抗ＨＣＶ作用を有する化合物およびそれを含む医薬組成物
【課題】 高いＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製阻害活性を有するため、ウイルス感染症、特にＨＣＶの感染による肝臓疾患の予防及び治療に有用な化合物、およびこれらの化合物を含む医薬組成物を提供する。
【解決手段】 式：
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水素原子など；Ｚは、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基など；Ａは、水素原子を表わすか、あるいはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基；Ｂは、水素原子など；Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基など；結合Ｑは、一重結合または二重結合を表す〕で示される化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【解決手段】 式：
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水素原子など；Ｚは、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基など；Ａは、水素原子を表わすか、あるいはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基；Ｂは、水素原子など；Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基など；結合Ｑは、一重結合または二重結合を表す〕で示される化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する高い複製阻害活性を有するため、ウイルス感染症、特にＨＣＶの感染による肝臓疾患の予防及び治療に有用な化合物、およびこれらの化合物を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの感染者は世界で１〜２億人、日本国内では２００万人以上と推測されている。これらの患者の約５０％が慢性肝炎に移行し、そのうち約２０％が感染後３０年以上たって肝硬変、肝癌となる。肝癌の約９０％の原因がＣ型肝炎といわれている。日本国内では、毎年２万人以上の患者がＨＣＶ感染に伴う肝癌により死亡している。
【０００３】
ＨＣＶは、１９８９年に輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された。ＨＣＶはエンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは１本鎖（＋）ＲＮＡからなり、フラビウイルス科のヘパチウイルス（Hepacivirus）属に分類される。
【０００４】
ＨＣＶは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多く、慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため肝癌が再発する患者が多いことも知られている。
【０００５】
よって、Ｃ型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤により炎症を抑える対症療法とは別に、患部である肝臓においてＨＣＶを減らすあるいは根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。
【０００６】
現在、ＨＣＶ排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン療法が知られている。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の１／３程度である。特にＨＣＶ ゲノタイプ１ｂに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフェロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗ＨＣＶ薬の開発が強く望まれている。
【０００７】
近年、リバビリン（Ribavirin：１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用によるＣ型肝炎治療薬として市販されているが、有効率は依然低く、更なる新規なＣ型肝炎治療薬が望まれている。また、インターフェロンアゴニスト、インターロイキン−１２アゴニストなど、患者の免疫力を増強させることによってウイルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見出されていない。
【０００８】
ＨＣＶ遺伝子がクローニングされて以来、ウイルス遺伝子の機構と機能、各ウイルスのタンパク質の機能などについての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト細胞内でのウイルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明されておらず、現在の所、信頼できる培養細胞を用いたＨＣＶ感染実験系は構築されていない。従って従来、抗ＨＣＶ薬の評価をするにあたり他の近縁ウイルスを用いた代替ウイルスアッセイ法を用いなければならなかった。
【０００９】
しかし近年、ＨＣＶの非構造領域部分を用いてインビトロでのＨＣＶ複製を観測することが可能になったことにより、レプリコンアッセイ法によって抗ＨＣＶ薬を容易に評価することができるようになった（非特許文献１）。この系でのＨＣＶ ＲＮＡ複製のメカニズムは、肝細胞に感染した全長ＨＣＶ ＲＮＡゲノムの複製と同一であると考えられている。従って、この系は、ＨＣＶの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づくアッセイ系ということができる。
【００１０】
本願発明者らは、糸状菌類に属する、フザリウム・エスピー（Fusarium sp.）Ｆ１４７６株（以下「Ｆ１４７６株」という）から下記化合物を単離し、該化合物が高いＨＣＶの複製阻害活性を有することを見出した（特許文献１）。なお、該化合物は、国際公開公報ＷＯ９８／５６７５５号（特許文献２）にも開示されており、抗真菌活性および免疫反応阻害作用を有することが知られている。
【化３】
更に本願発明者らは、該化合物およびその誘導体を全合成する方法を開発し、その方法により得られた各種誘導体が同様に優れたＨＣＶ複製阻害活性を有することを見出した（特許文献３）。
【特許文献１】特願２００３−３４０５６号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／５６７５５号パンフレット
【特許文献３】特願２００３−２７２４２０号明細書
【非特許文献１】ブイ・ローマンなど著、サイエンス（Science）、１９９９年、第２８５巻、第１１０−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者は、鋭意研究を行った結果、上記「Ｆ１４７６株」が、上記文献には記載されていない新たな天然化合物群を産生することを見出し、更に本化合物群が非常に強い抗ＨＣＶレプリコン活性、更にはＨＣＶの増幅抑制効果を有し、かつ、インビトロの細胞毒性は軽微であること、そして、抗ＨＣＶ予防／治療剤として極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、高いＨＣＶの複製阻害活性を有するため、ウイルス感染症、特にＨＣＶの感染による肝臓疾患の予防及び治療に有用な化合物、およびこれらの化合物を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、
式（Ｉ）：
【００１４】
【化４】
【００１５】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＺ、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し；
Ｚは、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し；
Ａは、水素原子を表わすか、あるいはヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）で置換されていてもよい炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基を表し；
Ｂは、水素原子、ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）、＝Ｎ−ＯＲ6、＝Ｎ−ＯＨ、ヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）またはオキソ基を表し、ここでＲ4およびＲ5は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表すか、あるいはＲ4とＲ5が一緒になって３〜８員環を表し、Ｒ6は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表し；
Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し（各ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）；
結合Ｑは、一重結合または二重結合を表し；
ただし、Ａが水素原子、またはヒドロキシ基で置換されていないアルケニル基を表す場合は、Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基であるか、あるいは２−ヒドロキシ−ｎ−ヘプチル基である〕
で示される化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩に関する。
【００１６】
更に本発明は、上記式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を含む、医薬組成物にも関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩は、非常に強い抗ＨＣＶレプリコン活性、更にはＨＣＶの増幅抑制効果を有し、更にインビトロの細胞毒性は軽微であるため、ウイルス感染症、特にＣ型肝炎などのＨＣＶ感染症の治療および予防に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書においては、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基とは、所定の炭素数を有する炭化水素基を意味する。炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、ｔ−ブチルを挙げることができる。炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、例えばｎ−ペンチル、ｔ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルなどを挙げることができる。炭素数６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、例えばｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ネオヘキサン−１−イルなどを挙げることができる。炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、ｎ−ヘプチル、５−メチルヘキシル、４，４−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ペンチルなどを挙げることができる。炭素数８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、ｎ−オクチル、イソオクチルなどを挙げることができる。
【００１９】
また直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基とは、所定の炭素数を有し、すくなくとも１つの二重結合を有する炭化水素基を意味する。炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、１−メチル−１−プロペニルなどを挙げることができる。炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、１−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニルなどを挙げることができる。炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、上記のアルケニル基のほか、１−ヘキセニル、２−ヘキセン−１−イル、３−ヘキセン−１−イルなどを挙げることができる。炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、１−ヘプテン−１−イル、２−ヘプテン−１−イルなどを挙げることができる。
【００２０】
また、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基とは、所定の炭素数を有し、少なくとも１つの三重結合を有する炭化水素基を意味する。炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニルなどを挙げることができる。炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基としては、上記のアルキニル基のほか、１−ペンチン−１−イル、２−ペンチン−１−イル、１−ヘキシン−１−イル、２−ヘキシン−１−イル、３−ヘキシン−１−イルなどを挙げることができる。炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基としては、１−ヘプチン−１−イニル、２−ヘプチン−１−イニル、３−ヘプチン−１−イニルなどを挙げることができる。
【００２１】
本明細書において記載されるプロドラッグとは、医薬品として処方された後に、生理的条件下あるいは加溶媒分解によって、式（Ｉ）の化合物又は製薬上許容されうるそれらの塩に変換されうる化学的修飾が施された、式（Ｉ）の化合物の誘導体を意味する。プロドラッグは、患者に投与されたときには不活性であってもよいが、生体内では活性のある式（Ｉ）の化合物に変換されて存在するものである。当該プロドラッグとしては、例えば、本化合物のカルボン酸部分においてＣ1-6アルキルエステル化、Ｃ6-10アリールエステル化、Ｃ1-6アルキルオキシＣ1-6アルキルエステル化（下式）、Ｃ1-6アルコキシエステル化、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキルエステル化（下式）などを施した化合物が含まれる。
【００２２】
【化５】
【００２３】
本明細書において記載される製薬上許容されうるそれらの塩とは、薬理学的に許容されるものであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。
【００２４】
また、本明細書において記載される治療という語は、本発明の医薬組成物を被験者に投与することによって、ＨＣＶを消滅あるいは軽減させること、さらなるＨＣＶの広がりを抑制すること、ＨＣＶの感染による症状を軽減することを意味する。ＨＣＶの感染による症状としては、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。
【００２５】
本発明の化合物について以下に詳細に記載する。
本発明の式（Ｉ）の化合物は、上記に示す式で示されるものであり、この式（Ｉ）においては、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＺ、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、ここでＺは、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3としては、ヒドロキシ基または−ＯＺ基が好ましく、ヒドロキシ基が特に好ましい。また、−ＯＺ基としては、具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ビニルオキシ、１−プロペン−１−イルオキシ、アリルオキシ、１−ブテン−１−イルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピン−１−イルオキシ、１−ブチン−１−イルオキシなどの基を挙げることができる。
【００２６】
本発明の式（Ｉ）の化合物においては、Ａは、水素原子を表すか、あるいはヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）で置換されていてもよい炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基を表す。Ａは、好ましくは３−メチル−２−ブテン−１−イル基または４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテン−１−イル基である。
【００２７】
本発明の式（Ｉ）の化合物においては、Ｂは、水素原子、ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）、＝Ｎ−ＯＲ6、＝Ｎ−ＯＨ、ヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）またはオキソ基を表し、ここでＲ4およびＲ5は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表すか、あるいはＲ4とＲ5が一緒になって３〜８員環を表し、Ｒ6は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表す。Ｒ4とＲ5が一緒になって表す３〜８員環は、Ｒ4およびＲ5が結合している窒素原子のほか、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を環原子として含有していてもよい３〜８員の単環または二環の飽和または不飽和炭素環を表し、このような環としては、例えばピペリジン、ピペラジン、モルホリンなどの環を挙げることができる。
【００２８】
本発明の式（Ｉ）の化合物においては、Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、各ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい。Ｃは、好ましくは１−ヘプテニル基、２−ヘプテン−１−イル基、ｎ−ヘプチル基、１−ヒドロキシ−２−ヘプテン−１−イル基、または２−ヒドロキシ−ｎ−ヘプチル基である。
本発明の式（Ｉ）の化合物においては、結合Ｑは、一重結合または二重結合を表す。好ましくは、結合Ｑは、二重結合である。
【００２９】
本発明の好ましい式（Ｉ）の化合物としては、以下の化合物を挙げることができる。
【００３０】
【化６】
【００３１】
上記の好ましい式（Ｉ）の化合物のうち、なかでもＲ1、Ｒ2、及びＲ3が、それぞれヒドロキシ基または−ＯＺ基であり、ここでＺは、式（Ｉ）に記載のとおりである化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を挙げることができる。さらに、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が、それぞれヒドロキシ基である下記の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を特に好ましく挙げることができる。
【００３２】
【化７−１】
【００３３】
【化７−２】
【００３４】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、糸状菌類に属し、上記化合物１〜７を産生することができる菌株、例えば、フザリウム・エスピー（Fusarium sp.）Ｆ１４７６株（以下「Ｆ１４７６株」という）などを培養し、単離された化合物を必要に応じて修飾することにより得ることができる。この上記Ｆ１４７６株の生理学的性質は、下記に示すとおりである：
【００３５】
生育温度範囲は、１０〜３０℃であり、好ましくは、２０〜３０℃である。
生育可能pH範囲は、３〜１１であり、好ましくは、５〜７である。
Ｆ１４７６株は、Fusarium sp. F 1476と表示し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、２００３年２月４日付で、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９０として寄託されている。
【００３６】
本発明においては、上記Ｆ１４７６株の他に、Ｆ１４７６株の自然または人工的な突然変異体、あるいはフザリウム属などの糸状菌類に属するその他の菌種などであって、Ｆ１４７６株と同様の産生能を有する微生物を使用することができる。
【００３７】
本発明においては、上記Ｆ１４７６株を、栄養源含有培地に接種し、これを培養することによって培養物を得ることができる。上記栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、サッカロース、澱粉、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸などを挙げることができる。
【００３８】
上記栄養源のうち、窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩などの有機窒素化合物、無機窒素化合物などを挙げることができる。
【００３９】
上記栄養源のうち、塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類などを挙げることができる。これらは、単独で使用されてもよく、適宜組み合わせて使用されてもよい。
上記栄養源は、単独か又は適宜組み合わせて使用することができる。
【００４０】
上記栄養源含有培地には、必要に応じ、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩などの重金属塩；ビオチン、ビタミンＢ1などのビタミン類；その他、菌の生育を助け、本発明化合物の産生を促進する有機物、無機物などを適宜添加することができる。
【００４１】
上記栄養源含有培地には、上記栄養源の他に、更に必要に応じて、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの消泡剤、界面活性剤などを添加することができる。
【００４２】
本発明化合物を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、生理活性物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される、固体培養法、液体培養法などの培養方法を採用することができる。
【００４３】
上述の培養方法によって、本発明化合物は、培養物中に蓄積される。本発明においては、培養物中に蓄積された化合物を、公知の方法により、培養物中から分離した後、必要に応じて更に精製することができる。
【００４４】
上記分離は、培養物全体を、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ブタノール、メチルイソブチルケトンなどの非親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる。また、培養物を濾過又は遠心分離によって培養液と菌体とに分離した後、培養液、菌体のそれぞれから分離することもできる。
【００４５】
上記分離した培養液から本発明化合物を分離するには、上記非親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、培養液中の上記化合物を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用することもできる。
【００４６】
上記担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性樹脂などを挙げることができる。上記溶媒としては、担体の種類、性質などによって適宜１種又は２種以上を組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類などの水溶性有機溶媒の含水溶液などを適宜組み合わせたものなどを挙げることができる。
【００４７】
上記分離した菌体から本発明化合物を分離するには、アセトンなどの親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することができる。
【００４８】
本発明においては、このようにして培養物中から分離された本発明化合物の粗抽出物を、必要に応じて、更に精製する工程に付することができる。
【００４９】
上記精製は、脂溶性生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などを挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、水などを挙げることができ、これらは２種以上を併用することができる。
【００５０】
上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基などが結合した化学結合型シリカゲル；ポリスチレン系ポーラスポリマーゲルなどを挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノール、含水アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒の含水溶液などを使用することができる。
【００５１】
本発明の化合物は、上記のように化合物１〜７を産生する菌株を培養し、その後培養物から上記の化合物１〜７を単離することにより製造することができる。更に、上記の単離された化合物を出発物質として下記に記載の方法を用いて、種々の誘導体を得ることができる。
製法１
上記単離された化合物を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、バラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケルなどの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することにより、ジヒドロ体（Ｑが一重結合である化合物、または他の炭素鎖の二重結合がジヒドロ化された化合物）を得ることができる。
製法２
上記単離された化合物を、メタノール、エタノール、プロパノール、テトラヒドロフランなどの溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ジエチルアルミニウムナトリウム、水素化アルニミウムリチウムなどの還元剤の存在下、室温または冷却条件下で還元することにより、アルコール体（Ｂがヒドロキシ基である化合物など）を得ることができる。
製法３
上記単離された化合物を、メタノール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、水などの溶媒中、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの存在下、室温または冷却条件下で処理することにより、脱アルケニル化体（Ａが水素である化合物など）を得ることができる。更に、この脱アルケニル化された化合物を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケル、酸化白金などの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりジヒドロ体（Ｑが一重結合であり、かつＡが水素である化合物など）を得ることができる。
製法４
上記脱アルケニル化体化合物を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウムなどの塩基の存在下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフランなどの溶媒中、室温または加熱条件下で、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリル、ハロゲン化アルキニルなどのアルキル、アルケニルまたはアルキニル化剤で処理することにより、所望のテトラアルキル、テトラアルキニルまたはテトラアルケニル化体（Ａがアルキル、アルケニルまたはアルキニルである化合物、および／またはＺがアルキル、アルキニルまたはアルケニルである化合物）を合成することができる。
また、上記単離された化合物を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウムなどの塩基の存在下、メタノール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、水などの溶媒中、室温または加熱条件下、アルキル、アルキニルまたはアルケニル化剤で処理することにより、アルキル、アルキニルまたはアルケニル化体（Ａがアルキル、アルキニルまたはアルケニルである化合物など）を合成することができる。
製法５
上記単離された化合物と各種アミンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフランなどの溶媒中で、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンなどの塩基の存在下で、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などの縮合剤で処理することにより、室温または加熱条件下で、対応するトリアミド体（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝アミノ基である化合物など）を得ることができる。
【００５２】
製法６
上記単離された化合物を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケル、酸化白金などの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりテトラヒドロ体（Ｑが一重結合である化合物など）を得ることができる。
製法７
上記単離された化合物を、テトラヒドロフラン、ＤＭＦおよびジクロロメタンなどの溶媒中、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの縮合剤により所望の基Ｚを有する各種のアルコール（Ｚ−ＯＨ）と反応させることによって、室温または加熱条件下で、対応するトリエステル体（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝ＯＺである化合物など）を得ることができる。あるいは、上記単離された化合物をメタノールおよびジクロロメタンなどの混合溶媒中、アミドジヒドロ体トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＣＨＮ2）などで処理し、トリメチルエステル体（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝ＯＣＨ3）である化合物を得ることができる。
製法８
製法７で得られたトリメチルエステル体をメタノール、エタノールおよびブタノールなどの溶媒中で４−トルエンスルホニルヒドラジドなどのヒドラジン誘導体で処理することにより、室温または加熱条件下で、対応するヒドラジド体を得、本ヒドラジド体をカテコールボランなどの還元剤で処理した後、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基の存在下、エタノール、メタノールおよび水などの溶媒中、室温または加熱条件下で、脱ケト体（Ｂが水素である化合物）を得ることができる。
製法９
上記単離された化合物とヒドロキシルアミンまたは各種Ｏ−置換ヒドロキシルアミンをピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの存在下で、室温または加熱条件下で処理することにより対応するオキシムエーテルおよびオキシム体（Ｂが＝Ｎ−ＯＲ6および＝Ｎ−ＯＨである化合物など）を得ることができる。ここでＲ6は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表す。
製法１０
上記単離された化合物を、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルムなどの溶媒中、三フッ化Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ硫黄（ＤＡＳＴ）などで処理し、ハロゲン化体（Ｂがフッ素などのハロゲンである化合物など）を得ることができる。
製法１１
上記単離された化合物と各種アミンをエタノール、メタノールおよびテトラヒドロフランなどの溶媒中で、中性または弱酸性条件下で、室温または加熱条件下で、水素化シアノホウ素ナトリウムまたは水素化トリアセトキシホウ素ナトリウムなどの還元剤で処理することにより、還元的アミノ化を行い、対応するアミン体（Ｂ＝−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）である化合物など）を得ることができる。ここでＲ4およびＲ5は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表すか、もしくはＲ4とＲ5が一緒になって３〜８員環を表す。
上記の製法は、目的とする式（Ｉ）の化合物に応じて、適宜組み合わせて実施することができる。
【００５３】
このようにして得られる本発明の式（Ｉ）の化合物は、そのまま、もしくはそのプロドラッグとして、または製薬的に許容されうる塩として、医薬組成物とすることができる。本医薬組成物に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％である。
【００５４】
本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩は、常法に従って、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて、経口投与、組織内投与、局所投与、経直腸的投与などに適した剤型に製剤化することができる。また、上記の補助剤のほか、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの補助剤、および他の医薬品を含有させることもできる。
経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、糖衣剤、丸剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、末剤、散剤、飲用液剤、その他の剤型を挙げることができる。更に錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、または多層錠とすることができる。錠剤の形態に調製するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。このような担体としては、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが例示できる。
丸剤の形態に調製するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。このような担体としては、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン寒天などの崩壊剤などが例示できる。
これら経口投与用製剤は、固形、粉末または液剤の用量単位で投与することができる。
【００５５】
組織内投与に適した剤型としては、注射剤を挙げることができる。
注射剤として調製する場合には、溶液、乳剤および懸濁剤などの形態とすることができる。これらは、殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましい。これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に調製するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものを使用することができる。このような希釈剤としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを用いることができる。また、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース、またはグリセリン、および通常の溶解補助剤、緩衝剤、ｐH調整剤、無痛化剤なども配合することができる。これら溶液、乳剤および懸濁剤は、本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩の一定量を、上述のような水性や油性の非毒性の希釈剤に溶解または懸濁し、更に必要に応じて等張化剤などを加え、滅菌することにより調製することができる。これら注射剤は、皮下、筋肉内または静脈内に投与することができる。
局所投与に適した剤型としては、例えば、局所用液剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤を挙げることができる。これらは、本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより調製することができる。
経直腸的投与に適した剤型としては、坐剤を挙げることができる。坐剤の形態に調製するに際しては、基材としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。このような基材としては、例えばパルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、高級アルコール類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、ゼラチン、半合成グリセリド、これらの混合物などの低融点基材を挙げることができる。座剤は、本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を上記のような基材に混入し、成型することにより調製することができる。
【００５６】
上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。
【００５７】
本発明の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を医薬として投与する場合、抗ウイルス剤としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で決定することができ、通常は、ヒト成人に対しては、有効成分量として、一日当たり、１〜２０００mgの範囲である。患者の状態などに応じて、上記範囲未満または上記範囲を超える用量を投与することもできる。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
フザリウム属の菌株Ｆ１４７６株の斜面培養から一白金耳を、１００mlの液体培地（グルコース２％、グリセロール１．５％、ポテトスターチ１％、ポリペプトン０．２５％、イーストエクストラクト０．３５％、炭酸カルシウム０．５％、塩化ナトリウム０．３％、硫酸亜鉛７水和物０．００５％、硫酸銅５水和物０．０００５％、塩化マンガン４水和物０．０００５％、トーストソーヤ１％）を入れた５００ml容の臍つき三角フラスコ４００本に接種し、２５℃、３日間振とう培養し(振とう２２０rpm)、種培養液を得た。この種培養液１６mlを固体培地（玄米５０ｇ、SF1溶液（イーストエクストラクト０．２％、酒石酸ナトリウム０．１％、リン酸２水素カリウム０．１％）１８ml）を入れた５００ml容の臍つき三角フラスコ４００本に接種し、２７℃で１０日間静置培養を行った。このように培養した培養物にメタノール４０Ｌを加え、１晩浸潤、放置後ろ過した。沈殿にメタノール２０Ｌを加え、１晩放置後ろ過した。このようにして得られたメタノール抽出液をあわせて濃縮後、水３Ｌに懸濁し、水酸化ナトリウム水溶液にてpHを６．３に調整した後、酢酸エチル３Ｌで抽出した。この水層を塩酸にてpHを２．２に調整した後に、酢酸エチル３Ｌで抽出した。水層は再度２Ｌの酢酸エチルで抽出し、一回目の抽出物と合わせ、濃縮乾固した。この抽出物を酢酸エチル５００mlに溶解し、水５００mlを添加して、水酸化ナトリウム水溶液でｐHを１０に調整後分配を行った。酢酸エチル層には３００mlの水を加え、水酸化ナトリウム水溶液でpHを１０に調整後分配を行った。これら分配操作で得られた水層をあわせて、塩酸にてｐHを２．１に調整後、５００mlおよび３５０mlの酢酸エチルで順次抽出した。このようにして得られた酢酸エチル抽出液（８５０ml）を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮乾固し、粗抽出物１１．４ｇを得た。
【００５９】
これを５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、下記に示す条件１のＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィーによって、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７および化合物６を含む分画を得た。これらを濃縮乾固した後、メタノールに溶解し、下記に示す条件２で分取ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィーを繰り返すことによって化合物１および化合物２を含む分画(フラクション１、９．９mg)、化合物４および化合物５を含む分画(フラクション２、５mg)、化合物３を含む分画(フラクション３、０．７mg)、化合物７を含む分画(フラクション４、１０mg)、化合物６を含む分画(フラクション５、５mg)を得た。フラクション１を下記に示す条件３で分取ＣＮ高速液体クロマトグラフィーに繰り返し付すことによって化合物１を含む分画(フラクション１−１)および化合物２を含む分画(フラクション１−２)を得た。フラクション１−１、１−２および３を減圧濃縮することにより、それぞれ、２．０mgの化合物１、４．２mgの化合物２および０．７mgの化合物３を無色タール状物質として得た。
【００６０】
条件１：ＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィーの条件
カラム：２５０ｇのＯＤＳ充填剤（ウォーターズ社製、Preparative C18, 125A Bulk Packing Material）を内径５．５cm、長さ５０cmのガラスカラムに、充填剤高さ２４cmになるように、乾燥状態で充填した。これに、０．０１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを通搭し、充填剤を湿潤させた後、０．０１％のトリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水を通搭することで、平衡化した。
サンプルの添加および溶出：１１．４ｇのサンプルを１００mlの５０％アセトニトリル水に溶解し、カラム上端に添加した。次いで、０．０１％トリフルオロ酢酸を加えた５０％、６０％、７０％、８０％のアセトニトリル水を、それぞれ２Ｌづつ添加し、化合物を溶出させた。
【００６１】
条件２：分取ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィーの条件
装置：CCPP-D、MCPD-3600システム（東ソー）
カラム：CAPCELL PAK C18 (UG８０，20 mm x 250 mm) (資生堂製)
移動相：０．０１％トリフルオロ酢酸を含有する水と０．０１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルによる溶媒グラジエント溶出（１５％アセトニトリル〜９８％アセトニトリル、ステップワイズ）
【００６２】
条件３：分取ＣＮ高速液体クロマトグラフィーの条件
装置：３０６、８１１Ｃ、８０６ システム（ギルソン）
カラム：CAPCELL PAK ＣＮ (ＳＧ１２０，20 mm x 250 mm) (資生堂製)
移動相：０．１％ギ酸添加４０％アセトニトリル水（イソクラティック溶出）
【００６３】
化合物１の物理化学的性状
【化８】
分子量 ６７５
ESI（LC/MSポジティブモード）６７６（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６７４（M−H-)
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.25-1.40(12H, m)、1.50(2H, m)、1.73(3H, s)、1.77(3H, s)、1.95-2.20(4H, m)、2.56(1H, d, J=16.5Hz)、2.85(1H, d, J=16.5Hz)、2.93(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.14(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.19(1H, d, J=8Hz)、3.38(1H, m)、4.17(1H,dd,J=6,9Hz)、4.48(2H, d, J=6Hz)、4.62(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.34(1H, m)、5.42(1H, m)、5.54(3H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.10(2H, d, J=9Hz)
【００６４】
化合物２の物理化学的性状
【化９】
分子量 ６７５
ESI（LC/MSポジティブモード）６７６（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６７４（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.40(14H, m)、1.53(4H, m)、1.73(3H, s)、1.98(2H, m)、2.41(4H, m)、2.57(1H, d, J=16.5Hz)、2.83(1H, d, J=16.5Hz)、2.91(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.15(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.19(1H, d, J=8Hz)、3.99(2H,s)、4.57(2H, d, J=6Hz)、4.62(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.53(2H, m)、5.70(1H, m)、6.80(2H, d, J=9Hz)、7.11(2H, d, J=9Hz)
【００６５】
化合物３の物理化学的性状
【化１０】
分子量 ６５７
ESI（LC/MSポジティブモード）６５８（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６５６（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.90(3H, t, J=7Hz)、1.25-1.35(10H, m)、1.48(2H, m)、1.55(2H, m)、1.73(3H, s)、1.77(3H, s)、1.97(2H, m)、2.23(2H, m)、2.57(2H, t, J=8Hz)、2.57(1H, d, J=16.5Hz)、2.85(1H, d, J=16.5Hz)、2.92(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.14(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.19(1H, d, J=8Hz)、4.47(2H, d, J=6Hz)、4.62(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.43(1H, m)、5.52(2H, m)、6.10(1H, d, J=16Hz)6.78(2H, d, J=9Hz)、6.92(1H, dt, J=16, 7.5Hz)、 7.11(2H, d, J=9Hz)
【００６６】
実施例２
実施例１で得られた分画(フラクション２、５mg)を更に下記に示す条件４で分取Ｐｈｅｎｙｌ高速液体クロマトグラフィーに付すことによって化合物４を含む分画（フラクション２−１）と化合物５を含む分画（フラクション２−２）を得た。フラクション２−１および２−２を減圧濃縮することにより、それそれ、１．１mgの化合物４および０．６mgの化合物５を無色タール状物質として得た。
【００６７】
条件４：分取Ｐｈｅｎｙｌ高速液体クロマトグラフィーの条件
装置：３０６、８１１Ｃ、８０６ システム（ギルソン）
カラム：YMC PAK Ph (120A，20 mm x 250 mm) (ワイエムシー製)
移動相：０．１％ギ酸添加４８％アセトニトリル水（イソクラティック溶出）
【００６８】
化合物４の物理化学的性状
【化１１】
分子量 ６７５
ESI（LC/MSポジティブモード）６７６（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６７４（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.40(14H, m)、1.53(4H, m)、1.83(3H, s)、1.96(2H, m)、2.42(4H, m)、2.57(1H, d, J=16.5Hz)、2.89(1H, d, J=16.5Hz)、2.91(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.15(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.20(1H, d, J=8Hz)、4.13(2H, s)、4.50(2H, d, J=6Hz)、4.63(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.50(1H, m)、5.52(2H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.10(2H, d, J=9Hz)
【００６９】
化合物５の物理化学的性状
【化１２】
分子量 ６７５
ESI（LC/MSポジティブモード）６７６（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６７４（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.35(12H, m)、1.42(4H, m)、1.52(2H, m)、1.73(3H, s)、1.77(3H, s)、1.96(2H, m)、2.40-2.50(4H, m)、2.57(1H, d, J=16.5Hz)、2.80(1H, d, J=16.5Hz)、2.91(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.15(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.20(1H, d, J=8Hz)、4.00(1H, s)、4.47(2H, d, J=6Hz)、4.63(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.43(1H, m)、5.52(2H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.10(2H, d, J=9Hz)
【００７０】
実施例３
実施例１で得られた分画(フラクション４、１０mgおよびフラクション５、５mg)を更に下記に示す条件５で、それぞれ、分取ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィー(中性)に付すことによって、フラクション４からは化合物７を含む分画（フラクション４−１）と、フラクション５からは化合物６を含む分画（フラクション５−１）を得た。フラクション４−１および５−１を減圧濃縮することにより、それそれ、１mgの化合物７および１mgの化合物６を無色タール状物質として得た。
条件５：分取ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィー(中性)の条件
装置：３０６、８１１Ｃ、８０６ システム（ギルソン）
カラム：Mightysil RP18 GP (５μm，20 mm x 50 mm) (関東化学製)
移動相：水、アセトニトリルおよび１００mMの酢酸アンモニウムを含有する水の３液による溶媒グラジエント溶出（１５％アセトニトリル〜８０％アセトニトリル、酢酸アンモニウム最終濃度１０mM）
【００７１】
化合物６の物理化学的性状
【化１３】
分子量 ６５９
ESI（LC/MSポジティブモード）６６０（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６５８（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.40(14H, m)、1.72(3H, s)、1.77(3H, s)、1.98(2H, m)、2.04(2H, m)、2.19(2H, m)、2.51(1H, d, J=16.5Hz)、2.79(1H, d, J=16.5Hz)、2.97(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.11(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.18(1H, m)、3.52(1H, m)、4.46(2H, d, J=6Hz)、4.50(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.43(3H, m)、5.57(2H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.10(2H, d, J=9Hz)
【００７２】
化合物７の物理化学的性状
【化１４】
分子量 ６５９
ESI（LC/MSポジティブモード）６６０（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６５８（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.40(16H, m)、1.73(3H, s)、1.77(3H, s)、1.98(4H, m)、2.52(1H, d, J=16.5Hz)、2.79(1H, d, J=16.5Hz)、2.96(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.11(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.18(1H, m)、4.35(1H、m)、4.46(2H, d, J=6Hz)、4.51(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.29(1H、m)、5.43(2H, m)、5.57(2H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.13(2H, d, J=9Hz)
【００７３】
試験例１
レプリコンアッセイ
ＨＣＶ−ＲＮＡのコピー数を定量するためにＨＣＶ−ＲＮＡの中にレポーター遺伝子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを構築した。Kriegerら（J. Virol.75:4614）の方法に従い、ＨＣＶ遺伝子のＩＲＥＳ（Internal Ribosome Entry Site）の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。インビトロで当該ＲＮＡを合成後、エレクトロポレーション法でＨｕｈ７細胞に導入し、Ｇ４１８耐性クローンとして単離した。ホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞（３−１）を５％ウシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03）を含むダルベッコＭＥＭ（Gibco cat. no. 10569-010）に懸濁し、９６穴プレートに５０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ2 ３７℃で一夜培養した。約２０時間後、希釈した試験化合物をウェルあたり１０μl加え、更に３日間培養した。アッセイプレートを２系統用意し、１つは白色プレート、他はクリアープレートでアッセイを行った。培養終了後、白色プレートはSteady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）に用いた。すなわち、ウェルあたり１００μlの試薬を入れ、３〜４回ピペットで混ぜ、５分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX（WALLAC）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、試験化合物未添加の値を阻害０％として薬剤のＩＣ50（５０％阻害濃度）を算出した。
【００７４】
試験例２
細胞毒性試験
細胞毒性の測定にはCell counting kit-8（同人堂カタログNo. CK04）を用いた。すなわち、１０μlのCell counting kit-8をクリアープレートに添加し、３７℃で３０〜６０分間保温した。９６穴プレートリーダーにて波長４５０nm、対照波長６３０nmで吸光度を測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害０％として薬剤のＣＣ50（５０％細胞阻害濃度）を算出した。
試験例１および２の結果を以下に示す。
【００７５】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する高い複製阻害活性を有するため、ウイルス感染症、特にＨＣＶの感染による肝臓疾患の予防及び治療に有用な化合物、およびこれらの化合物を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶの感染者は世界で１〜２億人、日本国内では２００万人以上と推測されている。これらの患者の約５０％が慢性肝炎に移行し、そのうち約２０％が感染後３０年以上たって肝硬変、肝癌となる。肝癌の約９０％の原因がＣ型肝炎といわれている。日本国内では、毎年２万人以上の患者がＨＣＶ感染に伴う肝癌により死亡している。
【０００３】
ＨＣＶは、１９８９年に輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスとして発見された。ＨＣＶはエンベロープを有するＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは１本鎖（＋）ＲＮＡからなり、フラビウイルス科のヘパチウイルス（Hepacivirus）属に分類される。
【０００４】
ＨＣＶは、いまだ明らかでない原因により宿主の免疫機構を回避するため、免疫機構の発達した大人に感染した場合でも持続感染が成立することが多く、慢性肝炎、肝硬変、肝癌へと進行し、手術により摘出しても、非癌部で引き続き起こる炎症のため肝癌が再発する患者が多いことも知られている。
【０００５】
よって、Ｃ型肝炎の有効な治療法の確立が望まれており、その中でも、抗炎症剤により炎症を抑える対症療法とは別に、患部である肝臓においてＨＣＶを減らすあるいは根絶させる薬剤の開発が強く望まれている。
【０００６】
現在、ＨＣＶ排除の唯一の有効な治療法としてインターフェロン療法が知られている。しかしインターフェロンが有効な患者は、全患者の１／３程度である。特にＨＣＶ ゲノタイプ１ｂに対するインターフェロンの奏効率は非常に低い。従って、インターフェロンに代わる、もしくはそれと併用し得る抗ＨＣＶ薬の開発が強く望まれている。
【０００７】
近年、リバビリン（Ribavirin：１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシアミド）がインターフェロンとの併用によるＣ型肝炎治療薬として市販されているが、有効率は依然低く、更なる新規なＣ型肝炎治療薬が望まれている。また、インターフェロンアゴニスト、インターロイキン−１２アゴニストなど、患者の免疫力を増強させることによってウイルスを排除する手段も試みられているが、いまだ有効とされる薬剤は見出されていない。
【０００８】
ＨＣＶ遺伝子がクローニングされて以来、ウイルス遺伝子の機構と機能、各ウイルスのタンパク質の機能などについての分子生物学的解析は急速に進展したが、ホスト細胞内でのウイルスの複製、持続感染、病原性などのメカニズムは十分に解明されておらず、現在の所、信頼できる培養細胞を用いたＨＣＶ感染実験系は構築されていない。従って従来、抗ＨＣＶ薬の評価をするにあたり他の近縁ウイルスを用いた代替ウイルスアッセイ法を用いなければならなかった。
【０００９】
しかし近年、ＨＣＶの非構造領域部分を用いてインビトロでのＨＣＶ複製を観測することが可能になったことにより、レプリコンアッセイ法によって抗ＨＣＶ薬を容易に評価することができるようになった（非特許文献１）。この系でのＨＣＶ ＲＮＡ複製のメカニズムは、肝細胞に感染した全長ＨＣＶ ＲＮＡゲノムの複製と同一であると考えられている。従って、この系は、ＨＣＶの複製を阻害する化合物の同定に有用な細胞に基づくアッセイ系ということができる。
【００１０】
本願発明者らは、糸状菌類に属する、フザリウム・エスピー（Fusarium sp.）Ｆ１４７６株（以下「Ｆ１４７６株」という）から下記化合物を単離し、該化合物が高いＨＣＶの複製阻害活性を有することを見出した（特許文献１）。なお、該化合物は、国際公開公報ＷＯ９８／５６７５５号（特許文献２）にも開示されており、抗真菌活性および免疫反応阻害作用を有することが知られている。
【化３】
更に本願発明者らは、該化合物およびその誘導体を全合成する方法を開発し、その方法により得られた各種誘導体が同様に優れたＨＣＶ複製阻害活性を有することを見出した（特許文献３）。
【特許文献１】特願２００３−３４０５６号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／５６７５５号パンフレット
【特許文献３】特願２００３−２７２４２０号明細書
【非特許文献１】ブイ・ローマンなど著、サイエンス（Science）、１９９９年、第２８５巻、第１１０−１１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者は、鋭意研究を行った結果、上記「Ｆ１４７６株」が、上記文献には記載されていない新たな天然化合物群を産生することを見出し、更に本化合物群が非常に強い抗ＨＣＶレプリコン活性、更にはＨＣＶの増幅抑制効果を有し、かつ、インビトロの細胞毒性は軽微であること、そして、抗ＨＣＶ予防／治療剤として極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、高いＨＣＶの複製阻害活性を有するため、ウイルス感染症、特にＨＣＶの感染による肝臓疾患の予防及び治療に有用な化合物、およびこれらの化合物を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、
式（Ｉ）：
【００１４】
【化４】
【００１５】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＺ、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し；
Ｚは、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し；
Ａは、水素原子を表わすか、あるいはヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）で置換されていてもよい炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基を表し；
Ｂは、水素原子、ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）、＝Ｎ−ＯＲ6、＝Ｎ−ＯＨ、ヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）またはオキソ基を表し、ここでＲ4およびＲ5は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表すか、あるいはＲ4とＲ5が一緒になって３〜８員環を表し、Ｒ6は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表し；
Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し（各ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）；
結合Ｑは、一重結合または二重結合を表し；
ただし、Ａが水素原子、またはヒドロキシ基で置換されていないアルケニル基を表す場合は、Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基であるか、あるいは２−ヒドロキシ−ｎ−ヘプチル基である〕
で示される化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩に関する。
【００１６】
更に本発明は、上記式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を含む、医薬組成物にも関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩は、非常に強い抗ＨＣＶレプリコン活性、更にはＨＣＶの増幅抑制効果を有し、更にインビトロの細胞毒性は軽微であるため、ウイルス感染症、特にＣ型肝炎などのＨＣＶ感染症の治療および予防に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書においては、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基とは、所定の炭素数を有する炭化水素基を意味する。炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、ｔ−ブチルを挙げることができる。炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、例えばｎ−ペンチル、ｔ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルなどを挙げることができる。炭素数６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、例えばｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ネオヘキサン−１−イルなどを挙げることができる。炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、ｎ−ヘプチル、５−メチルヘキシル、４，４−ジメチル−ペンチル、１，１−ジメチル−ペンチルなどを挙げることができる。炭素数８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基としては、ｎ−オクチル、イソオクチルなどを挙げることができる。
【００１９】
また直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基とは、所定の炭素数を有し、すくなくとも１つの二重結合を有する炭化水素基を意味する。炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、１−メチル−１−プロペニルなどを挙げることができる。炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、１−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニルなどを挙げることができる。炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、上記のアルケニル基のほか、１−ヘキセニル、２−ヘキセン−１−イル、３−ヘキセン−１−イルなどを挙げることができる。炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基としては、１−ヘプテン−１−イル、２−ヘプテン−１−イルなどを挙げることができる。
【００２０】
また、直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基とは、所定の炭素数を有し、少なくとも１つの三重結合を有する炭化水素基を意味する。炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基としては、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニルなどを挙げることができる。炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基としては、上記のアルキニル基のほか、１−ペンチン−１−イル、２−ペンチン−１−イル、１−ヘキシン−１−イル、２−ヘキシン−１−イル、３−ヘキシン−１−イルなどを挙げることができる。炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基としては、１−ヘプチン−１−イニル、２−ヘプチン−１−イニル、３−ヘプチン−１−イニルなどを挙げることができる。
【００２１】
本明細書において記載されるプロドラッグとは、医薬品として処方された後に、生理的条件下あるいは加溶媒分解によって、式（Ｉ）の化合物又は製薬上許容されうるそれらの塩に変換されうる化学的修飾が施された、式（Ｉ）の化合物の誘導体を意味する。プロドラッグは、患者に投与されたときには不活性であってもよいが、生体内では活性のある式（Ｉ）の化合物に変換されて存在するものである。当該プロドラッグとしては、例えば、本化合物のカルボン酸部分においてＣ1-6アルキルエステル化、Ｃ6-10アリールエステル化、Ｃ1-6アルキルオキシＣ1-6アルキルエステル化（下式）、Ｃ1-6アルコキシエステル化、ヒドロキシ−Ｃ1-6アルキルエステル化（下式）などを施した化合物が含まれる。
【００２２】
【化５】
【００２３】
本明細書において記載される製薬上許容されうるそれらの塩とは、薬理学的に許容されるものであれば特に限定されない。例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸などの鉱酸との塩；酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ショウノウスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属又はアルカリ土類金属などとの塩などを挙げることができる。
【００２４】
また、本明細書において記載される治療という語は、本発明の医薬組成物を被験者に投与することによって、ＨＣＶを消滅あるいは軽減させること、さらなるＨＣＶの広がりを抑制すること、ＨＣＶの感染による症状を軽減することを意味する。ＨＣＶの感染による症状としては、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝繊維化、肝癌などが挙げられる。
【００２５】
本発明の化合物について以下に詳細に記載する。
本発明の式（Ｉ）の化合物は、上記に示す式で示されるものであり、この式（Ｉ）においては、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＺ、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、ここでＺは、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表す。Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3としては、ヒドロキシ基または−ＯＺ基が好ましく、ヒドロキシ基が特に好ましい。また、−ＯＺ基としては、具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ビニルオキシ、１−プロペン−１−イルオキシ、アリルオキシ、１−ブテン−１−イルオキシ、エチニルオキシ、１−プロピン−１−イルオキシ、１−ブチン−１−イルオキシなどの基を挙げることができる。
【００２６】
本発明の式（Ｉ）の化合物においては、Ａは、水素原子を表すか、あるいはヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）で置換されていてもよい炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基を表す。Ａは、好ましくは３−メチル−２−ブテン−１−イル基または４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテン−１−イル基である。
【００２７】
本発明の式（Ｉ）の化合物においては、Ｂは、水素原子、ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）、＝Ｎ−ＯＲ6、＝Ｎ−ＯＨ、ヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）またはオキソ基を表し、ここでＲ4およびＲ5は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表すか、あるいはＲ4とＲ5が一緒になって３〜８員環を表し、Ｒ6は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表す。Ｒ4とＲ5が一緒になって表す３〜８員環は、Ｒ4およびＲ5が結合している窒素原子のほか、窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を環原子として含有していてもよい３〜８員の単環または二環の飽和または不飽和炭素環を表し、このような環としては、例えばピペリジン、ピペラジン、モルホリンなどの環を挙げることができる。
【００２８】
本発明の式（Ｉ）の化合物においては、Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し、各ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい。Ｃは、好ましくは１−ヘプテニル基、２−ヘプテン−１−イル基、ｎ−ヘプチル基、１−ヒドロキシ−２−ヘプテン−１−イル基、または２−ヒドロキシ−ｎ−ヘプチル基である。
本発明の式（Ｉ）の化合物においては、結合Ｑは、一重結合または二重結合を表す。好ましくは、結合Ｑは、二重結合である。
【００２９】
本発明の好ましい式（Ｉ）の化合物としては、以下の化合物を挙げることができる。
【００３０】
【化６】
【００３１】
上記の好ましい式（Ｉ）の化合物のうち、なかでもＲ1、Ｒ2、及びＲ3が、それぞれヒドロキシ基または−ＯＺ基であり、ここでＺは、式（Ｉ）に記載のとおりである化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を挙げることができる。さらに、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が、それぞれヒドロキシ基である下記の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を特に好ましく挙げることができる。
【００３２】
【化７−１】
【００３３】
【化７−２】
【００３４】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、糸状菌類に属し、上記化合物１〜７を産生することができる菌株、例えば、フザリウム・エスピー（Fusarium sp.）Ｆ１４７６株（以下「Ｆ１４７６株」という）などを培養し、単離された化合物を必要に応じて修飾することにより得ることができる。この上記Ｆ１４７６株の生理学的性質は、下記に示すとおりである：
【００３５】
生育温度範囲は、１０〜３０℃であり、好ましくは、２０〜３０℃である。
生育可能pH範囲は、３〜１１であり、好ましくは、５〜７である。
Ｆ１４７６株は、Fusarium sp. F 1476と表示し、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、２００３年２月４日付で、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９０として寄託されている。
【００３６】
本発明においては、上記Ｆ１４７６株の他に、Ｆ１４７６株の自然または人工的な突然変異体、あるいはフザリウム属などの糸状菌類に属するその他の菌種などであって、Ｆ１４７６株と同様の産生能を有する微生物を使用することができる。
【００３７】
本発明においては、上記Ｆ１４７６株を、栄養源含有培地に接種し、これを培養することによって培養物を得ることができる。上記栄養源のうち、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、サッカロース、澱粉、デキストリン、グリセリン、糖蜜、水飴、油脂類、有機酸などを挙げることができる。
【００３８】
上記栄養源のうち、窒素源としては、例えば、大豆粉、綿実粉、コーンスチープリカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、胚芽、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩などの有機窒素化合物、無機窒素化合物などを挙げることができる。
【００３９】
上記栄養源のうち、塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類などを挙げることができる。これらは、単独で使用されてもよく、適宜組み合わせて使用されてもよい。
上記栄養源は、単独か又は適宜組み合わせて使用することができる。
【００４０】
上記栄養源含有培地には、必要に応じ、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩などの重金属塩；ビオチン、ビタミンＢ1などのビタミン類；その他、菌の生育を助け、本発明化合物の産生を促進する有機物、無機物などを適宜添加することができる。
【００４１】
上記栄養源含有培地には、上記栄養源の他に、更に必要に応じて、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエーテルなどの消泡剤、界面活性剤などを添加することができる。
【００４２】
本発明化合物を産生する菌株を、上記栄養源含有培地で培養するに際しては、生理活性物質の産生を微生物の培養によって行う際に一般的に使用される、固体培養法、液体培養法などの培養方法を採用することができる。
【００４３】
上述の培養方法によって、本発明化合物は、培養物中に蓄積される。本発明においては、培養物中に蓄積された化合物を、公知の方法により、培養物中から分離した後、必要に応じて更に精製することができる。
【００４４】
上記分離は、培養物全体を、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、ブタノール、メチルイソブチルケトンなどの非親水性有機溶媒で抽出することにより行うことができる。また、培養物を濾過又は遠心分離によって培養液と菌体とに分離した後、培養液、菌体のそれぞれから分離することもできる。
【００４５】
上記分離した培養液から本発明化合物を分離するには、上記非親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することもでき、また、培養液を吸着性の担体に接触させ、培養液中の上記化合物を担体に吸着させた後、溶媒で溶出する方法を採用することもできる。
【００４６】
上記担体としては、例えば、活性炭、粉末セルロース、吸着性樹脂などを挙げることができる。上記溶媒としては、担体の種類、性質などによって適宜１種又は２種以上を組み合わせて使用することができ、例えば、含水アセトン、含水アルコール類などの水溶性有機溶媒の含水溶液などを適宜組み合わせたものなどを挙げることができる。
【００４７】
上記分離した菌体から本発明化合物を分離するには、アセトンなどの親水性有機溶媒で抽出する方法を採用することができる。
【００４８】
本発明においては、このようにして培養物中から分離された本発明化合物の粗抽出物を、必要に応じて、更に精製する工程に付することができる。
【００４９】
上記精製は、脂溶性生理活性物質の分離、精製に通常使用される方法によって行うことができ、このような方法としては、例えば、シリカゲル、活性アルミナ、活性炭、吸着性樹脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などを挙げることができる。シリカゲルを担体として用いるカラムクロマトグラフィー法を採用する場合は、溶出溶媒としては、例えば、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、水などを挙げることができ、これらは２種以上を併用することができる。
【００５０】
上記高速液体クロマトグラフィー法を採用する場合は、担体としては、例えば、オクタデシル基、オクチル基、フェニル基などが結合した化学結合型シリカゲル；ポリスチレン系ポーラスポリマーゲルなどを挙げることができ、移動相としては、例えば、含水メタノール、含水アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒の含水溶液などを使用することができる。
【００５１】
本発明の化合物は、上記のように化合物１〜７を産生する菌株を培養し、その後培養物から上記の化合物１〜７を単離することにより製造することができる。更に、上記の単離された化合物を出発物質として下記に記載の方法を用いて、種々の誘導体を得ることができる。
製法１
上記単離された化合物を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、バラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケルなどの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することにより、ジヒドロ体（Ｑが一重結合である化合物、または他の炭素鎖の二重結合がジヒドロ化された化合物）を得ることができる。
製法２
上記単離された化合物を、メタノール、エタノール、プロパノール、テトラヒドロフランなどの溶媒中、水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、水素化シアノホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ジエチルアルミニウムナトリウム、水素化アルニミウムリチウムなどの還元剤の存在下、室温または冷却条件下で還元することにより、アルコール体（Ｂがヒドロキシ基である化合物など）を得ることができる。
製法３
上記単離された化合物を、メタノール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、水などの溶媒中、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの存在下、室温または冷却条件下で処理することにより、脱アルケニル化体（Ａが水素である化合物など）を得ることができる。更に、この脱アルケニル化された化合物を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケル、酸化白金などの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりジヒドロ体（Ｑが一重結合であり、かつＡが水素である化合物など）を得ることができる。
製法４
上記脱アルケニル化体化合物を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウムなどの塩基の存在下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフランなどの溶媒中、室温または加熱条件下で、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリル、ハロゲン化アルキニルなどのアルキル、アルケニルまたはアルキニル化剤で処理することにより、所望のテトラアルキル、テトラアルキニルまたはテトラアルケニル化体（Ａがアルキル、アルケニルまたはアルキニルである化合物、および／またはＺがアルキル、アルキニルまたはアルケニルである化合物）を合成することができる。
また、上記単離された化合物を水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウムなどの塩基の存在下、メタノール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、水などの溶媒中、室温または加熱条件下、アルキル、アルキニルまたはアルケニル化剤で処理することにより、アルキル、アルキニルまたはアルケニル化体（Ａがアルキル、アルキニルまたはアルケニルである化合物など）を合成することができる。
製法５
上記単離された化合物と各種アミンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフランなどの溶媒中で、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンなどの塩基の存在下で、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などの縮合剤で処理することにより、室温または加熱条件下で、対応するトリアミド体（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝アミノ基である化合物など）を得ることができる。
【００５２】
製法６
上記単離された化合物を、メタノール、エタノール、酢酸エチル、テトラヒドロフランなどの溶媒中、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、ラネーニッケル、酸化白金などの触媒の存在下、室温または加熱条件下で水素化することによりテトラヒドロ体（Ｑが一重結合である化合物など）を得ることができる。
製法７
上記単離された化合物を、テトラヒドロフラン、ＤＭＦおよびジクロロメタンなどの溶媒中、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの縮合剤により所望の基Ｚを有する各種のアルコール（Ｚ−ＯＨ）と反応させることによって、室温または加熱条件下で、対応するトリエステル体（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝ＯＺである化合物など）を得ることができる。あるいは、上記単離された化合物をメタノールおよびジクロロメタンなどの混合溶媒中、アミドジヒドロ体トリメチルシリルジアゾメタン（ＴＭＳＣＨＮ2）などで処理し、トリメチルエステル体（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝ＯＣＨ3）である化合物を得ることができる。
製法８
製法７で得られたトリメチルエステル体をメタノール、エタノールおよびブタノールなどの溶媒中で４−トルエンスルホニルヒドラジドなどのヒドラジン誘導体で処理することにより、室温または加熱条件下で、対応するヒドラジド体を得、本ヒドラジド体をカテコールボランなどの還元剤で処理した後、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基の存在下、エタノール、メタノールおよび水などの溶媒中、室温または加熱条件下で、脱ケト体（Ｂが水素である化合物）を得ることができる。
製法９
上記単離された化合物とヒドロキシルアミンまたは各種Ｏ−置換ヒドロキシルアミンをピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの存在下で、室温または加熱条件下で処理することにより対応するオキシムエーテルおよびオキシム体（Ｂが＝Ｎ−ＯＲ6および＝Ｎ−ＯＨである化合物など）を得ることができる。ここでＲ6は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表す。
製法１０
上記単離された化合物を、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、クロロホルムなどの溶媒中、三フッ化Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ硫黄（ＤＡＳＴ）などで処理し、ハロゲン化体（Ｂがフッ素などのハロゲンである化合物など）を得ることができる。
製法１１
上記単離された化合物と各種アミンをエタノール、メタノールおよびテトラヒドロフランなどの溶媒中で、中性または弱酸性条件下で、室温または加熱条件下で、水素化シアノホウ素ナトリウムまたは水素化トリアセトキシホウ素ナトリウムなどの還元剤で処理することにより、還元的アミノ化を行い、対応するアミン体（Ｂ＝−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）である化合物など）を得ることができる。ここでＲ4およびＲ5は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表すか、もしくはＲ4とＲ5が一緒になって３〜８員環を表す。
上記の製法は、目的とする式（Ｉ）の化合物に応じて、適宜組み合わせて実施することができる。
【００５３】
このようにして得られる本発明の式（Ｉ）の化合物は、そのまま、もしくはそのプロドラッグとして、または製薬的に許容されうる塩として、医薬組成物とすることができる。本医薬組成物に含まれる有効成分化合物の量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、０．１〜９９．５重量％、好ましくは０．５〜９０重量％である。
【００５４】
本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩は、常法に従って、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて、経口投与、組織内投与、局所投与、経直腸的投与などに適した剤型に製剤化することができる。また、上記の補助剤のほか、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの補助剤、および他の医薬品を含有させることもできる。
経口投与に適した剤型としては、例えば、錠剤、糖衣剤、丸剤、カプセル剤、ドロップ剤、舌下剤、末剤、散剤、飲用液剤、その他の剤型を挙げることができる。更に錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、または多層錠とすることができる。錠剤の形態に調製するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。このような担体としては、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、グルコース液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、寒天末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖などの崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、澱粉などの保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコールなどの潤沢剤などが例示できる。
丸剤の形態に調製するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。このような担体としては、例えばグルコース、乳糖、カカオバター、澱粉、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン寒天などの崩壊剤などが例示できる。
これら経口投与用製剤は、固形、粉末または液剤の用量単位で投与することができる。
【００５５】
組織内投与に適した剤型としては、注射剤を挙げることができる。
注射剤として調製する場合には、溶液、乳剤および懸濁剤などの形態とすることができる。これらは、殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましい。これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に調製するに際しては、希釈剤としてこの分野で慣用されているものを使用することができる。このような希釈剤としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類などを用いることができる。また、等張性の溶液を調製するのに充分な量の食塩、グルコース、またはグリセリン、および通常の溶解補助剤、緩衝剤、ｐH調整剤、無痛化剤なども配合することができる。これら溶液、乳剤および懸濁剤は、本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩の一定量を、上述のような水性や油性の非毒性の希釈剤に溶解または懸濁し、更に必要に応じて等張化剤などを加え、滅菌することにより調製することができる。これら注射剤は、皮下、筋肉内または静脈内に投与することができる。
局所投与に適した剤型としては、例えば、局所用液剤、クリーム剤、粉剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤などの外用製剤を挙げることができる。これらは、本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩の一定量を、外用製剤の目的に適合する香料、着色料、充填剤、界面活性剤、保湿剤、皮膚軟化剤、ゲル化剤、担体、保存剤、安定剤などのうちの一種以上と組み合わせることにより調製することができる。
経直腸的投与に適した剤型としては、坐剤を挙げることができる。坐剤の形態に調製するに際しては、基材としてこの分野で従来公知のものを広く使用できる。このような基材としては、例えばパルミチン酸ミリスチルエステルなどの高級エステル類、高級アルコール類、ポリエチレングリコール、カカオ脂、ゼラチン、半合成グリセリド、これらの混合物などの低融点基材を挙げることができる。座剤は、本発明の式（Ｉ）の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を上記のような基材に混入し、成型することにより調製することができる。
【００５６】
上記医薬組成物は、投与単位形態で投与することが好ましく、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。上記医薬組成物は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。
【００５７】
本発明の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を医薬として投与する場合、抗ウイルス剤としての用量は、年齢、体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で決定することができ、通常は、ヒト成人に対しては、有効成分量として、一日当たり、１〜２０００mgの範囲である。患者の状態などに応じて、上記範囲未満または上記範囲を超える用量を投与することもできる。多量に投与するときは、一日数回に分割して投与することが望ましい。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
フザリウム属の菌株Ｆ１４７６株の斜面培養から一白金耳を、１００mlの液体培地（グルコース２％、グリセロール１．５％、ポテトスターチ１％、ポリペプトン０．２５％、イーストエクストラクト０．３５％、炭酸カルシウム０．５％、塩化ナトリウム０．３％、硫酸亜鉛７水和物０．００５％、硫酸銅５水和物０．０００５％、塩化マンガン４水和物０．０００５％、トーストソーヤ１％）を入れた５００ml容の臍つき三角フラスコ４００本に接種し、２５℃、３日間振とう培養し(振とう２２０rpm)、種培養液を得た。この種培養液１６mlを固体培地（玄米５０ｇ、SF1溶液（イーストエクストラクト０．２％、酒石酸ナトリウム０．１％、リン酸２水素カリウム０．１％）１８ml）を入れた５００ml容の臍つき三角フラスコ４００本に接種し、２７℃で１０日間静置培養を行った。このように培養した培養物にメタノール４０Ｌを加え、１晩浸潤、放置後ろ過した。沈殿にメタノール２０Ｌを加え、１晩放置後ろ過した。このようにして得られたメタノール抽出液をあわせて濃縮後、水３Ｌに懸濁し、水酸化ナトリウム水溶液にてpHを６．３に調整した後、酢酸エチル３Ｌで抽出した。この水層を塩酸にてpHを２．２に調整した後に、酢酸エチル３Ｌで抽出した。水層は再度２Ｌの酢酸エチルで抽出し、一回目の抽出物と合わせ、濃縮乾固した。この抽出物を酢酸エチル５００mlに溶解し、水５００mlを添加して、水酸化ナトリウム水溶液でｐHを１０に調整後分配を行った。酢酸エチル層には３００mlの水を加え、水酸化ナトリウム水溶液でpHを１０に調整後分配を行った。これら分配操作で得られた水層をあわせて、塩酸にてｐHを２．１に調整後、５００mlおよび３５０mlの酢酸エチルで順次抽出した。このようにして得られた酢酸エチル抽出液（８５０ml）を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮乾固し、粗抽出物１１．４ｇを得た。
【００５９】
これを５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、下記に示す条件１のＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィーによって、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物７および化合物６を含む分画を得た。これらを濃縮乾固した後、メタノールに溶解し、下記に示す条件２で分取ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィーを繰り返すことによって化合物１および化合物２を含む分画(フラクション１、９．９mg)、化合物４および化合物５を含む分画(フラクション２、５mg)、化合物３を含む分画(フラクション３、０．７mg)、化合物７を含む分画(フラクション４、１０mg)、化合物６を含む分画(フラクション５、５mg)を得た。フラクション１を下記に示す条件３で分取ＣＮ高速液体クロマトグラフィーに繰り返し付すことによって化合物１を含む分画(フラクション１−１)および化合物２を含む分画(フラクション１−２)を得た。フラクション１−１、１−２および３を減圧濃縮することにより、それぞれ、２．０mgの化合物１、４．２mgの化合物２および０．７mgの化合物３を無色タール状物質として得た。
【００６０】
条件１：ＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィーの条件
カラム：２５０ｇのＯＤＳ充填剤（ウォーターズ社製、Preparative C18, 125A Bulk Packing Material）を内径５．５cm、長さ５０cmのガラスカラムに、充填剤高さ２４cmになるように、乾燥状態で充填した。これに、０．０１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを通搭し、充填剤を湿潤させた後、０．０１％のトリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル水を通搭することで、平衡化した。
サンプルの添加および溶出：１１．４ｇのサンプルを１００mlの５０％アセトニトリル水に溶解し、カラム上端に添加した。次いで、０．０１％トリフルオロ酢酸を加えた５０％、６０％、７０％、８０％のアセトニトリル水を、それぞれ２Ｌづつ添加し、化合物を溶出させた。
【００６１】
条件２：分取ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィーの条件
装置：CCPP-D、MCPD-3600システム（東ソー）
カラム：CAPCELL PAK C18 (UG８０，20 mm x 250 mm) (資生堂製)
移動相：０．０１％トリフルオロ酢酸を含有する水と０．０１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルによる溶媒グラジエント溶出（１５％アセトニトリル〜９８％アセトニトリル、ステップワイズ）
【００６２】
条件３：分取ＣＮ高速液体クロマトグラフィーの条件
装置：３０６、８１１Ｃ、８０６ システム（ギルソン）
カラム：CAPCELL PAK ＣＮ (ＳＧ１２０，20 mm x 250 mm) (資生堂製)
移動相：０．１％ギ酸添加４０％アセトニトリル水（イソクラティック溶出）
【００６３】
化合物１の物理化学的性状
【化８】
分子量 ６７５
ESI（LC/MSポジティブモード）６７６（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６７４（M−H-)
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.25-1.40(12H, m)、1.50(2H, m)、1.73(3H, s)、1.77(3H, s)、1.95-2.20(4H, m)、2.56(1H, d, J=16.5Hz)、2.85(1H, d, J=16.5Hz)、2.93(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.14(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.19(1H, d, J=8Hz)、3.38(1H, m)、4.17(1H,dd,J=6,9Hz)、4.48(2H, d, J=6Hz)、4.62(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.34(1H, m)、5.42(1H, m)、5.54(3H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.10(2H, d, J=9Hz)
【００６４】
化合物２の物理化学的性状
【化９】
分子量 ６７５
ESI（LC/MSポジティブモード）６７６（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６７４（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.40(14H, m)、1.53(4H, m)、1.73(3H, s)、1.98(2H, m)、2.41(4H, m)、2.57(1H, d, J=16.5Hz)、2.83(1H, d, J=16.5Hz)、2.91(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.15(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.19(1H, d, J=8Hz)、3.99(2H,s)、4.57(2H, d, J=6Hz)、4.62(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.53(2H, m)、5.70(1H, m)、6.80(2H, d, J=9Hz)、7.11(2H, d, J=9Hz)
【００６５】
化合物３の物理化学的性状
【化１０】
分子量 ６５７
ESI（LC/MSポジティブモード）６５８（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６５６（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.90(3H, t, J=7Hz)、1.25-1.35(10H, m)、1.48(2H, m)、1.55(2H, m)、1.73(3H, s)、1.77(3H, s)、1.97(2H, m)、2.23(2H, m)、2.57(2H, t, J=8Hz)、2.57(1H, d, J=16.5Hz)、2.85(1H, d, J=16.5Hz)、2.92(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.14(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.19(1H, d, J=8Hz)、4.47(2H, d, J=6Hz)、4.62(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.43(1H, m)、5.52(2H, m)、6.10(1H, d, J=16Hz)6.78(2H, d, J=9Hz)、6.92(1H, dt, J=16, 7.5Hz)、 7.11(2H, d, J=9Hz)
【００６６】
実施例２
実施例１で得られた分画(フラクション２、５mg)を更に下記に示す条件４で分取Ｐｈｅｎｙｌ高速液体クロマトグラフィーに付すことによって化合物４を含む分画（フラクション２−１）と化合物５を含む分画（フラクション２−２）を得た。フラクション２−１および２−２を減圧濃縮することにより、それそれ、１．１mgの化合物４および０．６mgの化合物５を無色タール状物質として得た。
【００６７】
条件４：分取Ｐｈｅｎｙｌ高速液体クロマトグラフィーの条件
装置：３０６、８１１Ｃ、８０６ システム（ギルソン）
カラム：YMC PAK Ph (120A，20 mm x 250 mm) (ワイエムシー製)
移動相：０．１％ギ酸添加４８％アセトニトリル水（イソクラティック溶出）
【００６８】
化合物４の物理化学的性状
【化１１】
分子量 ６７５
ESI（LC/MSポジティブモード）６７６（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６７４（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.40(14H, m)、1.53(4H, m)、1.83(3H, s)、1.96(2H, m)、2.42(4H, m)、2.57(1H, d, J=16.5Hz)、2.89(1H, d, J=16.5Hz)、2.91(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.15(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.20(1H, d, J=8Hz)、4.13(2H, s)、4.50(2H, d, J=6Hz)、4.63(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.50(1H, m)、5.52(2H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.10(2H, d, J=9Hz)
【００６９】
化合物５の物理化学的性状
【化１２】
分子量 ６７５
ESI（LC/MSポジティブモード）６７６（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６７４（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.35(12H, m)、1.42(4H, m)、1.52(2H, m)、1.73(3H, s)、1.77(3H, s)、1.96(2H, m)、2.40-2.50(4H, m)、2.57(1H, d, J=16.5Hz)、2.80(1H, d, J=16.5Hz)、2.91(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.15(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.20(1H, d, J=8Hz)、4.00(1H, s)、4.47(2H, d, J=6Hz)、4.63(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.43(1H, m)、5.52(2H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.10(2H, d, J=9Hz)
【００７０】
実施例３
実施例１で得られた分画(フラクション４、１０mgおよびフラクション５、５mg)を更に下記に示す条件５で、それぞれ、分取ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィー(中性)に付すことによって、フラクション４からは化合物７を含む分画（フラクション４−１）と、フラクション５からは化合物６を含む分画（フラクション５−１）を得た。フラクション４−１および５−１を減圧濃縮することにより、それそれ、１mgの化合物７および１mgの化合物６を無色タール状物質として得た。
条件５：分取ＯＤＳ高速液体クロマトグラフィー(中性)の条件
装置：３０６、８１１Ｃ、８０６ システム（ギルソン）
カラム：Mightysil RP18 GP (５μm，20 mm x 50 mm) (関東化学製)
移動相：水、アセトニトリルおよび１００mMの酢酸アンモニウムを含有する水の３液による溶媒グラジエント溶出（１５％アセトニトリル〜８０％アセトニトリル、酢酸アンモニウム最終濃度１０mM）
【００７１】
化合物６の物理化学的性状
【化１３】
分子量 ６５９
ESI（LC/MSポジティブモード）６６０（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６５８（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.40(14H, m)、1.72(3H, s)、1.77(3H, s)、1.98(2H, m)、2.04(2H, m)、2.19(2H, m)、2.51(1H, d, J=16.5Hz)、2.79(1H, d, J=16.5Hz)、2.97(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.11(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.18(1H, m)、3.52(1H, m)、4.46(2H, d, J=6Hz)、4.50(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.43(3H, m)、5.57(2H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.10(2H, d, J=9Hz)
【００７２】
化合物７の物理化学的性状
【化１４】
分子量 ６５９
ESI（LC/MSポジティブモード）６６０（M＋H+）
ESI（LC/MSネガティブモード）６５８（M−H-）
1H-NMR (メタノールd-4中)の化学シフト値d
0.89(3H, t, J=7Hz)、1.20-1.40(16H, m)、1.73(3H, s)、1.77(3H, s)、1.98(4H, m)、2.52(1H, d, J=16.5Hz)、2.79(1H, d, J=16.5Hz)、2.96(1H, dd, J=14, 9Hz)、3.11(1H, dd, J=14, 4.5Hz)、3.18(1H, m)、4.35(1H、m)、4.46(2H, d, J=6Hz)、4.51(1H, dd, J=9, 4.5Hz)、5.29(1H、m)、5.43(2H, m)、5.57(2H, m)、6.78(2H, d, J=9Hz)、7.13(2H, d, J=9Hz)
【００７３】
試験例１
レプリコンアッセイ
ＨＣＶ−ＲＮＡのコピー数を定量するためにＨＣＶ−ＲＮＡの中にレポーター遺伝子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを構築した。Kriegerら（J. Virol.75:4614）の方法に従い、ＨＣＶ遺伝子のＩＲＥＳ（Internal Ribosome Entry Site）の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。インビトロで当該ＲＮＡを合成後、エレクトロポレーション法でＨｕｈ７細胞に導入し、Ｇ４１８耐性クローンとして単離した。ホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞（３−１）を５％ウシ胎児血清（Hyclone cat. no. SH30071.03）を含むダルベッコＭＥＭ（Gibco cat. no. 10569-010）に懸濁し、９６穴プレートに５０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ2 ３７℃で一夜培養した。約２０時間後、希釈した試験化合物をウェルあたり１０μl加え、更に３日間培養した。アッセイプレートを２系統用意し、１つは白色プレート、他はクリアープレートでアッセイを行った。培養終了後、白色プレートはSteady-Glo Luciferase Assay System（Promega cat. no. E2520）に用いた。すなわち、ウェルあたり１００μlの試薬を入れ、３〜４回ピペットで混ぜ、５分間放置後に1450 MicroBeta TRILUX（WALLAC）にてルミネッセンスを測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、試験化合物未添加の値を阻害０％として薬剤のＩＣ50（５０％阻害濃度）を算出した。
【００７４】
試験例２
細胞毒性試験
細胞毒性の測定にはCell counting kit-8（同人堂カタログNo. CK04）を用いた。すなわち、１０μlのCell counting kit-8をクリアープレートに添加し、３７℃で３０〜６０分間保温した。９６穴プレートリーダーにて波長４５０nm、対照波長６３０nmで吸光度を測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、薬剤未添加の値を阻害０％として薬剤のＣＣ50（５０％細胞阻害濃度）を算出した。
試験例１および２の結果を以下に示す。
【００７５】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＺ、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し；
Ｚは、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し；
Ａは、水素原子を表わすか、あるいはヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）で置換されていてもよい炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基を表し；
Ｂは、水素原子、ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）、＝Ｎ−ＯＲ6、＝Ｎ−ＯＨ、ヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）またはオキソ基を表し、ここでＲ4およびＲ5は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表すか、あるいはＲ4とＲ5が一緒になって３〜８員環を表し、Ｒ6は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表し；
Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し（各ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）；
結合Ｑは、一重結合または二重結合を表し；
ただし、Ａが水素原子、またはヒドロキシ基で置換されていないアルケニル基を表す場合は、Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基であるか、あるいは２−ヒドロキシ−ｎ−ヘプチル基である〕
で示される化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【請求項２】
以下の化合物：
【化２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、請求項１の式（Ｉ）に記載のとおりである］
からなる群より選択される、請求項１記載の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【請求項３】
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が、それぞれヒドロキシ基または−ＯＺ基であり、ここでＺは、請求項１の式（Ｉ）に記載のとおりである、請求項２記載の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【請求項４】
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が、それぞれヒドロキシ基である、請求項２記載の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を含む、医薬組成物。
【請求項６】
ウイルス感染症を予防または治療するための、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
ウイルス感染症が、ＨＣＶ感染症である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＨＣＶ感染症が、Ｃ型肝炎である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
〔式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、同一又は異なって、水素原子、ヒドロキシ基、アミノ基（炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよい）、−ＯＺ、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し；
Ｚは、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し；
Ａは、水素原子を表わすか、あるいはヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）で置換されていてもよい炭素数５の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基を表し；
Ｂは、水素原子、ハロゲン原子、−Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）、＝Ｎ−ＯＲ6、＝Ｎ−ＯＨ、ヒドロキシ基（ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）またはオキソ基を表し、ここでＲ4およびＲ5は、同一又は異なって、水素原子、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表すか、あるいはＲ4とＲ5が一緒になって３〜８員環を表し、Ｒ6は、炭素数１〜８の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基（炭素数１〜４の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基でモノまたはジ置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよい）を表し；
Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、またはヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を表し（各ヒドロキシ基の水素原子は、炭素数１〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または炭素数２〜４の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基で更に置換されていてもよい）；
結合Ｑは、一重結合または二重結合を表し；
ただし、Ａが水素原子、またはヒドロキシ基で置換されていないアルケニル基を表す場合は、Ｃは、ヒドロキシ基で置換されていてもよい炭素数７の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基であるか、あるいは２−ヒドロキシ−ｎ−ヘプチル基である〕
で示される化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【請求項２】
以下の化合物：
【化２】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は、請求項１の式（Ｉ）に記載のとおりである］
からなる群より選択される、請求項１記載の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【請求項３】
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が、それぞれヒドロキシ基または−ＯＺ基であり、ここでＺは、請求項１の式（Ｉ）に記載のとおりである、請求項２記載の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【請求項４】
Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3が、それぞれヒドロキシ基である、請求項２記載の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物もしくはそのプロドラッグ、または製薬上許容されうるそれらの塩を含む、医薬組成物。
【請求項６】
ウイルス感染症を予防または治療するための、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
ウイルス感染症が、ＨＣＶ感染症である請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＨＣＶ感染症が、Ｃ型肝炎である、請求項７記載の医薬組成物。
【公開番号】特開２００６−７７００４（Ｐ２００６−７７００４Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３１５８７（Ｐ２００５−２３１５８７）
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【出願人】（０００００３３１１）中外製薬株式会社 (228)
【Ｆターム（参考）】
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