抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖおよび抗ＥＧＦＲ抗体
【課題】 免疫された哺乳動物、好ましくはマウスの細胞から構築されるファージ−抗体ライブラリーから得られる新規の抗ＥＧＦＲ抗体およびそれらの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の提供。
【解決手段】 ファージ−抗体ライブラリーから分離された一本鎖Ｆｖの二つを、部分的にヒト化された全抗体分子を作出するために遺伝子操作した。これらキメラ抗ＥＧＦＲ抗体はヒト免疫グロブリンの定常部を含み、一本鎖Ｆｖと同様にヒト腫瘍の診断および治療のための薬剤として使用することができる。
【解決手段】 ファージ−抗体ライブラリーから分離された一本鎖Ｆｖの二つを、部分的にヒト化された全抗体分子を作出するために遺伝子操作した。これらキメラ抗ＥＧＦＲ抗体はヒト免疫グロブリンの定常部を含み、一本鎖Ｆｖと同様にヒト腫瘍の診断および治療のための薬剤として使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、新規の抗ＥＧＦＲ抗体および抗体フラグメント、好ましくは、免疫された哺乳動物、好ましくはマウスの細胞から構築されるファージ−抗体ライブラリーから得られる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）に関する。ファージ−抗体ライブラリーから分離された抗体フラグメントを操作して部分的にヒト化された全抗体分子を作出することができる。これらキメラ抗ＥＧＦＲ抗体はヒト免疫グロブリンの定常部を含み、それらのフラグメントと同様にヒト腫瘍の診断および治療のための薬剤として使用することができる。
【０００２】
さらに、本発明はファージ−抗体ライブラリーが、免疫哺乳動物からの抗体の分離方法として標準的なハイブリドーマ手法に較べてより多様に用い得る代わりの方法であることを示している。
【０００３】
さらには、本発明は、黒色腫、神経膠腫または癌腫などの腫瘍の治療のための該抗体またはフラグメントからなる薬剤組成物に関する。該抗体またはフラグメントはまた、該腫瘍のインビトロまたはインビボでの探索および評価に関する診断的適用のために使用できる。
【背景技術】
【０００４】
本明細書は、ここで次のように定義するいくつかの技術用語に関連している。
「ＦＲ」（フレームワーク領域）は、三つのＣＤＲを支える軽鎖または重鎖可変部の四つのサブ領域を意味する。
「ＣＤＲ」（相補性決定領域）は、超可変配列を含み、本来抗原との直接接触を起こす主な原因となるループ構造物を形成する軽鎖または重鎖可変部の三つのサブ領域を意味する。
「キメラ」または部分的にヒト化された抗体は、ヒト材料由来の定常部および非ヒト材料、例えばマウスに由来する可変部（ＣＤＲを含む）からなる抗体を意味する。
「ヒト化」または完全にヒト化された抗体は、ＣＤＲが非ヒト材料に由来するのに対して、ヒト材料由来の定常部およびＦＲからなる抗体を意味する。
「ＥＧＲ」および「ＥＧＦＲ」は、上皮増殖因子およびそのレセプターを意味する。
「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
「ｓｃＦｖ」は、抗体フラグメントである一本鎖Ｆｖを意味する。
「ＶL」は、軽鎖可変部を意味する。
「Ｖκ」は、カッパ軽鎖可変部を意味する。
「ＶH」は、重鎖可変部を意味する。
ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水を意味する。
ＦＣＳは、ウシ胎児血清を意味する。
ＨＢＳＳは、ハンクスの平衡塩類溶液を意味する。
ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネートを意味する。
ＭＴＣは、混合細胞培養を意味する。
発明の背景
上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、表皮および上皮細胞のマイトゲンであるポリペプチドホルモンである。ＥＧＦが感受性細胞と相互作用する場合、これは膜レセプター（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１７０ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃ−ｅｒｂ−Ｂプロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
【０００５】
ＭＡｂ４２５は、よく知られたヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）に対してつくられたネズミモノクローナル抗体であって、ヒトＥＧＦＲの外側ドメインのポリペプチドエピトープに結合し、ＥＧＦの結合を阻害する。ＭＡｂ４２５（ＡＴＣＣ ＨＢ ９６２９）は、インビトロで腫瘍細胞毒性を媒介し、インビトロで類表皮腫および結腸直腸癌腫由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出された（Ｒｏｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４７，３６９２、１９８７）。ＭＡｂ４２５のヒト化されたキメラは、ＷＯ ９２／１５６８３に開示されている。
【０００６】
ここ数年の間に、機能的抗体フラグメントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主原核細胞中で産生し得る方法が記述された（Ｓｋｅｒｒａ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０３３、１９８８、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０４１、１９８８）。これらにはＦｖフラグメントおよびＦａｂフラグメントが含まれており、Ｆｖフラグメントはとくに関心がもたれる。一本鎖Ｆｖ（鎖中、ＶLおよびＶH鎖は一緒に連結している）についてもまた、記述がある（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３、１９８８、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９、１９８８）。
【０００７】
ファージ−抗体ライブラリーは、免疫した動物からの抗体の分離におけるハイブリドーマ手法に別の手法を提供する。ハイブリドーマ法は、抗体を産生する細胞を不死化することによって行われる。ファージ−抗体手法は、抗体をコードする遺伝子を不死化することによって行われる（Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３、１９９１）。ファージ−抗体手法において、抗体重鎖可変部（ＶH）および軽鎖可変部（ＶL）遺伝子はＰＣＲ増幅され、可変部は無作為に組み合わされて、ファージ粒子の表面で抗体フラグメントとして発現されて、目的の抗原と結合する抗体についてファージ抗体のライブラリーをスクリーニングする。
【０００８】
ハイブリドーマ手法は、動物の脾臓において強い免疫応答を生じさせることが可能な場合はマウスモノクローナル抗体の分離にきわめて良好な結果をもたらした。例えば、ヒト上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）に対するマウスＭＡｂは、ヒトＡ４３１腫瘍細胞で腹腔内免疫したマウスの脾臓から分離された（Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５２、５４９、１９８７）。ハイブリドーマ手法と比較した場合のファージ−抗体手法の考え得る利点は、出発材料としては本質的にいかなる材料からの抗体発現細胞でも用いることができ、多数の異なる抗体が迅速にスクリーニングされることである。ファージ−抗体手法の他の利点は、目的の抗体の可変部をコードする遺伝子はすでにクローニングされており、さらなる遺伝子操作のために直ちに入手できることである。
【０００９】
ファージ−抗体ライブラリーから分離された抗破傷風トキソイドＦａｂフラグメントを全抗体分子に変換したという一報告がある（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、４、７４、１９９３）。
【００１０】
過去十年間、インビトロ免疫は、ヒトおよびネズミ系の双方からの多様な抗原に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作出するための能動免疫の代わりの手法として用いられてきた（例えば、Ｖａｕｘ、Ｄ．Ｊ．Ｔ．、ＨｅＩｅｎｉｕｓ，．Ａ．ａｎｄ Ｍｅｌｌｍａｎ、Ｉ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３６、３６、１９８８、 Ｇａｔｈｕｒｕ、Ｊ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３７、９５、１９９１、 Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、９、３５５、１９８８）。このアプローチの利点は、ごく少量の抗原しか要求されないことおよびこの方法がヒト・ハイブリドーマの作出にも適用されることである。しかし、インビトロ免疫後の低親和性ＩｇＭ抗体の作出およびヒトリンパ球の不死化の困難さは、この手法に常に伴う問題となってきた。
【００１１】
抗体を得る新たな方法は、重鎖および軽鎖可変部（ＶHおよびＶL）領域の遺伝子のＰＣＲ増幅し、次いでこれらを無作為に組み換えてファージ提示ライブラリーとして発現する方法である（７−９）。抗体可変部遺伝子をクローニングされ、副コートタンパク質（遺伝子３）に一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）として融合された（１０）。ファージ粒子はその表面に抗体フラグメントを提示し、抗体の結合性を用いて選別することによって選択することができる。この手法は、Ｖ遺伝子の無作為組み換えが天然のプロセスでは選択され得ない新しい特異性および親和性を有する新規の対合を産生する可能性があるという利点を有する。
【００１２】
さらに、そのようなアプローチによって、ネズミまたはヒト由来の天然のまたはインビトロ免疫されたリンパ球の使用が可能になる。
【００１３】
ネズミＢ細胞インビトロ免疫およびハイブリドーマ手法によるＥＧＦＲに対するｍＡｂ取得の以前の試みでは、低親和性の交差反応抗体しか得られなかった。
【００１４】
そのような欠点を改良するために、インビトロ免疫とそれに続くＰＣＲクローニング手法との組み合わせが行われた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、ＥＧＦレセプターに対して高親和性を有し、上記および下記の有利な方法によって得られる抗体および抗体フラグメントを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の開示
本発明は、標準ハイブリドーマ手法（Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５２、５４９、１９８７、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３、１９９１）によって分離されたマウスＭＡｂ（４２５）と三つの異なるファージ−抗体ライブラリーから分離されたマウス抗ＥＧＦＲ抗体とを比較する。ライブラリーは、免疫したマウスの脾臓からだけではなく免疫したマウスの排液リンパ節からおよびインビトロ免疫したマウス細胞からも調製した。ライブラリーから分離した二つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を、ヒト定常部に連結したマウス可変部を有するキメラ全抗体分子の作出のために遺伝子操作した。
【００１７】
詳細には、本発明は、免疫した哺乳動物、細胞、好ましくはマウスの好ましくは脾臓または排液リンパ節の細胞、またはインビトロ免疫した細胞から構築したファージ−抗体ライブラリーから得ることができる抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖに関する。原則として、本発明はｓｃＦｖに限定されることなく、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2などの他の抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントまでにも及ぶ。
【００１８】
本発明によるｓｃＦｖのいくつかは、明確に定義されるＤＮＡおよびアミノ酸配列を有する。したがって、本発明の他の目的は、重鎖および軽鎖の可変部が配列ＩＤ番号１〜３２、好ましくは第５〜８図に示された重鎖および軽鎖配列の一つから選択されるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列からなることを特徴とする一本鎖Ｆｖフラグメントを提供することである。
【００１９】
多くの場合、完全に機能する全抗体のみが診断および治療目的に使用し得ることから、一本鎖Ｆｖからの可変部を全部、一部またはヒト化した抗ＥＧＦＲ抗体を形成するヒト免疫グロブリンの定常部と連結することは本発明の関心事である。
【００２０】
したがって、本発明の一つの目的は、上記および下記に定義されたまたは請求の範囲に定義された抗体フラグメントに由来するＤＮＡ配列からおよびヒト免疫グロブリンの定常部に由来するＤＮＡ配列から構築される全抗ＥＧＦＲ抗体を提供することであって、これは好ましい実施態様として、重鎖がγ−１鎖からなり軽鎖がκ鎖のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００２１】
本発明によると、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖはファージ−抗体ライブラリー手法によって分離される。したがって、本発明は抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖの調製法に関し、それは以下のステップからなる。
（１）免疫した哺乳動物細胞、好ましくはマウス細胞からＲＮＡを分離する。
（２）第一鎖ｃＤＮＡを合成する。
（３）免疫した細胞からのｃＤＮＡのＶHおよびＶκ遺伝子を増幅する。
（４）適当な制限部位とともに該遺伝子をファージミドベクターにクローニングする。
（５）連結混合物を用いて原核細胞を形質転換させる。
（６）精製ＥＧＦＲを用いてＥＧＦＲに対するファージ抗体に関してファージライブラリーをスクリーニングする。
（７）所望の一本鎖Ｆｖを宿主原核細胞、好ましくは大腸菌中で産生させる。
【００２２】
さらに、本発明の目的は、上記のようにしてまたは請求の範囲に定義したようにして産生された抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントの可変部をコードするＤＮＡを、ヒト免疫グロブリンの定常部をコードするゲノムＤＮＡを含む少なくとも一つの真核細胞発現ベクター中にクローニングして、真核細胞を該ベクターで形質転換して、抗体を発現させて分離することによって全抗ＥＧＦＲ抗体を調製する方法を開示することである。
【００２３】
抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ、とりわけ全抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト腫瘍の診断および治療において用いることができる。このように、本発明は上記および請求の範囲に定義したような抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖまたは全抗ＥＧＦＲ抗体からなる薬剤組成物に関する。
【００２４】
本発明の結果および利点は次のように要約される。
【００２５】
新規のマウス抗ＥＧＦＲ抗体をファージ−抗体ライブラリーから分離した。新抗体は、少なくとも四つの異なるＶHサブグループおよび四つの異なるＶκサブグループで表された（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｓ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１）。これらは、ハイブリドーマ手法を用いて分離したマウスＭＡｂによって用いられる対合および配列とは異なった対合および配列を示した。マウス４２５ＭＡｂは、ファージ抗体には見られなかったＶH２ｂとＶκ４対合を有する。Ｆｖ Ｌ３ １１ＤのＶHは、最高の４２５ＶＨに対して最高割合の一致（８４．９％）を有した。主な相違はＣＤＲにあった。ｓｃＦｖ Ｓ４ ２ＤのＶκは４２５Ｖκに対して最高割合の一致（８３．２％）を有した。ここでも、主な相違はＣＤＲ、とくにＣＤＲ３にあった。本発明において、多様な新抗ＥＧＦＲ抗体がファージ−抗体ライブラリーから分離され、それら抗体は全て、４２５ＭＡｂによって認識されるものとは異なるＥＧＦＲ上のエピトープを認識する少なくとも二つのｓｃＦｖを有する４２５ＭＡｂと異なっている。これは、組み合わせのライブラリーから分離された抗体がハイブリドーマ手法によって分離されたものときわめて類似しているという以前の報告（Ｃａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、６４５０、１９９０）と対照的である。
【００２６】
三つのファージ−抗体ライブラリーのうち、高親和性抗体を得るために要求される選択ステップ回数および分離される高親和性抗体の多様性の点から最良のライブラリーは、排液リンパ節から作られたライブラリーであった。リンパ節はファージ−抗体ライブラリーの構築のためのＲＮＡ源として二つの理由で選択された。まず、以前の研究によって、高親和性ＩｇＧ抗体を産生するＢ細胞は、腹膜を介して免疫した後の脾臓からよりも肉趾を介して免疫した後の膝窩リンパ節からの方がより高率で得られることが示された（Ｖｅｎｎ ａｎｄ Ｄｒｅｓｓｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０２、９５、１９８７）。第二に、排液リンパ節はヒト抗腫瘍抗体の分離のための好適な材料であると考えられている。したがって、肉趾を介して免疫したマウスの膝窩リンパ節からのマウス抗ＥＧＦＲ抗体の分離は、乳ガン患者の腋窩リンパ節からのヒト抗ＥＧＦＲ抗体の分離のためのモデルであった。少量のリンパ節材料からの適切なサイズのライブラリーの調製およびそのライブラリーからの高親和性抗体の分離の可能性が示された。
【００２７】
マウス抗ＥＧＦＲ抗体が三つのファージ−抗体ライブラリーの全てから分離されたが、新たに分離された抗体のいずれかがハイブリドーマ手法を用いて分離したマウス４２５ＭＡｂよりもより高い親和性を有するということは明らかにはされていない。最初の分析において、ｓｃＦｖ由来のファージ抗体は４２５ＭＡｂから構築されたｓｃＦｖよりもよくＥＧＦＲに結合したようであった（第２図）。
【００２８】
キメラ全抗体分子を用いた他の実験において、キメラ抗体の一つ（Ｓ４ ２Ｄ）はキメラ４２５抗体と等しいＥＧＦＲ親和性を示した。第二のキメラ抗体（Ｌ３ １１Ｄ）は、キメラ４２５抗体に較べて４分の１の低い親和性を有した（第４図）。ＳｃＦｖを用いて得られた結合データは、おそらくｓｃＦｖ調製物がモノマーおよびダイマーの混合物を含み得ることから誤解を生む結果を示した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２、７２５、１９９３）。これに対して、キメラＩｇＧ抗体がダイマーを形成することは予想されず、キメラＬ３ １１ＤおよびＳ４ ２Ｄ抗体は２価のモノマーキメラＩｇＧ抗体に予想される大きさを示した。しかし、４２５、Ｌ３ １１ＤおよびＳ４ ２ＤｓｃＦｖのアフィニティー精製調製物の分析は、ｓｃＦｖのこれら調製物はモノマー、ダイマーおよび他の多量体を含んでいなかったことを示した。さらに、モノマーおよび多量体の相対比はそれぞれのｓｃＦｖで異なっていた。４２５ｓｃＦｖは、最低のダイマーの割合を有した。予想されたように、ダイマーおよびとくにそれ以上の多量体はモノマーよりも精製ＥＧＦＲに対してより強い結合を示した。４２５ｓｃＦｖは、新たに分離されたｓｃＦｖのいくつかに較べてダイマーになる傾向が弱いようである。
【００２９】
ファージ粒子表面の抗体フラグメントの発現は所望の特異性を有する抗体の迅速な選択のための強力な方法の基礎を形成するが、ファージ抗体または抗体フラグメントそれ自体（ｓｃＦｖまたはＦａｂ）のいずれも所望の最終産生物ではないようである。さらに、いかにしてファージライブラリーから分離されたマウスｓｃＦｖが全抗体分子に容易に変換し得るかが示されている。この場合、マウス可変部をヒト定常部と連結して、部分的にヒト化したキメラ抗体が作出された。
【００３０】
これらの結果は、免疫したマウスから種々の抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントを分離するためにファージ抗体手法を用いることが可能であることを示している。所望の定常部を有する全抗体分子は、次いで抗体フラグメントから構築できる。ある場合には、マウスからのモノクローナル抗体を分離する方法としてハイブリドーマ手法がそれでも最良の方法であるかもしれない。高免疫原性の抗原が入手可能であって、一つまたは二、三の異なる抗−抗原抗体を産生する二、三のハイブリドーマ細胞系が適切である場合には、ファージ抗体手法を考慮する理由はほとんどないと思われる。しかし、肉趾注射などの特殊な免疫プロトコールが高親和性抗体を生じさせるために有利であるような場合または抗原上の多様なエピトープに対する多数の抗体が要求される場合またはきわめて微弱で、免疫原性もおそらくより低いエピトープに対する抗体が要求される場合には、ファージ抗体手法が最良の方法であり得る。また、抗体のさらなる遺伝子操作が予想される場合には、抗体遺伝子がすでにクローニングされているという点でファージ抗体手法が有利である。
【００３１】
微粒子抗原を用いるインビトロ免疫とＰＣＲ−クローニング手法とを組み合わせる本アプローチは、ＥＧＦＲと反応して他の抗原とは交差反応しないｓｃＦｖフラグメントをもたらした。ここで報告された免疫プロトコールは、可溶性ではなく膜小胞調製物である抗原提示およびＦＣＳを欠いた培養培地自体によって異なる。両方法は、抗原を抗原提示細胞に利用できるようにすることによってインビトロ免疫の効率を高める手段として報告されている（例えば、Ｂｒａｍｓ、Ｐ．、ｅｔａｌ．、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、９８、１１．１９８７）。
【００３２】
ＭＴＣを用いて得られた結果は、インビトロ免疫プロセスを改良するためにリンホカイン源としてＭＴＣ上清の使用を提唱している以前の報告（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｍｏｅｌｌｅｒ、Ｓ．Ａ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３６、３７１０、１９８６、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．（Ｅｄｓ．）、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、アムステルダム、１９８８、ｐ．３）と一致する。膜小胞調製物は、多くの異なる抗原決定基がそのような小胞に存在することから、ポリ抗原とみなされるべきである。この理由から、これら調製物があるレベルのポリクローナル活性化を誘導することも考えられる。しかし、抗ＥＧＦＲ特異性応答は標準ポリクローナル活性剤処理によって得られる応答とは明らかに異なることから、本発明者らはこれを不適切と考えた。
【００３３】
インビトロ免疫後にＢ細胞を不死化する代わりに、本発明者らは抗体ＶHおよびＶL遺伝子を不死化する分子的方策を用いた。これらモノクローナル抗体フラグメントを細菌中で発現して産生した。ファージ提示系は特異的抗原に対する抗体フラグメントを分離するための強力な方法である。抗体フラグメントとｇ３ｐ被覆タンパク質間の終止コドンの存在によって、サプレッサーまたは非サプレッサー菌株を用いて溶解性ｓｃＦｖフラグメントとしての表面提示と分泌との間のスイッチが可能になる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、４１３３、１９９１）。
【００３４】
インビトロ抗体剌激されたＢ細胞における特異的応答およびｍＲＮＡレベルの上昇によって、インビトロ免疫は抗原に対して高い特異性を有する抗体フラグメントの分離に寄与する。二回の選択プロセスの後、１００％のクローンがＥＧＦＲの結合に関して陽性であった。これに対して、インビトロ免疫プロセスに由来するクローンでは、４回の選択の後に初めて１００％陽性であった（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、ＥＰ９４１０４１６０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４、９５２、１９９４）。
【００３５】
天然の未処理の抗体遺伝子からのファージ提示ライブラリーの使用によって免疫なしでまたはインビトロ免疫の後に特異的なヒト抗体フラグメントが作出されることも考えられる。このように、抗体フラグメントは細菌中で簡単、迅速、かつ経済的に直接産生され得る。
生物学的材料および一般的方法
本出願に記述の微生物、細胞系、プラスミド、ファージミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点またはベクターの他のフラグメントは、市販されているかあるいは一般に入手可能である。とくに記載がない限り、これらは例として使用されるのみであって、本発明に必ずしも必須ではなく、それぞれ他の適当な手段および生物学的材料によって置き換えることができる。
【００３６】
ｓｃＦｖのクローニングおよびｓｃＦｖタンパク質の産生のために細菌宿主を好ましく用いる。これら宿主の例は大腸菌またはバチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。
【００３７】
例えばＣＯＳ、ＣＨＯまたは酵母のような真核細胞宿主は、本発明による全抗ＥＧＦＲ抗体の産生のために好ましい。
【００３８】
本発明に必要な方法技術を以下に詳細に記述する。詳記されない他の方法技術は、当業者によく知られた公知の標準法または引用された参考文献および特許出願明細書および標準的文献により詳細に記載されている方法技術である。
図面の簡単な説明
第１図は、ファージ−抗体ライブラリーから分離されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖ。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。
【００３９】
第２図は、ＥＧＦＲへのｓｃＦｖの結合を示す説明図である。細菌培養上清中のｓｃＦｖの濃度を推定して、ｓｃＦｖを精製ＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖライブラリー。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。Ｐ１（陽性対照）はＭＡｂ４２５由来のｓｃＦｖである。Ｌ１およびＳ１（陰性対照）はあらかじめ選択したリンパ節および脾臓ライブラリーからの非結合ｓｃＦｖである。
【００４０】
第３図は、哺乳動物細胞における発現のための可変部を再構築するために用いる中間ベクターの説明図である。（Ａ）ＶHベクター。（Ｂ）Ｖκベクター。
【００４１】
第４図は、キメラ全抗体のＥＧＦＲへの結合を示す説明図である。ＣＯＳ細胞上清中の抗体の濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、抗体を精製したＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。
【００４２】
第５図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ２ １１ＣのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【００４３】
アミノ酸位置
（Ａ） ＦＲ−１： １−２３，ＣＤＲ−１：２４−３４，
ＦＲ−２：３５−４９，ＣＤＲ−２：５０−５６，
ＦＲ−３：５７−８８，ＣＤＲ−３：８９−９７，
ＦＲ−４：９８−１０９．
（Ｂ） ＦＲ−１： １−３０，ＣＤＲ−１：３１−３５
ＦＲ−２：３６−４９，ＣＤＲ−２：５０−６６，
ＦＲ−３：６７−９８，ＣＤＲ−３：９９−１０８，
ＦＲ−４：１０９−１１９．
第６図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ２ １２ＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【００４４】
アミノ酸位置
（Ａ） ＦＲ−１： １−２３，ＣＤＲ−１：２４−３８，
ＦＲ−２：３９−４９，ＣＤＲ−２：５０−５６，
ＦＲ−３：５７−８８，ＣＤＲ−３：８９−９７，
ＦＲ−４：９８−１０９．
（Ｂ） ＦＲ−１： １−３０，ＣＤＲ−１：３１−３５，
ＦＲ−２：３６−４９，ＣＤＲ−２：５０−６６，
ＦＲ−３：６７−９８，ＣＤＲ−３：９９−１０８，
ＦＲ−４：１０９−１１９．
第７図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ３ １１ＤのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【００４５】
ＦＲおよびＣＤＲのアミノ酸位置は、第６図のものに対応する。
【００４６】
第８図は、ｓｃＦｖ番号Ｓ４ ２ＤのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【００４７】
アミノ酸位置
（Ａ） ＦＲ−１： １−２３，ＣＤＲ−１：２４−３５，
ＦＲ−２：３６−５０，ＣＤＲ−２：５１−５７，
ＦＲ−３：５８−８９，ＣＤＲ−３：９０−９８，
ＦＲ−４：９９−１１０．
（Ｂ） ＦＲ−１： １−３０，ＣＤＲ−１：３１−３５，
ＦＲ−２：３６−４９，ＣＤＲ−２：５０−６６，
ＦＲ−３：６７−９８，ＣＤＲ−３：９９−１０７，
ＦＲ−４：１０８−１１８．
第５〜８図の配列は、また、本発明の開示の一部である添付配列表にも示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
（１）ファージ−抗体ライブラリーの構築およびスクリーニング
三つのファージ−抗体ライブラリーを、一つはヒト癌腫細胞系Ａ４３１（８．８×１０5個）を用いて免疫したマウスの脾臓から、一つは精製ＥＧＦＲ（６．５×１０6個）を肉鉦に免疫したマウスの膝窩リンパ節から、そして一つはＡ４３１小胞（１．１×１０5個）を用いてインビトロ免疫したマウスリンパ球から構築した（Ａ４３１小胞の構築およびインビトロ免疫の詳細は実施例１および２に記載されている）。選択に先立って、各ライブラリーからの少なくとも４６個のクローンを能力範囲の多様性を決定するためにＢｓｔＮＩフィンガープリント法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４、１９９１）によって分析した。広範囲の切断パターンが観察された。さらに選択に先立って、各ライブラリーからの９６個のクローンからのｓｃＦｖを、ＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。
【００４９】
脾臓およびリンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖのいずれもＥＧＦＲに結合しなかった。インビトロ免疫したライブラリーからのｓｃＦｖの一つがＥＧＦＲに結合した。１回目の選択をＥＧＦＲ被覆免疫チューブを用いて行った後、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖの明らかな濃厚富化が、リンパ節ライブラリーおよびインビトロ免疫したライブラリーに関して観察された。第２回目の選択は、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖが脾臓ライブラリーから検出される前に必要であった。３回目の選択までに、リンパ節からおよびインビトロ免疫ライブラリーからのｓｃＦｖのほとんどがＥＧＦＲへの結合に関して陽性であった。脾臓ライブラリーを用いる４回目の選択の後、ほとんどのｓｃＦｖがＥＧＦＲへの結合に関して陽性であった（表１）。
【００５０】
【表１】
【００５１】
（２）ＥＧＦＲ結合クローンの配列分析
各回の選択後、ＥＧＦＲ結合クローンからのｓｃＦｖ挿入部分をＢｓｔＮＩフィンガープリント法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４、１９９１）によって分析した。ある切断パターンに関して富化があったことが明確となった。異なるＢｓｔＮＩフィンガープリントを有するクローンを、リンパ節ライブラリーの２回目および３回目の選択からおよび脾臓ライブラリーの３回目および４回目の選択からＶHおよびＶκのＤＮＡ配列決定のために選択した。より高親和性抗体の存在が後の回において予想されることから、後の選択回からのクローンを分析した（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、３５２、６２４、１９９１）。
リンパ節ライブラリーからの１６個のクローンを配列決定して、６個の異なるｓｃＦｖを得た（第１図）。このうち、５個は、ユニークなＶHおよびＶκの対合であった。第６番目は、６個のアミノ酸変異を有する、前述するＶHの変型であって、そのうちの５個はフレームワーク領域（ＦＲ）１にあった。これら変異の二つは、縮退ＶＨ１ＢＡＣＫＳＦＩプライマー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、４１３３、１９９１）の使用によるものとみなし得る。他は、ＰＣＲエラーの結果と考え得る。ＶHは、ＶH２ｂおよびＶH３ｄの二つのサブグループに分類され、ＶκはＶκ３、Ｖκ４、Ｖκ５およびＶκ６の四つのサブグループに分類される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｓ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１）。脾臓ライブラリーからの１０個のクローンを配列決定して、四つの異なるｓｃＦｖを見出した。このうちの三つはユニークなＶHおよびＶκの対合であり、残りの一つは前出の対合と同様のものであって、ＶHに二つだけのアミノ酸の変異があり、うち一つは相補性決定領域（ＣＤＲ）２にあり、Ｖκに二つのアミノ酸の変異を有する。サブグループへの分類によって、サブグループＶH２ａ、ＶH２ｃおよびＶH３ｄからのＶHおよびサブグループＶκ３およびＶκ４からのＶκが明らかになった。リンパ節および脾臓ライブラリーから得られたｓｃＦｖを比較することによって、両ライブラリーに共通するｓｃＦｖは唯一、すなわち、ｓｃＦｖ Ｌ３ １０Ａ／ｓｃＦｖ Ｓ４ １０Ｈであることが明らかにされた（第１図）。このクローンは、ＥＬＩＳＡで試験した場合にＥＧＦＲに強く結合しているようであった。ライブラリー間の交差混入を除去するために充分の考慮を行ったが、強く結合しているＥＧＦＲクローンのわずかな混入を全て除外することは難しい。しかし、Ｂａｌｂ／ｃマウスの同血統繁殖的性質を考慮すると、同一のｓｃＦｖが二つの異なるライブラリーから独立して生じたということは可能である。
【００５２】
（３）ＥＧＦＲへの親和性および結合特異性の分析
抗原への良好な結合およびＤＮＡ配列における多様性に基づいて、リンパ節および脾臓ライブラリーに由来するいくつかのｓｃＦｖをさらなる分析のために選択した。これらｓｃＦｖを、精製ＥＧＦＲへの結合、非関連抗体への結合およびＥＧＦＲを発現したあるいはしなかった腫瘍細胞系への結合に関してＥＬＩＳＡを用いて分析した。陽性対照として、ｓｃＦｖをマウス４２５ＭＡｂから調製した（Ｐ１）。陰性対照として、ｓｃＦｖをリンパ節および脾臓ライブラリーから選択に先立って分離したファージ抗体から調製した（それぞれＬ１およびＳ１）。ｓｃＦｖの濃度は、ウェスタンブロットにおいて試験するｓｃＦｖの希釈率と既知濃度の精製ｓｃＦｖの希釈率とを比較することによって決定した。
【００５３】
ｓｃＦｖの精製ＥＧＦＲへの結合をＥＬＩＳＡによって試験して、その結果をプロットした（第２図）。ｓｃＦｖをＥＧＦＲへの結合によってランクづけすることが可能であった。これらランクは実験間で再現性があった。もっとも強くＥＧＦＲに結合したｓｃＦｖは、リンパ節ライブラリーからのＬ２ １ＣおよびＬ３ １０Ａおよび脾臓ライブラリーからのＳ４ １０Ｈであった。上記したように、ｓｃＦｖ Ｌ３ １０ＡおよびＳ４ １０Ｈは同一のＤＮＡ配列を有する。二つのアミノ酸変異をＶH中およびＶκ中にそれぞれ有するｓｃＦｖＳ４ １０Ｈとよく似ているｓｃＦｖ（Ｓ４ ５Ａ）は、Ｓ４ １０Ｈよりも常に低いランクを示した。これに対して、Ｌ２ １２ＢとＬ３ １１Ｄ間に観察された配列の違いは結合に顕著な影響を及ぼさないようであった。分離されたｓｃＦｖのうち、Ｌ２ ８ＣおよびＬ２ １１Ｃの二つだけがｓｃＦｖ４２５よりも結合性に劣るようであった。
【００５４】
ｓｃＦｖのプラスチックおよび非関連のタンパク質パネル（卵白アルブミン、鶏卵リゾチーム、チトクロームｃ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＣＢＡアルブミンおよびＢＳＡ）への結合をＥＬＩＳＡによって試験した。いずれのｓｃＦｖもバックグランド以上の変化を示さなかった。
【００５５】
ｓｃＦｖの三つの腫瘍細胞系への結合をＥＬＩＳＡによって試験した。細胞系Ａ４３１およびＭＤＡＭＢ４６８は、それぞれ外陰部および胸部から分離されたＥＧＦＲを有する腫瘍細胞である。陰性対照として、ガングリオシドを有する黒色腫細胞系であるＳＫ−ＭＥＬ−２３を用いた。試験した１０個のｓｃＦｖのうち、四つのみが精製ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲを有する腫瘍細胞の双方に結合した（第５〜８図、Ｌ２ １２Ｂ、Ｌ３ １１Ｄ、Ｌ２ １１ＣおよびＳ４ ２Ｄ）。ＳＫ−ＭＥＬ−２３細胞への結合は検出されなかった。この驚くべき結果にはいくつかの説明が可能である。一つは、免疫、選択およびＥＬＩＳＡに使用されたＥＧＦＲが分泌されたＥＧＦＲ関連タンパク質であるということが考えられる（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｎｅｃｅ、２２４、２９４、１９８４）。このタンパク質は追加の１７個のアミノ酸をＣ末端に有する（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、２２０８２、１９９０）。
【００５６】
ｓｃＦｖをこの１７個のアミノ酸からなるペプチドへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験したが、結合は観察されなかった。分泌されたＥＧＦＲ関連タンパク質と腫瘍細胞表面のＥＧＦＲとに、立体配座またはグリコシル化配糖体の点で相違があることが可能である。
（４）ｓｃＦｖに由来するキメラ全抗体
二つのｓｃＦｖ（Ｌ３ １１ＤおよびＳ４ ２Ｄ）を、全抗体分子への変換のために選択した。マウスＶHおよびＶκをコードするＤＮＡを、免疫グロブリンリーダー配列およびスプライスドナーシグナルをコードするＤＮＡ配列を含む中間ベクター中にクローニングした（第３図）。ＶH中間ベクター中にクローニング部位を位置するということは、ＶHの最初の基をアスパラギン酸からグルタミン酸に変えることを意味した。中間ベクターから、リーダーおよびスプライスドナー配列にここで連結されたＶHおよびＶκを含むＤＮＡフラグメントを、ヒトガンマ−１定常部またはヒトκ定常部のいずれかをコードするＤＮＡを含む哺乳動物細胞発現ベクター中にクローニングした（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、２、１２４、１９９１）。それぞれのキメラ抗体のために、重鎖および軽鎖発現ベクターをＣＯＳ細胞中に共トランスフェクトさせた。陽性対照として、細胞をまたキメラ４２５抗体をコードする重鎖および軽鎖発現ベクターを用いて共トランスフェクトさせた（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３、１９９１）。培地を細胞から集めて、存在する抗体の濃度および抗体のＥＧＦＲへの結合能を決定するためにＥＬＩＳＡによって分析した（第４図）。抗体への最高結合の５０％を達成するために要求される抗体濃度を比較すると、キメラＳ４ ２Ｄ抗体はキメラ４２５抗体と同等にＥＧＦＲに結合した。しかし、キメラＬ３ １１Ｄ抗体はキメラ４２５抗体の約４分の１程度にしかＥＧＦＲと結合しなかった。キメラ４２５抗体の親和性は競合結合分析によって１．９×１０8Ｍ-1と決定された（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３、１９９１）。これらの結果は、ｓｃＦｖを分析した以前のデータがｓｃＦｖ Ｓ４ ２ＤおよびＬ３ １１Ｄの双方がｓｃＦｖ４２５よりもＥＧＦＲによく結合したことを示したことから驚きであった（第２図）。キメラＬ３ １１ＤおよびＳ４２Ｄ抗体のプロテインＡ精製試料を、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。キメラＬ３ １１ＤおよびＳ４ ２Ｄ抗体をまた、Ａ４３１およびＳＫ−ＭＥＬ−２３細胞への結合に関してフローサイトメトリーによって試験した。両キメラ抗体はＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞によく結合し、ＥＧＦＲ陰性ＳＫ−ＭＥＬ−２３細胞には結合しなかった。
（５）治療および診断的使用
本発明の抗体フラグメントおよび全抗体は、治療のためにヒト患者に投与することができる。したがって、本発明の目的は、活性組成分として上記および請求の範囲に記載の少なくとも一つの抗体または抗体フラグメントを、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる薬剤調製物を提供することである。
【００５７】
通常、本発明の抗体は静脈注射によってまたは非経口的に投与される。一般に、抗体フラグメントの投与量は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得られるに充分な範囲の量である。投与量は、患者の年齢、状態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ以上を１日または数日間投与することができる。
【００５８】
非経口的投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれらの目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられる。
【００５９】
本発明の抗体は、生理学的に容認し得る担体を含む組成物において使用することができる。それら適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００６０】
抗体（フラグメント）はまた、それらの細胞毒性を支持するために公知の方法によってＩＬ−２などのサイトカインと抱合させることができる。
【００６１】
本発明の薬剤調製物は、黒色腫、神経膠腫および癌腫、さらに循環系の腫瘍および固形腫瘍を含むあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。
【００６２】
診断目的のために、抗体は、例えば放射線不透過性染料と抱合させるかまたは放射線標識することができる。好ましい標識法はロドゲン法（ｌｏｄｏｇｅｎ ｍｅｔｈｏｄ）である。好ましくは、診断目的の抗体はＦ（ａｂ’）2またはｓｃＦｖフラグメントとして投与される。これによってバックグランド差し引きが不要になるような優れた結果が得られる。
【実施例】
【００６３】
［実施例１］ Ａ４３１小胞
脱落膜小胞調製物を上記したように既述の方法（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７、１５２３、１９８２、Ｙｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８、９２５４、１９８３）をいくらか修飾した方法によって得た。Ａ４３１細胞を含む集密状態になったフラスコを、カルシウムおよびマグネシウムを含むＰＢＳを用いて洗浄した。低張のＰＢＳを加えてフラスコを１５分間振盪した。次いで細胞を小胞化緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＳＯ2、ｐＨ８．５）を用いて洗浄した。小胞化緩衝液を加えて、フラスコを室温および３７℃で撹拌を続けた。次いで、緩衝液を金属スクリーンを通して氷中で５０ｍｌチューブに傾瀉して、１５０×ｇで４℃で５分間遠心分離した。ペレットを除去して、上清を３９、０００ｒｐｍで９０分間超遠心分離した。最終ペレットを１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。小胞からのＥＧＦＲを分析するために、試料を９容量のエタノールで沈殿させて、０．０８Ｍトリス（ｐＨ６．８）で再懸濁して、次いで、標準としてＭＡｂ４２５を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００６４】
調製物のタンパク質含量を、標準物質としてＢＳＡを用いて５９５ｎｍで測定する修飾クマシープラス法によって定量した。小胞からのＥＧＦＲを分析するために、試料を９容量のエタノールで沈殿させた（４℃で一晩）。ペレットをトリス（０．０８Ｍ、ｐＨ６．８）を用いて再懸濁させて、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（５％スタッキングゲル、１時間、３５ｍＡ；１０％泳動ゲル、２．５時間、４０ｍＡ）。試料および標準物質について重複して行った。そのうちの一つをクマシーブルーで染色して、一方をニトロセルロースシート上ににじませて（１２Ｖ、４℃で１６時間）、マウスＭＡｂ４２５（抗ＥＧＦＲ）およびアルカリホスファターゼと抱合させた抗マウスＩｇＧ抗体で処理した。
【００６５】
三つの培地をインビトロ免疫に用いた。培地１（Ｍ１）、培地２（Ｍ２）および混合胸腺細胞培養培地（ＭＴＣ）である。Ｍ１は、５０ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ギブコ）を添加したＨＬ１（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）からなる。Ｍ２は、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール、４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、２０ｍｇ／ｍｌアジュバントペプチド（シグマ）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）を添加したＨＬ１からなる。４％または２０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）をＭ２に加えた。ＭＴＣをＶａｕｘ（１）による記述のようにして調製した。簡単に述べると、３週令のＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ−１マウスの胸腺の単細胞懸濁液を、胸腺を滅菌５０−メッシュスクリーンを加圧して通すことによって調製した。細胞懸濁液を集めて、ＨＢＳＳ中で２回洗浄して、生細胞数をトリパンブルー排除試験によって決定した。次いで、胸腺細胞をそれぞれ１ｍｌ当たり２．５×１０6個の胸腺細胞密度で４％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＨＬ１培地中で培養した。４８時間後、上清を回収して、０．２２ｍｍのフィルターを通して瀘過して、−７０℃で保存した。
【００６６】
非免疫８週令Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞の懸濁液を胸腺細胞と同様にして得た。生存率をトリパンブルー排除試験によって決定した。
【００６７】
［実施例２］ インビトロ免疫およびスクリーニング
インビトロ免疫において三つの培地を用いた。培地１（Ｍ１）、培地２（Ｍ２）および混合胸腺細胞培養培地（ＭＴＣ）である。Ｍ１は、５０ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭＬ−グルタミン（ギブコ）添加ＨＬ１（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）からなる。Ｍ２は、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール、４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、２０ｍｇ／ｍｌアジュバントペプチド（シグマ）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）を添加したＨＬ１からなる。４％または２０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）をＭ２に加えた。ＭＴＣをＶａｕｘ（１）による記述のようにして調製した。簡単に述べると、３週令のＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ−１マウスの胸腺の単細胞懸濁液を、胸腺を滅菌５０−メッシュスクリーンを加圧して通すことによって調製した。細胞懸濁液を集めて、ＨＢＳＳ中で２回洗浄して、生細胞数をトリパンブルー排除試験によって決定した。次いで胸腺細胞をそれぞれ１ｍｌ当たり２．５×１０6個の胸腺細胞密度で４％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＨＬ１培地中で培養した。４８時間後、上清を回収して、０．２２ｍｍのフィルターを通して瀘過して、−７０℃で保存した。
【００６８】
非免疫８週令Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞の懸濁液を胸腺細胞と同様にして得た。生存率をトリパンブルー排除試験によって決定した。
【００６９】
３週令のＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ−１マウスからの胸腺の単細胞懸濁液を、胸腺を滅菌５０−メッシュスクリーンを加圧して通すことによって得た。細胞懸濁液を集めて、ＨＢＳＳ中で洗浄して、生細胞数をトリパンブルー排除試験によって決定した。次いで胸腺細胞をそれぞれ１ｍｌ当たり２．５×１０6個の胸腺細胞密度で４％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＨＬ１培地中で培養した。４８時間後、上清を回収して、瀘過して、保存した。
【００７０】
非免疫８週令Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞の懸濁液を胸腺細胞と同様にして得た。生存率をトリパンブルー排除試験によって決定した。
【００７１】
インビトロ免疫を６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で行った。３．５ｍｌのＭ１培地（５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ギブコ）を添加したＨＬ１培地（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）からなる）中に１０7個の脾臓細胞を含むウェルを、所望の濃度のＥＧＦＲを有する小胞とともにインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ2）。ＥＧＦＲを発現しない細胞からの小胞またはＰＢＳを対照ウェルに加えた。数時間後、４％または１０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含む３．５ｍｌのＭ２培地（５０μＭ２−メルカプトエタノール、４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、２０μｇ／ｍｌアジュバントペプチド（シグマ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）を添加したＨＬ１からなる）を各ウェルに加えた。いくつかの実験において、Ｍ２をＭＴＣ培地（アジュバントペプチド（２０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（４０Ｕ／ｍｌ）を添加した混合胸腺細胞培養培地（Ｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．、３３６、３６、１９８８））に置き換えた（培養培地中のＦＣＳ、ＩＬ−２およびアジュバントペプチドの最終濃度は５０％減少することを留意されたい）。細胞を同一条件で７２、９６、１２０または１４４時間インキュベートして、最終的に、細胞を特異的免疫グロブリンの存在に関して試験するかＲＮＡ分離のために処理した。
【００７２】
スクリーニングを精製抗原またはＡ４３１固定細胞を用いて行った。本質的には以前に記述された方法（Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、９、８１、１９９０）をいくらか修飾した方法を用いた。簡単に述べると、滅菌９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を精製ＥＧＦＲ（２．５μｇ／ｍｌ）、ＧＤ３ガングリオシド（２μｇ／ｍｌ）またはＲＮａｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液で一晩被覆した。Ａ４３１細胞を抗原として用いた場合、細胞を９６ウェルプレート中で集密状態になるまで培養して、０．１％のグルタルアルデヒドで固定した。インビトロ免疫されたリンパ球を洗浄して、２％ＦＣＳおよび２ｍＭのＬグルタミンを添加したＨＬ１培地中に５×１０5細胞／ｍｌに再懸濁させて、１×１０5個の細胞を各ウェルに加えて、４８時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ2）。各グループとも１６重複を行った。次いで０．１％のツイーン２０を含むＰＢＳを用いて５回洗浄することによってリンパ球を除去した。特異的免疫グロブリンをペルオキシダーゼ標識したウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）を用いて検出した（１時間、３７℃）。基質として、２、２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）（シグマ）のクエン酸塩−リン酸塩緩衝液溶液（０．５５ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
【００７３】
［実施例３］ ライブラリー構築
三つのライブラリーを、Ａ４３１細胞で腹腔内免疫したマウスの脾臓から調製したＲＮＡ（Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５２、５４９、１９８７）、精製ＥＧＦＲで肉踊に免疫したマウスの膝窩リンパ節から調製したＲＮＡおよびＡ４３１小胞でインビトロ免疫したマウス細胞から調製したＲＮＡからそれぞれ構築した。第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＶHおよびＶκ遺伝子をＰＣＲ増幅して、組み立てた（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４、１９９１）。ＰＣＲを用いて、ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ制限部位を追加して、ｓｃＦｖをファージミドベクターｐＨＥＮ１にクローニングした（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、４１３３、１９、１９９１）。連結混合物を大腸菌に電気穿孔して、得られるコロニーを培地に掻き入れて、ライブラリーストックをつくった（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１、１９９１）。
【００７４】
［実施例４］ ライブラリースクリーニング
ファージ抗体を、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン）を用いてライブラリーから取り出した（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１、１９９１）。イムノチューブ（Ｎｕｎｃ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）を４ｍｌの２．５μｇ／ｍｌのＥＧＦＲのＰＢＳ溶液で一晩被覆した。ＰＢＳで３回洗浄した後、チューブを２％粉乳を含むＰＢＳ（ＰＢＳＭ）中で３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。ファージ（１０12〜１０13）を４ｍｌのＰＢＳＭ中に再懸濁して、ＥＧＦＲ被覆チューブ中で室温で１時間インキュベートした。チューブをＰＢＳ、０．１％ツイーンを用いて２０回、ＰＢＳを用いて２０回洗浄した。結合したファージを、１ｍｌの０．１Ｍトリエチルアミン中で上下に混合しながら１０分間インキュベートした後に溶出させた。溶出したファージを０．５ｍｌの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）を加えて中和して、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１細胞の感染に用いた。感染細胞をプレートにまいてコロニー形成させて、ｓｃＦｖの小規模誘導を示す個々のコロニーを拾いあげた。残りのコロニーを培地に掻き入れて、その液を用いて次の回のスクリーニングのためのファージを調製した。
【００７５】
［実施例５］ ｓｃＦｖの産生および分析
可溶性ｓｃＦｖを上述（例えば、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、前出）のようにして大腸菌ＨＢ２１５１中で産生した。細菌培養上清中のｓｃＦｖ濃度を、既知濃度の精製ｓｃＦｖ調製物を標準として用いて推定した。上清を瀘過して、アジ化ナトリウムを０．１％濃度で加えた。上清および標準液の一連希釈物をイモビロン−ＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ、英国）上に９６ウェルマニホールドを用いて斑点づけした。フィルターをウェスタンブロット処理した（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７６、４３５０、１９７９）。ｓｃＦｖを、Ｃ末端目印に対する抗体（９Ｅ１０）（Ｍｕｎｒｏ ａｎｄ Ｐｅｌｈａｍ、Ｃｅｌｌ、４６、２９１、１９８６）、続いてペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ペンシルバニア）を用いて検出した。反応を、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、英国）を用いて展開した。予めフラッシュをかけたラジオオートグラフをデンシトメーターを用いて走査した。標準曲線を作成して、上清中のｓｃＦｖ濃度の推定に用いた。
【００７６】
抗原結合ＥＬＩＳＡを、ＥＧＦＲ被覆プレート（２．５μｇ／ｍｌ）を用いて行った。ｓｃＦｖを含む上清をＰＢＳＭ中で希釈して、プレートに加えた。結合したｓｃＦｖを上記のように９Ｅ１０抗体を用いて検出した。また、上清を非関連タンパク質のパネルおよびプラスチックへの結合に関して試験した。ＥＬＩＳＡプレートを、卵白アルブミン、卵リゾチーム、チトクロームｃ、グリセルアルデヒド３−リン酸ヒドロゲナーゼ、ネズミアルブミン（ＣＢＡ株）およびＢＳＡを用いて１００μｇ／ｍｌの濃度で一晩被覆した。２％粉乳を含む非希釈上清を被覆プレートに二重に加えて、結合ｓｃＦｖを上記のようにして検出した。
【００７７】
細胞結合ＥＬＩＳＡを、腫瘍細胞系、Ａ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）、ＭＤＡＭＢ４６８（ＡＴＣＣ ＨＴＢ１３２）およびＳＫ−ＭＥＬ−２３（陰性対照）を用いて行った。細胞を、ポリ−Ｄ−リジン処理した９６ウェル組織培養トレー（Ｎｕｎｃ）中で集密状態になるまで増殖させた。細胞をＤＭＥＭで洗浄して、２．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロック処理した。吸引後、上清を４％粉乳を含む等量の２×ＹＴ培地とともに各ウェルに加えて、４℃で１時間インキュベートした。結合したｓｃＦｖを上記のようにして検出した。
【００７８】
競合に基づくＥＬＩＳＡを、ＥＧＦＲ被覆ＥＬＩＳＡプレートを５０μｌの精製ｓｃＦｖ（１００μｇ／ｍｌ）とともに１０分間予備インキュベートすることによって行った。次いで、マウスＭＡｂ４２５（５０μｌ）を３．１３〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加えた。インキュベートおよび洗浄の後、結合したマウスＭＡｂ４２５を、ペルオキシダーゼ抱合したヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を用いて検出した。
【００７９】
［実施例６］ ＤＮＡ分析
ＢｓｔＮＩフィンガープリント法のために、個々のクローンからのｓｃＦｖ挿入物をＰＣＲによって増幅させて、産生物をＢｓｔＮＩで切断した（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４、１９９１）。ＤＮＡをシンケナーゼキット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、オハイオ）を用いて配列決定した。
【００８０】
［実施例７］ ｓｃＦｖの精製
細菌培養上清を遠心分離および０．２μｍフィルターを通す瀘過によって清澄にした後、精製ＥＧＦＲ（５ｍｇ）をカップリングさせた１ｍｌの臭化シアン−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）カラム上に供した。カラムを３０ｍｌのＰＢＳ、次いで５ｍｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ５．０）で洗浄した。ｓｃＦｖを０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．８）で溶出した。溶出液を１０×ＰＢＳで中和した。タンパク質含有画分をプールして、緩衝液を限外瀘過（Ａｍｉｃｏｎ、Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、英国）を用いて１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに交換した。
【００８１】
［実施例８］ 精製ｓｃＦｖのＦＡＣＳ分析
Ａ４３１細胞をトリプシン処理して、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。細胞を冷ＤＭＥＭで２回洗浄して、４５μｍスクリーンを通して瀘過した。細胞（１０6）を５０μｌのＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で精製ｓｃＦｖｓとともに氷上で３０分間インキュベートした。冷ＰＢＳで２回洗浄した後、結合したｓｃＦｖを、５０μｌのＦＩＴＣ−抱合した９Ｅ１０抗体（１００μｇ／ｍｌ）を用いて検出した。氷上に３０分間おいた後、細胞をＰＢＳで１回洗浄して、１％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定して、ＦＡＣＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｃｏｗｌｅｙ、英国）を用いて分析した。
【００８２】
［実施例９］ 全キメラ抗体の構築、分析および発現
ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩ部位を用いて、選択したｓｃＦｖのＶＨをコードするＤＮＡを、ヒト抗体ＨＧ３ＣＬに由来する真核細胞リーダー配列（Ｒｅｃｈａｖｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、８５５、１９８３）およびスプライスドナー部位を含む中間ＶHベクター中にサブクローニングした（第３図）。ＶκをコードするＤＮＡを、ＰＣＲプライマーを用いて中間Ｖκベクターへの挿入のためにＸｈｏＩおよびＳｓｔＩ部位を５’−および３’−末端において組み入れるように改変した。
（ＶκＦｏｒ： ５’−CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CCC−３’
ＶκＢａｃｋ：５’−GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA−３’）
ＳｓｔＩ−ＸｈｏＩフラグメントを改変したヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１軽鎖（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、２１，１９８８）に由来する真核細胞リーダー配列およびスプライスドナー部位を含む中間Ｖκベクター中にクローニングした（第３図）。可変部プラス真核細胞フランキング領域をコードするＤＮＡを、ヒトガンマー１定常部またはヒトカッパ定常部をコードするゲノムＤＮＡ（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｏｄｏｍａｓ、２、１２４、１９９１）を含む哺乳動物細胞発現ベクター中にＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローニングした。重鎖および軽鎖発現ベクターを、ＣＯＳ細胞に電気穿孔法で導入した。７２時間後、培地を集めて、キメラ抗ＥＧＦＲ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３、１９９１）。
【００８３】
［実施例１０］ インビトロ免疫細胞に由来するｓｃＦｖの産生
以下に開示する方法は上記の方法をわずかに修飾したものである。免疫、ライブラリー構築およびスクリーニングは、実施例１〜４に記述する。続くステップを以下に詳述する。
【００８４】
プライマリーライブラリーおよび３回の選別に由来するクローンをスクリーニングした後、いくつかの単離アンピシリン耐性コロニーを選択した。ファージミドＤＮＡをアルカリ溶解によって調製して、非サプレッサー株の大腸菌ＨＢ２１５１に熱ショックによるトランスフェクションに用いた。コロニーを２×ＴＹ−Ａｍｐ−Ｇｌｕ中に接種して、３０℃で一晩増殖させた。その培養液５ｍｌを１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．１％のグルコースを含む２×ＴＹ液体培地５０ｍｌの接種に用いて、３７℃で１時間振盪しながら増殖させた（対数増殖期まで）。細胞を集めて、可溶性ｓｃＦｖの発現をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭになるように添加することによって誘導した（Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓ、Ｄ．ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｉ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、１３１１、１９９０）。培養物を３０℃で一晩振盪しながら増殖させた。ｓｃＦｖを含む上清をとり、遠心分離および０．２２ｍｍフィルターを通す瀘過によって清澄にして、試験した。細菌培養上清をＥＧＦＲへの結合についてＥＬＩＳＡによって記述された方法（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、ＥＰ９４１０４１６０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４、９５２、１９９４）にしたがって試験した。選択されたｓｃＦｖフラグメントの特異性を、ＥＧＦＲ関連および非関連の種々のタンパク質および他の抗原およびプラスチックで被覆したプレートを用いてＥＬＩＳＡによって調べた。用いた抗原は、ＲＮａｓｅ、ＢＳＡ、ＯＶＡ、ＧＤ3ガングリオシド、ビトロネクチンレセプター（ＶＮＲ）、血小板糖タンパク質ＩＩｂＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂＩＩａ）およびジシアリル−ラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）であった。被覆は、各抗原の最適濃度で一晩行った。被覆したＥＬＩＳＡプレートを、１．５％（ｗ／ｖ）脱脂乳ＰＢＳ溶液を用いて３７℃で１時間ブロックした。洗浄後、１００μｌのｓｃＦｖ上清をマイクロタイターウェルに加えて、３７℃で２時間インキュベートした。結合したｓｃＦｖを、抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（Ｍｙｃ１−９Ｅ１０．２ハイブリッドからの使用済み培地）およびアルカリホスファターゼ抱合ウサギ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ）を用いて検出した。
【００８５】
ＥＧＦＲを有する三つの腫瘍細胞系、すなわちＡ４３１、ＭＤＡＭＢ２３１ヒト乳腺癌腫（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ２６）およびＨＴ２９ヒト結腸腺癌腫（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ３８）、および一つの非発現性ＥＧＦＲ細胞系、ＷＭ１６４、を用いて、ｓｃＦｖの細胞上のＥＧＦＲへの結合能を中間ＦＡＣＳ分析および非固定細胞を用いる免疫蛍光法によって試験した。間接免疫蛍光分析のために、細胞をテラサキプレートに入れて（２×１０4個細胞／ウェル）、２４時間培養した。次いで、細胞をｓｃＦｖフラグメントを含む粗細菌培養上清２０ｍｌとともに室温で９０分間インキュベートした。一次抗体（抗ｃ−ｍｙｃ）および二次抗体とともに室温で６０分間インキュベートした。二次抗体のＦＩＣＴ−抱合ウサギ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ）は１：２０に希釈した。
【００８６】
ＦＡＣＳ分析のために、５×１０5個の細胞を１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で洗浄して、５０ｍｌの粗細菌培養上清とともに４℃で２０分間インキュベートした。冷ＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄した後、結合ｓｃＦｖを抗ｃ−ｍｙｃ抗体およびＰＢＳ−ＢＳＡ中で１：２５に希釈したＦＩＴＣ−抱合ヤギ抗マウス抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて検出した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を最終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように加えた。フローサイトメトリー分析を、空冷アルゴンレーザーを備えたＥＰＩＣＳプロフィールＩＩ中で行った。４８８ｎｍの発振線（１５ｍＶ）を励起に用いた。
【００８７】
５３０ｎｍバンドパスフィルターをＦＩＴＣ放出の収集に用い、６２５ｎｍバンドパスフィルターをＰＩ放出の収集に用いた。生細胞を前方および側部散布範囲にビットマップを設定することによっておよびＰＩ染色細胞の排除によって選別した。
【００８８】
プライマリーライブラリーと選択されたライブラリーの相違点を、クローニングしたフラグメントのＰＣＲ増幅（Ｇｕｅｓｓｏｗ、Ｄ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７、４０００、１９８９）およびＢｓｔＮＩ切断パターン（８）の分析によって決定した。いくつかのクローンをシークエナーゼキット（ＵＳＢ）を用いてジデオキシ鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７４、５４６３、１９７７）によって配列決定した。
【００８９】
粗細菌培養上清（１０ｍｌ）を、１２．５％ゲル使用のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ウェスタンブロットを、本質的にはＴｏｗｂｉｎ（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７６、４３５０、１９７９）による方法で行った。タンパク質を電気ブロッティングによってイモビロン−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはニトロセルロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ブロットを２％脱脂乳（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳによってブロックした。ｓｃＦｖフラグメントを、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）、ペルオキシダーゼ−抱合抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）および増強化学発光システム（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。
【００９０】
脱落膜小胞の定量分析によって、全タンパク質濃度２．５ｍｇ／ｍｌのうち、わずかに１０〜１４％、すなわち２５０〜３５０ｎｇ／ｍｌがＥＧＦＲに対応することが明らかになった（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、２１、１６０１、１９８９、Ｙｅａｔｏｎ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８、９２５４、１９８３）。ＰＡＧＥ−ＳＤＳを用いる電気泳動分析とそれに続くクマシーブルー染色によって、小胞がタンパク質のかなり複雑な混合物を含むことが示された。タンパク質分解は検出されなかった。ウェスタンブロット分析によって、本発明者らの実験条件下で、完全なＥＧＦレセプター分子が膜小胞調製物中に存在することが明らかにされた。
【００９１】
ＦＣＳおよびリンホカインの要求を決定するために、ＭＴＣおよび２０％または４％のＦＣＳを含むＭ２を比較した。ＥＧＦＲおよびＰＢＳを有する小胞を、それぞれ抗原と対照として用いた。脾臓細胞を６ウェルプレート中で抗原を添加してまたは添加せずにＭ１（無血清）中で３時間インキュベートした。次いで、ＭＴＣまたはＭ２を加えて、７２、９６、１２０または１４４時間後にＡ４３１固定細胞を用いてスクリーニングを行った。全実験において、回収された生細胞数は２０〜４０％であって、公開された結果（Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ−Ｃｏｗｌｅｙ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｐ．１３１、１９８８）と一致した。最高の特異的応答は、第４日にＭＴＣを用いて得られた。一方、４％または２０％（最終濃度は２％または１０％）のＦＣＳを含むＭ２は最高応答を第６日まで遅延させた（表２）。しかし、結果を特異的／非特異的応答比で表した場合に見られるように、ＭＴＣおよび１０％ＦＣＳは非特異的応答をおそらくはポリクローナル活性化によって誘導した。さらなる分析のために、本発明者らは４％ＦＣＳ添加Ｍ２および６日培養を用いることにした。
【００９２】
小胞表面におけるＥＧＦＲの存在は、この抗原に対する応答を著しく増強した。上記と同様のプロトコールにおいて、発現および非発現ＥＧＦＲ細胞系からの小胞を比較した。リンパ球を小胞とともにＭ１中で３時間培養した。次いで、４％ＦＣＳを含むＭ２を加えた。６日後、各グループからのリンパ球を、ＥＧＦＲ、Ａ４３１−固定細胞、ＲＮａｓｅまたはＧＤ３で被覆した９６ウェルプレート中で４８時間培養した。予期されたように、これらの分析結果は応答の多特異性パターンを示した（表３）。ＥＧＦＲに対する反応性は、ＥＧＦＲ発現小胞を抗原として用いた場合に吸光度として明らかに増加した。
【００９３】
まとめると、これらの結果は、可変部のＰＣＲクローニングに適するＥＧＦＲに対する免疫されたリンパ球のいくつかのプールを生じさせたインビトロ免疫の後に、未熟ではあるが測定可能な抗原依存性応答があったことを示唆する。
【００９４】
１．１×１０5個のクローンのライブラリーを、インビトロ免疫に由来するｓｃＦｖフラグメントをｐＨＥＮ１ファージミドにクローニングした後に得た。このライブラリーは、インビボ免疫によるさらに二つのライブラリーと平衡して得られた。これらファージライブラリーの構築については以前に記述がある（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、ＥＰ９４１０４１６０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４、９５２、１９９４）。
【００９５】
ＥＧＦＲに結合するｓｃＦｖフラグメントを選択するために、ファージをＥＧＦＲ被覆イムノテュープを用いて選別した。溶出したファージを大腸菌のＳｕｐＥ株の再感染に用いた。全部で３回の選択を行った。それぞれの回において、抗原を含まないチューブの試験を平行して行い、バックグランドを算出した。１回目の選別において１．５×１０10個のファージ粒子をイムノチューブに供して、６．６×１０4個を被覆イムノチューブから溶出した。バックグランドからはわずかに２００コロニーしか得られなかった。３回目の選別後では、１×１０11ファージを供して、５．６×１０10個が溶出された。
【００９６】
さらにｓｃＦｖフラグメントを特徴づけするために、発明者らはファージ集団から２２クローンを、選別前、および各選別回後に選択した。
【００９７】
ライブラリーの相違を、クローニングしたフラグメントのＢｓｔＮＩ切断パターンによって分析した。選択前、ライブラリーはきわめて相違しているようだった。最初の回の選択後に由来する結合クローンのフィンガープリントは、同一制限パターンを有するいくつかのグループの存在を示した。
【００９８】
クローンを、それらの切断パターンに基づいて異なる選択回数のものを選んだ。ＤＮＡ配列決定によって、選択クローンのほとんどにおいて異なる配列が存在することが明らかになった。
【００９９】
クローン１０Ｄ２、５Ｄ３、１０Ｅ２、１Ｂ３、４Ｂ３および５Ｅ２の相補性決定領域（ＣＤＲ）の長さおよび構成は異なっていた。ほとんどの違いは、ＶHおよびＶL配列のＣＤＲ３において認められた。クローン５Ｄ３および１Ｅ３は、第３回目の選別に由来した。これらはＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによる分析ではＥＧＦＲに強く結合し、同一の配列を有した。
【０１００】
可溶性ｓｃＦｖフラグメントを、ＩＰＴＧの存在下での非サプレッサー大腸菌株ＨＢ２１５１の増殖によって得た。
【０１０１】
ｓｃＦｖ産生を確実にするために、個々のクローンからの細菌培養培地をゲル電気泳動によって分析した。ウェスタンブロット分析は、約３５、０００ｋＤの明瞭なバンドを示した。
【０１０２】
ＥＧＦＲへの結合活性を有するクローンを、ＥＬＩＳＡで同定した。選択されたクローンの交差反応性を調べるために、異なる抗原を用いるＥＬＩＳＡアッセイを行った。抗原（ＥＧＦＲ、ＲＮａｓｅ、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ＯＶＡ、ＧＤ3ガングリオシド、ビトロネクチンレセプター、血小板糖タンパク質ＩＩｂＩＩＩａおよびジシアリル−ラクト−Ｎ−テトラオース）を最適濃度でＥＬＩＳＡプレートに被覆した（表４）。非ＥＧＦＲ抗原への結合は検出されなかった。ｓｃＦｖをまた、ＥＧＦＲを有する三つの腫瘍細胞系（ヒト上皮性癌腫Ａ４３１、ヒト乳腺腫ＭＤＡＭＢ２３１およびヒト結腸腺腫ＨＴ２９）への結合に関して試験した。ＷＭ１６４ヒト黒色腫非発現ＥＧＦＲを陰性対照として用いた。腫瘍細胞系に結合したものを、非固定細胞を用いる間接免疫蛍光法によって試験して、ＦＡＣＳ分析によって定量した。非固定細胞の使用によって、膜レセプターの天然構造が確かになる。陽性クローンは、Ａ４３１細胞を用いて明瞭な蛍光を示した。ＥＧＦＲを有する他の腫瘍細胞系の蛍光は、弱かった。陰性細胞系への結合は検出されなかった。結果は、フローサイトメトリーによって確認された。１７の陽性クローンおよび三つの陰性クローンをＡ４３１、ＭＤＡ ＭＢ２３１およびＨＴ２９細胞への結合に関してフローサイトメトリーによって分析した。ＷＭ１６４を陰性細胞系として用いた。
【０１０３】
４２５ｓｃＦｖ（Ｐ１クローン）を陽性対照として、クローニングベクター（ＨＥＮ）を陰性対照として用いた。結果を表５に要約する。二つのクローン、４Ｂ２および５Ｅ２はＥＬＩＳＡの分析でＥＧＦＲとの結合に関して陽性であったが、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞系との結合に関しては陰性であった。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
アッセイ１：Ｍ１プラスＭ２、 ４％ＦＣＳ（最終ＦＣＳ： ２％）
アッセイ２：Ｍ１プラスＭ２、 ２０％ＦＣＳ（最終ＦＣＳ：１０％）
アッセイ３：Ａ培地プラスＭＴＣ、 ４％ＦＣＳ（最終ＦＣＳ： ２％）
ａ） ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞（１０7）を、３．５ｍｌのＭ１中で、Ａ４３１細胞由来の小胞またはＰＢＳとともに６ウェルプレート中で３時間インキュベートした。その後、４％または２０％のＦＣＳを含むＭＴＣまたはＭ２を３．５ｍｌを加えて、プレートをインキュベートした。３、４、５または６日目に、インビトロ免疫したリンパ球を培養培地から除去して、ＨＢＳＳ中で洗浄して、小胞を除去して、固定Ａ４３１細胞で被覆した９６ウェルプレートにまいて、４８時間インキュベートした。（方法を参照のこと）
ｂ）培養培地中におけるＦＣＳの最終濃度
ｃ）Ｏ．Ｄ． ４０５ｎｍにおける吸光度。１６ウェルの平均値を表す。
【０１０６】
ｄ）特異的応答（小胞を抗原として）／非特異的応答（ＰＢＳを抗原として）の比。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
ａ） リンパ球をＥＧＦＲ発現小胞（ＥＧＦＲ＋）またはＥＧＦＲ非発現小胞（ＥＧＦＲ−）のいずれかを用いて、インビトロ免疫した。６日間のインキュベーションの後、細胞を培養液から除去して、上記の抗原に対して、スクリーニングした。
【０１０９】
ｂ） 応答を吸光度（４０５ｎｍ）として表す。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
ａ） ＥＬＩＳＡアッセイは、上述のように行った。
【０１１２】
ｂ） ビトロネクチンレセプター（ＶＮＲ）；血小板糖タンパク質IIｂIIIａ（ＧＰIIｂIIIａ）；ジシアリル−ラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
ａ） 上述するように、ＥＧＦＲを有する三つの細胞系（Ａ４３１、ＭＤＡＡＭＢ２３１およびＨＴ２９）および一つの非発現細胞系（ＷＭ１６４）を用いて、サイトメトリー分析によってｓｃＦｖの腫瘍細胞計への結合能のアッセイを行った。
【０１１５】
ｂ） フラクメントのないベクター（ＨＥＮ）および４２５ＭＡｂ由来のｓｃＦＶフラグメント（ＰＩ）を、それぞれ陰性および陽性対照として用いた。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
【表７】
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
【表１０】
【０１２１】
【表１１】
【０１２２】
【表１２】
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
【表１４】
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
【表１６】
【０１２７】
【表１７】
【０１２８】
【表１８】
【０１２９】
【表１９】
【０１３０】
【表２０】
【０１３１】
【表２１】
【０１３２】
【表２２】
【０１３３】
【表２３】
【０１３４】
【表２４】
【０１３５】
【表２５】
【０１３６】
【表２６】
【０１３７】
【表２７】
【０１３８】
【表２８】
【０１３９】
【表２９】
【０１４０】
【表３０】
【０１４１】
【表３１】
【０１４２】
【表３２】
【０１４３】
【表３３】
【０１４４】
【表３４】
【０１４５】
【表３５】
【０１４６】
【表３６】
【０１４７】
【表３７】
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１−Ａ】第１図は、ファージ−抗体ライブラリーから分離されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖ。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。
【図１−Ｂ】第１図は、ファージ−抗体ライブラリーから分離されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖ。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。
【図２】第２図は、ＥＧＦＲへのｓｃＦｖの結合を示す説明図である。細菌培養上清中のｓｃＦｖの濃度を推定して、ｓｃＦｖを精製ＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖライブラリー。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。Ｐ１（陽性対照）はＭＡｂ４２５由来のｓｃＦｖである。Ｌ１およびＳ１（陰性対照）はあらかじめ選択したリンパ節および脾臓ライブラリーからの非結合ｓｃＦｖである。
【図３】第３図は、哺乳動物細胞における発現のための可変部を再構築するために用いる中間ベクターの説明図である。（Ａ）ＶHベクター。（Ｂ）Ｖκベクター。
【図４】第４図は、キメラ全抗体のＥＧＦＲへの結合を示す説明図である。ＣＯＳ細胞上清中の抗体の濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、抗体を精製したＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。
【図５】第５図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ２ １１ＣのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【図６】第６図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ２ １２ＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【図７】第７図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ３ １１ＤのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【０１４９】
ＦＲおよびＣＤＲのアミノ酸位置は、第６図のものに対応する。
【図８】第８図は、ｓｃＦｖ番号Ｓ４ ２ＤのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、新規の抗ＥＧＦＲ抗体および抗体フラグメント、好ましくは、免疫された哺乳動物、好ましくはマウスの細胞から構築されるファージ−抗体ライブラリーから得られる一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）に関する。ファージ−抗体ライブラリーから分離された抗体フラグメントを操作して部分的にヒト化された全抗体分子を作出することができる。これらキメラ抗ＥＧＦＲ抗体はヒト免疫グロブリンの定常部を含み、それらのフラグメントと同様にヒト腫瘍の診断および治療のための薬剤として使用することができる。
【０００２】
さらに、本発明はファージ−抗体ライブラリーが、免疫哺乳動物からの抗体の分離方法として標準的なハイブリドーマ手法に較べてより多様に用い得る代わりの方法であることを示している。
【０００３】
さらには、本発明は、黒色腫、神経膠腫または癌腫などの腫瘍の治療のための該抗体またはフラグメントからなる薬剤組成物に関する。該抗体またはフラグメントはまた、該腫瘍のインビトロまたはインビボでの探索および評価に関する診断的適用のために使用できる。
【背景技術】
【０００４】
本明細書は、ここで次のように定義するいくつかの技術用語に関連している。
「ＦＲ」（フレームワーク領域）は、三つのＣＤＲを支える軽鎖または重鎖可変部の四つのサブ領域を意味する。
「ＣＤＲ」（相補性決定領域）は、超可変配列を含み、本来抗原との直接接触を起こす主な原因となるループ構造物を形成する軽鎖または重鎖可変部の三つのサブ領域を意味する。
「キメラ」または部分的にヒト化された抗体は、ヒト材料由来の定常部および非ヒト材料、例えばマウスに由来する可変部（ＣＤＲを含む）からなる抗体を意味する。
「ヒト化」または完全にヒト化された抗体は、ＣＤＲが非ヒト材料に由来するのに対して、ヒト材料由来の定常部およびＦＲからなる抗体を意味する。
「ＥＧＲ」および「ＥＧＦＲ」は、上皮増殖因子およびそのレセプターを意味する。
「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
「ｓｃＦｖ」は、抗体フラグメントである一本鎖Ｆｖを意味する。
「ＶL」は、軽鎖可変部を意味する。
「Ｖκ」は、カッパ軽鎖可変部を意味する。
「ＶH」は、重鎖可変部を意味する。
ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水を意味する。
ＦＣＳは、ウシ胎児血清を意味する。
ＨＢＳＳは、ハンクスの平衡塩類溶液を意味する。
ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネートを意味する。
ＭＴＣは、混合細胞培養を意味する。
発明の背景
上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、表皮および上皮細胞のマイトゲンであるポリペプチドホルモンである。ＥＧＦが感受性細胞と相互作用する場合、これは膜レセプター（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１７０ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃ−ｅｒｂ−Ｂプロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
【０００５】
ＭＡｂ４２５は、よく知られたヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）に対してつくられたネズミモノクローナル抗体であって、ヒトＥＧＦＲの外側ドメインのポリペプチドエピトープに結合し、ＥＧＦの結合を阻害する。ＭＡｂ４２５（ＡＴＣＣ ＨＢ ９６２９）は、インビトロで腫瘍細胞毒性を媒介し、インビトロで類表皮腫および結腸直腸癌腫由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出された（Ｒｏｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４７，３６９２、１９８７）。ＭＡｂ４２５のヒト化されたキメラは、ＷＯ ９２／１５６８３に開示されている。
【０００６】
ここ数年の間に、機能的抗体フラグメントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主原核細胞中で産生し得る方法が記述された（Ｓｋｅｒｒａ ａｎｄ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０３３、１９８８、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０４１、１９８８）。これらにはＦｖフラグメントおよびＦａｂフラグメントが含まれており、Ｆｖフラグメントはとくに関心がもたれる。一本鎖Ｆｖ（鎖中、ＶLおよびＶH鎖は一緒に連結している）についてもまた、記述がある（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３、１９８８、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９、１９８８）。
【０００７】
ファージ−抗体ライブラリーは、免疫した動物からの抗体の分離におけるハイブリドーマ手法に別の手法を提供する。ハイブリドーマ法は、抗体を産生する細胞を不死化することによって行われる。ファージ−抗体手法は、抗体をコードする遺伝子を不死化することによって行われる（Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４９、２９３、１９９１）。ファージ−抗体手法において、抗体重鎖可変部（ＶH）および軽鎖可変部（ＶL）遺伝子はＰＣＲ増幅され、可変部は無作為に組み合わされて、ファージ粒子の表面で抗体フラグメントとして発現されて、目的の抗原と結合する抗体についてファージ抗体のライブラリーをスクリーニングする。
【０００８】
ハイブリドーマ手法は、動物の脾臓において強い免疫応答を生じさせることが可能な場合はマウスモノクローナル抗体の分離にきわめて良好な結果をもたらした。例えば、ヒト上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）に対するマウスＭＡｂは、ヒトＡ４３１腫瘍細胞で腹腔内免疫したマウスの脾臓から分離された（Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５２、５４９、１９８７）。ハイブリドーマ手法と比較した場合のファージ−抗体手法の考え得る利点は、出発材料としては本質的にいかなる材料からの抗体発現細胞でも用いることができ、多数の異なる抗体が迅速にスクリーニングされることである。ファージ−抗体手法の他の利点は、目的の抗体の可変部をコードする遺伝子はすでにクローニングされており、さらなる遺伝子操作のために直ちに入手できることである。
【０００９】
ファージ−抗体ライブラリーから分離された抗破傷風トキソイドＦａｂフラグメントを全抗体分子に変換したという一報告がある（Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、４、７４、１９９３）。
【００１０】
過去十年間、インビトロ免疫は、ヒトおよびネズミ系の双方からの多様な抗原に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作出するための能動免疫の代わりの手法として用いられてきた（例えば、Ｖａｕｘ、Ｄ．Ｊ．Ｔ．、ＨｅＩｅｎｉｕｓ，．Ａ．ａｎｄ Ｍｅｌｌｍａｎ、Ｉ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３６、３６、１９８８、 Ｇａｔｈｕｒｕ、Ｊ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３７、９５、１９９１、 Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、９、３５５、１９８８）。このアプローチの利点は、ごく少量の抗原しか要求されないことおよびこの方法がヒト・ハイブリドーマの作出にも適用されることである。しかし、インビトロ免疫後の低親和性ＩｇＭ抗体の作出およびヒトリンパ球の不死化の困難さは、この手法に常に伴う問題となってきた。
【００１１】
抗体を得る新たな方法は、重鎖および軽鎖可変部（ＶHおよびＶL）領域の遺伝子のＰＣＲ増幅し、次いでこれらを無作為に組み換えてファージ提示ライブラリーとして発現する方法である（７−９）。抗体可変部遺伝子をクローニングされ、副コートタンパク質（遺伝子３）に一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）として融合された（１０）。ファージ粒子はその表面に抗体フラグメントを提示し、抗体の結合性を用いて選別することによって選択することができる。この手法は、Ｖ遺伝子の無作為組み換えが天然のプロセスでは選択され得ない新しい特異性および親和性を有する新規の対合を産生する可能性があるという利点を有する。
【００１２】
さらに、そのようなアプローチによって、ネズミまたはヒト由来の天然のまたはインビトロ免疫されたリンパ球の使用が可能になる。
【００１３】
ネズミＢ細胞インビトロ免疫およびハイブリドーマ手法によるＥＧＦＲに対するｍＡｂ取得の以前の試みでは、低親和性の交差反応抗体しか得られなかった。
【００１４】
そのような欠点を改良するために、インビトロ免疫とそれに続くＰＣＲクローニング手法との組み合わせが行われた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、ＥＧＦレセプターに対して高親和性を有し、上記および下記の有利な方法によって得られる抗体および抗体フラグメントを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の開示
本発明は、標準ハイブリドーマ手法（Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５２、５４９、１９８７、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３、１９９１）によって分離されたマウスＭＡｂ（４２５）と三つの異なるファージ−抗体ライブラリーから分離されたマウス抗ＥＧＦＲ抗体とを比較する。ライブラリーは、免疫したマウスの脾臓からだけではなく免疫したマウスの排液リンパ節からおよびインビトロ免疫したマウス細胞からも調製した。ライブラリーから分離した二つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を、ヒト定常部に連結したマウス可変部を有するキメラ全抗体分子の作出のために遺伝子操作した。
【００１７】
詳細には、本発明は、免疫した哺乳動物、細胞、好ましくはマウスの好ましくは脾臓または排液リンパ節の細胞、またはインビトロ免疫した細胞から構築したファージ−抗体ライブラリーから得ることができる抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖに関する。原則として、本発明はｓｃＦｖに限定されることなく、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2などの他の抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントまでにも及ぶ。
【００１８】
本発明によるｓｃＦｖのいくつかは、明確に定義されるＤＮＡおよびアミノ酸配列を有する。したがって、本発明の他の目的は、重鎖および軽鎖の可変部が配列ＩＤ番号１〜３２、好ましくは第５〜８図に示された重鎖および軽鎖配列の一つから選択されるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列からなることを特徴とする一本鎖Ｆｖフラグメントを提供することである。
【００１９】
多くの場合、完全に機能する全抗体のみが診断および治療目的に使用し得ることから、一本鎖Ｆｖからの可変部を全部、一部またはヒト化した抗ＥＧＦＲ抗体を形成するヒト免疫グロブリンの定常部と連結することは本発明の関心事である。
【００２０】
したがって、本発明の一つの目的は、上記および下記に定義されたまたは請求の範囲に定義された抗体フラグメントに由来するＤＮＡ配列からおよびヒト免疫グロブリンの定常部に由来するＤＮＡ配列から構築される全抗ＥＧＦＲ抗体を提供することであって、これは好ましい実施態様として、重鎖がγ−１鎖からなり軽鎖がκ鎖のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００２１】
本発明によると、抗ＥＧＦＲｓｃＦｖはファージ−抗体ライブラリー手法によって分離される。したがって、本発明は抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖの調製法に関し、それは以下のステップからなる。
（１）免疫した哺乳動物細胞、好ましくはマウス細胞からＲＮＡを分離する。
（２）第一鎖ｃＤＮＡを合成する。
（３）免疫した細胞からのｃＤＮＡのＶHおよびＶκ遺伝子を増幅する。
（４）適当な制限部位とともに該遺伝子をファージミドベクターにクローニングする。
（５）連結混合物を用いて原核細胞を形質転換させる。
（６）精製ＥＧＦＲを用いてＥＧＦＲに対するファージ抗体に関してファージライブラリーをスクリーニングする。
（７）所望の一本鎖Ｆｖを宿主原核細胞、好ましくは大腸菌中で産生させる。
【００２２】
さらに、本発明の目的は、上記のようにしてまたは請求の範囲に定義したようにして産生された抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントの可変部をコードするＤＮＡを、ヒト免疫グロブリンの定常部をコードするゲノムＤＮＡを含む少なくとも一つの真核細胞発現ベクター中にクローニングして、真核細胞を該ベクターで形質転換して、抗体を発現させて分離することによって全抗ＥＧＦＲ抗体を調製する方法を開示することである。
【００２３】
抗ＥＧＦＲｓｃＦｖ、とりわけ全抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒト腫瘍の診断および治療において用いることができる。このように、本発明は上記および請求の範囲に定義したような抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖまたは全抗ＥＧＦＲ抗体からなる薬剤組成物に関する。
【００２４】
本発明の結果および利点は次のように要約される。
【００２５】
新規のマウス抗ＥＧＦＲ抗体をファージ−抗体ライブラリーから分離した。新抗体は、少なくとも四つの異なるＶHサブグループおよび四つの異なるＶκサブグループで表された（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｓ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１）。これらは、ハイブリドーマ手法を用いて分離したマウスＭＡｂによって用いられる対合および配列とは異なった対合および配列を示した。マウス４２５ＭＡｂは、ファージ抗体には見られなかったＶH２ｂとＶκ４対合を有する。Ｆｖ Ｌ３ １１ＤのＶHは、最高の４２５ＶＨに対して最高割合の一致（８４．９％）を有した。主な相違はＣＤＲにあった。ｓｃＦｖ Ｓ４ ２ＤのＶκは４２５Ｖκに対して最高割合の一致（８３．２％）を有した。ここでも、主な相違はＣＤＲ、とくにＣＤＲ３にあった。本発明において、多様な新抗ＥＧＦＲ抗体がファージ−抗体ライブラリーから分離され、それら抗体は全て、４２５ＭＡｂによって認識されるものとは異なるＥＧＦＲ上のエピトープを認識する少なくとも二つのｓｃＦｖを有する４２５ＭＡｂと異なっている。これは、組み合わせのライブラリーから分離された抗体がハイブリドーマ手法によって分離されたものときわめて類似しているという以前の報告（Ｃａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、６４５０、１９９０）と対照的である。
【００２６】
三つのファージ−抗体ライブラリーのうち、高親和性抗体を得るために要求される選択ステップ回数および分離される高親和性抗体の多様性の点から最良のライブラリーは、排液リンパ節から作られたライブラリーであった。リンパ節はファージ−抗体ライブラリーの構築のためのＲＮＡ源として二つの理由で選択された。まず、以前の研究によって、高親和性ＩｇＧ抗体を産生するＢ細胞は、腹膜を介して免疫した後の脾臓からよりも肉趾を介して免疫した後の膝窩リンパ節からの方がより高率で得られることが示された（Ｖｅｎｎ ａｎｄ Ｄｒｅｓｓｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０２、９５、１９８７）。第二に、排液リンパ節はヒト抗腫瘍抗体の分離のための好適な材料であると考えられている。したがって、肉趾を介して免疫したマウスの膝窩リンパ節からのマウス抗ＥＧＦＲ抗体の分離は、乳ガン患者の腋窩リンパ節からのヒト抗ＥＧＦＲ抗体の分離のためのモデルであった。少量のリンパ節材料からの適切なサイズのライブラリーの調製およびそのライブラリーからの高親和性抗体の分離の可能性が示された。
【００２７】
マウス抗ＥＧＦＲ抗体が三つのファージ−抗体ライブラリーの全てから分離されたが、新たに分離された抗体のいずれかがハイブリドーマ手法を用いて分離したマウス４２５ＭＡｂよりもより高い親和性を有するということは明らかにはされていない。最初の分析において、ｓｃＦｖ由来のファージ抗体は４２５ＭＡｂから構築されたｓｃＦｖよりもよくＥＧＦＲに結合したようであった（第２図）。
【００２８】
キメラ全抗体分子を用いた他の実験において、キメラ抗体の一つ（Ｓ４ ２Ｄ）はキメラ４２５抗体と等しいＥＧＦＲ親和性を示した。第二のキメラ抗体（Ｌ３ １１Ｄ）は、キメラ４２５抗体に較べて４分の１の低い親和性を有した（第４図）。ＳｃＦｖを用いて得られた結合データは、おそらくｓｃＦｖ調製物がモノマーおよびダイマーの混合物を含み得ることから誤解を生む結果を示した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２、７２５、１９９３）。これに対して、キメラＩｇＧ抗体がダイマーを形成することは予想されず、キメラＬ３ １１ＤおよびＳ４ ２Ｄ抗体は２価のモノマーキメラＩｇＧ抗体に予想される大きさを示した。しかし、４２５、Ｌ３ １１ＤおよびＳ４ ２ＤｓｃＦｖのアフィニティー精製調製物の分析は、ｓｃＦｖのこれら調製物はモノマー、ダイマーおよび他の多量体を含んでいなかったことを示した。さらに、モノマーおよび多量体の相対比はそれぞれのｓｃＦｖで異なっていた。４２５ｓｃＦｖは、最低のダイマーの割合を有した。予想されたように、ダイマーおよびとくにそれ以上の多量体はモノマーよりも精製ＥＧＦＲに対してより強い結合を示した。４２５ｓｃＦｖは、新たに分離されたｓｃＦｖのいくつかに較べてダイマーになる傾向が弱いようである。
【００２９】
ファージ粒子表面の抗体フラグメントの発現は所望の特異性を有する抗体の迅速な選択のための強力な方法の基礎を形成するが、ファージ抗体または抗体フラグメントそれ自体（ｓｃＦｖまたはＦａｂ）のいずれも所望の最終産生物ではないようである。さらに、いかにしてファージライブラリーから分離されたマウスｓｃＦｖが全抗体分子に容易に変換し得るかが示されている。この場合、マウス可変部をヒト定常部と連結して、部分的にヒト化したキメラ抗体が作出された。
【００３０】
これらの結果は、免疫したマウスから種々の抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントを分離するためにファージ抗体手法を用いることが可能であることを示している。所望の定常部を有する全抗体分子は、次いで抗体フラグメントから構築できる。ある場合には、マウスからのモノクローナル抗体を分離する方法としてハイブリドーマ手法がそれでも最良の方法であるかもしれない。高免疫原性の抗原が入手可能であって、一つまたは二、三の異なる抗−抗原抗体を産生する二、三のハイブリドーマ細胞系が適切である場合には、ファージ抗体手法を考慮する理由はほとんどないと思われる。しかし、肉趾注射などの特殊な免疫プロトコールが高親和性抗体を生じさせるために有利であるような場合または抗原上の多様なエピトープに対する多数の抗体が要求される場合またはきわめて微弱で、免疫原性もおそらくより低いエピトープに対する抗体が要求される場合には、ファージ抗体手法が最良の方法であり得る。また、抗体のさらなる遺伝子操作が予想される場合には、抗体遺伝子がすでにクローニングされているという点でファージ抗体手法が有利である。
【００３１】
微粒子抗原を用いるインビトロ免疫とＰＣＲ−クローニング手法とを組み合わせる本アプローチは、ＥＧＦＲと反応して他の抗原とは交差反応しないｓｃＦｖフラグメントをもたらした。ここで報告された免疫プロトコールは、可溶性ではなく膜小胞調製物である抗原提示およびＦＣＳを欠いた培養培地自体によって異なる。両方法は、抗原を抗原提示細胞に利用できるようにすることによってインビトロ免疫の効率を高める手段として報告されている（例えば、Ｂｒａｍｓ、Ｐ．、ｅｔａｌ．、Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、９８、１１．１９８７）。
【００３２】
ＭＴＣを用いて得られた結果は、インビトロ免疫プロセスを改良するためにリンホカイン源としてＭＴＣ上清の使用を提唱している以前の報告（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｍｏｅｌｌｅｒ、Ｓ．Ａ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３６、３７１０、１９８６、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．（Ｅｄｓ．）、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、アムステルダム、１９８８、ｐ．３）と一致する。膜小胞調製物は、多くの異なる抗原決定基がそのような小胞に存在することから、ポリ抗原とみなされるべきである。この理由から、これら調製物があるレベルのポリクローナル活性化を誘導することも考えられる。しかし、抗ＥＧＦＲ特異性応答は標準ポリクローナル活性剤処理によって得られる応答とは明らかに異なることから、本発明者らはこれを不適切と考えた。
【００３３】
インビトロ免疫後にＢ細胞を不死化する代わりに、本発明者らは抗体ＶHおよびＶL遺伝子を不死化する分子的方策を用いた。これらモノクローナル抗体フラグメントを細菌中で発現して産生した。ファージ提示系は特異的抗原に対する抗体フラグメントを分離するための強力な方法である。抗体フラグメントとｇ３ｐ被覆タンパク質間の終止コドンの存在によって、サプレッサーまたは非サプレッサー菌株を用いて溶解性ｓｃＦｖフラグメントとしての表面提示と分泌との間のスイッチが可能になる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、４１３３、１９９１）。
【００３４】
インビトロ抗体剌激されたＢ細胞における特異的応答およびｍＲＮＡレベルの上昇によって、インビトロ免疫は抗原に対して高い特異性を有する抗体フラグメントの分離に寄与する。二回の選択プロセスの後、１００％のクローンがＥＧＦＲの結合に関して陽性であった。これに対して、インビトロ免疫プロセスに由来するクローンでは、４回の選択の後に初めて１００％陽性であった（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、ＥＰ９４１０４１６０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４、９５２、１９９４）。
【００３５】
天然の未処理の抗体遺伝子からのファージ提示ライブラリーの使用によって免疫なしでまたはインビトロ免疫の後に特異的なヒト抗体フラグメントが作出されることも考えられる。このように、抗体フラグメントは細菌中で簡単、迅速、かつ経済的に直接産生され得る。
生物学的材料および一般的方法
本出願に記述の微生物、細胞系、プラスミド、ファージミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点またはベクターの他のフラグメントは、市販されているかあるいは一般に入手可能である。とくに記載がない限り、これらは例として使用されるのみであって、本発明に必ずしも必須ではなく、それぞれ他の適当な手段および生物学的材料によって置き換えることができる。
【００３６】
ｓｃＦｖのクローニングおよびｓｃＦｖタンパク質の産生のために細菌宿主を好ましく用いる。これら宿主の例は大腸菌またはバチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）である。
【００３７】
例えばＣＯＳ、ＣＨＯまたは酵母のような真核細胞宿主は、本発明による全抗ＥＧＦＲ抗体の産生のために好ましい。
【００３８】
本発明に必要な方法技術を以下に詳細に記述する。詳記されない他の方法技術は、当業者によく知られた公知の標準法または引用された参考文献および特許出願明細書および標準的文献により詳細に記載されている方法技術である。
図面の簡単な説明
第１図は、ファージ−抗体ライブラリーから分離されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖ。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。
【００３９】
第２図は、ＥＧＦＲへのｓｃＦｖの結合を示す説明図である。細菌培養上清中のｓｃＦｖの濃度を推定して、ｓｃＦｖを精製ＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖライブラリー。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。Ｐ１（陽性対照）はＭＡｂ４２５由来のｓｃＦｖである。Ｌ１およびＳ１（陰性対照）はあらかじめ選択したリンパ節および脾臓ライブラリーからの非結合ｓｃＦｖである。
【００４０】
第３図は、哺乳動物細胞における発現のための可変部を再構築するために用いる中間ベクターの説明図である。（Ａ）ＶHベクター。（Ｂ）Ｖκベクター。
【００４１】
第４図は、キメラ全抗体のＥＧＦＲへの結合を示す説明図である。ＣＯＳ細胞上清中の抗体の濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、抗体を精製したＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。
【００４２】
第５図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ２ １１ＣのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【００４３】
アミノ酸位置
（Ａ） ＦＲ−１： １−２３，ＣＤＲ−１：２４−３４，
ＦＲ−２：３５−４９，ＣＤＲ−２：５０−５６，
ＦＲ−３：５７−８８，ＣＤＲ−３：８９−９７，
ＦＲ−４：９８−１０９．
（Ｂ） ＦＲ−１： １−３０，ＣＤＲ−１：３１−３５
ＦＲ−２：３６−４９，ＣＤＲ−２：５０−６６，
ＦＲ−３：６７−９８，ＣＤＲ−３：９９−１０８，
ＦＲ−４：１０９−１１９．
第６図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ２ １２ＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【００４４】
アミノ酸位置
（Ａ） ＦＲ−１： １−２３，ＣＤＲ−１：２４−３８，
ＦＲ−２：３９−４９，ＣＤＲ−２：５０−５６，
ＦＲ−３：５７−８８，ＣＤＲ−３：８９−９７，
ＦＲ−４：９８−１０９．
（Ｂ） ＦＲ−１： １−３０，ＣＤＲ−１：３１−３５，
ＦＲ−２：３６−４９，ＣＤＲ−２：５０−６６，
ＦＲ−３：６７−９８，ＣＤＲ−３：９９−１０８，
ＦＲ−４：１０９−１１９．
第７図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ３ １１ＤのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【００４５】
ＦＲおよびＣＤＲのアミノ酸位置は、第６図のものに対応する。
【００４６】
第８図は、ｓｃＦｖ番号Ｓ４ ２ＤのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【００４７】
アミノ酸位置
（Ａ） ＦＲ−１： １−２３，ＣＤＲ−１：２４−３５，
ＦＲ−２：３６−５０，ＣＤＲ−２：５１−５７，
ＦＲ−３：５８−８９，ＣＤＲ−３：９０−９８，
ＦＲ−４：９９−１１０．
（Ｂ） ＦＲ−１： １−３０，ＣＤＲ−１：３１−３５，
ＦＲ−２：３６−４９，ＣＤＲ−２：５０−６６，
ＦＲ−３：６７−９８，ＣＤＲ−３：９９−１０７，
ＦＲ−４：１０８−１１８．
第５〜８図の配列は、また、本発明の開示の一部である添付配列表にも示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
（１）ファージ−抗体ライブラリーの構築およびスクリーニング
三つのファージ−抗体ライブラリーを、一つはヒト癌腫細胞系Ａ４３１（８．８×１０5個）を用いて免疫したマウスの脾臓から、一つは精製ＥＧＦＲ（６．５×１０6個）を肉鉦に免疫したマウスの膝窩リンパ節から、そして一つはＡ４３１小胞（１．１×１０5個）を用いてインビトロ免疫したマウスリンパ球から構築した（Ａ４３１小胞の構築およびインビトロ免疫の詳細は実施例１および２に記載されている）。選択に先立って、各ライブラリーからの少なくとも４６個のクローンを能力範囲の多様性を決定するためにＢｓｔＮＩフィンガープリント法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４、１９９１）によって分析した。広範囲の切断パターンが観察された。さらに選択に先立って、各ライブラリーからの９６個のクローンからのｓｃＦｖを、ＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。
【００４９】
脾臓およびリンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖのいずれもＥＧＦＲに結合しなかった。インビトロ免疫したライブラリーからのｓｃＦｖの一つがＥＧＦＲに結合した。１回目の選択をＥＧＦＲ被覆免疫チューブを用いて行った後、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖの明らかな濃厚富化が、リンパ節ライブラリーおよびインビトロ免疫したライブラリーに関して観察された。第２回目の選択は、ＥＧＦＲ結合ｓｃＦｖが脾臓ライブラリーから検出される前に必要であった。３回目の選択までに、リンパ節からおよびインビトロ免疫ライブラリーからのｓｃＦｖのほとんどがＥＧＦＲへの結合に関して陽性であった。脾臓ライブラリーを用いる４回目の選択の後、ほとんどのｓｃＦｖがＥＧＦＲへの結合に関して陽性であった（表１）。
【００５０】
【表１】
【００５１】
（２）ＥＧＦＲ結合クローンの配列分析
各回の選択後、ＥＧＦＲ結合クローンからのｓｃＦｖ挿入部分をＢｓｔＮＩフィンガープリント法（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４、１９９１）によって分析した。ある切断パターンに関して富化があったことが明確となった。異なるＢｓｔＮＩフィンガープリントを有するクローンを、リンパ節ライブラリーの２回目および３回目の選択からおよび脾臓ライブラリーの３回目および４回目の選択からＶHおよびＶκのＤＮＡ配列決定のために選択した。より高親和性抗体の存在が後の回において予想されることから、後の選択回からのクローンを分析した（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、３５２、６２４、１９９１）。
リンパ節ライブラリーからの１６個のクローンを配列決定して、６個の異なるｓｃＦｖを得た（第１図）。このうち、５個は、ユニークなＶHおよびＶκの対合であった。第６番目は、６個のアミノ酸変異を有する、前述するＶHの変型であって、そのうちの５個はフレームワーク領域（ＦＲ）１にあった。これら変異の二つは、縮退ＶＨ１ＢＡＣＫＳＦＩプライマー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、４１３３、１９９１）の使用によるものとみなし得る。他は、ＰＣＲエラーの結果と考え得る。ＶHは、ＶH２ｂおよびＶH３ｄの二つのサブグループに分類され、ＶκはＶκ３、Ｖκ４、Ｖκ５およびＶκ６の四つのサブグループに分類される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｓ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、１９９１）。脾臓ライブラリーからの１０個のクローンを配列決定して、四つの異なるｓｃＦｖを見出した。このうちの三つはユニークなＶHおよびＶκの対合であり、残りの一つは前出の対合と同様のものであって、ＶHに二つだけのアミノ酸の変異があり、うち一つは相補性決定領域（ＣＤＲ）２にあり、Ｖκに二つのアミノ酸の変異を有する。サブグループへの分類によって、サブグループＶH２ａ、ＶH２ｃおよびＶH３ｄからのＶHおよびサブグループＶκ３およびＶκ４からのＶκが明らかになった。リンパ節および脾臓ライブラリーから得られたｓｃＦｖを比較することによって、両ライブラリーに共通するｓｃＦｖは唯一、すなわち、ｓｃＦｖ Ｌ３ １０Ａ／ｓｃＦｖ Ｓ４ １０Ｈであることが明らかにされた（第１図）。このクローンは、ＥＬＩＳＡで試験した場合にＥＧＦＲに強く結合しているようであった。ライブラリー間の交差混入を除去するために充分の考慮を行ったが、強く結合しているＥＧＦＲクローンのわずかな混入を全て除外することは難しい。しかし、Ｂａｌｂ／ｃマウスの同血統繁殖的性質を考慮すると、同一のｓｃＦｖが二つの異なるライブラリーから独立して生じたということは可能である。
【００５２】
（３）ＥＧＦＲへの親和性および結合特異性の分析
抗原への良好な結合およびＤＮＡ配列における多様性に基づいて、リンパ節および脾臓ライブラリーに由来するいくつかのｓｃＦｖをさらなる分析のために選択した。これらｓｃＦｖを、精製ＥＧＦＲへの結合、非関連抗体への結合およびＥＧＦＲを発現したあるいはしなかった腫瘍細胞系への結合に関してＥＬＩＳＡを用いて分析した。陽性対照として、ｓｃＦｖをマウス４２５ＭＡｂから調製した（Ｐ１）。陰性対照として、ｓｃＦｖをリンパ節および脾臓ライブラリーから選択に先立って分離したファージ抗体から調製した（それぞれＬ１およびＳ１）。ｓｃＦｖの濃度は、ウェスタンブロットにおいて試験するｓｃＦｖの希釈率と既知濃度の精製ｓｃＦｖの希釈率とを比較することによって決定した。
【００５３】
ｓｃＦｖの精製ＥＧＦＲへの結合をＥＬＩＳＡによって試験して、その結果をプロットした（第２図）。ｓｃＦｖをＥＧＦＲへの結合によってランクづけすることが可能であった。これらランクは実験間で再現性があった。もっとも強くＥＧＦＲに結合したｓｃＦｖは、リンパ節ライブラリーからのＬ２ １ＣおよびＬ３ １０Ａおよび脾臓ライブラリーからのＳ４ １０Ｈであった。上記したように、ｓｃＦｖ Ｌ３ １０ＡおよびＳ４ １０Ｈは同一のＤＮＡ配列を有する。二つのアミノ酸変異をＶH中およびＶκ中にそれぞれ有するｓｃＦｖＳ４ １０Ｈとよく似ているｓｃＦｖ（Ｓ４ ５Ａ）は、Ｓ４ １０Ｈよりも常に低いランクを示した。これに対して、Ｌ２ １２ＢとＬ３ １１Ｄ間に観察された配列の違いは結合に顕著な影響を及ぼさないようであった。分離されたｓｃＦｖのうち、Ｌ２ ８ＣおよびＬ２ １１Ｃの二つだけがｓｃＦｖ４２５よりも結合性に劣るようであった。
【００５４】
ｓｃＦｖのプラスチックおよび非関連のタンパク質パネル（卵白アルブミン、鶏卵リゾチーム、チトクロームｃ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＣＢＡアルブミンおよびＢＳＡ）への結合をＥＬＩＳＡによって試験した。いずれのｓｃＦｖもバックグランド以上の変化を示さなかった。
【００５５】
ｓｃＦｖの三つの腫瘍細胞系への結合をＥＬＩＳＡによって試験した。細胞系Ａ４３１およびＭＤＡＭＢ４６８は、それぞれ外陰部および胸部から分離されたＥＧＦＲを有する腫瘍細胞である。陰性対照として、ガングリオシドを有する黒色腫細胞系であるＳＫ−ＭＥＬ−２３を用いた。試験した１０個のｓｃＦｖのうち、四つのみが精製ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲを有する腫瘍細胞の双方に結合した（第５〜８図、Ｌ２ １２Ｂ、Ｌ３ １１Ｄ、Ｌ２ １１ＣおよびＳ４ ２Ｄ）。ＳＫ−ＭＥＬ−２３細胞への結合は検出されなかった。この驚くべき結果にはいくつかの説明が可能である。一つは、免疫、選択およびＥＬＩＳＡに使用されたＥＧＦＲが分泌されたＥＧＦＲ関連タンパク質であるということが考えられる（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｎｅｃｅ、２２４、２９４、１９８４）。このタンパク質は追加の１７個のアミノ酸をＣ末端に有する（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、２２０８２、１９９０）。
【００５６】
ｓｃＦｖをこの１７個のアミノ酸からなるペプチドへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験したが、結合は観察されなかった。分泌されたＥＧＦＲ関連タンパク質と腫瘍細胞表面のＥＧＦＲとに、立体配座またはグリコシル化配糖体の点で相違があることが可能である。
（４）ｓｃＦｖに由来するキメラ全抗体
二つのｓｃＦｖ（Ｌ３ １１ＤおよびＳ４ ２Ｄ）を、全抗体分子への変換のために選択した。マウスＶHおよびＶκをコードするＤＮＡを、免疫グロブリンリーダー配列およびスプライスドナーシグナルをコードするＤＮＡ配列を含む中間ベクター中にクローニングした（第３図）。ＶH中間ベクター中にクローニング部位を位置するということは、ＶHの最初の基をアスパラギン酸からグルタミン酸に変えることを意味した。中間ベクターから、リーダーおよびスプライスドナー配列にここで連結されたＶHおよびＶκを含むＤＮＡフラグメントを、ヒトガンマ−１定常部またはヒトκ定常部のいずれかをコードするＤＮＡを含む哺乳動物細胞発現ベクター中にクローニングした（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、２、１２４、１９９１）。それぞれのキメラ抗体のために、重鎖および軽鎖発現ベクターをＣＯＳ細胞中に共トランスフェクトさせた。陽性対照として、細胞をまたキメラ４２５抗体をコードする重鎖および軽鎖発現ベクターを用いて共トランスフェクトさせた（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３、１９９１）。培地を細胞から集めて、存在する抗体の濃度および抗体のＥＧＦＲへの結合能を決定するためにＥＬＩＳＡによって分析した（第４図）。抗体への最高結合の５０％を達成するために要求される抗体濃度を比較すると、キメラＳ４ ２Ｄ抗体はキメラ４２５抗体と同等にＥＧＦＲに結合した。しかし、キメラＬ３ １１Ｄ抗体はキメラ４２５抗体の約４分の１程度にしかＥＧＦＲと結合しなかった。キメラ４２５抗体の親和性は競合結合分析によって１．９×１０8Ｍ-1と決定された（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３、１９９１）。これらの結果は、ｓｃＦｖを分析した以前のデータがｓｃＦｖ Ｓ４ ２ＤおよびＬ３ １１Ｄの双方がｓｃＦｖ４２５よりもＥＧＦＲによく結合したことを示したことから驚きであった（第２図）。キメラＬ３ １１ＤおよびＳ４２Ｄ抗体のプロテインＡ精製試料を、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。キメラＬ３ １１ＤおよびＳ４ ２Ｄ抗体をまた、Ａ４３１およびＳＫ−ＭＥＬ−２３細胞への結合に関してフローサイトメトリーによって試験した。両キメラ抗体はＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞によく結合し、ＥＧＦＲ陰性ＳＫ−ＭＥＬ−２３細胞には結合しなかった。
（５）治療および診断的使用
本発明の抗体フラグメントおよび全抗体は、治療のためにヒト患者に投与することができる。したがって、本発明の目的は、活性組成分として上記および請求の範囲に記載の少なくとも一つの抗体または抗体フラグメントを、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる薬剤調製物を提供することである。
【００５７】
通常、本発明の抗体は静脈注射によってまたは非経口的に投与される。一般に、抗体フラグメントの投与量は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得られるに充分な範囲の量である。投与量は、患者の年齢、状態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ以上を１日または数日間投与することができる。
【００５８】
非経口的投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよびこれらの目的に適した当業者に公知の他の溶媒があげられる。
【００５９】
本発明の抗体は、生理学的に容認し得る担体を含む組成物において使用することができる。それら適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００６０】
抗体（フラグメント）はまた、それらの細胞毒性を支持するために公知の方法によってＩＬ−２などのサイトカインと抱合させることができる。
【００６１】
本発明の薬剤調製物は、黒色腫、神経膠腫および癌腫、さらに循環系の腫瘍および固形腫瘍を含むあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。
【００６２】
診断目的のために、抗体は、例えば放射線不透過性染料と抱合させるかまたは放射線標識することができる。好ましい標識法はロドゲン法（ｌｏｄｏｇｅｎ ｍｅｔｈｏｄ）である。好ましくは、診断目的の抗体はＦ（ａｂ’）2またはｓｃＦｖフラグメントとして投与される。これによってバックグランド差し引きが不要になるような優れた結果が得られる。
【実施例】
【００６３】
［実施例１］ Ａ４３１小胞
脱落膜小胞調製物を上記したように既述の方法（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７、１５２３、１９８２、Ｙｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８、９２５４、１９８３）をいくらか修飾した方法によって得た。Ａ４３１細胞を含む集密状態になったフラスコを、カルシウムおよびマグネシウムを含むＰＢＳを用いて洗浄した。低張のＰＢＳを加えてフラスコを１５分間振盪した。次いで細胞を小胞化緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭＮａ2ＨＰＯ4、５ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＳＯ2、ｐＨ８．５）を用いて洗浄した。小胞化緩衝液を加えて、フラスコを室温および３７℃で撹拌を続けた。次いで、緩衝液を金属スクリーンを通して氷中で５０ｍｌチューブに傾瀉して、１５０×ｇで４℃で５分間遠心分離した。ペレットを除去して、上清を３９、０００ｒｐｍで９０分間超遠心分離した。最終ペレットを１０ｍＭのヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。小胞からのＥＧＦＲを分析するために、試料を９容量のエタノールで沈殿させて、０．０８Ｍトリス（ｐＨ６．８）で再懸濁して、次いで、標準としてＭＡｂ４２５を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００６４】
調製物のタンパク質含量を、標準物質としてＢＳＡを用いて５９５ｎｍで測定する修飾クマシープラス法によって定量した。小胞からのＥＧＦＲを分析するために、試料を９容量のエタノールで沈殿させた（４℃で一晩）。ペレットをトリス（０．０８Ｍ、ｐＨ６．８）を用いて再懸濁させて、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（５％スタッキングゲル、１時間、３５ｍＡ；１０％泳動ゲル、２．５時間、４０ｍＡ）。試料および標準物質について重複して行った。そのうちの一つをクマシーブルーで染色して、一方をニトロセルロースシート上ににじませて（１２Ｖ、４℃で１６時間）、マウスＭＡｂ４２５（抗ＥＧＦＲ）およびアルカリホスファターゼと抱合させた抗マウスＩｇＧ抗体で処理した。
【００６５】
三つの培地をインビトロ免疫に用いた。培地１（Ｍ１）、培地２（Ｍ２）および混合胸腺細胞培養培地（ＭＴＣ）である。Ｍ１は、５０ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ギブコ）を添加したＨＬ１（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）からなる。Ｍ２は、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール、４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、２０ｍｇ／ｍｌアジュバントペプチド（シグマ）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）を添加したＨＬ１からなる。４％または２０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）をＭ２に加えた。ＭＴＣをＶａｕｘ（１）による記述のようにして調製した。簡単に述べると、３週令のＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ−１マウスの胸腺の単細胞懸濁液を、胸腺を滅菌５０−メッシュスクリーンを加圧して通すことによって調製した。細胞懸濁液を集めて、ＨＢＳＳ中で２回洗浄して、生細胞数をトリパンブルー排除試験によって決定した。次いで、胸腺細胞をそれぞれ１ｍｌ当たり２．５×１０6個の胸腺細胞密度で４％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＨＬ１培地中で培養した。４８時間後、上清を回収して、０．２２ｍｍのフィルターを通して瀘過して、−７０℃で保存した。
【００６６】
非免疫８週令Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞の懸濁液を胸腺細胞と同様にして得た。生存率をトリパンブルー排除試験によって決定した。
【００６７】
［実施例２］ インビトロ免疫およびスクリーニング
インビトロ免疫において三つの培地を用いた。培地１（Ｍ１）、培地２（Ｍ２）および混合胸腺細胞培養培地（ＭＴＣ）である。Ｍ１は、５０ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭＬ−グルタミン（ギブコ）添加ＨＬ１（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）からなる。Ｍ２は、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール、４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、２０ｍｇ／ｍｌアジュバントペプチド（シグマ）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）を添加したＨＬ１からなる。４％または２０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）をＭ２に加えた。ＭＴＣをＶａｕｘ（１）による記述のようにして調製した。簡単に述べると、３週令のＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ−１マウスの胸腺の単細胞懸濁液を、胸腺を滅菌５０−メッシュスクリーンを加圧して通すことによって調製した。細胞懸濁液を集めて、ＨＢＳＳ中で２回洗浄して、生細胞数をトリパンブルー排除試験によって決定した。次いで胸腺細胞をそれぞれ１ｍｌ当たり２．５×１０6個の胸腺細胞密度で４％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＨＬ１培地中で培養した。４８時間後、上清を回収して、０．２２ｍｍのフィルターを通して瀘過して、−７０℃で保存した。
【００６８】
非免疫８週令Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞の懸濁液を胸腺細胞と同様にして得た。生存率をトリパンブルー排除試験によって決定した。
【００６９】
３週令のＢａｌｂ／ｃおよびＣ５７／ＢＬ−１マウスからの胸腺の単細胞懸濁液を、胸腺を滅菌５０−メッシュスクリーンを加圧して通すことによって得た。細胞懸濁液を集めて、ＨＢＳＳ中で洗浄して、生細胞数をトリパンブルー排除試験によって決定した。次いで胸腺細胞をそれぞれ１ｍｌ当たり２．５×１０6個の胸腺細胞密度で４％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＨＬ１培地中で培養した。４８時間後、上清を回収して、瀘過して、保存した。
【００７０】
非免疫８週令Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞の懸濁液を胸腺細胞と同様にして得た。生存率をトリパンブルー排除試験によって決定した。
【００７１】
インビトロ免疫を６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で行った。３．５ｍｌのＭ１培地（５０μＭの２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ギブコ）を添加したＨＬ１培地（Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）からなる）中に１０7個の脾臓細胞を含むウェルを、所望の濃度のＥＧＦＲを有する小胞とともにインキュベートした（３７℃、５％ＣＯ2）。ＥＧＦＲを発現しない細胞からの小胞またはＰＢＳを対照ウェルに加えた。数時間後、４％または１０％のＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含む３．５ｍｌのＭ２培地（５０μＭ２−メルカプトエタノール、４０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、２０μｇ／ｍｌアジュバントペプチド（シグマ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）を添加したＨＬ１からなる）を各ウェルに加えた。いくつかの実験において、Ｍ２をＭＴＣ培地（アジュバントペプチド（２０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（４０Ｕ／ｍｌ）を添加した混合胸腺細胞培養培地（Ｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．、３３６、３６、１９８８））に置き換えた（培養培地中のＦＣＳ、ＩＬ−２およびアジュバントペプチドの最終濃度は５０％減少することを留意されたい）。細胞を同一条件で７２、９６、１２０または１４４時間インキュベートして、最終的に、細胞を特異的免疫グロブリンの存在に関して試験するかＲＮＡ分離のために処理した。
【００７２】
スクリーニングを精製抗原またはＡ４３１固定細胞を用いて行った。本質的には以前に記述された方法（Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、９、８１、１９９０）をいくらか修飾した方法を用いた。簡単に述べると、滅菌９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｘｉｓｏｒｂ）を精製ＥＧＦＲ（２．５μｇ／ｍｌ）、ＧＤ３ガングリオシド（２μｇ／ｍｌ）またはＲＮａｓｅ（１０μｇ／ｍｌ）のＰＢＳ溶液で一晩被覆した。Ａ４３１細胞を抗原として用いた場合、細胞を９６ウェルプレート中で集密状態になるまで培養して、０．１％のグルタルアルデヒドで固定した。インビトロ免疫されたリンパ球を洗浄して、２％ＦＣＳおよび２ｍＭのＬグルタミンを添加したＨＬ１培地中に５×１０5細胞／ｍｌに再懸濁させて、１×１０5個の細胞を各ウェルに加えて、４８時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ2）。各グループとも１６重複を行った。次いで０．１％のツイーン２０を含むＰＢＳを用いて５回洗浄することによってリンパ球を除去した。特異的免疫グロブリンをペルオキシダーゼ標識したウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）を用いて検出した（１時間、３７℃）。基質として、２、２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）（シグマ）のクエン酸塩−リン酸塩緩衝液溶液（０．５５ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
【００７３】
［実施例３］ ライブラリー構築
三つのライブラリーを、Ａ４３１細胞で腹腔内免疫したマウスの脾臓から調製したＲＮＡ（Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５２、５４９、１９８７）、精製ＥＧＦＲで肉踊に免疫したマウスの膝窩リンパ節から調製したＲＮＡおよびＡ４３１小胞でインビトロ免疫したマウス細胞から調製したＲＮＡからそれぞれ構築した。第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＶHおよびＶκ遺伝子をＰＣＲ増幅して、組み立てた（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４、１９９１）。ＰＣＲを用いて、ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩ制限部位を追加して、ｓｃＦｖをファージミドベクターｐＨＥＮ１にクローニングした（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、４１３３、１９、１９９１）。連結混合物を大腸菌に電気穿孔して、得られるコロニーを培地に掻き入れて、ライブラリーストックをつくった（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１、１９９１）。
【００７４】
［実施例４］ ライブラリースクリーニング
ファージ抗体を、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン）を用いてライブラリーから取り出した（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１、１９９１）。イムノチューブ（Ｎｕｎｃ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）を４ｍｌの２．５μｇ／ｍｌのＥＧＦＲのＰＢＳ溶液で一晩被覆した。ＰＢＳで３回洗浄した後、チューブを２％粉乳を含むＰＢＳ（ＰＢＳＭ）中で３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。ファージ（１０12〜１０13）を４ｍｌのＰＢＳＭ中に再懸濁して、ＥＧＦＲ被覆チューブ中で室温で１時間インキュベートした。チューブをＰＢＳ、０．１％ツイーンを用いて２０回、ＰＢＳを用いて２０回洗浄した。結合したファージを、１ｍｌの０．１Ｍトリエチルアミン中で上下に混合しながら１０分間インキュベートした後に溶出させた。溶出したファージを０．５ｍｌの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）を加えて中和して、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１細胞の感染に用いた。感染細胞をプレートにまいてコロニー形成させて、ｓｃＦｖの小規模誘導を示す個々のコロニーを拾いあげた。残りのコロニーを培地に掻き入れて、その液を用いて次の回のスクリーニングのためのファージを調製した。
【００７５】
［実施例５］ ｓｃＦｖの産生および分析
可溶性ｓｃＦｖを上述（例えば、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、前出）のようにして大腸菌ＨＢ２１５１中で産生した。細菌培養上清中のｓｃＦｖ濃度を、既知濃度の精製ｓｃＦｖ調製物を標準として用いて推定した。上清を瀘過して、アジ化ナトリウムを０．１％濃度で加えた。上清および標準液の一連希釈物をイモビロン−ＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｗａｔｆｏｒｄ、英国）上に９６ウェルマニホールドを用いて斑点づけした。フィルターをウェスタンブロット処理した（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７６、４３５０、１９７９）。ｓｃＦｖを、Ｃ末端目印に対する抗体（９Ｅ１０）（Ｍｕｎｒｏ ａｎｄ Ｐｅｌｈａｍ、Ｃｅｌｌ、４６、２９１、１９８６）、続いてペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ペンシルバニア）を用いて検出した。反応を、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、英国）を用いて展開した。予めフラッシュをかけたラジオオートグラフをデンシトメーターを用いて走査した。標準曲線を作成して、上清中のｓｃＦｖ濃度の推定に用いた。
【００７６】
抗原結合ＥＬＩＳＡを、ＥＧＦＲ被覆プレート（２．５μｇ／ｍｌ）を用いて行った。ｓｃＦｖを含む上清をＰＢＳＭ中で希釈して、プレートに加えた。結合したｓｃＦｖを上記のように９Ｅ１０抗体を用いて検出した。また、上清を非関連タンパク質のパネルおよびプラスチックへの結合に関して試験した。ＥＬＩＳＡプレートを、卵白アルブミン、卵リゾチーム、チトクロームｃ、グリセルアルデヒド３−リン酸ヒドロゲナーゼ、ネズミアルブミン（ＣＢＡ株）およびＢＳＡを用いて１００μｇ／ｍｌの濃度で一晩被覆した。２％粉乳を含む非希釈上清を被覆プレートに二重に加えて、結合ｓｃＦｖを上記のようにして検出した。
【００７７】
細胞結合ＥＬＩＳＡを、腫瘍細胞系、Ａ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）、ＭＤＡＭＢ４６８（ＡＴＣＣ ＨＴＢ１３２）およびＳＫ−ＭＥＬ−２３（陰性対照）を用いて行った。細胞を、ポリ−Ｄ−リジン処理した９６ウェル組織培養トレー（Ｎｕｎｃ）中で集密状態になるまで増殖させた。細胞をＤＭＥＭで洗浄して、２．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロック処理した。吸引後、上清を４％粉乳を含む等量の２×ＹＴ培地とともに各ウェルに加えて、４℃で１時間インキュベートした。結合したｓｃＦｖを上記のようにして検出した。
【００７８】
競合に基づくＥＬＩＳＡを、ＥＧＦＲ被覆ＥＬＩＳＡプレートを５０μｌの精製ｓｃＦｖ（１００μｇ／ｍｌ）とともに１０分間予備インキュベートすることによって行った。次いで、マウスＭＡｂ４２５（５０μｌ）を３．１３〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加えた。インキュベートおよび洗浄の後、結合したマウスＭＡｂ４２５を、ペルオキシダーゼ抱合したヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を用いて検出した。
【００７９】
［実施例６］ ＤＮＡ分析
ＢｓｔＮＩフィンガープリント法のために、個々のクローンからのｓｃＦｖ挿入物をＰＣＲによって増幅させて、産生物をＢｓｔＮＩで切断した（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４、１９９１）。ＤＮＡをシンケナーゼキット（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、オハイオ）を用いて配列決定した。
【００８０】
［実施例７］ ｓｃＦｖの精製
細菌培養上清を遠心分離および０．２μｍフィルターを通す瀘過によって清澄にした後、精製ＥＧＦＲ（５ｍｇ）をカップリングさせた１ｍｌの臭化シアン−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）カラム上に供した。カラムを３０ｍｌのＰＢＳ、次いで５ｍｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ５．０）で洗浄した。ｓｃＦｖを０．２Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．８）で溶出した。溶出液を１０×ＰＢＳで中和した。タンパク質含有画分をプールして、緩衝液を限外瀘過（Ａｍｉｃｏｎ、Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、英国）を用いて１％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに交換した。
【００８１】
［実施例８］ 精製ｓｃＦｖのＦＡＣＳ分析
Ａ４３１細胞をトリプシン処理して、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。細胞を冷ＤＭＥＭで２回洗浄して、４５μｍスクリーンを通して瀘過した。細胞（１０6）を５０μｌのＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で精製ｓｃＦｖｓとともに氷上で３０分間インキュベートした。冷ＰＢＳで２回洗浄した後、結合したｓｃＦｖを、５０μｌのＦＩＴＣ−抱合した９Ｅ１０抗体（１００μｇ／ｍｌ）を用いて検出した。氷上に３０分間おいた後、細胞をＰＢＳで１回洗浄して、１％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定して、ＦＡＣＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｃｏｗｌｅｙ、英国）を用いて分析した。
【００８２】
［実施例９］ 全キメラ抗体の構築、分析および発現
ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩ部位を用いて、選択したｓｃＦｖのＶＨをコードするＤＮＡを、ヒト抗体ＨＧ３ＣＬに由来する真核細胞リーダー配列（Ｒｅｃｈａｖｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、８５５、１９８３）およびスプライスドナー部位を含む中間ＶHベクター中にサブクローニングした（第３図）。ＶκをコードするＤＮＡを、ＰＣＲプライマーを用いて中間Ｖκベクターへの挿入のためにＸｈｏＩおよびＳｓｔＩ部位を５’−および３’−末端において組み入れるように改変した。
（ＶκＦｏｒ： ５’−CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CCC−３’
ＶκＢａｃｋ：５’−GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA−３’）
ＳｓｔＩ−ＸｈｏＩフラグメントを改変したヒトＣＡＭＰＡＴＨ−１軽鎖（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、２１，１９８８）に由来する真核細胞リーダー配列およびスプライスドナー部位を含む中間Ｖκベクター中にクローニングした（第３図）。可変部プラス真核細胞フランキング領域をコードするＤＮＡを、ヒトガンマー１定常部またはヒトカッパ定常部をコードするゲノムＤＮＡ（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｏｄｏｍａｓ、２、１２４、１９９１）を含む哺乳動物細胞発現ベクター中にＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローニングした。重鎖および軽鎖発現ベクターを、ＣＯＳ細胞に電気穿孔法で導入した。７２時間後、培地を集めて、キメラ抗ＥＧＦＲ抗体をＥＬＩＳＡによって分析した（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、４、７７３、１９９１）。
【００８３】
［実施例１０］ インビトロ免疫細胞に由来するｓｃＦｖの産生
以下に開示する方法は上記の方法をわずかに修飾したものである。免疫、ライブラリー構築およびスクリーニングは、実施例１〜４に記述する。続くステップを以下に詳述する。
【００８４】
プライマリーライブラリーおよび３回の選別に由来するクローンをスクリーニングした後、いくつかの単離アンピシリン耐性コロニーを選択した。ファージミドＤＮＡをアルカリ溶解によって調製して、非サプレッサー株の大腸菌ＨＢ２１５１に熱ショックによるトランスフェクションに用いた。コロニーを２×ＴＹ−Ａｍｐ−Ｇｌｕ中に接種して、３０℃で一晩増殖させた。その培養液５ｍｌを１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．１％のグルコースを含む２×ＴＹ液体培地５０ｍｌの接種に用いて、３７℃で１時間振盪しながら増殖させた（対数増殖期まで）。細胞を集めて、可溶性ｓｃＦｖの発現をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭになるように添加することによって誘導した（Ｄｅ Ｂｅｌｌｉｓ、Ｄ．ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｉ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、１３１１、１９９０）。培養物を３０℃で一晩振盪しながら増殖させた。ｓｃＦｖを含む上清をとり、遠心分離および０．２２ｍｍフィルターを通す瀘過によって清澄にして、試験した。細菌培養上清をＥＧＦＲへの結合についてＥＬＩＳＡによって記述された方法（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、ＥＰ９４１０４１６０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４、９５２、１９９４）にしたがって試験した。選択されたｓｃＦｖフラグメントの特異性を、ＥＧＦＲ関連および非関連の種々のタンパク質および他の抗原およびプラスチックで被覆したプレートを用いてＥＬＩＳＡによって調べた。用いた抗原は、ＲＮａｓｅ、ＢＳＡ、ＯＶＡ、ＧＤ3ガングリオシド、ビトロネクチンレセプター（ＶＮＲ）、血小板糖タンパク質ＩＩｂＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂＩＩａ）およびジシアリル−ラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）であった。被覆は、各抗原の最適濃度で一晩行った。被覆したＥＬＩＳＡプレートを、１．５％（ｗ／ｖ）脱脂乳ＰＢＳ溶液を用いて３７℃で１時間ブロックした。洗浄後、１００μｌのｓｃＦｖ上清をマイクロタイターウェルに加えて、３７℃で２時間インキュベートした。結合したｓｃＦｖを、抗ｃ−ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（Ｍｙｃ１−９Ｅ１０．２ハイブリッドからの使用済み培地）およびアルカリホスファターゼ抱合ウサギ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ）を用いて検出した。
【００８５】
ＥＧＦＲを有する三つの腫瘍細胞系、すなわちＡ４３１、ＭＤＡＭＢ２３１ヒト乳腺癌腫（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ２６）およびＨＴ２９ヒト結腸腺癌腫（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ３８）、および一つの非発現性ＥＧＦＲ細胞系、ＷＭ１６４、を用いて、ｓｃＦｖの細胞上のＥＧＦＲへの結合能を中間ＦＡＣＳ分析および非固定細胞を用いる免疫蛍光法によって試験した。間接免疫蛍光分析のために、細胞をテラサキプレートに入れて（２×１０4個細胞／ウェル）、２４時間培養した。次いで、細胞をｓｃＦｖフラグメントを含む粗細菌培養上清２０ｍｌとともに室温で９０分間インキュベートした。一次抗体（抗ｃ−ｍｙｃ）および二次抗体とともに室温で６０分間インキュベートした。二次抗体のＦＩＣＴ−抱合ウサギ抗マウス抗体（Ｄａｋｏ）は１：２０に希釈した。
【００８６】
ＦＡＣＳ分析のために、５×１０5個の細胞を１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で洗浄して、５０ｍｌの粗細菌培養上清とともに４℃で２０分間インキュベートした。冷ＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄した後、結合ｓｃＦｖを抗ｃ−ｍｙｃ抗体およびＰＢＳ−ＢＳＡ中で１：２５に希釈したＦＩＴＣ−抱合ヤギ抗マウス抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて検出した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を最終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように加えた。フローサイトメトリー分析を、空冷アルゴンレーザーを備えたＥＰＩＣＳプロフィールＩＩ中で行った。４８８ｎｍの発振線（１５ｍＶ）を励起に用いた。
【００８７】
５３０ｎｍバンドパスフィルターをＦＩＴＣ放出の収集に用い、６２５ｎｍバンドパスフィルターをＰＩ放出の収集に用いた。生細胞を前方および側部散布範囲にビットマップを設定することによっておよびＰＩ染色細胞の排除によって選別した。
【００８８】
プライマリーライブラリーと選択されたライブラリーの相違点を、クローニングしたフラグメントのＰＣＲ増幅（Ｇｕｅｓｓｏｗ、Ｄ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ、Ｔ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７、４０００、１９８９）およびＢｓｔＮＩ切断パターン（８）の分析によって決定した。いくつかのクローンをシークエナーゼキット（ＵＳＢ）を用いてジデオキシ鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７４、５４６３、１９７７）によって配列決定した。
【００８９】
粗細菌培養上清（１０ｍｌ）を、１２．５％ゲル使用のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ウェスタンブロットを、本質的にはＴｏｗｂｉｎ（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７６、４３５０、１９７９）による方法で行った。タンパク質を電気ブロッティングによってイモビロン−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはニトロセルロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。ブロットを２％脱脂乳（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳによってブロックした。ｓｃＦｖフラグメントを、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）、ペルオキシダーゼ−抱合抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）および増強化学発光システム（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。
【００９０】
脱落膜小胞の定量分析によって、全タンパク質濃度２．５ｍｇ／ｍｌのうち、わずかに１０〜１４％、すなわち２５０〜３５０ｎｇ／ｍｌがＥＧＦＲに対応することが明らかになった（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、２１、１６０１、１９８９、Ｙｅａｔｏｎ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８、９２５４、１９８３）。ＰＡＧＥ−ＳＤＳを用いる電気泳動分析とそれに続くクマシーブルー染色によって、小胞がタンパク質のかなり複雑な混合物を含むことが示された。タンパク質分解は検出されなかった。ウェスタンブロット分析によって、本発明者らの実験条件下で、完全なＥＧＦレセプター分子が膜小胞調製物中に存在することが明らかにされた。
【００９１】
ＦＣＳおよびリンホカインの要求を決定するために、ＭＴＣおよび２０％または４％のＦＣＳを含むＭ２を比較した。ＥＧＦＲおよびＰＢＳを有する小胞を、それぞれ抗原と対照として用いた。脾臓細胞を６ウェルプレート中で抗原を添加してまたは添加せずにＭ１（無血清）中で３時間インキュベートした。次いで、ＭＴＣまたはＭ２を加えて、７２、９６、１２０または１４４時間後にＡ４３１固定細胞を用いてスクリーニングを行った。全実験において、回収された生細胞数は２０〜４０％であって、公開された結果（Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ−Ｃｏｗｌｅｙ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｐ．１３１、１９８８）と一致した。最高の特異的応答は、第４日にＭＴＣを用いて得られた。一方、４％または２０％（最終濃度は２％または１０％）のＦＣＳを含むＭ２は最高応答を第６日まで遅延させた（表２）。しかし、結果を特異的／非特異的応答比で表した場合に見られるように、ＭＴＣおよび１０％ＦＣＳは非特異的応答をおそらくはポリクローナル活性化によって誘導した。さらなる分析のために、本発明者らは４％ＦＣＳ添加Ｍ２および６日培養を用いることにした。
【００９２】
小胞表面におけるＥＧＦＲの存在は、この抗原に対する応答を著しく増強した。上記と同様のプロトコールにおいて、発現および非発現ＥＧＦＲ細胞系からの小胞を比較した。リンパ球を小胞とともにＭ１中で３時間培養した。次いで、４％ＦＣＳを含むＭ２を加えた。６日後、各グループからのリンパ球を、ＥＧＦＲ、Ａ４３１−固定細胞、ＲＮａｓｅまたはＧＤ３で被覆した９６ウェルプレート中で４８時間培養した。予期されたように、これらの分析結果は応答の多特異性パターンを示した（表３）。ＥＧＦＲに対する反応性は、ＥＧＦＲ発現小胞を抗原として用いた場合に吸光度として明らかに増加した。
【００９３】
まとめると、これらの結果は、可変部のＰＣＲクローニングに適するＥＧＦＲに対する免疫されたリンパ球のいくつかのプールを生じさせたインビトロ免疫の後に、未熟ではあるが測定可能な抗原依存性応答があったことを示唆する。
【００９４】
１．１×１０5個のクローンのライブラリーを、インビトロ免疫に由来するｓｃＦｖフラグメントをｐＨＥＮ１ファージミドにクローニングした後に得た。このライブラリーは、インビボ免疫によるさらに二つのライブラリーと平衡して得られた。これらファージライブラリーの構築については以前に記述がある（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、ＥＰ９４１０４１６０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４、９５２、１９９４）。
【００９５】
ＥＧＦＲに結合するｓｃＦｖフラグメントを選択するために、ファージをＥＧＦＲ被覆イムノテュープを用いて選別した。溶出したファージを大腸菌のＳｕｐＥ株の再感染に用いた。全部で３回の選択を行った。それぞれの回において、抗原を含まないチューブの試験を平行して行い、バックグランドを算出した。１回目の選別において１．５×１０10個のファージ粒子をイムノチューブに供して、６．６×１０4個を被覆イムノチューブから溶出した。バックグランドからはわずかに２００コロニーしか得られなかった。３回目の選別後では、１×１０11ファージを供して、５．６×１０10個が溶出された。
【００９６】
さらにｓｃＦｖフラグメントを特徴づけするために、発明者らはファージ集団から２２クローンを、選別前、および各選別回後に選択した。
【００９７】
ライブラリーの相違を、クローニングしたフラグメントのＢｓｔＮＩ切断パターンによって分析した。選択前、ライブラリーはきわめて相違しているようだった。最初の回の選択後に由来する結合クローンのフィンガープリントは、同一制限パターンを有するいくつかのグループの存在を示した。
【００９８】
クローンを、それらの切断パターンに基づいて異なる選択回数のものを選んだ。ＤＮＡ配列決定によって、選択クローンのほとんどにおいて異なる配列が存在することが明らかになった。
【００９９】
クローン１０Ｄ２、５Ｄ３、１０Ｅ２、１Ｂ３、４Ｂ３および５Ｅ２の相補性決定領域（ＣＤＲ）の長さおよび構成は異なっていた。ほとんどの違いは、ＶHおよびＶL配列のＣＤＲ３において認められた。クローン５Ｄ３および１Ｅ３は、第３回目の選別に由来した。これらはＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによる分析ではＥＧＦＲに強く結合し、同一の配列を有した。
【０１００】
可溶性ｓｃＦｖフラグメントを、ＩＰＴＧの存在下での非サプレッサー大腸菌株ＨＢ２１５１の増殖によって得た。
【０１０１】
ｓｃＦｖ産生を確実にするために、個々のクローンからの細菌培養培地をゲル電気泳動によって分析した。ウェスタンブロット分析は、約３５、０００ｋＤの明瞭なバンドを示した。
【０１０２】
ＥＧＦＲへの結合活性を有するクローンを、ＥＬＩＳＡで同定した。選択されたクローンの交差反応性を調べるために、異なる抗原を用いるＥＬＩＳＡアッセイを行った。抗原（ＥＧＦＲ、ＲＮａｓｅ、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ＯＶＡ、ＧＤ3ガングリオシド、ビトロネクチンレセプター、血小板糖タンパク質ＩＩｂＩＩＩａおよびジシアリル−ラクト−Ｎ−テトラオース）を最適濃度でＥＬＩＳＡプレートに被覆した（表４）。非ＥＧＦＲ抗原への結合は検出されなかった。ｓｃＦｖをまた、ＥＧＦＲを有する三つの腫瘍細胞系（ヒト上皮性癌腫Ａ４３１、ヒト乳腺腫ＭＤＡＭＢ２３１およびヒト結腸腺腫ＨＴ２９）への結合に関して試験した。ＷＭ１６４ヒト黒色腫非発現ＥＧＦＲを陰性対照として用いた。腫瘍細胞系に結合したものを、非固定細胞を用いる間接免疫蛍光法によって試験して、ＦＡＣＳ分析によって定量した。非固定細胞の使用によって、膜レセプターの天然構造が確かになる。陽性クローンは、Ａ４３１細胞を用いて明瞭な蛍光を示した。ＥＧＦＲを有する他の腫瘍細胞系の蛍光は、弱かった。陰性細胞系への結合は検出されなかった。結果は、フローサイトメトリーによって確認された。１７の陽性クローンおよび三つの陰性クローンをＡ４３１、ＭＤＡ ＭＢ２３１およびＨＴ２９細胞への結合に関してフローサイトメトリーによって分析した。ＷＭ１６４を陰性細胞系として用いた。
【０１０３】
４２５ｓｃＦｖ（Ｐ１クローン）を陽性対照として、クローニングベクター（ＨＥＮ）を陰性対照として用いた。結果を表５に要約する。二つのクローン、４Ｂ２および５Ｅ２はＥＬＩＳＡの分析でＥＧＦＲとの結合に関して陽性であったが、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞系との結合に関しては陰性であった。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
アッセイ１：Ｍ１プラスＭ２、 ４％ＦＣＳ（最終ＦＣＳ： ２％）
アッセイ２：Ｍ１プラスＭ２、 ２０％ＦＣＳ（最終ＦＣＳ：１０％）
アッセイ３：Ａ培地プラスＭＴＣ、 ４％ＦＣＳ（最終ＦＣＳ： ２％）
ａ） ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞（１０7）を、３．５ｍｌのＭ１中で、Ａ４３１細胞由来の小胞またはＰＢＳとともに６ウェルプレート中で３時間インキュベートした。その後、４％または２０％のＦＣＳを含むＭＴＣまたはＭ２を３．５ｍｌを加えて、プレートをインキュベートした。３、４、５または６日目に、インビトロ免疫したリンパ球を培養培地から除去して、ＨＢＳＳ中で洗浄して、小胞を除去して、固定Ａ４３１細胞で被覆した９６ウェルプレートにまいて、４８時間インキュベートした。（方法を参照のこと）
ｂ）培養培地中におけるＦＣＳの最終濃度
ｃ）Ｏ．Ｄ． ４０５ｎｍにおける吸光度。１６ウェルの平均値を表す。
【０１０６】
ｄ）特異的応答（小胞を抗原として）／非特異的応答（ＰＢＳを抗原として）の比。
【０１０７】
【表３】
【０１０８】
ａ） リンパ球をＥＧＦＲ発現小胞（ＥＧＦＲ＋）またはＥＧＦＲ非発現小胞（ＥＧＦＲ−）のいずれかを用いて、インビトロ免疫した。６日間のインキュベーションの後、細胞を培養液から除去して、上記の抗原に対して、スクリーニングした。
【０１０９】
ｂ） 応答を吸光度（４０５ｎｍ）として表す。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
ａ） ＥＬＩＳＡアッセイは、上述のように行った。
【０１１２】
ｂ） ビトロネクチンレセプター（ＶＮＲ）；血小板糖タンパク質IIｂIIIａ（ＧＰIIｂIIIａ）；ジシアリル−ラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】
ａ） 上述するように、ＥＧＦＲを有する三つの細胞系（Ａ４３１、ＭＤＡＡＭＢ２３１およびＨＴ２９）および一つの非発現細胞系（ＷＭ１６４）を用いて、サイトメトリー分析によってｓｃＦｖの腫瘍細胞計への結合能のアッセイを行った。
【０１１５】
ｂ） フラクメントのないベクター（ＨＥＮ）および４２５ＭＡｂ由来のｓｃＦＶフラグメント（ＰＩ）を、それぞれ陰性および陽性対照として用いた。
【０１１６】
【表６】
【０１１７】
【表７】
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
【表１０】
【０１２１】
【表１１】
【０１２２】
【表１２】
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
【表１４】
【０１２５】
【表１５】
【０１２６】
【表１６】
【０１２７】
【表１７】
【０１２８】
【表１８】
【０１２９】
【表１９】
【０１３０】
【表２０】
【０１３１】
【表２１】
【０１３２】
【表２２】
【０１３３】
【表２３】
【０１３４】
【表２４】
【０１３５】
【表２５】
【０１３６】
【表２６】
【０１３７】
【表２７】
【０１３８】
【表２８】
【０１３９】
【表２９】
【０１４０】
【表３０】
【０１４１】
【表３１】
【０１４２】
【表３２】
【０１４３】
【表３３】
【０１４４】
【表３４】
【０１４５】
【表３５】
【０１４６】
【表３６】
【０１４７】
【表３７】
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１−Ａ】第１図は、ファージ−抗体ライブラリーから分離されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖ。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。
【図１−Ｂ】第１図は、ファージ−抗体ライブラリーから分離されたｓｃＦｖのアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖ。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）が示されている。
【図２】第２図は、ＥＧＦＲへのｓｃＦｖの結合を示す説明図である。細菌培養上清中のｓｃＦｖの濃度を推定して、ｓｃＦｖを精製ＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。（Ａ）リンパ節ライブラリーからのｓｃＦｖライブラリー。（Ｂ）脾臓ライブラリーからのｓｃＦｖ。Ｐ１（陽性対照）はＭＡｂ４２５由来のｓｃＦｖである。Ｌ１およびＳ１（陰性対照）はあらかじめ選択したリンパ節および脾臓ライブラリーからの非結合ｓｃＦｖである。
【図３】第３図は、哺乳動物細胞における発現のための可変部を再構築するために用いる中間ベクターの説明図である。（Ａ）ＶHベクター。（Ｂ）Ｖκベクター。
【図４】第４図は、キメラ全抗体のＥＧＦＲへの結合を示す説明図である。ＣＯＳ細胞上清中の抗体の濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、抗体を精製したＥＧＦＲへの結合に関してＥＬＩＳＡによって試験した。
【図５】第５図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ２ １１ＣのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【図６】第６図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ２ １２ＢのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【図７】第７図は、ｓｃＦｖ番号Ｌ３ １１ＤのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【０１４９】
ＦＲおよびＣＤＲのアミノ酸位置は、第６図のものに対応する。
【図８】第８図は、ｓｃＦｖ番号Ｓ４ ２ＤのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す説明図である。（Ａ）軽鎖。（Ｂ）重鎖。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫された哺乳動物に由来する細胞から構築されたファージ−抗体ライブラリーから得られる抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖ。
【請求項２】
免疫されたマウスの細胞から得られる請求項１に記載の抗体フラグメント。
【請求項３】
以下の細胞、すなわち（１）リンパ節（２）脾臓、または（３）インビトロ免疫細胞から得られる請求項１または２に記載の抗体フラグメント。
【請求項４】
重鎖および軽鎖の可変部が配列表の配列ＩＤ番号１〜３２に示される重鎖および軽鎮配列の一つから選択されるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１、２または３に記載の抗体フラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体フラグメントに由来するＤＮＡ配列およびヒト免疫グロブリンの定常部に由来するＤＮＡ配列から構築される抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項６】
重鎖定常部がヒトガンマ−１鎖のアミノ酸配列を含み、軽鎖定常部がヒトカッパ鎖のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖの調製法であって、次のステップからなる。
（１）免疫した哺乳動物細胞、好ましくはマウス細胞からＲＮＡを分離する。
（２）第１鎖ｃＤＮＡを合成する。
（３）免疫した細胞からのｃＤＮＡのＶHおよびＶκ遺伝子を増幅する。
（４）適当な制限部位とともに該遺伝子をファージミドベクターにクローニングする。
（５）連結混合物を用いて原核細胞を形質転換させる。
（６）精製ＥＧＦＲを用いてＥＧＦＲに対するファージ抗体に関してファージライブラリーをスクリーニングする。
（７）所望の一本鎖Ｆｖを宿主原核細胞、好ましくは大腸菌中で産生させる。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって産生された抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントの可変部をコードするＤＮＡを、ヒト免疫グロブリンの定常部をコードするゲノムＤＮＡを含む少なくとも一つの真核細胞発現ベクター中にクローニングして、真核細胞を該ベクターで形質転換して、抗体を発現させて分離することによってなる全抗ＥＧＦＲ抗体の調製法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントまたは請求項５または６に記載の全抗ＥＧＦＲ抗体を含んでなる薬剤組成物。
【請求項１０】
腫瘍に対する薬物の製造または腫瘍成長の診断的探索および評価のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントまたは請求項５または６に記載の全抗ＥＧＦＲ抗体の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫されたマウス細胞より単離されたＲＮＡから構築されたファージ−抗体ライブラリーから得られる抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖであって、
前記免疫されたマウス細胞は、ヒト癌腫細胞系Ａ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）、Ａ４３１細胞由来の脱落膜小胞、精製ヒトＥＧＦＲからなる抗原群から選択される免疫原を用いる免疫により調製されており、但し、ｍＡｂ４２５の産生能を有するマウス細胞以外のマウス細胞であり、
前記抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖは、重鎖および軽鎖の可変部を含んでなり、
（ｉ）該一本鎖Ｆｖは、下記（ｂ）と（ｄ）からなる群から選択され、
（ｂ）Ｌ３ １１Ｄ：配列ＩＤ番号：１０に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１２に記載される重鎖の可変部とからなる一本鎖Ｆｖ；
（ｄ）Ｓ４ ２Ｄ：配列ＩＤ番号：１４に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１６に記載される重鎖の可変部とからなる一本鎖Ｆｖ；
（ii）該一本鎖Ｆｖは、精製されたＥＧＦＲと、ＥＧＦＲを有する腫瘍細胞系Ａ４３１およびＭＤＡ ＭＢ４６８とは結合し、ＥＧＦＲ陰性の黒色腫細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−２３とは結合せず、
（iii）該一本鎖Ｆｖは、ｍＡｂ４２５由来の一本鎖Ｆｖよりも、精製されたＥＧＦＲとの結合能に優れている
ことを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載される抗ＥＧＦＲ一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ分子であって、
該抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖの重鎖および軽鎖の可変部のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、下記（ｂ）と（ｄ）からなる群から選択されている
（ｂ）Ｌ３ １１Ｄ：配列ＩＤ番号：９に記載される軽鎖の可変部をコードする塩基配列と、配列ＩＤ番号：１１に記載される重鎖の可変部をコードする塩基配列とを含んでなる配列；
（ｄ）Ｓ４ ２Ｄ：配列ＩＤ番号：１３に記載される軽鎖の可変部をコードする塩基配列と、配列ＩＤ番号：１５に記載される重鎖の可変部をコードする塩基配列とを含んでなる配列；
ことを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項３】
ヒトＥＧＦＲに対して特異的な反応性を有する、抗ＥＧＦＲキメラ全抗体であって、
該キメラ全抗体は、ＥＧＦＲを発現しているＡ４３１細胞とは結合し、ＥＧＦＲ陰性の黒色腫細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−２３とは結合せず、
前記キメラ全抗体は、下記（ｂ）と（ｄ）からなる群から選択される、重鎖および軽鎖の可変部が、
（ｂ）Ｌ３ １１Ｄ：配列ＩＤ番号：１０に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１２に記載される重鎖の可変部；
（ｄ）Ｓ４ ２Ｄ：配列ＩＤ番号：１４に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１６に記載される重鎖の可変部；
ヒト免疫グロブリン由来の重鎖および軽鎖の定常部に、それぞれ連結されている、部分的ヒト化全抗体分子である
ことを特徴とする抗ＥＧＦＲキメラ全抗体。
【請求項４】
重鎖定常部がヒトガンマ−１鎖のアミノ酸配列を含み、軽鎖定常部がヒトカッパ鎖のアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする請求項３に記載の抗ＥＧＦＲキメラ全抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖの調製法であって、次の工程：
（１）ヒト癌腫細胞系Ａ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）、Ａ４３１細胞由来の脱落膜小胞、精製ヒトＥＧＦＲからなる抗原群から選択される免疫原を用いる免疫により調製されており、但し、ｍＡｂ４２５の産生能を有するマウス細胞以外のマウス細胞である、免疫されたマウス細胞からＲＮＡを分離する；
（２）前記分離されたＲＮＡに基づき、第１鎖ｃＤＮＡを合成する；
（３）該免疫されたマウス細胞由来のｃＤＮＡ中の、ＶHおよびＶκ遺伝子を増幅する；
（４）適当な制限部位とともに、前記ＶHおよびＶκ遺伝子をファージミド・ベクターにクローニングする；
（５）前記工程（４）により得られる連結混合物を用いて、原核細胞を形質転換させて、ファージライブラリーを構築する；
（６）精製ＥＧＦＲを用いて、ＥＧＦＲに対するファージ抗体に関して、該ファージライブラリーをスクリーニングし、ＥＧＦＲに対するファージ抗体をコードしているクローンを選択する；ならびに
（７）該工程（６）で選択されるクローンの遺伝子を宿主原核細胞中で発現させ、所望の一本鎖Ｆｖを産生させる；
を含む
ことを特徴とする調製法。
【請求項６】
請求項３に記載のヒトＥＧＦＲに対して特異的な反応性を有する、抗ＥＧＦＲキメラ全抗体の調製法であって、次の工程：
（１）下記（ｂ）と（ｄ）からなる群から選択される、重鎖および軽鎖の可変部をコードするＤＮＡを調製する；
（ｂ）Ｌ３ １１Ｄ：配列ＩＤ番号：１０に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１２に記載される重鎖の可変部；
（ｄ）Ｓ４ ２Ｄ：配列ＩＤ番号：１４に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１６に記載される重鎖の可変部；
（２）前記重鎖および軽鎖の可変部をコードするＤＮＡを、ヒト免疫グロブリンの定常部をコードするゲノムＤＮＡを含む少なくとも一つの真核細胞発現ベクター中にクローニングして、前記重鎖および軽鎖の可変部を、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常部とがそれぞれ連結されてなる、キメラ型重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を含む真核細胞発現ベクターを構築する；ならびに
（３）該工程（２）で得られるキメラ型重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を含む真核細胞発現ベクターで、真核細胞を形質転換し、該形質転換された真核細胞中で該キメラ全抗体を発現させて、分離する；
を含む
ことを特徴とする調製法。
【請求項７】
請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖ、あるいは請求項３または４に記載の抗ＥＧＦＲキメラ全抗体を、薬理的有効量で、薬剤学的に容認される担体、賦形剤、または希釈剤とともに含んでなる、ヒトＥＧＦＲ発現腫瘍の診断、または治療用途の薬剤組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖ、あるいは請求項３または４に記載の抗ＥＧＦＲキメラ全抗体を、ヒトＥＧＦＲ発現腫瘍の診断、または治療用途の薬剤組成物の製造において、薬理的有効量で含有される、該腫瘍細胞上に発現されるＥＧＦＲと結合可能な抗体成分として使用する方法。
【請求項１】
免疫された哺乳動物に由来する細胞から構築されたファージ−抗体ライブラリーから得られる抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖ。
【請求項２】
免疫されたマウスの細胞から得られる請求項１に記載の抗体フラグメント。
【請求項３】
以下の細胞、すなわち（１）リンパ節（２）脾臓、または（３）インビトロ免疫細胞から得られる請求項１または２に記載の抗体フラグメント。
【請求項４】
重鎖および軽鎖の可変部が配列表の配列ＩＤ番号１〜３２に示される重鎖および軽鎮配列の一つから選択されるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１、２または３に記載の抗体フラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体フラグメントに由来するＤＮＡ配列およびヒト免疫グロブリンの定常部に由来するＤＮＡ配列から構築される抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項６】
重鎖定常部がヒトガンマ−１鎖のアミノ酸配列を含み、軽鎖定常部がヒトカッパ鎖のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖの調製法であって、次のステップからなる。
（１）免疫した哺乳動物細胞、好ましくはマウス細胞からＲＮＡを分離する。
（２）第１鎖ｃＤＮＡを合成する。
（３）免疫した細胞からのｃＤＮＡのＶHおよびＶκ遺伝子を増幅する。
（４）適当な制限部位とともに該遺伝子をファージミドベクターにクローニングする。
（５）連結混合物を用いて原核細胞を形質転換させる。
（６）精製ＥＧＦＲを用いてＥＧＦＲに対するファージ抗体に関してファージライブラリーをスクリーニングする。
（７）所望の一本鎖Ｆｖを宿主原核細胞、好ましくは大腸菌中で産生させる。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって産生された抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントの可変部をコードするＤＮＡを、ヒト免疫グロブリンの定常部をコードするゲノムＤＮＡを含む少なくとも一つの真核細胞発現ベクター中にクローニングして、真核細胞を該ベクターで形質転換して、抗体を発現させて分離することによってなる全抗ＥＧＦＲ抗体の調製法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントまたは請求項５または６に記載の全抗ＥＧＦＲ抗体を含んでなる薬剤組成物。
【請求項１０】
腫瘍に対する薬物の製造または腫瘍成長の診断的探索および評価のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体フラグメントまたは請求項５または６に記載の全抗ＥＧＦＲ抗体の使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫されたマウス細胞より単離されたＲＮＡから構築されたファージ−抗体ライブラリーから得られる抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖであって、
前記免疫されたマウス細胞は、ヒト癌腫細胞系Ａ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）、Ａ４３１細胞由来の脱落膜小胞、精製ヒトＥＧＦＲからなる抗原群から選択される免疫原を用いる免疫により調製されており、但し、ｍＡｂ４２５の産生能を有するマウス細胞以外のマウス細胞であり、
前記抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖは、重鎖および軽鎖の可変部を含んでなり、
（ｉ）該一本鎖Ｆｖは、下記（ｂ）と（ｄ）からなる群から選択され、
（ｂ）Ｌ３ １１Ｄ：配列ＩＤ番号：１０に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１２に記載される重鎖の可変部とからなる一本鎖Ｆｖ；
（ｄ）Ｓ４ ２Ｄ：配列ＩＤ番号：１４に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１６に記載される重鎖の可変部とからなる一本鎖Ｆｖ；
（ii）該一本鎖Ｆｖは、精製されたＥＧＦＲと、ＥＧＦＲを有する腫瘍細胞系Ａ４３１およびＭＤＡ ＭＢ４６８とは結合し、ＥＧＦＲ陰性の黒色腫細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−２３とは結合せず、
（iii）該一本鎖Ｆｖは、ｍＡｂ４２５由来の一本鎖Ｆｖよりも、精製されたＥＧＦＲとの結合能に優れている
ことを特徴とする抗体フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載される抗ＥＧＦＲ一本鎖ＦｖをコードするＤＮＡ分子であって、
該抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖの重鎖および軽鎖の可変部のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、下記（ｂ）と（ｄ）からなる群から選択されている
（ｂ）Ｌ３ １１Ｄ：配列ＩＤ番号：９に記載される軽鎖の可変部をコードする塩基配列と、配列ＩＤ番号：１１に記載される重鎖の可変部をコードする塩基配列とを含んでなる配列；
（ｄ）Ｓ４ ２Ｄ：配列ＩＤ番号：１３に記載される軽鎖の可変部をコードする塩基配列と、配列ＩＤ番号：１５に記載される重鎖の可変部をコードする塩基配列とを含んでなる配列；
ことを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項３】
ヒトＥＧＦＲに対して特異的な反応性を有する、抗ＥＧＦＲキメラ全抗体であって、
該キメラ全抗体は、ＥＧＦＲを発現しているＡ４３１細胞とは結合し、ＥＧＦＲ陰性の黒色腫細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−２３とは結合せず、
前記キメラ全抗体は、下記（ｂ）と（ｄ）からなる群から選択される、重鎖および軽鎖の可変部が、
（ｂ）Ｌ３ １１Ｄ：配列ＩＤ番号：１０に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１２に記載される重鎖の可変部；
（ｄ）Ｓ４ ２Ｄ：配列ＩＤ番号：１４に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１６に記載される重鎖の可変部；
ヒト免疫グロブリン由来の重鎖および軽鎖の定常部に、それぞれ連結されている、部分的ヒト化全抗体分子である
ことを特徴とする抗ＥＧＦＲキメラ全抗体。
【請求項４】
重鎖定常部がヒトガンマ−１鎖のアミノ酸配列を含み、軽鎖定常部がヒトカッパ鎖のアミノ酸配列を含む
ことを特徴とする請求項３に記載の抗ＥＧＦＲキメラ全抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖの調製法であって、次の工程：
（１）ヒト癌腫細胞系Ａ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）、Ａ４３１細胞由来の脱落膜小胞、精製ヒトＥＧＦＲからなる抗原群から選択される免疫原を用いる免疫により調製されており、但し、ｍＡｂ４２５の産生能を有するマウス細胞以外のマウス細胞である、免疫されたマウス細胞からＲＮＡを分離する；
（２）前記分離されたＲＮＡに基づき、第１鎖ｃＤＮＡを合成する；
（３）該免疫されたマウス細胞由来のｃＤＮＡ中の、ＶHおよびＶκ遺伝子を増幅する；
（４）適当な制限部位とともに、前記ＶHおよびＶκ遺伝子をファージミド・ベクターにクローニングする；
（５）前記工程（４）により得られる連結混合物を用いて、原核細胞を形質転換させて、ファージライブラリーを構築する；
（６）精製ＥＧＦＲを用いて、ＥＧＦＲに対するファージ抗体に関して、該ファージライブラリーをスクリーニングし、ＥＧＦＲに対するファージ抗体をコードしているクローンを選択する；ならびに
（７）該工程（６）で選択されるクローンの遺伝子を宿主原核細胞中で発現させ、所望の一本鎖Ｆｖを産生させる；
を含む
ことを特徴とする調製法。
【請求項６】
請求項３に記載のヒトＥＧＦＲに対して特異的な反応性を有する、抗ＥＧＦＲキメラ全抗体の調製法であって、次の工程：
（１）下記（ｂ）と（ｄ）からなる群から選択される、重鎖および軽鎖の可変部をコードするＤＮＡを調製する；
（ｂ）Ｌ３ １１Ｄ：配列ＩＤ番号：１０に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１２に記載される重鎖の可変部；
（ｄ）Ｓ４ ２Ｄ：配列ＩＤ番号：１４に記載される軽鎖の可変部と配列ＩＤ番号：１６に記載される重鎖の可変部；
（２）前記重鎖および軽鎖の可変部をコードするＤＮＡを、ヒト免疫グロブリンの定常部をコードするゲノムＤＮＡを含む少なくとも一つの真核細胞発現ベクター中にクローニングして、前記重鎖および軽鎖の可変部を、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の定常部とがそれぞれ連結されてなる、キメラ型重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を含む真核細胞発現ベクターを構築する；ならびに
（３）該工程（２）で得られるキメラ型重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を含む真核細胞発現ベクターで、真核細胞を形質転換し、該形質転換された真核細胞中で該キメラ全抗体を発現させて、分離する；
を含む
ことを特徴とする調製法。
【請求項７】
請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖ、あるいは請求項３または４に記載の抗ＥＧＦＲキメラ全抗体を、薬理的有効量で、薬剤学的に容認される担体、賦形剤、または希釈剤とともに含んでなる、ヒトＥＧＦＲ発現腫瘍の診断、または治療用途の薬剤組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ一本鎖Ｆｖ、あるいは請求項３または４に記載の抗ＥＧＦＲキメラ全抗体を、ヒトＥＧＦＲ発現腫瘍の診断、または治療用途の薬剤組成物の製造において、薬理的有効量で含有される、該腫瘍細胞上に発現されるＥＧＦＲと結合可能な抗体成分として使用する方法。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１−Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−２５７９４（Ｐ２００６−２５７９４Ａ）
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３３０９３（Ｐ２００５−２３３０９３）
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【分割の表示】特願平７−５２３８４７の分割
【原出願日】平成７年３月１６日（１９９５．３．１６）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【分割の表示】特願平７−５２３８４７の分割
【原出願日】平成７年３月１６日（１９９５．３．１６）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]