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと、
該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築するステップと、
該発現ベクターを宿主細胞中に導入するステップと、
組換えタンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、発現された組換えタンパク質を回収及び精製するステップとを含む、本発明の抗ＦＭＤＶワクチンにおける使用のための組換えタンパク質を調製する方法を、さらに提供する。
【００１６】
また、本発明は、有効量の本発明のワクチン組成物を、該ワクチン組成物を必要とする動物に投与するステップを含む、動物においてＦＭＤＶ感染を予防する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の抗Ｏ血清型ＦＭＤＶワクチンの構成を示す図である。Ａ：実施例中で調製されたワクチン組成物Ａであり、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、動物免疫グロブリン重鎖の定常領域、及びＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質が、組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる）を形成するように連結されている。Ｂ：実施例中で調製されたワクチン組成物Ｂであり、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート及び動物免疫グロブリン重鎖の定常領域が、組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣ」によってコードされる）を形成するように連結されており、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質は別の成分である。
【図２】本発明のワクチン組成物Ａ中の組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる）のクマシーブルー染色を示す図である。Ｍ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：総タンパク質；レーン２：可溶性タンパク質；レーン３：封入体（６Ｍ尿素中に溶解）；レーン４：封入体（８Ｍ尿素中に溶解）。
【図３】抗Ｏ血清型ＦＭＤＶ血清を使用した、本発明のワクチン組成物Ａ中の組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる）のイムノブロッティング検出を示す図である。Ｍ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：総タンパク質；レーン２：可溶性タンパク質；；レーン３：封入体（６Ｍ尿素中に溶解）；レーン４：封入体（８Ｍ尿素中に溶解）。
【図４】本発明のワクチン組成物Ｂ中の組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣ」によってコードされる）のクマシーブルー染色及びイムノブロッティング検出を示す図である。Ａ：３Ｒ−ＩＧＣ断片によってコードされる組換えタンパク質を発現している細菌由来の総タンパク質溶解物のクマシーブルー染色（ＩＰＴＧ誘導の前及び後）；Ｂ：ブタ由来の抗Ｏ血清型ＦＭＤＶ血清を使用したＩＰＴＧ誘導の後に得られた総タンパク質溶解物中の組換えタンパク質（３Ｒ−ＩＧＣ断片によってコードされる）のイムノブロッティング検出。
【図５】本発明のワクチン組成物Ｂ中の３Ｄタンパク質成分のクマシーブルー染色及びイムノブロッティング検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ＦＭＤＶカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートと、免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片と、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片とを含む組換えタンパク質を含む、動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端に、（ａ）ＦＭＤＶカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート及び（ｂ）免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片、を含む組換えタンパク質と、（ｉｉ）ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片とを含む、動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。
【００２０】
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態において、抗原性エピトープは、ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の抗原性エピトープ等、ＦＭＤＶカプシドタンパク質に由来する。
【００２１】
本発明の抗ＦＭＤＶワクチン組成物において、組換えタンパク質の構築において有用なＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープは、ＶＰ１タンパク質の公知の主な抗原性エピトープ、例えば、ブタＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１４１〜１６０（配列番号９）又はアミノ酸残基２００〜２１３（配列番号１０）によって表されるエピトープであり得る。ＦＭＤＶに感染した動物において、これらのエピトープがＢリンパ球応答を誘発することができることが、実証されている。
【００２２】
本発明のワクチン中の組換えタンパク質の免疫原性を促進するために、ＦＭＤＶの抗原性エピトープ（例えば、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープ）を、本発明のワクチンにおける使用のために構築される組換えタンパク質中で縦列反復させる。また、タンデムリピートは、縦列反復された、ＦＭＤＶの１つ又は複数の抗原性エピトープ（例えば、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープ）によって形成させることができる。この点で、語句「抗原性エピトープのタンデムリピート」は、本明細書中で使用される場合、組換えタンパク質のアミノ酸配列において、抗原性エピトープのそれぞれ（同一であるか、又は異なるかのいずれかであり得る）が別のものに直接、又はリンカーを介して間接的に、規則正しく連結され、これらの縦列に連結された抗原性エピトープのそれぞれ（同一であるか、又は異なるかのいずれかであり得る）が２回以上、例えば３回、繰り返されることを意味するよう意図される。語句「抗原性エピトープのタンデムリピート」は、本明細書中で使用される場合、組換えタンパク質のアミノ酸配列中で互いに縦列に配置されて直接連結されるか、又はリンカーを介して間接的に連結された、ＦＭＤＶの複数の異なる抗原性エピトープ（例えば、３つのエピトープ）もまた包含し、ここで、エピトープのそれぞれは、１回又は複数回（例えば、２回又は３回）出現し得る。
【００２３】
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態において、組換えタンパク質中の抗原性エピトープは、タンデムリピート中で２〜５回繰り返される。５回を超える繰り返しもまた可能であるが、５回未満の繰り返しによって、組換え発現によって本発明の組換えタンパク質を発現するのがより簡便になる。より好ましくは、組換えタンパク質中の抗原性エピトープは、タンデムリピート中で３回繰り返される。
【００２４】
本発明のワクチン組成物の特定の実施形態において、組換えタンパク質中のタンデムリピートは、ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の２つの抗原性エピトープのタンデムリピートである。ある特定の実施形態において、タンデムリピートは、縦列に配置されて３回繰り返された２つの抗原性エピトープによって形成され、ここで該２つの抗原性エピトープは、それぞれ、ブタＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の、残基１４１〜１６０のアミノ酸配列（配列番号９）及び残基２００〜２１３のアミノ酸配列（配列番号１０）によって表される。実験パートに示すように、この組換えタンパク質は、動物においてＯ血清型ＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を効果的に誘導することによって、動物を防御することができる。
【００２５】
図１は、抗Ｏ血清型ＦＭＤＶワクチン組成物に関する本発明のワクチンの構成を示す。該ワクチンにおいて、組換えタンパク質のＮ末端はＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートの領域であり、家畜由来の免疫グロブリン重鎖の定常領域が後に続き、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質が免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣ末端に直接連結している（図１Ａ）か、又は別のタンパク質成分となっている（図１Ｂ）。
【００２６】
本発明のワクチンの好ましい実施形態において、組換えタンパク質中の抗原性エピトープ及び／又はタンデムリピートは、ペプチドリンカーを介して互いに連結される。抗原性エピトープ及び／又はタンデムリピートの間のペプチドリンカーは、抗原性エピトープの線状構造に影響を与えるべきではない。本発明において使用することができるペプチドリンカーの例は、例えば、ＧＧＳＳＧＧ（配列番号１１）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、及びＧＧＧＧＳ（配列番号２７）である。本明細書中に提供される実験データから、上記「ＧＳリンカー」を、組換えタンパク質中でタンデムリピートの形態に配置された抗原性エピトープの線状構造に影響を与えない、本発明におけるペプチドリンカーとして使用することができ、該組換えタンパク質が、動物における防御抗体の産生を誘発することができることが、示される。また、本発明のワクチン中の組換えタンパク質において、抗原性エピトープ（複数可）のタンデムリピートは、上述のようなペプチドリンカーを介して、免疫グロブリン重鎖の定常領域のアミノ酸配列に連結させることもできる。
【００２７】
タンデムリピートの形態に配置された抗原性エピトープが組換えタンパク質分子の表面に提示されるために、タンデムリピートの形態に配置された、抗原性エピトープ、例えばＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープは、免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片に連結される。免疫グロブリン重鎖の定常領域は、免疫グロブリン分子の表面の抗体の可変領域の配列を提示することができる。免疫グロブリン重鎖の定常領域の、この特性を利用することによって、本発明者は、免疫グロブリン重鎖の可変領域を、タンデムリピートの形態に配置された抗原性エピトープと置換して、免疫グロブリン重鎖の定常領域が抗原性エピトープ、例えばＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートを、組換えタンパク質分子の表面に提示することを可能にする。動物へ本発明のワクチンを投与する際に、Ｂ細胞表面ＩｇＭモノマーを組換えタンパク質分子中の抗原性エピトープに接触させ、次いで活性化して、免疫応答の産生を生じることができる。動物に関して行われた実験によって、この方法で設計されたワクチンが、強い防御免疫応答を誘発することができ、それによって動物を感染から防御する目的を達成することができることが確認される。
【００２８】
好ましくは、本発明の組換えタンパク質において使用することができる免疫グロブリン重鎖の定常領域は、家畜由来である。組換えタンパク質分子における、免疫グロブリン重鎖の定常領域の免疫原性を減少させるために、ワクチン接種される動物と同じ種由来である免疫グロブリン重鎖の定常領域を使用することが好ましい。免疫グロブリン重鎖の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＧ又はそれらのサブタイプに由来し得る。免疫グロブリン重鎖の定常領域の「機能性断片」は、抗原性エピトープのタンデムリピートを組換えタンパク質分子の表面に提示する能力を保持している、免疫グロブリン重鎖の定常領域の一部をいう。
【００２９】
本発明のワクチン中の別の部分又は成分は、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片、好ましくはインタクトな３Ｄタンパク質である。ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質、及びＶＰ１タンパク質等のカプシドタンパク質由来の抗原性エピトープは、同じ型のＦＭＤＶに由来し得る。あるいは、異なる型のＦＭＤＶに由来し得る。例えば、本発明のワクチンにおいて、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープはＯ血清型ＦＭＤＶに由来し得るが、３Ｄタンパク質はＯ血清型ＦＭＤＶ由来又はＡ血清型若しくはアジア１ ＦＭＤＶ由来のいずれかであり得る。
【００３０】
本発明のワクチンにおいて、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質は、ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、免疫グロブリン重鎖の定常領域、及びＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質を含む組換えタンパク質全体を形成するように、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣ末端に直接連結させることができる。あるいは、３Ｄタンパク質は、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート及び免疫グロブリン重鎖の定常領域を含む組換えタンパク質とともに本発明のワクチンの有効な成分を形成する、別のタンパク質成分として存在し得る。
【００３１】
ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質を、組換えタンパク質の一部として、又は別の成分として、本発明のワクチン中に導入する目的は、ワクチン接種される動物においてＴ細胞応答を誘発することである。Ｔ細胞は、動物の体内で、ウイルスに感染している細胞を攻撃し、感染細胞を排除することによってウイルスを一掃することができる。したがって、Ｔ細胞応答は、動物をウイルス感染から防御することにおいて、重要な役割を果たす。動物が本発明のワクチンをワクチン接種された後に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ワクチン中のタンパク質成分を取り込み及び処理することができ、処理された成分は、ＭＨＣ分子によってＡＰＣの表面に提示され得る。これによって、抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球の活性化及び増殖、並びに免疫記憶細胞の発生が誘導される。ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質の「免疫原性断片」は、インタクトな３Ｄタンパク質同様に、ワクチン接種された動物においてＴ細胞応答を効率的に誘発することができる、３Ｄタンパク質の一部をいう。
【００３２】
本発明のワクチンの特定の実施形態において、組換えタンパク質のＮ末端は、縦列に配置されて３回繰り返された、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープによって形成され、ここで該２つの抗原性エピトープは、ペプチドリンカー配列番号１１によって連結された、配列番号９（ＶＰ１のアミノ酸残基１４１〜１６０）及び配列番号１０（ＶＰ１のアミノ酸残基２００〜２１３）であり、このタンデムリピートは、免疫グロブリン重鎖（配列番号４）に、そのＣ末端でペプチドリンカー配列番号１１によって連結され、組換えタンパク質のＣ末端はＯ血清型ＦＭＤＶのインタクトな３Ｄタンパク質配列によって形成され、それによって、組換えタンパク質全体（配列番号８）が形成される。別の特定の実施形態において、組換えタンパク質のＮ末端は、縦列に配置されて３回繰り返された、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープによって形成され、ここで２つの抗原性エピトープは、ペプチドリンカー配列番号１１によって連結された、配列番号９（ＶＰ１のアミノ酸残基１４１〜１６０）及び配列番号１０（ＶＰ１のアミノ酸残基２００〜２１３）であり、組換えタンパク質のＣ末端は免疫グロブリン重鎖（配列番号４）によって形成され、上述の２つの部分はペプチドリンカー配列番号１１によって連結されているが、インタクトな３Ｄタンパク質は別の独立した成分である。このように、組換えタンパク質（配列番号１３）成分及び３Ｄタンパク質（配列番号６）成分は、ワクチン組成物の有効な成分をともに形成する。
【００３３】
本発明は、上述の態様において記載されているような組換えタンパク質もまた、包含する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、本発明のワクチン組成物中の組換えタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３５】
本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得る方法は、当該分野で公知である。例えば、ポリヌクレオチド分子は、化学合成によって、直接調製することができる。あるいは、抗原性エピトープのタンデムリピート、免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片、及びＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片をそれぞれコードする核酸分子を最初に得て、ペプチドリンカーをコードする配列を付加し、次いでそれらをともに連結して、組換えタンパク質全体をコードするポリヌクレオチドを形成させることが可能である。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって、動物の脾臓細胞由来の免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチド、及びＦＭＤＶ試料由来の３Ｄタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ることが可能である。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドを使用して、例えば該ポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入し、次いで宿主細胞に導入して組換えタンパク質を発現させることによって、本発明のワクチン中の成分を調製することができる。
【００３７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、動物におけるＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物における使用のための、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、
上述のような組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと、
該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築するステップと、
該発現ベクターを宿主細胞中に導入するステップと、
組換えタンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、発現された組換えタンパク質を回収及び精製するステップとを含む。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために使用することができる、発現ベクター、例えば原核生物又は真核生物発現ベクターもまた、当該分野で公知である。
【００３９】
本発明の組換えタンパク質を発現させるために使用することができる宿主細胞は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及び酵母細胞である。
【００４０】
本発明の抗ＦＭＤＶワクチン組成物は、有効量の有効な成分（複数可）、すなわち組換えタンパク質全体又は組換えタンパク質成分と別の３Ｄ成分とを、薬学的に許容され得る担体及びアジュバントとともに含む。動物は、ブタ、ウシ、又はヒツジ等の、偶蹄類動物である。本明細書中で使用される場合、「有効量」は、ワクチンの１つの成分又は複数の成分が、ワクチン接種される動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するのに十分な量であることを意味する。
【００４１】
適切な担体及びアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム等の無機アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ又はポリＡ等の有機アジュバント、微生物及びその抽出物、並びにオイルアジュバント等である。
【００４２】
本発明は、有効量の本発明のワクチン組成物を、該ワクチン組成物を必要とする動物に投与するステップを含む、動物においてＦＭＤＶ感染を予防する方法もまた、提供する。本発明のワクチンは、例えば皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射によって、タンパク質ワクチンの投与に適切な任意の経路で投与することができる。本明細書中で使用される場合、「有効量」は、ワクチンの１つの成分又は複数の成分が、ワクチン接種される動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するのに十分な量であることを意味する。有効量は、例えば、動物に関する従来の実験によって、当業者によって、容易に決定することができる。本発明のワクチン中のタンパク質成分は、１００〜２０００μｇ、好ましくは２００〜１０００μｇの総量で投与することができる。実施例中で調製されたワクチン組成物Ａ中の組換えタンパク質を例にとれば、２００〜１０００μｇの量の組換えタンパク質の単回投薬投与によって、ワクチン接種される動物においてＯ血清型ＦＭＤＶに対する有効な防御免疫応答を誘発することができる。
【００４３】
抗ＦＭＤＶワクチン組成物の効能を測定及び評価するための方法及び技術は、当該分野で公知である。かかる方法及び技術としては、ハムスター細胞の培養、ウイルスのインビトロ増殖、及びタンパク質の調製等の、ＦＭＤＶのインビトロ培養及び滴定；ワクチン接種された動物から血清を採取すること、血清中和試験、哺乳マウス防御試験、ＩＤ５０及びＬＤ５０測定、並びにブタにおけるウイルス負荷試験等の動物実験；並びに血清中和抗体応答アッセイ及びＴ細胞応答アッセイ等の、動物における免疫応答アッセイが挙げられる。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例は、例示によってのみ提示される。実施例は決して、本発明の範囲を限定するように意図されない。
【００４５】
実施例１：組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
実施例１ａ：Ｏ血清型ＦＭＤＶベースの組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
１．１．縦列反復されたＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープをコードするＤＮＡの合成
３回縦列反復された、ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＤＮＡ合成によって得た。２つの抗原性エピトープは、最近のＦＭＤの発生の原因であるＯ血清型ＦＭＤＶ由来、すなわち、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１４１〜１６０（配列番号９）及びアミノ酸残基２００〜２１３（配列番号１０）である。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を、縦列反復されたＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのそれぞれをコードするヌクレオチド配列の間に導入した。また、メチオニンコドンを５’末端に付加し、ペプチドリンカーをコードするさらなるヌクレオチド配列（配列番号１１）を３’末端に付加した。得られた産物を「３Ｒ」断片と名付け、そのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。
【００４６】
１．２．ブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を得る
動物免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードする核酸を、以下に概説するように、動物脾臓細胞からのＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得た。ブタ単鎖ＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）由来の重鎖の定常領域のｍＲＮＡを含む全ｍＲＮＡを、ファストプレップ（ＦａｓｔＰｒｅｐ）キット（Ｇｉｂｃｏ）を使用することによって、ブタ脾臓試料から抽出及び精製した。ｓｃＩｇＧをコードするｃＤＮＡ断片を、以下のプライマーを用いることによって、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得た（Ｋａｃｋｏｖｉｃｓ，Ｉ．、Ｓｕｎ，Ｊ．、Ｂｕｌｔｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｆｉｖｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＩｇＧ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｉｍａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４；１５３：３５６５〜７３ページ）：
ｓｃＩｇＧ ５’プライマー：５’−ＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＣＧＧＣＣＣＣＡ−３’ 配列番号１５
ｓｃＩｇＧ ３’プライマー：５’−ＴＣＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴ−３’ 配列番号１６
【００４７】
以下の条件下での逆転写のために、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した：５μｌのＭ−ＭＬＶ ５Ｘ反応バッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ）；１．２５μｌの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ；２５単位の組換えＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤；２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素；２μｇ ｍＲＮＡ；０．５μｇのプライマー；２５μｌの最終体積までリボヌクレアーゼ不含水を添加する。３７℃で６０分間反応を行い、次いで７０℃で１５分間不活化した。
【００４８】
次いで、得られた産物を、その後のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅系の総体積は２５μｌであり、２．５μｌの１０ｘＰＣＲバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ グルチン）、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌのｓｃＩｇＧ ５’プライマー（配列番号１５）（１０ｍＭ）、１μｌのｓｃＩｇＧ ３’プライマー（配列番号１６）（１０ｍＭ）、０．２μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μｌの鋳型、１８．３μｌのｄｄＨ２Ｏを含んでいた。ＰＣＲは、以下の条件下で行った：９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、及び７２℃で２分間の３４サイクル；並びに最後に７２℃で５分間。得られた増幅産物を「ＩＧＣ」断片と名付けた。配列決定解析から、この断片が配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有することが明らかになった。
【００４９】
１．３．タンデムリピート領域及びブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードする核酸のライゲーション
ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートをコードする核酸（３Ｒ断片）とブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域のｃＤＮＡ（ＩＧＣ断片）とのライゲーションを、３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＡＴＰを含むライゲーション反応系において行った。ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートをコードする核酸の、重鎖の定常領域のｃＤＮＡ断片に対するモル比は、１：１であった。２ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及び０．２ｕ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ライゲーションの効率を促進した。ライゲーション産物を「３Ｒ−ＩＧＣ」断片と名付け、そのヌクレオチド配列を配列番号１４に示す。
【００５０】
１．４．ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードする核酸を得る
Ｏ血清型ＦＭＤＶに感染したブタから得られた水疱液試料から、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードする核酸をクローニングするために、以下のプライマーを使用した：
３Ｄ ５’プライマー：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＣ−３’ 配列番号１７
３Ｄ ３’プライマー：５’−ＧＴＡＴＧＣＧＴＣＡＣＣＧＣＡＣ−３’ 配列番号１８
【００５１】
ＲＴ−ＰＣＲ条件は、ＩＧＣの増幅に使用したものと同じであった。ＦＭＤＶから増幅された産物を「Ｄ」断片と名付けた。この産物は、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードし、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する。
【００５２】
１．５．組換えタンパク質全体をコードする核酸を得る
上記で調製された「３Ｒ−ＩＧＣ」断片を、次いで、オーバーラッピングＰＣＲによってＦＭＤＶから増幅された、３Ｄタンパク質をコードする「Ｄ」断片とライゲートさせ、それによって、組換えタンパク質全体をコードする核酸分子「３Ｒ−ＩＧＣＤ」を得た。詳細なステップは以下の通りである。
【００５３】
（１）「３Ｒ−ＩＧＣ」断片増幅のためのプライマーを設計する：
３Ｒ−ＩＧＣＤ ５’プライマー：５’−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣＣＴＧ−３’ 配列番号１９
３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー１：５’−ＧＧＴＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧ−３’ 配列番号２０
【００５４】
３Ｒ−ＩＧＣＤ ５’プライマーは「３Ｒ−ＩＧＣ」断片の５’末端に相補的であり、３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー１は「３Ｒ−ＩＧＣ」断片の３’末端に部分的に相補的であり、「Ｄ」断片の５’末端に部分的に相補的である。ＰＣＲ増幅によって、３Ｒ−ＩＧＣＤの３Ｒ−ＩＧＣ部分が生成され、その３’末端配列は、「Ｄ」断片の５’末端に部分的に相同である。
【００５５】
（２）「Ｄ」断片増幅のためのプライマーを設計する：
Ｄ ５’プライマー：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＣ−３’ 配列番号２１
３Ｒ−ＩＧＣＤ ３’プライマー：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＧＴＣＡＣＣＧＣＡＣ−３’ 配列番号２２
【００５６】
Ｄ ５’プライマーは「Ｄ」断片の５’末端に部分的に相補的であり、「３Ｒ−ＩＧＣ」断片の３’末端に部分的に相補的であり、３Ｒ−ＩＧＣＤ ３’プライマーは「Ｄ」断片の３’末端に相補的である。ＰＣＲ増幅によって、３Ｒ−ＩＧＣＤのＤ部分が生成され、その５’末端配列は、「３Ｒ−ＩＧＣ」断片の３’末端に部分的に相同である。
【００５７】
（３）各５μｇの、３Ｒ−ＩＧＣ部分及びＤ部分を、互いにＰＣＲプライマー及び鋳型として使用し、１分間の９５℃変性、２分間の６５℃伸長の６サイクルに供した。次いで、３Ｒ−ＩＧＣＤ ５’プライマー及び３Ｒ−ＩＧＣＤ ３’プライマーをこの反応系に添加し、１分間の９５℃変性、５５℃３０秒間、２分間の７２℃伸長の２０サイクルに供した。得られた増幅産物は３Ｒ−ＩＧＣＤ（配列番号７）であり、実施例２で調製されるようなワクチン組成物Ａにおける組換えタンパク質をコードする。
【００５８】
１．６．発現ベクターの構築
上述のようにして得られた増幅産物「３Ｒ−ＩＧＣＤ」を、ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入し、それによって、プラスミドｐ３Ｒ−ＩＧＣＤを得た。
【００５９】
上述の１．３節で調製された「３Ｒ−ＩＧＣ」のＰＣＲ増幅において、以下のプライマーを使用した：
３Ｒ−ＩＧＣ ５’プライマー：５’−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣ−３’ 配列番号２３
３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー２：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴ−３’ 配列番号２４
【００６０】
増幅産物をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入し、それによって、プラスミドｐ３Ｒ−ＩＧＣを得た。
【００６１】
実施例１ｂ：アジア１ ＦＭＤＶベースの組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
縦列反復された、アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、実施例１ａの１．１節に記載されているのと同様の方法で合成した。簡潔にいうと、縦列反復された、アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＤＮＡ合成によって得た。２つの抗原性エピトープは、それぞれ、アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の、残基１３３〜１５８のアミノ酸配列（配列番号２５）及び残基２００〜２１３のアミノ酸配列（配列番号２６）を有する。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を、縦列反復された、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのそれぞれをコードするヌクレオチド配列の間に導入した。また、メチオニンコドンをＤＮＡ配列の５’末端に付加し、ペプチドリンカーをコードするさらなるヌクレオチド配列（配列番号２７）を３’末端に付加した。得られた産物を「３Ａｓ」断片と名付けた。
【００６２】
３Ａｓを、実施例１ａの１．３節に記載されているのと同様の方法で、実施例１ａの１．２節で得られたＩＧＣ（配列番号３）とライゲートした。ライゲーション産物は、「３Ａｓ−ＩＧＣ」断片と名付け、配列番号２９に示されるヌクレオチド配列を有し、「３Ａｓ−ＩＧＣ」によってコードされるアミノ酸配列を配列番号２８に示す。
【００６３】
次いで、「３Ａｓ−ＩＧＣ」断片を、実施例１ａの１．５節に記載されているのと同様なオーバーラッピングＰＣＲによって、上述の１．４節で得られた「Ｄ」断片（配列番号５）とライゲートし、それによって、アジア１ ＦＭＤＶベースの組換えタンパク質全体をコードする核酸分子「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」を得た。配列決定解析から、該核酸分子が配列番号３１に示されるＤＮＡ配列を有することが明らかになり、コードされるアミノ酸配列を配列番号３０に示す。
【００６４】
最後に、「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで、細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入して、プラスミドｐ３Ａｓ−ＩＧＣＤを得た。
【００６５】
実施例１ｃ：ウシＯ血清型ＦＭＤＶベースの組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
縦列反復された、ウシＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、実施例１ａの１．１節に記載されているのと同様の方法で合成した。簡潔にいうと、縦列反復された、ウシＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の３つの抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＤＮＡ合成によって得た。ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープは、それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４のアミノ酸配列を有する。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を、縦列反復された、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのそれぞれをコードするヌクレオチド配列の間に導入した。また、メチオニンコドンをＤＮＡ配列の５’末端に付加し、ペプチドリンカーをコードするさらなるヌクレオチド配列（配列番号２７）を３’末端に付加した。得られた産物を「３ＫＯ」断片と名付けた。
【００６６】
ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を、実施例１ａの１．２節に記載されているのと同様の方法で得た。以下のプライマーを使用した：
ｃＩＧＣ ５’プライマー：５’−ＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＧ−３’ 配列番号３５
ｃＩＧＣ ３’プライマー：５’−ＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’ 配列番号３６
【００６７】
配列決定解析から、「ｃＩＧＣ」断片と名付けられた、得られたｃＤＮＡが、配列番号３８に示される配列を有することが明らかになり、コードされるアミノ酸配列を配列番号３７に示す。
【００６８】
３ＫＯを、実施例１ａの１．３節に記載されているのと同様な方法で、ｃＩＧＣとライゲートした。ライゲーション産物は、「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」断片と名付け、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列を有し、「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」によってコードされるアミノ酸配列を配列番号３９に示す。
【００６９】
次いで、「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」断片を、実施例１ａの１．５節に記載されているのと同様なオーバーラッピングＰＣＲによって、上述の１．４節で得られた「Ｄ」断片（配列番号５）とライゲートし、それによって、ウシＯ血清型ＦＭＤＶベースの組換えタンパク質全体をコードする核酸分子「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」を得た。配列決定解析から、該核酸分子が配列番号４２に示されるＤＮＡ配列を有することが明らかになり、コードされるアミノ酸配列を配列番号４１に示す。
【００７０】
最後に、「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入し、プラスミドｐ３ＫＯ−ｃＩＧＣＤを得た。
【００７１】
実施例１ｄ：Ａ血清型ＦＭＤＶベースの組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
縦列反復された、Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、実施例１ａの１．１節に記載されているのと同様の方法で合成した。簡潔にいうと、縦列反復された、Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＤＮＡ合成によって得た。２つの抗原性エピトープはそれぞれ、Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の、残基１４１〜１６０のアミノ酸配列（配列番号４３）及び残基２００〜２１３のアミノ酸配列（配列番号４４）を有する。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を、縦列反復された、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのそれぞれをコードするヌクレオチド配列の間に導入した。また、メチオニンコドンをＤＮＡ配列の５’末端に付加し、ペプチドリンカーをコードするさらなるヌクレオチド配列（配列番号２７）を３’末端に付加した。縦列反復された抗原性エピトープをブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域の断片と連結させるために、このリンカーを使用した。得られた産物を「３Ａ」断片と名付けた。
【００７２】
３Ａを、実施例１ａの１．３節に記載されているのと同様の方法で、実施例１ａの１．２節で得られたＩＧＣ（配列番号３）とライゲートした。ライゲーション産物は、「３Ａ−ＩＧＣ」断片と名付け、配列番号４６に示されるヌクレオチド配列を有し、「３Ａ−ＩＧＣ」によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４５に示す。
【００７３】
次いで、「３Ａ−ＩＧＣ」断片を、実施例１ａの１．５節に記載されているのと同様のオーバーラッピングＰＣＲによって、上述の１．４節で得られた「Ｄ」断片（配列番号５）とライゲートし、それによって、Ａ血清型ＦＭＤＶベースの組換えタンパク質全体をコードする核酸分子「３Ａ−ＩＧＣＤ」を得た。配列決定解析から、該核酸分子が配列番号４８に示されるＤＮＡ配列を有することが明らかになり、コードされるアミノ酸配列を配列番号４７に示す。
【００７４】
最後に、「３Ａ−ＩＧＣＤ」をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで、細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入し、プラスミドｐ３Ａ−ＩＧＣＤを得た。
【００７５】
実施例２：ワクチンの調製
２．１．本発明のワクチン組成物Ａの調製
２．１．１． ３Ｒ−ＩＧＣＤによってコードされる組換えタンパク質の発現：コンピテント細胞（大腸菌、ＢＬ２１）を氷上で解凍し、３００μｌのコンピテント細胞を各氷冷チューブに加えた。実施例１で調製したプラスミドｐ３Ｒ−ＩＧＣＤを各チューブに加え、混合し、氷上で４０分間静置し、次いで４２℃の水浴中で４５秒間の熱ショックに供した。１ｍｌのＬ培地（抗生物質なし）を各チューブに加えた。チューブをシェイカー上、３７℃で４５分間インキュベートして、プラスミドからのタンパク質の発現を可能にした。形質転換された細菌をアンピシリンとともに培養プレート上で平板培養し、３７℃で一晩放置した。アンピシリン耐性を有する細菌クローンを選択し、プラスミド抽出後にＤＮＡ配列決定に供した。次いで、正しい配列を有するプラスミドを含む株を選択した。該株をＬＢ培地中に接種し、３７℃でＯＤ＝０．５まで増殖させ、次いで０．４ｍＭ ＩＰＴＧを培地に添加して、組換えタンパク質の発現を誘導した。４時間後に、細菌細胞を収集した。細菌細胞の懸濁液を超音波破砕し、次いで残りの細菌残屑を除去するように、４℃で１０分間、１０，０００ｘｇで遠心分離した。イムノブロッティング解析のために、上清を直接使用した。不溶性タンパク質（封入体）を、３０，０００ｘｇでの遠心分離によって収集し、ＬＢ培地で１回洗浄し、次いで、振とうしながら、沈殿１ｇあたり２５ｍｌの量でバッファー１（ＳＢ１：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、８Ｍ尿素、１．５Ｍ ＮａＣｌ）と混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートした。ガラス質の不溶性細胞壁を、６５，０００ｘｇで３０分間の遠心分離によって除去した。上清を、０．２μｍろ過膜を通してろ過し、それによって、組換えタンパク質を含むタンパク質試料を得た。発現された組換えタンパク質を、Ｈｉｓトラップ（Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ）カラムで精製した（Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．、Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．、Ｏｌｓｓｏｎ，Ｉ．、Ｂｅｌｆｒａｇｅ，Ｇ．、Ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ １９７５；２５８：５９８〜９９ページ）。５〜１０ｍｇ／ｍｌの上述のタンパク質試料を、１×５ｃｍ予備平衡化Ｈｉｓトラップカラム上に置いた。ｐ３Ｒ−ＩＧＣＤプラスミドから発現された組換えタンパク質は、Ｈｉｓ尾部を有する。結合タンパク質を５０ｍｌのＳＢ１で洗浄し、次いで、溶出バッファー２（ＥＢ２：ＳＢ１＋０．５Ｍ ＮａＣｌ＋４８０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を使用して、カラムから溶出させた。溶出したタンパク質を、ＳＢ１で１０倍希釈し、次いで、同じ条件下で、２回目のクロマトグラフィーに供した。溶出したタンパク質を組み合わせ、製造業者の使用説明書に従ってＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質分析キットを使用して、その濃度を測定した。タンパク質の濃度を０．３〜０．４ｍｇ／ｍｌに調節した。透析物を頻繁に交換しながら、５Ｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１．０Ｍ ＮａＣｌで７２時間透析を行った。タンパク質はまた、８Ｍ尿素の代わりに６Ｍ尿素を使用してタンパク質を溶解させたことを除いて同様の方法を用いて、精製した。精製されたタンパク質を４℃で保存した。
【００７６】
２．１．２．３Ｒ−ＩＧＣＤによってコードされる組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング解析：組換えタンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法によって明らかにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、得られた組換えタンパク質の分子量が、期待されるものと一致することが示された（図２）。標的タンパク質の発現を、イムノブロッティング（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬイムノブロッティングキット）によって測定した（Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｈａｍｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．編）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８１）。イムノブロッティング解析において、Ｏ血清型ＦＭＤＶに感染したブタから得られた抗ＦＭＤＶ抗血清を使用し（図３）、結果から、組換えタンパク質は免疫原性があり、上述の血清に反応性があることが確認される。
【００７７】
２．１．３．ワクチン組成物Ａを得る：乳化剤２０６（ＳＥＰＰＩＣ Ｉｎｃ、仏国）を組換えタンパク質に添加及び混合し、本発明のワクチン組成物Ａ（３Ｒ−ＩＧＣＤによってコードされる組換えタンパク質（配列番号８）を有効成分として含む）を得た。
【００７８】
２．２．本発明のワクチン組成物Ｂの調製
２．１節と同様の手順に従って、プラスミドｐ３Ｒ−ＩＧＣを使用して、３Ｒ−ＩＧＣによってコードされる組換えタンパク質（配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する）を発現及び精製した。この組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの、クマシーブルー染色及びイムノブロッティングアッセイ（ブタ由来の抗ＦＭＤＶ血清でプロービングした）の結果を、図４に示した。
【００７９】
実施例１の１．４節で得られたＦＭＤＶの３Ｄタンパク質をコードする核酸を、発現ベクターｐＥＴ１００−Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、それによって、プラスミドｐＥＴ１００−Ｐ３Ｄを得た。ベクターｐＥＴ１００−Ｄ−ＴＯＰＯは、製造業者によって直線化されており、細菌中の組換えタンパク質の発現のための標的断片に連結させることができる。２．１節と同様の手順に従って、プラスミドｐＥＴ１００−Ｐ３Ｄを使用して、大腸菌株ＢＬ２１コドンプラスを形質転換した。３Ｄタンパク質を発現させるように、培養された細菌を０．４ｍＭ ＩＰＴＧで４時間誘導した。発現及び精製された３Ｄタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色、並びに抗Ｈｉｓ抗体を用いたイムノブロッティングに供した。結果を図５に示す。
【００８０】
３Ｒ−ＩＧＣによってコードされる組換えタンパク質及び３Ｄタンパク質を等しいモル比で混合し、これに乳化剤２０６（ＳＥＰＰＩＣ Ｉｎｃ、仏国）を添加し、それによって、本発明のワクチン組成物Ｂ（３Ｒ−ＩＧＣによってコードされる組換えタンパク質（配列番号１３）及び３Ｄタンパク質（配列番号６）を有効成分として含む）を得た。
【００８１】
２．３．本発明の他のワクチン組成物の調製
２．１節及び２．２節と同様の手順をそれぞれ用いて、実施例１ｂ、１ｃ及び１ｄで生じた組換えタンパク質を含んで、ワクチンを調製した。上記のワクチンはそれぞれ、組換えタンパク質全体「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」、「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」、若しくは「３Ａ−ＩＧＣＤ」を有効成分として含むか、又は組換えタンパク質「３Ａｓ−ＩＧＣ」、「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」、若しくは「３Ａ−ＩＧＣ」とともに別の３Ｄ成分を有効成分として含む。
【００８２】
実施例３：抗ＦＭＤＶワクチンの効能
３．１．細胞培養
ハムスター腎臓細胞株（ＢＨＫ２１）（ＡＴＣＣから購入、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ ｍｌ−１）、ストレプトマイシン（１００μｇ ｍｌ−１）及びアール塩を補充した必須培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｐ．Ｖ．、Ｌ．Ｐｕｌｌｅｎ、Ｒ．Ｆ．Ｓｔａｐｌｅ、Ｌ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ｒ．Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｄ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ、及びＴ．Ｒ．Ｄｏｅｌ．１９９６。Ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａ２４ Ｃｒｕｚｅｉｒｏ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｓｕｂｔｙｐｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０１１〜１０１８ページ）。
【００８３】
３．２．ＦＭＤＶ増殖及びウイルスタンパク質の調製
ＦＭＤＶは、流行の際にＦＭＤＶに感染したブタの水疱の上皮組織由来であった。ＢＨＫ２１単層細胞が８０％コンフルエンスに増殖したときに、１ｍｌのＦＭＤＶ液を細胞層の表面に添加して、ＦＭＤＶを増殖させた。ＢＨＫ２１細胞を、３７℃で４５分間培養し、細胞が７５％の細胞変性効果を示すまで収集し、次いで、アール塩を補充し、ＦＢＳを含まない、２０ｍｌの必須培地（ＥＭＥＭ）を添加した。培養の後に、０．０１Ｍバイナリーエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ）を添加し、培養物を３７℃で１時間平板培養して、ＦＭＤＶを不活化させ、次いで、７％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）（Ｓｉｇｍａ）を添加し、４℃で一晩平板培養して、不活化したＦＭＤＶを沈殿させた。ウイルスの総タンパク質を、４０，０００ｒｐｍで２時間の超遠心分離によって得た。精製されたウイルスタンパク質の濃度を、２５９ｎｍでの光学密度を測定することによって、測定した（１ＯＤ＝１３２μｇ）（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｐ．Ｖ．、Ｌ．Ｐｕｌｌｅｎ、Ｒ．Ｆ．Ｓｔａｐｌｅ、Ｌ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ｒ．Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｄ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ、及びＴ．Ｒ．Ｄｏｅｌ．１９９６。Ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａ２４ Ｃｒｕｚｅｉｒｏ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｓｕｂｔｙｐｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０１１〜１０１８ページ）。該ウイルスタンパク質を、Ｔ細胞増殖アッセイのために使用した。
【００８４】
３．３．ＦＭＤＶの５０％感染量（ＩＤ５０）の測定
ＦＭＤＶの５０％感染量（ＩＤ５０）の濃度を測定するために、ＦＭＤＶ血清反応について陰性な２５匹のブタを、５０％感染量（ＩＤ５０）の分析のために使用した。該動物を、１群あたり５匹の動物の、５つの群に分けた。口蹄疫ウイルス液を１：１０に段階希釈し（例えば、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７及び１０−８）、それぞれブタの頸部の筋肉に注射した。ウイルス負荷の２〜１０日後に、毎日体温を記録しながら、鼻、頬、舌及び足の水疱形成の観察を行った。ＦＭＤ症状があり、４０℃を超える体温を有するブタを、ＦＭＤ陽性であるとして同定した。５０％のブタがＦＭＤＶ感染による陽性の症状を示す希釈濃度を、ＦＭＤＶ液のＩＤ５０、すなわち１ ＩＤ５０として定義した（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｔ．、Ｒ．Ｄｉｍａｒｃｈｉ、及びＴ．Ｒ．Ｄｏｅｌ。１９９１。Ａ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ＶＰ１ ｏｆ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ ｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ Ｃａｔｔｌｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４Ｇ：７４９〜７５５ページ。Ｔａｂｏｇａ，Ｏ．、Ｃ．Ｔａｍｉ、Ｅ．Ｃａｒｒｉｌｌｏ、Ｊ．Ｉ．Ｎｕｎｅｚ、Ａ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｊ．Ｃ．Ｓａｉｚ、Ｅ．Ｂｌａｎｃｏ、Ｍ．Ｌ．Ｖａｌｅｒｏ、Ｘ．Ｒｏｉｇ、Ｊ．Ａ．Ｃａｍａｒｅｒｏ、Ｄ．Ａｎｄｒｅｕ、Ｍ．Ｇ．Ｍａｔｅｕ、Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ、Ｅ．Ｄｏｍｉｎｇｏ、Ｆ．Ｓｏｂｒｉｎｏ、及びＥ．Ｌ．Ｐａｌｍａ．１９９７。Ａ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｌａｃｋ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｔｔｌｅ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃａｐｅ Ｍｕｔａｎｔｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２６０４〜２６１４ページ）。
【００８５】
３．４．ワクチン接種されたブタの血清採取及びウイルス負荷試験
ＦＭＤＶウイルス負荷試験は、組換えワクチンの効能を測定する方法である。ＦＭＤＶ血清反応について陰性な、全体で２５匹のブタ（生後２．５カ月、約２５ｋｇ）を、ウイルス負荷分析のために使用した。
【００８６】
ブタを、５つの群に分けた：（ａ）５匹を、陰性対照群として使用した（１ｍｌのＰＢＳを注射した）；（ｂ）５匹を、陽性対照群として使用した（２ｍｌの市販のＦＭＤワクチン（不活化全ウイルス）、Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｕｃｕｌｔｕｒａｌ ＶＥＴ．ＢＩＯ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．ＬＴＤ．、Ｌａｎｚｈｏｕ、中国を、製造業者によって推奨される投薬量に従って、注射した）；残りの群、ｃ、ｄ、ｅに、ワクチン組成物Ａ、すなわち、実施例２の２．１節で調製した組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる）を、以下のように注射した：（ｃ）５匹に、０．２ｍｇの組換えタンパク質を注射した；（ｄ）５匹に、０．５ｍｇの組換えタンパク質を注射した；（ｅ）５匹に、１ｍｇの組換えタンパク質を注射した。実施例２の２．２節で調製したワクチン組成物Ｂを試験するとき、グループ分けはワクチン組成物Ａを試験するために上述したのと同じであり、注射されたタンパク質の総量はワクチン組成物Ａと同じであり、ここで、３Ｄタンパク質に対する組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣ」によってコードされる）のモル比は１：１であった。
【００８７】
始めに、ブタを、最初に頸部の筋肉でワクチン接種し、次いで摂取後２１日目に同じ投薬量で再度ワクチン接種した。各群の動物から、０及び５１日目に血清試料を採取し、試験した。１週間後に、動物にＦＭＤＶを１０００×ＩＤ５０で付加し、ＦＭＤを同定するための診断基準は、上述のＩＤ５０測定におけるものと同じであった（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．、Ｊ．Ｃ．Ｓａｌｚ、Ｉ．Ｓ．Ｎｏｖｅｌｌａ、Ｄ．Ａｎｄｒｅｕ、及びＦ．Ｓｏｂｒｉｎｏ．１９９４。Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ＶＰ１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０５：２４〜３３ページ）。
【００８８】
３．５．血清抗体中和試験（ＳＮＴ）
組換えタンパク質、市販の抗ＦＭＤワクチン、及びバッファーをそれぞれ注射されたブタの５つの群について、ＦＭＤＶに対するそれらの特異的抗体応答を測定するために、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙによってＦＭＤについて規定されている手順に従って、血清中和試験（ＳＮＴ）を行った（第２．１．１章Ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｕｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ．「ＯＩＥ ｍａｎｕａｌ」中。Ｏｆｆｉｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓ Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ、Ｐａｒｉｓ、１９９６；４７〜５６ページ）。抗体の濃度を、ｌｏｇ１０ＳＮ５０の形で表す（Ｓａｌｔ，Ｊ．Ｓ．、Ｐ．Ｖ．Ｂａｒｎｅｔｔ、Ｐ．Ｄａｎｉ、及びＬ．Ｗｉｌｌｉａｍ。１９９８。Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｔａｃｔ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ１６：７４６〜７５４ページ）。結果を表１及び２に示す。
【００８９】
【表１】
【００９０】
【表２】
【００９１】
血清中和試験の結果から、ワクチン組成物Ａ又はワクチン組成物Ｂ（２００μｇ、５００μｇ及び１ｍｇ）でのワクチン接種の後に、以前はＦＭＤＶ血清反応において陰性であった全てのブタにおいて、ＦＭＤＶに対する抗体中和反応が誘発され得ることが示される（表１及び２）。陰性対照群中のブタは、組換えタンパク質又は市販の抗ＦＭＤワクチンをワクチン接種されておらず、したがって、抗体反応は検出されなかった。本発明者らのワクチンをワクチン接種された３つの群と市販の抗ＦＭＤワクチンをワクチン接種された群の抗体レベルの間に、統計的に有意な差はなかった。
【００９２】
３．６．哺乳マウス防御試験
哺乳マウス防御試験（ＭＰＴ）は、本発明のワクチンをワクチン接種されたブタがＦＭＤＶに対する抗体を産生することができるかどうかを判定する、第２の方法である。改変を加えて、Ｍｕｌｃａｈｙらに記載されているようにマウス防御試験を行った（Ｍｕｌｃａｈｙ，Ｇ．、Ｌ．Ａ．Ｐｕｌｌｅｎ、Ｃ．Ｇａｌｅ、Ｒ．Ｄ．ＤｉＭａｒｃｈｉ、及びＴ．Ｒ．Ｄｏｅｌ。１９９１。Ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ９：１９〜２４ページ）。５０％致死量（ＬＤ５０）のＦＭＤＶ物質：段階希釈によって希釈された５つのウイルス試料（１０−３、１０−４、１０−５、１０−６及び１０−７等）を、５つの群の哺乳マウス（各群中４匹のマウス）に注射し、次いで、マウスにおいて５０％の死亡を引き起こす希釈濃度をＬＤ５０として測定した。実験用のブタ（本発明のワクチン（ワクチン組成物Ａ又はワクチン組成物Ｂ）、市販の抗ＦＭＤワクチン、及びバッファーをそれぞれワクチン接種された）の抗血清を、ワクチン接種後の５１日目に採取した。全ての抗血清を、５６℃で３０分間不活化した。各群中、４匹の、生後３〜４日の哺乳マウスに、１００μｌの無希釈ブタ抗血清を、それぞれ腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。２０〜２３時間以内に、全てのマウスに、５０％致死量（ＬＤ５０）の１０、１００、又は１０００倍の用量でＦＭＤＶをそれぞれ負荷し、次いで４日間観察した。生存し続けているマウスの数を記録した。結果を表３に示す。
【００９３】
【表３】
【００９４】
表３において、２００μｇ、５００μｇ又は１ｍｇのワクチン組成物Ａ又はワクチン組成物Ｂのいずれかでワクチン接種されたブタ由来の抗血清は全て、５０％致死量（ＬＤ５０）の１０００倍の用量でのＦＭＤＶの負荷に対して、哺乳マウスを完全に防御したことが、明らかに示される。組換えタンパク質をワクチン接種されなかったブタ（陰性対照群）の抗血清は、ＦＭＤＶの感染に対して哺乳マウスを全く防御することができなかったが、市販の抗ＦＭＤワクチンをワクチン接種されたブタの抗血清は、５０％致死量（ＬＤ５０）の１０００倍までの用量でのＦＭＤＶの負荷に対して、哺乳マウスを防御することができる。
【００９５】
３．７．Ｔ細胞増殖分析
Ｔ細胞増殖分析を行って、組換えタンパク質の注射によって引き起こされるＴ細胞増殖を特徴付けた。ワクチン組成物Ａ又はワクチン組成物Ｂ、市販の抗ＦＭＤワクチン、及びバッファーをワクチン接種されたブタの群から、Ｔ細胞を収集した。１．０７７ｇ ｍｌ−１のパーコール溶液によって、血液細胞を精製した。各群について４×１０６個のＴ細胞／ｍｌを９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養し、ＦＭＤＶウイルスタンパク質を１０μｇ ｍｌ−１又は５０μｇ ｍｌ−１の濃度まで添加した。プレートを３７℃で４日間培養し、次いで２５μｌあたり１マイクロキュリー（μＣｉ）の［トリチウム］チミジン（［３Ｈ］チミジン）を添加し、１８時間培養した後に細胞を収集し、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ６５００）を用いて測定した（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、第７．１０章、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｏｇａｎ編（ＮＩＨ）、２００５、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｌｉｅｒｏｐ，Ｍ．Ｊ．Ｃ．Ｖ．、Ｋ．Ｖ．Ｍａａｎｅｎ、Ｒ．Ｈ．Ｍｅｌｏｅｎ、Ｖ．Ｐ．Ｍ．Ｇ．Ｒｕｔｔｅｎ、Ｍ．Ａ．Ｃ．Ｄｅｊｏｎｇ、及びＥ．Ｊ．Ｈｅｎｓｅｎ。１９９２。Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ＦＭＰＶ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｆｔｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：４０６〜４１３ページ）。
【００９６】
【表４】
【００９７】
【表５】
【００９８】
表４及び５は、ワクチン組成物Ａ若しくはワクチン組成物Ｂ（２００μｇ、５００μｇ及び１ｍｇのタンパク質）、市販の抗ＦＭＤワクチン又はバッファーをそれぞれワクチン接種されたブタから収集されたＴ細胞のインビトロ増殖応答を説明する。１０μｇ ｍｌ−１又は５０μｇ ｍｌ−１のＦＭＤＶタンパク質のインビトロ刺激の後に、増殖応答を測定した。５０μｇ ｍｌ−１のウイルスタンパク質によって刺激した場合、組換えタンパク質及び市販の抗ＦＭＤワクチンをワクチン接種されたブタ由来のＴ細胞は、最もよい応答を示したが、バッファーによって刺激した群は、増殖応答を示さなかった。
【００９９】
ブタへのＦＭＤＶの負荷の結果を、表６及び７に示す。
【０１００】
【表６】
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
ＦＭＤＶによって負荷されたブタの５つの群の中でも、バッファー対照群（ｎ＝５）において、疾患の迅速な発症が見られた。規定された期限内（７〜１０日間）での典型的なＦＭＤ症状の発生に基づいて、それらの全てはＦＭＤ陽性であると診断された。市販の抗ＦＭＤワクチンの陽性対照群中の動物（ｎ＝５）は、いかなるＦＭＤ症状も示さなかった。０．２ｍｇのワクチン組成物Ａをワクチン接種されたブタ（ｎ＝５）については、それらのうち４匹はＦＭＤＶ負荷に対して防御された；０．５ｍｇ又は１ｍｇのワクチン組成物Ａをワクチン接種された全てのブタ（ｎ＝５）は、ＦＭＤＶ負荷に対して完全に防御された。０．２ｍｇ、０．５ｍｇ又は１ｍｇのワクチン組成物Ｂをワクチン接種されたブタ（ｎ＝５）もまた、ＦＭＤＶ負荷に対して完全に防御され、いかなるＦＭＤ症状も示さなかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号１：実施例中で使用されるＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の縦列反復された抗原性エピトープをコードするＤＮＡ配列；
配列番号２：実施例中で使用されるＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の縦列反復された抗原性エピトープのアミノ酸配列；
配列番号３：実施例中で使用されるブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列；
配列番号４：実施例中で使用されるブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域のアミノ酸配列；
配列番号５：実施例中で使用されるＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードするＤＮＡ配列；
配列番号６：実施例中で使用されるＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号７：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」）；
配列番号８：「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号９：Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基１４１〜１６０のアミノ酸配列；
配列番号１０：Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基２００〜２１３のアミノ酸配列；
配列番号１１：本発明において使用され得るペプチドリンカーＧＧＳＳＧＧ；
配列番号１２：本発明において使用され得るペプチドリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；
配列番号１３：「３Ｒ−ＩＧＣ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号１４：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ｒ−ＩＧＣ」）；
配列番号１５：ブタｓｃＩｇＧをコードするｃＤＮＡ断片を増幅するためのｓｃＩｇＧ ５’プライマー；
配列番号１６：ブタｓｃＩｇＧをコードするｃＤＮＡ断片を増幅するためのｓｃＩｇＧ ３’プライマー；
配列番号１７：ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードする核酸をクローニングするための３Ｄ ５’プライマー；
配列番号１８：ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードする核酸をクローニングするための３Ｄ ３’プライマー；
配列番号１９：３Ｒ−ＩＧＣＤ断片を合成するために使用される３Ｒ−ＩＧＣＤ ５’プライマー；
配列番号２０：３Ｒ−ＩＧＣＤ断片を合成するために使用される３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー１；
配列番号２１：３Ｒ−ＩＧＣＤ断片を合成するために使用されるＤ ５’プライマー；
配列番号２２：３Ｒ−ＩＧＣＤ断片を合成するために使用される３Ｒ−ＩＧＣＤ ３’プライマー；
配列番号２３：配列番号１４を増幅するために使用される３Ｒ−ＩＧＣ ５’プライマー；
配列番号２４：配列番号１４を増幅するために使用される３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー２；
配列番号２５：アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基１３３〜１５８のアミノ酸配列；
配列番号２６：アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基２００〜２１３のアミノ酸配列；
配列番号２７：本発明において使用され得るペプチドリンカーＧＧＧＧＳ；
配列番号２８：「３Ａｓ−ＩＧＣ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号２９：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ａｓ−ＩＧＣ」）；
配列番号３０：「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号３１：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」）；
配列番号３２：ウシＯ血清型ＦＭＤＶのＶＰ１エピトープのアミノ酸配列；
配列番号３３：ウシＯ血清型ＦＭＤＶのＶＰ１エピトープのアミノ酸配列；
配列番号３４：ウシＯ血清型ＦＭＤＶのＶＰ１エピトープのアミノ酸配列；
配列番号３５：ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を増幅するためのｃＩＧＣ ５’プライマー；
配列番号３６：ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を増幅するためのｃＩＧＣ ３’プライマー；
配列番号３７：ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域のアミノ酸配列；
配列番号３８：ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列（「ｃＩＧＣ」断片）；
配列番号３９：「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号４０：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」）；
配列番号４１：「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号４２：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」）；
配列番号４３：Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基１４１〜１６０のアミノ酸配列；
配列番号４４：Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基２００〜２１３のアミノ酸配列；
配列番号４５：「３Ａ−ＩＧＣ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号４６：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ａ−ＩＧＣ」）；
配列番号４７：「３Ａ−ＩＧＣＤ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；及び
配列番号４８：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ａ−ＩＧＣＤ」）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学及び遺伝子工学の分野に関連する。特に、本発明は、口蹄疫ウイルスに対する組換えワクチン組成物並びにその調製及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫（ＦＭＤ）は、動物におけるＡ類感染症の中で最も深刻な疾患であり、ブタ、ウシ、ヒツジ等の偶蹄類動物に深刻に影響を与える劇症の感染症である。近年、多くの国々の畜産業が、ＦＭＤの発生及び流行によって引き起こされる、大きな経済的損失を被っている。今までのところ、７つの血清型の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（ヨーロッパＡ、Ｏ及びＣ、アフリカＳＡＴ１、ＳＡＴ２及びＳＡＴ３、並びにアジア１血清型）及び多くのサブタイプ（例えば、Ｋｌｅｉｄら、１９８１、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４：１１２５〜１１２９ページ参照）が公知であり、Ｏ血清型ＦＭＤＶが、最も広範囲に広がった血清型である。
【０００３】
ＦＭＤＶは、ピコナウイルス科のアフトウイルス属に属する。ＦＭＤＶは、６０コピーの３つのカプシドウイルスタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）に囲まれたプラスセンスの一本鎖ＲＮＡゲノム（約８．５ｋｂ）からなる。研究から、ＦＭＤＶ血清型Ｏにおいて、これらの３つのウイルスタンパク質のＶＰ１が、ウイルスの感染性に最も関連があることが示されている。ＶＰ１タンパク質中の２つの免疫原性領域、すなわちアミノ酸残基１４１〜１６０及び残基２００〜２１３の部分がある。それらの領域はそれぞれ、２つの突出し、スクランブルした、可動性の高いループ構造中にある。残基１４５〜１５７の領域のループ構造は、細胞表面受容体への付着に関与する保存構造Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ領域）を含む（Ｂｅｌｓｈａｍ ＧＪ及びＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ Ｅ、Ｇｅｎｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ、１９〜５２ページ、２００４、Ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ、Ｓｏｂｒｉｎｏ Ｆ及びＤｏｍｉｎｇｏ Ｅ編）。タンパク質３Ｄは、ＦＭＤＶ中のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、ブタＴ細胞によって認識される抗原性エピトープを有する（Ｂｅｌｓｈａｍ ＧＪ及びＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ Ｅ、Ｇｅｎｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ、１９〜５２ページ、２００４、Ｆｏｏｔ ａｎｄ Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ、Ｓｏｂｒｉｎｏ Ｆ及びＤｏｍｉｎｇｏ Ｅ編）。
【０００４】
予防的免疫化によって、ＦＭＤＶの感染を制御することができる。既存の抗ＦＭＤＶワクチンにおいては、死滅ウイルスが使用される。実際には、かかるワクチンは、ウイルスＲＮＡのインビボ組換えのために、疾患の伝染を引き起こすことがある（Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＭＤＶ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｗｈｅｎ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ １９９１；７５：３７〜４１ページ）。その一方で、化学的不活化剤を使用して、かかるワクチン中のウイルスが不活化され、送達の間に低温コールドチェーン輸送及び冷凍庫保存が必要とされる。いくつかの発展途上国の農村部においては、冷凍庫が入手可能できず、結果的に、ワクチンが注射の時点で実質的に効能を失っていることがある。さらに、製造プロセスの間の生きたＦＭＤＶウイルスの漏出の可能性によって、かかるワクチンの製造が環境にとって危険因子になることがある。
【０００５】
本発明のエピトープ特異的ワクチンは、ワクチン接種された動物において、ＦＭＤＶに対する抗体応答を誘発することができる。本発明のワクチンは、使用及び製造において非常に安全なだけでなく、操作、保存及び輸送において非常に便利である。その一方で、本発明のワクチンを設計して、特定の用件を満たすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＦＭＤＶに対する安全で有効な組換えワクチン並びにその調製及び使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、
ＦＭＤＶカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、
免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片、及び、
ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片
を含む組換えタンパク質を含む、動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端に、
ＦＭＤＶカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、及び
免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片
を含む組換えタンパク質と、
（ｉｉ）ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片と
を含む、動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。
【０００９】
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態において、組換えタンパク質が抗原性エピトープの２〜５回のタンデムリピートを含み、より好ましくは、組換えタンパク質が抗原性エピトープの３回タンデムリピートを含む。
【００１０】
本発明のワクチン組成物の一実施形態において、繰り返された抗原性エピトープは、ペプチドリンカーを介して互いに連結されている、及び／又は抗原性エピトープのタンデムリピートが、ペプチドリンカーを介して免疫グロブリン重鎖の定常領域に連結されている。
【００１１】
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態において、抗原性エピトープは、ＦＭＤＶカプシドタンパク質に由来する。抗原性エピトープは、例えば、ヨーロッパＡ、Ｏ及びＣ血清型；アフリカＳＡＴ１、ＳＡＴ２及びＳＡＴ３血清型；並びにアジア１血清型に由来し得る。より好ましくは、抗原性エピトープは、ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質に由来する。本発明の上述のワクチン組成物の一実施形態において、タンデムリピートはＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の２つの抗原性エピトープのタンデムリピートであり、該２つの２つの抗原性エピトープのタンデムリピートは、それぞれ配列番号９若しくは配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、又はそれぞれ配列番号９若しくは配列番号１０のアミノ酸配列からなる。本発明の上述のワクチン組成物のさらなる実施形態において、タンデムリピートはアジア１血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の２つの抗原性エピトープのタンデムリピートであり、該２つの抗原性エピトープのタンデムリピートは、それぞれ配列番号２５若しくは配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、又はそれぞれ配列番号２５若しくは配列番号２６のアミノ酸配列からなる。本発明の上述のワクチン組成物のさらなる実施形態において、タンデムリピートはＡ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の２つの抗原性エピトープのタンデムリピートであり、該２つの抗原性エピトープのタンデムリピートは、それぞれ配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、又はそれぞれ配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列からなる。本発明の上述のワクチン組成物のさらなる実施形態において、タンデムリピートはウシＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の３つの抗原性エピトープのタンデムリピートであり、該３つの抗原性エピトープのタンデムリピートは、それぞれ配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、又はそれぞれ配列番号３２、配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列からなる。
【００１２】
本発明のワクチン組成物を、ブタ、ウシ、又はヒツジ等の偶蹄類動物に投与して、ＦＭＤＶ感染に対する免疫応答を誘導することができる。好ましくは、本発明のワクチン組成物において、組換えタンパク質中に含まれる免疫グロブリン重鎖の定常領域は、ワクチン接種される動物と同じ種に由来する。本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容され得る担体及び／又はアジュバントをさらに含み得る。
【００１３】
本発明は、上述のような組換えタンパク質もまた、包含する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、本発明のワクチン組成物中に含まれる組換えタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明は、
組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと、
該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築するステップと、
該発現ベクターを宿主細胞中に導入するステップと、
組換えタンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、発現された組換えタンパク質を回収及び精製するステップとを含む、本発明の抗ＦＭＤＶワクチンにおける使用のための組換えタンパク質を調製する方法を、さらに提供する。
【００１６】
また、本発明は、有効量の本発明のワクチン組成物を、該ワクチン組成物を必要とする動物に投与するステップを含む、動物においてＦＭＤＶ感染を予防する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の抗Ｏ血清型ＦＭＤＶワクチンの構成を示す図である。Ａ：実施例中で調製されたワクチン組成物Ａであり、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、動物免疫グロブリン重鎖の定常領域、及びＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質が、組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる）を形成するように連結されている。Ｂ：実施例中で調製されたワクチン組成物Ｂであり、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート及び動物免疫グロブリン重鎖の定常領域が、組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣ」によってコードされる）を形成するように連結されており、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質は別の成分である。
【図２】本発明のワクチン組成物Ａ中の組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる）のクマシーブルー染色を示す図である。Ｍ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：総タンパク質；レーン２：可溶性タンパク質；レーン３：封入体（６Ｍ尿素中に溶解）；レーン４：封入体（８Ｍ尿素中に溶解）。
【図３】抗Ｏ血清型ＦＭＤＶ血清を使用した、本発明のワクチン組成物Ａ中の組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる）のイムノブロッティング検出を示す図である。Ｍ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：総タンパク質；レーン２：可溶性タンパク質；；レーン３：封入体（６Ｍ尿素中に溶解）；レーン４：封入体（８Ｍ尿素中に溶解）。
【図４】本発明のワクチン組成物Ｂ中の組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣ」によってコードされる）のクマシーブルー染色及びイムノブロッティング検出を示す図である。Ａ：３Ｒ−ＩＧＣ断片によってコードされる組換えタンパク質を発現している細菌由来の総タンパク質溶解物のクマシーブルー染色（ＩＰＴＧ誘導の前及び後）；Ｂ：ブタ由来の抗Ｏ血清型ＦＭＤＶ血清を使用したＩＰＴＧ誘導の後に得られた総タンパク質溶解物中の組換えタンパク質（３Ｒ−ＩＧＣ断片によってコードされる）のイムノブロッティング検出。
【図５】本発明のワクチン組成物Ｂ中の３Ｄタンパク質成分のクマシーブルー染色及びイムノブロッティング検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ＦＭＤＶカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートと、免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片と、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片とを含む組換えタンパク質を含む、動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）Ｎ末端からＣ末端に、（ａ）ＦＭＤＶカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート及び（ｂ）免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片、を含む組換えタンパク質と、（ｉｉ）ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片とを含む、動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物を提供する。
【００２０】
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態において、抗原性エピトープは、ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の抗原性エピトープ等、ＦＭＤＶカプシドタンパク質に由来する。
【００２１】
本発明の抗ＦＭＤＶワクチン組成物において、組換えタンパク質の構築において有用なＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープは、ＶＰ１タンパク質の公知の主な抗原性エピトープ、例えば、ブタＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１４１〜１６０（配列番号９）又はアミノ酸残基２００〜２１３（配列番号１０）によって表されるエピトープであり得る。ＦＭＤＶに感染した動物において、これらのエピトープがＢリンパ球応答を誘発することができることが、実証されている。
【００２２】
本発明のワクチン中の組換えタンパク質の免疫原性を促進するために、ＦＭＤＶの抗原性エピトープ（例えば、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープ）を、本発明のワクチンにおける使用のために構築される組換えタンパク質中で縦列反復させる。また、タンデムリピートは、縦列反復された、ＦＭＤＶの１つ又は複数の抗原性エピトープ（例えば、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープ）によって形成させることができる。この点で、語句「抗原性エピトープのタンデムリピート」は、本明細書中で使用される場合、組換えタンパク質のアミノ酸配列において、抗原性エピトープのそれぞれ（同一であるか、又は異なるかのいずれかであり得る）が別のものに直接、又はリンカーを介して間接的に、規則正しく連結され、これらの縦列に連結された抗原性エピトープのそれぞれ（同一であるか、又は異なるかのいずれかであり得る）が２回以上、例えば３回、繰り返されることを意味するよう意図される。語句「抗原性エピトープのタンデムリピート」は、本明細書中で使用される場合、組換えタンパク質のアミノ酸配列中で互いに縦列に配置されて直接連結されるか、又はリンカーを介して間接的に連結された、ＦＭＤＶの複数の異なる抗原性エピトープ（例えば、３つのエピトープ）もまた包含し、ここで、エピトープのそれぞれは、１回又は複数回（例えば、２回又は３回）出現し得る。
【００２３】
本発明のワクチン組成物の好ましい実施形態において、組換えタンパク質中の抗原性エピトープは、タンデムリピート中で２〜５回繰り返される。５回を超える繰り返しもまた可能であるが、５回未満の繰り返しによって、組換え発現によって本発明の組換えタンパク質を発現するのがより簡便になる。より好ましくは、組換えタンパク質中の抗原性エピトープは、タンデムリピート中で３回繰り返される。
【００２４】
本発明のワクチン組成物の特定の実施形態において、組換えタンパク質中のタンデムリピートは、ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質由来の２つの抗原性エピトープのタンデムリピートである。ある特定の実施形態において、タンデムリピートは、縦列に配置されて３回繰り返された２つの抗原性エピトープによって形成され、ここで該２つの抗原性エピトープは、それぞれ、ブタＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の、残基１４１〜１６０のアミノ酸配列（配列番号９）及び残基２００〜２１３のアミノ酸配列（配列番号１０）によって表される。実験パートに示すように、この組換えタンパク質は、動物においてＯ血清型ＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を効果的に誘導することによって、動物を防御することができる。
【００２５】
図１は、抗Ｏ血清型ＦＭＤＶワクチン組成物に関する本発明のワクチンの構成を示す。該ワクチンにおいて、組換えタンパク質のＮ末端はＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートの領域であり、家畜由来の免疫グロブリン重鎖の定常領域が後に続き、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質が免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣ末端に直接連結している（図１Ａ）か、又は別のタンパク質成分となっている（図１Ｂ）。
【００２６】
本発明のワクチンの好ましい実施形態において、組換えタンパク質中の抗原性エピトープ及び／又はタンデムリピートは、ペプチドリンカーを介して互いに連結される。抗原性エピトープ及び／又はタンデムリピートの間のペプチドリンカーは、抗原性エピトープの線状構造に影響を与えるべきではない。本発明において使用することができるペプチドリンカーの例は、例えば、ＧＧＳＳＧＧ（配列番号１１）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、及びＧＧＧＧＳ（配列番号２７）である。本明細書中に提供される実験データから、上記「ＧＳリンカー」を、組換えタンパク質中でタンデムリピートの形態に配置された抗原性エピトープの線状構造に影響を与えない、本発明におけるペプチドリンカーとして使用することができ、該組換えタンパク質が、動物における防御抗体の産生を誘発することができることが、示される。また、本発明のワクチン中の組換えタンパク質において、抗原性エピトープ（複数可）のタンデムリピートは、上述のようなペプチドリンカーを介して、免疫グロブリン重鎖の定常領域のアミノ酸配列に連結させることもできる。
【００２７】
タンデムリピートの形態に配置された抗原性エピトープが組換えタンパク質分子の表面に提示されるために、タンデムリピートの形態に配置された、抗原性エピトープ、例えばＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープは、免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片に連結される。免疫グロブリン重鎖の定常領域は、免疫グロブリン分子の表面の抗体の可変領域の配列を提示することができる。免疫グロブリン重鎖の定常領域の、この特性を利用することによって、本発明者は、免疫グロブリン重鎖の可変領域を、タンデムリピートの形態に配置された抗原性エピトープと置換して、免疫グロブリン重鎖の定常領域が抗原性エピトープ、例えばＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートを、組換えタンパク質分子の表面に提示することを可能にする。動物へ本発明のワクチンを投与する際に、Ｂ細胞表面ＩｇＭモノマーを組換えタンパク質分子中の抗原性エピトープに接触させ、次いで活性化して、免疫応答の産生を生じることができる。動物に関して行われた実験によって、この方法で設計されたワクチンが、強い防御免疫応答を誘発することができ、それによって動物を感染から防御する目的を達成することができることが確認される。
【００２８】
好ましくは、本発明の組換えタンパク質において使用することができる免疫グロブリン重鎖の定常領域は、家畜由来である。組換えタンパク質分子における、免疫グロブリン重鎖の定常領域の免疫原性を減少させるために、ワクチン接種される動物と同じ種由来である免疫グロブリン重鎖の定常領域を使用することが好ましい。免疫グロブリン重鎖の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＧ又はそれらのサブタイプに由来し得る。免疫グロブリン重鎖の定常領域の「機能性断片」は、抗原性エピトープのタンデムリピートを組換えタンパク質分子の表面に提示する能力を保持している、免疫グロブリン重鎖の定常領域の一部をいう。
【００２９】
本発明のワクチン中の別の部分又は成分は、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片、好ましくはインタクトな３Ｄタンパク質である。ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質、及びＶＰ１タンパク質等のカプシドタンパク質由来の抗原性エピトープは、同じ型のＦＭＤＶに由来し得る。あるいは、異なる型のＦＭＤＶに由来し得る。例えば、本発明のワクチンにおいて、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープはＯ血清型ＦＭＤＶに由来し得るが、３Ｄタンパク質はＯ血清型ＦＭＤＶ由来又はＡ血清型若しくはアジア１ ＦＭＤＶ由来のいずれかであり得る。
【００３０】
本発明のワクチンにおいて、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質は、ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、免疫グロブリン重鎖の定常領域、及びＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質を含む組換えタンパク質全体を形成するように、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣ末端に直接連結させることができる。あるいは、３Ｄタンパク質は、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート及び免疫グロブリン重鎖の定常領域を含む組換えタンパク質とともに本発明のワクチンの有効な成分を形成する、別のタンパク質成分として存在し得る。
【００３１】
ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質を、組換えタンパク質の一部として、又は別の成分として、本発明のワクチン中に導入する目的は、ワクチン接種される動物においてＴ細胞応答を誘発することである。Ｔ細胞は、動物の体内で、ウイルスに感染している細胞を攻撃し、感染細胞を排除することによってウイルスを一掃することができる。したがって、Ｔ細胞応答は、動物をウイルス感染から防御することにおいて、重要な役割を果たす。動物が本発明のワクチンをワクチン接種された後に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ワクチン中のタンパク質成分を取り込み及び処理することができ、処理された成分は、ＭＨＣ分子によってＡＰＣの表面に提示され得る。これによって、抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球の活性化及び増殖、並びに免疫記憶細胞の発生が誘導される。ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質の「免疫原性断片」は、インタクトな３Ｄタンパク質同様に、ワクチン接種された動物においてＴ細胞応答を効率的に誘発することができる、３Ｄタンパク質の一部をいう。
【００３２】
本発明のワクチンの特定の実施形態において、組換えタンパク質のＮ末端は、縦列に配置されて３回繰り返された、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープによって形成され、ここで該２つの抗原性エピトープは、ペプチドリンカー配列番号１１によって連結された、配列番号９（ＶＰ１のアミノ酸残基１４１〜１６０）及び配列番号１０（ＶＰ１のアミノ酸残基２００〜２１３）であり、このタンデムリピートは、免疫グロブリン重鎖（配列番号４）に、そのＣ末端でペプチドリンカー配列番号１１によって連結され、組換えタンパク質のＣ末端はＯ血清型ＦＭＤＶのインタクトな３Ｄタンパク質配列によって形成され、それによって、組換えタンパク質全体（配列番号８）が形成される。別の特定の実施形態において、組換えタンパク質のＮ末端は、縦列に配置されて３回繰り返された、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープによって形成され、ここで２つの抗原性エピトープは、ペプチドリンカー配列番号１１によって連結された、配列番号９（ＶＰ１のアミノ酸残基１４１〜１６０）及び配列番号１０（ＶＰ１のアミノ酸残基２００〜２１３）であり、組換えタンパク質のＣ末端は免疫グロブリン重鎖（配列番号４）によって形成され、上述の２つの部分はペプチドリンカー配列番号１１によって連結されているが、インタクトな３Ｄタンパク質は別の独立した成分である。このように、組換えタンパク質（配列番号１３）成分及び３Ｄタンパク質（配列番号６）成分は、ワクチン組成物の有効な成分をともに形成する。
【００３３】
本発明は、上述の態様において記載されているような組換えタンパク質もまた、包含する。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、本発明のワクチン組成物中の組換えタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３５】
本発明の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得る方法は、当該分野で公知である。例えば、ポリヌクレオチド分子は、化学合成によって、直接調製することができる。あるいは、抗原性エピトープのタンデムリピート、免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片、及びＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片をそれぞれコードする核酸分子を最初に得て、ペプチドリンカーをコードする配列を付加し、次いでそれらをともに連結して、組換えタンパク質全体をコードするポリヌクレオチドを形成させることが可能である。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって、動物の脾臓細胞由来の免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするポリヌクレオチド、及びＦＭＤＶ試料由来の３Ｄタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ることが可能である。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドを使用して、例えば該ポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入し、次いで宿主細胞に導入して組換えタンパク質を発現させることによって、本発明のワクチン中の成分を調製することができる。
【００３７】
したがって、さらなる態様において、本発明は、動物におけるＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物における使用のための、組換えタンパク質を調製する方法を提供し、該方法は、
上述のような組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを得るステップと、
該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築するステップと、
該発現ベクターを宿主細胞中に導入するステップと、
組換えタンパク質の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、発現された組換えタンパク質を回収及び精製するステップとを含む。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために使用することができる、発現ベクター、例えば原核生物又は真核生物発現ベクターもまた、当該分野で公知である。
【００３９】
本発明の組換えタンパク質を発現させるために使用することができる宿主細胞は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及び酵母細胞である。
【００４０】
本発明の抗ＦＭＤＶワクチン組成物は、有効量の有効な成分（複数可）、すなわち組換えタンパク質全体又は組換えタンパク質成分と別の３Ｄ成分とを、薬学的に許容され得る担体及びアジュバントとともに含む。動物は、ブタ、ウシ、又はヒツジ等の、偶蹄類動物である。本明細書中で使用される場合、「有効量」は、ワクチンの１つの成分又は複数の成分が、ワクチン接種される動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するのに十分な量であることを意味する。
【００４１】
適切な担体及びアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム等の無機アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ又はポリＡ等の有機アジュバント、微生物及びその抽出物、並びにオイルアジュバント等である。
【００４２】
本発明は、有効量の本発明のワクチン組成物を、該ワクチン組成物を必要とする動物に投与するステップを含む、動物においてＦＭＤＶ感染を予防する方法もまた、提供する。本発明のワクチンは、例えば皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射によって、タンパク質ワクチンの投与に適切な任意の経路で投与することができる。本明細書中で使用される場合、「有効量」は、ワクチンの１つの成分又は複数の成分が、ワクチン接種される動物においてＦＭＤＶに対する特異的免疫応答を誘導するのに十分な量であることを意味する。有効量は、例えば、動物に関する従来の実験によって、当業者によって、容易に決定することができる。本発明のワクチン中のタンパク質成分は、１００〜２０００μｇ、好ましくは２００〜１０００μｇの総量で投与することができる。実施例中で調製されたワクチン組成物Ａ中の組換えタンパク質を例にとれば、２００〜１０００μｇの量の組換えタンパク質の単回投薬投与によって、ワクチン接種される動物においてＯ血清型ＦＭＤＶに対する有効な防御免疫応答を誘発することができる。
【００４３】
抗ＦＭＤＶワクチン組成物の効能を測定及び評価するための方法及び技術は、当該分野で公知である。かかる方法及び技術としては、ハムスター細胞の培養、ウイルスのインビトロ増殖、及びタンパク質の調製等の、ＦＭＤＶのインビトロ培養及び滴定；ワクチン接種された動物から血清を採取すること、血清中和試験、哺乳マウス防御試験、ＩＤ５０及びＬＤ５０測定、並びにブタにおけるウイルス負荷試験等の動物実験；並びに血清中和抗体応答アッセイ及びＴ細胞応答アッセイ等の、動物における免疫応答アッセイが挙げられる。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例は、例示によってのみ提示される。実施例は決して、本発明の範囲を限定するように意図されない。
【００４５】
実施例１：組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
実施例１ａ：Ｏ血清型ＦＭＤＶベースの組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
１．１．縦列反復されたＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープをコードするＤＮＡの合成
３回縦列反復された、ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＤＮＡ合成によって得た。２つの抗原性エピトープは、最近のＦＭＤの発生の原因であるＯ血清型ＦＭＤＶ由来、すなわち、Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質のアミノ酸残基１４１〜１６０（配列番号９）及びアミノ酸残基２００〜２１３（配列番号１０）である。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を、縦列反復されたＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのそれぞれをコードするヌクレオチド配列の間に導入した。また、メチオニンコドンを５’末端に付加し、ペプチドリンカーをコードするさらなるヌクレオチド配列（配列番号１１）を３’末端に付加した。得られた産物を「３Ｒ」断片と名付け、そのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。
【００４６】
１．２．ブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を得る
動物免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードする核酸を、以下に概説するように、動物脾臓細胞からのＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得た。ブタ単鎖ＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）由来の重鎖の定常領域のｍＲＮＡを含む全ｍＲＮＡを、ファストプレップ（ＦａｓｔＰｒｅｐ）キット（Ｇｉｂｃｏ）を使用することによって、ブタ脾臓試料から抽出及び精製した。ｓｃＩｇＧをコードするｃＤＮＡ断片を、以下のプライマーを用いることによって、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得た（Ｋａｃｋｏｖｉｃｓ，Ｉ．、Ｓｕｎ，Ｊ．、Ｂｕｌｔｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｆｉｖｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ＩｇＧ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｉｍａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４；１５３：３５６５〜７３ページ）：
ｓｃＩｇＧ ５’プライマー：５’−ＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＣＧＧＣＣＣＣＡ−３’ 配列番号１５
ｓｃＩｇＧ ３’プライマー：５’−ＴＣＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴ−３’ 配列番号１６
【００４７】
以下の条件下での逆転写のために、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した：５μｌのＭ−ＭＬＶ ５Ｘ反応バッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ）；１．２５μｌの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ；２５単位の組換えＲＮａｓｉｎ（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤；２００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素；２μｇ ｍＲＮＡ；０．５μｇのプライマー；２５μｌの最終体積までリボヌクレアーゼ不含水を添加する。３７℃で６０分間反応を行い、次いで７０℃で１５分間不活化した。
【００４８】
次いで、得られた産物を、その後のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅系の総体積は２５μｌであり、２．５μｌの１０ｘＰＣＲバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ グルチン）、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１μｌのｓｃＩｇＧ ５’プライマー（配列番号１５）（１０ｍＭ）、１μｌのｓｃＩｇＧ ３’プライマー（配列番号１６）（１０ｍＭ）、０．２μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μｌの鋳型、１８．３μｌのｄｄＨ２Ｏを含んでいた。ＰＣＲは、以下の条件下で行った：９５℃で５分間；９５℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、及び７２℃で２分間の３４サイクル；並びに最後に７２℃で５分間。得られた増幅産物を「ＩＧＣ」断片と名付けた。配列決定解析から、この断片が配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有することが明らかになった。
【００４９】
１．３．タンデムリピート領域及びブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードする核酸のライゲーション
ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートをコードする核酸（３Ｒ断片）とブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域のｃＤＮＡ（ＩＧＣ断片）とのライゲーションを、３００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＡＴＰを含むライゲーション反応系において行った。ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートをコードする核酸の、重鎖の定常領域のｃＤＮＡ断片に対するモル比は、１：１であった。２ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ及び０．２ｕ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ライゲーションの効率を促進した。ライゲーション産物を「３Ｒ−ＩＧＣ」断片と名付け、そのヌクレオチド配列を配列番号１４に示す。
【００５０】
１．４．ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードする核酸を得る
Ｏ血清型ＦＭＤＶに感染したブタから得られた水疱液試料から、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードする核酸をクローニングするために、以下のプライマーを使用した：
３Ｄ ５’プライマー：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＣ−３’ 配列番号１７
３Ｄ ３’プライマー：５’−ＧＴＡＴＧＣＧＴＣＡＣＣＧＣＡＣ−３’ 配列番号１８
【００５１】
ＲＴ−ＰＣＲ条件は、ＩＧＣの増幅に使用したものと同じであった。ＦＭＤＶから増幅された産物を「Ｄ」断片と名付けた。この産物は、ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードし、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有する。
【００５２】
１．５．組換えタンパク質全体をコードする核酸を得る
上記で調製された「３Ｒ−ＩＧＣ」断片を、次いで、オーバーラッピングＰＣＲによってＦＭＤＶから増幅された、３Ｄタンパク質をコードする「Ｄ」断片とライゲートさせ、それによって、組換えタンパク質全体をコードする核酸分子「３Ｒ−ＩＧＣＤ」を得た。詳細なステップは以下の通りである。
【００５３】
（１）「３Ｒ−ＩＧＣ」断片増幅のためのプライマーを設計する：
３Ｒ−ＩＧＣＤ ５’プライマー：５’−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣＣＴＧ−３’ 配列番号１９
３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー１：５’−ＧＧＴＡＧＡＧＧＴＴＣＴＧＡＧＴＣＣＣＡＴＴＴＣＣＣＡＡＣＴＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧ−３’ 配列番号２０
【００５４】
３Ｒ−ＩＧＣＤ ５’プライマーは「３Ｒ−ＩＧＣ」断片の５’末端に相補的であり、３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー１は「３Ｒ−ＩＧＣ」断片の３’末端に部分的に相補的であり、「Ｄ」断片の５’末端に部分的に相補的である。ＰＣＲ増幅によって、３Ｒ−ＩＧＣＤの３Ｒ−ＩＧＣ部分が生成され、その３’末端配列は、「Ｄ」断片の５’末端に部分的に相同である。
【００５５】
（２）「Ｄ」断片増幅のためのプライマーを設計する：
Ｄ ５’プライマー：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧＧＴＴＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＡＣＣ−３’ 配列番号２１
３Ｒ−ＩＧＣＤ ３’プライマー：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＧＴＣＡＣＣＧＣＡＣ−３’ 配列番号２２
【００５６】
Ｄ ５’プライマーは「Ｄ」断片の５’末端に部分的に相補的であり、「３Ｒ−ＩＧＣ」断片の３’末端に部分的に相補的であり、３Ｒ−ＩＧＣＤ ３’プライマーは「Ｄ」断片の３’末端に相補的である。ＰＣＲ増幅によって、３Ｒ−ＩＧＣＤのＤ部分が生成され、その５’末端配列は、「３Ｒ−ＩＧＣ」断片の３’末端に部分的に相同である。
【００５７】
（３）各５μｇの、３Ｒ−ＩＧＣ部分及びＤ部分を、互いにＰＣＲプライマー及び鋳型として使用し、１分間の９５℃変性、２分間の６５℃伸長の６サイクルに供した。次いで、３Ｒ−ＩＧＣＤ ５’プライマー及び３Ｒ−ＩＧＣＤ ３’プライマーをこの反応系に添加し、１分間の９５℃変性、５５℃３０秒間、２分間の７２℃伸長の２０サイクルに供した。得られた増幅産物は３Ｒ−ＩＧＣＤ（配列番号７）であり、実施例２で調製されるようなワクチン組成物Ａにおける組換えタンパク質をコードする。
【００５８】
１．６．発現ベクターの構築
上述のようにして得られた増幅産物「３Ｒ−ＩＧＣＤ」を、ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入し、それによって、プラスミドｐ３Ｒ−ＩＧＣＤを得た。
【００５９】
上述の１．３節で調製された「３Ｒ−ＩＧＣ」のＰＣＲ増幅において、以下のプライマーを使用した：
３Ｒ−ＩＧＣ ５’プライマー：５’−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＡＡＣ−３’ 配列番号２３
３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー２：５’−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴ−３’ 配列番号２４
【００６０】
増幅産物をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入し、それによって、プラスミドｐ３Ｒ−ＩＧＣを得た。
【００６１】
実施例１ｂ：アジア１ ＦＭＤＶベースの組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
縦列反復された、アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、実施例１ａの１．１節に記載されているのと同様の方法で合成した。簡潔にいうと、縦列反復された、アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＤＮＡ合成によって得た。２つの抗原性エピトープは、それぞれ、アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の、残基１３３〜１５８のアミノ酸配列（配列番号２５）及び残基２００〜２１３のアミノ酸配列（配列番号２６）を有する。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を、縦列反復された、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのそれぞれをコードするヌクレオチド配列の間に導入した。また、メチオニンコドンをＤＮＡ配列の５’末端に付加し、ペプチドリンカーをコードするさらなるヌクレオチド配列（配列番号２７）を３’末端に付加した。得られた産物を「３Ａｓ」断片と名付けた。
【００６２】
３Ａｓを、実施例１ａの１．３節に記載されているのと同様の方法で、実施例１ａの１．２節で得られたＩＧＣ（配列番号３）とライゲートした。ライゲーション産物は、「３Ａｓ−ＩＧＣ」断片と名付け、配列番号２９に示されるヌクレオチド配列を有し、「３Ａｓ−ＩＧＣ」によってコードされるアミノ酸配列を配列番号２８に示す。
【００６３】
次いで、「３Ａｓ−ＩＧＣ」断片を、実施例１ａの１．５節に記載されているのと同様なオーバーラッピングＰＣＲによって、上述の１．４節で得られた「Ｄ」断片（配列番号５）とライゲートし、それによって、アジア１ ＦＭＤＶベースの組換えタンパク質全体をコードする核酸分子「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」を得た。配列決定解析から、該核酸分子が配列番号３１に示されるＤＮＡ配列を有することが明らかになり、コードされるアミノ酸配列を配列番号３０に示す。
【００６４】
最後に、「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで、細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入して、プラスミドｐ３Ａｓ−ＩＧＣＤを得た。
【００６５】
実施例１ｃ：ウシＯ血清型ＦＭＤＶベースの組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
縦列反復された、ウシＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、実施例１ａの１．１節に記載されているのと同様の方法で合成した。簡潔にいうと、縦列反復された、ウシＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の３つの抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＤＮＡ合成によって得た。ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープは、それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、及び配列番号３４のアミノ酸配列を有する。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を、縦列反復された、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのそれぞれをコードするヌクレオチド配列の間に導入した。また、メチオニンコドンをＤＮＡ配列の５’末端に付加し、ペプチドリンカーをコードするさらなるヌクレオチド配列（配列番号２７）を３’末端に付加した。得られた産物を「３ＫＯ」断片と名付けた。
【００６６】
ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を、実施例１ａの１．２節に記載されているのと同様の方法で得た。以下のプライマーを使用した：
ｃＩＧＣ ５’プライマー：５’−ＣＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＧ−３’ 配列番号３５
ｃＩＧＣ ３’プライマー：５’−ＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣ−３’ 配列番号３６
【００６７】
配列決定解析から、「ｃＩＧＣ」断片と名付けられた、得られたｃＤＮＡが、配列番号３８に示される配列を有することが明らかになり、コードされるアミノ酸配列を配列番号３７に示す。
【００６８】
３ＫＯを、実施例１ａの１．３節に記載されているのと同様な方法で、ｃＩＧＣとライゲートした。ライゲーション産物は、「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」断片と名付け、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列を有し、「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」によってコードされるアミノ酸配列を配列番号３９に示す。
【００６９】
次いで、「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」断片を、実施例１ａの１．５節に記載されているのと同様なオーバーラッピングＰＣＲによって、上述の１．４節で得られた「Ｄ」断片（配列番号５）とライゲートし、それによって、ウシＯ血清型ＦＭＤＶベースの組換えタンパク質全体をコードする核酸分子「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」を得た。配列決定解析から、該核酸分子が配列番号４２に示されるＤＮＡ配列を有することが明らかになり、コードされるアミノ酸配列を配列番号４１に示す。
【００７０】
最後に、「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入し、プラスミドｐ３ＫＯ−ｃＩＧＣＤを得た。
【００７１】
実施例１ｄ：Ａ血清型ＦＭＤＶベースの組換え遺伝子及び発現ベクターの構築
縦列反復された、Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、実施例１ａの１．１節に記載されているのと同様の方法で合成した。簡潔にいうと、縦列反復された、Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の２つの抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＤＮＡ合成によって得た。２つの抗原性エピトープはそれぞれ、Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の、残基１４１〜１６０のアミノ酸配列（配列番号４３）及び残基２００〜２１３のアミノ酸配列（配列番号４４）を有する。ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）を、縦列反復された、ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのそれぞれをコードするヌクレオチド配列の間に導入した。また、メチオニンコドンをＤＮＡ配列の５’末端に付加し、ペプチドリンカーをコードするさらなるヌクレオチド配列（配列番号２７）を３’末端に付加した。縦列反復された抗原性エピトープをブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域の断片と連結させるために、このリンカーを使用した。得られた産物を「３Ａ」断片と名付けた。
【００７２】
３Ａを、実施例１ａの１．３節に記載されているのと同様の方法で、実施例１ａの１．２節で得られたＩＧＣ（配列番号３）とライゲートした。ライゲーション産物は、「３Ａ−ＩＧＣ」断片と名付け、配列番号４６に示されるヌクレオチド配列を有し、「３Ａ−ＩＧＣ」によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４５に示す。
【００７３】
次いで、「３Ａ−ＩＧＣ」断片を、実施例１ａの１．５節に記載されているのと同様のオーバーラッピングＰＣＲによって、上述の１．４節で得られた「Ｄ」断片（配列番号５）とライゲートし、それによって、Ａ血清型ＦＭＤＶベースの組換えタンパク質全体をコードする核酸分子「３Ａ−ＩＧＣＤ」を得た。配列決定解析から、該核酸分子が配列番号４８に示されるＤＮＡ配列を有することが明らかになり、コードされるアミノ酸配列を配列番号４７に示す。
【００７４】
最後に、「３Ａ−ＩＧＣＤ」をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｂａ Ｉで消化し、次いで、細菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）に挿入し、プラスミドｐ３Ａ−ＩＧＣＤを得た。
【００７５】
実施例２：ワクチンの調製
２．１．本発明のワクチン組成物Ａの調製
２．１．１． ３Ｒ−ＩＧＣＤによってコードされる組換えタンパク質の発現：コンピテント細胞（大腸菌、ＢＬ２１）を氷上で解凍し、３００μｌのコンピテント細胞を各氷冷チューブに加えた。実施例１で調製したプラスミドｐ３Ｒ−ＩＧＣＤを各チューブに加え、混合し、氷上で４０分間静置し、次いで４２℃の水浴中で４５秒間の熱ショックに供した。１ｍｌのＬ培地（抗生物質なし）を各チューブに加えた。チューブをシェイカー上、３７℃で４５分間インキュベートして、プラスミドからのタンパク質の発現を可能にした。形質転換された細菌をアンピシリンとともに培養プレート上で平板培養し、３７℃で一晩放置した。アンピシリン耐性を有する細菌クローンを選択し、プラスミド抽出後にＤＮＡ配列決定に供した。次いで、正しい配列を有するプラスミドを含む株を選択した。該株をＬＢ培地中に接種し、３７℃でＯＤ＝０．５まで増殖させ、次いで０．４ｍＭ ＩＰＴＧを培地に添加して、組換えタンパク質の発現を誘導した。４時間後に、細菌細胞を収集した。細菌細胞の懸濁液を超音波破砕し、次いで残りの細菌残屑を除去するように、４℃で１０分間、１０，０００ｘｇで遠心分離した。イムノブロッティング解析のために、上清を直接使用した。不溶性タンパク質（封入体）を、３０，０００ｘｇでの遠心分離によって収集し、ＬＢ培地で１回洗浄し、次いで、振とうしながら、沈殿１ｇあたり２５ｍｌの量でバッファー１（ＳＢ１：１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、８Ｍ尿素、１．５Ｍ ＮａＣｌ）と混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートした。ガラス質の不溶性細胞壁を、６５，０００ｘｇで３０分間の遠心分離によって除去した。上清を、０．２μｍろ過膜を通してろ過し、それによって、組換えタンパク質を含むタンパク質試料を得た。発現された組換えタンパク質を、Ｈｉｓトラップ（Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ）カラムで精製した（Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．、Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｊ．、Ｏｌｓｓｏｎ，Ｉ．、Ｂｅｌｆｒａｇｅ，Ｇ．、Ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ １９７５；２５８：５９８〜９９ページ）。５〜１０ｍｇ／ｍｌの上述のタンパク質試料を、１×５ｃｍ予備平衡化Ｈｉｓトラップカラム上に置いた。ｐ３Ｒ−ＩＧＣＤプラスミドから発現された組換えタンパク質は、Ｈｉｓ尾部を有する。結合タンパク質を５０ｍｌのＳＢ１で洗浄し、次いで、溶出バッファー２（ＥＢ２：ＳＢ１＋０．５Ｍ ＮａＣｌ＋４８０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を使用して、カラムから溶出させた。溶出したタンパク質を、ＳＢ１で１０倍希釈し、次いで、同じ条件下で、２回目のクロマトグラフィーに供した。溶出したタンパク質を組み合わせ、製造業者の使用説明書に従ってＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質分析キットを使用して、その濃度を測定した。タンパク質の濃度を０．３〜０．４ｍｇ／ｍｌに調節した。透析物を頻繁に交換しながら、５Ｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１．０Ｍ ＮａＣｌで７２時間透析を行った。タンパク質はまた、８Ｍ尿素の代わりに６Ｍ尿素を使用してタンパク質を溶解させたことを除いて同様の方法を用いて、精製した。精製されたタンパク質を４℃で保存した。
【００７６】
２．１．２．３Ｒ−ＩＧＣＤによってコードされる組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング解析：組換えタンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法によって明らかにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、得られた組換えタンパク質の分子量が、期待されるものと一致することが示された（図２）。標的タンパク質の発現を、イムノブロッティング（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬイムノブロッティングキット）によって測定した（Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｈａｍｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．編）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８１）。イムノブロッティング解析において、Ｏ血清型ＦＭＤＶに感染したブタから得られた抗ＦＭＤＶ抗血清を使用し（図３）、結果から、組換えタンパク質は免疫原性があり、上述の血清に反応性があることが確認される。
【００７７】
２．１．３．ワクチン組成物Ａを得る：乳化剤２０６（ＳＥＰＰＩＣ Ｉｎｃ、仏国）を組換えタンパク質に添加及び混合し、本発明のワクチン組成物Ａ（３Ｒ−ＩＧＣＤによってコードされる組換えタンパク質（配列番号８）を有効成分として含む）を得た。
【００７８】
２．２．本発明のワクチン組成物Ｂの調製
２．１節と同様の手順に従って、プラスミドｐ３Ｒ−ＩＧＣを使用して、３Ｒ−ＩＧＣによってコードされる組換えタンパク質（配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する）を発現及び精製した。この組換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの、クマシーブルー染色及びイムノブロッティングアッセイ（ブタ由来の抗ＦＭＤＶ血清でプロービングした）の結果を、図４に示した。
【００７９】
実施例１の１．４節で得られたＦＭＤＶの３Ｄタンパク質をコードする核酸を、発現ベクターｐＥＴ１００−Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、それによって、プラスミドｐＥＴ１００−Ｐ３Ｄを得た。ベクターｐＥＴ１００−Ｄ−ＴＯＰＯは、製造業者によって直線化されており、細菌中の組換えタンパク質の発現のための標的断片に連結させることができる。２．１節と同様の手順に従って、プラスミドｐＥＴ１００−Ｐ３Ｄを使用して、大腸菌株ＢＬ２１コドンプラスを形質転換した。３Ｄタンパク質を発現させるように、培養された細菌を０．４ｍＭ ＩＰＴＧで４時間誘導した。発現及び精製された３Ｄタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色、並びに抗Ｈｉｓ抗体を用いたイムノブロッティングに供した。結果を図５に示す。
【００８０】
３Ｒ−ＩＧＣによってコードされる組換えタンパク質及び３Ｄタンパク質を等しいモル比で混合し、これに乳化剤２０６（ＳＥＰＰＩＣ Ｉｎｃ、仏国）を添加し、それによって、本発明のワクチン組成物Ｂ（３Ｒ−ＩＧＣによってコードされる組換えタンパク質（配列番号１３）及び３Ｄタンパク質（配列番号６）を有効成分として含む）を得た。
【００８１】
２．３．本発明の他のワクチン組成物の調製
２．１節及び２．２節と同様の手順をそれぞれ用いて、実施例１ｂ、１ｃ及び１ｄで生じた組換えタンパク質を含んで、ワクチンを調製した。上記のワクチンはそれぞれ、組換えタンパク質全体「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」、「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」、若しくは「３Ａ−ＩＧＣＤ」を有効成分として含むか、又は組換えタンパク質「３Ａｓ−ＩＧＣ」、「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」、若しくは「３Ａ−ＩＧＣ」とともに別の３Ｄ成分を有効成分として含む。
【００８２】
実施例３：抗ＦＭＤＶワクチンの効能
３．１．細胞培養
ハムスター腎臓細胞株（ＢＨＫ２１）（ＡＴＣＣから購入、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ ｍｌ−１）、ストレプトマイシン（１００μｇ ｍｌ−１）及びアール塩を補充した必須培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｐ．Ｖ．、Ｌ．Ｐｕｌｌｅｎ、Ｒ．Ｆ．Ｓｔａｐｌｅ、Ｌ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ｒ．Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｄ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ、及びＴ．Ｒ．Ｄｏｅｌ．１９９６。Ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａ２４ Ｃｒｕｚｅｉｒｏ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｓｕｂｔｙｐｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０１１〜１０１８ページ）。
【００８３】
３．２．ＦＭＤＶ増殖及びウイルスタンパク質の調製
ＦＭＤＶは、流行の際にＦＭＤＶに感染したブタの水疱の上皮組織由来であった。ＢＨＫ２１単層細胞が８０％コンフルエンスに増殖したときに、１ｍｌのＦＭＤＶ液を細胞層の表面に添加して、ＦＭＤＶを増殖させた。ＢＨＫ２１細胞を、３７℃で４５分間培養し、細胞が７５％の細胞変性効果を示すまで収集し、次いで、アール塩を補充し、ＦＢＳを含まない、２０ｍｌの必須培地（ＥＭＥＭ）を添加した。培養の後に、０．０１Ｍバイナリーエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ）を添加し、培養物を３７℃で１時間平板培養して、ＦＭＤＶを不活化させ、次いで、７％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）（Ｓｉｇｍａ）を添加し、４℃で一晩平板培養して、不活化したＦＭＤＶを沈殿させた。ウイルスの総タンパク質を、４０，０００ｒｐｍで２時間の超遠心分離によって得た。精製されたウイルスタンパク質の濃度を、２５９ｎｍでの光学密度を測定することによって、測定した（１ＯＤ＝１３２μｇ）（Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｐ．Ｖ．、Ｌ．Ｐｕｌｌｅｎ、Ｒ．Ｆ．Ｓｔａｐｌｅ、Ｌ．Ｊ．Ｌｅｅ、Ｒ．Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｄ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ、及びＴ．Ｒ．Ｄｏｅｌ．１９９６。Ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａ２４ Ｃｒｕｚｅｉｒｏ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｓｕｂｔｙｐｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｍｉｎｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１０１１〜１０１８ページ）。該ウイルスタンパク質を、Ｔ細胞増殖アッセイのために使用した。
【００８４】
３．３．ＦＭＤＶの５０％感染量（ＩＤ５０）の測定
ＦＭＤＶの５０％感染量（ＩＤ５０）の濃度を測定するために、ＦＭＤＶ血清反応について陰性な２５匹のブタを、５０％感染量（ＩＤ５０）の分析のために使用した。該動物を、１群あたり５匹の動物の、５つの群に分けた。口蹄疫ウイルス液を１：１０に段階希釈し（例えば、１０−４、１０−５、１０−６、１０−７及び１０−８）、それぞれブタの頸部の筋肉に注射した。ウイルス負荷の２〜１０日後に、毎日体温を記録しながら、鼻、頬、舌及び足の水疱形成の観察を行った。ＦＭＤ症状があり、４０℃を超える体温を有するブタを、ＦＭＤ陽性であるとして同定した。５０％のブタがＦＭＤＶ感染による陽性の症状を示す希釈濃度を、ＦＭＤＶ液のＩＤ５０、すなわち１ ＩＤ５０として定義した（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｔ．、Ｒ．Ｄｉｍａｒｃｈｉ、及びＴ．Ｒ．Ｄｏｅｌ。１９９１。Ａ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ ｉｎ ＶＰ１ ｏｆ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ ｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ Ｃａｔｔｌｅ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４Ｇ：７４９〜７５５ページ。Ｔａｂｏｇａ，Ｏ．、Ｃ．Ｔａｍｉ、Ｅ．Ｃａｒｒｉｌｌｏ、Ｊ．Ｉ．Ｎｕｎｅｚ、Ａ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｊ．Ｃ．Ｓａｉｚ、Ｅ．Ｂｌａｎｃｏ、Ｍ．Ｌ．Ｖａｌｅｒｏ、Ｘ．Ｒｏｉｇ、Ｊ．Ａ．Ｃａｍａｒｅｒｏ、Ｄ．Ａｎｄｒｅｕ、Ｍ．Ｇ．Ｍａｔｅｕ、Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ、Ｅ．Ｄｏｍｉｎｇｏ、Ｆ．Ｓｏｂｒｉｎｏ、及びＥ．Ｌ．Ｐａｌｍａ．１９９７。Ａ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｌａｃｋ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｔｔｌｅ ａｎｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃａｐｅ Ｍｕｔａｎｔｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２６０４〜２６１４ページ）。
【００８５】
３．４．ワクチン接種されたブタの血清採取及びウイルス負荷試験
ＦＭＤＶウイルス負荷試験は、組換えワクチンの効能を測定する方法である。ＦＭＤＶ血清反応について陰性な、全体で２５匹のブタ（生後２．５カ月、約２５ｋｇ）を、ウイルス負荷分析のために使用した。
【００８６】
ブタを、５つの群に分けた：（ａ）５匹を、陰性対照群として使用した（１ｍｌのＰＢＳを注射した）；（ｂ）５匹を、陽性対照群として使用した（２ｍｌの市販のＦＭＤワクチン（不活化全ウイルス）、Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｕｃｕｌｔｕｒａｌ ＶＥＴ．ＢＩＯ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．ＬＴＤ．、Ｌａｎｚｈｏｕ、中国を、製造業者によって推奨される投薬量に従って、注射した）；残りの群、ｃ、ｄ、ｅに、ワクチン組成物Ａ、すなわち、実施例２の２．１節で調製した組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる）を、以下のように注射した：（ｃ）５匹に、０．２ｍｇの組換えタンパク質を注射した；（ｄ）５匹に、０．５ｍｇの組換えタンパク質を注射した；（ｅ）５匹に、１ｍｇの組換えタンパク質を注射した。実施例２の２．２節で調製したワクチン組成物Ｂを試験するとき、グループ分けはワクチン組成物Ａを試験するために上述したのと同じであり、注射されたタンパク質の総量はワクチン組成物Ａと同じであり、ここで、３Ｄタンパク質に対する組換えタンパク質（「３Ｒ−ＩＧＣ」によってコードされる）のモル比は１：１であった。
【００８７】
始めに、ブタを、最初に頸部の筋肉でワクチン接種し、次いで摂取後２１日目に同じ投薬量で再度ワクチン接種した。各群の動物から、０及び５１日目に血清試料を採取し、試験した。１週間後に、動物にＦＭＤＶを１０００×ＩＤ５０で付加し、ＦＭＤを同定するための診断基準は、上述のＩＤ５０測定におけるものと同じであった（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．、Ｊ．Ｃ．Ｓａｌｚ、Ｉ．Ｓ．Ｎｏｖｅｌｌａ、Ｄ．Ａｎｄｒｅｕ、及びＦ．Ｓｏｂｒｉｎｏ．１９９４。Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−Ｍｏｕｔｈ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ＶＰ１．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０５：２４〜３３ページ）。
【００８８】
３．５．血清抗体中和試験（ＳＮＴ）
組換えタンパク質、市販の抗ＦＭＤワクチン、及びバッファーをそれぞれ注射されたブタの５つの群について、ＦＭＤＶに対するそれらの特異的抗体応答を測定するために、Ｗｏｒｌｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙによってＦＭＤについて規定されている手順に従って、血清中和試験（ＳＮＴ）を行った（第２．１．１章Ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｕｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ．「ＯＩＥ ｍａｎｕａｌ」中。Ｏｆｆｉｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓ Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ、Ｐａｒｉｓ、１９９６；４７〜５６ページ）。抗体の濃度を、ｌｏｇ１０ＳＮ５０の形で表す（Ｓａｌｔ，Ｊ．Ｓ．、Ｐ．Ｖ．Ｂａｒｎｅｔｔ、Ｐ．Ｄａｎｉ、及びＬ．Ｗｉｌｌｉａｍ。１９９８。Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｔａｃｔ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ１６：７４６〜７５４ページ）。結果を表１及び２に示す。
【００８９】
【表１】
【００９０】
【表２】
【００９１】
血清中和試験の結果から、ワクチン組成物Ａ又はワクチン組成物Ｂ（２００μｇ、５００μｇ及び１ｍｇ）でのワクチン接種の後に、以前はＦＭＤＶ血清反応において陰性であった全てのブタにおいて、ＦＭＤＶに対する抗体中和反応が誘発され得ることが示される（表１及び２）。陰性対照群中のブタは、組換えタンパク質又は市販の抗ＦＭＤワクチンをワクチン接種されておらず、したがって、抗体反応は検出されなかった。本発明者らのワクチンをワクチン接種された３つの群と市販の抗ＦＭＤワクチンをワクチン接種された群の抗体レベルの間に、統計的に有意な差はなかった。
【００９２】
３．６．哺乳マウス防御試験
哺乳マウス防御試験（ＭＰＴ）は、本発明のワクチンをワクチン接種されたブタがＦＭＤＶに対する抗体を産生することができるかどうかを判定する、第２の方法である。改変を加えて、Ｍｕｌｃａｈｙらに記載されているようにマウス防御試験を行った（Ｍｕｌｃａｈｙ，Ｇ．、Ｌ．Ａ．Ｐｕｌｌｅｎ、Ｃ．Ｇａｌｅ、Ｒ．Ｄ．ＤｉＭａｒｃｈｉ、及びＴ．Ｒ．Ｄｏｅｌ。１９９１。Ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ９：１９〜２４ページ）。５０％致死量（ＬＤ５０）のＦＭＤＶ物質：段階希釈によって希釈された５つのウイルス試料（１０−３、１０−４、１０−５、１０−６及び１０−７等）を、５つの群の哺乳マウス（各群中４匹のマウス）に注射し、次いで、マウスにおいて５０％の死亡を引き起こす希釈濃度をＬＤ５０として測定した。実験用のブタ（本発明のワクチン（ワクチン組成物Ａ又はワクチン組成物Ｂ）、市販の抗ＦＭＤワクチン、及びバッファーをそれぞれワクチン接種された）の抗血清を、ワクチン接種後の５１日目に採取した。全ての抗血清を、５６℃で３０分間不活化した。各群中、４匹の、生後３〜４日の哺乳マウスに、１００μｌの無希釈ブタ抗血清を、それぞれ腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。２０〜２３時間以内に、全てのマウスに、５０％致死量（ＬＤ５０）の１０、１００、又は１０００倍の用量でＦＭＤＶをそれぞれ負荷し、次いで４日間観察した。生存し続けているマウスの数を記録した。結果を表３に示す。
【００９３】
【表３】
【００９４】
表３において、２００μｇ、５００μｇ又は１ｍｇのワクチン組成物Ａ又はワクチン組成物Ｂのいずれかでワクチン接種されたブタ由来の抗血清は全て、５０％致死量（ＬＤ５０）の１０００倍の用量でのＦＭＤＶの負荷に対して、哺乳マウスを完全に防御したことが、明らかに示される。組換えタンパク質をワクチン接種されなかったブタ（陰性対照群）の抗血清は、ＦＭＤＶの感染に対して哺乳マウスを全く防御することができなかったが、市販の抗ＦＭＤワクチンをワクチン接種されたブタの抗血清は、５０％致死量（ＬＤ５０）の１０００倍までの用量でのＦＭＤＶの負荷に対して、哺乳マウスを防御することができる。
【００９５】
３．７．Ｔ細胞増殖分析
Ｔ細胞増殖分析を行って、組換えタンパク質の注射によって引き起こされるＴ細胞増殖を特徴付けた。ワクチン組成物Ａ又はワクチン組成物Ｂ、市販の抗ＦＭＤワクチン、及びバッファーをワクチン接種されたブタの群から、Ｔ細胞を収集した。１．０７７ｇ ｍｌ−１のパーコール溶液によって、血液細胞を精製した。各群について４×１０６個のＴ細胞／ｍｌを９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で培養し、ＦＭＤＶウイルスタンパク質を１０μｇ ｍｌ−１又は５０μｇ ｍｌ−１の濃度まで添加した。プレートを３７℃で４日間培養し、次いで２５μｌあたり１マイクロキュリー（μＣｉ）の［トリチウム］チミジン（［３Ｈ］チミジン）を添加し、１８時間培養した後に細胞を収集し、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ６５００）を用いて測定した（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、第７．１０章、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｏｇａｎ編（ＮＩＨ）、２００５、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｌｉｅｒｏｐ，Ｍ．Ｊ．Ｃ．Ｖ．、Ｋ．Ｖ．Ｍａａｎｅｎ、Ｒ．Ｈ．Ｍｅｌｏｅｎ、Ｖ．Ｐ．Ｍ．Ｇ．Ｒｕｔｔｅｎ、Ｍ．Ａ．Ｃ．Ｄｅｊｏｎｇ、及びＥ．Ｊ．Ｈｅｎｓｅｎ。１９９２。Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ＦＭＰＶ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｆｔｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：４０６〜４１３ページ）。
【００９６】
【表４】
【００９７】
【表５】
【００９８】
表４及び５は、ワクチン組成物Ａ若しくはワクチン組成物Ｂ（２００μｇ、５００μｇ及び１ｍｇのタンパク質）、市販の抗ＦＭＤワクチン又はバッファーをそれぞれワクチン接種されたブタから収集されたＴ細胞のインビトロ増殖応答を説明する。１０μｇ ｍｌ−１又は５０μｇ ｍｌ−１のＦＭＤＶタンパク質のインビトロ刺激の後に、増殖応答を測定した。５０μｇ ｍｌ−１のウイルスタンパク質によって刺激した場合、組換えタンパク質及び市販の抗ＦＭＤワクチンをワクチン接種されたブタ由来のＴ細胞は、最もよい応答を示したが、バッファーによって刺激した群は、増殖応答を示さなかった。
【００９９】
ブタへのＦＭＤＶの負荷の結果を、表６及び７に示す。
【０１００】
【表６】
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
ＦＭＤＶによって負荷されたブタの５つの群の中でも、バッファー対照群（ｎ＝５）において、疾患の迅速な発症が見られた。規定された期限内（７〜１０日間）での典型的なＦＭＤ症状の発生に基づいて、それらの全てはＦＭＤ陽性であると診断された。市販の抗ＦＭＤワクチンの陽性対照群中の動物（ｎ＝５）は、いかなるＦＭＤ症状も示さなかった。０．２ｍｇのワクチン組成物Ａをワクチン接種されたブタ（ｎ＝５）については、それらのうち４匹はＦＭＤＶ負荷に対して防御された；０．５ｍｇ又は１ｍｇのワクチン組成物Ａをワクチン接種された全てのブタ（ｎ＝５）は、ＦＭＤＶ負荷に対して完全に防御された。０．２ｍｇ、０．５ｍｇ又は１ｍｇのワクチン組成物Ｂをワクチン接種されたブタ（ｎ＝５）もまた、ＦＭＤＶ負荷に対して完全に防御され、いかなるＦＭＤ症状も示さなかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
配列番号１：実施例中で使用されるＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の縦列反復された抗原性エピトープをコードするＤＮＡ配列；
配列番号２：実施例中で使用されるＯ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の縦列反復された抗原性エピトープのアミノ酸配列；
配列番号３：実施例中で使用されるブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするＤＮＡ配列；
配列番号４：実施例中で使用されるブタ免疫グロブリン重鎖の定常領域のアミノ酸配列；
配列番号５：実施例中で使用されるＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードするＤＮＡ配列；
配列番号６：実施例中で使用されるＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号７：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ｒ−ＩＧＣＤ」）；
配列番号８：「３Ｒ−ＩＧＣＤ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号９：Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基１４１〜１６０のアミノ酸配列；
配列番号１０：Ｏ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基２００〜２１３のアミノ酸配列；
配列番号１１：本発明において使用され得るペプチドリンカーＧＧＳＳＧＧ；
配列番号１２：本発明において使用され得るペプチドリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；
配列番号１３：「３Ｒ−ＩＧＣ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号１４：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ｒ−ＩＧＣ」）；
配列番号１５：ブタｓｃＩｇＧをコードするｃＤＮＡ断片を増幅するためのｓｃＩｇＧ ５’プライマー；
配列番号１６：ブタｓｃＩｇＧをコードするｃＤＮＡ断片を増幅するためのｓｃＩｇＧ ３’プライマー；
配列番号１７：ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードする核酸をクローニングするための３Ｄ ５’プライマー；
配列番号１８：ＦＭＤＶ ３Ｄタンパク質をコードする核酸をクローニングするための３Ｄ ３’プライマー；
配列番号１９：３Ｒ−ＩＧＣＤ断片を合成するために使用される３Ｒ−ＩＧＣＤ ５’プライマー；
配列番号２０：３Ｒ−ＩＧＣＤ断片を合成するために使用される３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー１；
配列番号２１：３Ｒ−ＩＧＣＤ断片を合成するために使用されるＤ ５’プライマー；
配列番号２２：３Ｒ−ＩＧＣＤ断片を合成するために使用される３Ｒ−ＩＧＣＤ ３’プライマー；
配列番号２３：配列番号１４を増幅するために使用される３Ｒ−ＩＧＣ ５’プライマー；
配列番号２４：配列番号１４を増幅するために使用される３Ｒ−ＩＧＣ ３’プライマー２；
配列番号２５：アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基１３３〜１５８のアミノ酸配列；
配列番号２６：アジア１ ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基２００〜２１３のアミノ酸配列；
配列番号２７：本発明において使用され得るペプチドリンカーＧＧＧＧＳ；
配列番号２８：「３Ａｓ−ＩＧＣ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号２９：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ａｓ−ＩＧＣ」）；
配列番号３０：「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号３１：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ａｓ−ＩＧＣＤ」）；
配列番号３２：ウシＯ血清型ＦＭＤＶのＶＰ１エピトープのアミノ酸配列；
配列番号３３：ウシＯ血清型ＦＭＤＶのＶＰ１エピトープのアミノ酸配列；
配列番号３４：ウシＯ血清型ＦＭＤＶのＶＰ１エピトープのアミノ酸配列；
配列番号３５：ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を増幅するためのｃＩＧＣ ５’プライマー；
配列番号３６：ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を増幅するためのｃＩＧＣ ３’プライマー；
配列番号３７：ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域のアミノ酸配列；
配列番号３８：ウシ免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列（「ｃＩＧＣ」断片）；
配列番号３９：「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号４０：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３ＫＯ−ｃＩＧＣ」）；
配列番号４１：「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号４２：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３ＫＯ−ｃＩＧＣＤ」）；
配列番号４３：Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基１４１〜１６０のアミノ酸配列；
配列番号４４：Ａ血清型ＦＭＤＶ ＶＰ１タンパク質の残基２００〜２１３のアミノ酸配列；
配列番号４５：「３Ａ−ＩＧＣ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；
配列番号４６：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ａ−ＩＧＣ」）；
配列番号４７：「３Ａ−ＩＧＣＤ」によってコードされる、実施例中で使用される組換えタンパク質のアミノ酸配列；及び
配列番号４８：実施例中で使用される本発明の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列（「３Ａ−ＩＧＣＤ」）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端に、
口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、
免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片、及び
口蹄疫ウイルス３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片
を含む組換えタンパク質を含む、動物において口蹄疫ウイルスに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物。
【請求項２】
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端に、
口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、及び
免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片
を含む組換えタンパク質と、
（ｉｉ）口蹄疫ウイルス３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片と
を含む、動物において口蹄疫ウイルスに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物。
【請求項３】
組換えタンパク質が、前記抗原性エピトープの２、３、４、又は５回のタンデムリピートを含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記抗原性エピトープが、ペプチドリンカーを介して互いに連結されている、及び／又は、前記抗原性エピトープのタンデムリピートが、ペプチドリンカーを介して免疫グロブリン重鎖の定常領域に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記抗原性エピトープが口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質がＶＰ１タンパク質である、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープが、配列番号９、配列番号１０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記タンデムリピートが、２つのＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートであり、ここで、第１の及び第２の抗原性エピトープのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号１０、配列番号２５及び配列番号２６、又は、配列番号４３及び配列番号４４であり、或いは、前記タンデムリピートが、３つのＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートであり、ここで、第１、第２及び第３のタンデムリピートのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号２７からなる群から選択される、請求項４〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
免疫グロブリン重鎖の前記定常領域が前記動物と同じ種に由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
免疫グロブリン重鎖の前記定常領域が、配列番号４又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記口蹄疫ウイルス３Ｄタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記組換えタンパク質が、配列番号８、配列番号３０、配列番号４１、及び配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記組換えタンパク質が、配列番号１３、配列番号２８、配列番号３９及び配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記動物がブタ、ウシ、又はヒツジである、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容され得る担体及び／又はアジュバントをさらに含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物中に含まれる組換えタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号７、配列番号１４、配列番号２９、配列番号３１、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４６、及び配列番号４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、単離された組換えタンパク質。
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端に、
口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、
免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片、及び
口蹄疫ウイルス３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片
を含む組換えタンパク質を含む、動物において口蹄疫ウイルスに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物。
【請求項２】
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端に、
口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピート、及び
免疫グロブリン重鎖の定常領域若しくはその機能性断片
を含む組換えタンパク質と、
（ｉｉ）口蹄疫ウイルス３Ｄタンパク質若しくはその免疫原性断片と
を含む、動物において口蹄疫ウイルスに対する特異的免疫応答を誘導するためのワクチン組成物。
【請求項３】
組換えタンパク質が、前記抗原性エピトープの２、３、４、又は５回のタンデムリピートを含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記抗原性エピトープが、ペプチドリンカーを介して互いに連結されている、及び／又は、前記抗原性エピトープのタンデムリピートが、ペプチドリンカーを介して免疫グロブリン重鎖の定常領域に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記抗原性エピトープが口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記口蹄疫ウイルスカプシドタンパク質がＶＰ１タンパク質である、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープが、配列番号９、配列番号１０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記タンデムリピートが、２つのＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートであり、ここで、第１の及び第２の抗原性エピトープのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号９及び配列番号１０、配列番号２５及び配列番号２６、又は、配列番号４３及び配列番号４４であり、或いは、前記タンデムリピートが、３つのＶＰ１タンパク質の抗原性エピトープのタンデムリピートであり、ここで、第１、第２及び第３のタンデムリピートのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記ペプチドリンカーが、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号２７からなる群から選択される、請求項４〜８のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
免疫グロブリン重鎖の前記定常領域が前記動物と同じ種に由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
免疫グロブリン重鎖の前記定常領域が、配列番号４又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記口蹄疫ウイルス３Ｄタンパク質が配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記組換えタンパク質が、配列番号８、配列番号３０、配列番号４１、及び配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記組換えタンパク質が、配列番号１３、配列番号２８、配列番号３９及び配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記動物がブタ、ウシ、又はヒツジである、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容され得る担体及び／又はアジュバントをさらに含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物中に含まれる組換えタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号７、配列番号１４、配列番号２９、配列番号３１、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４６、及び配列番号４８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む、単離された組換えタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５０６２４２（Ｐ２０１２−５０６２４２Ａ）
【公表日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３２４８６（Ｐ２０１１−５３２４８６）
【出願日】平成２１年１０月２３日（２００９．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／０７４５８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４５８８１
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【出願人】（５１１０９４６２４）レイ ヴァクシン リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２３日（２００９．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００９／０７４５８５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４５８８１
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【出願人】（５１１０９４６２４）レイ ヴァクシン リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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