抗血管新生活性を有する組換えアデノウイルス
本発明は、（ａ）アデノウイルスの逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）ヌクレオチド配列と、（ｂ）（ｉ） ＶＥＧＦＲ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）の細胞外ドメインとを含むキメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列と、を含む血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルス、及びこれを含む血管新生抑制用医薬組成物に関する。キメラデコイ受容体を発現する本発明の組換えアデノウイルスは、血管新生を非常に効果的に抑制し、多様な血管新生関連疾患の遺伝子治療剤として利用することができる。特に、本発明の組換えアデノウイルスは、腫瘍崩壊能に優れている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラデコイ受容体を発現する血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルス及びこれを含む薬剤学的血管新生抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の血管から新しい血管が形成される血管新生は、厳密に調節される一連の過程であって、細胞外基質と基底膜の分解を介して始まり、毛細血管内皮細胞の分裂、分化、周辺基質への浸潤、そして新しい機能的ネットワークへの再組織化を通じて完成される１。血管新生のためには、様々な種類の増殖因子が必要であり、これらのうち、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）、特にＶＥＧＦ−Ａが主に関与することが明らかにされている。特異的スプライシングにより形成される７種類のヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム（ＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１４５，ＶＥＧＦ１４８，ＶＥＧＦ１６５，ＶＥＧＦ１８３，ＶＥＧＦ１８９，ＶＥＧＦ２０６）は、それぞれ１２１，１４５，１４８，１６５，１８３，１８９そして２０６個のアミノ酸残基から構成されており、このうち、ＶＥＧＦ１２１の基本配列は、全てのアイソフォームに共有されている２−４。
【０００３】
ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体の結合により、血管内皮細胞の細胞アポトーシスの抑制、リンパ管形成、免疫抑制、血管透過性、そして造血幹細胞の生存などが調節される４−７。
【０００４】
固形癌は、血管がない状態で２ｍｍ〜３ｍｍの大きさまで育つことができるが、それ以上の成長のためには、酸素と栄養素の供給のために、ＶＥＧＦにより誘導される血管新生が必須である。正常な組織において、血管ネットワークは、誘導因子と抑制因子の適切な比率を通じて、効果的な血流速度と均一な血管の幅を有した階層的構造を備える５。しかし、腫瘍で見られる血管系は、血管壁による透過性が増加されていて、高い内圧を有しており、血管が大きくなっているなど、異常に発達している。腫瘍における制御されていない血管新生及び異常な血管の形態は、腫瘍内部の低酸素症と低いｐＨにより高発現されるＶＥＧＦと、これの受容体であるＶＥＧＦＲ２との結合により生じる細胞内情報により起こる９。
【０００５】
ＶＥＧＦによる血管新生は、腫瘍の成長だけではなく、浸潤と転移にも重要な役割を果たす１０。肺癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、そして子宮癌のような多様な腫瘍において、ＶＥＧＦが過剰発現されていることが示され、ＶＥＧＦの発現が高い癌であるほど、予後もよくないことが報告された１１。腫瘍の増殖に血管新生による血流供給の増加は必須であるため、腫瘍内血管新生の抑制は、癌治療の主要な標的になっており、アンギオスタチン、エンドスタチン、スロンボスポンディン−１、そしてｕＰＡ断片などが、現在血管新生抑制剤として利用されている。また、ＶＥＧＦの活性を抑制するか、ＶＥＧＦの細胞受容体であるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）又はＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）の機能を抑制することにより、腫瘍の成長を抑制するか転移を抑制する研究が活発に進行されている１２−１６。細胞内だけではなく、細胞外でもＶＥＧＦと細胞受容体との結合を阻害できる中和抗体や、ＶＥＧＦＲ−１又はＶＥＧＦＲ−２特異的中和抗体は、ヌードマウスに形成されたヒト腫瘍異種移植片を処理した場合、血管内皮細胞の細胞アポトーシスを誘導して、腫瘍の成長を著しく抑制した１７。
【０００６】
ＶＥＧＦトラップは、細胞表面にあるＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２のドメインを結合して作製した水溶性デコイ（おとり）ＶＥＧＦ受容体であって、ＶＥＧＦと高い親和性を有している。現在までＶＥＧＦトラップに関する研究がたくさんなされており、それにより、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、そして胎盤増殖因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＰＧＦ）に対する親和性がさらに増加されたＶＥＧＦトラップが作製されている１８。様々な腫瘍異種移植モデルで行われた前臨床試験において、ＶＥＧＦトラップの抗腫瘍効果が検証されて１９−２１、ＶＥＧＦトラップ又は抗癌剤のそれぞれ単独で処理した場合に比べ、商用的に利用される抗癌剤とＶＥＧＦトラップとの併用治療時に向上された腫瘍成長抑制効果が見られた２２。ＶＥＧＦトラップがＶＥＧＦモノクローナル抗体であるベバシズマブやＶＥＧＦＲ２抗体であるＤＣ１０１に比べて優れた抗腫瘍効果を示す理由は、全てのＶＥＧＦアイソフォームとの高い親和性だけではなく、ＶＥＧＦサブファミリーのうち、ＰＧＦとの結合能も有しているからである２３。したがって、ＶＥＧＦとの親和性が強いＶＥＧＦトラップを腫瘍内で持続的に発現させることができれば、腫瘍から分泌されるＶＥＧＦの発現量を著しく減少させて、優れた抗腫瘍効果を奏することができ、これを通じて、相当な治療効果が得られると期待される。
【０００７】
アデノウイルスは、優れた遺伝子伝達体であって、高い力価で産生が可能であり、容易に濃縮できるため、癌遺伝子治療のための遺伝子伝達体として脚光を浴びている２４−２５。しかしながら、アデノウイルスを利用した癌遺伝子治療剤が臨床的に利用されるためには、周辺の正常組織の細胞には副作用無しに、癌細胞のみを特異的に殺傷できるような特異性と共に、癌細胞を効果的に死滅できる殺傷能の高いアデノウイルスの開発が必要である。腫瘍細胞では、ｐ５３タンパク質の変異だけではなく、繊維芽細胞腫タンパク質（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐＲｂ）の変異が頻繁に生じるか、あるいはｐＲｂ関連情報系が相当部分損傷されているため、ｐＲｂとの結合能を失ったアデノウイルスは、正常細胞では、ｐＲｂの活性によりアデノウイルスの複製が抑制されるが、ｐＲｂの機能が抑制された腫瘍細胞では、活発に複製されて、癌細胞を特異的に殺傷することができる。このような背景下で、本発明者らは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの癌細胞特異的複製能を増進させるために、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子部位のうち、ｐＲｂとの結合に関与するＣＲ１部位のＧｌｕ残基をＧｌｙ残基に置換し、ＣＲ２部位の７個のアミノ酸残基（ＤＬＴＣＨＥＡ）を全てＧｌｙ残基（ＧＧＧＧＧＧＧ）に置換することにより、ｐＲｂとの結合能を欠失させ、同時にｐ５３タンパク質の機能を抑制するＥ１Ｂ５５ｋＤａとアポトーシスを抑制するＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子を除去することにより、ｐ５３が不活化された腫瘍細胞においてのみ特異的に複製が可能であり、これによる癌細胞特異的細胞殺傷及び細胞アポトーシスを同時に誘発できるような、改善された腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるＡｄ−ΔＢ７を作製して、優れた生体内・外抗腫瘍効果を報告した２６−２８。
【０００８】
本明細書全体にかけて多数の引用文献及び特許文献が参照されて、その引用が表示されている。引用された文献及び特許の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、外来配列をアデノウイルスゲノムに挿入させる戦略でアデノウイルスの血管新生抑制能、特に腫瘍崩壊（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）能を向上させるために鋭意研究した結果、ＶＥＧＦＲのキメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列をアデノウイルスのゲノムに挿入して発現させると、前記アデノウイルスの血管新生抑制能、特に腫瘍崩壊能が顕著に向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、キメラデコイ受容体を発現する、血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルスを提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、キメラデコイ受容体を発現する組換えアデノウイルスを含む血管新生抑制用医薬組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、過多血管新生による疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）アデノウイルスの逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ；ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、（ｂ）（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）の細胞外ドメインとを含むキメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列と、を含む血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルスを提供する。
【００１５】
本発明者らは、外来配列をアデノウイルスゲノムに挿入させる戦略でアデノウイルスの血管新生抑制能、特に腫瘍崩壊能を向上させるために鋭意研究した結果、ＶＥＧＦＲのキメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列をアデノウイルスのゲノムに挿入して発現させると、アデノウイルスの血管新生抑制能、特に腫瘍崩壊能が大きく向上することを見出した。
【００１６】
既存の血管から新しい血管が形成される血管新生は、腫瘍が成長して転移されるのに非常に重要な役割を果たす。血管新生が起こるためには、種々の増殖因子が必要であるが、これらのうち、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が血管新生に主に関与することが明らかにされた。
【００１７】
本発明のアデノウイルスベクターに挿入されるＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインとを含むキメラデコイ受容体は、いわゆるＶＥＧＦトラップの一種であって、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、そしてＰＧＦに対する親和性に優れており、これらの増殖因子に対するデコイ受容体として作用して、血管新生を抑制する。
【００１８】
本明細書で使用される用語‘デコイ受容体’は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰＧＦ、又はこれらの全てに結合して、これらの増殖因子が正常な受容体と結合することを抑制する受容体を意味する。
【００１９】
本明細書で使用される用語‘キメラデコイ受容体’は、ＶＥＧＦＲ−１由来の細胞外ドメインとＶＥＧＦＲ−２由来の細胞外ドメインを結合して製造された受容体を意味する。
【００２０】
本発明で利用されるキメラデコイ受容体は、ＶＥＧＦＲ−１の７個の細胞外ドメインのうち、少なくとも１つの細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の７個の細胞外ドメインのうち、少なくとも１つの細胞外ドメインとを結合して得られるキメラ受容体である。
【００２１】
本発明の好ましい具体例によると、前記キメラデコイ受容体は、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインと、を含む。
【００２２】
より好ましくは、前記キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第３細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｖ）ＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、並びに（ｖ）ＶＥＧＦＲ−１の第５細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインを含む。
【００２３】
あるいは、前記キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第２細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｖ）ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、並びに（ｖ）ＶＥＧＦＲ−２の第５細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインを含む。
【００２４】
本発明で利用されるキメラデコイ受容体は、好ましくは、２個〜４個の細胞外ドメイン、最も好ましくは、３個の細胞外ドメインを含む。
【００２５】
さらに好ましいものとしては、キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン、又は（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第５細胞外ドメインを含むものである。
【００２６】
別のさらに好ましいものとしては、キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメイン、又は（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−１の第５細胞外ドメインを含むものである。
【００２７】
最も好ましくは、本発明で利用されるキメラデコイ受容体は、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメインを含む。
【００２８】
ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。例えば、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号１及び２の配列であり、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号３及び４の配列であって、ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号５及び６の配列である。
【００２９】
本発明の好ましい具体例によると、前記キメラデコイ受容体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ領域と融合される。より好ましくは、本発明で利用されるキメラデコイ受容体は、ＩｇＧのＦｃ領域、最も好ましくは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と融合されている。ＩｇのＦｃ領域は、前記キメラデコイ受容体のＮ末端又はＣ末端と、好ましくは、Ｃ末端と融合される。
【００３０】
好ましいＩｇのＦｃ領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号７及び８に記載されている。
【００３１】
キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスゲノムに挿入される。
【００３２】
キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現コンストラクト内に存在することが好ましい。前記発現コンストラクトにおいて、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに機能的に連結されることが好ましい。本明細書において、用語‘機能的に結合された’は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写因子結合部位の配列）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は翻訳を調節するようになる。本発明において、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列に結合されたプロモーターは、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で機能し、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列の転写を調節することができるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、βアクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、誘導性プロモーター、癌細胞特異的プロモーター（例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター及びＡＦＰプロモーター）及び組織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）を含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＣＭＶプロモーターである。
【００３３】
癌を対象に遺伝子治療を行う場合は、一生治療遺伝子の発現を持続させる必要がなく、局所投与する場合は、アデノウイルスによる免疫反応が大きく問題化されないばかりか、却って長所になり得るため、アデノウイルスを利用した癌遺伝子治療剤の開発研究が活発になされている。したがって、本発明でも、基本的にアデノウイルスのゲノム骨格を利用して癌の遺伝子治療を達成している。
【００３４】
アデノウイルスは、中間程度のゲノム大きさ、操作の利便性、高いタイター、広範囲なターゲット細胞性及び優れた感染性のため、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。ゲノムの両末端は、１００ｂｐ〜２００ｂｐの逆方向末端反復を含み、これは、ＤＮＡ複製及びパッケージングに必須なシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、転写及び宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードする。
【００３５】
アデノウイルスゲノムの少しの部分だけがシスエレメントとして必要であるので（Ｔｏｏｚａ，Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＤＮＡ Ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ，２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１））、特に、２９３細胞のような特定細胞株を利用する場合に、アデノウイルスＤＮＡの多くを外来ＤＮＡ分子に置換することができる。このような側面として、本発明の組換えアデノウイルスにおいて、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列以外に、他のアデノウイルスの配列として少なくとも逆方向末端反復配列を含む。
【００３６】
キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、Ｅ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくは、Ｅ１Ｂ領域）、又はＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、Ｅ３領域に挿入される。一方、他の外来ヌクレオチド配列（例えば、サイトカイン、免疫共刺激因子、アポトーシス遺伝子、及び癌抑制遺伝子）も追加的にアデノウイルスに挿入することができて、これは、Ｅ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくは、Ｅ１Ｂ領域）又はＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、Ｅ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくは、Ｅ１Ｂ領域）に挿入される。また、前記挿入配列は、Ｅ４領域にも挿入できる。
【００３７】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングすることができるため、約２ｋｂを追加的にパッケージングすることができる。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスの野生型ゲノムに追加的に挿入することもできる。
【００３８】
本発明の好ましい具体例において、本発明の組換えアデノウイルスは、不活化されたＥ１Ｂ１９ｋＤａ（「Ｅ１Ｂ１９」とも記載）遺伝子、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ（「Ｅ１Ｂ５５」とも記載）遺伝子、又はＥ１Ｂ１９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ（「Ｅ１Ｂ１９／５５」とも記載）遺伝子を有する。本明細書において、遺伝子と関連して使用される用語‘不活化’は、その遺伝子の転写及び／又は翻訳が正常になされず、その遺伝子によりコードされる正常なタンパク質の機能が誘発されないことを意味する。例えば、不活化Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子は、その遺伝子に変異（置換、付加、部分的欠失、又は全体的欠失）を生じ、活性型のＥ１Ｂ１９ｋＤａタンパク質を産生できない遺伝子である。Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子が欠失された場合は、細胞アポトーシス能が増加して、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が欠失された場合は、腫瘍細胞特異性を有するようになる（参照：大韓民国特許出願第２００２−２３７６０号）。本明細書において、ウイルスゲノム配列と関連して使用される用語‘欠失’は、該当配列が完全に欠失されたものだけではなく、部分的に欠失されたものも含む意味を有する。
【００３９】
本発明の好ましい具体例によると、本発明の組換えアデノウイルスは、活性型のＥ１Ａ遺伝子を含む。Ｅ１Ａ遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、複製可能な特性を有するようになる。本発明のより好ましい具体例によると、本発明の組換えアデノウイルスは、不活化されたＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子及び活性型のＥ１Ａ遺伝子を含む。本発明のさらに好ましい具体例によると、本発明の組換えアデノウイルスは、不活化されたＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子及び活性のＥ１Ａ遺伝子を含み、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、欠失されたＥ３領域に挿入される。
【００４０】
本発明の最も好ましい具体例によると、本発明の組換えアデノウイルスは、不活化されたＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子、及び変異をもつ活性型のＥ１Ａ遺伝子を含み、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、欠失されたＥ３領域に挿入されているものである。ここで、変異をもつ活性型のＥ１Ａ遺伝子は、Ｒｂ結合部位をコードするヌクレオチド配列のうち、第４５番目Ｇｌｕ残基がＧｌｙ残基に置換された変異及び第１２１番目〜１２７番目アミノ酸残基が全てＧｌｙ残基に置換された変異を有する。
【００４１】
腫瘍細胞では、ｐ５３タンパク質の変異だけではなく、Ｒｂの突然変異あるいはＲｂ関連情報系が相当部分損傷されているため、Ｒｂとの結合能が欠失されたアデノウイルスは、正常細胞では、Ｒｂの活性によりアデノウイルスの複製が抑制されるが、Ｒｂの機能が抑制された腫瘍細胞では、活発に複製されて、癌細胞を特異的に殺傷することができる。したがって、上述のＲｂ結合部位における変異を含む本発明の組み換えアデノウイルスは、特異的な腫瘍崩壊性を示す。
【００４２】
下記の実施例で例証されたように、キメラデコイ受容体を発現する本発明の組換えアデノウイルスは、ＶＥＧＦによる血管新生、特に、ＶＥＧＦによる腫瘍細胞における血管新生を特異的に抑制することにより、抗腫瘍効果をもたらす。そして、キメラデコイ受容体を発現する本発明の組換えアデノウイルスは、低い力価のウイルスでも高い殺傷効果を誘導することができるため、投与された体内における安全性に非常に優れている。
【００４３】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）上述の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含む抗血管新生組成物を提供する。
【００４４】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）上述の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含む抗血管新生組成物を、これを必要とする対象に投与する段階を含む過多血管新生による疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物に有効成分として含まれる組換えアデノウイルスは、上述の本発明の組換えアデノウイルスと同一なものであるため、組換えアデノウイルスに対する詳細な説明は、本発明の薬剤学的組成物にも同様に適用される。したがって、本明細書の不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。
【００４６】
本発明の抗血管新生組成物により予防又は治療できる疾患又は疾病は、過多な血管新生により招来されるあらゆる疾患又は疾病を含み、好ましくは、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロ−ム性動脈硬化プラーク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ性関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症又は神経退行性疾患である。
【００４７】
本発明で開発されたキメラデコイ受容体を発現する組換えアデノウイルスは、血管新生を効果的に抑制し、多様な血管新生関連疾患、特に、抗腫瘍効果が格段に増大されて、特に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が不活化されるか、Ｅ１ＡにおいてＲｂ結合部位が変異された場合は、癌細胞特異性に非常に優れる。これは、結果的に癌治療に必要なウイルス投与量を減少させることができて、ウイルスによる生体内毒性と免疫反応を大きく減らすことができる。
【００４８】
本発明の組成物に含まれる組換えアデノウイルスは、多様な腫瘍細胞に対して殺傷効能を示すため、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍に係る様々な疾病又は疾患、例えば、脳癌、胃癌、皮膚癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、頭頸癌、皮膚癌、黒色腫、結腸癌及び子宮頸癌などの治療に利用することができる。本明細書において、用語‘治療’は、（ｉ）血管新生の予防；（ｉｉ）血管新生の抑制による血管新生に係わる疾病又は疾患の抑制；及び（ｉｉｉ）血管新生の抑制による血管新生に係わる疾病又は疾患の軽減を意味する。したがって、本明細書における用語‘治療学的有効量’は、上記した薬理学的効果を達成するに十分な量を意味する。
【００４９】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００５０】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は、局部投与を利用して投与することができる。卵巣癌で腹腔内に投与する場合及び肝癌で門脈に投与する場合は、注入方法により投与することができて、乳癌の場合は、腫瘍塊に直接注射して投与することができ、結腸癌の場合は、浣腸で直接注射して投与することができて、膀胱癌の場合は、カテーテル内に直接注入することができる。
【００５１】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々であり、普通に熟練した医者は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、１×１０５ＰＦＵ／ｍｌ〜１×１０１５ＰＦＵ／ｍｌの組換えアデノウイルスを含み、通常、１×１０１０ＰＦＵを２日に１回、２週間注射する。
【００５２】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造する。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エリキシル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【００５３】
本発明の薬剤学的組成物は、単独療法として利用してもよいが、他の通常的な化学療法又は放射療法と共に利用してもよく、このような並行療法を実施する場合は、より効果的に癌治療をすることができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランス−プラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びメトトレキサートなどを含む、本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、Ｘ線照射及びγ線照射などである。
【発明の効果】
【００５４】
本発明の特徴及び長所を要約すると、下記のようである：
（ａ）本発明の組換えアデノウイルスは、血管新生を抑制するキメラデコイ受容体を発現する。
（ｂ）キメラデコイ受容体を発現する本発明の組換えアデノウイルスは、血管新生を顕著に抑制して、多様な血管新生関連疾患の遺伝子治療剤として利用できる。
（ｃ）特に、本発明の組換えアデノウイルスは、腫瘍崩壊能に優れている。
（ｄ）既存の血管新生関連抗癌剤（例えば、アバスチン）は、細胞増殖抑制効果のみを有しており、癌治療剤としての限界を有しているが、本発明の組換えアデノウイルスは、殺細胞効果を有しており、癌細胞を死滅させることができて、これにより、既存の癌治療剤の限界を克服することができる。
（ｅ）また、既存の血管新生関連抗癌剤は、正常細胞にも作用し、副作用を誘発するが、本発明の組換えアデノウイルスは、癌細胞に特異的に作用し、このような副作用を大きく減らすことができる。
（ｆ）既存のＶＥＧＦトラップは、タンパク質製剤であって、生体内において半減期が短い。しかし、本発明の組換えアデノウイルスは、持続的にＶＥＧＦトラップを過剰発現するため、このような問題点を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１ａ】図１ａは、組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターのコンストラクトで、Ｅ１が欠失した複製不能組換えアデノウイルスに関する。ｄＥ１−ｋ３５は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの調節下でβ−ガラクトシダーゼを発現する。ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３は、Ｅ３部位にキメラデコイ受容体ＫＨ９０３を含む。
【図１ｂ】図１ｂは、組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターのコンストラクトで、複製可能組換えアデノウイルスに関する。ＲｄＢは、変異されたＥ１Ａを含み、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａとＥ１Ｂ５５ｋＤａが欠失している。ＲｄＢ／ＫＨ９０３は、Ｅ３部位にキメラデコイ受容体ＫＨ９０３を含む。
【図１ｃ】図１ｃは、培地に分泌されたＫＨ９０３を検出した結果である。Ａｄ：アデノウイルス；ＩＴＲ：逆方向末端反復配列；ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図２ａ】図２ａは、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３によるＶＥＧＦ発現の抑制を示すＶＥＧＦレベルの定量化の結果である。図２ａにおいて、多様なヒト肺癌細胞株に対して２０ＭＯＩ〜１００ＭＯＩ（感染多重度）でｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させた。感染４８時間後、上清のＶＥＧＦ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。Ｃｅｌｌ：非感染細胞
【図２ｂ】図２ｂは、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３によるＶＥＧＦ発現の抑制を示すＶＥＧＦレベルの定量化の結果で、Ａ５４９細胞溶解液中のＶＥＧＦレベルを測定した結果である。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図３】図３は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ誘導性増殖に対するｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３の抑制実験の結果である。ＨＵＶＥＣを３０ＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３で処理した。感染７２時間後、ＭＴＴ分析を行って、総生存細胞を測定した。結果は、３回行った実験の平均で示した。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図４ａ】図４ａは、ＨＵＶＥＣ運動性に対するｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３の影響を示す。ＥＢＭを含む２４ウェル組織培養プレートの上部チャンバに細胞を静置して、３．５時間後、通過細胞を固定化して、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンとエオシン）で染色したものである。図４ａは、ＨＵＶＥＣの運動性を示す（倍率：×４０）。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図４ｂ】図４ｂは、図４ａのものにおいて、高倍率（×２００）で、フィールドにおける運動性の細胞数を数えた。８個のフィールドを２回ずつカウントした。エラーバーは、±ｓ．ｅを示す。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．００１，ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図５ａ】図５ａは、ＨＵＶＥＣのチューブ形成に関するｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３の効果を示す。ＨＵＶＥＣをマトリゲルコートされたプレートに１．５×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングして、次いで、ｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させ（２０ＭＯＩ）、Ａ５４９又はＨ４６０のコンディショニング培地で４８時間培養した。図５ａは、チューブ形成に対する代表的な写真である（倍率：×４０）。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図５ｂ】図５ｂは、図５ａのもののチューブ形成に対する定量的分析結果である。チューブネットワークによりカバーされる広さを測定し、チューブ形成の定量化を行った。実験は３回行って、値は、これらの平均で示した。エラーバーは、±ｓ．ｅを示す。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．００１，ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図６】図６は、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３による血管の出芽（ｖｅｓｓｅｌ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）抑制を示す。ＫＨ９０３を含む複製不能アデノウイルスは、エクスビボでＶＥＧＦ誘導性の血管の出芽を抑制する。分析結果は、０（最小ポジティブ）から５（最大ポジティブ）までスコアリングした。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図７】図７は、ＲｄＢ／ＫＨ９０３のインビトロ細胞変性効果を示す。細胞を、指定されたＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３、ＲｄＢ又はＲｄＢ／ＫＨ９０３に感染させた。複製不能アデノウイルスｄＥ１−ｋ３５を陰性対照群として利用した。感染４日目〜１０日目にプレートにある細胞を固定化して、クリスタルバイオレットで染色した。
【図８】図８は、ＫＨ９０３発現アデノウイルスの抗腫瘍効果を示す。１×１０７個のＨ４６０腫瘍細胞を皮下注入した異種移殖モデルを作製した。腫瘍を８０ｍｍ３〜１２０ｍｍ３まで成長させた。腫瘍を有するヌードマウスを３つの実験群（それぞれ５匹ずつ）にランダムに分けた。それぞれの実験群に対して、１日、３日及び５日目にアデノウイルス（３０μｌのＰＢＳ中に１×１０１０個のアデノウイルス粒子）を腫瘍内に注入した。腫瘍の短軸（ｗ）及び長軸（Ｌ）を測定し、腫瘍成長を毎日モニタリングした。
【図９ａ】図９ａは、ＲｄＢ／ＫＨ９０３で処理されたＨ４６０腫瘍組織の血管新生に対する組織学的評価結果である。図９ａにおいて、微細血管を抗ＰＥＣＡＭ抗体（ＣＤ３１）で染色した。ＣＤ３１に対する染色結果を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ＲｄＢ／ＫＨ９０３で処理されたＨ４６０腫瘍組織の血管新生に対する組織学的評価結果である。図９ｂは、腫瘍組織に対する血管数を定量化した結果である。データを平均（ｎ＝３）±標準誤差で示した。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。
【実施例】
【００５７】
−実験材料及び実験方法−
１．対象細胞株及び細胞の培養
実験に使用されたヒト肺癌細胞株であるＡ５４９とＨ４６０は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入して、ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）は、Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，スイス）から購入した。アデノウイルスの初期発現遺伝子であるＥ１部位が宿主遺伝体内に内在されているＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ）をアデノウイルス産生細胞株として使用した。ＨＵＶＥＣを除いた全ての細胞株は、１００Ｕ／ｍｌペニシリンと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加した１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培養液で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＨＵＶＥＣは、５％ＦＢＳの含まれたＥＧＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＣ，ＵＳＡ）に抗生剤１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を入れて、継代培養５日目〜８日目の細胞で実験を行った。
【００５８】
２．ＫＨ９０３を発現するアデノウイルスの作製及び力価算出
ＫＨ９０３を発現する組換えアデノウイルスを作製するために、ＫＨ９０３プラスミドであるｐＫＨ９０３（ＫａｎｇＨｏｎｇ，Ｃｈｅｎｇ ｄｕ，中国）をアデノウイルスＥ１シャトルベクターであるｐＣＡ１４（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）にＥｃｏＲＩ切断して挿入した後、これを再びＢｇｌＩＩで切断して得られたＫＨ９０３のＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで切断したＥ３シャトルベクターｐＳＰ７２ΔＥ３（本発明者が作製、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：６１−７１（２００５））に挿入した。ＫＨ９０３は、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン（配列番号１及び２の配列）、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン（配列番号３及び４の配列）及びＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン（配列番号５及び６の配列）が順次結合して製造されたキメラデコイ受容体に、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（配列番号７及び８の配列）が融合されて作られたものである。作製されたｐＳＰ７２ΔＥ３／ＫＨ９０３ベクターをＸｂａＩで切断し、ｐＳＰ７２ΔＥ３／ＣＭＶベクター（本発明者が作製、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：６１−７１（２００５））のＣＭＶプロモーターを挿入してｐＳＰ７２ΔＥ３−ＣＭＶ−ＫＨ９０３ Ｅ３シャトルベクターを製造した。ＫＨ９０３を発現する複製不能アデノウイルスを作製するために、上記作製されたｐＳＰ７２ΔＥ３−ＣＭＶ−ＫＨ９０３ Ｅ３シャトルベクターをＰｖｕＩで処理して直鎖化し、Ｅ３遺伝子が欠失されて、Ｅ１部位にｌａｃＺが挿入されており、アデノウイルスタイプ３５のファイバーノブ（ノブ）で置換されたｐｄＥ１−ｋ３５トータルベクター［Ａｄ３５ファイバーノブ部分を有したアデノウイルス（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ）からＰＣＲで７００ｂｐの３５ノブ部分を得て、ＮｃｏＩ／ＭｆｅＩで切断し、予めＮｃｏＩ／ＭｆｅＩで切断していたｐＳＫ５５４３（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｂｌａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌｉｖｅｒ ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：２４８−２６１（２００５））とライゲーションしてｐＳＫ５５４３／３５ｋを作製した。作製されたｐＳＫ５５４３／３５ｋは、ＳａｃＩＩ／ＸｍｎＩで切断し、ＳｐｅＩで切断したｄＥ１／ｌａｃＺと相同組換えすることでｐｄＥ１−ｋ３５を作製した］をＳｐｅＩで処理して直鎖化した。これらで大腸菌ＢＪ５１８３（スイスのＦｒｉｂｏｕｒｇｈ大学のＶｅｒｃａ；Ｈｅｉｄｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８（２）：２６０−２６５，２６８−２７０（２０００））を同時形質転換し、相同組換えにより、ｌａｃＺ遺伝子とＫＨ９０３を同時に発現する複製不能アデノウイルスベクターであるｐｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を作製した。ＶＥＧＦを効果的に抑制させることのできるＶＥＧＦトラップを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスを作製するためには、上記作製されたｐＳＰ７２ΔＥ３−ＣＭＶ−ＫＨ９０３ Ｅ３シャトルベクターをＰｖｕＩで処理して直鎖化したものと、ＳｐｅＩ処理して直鎖化したｐＲｄＢアデノウイルストータルベクター（Ｅ１ＡのＲｂ結合部位が変異して、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子とＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が共に欠失された腫瘍崩壊アデノウイルス，参照：大韓民国特許第０７４６１２２号）とで、一緒に大腸菌ＢＪ５１８３を形質転換して、ｐＲｄＢ／ＫＨ９０３腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを作製した。Ｅ１ＡのＲｂ結合部位の変異は、ＥｌＡ遺伝子配列に位置したＲｂ結合部位をコードするヌクレオチド配列のうち、第４５番目のＧｌｕ残基がＧｌｙ残基に置換された変異、及び第１２１番目〜１２７番目アミノ酸残基が全てＧｌｙ残基に置換された変異である。相同組換えされたアデノウイルスベクターをＨｉｎｄＩＩＩで処理して相同組換えの有無を確認した後、確認されたプラスミドを、ＰａｃＩ制限酵素で切断した後、ＨＥＫ２９３細胞株を形質転換してアデノウイルスを産生した。対照群として使用されたウイルスは、Ｅ１部位の遺伝子が欠失して、その部位にｌａｃＺ遺伝子を有するｄＥ１−ｋ３５と、同時にＥ１Ｂ１９ｋＤａとＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が全て欠失したＲｄＢである。それぞれのアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞株で増殖させて、ＣｓＣｌ濃度勾配で濃縮して精製して、限界適正分析（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）及びフォトスペクトロメーターで力価（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ； ＰＦＵ）を算出した。
【００５９】
３．ウェスタンブロット
ＫＨ９０３を発現するアデノウイルスをヒト肺癌細胞株に感染させることで、細胞内でＫＨ９０３タンパク質が産生されて、細胞培養液に分泌されるかどうかを検証するために、Ａ５４９細胞に、作製したアデノウイルスであるｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を、２０ＭＯＩ、５０ＭＯＩ及び１００ＭＯＩでそれぞれ処理して、４８時間後に細胞培養液と細胞を全て回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。電気泳動後、ゲルにあるタンパク質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜にエレクトロトランスファーした後、ＫＨ９０３のヒトＩｇＧのＦｃ部位を特異的に認識する抗体を一次抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）として用いた。ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）として反応させた後、ＬＡＳ４０００を用いて、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）による発色で、膜上のタンパク質と抗体との結合の有無を調べて、各タンパク質の発現を確認した。
【００６０】
４．ＶＥＧＦ発現変化
腫瘍から分泌されるＶＥＧＦを効果的に抑制可能なＫＨ９０３を発現するアデノウイルスにより、ＶＥＧＦの発現が減少されるかどうかを検証するために、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を行った。まず、ＶＥＧＦの発現が効果的に抑制されるかを検証するために、肺癌細胞株であるＡ５４９、Ｈ４６０、Ｈ３２２（ＡＴＣＣ）、Ｈ３５８（ＡＴＣＣ）及びＨ１２９９（ＡＴＣＣ）を６ウェルプレートにそれぞれ３×１０５細胞／ウェルで播いた後、翌日アデノウイルスを２ＭＯＩ〜１００ＭＯＩで感染させて６時間後、５％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地に入れ替えた。ウイルス感染から４８時間後に培地を回収するために、培地回収の２４時間前にＦＢＳの含まれていないＤＭＥＭに入れ替えた。回収された培地は、８００×ｇで遠心して上清を分離した後、このうち、１５０μｇを利用してＶＥＧＦのＥＬＩＳＡ分析を行った。
【００６１】
５．ＭＴＴ分析
アデノウイルス感染後のＫＨ９０３の発現による血管内皮細胞増殖能の抑制を定量化するために、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｈｉａｚｏｌ−２ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，２ｍｇ／ｍｌ）分析を行った。ＨＵＶＥＣを２％ゼラチンでコートされた４８ウェルプレートに播いて、２４時間後、３０ＭＯＩの組換えアデノウイルスで処理した。ウイルス処理前、ＨＵＶＥＣは、ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＣ，ＵＳＡ）培地で血清飢餓（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）処理した。ウイルス処理７２時間後の細胞の生存率を測定するために、培地を除去した後、ＭＴＴ溶液を各ウェル当たり１５０μｌ入れて、５％ＣＯ２の存在下、３７℃恒温培養器中で４時間反応した後、上清を除去した。上清の除去されたプレートウェルに１ｍｌのＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）を添加して、３７℃で１０分間反応した後、上清（ＤＭＳＯで溶出されたもの）の５４０ｎｍでの吸光度を測定し、細胞の相対的生存率を測定した。
【００６２】
６．内皮細胞の移動性分析
ＨＵＶＥＣの走化性を調べるために、６．５ｍｍ直径のポリカーボネートろ紙（８μｍポアサイズ）のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、内皮細胞の運動性分析を行った。まず、上部チャンバのフィルターを０．１％ゼラチンでコートした。ゼラチンの乾燥後、６時間血清飢餓培地で培養し、血清飢餓処理したＨＵＶＥＣを１×１０５細胞になるようにカウントし、上部チャンバに入れて、ｄＥ１−ｋ３５とｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させて、回収した細胞培養液を下部チャンバに入れて、プレートを３７℃で３時間３０分間インキュベートした。プレートを取り出して、上部チャンバの培地を捨てた後、細胞をメタノ−ルで１分間固定し、Ｈ＆Ｅ染色してスライドを作製した。その後、グループ別に２００倍の倍率で８ヶ所の写真を撮って、平均を求め、細胞の運動性を定量化した。
【００６３】
７．チューブ形成分析
腫瘍が分泌するＶＥＧＦを効果的に抑制できるＫＨ９０３によるＶＥＧＦの発現減少により、血管内皮細胞のチューブ形成機能が変化するかどうかを調べるために、ＨＵＶＥＣを利用したチューブ形成分析を行った。まず、２５０μｌの増殖因子を減らしたマトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏ−ｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を−２０℃に保存しておいた２４ウェルプレートに均一にプレート後、３７℃で３０分間置いて固めた。ＨＵＶＥＣ（５回〜７回継代培養）細胞は、６時間、血清飢餓ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＣ，ＵＳＡ）培地で培養し、血清飢餓処理した後、トリプシン処理して細胞数を測定した。ｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスでそれぞれ２０ＭＯＩ処理した後、４８時間後に回収したＡ５４９及びＨ４６０細胞培養液を、血清飢餓の前処理をしたＨＵＶＥＣ（１．５×１０５細胞／ウェル）と混ぜた後、マトリゲルがプレートされた２４ウェルプレートに播いて培養した。陽性対照群としては、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦタンパク質を利用した。培養後１２時間〜１６時間の間に培養液を除去して、ＰＢＳで２回洗浄した後、顕微鏡でチューブ形成を観察した。
【００６４】
８．エクスビボ大動脈輪出芽分析
腫瘍から分泌されるＶＥＧＦを効果的に抑制できるＫＨ９０３による血管形成抑制を観察するために、大動脈輪出芽（ａｏｒｔａｌ ｒｉｎｇ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）分析を行った。オリエント社（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ，Ｋｏｒｅａ，Ｉｎｃ．）から購入した６週齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットから大動脈を分離して、大動脈周辺の繊維脂肪組織を除去した後、１ｍｍ厚の輪に薄く切断した。予め冷やしておいた４８ウェルプレートにマトリゲルを２００μｌずつプレートして、大動脈輪をそれぞれのウェルの中のマトリゲルに植えた後、３７℃で２０分間置いた。マトリゲルが固まった後、チューブ形成分析で使用された細胞培養液２５０μｌをそれぞれのウェルに添加して培養し、毎日顕微鏡で大動脈輪から形成された血管を観察した。陽性対照群として、ＶＥＧＦタンパク質（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いた。培養後、新しく形成された血管は、二重盲分析により、陽性対照群を５点、血管が形成されなかった実験群を０点の点数を付与して分析して、それぞれの実験群に対して１２個の大動脈輪を対象に大動脈輪出芽分析を行った。
【００６５】
９．ＫＨ９０３が発現するアデノウイルスの腫瘍殺傷能
腫瘍から分泌されるＶＥＧＦを減少させるＫＨ９０３の発現の有無がアデノウイルスの複製にどのような影響を及ぼすか検証するために、細胞変性分析を行った。肺癌細胞株を含むヒト腫瘍細胞株を４８ウェルプレートにそれぞれ播いて、２４時間後、ｄＥ１−ｋ３５，ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３，ＲｄＢ又はＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを０．１ＭＯＩ〜１０ＭＯＩで感染させた。対照群ウイルスとの差が最も顕著な時点で培地を除去し、プレートの底に残っている細胞を０．５％クリスタルバイオレットで固定して染色した後、分析した。
【００６６】
１０．生体内抗腫瘍効果の検証
オリエント社から購入した生後６週〜８週程度のヌードマウスの腹部皮下に１×１０７個のヒト肺癌細胞株、Ｈ４６０を注射した。腫瘍の容積が約７０ｍｍ３〜１００ｍｍ３程度になった時、ＲｄＢ、ＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを陰性対照群のＰＢＳと共にそれぞれ２日間隔で３回腫瘍内に直接注射した後、腫瘍の大きさを２日間隔で測定した。腫瘍の容積は、カリパースで腫瘍の短軸と長軸を測定し、下記のような公式で算出した：
腫瘍の容積（ｍｍ３）＝（短軸（ｍｍ））２×長軸（ｍｍ）×０．５２３
【００６７】
１１．ＶＥＧＦと結合するＫＨ９０３を発現する腫瘍特異的崩壊性アデノウイルスの投与による腫瘍組織内の血管新生の抑制
６〜８週齢のヌードマウスの腹部皮下に肺癌細胞株であるＨ４６０を注射した後、腫瘍の大きさが約１００〜１２０ｍｍ３程度になった時、ＲｄＢ，ＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルス又は陰性対照群のＰＢＳを２日間隔で３回腫瘍内投与した。最後のウイルスを投与した後、１０日後頃に腫瘍を摘出して、ＩＨＣ ｚｉｎｃ ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｒｅｅ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）溶液で固定した後、パラフィンブロックを作製した。作製したパラフィンブロックを４μｍ厚に切断してスライドを作った後、これをキシレン、１００％、９５％、８０％及び７０％エタノ−ル溶液に順に浸してパラフィンを除去してから、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。腫瘍が分泌するＶＥＧＦと結合してその発現を減少させるＫＨ９０３により腫瘍組織内血管形成が抑制されるかどうか確認するために、血管内皮細胞特異的抗原であるＣＤ３１を特異的に認識できる抗体であるラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＭＥＣ１３．３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、組織免疫染色を行った。パラフィンが除去された４μｍ厚の腫瘍組織スライドを３％Ｈ２Ｏ２溶液で１０分間反応して、内因性過酸化酵素の作用を除いた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で３０分間処理して非特異的な抗体反応が起こらないようにした後、ＣＤ３１抗体を一次抗体としてハイブリダイゼーションを行った。ビオチンの結合されたポリクロ−ナル抗ラットＩｇＧ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を二次抗体として反応した後、ＤＡＢ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して、ＣＤ３１の発現を調べた。
【００６８】
１２．腫瘍内血管数の計測
血管内皮細胞特異的抗原であるＣＤ３１（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）に対する染色を行った腫瘍内血管をまず低倍率で観察し、無作為に写真を取った後、倍率を高めて１００倍視野で観察される血管の数を定量した。３枚のスライドからそれぞれ５個の視野を選択し血管数を計測して、平均値を算出し、その値を代表値として使用した。
【００６９】
−実験結果−
１．ＶＥＧＦと特異的に結合するＫＨ９０３を発現するアデノウイルスの作製及びＶＥＧＦ発現変化の検証
ＶＥＧＦに特異的に結合し、腫瘍から分泌するＶＥＧＦの発現を抑制するＶＥＧＦトラップであるＫＨ９０３を発現するアデノウイルスｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を作製した（図１ａ）。ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスのＥ３部位に挿入されたＫＨ９０３が、細胞感染時に実際に細胞から培地に分泌されるか確認するために、感染させた腫瘍細胞と培地を全て回収し、ＫＨ９０３の構造のうち、ヒトＩｇＧのＦｃ部位を検出する抗体を利用してウェスタンブロッティングを行った。結果的に、細胞溶出液ではＫＨ９０３の産生を確認できる程度の量が観察されたが、培地では、多量のＫＨ９０３を観察することができた。したがって、ＫＨ９０３は感染された細胞内で産生されて、培地に分泌されることを確認することができた（図１ｃ）。
【００７０】
アデノウイルスの初期遺伝子であるＥ１Ａを発現する複製可能アデノウイルスによりＶＥＧＦの発現が減少するという報告があったので２８、ＫＨ９０３によるＶＥＧＦ発現変化を検証するために、Ｅ１Ａを欠失し、ｌａｃＺとＫＨ９０３を同時に発現する複製不能アデノウイルスであるｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を作製した。ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３をヒト肺癌細胞株（Ａ５４９，Ｈ４６０，ＨＣＣ８２７，Ｈ１２９９，Ｈ２１７２，Ｈ３２２）に感染させて、細胞から培地を回収して、ＥＬＩＳＡでＶＥＧＦ発現量を定量した。その結果、実験に利用された全ての種類の肺癌細胞株において、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスの感染によりＶＥＧＦの発現が顕著に減少することを確認することができた（図２ａ）。
【００７１】
実際に腫瘍細胞でＶＥＧＦがどれだけ産生されており、分泌されるＶＥＧＦがＫＨ９０３の発現により減少するかを検証するために、培地を回収した後の細胞を破砕し、細胞のＶＥＧＦ発現量を確認した。図２ｂから分かるように、アデノウイルスの感染後、培地を用いたＶＥＧＦのＥＬＩＳＡの結果と同様に、ｄＥ１−ｋ３５を感染させた細胞に比べ、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させた細胞でＶＥＧＦ発現量が顕著に減少したことを観察することができた（図２ｂ）。
【００７２】
２．ＶＥＧＦと特異的に結合するＫＨ９０３を発現するアデノウイルスによる血管新生抑制能の観察
まず、ＶＥＧＦを抑制するＫＨ９０３の発現によるＶＥＧＦレベルの変化によるＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導性増殖能に対する影響を確認した。ＨＵＶＥＣをマトリゲルコートした４８ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで播いた後、３０ＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させて、７２時間後、ＭＴＴ分析を行って、細胞の生存率を測定した。その結果、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させたグル−プが、ウイルスを処理しなかったグループに比べ、生存率が５３％減少し、陽性対照群であるｄＥ１−ｋ３５を感染させたグループに比べては、３０％減少したことを観察した（図３）。
【００７３】
ＶＥＧＦ発現を抑制させるＫＨ９０３によるＶＥＧＦ量の変化が血管内皮細胞の運動能に及ぼす影響を検証するために、ＨＵＶＥＣを利用して運動性分析を行った。Ａ５４９、Ｈ４６０細胞株を２０ＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスにそれぞれ感染させて、４８時間後に回収した培地でＨＵＶＥＣを培養した。その結果、何も処理しなかった細胞培養液又はｄＥ１−ｋ３５アデノウイルスを感染させた細胞培養液を処理した場合は、上部チャンバから下部チャンバにたくさんの細胞が移動した反面、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させた細胞培養液を処理した場合は、ＨＵＶＥＣの移動は、上記の２つのグループに比べ低いことを観察した（図４）。
【００７４】
ＫＨ９０３の発現によるＶＥＧＦ量の変化が、血管内皮細胞の血管形成能力に及ぼす影響を検証するために、ＨＵＶＥＣを利用してチューブ形成分析を行った。Ａ５４９、Ｈ４６０細胞株を２０ＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスにそれぞれ感染させて、４８時間後に回収した培地でＨＵＶＥＣを培養した。その結果、何も処理しなかった細胞培養液又はｄＥ１−ｋ３５アデノウイルスを感染させた細胞培養液を処理した場合は、大きくて太いチューブが形成された反面、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させた細胞培養液を処理した場合は、ＨＵＶＥＣの血管形成がうまくいかず、細くて部分的に切られたチューブが形成されたことを観察した（図５）。
【００７５】
以上から確認された血管新生能の差を、エクスビボ上で確認するために、ラットの大動脈を利用して血管出芽分析を行った。まず、ｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルス、２０ＭＯＩで処理して４８時間後に回収したＡ５４９、Ｈ４６０細胞培養液で大動脈輪を処理して５日間培養した結果、何も処理しなかった細胞培養液やｄＥ１−ｋ３５を感染させたＡ５４９細胞培養液を処理した大動脈輪とは対照的に、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを処理した細胞培養液で大動脈輪を培養した場合、血管の出芽がほとんど起こらないことを確認することができた（図６）。これを、より定量的に比較検証するために、形成された血管を、二重盲方式で陽性対照群（ｍｏｓｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を５点、血管が出芽されなかった実験群（ｌｅａｓｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を０点で点数を付与して分析した。何も処理しなかった細胞培養液やｄＥ１−ｋ３５を感染させたＡ５４９、Ｈ４６０細胞培養液を処理した全ての大動脈輪において血管形成が活発に起こることを確認することができたが、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させた細胞の培養液を処理した場合は、対照群ウイルスであるｄＥ１−ｋ３５に比べ、血管形成が顕著に抑制されることを確認した。
【００７６】
３．ＶＥＧＦと特異的に結合するＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスの細胞殺傷能の検証
ＶＥＧＦ発現抑制による血管新生能の低下は、腫瘍の成長を抑制すると考えられるので、ＫＨ９０３の抗癌効果を確認するために、ＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢ／ＫＨ９０３と、対照群としての腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢをそれぞれ作製した。ＫＨ９０３の発現によりアデノウイルスの複製が阻害できるかどうか確認するために、数種類の癌細胞株及び正常細胞株をｄＥ１−ｋ３５、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３、ＲｄＢ又はＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスに感染させて、ウイルスの複製による細胞の死滅の程度をＣＰＥ分析で観察した。陰性対照群であるｄＥ１−ｋ３５複製不能アデノウイルスに感染させた細胞においてはアデノウイルスが複製されないため、細胞殺傷効果が現れなかったが、複製可能アデノウイルスであるＲｄＢ又はＲｄＢ／ＫＨ９０３に感染させ場合は、ウイルスの量が増加するにつれて、細胞殺傷効果も増加した。実験に利用された全ての細胞株において、ＫＨ９０３を発現するアデノウイルスであるＲｄＢ／ＫＨ９０３の細胞殺傷能が、対照群ウイルスであるＲｄＢに比べ、優れていることを観察することができた（図７）。
【００７７】
４．ＶＥＧＦと特異的に結合するＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスの生体内抗腫瘍効果の検証
ＶＥＧＦ発現を抑制するＫＨ９０３を発現するアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果を検証するために、ヒト肺癌細胞株であるＨ４６０細胞をヌードマウスの腹部皮下に注射して、形成された腫瘍の容積が約８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３程度になった時、１×１０１０ｖｐのＲｄＢとＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを陰性対照群であるＰＢＳと共に２日間隔で３回腫瘍内に投与した後、腫瘍の成長を観察した（図８）。陰性対照群であるＰＢＳを投与したヌードマウスの場合、ウイルスの投与後、２３日後頃に既に腫瘍の容積が２１７０．２３８±４５５．１２１６ｍｍ３に急激に成長したが、ＫＨ９０３を発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるＲｄＢ／ＫＨ９０３を投与した場合は、腫瘍の成長が大きく遅延されることを確認した。即ち、ＲｄＢとＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを投与したマウスの場合、それぞれ１１８１．３９１±９８５．９１３１ｍｍ３、及び２５２．６７±１０３．８４６４ｍｍ３であって、ＫＨ９０３の血管新生の抑制による、抗腫瘍効果を観察することができた。
【００７８】
５．ＶＥＧＦ発現を抑制するＫＨ９０３を発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの投与による腫瘍内血管分布観察
ヒト肺癌細胞株であるＨ４６０をヌードマウスの腹部皮下に注射した後、腫瘍が形成された後、ＲｄＢとＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを、ＰＢＳを陰性対照群として、１×１０１０ｖｐで２日間隔で３回腫瘍内注射した。最後の投与の１日後に腫瘍を摘出して、血管内皮細胞特異的抗原であるＣＤ３１を、組織免疫染色法で観察した。その結果、陰性対照群であるＰＢＳ群に比べ、腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢを処理した実験群では、腫瘍内血管数が２１％減少したことを確認し、ＲｄＢ／ＫＨ９０３を投与した場合は、血管数が７１％抑制されたことを観察することができた（図９）。
【００７９】
−追加的議論−
血管新生は、既に存在する血管から新しい血管が形成される過程であって、胚発生と、器官の形成及び組織の再生に重要な役割をする。また、血管新生は、初期の腫瘍が成長するための必須条件であって、腫瘍の体積が大きくなるにつれて、腫瘍細胞や浸潤されたマクロファージが様々な血管形成因子を産生して、腫瘍内微細血管を形成させる。このように形成された血管は、腫瘍細胞に養分を供給と同時に、様々な増殖因子を供給し、腫瘍を成長させる。血管新生に関与する種々の増殖因子のうち、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が腫瘍の成長と転移に大きく関与することが知られている。ＶＥＧＦは、受容体型チロシンキナーゼ、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）の二量体と結合し、直接血管内皮細胞の分裂を促進する、強力な血管新生因子として作用し、微細血管の透過性を増加させて血漿タンパクが周辺組織に排出され、細胞外基質を修飾して血管形成を容易にする。そのため、癌の成長を防ぐためには、血管新生因子であるＶＥＧＦの抑制が極めて重要である。ここ３０年間、抗癌治療の標的として、腫瘍内血管形成を抑制することにより腫瘍の成長を抑制する研究が活発になされてきた。しかし、現在利用可能な血管新生抑制剤は、主に単一治療剤として利用されるよりは、併用治療によく利用されており、高額な費用と反復投与による毒性を起こせるという短所がある。本研究では、このような限界を克服するために、水溶性のＶＥＧＦ特異的デコイ受容体として作用するＫＨ９０３を腫瘍崩壊性アデノウイルスに発現させることにより、効果的にＶＥＧＦを抑制すると同時に、腫瘍崩壊性アデノウイルスを使用することにより、相乗的に抗腫瘍効果を向上させようとした。
【００８０】
ＫＨ９０３は、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ結合ドメインを結合させて作製したＶＥＧＦ特異的水溶性デコイ受容体であって、腫瘍細胞で分泌されるＶＥＧＦを効果的に抑制することができる。即ち、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲの結合相互作用に直接的に関与するＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２の主要ドメインを利用して作製したＫＨ９０３は、ＶＥＧＦＲの代わりに腫瘍細胞で分泌されるＶＥＧＦと結合し、受容体とリガンドの反応を遮断することにより、血管新生過程を抑制することができる２９，３０。
【００８１】
初期に作製されたＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦと結合する主要部位であるＶＥＧＦＲ１の２番目のドメインとＶＥＧＦＲ２の３番目のドメインがヒトＩｇＧのＦｃ部位に融合された形態である１１。本研究では、ＶＥＧＦ−Ａだけではなく、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣそしてＰＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）とも結合できるため、ＶＥＧＦとの結合能が、既存のＶＥＧＦトラップに比べ、約２倍向上されたＫＨ９０３を利用した。ＫＨ９０３がＶＥＧＦ−Ａを始めとして、あらゆる種類のＶＥＧＦファミリーと優れた結合性を示す理由は、既存のＶＥＧＦトラップ構造に、ＶＥＧＦと受容体との強い結合性が維持されるように関与するＶＥＧＦＲ２の４番目ドメインが追加されたからである。また、このドメインは、Ｈ９０３が３次構造を安定的に形成するようにするだけではなく、ダイマーを形成する効率を高めて、結果的に、ＫＨ９０３は既存ＶＥＧＦトラップより延長された半減期を有するという利点を持った２９。このような長所を有しするＫＨ９０３の血管新生抑制効果を観察するために、Ｅ１部位にレポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼが挿入されており、Ｅ３部位遺伝子が欠失されたアデノウイルスのＥ３部位にＫＨ９０３を挿入して、複製不能アデノウイルスであるｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を作製した。血管形成が旺盛なＡ５４９とＨ４６０を始めとして、種々の肺癌細胞株に多様なＭＯＩで感染させて、ＶＥＧＦ発現量を比較検証した結果、実験に利用した全ての細胞株において、ＫＨ９０３がＶＥＧＦの発現を抑制する効果を強くもつことを確認することができた（図２）。このようにＫＨ９０３により、腫瘍細胞においてＶＥＧＦの発現が効果的に抑制されることを観察した後、減少したＶＥＧＦ量が実際の血管内皮細胞の運動性、増殖そして血管形成及び拡張のような血管新生の一連の過程にどのような影響を及ぼすか、インビボとエクスビボで観察した。
【００８２】
まず、血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣに、ＫＨ９０３を発現する複製不能ウイルスｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させた時、ＶＥＧＦ発現量の減少により血管内皮細胞の生存率が減少することを確認した。次いで、ＫＨ９０３を発現する複製不能ウイルスと対照群ウイルスをそれぞれ感染させた細胞、そして非感染細胞の培養液を利用して、血管内皮細胞の運動性を観察する運動性分析を行った。増殖因子が十分にある対照群としてウイルスに非感染細胞の培養液を利用した時は、ＨＵＶＥＣの移動が活発に起こることを観察することができたが、ＫＨ９０３を発現するウイルスで処理した細胞から得た培養液を利用した場合は、ＶＥＧＦの減少により、ＨＵＶＥＣの運動性が非常に低下したことを観察することができた。血管形成能と血管の出芽も抑制されることを、チューブ形成分析と大動脈輪出芽分析を通じて検証した。このようなＫＨ９０３による血管新生抑制は、抗癌効果を期待することができる。そこで、増大された抗腫瘍効果を検証するために、本研究室で開発したＥ１ＡのＲｂ結合部位が修飾されてＥ１Ｂ部位が除去された腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢにＫＨ９０３を挿入したＲｄＢ−ＫＨ９０３アデノウイルスを作製して、Ｈ４６０異種移植モデルにおいて優れた抗腫瘍効果を確認した。腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢ−ＫＨ９０３は、Ｅ１Ａ遺伝子発現によるＶＥＧＦ発現抑制だけではなく、効率的で且つ持続的な遺伝子伝達により、ＫＨ９０３によるＶＥＧＦ発現抑制も同時に誘導して、対照群のＲｄＢアデノウイルスに比べ、生体内抗腫瘍効果が顕著に昂進した。腫瘍組織内血管分布を観察した結果においても、ＲｄＢ／ＫＨ９０３の効果を再び検証することができた。腫瘍組織において、ＰＢＳ群に比べ、腫瘍崩壊性アデノウイルスで処理した場合、血管の数が減少し、腫瘍崩壊性アデノウイルスだけでも血管新生を抑制することができることを確認することができた。また、ＫＨ９０３によるさらに顕著な血管新生抑制効果を立証することにより、ＫＨ９０３が効果的にＶＥＧＦを抑制したことが分かった。
【００８３】
即ち、本研究で作製したＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢ−ＫＨ９０３は、ＶＥＧＦ特異的水溶性デコイ受容体であるＫＨ９０３を通じて得られる腫瘍内血管新生の遮断と共に、アデノウイルスの腫瘍崩壊性能を同時に誘導して、より一層増大された抗腫瘍効果が誘導されると判断される。
【００８４】
ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ結合ドメインをヒトＩｇＧのＦｃ部位に結合させて作製したＫＨ９０３は、効果的に腫瘍細胞が分泌するＶＥＧＦを抑制することができた。本研究に利用されたＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢ−ＫＨ９０３は、腫瘍特異的アデノウイルスの複製による腫瘍特異的殺傷能と共に、Ｅ１Ａ発現とＨ９０３により誘導されたＶＥＧＦの抑制により、顕著な抗腫瘍効果を示し、癌治療に有用に利用されると期待される。
【００８５】
以上、本発明の望ましい具体例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具体例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその均等物により定義されると言える。
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１２．Ｖｏｓｓｅｌｅｒ Ｓ，Ｍｉｒａｎｃｅａ Ｎ，Ｂｏｈｌｅｎ Ｐ，Ｍｕｅｌｌｅｒ ＭＭ，Ｆｕｓｅｎｉｇ ＮＥ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｔｒｏｍａｌ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ ｒｅｖｅｒｔｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｈｅｔｅｒｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：１２９４−３０５
１３．Ｊｏｃｅｌｙｎ Ｈ，Ｓａｍ Ｄ，Ｎｉｃｋ Ｐ，Ｓｕｓａｎ ＤＣ，Ｌｉｌｌｉａｎ Ｈ，Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ ： ａ ＶＥＧＦ ｂｌｏｃｋｅｒ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ，Ｐｏｒｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ２００２；９９：１１３９３−８
１４．Ｓ． Ｐｅｒｃｙ Ｉｖｙ，Ｊｅａｎｎｅｔｔｅ Ｙ． Ｗｉｃｋ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ ＭＫ，Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆ ＶＥＧＦＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２００９ ６：５６９−７９
１５．Ｋｅ Ｘｉｅ，Ｒｕｉ−Ｚｈｅｎ Ｂ，Ｙａｎｇ Ｗ，Ｑｕａｎ Ｌ，Ｋａｎｇ Ｌ，Ｙｕ−Ｑｕａｎ Ｗ，Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦＲ−２−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９ ７
１６．Ｐｕｊａ，Ｄｅｂａｓｈｉｓｈ Ｂ，Ｓｈａｉｊａ Ｓ，Ｌｅｅ ＭＥ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００９ ３６：Ｓ１２−Ｓ１９
１７．Ｗａｎｇ Ｙ，Ｆｅｉ Ｄ，Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ Ｍ，Ｓｏｎｇ Ａ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ，ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ２００４；７：３３５−４５
１８．Ｊｏｃｅｌｙｎ Ｈ，Ｓａｍ Ｄ，Ｎｉｃｋ Ｐ，Ｓｕｓａｎ ＤＣ，Ｌｉｌｌｉａｎ Ｈ，Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｒ ｅｔ ａｌ．，ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ ： ａ ＶＥＧＦ ｂｌｏｃｋｅｒ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ． Ｐｏｒｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００２；９９：１１３９３−８
１９．Ｆｕｋａｓａｗａ Ｍ，Ｋｏｒｃ Ｍ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｔｒａｐ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：３３２７−３２
２０．Ｊｉａｎｚｈｏｎｇ Ｈ，Ｊａｓｏｎ ＳＦ，Ａｎｎａ Ｓ，Ａｎｇｅｌａ Ｋ，Ａｋｉｋｏ Ｙ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ ＷＭ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｂｙ ｐｏｔｅｎｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｌｏｃｋａｄｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００３；１００：７７８５−９０
２１．Ｈｕ Ｌ，Ｈｏｆｍａｎｎ Ｊ，Ｈｏｌａｓｈ Ｊ，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ＧＤ，Ｓｏｏｄ ＡＫ，Ｊａｆｆｅ ＲＢ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｒａｐ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｓｔｒｉｋｉｎｇｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ａｓｃｉｔｅｓ，ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；１１：６９６６−７１
２２．Ｒｅｉｌｙ ＧＪ，Ｍｉｌｌｅｒ ＶＡ，Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｔｒａｐ ｉｎ Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；１３：４６２３−７
２３．Ｊｕａｎ Ｆ，Ｃａｎｄｅｌａｒｉａ ＧＭ，Ｒａｍｏｎ Ａ，Ｐｏｌｌｙ ＳＹＬ，Ｔｉｍｏｔｈｙ ＪＭ，Ｐａｒａｓｋｅｖｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍｕｔａｎｔ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｂ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎｔｉ−ｇｌｉｏｍａ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００；１９：２−１２
２４．Ｈｅｉｓｅ Ｃ，Ｓａｍｐｓｏｎ−Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ａ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ａ，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｆ，Ｖｏｎ Ｈｏｆｆ ＤＤ，Ｋｉｒｎ ＤＨ ： ＯＮＹＸ−０１５，ａｎ Ｅ１Ｂ ｇｅｎｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，ｃａｕｓｅｓ ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９７；３：６３９−４５
２５．Ｌｅｅ Ｈ，Ｋｉｍ Ｊ，Ｌｅｅ Ｂ，Ｃｈａｎｇ ＪＷ，Ａｈｎ Ｊ，Ｐａｒｋ ＪＯ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｅ１Ｂ ５５ ｋＤａ−ｄｅｌｅｔｅｄ ＹＫＬ−１ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ： ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ５３ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０００；８８：４５４−６３
２６．Ｋｉｍ Ｊ，Ｃｈｏ ＪＹ，Ｋｉｍ ＪＨ，Ｊｕｎｇ ＫＣ，Ｙｕｎ ＣＯ ： Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ１Ｂ ｇｅｎｅ−ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００２；９：７２５−３６
２７． Ｓａｕｔｈｏｆｆ Ｈ，Ｈｅｉｔｎｅｒ Ｓ，Ｒｏｍ ＷＮ，Ｈａｙ ＪＧ ： Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅ１ｂ−１９ｋＤ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０００；１１：３７９−８８
２８．Ｚｈｏｕ Ｚ，Ｚｈｏｕ ＲＲ，Ｇｕａｎ Ｈ，Ｂｕｃａｂａ ＣＤ，Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ ＥＳ．，Ｅ１Ａ ｇｅｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｅｗｉｎｇ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００３：２：１３１３−９
２９．Ａｋｅｏ Ｓ，Ｍｉｋｉｔｏ Ｉ，Ｈｉｄｅｈａｒｕ Ａ，Ｓａｃｈｉｋｏ Ｙ，Ｋｅｎｙａ Ｓ，Ｍａｓａｂｕｍｉ Ｓ．，Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｔｅｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｌｉｇａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｓｅｒｔ Ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ １９９８ ２７３：３１２８３−８
３０．Ｆｌｏｒｅｎｃｅ Ｔ．Ｈ． Ｗｕ，Ｍａｒｉａｎｎｅ Ｏ． Ｓｔｅｆａｎｉｎｉ，Ｆｅｉｌｉｍ Ｍａｃ Ｇａｂｈａｎｎ，Ａｌｅｋｓａｎｄｅｒ Ｓ． Ｐｏｐｅｌ，Ａ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＶＥＧＦ ｄｉｓｔｒｉｖｕｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１ ａｃｔｉｎｇ ａｓ ａ ｌｉｇａｎｄ ｔｒａｐ． Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ２００９；４：１−３６
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラデコイ受容体を発現する血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルス及びこれを含む薬剤学的血管新生抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の血管から新しい血管が形成される血管新生は、厳密に調節される一連の過程であって、細胞外基質と基底膜の分解を介して始まり、毛細血管内皮細胞の分裂、分化、周辺基質への浸潤、そして新しい機能的ネットワークへの再組織化を通じて完成される１。血管新生のためには、様々な種類の増殖因子が必要であり、これらのうち、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）、特にＶＥＧＦ−Ａが主に関与することが明らかにされている。特異的スプライシングにより形成される７種類のヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム（ＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１４５，ＶＥＧＦ１４８，ＶＥＧＦ１６５，ＶＥＧＦ１８３，ＶＥＧＦ１８９，ＶＥＧＦ２０６）は、それぞれ１２１，１４５，１４８，１６５，１８３，１８９そして２０６個のアミノ酸残基から構成されており、このうち、ＶＥＧＦ１２１の基本配列は、全てのアイソフォームに共有されている２−４。
【０００３】
ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体の結合により、血管内皮細胞の細胞アポトーシスの抑制、リンパ管形成、免疫抑制、血管透過性、そして造血幹細胞の生存などが調節される４−７。
【０００４】
固形癌は、血管がない状態で２ｍｍ〜３ｍｍの大きさまで育つことができるが、それ以上の成長のためには、酸素と栄養素の供給のために、ＶＥＧＦにより誘導される血管新生が必須である。正常な組織において、血管ネットワークは、誘導因子と抑制因子の適切な比率を通じて、効果的な血流速度と均一な血管の幅を有した階層的構造を備える５。しかし、腫瘍で見られる血管系は、血管壁による透過性が増加されていて、高い内圧を有しており、血管が大きくなっているなど、異常に発達している。腫瘍における制御されていない血管新生及び異常な血管の形態は、腫瘍内部の低酸素症と低いｐＨにより高発現されるＶＥＧＦと、これの受容体であるＶＥＧＦＲ２との結合により生じる細胞内情報により起こる９。
【０００５】
ＶＥＧＦによる血管新生は、腫瘍の成長だけではなく、浸潤と転移にも重要な役割を果たす１０。肺癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣癌、そして子宮癌のような多様な腫瘍において、ＶＥＧＦが過剰発現されていることが示され、ＶＥＧＦの発現が高い癌であるほど、予後もよくないことが報告された１１。腫瘍の増殖に血管新生による血流供給の増加は必須であるため、腫瘍内血管新生の抑制は、癌治療の主要な標的になっており、アンギオスタチン、エンドスタチン、スロンボスポンディン−１、そしてｕＰＡ断片などが、現在血管新生抑制剤として利用されている。また、ＶＥＧＦの活性を抑制するか、ＶＥＧＦの細胞受容体であるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）又はＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）の機能を抑制することにより、腫瘍の成長を抑制するか転移を抑制する研究が活発に進行されている１２−１６。細胞内だけではなく、細胞外でもＶＥＧＦと細胞受容体との結合を阻害できる中和抗体や、ＶＥＧＦＲ−１又はＶＥＧＦＲ−２特異的中和抗体は、ヌードマウスに形成されたヒト腫瘍異種移植片を処理した場合、血管内皮細胞の細胞アポトーシスを誘導して、腫瘍の成長を著しく抑制した１７。
【０００６】
ＶＥＧＦトラップは、細胞表面にあるＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２のドメインを結合して作製した水溶性デコイ（おとり）ＶＥＧＦ受容体であって、ＶＥＧＦと高い親和性を有している。現在までＶＥＧＦトラップに関する研究がたくさんなされており、それにより、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、そして胎盤増殖因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＰＧＦ）に対する親和性がさらに増加されたＶＥＧＦトラップが作製されている１８。様々な腫瘍異種移植モデルで行われた前臨床試験において、ＶＥＧＦトラップの抗腫瘍効果が検証されて１９−２１、ＶＥＧＦトラップ又は抗癌剤のそれぞれ単独で処理した場合に比べ、商用的に利用される抗癌剤とＶＥＧＦトラップとの併用治療時に向上された腫瘍成長抑制効果が見られた２２。ＶＥＧＦトラップがＶＥＧＦモノクローナル抗体であるベバシズマブやＶＥＧＦＲ２抗体であるＤＣ１０１に比べて優れた抗腫瘍効果を示す理由は、全てのＶＥＧＦアイソフォームとの高い親和性だけではなく、ＶＥＧＦサブファミリーのうち、ＰＧＦとの結合能も有しているからである２３。したがって、ＶＥＧＦとの親和性が強いＶＥＧＦトラップを腫瘍内で持続的に発現させることができれば、腫瘍から分泌されるＶＥＧＦの発現量を著しく減少させて、優れた抗腫瘍効果を奏することができ、これを通じて、相当な治療効果が得られると期待される。
【０００７】
アデノウイルスは、優れた遺伝子伝達体であって、高い力価で産生が可能であり、容易に濃縮できるため、癌遺伝子治療のための遺伝子伝達体として脚光を浴びている２４−２５。しかしながら、アデノウイルスを利用した癌遺伝子治療剤が臨床的に利用されるためには、周辺の正常組織の細胞には副作用無しに、癌細胞のみを特異的に殺傷できるような特異性と共に、癌細胞を効果的に死滅できる殺傷能の高いアデノウイルスの開発が必要である。腫瘍細胞では、ｐ５３タンパク質の変異だけではなく、繊維芽細胞腫タンパク質（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐＲｂ）の変異が頻繁に生じるか、あるいはｐＲｂ関連情報系が相当部分損傷されているため、ｐＲｂとの結合能を失ったアデノウイルスは、正常細胞では、ｐＲｂの活性によりアデノウイルスの複製が抑制されるが、ｐＲｂの機能が抑制された腫瘍細胞では、活発に複製されて、癌細胞を特異的に殺傷することができる。このような背景下で、本発明者らは、腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの癌細胞特異的複製能を増進させるために、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子部位のうち、ｐＲｂとの結合に関与するＣＲ１部位のＧｌｕ残基をＧｌｙ残基に置換し、ＣＲ２部位の７個のアミノ酸残基（ＤＬＴＣＨＥＡ）を全てＧｌｙ残基（ＧＧＧＧＧＧＧ）に置換することにより、ｐＲｂとの結合能を欠失させ、同時にｐ５３タンパク質の機能を抑制するＥ１Ｂ５５ｋＤａとアポトーシスを抑制するＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子を除去することにより、ｐ５３が不活化された腫瘍細胞においてのみ特異的に複製が可能であり、これによる癌細胞特異的細胞殺傷及び細胞アポトーシスを同時に誘発できるような、改善された腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるＡｄ−ΔＢ７を作製して、優れた生体内・外抗腫瘍効果を報告した２６−２８。
【０００８】
本明細書全体にかけて多数の引用文献及び特許文献が参照されて、その引用が表示されている。引用された文献及び特許の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、外来配列をアデノウイルスゲノムに挿入させる戦略でアデノウイルスの血管新生抑制能、特に腫瘍崩壊（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）能を向上させるために鋭意研究した結果、ＶＥＧＦＲのキメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列をアデノウイルスのゲノムに挿入して発現させると、前記アデノウイルスの血管新生抑制能、特に腫瘍崩壊能が顕著に向上することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、キメラデコイ受容体を発現する、血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルスを提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、キメラデコイ受容体を発現する組換えアデノウイルスを含む血管新生抑制用医薬組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、過多血管新生による疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）アデノウイルスの逆方向末端反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ；ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、（ｂ）（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）の細胞外ドメインとを含むキメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列と、を含む血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルスを提供する。
【００１５】
本発明者らは、外来配列をアデノウイルスゲノムに挿入させる戦略でアデノウイルスの血管新生抑制能、特に腫瘍崩壊能を向上させるために鋭意研究した結果、ＶＥＧＦＲのキメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列をアデノウイルスのゲノムに挿入して発現させると、アデノウイルスの血管新生抑制能、特に腫瘍崩壊能が大きく向上することを見出した。
【００１６】
既存の血管から新しい血管が形成される血管新生は、腫瘍が成長して転移されるのに非常に重要な役割を果たす。血管新生が起こるためには、種々の増殖因子が必要であるが、これらのうち、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が血管新生に主に関与することが明らかにされた。
【００１７】
本発明のアデノウイルスベクターに挿入されるＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインとを含むキメラデコイ受容体は、いわゆるＶＥＧＦトラップの一種であって、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、そしてＰＧＦに対する親和性に優れており、これらの増殖因子に対するデコイ受容体として作用して、血管新生を抑制する。
【００１８】
本明細書で使用される用語‘デコイ受容体’は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰＧＦ、又はこれらの全てに結合して、これらの増殖因子が正常な受容体と結合することを抑制する受容体を意味する。
【００１９】
本明細書で使用される用語‘キメラデコイ受容体’は、ＶＥＧＦＲ−１由来の細胞外ドメインとＶＥＧＦＲ−２由来の細胞外ドメインを結合して製造された受容体を意味する。
【００２０】
本発明で利用されるキメラデコイ受容体は、ＶＥＧＦＲ−１の７個の細胞外ドメインのうち、少なくとも１つの細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の７個の細胞外ドメインのうち、少なくとも１つの細胞外ドメインとを結合して得られるキメラ受容体である。
【００２１】
本発明の好ましい具体例によると、前記キメラデコイ受容体は、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインと、を含む。
【００２２】
より好ましくは、前記キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第３細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｖ）ＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、並びに（ｖ）ＶＥＧＦＲ−１の第５細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインを含む。
【００２３】
あるいは、前記キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第２細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｖ）ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、並びに（ｖ）ＶＥＧＦＲ−２の第５細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインを含む。
【００２４】
本発明で利用されるキメラデコイ受容体は、好ましくは、２個〜４個の細胞外ドメイン、最も好ましくは、３個の細胞外ドメインを含む。
【００２５】
さらに好ましいものとしては、キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン、又は（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第５細胞外ドメインを含むものである。
【００２６】
別のさらに好ましいものとしては、キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメイン、又は（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−１の第５細胞外ドメインを含むものである。
【００２７】
最も好ましくは、本発明で利用されるキメラデコイ受容体は、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメインを含む。
【００２８】
ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。例えば、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号１及び２の配列であり、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号３及び４の配列であって、ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号５及び６の配列である。
【００２９】
本発明の好ましい具体例によると、前記キメラデコイ受容体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ領域と融合される。より好ましくは、本発明で利用されるキメラデコイ受容体は、ＩｇＧのＦｃ領域、最も好ましくは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域と融合されている。ＩｇのＦｃ領域は、前記キメラデコイ受容体のＮ末端又はＣ末端と、好ましくは、Ｃ末端と融合される。
【００３０】
好ましいＩｇのＦｃ領域のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号７及び８に記載されている。
【００３１】
キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、アデノウイルスゲノムに挿入される。
【００３２】
キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現コンストラクト内に存在することが好ましい。前記発現コンストラクトにおいて、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに機能的に連結されることが好ましい。本明細書において、用語‘機能的に結合された’は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写因子結合部位の配列）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は翻訳を調節するようになる。本発明において、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列に結合されたプロモーターは、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞で機能し、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列の転写を調節することができるものであって、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターを含み、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、βアクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、誘導性プロモーター、癌細胞特異的プロモーター（例えば、ＴＥＲＴプロモーター、ＰＳＡプロモーター、ＰＳＭＡプロモーター、ＣＥＡプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター及びＡＦＰプロモーター）及び組織特異的プロモーター（例えば、アルブミンプロモーター）を含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＣＭＶプロモーターである。
【００３３】
癌を対象に遺伝子治療を行う場合は、一生治療遺伝子の発現を持続させる必要がなく、局所投与する場合は、アデノウイルスによる免疫反応が大きく問題化されないばかりか、却って長所になり得るため、アデノウイルスを利用した癌遺伝子治療剤の開発研究が活発になされている。したがって、本発明でも、基本的にアデノウイルスのゲノム骨格を利用して癌の遺伝子治療を達成している。
【００３４】
アデノウイルスは、中間程度のゲノム大きさ、操作の利便性、高いタイター、広範囲なターゲット細胞性及び優れた感染性のため、遺伝子伝達ベクターとしてよく利用されている。ゲノムの両末端は、１００ｂｐ〜２００ｂｐの逆方向末端反復を含み、これは、ＤＮＡ複製及びパッケージングに必須なシスエレメントである。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、転写及び宿主細胞遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードする。
【００３５】
アデノウイルスゲノムの少しの部分だけがシスエレメントとして必要であるので（Ｔｏｏｚａ，Ｊ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＤＮＡ Ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ，２ｎｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８１））、特に、２９３細胞のような特定細胞株を利用する場合に、アデノウイルスＤＮＡの多くを外来ＤＮＡ分子に置換することができる。このような側面として、本発明の組換えアデノウイルスにおいて、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列以外に、他のアデノウイルスの配列として少なくとも逆方向末端反復配列を含む。
【００３６】
キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、Ｅ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくは、Ｅ１Ｂ領域）、又はＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、Ｅ３領域に挿入される。一方、他の外来ヌクレオチド配列（例えば、サイトカイン、免疫共刺激因子、アポトーシス遺伝子、及び癌抑制遺伝子）も追加的にアデノウイルスに挿入することができて、これは、Ｅ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくは、Ｅ１Ｂ領域）又はＥ３領域に挿入されることが好ましく、より好ましくは、Ｅ１領域（Ｅ１Ａ領域及び／又はＥ１Ｂ領域、好ましくは、Ｅ１Ｂ領域）に挿入される。また、前記挿入配列は、Ｅ４領域にも挿入できる。
【００３７】
また、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％までパッケージングすることができるため、約２ｋｂを追加的にパッケージングすることができる。したがって、アデノウイルスに挿入される上述の外来配列は、アデノウイルスの野生型ゲノムに追加的に挿入することもできる。
【００３８】
本発明の好ましい具体例において、本発明の組換えアデノウイルスは、不活化されたＥ１Ｂ１９ｋＤａ（「Ｅ１Ｂ１９」とも記載）遺伝子、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ（「Ｅ１Ｂ５５」とも記載）遺伝子、又はＥ１Ｂ１９ｋＤａ／Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ（「Ｅ１Ｂ１９／５５」とも記載）遺伝子を有する。本明細書において、遺伝子と関連して使用される用語‘不活化’は、その遺伝子の転写及び／又は翻訳が正常になされず、その遺伝子によりコードされる正常なタンパク質の機能が誘発されないことを意味する。例えば、不活化Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子は、その遺伝子に変異（置換、付加、部分的欠失、又は全体的欠失）を生じ、活性型のＥ１Ｂ１９ｋＤａタンパク質を産生できない遺伝子である。Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子が欠失された場合は、細胞アポトーシス能が増加して、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が欠失された場合は、腫瘍細胞特異性を有するようになる（参照：大韓民国特許出願第２００２−２３７６０号）。本明細書において、ウイルスゲノム配列と関連して使用される用語‘欠失’は、該当配列が完全に欠失されたものだけではなく、部分的に欠失されたものも含む意味を有する。
【００３９】
本発明の好ましい具体例によると、本発明の組換えアデノウイルスは、活性型のＥ１Ａ遺伝子を含む。Ｅ１Ａ遺伝子を含む組換えアデノウイルスは、複製可能な特性を有するようになる。本発明のより好ましい具体例によると、本発明の組換えアデノウイルスは、不活化されたＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子及び活性型のＥ１Ａ遺伝子を含む。本発明のさらに好ましい具体例によると、本発明の組換えアデノウイルスは、不活化されたＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子及び活性のＥ１Ａ遺伝子を含み、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、欠失されたＥ３領域に挿入される。
【００４０】
本発明の最も好ましい具体例によると、本発明の組換えアデノウイルスは、不活化されたＥ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子、及び変異をもつ活性型のＥ１Ａ遺伝子を含み、キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、欠失されたＥ３領域に挿入されているものである。ここで、変異をもつ活性型のＥ１Ａ遺伝子は、Ｒｂ結合部位をコードするヌクレオチド配列のうち、第４５番目Ｇｌｕ残基がＧｌｙ残基に置換された変異及び第１２１番目〜１２７番目アミノ酸残基が全てＧｌｙ残基に置換された変異を有する。
【００４１】
腫瘍細胞では、ｐ５３タンパク質の変異だけではなく、Ｒｂの突然変異あるいはＲｂ関連情報系が相当部分損傷されているため、Ｒｂとの結合能が欠失されたアデノウイルスは、正常細胞では、Ｒｂの活性によりアデノウイルスの複製が抑制されるが、Ｒｂの機能が抑制された腫瘍細胞では、活発に複製されて、癌細胞を特異的に殺傷することができる。したがって、上述のＲｂ結合部位における変異を含む本発明の組み換えアデノウイルスは、特異的な腫瘍崩壊性を示す。
【００４２】
下記の実施例で例証されたように、キメラデコイ受容体を発現する本発明の組換えアデノウイルスは、ＶＥＧＦによる血管新生、特に、ＶＥＧＦによる腫瘍細胞における血管新生を特異的に抑制することにより、抗腫瘍効果をもたらす。そして、キメラデコイ受容体を発現する本発明の組換えアデノウイルスは、低い力価のウイルスでも高い殺傷効果を誘導することができるため、投与された体内における安全性に非常に優れている。
【００４３】
本発明の他の様態によると、本発明は、（ａ）上述の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含む抗血管新生組成物を提供する。
【００４４】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）上述の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含む抗血管新生組成物を、これを必要とする対象に投与する段階を含む過多血管新生による疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物に有効成分として含まれる組換えアデノウイルスは、上述の本発明の組換えアデノウイルスと同一なものであるため、組換えアデノウイルスに対する詳細な説明は、本発明の薬剤学的組成物にも同様に適用される。したがって、本明細書の不要な重複記載による過度なる複雑性を避けるために、共通事項は、その記載を省略する。
【００４６】
本発明の抗血管新生組成物により予防又は治療できる疾患又は疾病は、過多な血管新生により招来されるあらゆる疾患又は疾病を含み、好ましくは、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロ−ム性動脈硬化プラーク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ性関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クローン病、再発狭窄症、アテローム性動脈硬化、腸管接着、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症又は神経退行性疾患である。
【００４７】
本発明で開発されたキメラデコイ受容体を発現する組換えアデノウイルスは、血管新生を効果的に抑制し、多様な血管新生関連疾患、特に、抗腫瘍効果が格段に増大されて、特に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が不活化されるか、Ｅ１ＡにおいてＲｂ結合部位が変異された場合は、癌細胞特異性に非常に優れる。これは、結果的に癌治療に必要なウイルス投与量を減少させることができて、ウイルスによる生体内毒性と免疫反応を大きく減らすことができる。
【００４８】
本発明の組成物に含まれる組換えアデノウイルスは、多様な腫瘍細胞に対して殺傷効能を示すため、本発明の薬剤学的組成物は、腫瘍に係る様々な疾病又は疾患、例えば、脳癌、胃癌、皮膚癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、前立腺癌、大腸癌、頭頸癌、皮膚癌、黒色腫、結腸癌及び子宮頸癌などの治療に利用することができる。本明細書において、用語‘治療’は、（ｉ）血管新生の予防；（ｉｉ）血管新生の抑制による血管新生に係わる疾病又は疾患の抑制；及び（ｉｉｉ）血管新生の抑制による血管新生に係わる疾病又は疾患の軽減を意味する。したがって、本明細書における用語‘治療学的有効量’は、上記した薬理学的効果を達成するに十分な量を意味する。
【００４９】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００５０】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は、局部投与を利用して投与することができる。卵巣癌で腹腔内に投与する場合及び肝癌で門脈に投与する場合は、注入方法により投与することができて、乳癌の場合は、腫瘍塊に直接注射して投与することができ、結腸癌の場合は、浣腸で直接注射して投与することができて、膀胱癌の場合は、カテーテル内に直接注入することができる。
【００５１】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々であり、普通に熟練した医者は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、１×１０５ＰＦＵ／ｍｌ〜１×１０１５ＰＦＵ／ｍｌの組換えアデノウイルスを含み、通常、１×１０１０ＰＦＵを２日に１回、２週間注射する。
【００５２】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造する。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エリキシル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態でもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【００５３】
本発明の薬剤学的組成物は、単独療法として利用してもよいが、他の通常的な化学療法又は放射療法と共に利用してもよく、このような並行療法を実施する場合は、より効果的に癌治療をすることができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ビスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド、タモキシフェン、タキソール、トランス−プラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びメトトレキサートなどを含む、本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、Ｘ線照射及びγ線照射などである。
【発明の効果】
【００５４】
本発明の特徴及び長所を要約すると、下記のようである：
（ａ）本発明の組換えアデノウイルスは、血管新生を抑制するキメラデコイ受容体を発現する。
（ｂ）キメラデコイ受容体を発現する本発明の組換えアデノウイルスは、血管新生を顕著に抑制して、多様な血管新生関連疾患の遺伝子治療剤として利用できる。
（ｃ）特に、本発明の組換えアデノウイルスは、腫瘍崩壊能に優れている。
（ｄ）既存の血管新生関連抗癌剤（例えば、アバスチン）は、細胞増殖抑制効果のみを有しており、癌治療剤としての限界を有しているが、本発明の組換えアデノウイルスは、殺細胞効果を有しており、癌細胞を死滅させることができて、これにより、既存の癌治療剤の限界を克服することができる。
（ｅ）また、既存の血管新生関連抗癌剤は、正常細胞にも作用し、副作用を誘発するが、本発明の組換えアデノウイルスは、癌細胞に特異的に作用し、このような副作用を大きく減らすことができる。
（ｆ）既存のＶＥＧＦトラップは、タンパク質製剤であって、生体内において半減期が短い。しかし、本発明の組換えアデノウイルスは、持続的にＶＥＧＦトラップを過剰発現するため、このような問題点を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１ａ】図１ａは、組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターのコンストラクトで、Ｅ１が欠失した複製不能組換えアデノウイルスに関する。ｄＥ１−ｋ３５は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの調節下でβ−ガラクトシダーゼを発現する。ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３は、Ｅ３部位にキメラデコイ受容体ＫＨ９０３を含む。
【図１ｂ】図１ｂは、組換えアデノウイルス（Ａｄ）ベクターのコンストラクトで、複製可能組換えアデノウイルスに関する。ＲｄＢは、変異されたＥ１Ａを含み、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａとＥ１Ｂ５５ｋＤａが欠失している。ＲｄＢ／ＫＨ９０３は、Ｅ３部位にキメラデコイ受容体ＫＨ９０３を含む。
【図１ｃ】図１ｃは、培地に分泌されたＫＨ９０３を検出した結果である。Ａｄ：アデノウイルス；ＩＴＲ：逆方向末端反復配列；ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図２ａ】図２ａは、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３によるＶＥＧＦ発現の抑制を示すＶＥＧＦレベルの定量化の結果である。図２ａにおいて、多様なヒト肺癌細胞株に対して２０ＭＯＩ〜１００ＭＯＩ（感染多重度）でｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させた。感染４８時間後、上清のＶＥＧＦ濃度をＥＬＩＳＡで測定した。Ｃｅｌｌ：非感染細胞
【図２ｂ】図２ｂは、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３によるＶＥＧＦ発現の抑制を示すＶＥＧＦレベルの定量化の結果で、Ａ５４９細胞溶解液中のＶＥＧＦレベルを測定した結果である。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図３】図３は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ誘導性増殖に対するｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３の抑制実験の結果である。ＨＵＶＥＣを３０ＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３で処理した。感染７２時間後、ＭＴＴ分析を行って、総生存細胞を測定した。結果は、３回行った実験の平均で示した。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図４ａ】図４ａは、ＨＵＶＥＣ運動性に対するｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３の影響を示す。ＥＢＭを含む２４ウェル組織培養プレートの上部チャンバに細胞を静置して、３．５時間後、通過細胞を固定化して、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンとエオシン）で染色したものである。図４ａは、ＨＵＶＥＣの運動性を示す（倍率：×４０）。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図４ｂ】図４ｂは、図４ａのものにおいて、高倍率（×２００）で、フィールドにおける運動性の細胞数を数えた。８個のフィールドを２回ずつカウントした。エラーバーは、±ｓ．ｅを示す。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．００１，ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図５ａ】図５ａは、ＨＵＶＥＣのチューブ形成に関するｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３の効果を示す。ＨＵＶＥＣをマトリゲルコートされたプレートに１．５×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングして、次いで、ｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させ（２０ＭＯＩ）、Ａ５４９又はＨ４６０のコンディショニング培地で４８時間培養した。図５ａは、チューブ形成に対する代表的な写真である（倍率：×４０）。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図５ｂ】図５ｂは、図５ａのもののチューブ形成に対する定量的分析結果である。チューブネットワークによりカバーされる広さを測定し、チューブ形成の定量化を行った。実験は３回行って、値は、これらの平均で示した。エラーバーは、±ｓ．ｅを示す。＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．００１，ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図６】図６は、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３による血管の出芽（ｖｅｓｓｅｌ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）抑制を示す。ＫＨ９０３を含む複製不能アデノウイルスは、エクスビボでＶＥＧＦ誘導性の血管の出芽を抑制する。分析結果は、０（最小ポジティブ）から５（最大ポジティブ）までスコアリングした。ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ：非感染
【図７】図７は、ＲｄＢ／ＫＨ９０３のインビトロ細胞変性効果を示す。細胞を、指定されたＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３、ＲｄＢ又はＲｄＢ／ＫＨ９０３に感染させた。複製不能アデノウイルスｄＥ１−ｋ３５を陰性対照群として利用した。感染４日目〜１０日目にプレートにある細胞を固定化して、クリスタルバイオレットで染色した。
【図８】図８は、ＫＨ９０３発現アデノウイルスの抗腫瘍効果を示す。１×１０７個のＨ４６０腫瘍細胞を皮下注入した異種移殖モデルを作製した。腫瘍を８０ｍｍ３〜１２０ｍｍ３まで成長させた。腫瘍を有するヌードマウスを３つの実験群（それぞれ５匹ずつ）にランダムに分けた。それぞれの実験群に対して、１日、３日及び５日目にアデノウイルス（３０μｌのＰＢＳ中に１×１０１０個のアデノウイルス粒子）を腫瘍内に注入した。腫瘍の短軸（ｗ）及び長軸（Ｌ）を測定し、腫瘍成長を毎日モニタリングした。
【図９ａ】図９ａは、ＲｄＢ／ＫＨ９０３で処理されたＨ４６０腫瘍組織の血管新生に対する組織学的評価結果である。図９ａにおいて、微細血管を抗ＰＥＣＡＭ抗体（ＣＤ３１）で染色した。ＣＤ３１に対する染色結果を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ＲｄＢ／ＫＨ９０３で処理されたＨ４６０腫瘍組織の血管新生に対する組織学的評価結果である。図９ｂは、腫瘍組織に対する血管数を定量化した結果である。データを平均（ｎ＝３）±標準誤差で示した。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。
【実施例】
【００５７】
−実験材料及び実験方法−
１．対象細胞株及び細胞の培養
実験に使用されたヒト肺癌細胞株であるＡ５４９とＨ４６０は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入して、ＨＵＶＥＣ（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）は、Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，スイス）から購入した。アデノウイルスの初期発現遺伝子であるＥ１部位が宿主遺伝体内に内在されているＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ）をアデノウイルス産生細胞株として使用した。ＨＵＶＥＣを除いた全ての細胞株は、１００Ｕ／ｍｌペニシリンと１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加した１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ培養液で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＨＵＶＥＣは、５％ＦＢＳの含まれたＥＧＭ−２ＭＶ（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＣ，ＵＳＡ）に抗生剤１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を入れて、継代培養５日目〜８日目の細胞で実験を行った。
【００５８】
２．ＫＨ９０３を発現するアデノウイルスの作製及び力価算出
ＫＨ９０３を発現する組換えアデノウイルスを作製するために、ＫＨ９０３プラスミドであるｐＫＨ９０３（ＫａｎｇＨｏｎｇ，Ｃｈｅｎｇ ｄｕ，中国）をアデノウイルスＥ１シャトルベクターであるｐＣＡ１４（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）にＥｃｏＲＩ切断して挿入した後、これを再びＢｇｌＩＩで切断して得られたＫＨ９０３のＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで切断したＥ３シャトルベクターｐＳＰ７２ΔＥ３（本発明者が作製、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：６１−７１（２００５））に挿入した。ＫＨ９０３は、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン（配列番号１及び２の配列）、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン（配列番号３及び４の配列）及びＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン（配列番号５及び６の配列）が順次結合して製造されたキメラデコイ受容体に、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（配列番号７及び８の配列）が融合されて作られたものである。作製されたｐＳＰ７２ΔＥ３／ＫＨ９０３ベクターをＸｂａＩで切断し、ｐＳＰ７２ΔＥ３／ＣＭＶベクター（本発明者が作製、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１２：６１−７１（２００５））のＣＭＶプロモーターを挿入してｐＳＰ７２ΔＥ３−ＣＭＶ−ＫＨ９０３ Ｅ３シャトルベクターを製造した。ＫＨ９０３を発現する複製不能アデノウイルスを作製するために、上記作製されたｐＳＰ７２ΔＥ３−ＣＭＶ−ＫＨ９０３ Ｅ３シャトルベクターをＰｖｕＩで処理して直鎖化し、Ｅ３遺伝子が欠失されて、Ｅ１部位にｌａｃＺが挿入されており、アデノウイルスタイプ３５のファイバーノブ（ノブ）で置換されたｐｄＥ１−ｋ３５トータルベクター［Ａｄ３５ファイバーノブ部分を有したアデノウイルス（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ）からＰＣＲで７００ｂｐの３５ノブ部分を得て、ＮｃｏＩ／ＭｆｅＩで切断し、予めＮｃｏＩ／ＭｆｅＩで切断していたｐＳＫ５５４３（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｂｌａｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌｉｖｅｒ ｔｒｏｐｉｓｍ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：２４８−２６１（２００５））とライゲーションしてｐＳＫ５５４３／３５ｋを作製した。作製されたｐＳＫ５５４３／３５ｋは、ＳａｃＩＩ／ＸｍｎＩで切断し、ＳｐｅＩで切断したｄＥ１／ｌａｃＺと相同組換えすることでｐｄＥ１−ｋ３５を作製した］をＳｐｅＩで処理して直鎖化した。これらで大腸菌ＢＪ５１８３（スイスのＦｒｉｂｏｕｒｇｈ大学のＶｅｒｃａ；Ｈｅｉｄｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２８（２）：２６０−２６５，２６８−２７０（２０００））を同時形質転換し、相同組換えにより、ｌａｃＺ遺伝子とＫＨ９０３を同時に発現する複製不能アデノウイルスベクターであるｐｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を作製した。ＶＥＧＦを効果的に抑制させることのできるＶＥＧＦトラップを発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスを作製するためには、上記作製されたｐＳＰ７２ΔＥ３−ＣＭＶ−ＫＨ９０３ Ｅ３シャトルベクターをＰｖｕＩで処理して直鎖化したものと、ＳｐｅＩ処理して直鎖化したｐＲｄＢアデノウイルストータルベクター（Ｅ１ＡのＲｂ結合部位が変異して、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子とＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が共に欠失された腫瘍崩壊アデノウイルス，参照：大韓民国特許第０７４６１２２号）とで、一緒に大腸菌ＢＪ５１８３を形質転換して、ｐＲｄＢ／ＫＨ９０３腫瘍崩壊性アデノウイルスベクターを作製した。Ｅ１ＡのＲｂ結合部位の変異は、ＥｌＡ遺伝子配列に位置したＲｂ結合部位をコードするヌクレオチド配列のうち、第４５番目のＧｌｕ残基がＧｌｙ残基に置換された変異、及び第１２１番目〜１２７番目アミノ酸残基が全てＧｌｙ残基に置換された変異である。相同組換えされたアデノウイルスベクターをＨｉｎｄＩＩＩで処理して相同組換えの有無を確認した後、確認されたプラスミドを、ＰａｃＩ制限酵素で切断した後、ＨＥＫ２９３細胞株を形質転換してアデノウイルスを産生した。対照群として使用されたウイルスは、Ｅ１部位の遺伝子が欠失して、その部位にｌａｃＺ遺伝子を有するｄＥ１−ｋ３５と、同時にＥ１Ｂ１９ｋＤａとＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子が全て欠失したＲｄＢである。それぞれのアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞株で増殖させて、ＣｓＣｌ濃度勾配で濃縮して精製して、限界適正分析（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）及びフォトスペクトロメーターで力価（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ； ＰＦＵ）を算出した。
【００５９】
３．ウェスタンブロット
ＫＨ９０３を発現するアデノウイルスをヒト肺癌細胞株に感染させることで、細胞内でＫＨ９０３タンパク質が産生されて、細胞培養液に分泌されるかどうかを検証するために、Ａ５４９細胞に、作製したアデノウイルスであるｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を、２０ＭＯＩ、５０ＭＯＩ及び１００ＭＯＩでそれぞれ処理して、４８時間後に細胞培養液と細胞を全て回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。電気泳動後、ゲルにあるタンパク質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜にエレクトロトランスファーした後、ＫＨ９０３のヒトＩｇＧのＦｃ部位を特異的に認識する抗体を一次抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）として用いた。ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）として反応させた後、ＬＡＳ４０００を用いて、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）による発色で、膜上のタンパク質と抗体との結合の有無を調べて、各タンパク質の発現を確認した。
【００６０】
４．ＶＥＧＦ発現変化
腫瘍から分泌されるＶＥＧＦを効果的に抑制可能なＫＨ９０３を発現するアデノウイルスにより、ＶＥＧＦの発現が減少されるかどうかを検証するために、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を行った。まず、ＶＥＧＦの発現が効果的に抑制されるかを検証するために、肺癌細胞株であるＡ５４９、Ｈ４６０、Ｈ３２２（ＡＴＣＣ）、Ｈ３５８（ＡＴＣＣ）及びＨ１２９９（ＡＴＣＣ）を６ウェルプレートにそれぞれ３×１０５細胞／ウェルで播いた後、翌日アデノウイルスを２ＭＯＩ〜１００ＭＯＩで感染させて６時間後、５％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地に入れ替えた。ウイルス感染から４８時間後に培地を回収するために、培地回収の２４時間前にＦＢＳの含まれていないＤＭＥＭに入れ替えた。回収された培地は、８００×ｇで遠心して上清を分離した後、このうち、１５０μｇを利用してＶＥＧＦのＥＬＩＳＡ分析を行った。
【００６１】
５．ＭＴＴ分析
アデノウイルス感染後のＫＨ９０３の発現による血管内皮細胞増殖能の抑制を定量化するために、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｔｈｉａｚｏｌ−２ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，２ｍｇ／ｍｌ）分析を行った。ＨＵＶＥＣを２％ゼラチンでコートされた４８ウェルプレートに播いて、２４時間後、３０ＭＯＩの組換えアデノウイルスで処理した。ウイルス処理前、ＨＵＶＥＣは、ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＣ，ＵＳＡ）培地で血清飢餓（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）処理した。ウイルス処理７２時間後の細胞の生存率を測定するために、培地を除去した後、ＭＴＴ溶液を各ウェル当たり１５０μｌ入れて、５％ＣＯ２の存在下、３７℃恒温培養器中で４時間反応した後、上清を除去した。上清の除去されたプレートウェルに１ｍｌのＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）を添加して、３７℃で１０分間反応した後、上清（ＤＭＳＯで溶出されたもの）の５４０ｎｍでの吸光度を測定し、細胞の相対的生存率を測定した。
【００６２】
６．内皮細胞の移動性分析
ＨＵＶＥＣの走化性を調べるために、６．５ｍｍ直径のポリカーボネートろ紙（８μｍポアサイズ）のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、内皮細胞の運動性分析を行った。まず、上部チャンバのフィルターを０．１％ゼラチンでコートした。ゼラチンの乾燥後、６時間血清飢餓培地で培養し、血清飢餓処理したＨＵＶＥＣを１×１０５細胞になるようにカウントし、上部チャンバに入れて、ｄＥ１−ｋ３５とｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させて、回収した細胞培養液を下部チャンバに入れて、プレートを３７℃で３時間３０分間インキュベートした。プレートを取り出して、上部チャンバの培地を捨てた後、細胞をメタノ−ルで１分間固定し、Ｈ＆Ｅ染色してスライドを作製した。その後、グループ別に２００倍の倍率で８ヶ所の写真を撮って、平均を求め、細胞の運動性を定量化した。
【００６３】
７．チューブ形成分析
腫瘍が分泌するＶＥＧＦを効果的に抑制できるＫＨ９０３によるＶＥＧＦの発現減少により、血管内皮細胞のチューブ形成機能が変化するかどうかを調べるために、ＨＵＶＥＣを利用したチューブ形成分析を行った。まず、２５０μｌの増殖因子を減らしたマトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏ−ｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を−２０℃に保存しておいた２４ウェルプレートに均一にプレート後、３７℃で３０分間置いて固めた。ＨＵＶＥＣ（５回〜７回継代培養）細胞は、６時間、血清飢餓ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＣ，ＵＳＡ）培地で培養し、血清飢餓処理した後、トリプシン処理して細胞数を測定した。ｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスでそれぞれ２０ＭＯＩ処理した後、４８時間後に回収したＡ５４９及びＨ４６０細胞培養液を、血清飢餓の前処理をしたＨＵＶＥＣ（１．５×１０５細胞／ウェル）と混ぜた後、マトリゲルがプレートされた２４ウェルプレートに播いて培養した。陽性対照群としては、２０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦタンパク質を利用した。培養後１２時間〜１６時間の間に培養液を除去して、ＰＢＳで２回洗浄した後、顕微鏡でチューブ形成を観察した。
【００６４】
８．エクスビボ大動脈輪出芽分析
腫瘍から分泌されるＶＥＧＦを効果的に抑制できるＫＨ９０３による血管形成抑制を観察するために、大動脈輪出芽（ａｏｒｔａｌ ｒｉｎｇ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）分析を行った。オリエント社（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ，Ｋｏｒｅａ，Ｉｎｃ．）から購入した６週齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットから大動脈を分離して、大動脈周辺の繊維脂肪組織を除去した後、１ｍｍ厚の輪に薄く切断した。予め冷やしておいた４８ウェルプレートにマトリゲルを２００μｌずつプレートして、大動脈輪をそれぞれのウェルの中のマトリゲルに植えた後、３７℃で２０分間置いた。マトリゲルが固まった後、チューブ形成分析で使用された細胞培養液２５０μｌをそれぞれのウェルに添加して培養し、毎日顕微鏡で大動脈輪から形成された血管を観察した。陽性対照群として、ＶＥＧＦタンパク質（２０ｎｇ／ｍｌ）を用いた。培養後、新しく形成された血管は、二重盲分析により、陽性対照群を５点、血管が形成されなかった実験群を０点の点数を付与して分析して、それぞれの実験群に対して１２個の大動脈輪を対象に大動脈輪出芽分析を行った。
【００６５】
９．ＫＨ９０３が発現するアデノウイルスの腫瘍殺傷能
腫瘍から分泌されるＶＥＧＦを減少させるＫＨ９０３の発現の有無がアデノウイルスの複製にどのような影響を及ぼすか検証するために、細胞変性分析を行った。肺癌細胞株を含むヒト腫瘍細胞株を４８ウェルプレートにそれぞれ播いて、２４時間後、ｄＥ１−ｋ３５，ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３，ＲｄＢ又はＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを０．１ＭＯＩ〜１０ＭＯＩで感染させた。対照群ウイルスとの差が最も顕著な時点で培地を除去し、プレートの底に残っている細胞を０．５％クリスタルバイオレットで固定して染色した後、分析した。
【００６６】
１０．生体内抗腫瘍効果の検証
オリエント社から購入した生後６週〜８週程度のヌードマウスの腹部皮下に１×１０７個のヒト肺癌細胞株、Ｈ４６０を注射した。腫瘍の容積が約７０ｍｍ３〜１００ｍｍ３程度になった時、ＲｄＢ、ＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを陰性対照群のＰＢＳと共にそれぞれ２日間隔で３回腫瘍内に直接注射した後、腫瘍の大きさを２日間隔で測定した。腫瘍の容積は、カリパースで腫瘍の短軸と長軸を測定し、下記のような公式で算出した：
腫瘍の容積（ｍｍ３）＝（短軸（ｍｍ））２×長軸（ｍｍ）×０．５２３
【００６７】
１１．ＶＥＧＦと結合するＫＨ９０３を発現する腫瘍特異的崩壊性アデノウイルスの投与による腫瘍組織内の血管新生の抑制
６〜８週齢のヌードマウスの腹部皮下に肺癌細胞株であるＨ４６０を注射した後、腫瘍の大きさが約１００〜１２０ｍｍ３程度になった時、ＲｄＢ，ＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルス又は陰性対照群のＰＢＳを２日間隔で３回腫瘍内投与した。最後のウイルスを投与した後、１０日後頃に腫瘍を摘出して、ＩＨＣ ｚｉｎｃ ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｒｅｅ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）溶液で固定した後、パラフィンブロックを作製した。作製したパラフィンブロックを４μｍ厚に切断してスライドを作った後、これをキシレン、１００％、９５％、８０％及び７０％エタノ−ル溶液に順に浸してパラフィンを除去してから、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。腫瘍が分泌するＶＥＧＦと結合してその発現を減少させるＫＨ９０３により腫瘍組織内血管形成が抑制されるかどうか確認するために、血管内皮細胞特異的抗原であるＣＤ３１を特異的に認識できる抗体であるラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＭＥＣ１３．３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、組織免疫染色を行った。パラフィンが除去された４μｍ厚の腫瘍組織スライドを３％Ｈ２Ｏ２溶液で１０分間反応して、内因性過酸化酵素の作用を除いた。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で３０分間処理して非特異的な抗体反応が起こらないようにした後、ＣＤ３１抗体を一次抗体としてハイブリダイゼーションを行った。ビオチンの結合されたポリクロ−ナル抗ラットＩｇＧ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を二次抗体として反応した後、ＤＡＢ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して、ＣＤ３１の発現を調べた。
【００６８】
１２．腫瘍内血管数の計測
血管内皮細胞特異的抗原であるＣＤ３１（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）に対する染色を行った腫瘍内血管をまず低倍率で観察し、無作為に写真を取った後、倍率を高めて１００倍視野で観察される血管の数を定量した。３枚のスライドからそれぞれ５個の視野を選択し血管数を計測して、平均値を算出し、その値を代表値として使用した。
【００６９】
−実験結果−
１．ＶＥＧＦと特異的に結合するＫＨ９０３を発現するアデノウイルスの作製及びＶＥＧＦ発現変化の検証
ＶＥＧＦに特異的に結合し、腫瘍から分泌するＶＥＧＦの発現を抑制するＶＥＧＦトラップであるＫＨ９０３を発現するアデノウイルスｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を作製した（図１ａ）。ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスのＥ３部位に挿入されたＫＨ９０３が、細胞感染時に実際に細胞から培地に分泌されるか確認するために、感染させた腫瘍細胞と培地を全て回収し、ＫＨ９０３の構造のうち、ヒトＩｇＧのＦｃ部位を検出する抗体を利用してウェスタンブロッティングを行った。結果的に、細胞溶出液ではＫＨ９０３の産生を確認できる程度の量が観察されたが、培地では、多量のＫＨ９０３を観察することができた。したがって、ＫＨ９０３は感染された細胞内で産生されて、培地に分泌されることを確認することができた（図１ｃ）。
【００７０】
アデノウイルスの初期遺伝子であるＥ１Ａを発現する複製可能アデノウイルスによりＶＥＧＦの発現が減少するという報告があったので２８、ＫＨ９０３によるＶＥＧＦ発現変化を検証するために、Ｅ１Ａを欠失し、ｌａｃＺとＫＨ９０３を同時に発現する複製不能アデノウイルスであるｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を作製した。ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３をヒト肺癌細胞株（Ａ５４９，Ｈ４６０，ＨＣＣ８２７，Ｈ１２９９，Ｈ２１７２，Ｈ３２２）に感染させて、細胞から培地を回収して、ＥＬＩＳＡでＶＥＧＦ発現量を定量した。その結果、実験に利用された全ての種類の肺癌細胞株において、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスの感染によりＶＥＧＦの発現が顕著に減少することを確認することができた（図２ａ）。
【００７１】
実際に腫瘍細胞でＶＥＧＦがどれだけ産生されており、分泌されるＶＥＧＦがＫＨ９０３の発現により減少するかを検証するために、培地を回収した後の細胞を破砕し、細胞のＶＥＧＦ発現量を確認した。図２ｂから分かるように、アデノウイルスの感染後、培地を用いたＶＥＧＦのＥＬＩＳＡの結果と同様に、ｄＥ１−ｋ３５を感染させた細胞に比べ、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させた細胞でＶＥＧＦ発現量が顕著に減少したことを観察することができた（図２ｂ）。
【００７２】
２．ＶＥＧＦと特異的に結合するＫＨ９０３を発現するアデノウイルスによる血管新生抑制能の観察
まず、ＶＥＧＦを抑制するＫＨ９０３の発現によるＶＥＧＦレベルの変化によるＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ誘導性増殖能に対する影響を確認した。ＨＵＶＥＣをマトリゲルコートした４８ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルで播いた後、３０ＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させて、７２時間後、ＭＴＴ分析を行って、細胞の生存率を測定した。その結果、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させたグル−プが、ウイルスを処理しなかったグループに比べ、生存率が５３％減少し、陽性対照群であるｄＥ１−ｋ３５を感染させたグループに比べては、３０％減少したことを観察した（図３）。
【００７３】
ＶＥＧＦ発現を抑制させるＫＨ９０３によるＶＥＧＦ量の変化が血管内皮細胞の運動能に及ぼす影響を検証するために、ＨＵＶＥＣを利用して運動性分析を行った。Ａ５４９、Ｈ４６０細胞株を２０ＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスにそれぞれ感染させて、４８時間後に回収した培地でＨＵＶＥＣを培養した。その結果、何も処理しなかった細胞培養液又はｄＥ１−ｋ３５アデノウイルスを感染させた細胞培養液を処理した場合は、上部チャンバから下部チャンバにたくさんの細胞が移動した反面、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させた細胞培養液を処理した場合は、ＨＵＶＥＣの移動は、上記の２つのグループに比べ低いことを観察した（図４）。
【００７４】
ＫＨ９０３の発現によるＶＥＧＦ量の変化が、血管内皮細胞の血管形成能力に及ぼす影響を検証するために、ＨＵＶＥＣを利用してチューブ形成分析を行った。Ａ５４９、Ｈ４６０細胞株を２０ＭＯＩのｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスにそれぞれ感染させて、４８時間後に回収した培地でＨＵＶＥＣを培養した。その結果、何も処理しなかった細胞培養液又はｄＥ１−ｋ３５アデノウイルスを感染させた細胞培養液を処理した場合は、大きくて太いチューブが形成された反面、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させた細胞培養液を処理した場合は、ＨＵＶＥＣの血管形成がうまくいかず、細くて部分的に切られたチューブが形成されたことを観察した（図５）。
【００７５】
以上から確認された血管新生能の差を、エクスビボ上で確認するために、ラットの大動脈を利用して血管出芽分析を行った。まず、ｄＥ１−ｋ３５又はｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルス、２０ＭＯＩで処理して４８時間後に回収したＡ５４９、Ｈ４６０細胞培養液で大動脈輪を処理して５日間培養した結果、何も処理しなかった細胞培養液やｄＥ１−ｋ３５を感染させたＡ５４９細胞培養液を処理した大動脈輪とは対照的に、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを処理した細胞培養液で大動脈輪を培養した場合、血管の出芽がほとんど起こらないことを確認することができた（図６）。これを、より定量的に比較検証するために、形成された血管を、二重盲方式で陽性対照群（ｍｏｓｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を５点、血管が出芽されなかった実験群（ｌｅａｓｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を０点で点数を付与して分析した。何も処理しなかった細胞培養液やｄＥ１−ｋ３５を感染させたＡ５４９、Ｈ４６０細胞培養液を処理した全ての大動脈輪において血管形成が活発に起こることを確認することができたが、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３アデノウイルスを感染させた細胞の培養液を処理した場合は、対照群ウイルスであるｄＥ１−ｋ３５に比べ、血管形成が顕著に抑制されることを確認した。
【００７６】
３．ＶＥＧＦと特異的に結合するＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスの細胞殺傷能の検証
ＶＥＧＦ発現抑制による血管新生能の低下は、腫瘍の成長を抑制すると考えられるので、ＫＨ９０３の抗癌効果を確認するために、ＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢ／ＫＨ９０３と、対照群としての腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢをそれぞれ作製した。ＫＨ９０３の発現によりアデノウイルスの複製が阻害できるかどうか確認するために、数種類の癌細胞株及び正常細胞株をｄＥ１−ｋ３５、ｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３、ＲｄＢ又はＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスに感染させて、ウイルスの複製による細胞の死滅の程度をＣＰＥ分析で観察した。陰性対照群であるｄＥ１−ｋ３５複製不能アデノウイルスに感染させた細胞においてはアデノウイルスが複製されないため、細胞殺傷効果が現れなかったが、複製可能アデノウイルスであるＲｄＢ又はＲｄＢ／ＫＨ９０３に感染させ場合は、ウイルスの量が増加するにつれて、細胞殺傷効果も増加した。実験に利用された全ての細胞株において、ＫＨ９０３を発現するアデノウイルスであるＲｄＢ／ＫＨ９０３の細胞殺傷能が、対照群ウイルスであるＲｄＢに比べ、優れていることを観察することができた（図７）。
【００７７】
４．ＶＥＧＦと特異的に結合するＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスの生体内抗腫瘍効果の検証
ＶＥＧＦ発現を抑制するＫＨ９０３を発現するアデノウイルスの生体内抗腫瘍効果を検証するために、ヒト肺癌細胞株であるＨ４６０細胞をヌードマウスの腹部皮下に注射して、形成された腫瘍の容積が約８０ｍｍ３〜１００ｍｍ３程度になった時、１×１０１０ｖｐのＲｄＢとＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを陰性対照群であるＰＢＳと共に２日間隔で３回腫瘍内に投与した後、腫瘍の成長を観察した（図８）。陰性対照群であるＰＢＳを投与したヌードマウスの場合、ウイルスの投与後、２３日後頃に既に腫瘍の容積が２１７０．２３８±４５５．１２１６ｍｍ３に急激に成長したが、ＫＨ９０３を発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスであるＲｄＢ／ＫＨ９０３を投与した場合は、腫瘍の成長が大きく遅延されることを確認した。即ち、ＲｄＢとＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを投与したマウスの場合、それぞれ１１８１．３９１±９８５．９１３１ｍｍ３、及び２５２．６７±１０３．８４６４ｍｍ３であって、ＫＨ９０３の血管新生の抑制による、抗腫瘍効果を観察することができた。
【００７８】
５．ＶＥＧＦ発現を抑制するＫＨ９０３を発現する腫瘍特異的殺傷アデノウイルスの投与による腫瘍内血管分布観察
ヒト肺癌細胞株であるＨ４６０をヌードマウスの腹部皮下に注射した後、腫瘍が形成された後、ＲｄＢとＲｄＢ／ＫＨ９０３アデノウイルスを、ＰＢＳを陰性対照群として、１×１０１０ｖｐで２日間隔で３回腫瘍内注射した。最後の投与の１日後に腫瘍を摘出して、血管内皮細胞特異的抗原であるＣＤ３１を、組織免疫染色法で観察した。その結果、陰性対照群であるＰＢＳ群に比べ、腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢを処理した実験群では、腫瘍内血管数が２１％減少したことを確認し、ＲｄＢ／ＫＨ９０３を投与した場合は、血管数が７１％抑制されたことを観察することができた（図９）。
【００７９】
−追加的議論−
血管新生は、既に存在する血管から新しい血管が形成される過程であって、胚発生と、器官の形成及び組織の再生に重要な役割をする。また、血管新生は、初期の腫瘍が成長するための必須条件であって、腫瘍の体積が大きくなるにつれて、腫瘍細胞や浸潤されたマクロファージが様々な血管形成因子を産生して、腫瘍内微細血管を形成させる。このように形成された血管は、腫瘍細胞に養分を供給と同時に、様々な増殖因子を供給し、腫瘍を成長させる。血管新生に関与する種々の増殖因子のうち、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が腫瘍の成長と転移に大きく関与することが知られている。ＶＥＧＦは、受容体型チロシンキナーゼ、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）の二量体と結合し、直接血管内皮細胞の分裂を促進する、強力な血管新生因子として作用し、微細血管の透過性を増加させて血漿タンパクが周辺組織に排出され、細胞外基質を修飾して血管形成を容易にする。そのため、癌の成長を防ぐためには、血管新生因子であるＶＥＧＦの抑制が極めて重要である。ここ３０年間、抗癌治療の標的として、腫瘍内血管形成を抑制することにより腫瘍の成長を抑制する研究が活発になされてきた。しかし、現在利用可能な血管新生抑制剤は、主に単一治療剤として利用されるよりは、併用治療によく利用されており、高額な費用と反復投与による毒性を起こせるという短所がある。本研究では、このような限界を克服するために、水溶性のＶＥＧＦ特異的デコイ受容体として作用するＫＨ９０３を腫瘍崩壊性アデノウイルスに発現させることにより、効果的にＶＥＧＦを抑制すると同時に、腫瘍崩壊性アデノウイルスを使用することにより、相乗的に抗腫瘍効果を向上させようとした。
【００８０】
ＫＨ９０３は、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ結合ドメインを結合させて作製したＶＥＧＦ特異的水溶性デコイ受容体であって、腫瘍細胞で分泌されるＶＥＧＦを効果的に抑制することができる。即ち、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲの結合相互作用に直接的に関与するＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２の主要ドメインを利用して作製したＫＨ９０３は、ＶＥＧＦＲの代わりに腫瘍細胞で分泌されるＶＥＧＦと結合し、受容体とリガンドの反応を遮断することにより、血管新生過程を抑制することができる２９，３０。
【００８１】
初期に作製されたＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦと結合する主要部位であるＶＥＧＦＲ１の２番目のドメインとＶＥＧＦＲ２の３番目のドメインがヒトＩｇＧのＦｃ部位に融合された形態である１１。本研究では、ＶＥＧＦ−Ａだけではなく、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣそしてＰＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）とも結合できるため、ＶＥＧＦとの結合能が、既存のＶＥＧＦトラップに比べ、約２倍向上されたＫＨ９０３を利用した。ＫＨ９０３がＶＥＧＦ−Ａを始めとして、あらゆる種類のＶＥＧＦファミリーと優れた結合性を示す理由は、既存のＶＥＧＦトラップ構造に、ＶＥＧＦと受容体との強い結合性が維持されるように関与するＶＥＧＦＲ２の４番目ドメインが追加されたからである。また、このドメインは、Ｈ９０３が３次構造を安定的に形成するようにするだけではなく、ダイマーを形成する効率を高めて、結果的に、ＫＨ９０３は既存ＶＥＧＦトラップより延長された半減期を有するという利点を持った２９。このような長所を有しするＫＨ９０３の血管新生抑制効果を観察するために、Ｅ１部位にレポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼが挿入されており、Ｅ３部位遺伝子が欠失されたアデノウイルスのＥ３部位にＫＨ９０３を挿入して、複製不能アデノウイルスであるｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を作製した。血管形成が旺盛なＡ５４９とＨ４６０を始めとして、種々の肺癌細胞株に多様なＭＯＩで感染させて、ＶＥＧＦ発現量を比較検証した結果、実験に利用した全ての細胞株において、ＫＨ９０３がＶＥＧＦの発現を抑制する効果を強くもつことを確認することができた（図２）。このようにＫＨ９０３により、腫瘍細胞においてＶＥＧＦの発現が効果的に抑制されることを観察した後、減少したＶＥＧＦ量が実際の血管内皮細胞の運動性、増殖そして血管形成及び拡張のような血管新生の一連の過程にどのような影響を及ぼすか、インビボとエクスビボで観察した。
【００８２】
まず、血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣに、ＫＨ９０３を発現する複製不能ウイルスｄＥ１−ｋ３５／ＫＨ９０３を感染させた時、ＶＥＧＦ発現量の減少により血管内皮細胞の生存率が減少することを確認した。次いで、ＫＨ９０３を発現する複製不能ウイルスと対照群ウイルスをそれぞれ感染させた細胞、そして非感染細胞の培養液を利用して、血管内皮細胞の運動性を観察する運動性分析を行った。増殖因子が十分にある対照群としてウイルスに非感染細胞の培養液を利用した時は、ＨＵＶＥＣの移動が活発に起こることを観察することができたが、ＫＨ９０３を発現するウイルスで処理した細胞から得た培養液を利用した場合は、ＶＥＧＦの減少により、ＨＵＶＥＣの運動性が非常に低下したことを観察することができた。血管形成能と血管の出芽も抑制されることを、チューブ形成分析と大動脈輪出芽分析を通じて検証した。このようなＫＨ９０３による血管新生抑制は、抗癌効果を期待することができる。そこで、増大された抗腫瘍効果を検証するために、本研究室で開発したＥ１ＡのＲｂ結合部位が修飾されてＥ１Ｂ部位が除去された腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢにＫＨ９０３を挿入したＲｄＢ−ＫＨ９０３アデノウイルスを作製して、Ｈ４６０異種移植モデルにおいて優れた抗腫瘍効果を確認した。腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢ−ＫＨ９０３は、Ｅ１Ａ遺伝子発現によるＶＥＧＦ発現抑制だけではなく、効率的で且つ持続的な遺伝子伝達により、ＫＨ９０３によるＶＥＧＦ発現抑制も同時に誘導して、対照群のＲｄＢアデノウイルスに比べ、生体内抗腫瘍効果が顕著に昂進した。腫瘍組織内血管分布を観察した結果においても、ＲｄＢ／ＫＨ９０３の効果を再び検証することができた。腫瘍組織において、ＰＢＳ群に比べ、腫瘍崩壊性アデノウイルスで処理した場合、血管の数が減少し、腫瘍崩壊性アデノウイルスだけでも血管新生を抑制することができることを確認することができた。また、ＫＨ９０３によるさらに顕著な血管新生抑制効果を立証することにより、ＫＨ９０３が効果的にＶＥＧＦを抑制したことが分かった。
【００８３】
即ち、本研究で作製したＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢ−ＫＨ９０３は、ＶＥＧＦ特異的水溶性デコイ受容体であるＫＨ９０３を通じて得られる腫瘍内血管新生の遮断と共に、アデノウイルスの腫瘍崩壊性能を同時に誘導して、より一層増大された抗腫瘍効果が誘導されると判断される。
【００８４】
ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ結合ドメインをヒトＩｇＧのＦｃ部位に結合させて作製したＫＨ９０３は、効果的に腫瘍細胞が分泌するＶＥＧＦを抑制することができた。本研究に利用されたＫＨ９０３を発現する腫瘍崩壊性アデノウイルスであるＲｄＢ−ＫＨ９０３は、腫瘍特異的アデノウイルスの複製による腫瘍特異的殺傷能と共に、Ｅ１Ａ発現とＨ９０３により誘導されたＶＥＧＦの抑制により、顕著な抗腫瘍効果を示し、癌治療に有用に利用されると期待される。
【００８５】
以上、本発明の望ましい具体例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具体例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその均等物により定義されると言える。
参照文献
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１２．Ｖｏｓｓｅｌｅｒ Ｓ，Ｍｉｒａｎｃｅａ Ｎ，Ｂｏｈｌｅｎ Ｐ，Ｍｕｅｌｌｅｒ ＭＭ，Ｆｕｓｅｎｉｇ ＮＥ，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｔｒｏｍａｌ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ ｒｅｖｅｒｔｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｈｅｔｅｒｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；６５：１２９４−３０５
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１４．Ｓ． Ｐｅｒｃｙ Ｉｖｙ，Ｊｅａｎｎｅｔｔｅ Ｙ． Ｗｉｃｋ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ ＭＫ，Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆ ＶＥＧＦＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２００９ ６：５６９−７９
１５．Ｋｅ Ｘｉｅ，Ｒｕｉ−Ｚｈｅｎ Ｂ，Ｙａｎｇ Ｗ，Ｑｕａｎ Ｌ，Ｋａｎｇ Ｌ，Ｙｕ−Ｑｕａｎ Ｗ，Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦＲ−２−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９ ７
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２２．Ｒｅｉｌｙ ＧＪ，Ｍｉｌｌｅｒ ＶＡ，Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｔｒａｐ ｉｎ Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；１３：４６２３−７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アデノウイルスの逆方向反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ；ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、（ｂ）（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）の細胞外ドメインとを含むキメラデコイ受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードするヌクレオチド配列と、を含むことを特徴とする血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルス。
【請求項２】
キメラデコイ受容体は、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインと、を含む請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第３細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｖ）ＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、並びに（ｖ）ＶＥＧＦＲ−１の第５細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインを含む請求項２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第２細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｖ）ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、並びに（ｖ）ＶＥＧＦＲ−２の第５細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインを含む請求項２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】
キメラデコイ受容体は、２個〜４個の細胞外ドメインを含む請求項３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
キメラデコイ受容体は、２個〜４個の細胞外ドメインを含む請求項４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】
キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン、又は（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第５細胞外ドメインを含む請求項５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメイン、又は（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−１の第５細胞外ドメインを含む請求項６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
キメラデコイ受容体は、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合されている請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
組換えアデノウイルスは、Ｅ３遺伝子が欠失したものであり、前記キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、前記Ｅ３遺伝子領域に挿入されている請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
組換えアデノウイルスは、非活性型Ｅ１Ｂ１９遺伝子、非活性型Ｅ１Ｂ５５遺伝子又は非活性型Ｅ１Ｂ１９／５５遺伝子を含む請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
組換えアデノウイルスは、活性型のＥ１Ａ遺伝子を含む請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ遺伝子のＲｂ結合部位をコードするヌクレオチド配列のうち、第４５番目のＧｌｕ残基がＧｌｙ残基に置換された変異、及び第１２１番目から第１２７番目のアミノ酸残基が全てＧｌｙ残基に置換された変異を有する請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
（ａ）請求項１から１３のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする抗血管新生組成物。
【請求項１５】
抗血管新生組成物は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロ−ム性動脈硬化プラ−ク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ性関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クロ−ン病、再発狭窄症、アテロ−ム性動脈硬化、腸管接着、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症及び神経退行性疾患のいずれかの予防又は治療のための組成物であることを特徴とする請求項１４に記載の抗血管新生組成物。
【請求項１６】
（ａ）請求項１から１３のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含む抗血管新生組成物を、これを必要とする対象に投与する工程を有することを特徴とする過多血管新生による疾患の予防又は治療方法。
【請求項１７】
過多血管新生による疾患は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロ−ム性動脈硬化プラ−ク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ性関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クロ−ン病、再発狭窄症、アテロ−ム性動脈硬化、腸管接着、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症及び神経退行性疾患のいずれかである請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）アデノウイルスの逆方向反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ；ＩＴＲ）ヌクレオチド配列と、（ｂ）（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）の細胞外ドメインと（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）の細胞外ドメインとを含むキメラデコイ受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードするヌクレオチド配列と、を含むことを特徴とする血管新生抑制能の改善された組換えアデノウイルス。
【請求項２】
キメラデコイ受容体は、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインと、を含む請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第３細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、（ｉｖ）ＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン、並びに（ｖ）ＶＥＧＦＲ−１の第５細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインを含む請求項２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第２細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、（ｉｖ）ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第５細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメイン、並びに（ｖ）ＶＥＧＦＲ−２の第５細胞外ドメインと、ＶＥＧＦＲ−１の第１細胞外ドメイン、第２細胞外ドメイン、第３細胞外ドメイン、第４細胞外ドメイン、第６細胞外ドメイン及び第７細胞外ドメインからなる群から選択される少なくとも１つのＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインを含む請求項２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】
キメラデコイ受容体は、２個〜４個の細胞外ドメインを含む請求項３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
キメラデコイ受容体は、２個〜４個の細胞外ドメインを含む請求項４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】
キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−２の第１細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン、又は（ｉｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−２の第５細胞外ドメインを含む請求項５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
キメラデコイ受容体は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメイン、又は（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１の第２細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−２の第３細胞外ドメイン、ＶＥＧＦＲ−１の第４細胞外ドメイン及びＶＥＧＦＲ−１の第５細胞外ドメインを含む請求項６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
キメラデコイ受容体は、免疫グロブリンのＦｃ領域と融合されている請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
組換えアデノウイルスは、Ｅ３遺伝子が欠失したものであり、前記キメラデコイ受容体をコードするヌクレオチド配列は、前記Ｅ３遺伝子領域に挿入されている請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
組換えアデノウイルスは、非活性型Ｅ１Ｂ１９遺伝子、非活性型Ｅ１Ｂ５５遺伝子又は非活性型Ｅ１Ｂ１９／５５遺伝子を含む請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
組換えアデノウイルスは、活性型のＥ１Ａ遺伝子を含む請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ遺伝子のＲｂ結合部位をコードするヌクレオチド配列のうち、第４５番目のＧｌｕ残基がＧｌｙ残基に置換された変異、及び第１２１番目から第１２７番目のアミノ酸残基が全てＧｌｙ残基に置換された変異を有する請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
（ａ）請求項１から１３のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする抗血管新生組成物。
【請求項１５】
抗血管新生組成物は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロ−ム性動脈硬化プラ−ク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ性関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クロ−ン病、再発狭窄症、アテロ−ム性動脈硬化、腸管接着、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症及び神経退行性疾患のいずれかの予防又は治療のための組成物であることを特徴とする請求項１４に記載の抗血管新生組成物。
【請求項１６】
（ａ）請求項１から１３のいずれかに記載の組換えアデノウイルスの治療学的有効量と、（ｂ）薬剤学的に許容される担体とを含む抗血管新生組成物を、これを必要とする対象に投与する工程を有することを特徴とする過多血管新生による疾患の予防又は治療方法。
【請求項１７】
過多血管新生による疾患は、癌、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒否、新生血管緑内障、紅色症、増殖性網膜症、乾癬、血友病性関節、アテロ−ム性動脈硬化プラ−ク内における毛細血管増殖、ケロイド、傷の顆粒化、血管接着、リウマチ性関節炎、骨関節炎、自己免疫疾患、クロ−ン病、再発狭窄症、アテロ−ム性動脈硬化、腸管接着、猫引っかき病、潰瘍、肝硬変、糸球体腎炎、糖尿病性腎臓病症、悪性腎硬化症、血栓性微小血管症、器官移植拒否、腎糸球体病症、糖尿病、炎症及び神経退行性疾患のいずれかである請求項１６に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５１６１６９（Ｐ２０１３−５１６１６９Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４６９８４（Ｐ２０１２−５４６９８４）
【出願日】平成２２年１１月９日（２０１０．１１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００７８６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８１２９４
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（５１２１７２１８７）インダストリー−ユニバーシティー コーポレーション ファウンデーション ハンヤン ユニバーシティー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月９日（２０１０．１１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００７８６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８１２９４
【国際公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（５１２１７２１８７）インダストリー−ユニバーシティー コーポレーション ファウンデーション ハンヤン ユニバーシティー (1)
【Ｆターム（参考）】
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