抗筋肉疲労剤及び飲食品
【課題】 長期間に渡って継続して経口的に服用・摂取することが可能で、筋肉疲労を効果的に改善し得る抗筋肉疲労剤及び飲食品の提供。
【解決手段】 サンゴハリタケ属のきのこ子実体、その菌株の培養物又はそれらの処理物から抽出される複合成分を有効成分とすることを特徴とする抗筋肉疲労剤。
【解決手段】 サンゴハリタケ属のきのこ子実体、その菌株の培養物又はそれらの処理物から抽出される複合成分を有効成分とすることを特徴とする抗筋肉疲労剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンゴハリタケ属のきのこに含まれる複合成分を有効成分とする抗筋肉疲労剤及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、疲労回復促進（一般には補精、強壮）作用を有するものとして、牛の胆嚢や胆管中の結石である午黄（ゴオウ）；シナヒキガエルの耳腺その他の皮腺分泌物である蟾酥（センソ）；雄のジャコウジカのジャコウ嚢の分泌物である麝香（ジャコウ）；女王蜂より得られる王乳（ローヤルゼリー）濃縮物等の動物性生薬、オタネニンジンの根から得られる人参を原料とするもの；催淫薬ヨヒンビンを含有する南部アフリカ産のヨヒンベ皮より得られる淫羊霍（インヨウカク）；南米ブラジル産のガラナ等の植物性生薬が知られている。
【０００３】
しかしながら、各種の天然素材を用いた機能性製品の中で、筋肉疲労の改善等を直接の目的としたものは少ないのが実状であった。そこで、天然素材を用い、長期間に渡って継続して経口的に服用・摂取することが可能な経口剤又は食品の開発が望まれていた。
【０００４】
一方、ヤマブシタケ（学名「Hericium erinaceum」）は、サンゴハリタケ属に属する担子菌類で、日本ではジョウゴタケ、ウサギタケ、ハリセンボン等と称されている。ヤマブシタケの子実体には、抗腫瘍活性成分が含まれることが報告されている（例えば特許文献１〜２、非特許文献１参照）。また、子実体に含まれるフェノール関連化合物が神経成長因子（ＮＧＦ）合成誘導促進活性を有し、アルツハイマー型痴呆症改善効果を示すことが報告されている（例えば非特許文献２、３参照）。
しかし、ヤマブシタケから分離される複合成分に抗筋肉疲労作用があることは知られていない。
【特許文献１】特願平５−１１７３０３号公報
【特許文献２】特願平５−１１７３０４号公報
【非特許文献１】Takashi MIZUNO, Tetsuya WASA, Hitoshi ITO,* Chiharu SUZUKI,** and Nobuo UKAI***, Antitumor-active Polysaccharides Isolated from the Fruiting Body of Hericium erinaceum, an Edible and Medicinal Mushroom Called yamabushitake or houtou*, Biosci. Biotech. Biochem., 1992, 56(2), 347-348.
【非特許文献２】Kawagishi, H.; Ando, M.; Shinba, K.; Sakamoto, H.; Yoshida, S.; Ishiguro, Y.; Furukawa, S. Phytochemistry 1993, 32, 175-178.
【非特許文献３】Kawagishi, H.; Shimada, A.; Shiral, R.; Okamoto, K.; Ojima, F.; Sakamoto, H.; Ishiguro, Y. Furukawa, S. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 239-241.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、斯かる実状に鑑みてなされたもので、長期間に渡って継続して経口的に服用・摂取することが可能で、筋肉疲労を効果的に改善し得る抗筋肉疲労剤及び飲食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく、天然物中に抗筋肉疲労作用を有する物質を鋭意探索したところ、サンゴハリタケ属のきのこの子実体、その菌株の培養物又はそれらの処理物から抽出される複合成分が優れた抗筋肉疲労活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、サンゴハリタケ属のきのこ子実体、その菌株の培養物又はそれらの処理物から抽出される複合成分を有効成分とすることを特徴とする抗筋肉疲労剤により上記課題を解決したものである。
【０００８】
また、本発明は、上記抗筋肉疲労剤を含有する飲食品により上記課題を解決したものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抗筋肉疲労剤は、優れた抗筋肉疲労作用を有すると共に、安全性に優れるため、筋肉痛の改善・治療薬として極めて有用であり、また食品中に配合して継続的な摂取もできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いるサンゴハリタケ属に属するきのことしては、サンゴハリタケ（学名「Hericium ramosum (merat) Letellier」）、ヤマブシタケ（学名「Hericium erinaceum」）等が挙げられ、特にヤマブシタケが好ましい。ヤマブシタケの菌株は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０３５２として寄託されており、通常の方法により栽培することができる。さらに上記菌株の人工的あるいは自然的変異株も用いることができる。
【００１１】
本発明の複合成分は、サンゴハリタケ属に属するきのこの子実体（生もしくは乾燥）、その菌株を培養した培養物（培養菌糸体及び培養濾液）、あるいはこれらの細胞壁破砕物、磨砕物、乾燥物、乾燥粉砕物等の処理物を抽出処理して得ることができる。
【００１２】
菌株の培養は、担子菌の培養に通常用いられる固体培養法（菌床栽培、ビン栽培）又は、液体培養法のいずれでもよいが、液体培養法が好ましい。
培養の培地としては、特に制限はなく、菌の発育に必要な諸栄養が含まれていればよい。すなわち、グルコース、シュークロース、マルトース、でんぷん等の炭素源；硫安、硝安、硝酸ソーダ、尿素等の窒素源；ジャガイモエキス、ニンジンエキス、麦芽エキス、ペプトン、Ｖ−８ジュース、麹エキス、酵母エキス、酵母粉、タマネギエキス、コーンスティープリカー等の天然の複合栄養源；リン酸、塩酸、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄等の無機塩類等が利用できる。この他に生長に必要な微量元素、ビタミンなどは適宜添加してもよい。
培養は通常好気条件下がよく、例えば振とう培養法あるいは通気撹拌培養法が用いられる。培養温度は２０〜３７℃、特に３０℃前後で培養するのが好ましい。培養pHは３．０〜９．０、好ましくは４．５〜７．０が生育に好適である。培養日数は培養条件によって異なるが菌糸体の生育があればよく、通常は２〜３０日間で、最大の菌糸体の生産される日数がよい。通気撹拌培養では、通気量０．１〜１０容量％、撹拌速度３０〜８００r.p.m.の範囲で行なうのが好ましい。
培養終了後、培養液を遠心分離あるいは濾過することにより培養菌糸体が培養濾液から分離採取される。
【００１３】
本発明において、上記きのこの子実体、培養物あるいはこれらの処理物の抽出処理は、水系溶媒又は含水有機溶媒を用いて行うことができる。ここに水系溶媒としては、６０℃以上の熱水、好ましくは８０℃以上の熱水が挙げられる。また、含水有機溶媒としては、炭素数１〜５の低級アルコール、アセトン、ジエチルエーテル等の有機溶媒の含水物が挙げられ、２０〜９９重量％程度の低級アルコールが好ましく、特に６０〜８０重量％の含水エタノール溶液が好ましい。
【００１４】
抽出方法としては、一般的な方法を使用することができ、例えば、溶媒に上記きのこの子実体等を浸漬する方法や、更に加温下（常温〜溶媒の沸点の範囲）攪拌する方法等を挙げることができる。得られた抽出物は、必要に応じて濾過又は遠心分離によって固形物を除いた後、そのまま又は当該抽出物を濃縮若しくは乾燥して用いられるが、特に当該抽出物を減圧乾燥や真空凍結乾燥等の手段によって乾燥して使用するのが好ましい。
【００１５】
得られた複合成分は、更に、クロマト分画処理及び／又は膜分離処理により精製して用いることができる。精製により分画して得られる糖蛋白複合体を使用すると、より優れた抗筋肉疲労作用が得られ特に好ましい。クロマト分画処理としては、カラムクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーが挙げられ、膜分離処理としては、透析や限外濾過が挙げられる。
【００１６】
抗筋肉疲労剤とするには、適宜、薬学的に許容される担体、例えば賦形剤、滑沢剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、嬌味嬌臭剤等を使用して錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口的に投与する製剤とするのが好ましい。
本発明の複合成分の有効投与量は、抽出物として１，０００ｍｇ〜３，０００ｍｇ／日（成人）とするのが好ましい。
【００１７】
本発明の複合成分は、食品中に配合してもよく、特に健康増進を図る健康食品とするのが好ましい。
食品の形態も特に制限されず、ドリンク剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ペースト剤等の形態が挙げられる。また、かまぼこ、ちくわ等の練り製品；パン等の発酵食品；粉乳、発酵乳等の乳製品；バター等の油脂製品；水、果汁、牛乳、清涼飲料等の飲料；菓子等の食品に添加して使用することもできる。
このような食品には、保存料、着色料、甘味料、酸化防止剤、増粘安定剤、乳化剤、調味料、防腐剤等の食品添加物、天然物等を用いることができる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
ヤマブシタケ乾燥子実体の細胞壁破砕粉末２，０００ｇに抽出溶媒として８５％濃度のエタノール８Ｌを加え、室温で撹拌しながら１日放置して溶媒抽出を行なった。エタノール可溶画分を吸引濾過して低分子成分を除去した後、残渣を７０℃以下で通風しながら乾燥した。次いで、この乾燥したエタノール抽出残渣５００ｇを、１００℃の熱水３Ｌで３時間撹拌しつつ煮沸し、熱水抽出を行なった。
熱水抽出液を冷却し、１％シュウ酸アンモニウム（１００℃）及び５％水酸化ナトリウム水溶液（３０℃）で順次抽出し、遠心分離したその上澄液に５倍量の９９％濃度のエタノールを加え、多糖類を沈殿させ、更に遠心分離して得た沈殿を流水中で透析後、凍結乾燥粉末として粗多糖類（１）を得た。収量は２３ｇであった。
【００２０】
次いで、この粗多糖類（１）の粉末１５ｇを陰イオン交換クロマト法（ＤＥＡＥセルロース（Ｃｌ-）カラム（３×７０ｃｍ））に供し、水によって溶出し、非吸着画分である多糖類（２）を得た。収量は５ｇであった。
上記で得られた多糖類（１）及び（２）の理化学的性質を表１に示し、スペクトルデータを表２に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
上記表２に示したように、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）ＫＢｒ法により、多糖類（１）及び（２）はいずれも８９０cm-1付近にβ−グルコシド結合を示す吸収が認められ、β−Ｄ−グルカンであることが確認された。
また、多糖類（２）２０mgを０．３Ｍ ＮａＯＤ・Ｄ2Ｏに溶解して、ＪＥＯＬ製ＧＳＸ−４００スペクトルメーターによって測定した核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル分析）分析の結果、多糖類（２）はキシロース、グルコース、マンノース等を随伴するβ−（１→６）：β−（１→３）−Ｄ−グルカン蛋白複合体であることが確認された。
【００２４】
実施例２
ヤマブシタケ菌糸体を、蔗糖（グルコース）３０ｇ、ポリペプトン２．０ｇ、酵母エキス５ｇ、硝酸ソーダ７ｇ、酸性リン酸−ソーダ７ｇ、塩化カリウム０．３ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇを水１Ｌに溶解し、pHを５．０〜７．０にした培地に植菌した。前記組成の液体培地２００ｍＬずつを１Ｌ容の三角フラスコに分注し、２３〜２５℃、３〜５日間通風培養あるいはロータリーシェカーを用いて２００r.p.m.にて振盪培養し、菌糸体とともにやや粘稠性のある培養濾液を得た。
遠心分離した得た菌糸体に７倍量の水を加え、９５〜１００℃にて３時間熱水抽出を行なった。熱水抽出液を冷却し、５倍量の９９％濃度のエタノールを加え、多糖類を沈殿させ、遠心分離によって得た沈殿を流水中で透析後、凍結乾燥粉末して粗多糖類（３）を得た。収量は菌糸体１ｇ当り８０ｍｇであった。
次いで、上記の菌糸体を培養して得られた培養濾液を１／５容まで減圧濃縮し、これに等量の９９％濃度のエタノールを加え、４℃にて一夜放置し生じた沈殿を遠心分離後、真空凍結乾燥して、粗多糖類（４）の粉末を得た。収量は培養濾液１Ｌ当り８００ｍｇであった。
【００２５】
次いで、菌糸体由来の粗多糖類（３）及び培養濾液由来の粗多糖類（４）の粉末、各１０ｇずつを陰イオン交換クロマト法（ＤＥＡＥセルロース（Ｃｌ-）カラム（３×７０cm））に供し、水によって溶出し、吸着画分を、０→２Ｍ食塩溶液による濃度勾配溶出によって、多糖類（５）及び（６）を得た。収量は多糖類（５）は４ｇ、多糖類（６）は４．３ｇであった。
上記で得られた多糖類（５）及び（６）の理化学的性質を表３に示し、スペクトルデータを表４に示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
上記表４に示した赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）ＫＢｒ法により、多糖類（５）及び（６）はいずれも８９０cm-1付近にβ−グルコシド結合を示す吸収が認められ、β−Ｄ−グルカンであることが確認された。
また、多糖類（５）及び（６）それぞれ各２０mgを０．３Ｍ ＮａＯＤ・Ｄ2Ｏに溶解して、ＪＥＯＬ製ＧＳＸ−４００スペクトルメーターによって測定した核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル分析）分析の結果、多糖類（５）はグルコキシラン−蛋白複合体でβ−（１→６）：β−（１→３）−Ｄ−グルカン構造をもつことが確認された。
多糖類（６）もβ−（１→６）：β−（１→３）−Ｄ−グルカン構造をもつガラクトキシログルカン−蛋白複合体であることが確認された。
【００２９】
試験例１ 腓腹筋を用いた抗筋肉疲労作用の検討
ウレタン麻酔（１．０ｇ／１０ｍＬ／ｋｇ、腹腔内注射）を施した雄ラット（日本クレア製Ｊｃｌ：ＳＤ系２５０〜３００ｇ）の十二指腸内にカニューレを挿入後、腹位に固定した。腓腹筋を剥離し、腱の切断末端に糸をつけ、日本光電製 ＦＤ−ピックアップを介して、筋の張力を記録した。電気刺激は、エム・イー・コマーシャル製（ＭＥ２１００）刺激装置から注射針電極を介して、腓腹筋に直接行なった。記録開始後１０分間は０．１Ｈｚで安定させ、安定後４Ｈｚで１５分間刺激した。腓腹筋を０．１Ｈｚで刺激した時は、筋収縮力は数時間安定し変化しないが、４Ｈｚで刺激すると収縮力は一過性に増加した後に減少した。次いで、上記実施例１で得た多糖類（１）、（２）及び実施例２で得た多糖類（５）、（６）をそれぞれ３００mg/kgずつ十二指腸内に注入し、３０分間刺激を休止した後、４Ｈｚで２分間刺激し筋収縮力を記録した。以後１時間毎に、３時間まで筋の収縮力の回復を、最初に４Ｈｚで刺激した時の最大収縮力を１００として測定した。
【００３０】
結果を表５に示す。表５から明らかなように、多糖類（１）、（２）、（５）、（６）の投与により、時間の経過とともに統計学的に有意の筋収縮力（数値が１００に近似するほど筋肉疲労回復効果が強い）の回復促進が認められ、各多糖類は抗筋肉疲労作用を有することが確認された。
【００３１】
【表５】
【００３２】
試験例２ 摘出心臓を用いた抗筋肉疲労作用の検討
摘出心臓標本を用いた試験では、大動脈と後大動脈にカニューレを入れ、心臓内に栄養液であるリンゲル液（塩化ナトリウム６ｇ、塩化カリウム０．０７ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、炭酸水素ナトリウム０．１ｇを１Ｌの水に溶解した液）を灌流させる。なお、静脈洞（ペースメーカ）が残っているので自動能は残っている。また、この標本には交感神経節後線維（心臓機能に促進的に働く）の終末部と副交感神経節及び節後線維（心臓機能に抑制的に働く）が含まれているので、これらに働く薬剤と心筋に直接働く薬剤の検定ができる。
【００３３】
本発明の試験の概略を図１に示す。まず、ガマの脳脊髄を破壊し、背位に固定した。次いで、図１に記載の１−７の操作を順次実施し、大動脈から後大静脈にリンゲル液がスムーズに潅流することを確認した。なお、本試験では、上記リンゲル液のカルシウム量を３分の１に減らし、心筋を疲労させ心臓の収縮力を減弱させた。次いで、上記実施例１で得た多糖類（１）、（２）及び実施例２で得た多糖類（５）、（６）の０．５％溶液１ｍＬをそれぞれ心筋内に注入し、心臓内の灌流液を順次交換することによって心臓に対する作用を観察した。試験では、心尖部をセルフィンではさみ、適当な方法、例えばヘーベル（記録するレバー）でキモグラフィー上に心臓の動きを描記した。また、試験中はリンゲル液に通気して酸素供給を計った。
【００３４】
結果を図２及び図３に示す。図２及び図３から明らかなように、多糖類（１）、（２）、（５）、（６）の投与により、顕著な心筋収縮力の促進が認められた。また、多糖類（２）、（５）及び（６）は、多糖類（１）に比べ、心筋収縮力の発現時間が速やかであり、且つ心筋収縮力の促進作用もより優れていることが確認された。
【００３５】
試験例３ ラットに対する生化学的・薬理学的一般試験
４週齢のＳＤ系（雌／雄）ラット３０匹を以下の３群（各群雌５例、雄５例）、すなわち対照（非投与）群、上記実施例１で得た多糖類（１）投与（３，０００mg/kg）群及び多糖類（１）投与（１，０００mg/kg）群に群分けし、１日１回３０日間経口投与し、尿及び血液の各成分値に対する影響を試験した。その結果、全て正常範囲にあり、対照群との差は認められなかった。
【００３６】
上記実施例で得られた多糖類（１）、（２）、（５）、（６）はいずれも一定の分解点、融点を示さず、強熱により炭化するが、著しく安定である。また、１２０℃×２０分間の滅菌処理を行なって、試験例１及び２と同様に抗筋肉疲労作用を確認したところ、活性の低下は見られなかった。
【００３７】
［飲食品の製造］
製造例１
実施例１と同様にして得た子実体の熱水抽出液１kg、砂糖１kg、ハチミツ１５ｇ、カラメル５ｇ、アスコルビン酸０．７５ｇ、クエン酸０．３ｇ及びレモン系香料０．２ｇを調合し、健康飲料を製造した。
【００３８】
製造例２
実施例１と同様にしてエタノール抽出残渣を得、次いで該エタノール抽出残渣を凍結乾燥させ、凍結乾燥物を得た。この凍結乾燥物１０ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ及びリンゴ搾汁液２kgを調合してリンゴジュースを製造した。
【００３９】
製造例３
採肉後、水さらしして脱水した魚肉類２kgを予冷し、実施例１で得た多糖類（２）５ｇ、若干量の塩化カルシウム及び第三リン酸ナトリウムを添加した。次いで、魚肉類をすりつぶし、成形後凍結して冷凍すり味を得た。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、摘出心臓標本による試験概略を示す図である。
【図２】図２は、ヤマブシタケ子実体より得られる本発明の多糖類（１）及び多糖類（２）の抗筋肉（心筋）疲労作用に対する効果を示す図である。図中、縦軸は心筋収縮力、横軸は時間（１cm＝１２０秒）を表す。
【図３】図３は、ヤマブシタケ培養物（培養菌糸体、培養濾液）より得られる本発明の多糖類（５）及び多糖類（６）の抗筋肉（心筋）疲労作用に対する効果を示す図である。図中、縦軸は心筋収縮力、横軸は時間（１cm＝１２０秒）を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンゴハリタケ属のきのこに含まれる複合成分を有効成分とする抗筋肉疲労剤及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、疲労回復促進（一般には補精、強壮）作用を有するものとして、牛の胆嚢や胆管中の結石である午黄（ゴオウ）；シナヒキガエルの耳腺その他の皮腺分泌物である蟾酥（センソ）；雄のジャコウジカのジャコウ嚢の分泌物である麝香（ジャコウ）；女王蜂より得られる王乳（ローヤルゼリー）濃縮物等の動物性生薬、オタネニンジンの根から得られる人参を原料とするもの；催淫薬ヨヒンビンを含有する南部アフリカ産のヨヒンベ皮より得られる淫羊霍（インヨウカク）；南米ブラジル産のガラナ等の植物性生薬が知られている。
【０００３】
しかしながら、各種の天然素材を用いた機能性製品の中で、筋肉疲労の改善等を直接の目的としたものは少ないのが実状であった。そこで、天然素材を用い、長期間に渡って継続して経口的に服用・摂取することが可能な経口剤又は食品の開発が望まれていた。
【０００４】
一方、ヤマブシタケ（学名「Hericium erinaceum」）は、サンゴハリタケ属に属する担子菌類で、日本ではジョウゴタケ、ウサギタケ、ハリセンボン等と称されている。ヤマブシタケの子実体には、抗腫瘍活性成分が含まれることが報告されている（例えば特許文献１〜２、非特許文献１参照）。また、子実体に含まれるフェノール関連化合物が神経成長因子（ＮＧＦ）合成誘導促進活性を有し、アルツハイマー型痴呆症改善効果を示すことが報告されている（例えば非特許文献２、３参照）。
しかし、ヤマブシタケから分離される複合成分に抗筋肉疲労作用があることは知られていない。
【特許文献１】特願平５−１１７３０３号公報
【特許文献２】特願平５−１１７３０４号公報
【非特許文献１】Takashi MIZUNO, Tetsuya WASA, Hitoshi ITO,* Chiharu SUZUKI,** and Nobuo UKAI***, Antitumor-active Polysaccharides Isolated from the Fruiting Body of Hericium erinaceum, an Edible and Medicinal Mushroom Called yamabushitake or houtou*, Biosci. Biotech. Biochem., 1992, 56(2), 347-348.
【非特許文献２】Kawagishi, H.; Ando, M.; Shinba, K.; Sakamoto, H.; Yoshida, S.; Ishiguro, Y.; Furukawa, S. Phytochemistry 1993, 32, 175-178.
【非特許文献３】Kawagishi, H.; Shimada, A.; Shiral, R.; Okamoto, K.; Ojima, F.; Sakamoto, H.; Ishiguro, Y. Furukawa, S. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 239-241.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、斯かる実状に鑑みてなされたもので、長期間に渡って継続して経口的に服用・摂取することが可能で、筋肉疲労を効果的に改善し得る抗筋肉疲労剤及び飲食品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく、天然物中に抗筋肉疲労作用を有する物質を鋭意探索したところ、サンゴハリタケ属のきのこの子実体、その菌株の培養物又はそれらの処理物から抽出される複合成分が優れた抗筋肉疲労活性を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、サンゴハリタケ属のきのこ子実体、その菌株の培養物又はそれらの処理物から抽出される複合成分を有効成分とすることを特徴とする抗筋肉疲労剤により上記課題を解決したものである。
【０００８】
また、本発明は、上記抗筋肉疲労剤を含有する飲食品により上記課題を解決したものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抗筋肉疲労剤は、優れた抗筋肉疲労作用を有すると共に、安全性に優れるため、筋肉痛の改善・治療薬として極めて有用であり、また食品中に配合して継続的な摂取もできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いるサンゴハリタケ属に属するきのことしては、サンゴハリタケ（学名「Hericium ramosum (merat) Letellier」）、ヤマブシタケ（学名「Hericium erinaceum」）等が挙げられ、特にヤマブシタケが好ましい。ヤマブシタケの菌株は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０３５２として寄託されており、通常の方法により栽培することができる。さらに上記菌株の人工的あるいは自然的変異株も用いることができる。
【００１１】
本発明の複合成分は、サンゴハリタケ属に属するきのこの子実体（生もしくは乾燥）、その菌株を培養した培養物（培養菌糸体及び培養濾液）、あるいはこれらの細胞壁破砕物、磨砕物、乾燥物、乾燥粉砕物等の処理物を抽出処理して得ることができる。
【００１２】
菌株の培養は、担子菌の培養に通常用いられる固体培養法（菌床栽培、ビン栽培）又は、液体培養法のいずれでもよいが、液体培養法が好ましい。
培養の培地としては、特に制限はなく、菌の発育に必要な諸栄養が含まれていればよい。すなわち、グルコース、シュークロース、マルトース、でんぷん等の炭素源；硫安、硝安、硝酸ソーダ、尿素等の窒素源；ジャガイモエキス、ニンジンエキス、麦芽エキス、ペプトン、Ｖ−８ジュース、麹エキス、酵母エキス、酵母粉、タマネギエキス、コーンスティープリカー等の天然の複合栄養源；リン酸、塩酸、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄等の無機塩類等が利用できる。この他に生長に必要な微量元素、ビタミンなどは適宜添加してもよい。
培養は通常好気条件下がよく、例えば振とう培養法あるいは通気撹拌培養法が用いられる。培養温度は２０〜３７℃、特に３０℃前後で培養するのが好ましい。培養pHは３．０〜９．０、好ましくは４．５〜７．０が生育に好適である。培養日数は培養条件によって異なるが菌糸体の生育があればよく、通常は２〜３０日間で、最大の菌糸体の生産される日数がよい。通気撹拌培養では、通気量０．１〜１０容量％、撹拌速度３０〜８００r.p.m.の範囲で行なうのが好ましい。
培養終了後、培養液を遠心分離あるいは濾過することにより培養菌糸体が培養濾液から分離採取される。
【００１３】
本発明において、上記きのこの子実体、培養物あるいはこれらの処理物の抽出処理は、水系溶媒又は含水有機溶媒を用いて行うことができる。ここに水系溶媒としては、６０℃以上の熱水、好ましくは８０℃以上の熱水が挙げられる。また、含水有機溶媒としては、炭素数１〜５の低級アルコール、アセトン、ジエチルエーテル等の有機溶媒の含水物が挙げられ、２０〜９９重量％程度の低級アルコールが好ましく、特に６０〜８０重量％の含水エタノール溶液が好ましい。
【００１４】
抽出方法としては、一般的な方法を使用することができ、例えば、溶媒に上記きのこの子実体等を浸漬する方法や、更に加温下（常温〜溶媒の沸点の範囲）攪拌する方法等を挙げることができる。得られた抽出物は、必要に応じて濾過又は遠心分離によって固形物を除いた後、そのまま又は当該抽出物を濃縮若しくは乾燥して用いられるが、特に当該抽出物を減圧乾燥や真空凍結乾燥等の手段によって乾燥して使用するのが好ましい。
【００１５】
得られた複合成分は、更に、クロマト分画処理及び／又は膜分離処理により精製して用いることができる。精製により分画して得られる糖蛋白複合体を使用すると、より優れた抗筋肉疲労作用が得られ特に好ましい。クロマト分画処理としては、カラムクロマトグラフィーや液体クロマトグラフィーが挙げられ、膜分離処理としては、透析や限外濾過が挙げられる。
【００１６】
抗筋肉疲労剤とするには、適宜、薬学的に許容される担体、例えば賦形剤、滑沢剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、嬌味嬌臭剤等を使用して錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口的に投与する製剤とするのが好ましい。
本発明の複合成分の有効投与量は、抽出物として１，０００ｍｇ〜３，０００ｍｇ／日（成人）とするのが好ましい。
【００１７】
本発明の複合成分は、食品中に配合してもよく、特に健康増進を図る健康食品とするのが好ましい。
食品の形態も特に制限されず、ドリンク剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ペースト剤等の形態が挙げられる。また、かまぼこ、ちくわ等の練り製品；パン等の発酵食品；粉乳、発酵乳等の乳製品；バター等の油脂製品；水、果汁、牛乳、清涼飲料等の飲料；菓子等の食品に添加して使用することもできる。
このような食品には、保存料、着色料、甘味料、酸化防止剤、増粘安定剤、乳化剤、調味料、防腐剤等の食品添加物、天然物等を用いることができる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１
ヤマブシタケ乾燥子実体の細胞壁破砕粉末２，０００ｇに抽出溶媒として８５％濃度のエタノール８Ｌを加え、室温で撹拌しながら１日放置して溶媒抽出を行なった。エタノール可溶画分を吸引濾過して低分子成分を除去した後、残渣を７０℃以下で通風しながら乾燥した。次いで、この乾燥したエタノール抽出残渣５００ｇを、１００℃の熱水３Ｌで３時間撹拌しつつ煮沸し、熱水抽出を行なった。
熱水抽出液を冷却し、１％シュウ酸アンモニウム（１００℃）及び５％水酸化ナトリウム水溶液（３０℃）で順次抽出し、遠心分離したその上澄液に５倍量の９９％濃度のエタノールを加え、多糖類を沈殿させ、更に遠心分離して得た沈殿を流水中で透析後、凍結乾燥粉末として粗多糖類（１）を得た。収量は２３ｇであった。
【００２０】
次いで、この粗多糖類（１）の粉末１５ｇを陰イオン交換クロマト法（ＤＥＡＥセルロース（Ｃｌ-）カラム（３×７０ｃｍ））に供し、水によって溶出し、非吸着画分である多糖類（２）を得た。収量は５ｇであった。
上記で得られた多糖類（１）及び（２）の理化学的性質を表１に示し、スペクトルデータを表２に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】
【表２】
【００２３】
上記表２に示したように、赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）ＫＢｒ法により、多糖類（１）及び（２）はいずれも８９０cm-1付近にβ−グルコシド結合を示す吸収が認められ、β−Ｄ−グルカンであることが確認された。
また、多糖類（２）２０mgを０．３Ｍ ＮａＯＤ・Ｄ2Ｏに溶解して、ＪＥＯＬ製ＧＳＸ−４００スペクトルメーターによって測定した核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル分析）分析の結果、多糖類（２）はキシロース、グルコース、マンノース等を随伴するβ−（１→６）：β−（１→３）−Ｄ−グルカン蛋白複合体であることが確認された。
【００２４】
実施例２
ヤマブシタケ菌糸体を、蔗糖（グルコース）３０ｇ、ポリペプトン２．０ｇ、酵母エキス５ｇ、硝酸ソーダ７ｇ、酸性リン酸−ソーダ７ｇ、塩化カリウム０．３ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇを水１Ｌに溶解し、pHを５．０〜７．０にした培地に植菌した。前記組成の液体培地２００ｍＬずつを１Ｌ容の三角フラスコに分注し、２３〜２５℃、３〜５日間通風培養あるいはロータリーシェカーを用いて２００r.p.m.にて振盪培養し、菌糸体とともにやや粘稠性のある培養濾液を得た。
遠心分離した得た菌糸体に７倍量の水を加え、９５〜１００℃にて３時間熱水抽出を行なった。熱水抽出液を冷却し、５倍量の９９％濃度のエタノールを加え、多糖類を沈殿させ、遠心分離によって得た沈殿を流水中で透析後、凍結乾燥粉末して粗多糖類（３）を得た。収量は菌糸体１ｇ当り８０ｍｇであった。
次いで、上記の菌糸体を培養して得られた培養濾液を１／５容まで減圧濃縮し、これに等量の９９％濃度のエタノールを加え、４℃にて一夜放置し生じた沈殿を遠心分離後、真空凍結乾燥して、粗多糖類（４）の粉末を得た。収量は培養濾液１Ｌ当り８００ｍｇであった。
【００２５】
次いで、菌糸体由来の粗多糖類（３）及び培養濾液由来の粗多糖類（４）の粉末、各１０ｇずつを陰イオン交換クロマト法（ＤＥＡＥセルロース（Ｃｌ-）カラム（３×７０cm））に供し、水によって溶出し、吸着画分を、０→２Ｍ食塩溶液による濃度勾配溶出によって、多糖類（５）及び（６）を得た。収量は多糖類（５）は４ｇ、多糖類（６）は４．３ｇであった。
上記で得られた多糖類（５）及び（６）の理化学的性質を表３に示し、スペクトルデータを表４に示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
上記表４に示した赤外線吸収スペクトル（ＩＲ）ＫＢｒ法により、多糖類（５）及び（６）はいずれも８９０cm-1付近にβ−グルコシド結合を示す吸収が認められ、β−Ｄ−グルカンであることが確認された。
また、多糖類（５）及び（６）それぞれ各２０mgを０．３Ｍ ＮａＯＤ・Ｄ2Ｏに溶解して、ＪＥＯＬ製ＧＳＸ−４００スペクトルメーターによって測定した核磁気共鳴スペクトル（1Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析、13Ｃ−ＮＭＲスペクトル分析）分析の結果、多糖類（５）はグルコキシラン−蛋白複合体でβ−（１→６）：β−（１→３）−Ｄ−グルカン構造をもつことが確認された。
多糖類（６）もβ−（１→６）：β−（１→３）−Ｄ−グルカン構造をもつガラクトキシログルカン−蛋白複合体であることが確認された。
【００２９】
試験例１ 腓腹筋を用いた抗筋肉疲労作用の検討
ウレタン麻酔（１．０ｇ／１０ｍＬ／ｋｇ、腹腔内注射）を施した雄ラット（日本クレア製Ｊｃｌ：ＳＤ系２５０〜３００ｇ）の十二指腸内にカニューレを挿入後、腹位に固定した。腓腹筋を剥離し、腱の切断末端に糸をつけ、日本光電製 ＦＤ−ピックアップを介して、筋の張力を記録した。電気刺激は、エム・イー・コマーシャル製（ＭＥ２１００）刺激装置から注射針電極を介して、腓腹筋に直接行なった。記録開始後１０分間は０．１Ｈｚで安定させ、安定後４Ｈｚで１５分間刺激した。腓腹筋を０．１Ｈｚで刺激した時は、筋収縮力は数時間安定し変化しないが、４Ｈｚで刺激すると収縮力は一過性に増加した後に減少した。次いで、上記実施例１で得た多糖類（１）、（２）及び実施例２で得た多糖類（５）、（６）をそれぞれ３００mg/kgずつ十二指腸内に注入し、３０分間刺激を休止した後、４Ｈｚで２分間刺激し筋収縮力を記録した。以後１時間毎に、３時間まで筋の収縮力の回復を、最初に４Ｈｚで刺激した時の最大収縮力を１００として測定した。
【００３０】
結果を表５に示す。表５から明らかなように、多糖類（１）、（２）、（５）、（６）の投与により、時間の経過とともに統計学的に有意の筋収縮力（数値が１００に近似するほど筋肉疲労回復効果が強い）の回復促進が認められ、各多糖類は抗筋肉疲労作用を有することが確認された。
【００３１】
【表５】
【００３２】
試験例２ 摘出心臓を用いた抗筋肉疲労作用の検討
摘出心臓標本を用いた試験では、大動脈と後大動脈にカニューレを入れ、心臓内に栄養液であるリンゲル液（塩化ナトリウム６ｇ、塩化カリウム０．０７ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ、炭酸水素ナトリウム０．１ｇを１Ｌの水に溶解した液）を灌流させる。なお、静脈洞（ペースメーカ）が残っているので自動能は残っている。また、この標本には交感神経節後線維（心臓機能に促進的に働く）の終末部と副交感神経節及び節後線維（心臓機能に抑制的に働く）が含まれているので、これらに働く薬剤と心筋に直接働く薬剤の検定ができる。
【００３３】
本発明の試験の概略を図１に示す。まず、ガマの脳脊髄を破壊し、背位に固定した。次いで、図１に記載の１−７の操作を順次実施し、大動脈から後大静脈にリンゲル液がスムーズに潅流することを確認した。なお、本試験では、上記リンゲル液のカルシウム量を３分の１に減らし、心筋を疲労させ心臓の収縮力を減弱させた。次いで、上記実施例１で得た多糖類（１）、（２）及び実施例２で得た多糖類（５）、（６）の０．５％溶液１ｍＬをそれぞれ心筋内に注入し、心臓内の灌流液を順次交換することによって心臓に対する作用を観察した。試験では、心尖部をセルフィンではさみ、適当な方法、例えばヘーベル（記録するレバー）でキモグラフィー上に心臓の動きを描記した。また、試験中はリンゲル液に通気して酸素供給を計った。
【００３４】
結果を図２及び図３に示す。図２及び図３から明らかなように、多糖類（１）、（２）、（５）、（６）の投与により、顕著な心筋収縮力の促進が認められた。また、多糖類（２）、（５）及び（６）は、多糖類（１）に比べ、心筋収縮力の発現時間が速やかであり、且つ心筋収縮力の促進作用もより優れていることが確認された。
【００３５】
試験例３ ラットに対する生化学的・薬理学的一般試験
４週齢のＳＤ系（雌／雄）ラット３０匹を以下の３群（各群雌５例、雄５例）、すなわち対照（非投与）群、上記実施例１で得た多糖類（１）投与（３，０００mg/kg）群及び多糖類（１）投与（１，０００mg/kg）群に群分けし、１日１回３０日間経口投与し、尿及び血液の各成分値に対する影響を試験した。その結果、全て正常範囲にあり、対照群との差は認められなかった。
【００３６】
上記実施例で得られた多糖類（１）、（２）、（５）、（６）はいずれも一定の分解点、融点を示さず、強熱により炭化するが、著しく安定である。また、１２０℃×２０分間の滅菌処理を行なって、試験例１及び２と同様に抗筋肉疲労作用を確認したところ、活性の低下は見られなかった。
【００３７】
［飲食品の製造］
製造例１
実施例１と同様にして得た子実体の熱水抽出液１kg、砂糖１kg、ハチミツ１５ｇ、カラメル５ｇ、アスコルビン酸０．７５ｇ、クエン酸０．３ｇ及びレモン系香料０．２ｇを調合し、健康飲料を製造した。
【００３８】
製造例２
実施例１と同様にしてエタノール抽出残渣を得、次いで該エタノール抽出残渣を凍結乾燥させ、凍結乾燥物を得た。この凍結乾燥物１０ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ及びリンゴ搾汁液２kgを調合してリンゴジュースを製造した。
【００３９】
製造例３
採肉後、水さらしして脱水した魚肉類２kgを予冷し、実施例１で得た多糖類（２）５ｇ、若干量の塩化カルシウム及び第三リン酸ナトリウムを添加した。次いで、魚肉類をすりつぶし、成形後凍結して冷凍すり味を得た。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、摘出心臓標本による試験概略を示す図である。
【図２】図２は、ヤマブシタケ子実体より得られる本発明の多糖類（１）及び多糖類（２）の抗筋肉（心筋）疲労作用に対する効果を示す図である。図中、縦軸は心筋収縮力、横軸は時間（１cm＝１２０秒）を表す。
【図３】図３は、ヤマブシタケ培養物（培養菌糸体、培養濾液）より得られる本発明の多糖類（５）及び多糖類（６）の抗筋肉（心筋）疲労作用に対する効果を示す図である。図中、縦軸は心筋収縮力、横軸は時間（１cm＝１２０秒）を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンゴハリタケ属のきのこ子実体、その菌株の培養物又はそれらの処理物から抽出される複合成分を有効成分とすることを特徴とする抗筋肉疲労剤。
【請求項２】
サンゴハリタケ属のきのこがヤマブシタケである請求項１記載の抗筋肉疲労剤。
【請求項３】
請求項１記載の複合成分を、更にクロマト分画処理及び／又は膜分離処理して得られる糖蛋白複合体を有効成分とすることを特徴とする抗筋肉疲労剤。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の抗筋肉疲労剤を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項１】
サンゴハリタケ属のきのこ子実体、その菌株の培養物又はそれらの処理物から抽出される複合成分を有効成分とすることを特徴とする抗筋肉疲労剤。
【請求項２】
サンゴハリタケ属のきのこがヤマブシタケである請求項１記載の抗筋肉疲労剤。
【請求項３】
請求項１記載の複合成分を、更にクロマト分画処理及び／又は膜分離処理して得られる糖蛋白複合体を有効成分とすることを特徴とする抗筋肉疲労剤。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の抗筋肉疲労剤を含有することを特徴とする飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００７−１９２０（Ｐ２００７−１９２０Ａ）
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１８３２００（Ｐ２００５−１８３２００）
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（０００１１８０９５）
【出願人】（５９１２５３２４９）パワフル健康食品株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【出願人】（０００１１８０９５）
【出願人】（５９１２５３２４９）パワフル健康食品株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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