抗真核微生物剤のスクリーニング方法
【課題】有効性の高い抗真核微生物剤を効率よくスクリーニングするための方法および有効性の高い抗真核微生物剤を提供することを課題とする。
【解決手段】14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質を検出して、抗真核微生物薬剤となり得る蓋然性の極めて高い物質をスクリーニングする。
【解決手段】14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質を検出して、抗真核微生物薬剤となり得る蓋然性の極めて高い物質をスクリーニングする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真核微生物剤のスクリーニング方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
14-3-3タンパク質は、相対分子量約30KDの二量体酸性タンパク質である。このタンパク質は、細胞周期、情報伝達、細胞内転送／ターゲティング、転写、宿主防御、細胞死などの多くの生物学的経路に関与する分子シャペロンとして、ほぼすべての真核生物組織活動において発現すると考えられている。１００を越える相互作用タンパク質がリストアップされており、ほとんどの相互作用は、保存性の高いリン酸化セリン／スレオニンペプチドモチーフを介する（例えば、非特許文献１、２、３および４）。
【０００３】
ほとんどの生物種において、１つ以上の14-3-3タンパク質のアイソフォームを有する。哺乳類では少なくとも７種のアイソフォームがあり、植物では少なくとも１５種のアイソフォームがある（例えば非特許文献５）。したがって、14-3-3タンパク質の二量体の組み合わせは14-3-3タンパク質二量体分子に多様性を賦与している可能性がある。いくつかの14-3-3タンパク質の結合パートナーは、二量体の形成あるいは単量体の形成でその結合に変化を受けないが、結合標的タンパク質全般的に見ると、その結合の強度に差異がみられる。（例えば非特許文献６）。
【０００４】
14-3-3タンパク質は、ほとんど二量体を形成して存在していることが報告されているが（非特許文献７）、最近では、MAPKAPK2、プロテインキナーゼB/Aktおよびスフィンゴシン依存性キナーゼなどのいくつかのキナーゼによるセリン残基のリン酸化が、細胞内における14-3-3タンパク質の二量体化を阻止することも報告されている（非特許文献８）。さらに、二量体化した14-3-3タンパク質は特定部位においてリン酸化を伴うc-Raf1およびDAF-16との結合を生じるが、単量体の場合にはリン酸化とは独立にc-Raf1およびDAF-16と結合する（例えば非特許文献９）。さらに、植物においては、二量体の形成にはフシコシン受容体に結合することが厳格に要求される（例えば非特許文献１０）。このように、14-3-3タンパク質の二量体化において、分子的にメカニズムを解明することは重要である。
【０００５】
ところで、アフリカなどの諸国においては、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）など、多くの真核微生物による感染症が重大な問題となっている。例えば、１０億人以上および２０億頭以上の畜牛が、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）の感染または感染の危険にさらされており、アフリカの経済および健康問題に重大な損害を与える結果を招いている。
【０００６】
T.bruceiはツェツェバエ（testse fly）が刺すことにより感染し、そのため２つの特徴的なライフサイクルを有する。ひとつは、プロサイクリック型（procyclic（insect） form：ＰＣＦ）であり、もう一つは血流型（blood stream(animal) form：ＢＳＦ）である。この病原体は、リボソーム配列に基づく進化系統樹においてホモ・サピエンスから最も離れた真核生物である。T.bruceiについては、RNA編集、キネトプラスト（kinetoplast）DNA複製、RNA転写−スプライシング、およびグリコシルフォスファチジルイノシトール（Glycosylphosphatidyl Inositol）タンパク質アンカーなどを含む、多くの生物学的特徴が明らかにされている（例えば非特許文献１１）。
【０００７】
しかしながら、これらの真核微生物による感染症に対する特効薬は、未だに開発されておらず、早急な開発が求められている。
【０００８】
【非特許文献１】Tzivion G, Shen YH, Zhu J. 14-3-3 proteins; bringing new definitions to scaffolding, . Oncogene. 20 (2001) 6331-6338.
【非特許文献２】Tzivion G, Avruch J. 14-3-3 proteins: active cofactors in cellular regulation by serine/threonine phosphorylation. J. Biol. Chem. 277 (2002) 3061-3064.
【非特許文献３】Yaffe MB. How do 14-3-3 proteins work-- Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis. FEBS Lett. 513 (2002) 53-57.
【非特許文献４】van Hemert MJ, Steensma HY, van Heusden GP. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. Bioessays. 23 (2001) 936-946.
【非特許文献５】Rosenquist M, Alsterfjord M, Larsson C, Sommarin M. Data mining the Arabidopsis genome reveals fifteen 14-3-3 genes. Expression is demonstrated for two out of five novel genes. Plant. Physiol. 127 (2001) 142-149.
【非特許文献６】Tzivion G, Luo ZJ, Avruch J. Calyculin A-induced vimentin phosphorylation sequesters 14-3-3 and displaces other 14-3-3 partners in vivo. J. Biol. Chem. 275 (2000) 29772-29778.
【非特許文献７】Jones DH, Ley S, Aitken A. Isoforms of 14-3-3 protein can form homo- and heterodimers in vivo and in vitro: implications for function as adapter proteins. FEBS lett. 368 (1995) 55-58.
【非特許文献８】Powell DW, Rane MJ, Joughin BA, Kalmukova R, Hong JH, Tidor B, Dean WL, Pierce WM, Klein JB, Yaffe MB, McLeish KR. Proteomic identification of 14-3-3zeta as a mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 substrate: role in dimer formation and ligand binding. Mol. Cell. Biol. 23 (2003) 5376-5387.
【非特許文献９】Shen YH, Godlewski J, Bronisz A, Zhu J, Comb MJ, Avruch J, Tzivion G. Significance of 14-3-3 Self-Dimerization for Phosphorylation-dependent Target Binding. Mol. Biol. Cell. 14 (2003) 4721-4733.
【非特許文献１０】Jaspert N, Oecking C. Regulatory 14-3-3 proteins bind the atypical motif within the C terminus of the plant plasma membrane H(+)-ATPase via their typical amphipathic groove. 216 (2002) 136-139.
【非特許文献１１】Molecular Biology of Parasitic Protozoa, Edited by Smith DF and Parsons M. IRL PRESS OXFORD UNIVERSITY PRESS (1996) 6-24、75-86、88-107、134-153, 205-222．
【非特許文献１２】Protocols in Molecular Parasitology, Edited by Hide JEMethods in Molecular Biology-21 Humana Press, (1993) 1-13.
【非特許文献１３】Rittinger K, Budman J, Xu J, Volinia S, Cantley LC, Smerdon SJ, Gamblin SJ, Yaffe MB. Structural analysis of 14-3-3 phosphopeptide complexes identifies a dual role for the nuclear export signal of 14-3-3 in ligand binding. Mol. Cell. 4 (1999) 153-166.
【非特許文献１４】Tzivion G, Luo Z, Avruch J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394 (1998) 88-92.
【非特許文献１５】Obsil T, Ghirlando R, Klein DC, Ganguly S, Dyda F. Crystal structure of the 14-3-3zeta:serotonin N-acetyltransferase complex. a role for scaffolding in enzyme regulation. Cell. 105 (2001) 257-267.
【非特許文献１６】Chaudhri M, Scarabel M, Aitken A. Mammalian and yeast 14-3-3 isoforms form distinct patterns of dimers in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300 (2003) 679-685.
【非特許文献１７】Liu D, Bienkowska J, Petosa C, Collier RJ, Fu H, Liddington R. Crystal structure of the zeta isoform of the 14-3-3 protein.Nature. 376 (1995) 191-194.
【非特許文献１８】Xiao B, Smerdon SJ, Jones DH, Dodson GG, Soneji Y, Aitken A, Gamblin SJ. Structure of a 14-3-3 protein and implications for coordination of multiple signalling pathways. Nature. 376 (1995) 188-191.
【非特許文献１９】McEwan NR, Eschenlauer SC, Calza RE, Wallace RJ, Newbold CJ. 19 Protozoal sequences may reveal additional isoforms of the 14-3-3 protein family. Protist. 150 (1999) 257-264.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のような状況の下、真核微生物の増殖等を抑制し、真核微生物に起因する感染症などを治療するための抗真核微生物剤の開発が求められている。本発明は、有効性の高い抗真核微生物剤を効率よくスクリーニングするための方法および有効性の高い抗真核微生物剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ユニークな特性をもつT.bruceiについて、14-3-3タンパク質の解析をすることは14-3-3タンパク質についてのさらなる生物学的情報、さらには治療薬の開発に必要な情報を提供するものと考えた。そこで、本発明者らは、T.bruceiから14-3-3タンパク質の２つのアイソフォームをクローニングし、アイソフォームに特異的な抗体を作製し、PCFとともにBSFにおいてそれらの発現を調べた。さらに、本発明者らは、リン酸化結合モチーフとの結合に加えて、14-3-3タンパク質の最も保存された特徴である二量体化について各種の実験を行った。その結果、単にアミノ酸配列のアライメントを比較検討しただけでは通常予測しがたい、14-3-3タンパク質の二量体形成において極めて重要な部位を新たに見い出すことに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明は、下記、抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法、および抗真核微生物薬剤などを提供する。
〔１〕 14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質を検出する、抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法。
〔２〕 前記Ｎ末端領域が、前記サブユニットのＮ末端側から第１番目のαへリックス領域中に保存されるロイシン部位からＮ末端までの領域である、上記〔１〕に記載の抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法。
〔３〕 前記Ｎ末端領域が、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、上記〔１〕または〔２〕に記載の抗真核微生物薬剤のスクリーニング方法。
〔４〕 前記真核微生物が、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）からなる群より選ばれる真核微生物の少なくとも１種である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の抗真核微生物剤となり得る物質のスクリーニング方法。
〔５〕 14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域に結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する抗真核微生物剤。
［付記１］ 14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域に結合する物質を投与し、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する、真核微生物に起因する疾患の治療方法。
【００１２】
なお、本明細書においては、特に断らない限り、「14-3-3タンパク質」の用語は、二量体を形成した形態を指し、二量体の一構成単位を「サブユニット」という。
また、本明細書において真核微生物とは、真核細胞を有する微生物であり、例えば、糸状菌、酵母、変形菌、担子菌、細胞性の藻類および原生動物などが含まれる。
また、以下特に断らない限り、各配列番号は配列表中の配列番号のことをさす。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、真核微生物の増殖等を抑制する抗真核微生物剤となり得る物質を効率よくスクリーニングすることができる方法が提供され、このスクリーニング方法によれば有効性の高い抗真核微生物剤が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。なお、本発明における生物化学的なあるいは遺伝子工学的な手法を実施するにあたっては、例えば、Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, 第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, New York (2001)、新遺伝子工学ハンドブック（村松正實ら編、羊土社、実験医学別冊、第３版、１９９９年）、タンパク質実験の進め方（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第１版、１９９８年）タンパク質実験ノート（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第２版、１９９９年）、タンパク質実験ハンドブック（竹縄忠臣編集、実験医学別冊、初版、２００３年８月１５日）などのような種々の実験マニュアルの記載が参照される。
【００１５】
本発明の抗真核微生物薬剤のスクリーニング方法（以下、「本発明の薬剤スクリーニング方法」という場合がある）は、14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質を検出するものである。。二量体形成を阻害する物質は、抗真核微生物薬剤として利用可能な蓋然性の高い物質であるが、最終的には臨床的試験など他の試験を経てた上で用いられることが望ましい。本発明のスクリーニング方法により得られた物質は、必要に応じて単離、精製などの処理をしてもよい。また、本発明のスクリーニング方法により得られた物質をさらに化学的に修飾して最終的な抗真核微生物薬剤とすることができる。
【００１６】
14-3-3タンパク質における二量体は、２つのサブユニットにより形成される。二量体はホモダイマーの場合もあるし、ヘテロダイマーの場合もありえる。本発明では、サブユニットの少なくとも一方のＮ末端領域に結合し、二量体形成を阻害する物質を検出する。阻害物質の結合は、結合状態が維持されるものに限られず、一旦Ｎ末端領域に結合し、Ｎ末端領域に化学的な修飾を与えて離れ、付与された化学修飾に起因して二量体の形成を阻害するような物質も含まれる。
【００１７】
本発明の薬剤スクリーニング方法の好ましい一形態としては、Ｎ末端領域として14-3-3タンパク質のＮ末端側から第１番目のαへリックス領域中に保存されるロイシン部位からＮ末端までの領域が用いられる形態などが挙げられる。ここでいう「保存」は分子生物学または遺伝学的な見地において種を越えて保存されているという意味である。14-3-3タンパク質には複数のαへリックスが保存されていることが知られており、第１番目のαへリックス領域とは、最もＮ末端よりに存在するαへリックスの領域を指す。また、14-3-3タンパク質の特徴として、14-3-3タンパク質の第１番目のαへリックスには、ロイシン残基が極めて高い確率で保存されている。
【００１８】
例として、図１に、T.brucei由来のＩ型14-3-3（配列番号１５）、II型14-3-3（配列番号１６）およびヒト14-3-3τ（配列番号１７）のサブユニットのアミノ酸配列を示す。図１に示すように、これら３種の14-3-3サブユニットには、１から９までのαへリックスが含まれている。また、第１番目のαへリックスには、ロイシン残基が保存されている。
【００１９】
本発明者らは、そのロイシン残基からＮ末端までの領域が、二量体の形成に極めて重要な役割を果たしていることを見いだした（下記実施例参照）。このＮ末端領域に結合する物質は、二量体形成を阻害する可能性が極めて高い。
【００２０】
本発明の薬剤スクリーニング方法において用いられるＮ末端領域として具体的には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドが例示される。これらの配列は、下記の真核微生物の14-3-3のＮ末端領域に由来するものである。配列番号１から１４の各配列のペプチドを用いることにより、少なくとも由来元の微生物における14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害することができる可能性が極めて高い。
【００２１】
各配列の由来は次の通りである（かっこ内の番号は、GenBank/EMBL/DDBJあるいはSanger InstituteのデータベースにおけるAccession numberである）。
配列番号１；Leishmania major（LmjF36.3210）
MTETIKWKNVAIQDEVVPRPSDIKLPDDLAEL
配列番号２；Plasmodium falciparum（NP_705504）
MNQYIDNDISVSNKEELIYYIKILNHLGSYDGKNIYEY
配列番号３； Trypanosoma cruzi（Tc00.1047053508851.18）
MAEGIKWHNAAIQDELVPKKSPLEFKLPDSAKEL
配列番号４； Trypanosoma brucei I（AB59827）
MTDCIKWYNAVLLDEVVPKKNLSEFKLPDATKDL
配列番号５； Trypanosoma cruzi（Tc00.1047053）
MAEGIKWHNAAIQDELVPKKSPLEFKLPDSAKEL
配列番号６； Trypanosoma brucei II（AB066565）
MAGFQIPEKREQL
配列番号７； Candida albicans（AF038154.2）
MPASREDS
配列番号８； Leishmania major（LmjF11.0350）
MTNVFKVPEKREEL
配列番号９； Plasmodium falciparum（MAL8P1.69）
MATSEELKQLRCDC
配列番号１０； Plasmodium knowlesi（AF065986.1）
MATSEDLKQLRSDC
配列番号１１； Plasmodium yoeii（AABL01000000）
MATPEELKQLRSDC
配列番号１２； Pneumocystis carinii（AF461162.1）
MTSRENL
配列番号１３； Trypanosoma cruzi（Tc00.1047053506775.80）
MSSFTVPEKREQL
配列番号１４； Toxoplasma gondii（BAA25996）
MAEEIKNLRDEY
【００２２】
また、本発明の薬剤スクリーニング方法は、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）からなる群より選ばれる真核微生物における14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質のスクリーニングに好適である。これらの真核微生物は病原体である。また、14-3-3タンパク質の二量体形成が阻害されると、細胞内における14-3-3タンパク質本来の機能が失われる。14-3-3タンパク質は細胞におけるさまざまな代謝経路、シグナル伝達に関与する物質であり、14-3-3タンパク質の機能停止または機能阻害により、その細胞の生命活動は大きく阻害される。したがって、本発明の薬剤スクリーニング方法により、上記の病原体に起因する各種の感染症に対する予防薬および／または治療薬となり得る物質を発見することができる。
【００２３】
上記の病原体によって引き起こされる感染症は次の通りである。
トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）；アフリカ睡眠病
トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）；シャーガス病
熱帯リーシュマニア（Leishmania major）；旧世界リシューマニア症
トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）；先天性および後天性トキソプラズマ症
熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）；熱帯熱マラリア
ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）；カリニ肺炎
【００２４】
阻害物質は物質としての種類について特に限定はない。阻害物質は、無機化合物であっても有機化合物であってもよい。また阻害物質は、人工的に化学合成したものであってもよいし、生物由来物質などでもよい。阻害物質の候補としては、例えば、ペプチド、低分子量の合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質などの物質が例示される。阻害物質の候補は、例えば、コンビトナリアル・ケミストリリーなどの手法により調製される化合物ライブラリーなどから供給される。化合物ライブラリーを用いて、ハイスループットな検出を行うことにより、新規な阻害物質の発見確率を向上させることができる。
【００２５】
本発明の薬剤スクリーニング方法では、14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質のスクリーニングを行う。14-3-3タンパク質のサブユニットには、Ｎ末端領域を備えているものを用いる。あるいは、Ｎ末端領域のみを利用してもよい。Ｎ末端領域に結合する物質の検出方法は、特に制限はなく、特定のタンパク質との相互作用を検出可能な既知の方法等を採用することができる。また、Ｎ末端領域との結合および二量体の形成阻害を一緒に検出する方法を採用してもよい。
【００２６】
タンパク質の相互作用を検出する方法としては、例えば、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、酵母ツーハイブリッド法、酵母スリーハイブリッド法、ＰＣＡ（例えば、β―ガラクタマーゼを用いたprotein fragment complimentation assay）、プロテインマイクロアッセイ解析、BIAcoreによる解析、ゲルシフト法、アクティビティーゲル法などが例示される。より具体的には、本発明における薬剤スクリーニング方法において用いられる好適形態として、下記の方法が例示される。
【００２７】
BIAcore（「BIAcore」は登録商標）によるスクリーニング法；
二量体形成に重要なＮ−末端可変部位の(保存されていない)アミノ酸配列をペプチド合成機により合成する。合成されたペプチドのＣ末端にビオチン（Biotin）基を導入する。得られたビオチン導入ペプチド（リガンド）をBIAcoreのstreptoavidin-センサーチップへ固定化後、ケミカルライブラリー(リガンドライブラリー)の候補化合物（アナライト）を流す。センサーチップに固定されたリガンドとアナライトとが結合すると、所定波長の反射光の屈折率変化が観測され、センサーグラムとしてアウトプットされる。得られるセンサーグラムに基づき、結合の有無を判断する。
【００２８】
ラジオアイソトープラベリングによるスクリーニング方法；
ペプチドをラジオアイソトープ（RI）でラベルしたものを調製する。ペプチドを合成する際にアイソトープでラベルされたアミノ酸を用いる。ケミカルリガンドがスポットされたフィルターまたはウェルに、このアイソトープラベルされたペプチドを反応させる。反応後、PBS(-)（Phosphate buffered saline(-)）にて洗浄後、結合したペプチドの量をRIのカウントとして定量する。ＲＩのカウントの高いものを結合の阻害剤の候補として回収する。
【００２９】
蛍光ラベルしたペプチドによるスクリーニング法；
ペプチドを蛍光ラベルして、ラジオアイソトープと同様のスクリーニングを行う。結合したペプチド量を蛍光強度として定量する。蛍光強度の高いものを阻害物質の候補とする。蛍光ラベルに用いられる物質としては、例えば、FITC（fluorescein isothiocyanate）RITC（rhodoamine isothiocyanate）、Alexa Fluor 488, 633, 680（Invitrogen社製）などが例示される。
【００３０】
二量体形成の検出法；
二量体の検出方法としては、次のような方法が例示される。
Ｃ末端に異なるTagのついた14-3-3タンパク質を調製する。Tagのついた14-3-3タンパク質を哺乳類細胞293細胞、cos細胞、大腸菌、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液などの発現系で共発現させ、一方のTag抗体で共免疫沈降反応（Co-immunoprecipitation）を行い、他方のTag抗体でウエスタン・ブロット法にて検出する。
【００３１】
二量体形成に必須なアミノ酸の検出；
二量体に必須なアミノ酸の検出方法として、下記のような方法が例示される。
Ｎ末端領域のアミノ酸配列に改変を加えた14-3-3タンパク質を調製する。例えば、マラリア原虫，トリパノソーマ・クルージ，トキソプラズマ，ニューモシスチス・カリニなどの14-3-3タンパク質に、Ｃ末端に異なるTagをつけた14-3-3タンパク質を発現させる。共免疫沈降してきたものをウエスタン・ブロット法にて検出する。Ｎ末端領域における改変部位のことなるタンパク質ごとに14-3-3タンパク質の二量体形成を調べ、二量体形成に必須のアミノ酸を検出する。
【００３２】
本発明は、抗真核微生物阻害剤も提供する。本発明の抗真核微生物阻害剤は、上記薬剤スクリーニング方法により得られる阻害物質である。上記本発明のスクリーニング方法により得られたものは、薬学的に適切な試験等により、さらに安全性などを確認して用いられることが望ましい。上記のように、14-3-3タンパク質の二量体形成は、14-3-3タンパク質が本来の機能を発揮するために極めて重要である場合が多い。すなわち、二量体形成の阻害剤は、14-3-3タンパク質を有する真核微生物の生命活動を大きく阻害する可能性が極めて高い物質である。また、上記のように、真核微生物のなかには重篤な感染症を引き起こす病原体が存在する。本発明の抗真核微生物阻害剤は、これらの病原体が引き起こす疾病に対する効果的な予防および／または治療薬となる可能性が高い。
【００３３】
阻害物質の具体的な候補としては、例えば下記（Ａ）および／または（Ｂ）に記載のペプチドが例示される。
（Ａ）14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域を構成するアミノ酸配列を有するペプチド
（Ｂ）アミノ酸配列が14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域を構成するアミノ酸配列を有するペプチドに置換、欠失、挿入および付加のうち少なくとも１種の変異を導入したペプチド
Ｎ末端領域は、第１番目のαへリックスに保存されているロイシン残基を含むことが望ましい。また、阻害物質の具体的な候補としてさらに具体的には、例えば、アミノ酸配列が配列番号１〜１４のいずれかに記載の配列であるペプチドやこれらに置換、欠失、挿入および付加のいずれかの変異を導入したペプチドなども例示される。
【００３４】
さらに、本発明は、14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域を構成するアミノ酸配列を改変し、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する方法を提供する。本発明者らの研究により、14-3-3タンパク質の二量体形成においては、14-3-3タンパク質のサブユニットのＮ末端領域が極めて重要であることが明らかになった。Ｎ末端領域のアミノ酸配列を改変することにより、二量体を形成できない14-3-3タンパク質のサブユニットが得られる。
【００３５】
アミノ酸配列の改変は、既知の方法により行うことができる。例えば、改変を加えようとするアミノ酸配列に対応する塩基配列を変更して、部位特異的にアミノ酸の配列を変更することができる。また、放射線や薬品等による突然変異導入などによってもアミノ酸の改変を行うことができる。より具体的には、例えば、Quick change site directed Mutagenesis kit（Stratagene社製）などの市販品を用いて行うことができる。
【実施例】
【００３６】
［実験例１］ T. bruceiからの14-3-3遺伝子のクローニング
BSF（Blood Stream Form）型427をddYマウスにおいて生育させ、Protocols in Molecular Parasitology, Edited by Hide JE Methods in Molecular Biology-21 Humana Press, (1993) 1-13（非特許文献１２）に記載の方法に従って精製した。20 mlのTRIzol Reagent(Invitrogen社製)を用い、約１×１０9cellsから全RNAを精製し、ｍRNAをMACS mRNA isolation kit（Miltenyi Biotec 社製）を用いて精製した。１μｇの全RNAまたは３μｇのｍRNAからCap-finder oligonucleotide oligo-dt(Clontech社製)を用いてｃDNAを合成した。酵母、植物および哺乳動物間における14-3-3の保存アミノ酸配列であるKMKGDY（配列番号１８）およびVFYYEI（配列番号１９）に基づき、プライマー；5'-AARATGAARGGNGAYTAY-3'（配列番号２０）および5'-DATYTCRTARTARAANAC-3'（配列番号２１）を設計した。
【００３７】
PCRを次の条件下で実施した；９５℃、１分；９５℃、１５秒、３０サイクル（４８℃、３０秒；および７２℃、１５秒）加えて、９５℃、１５秒、１０サイクル（４５℃、３０秒；および７２℃、１５秒）、続いて７２℃、７分。PCR産物をpGEM-T Easy（Promega社製）にサブクローニングし、ABI310シーケンサー（Applied Biosystems社製）を用いて１１クローンの配列を分析した。T. brucei のミニエクソン（mini exon）配列、5'-CGCTATTATTAGAACAGTTTCTGTACTATATTTG-3'（配列番号２２）およびPCR産物から得られた5'-GGTGCCAGTGAACTGTTCGCCA-3'（配列番号２３）を用いて、5'RACE（Rapid amplification of cDNA ends）を行った。また、T. brucei のCap-finder（Clontech社製）のPCRプライマー配列、およびPCR産物から得られた5'-CACGGAGGTGGCGAACAGTTCA-3'（配列番号２４）を用いて、3'RACE（Rapid amplification of cDNA ends）を行った。
【００３８】
5'および3'RACE産物をクローニングし、その配列を調べ、上記のようにして14-3-3タンパク質の全長コード配列が得られたことを確認した。得られた14-3-3タンパク質の全長コード配列は、λ BluesSTAR BamHI kit（Novagen社製）を用いて構築されたプロサイクリック型427菌株のゲノムライブラリーのスクリーニングに用いた。λ BluesSTAR BamHI kit（Novagen社製）は、ゲノムDNAをBamHIにより完全に消化し、約９kbの断片群をλ BluesSTAR にライゲーションしたものである。
【００３９】
低ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で、５つの弱いシグナルおよび３つの強いシグナルが得られ、そのプラークを精製した。ハイブリダイゼーションの条件は、Alphos Direct Labelling and Detection KitのプロトコールのWash条件を５５℃から５０℃に変更し、それ以外の点は上記キットに添付のプロトコールに従った。これらのファージクローンからin vivo で切り出すことにより、pBluesSTARプラスミドクローンを得た。合成pBluesSTARプラスミドDNAをPstIまたはSalIを含む数種の制限酵素を用いて消化し、さまざまな制限消化パターンを調製して、14-3-3タンパク質のコード配列を用いてサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。
【００４０】
14-3-3タンパク質のコード配列と弱くハイブリダイズしたPstIによる消化フラグメントおよび強くハイブリダイズしたSalIによる消化フラグメントは単離して、pGEM 3Zf（＋）（Promega社製）にサブクローニングした。配列は、EN::TN ＜KAN-2＞ Insertion kit（EPICENTRE TECHNOLOGIES社製）を用いて特定した。T. brucei cDNAライブラリーをλZipLox、NotI-SalI Arms（GIBCO BRL社製）を用いて構築した。２種の異なる14-3-3タンパク質のコード配列を用いたハイブリダイゼーションによって、クローンを得た。14-3-3タンパク質のコード配列もこれらのクローンを用いて検証した。
【００４１】
GST、MAL-14-3-3およびpcDNA3-6myc 14-3-3発現ベクターの構築
I型、II型およびヒト14-3-3τ（以下、ヒト14-3-3τを「τ型」ともいう）の14-3-3 cDNAを、下記のプライマーをそれぞれ用いてLA Taq（TAKARA Bio社製）により増幅した。
I,センス鎖：CGAATTCATGACGGACTGCATCAAGT（配列番号２５）
I,アンチセンス鎖：GGTCTCCACCCTTGTCAGTT（配列番号２６）
II,センス鎖：CGGAATTCATGGCGGGCTTTCAAATAC（配列番号２７）
II,アンチセンス鎖：GAGCTCACTCCAATTCCTCCATC（配列番号２８）
τ，センス鎖：GAATTCATGGAGAAGACTGAGCTGATCC（配列番号２９）
τ，アンチセンス鎖：CTTAGTTTTCAGCCCCTTCTGCCGCAT（配列番号３０）
【００４２】
PCR産物をpGEM-T Easy vectorにサブクローニングし、配列を調べた。EcoRIで消化したcDNAフラグメントのそれぞれをpMAL-c2X（New England Biolabs社製）、pGEX-1λT（Amersham Biosciences社製）およびpcDNA3-6myc vector（Kunihiro Tsuchida, University of Tokushima）にサブクローニングした。pcDNA3-6myc vectorは、pcDNA3 vector（Invitorogen社製）のBamHIサイトおよびEcoRIサイトの間にmycを６つ連結したものを組み込んだベクターである。
【００４３】
pcDNA3.1 TOPO I、IIおよびτSTOP(＋)または(−)の構築
構築物を作製するための、PCR用プライマーの一覧を下記に示す。
Ｉ，センス鎖：CACCATGGACGGACTGCATCAAGTGGTACAA（配列番号３１）
Ｉ，アンチセンス STOP（−）：GTTCACGGGTTGCTCGTCAGTCCAGA（配列番号３２）
Ｉ，アンチセンス STOP（＋）：GTCAGTTCACGGGTTGCTCGTCAGTCCAGA（配列番号３３）
II，センス鎖：CACCATGGCGGGCTTTCAAATACCTGA（配列番号３４）
II，アンチセンス STOP（−）：CTCCAATTCCTCCATCGCAGTTC（配列番号３５）
II，アンチセンス STOP（＋）：CTCACTCCAATTCCTCCATCGCAGTTC（配列番号３６）
τ，センス鎖：CACCATGGAGAAGACTGAGCTGATCC（配列番号３７）
τ，アンチセンス鎖 STOP（−）：GTTTTCAGCCCCTTCTGCCGCAT（配列番号３８）
τ，アンチセンス鎖 STOP（＋）：TTAGTTTTCAGCCCCTTCTGCCGCAT（配列番号３９）
【００４４】
TOPOクローニングリアクションをpcDNA3.1 Directional TOPO Expression Kit（Invitrogen社製）に添付のプロトコールに従って行った。
【００４５】
pcDNA3.1 TOPO-MS.Tag vectorの構築
構築用の６種のオリゴヌクレオチドを下記に一覧として示す。
配列番号４０：ATCGCCTCTATGGAGCAAAAGCTCATTTCTGAAGAGGACTTGAATGA
配列番号４１：ATTTCATTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCCATAGAGGCGAT
配列番号４２：AATGGAGCAAAAGCTCATTTCTGAAGAGGACTTGAATGAAGCCTCTGC
配列番号４３：TTTGGCAGAGGCTTCATTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCC
配列番号４４：CAAAGAAACCGCCGCCGCTAAATTTGAACGCCAGCACATCGACAGCTAGC
配列番号４５：TCGAGCTAGCTGTCGATGTGCTGGCGTTCAAATTTAGCGGCGGCGGTTTC
【００４６】
相補的な２つのオリゴヌクレオチドをそれぞれアニールし、ライゲーションした。ライゲーションして得られたDNAフラグメントを４％低溶解アガロースゲルから単離し、pcDNA3.1 TOPO I、IIおよびτ STOP(-)のEcoRVおよびXhoI部位にサブクローニングした。得られたベクターは、哺乳動物細胞にトランスフェクションするとC末端タグ配列：IASMEQKLISEEDLNEMEQKLISEEDLNEASAKETAAAKFERQHIDS（2xMyc-Tag & S-Tag、配列番号４６）を含むタンパク質を発現する。
【００４７】
pcDNA3.1(+)SM-Tag Vectorの構築
pcDNA3.1(+)（Invitrogen社製）のＮ末端にS-Tag（Novagen社製）Myc-Tagを附属させたタグを導入するために、４種のオリゴヌクレオチド、
配列番号４７：GAAGCTTGCCACCATGGGTGTTACCAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCG
配列番号４８：AAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCAC
配列番号４９：TTTTGCTCCATGCTGCCCCCGGTTCCGCTGTCGATGTGCTGGCGTTCGA
配列番号５０：CGAATTCCCCTTTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCCATGCTG
を設計した。Ex-Tagをアニーリングおよびこれら４種のオリゴヌクレオチドの伸長反応（extention reaction）に用いた。生成物をpGEM-T Easyにサブクローニングした。得られたプラスミドをHindIIIおよびEcoRIを用いて切断し、pcDNA3.1(+)の対応部位にサブクローニングした。得られたベクターは、哺乳動物細胞にトランスフェクションすると、アミノ末端タグ配列としてMGVTKETAAAKFERQHIDSGTGGSMEQKLISEEDLKGEF（S-Tag & Myc-Tag、配列番号５１）を備えたタンパク質を発現する。pGEM-T Easy 14-3-3、I型、II型およびτ型のEcoRI部位挿入物をpcDNA3.1(+) SM-TagのEcoRI部位に挿入した。
【００４８】
14-3-3キメラ発現の構築
pcDNA3 6myc-I、pcDNA3 6myc-IIおよびpcDNA3 6myc-τを用いて、14-3-3キメラ発現構築物を、以下のようにして作製した。14-3-3 I型および／または14-3-3 II型のドメインを14-3-3 τ型のドメインに入れ替えるために、pcDNA3 6mycプラスミド内のβ−ラクタマーゼ遺伝子用のセンスおよびアンチセンスプライマーを利用した。配列5'-CCCTTCCGGCTGGCTGGTT-3'（配列番号５２）および5'-CCGAGCGCAGAAGTGGTCCT-3'（配列番号５３）の２つのプライマーを使用し、PCRおよびライゲーション反応により完全長のプラスミドを増幅できる。
【００４９】
例えば、異なる組み合わせのβ−ラクタマーゼ遺伝子のセンスプライマーおよび14-3-3 cDNAアンチセンスプライマー、並びに、β−ラクタマーゼ遺伝子のアンチセンスプライマーおよび14-3-3 cDNAのセンスプライマーを用いて、14-3-3 cDNAを加えたベクター配列を増幅した。DpnIで消化後、TAE/アガロースゲル電気泳動により分離された異なるアイソフォームのcDNAに由来する２種のフラグメントをライゲーションした。DH5αコンピテントセルを形質転換に用いた。それぞれのキメラの配列を注意深く検証した。14-3-3キメラ発現構築物のために用いたプライマーの一覧を下記に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
組換えタンパク質の発現および分析
DH5αおよび／またはBL21内に組換えタンパク質を発現させ、製造業者が添付するプロトコールに従って精製した。
【００５２】
そのタンパク質を１０〜２０％または４〜２０％勾配のSDS-PAGE（第一化学社製、日本）によって分離し、電気的負荷をかけてPVDFメンブラン（ミリポア社製）に移した。メンブランは３％無脂肪乳またはBlock Ace（大日本製薬社製）のいずれかを用いて覆った。ウェスタンブロット用の一次抗体、抗-Myc抗体（９E11）(Oncogene社製)、抗-V5モノクローナル抗体（Invitrogen社製）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）ラベルされたSタンパク質（Novagen社製）を購入した。完全フロイントアジュバントのみを促進剤として用いて、精製GST-Iおよび精製GST-IIタンパク質をそれぞれ２５０μgずつ、ウィスターラット（Wister rat）に免疫感作して、Trypanosoma 14-3-3 I型およびII型に対する一次抗体を得た。他の動物タンパク質への最小クロスリアクションを伴う二次抗体、Peroxidase-AffiniPure F (ab')2 Fragment Goat anti-Rat Fc(gamma)(Code 112-036-071)、Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey AntiRabbt IgG(H+L)(Code 711-036-152)をすべてJackson ImmunoResearch社から購入した。購入した一次抗体（（Anti-Myc,V5,14-3-3:K19(Santa Cruz)、14-3-3τ：C-17は、製造業者が添付したプロトコールに従って使用した。抗−Ｉ型、II型ラット血清を２０％Block Aceを含むTTBS（50 mM Tris pH 7.5, 150 mM, NaCl, 0.02% Tween 20）を用いて１００００倍に希釈した。すべての二次抗体はTTBSを用いて１００００倍に希釈した。ブロットは、Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate（PIERCE社製）を用いＸ線フィルムに可視化した。
【００５３】
トランスフェクションのために、293および293T細胞をダルベッコ・モディファイド・イーグル培地（DMEM）に10％FCSおよび20μg/mlのゲンタマイシン（GIBCO BRL社製）を追加したものを用いて育成し、FuGENE 6 トランスフェクション試薬（Roche社製）を用いた標準トランスフェクションの16時間前に、5x105セルを6ウェルの培養皿に播種した。
【００５４】
トランスフェクションから２日後、細胞を氷冷PBS（-）（シグマ社製）で３回洗浄し、100μｇのNP-40 溶解緩衝液（0.5%, NP-40, 150mM, NaCl, 10 mM, Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM, NaVO4, protease inhibitor cocktail(Roche社製)）を用いて溶解した。溶解物を低速および高速遠心分離で２度洗浄した。洗浄して得られたもののうち10μｌはウェスタンブロット分析（Input）のために保管しておき、400μｌのNP-40 溶解緩衝液をそれぞれの試料に添加した。それぞれの試料について、１μｇの抗-Myc抗体 ５μｌのrec-protain G beads（ZYMED社製）を用いた免疫沈降処理、または、20μｌのS-protain beads（Novagen社製）を用いた S-Tag プルダウンアッセイを行った。沈降させた試料を３回洗浄し、空のAuto-Seq G50（Amersham Bioscience社製）に移し、5000 rpmで回転させ、NP-40溶解緩衝液を排出した。溶解緩衝液を排出した後、2-メルカプトエタノールを含む20μｌの１×SDS 試料緩衝液を添加し、５分間静置後、5000 rpmで１分間回転させた。そして、試料を煮沸し、SDS-PAGEに供し、続いて上記と同様にウェスタンブロッティングを行った。
【００５５】
T.brucei T7ポリメラーゼベース発現ベクターの構築
アルドラーゼスプライシングアクセプター配列（Aldolase splicing acceptor sequence）を、SmaIおよびHindIIIを用いてpT11-bsから単離し、pSP73（Promega社製）に挿入し、得られたプラスミドをpKI-0と命名した。また、配列番号７２および７３として示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをアニーリングして2xTetOカセットを作製した。
5'-TCGAGTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGC-3'（配列番号７２）
5'-GCTCTATCACTGATAGGGAGATCTCTATCACTGATAGGGAC-3'（配列番号７３）
【００５６】
アニールしたオリゴヌクレオチドをpKI-0に挿入し、さらに、T7ターミネーターオリゴヌクレオチド（配列番号７４および７５）をアニールしたものをBamHIおよびEcoRVサイトに挿入した。
5'-GATCCCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTAT-3'（配列番号７４）
5'-ATACAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGG-3'（配列番号７５）
【００５７】
得られたプラスミドはT7プロモーターとプロモーター：5'-ATACAAAAAACCCCTCAAGAC-3'
（配列番号７６）を用いてPCRにより増幅した。PCR産物をpBluescript II KS(+)のBssHIIの平滑切断サイトに挿入し、pKI-2と命名した。ｐKI-2をM13フォワードおよびリバースプライマーを用いてPCRにより増幅し、PCR産物をBamHIで切断した。切断して得られたT7プロモーターおよび2xTetOを含むフラグメントは、pLew100のKpnI平滑切断サイトおよびBamHIサイトに挿入した。StuIで消化したのち平滑化すると共にNheIで消化して、pLew111から、3'末端の非翻訳領域および2xT7ターミネーターを単離した。このフラグメントをpLew100のT7プロモーター、2xTetOおよびアルドラーゼSASが組み込まれている平滑切断されたBamHIサイトおよびNheIサイトに挿入した。得られたプラスミド構築物はpKI-6と命名した。pKI-7は、pKI-0のXhoI-HindIIIフラグメントを交換して作製し、下記の実験に用いた。
【００５８】
PKI-7を用いたＮ末端6myc-I、IIおよびτ発現 29-13 PCF細胞クローンの確立および分析
pKI-7をBamHIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化したものをさらにHindIIIで消化した。HindIIIおよびEcoRVで消化した断片をpcDNA3 6myc-I、IIおよびτから単離した。エレクトロポレーション法によって、pKI-7 6myc-I、IIおよびτを29-13 PCF 細胞にトランスフェクションした。29-13 PCF 細胞はTetRおよびT7ポリメラーゼを発現する細胞である。トランスフェクションの一日後に、MULTIWELL 96ウエル（Bacton Dickenson, FALCON社製）中でフレオマイシン（Phleomaycine）セレクションを行った。２週間以内に各プレートにつき５〜１０クローンが単離された。タンパク質の発現は、抗-Myc、I、IIおよびτ抗体を用いたウェスタンブロットにより確認し、高発現のクローンを以下の実験に用いた。
【００５９】
Myc-ペプチドの溶出物を除いた１×１０8セルを用い、上記の手順と同様にして免疫沈降法およびウェスタンブロットを行った。溶出物は４−２０％ SDS-PAGEにかけ、さらに銀染色を行った。これらの溶出物およびＩ型、II型およびτ型に対する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。その結果、Ｉ型とII型とのヘテロダイムライゼーションおよびI型とI型とのホモダイムライゼーションがトリパノソーマの細胞内においても生じることが確認された。
【００６０】
結果
本発明者らは、既に、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）427株のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーから14-3-3タンパク質の２つのアイソフォームをクローニングした。それらは、14-3-3 I型およびII型と命名され、accession No. AB059827およびAB066565として、GenBank/EMBL/DDBJに登録されている。低ストリンジェントな条件下でのゲノムライブラリースクリーニングおよび14-3-3配列に由来する数種のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ産物の直接的な配列分析（direct sequence analysis）によって、T. bruceiに存在するアイソフォームは２種のみであると確認された。配列は、後日、Sanger Institute Blast Serverにaccession No. TRYPtp 25a10ec07.plk_63として閲覧可能になった。サーバーに示されるとおり、両者の配列は、第１１染色体において発見された。
【００６１】
しかし、これらのアイソフォームについては、現時点までは生化学的および生物学的特性について確認されてこなかった。スタートコドンは、哺乳動物から酵母にわたり同定された他の14-3-3タンパク質のホモログによって決定し、本発明者らが特定したスタートコドンの上流には、スタートコドンとなり得る配列は見出されなかった。演繹されるアミノ酸配列には、ホスホセリンバインディングの両親媒性溝を形成すると予測される部位、Ｉ型においては、７７Ｋ、８４Ｒ、８８Ｒ、１５０Ｋ、１５４Ｄ、１５７Ｒ、１５８Ｙ、１９９Ｌ、２０３Ｖ、２４３Ｌ、２４７Ｌ、および２５５Ｗ、II型においては、５６Ｋ、６３Ｒ、６７Ｒ、１２８Ｋ、１３２Ｄ、１３５Ｒ、１３６Ｙ、１７４Ｌ、１７８Ｖ、２２１Ｌ、２２５Ｌ、および２３３Ｗが、すべて保存されている（図１参照）。
【００６２】
核移行シグナル（Nuclear exporting signal(NES)、非特許文献１３）は、α−へリックス９（図１参照）に存在する。これらのデータは、進化の過程においても保存された14-3-3タンパク質の特徴、すなわち、
１）通常、二量体の形態で存在する、
２）配列に依存して、ホスホセリンを含むモチーフに結合する、
３）核移行シグナルを含む、
に合致するものである。
【００６３】
そのため14-3-3タンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用を増強する受容体分子として作用することができ、おそらくは、多様なパートナーのホスホセリンを含む配列モチーフに結合することを介して、標的タンパク質の細胞局在化、酵素の活性化または阻害を制御する。
【００６４】
プロサイクリックフォーム（ＰＣＦ）およびブラッドストリームフォーム（ＢＳＦ）における14-3-3タンパク質の発現を確認するために、ラットをGST-Iタンパク質、GST-IIタンパク質（図２ａ）でそれぞれ免疫した。I型、II型およびヒト14-3-3τの精製したマルトースバインディング融合タンパク質（MAL）を用いて、ウエスタンブロッティングにより抗体の特異性を調査した。結果を図２ｂに示す。驚くべきことに、追加免疫（booster immunization）を行わなかった場合には、４５％程度の高い同一性を備えた配列を有するにもかかわらず（図１参照）、GST-Iタンパク質またはGST-IIタンパク質で免疫して得られた２つの抗体の交差反応は生じなかった。
【００６５】
そこで、PCF細胞の溶菌液を用いたウエスタン・ブロットにより、これらの抗体の特異性について調べた。両抗体ともに、若干のバックグラウンドを伴うものの、14-3-3 I型およびII型の相対分子量が30KDであることが明らかとなった（図２ｃ）。また、PCF細胞についてのノーザン・ブロッティング解析により、Ｉ型については2.2kbの転写物が、II型については3.8kbの転写物が検出された（図２ｄ）。II型の転写物の量は、I型の転写物のほぼ３倍に相当した（図２ｄ）。さらに、定量的ウエスタン・ブロット（Quantitative Western Blot）解析により、PCF細胞においては、II型よりもI型の転写物量のほうが多いことが示された（I型：107 ng/1x106cells、II型：70ng/1x106cells）。これに対し、BSF細胞においてはI型とII型の転写物量はほぼ同等である（I型：92ng/1x106cells、II型：84ng/1x106cells）。理論的には、１細胞における14-3-3タンパク質の発現量は、1x106−2x106分子である（図２ｅ）。ノーザンおよびウエスタンブロッティングの結果を併せて考慮すれば、14-3-3タンパク質の発現レベルは、トリパノソーマの多くのタンパク質と同様に、転写後制御されることが示された。抗Ｉ型およびII型抗体を用いて、ＰＣＦ細胞の免疫染色（immunostaining）を行ったところ、両アイソフォームともに、主として細胞質に局在化することが確認され、このことは予測された核移行シグナル（NES）がin vivoで機能することを示唆するものであった。
【００６６】
14-3-3タンパク質の二量体化の重要性は、まだほんの２、３のケースで示されていたに過ぎない。例えば、in vivoにおける14-3-3タンパク質の二量体は、Rafキナーゼ活性を維持するために必要とされること（非特許文献１４）、さらに、14-3-3タンパク質とセロトニン・Ｎ−アセチルトランスフェラーゼとの共結晶の結晶構造から、酵素の２つの部位への二量体14-3-3タンパク質の結合が、触媒活性を増強するコンフォーメーションの変化を誘導するために必要であること（非特許文献１５）などが報告されている。この報告においては、14-3-3タンパク質の重要な特徴である二量体化の正確なメカニズムに焦点を当てている。そこで、本発明者らは、上記材料および方法において述べたとおり、293細胞における二量体の検出のために、使い勝手の良い発現ベクターpcDNA3.1-SM.TagまたはpcDNA3.1TOPO-MS.Tagを創作した。これらのベクターは、抗-Myc抗体およびＳ−タンパク質にそれぞれ結合するMyc-TagおよびS-Tagを含んでいる。
【００６７】
Ｓ−タンパク質ビーズを用いたプルダウンアッセイ（pull-down assay）は、Ｓ−タンパク質が104アミノ酸と小サイズであるため、抗体と比べて立体障害を受けにくい。加えて、Myc-TagおよびS-Tagはともに、α−へリックスコンフォーメーションをとり得るため、結合パートナーの中での構造変化が少ない。そこで、構築物pcDNA3.1 TOPO I、IIまたはτ、並びに、pcDNA3.1TOPO-MS.Tag I、IIまたはτを共トランスフェクトし、可能性のあるすべての二量体について、Ｓ−タンパク質を用いたプルダウンアッセイを行った。その結果を図３に示す。図３に示されるように、I型およびII型の双方にI-MS.Tagタンパク質が結合する。また、II-MS.Tagタンパク質はI型にのみ結合する。しかし、τ型はI型およびII型のいずれとも結合しなかった。
【００６８】
なお、上記実験とは別に行った実験において、pcDNA3.1-SM.Tag I、IIまたはτ、並びに、pcDNA3.1 TOPO I、IIまたはτSTOP(+)を用いた場合でも、同様の結合パターンが確認された。また、これに対し、pcDNA3-6mycII構築物を用いた場合、6Myc-IIおよびI型そのものとの間では、二量体化は確認されたなかった。すなわち、これらのことから、Ｎ末端の６つのmyc配列に結合する抗体のため14-3-3タンパク質に立体障害が生じた可能性があり得ると推定された。
【００６９】
そこで、MS.およびSM.Tagベクターを用いて検討した。さらに、そのタンパク質のＣ末端のＶ５抗体認識配列を形成させるpcDNA3.1 TOPO I、IIおよびτ(-)を用い、二量体化の試験を行い、一致する結果を得た。また、最近の報告では、哺乳類および酵母の14-3-3アイソフォームもまた特徴的な二量体のパターンを示すことが示されている（非特許文献１６）。
【００７０】
本発明者らは次に、二量体化に必要なアミノ酸配列について試験を行った。本発明者らはT. brucei 14-3-3タンパク質（I型、II型）とτ型は二量体を形成しないことを明らかにしたため、さらに、T. brucei 14-3-3タンパク質とヒト由来のτ型とのキメラ構築物を作製し、それらが二量体を形成するか試験した。図４に示すように、すべての種類の構築物を作製したが、二量体化に必要な配列を特定するための試験にはＮｏ．３、４、５、９、１０および１１の構築物だけを用いた。その理由は、これまでに哺乳類の14-3-3アイソフォームの結晶構造解析において、１番から４番へリックス部分を含むＮ末端アミノ酸配列が二量体化を担うことが明らかにされているからである（非特許文献１７、１８）。
【００７１】
抗−I型および抗−II型抗体による検出では、Ｓ−タンパク質プルダウン、SM-Tag.Iα３＋II、およびSM-Tag.IIα３＋Iを示すレーンではバンドは観察されたなかった（図５）。このデータは、T. brucei 14-3-3タンパク質の両アイソフォームにおいてへリックス１−４を含むＮ末端配列がヘテロ二量体形成に必須であることを示している。
【００７２】
さらに本発明者らは、他の哺乳類の14-3-3アイソフォームがT.brucei 14-3-3タンパク質と二量体を形成することができるか否かについて調査した。pcDNA3.1TOPO-MS.Tag IおよびIIをそれぞれトランスフェクトした293T細胞の溶解物を用いて、Ｓ−タンパク質プルダウンアッセイを行った。14-3-3アイソフォームをすべて認識するK19抗体を用いてウエスタンブロッティングによる検出を行った。結果を図６に示す。この結果から、MS-Tag.Iは、ある種の哺乳類のアイソフォームと低い親和性で結合するが、MS-Tag.IIは結合しないことが明らかとなった。このことは、I型およびII型の双方において、おそらくはＮ末端領域がこれらの二量体形成に重要な役割を果たしているというユニークな特性を示唆するものである。このデータは、II型はアイソフォームのいずれとも二量体を形成しないことから、二量体化のシステムの細かな点が哺乳類のアイソフォームにおけるメカニズムと異なる形態である可能性があることを示唆している。T.brucei 14-3-3タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を哺乳類のものと比較したところ、αへリックス１の直前にある１つのプロリン残基が特徴的であることが明らかになった。
【００７３】
哺乳類の14-3-3タンパク質はT.bruceiの14-3-3タンパク質とほとんど結合しないというデータから、各アイソフォームにおけるスタートコドンからプロリン残基までの配列が、二量体を形成するパートナーとの嗜好性を決める要因であると推測された。
【００７４】
そこで、本発明者らは、Ｎ末端領域内に存在するプロリンの部位がスタートコドンの先頭位置となるようにＩ型およびII型のＮ末端配列が削除され、さらにこのプロリンがメチオニンに置換されるように塩基配列を改変したcDNAを作製した。そのcDNAを293T細胞にトランスフェクトし、二量体を形成するか否かをプルダウンアッセイにより調べた。図７に結果を示す。図７中、例えば「P→M II-V5 + I-MS」で示されるカラムは、新たにN末端となるプロリン（P）の位置のアミノ酸残基をメチオニン（M）に置換したII型にV5抗体を結合させた複合体と、I型およびMS.Tagの複合体との組み合わせについて実験した結果を示す。驚くべきことに、Ｉ-V5（P→M）として示されるＮ末端を除去したＩ型14-3-3、II-V5（P→M）として示されるＮ末端を除去したII型14-3-3のいずれも二量体を形成しなかった（図７）。このデータから、II型におけるＮ末端配列の７つのアミノ酸；I型では２８アミノ酸、で構成される配列が、II型の二量体形成において極めて重要であることが示唆された。
【００７５】
さらに、II型における二量体形成に必須のアミノ酸配列をアラニンスキャニング法にて特定した。図８に示すように、II型における二量体形成に必須なアミノ酸をアラニンスキャニング法を用いて決定した結果、ロイシン（Ｌ）からＮ末端までの１３個のアミノ酸の中フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびロイシン（Ｌ）うちの１つでもアラニン（Ａ）に変わると、もはや二量体形成能が消失することが明らかとなった。
【００７６】
アラニンスキャニング法によればポリペプチドの立体構造を変えないように所定のアミノ酸残基を置換することが可能である。通常、立体構造が変動しないのであればサブユニット同士の結合が起きても不思議はない。しかし、上記の結果は、Ｎ末端領域の特定のアミノ酸残基が置換されると、サブユニットが本来の立体構造をとり得る状態であっても、サブユニット同士の結合が阻害される場合があることを示すものである。すなわち、立体構造の変化を生じさせるか否かにかかわらず、Ｎ末端領域の特定部位のアミノ酸残基に何らかの影響が及べば二量体化は阻害され得る。したがって、Ｎ末端領域に何らかの物質が結合した場合にも、上記のような特定部位のアミノ酸残基本来の機能が働かず二量体化が阻害される蓋然性は極めて高い。
【００７７】
ヒト由来のτ型には、Ｉ型およびII型におけるＮ末端からプロリン（Ｐ）までの領域に対応する部位がないため、Ｎ末端からプロリン（Ｐ）までのフェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）およびプロリン（Ｐ）をターゲットに結合し、二量体化を阻害するような物質が抗真核生物薬剤としてはより好ましいと考えられる。
【００７８】
II型のこの短い配列に結合するペプチドおよび／または小型のリガンドは、T. brucei の14-3-3タンパク質の二量体化を阻害する一方で、哺乳類の14-3-3タンパク質については阻害しないと推定される。このことは、14-3-3タンパク質がT. bruceiのユニークな創薬ターゲットとなるという新規なアイディアを導く。このＮ末端の特徴的な配列に結合し、二量体化を阻害するリガンドの探索を現在進めているところである。さらに、14-3-3タンパク質がすべての真核生物において発現するものであり、またそれらのＮ末端配列は非高等真核生物において多種多様である（非特許文献１９）ことから、14-3-3タンパク質の二量体化は、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）を含むすべての真核病原菌に対する潜在的な治療ターゲットとなるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、真核病原菌などに対する予防薬、治療薬等の開発に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】T.brucei由来のＩ型14-3-3、II型14-3-3およびヒト14-3-3τのサブユニットのアミノ酸配列の対比図である。
【図２ａ】MAL複合体、GST複合体の電気泳動像を示す図である。
【図２ｂ】抗体の特異性を示すウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図２ｃ】正常血清とＩ型およびII型で免疫した血清のトリパノソーマライセートにおける反応性をみたウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図２ｄ】Ｉ型およびII型の転写物量を調査したノーザンブロットの結果を示す図である。
【図２ｅ】１個の細胞におけるＩ型およびII型の14-3-3タンパク質の発現量を示す図である。
【図３】S-タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図４】I型、II型のそれぞれとτ型とのキメラ構築物の設計図を示す図である。
【図５】S-タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図６】S-タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図７】N末端領域を一部削除したI型およびII型の14-3-3タンパク質について、S-タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図８】II型において、二量体形成に必要なアミノ酸を同定するために行ったアラニンスキャニングの結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号２０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４０：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４１：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４２：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４３：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４４：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４５：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４６：２ｘＭｙｃ−Ｔａｇ ＆ Ｓ−Ｔａｇ
配列番号４７：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＭ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４８：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＭ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４９：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＭ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号５０：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＭ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号５１：Ｓ−Ｔａｇ ＆ Ｍｙｃ−Ｔａｇ
配列番号５３：ＰＣＲプライマー
配列番号５４：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５５：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５６：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５７：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５８：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５９：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６０：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６１：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６２：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６３：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６４：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６５：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６６：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６７：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６８：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６９：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号７０：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号７１：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号７２：ｐＫＩ−０構築用オリゴヌクレオチド
配列番号７３：ｐＫＩ−０構築用オリゴヌクレオチド
配列番号７４：Ｔ７ターミネーター
配列番号７５：Ｔ７ターミネーター
配列番号７６：ＰＣＲプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真核微生物剤のスクリーニング方法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
14-3-3タンパク質は、相対分子量約30KDの二量体酸性タンパク質である。このタンパク質は、細胞周期、情報伝達、細胞内転送／ターゲティング、転写、宿主防御、細胞死などの多くの生物学的経路に関与する分子シャペロンとして、ほぼすべての真核生物組織活動において発現すると考えられている。１００を越える相互作用タンパク質がリストアップされており、ほとんどの相互作用は、保存性の高いリン酸化セリン／スレオニンペプチドモチーフを介する（例えば、非特許文献１、２、３および４）。
【０００３】
ほとんどの生物種において、１つ以上の14-3-3タンパク質のアイソフォームを有する。哺乳類では少なくとも７種のアイソフォームがあり、植物では少なくとも１５種のアイソフォームがある（例えば非特許文献５）。したがって、14-3-3タンパク質の二量体の組み合わせは14-3-3タンパク質二量体分子に多様性を賦与している可能性がある。いくつかの14-3-3タンパク質の結合パートナーは、二量体の形成あるいは単量体の形成でその結合に変化を受けないが、結合標的タンパク質全般的に見ると、その結合の強度に差異がみられる。（例えば非特許文献６）。
【０００４】
14-3-3タンパク質は、ほとんど二量体を形成して存在していることが報告されているが（非特許文献７）、最近では、MAPKAPK2、プロテインキナーゼB/Aktおよびスフィンゴシン依存性キナーゼなどのいくつかのキナーゼによるセリン残基のリン酸化が、細胞内における14-3-3タンパク質の二量体化を阻止することも報告されている（非特許文献８）。さらに、二量体化した14-3-3タンパク質は特定部位においてリン酸化を伴うc-Raf1およびDAF-16との結合を生じるが、単量体の場合にはリン酸化とは独立にc-Raf1およびDAF-16と結合する（例えば非特許文献９）。さらに、植物においては、二量体の形成にはフシコシン受容体に結合することが厳格に要求される（例えば非特許文献１０）。このように、14-3-3タンパク質の二量体化において、分子的にメカニズムを解明することは重要である。
【０００５】
ところで、アフリカなどの諸国においては、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）など、多くの真核微生物による感染症が重大な問題となっている。例えば、１０億人以上および２０億頭以上の畜牛が、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）の感染または感染の危険にさらされており、アフリカの経済および健康問題に重大な損害を与える結果を招いている。
【０００６】
T.bruceiはツェツェバエ（testse fly）が刺すことにより感染し、そのため２つの特徴的なライフサイクルを有する。ひとつは、プロサイクリック型（procyclic（insect） form：ＰＣＦ）であり、もう一つは血流型（blood stream(animal) form：ＢＳＦ）である。この病原体は、リボソーム配列に基づく進化系統樹においてホモ・サピエンスから最も離れた真核生物である。T.bruceiについては、RNA編集、キネトプラスト（kinetoplast）DNA複製、RNA転写−スプライシング、およびグリコシルフォスファチジルイノシトール（Glycosylphosphatidyl Inositol）タンパク質アンカーなどを含む、多くの生物学的特徴が明らかにされている（例えば非特許文献１１）。
【０００７】
しかしながら、これらの真核微生物による感染症に対する特効薬は、未だに開発されておらず、早急な開発が求められている。
【０００８】
【非特許文献１】Tzivion G, Shen YH, Zhu J. 14-3-3 proteins; bringing new definitions to scaffolding, . Oncogene. 20 (2001) 6331-6338.
【非特許文献２】Tzivion G, Avruch J. 14-3-3 proteins: active cofactors in cellular regulation by serine/threonine phosphorylation. J. Biol. Chem. 277 (2002) 3061-3064.
【非特許文献３】Yaffe MB. How do 14-3-3 proteins work-- Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis. FEBS Lett. 513 (2002) 53-57.
【非特許文献４】van Hemert MJ, Steensma HY, van Heusden GP. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. Bioessays. 23 (2001) 936-946.
【非特許文献５】Rosenquist M, Alsterfjord M, Larsson C, Sommarin M. Data mining the Arabidopsis genome reveals fifteen 14-3-3 genes. Expression is demonstrated for two out of five novel genes. Plant. Physiol. 127 (2001) 142-149.
【非特許文献６】Tzivion G, Luo ZJ, Avruch J. Calyculin A-induced vimentin phosphorylation sequesters 14-3-3 and displaces other 14-3-3 partners in vivo. J. Biol. Chem. 275 (2000) 29772-29778.
【非特許文献７】Jones DH, Ley S, Aitken A. Isoforms of 14-3-3 protein can form homo- and heterodimers in vivo and in vitro: implications for function as adapter proteins. FEBS lett. 368 (1995) 55-58.
【非特許文献８】Powell DW, Rane MJ, Joughin BA, Kalmukova R, Hong JH, Tidor B, Dean WL, Pierce WM, Klein JB, Yaffe MB, McLeish KR. Proteomic identification of 14-3-3zeta as a mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 substrate: role in dimer formation and ligand binding. Mol. Cell. Biol. 23 (2003) 5376-5387.
【非特許文献９】Shen YH, Godlewski J, Bronisz A, Zhu J, Comb MJ, Avruch J, Tzivion G. Significance of 14-3-3 Self-Dimerization for Phosphorylation-dependent Target Binding. Mol. Biol. Cell. 14 (2003) 4721-4733.
【非特許文献１０】Jaspert N, Oecking C. Regulatory 14-3-3 proteins bind the atypical motif within the C terminus of the plant plasma membrane H(+)-ATPase via their typical amphipathic groove. 216 (2002) 136-139.
【非特許文献１１】Molecular Biology of Parasitic Protozoa, Edited by Smith DF and Parsons M. IRL PRESS OXFORD UNIVERSITY PRESS (1996) 6-24、75-86、88-107、134-153, 205-222．
【非特許文献１２】Protocols in Molecular Parasitology, Edited by Hide JEMethods in Molecular Biology-21 Humana Press, (1993) 1-13.
【非特許文献１３】Rittinger K, Budman J, Xu J, Volinia S, Cantley LC, Smerdon SJ, Gamblin SJ, Yaffe MB. Structural analysis of 14-3-3 phosphopeptide complexes identifies a dual role for the nuclear export signal of 14-3-3 in ligand binding. Mol. Cell. 4 (1999) 153-166.
【非特許文献１４】Tzivion G, Luo Z, Avruch J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature. 394 (1998) 88-92.
【非特許文献１５】Obsil T, Ghirlando R, Klein DC, Ganguly S, Dyda F. Crystal structure of the 14-3-3zeta:serotonin N-acetyltransferase complex. a role for scaffolding in enzyme regulation. Cell. 105 (2001) 257-267.
【非特許文献１６】Chaudhri M, Scarabel M, Aitken A. Mammalian and yeast 14-3-3 isoforms form distinct patterns of dimers in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300 (2003) 679-685.
【非特許文献１７】Liu D, Bienkowska J, Petosa C, Collier RJ, Fu H, Liddington R. Crystal structure of the zeta isoform of the 14-3-3 protein.Nature. 376 (1995) 191-194.
【非特許文献１８】Xiao B, Smerdon SJ, Jones DH, Dodson GG, Soneji Y, Aitken A, Gamblin SJ. Structure of a 14-3-3 protein and implications for coordination of multiple signalling pathways. Nature. 376 (1995) 188-191.
【非特許文献１９】McEwan NR, Eschenlauer SC, Calza RE, Wallace RJ, Newbold CJ. 19 Protozoal sequences may reveal additional isoforms of the 14-3-3 protein family. Protist. 150 (1999) 257-264.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のような状況の下、真核微生物の増殖等を抑制し、真核微生物に起因する感染症などを治療するための抗真核微生物剤の開発が求められている。本発明は、有効性の高い抗真核微生物剤を効率よくスクリーニングするための方法および有効性の高い抗真核微生物剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ユニークな特性をもつT.bruceiについて、14-3-3タンパク質の解析をすることは14-3-3タンパク質についてのさらなる生物学的情報、さらには治療薬の開発に必要な情報を提供するものと考えた。そこで、本発明者らは、T.bruceiから14-3-3タンパク質の２つのアイソフォームをクローニングし、アイソフォームに特異的な抗体を作製し、PCFとともにBSFにおいてそれらの発現を調べた。さらに、本発明者らは、リン酸化結合モチーフとの結合に加えて、14-3-3タンパク質の最も保存された特徴である二量体化について各種の実験を行った。その結果、単にアミノ酸配列のアライメントを比較検討しただけでは通常予測しがたい、14-3-3タンパク質の二量体形成において極めて重要な部位を新たに見い出すことに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明は、下記、抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法、および抗真核微生物薬剤などを提供する。
〔１〕 14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質を検出する、抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法。
〔２〕 前記Ｎ末端領域が、前記サブユニットのＮ末端側から第１番目のαへリックス領域中に保存されるロイシン部位からＮ末端までの領域である、上記〔１〕に記載の抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法。
〔３〕 前記Ｎ末端領域が、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、上記〔１〕または〔２〕に記載の抗真核微生物薬剤のスクリーニング方法。
〔４〕 前記真核微生物が、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）からなる群より選ばれる真核微生物の少なくとも１種である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の抗真核微生物剤となり得る物質のスクリーニング方法。
〔５〕 14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域に結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する抗真核微生物剤。
［付記１］ 14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域に結合する物質を投与し、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する、真核微生物に起因する疾患の治療方法。
【００１２】
なお、本明細書においては、特に断らない限り、「14-3-3タンパク質」の用語は、二量体を形成した形態を指し、二量体の一構成単位を「サブユニット」という。
また、本明細書において真核微生物とは、真核細胞を有する微生物であり、例えば、糸状菌、酵母、変形菌、担子菌、細胞性の藻類および原生動物などが含まれる。
また、以下特に断らない限り、各配列番号は配列表中の配列番号のことをさす。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、真核微生物の増殖等を抑制する抗真核微生物剤となり得る物質を効率よくスクリーニングすることができる方法が提供され、このスクリーニング方法によれば有効性の高い抗真核微生物剤が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。なお、本発明における生物化学的なあるいは遺伝子工学的な手法を実施するにあたっては、例えば、Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, 第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, New York (2001)、新遺伝子工学ハンドブック（村松正實ら編、羊土社、実験医学別冊、第３版、１９９９年）、タンパク質実験の進め方（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第１版、１９９８年）タンパク質実験ノート（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第２版、１９９９年）、タンパク質実験ハンドブック（竹縄忠臣編集、実験医学別冊、初版、２００３年８月１５日）などのような種々の実験マニュアルの記載が参照される。
【００１５】
本発明の抗真核微生物薬剤のスクリーニング方法（以下、「本発明の薬剤スクリーニング方法」という場合がある）は、14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質を検出するものである。。二量体形成を阻害する物質は、抗真核微生物薬剤として利用可能な蓋然性の高い物質であるが、最終的には臨床的試験など他の試験を経てた上で用いられることが望ましい。本発明のスクリーニング方法により得られた物質は、必要に応じて単離、精製などの処理をしてもよい。また、本発明のスクリーニング方法により得られた物質をさらに化学的に修飾して最終的な抗真核微生物薬剤とすることができる。
【００１６】
14-3-3タンパク質における二量体は、２つのサブユニットにより形成される。二量体はホモダイマーの場合もあるし、ヘテロダイマーの場合もありえる。本発明では、サブユニットの少なくとも一方のＮ末端領域に結合し、二量体形成を阻害する物質を検出する。阻害物質の結合は、結合状態が維持されるものに限られず、一旦Ｎ末端領域に結合し、Ｎ末端領域に化学的な修飾を与えて離れ、付与された化学修飾に起因して二量体の形成を阻害するような物質も含まれる。
【００１７】
本発明の薬剤スクリーニング方法の好ましい一形態としては、Ｎ末端領域として14-3-3タンパク質のＮ末端側から第１番目のαへリックス領域中に保存されるロイシン部位からＮ末端までの領域が用いられる形態などが挙げられる。ここでいう「保存」は分子生物学または遺伝学的な見地において種を越えて保存されているという意味である。14-3-3タンパク質には複数のαへリックスが保存されていることが知られており、第１番目のαへリックス領域とは、最もＮ末端よりに存在するαへリックスの領域を指す。また、14-3-3タンパク質の特徴として、14-3-3タンパク質の第１番目のαへリックスには、ロイシン残基が極めて高い確率で保存されている。
【００１８】
例として、図１に、T.brucei由来のＩ型14-3-3（配列番号１５）、II型14-3-3（配列番号１６）およびヒト14-3-3τ（配列番号１７）のサブユニットのアミノ酸配列を示す。図１に示すように、これら３種の14-3-3サブユニットには、１から９までのαへリックスが含まれている。また、第１番目のαへリックスには、ロイシン残基が保存されている。
【００１９】
本発明者らは、そのロイシン残基からＮ末端までの領域が、二量体の形成に極めて重要な役割を果たしていることを見いだした（下記実施例参照）。このＮ末端領域に結合する物質は、二量体形成を阻害する可能性が極めて高い。
【００２０】
本発明の薬剤スクリーニング方法において用いられるＮ末端領域として具体的には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドが例示される。これらの配列は、下記の真核微生物の14-3-3のＮ末端領域に由来するものである。配列番号１から１４の各配列のペプチドを用いることにより、少なくとも由来元の微生物における14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害することができる可能性が極めて高い。
【００２１】
各配列の由来は次の通りである（かっこ内の番号は、GenBank/EMBL/DDBJあるいはSanger InstituteのデータベースにおけるAccession numberである）。
配列番号１；Leishmania major（LmjF36.3210）
MTETIKWKNVAIQDEVVPRPSDIKLPDDLAEL
配列番号２；Plasmodium falciparum（NP_705504）
MNQYIDNDISVSNKEELIYYIKILNHLGSYDGKNIYEY
配列番号３； Trypanosoma cruzi（Tc00.1047053508851.18）
MAEGIKWHNAAIQDELVPKKSPLEFKLPDSAKEL
配列番号４； Trypanosoma brucei I（AB59827）
MTDCIKWYNAVLLDEVVPKKNLSEFKLPDATKDL
配列番号５； Trypanosoma cruzi（Tc00.1047053）
MAEGIKWHNAAIQDELVPKKSPLEFKLPDSAKEL
配列番号６； Trypanosoma brucei II（AB066565）
MAGFQIPEKREQL
配列番号７； Candida albicans（AF038154.2）
MPASREDS
配列番号８； Leishmania major（LmjF11.0350）
MTNVFKVPEKREEL
配列番号９； Plasmodium falciparum（MAL8P1.69）
MATSEELKQLRCDC
配列番号１０； Plasmodium knowlesi（AF065986.1）
MATSEDLKQLRSDC
配列番号１１； Plasmodium yoeii（AABL01000000）
MATPEELKQLRSDC
配列番号１２； Pneumocystis carinii（AF461162.1）
MTSRENL
配列番号１３； Trypanosoma cruzi（Tc00.1047053506775.80）
MSSFTVPEKREQL
配列番号１４； Toxoplasma gondii（BAA25996）
MAEEIKNLRDEY
【００２２】
また、本発明の薬剤スクリーニング方法は、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）からなる群より選ばれる真核微生物における14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質のスクリーニングに好適である。これらの真核微生物は病原体である。また、14-3-3タンパク質の二量体形成が阻害されると、細胞内における14-3-3タンパク質本来の機能が失われる。14-3-3タンパク質は細胞におけるさまざまな代謝経路、シグナル伝達に関与する物質であり、14-3-3タンパク質の機能停止または機能阻害により、その細胞の生命活動は大きく阻害される。したがって、本発明の薬剤スクリーニング方法により、上記の病原体に起因する各種の感染症に対する予防薬および／または治療薬となり得る物質を発見することができる。
【００２３】
上記の病原体によって引き起こされる感染症は次の通りである。
トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）；アフリカ睡眠病
トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）；シャーガス病
熱帯リーシュマニア（Leishmania major）；旧世界リシューマニア症
トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）；先天性および後天性トキソプラズマ症
熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）；熱帯熱マラリア
ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）；カリニ肺炎
【００２４】
阻害物質は物質としての種類について特に限定はない。阻害物質は、無機化合物であっても有機化合物であってもよい。また阻害物質は、人工的に化学合成したものであってもよいし、生物由来物質などでもよい。阻害物質の候補としては、例えば、ペプチド、低分子量の合成化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質などの物質が例示される。阻害物質の候補は、例えば、コンビトナリアル・ケミストリリーなどの手法により調製される化合物ライブラリーなどから供給される。化合物ライブラリーを用いて、ハイスループットな検出を行うことにより、新規な阻害物質の発見確率を向上させることができる。
【００２５】
本発明の薬剤スクリーニング方法では、14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質のスクリーニングを行う。14-3-3タンパク質のサブユニットには、Ｎ末端領域を備えているものを用いる。あるいは、Ｎ末端領域のみを利用してもよい。Ｎ末端領域に結合する物質の検出方法は、特に制限はなく、特定のタンパク質との相互作用を検出可能な既知の方法等を採用することができる。また、Ｎ末端領域との結合および二量体の形成阻害を一緒に検出する方法を採用してもよい。
【００２６】
タンパク質の相互作用を検出する方法としては、例えば、免疫沈降法、プルダウンアッセイ、酵母ツーハイブリッド法、酵母スリーハイブリッド法、ＰＣＡ（例えば、β―ガラクタマーゼを用いたprotein fragment complimentation assay）、プロテインマイクロアッセイ解析、BIAcoreによる解析、ゲルシフト法、アクティビティーゲル法などが例示される。より具体的には、本発明における薬剤スクリーニング方法において用いられる好適形態として、下記の方法が例示される。
【００２７】
BIAcore（「BIAcore」は登録商標）によるスクリーニング法；
二量体形成に重要なＮ−末端可変部位の(保存されていない)アミノ酸配列をペプチド合成機により合成する。合成されたペプチドのＣ末端にビオチン（Biotin）基を導入する。得られたビオチン導入ペプチド（リガンド）をBIAcoreのstreptoavidin-センサーチップへ固定化後、ケミカルライブラリー(リガンドライブラリー)の候補化合物（アナライト）を流す。センサーチップに固定されたリガンドとアナライトとが結合すると、所定波長の反射光の屈折率変化が観測され、センサーグラムとしてアウトプットされる。得られるセンサーグラムに基づき、結合の有無を判断する。
【００２８】
ラジオアイソトープラベリングによるスクリーニング方法；
ペプチドをラジオアイソトープ（RI）でラベルしたものを調製する。ペプチドを合成する際にアイソトープでラベルされたアミノ酸を用いる。ケミカルリガンドがスポットされたフィルターまたはウェルに、このアイソトープラベルされたペプチドを反応させる。反応後、PBS(-)（Phosphate buffered saline(-)）にて洗浄後、結合したペプチドの量をRIのカウントとして定量する。ＲＩのカウントの高いものを結合の阻害剤の候補として回収する。
【００２９】
蛍光ラベルしたペプチドによるスクリーニング法；
ペプチドを蛍光ラベルして、ラジオアイソトープと同様のスクリーニングを行う。結合したペプチド量を蛍光強度として定量する。蛍光強度の高いものを阻害物質の候補とする。蛍光ラベルに用いられる物質としては、例えば、FITC（fluorescein isothiocyanate）RITC（rhodoamine isothiocyanate）、Alexa Fluor 488, 633, 680（Invitrogen社製）などが例示される。
【００３０】
二量体形成の検出法；
二量体の検出方法としては、次のような方法が例示される。
Ｃ末端に異なるTagのついた14-3-3タンパク質を調製する。Tagのついた14-3-3タンパク質を哺乳類細胞293細胞、cos細胞、大腸菌、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液などの発現系で共発現させ、一方のTag抗体で共免疫沈降反応（Co-immunoprecipitation）を行い、他方のTag抗体でウエスタン・ブロット法にて検出する。
【００３１】
二量体形成に必須なアミノ酸の検出；
二量体に必須なアミノ酸の検出方法として、下記のような方法が例示される。
Ｎ末端領域のアミノ酸配列に改変を加えた14-3-3タンパク質を調製する。例えば、マラリア原虫，トリパノソーマ・クルージ，トキソプラズマ，ニューモシスチス・カリニなどの14-3-3タンパク質に、Ｃ末端に異なるTagをつけた14-3-3タンパク質を発現させる。共免疫沈降してきたものをウエスタン・ブロット法にて検出する。Ｎ末端領域における改変部位のことなるタンパク質ごとに14-3-3タンパク質の二量体形成を調べ、二量体形成に必須のアミノ酸を検出する。
【００３２】
本発明は、抗真核微生物阻害剤も提供する。本発明の抗真核微生物阻害剤は、上記薬剤スクリーニング方法により得られる阻害物質である。上記本発明のスクリーニング方法により得られたものは、薬学的に適切な試験等により、さらに安全性などを確認して用いられることが望ましい。上記のように、14-3-3タンパク質の二量体形成は、14-3-3タンパク質が本来の機能を発揮するために極めて重要である場合が多い。すなわち、二量体形成の阻害剤は、14-3-3タンパク質を有する真核微生物の生命活動を大きく阻害する可能性が極めて高い物質である。また、上記のように、真核微生物のなかには重篤な感染症を引き起こす病原体が存在する。本発明の抗真核微生物阻害剤は、これらの病原体が引き起こす疾病に対する効果的な予防および／または治療薬となる可能性が高い。
【００３３】
阻害物質の具体的な候補としては、例えば下記（Ａ）および／または（Ｂ）に記載のペプチドが例示される。
（Ａ）14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域を構成するアミノ酸配列を有するペプチド
（Ｂ）アミノ酸配列が14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域を構成するアミノ酸配列を有するペプチドに置換、欠失、挿入および付加のうち少なくとも１種の変異を導入したペプチド
Ｎ末端領域は、第１番目のαへリックスに保存されているロイシン残基を含むことが望ましい。また、阻害物質の具体的な候補としてさらに具体的には、例えば、アミノ酸配列が配列番号１〜１４のいずれかに記載の配列であるペプチドやこれらに置換、欠失、挿入および付加のいずれかの変異を導入したペプチドなども例示される。
【００３４】
さらに、本発明は、14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域を構成するアミノ酸配列を改変し、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する方法を提供する。本発明者らの研究により、14-3-3タンパク質の二量体形成においては、14-3-3タンパク質のサブユニットのＮ末端領域が極めて重要であることが明らかになった。Ｎ末端領域のアミノ酸配列を改変することにより、二量体を形成できない14-3-3タンパク質のサブユニットが得られる。
【００３５】
アミノ酸配列の改変は、既知の方法により行うことができる。例えば、改変を加えようとするアミノ酸配列に対応する塩基配列を変更して、部位特異的にアミノ酸の配列を変更することができる。また、放射線や薬品等による突然変異導入などによってもアミノ酸の改変を行うことができる。より具体的には、例えば、Quick change site directed Mutagenesis kit（Stratagene社製）などの市販品を用いて行うことができる。
【実施例】
【００３６】
［実験例１］ T. bruceiからの14-3-3遺伝子のクローニング
BSF（Blood Stream Form）型427をddYマウスにおいて生育させ、Protocols in Molecular Parasitology, Edited by Hide JE Methods in Molecular Biology-21 Humana Press, (1993) 1-13（非特許文献１２）に記載の方法に従って精製した。20 mlのTRIzol Reagent(Invitrogen社製)を用い、約１×１０9cellsから全RNAを精製し、ｍRNAをMACS mRNA isolation kit（Miltenyi Biotec 社製）を用いて精製した。１μｇの全RNAまたは３μｇのｍRNAからCap-finder oligonucleotide oligo-dt(Clontech社製)を用いてｃDNAを合成した。酵母、植物および哺乳動物間における14-3-3の保存アミノ酸配列であるKMKGDY（配列番号１８）およびVFYYEI（配列番号１９）に基づき、プライマー；5'-AARATGAARGGNGAYTAY-3'（配列番号２０）および5'-DATYTCRTARTARAANAC-3'（配列番号２１）を設計した。
【００３７】
PCRを次の条件下で実施した；９５℃、１分；９５℃、１５秒、３０サイクル（４８℃、３０秒；および７２℃、１５秒）加えて、９５℃、１５秒、１０サイクル（４５℃、３０秒；および７２℃、１５秒）、続いて７２℃、７分。PCR産物をpGEM-T Easy（Promega社製）にサブクローニングし、ABI310シーケンサー（Applied Biosystems社製）を用いて１１クローンの配列を分析した。T. brucei のミニエクソン（mini exon）配列、5'-CGCTATTATTAGAACAGTTTCTGTACTATATTTG-3'（配列番号２２）およびPCR産物から得られた5'-GGTGCCAGTGAACTGTTCGCCA-3'（配列番号２３）を用いて、5'RACE（Rapid amplification of cDNA ends）を行った。また、T. brucei のCap-finder（Clontech社製）のPCRプライマー配列、およびPCR産物から得られた5'-CACGGAGGTGGCGAACAGTTCA-3'（配列番号２４）を用いて、3'RACE（Rapid amplification of cDNA ends）を行った。
【００３８】
5'および3'RACE産物をクローニングし、その配列を調べ、上記のようにして14-3-3タンパク質の全長コード配列が得られたことを確認した。得られた14-3-3タンパク質の全長コード配列は、λ BluesSTAR BamHI kit（Novagen社製）を用いて構築されたプロサイクリック型427菌株のゲノムライブラリーのスクリーニングに用いた。λ BluesSTAR BamHI kit（Novagen社製）は、ゲノムDNAをBamHIにより完全に消化し、約９kbの断片群をλ BluesSTAR にライゲーションしたものである。
【００３９】
低ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で、５つの弱いシグナルおよび３つの強いシグナルが得られ、そのプラークを精製した。ハイブリダイゼーションの条件は、Alphos Direct Labelling and Detection KitのプロトコールのWash条件を５５℃から５０℃に変更し、それ以外の点は上記キットに添付のプロトコールに従った。これらのファージクローンからin vivo で切り出すことにより、pBluesSTARプラスミドクローンを得た。合成pBluesSTARプラスミドDNAをPstIまたはSalIを含む数種の制限酵素を用いて消化し、さまざまな制限消化パターンを調製して、14-3-3タンパク質のコード配列を用いてサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。
【００４０】
14-3-3タンパク質のコード配列と弱くハイブリダイズしたPstIによる消化フラグメントおよび強くハイブリダイズしたSalIによる消化フラグメントは単離して、pGEM 3Zf（＋）（Promega社製）にサブクローニングした。配列は、EN::TN ＜KAN-2＞ Insertion kit（EPICENTRE TECHNOLOGIES社製）を用いて特定した。T. brucei cDNAライブラリーをλZipLox、NotI-SalI Arms（GIBCO BRL社製）を用いて構築した。２種の異なる14-3-3タンパク質のコード配列を用いたハイブリダイゼーションによって、クローンを得た。14-3-3タンパク質のコード配列もこれらのクローンを用いて検証した。
【００４１】
GST、MAL-14-3-3およびpcDNA3-6myc 14-3-3発現ベクターの構築
I型、II型およびヒト14-3-3τ（以下、ヒト14-3-3τを「τ型」ともいう）の14-3-3 cDNAを、下記のプライマーをそれぞれ用いてLA Taq（TAKARA Bio社製）により増幅した。
I,センス鎖：CGAATTCATGACGGACTGCATCAAGT（配列番号２５）
I,アンチセンス鎖：GGTCTCCACCCTTGTCAGTT（配列番号２６）
II,センス鎖：CGGAATTCATGGCGGGCTTTCAAATAC（配列番号２７）
II,アンチセンス鎖：GAGCTCACTCCAATTCCTCCATC（配列番号２８）
τ，センス鎖：GAATTCATGGAGAAGACTGAGCTGATCC（配列番号２９）
τ，アンチセンス鎖：CTTAGTTTTCAGCCCCTTCTGCCGCAT（配列番号３０）
【００４２】
PCR産物をpGEM-T Easy vectorにサブクローニングし、配列を調べた。EcoRIで消化したcDNAフラグメントのそれぞれをpMAL-c2X（New England Biolabs社製）、pGEX-1λT（Amersham Biosciences社製）およびpcDNA3-6myc vector（Kunihiro Tsuchida, University of Tokushima）にサブクローニングした。pcDNA3-6myc vectorは、pcDNA3 vector（Invitorogen社製）のBamHIサイトおよびEcoRIサイトの間にmycを６つ連結したものを組み込んだベクターである。
【００４３】
pcDNA3.1 TOPO I、IIおよびτSTOP(＋)または(−)の構築
構築物を作製するための、PCR用プライマーの一覧を下記に示す。
Ｉ，センス鎖：CACCATGGACGGACTGCATCAAGTGGTACAA（配列番号３１）
Ｉ，アンチセンス STOP（−）：GTTCACGGGTTGCTCGTCAGTCCAGA（配列番号３２）
Ｉ，アンチセンス STOP（＋）：GTCAGTTCACGGGTTGCTCGTCAGTCCAGA（配列番号３３）
II，センス鎖：CACCATGGCGGGCTTTCAAATACCTGA（配列番号３４）
II，アンチセンス STOP（−）：CTCCAATTCCTCCATCGCAGTTC（配列番号３５）
II，アンチセンス STOP（＋）：CTCACTCCAATTCCTCCATCGCAGTTC（配列番号３６）
τ，センス鎖：CACCATGGAGAAGACTGAGCTGATCC（配列番号３７）
τ，アンチセンス鎖 STOP（−）：GTTTTCAGCCCCTTCTGCCGCAT（配列番号３８）
τ，アンチセンス鎖 STOP（＋）：TTAGTTTTCAGCCCCTTCTGCCGCAT（配列番号３９）
【００４４】
TOPOクローニングリアクションをpcDNA3.1 Directional TOPO Expression Kit（Invitrogen社製）に添付のプロトコールに従って行った。
【００４５】
pcDNA3.1 TOPO-MS.Tag vectorの構築
構築用の６種のオリゴヌクレオチドを下記に一覧として示す。
配列番号４０：ATCGCCTCTATGGAGCAAAAGCTCATTTCTGAAGAGGACTTGAATGA
配列番号４１：ATTTCATTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCCATAGAGGCGAT
配列番号４２：AATGGAGCAAAAGCTCATTTCTGAAGAGGACTTGAATGAAGCCTCTGC
配列番号４３：TTTGGCAGAGGCTTCATTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCC
配列番号４４：CAAAGAAACCGCCGCCGCTAAATTTGAACGCCAGCACATCGACAGCTAGC
配列番号４５：TCGAGCTAGCTGTCGATGTGCTGGCGTTCAAATTTAGCGGCGGCGGTTTC
【００４６】
相補的な２つのオリゴヌクレオチドをそれぞれアニールし、ライゲーションした。ライゲーションして得られたDNAフラグメントを４％低溶解アガロースゲルから単離し、pcDNA3.1 TOPO I、IIおよびτ STOP(-)のEcoRVおよびXhoI部位にサブクローニングした。得られたベクターは、哺乳動物細胞にトランスフェクションするとC末端タグ配列：IASMEQKLISEEDLNEMEQKLISEEDLNEASAKETAAAKFERQHIDS（2xMyc-Tag & S-Tag、配列番号４６）を含むタンパク質を発現する。
【００４７】
pcDNA3.1(+)SM-Tag Vectorの構築
pcDNA3.1(+)（Invitrogen社製）のＮ末端にS-Tag（Novagen社製）Myc-Tagを附属させたタグを導入するために、４種のオリゴヌクレオチド、
配列番号４７：GAAGCTTGCCACCATGGGTGTTACCAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCG
配列番号４８：AAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCAC
配列番号４９：TTTTGCTCCATGCTGCCCCCGGTTCCGCTGTCGATGTGCTGGCGTTCGA
配列番号５０：CGAATTCCCCTTTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCCATGCTG
を設計した。Ex-Tagをアニーリングおよびこれら４種のオリゴヌクレオチドの伸長反応（extention reaction）に用いた。生成物をpGEM-T Easyにサブクローニングした。得られたプラスミドをHindIIIおよびEcoRIを用いて切断し、pcDNA3.1(+)の対応部位にサブクローニングした。得られたベクターは、哺乳動物細胞にトランスフェクションすると、アミノ末端タグ配列としてMGVTKETAAAKFERQHIDSGTGGSMEQKLISEEDLKGEF（S-Tag & Myc-Tag、配列番号５１）を備えたタンパク質を発現する。pGEM-T Easy 14-3-3、I型、II型およびτ型のEcoRI部位挿入物をpcDNA3.1(+) SM-TagのEcoRI部位に挿入した。
【００４８】
14-3-3キメラ発現の構築
pcDNA3 6myc-I、pcDNA3 6myc-IIおよびpcDNA3 6myc-τを用いて、14-3-3キメラ発現構築物を、以下のようにして作製した。14-3-3 I型および／または14-3-3 II型のドメインを14-3-3 τ型のドメインに入れ替えるために、pcDNA3 6mycプラスミド内のβ−ラクタマーゼ遺伝子用のセンスおよびアンチセンスプライマーを利用した。配列5'-CCCTTCCGGCTGGCTGGTT-3'（配列番号５２）および5'-CCGAGCGCAGAAGTGGTCCT-3'（配列番号５３）の２つのプライマーを使用し、PCRおよびライゲーション反応により完全長のプラスミドを増幅できる。
【００４９】
例えば、異なる組み合わせのβ−ラクタマーゼ遺伝子のセンスプライマーおよび14-3-3 cDNAアンチセンスプライマー、並びに、β−ラクタマーゼ遺伝子のアンチセンスプライマーおよび14-3-3 cDNAのセンスプライマーを用いて、14-3-3 cDNAを加えたベクター配列を増幅した。DpnIで消化後、TAE/アガロースゲル電気泳動により分離された異なるアイソフォームのcDNAに由来する２種のフラグメントをライゲーションした。DH5αコンピテントセルを形質転換に用いた。それぞれのキメラの配列を注意深く検証した。14-3-3キメラ発現構築物のために用いたプライマーの一覧を下記に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
組換えタンパク質の発現および分析
DH5αおよび／またはBL21内に組換えタンパク質を発現させ、製造業者が添付するプロトコールに従って精製した。
【００５２】
そのタンパク質を１０〜２０％または４〜２０％勾配のSDS-PAGE（第一化学社製、日本）によって分離し、電気的負荷をかけてPVDFメンブラン（ミリポア社製）に移した。メンブランは３％無脂肪乳またはBlock Ace（大日本製薬社製）のいずれかを用いて覆った。ウェスタンブロット用の一次抗体、抗-Myc抗体（９E11）(Oncogene社製)、抗-V5モノクローナル抗体（Invitrogen社製）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）ラベルされたSタンパク質（Novagen社製）を購入した。完全フロイントアジュバントのみを促進剤として用いて、精製GST-Iおよび精製GST-IIタンパク質をそれぞれ２５０μgずつ、ウィスターラット（Wister rat）に免疫感作して、Trypanosoma 14-3-3 I型およびII型に対する一次抗体を得た。他の動物タンパク質への最小クロスリアクションを伴う二次抗体、Peroxidase-AffiniPure F (ab')2 Fragment Goat anti-Rat Fc(gamma)(Code 112-036-071)、Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey AntiRabbt IgG(H+L)(Code 711-036-152)をすべてJackson ImmunoResearch社から購入した。購入した一次抗体（（Anti-Myc,V5,14-3-3:K19(Santa Cruz)、14-3-3τ：C-17は、製造業者が添付したプロトコールに従って使用した。抗−Ｉ型、II型ラット血清を２０％Block Aceを含むTTBS（50 mM Tris pH 7.5, 150 mM, NaCl, 0.02% Tween 20）を用いて１００００倍に希釈した。すべての二次抗体はTTBSを用いて１００００倍に希釈した。ブロットは、Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate（PIERCE社製）を用いＸ線フィルムに可視化した。
【００５３】
トランスフェクションのために、293および293T細胞をダルベッコ・モディファイド・イーグル培地（DMEM）に10％FCSおよび20μg/mlのゲンタマイシン（GIBCO BRL社製）を追加したものを用いて育成し、FuGENE 6 トランスフェクション試薬（Roche社製）を用いた標準トランスフェクションの16時間前に、5x105セルを6ウェルの培養皿に播種した。
【００５４】
トランスフェクションから２日後、細胞を氷冷PBS（-）（シグマ社製）で３回洗浄し、100μｇのNP-40 溶解緩衝液（0.5%, NP-40, 150mM, NaCl, 10 mM, Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM, NaVO4, protease inhibitor cocktail(Roche社製)）を用いて溶解した。溶解物を低速および高速遠心分離で２度洗浄した。洗浄して得られたもののうち10μｌはウェスタンブロット分析（Input）のために保管しておき、400μｌのNP-40 溶解緩衝液をそれぞれの試料に添加した。それぞれの試料について、１μｇの抗-Myc抗体 ５μｌのrec-protain G beads（ZYMED社製）を用いた免疫沈降処理、または、20μｌのS-protain beads（Novagen社製）を用いた S-Tag プルダウンアッセイを行った。沈降させた試料を３回洗浄し、空のAuto-Seq G50（Amersham Bioscience社製）に移し、5000 rpmで回転させ、NP-40溶解緩衝液を排出した。溶解緩衝液を排出した後、2-メルカプトエタノールを含む20μｌの１×SDS 試料緩衝液を添加し、５分間静置後、5000 rpmで１分間回転させた。そして、試料を煮沸し、SDS-PAGEに供し、続いて上記と同様にウェスタンブロッティングを行った。
【００５５】
T.brucei T7ポリメラーゼベース発現ベクターの構築
アルドラーゼスプライシングアクセプター配列（Aldolase splicing acceptor sequence）を、SmaIおよびHindIIIを用いてpT11-bsから単離し、pSP73（Promega社製）に挿入し、得られたプラスミドをpKI-0と命名した。また、配列番号７２および７３として示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをアニーリングして2xTetOカセットを作製した。
5'-TCGAGTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGC-3'（配列番号７２）
5'-GCTCTATCACTGATAGGGAGATCTCTATCACTGATAGGGAC-3'（配列番号７３）
【００５６】
アニールしたオリゴヌクレオチドをpKI-0に挿入し、さらに、T7ターミネーターオリゴヌクレオチド（配列番号７４および７５）をアニールしたものをBamHIおよびEcoRVサイトに挿入した。
5'-GATCCCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTAT-3'（配列番号７４）
5'-ATACAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGG-3'（配列番号７５）
【００５７】
得られたプラスミドはT7プロモーターとプロモーター：5'-ATACAAAAAACCCCTCAAGAC-3'
（配列番号７６）を用いてPCRにより増幅した。PCR産物をpBluescript II KS(+)のBssHIIの平滑切断サイトに挿入し、pKI-2と命名した。ｐKI-2をM13フォワードおよびリバースプライマーを用いてPCRにより増幅し、PCR産物をBamHIで切断した。切断して得られたT7プロモーターおよび2xTetOを含むフラグメントは、pLew100のKpnI平滑切断サイトおよびBamHIサイトに挿入した。StuIで消化したのち平滑化すると共にNheIで消化して、pLew111から、3'末端の非翻訳領域および2xT7ターミネーターを単離した。このフラグメントをpLew100のT7プロモーター、2xTetOおよびアルドラーゼSASが組み込まれている平滑切断されたBamHIサイトおよびNheIサイトに挿入した。得られたプラスミド構築物はpKI-6と命名した。pKI-7は、pKI-0のXhoI-HindIIIフラグメントを交換して作製し、下記の実験に用いた。
【００５８】
PKI-7を用いたＮ末端6myc-I、IIおよびτ発現 29-13 PCF細胞クローンの確立および分析
pKI-7をBamHIで消化し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化したものをさらにHindIIIで消化した。HindIIIおよびEcoRVで消化した断片をpcDNA3 6myc-I、IIおよびτから単離した。エレクトロポレーション法によって、pKI-7 6myc-I、IIおよびτを29-13 PCF 細胞にトランスフェクションした。29-13 PCF 細胞はTetRおよびT7ポリメラーゼを発現する細胞である。トランスフェクションの一日後に、MULTIWELL 96ウエル（Bacton Dickenson, FALCON社製）中でフレオマイシン（Phleomaycine）セレクションを行った。２週間以内に各プレートにつき５〜１０クローンが単離された。タンパク質の発現は、抗-Myc、I、IIおよびτ抗体を用いたウェスタンブロットにより確認し、高発現のクローンを以下の実験に用いた。
【００５９】
Myc-ペプチドの溶出物を除いた１×１０8セルを用い、上記の手順と同様にして免疫沈降法およびウェスタンブロットを行った。溶出物は４−２０％ SDS-PAGEにかけ、さらに銀染色を行った。これらの溶出物およびＩ型、II型およびτ型に対する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。その結果、Ｉ型とII型とのヘテロダイムライゼーションおよびI型とI型とのホモダイムライゼーションがトリパノソーマの細胞内においても生じることが確認された。
【００６０】
結果
本発明者らは、既に、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）427株のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーから14-3-3タンパク質の２つのアイソフォームをクローニングした。それらは、14-3-3 I型およびII型と命名され、accession No. AB059827およびAB066565として、GenBank/EMBL/DDBJに登録されている。低ストリンジェントな条件下でのゲノムライブラリースクリーニングおよび14-3-3配列に由来する数種のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ産物の直接的な配列分析（direct sequence analysis）によって、T. bruceiに存在するアイソフォームは２種のみであると確認された。配列は、後日、Sanger Institute Blast Serverにaccession No. TRYPtp 25a10ec07.plk_63として閲覧可能になった。サーバーに示されるとおり、両者の配列は、第１１染色体において発見された。
【００６１】
しかし、これらのアイソフォームについては、現時点までは生化学的および生物学的特性について確認されてこなかった。スタートコドンは、哺乳動物から酵母にわたり同定された他の14-3-3タンパク質のホモログによって決定し、本発明者らが特定したスタートコドンの上流には、スタートコドンとなり得る配列は見出されなかった。演繹されるアミノ酸配列には、ホスホセリンバインディングの両親媒性溝を形成すると予測される部位、Ｉ型においては、７７Ｋ、８４Ｒ、８８Ｒ、１５０Ｋ、１５４Ｄ、１５７Ｒ、１５８Ｙ、１９９Ｌ、２０３Ｖ、２４３Ｌ、２４７Ｌ、および２５５Ｗ、II型においては、５６Ｋ、６３Ｒ、６７Ｒ、１２８Ｋ、１３２Ｄ、１３５Ｒ、１３６Ｙ、１７４Ｌ、１７８Ｖ、２２１Ｌ、２２５Ｌ、および２３３Ｗが、すべて保存されている（図１参照）。
【００６２】
核移行シグナル（Nuclear exporting signal(NES)、非特許文献１３）は、α−へリックス９（図１参照）に存在する。これらのデータは、進化の過程においても保存された14-3-3タンパク質の特徴、すなわち、
１）通常、二量体の形態で存在する、
２）配列に依存して、ホスホセリンを含むモチーフに結合する、
３）核移行シグナルを含む、
に合致するものである。
【００６３】
そのため14-3-3タンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用を増強する受容体分子として作用することができ、おそらくは、多様なパートナーのホスホセリンを含む配列モチーフに結合することを介して、標的タンパク質の細胞局在化、酵素の活性化または阻害を制御する。
【００６４】
プロサイクリックフォーム（ＰＣＦ）およびブラッドストリームフォーム（ＢＳＦ）における14-3-3タンパク質の発現を確認するために、ラットをGST-Iタンパク質、GST-IIタンパク質（図２ａ）でそれぞれ免疫した。I型、II型およびヒト14-3-3τの精製したマルトースバインディング融合タンパク質（MAL）を用いて、ウエスタンブロッティングにより抗体の特異性を調査した。結果を図２ｂに示す。驚くべきことに、追加免疫（booster immunization）を行わなかった場合には、４５％程度の高い同一性を備えた配列を有するにもかかわらず（図１参照）、GST-Iタンパク質またはGST-IIタンパク質で免疫して得られた２つの抗体の交差反応は生じなかった。
【００６５】
そこで、PCF細胞の溶菌液を用いたウエスタン・ブロットにより、これらの抗体の特異性について調べた。両抗体ともに、若干のバックグラウンドを伴うものの、14-3-3 I型およびII型の相対分子量が30KDであることが明らかとなった（図２ｃ）。また、PCF細胞についてのノーザン・ブロッティング解析により、Ｉ型については2.2kbの転写物が、II型については3.8kbの転写物が検出された（図２ｄ）。II型の転写物の量は、I型の転写物のほぼ３倍に相当した（図２ｄ）。さらに、定量的ウエスタン・ブロット（Quantitative Western Blot）解析により、PCF細胞においては、II型よりもI型の転写物量のほうが多いことが示された（I型：107 ng/1x106cells、II型：70ng/1x106cells）。これに対し、BSF細胞においてはI型とII型の転写物量はほぼ同等である（I型：92ng/1x106cells、II型：84ng/1x106cells）。理論的には、１細胞における14-3-3タンパク質の発現量は、1x106−2x106分子である（図２ｅ）。ノーザンおよびウエスタンブロッティングの結果を併せて考慮すれば、14-3-3タンパク質の発現レベルは、トリパノソーマの多くのタンパク質と同様に、転写後制御されることが示された。抗Ｉ型およびII型抗体を用いて、ＰＣＦ細胞の免疫染色（immunostaining）を行ったところ、両アイソフォームともに、主として細胞質に局在化することが確認され、このことは予測された核移行シグナル（NES）がin vivoで機能することを示唆するものであった。
【００６６】
14-3-3タンパク質の二量体化の重要性は、まだほんの２、３のケースで示されていたに過ぎない。例えば、in vivoにおける14-3-3タンパク質の二量体は、Rafキナーゼ活性を維持するために必要とされること（非特許文献１４）、さらに、14-3-3タンパク質とセロトニン・Ｎ−アセチルトランスフェラーゼとの共結晶の結晶構造から、酵素の２つの部位への二量体14-3-3タンパク質の結合が、触媒活性を増強するコンフォーメーションの変化を誘導するために必要であること（非特許文献１５）などが報告されている。この報告においては、14-3-3タンパク質の重要な特徴である二量体化の正確なメカニズムに焦点を当てている。そこで、本発明者らは、上記材料および方法において述べたとおり、293細胞における二量体の検出のために、使い勝手の良い発現ベクターpcDNA3.1-SM.TagまたはpcDNA3.1TOPO-MS.Tagを創作した。これらのベクターは、抗-Myc抗体およびＳ−タンパク質にそれぞれ結合するMyc-TagおよびS-Tagを含んでいる。
【００６７】
Ｓ−タンパク質ビーズを用いたプルダウンアッセイ（pull-down assay）は、Ｓ−タンパク質が104アミノ酸と小サイズであるため、抗体と比べて立体障害を受けにくい。加えて、Myc-TagおよびS-Tagはともに、α−へリックスコンフォーメーションをとり得るため、結合パートナーの中での構造変化が少ない。そこで、構築物pcDNA3.1 TOPO I、IIまたはτ、並びに、pcDNA3.1TOPO-MS.Tag I、IIまたはτを共トランスフェクトし、可能性のあるすべての二量体について、Ｓ−タンパク質を用いたプルダウンアッセイを行った。その結果を図３に示す。図３に示されるように、I型およびII型の双方にI-MS.Tagタンパク質が結合する。また、II-MS.Tagタンパク質はI型にのみ結合する。しかし、τ型はI型およびII型のいずれとも結合しなかった。
【００６８】
なお、上記実験とは別に行った実験において、pcDNA3.1-SM.Tag I、IIまたはτ、並びに、pcDNA3.1 TOPO I、IIまたはτSTOP(+)を用いた場合でも、同様の結合パターンが確認された。また、これに対し、pcDNA3-6mycII構築物を用いた場合、6Myc-IIおよびI型そのものとの間では、二量体化は確認されたなかった。すなわち、これらのことから、Ｎ末端の６つのmyc配列に結合する抗体のため14-3-3タンパク質に立体障害が生じた可能性があり得ると推定された。
【００６９】
そこで、MS.およびSM.Tagベクターを用いて検討した。さらに、そのタンパク質のＣ末端のＶ５抗体認識配列を形成させるpcDNA3.1 TOPO I、IIおよびτ(-)を用い、二量体化の試験を行い、一致する結果を得た。また、最近の報告では、哺乳類および酵母の14-3-3アイソフォームもまた特徴的な二量体のパターンを示すことが示されている（非特許文献１６）。
【００７０】
本発明者らは次に、二量体化に必要なアミノ酸配列について試験を行った。本発明者らはT. brucei 14-3-3タンパク質（I型、II型）とτ型は二量体を形成しないことを明らかにしたため、さらに、T. brucei 14-3-3タンパク質とヒト由来のτ型とのキメラ構築物を作製し、それらが二量体を形成するか試験した。図４に示すように、すべての種類の構築物を作製したが、二量体化に必要な配列を特定するための試験にはＮｏ．３、４、５、９、１０および１１の構築物だけを用いた。その理由は、これまでに哺乳類の14-3-3アイソフォームの結晶構造解析において、１番から４番へリックス部分を含むＮ末端アミノ酸配列が二量体化を担うことが明らかにされているからである（非特許文献１７、１８）。
【００７１】
抗−I型および抗−II型抗体による検出では、Ｓ−タンパク質プルダウン、SM-Tag.Iα３＋II、およびSM-Tag.IIα３＋Iを示すレーンではバンドは観察されたなかった（図５）。このデータは、T. brucei 14-3-3タンパク質の両アイソフォームにおいてへリックス１−４を含むＮ末端配列がヘテロ二量体形成に必須であることを示している。
【００７２】
さらに本発明者らは、他の哺乳類の14-3-3アイソフォームがT.brucei 14-3-3タンパク質と二量体を形成することができるか否かについて調査した。pcDNA3.1TOPO-MS.Tag IおよびIIをそれぞれトランスフェクトした293T細胞の溶解物を用いて、Ｓ−タンパク質プルダウンアッセイを行った。14-3-3アイソフォームをすべて認識するK19抗体を用いてウエスタンブロッティングによる検出を行った。結果を図６に示す。この結果から、MS-Tag.Iは、ある種の哺乳類のアイソフォームと低い親和性で結合するが、MS-Tag.IIは結合しないことが明らかとなった。このことは、I型およびII型の双方において、おそらくはＮ末端領域がこれらの二量体形成に重要な役割を果たしているというユニークな特性を示唆するものである。このデータは、II型はアイソフォームのいずれとも二量体を形成しないことから、二量体化のシステムの細かな点が哺乳類のアイソフォームにおけるメカニズムと異なる形態である可能性があることを示唆している。T.brucei 14-3-3タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を哺乳類のものと比較したところ、αへリックス１の直前にある１つのプロリン残基が特徴的であることが明らかになった。
【００７３】
哺乳類の14-3-3タンパク質はT.bruceiの14-3-3タンパク質とほとんど結合しないというデータから、各アイソフォームにおけるスタートコドンからプロリン残基までの配列が、二量体を形成するパートナーとの嗜好性を決める要因であると推測された。
【００７４】
そこで、本発明者らは、Ｎ末端領域内に存在するプロリンの部位がスタートコドンの先頭位置となるようにＩ型およびII型のＮ末端配列が削除され、さらにこのプロリンがメチオニンに置換されるように塩基配列を改変したcDNAを作製した。そのcDNAを293T細胞にトランスフェクトし、二量体を形成するか否かをプルダウンアッセイにより調べた。図７に結果を示す。図７中、例えば「P→M II-V5 + I-MS」で示されるカラムは、新たにN末端となるプロリン（P）の位置のアミノ酸残基をメチオニン（M）に置換したII型にV5抗体を結合させた複合体と、I型およびMS.Tagの複合体との組み合わせについて実験した結果を示す。驚くべきことに、Ｉ-V5（P→M）として示されるＮ末端を除去したＩ型14-3-3、II-V5（P→M）として示されるＮ末端を除去したII型14-3-3のいずれも二量体を形成しなかった（図７）。このデータから、II型におけるＮ末端配列の７つのアミノ酸；I型では２８アミノ酸、で構成される配列が、II型の二量体形成において極めて重要であることが示唆された。
【００７５】
さらに、II型における二量体形成に必須のアミノ酸配列をアラニンスキャニング法にて特定した。図８に示すように、II型における二量体形成に必須なアミノ酸をアラニンスキャニング法を用いて決定した結果、ロイシン（Ｌ）からＮ末端までの１３個のアミノ酸の中フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）およびロイシン（Ｌ）うちの１つでもアラニン（Ａ）に変わると、もはや二量体形成能が消失することが明らかとなった。
【００７６】
アラニンスキャニング法によればポリペプチドの立体構造を変えないように所定のアミノ酸残基を置換することが可能である。通常、立体構造が変動しないのであればサブユニット同士の結合が起きても不思議はない。しかし、上記の結果は、Ｎ末端領域の特定のアミノ酸残基が置換されると、サブユニットが本来の立体構造をとり得る状態であっても、サブユニット同士の結合が阻害される場合があることを示すものである。すなわち、立体構造の変化を生じさせるか否かにかかわらず、Ｎ末端領域の特定部位のアミノ酸残基に何らかの影響が及べば二量体化は阻害され得る。したがって、Ｎ末端領域に何らかの物質が結合した場合にも、上記のような特定部位のアミノ酸残基本来の機能が働かず二量体化が阻害される蓋然性は極めて高い。
【００７７】
ヒト由来のτ型には、Ｉ型およびII型におけるＮ末端からプロリン（Ｐ）までの領域に対応する部位がないため、Ｎ末端からプロリン（Ｐ）までのフェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）およびプロリン（Ｐ）をターゲットに結合し、二量体化を阻害するような物質が抗真核生物薬剤としてはより好ましいと考えられる。
【００７８】
II型のこの短い配列に結合するペプチドおよび／または小型のリガンドは、T. brucei の14-3-3タンパク質の二量体化を阻害する一方で、哺乳類の14-3-3タンパク質については阻害しないと推定される。このことは、14-3-3タンパク質がT. bruceiのユニークな創薬ターゲットとなるという新規なアイディアを導く。このＮ末端の特徴的な配列に結合し、二量体化を阻害するリガンドの探索を現在進めているところである。さらに、14-3-3タンパク質がすべての真核生物において発現するものであり、またそれらのＮ末端配列は非高等真核生物において多種多様である（非特許文献１９）ことから、14-3-3タンパク質の二量体化は、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）を含むすべての真核病原菌に対する潜在的な治療ターゲットとなるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、真核病原菌などに対する予防薬、治療薬等の開発に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】T.brucei由来のＩ型14-3-3、II型14-3-3およびヒト14-3-3τのサブユニットのアミノ酸配列の対比図である。
【図２ａ】MAL複合体、GST複合体の電気泳動像を示す図である。
【図２ｂ】抗体の特異性を示すウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図２ｃ】正常血清とＩ型およびII型で免疫した血清のトリパノソーマライセートにおける反応性をみたウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図２ｄ】Ｉ型およびII型の転写物量を調査したノーザンブロットの結果を示す図である。
【図２ｅ】１個の細胞におけるＩ型およびII型の14-3-3タンパク質の発現量を示す図である。
【図３】S-タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図４】I型、II型のそれぞれとτ型とのキメラ構築物の設計図を示す図である。
【図５】S-タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図６】S-タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図７】N末端領域を一部削除したI型およびII型の14-3-3タンパク質について、S-タンパク質を用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。
【図８】II型において、二量体形成に必要なアミノ酸を同定するために行ったアラニンスキャニングの結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号２０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４０：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４１：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４２：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４３：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４４：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４５：ｐｃＤＮＡ３．１ＴＯＰＯ−ＭＳ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４６：２ｘＭｙｃ−Ｔａｇ ＆ Ｓ−Ｔａｇ
配列番号４７：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＭ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４８：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＭ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号４９：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＭ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号５０：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＳＭ．−Ｔａｇベクター構築用オリゴヌクレオチド
配列番号５１：Ｓ−Ｔａｇ ＆ Ｍｙｃ−Ｔａｇ
配列番号５３：ＰＣＲプライマー
配列番号５４：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５５：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５６：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５７：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５８：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号５９：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６０：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６１：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６２：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６３：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６４：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６５：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６６：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６７：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６８：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号６９：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号７０：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号７１：１４−３−３キメラ発現構築物に用られるプライマー
配列番号７２：ｐＫＩ−０構築用オリゴヌクレオチド
配列番号７３：ｐＫＩ−０構築用オリゴヌクレオチド
配列番号７４：Ｔ７ターミネーター
配列番号７５：Ｔ７ターミネーター
配列番号７６：ＰＣＲプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質を検出する、抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記Ｎ末端領域が、前記サブユニットのＮ末端側から第１番目のαへリックス領域中に保存されるロイシン部位からＮ末端までの領域である、請求項１に記載の抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記Ｎ末端領域が、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の抗真核微生物薬剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記真核微生物が、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）からなる群より選ばれる真核微生物の少なくとも１種である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗真核微生物剤となり得る物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域に結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する抗真核微生物剤。
【請求項１】
14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域と結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する物質を検出する、抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記Ｎ末端領域が、前記サブユニットのＮ末端側から第１番目のαへリックス領域中に保存されるロイシン部位からＮ末端までの領域である、請求項１に記載の抗真核微生物薬剤となり得る物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記Ｎ末端領域が、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１４からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の抗真核微生物薬剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記真核微生物が、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）およびニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）からなる群より選ばれる真核微生物の少なくとも１種である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗真核微生物剤となり得る物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
14-3-3タンパク質を構成するサブユニットのＮ末端領域に結合し、かつ、14-3-3タンパク質の二量体形成を阻害する抗真核微生物剤。
【図４】
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−８１４１３（Ｐ２００６−８１４１３Ａ）
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６７２６０（Ｐ２００４−２６７２６０）
【出願日】平成１６年９月１４日（２００４．９．１４）
【出願人】（５００５２０６２８）セレスター・レキシコ・サイエンシズ株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１４日（２００４．９．１４）
【出願人】（５００５２０６２８）セレスター・レキシコ・サイエンシズ株式会社 (5)
【Ｆターム（参考）】
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