本開示は、トリパノソーマ・クルーズのエピトープを検出するための試薬及び該試薬を使用する方法に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の情報
本願は、２００８年１２月２７日に出願された米国特許出願６１／０１７，０７１号（参照により、その内容は本明細書に組み込まれる。）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、トリパノソーマ（スキゾトリパナム（Ｓｃｈｉｚｏｔｒｙｐａｎｕｍ））クルーズ抗原を検出又は定量するための方法、アッセイ及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
寄生虫トリパノソーマ（スキゾトリパナム）・クルーズは、シャーガス病（アメリカトリパノソーマ症）を引き起こし、中南米及びメキシコの風土病である。穏やかな急性期の後、多くの感染者は症候の欠如、低い寄生虫数及び抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体の低い力価を特徴とする中間期に入る。慢性のＴ．ｃｒｕｚｉ感染症を有する者の約１０から３０％は心臓又は胃腸の機能不全を発症する。化学療法は先天的に感染した幼児及び児童のかなりの数を治癒させることができるが、慢性的な感染症を有する成人においては概ね無効である（Ｃｏｕｒａ， Ｊ．， ａｎｄ Ｓ． ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ．２００２．Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ．９７：３−２４）。Ｔ．ｃｒｕｚｉに慢性的に感染している発症国内の推定１，２００万人のうち約２５，０００人が、心臓律動の異常又はうっ血性心不全のために、毎年、この病気によって死亡している（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ．Ｖ． ２００６．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ（Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）．Ｉｎ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｖｏｌ．Ｒ． Ｇｕｅｒｒａｎｔ， Ｄ． Ｗａｌｋｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｗｅｌｌｅｒ， ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１０８２−１０９４）。
【０００４】
シャーガスは、１９０９年にこの病気を初めて記載したブラジル人医師カルロス・シャーガスにちなんで名付けられた（Ｃｈａｇａｓ， Ｃ． １９０９ａ．Ｎｅｕｅ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｎ．Ｖｏｒｌａｕｆｉｇｅ Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇ．Ａｒｃｈ．Ｓｃｈｉｆｆ．Ｔｒｏｐｅｎｈｙｇ．１３：１２０−１２２； Ｒｅｄｈｅａｄ， Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００６．Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ａｎｄ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｙｐｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２−１１）。シャーガスは、トリアトミダエ（Ｔｒｉａｔｏｍｉｄａｅ）の腸がトリパノソーマ属の新種である鞭毛中原虫を有していることを発見し、感染した虫に咬まれたマーモセット猿に寄生虫が伝達され得ることを実験的に証明することができた。シャーガスは、この病気を引き起こす病原性寄生虫をトリパノソーマ・クルーズと名付け（Ｃｈａｇａ ｓ，１９０９ａ）、その年の後ほど、スキゾトリパナム・クルーズと名付け（Ｃｈａｇａｓ， Ｃ．１９０９ｂ．Ｎｏｖａ ｔｒｉｐａｎｏｚｏｍｉａｓｅ ｈｕｍａｎａ：Ｅｓｔｕｄｏｓ ｓｏｂｒｅ ａ ｍｏｒｆｏｌｏｊｉａ ｅ ｏ ｃｉｃｌｏ ｅｖｏｌｕｔｉｖｏ ｄｏ Ｓｃｈｉｚｏｔｒｙｐａｎｕｍ ｃｒｕｚｉ ｎ． ｇｅｎ．， ｎ． ｓｐ．， ａｊｅｎｔｅ ｅｔｉｏｌｏｊｉｃｏ ｄｅ ｎｏｖａ ｅｎｔｉｄａｄｅ ｍｏｒｂｉｄａ ｄｏ ｈｏｍｅｍ．Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ．１：１５９−２１８）、いずれの名前にも、２０世紀の代わる頃に黄熱病、天然痘及び腺ペストの伝染病と闘ったブラジル人医師及び疫学者であるオスワルド・クルツが含まれている。
【０００５】
チャールズ・ダーウィンは、「Ｇｒｅａｔ Ｂｌａｃｋ Ｂｕｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｍｐａｓ」に咬まれたためにメンドーザ付近のアンデス東部で感染し、この病気に罹患していた可能性がある。ダーウィンは、彼の日記、ビーグル号の船旅の中で症候を報告した。ダーウィンは若く、概ね、健康状態は良好であったが、６ヶ月前に、バルパライソ付近で、一ヶ月間、病気であったが、イギリスに帰国してからほぼ１年後の１９３７年には、奇妙な症候の群に断続的に苦しみ始め、残りの人生の大部分は不具となった。
【０００６】
風土病地域では、Ｔ．ｃｒｕｚｉは、主として、吸血トリアトミン虫によって伝達される。この病気は、輸血、静脈内薬の使用、先天的な伝染、性行為、臓器移植又は授乳によっても伝達され得る（Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ， Ａ．Ｌ． １９７６．Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃｈａｇａ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ．１３０：９７−１０３； Ｃｈｅｎｇ， Ｋ．Ｙ．， ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３５５−６１； Ｇｒａｎｔ， Ｉ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．１９８９．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｕｔｅ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１１１：８４９−５１； Ｈｏｆｆ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．１９７８．Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃｈａｇａｓ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｎ ｕｒｂａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｗｉｎｓ．Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．７２：２４７−５０； Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ．Ｖ． １９８９．Ｉｓ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ａ ｎｅｗ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｏｕｒ ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ？ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．１１１：７７３−５； Ｓｋｏｌｎｉｃｋ， Ａ． １９８９．Ｄｏｅｓ ｉｎｆｌｕｘ ｆｒｏｍ ｅｎｄｅｍｉｃ ａｒｅａｓ ｍｅａｎ ｍｏｒｅ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｇａ ｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ？ Ｊａｍａ．２６２：１４３３）。現在、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対するワクチンは存在しない。
【０００７】
慢性的なＴ．ｃｒｕｚｉ感染の診断は、この寄生虫の生活環の複雑さを反映している。高熱の期間中、診断は、単純に、血液、脳脊髄液、固定された組織又はリンパ節中に寄生虫を同定することからなるが、感染の潜伏期間及び慢性段階の間、虫を検出することは困難である。外因診断法では、患者と疑われる者の血液にこれらの寄生虫が感染してから数週間後に、Ｔ．ｃｒｕｚｉに関して、媒介昆虫の腸内含量が調べられる。しかしながら、この操作は面倒であり、高価であり、感度が低い（Ｓｅｇｕｒａ， Ｅ． １９８７．Ｘｅｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎ Ｃｈａｇａｓ’ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｏｌ．Ｒ．Ｒ． Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｓｔｏｋａ， ｅｄｉｔｏｒｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ．４１−４５）。
【０００８】
これに対して、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対する抗体に対する血清学的アッセイは、感染の迅速且つ安価な診断に対して極めて適している。これらの方法には、間接的免疫蛍光、間接的血球凝集、補体結合及び酵素イムノアッセイ（Ｃｈｅｎｇ， Ｋ．Ｙ．， ｅｔ ａｌ．２００７．Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３５５−６１）が含まれる。旧来のアッセイに一貫して伴う問題は、非確定的な偽陽性結果の発生であった（Ａｌｍｅｉｄａ， ＬＣ， ｅｔ ａｌ．１９９７．Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ． ３７：８５０−７； Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ， ２００６； Ｌｅｉｂｙ， Ｄ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．２０００．Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ’． ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ， ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ， ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｋｉｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：６３９−４２）。
【０００９】
何れのアッセイも、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の代表的な標準となる血清学的診断として一般的には認められていない（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００７）。Ｔ．ｃｒｕｚｉＤＮＡを検出するために設計されているアッセイは、感度が低いことが明らかとなっている（Ｇｏｍｅｓ， Ｍ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ １９９９．Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｃ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ａｎｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．６０：２０５−１０）。容易に解釈される結果を与える放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）は、ほぼ２０年前に開発され、米国において確認的な検査としての使用が提案されてきた（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ， １９８９）。しかしながら、その感受性及び特異性は系統的に確証されていない。さらに、ＲＩＰＡの複雑性のために、研究状況以外でＲＩＰＡが広く使用されることは困難となっている（Ｌｅｉｂｙ ｅｔ ａｌ，２０００）。
【００１０】
患者の試料中に存在する抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体を検出するために設計されたイムノアッセイは、迅速で信頼性の高い血清学的診断法を提供することができる。典型的には、このような診断キットは、較正用物質、陽性対照及び／又はパネルメンバーとして作用するための１つ以上の特異的抗体を使用する。しばしば、シャーガス高力価ヒト血漿及び／又は血清がスクリーニングされ、特定の量で陰性対照試薬中に添加される。陽性対照などのシャーガス品質管理試薬は、特異的なエピトープに対する抗体の存在に関してスクリーニングされるヒト血漿又は血清試料である。しかしながら、ヒト血清及び血漿試料を使用することは、幾つかの著しい欠点を有する。これらには、（１）増大する規制上の懸念、（２）高い力価及び特異性で大容量を調達することの困難さ、（３）ロット間の変動性、（４）性質決定に関する限界及び（５）費用が含まれる。
【００１１】
従って、較正用物質、陽性対照及び／又はパネル要素として機能するための特異的抗体に対する要望が本分野においてなお存在している。本開示は、新規抗体、これらの抗体を産生する細胞株及びこれらの抗体を作製する方法を提供することによって、現行のＴ．ｃｒｕｚｉイムノアッセイの問題（すなわち、増大する規制上の懸念、高い力価及び特異性で大容量を調達することの困難さ、ロット間の変動性、性質決定に関する限界及び費用）の幾つかを場合によって克服又は回避する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｃｏｕｒａ， Ｊ．， ａｎｄ Ｓ． ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ、Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ、２００２年、９７、ｐｐ．３−２４
【非特許文献２】Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ．Ｖ．、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ（Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ、Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｖｏｌ．Ｒ． Ｇｕｅｒｒａｎｔ， Ｄ． Ｗａｌｋｅｒ， ａｎｄ Ｐ． Ｗｅｌｌｅｒ， ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２００６年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１０８２−１０９４
【非特許文献３】Ｃｈａｇａｓ， Ｃ．、Ｎｅｕｅ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅｎ．Ｖｏｒｌａｕｆｉｇｅ Ｍｉｔｔｅｉｌｕｎｇ．Ａｒｃｈ．Ｓｃｈｉｆｆ．Ｔｒｏｐｅｎｈｙｇ、１９０９年ａ、１３、ｐｐ．１２０−１２２
【非特許文献４】Ｒｅｄｈｅａｄ， Ｓ．Ａ．他、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ａｎｄ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ：ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｙｐｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊ Ｅｕｋａｒｙｏｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２００６年、５３、ｐｐ．２−１１
【非特許文献５】Ｃｈａｇａｓ， Ｃ．、Ｎｏｖａ ｔｒｉｐａｎｏｚｏｍｉａｓｅ ｈｕｍａｎａ：Ｅｓｔｕｄｏｓ ｓｏｂｒｅ ａ ｍｏｒｆｏｌｏｊｉａ ｅ ｏ ｃｉｃｌｏ ｅｖｏｌｕｔｉｖｏ ｄｏ Ｓｃｈｉｚｏｔｒｙｐａｎｕｍ ｃｒｕｚｉ ｎ． ｇｅｎ．， ｎ． ｓｐ．， ａｊｅｎｔｅ ｅｔｉｏｌｏｊｉｃｏ ｄｅ ｎｏｖａ ｅｎｔｉｄａｄｅ ｍｏｒｂｉｄａ ｄｏ ｈｏｍｅｍ．Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ、１９０９年ｂ、１、ｐｐ．１５９−２１８
【非特許文献６】Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ， Ａ．Ｌ．、Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ、Ａｍ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ、１９７６年、１３０、ｐｐ．９７−１０３
【非特許文献７】Ｃｈｅｎｇ， Ｋ．Ｙ．他、Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００７年、１４、ｐｐ．３５５−６１
【非特許文献８】Ｇｒａｎｔ， Ｉ．Ｈ他、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｕｔｅ Ｃｈａｇａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．、１９８９年、１１１、ｐｐ．８４９−５１
【非特許文献９】Ｈｏｆｆ， Ｒ．他、Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｃｈａｇａｓ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ａｎ ｕｒｂａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｗｉｎｓ．Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．、１９７８年、７２、ｐｐ．２４７−５０
【非特許文献１０】Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ．Ｖ．、Ｉｓ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ａ ｎｅｗ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｏｕｒ ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ？ Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．、１９８９年、１１１、ｐｐ．７７３−５
【非特許文献１１】Ｓｋｏｌｎｉｃｋ， Ａ．、Ｄｏｅｓ ｉｎｆｌｕｘ ｆｒｏｍ ｅｎｄｅｍｉｃ ａｒｅａｓ ｍｅａｎ ｍｏｒｅ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ？ Ｊａｍａ．、１９８９年、２６２、ｐｐ．１４３３
【非特許文献１２】Ｓｅｇｕｒａ， Ｅ．、Ｘｅｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｉｎ Ｃｈａｇａｓ’ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖｏｌ．Ｒ．Ｒ． Ｂｒｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ａ． Ｍ． Ｓｔｏｋａ， ｅｄｉｔｏｒｓ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，、１９８７年、ｐｐ．４１−４５
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎｇ， Ｋ．Ｙ．他、Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ａ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、１４、ｐｐ．３５５−６１
【非特許文献１４】Ａｌｍｅｉｄａ， ＬＣ他、Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．、１９９７年、３７、ｐｐ．８５０−７
【非特許文献１５】Ｌｅｉｂｙ， Ｄ．Ａ．他、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ’． ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ， ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ， ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｋｉｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００年、３８、ｐｐ．６３９−４２
【非特許文献１６】Ｇｏｍｅｓ， Ｍ． Ｌ．他、Ｃｈａｇａｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｃ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ａｎｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ．、１９９９年、６０、ｐｐ．２０５−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本開示の目的は、トリパノソーマ（スキゾトリパナム）クルーズ抗原を特異的に結合する抗体（組換え抗体及びキメラ抗体を含む。）及びその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示の一態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合することができる組換え抗体（キメラ抗体を含む。）が提供される。抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドに対して特異的な抗体からなる群から選択される。
【００１５】
本開示の一態様において、抗体は前記抗体であり、以下からなる群から選択される。
【００１６】
（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＲＡであり、並びにさらに、前記抗体は、約７．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約７．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約４．０×１０^−３ｓ^−１から約３．０×１０^−１ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約５．７×１０^−１０Ｍから約４．３×１０^−７Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体は、約１．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１から約８．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約６．０×１０^−３ｓ^−１から約４．０×１０^−２ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約７．５×１０^−１０Ｍから約４．０×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ１０であり、並びにさらに、前記抗体は、（ａ）約５．０×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１から約３．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、（ｂ）約１．０×１０^−４ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び（ｃ）約３．３×１０^−１０Ｍから約１．６×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ３であり、並びにさらに、前記抗体は、約２．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約６．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約２．０×１０^−５ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約３．３×１０^−１２Ｍから約４．０×１０^−９Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。
【００１７】
本開示の別の態様において、抗体は、ＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から選択される細胞株によって発現されるキメラ抗体である。場合によって、抗体は、ＰＴＡ−８１３７、ＰＴＡ−８１３９、ＰＴＡ−８１４１及びＰＴＡ−８１４２からなる群から選択される細胞株によって発現される。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−ＩＧ^（Ｒ））又はこれらの断片である。
【００１８】
本開示の別の態様において、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができるこれらの抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）の１つ以上を含む免疫診断試薬が提供され、抗体はＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡからなる群から選択される。
【００１９】
本開示の別の態様に従えば、免疫診断試薬は以下からなる群から選択される抗体を含む。
【００２０】
（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＲＡであり、並びにさらに、前記抗体は、約７．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約７．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約４．０×１０^−３ｓ^−１から約３．０×１０^−１ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約５．７×１０^−１０Ｍから約４．３×１０^−７Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体は、約１．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１から約８．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約６．０×１０^−３ｓ^−１から約４．０×１０^−２ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約７．５×１０^−１０Ｍから約４．０×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ１０であり、並びにさらに、前記抗体は、（ａ）約５．０×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１から約３．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、（ｂ）約１．０×１０^−４ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び（ｃ）約３．３×１０^−１０Ｍから約１．６×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ３であり、並びにさらに、前記抗体は、約２．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約６．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約２．０×１０^−５ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約３．３×１０^−１２Ｍから約４．０×１０^−９Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。
【００２１】
本開示の別の態様に従えば、免疫診断試薬は、検出試薬、標準化試薬及び陽性対照試薬からなる群から選択される。
【００２２】
本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合することができる抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）が提供され、前記領域は、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％及び少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって構成されるエピトープを含む。本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する免疫診断試薬はキメラ抗体を含み、該キメラ抗体は配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合する。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片である。本開示の別の態様に従えば、これらの抗体を含む免疫診断試薬が提供される。
【００２３】
本開示の別の態様に従えば、抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）並びに前記抗体を含む免疫診断試薬（前記抗体は、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８及び配列番号２８）からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む。）が提供される。
【００２４】
本開示の別の態様に従えば、抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）並びに前記抗体を含む免疫診断試薬（前記抗体は、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２６）からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む。）が提供される。
【００２５】
本開示の別の態様に従えば、抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）及び前記抗体を含む免疫診断試薬（前記抗体は、配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のＶ_Ｈ領域及び配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のＶ_Ｈ領域及び配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のＶ_Ｈ領域及び配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のＶ_Ｈ領域及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域を含む抗体からなる群から選択される。）が提供される。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片である。
【００２６】
本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体を発現することができる細胞株が提供され、該細胞株はＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から場合によって選択される。ティー・クルツタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体を発現することができる細胞株も提供され、該細胞株はＰＴＡ−８１３７、ＰＴＡ−８１３９、ＰＴＡ−８１４１及びＰＴＡ−８１４２からなる群から場合によって選択される。
【００２７】
本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる１つ以上の抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）を場合によって含む免疫診断試薬を感度パネルとして使用することを含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイを標準化する方法が提供される。このようなパネルにおいて、１つ以上の抗体は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡに対して特異的な抗体からなる群から場合によって選択される。
【００２８】
本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を含有すると疑われる試料などの検査試料を、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を特異的に結合することができる１つ以上の抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）を含む免疫診断試薬と接触させることを含むＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の存在を検出する方法が提供される。場合によって、接触は、抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で行われる。さらに場合によって、前記方法は、形成された何れかの抗体：抗原複合体を検出することを含む。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片である。
【００２９】
本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉに対する抗体を含有すると疑われる試料などの検査試料を、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体に対して特異的な１つ以上の抗原と接触させることを含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体の存在を検出する方法が提供される。場合によって、この接触は、抗原：抗体複合体の形成を可能とする条件下で行われ、さらに場合によって、前記方法は、抗原：抗体複合体を検出することを含む。さらに、前記方法は、１つ以上の抗体（キメラ及び組換え抗体を含む。）を含む免疫診断試薬を使用することを場合によって含み、抗体の各々は、例えば、陽性対照又は標準化試薬の何れかとして、本方法において使用される抗原の１つを特異的に結合することができる。
【００３０】
本開示の別の態様に従えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる１つ以上の抗体（組換え及び組換えキメラ抗体を含む。）を含む免疫診断試薬を含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉの検出用診断キットが提供される。このようなキットにおいて、１つ以上の抗体は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡに対して特異的な抗体（キメラ及び組換え抗体）からなる群から場合によって選択される。抗体は、場合によって、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片である。
【００３１】
本開示のさらに別の態様に従えば、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０又はＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部を含む単離されたポリペプチドが提供される。キメラ抗体は、場合によって、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって構成されるエピトープを特異的に結合するキメラ抗体からなる群から選択される。単離されたポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８及び配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を場合によって含む。単離されたポリペプチドは、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を場合によって含む。さらに、単離されたポリペプチドは、配列番号１０のＶ_Ｈ領域及び配列番号１２のＶ_Ｌ領域；配列番号１４のＶ_Ｈ領域及び配列番号１６のＶ_Ｌ領域；配列番号１８のＶ_Ｈ領域及び配列番号２０のＶ_Ｌ領域；並びに配列番号２８のＶ_Ｈ領域及び配列番号２６のＶ_Ｌ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域をともに含む。
【００３２】
本開示のさらに別の態様に従えば、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。キメラ抗体は、場合によって、配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配列番号８に記載されているアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって構成されるエピトープを特異的に結合するキメラ抗体からなる群から選択される。単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８及び配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする領域を場合によって含む。単離されたポリペプチドは、配列番号１２、配列番号１６、配列番号２０及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする領域を含む。さらに、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１０のＶ_Ｈ領域及び配列番号１２のＶ_Ｌ領域；配列番号１４のＶ_Ｈ領域及び配列番号１６のＶ_Ｌ領域；配列番号１８のＶ_Ｈ領域及び配列番号２０のＶ_Ｌ領域；並びに配列番号２８のＶ_Ｈ領域及び配列番号２６のＶ_Ｌ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域をともにコードする領域を含む。別の態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２５及び配列番号２７からなる群から選択されるポリヌクレオチドである。
【００３３】
本開示のさらに別の態様に従えば、抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドを含有すると疑われる試料を、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質に特異的に結合することができる１つ以上の抗体（キメラ又は組換え抗体を含む。）を含む免疫診断試薬と接触させること、形成された抗体：抗原複合体を単離すること及び抗体から抗原を分離することを含む、配列番号１、３、５又は７に記載されているアミノ酸配列によって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉアミノ酸配列を含む抗原を精製する方法が提供される。場合によって、抗体（キメラ及び組換え抗体）は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドに結合する。
【００３４】
本開示のこれら及び他の特徴、態様、目的及び実施形態は、このような特徴、態様、目的及び実施形態を例示する添付の図面がその中において参照されている以下の詳細な説明においてさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本開示のキメラ（マウス−ヒト）抗Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープ抗体の模式的構造を表す。
【図２】図２は、プラスミドシャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢｊ、プラスミドサイズ：９５２０ヌクレオチドを模式的に図示している。アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦは、塩基６０−９１７に位置しており、エンハンサーは、塩基１５５１から２０２１に位置しており、プロモーターは、塩基２０２３から２７４４に位置しており、重鎖シグナルペプチドは、塩基２７７２から２８２８に位置しており、Ｖ_Ｈ遺伝子は、塩基２８２９から３１９４に位置しており、ヒト定常ｈｇＧ１、ｚ、非−ａは、塩基３１９５から４１８７に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基４２１９から４４１３に位置しており、ＳＶ４０プロモーターは、塩基４６８４から５２２９に位置しており、マウスＤＨＦＲは、塩基５２５７から５８２０に位置しており、ＴＫポリＡは、塩基５８４７から６２１３に位置しており、エンハンサーは、塩基６２４１から６７１１に位置しており、プロモーターは、塩基６７１２から７４３３に位置しており、κシグナルペプチドは、塩基７４６０から７５２５に位置しており、Ｖ_Ｌ遺伝子は、塩基７５２６から７８６１に位置しており、ヒト定常κは、塩基７８６２から８１８５に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基８１９８から８３９２に位置しており、及び、ｐＵＣ起点は、塩基８７５９から９４３２（相補的）に位置しており、
【図３Ａ】図３ＡからＣは、シャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪ中にクローニングされたＶＨ及びＶＬ配列（及び隣接領域）に対する注釈付き注釈付き二本鎖ポリヌクレオチド配列を図示する。図３ＡからＢは、塩基２７７２から２８２８に位置する重鎖シグナルペプチド、塩基２８２９から３１９４に位置するＶＨ遺伝子配列及び塩基３１９５から４１８７に位置するヒト定常ＩｇＧ１、ｚ、非ａ配列に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２１から２２）を図示する。
【図３Ｂ】図３ＡからＣは、シャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪ中にクローニングされたＶＨ及びＶＬ配列（及び隣接領域）に対する注釈付き注釈付き二本鎖ポリヌクレオチド配列を図示する。図３ＡからＢは、塩基２７７２から２８２８に位置する重鎖シグナルペプチド、塩基２８２９から３１９４に位置するＶＨ遺伝子配列及び塩基３１９５から４１８７に位置するヒト定常ＩｇＧ１、ｚ、非ａ配列に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２１から２２）を図示する。
【図３Ｃ】図３ＡからＣは、シャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪ中にクローニングされたＶＨ及びＶＬ配列（及び隣接領域）に対する注釈付き注釈付き二本鎖ポリヌクレオチド配列を図示する。図３Ｃは、塩基７４６０から７５２５に位置するκシグナルペプチド、塩基７５２６から７８６１に位置するＶＬ遺伝子配列及び塩基７８６２から８１８５に位置するヒト定常κ配列に対するポリヌクレオチド配列（配列番号２３から２４）を図示する。
【図４】図４は、プラスミドシャーガス９−６３８Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢｊ、プラスミドサイズ：９５１４ヌクレオチドを模式的に図示している。アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦは、塩基６０から９１７に位置している；エンハンサーは、塩基１５５１から２０２１に位置しており、プロモーターは、塩基２０２３から２７４４に位置しており、重鎖シグナルペプチドは、塩基２７７２から２８２８に位置しており、Ｖ_Ｈ遺伝子は、塩基２８２９から３１８８に位置しており、ヒト定常ｈｇＧ１、ｚ、非−ａは、塩基３１８９から４１８１に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基４２１３から４４０７に位置しており、ＳＶ４０プロモーターは、塩基４６７８から５２２３に位置しており、マウスＤＨＦＲは、塩基５２５１から５８１４に位置しており、ＴＫポリＡは、塩基５８４１から６２０７に位置しており、エンハンサーは、塩基６２３５から６７０５に位置しており、プロモーターは、塩基６７０６から７４２７に位置しており、κシグナルペプチドは、塩基７４５４から７５１９に位置しており、Ｖ_Ｌ遺伝子は、塩基７５２０から７８５８に位置しており、ヒト定常κは、塩基７８５９から８１７９に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基８１９２から８３８６に位置しており、及び、ｐＵＣ起点は、塩基８７５３から９４２６（相補的）に位置している。
【図５】図５は、プラスミドシャーガス１０−７４５Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪ、プラスミドサイズ：９５１４ヌクレオチドを模式的に図示している。アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦは、塩基６０から９１７に位置している；エンハンサーは、塩基１５５１から２０２１に位置しており、プロモーターは、２０２３から２７４４に位置しており、重鎖シグナルペプチドは、塩基２７７２から２８２８に位置しており、Ｖ_Ｈ遺伝子は、塩基２８２９から３１８８に位置しており、ヒト定常ＩｇＧ１、ｚ、非−ａは、塩基３１８９から４１８１に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基４２１３から４４０７に位置しており、ＳＶ４０プロモーターは、塩基４６７８から５２２３に位置しており、マウスＤＨＦＲは、塩基５２５１から５８１４に位置しており、ＴＫポリＡは、塩基５８４１から６２０７に位置しており、エンハンサーは、塩基６２３５から６７０５に位置しており、プロモーターは、塩基６７０６から７４２７に位置しており、κシグナルペプチドは、塩基７４５４から７５１９に位置しており、Ｖ_Ｌ遺伝子は、塩基７５２０から７８５５に位置しており、ヒト定常κは、塩基７８５６から８１７９に位置しており、ＳＶ４０ポリＡは、塩基８１９２から８３８６に位置しており、及び、ｐＵＣ起点は、塩基８７５３から９４２６（相補的）に位置している。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、とりわけ、トリパノソーマ（スキゾトリパナム）クルーズ抗原を検出又は定量するための方法、アッセイ及びキットを提供する。本開示の一実施形態に従えば、本開示の組換え抗体（キメラ抗体を含む。）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合し、従って、例えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉの検出用診断試薬として、及び／又はＴ．ｃｒｕｚｉの検出用アッセイにおける標準化試薬若しくは陽性対照試薬としての使用に適している。
【００３７】
従って、本開示は、各抗体がＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる１つ以上の抗体（キメラ抗体を含む。）を含む免疫診断試薬も提供する。組換え抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片などであり得る。別の実施形態において、免疫診断試薬は、２つ以上の組換え抗体（キメラ抗体を含む。）を含む。場合によって、免疫診断試薬中で使用される抗体は、免疫診断試薬がＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の複数を検出することができるように、それぞれ、異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質に対して特異的である。場合によって、免疫診断試薬は、シャーガスＦＰ３抗原に対して特異的な組換え抗体、シャーガスＦＰ６抗原に対して特異的な組換え抗体、シャーガスＦＰ１０抗原に対して特異的な組換え抗体及びシャーガスＦＲＡ抗原に対して特異的な組換え抗体からなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して特異的な少なくとも１つ若しくはそれ以上、又は少なくとも２つ若しくはそれ以上の組換え抗体を含む。さらに別の実施形態において、免疫診断試薬の１つ以上の抗体は、ハイブリドーマ細胞株によって産生される新規モノクローナル抗体であり、シャーガスＦＰ３抗原に対して特異的なモノクローナル抗体、シャーガスＦＰ６抗原に対して特異的なモノクローナル抗体、シャーガスＦＰ１０抗原に対してモノクローナル抗体及びシャーガスＦＲＡ抗原に対してモノクローナル抗体からなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して特異的である。
【００３８】
一実施形態において、本開示は、例えば、ヒト血清に代えて、Ｔ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイ中の標準化試薬として、免疫診断試薬を使用することを提供する。この文脈において、例えば、現行及び将来のＴ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイの性能を評価及び標準化するために、免疫診断試薬を場合によって使用することができる。
【００３９】
本開示のこれらの及びさらなる実施形態、特徴、態様、例示及び実施例が、以下の節にさらに記載されている。本明細書中に別段の定義がなければ、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４０】
Ａ．定義
本明細書に使用されているように、文脈上明確に反対の記述がなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、複数表記が含まれる。本明細書での数的範囲の引用に関して、その間に介在する各数字は、同じ正確度で明示的に想定される。例えば、範囲６から９の場合、６及び９に加えて、数字７及び８が想定され、範囲６．０から７．０の場合、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に想定される。
【００４１】
ａ）約
本明細書において使用される「約」という用語は、表記されている値からのおよそ＋／−１０％の変動を表す。このような変動は、具体的に参照されているかどうかに関わらず、本明細書に提供されている何れの所定の値にも常に含まれることを理解すべきである。
【００４２】
ｂ）抗体
本明細書において使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、ＴＣＡに対して誘導された単一の抗体（抗ＴＣＡ抗体）、ポリエピトープ特異性を有する抗ＴＣＡ抗体組成物、一本鎖抗ＴＣＡ抗体及び抗ＴＣＡ抗体の断片を含む。「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に均質な抗体の集団から得られる。すなわち、集団を構成する各抗体は、微量に存在する可能性がある天然の変異を除けば同一である。典型的な抗体には、ポリクローナル（ｐＡｂ）、モノクローナル（ｍＡｂ）、ヒト化、二重特異的（ｂｓＡｂ）、ヘテロ連結物抗体及び二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ^（Ｒ））及び二重可変ドメイン免疫グロブリンの誘導体（三重可変ドメインなど）が含まれる（二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその作製方法は、Ｗｕ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２５（１１）：１２９０−１２９７（２００７）及びＷＯ２００１／０５８９５６（これらの各々の内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。）。
【００４３】
ｃ）抗体断片
本明細書において使用される「抗体断片」という用語は、完全状態の抗体の抗原結合部位又は可変領域を含む完全状態の抗体の一部を表し、前記一部は完全状態の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体イソタイプに応じて、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及びＣ_Ｈ４）を含まない。抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、軽鎖可変ドメインを１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、重鎖可変領域を１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド及び重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
ｄ）二重機能性抗体
本明細書において使用される「二重機能性抗体」という用語は、ある抗原性部位に対して特異性を有する第一のアーム及び異なる抗原性部位に対して特異性を有する第二のアームを含む抗体をあらわす。すなわち、二重機能性抗体は二重の特異性を有する。
【００４５】
ｅ）生物学的試料
「生物学的試料」という用語には、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体が含まれる。対象から得られる生物学的試料は、ポリペプチド分子を含有する。生物学的試料の例には、全血、血清、血漿、間質液、唾液、眼のレンズ液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹腔液、膣液、月経血、羊水及び精液が含まれる。インビトロ及びインビボで生物学的試料中のＴＣＡを検出するために、検出方法を使用することができる。ＴＣＡを検出するためのインビトロ技術には、酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が含まれる。さらに、ＴＣＡを検出するためのインビボ技術には、標識された抗ＴＣＡ抗体を対象中に導入することが含まれる。例えば、抗体は、対象中でのその存在及び位置を標準的な画像化技術によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【００４６】
ｆ）結合定数
本明細書において互換的に使用される「会合速度定数」、「ｋ_ｏｎ」又は「ｋ_ａ」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原への抗体の結合速度又は抗体と抗原の間での複合体形成の速度を示す値を表す。
【００４７】
抗体（「Ａｂ」）＋抗原（「Ａｇ」）−＞Ａｂ−Ａｇ
本明細書において互換的に使用される「解離速度定数」、「ｋ_ｏｆｆ」又は「ｋ_ｄ」という用語は、以下の式によって示されているように、標的抗原からの抗体の解離速度又はＡｂ−Ａｇ複合体が経時的に遊離の抗体及び抗原へ分離することを示す値を表す。
【００４８】
Ａｂ＋Ａｇ＜−Ａｂ−Ａｇ
会合及び解離速度定数を測定するための方法は、本分野において周知である。蛍光を基礎とする技術を用いることによって、平衡状態にある生理的緩衝液中で試料を調べるための高い感度及び能力が得られる。ＢＩＡｃｏｒｅ^（Ｒ）（生物分子相互作用分析）アッセイなどの他の実験的アプローチ及び装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢから入手可能な装置、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することが可能である。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ^（Ｒ）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイも使用することが可能である。
【００４９】
本明細書において互換的に使用される「平衡解離定数」又は「Ｋ_Ｄ」という用語は、会合速度（ｋ_ｏｎ）によって解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を除することによって得られた値を表す。会合速度、解離速度及び平衡解離定数は、抗原への抗体の結合親和性を表すために使用される。
【００５０】
ｇ）キメラ抗体
本明細書において使用される「キメラ抗体」（又は「ｃＡｂ」）という用語は、別の宿主種由来の抗体定常領域の少なくとも一部に連結されたある宿主種由来の抗体の重及び軽鎖可変領域の全部又は一部を含むポリペプチドを表す。
【００５１】
ｈ）対応している又は対応する
「対応している」又は「対応する」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の全部又は一部と同一であることを表す。「〜に相補的」という用語は、核酸配列が参照核酸配列の相補的な鎖の全部又は一部と同一であることを表すために、本明細書において使用される。例として、核酸配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
【００５２】
本明細書において別段の記載がなければ、全ての核酸配列は５’から３’の方向に書かれており、全てのアミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書かれている。
【００５３】
ｉ）誘導化された抗体
本明細書において使用される「誘導化された抗体」という用語は、別の機能的分子に誘導化された又は連結された抗体又は抗体の一部を表す。例えば、抗体又は抗体断片は、化学的カップリング、遺伝的融合又は非共有会合などによって、別の抗体、検出可能な因子、細胞毒性因子、薬剤及び抗体又は抗体の一部の別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介することができるポリペプチドなどの１つ以上の分子に機能的に連結され得る。誘導化された抗体の１つの種類は、２つ以上の抗体を架橋することによって産生される。適切な架橋剤には、ヘテロ二機能性（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二機能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）であるものが含まれる。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）から入手することができる。
【００５４】
ｊ）検出可能な標識
本明細書において使用される「検出可能な標識」という用語には、直接又は間接的に検出することが可能な分子又は部分が含まれる。さらに、これらの因子は抗体で誘導化することが可能であり、蛍光性化合物が含まれる。標識のクラスには、蛍光性、発光性、生物発光性及び放射性物質、酵素及び補欠分子族が含まれる。有用な標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エコーリン及び^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ又は^３Ｈが含まれる。
【００５５】
ｋ）診断的に適切な
Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の領域に関して本明細書において使用される「診断的に適切な」という用語は、その検出が、単独で又はシャーガスの他の診断的に適切な領域と組み合わせて、Ｔ．ｃｒｕｚｉの検出を可能とするタンパク質の領域を表す。診断的に適切な領域の例には、本分野において公知の免疫優性領域及び本明細書に記載されているような領域が含まれる。
【００５６】
ｌ）エピトープ又は目的のエピトープ
本明細書において使用される「エピトープ」又は「目的のエピトープ」という用語は、認識され及びその特異的な結合対上の相補的部位に結合することができる何れかの分子上の部位を表す。分子及び特異的結合対は、特異的結合対の一部である。例えば、エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、ハプテン、炭水化物抗原（糖脂質、糖タンパク質又はリポ多糖など（但し、これらに限定されない。））又は多糖であり得、その特異的結合対は抗体であり得る（但し、これらに限定されない。）。典型的には、エピトープは、より大きな抗原性断片（すなわち、抗体を結合することができる領域又は断片）内に含有され、特異的結合対に接触することが知られている正確な残基を表す。抗原性断片は２以上のエピトープを含有することが可能である。
【００５７】
ｍ）ヒト化抗体
本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、可変領域の一部が非ヒト種由来の対応する配列によって可変領域の一部が置換されており及び修飾された可変領域がヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に連結されている、ヒト抗体の修飾された可変領域を含むポリペプチドを表す。一実施形態において、可変領域の一部は相補性決定領域（ＣＤＲ）の全部又は一部である。この用語は、ハイブリッド抗体が所望の生物活性（すなわち、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質を特異的に結合する能力）を示す限り、起源となる種、タンパク質の種類、免疫グロブリンクラス又はサブクラスの指定に関わらず、非ヒト抗体の可変領域又は１つ若しくはそれ以上のＣＤＲを異種タンパク質とスプライシングすることによって産生されたハイブリッド抗体も含まれる。
【００５８】
ｎ）単離された又は精製された
「単離された」又は「精製された」という用語は、分子を参照する場合、同定されており、その天然環境の成分から分離及び／又は回収されている分子を表す。その天然環境のきょう雑成分は、診断又は治療的使用を妨害する物質である。「単離された」又は「精製された」ポリペプチド又は本明細書において使用されている生物学的に活性な断片（Ｆａｂ断片など）は、その環境の成分から分離及び／又は回収されているポリペプチド又は生物学的に活性な断片を表す。きょう雑成分には、ポリペプチドに関する診断的使用を通例妨害する物質が含まれ、酵素、ホルモン及び他のポリペプチド性又は非ポリペプチド性物質が含まれ得る。実質的に単離するために、調製物は、きょう雑物質の乾燥重量の約３０％未満（すなわち、約０．０１％から約３０％）、通常、約２０％未満（すなわち、約０．０１％から約２０％）、約１０％未満（すなわち、約０．０１％から約１０％）、より頻繁には、約５％未満（すなわち、約０．０１％から約５％）のきょう雑物質を有する。単離され、組換え的に産生されたＴＣＡ、Ｖ_Ｌ若しくはＶ_Ｈ又は生物学的に活性な部分は、望ましくは、培地を実質的に含まない。すなわち、培地は、ＴＣＡ、Ｖ_Ｌ又はＶ_Ｈ調製物の容量の約２０％、約１０％又は約５％未満を占める。従って、本明細書において使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を表す。しかしながら、Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープを特異的に結合する単離された抗体は、例えば、シャーガスポリペプチドＴｃｆ及びＦＰ６上に見出されるＰｅｐ２エピトープを結合する抗体など、他のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対する交叉反応性を有することができる。
【００５９】
ｏ）品質管理試薬
本明細書において記載されるように、イムノアッセイは、例えば、較正用物質、対照及び感度パネルを含む（但し、これらに限定されない。）「品質管理試薬」を取り込む。「較正用物質」又は「標準」は、抗体濃度を内挿するための較正（標準）曲線を確立するために、通例使用される（例えば、１つ以上又は種々の）場合によって、正／負のカットオフに近い単一の較正用物質を使用することができる。「感度」パネルを構成するために、複数の較正用物質（すなわち、２以上の較正用物質又は較正用物質の変動量）を合わせて使用することができる。「陽性対照」はアッセイ性能特性を確立するために使用され、試薬（例えば、抗原）の完全性の有用な指標である。
【００６０】
ｐ）組換え抗体
本明細書において使用される「組換え抗体」という用語は、組換え技術によって、１つ以上のモノクローナル抗体の全部又は一部をコードする核酸配列を適切な発現ベクター中にクローニングし、続いて、適切な宿主細胞中で抗体を発現させることを含む１つ以上の工程によって調製された抗体を表す。従って、この用語には、モノクローナル抗体である組換え的に作製された抗体、モノクローナル抗体の断片を含む抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体（完全又は部分的にヒト化）、抗体断片から形成された多重特異的又は多価構造（二重可変ドメイン免疫グロブリン、ＤＶＤ−Ｉｇ^（Ｒ）と名付けられた四価ＩｇＧ様分子を含む。）及び二重機能性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
ｑ）特異的な又は特異性
本明細書において使用される、特異的な結合対（例えば、抗原及び抗体）の要素間での相互作用に関する「特異的な」又は「特異性」は、相互作用の選択的反応性を表す。「〜に特異的に結合する」という用語及びその類似語は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質に特異的に結合し、他の物体には特異的に結合しない抗体の能力を表す。Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片は、例えば、診断用イムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）及び酵素連結免疫吸着アッセイ（「ＥＬＩＳＡ」）（例えば、Ｐａｕｌ， ｅｄ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ３３２−３３６ （１９８９）参照）、ＢＩＡｃｏｒｅ^（Ｒ）（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）、ＫｉｎＥｘＡ^（Ｒ）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）から入手可能）又は当業者に公知の他の技術によって同定され得る。
【００６２】
ｒ）実質的に同一の
核酸又はアミノ酸配列に関して本明細書で使用される「実質的に同一の」という用語は、例えば、以下に記載されている方法を用いて、最適に並置された場合に、その核酸又はアミノ酸配列が所定の別の核酸又はアミノ酸配列（又は「参照配列」）と少なくとも約７０％（例えば、約７０％から約１００％）、少なくとも約７５％（例えば、約７５％から約１００％）、少なくとも約８０％（例えば、約８０％から約１００％）、少なくとも約８５％（例えば、約８５％から約１００％）、少なくとも約９０％（例えば、約９０％から約１００％）、少なくとも約９５％（例えば、約９５％から約１００％）、少なくとも約９６％（例えば、約９６％から約１００％）、少なくとも約９７％（例えば、約９７％から約１００％）、少なくとも約９８％（例えば、約９８％から約１００％）又は少なくとも約９９％（例えば、約９９％から約１００％）の配列同一性を有することを表す。「実質的な同一性」は、完全長配列、エピトープ又は免疫原性ペプチド、機能的ドメイン、コード及び／又は制御配列、エキソン、イントロン、プロモーター及びゲノム配列など、配列の様々な種類及び長さを表すために使用することができる。２つのアミノ酸又は核酸配列間の％同一性は、当業者の技術水準の範囲に属する様々な方法で、例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ， Ｔ． Ｆ． ａｎｄ Ｍ． Ｓ． Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１） Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ １４７：１９５−７）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ Ｐｌｕｓ^ＴＭに取り込まれているような“ＢｅｓｔＦｉｔ”（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１））、Ｓｃｈｗａｒｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｄａｙｈｏｆ， Ｍ． Ｏ．， Ｅｄ ｐｐ３５３−３５８；ＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ， ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３−１０）並びにＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬ及びＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどのこれらの変形などの一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて測定することができる。さらに、当業者は、比較されている配列の長さにわたって最大の並置を達成するために必要とされるアルゴリズムなど、並置を測定するための適切なパラメータを決定することが可能である。一般に、アミノ酸配列に関して、比較配列の長さは少なくとも約１０アミノ酸である。当業者は、実際の長さが比較されている配列の全長に依存すること、及び少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１１０、少なくとも約１２０、少なくとも約１３０、少なくとも約１４０、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００若しくは少なくとも約３５０アミノ酸であり得、又はアミノ酸配列の完全長であり得ることを理解する。核酸の場合、比較配列の長さは、一般に、少なくとも約２５ヌクレオチドであるが、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００若しくは少なくとも約１０００であり得、又は核酸配列の完全長であり得る。
【００６３】
ｓ）表面プラズモン共鳴
本明細書において使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^（Ｒ）システム（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ａ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｏｌｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｅｎｓｏｒｓ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−７７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．１９９５．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｅｎｓｏｒ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−３１； Ｊｏｎｓｓｏｎ， Ｕ．， ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｂａｓｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｎｎ Ｂｉｏｌ ＣＵｎ （Ｐａｒｉｓ）５１：１９−２６）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイム二重特異的相互作用の分析を可能とする光学的現象を表す。
【００６４】
ｔ）ＴＣＡ
本明細書で使用される「ＴＣＡ」という略号は、「Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原」を意味する。ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＴｃＦ、ＦＰ６及びＦＰ１０はＴＣＡを表し、以下でさらに定義されている。他の略号は導入されるごとに定義されている。
【００６５】
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載することを目的とするものであり、その他の限定を意図するものではない。
【００６６】
Ｂ．抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体及び該抗体を産生する細胞株
本開示は、とりわけ、新規抗体、これらの抗体を産生する細胞株及びこれらの抗体を作製する方法を提供する。これらの抗体は、様々なＴ．ｃｒｕｚｉ抗原（ＴＣＡ）を結合し、ＦＰ３、Ｐｅｐ２（ＴｃＦ、ＦＰ６）及びＦＰ１０ポリペプチド中に含有されているものが含まれ、マウスｍＡｂ、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＣＤＶＤ−Ｉｇ^（Ｒ））などのｍＡｂとして、又はマウス−ヒト（Ｍｕ−Ｈｕ）キメラなどのキメラ抗体として使用することができる。これらの抗体は、イムノアッセイ中の陽性対照として有用である。さらに、抗体は、ＴＣＡを保有するＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドを精製するために使用することができる。本開示の抗体及び細胞株の例が、以下の表１に挙げられている。
【００６７】
【表１】

【００６８】
本開示の抗体のさらなる例は、
（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合し（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＲＡであり、並びにさらに、前記抗体は、約７．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約７．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約４．０×１０^−３ｓ^−１から約３．０×１０^−１ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約５．７×１０^−１０Ｍから約４．３×１０^−７Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体は、約１．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１から約８．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約６．０×１０^−３ｓ^−１から約４．０×１０^−２ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約７．５×１０^−１０Ｍから約４．０×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ１０であり、並びにさらに、前記抗体は、（ａ）約５．０×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１から約３．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、（ｂ）約１．０×１０^−４ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び（ｃ）約３．３×１０^−１０Ｍから約１．６×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体（Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドはＦＰ３であり、並びにさらに、前記抗体は、約２．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約６．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約２．０×１０^−５ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約３．３×１０^−１２Ｍから約４．０×１０^−９Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する。）；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。
【００６９】
本明細書中でさらに記載されているような抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体及びこれらの抗体を産生する細胞株を作製するために、一般に、２工程のプロセスを経た。（１）目的の抗原（Ｔ．ｃｒｕｚｉエピトープ（ＴＣＡ））に特異的に結合されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が開発され、及び（２）組換え技術を用いて、キメラ抗体を改変し、次いで、改変された抗体を産生させるために、哺乳動物の発現細胞株を使用した。この第二の部分において、所望のｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞株を同定した後、ｍＲＮＡをこれらの細胞から単離し、抗体遺伝子配列を同定した。次いで、（ヒト抗体配列を供給する）ｐＢＯＳベクター中に可変軽（Ｖ_Ｌ）及び可変重（Ｖ_Ｈ）ポリヌクレオチド配列をクローニングし、次いで、得られたキメラ抗体が機能的であることを確認するために、一過性発現系中にｐＢＯＳベクターを同時形質移入した。確認したら、Ｖ_Ｌ配列をｐＪＶプラスミド中に、及びＶ_Ｈ配列をｐＢＶプラスミド中にサブクローニングした。これらのベクターは、次いで、安定なｐＢＪ発現ベクターを構築するために使用した。次いで、ｐＢＪでＣＨＯ細胞を形質移入し、形質移入体を選択し、分泌された抗体を再度検査し、産業規模の製造を可能とする。従って、本開示のキメラ抗体の典型を作製するために、マウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域をヒト定常鎖（ＣＨ）及び定常軽鎖（ＣＬ）領域と組み合わせた。従って、キメラ抗体は、ＴＣＡに対するマウスｍＡｂ機能的特異性及び親和性を保持しているが、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）を検出するために設計された抗体アッセイにおいて反応する。一実施形態において、本開示は、ＴＣＡＦＰ３、Ｐｅｐ２（ＦＰ６／Ｔｃｆ）、ＦＰ１０及びＦＲＡを特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に関する。ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０又はＦＲＡ組換え抗原を用いて、マウスを個別に免疫化し、抗体産生マウスを同定し、安楽死させ、脾細胞を採集し、骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞株を産生するｍＡｂを単離する。
【００７０】
Ｃ．免疫診断用試薬
本開示の免疫診断用試薬は、本明細書に記載されている１つ以上の抗体を含む（例えば、本明細書中のＢ及びＥ節を参照。）。例えば、免疫診断用試薬を含む抗体には、組換え抗体が含まれ得、ここでも、組換え抗体にはＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する組換えキメラ抗体が含まれる。従って、一実施形態において、本開示によって提供される免疫診断用試薬は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる単一の抗体を含む。別の実施形態において、本開示によって提供される免疫診断用試薬は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる単一のキメラ抗体を含む。他の実施形態において、免疫診断用試薬は、各々がＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域（例えば、同じ領域又は異なる領域）を特異的に結合することができる１つ以上の組換え抗体（組換えキメラ抗体など）を含み得る複数の抗体を含む。複数のキメラ抗体の１つ以上は、同じＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することが可能であり得る。あるいは、キメラ抗体の複数の各々は、異なるＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる。
【００７１】
本開示の一実施形態において、免疫診断用試薬は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の複数を検出することが可能であり、各々が異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質を特異的に結合することができる２つ以上の組換え抗体を場合によって含む。さらなる実施形態において、免疫診断用試薬は、各々が異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質を特異的に結合することができる３つ以上の組換え抗体を場合によって含む。別の実施形態において、免疫診断用試薬は、各々が異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質を特異的に結合することができる４つ以上の組換え抗体を場合によって含む。
【００７２】
免疫診断用試薬によって含まれる組換え抗体は、例えば、検出目的のために、固体支持体上への固定化のために、安定性を改善するために及び／若しくは薬物動態学的特性を改善するために、又は本分野において公知である他の手段によって場合によって修飾され得る。
【００７３】
Ｄ．Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原
Ｔ．ｃｒｕｚｉは、複雑な生活環を有する複雑な生物である。しかしながら、寄生生物の診断的検出のために有用である重要な抗原が同定されている。
【００７４】
ＦＰ３抗原（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ， Ｌ． Ｖ．， ａｎｄ Ｋ． Ｏｔｓｕ．米国特許出願２００４／０１３２０７７号。２００４）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉＡｇ１５（Ｏｔｓｕ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．１９９３．Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １４−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｐｅａｔｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５７：３１７−３０）とＴ．ｃｒｕｚｉプロテインＣ（後者は、鞭毛カルシウム結合タンパク質（Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９８５．Ａｐｐａｒｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｍＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｓｅｐａｒａｔｅ ｔａｎｄｅｍ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：５７８９−８０４）の組み合わせに実質的に対応する組換えタンパク質である。ポリヌクレオチド配列（配列番号１）及びポリペプチド配列（配列番号２）は、それぞれ、下表２及び３に示されている。Ｔ．ｃｒｕｚｉの１４アミノ酸反復に対して特異的なアミノ酸配列は表３において下線が付されており、Ｔ．ｃｒｕｚｉのプロテインＡに対応するアミノ酸は表３において太字で記載されており、プロテインＢに対応するアミノ酸は表３において斜字体で記載されており、プロテインＣに対応するアミノ酸は表３において二重下線が付されている。
【００７５】
【表２】

【００７６】
【表３】

【００７７】
Ｐｅｐ２抗原（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ及びＯｔｓｕ，２００４）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＰ６及びＴｃｆ、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチド（何れも、Ｐｅｐ２抗原を有する。）の反復配列の組換えタンパク質である。ポリヌクレオチド配列（配列番号３）及びポリペプチド配列（配列番号４）が、それぞれ、表４及び５に示されている。
【００７８】
【表４】

【００７９】
【表５】

【００８０】
ＦＰ１０抗原（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ ａｎｄ Ｏｔｓｕ， ２００４）は、Ｔ．ｃｒｕｚｉの反復配列の別の組換えタンパク質である。そのポリヌクレオチド（配列番号５）及びポリペプチド（配列番号６）配列は、それぞれ、下表６及び７に示されている。Ｉ−ドメインのアミノ酸配列は表７中において下線が付されており、Ｊ−ドメインのアミノ酸配列は、表７中において斜字体で記載されており、Ｋ−ドメインのアミノ酸配列は、表７中において太字で記載されており、Ｌ−ドメインのアミノ酸配列は表７中において二重下線が付されている。
【００８１】
【表６】

【００８２】
【表７】

【００８３】
ＦＲＡ抗原は、鞭毛反復タンパク質配列であり（Ｌａｆａｉｌｌｅ， ＪＪ．， ｅｔｃ．１９８９．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３５：１２７−３６）、ＧｅｎＢａｎｋ受付番号Ｊ０４０１５、下表８（ポリヌクレオチド配列、配列番号７）及び９（ポリペプチド配列；配列番号８）に示されている。
【００８４】
【表８】

【００８５】
【表９】

【００８６】
配列番号２、４、６及び８のＴＣＡは、インビトロで合成することが可能であり、又はポリヌクレオチド配列（配列番号１、３、５及び７と実質的に類似するものなど）から組換え的に発現することが可能である。遺伝子コードの縮重並びに配列番号２、４、６及び８のポリペプチドが置換を許容する能力のために、本開示を実施するために、配列は同一である必要はない。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の同一性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％及び、もちろん、約１００％など、約７０％から約１００％（特に、約９０％から約９７％）の範囲であり得る。
【００８７】
ＴＣＡは、ポリペプチド化学を用いて、インビトロで容易に合成することができる。例えば、ポリペプチド合成は、Ｒａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ， Ａｒｇｏｎａｕｔ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ又はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒなどの自動化されたポリペプチド合成装置を用いて、固相支持体上に、段階的様式で実施することができる。ペプチド合成装置は、固相ペプチド合成を実施するために、Ｆｍｏｃ化学をＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ活性化と組み合わせる。
【００８８】
合成は、Ｃ末端アミノ酸から始まり、カルボキシ末端は不溶性のポリマー支持体樹脂に共有結合される。有用な樹脂は、樹脂１ｇ当りＣ末端アミノ酸０．１ｍｍｏｌから０．７ｍｍｏｌを搭載することができる。ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＭＡ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）、Ｎ，Ｎ−ジ−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）又は水など、典型的な合成サイクルの間に使用される様々な溶媒及び化学物質に対して耐性を示し、連続的なフロー又はバッチ合成用途に適し得る。有用な樹脂の例には、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂（ＨＭＰ樹脂）、ＰＥＧｃｏ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、ＮｏｖａＳｙｎＴＧＡ^（Ｒ）樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂及びＣＬＥＡＲアミド樹脂が含まれる。アミノ酸が結合された樹脂は多数の様々な入手先から市販されているが、このような結合された樹脂は実験室において調製することもできる。
【００８９】
樹脂に結合されたアミノ酸（又はポリペプチド）のＮ末端は、次のＮ−末端アミノ酸反応物質の添加前に除去される９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によって化学的に保護される。Ｆｍｏｃ基は、ＮＭＰ又はＤＭＦなどの適切な溶媒中のアミン（２０から５５％ピペリジンなどの）の濃溶液によって容易に除去される塩基に対して不安定な保護基である。Ｆｍｏｃ脱保護のための他の有用なアミンには、トリス（２−アミノエチル）アミン、４−（アミノメチル）ピペリジン、テトラブチルアンモニウムフルオリド及び１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）が含まれる。樹脂に結合された全てのポリペプチド鎖が各カップリングサイクルに有効に関与するように、Ｎ末端からＦｍｏｃ基を完全に除去することが重要であり、そうでないと、異なる長さ及び配列のポリペプチド鎖が得られる。Ｆｍｏｃ基の塩基触媒による除去の後、塩基触媒を除去するために、適切な緩衝液で樹脂を徹底的に洗浄する。
【００９０】
多くのアミノ酸の側鎖は、アミン、アルコール又はチオールなどの化学的に反応性を有する基を含有する。これらの側鎖は、カップリング工程の間に、所望されない副反応を防止するためにさらに保護しなければならない。塩基に対して安定である、より好ましくは、塩基に対して安定であり且つ酸に対して不安定である側鎖保護基が最も有用である。表１０は、アミノ酸のこのカテゴリーに関する側鎖保護基の典型的な群を記載する。
【００９１】
【表１０】

【００９２】
導入されるＦｍｏｃ保護されたアミノ酸のカルボキシル基は、樹脂に結合されたポリペプチドのＮ末端への効率的な化学的連結を達成するために活性化される。活性化は、反応性エステルを生成するためにＦｍｏｃ保護されたアミノ酸を適切な試薬と反応させることによって典型的に達成される。活性化されたエステルの例には、ペンタフルオロフェニル（ＯＰｆｐ）エステル及び３−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−４−オキソ−ベンゾ−トリアゾン（ＯＤｈｂｔ）エステル、ＯＢｔエステル及び１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）から誘導されるＯＡｔエステルが含まれる。カップリング反応は、ＤＣＣ、ＢＯＰ、ＢＯＰ−Ｃｌ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ又はＯ−（７−アザベンゾトリゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＡＴＵ）などの活性化試薬を用いて、原位置で行うことができる。典型的なカップリング反応には、ＨＯＢｔ及びＨＢＴＵの混合物又はＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ及びＤＩＥＡの混合物が含まれた。Ｎ−メチルアミノ酸に関して、カップリング条件は唯一のカップリング試薬としてブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢｒｏＰ）を使用することが可能であり、カップリング反応は、Ｎ_２下に存在するＤＩＥＡとともにＤＣＭ中において手動で実施される。Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸は、樹脂に連結されたポリペプチドに対してモル濃度過剰で存在する。遅い速度で進行するカップリング反応に関しては、樹脂に結合された全てのポリペプチドが活性化されたＦｍｏｃアミノ酸と確実に首尾よく付加反応を行うようにするために、カップリング反応は１回以上（二重又は多重カップリング）繰り返される。不完全なカップリング反応に関しては、全ての反応していないＮ末端残基は、適切なキャッピング試薬を用いてキャップされる。
【００９３】
カップリング反応後、反応していないＦｍｏｃアミノ酸及びカップリング試薬を除去するために、樹脂支持体は洗浄される。次いで、別のアミノ酸を付加するためのポリペプチドを調製するために、樹脂はＮ末端のＦｍｏｃ基の塩基触媒された除去の新しいサイクルに供される。所望のポリペプチドが合成された後、残存するＦｍｏｃ保護基の塩基触媒された除去に樹脂を供する。塩基を除去するために、ポリペプチドが結合された樹脂を洗浄し、あらゆるアミノ酸側鎖保護基を除去するために、及び樹脂支持体からポリペプチド鎖を放出するために、続いて、酸で処理する。有用な酸は、試薬Ｋ［ＴＦＡ：チオアニソール：エタンジチオール：フェノール：水（８２．５：５：２．５：５：５）］などの適切なスカベンジャーの存在下にあるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸である。
【００９４】
続いて、ろ過によって、樹脂からポリペプチドを分離し、ＤＣＭ／ＤＭＦなどの適切な溶媒で場合によって繰り返し洗浄する。適切な分子量カットオフを有する膜を使用する限外ろ過を通じて、場合によってポリペプチドを脱塩することができる。ポリペプチドは、冷メチルｔ−ブチルエーテル又はｔ−ブチルエチルエーテルなどの適切な溶媒を用いて、溶液から沈殿させることが可能であり、沈殿は、冷エーテルなどの適切な溶媒で場合によって洗浄され、乾燥される。Ｃ１８樹脂を用いる疎水性クロマトグラフィー及びＴＦＡ／水／アセトニトリルなどの適切なクロマトグラフィー緩衝系などの適切なクロマトグラフィー手段を用いて、ポリペプチドをさらに精製することができる。ペプチドの純度は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析又は配列決定などの質量分析によって、場合によって分析することができる。
【００９５】
あるいは、配列番号２、４、６及び８のＴＣＡは、例えば、発現ベクターを用いて、配列番号１、３、５及び７のポリヌクレオチド配列を用いて組換え的に発現させることができる。発現ベクター中で、導入されたＤＮＡは、挿入されたＤＮＡを転写するために、宿主細胞へシグナルを伝達する要素（プロモーターなど）に作用可能に連結される。特定の因子に応答して遺伝子転写を調節する誘導性プロモーターなど、幾つかのプロモーターは極めて有用である。誘導性プロモーターの例には、ある種の細胞種に発現を限定する組織特異的なプロモーター、ステロイド応答性の（例えば、グルココルチコイド）プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ， ＲＪ．１９９０．Ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１）及びテトラサイクリン又は熱ショック反応性のプロモーターが含まれる。ｌａｃオペロンなどの幾つかの細菌性抑制系は、哺乳動物細胞及びトランスジェニック動物中で活用することが可能である（Ｆｉｅｃｋ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１７８５−９１；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ， Ｄ．Ｌ．， Ｌ．Ｃ． ＤｕＣｏｅｕｒ， ａｎｄ Ｊ．Ｍ． Ｓｈｏｒｔ．１９９６）。Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｏｌ Ｍｕｔａｇｅｎ．２８：４４７−５８； Ｗｙｂｏｒｓｋｉ， Ｄ． Ｌ．， ａｎｄ Ｊ．Ｍ． Ｓｈｏｒｔ．１９９１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ ．ｃｏｌｉ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ ａｎｉｍａｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４６４７−５３）。組換え核酸技術、細胞中への形質移入並びに細胞及びインビトロでの発現は、以下でさらに論述されている。
【００９６】
Ｅ．組換え抗体
本開示の組換え抗体は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質に特異的に結合することができる固有の抗体のＶ_Ｈ及び／又はＶ_Ｌドメインに由来する抗原結合領域を含む。組換え抗体は、例えば、組換え的に産生されるモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異的、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ^（Ｒ））又は抗体断片から形成された多価構造又は二重機能的抗体であり得る。
【００９７】
一実施形態において、場合によって、組換え抗体は、
（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＲＡであり、並びにさらに、前記抗体が約７．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約７．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約４．０×１０^−３ｓ^−１から約３．０×１０^−１ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約５．７×１０^−１０Ｍから約４．３×１０^−７Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体が約１．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１から約８．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約６．０×１０^−３ｓ^−１から約４．０×１０^−２ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約７．５×１０^−１０Ｍから約４．０×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ１０であり、並びにさらに、前記抗体が（ａ）約５．０×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１から約３．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、（ｂ）約１．０×１０^−４ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び（ｃ）約３．３×１０^−１０Ｍから約１．６×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ３であり、並びにさらに、前記抗体が約２．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約６．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約２．０×１０^−５ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約３．３×１０^−１２Ｍから約４．０×１０^−９Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ。別の実施形態において、場合によって、組換え抗体は、マウスモノクローナル抗体の特異性及び親和性を保持し、並びにヒト免疫グロブリンを測定するイムノアッセイフォーマットにおいて反応するキメラ抗体である。場合によって、マウス−ヒトキメラ抗体は、ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０又はＦＲＡ抗原に対して誘導される。場合によって、このようなキメラ抗体は、Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＡｘＳＹＭ^（Ｒ）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ）及びＰＲＩＳＭ^（Ｒ）プラットフォームなどの（但し、これらに限定されない。）既存のイムノアッセイフォーマットにおいて反応する。
【００９８】
組換え抗体によって含まれる抗原結合領域は、固有抗体由来のＶ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ配列を含むことができ、又は１つ若しくはそれ以上の他の抗体に由来する配列とともに、抗体の１つ若しくはそれ以上の部分（ＣＤＲなど）を含むことができる。一実施形態において、組換え抗体は固有抗体の完全長Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列を含む。
【００９９】
抗原結合領域が由来する固有抗体は、一般に、脊椎動物の抗体にである。例えば、固有抗体は、げっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラット）抗体、ニワトリ抗体、ウサギ抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ウシ抗体、ウマ抗体、ブタ抗体、類人猿（例えば、チンパンジー）抗体又はヒト抗体であり得る。抗体源は、主として、便利さを基本とする。一実施形態において、固有抗体は非ヒト抗体である。
【０１００】
組換え抗体は、同じ固有抗体又は異なる抗体に由来する１つ以上の定常領域（例えば、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及び／又はＣ_Ｈ４領域）を含むこともできる。定常領域は、上に列記されている種などの（但し、これらに限定されない。）多数の脊椎動物種の１つから得られる抗体に由来し得る。本開示の一実施形態において、組換え抗体は少なくとも１つの定常領域を含む。別の実施形態において、組換え抗体はヒト抗体に由来する１つ以上の定常領域を含む。本開示の特定の実施形態において、組換え抗体は、ヒト抗体の定常領域に連結された非ヒト抗体の可変領域を含む。
【０１０１】
組換え抗体を構成する定常領域は、例えば、ヒト免疫グロブリン由来の定常領域に対する１つ以上の免疫グロブリンクラス又はイソタイプに由来し得、定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２又はＩｇＥ定常領域の１つ以上に由来し得る。定常領域がＩｇＧ軽鎖に由来する領域を含む場合、これは、κ鎖又はλ鎖に由来し得る。組換え抗体は、２以上のクラス又はイソタイプから得られる配列を含み得る。組換え抗体の所望の機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、本分野における通常の技術水準に属する。本開示の一実施形態において、組換え抗体はＩｇＧに由来する１つ以上の定常ドメインを含む。別の実施形態において、組換え抗体はＩｇＧ定常領域の重及び軽鎖の両方から得られる領域を含む。
【０１０２】
本開示の一実施形態において、抗原結合領域は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原性タンパク質の診断的に適切な領域内のエピトープに特異的に結合する固有抗体に由来する。
【０１０３】
本開示の特定の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２６又は２８の何れか１つに記載されているＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ配列の全部又は一部と実質的に同一なアミノ酸配列を含む（下表１２参照。配列番号識別子のまとめ及び対応する配列の説明については、下表１１参照。）。別の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。
【０１０４】
【表１１】

【０１０５】
【表１２】


【０１０６】
本開示の一実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２５又は２７のいずれか１つによってコードされるアミノ酸配列の全部又は一部と実質的に同一のアミノ酸配列を含む（下表１３参照）。別の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ配列の相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号９及び１１の１つ若しくはそれ以上、配列番号１３及び１５の１つ若しくはそれ以上、配列番号１７及び１９の１つ若しくはそれ以上、又は配列番号２５若しくは２７の１つ若しくはそれ以上によってコードされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む（下表１３参照）。
【０１０７】
本開示の別の特定の実施形態において、組換え抗体の抗原結合領域は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２５又は２７の何れか１つによって記載される配列の全部又は一部と実質的に同一の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
【表１３】



【０１０９】
組換え抗体のアミノ酸配列は、親配列に正確に対応する必要はない。すなわち、組換え抗体のアミノ酸配列は、「変形配列」であり得る。例えば、組換え抗体によって含まれるドメインに応じて、その部位の残基が何れかの親（又は参照）配列に対応しないように、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３及びＣ_Ｈ４の１つ以上は、適宜、１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失によって変異を受け得る。しかしながら、当業者は、このような変異は大規模なものではなく、組換え抗体のその標的ＴＣＡへの結合に著しい影響を及ぼさないことを理解する。本開示に従えば、組換え抗体が変形配列を含む場合、変形配列は、参照配列と少なくとも約７０％（例えば、約７０％から約１００％）と同一である。一実施形態において、変形配列は、参照配列と少なくとも約７５％（例えば、約７５％から約１００％）と同一である。他の実施形態において、変形配列は、参照配列と少なくとも約８０％（例えば、約８０％から約１００％）、少なくとも約８５％（例えば、約８５％から約１００％）又は少なくとも約９０％（例えば、約９０％から約１００％）同一である。特定の実施形態において、参照配列は、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２６又は２８の何れか１つに記載されている配列に対応する。
【０１１０】
一般に、組換え抗体が１つ以上のアミノ酸置換を含有する変形配列を含む場合、アミノ酸置換は「保存的置換」である。保存的置換は、類似の側鎖特性を有する別の残基によってあるアミノ酸残基を置換することを含む。本分野において知られているように、天然に存在する２０のアミノ酸は、その側鎖の物理化学的特性に従ってグループ分けすることができる。適切なグループ分けには、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファン（疎水性側鎖）；グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン（極性非帯電側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖）並びにリジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖）が含まれる。アミノ酸の別のグループ分けは、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、同じ群から得られる別のアミノ酸によって、あるアミノ酸を置換することを含む。
【０１１１】
従って、他の実施形態における本開示は、本明細書に開示されている新規組換え抗体配列に対応する単離されたポリペプチドをさらに提供する。場合によって、単離されたポリペプチドは、ＦＰ３、ＦＰ６及びＦＰ１０からなる群から選択されるＴＣＡの診断的に適切な領域に特異的に結合する組換え（例えば、キメラ）抗体の部分を含む。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１２、１６、２０又は２８の何れか１つ以上に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１０、１４、１８又は２６の何れか１つ以上に記載されている配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域を含む。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域を含む。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１１、１５、１９又は２７の何れか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号９、１３、１７又は２５の何れか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域を含む。
【０１１３】
同様に、可変領域をコードする核酸配列は、親参照配列に正確に対応する必要はないが、遺伝コードの縮重によって及び／又は上記変形アミノ酸配列をコードするように変動し得る。従って、本開示の一実施形態において、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７０％（例えば、約７０％から約１００％）同一である。別の実施形態において、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７５％（例えば、約７５％から約１００％）同一である。他の実施形態において、組換え抗体の可変領域をコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約８０％（例えば、約８０％から約１００％）、少なくとも約８５％（例えば、約８５％から約１００％）又は少なくとも約９０％（例えば、約９０％から約１００％）同一である。特定の実施形態において、参照配列は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２５又は２７の何れか１つに記載されている配列に対応する。
【０１１４】
従って、他の実施形態における本開示は、本明細書に開示されている新規組換え抗体配列（キメラ抗体配列を含む。）をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。場合によって、単離されたポリヌクレオチドは、ＦＰ３、ＦＰ６及びＦＰ１０からなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に特異的に結合する組換え（例えば、キメラ）抗体の一部をコードする。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１２、１６、２０又は２８の何れか１つ以上に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１０、１４、１８又は２６の何れか１つ以上に記載されている配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域をコードする。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域をコードする。
【０１１５】
さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号９、１３、１７又は２７の何れか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域をコードする。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、相補性決定領域配列を含むＶ_Ｈ領域をコードする。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１、１３、１９又は２５の何れか１つ以上によってコードされる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域をコードする。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、相補性決定領域配列を含むＶ_Ｌ領域をコードする。
【０１１６】
一実施形態において、抗体は、ヒト免疫系に曝露された場合に、抗体の免疫原性を除去又は低減するために、ヒトＴ細胞に対する潜在的エピトープである抗体の非ヒト部分中の１つ以上のアミノ酸を変異させることによって固有抗体に比べて、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにさらに修飾することができる。適切な変異には、例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び挿入が含まれる。
【０１１７】
一実施形態において、本開示の組換え抗体は、適切な固相上に固定化するためにさらに修飾することができる。固定化は、固相への共有又は非共有的（例えば、イオン性、疎水性など）を通じて達成することができる。適切な修飾は本分野において公知であり、固体支持体への組換え抗体の架橋又は付着を促進するために、組換え抗体によって含まれるアミノ酸配列の１つのＣ末端又はＮ末端の何れかに官能基又は化学的部分を付加することが含まれる。典型的な修飾には、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳＡ）若しくはＳ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）などの官能基の付加又はアミノ酸配列のＮ若しくはＣ末端への１つ若しくはそれ以上のシステイン残基の付加が含まれる。他の架橋試薬が本分野において公知であり、多くは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ， ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ； Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， ＵＳＡのカタログ参照）。例には、１，６−ジアミノヘキサンなどのジアミン；グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド、エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）などのビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；ジスクシンイミジルグルタラート、ジスクシンイミジルスベラート及びエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシナート）；ヘキサメチレンジイソシアナートなどのジイソシアナート；１，４−ブタンジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシラン；スクシニジサリチラートなどの二カルボン酸；３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
他の修飾には、Ｎｉ^２＋誘導化表面への結合を可能とするためのヒスチジン残基又はジスルフィド架橋形成若しくはＳＵＬＦＯＬＩＮＫ^ＴＭアガロースへの結合を可能とするためのシステイン残基など、Ｎ又はＣ末端への１つ以上のアミノ酸の付加が含まれる。あるいは、固体支持体から組換え抗体を最適に離すために、Ｎ末端又はＣ末端に１つ以上の化学的スペーサーを含むように、抗体を修飾することができる。使用可能なスペーサーには、６−アミノヘキサン酸、１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノエタン及び１から５アミノ酸の短いアミノ酸配列（ポリグリシン配列など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
別の実施形態において、組換え抗体を固相上に固定化するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又はチログロブリンなどの担体タンパク質に組換え抗体を場合によって連結させることが可能である。
【０１２０】
別の実施形態において、本開示は、検出可能な標識を取り込ませるための組換え抗体の修飾を提供する。好ましくは、本開示に係る検出可能な標識は、直接又は間接的に検出可能な分子又は部分であり、組換え抗体への検出可能な標識の連結が抗体の標的Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質への特異的結合を好ましくは妨害しないように選択される。抗体を標識する方法は本分野において周知であり、組換え抗体を検出可能な標識に連結するための、例えば、ＳＡＭＳＡ（Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物）などの二官能性架橋物質の使用が含まれる。本分野において公知である又は上記されているものと同様の他の架橋試薬を同様に使用することができる。
【０１２１】
本開示の組換え抗体とともに使用するための検出可能な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素、コロイド状粒子、蛍光性微粒子など、直接検出可能なものが含まれる。検出可能な標識はそれ自体検出可能であり、又は検出可能な産物を生成するために１つ若しくはそれ以上のさらなる化合物と反応させることが可能である。従って、当業者は、本開示の直接検出可能な標識は、標識の検出を可能とするための基質、引き金を引く試薬、光などのさらなる成分を必要とし得ることを理解する。検出可能な標識の例には、発色性物質、放射性同位体（例えば、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓ及び^１４Ｃ）、蛍光性化合物（フルオレセイン、ローダミン、ルテニウムトリスビピリジル及びランタニドキレート誘導体など）、化学発光性化合物（例えば、アクリジニウム及びルミノールなど）、可視的若しくは蛍光性粒子、核酸、錯化剤又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなど）などの触媒が含まれるが、これらに限定されない。酵素を使用する場合、例えば、色素、蛍光又は発光性基質の添加は、好ましくは、検出可能なシグナルの生成をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光及びラマン分光測定法などの他の検出系も、場合によって有用である。
【０１２２】
本開示は、間接的に検出される標識の使用も提供する。間接的に検出可能な標識は、「親和性対」（すなわち、２つの異なる分子）の使用を通例含み、前記対の第一の要素は本開示の組換え抗体に連結され、前記対の第二の要素は第一の要素に特異的に結合する。前記対の２つの要素間の結合は、典型的には、化学的又は物理的な性質である。このような結合対の例には、抗原及び抗体、アビジン／ストレプトアビジン及びビオチン、ハプテン及びハプテンに対して特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子／基質及び酵素などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
Ｆ．抗体の調製
ポリクローナル抗体は、免疫原及び所望であれば、アジュバントの１つ以上の注射によって、哺乳動物宿主中に産生され得る。典型的には、免疫原（及びアジュバント）は、複数の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物中に注射される。免疫原は、ＴＣＡ又はＴＣＡ融合ポリペプチドを含むことができる。アジュバントの例には、フロイントの完全及びモノホスホリルリピドＡ合成トレハロースジコリノミコラート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫応答を向上させるために、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン及び大豆トリプシン阻害剤など、宿主中において免疫原性であるポリペプチドに免疫原を連結することができる。抗体産生のためのプロトコールは周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， １９８７； Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．， ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ．１９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．７２６ ｐｐ； Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．， ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ．１９９９．Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰＲｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。あるいは、ｐＡｂは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリ中で作製することができる（Ｓｃｈａｄｅ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｖｉａｎ （ｅｇｇ ｙｏｌｋ） ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＩｇＹ．Ｔｈｅ ｒｅｐｏｒｔ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＥＣＶＡＭ ｗｏｒｋｓｈｏｐ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ ｔｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ （ＡＴＬＡ）．２４：９２５−９３４）。
【０１２４】
所望の抗原に対するモノクローナル抗体を作製する方法は、本分野において周知である。例えば、モノクローナル抗体は、「Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）」によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができる。一般に、ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物（ハムスター又はマカクザル）は、複数部位への抗原並びに担体及び／又はアジュバントの複数回皮下又は腹腔内注射によって免疫化される。二週後、動物に追加免疫を行い、約７から１４日後、動物から採血し、抗抗原力価に関して血清をアッセイする。力価が一定になるまで、動物に追加免疫を施すことができる。
【０１２５】
マウスの脾細胞を抽出し、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ．５９−１０３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）； Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２６６：５５０ （１９７７）参照）。適切な骨髄腫細胞株は本分野において公知であり、ＭＯＰ−２１及びＭＣ−１１マウス腫瘍に由来するものなどのマウス骨髄腫株（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手可能）並びにＳＰ−２、ＳＰ２／０及びＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡから入手可能）が含まれるが、これらに限定されない。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の作製のために記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）； Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１−６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）参照）。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中に播種し、増殖させることができる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠如する場合には、ハイブリドーマ用の培地は、通例、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を抑制する。
【０１２６】
次いで、このような選択を通じて得られたハイブリドーマ細胞は、例えば、免疫沈降によって、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって、最初の免疫化において使用されたＴ．ｃｒｕｚｉ抗原を結合することができる抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、「Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）」のＳｃａｔｈｃａｒｄ分析によって、場合によって測定することができる。
【０１２７】
所望の特異性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈操作、例えば、Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２ （１９８１））によって記載されている操作によってサブクローニングされ、標準的な方法（例えば、Ｇｏｄｉｎｇｉｂｉｄ、同書参照）によって増殖させることができる。この目的のための適切な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物中の腹水腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
【０１２８】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用の免疫グロブリン精製操作によって、培地、腹水液又は血清から場合によって単離することができる。
【０１２９】
実施例１から４（実施例の部参照）は、ＦＰ３、ＦＰ６、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチド（例えば、配列番号２、４、６及び８のアミノ酸配列によって表されるポリペプチド）中に見出されるＴＣＡに対するｍＡｂを得るための１つのアプローチを例示するに過ぎない。
【０１３０】
Ｇ．組換え抗体の調製
本開示の組換え抗体は、例えば、ヒト又は非ヒト動物（げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、霊長類又はニワトリなど）によって産生されたモノクローナル抗体由来の抗原結合ドメイン配列（例えば、Ｖ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ配列又はその一部）を含むことができる。あるいは、所望の結合活性を有する抗原結合ドメインは、バクテリオファージ、細菌若しくは酵母の表面上でラムダファージ中に発現されたコンビナトリアルライブラリーの使用を通じて選択され、又は標準的な技術を用いて、他の生物学的（例えば、レトロウイルス又はポリソーム）若しくは非生物系上でのディスプレイによってスクリーニングすることができる（例えば、Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ． ｅｔ． ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７ （１９９１）； Ｂａｒｂａｓ， Ｃ． Ｆ． Ｉｌｌ ｅｔ． ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４４５７−４４６１ （１９９２）参照）。ライブラリーは、免疫化された又は免疫化されていない宿主から単離された固有の抗原結合ドメイン、合成もしくは半合成の抗原結合ドメイン又は修飾された抗原結合ドメインから構成され得る。
【０１３１】
１．組換え抗体一般
本開示の一実施形態において、組換え抗体は、目的のＴ．ｃｒｕｚｉに結合するモノクローナル抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。
【０１３２】
本開示の一実施形態において、組換え抗体は、Ｔ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域に由来するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。別の実施形態において、組換え抗体は、ＦＰ３、ＦＰ６又はＦＰ１０など、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原に産生されたモノクローナル抗体に由来する。別の実施形態において、組換え抗体は、ＦＰ３、ＦＰ６又はＦＰ１０の全て又は断片（例えば、１つ以上のエピトープを含む断片）を含むＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。さらなる実施形態において、組換え抗体は、配列番号２、４又は６の何れか１つに記載されている配列と実質的に同一の配列を含むＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に対して産生されたモノクローナル抗体に由来する。
【０１３３】
場合によって、モノクローナル抗体は、ＨＢＦＰ３、ＨＢＰｅｐ２及びＨＢＦＰ１０からなる群から選択される細胞株によって発現される。別の実施形態において、細胞株はシャーガス８−３６７−１７１である。
【０１３４】
モノクローナル抗体が調製されたら、モノクローナル抗体又はその可変領域をコードするＤＮＡは、標準的な技術によって、例えば、モノクローナル抗体の重及び軽鎖若しくは可変領域をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、又は保存された領域に対するプライマーを用いるモノクローナル抗体をコードするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手可能なＩｇＧプライマーの組）によって、容易に単離することができる。
【０１３５】
一旦単離されたら、ＤＮＡは、例えば、適切な発現ベクター中にクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために、イー・コリ細胞、酵母細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）又は本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの適切な宿主細胞中に導入することができる。場合によって、一実施形態において、本開示の抗Ｔ．ｃｒｕｚｉマウス−ヒトキメラ抗体は、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中で産生され、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株は、産業的な使用のために十分な量で産生することができる点で有利である。好ましくは、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞株及びＨＥＫ２９３細胞株である。別の好ましい宿主細胞は、Ｂ３．２細胞株（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）又は別のジヒドロ葉酸還元酵素欠失（ＤＨＦＲ⁻）ＣＨＯ細胞株（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）である。
【０１３６】
あるいは、モノクローナル抗体又はその可変領域をコードするＤＮＡは、本分野において公知の標準的な方法によってキメラ抗体、ヒト化抗体及び抗体断片を作製するために使用することができる。
【０１３７】
例えば、キメラモノクローナル抗体は、異なる宿主種に由来する抗体重及び軽鎖定常領域遺伝子を含有する哺乳動物発現ベクター中にモノクローナル抗体の可変領域をコードするＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。安定に組み込まれた又は染色体外要素として存在する多くの真核生物抗体発現ベクターが記載されており、当業者に公知である。一般に、抗体発現ベクターは、重鎖定常領域をコードする遺伝子及び／又は軽鎖定常領域をコードする遺伝子、上流エンハンサー要素並びに適切なプロモーターを含むプラスミドである。
【０１３８】
多様な発現調節配列が、本開示において使用され得る。このような有用な発現調節配列には、前記発現ベクターの構造遺伝子に付随する発現調節配列及び原核若しくは真核細胞若しくはそのウイルスの遺伝子の発現を調節することが知られた任意の配列並びにこれらの様々な組み合わせが含まれる。哺乳動物細胞中での転写を誘導するための適切な調節配列の例には、ＳＶ４０及びアデノウイルスの早期及び後期プロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター、ＭＴ−Ｉ（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ドロソフィラ最小熱ショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネータ、ＳＶ４０又はアデノウイルスＥＩｂ領域ポリアデニル化シグナル及びＫｏｚａｋコンセンサス配列 （Ｋｏｚａｋ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， １９６：９４７−５０（１９８７））が含まれる。
【０１３９】
例えば、ヒト定常領域に関して、抗体発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１（ヒトＣγ１）及びヒトκ定常領域（ヒトＣκ）遺伝子及び免疫グロブリンＨ鎖エンハンサー要素を含み得る。ベクターは、細菌の複製基点及び選択マーカーも含有し得る。本分野において公知であるように、選択マーカーを場合によって含めることによって、所定の増殖条件下で選択及び増幅を可能とする。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子はメトトレキサートを用いた哺乳動物細胞中での選択及び増幅を提供する。市販の哺乳動物発現ベクターから始まる抗体発現に適したベクターの構築は、当業者によって容易に達成することが可能である。本明細書に記載されているように、ｐＢＶ、ｐＪＶ及びｐＢＯＳベクターを含むベクター及び様々な中間的ベクターなどの様々なベクター並びにプラスミドを、抗体作製のために使用することができる。ｐＢＶ、ｐＪＶ及びｐＢＯＳベクターは、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡ）から入手した。他の類似のプラスミド及びベクターは、市販されており及び／又は容易に構築される。
【０１４０】
適切な宿主細胞中への発現構築物の導入は、所定の特異性の完全なキメラ抗体の産生をもたらす（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５ （１９８４）参照）。重及び軽鎖コード配列は、別個のプラスミド上に個別に宿主種細胞中へ導入し、又は同じベクター上に一緒に導入することができる。
【０１４１】
使用されるベクター系に応じて、多くの異なる不死化された細胞株が適切な宿主細胞としての役割を果たすことができ、これらには、骨髄腫（例えば、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ハイブリドーマ（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４）、リンパ腫、昆虫細胞（例えば、ｓｆ９細胞）、ヒト胎児性腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）及びチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が含まれるが、これらに限定されない。発現構築物は、リン酸カルシウム沈殿、プロトプラスト融合、リポフェクション、レトロウイルス由来のシャトルベクター及び電気穿孔などの（但し、これらに限定されない。）本分野において公知の様々な技術を用いて宿主細胞中に導入することができる。
【０１４２】
キメラ抗体及び抗体断片は、バキュロウイルス、酵母、細菌（イー・コリなど）などの（但し、これらに限定されない。）他の発現系中で及びウサギ赤血球網状赤血球可溶化液などの無細胞系中インビトロで作製することもできる。
【０１４３】
組換え抗体は、例えば、クロスフローろ過、硫安沈殿、プロテインＡクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー又はこれらの組み合わせなどの標準的な免疫グロブリン精製操作によって宿主細胞から単離され得る。
【０１４４】
あるいは、抗体断片は、慣用の酵素的方法によって精製された抗体調製物から作製することが可能であり、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、完全な状態の抗体のペプシン切断によって作製することができ、Ｆａｂ断片は、パパインで完全な状態の抗体を短時間消化することによって作製することができる。
【０１４５】
少なくとも２つの異なる抗原に対して特異性を有する組換え二重特異的及びヘテロ連結抗体断片は、完全長抗体として又は抗体断片（Ｆ（ａｂ’）_２二重特異的抗体断片など）として調製することができる。３以上の価数（例えば、三価以上の価数の抗体断片）を有する抗体断片も想定される。二重特異的抗体、ヘテロ連結抗体及び多価抗体は、当業者に公知の標準的な方法によって調製することができる。
【０１４６】
２．一価抗体
一価抗体は互いに架橋しない。１つの方法は、Ｉｇ軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現を含む。一般にＦｃ領域中の何れかの点での重鎖末端切断は、重鎖架橋を妨げる。あるいは、適切なシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換され又は欠失され、ジスルフィド結合による架橋を妨げる。インビトロ法は、一価抗体を調製するのにも適している。抗体は、Ｆａｂなどの断片を作製するために消化することができる（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，上記；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９９９，上記）。
【０１４７】
３．ヒト化及びヒト抗体
ＴＣＡを結合する非ヒト抗体のヒト化された形態は、非ヒトＩｇに由来する最小配列を含有するキメラＩｇ、Ｉｇ鎖又は断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２又は抗体の他の抗原結合配列など）である。
【０１４８】
一般に、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「輸入」可変ドメインから通例採取される「輸入」残基としばしば称される。ヒト化は、げっ歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって達成される（Ｊｏｎｅｓ， Ｐ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．１９８６．Ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ３２１：５２２−５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．１９８８．Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ．３３２：３２３−７； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．１９８８．Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｇｒａｆｔｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３９：１５３４−６）。このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより大幅に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体（Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９）である。実際に、典型的には、ヒト化抗体は、幾つかのＣＤＲ残基及びおそらくは幾つかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位から得られる残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（マウス、ラット又はウサギなど）のＣＤＲ（ドナー抗体）から得られる残基によって置換されているヒトＩｇ（レシピエント抗体）が含まれる。幾つかの例では、対応する非ヒト残基は、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基を置換する。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも、輸入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含有し、全てではなくてもＣＤＲ領域の殆どが非ヒトＩｇのものに対応し、全てではなくてもＦＲ領域の殆どがヒトＩｇコンセンサス配列のものに対応している。最適には、ヒト化抗体は、Ｉｇ定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒトＩｇのＩｇ定常領域の少なくとも一部も含む（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ， １９８６； Ｐｒｅｓｔａ， １９９２； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ， １９８８）。
【０１４９】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｈ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ １９９１．Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｆａｂ） ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−７； Ｍａｒｋｓ， Ｊ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｖ−ｇｅｎｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ ｐｈａｇｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）及びヒトモノクローナル抗体（Ｂｏｅｒｎｅｒ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ−ｐｒｉｍｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５； Ｒｅｉｓｆｅｌｄ， Ｒ．Ａ．， ａｎｄ Ｓ． Ｓｅｌｌ．１９８５．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｃｈｅ−ＵＣＬＡ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｈｅｌｄ ｉｎ Ｐａｒｋ Ｃｉｔｙ， Ｕｔａｈ， Ｊａｎｕａｒｙ ２６−Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２， １９８５． Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．６０９ ｐｐ）などの、様々な技術を用いて作製することもできる。内在性Ｉｇ遺伝子が部分的に又は完全に不活化されたトランスジェニック動物中にヒトＩｇ遺伝子を導入することが、ヒト抗体を合成するために活用することができる。攻撃誘発を行うと、ヒト抗体の産生が観察され、ヒト抗体の産生は、遺伝子再配置、集合及び抗体レパートリーなどのあらゆる点で、ヒトにおいて見られるものと極めて似通っている（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ， Ｄ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｋａｐｐａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−５１； Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ， １９９５； Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ， １９９４； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ， １９９２； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｋａｙ．米国特許第５５６９８２５号。１９９６； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｒ．Ｍ． Ｋａｙ．米国特許第５６３３４２５号。１９９７ａ； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｒ．Ｍ． Ｋａｙ．米国特許第５６６１０１６号。１９９７ｂ； Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．， ａｎｄ Ｒ．Ｍ． Ｋａｙ．米国特許第５６２５１２６号。１９９７ｃ； Ｓｕｒａｎｉ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．米国特許第５５４５８０７号。１９９６）。
【０１５０】
３．二重特異的抗体
二重特異的モノクローナル抗体は、少なくとも２つの異なる抗原を結合する。例えば、結合特異性はＴＣＡであり、その他は選択した任意の抗原に対する。
【０１５１】
二重特異的抗体の組換え産生は、しばしば、２つのＩｇ重鎖／軽鎖対（各々が異なる特異性を有する。）を同時発現させることによって達成される。得られたハイブリドーマ（クアドローマ）中でのこれらのＩｇ重及び軽鎖の無作為な集まりは、１０の異なる分子の潜在的混合物を与え、そのうち１つのみが所望の二重特異的構造を有する。所望の抗体は、アフィニティークロマトグラフィー又は他の技術を用いて精製することができる（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｍｙｅｌｏｍａ ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１０９−１３； Ｗａｂｌ， Ｍ．， Ｊ． Ｂｅｒｇ， ａｎｄ Ｅ． Ｌｏｔｓｃｈｅｒ．ＷＯ９３／０８８２９。１９９３）。
【０１５２】
二重特異的抗体を製造するために、所望の抗体−抗原結合部位を有する可変ドメインはＩｇ定常ドメイン配列に融合される（Ｓｕｒｅｓｈ， Ｍ．Ｒ．， Ａ． Ｃ． Ｃｕｅｌｌｏ， ａｎｄ Ｃ． Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．１９８６．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｙｂｒｉｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０−２８）。融合は、通常、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインと行われる。軽鎖結合のために必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合の少なくとも１つの中に存在する。Ｉｇ重鎖融合及び所望であれば、Ｉｇ軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターの中に挿入され、適切な宿主生物中に同時形質移入される。
【０１５３】
抗体分子の対間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大化するために改変することができる（Ｃａｒｔｅｒ， Ｐ．， Ｌ． ｅｔ ａｌ．ＷＯ ９６／２７０１１．１９９６）。この方法において、第一の抗体分子の界面に由来する１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）と置換することによって、大きな側鎖と同一又は類似のサイズの補償的「空洞」が第二の抗体分子の界面上に作製される。この機構は、ホモ二量体などの望ましくない最終産物に対するヘテロ二量体の収率を増加させる。
【０１５４】
二重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆａｂ’_２二重特異的抗体）として調製することができる。二重特異的抗体を作製するための１つの技術は、化学的連結を活用する。完全な抗体は、Ｆａｂ’_２断片を作製するためにタンパク分解的に切断され得る（Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．１９８５．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ１ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２２９：８１−３）。断片は、隣接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を抑制するために、亜ヒ酸ナトリウムなどのジチオール錯化剤を用いて還元される。次いで、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体へ転化される。次いで、メルカプトエチルアミンでの還元によって、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つはＦａｂ’−チオールへ再度転化され、二重特異的抗体を形成するために他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル濃度量と混合される。
【０１５５】
Ｆａｂ’断片は、イー・コリから直接回収し、二重特異的抗体を形成するために化学的結合され得る。例えば、完全にヒト化された二重特異的Ｆａｂ’_２抗体を作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙ， Ｍ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ＨＥＲ２ ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７５：２１７−２５）。各Ｆａｂ’断片はイー・コリから別個に分泌され、インビトロで化学的に直接結合され、二重特異的抗体を形成する。
【０１５６】
組換え細胞培養から直接得られる二重特異的抗体断片を作製及び単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーモチーフを使用することができる（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ， Ｓ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３）。Ｆｏｓ及びＪｕｎポリペプチドから得られるペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結されている。抗体ホモ二量体は、単量体を形成するために、ヒンジ領域において還元され、次いで、抗体へテロ二量体を形成するために再酸化される。この方法は、抗体ホモ二量体を作製することもできる。「ダイアボディ」技術は、二重特異的抗体断片を作製するための別の方法を提供する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３）。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能とするほど十分に短いリンカーによって、軽鎖Ｖ_Ｌに接続された重鎖Ｖ_Ｈからなる。１つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは、別の断片の相補的なＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと強制的に対合され、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異的抗体断片を作製するための別の戦略は、一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用である（Ｇｒｕｂｅｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．１９９４．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８−７４）。三重特異的抗体などの３以上の価数を有する抗体も作製することができる（Ｔｕｔｔ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．１９９１．Ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｆ（ａｂ’）３ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｔｈａｔ ｕｓｅ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｖｉａ ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ＣＤ２ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ａｎｄ ｒｅｄｉｒｅｃｔ ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−９）。典型的な二重特異的抗体は、所定のＴＣＡ上の２つの異なるエピトープに結合することができる。
【０１５７】
Ｈ．組換え抗体の検査
組換え抗体が標的Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原に特異的に結合する能力は、標準的な免疫学的技術によって評価することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）。例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）による。本開示の一実施形態において、組換え抗体は、抗原結合ドメインが由来するモノクローナル抗体と実質的に同じ特異性を示す。
【０１５８】
組換え抗体は、標準的な技術により平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定することによって、標的Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原への結合親和性に関しても、場合によって検査することができる。本開示の一実施形態において、組換え抗体（例えば、キメラ抗体）は約１μＭ未満のＫ_Ｄを有する。別の実施形態において、組換え抗体（例えば、キメラ抗体）は約１００ｎＭ未満のＫ_Ｄを有する。
【０１５９】
他の標準的な試験も抗体に対して行うことができる。例えば、抗体のｐＩ値を得ることができる。
【０１６０】
場合によって、組換え抗体（例えば、キメラ抗体）は、組換え抗体が結合する標的抗原の領域を同定するために、エピトープマッピング操作に供される。エピトープマッピングの様々な方法が本分野において公知であり（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．）， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）、例えば、ファージ及び酵母ディスプレイ法が含まれる。ファージ及び酵母ディスプレイ法は、抗体結合に含まれる標的抗原の残基をより正確にマッピングするために、無作為な突然変異誘発技術と組み合わせることもできる（例えば、Ｃｈａｏ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１０：５３９−５０ （２００４）参照）。
【０１６１】
本開示の一実施形態において、組換え抗体が結合する標的抗原の残基は、スキャニングアラニン突然変異誘発を酵母ディスプレイと組み合わせる技術によって同定される。一般に、この技術は、各々が抗原の標的領域に相当するペプチドをコードする一連のオリゴヌクレオチドを調製することを含み、この領域中のそれぞれの各アミノ酸はアラニンによって連続的に置換される。抗原の標的領域は、親モノクローナル抗体を調製するための最初の免疫化において使用される抗原から又は酵母若しくはファージディスプレイを使用する予備的な「低分解」スクリーニングから決定される。抗原の野生型様式は、対照として使用される。適切な酵母ディスプレイベクター中に、各オリゴヌクレオチドをクローニングし、各アラニン変異体はイー・コリなどの適切な宿主中に形質転換する。プラスミドＤＮＡを抽出し、配列決定し、配列決定に基づいてクローンを選択する。酵母ディスプレイベクターは本分野において公知であり、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡから入手可能なｐＹＤ１）。
【０１６２】
次いで、選択されたクローンをサッカロミセス・セレビシアエ細胞、例えば、ＥＢＹ１００細胞（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）中に形質転換し、各酵母クローンを培養し、ペプチド発現のために誘導する。細胞表面上にアラニン変異体を発現する誘導された酵母細胞を組換え抗体とともに温置し、慣用の方法によって、例えば、標識された二次抗体を用いて、結合された抗体を検出する。次いで、組換え抗体に結合することができないアラニン変異体の同定に基づいて、標的抗原性領域中の中心となる残基を決定することができる。抗体結合活性の喪失は、変異体が、組換え抗体に対するエピトープの一部を形成する位置にアラニン残基を含むことを示す。
【０１６３】
Ｉ．組換え抗体の使用
本開示の組換え抗体は、例えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉを検出するための診断試薬として、及び／又は伝統的な血漿又は血清の代わりに、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体を検出するためのアッセイ若しくはキットにおける標準化試薬、陽性対照試薬若しくは較正物質試薬として使用するのに適している。標準化試薬は、例えば、抗体濃度を内挿するための標準曲線を確立するために使用することができる。陽性対照は、アッセイ性能特性を確立し、並びに／又はアッセイにおいて使用される抗原の完全性を定量及びモニターするために使用することができる。本開示は、複数の組換え抗体（各組換え抗体は、標準化された抗体感度パネルとして、異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原に特異的に結合することができる。）の使用も提供する。このような感度パネルは、例えば、アッセイ性能特性を確立するために、並びに／又はアッセイにおいて使用される抗原の完全性を定量及びモニターするために、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体検出キットの品質管理のために、伝統的な血漿又は血清の代わりに使用され得る。本開示は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の治療又は予防における組換え抗体の使用も想定する。
【０１６４】
従って、本開示の一実施形態は、各々がＴ．ｃｒｕｚｉタンパク質の診断的に適切な領域を特異的に結合することができる１つ以上の組換えタンパク質を含む免疫診断試薬を提供する。
【０１６５】
本開示の一実施形態において、免疫診断試薬は、各々が異なるＴ．ｃｒｕｚｉ抗原を検出することができる複数の（例えば、２つ以上の）組換え抗体を含む。
【０１６６】
免疫診断試薬は、該試薬が含む組換え抗体の適切な選択によって、特定の最終的使用に関して適合させることが可能であり、このため、免疫診断試薬は多数の既存のＴ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイフォーマット及びキットに適合する。このようにして免疫診断試薬を誂えることによって、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染のある種の段階の検出に関して試薬を最適化することも可能となる。
【０１６７】
本開示は、各々が異なるＴＣＡに特異的に結合することができる複数の組換え抗体を含む免疫診断試薬を感度パネルとして用いて、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体検出アッセイを標準化する方法をさらに提供する。
【０１６８】
本開示は、組換え抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で、各々がＴＣＡを特異的に結合することができる１つ以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬とＴＣＡを含有すると疑われる検査試料を接触すること、及び形成された何れかの組換え抗体：抗原複合体を検出することを含む、ＴＣＡの存在を検出するための方法をさらに提供する。
【０１６９】
本開示は、抗原／抗体複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体に対して特異的な１つ以上の抗原と、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体を含有すると疑われる検査試料を接触させること、抗原：抗体複合体を検出すること、及び陽性対照又は標準化試薬として、各々が本方法において使用される抗原の１つを特異的に結合することができる１つ以上の組換え抗体を含む免疫診断試薬を使用することを含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体の存在を検出する方法も提供する。
【０１７０】
本開示の免疫診断試薬は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染に対して感受性を有し及びＴ．ｃｒｕｚｉ感染に対して抗体応答を生成することができるヒト及び他の脊椎動物種において、Ｔ．ｃｒｕｚｉ応答をモニターするアッセイ及びキットとともに使用するのに適している。従って、免疫診断試薬は、ヒト医療及び獣医学用途を有する。
【０１７１】
本開示は、インビトロで新規組換え抗体を生産するための、ファージディスプレイ技術並びに細菌及び酵母細胞表面ディスプレイ技術などの誘導された分子進化技術における本明細書に記載された組換え抗体及び可変領域の使用も包含する（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５６４ （１９９３） ａｎｄ Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４ （１９９１）参照）。
【０１７２】
場合によって、本開示の免疫診断試薬、例えば、キメラ抗体は、市販のプラットフォームイムノアッセイにおいて使用することができる。
【０１７３】
Ｊ．組換え抗体を含むキット
本開示は、本開示の１つ以上の組換え抗体を含む治療用、診断用及び品質管理キットをさらに提供する。
【０１７４】
本開示の一態様は、Ｔ．ｃｒｕｚｉを検出するための診断用キットを提供する。キットは、本開示の１つ以上の組換え抗体を含む。組換え抗体は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を捕捉及び／若しくは検出するために使用するための、又は抗原：抗体複合体を検出するための二次抗体として使用するための検出試薬としてキット中で提供することができる。あるいは、組換え抗体は、陽性対照試薬、標準化試薬、較正試薬又は感度パネルとして、キット中に提供することができる。様々な実施形態において、診断用キットは、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗源を検出するための試薬又はＴ．ｃｒｕｚｉ抗体を検出するための試薬をさらに含むことができる。一実施形態において、本開示は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体に対して特異的な１つ以上の抗原などのＴ．ｃｒｕｚｉ抗体の検出用試薬及び各々がキット中に含まれている前記１つ以上の抗原の１つを特異的に結合することができる本開示の１つ以上の組換え抗体を含む陽性対照又は標準化試薬を含む診断用キットを提供する。
【０１７５】
従って、本開示は、１つ若しくはそれ以上の本開示の抗体を含む診断用及び品質管理キットをさらに提供する。場合によって、本開示のアッセイ、キット及びキット成分は、市販のプラットフォーム上での使用（例えば、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬのＰｒｉｓｍ^（Ｒ）、ＡｘＳＹＭ^（Ｒ）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ）及びＥＩＡ（ビーズ）プラットフォーム上でのイムノアッセイ並びに他の市販の及び／又はインビトロ診断用アッセイ）に対して最適化される。さらに、前記アッセイ、キット及びキット成分は、他の形式で、例えば、電気化学的な又はその他の携帯式又は治療場所でのアッセイ系に対して使用することができる。例えば、本開示は、ＴｎＩ、ＣＫＭＢ及びＢＮＰを含む幾つかの心臓マーカーに対するサンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ^（Ｒ）， Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）電気化学的イムノアッセイ系に対して適用可能である。イムノセンサー及び使い捨て検査装置中でイムノセンサーを作動させる方法は、例えば、米国特許出願２００３０１７０８８１号、２００４００１８５７７号、２００５００５４０７８号及び２００６０１６０１６４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。電気化学的なイムノセンサー及びイムノセンサーの他の種類の製造に関するさらなる背景は、米国特許第５，０６３，０８１号（同じく、これらに関するその記述に関して、参照により組み込まれる。）に見出される。
【０１７６】
場合によって、キットは、品質管理試薬（例えば、感度パネル、較正用物質及び陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は本分野において周知であり、例えば、様々な免疫診断用製品同封シート上に記載されている。感度パネルの一員は、例えば、適切なアッセイ緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）中に本開示の抗体の既知量をスパイクすることによって、例えば、「低」から「高」にわたる抗体の既知量を含有する可変量で場合によって調製することができる。これらの感度パネルの一員は、アッセイの性能特性を確立するために場合によって使用され、さらに、場合によって、イムノアッセイキット試薬の完全性及びアッセイの標準化の有用な指標である。
【０１７７】
キット中に提供される抗体は、蛍光色素、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、色素団、化学発光標識などの検出可能な標識を取り込むことが可能であり、又はキットは抗体を標識するための試薬又は抗体（例えば、検出抗体）を検出するための試薬及び／若しくは抗原を標識するための試薬若しくは抗原を検出するための試薬を含み得る。抗体、較正用物質及び／又は対照は、別個の容器中に提供され得、又は適切なアッセイフォーマット中に（例えば、マイクロタイタープレート中に）予め分配され得る。
【０１７８】
キットは、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などの、診断アッセイを実施し又は品質管理評価を容易にするために必要とされる他の試薬を場合によって含み得る。検査試料を単離及び／又は治療するための緩衝液及び溶液などの他の成分（例えば、前処理試薬）も、キットに含め得る。キットは、１つ以上の他の対照をさらに含み得る。キットの成分の１つ以上は凍結乾燥させることができ、キットは、凍結乾燥された成分の再構成に適した試薬をさらに含み得る。
【０１７９】
キットの様々な成分は、場合によって、適切な容器中に与えられる。上述のように、容器の１つ以上は、マイクロタイタープレートであり得る。さらに、キットは、試料を保持又は保存するための容器（例えば、血液又は尿試料用の容器又はカートリッジ）を含むことができる。適宜、キットは、反応容器、混合容器及び試薬又は検査試料の調製を容易にする他の成分も場合によって含有し得る。キットは、注射器、ピペット、鉗子、測定用スプーンなどの検査試料の取得を補助するための１つ以上の機器も含み得る。
【０１８０】
キットは、紙形態又はディスク、ＣＤ、ＤＶＤなどのコンピュータ読み取り可能な形態で提供され得る使用説明書を場合によってさらに含み得る。
【０１８１】
Ｋ．キットの適合
キット（又はその成分）並びに本明細書中に記載されている成分及び方法を用いるアッセイによって、検査試料中のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の存在又は濃度を測定、検出する方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号及び同第５，００６，３０９号に記載されているように、並びに、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ）としてＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）によって市販されているように、様々な自動化及び半自動化されたシステム（固相が微粒子を含むシステムを含む。）で使用するために改変することができる。
【０１８２】
自動化されていないシステム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した自動化又は半自動化されたシステムとの差の幾つかには、（サンドイッチの形成と分析物の反応性に影響を及ぼし得る）第一の特異的結合対（例えば、Ｔ．ｃｒｕｚｉ捕捉抗体）が付着されている基材並びに捕捉、検出及び／又は場合によって行われる何れかの洗浄工程の長さ及びタイミングが含まれる。ＥＬＩＳＡなどの自動化されていないフォーマットは試料及び捕捉試薬との相対的により長い温置時間（例えば、約２時間）を必要とする場合があり得るのに対して、自動化又は半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ）Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は相対的により短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ）に関して約１８分）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡなどの自動化されていないフォーマットは相対的により長い温置時間（例えば、約２時間）、連結物試薬などの検出抗体を温置する場合があり得るのに対して、自動化又は半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ））は相対的により短い温置時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ）に関して約４分）を有し得る。
【０１８３】
Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームには、ＡｘＳＹＭ^（Ｒ）、ＩＭｘ^（Ｒ）（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ^（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）及びＱｕａｎｔｕｍ^ＴＭＩＩ並びに他のプラットフォームが含まれる。さらに、アッセイ、キット及びキット成分は、他のフォーマット、例えば、電気化学的又は他の携帯式又は治療場所アッセイシステムにおいて使用することができる。例えば、本開示は、サンドイッチイムノアッセイを実施する市販のＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ− ＳＴＡＴ^（Ｒ）， Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイ系に対して適用可能である。イムノセンサー並びにその製造方法及び使い捨て検査装置中でイムノセンサーを作動させる方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開２００３０／０１７０８８１号、米国特許出願公開２００４／００１８５７７号、米国特許出願公開２００５／００５４０７８号及び米国特許出願公開２００６／０１６０１６４号（上記に関する教示に関して、参照により、これらの全体が組み込まれる。）に記載されている。
【０１８４】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ^（Ｒ）システムへのＴ．ｃｒｕｚｉ抗原アッセイの改変に関して、以下の構成が好ましい。微小加工されたシリコンチップは、金電流測定作用電極及び銀−塩化銀参照電極の一対を用いて製造される。作用電極の１つの上で、固定化された捕捉抗体を有するポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）が電極の上にパターン化されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに接着される。このチップは、イムノアッセイに適した流体装置フォーマットを有するＩ−ＳＴＡＴ^（Ｒ）カートリッジ中に組み立てられる。カートリッジの試料保持チャンバーの壁の一部上に、アルカリホスファターゼ（又は他の標識）で標識された第二の検出抗体を含む層が存在する。カートリッジの流体袋内には、ｐ−アミノフェノールリン酸を含む水性試薬である。
【０１８５】
作動時に、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を含有すると疑われる試料は、検査カートリッジの保持チャンバーに添加され、カートリッジはＩ−ＳＴＡＴ^（Ｒ）読取装置中に挿入される。第二の抗体（検出抗体）試料中に溶解された後、カートリッジ内のポンプ要素がチップを含有する伝導路内に試料を押し出す。ここで、ポンプ要素は、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原、Ｔ．ｃｒｕｚｉ捕捉抗体及び標識された検出抗体間でのサンドイッチの形成を促進するために、周期的に振動する。アッセイの最後から２番目の工程において、試料をチップから廃棄チャンバーの中に洗浄するために、液体は袋から伝導路の中に押し出される。アッセイの最後の工程において、アルカリホスファターゼ標識は、ｐ−アミノフェノールリン酸と反応してリン酸基を切断し、放出されたｐ−アミノフェノールを作用電極において電気化学的に酸化させる。測定された電流に基づいて、読取装置は、埋め込まれたアルゴリズム及び工場で測定された較正曲線を用いて、試料中のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原の量を計算することができる。
【０１８６】
さらに、本明細書に記載されている方法及びキットは、イムノアッセイを実施するための他の試薬及び方法を必ず包含することは言うまでもない。例えば、連結物希釈剤及び／又は較正用物質希釈剤として、例えば洗浄のために、本分野において公知であり及び／又は使用するために容易に調製し、若しくは最適化され得る様々な緩衝液が包含される。典型的な連結物希釈剤は、ある種のキットにおいて使用され、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッキング剤、抗微生物剤及び界面活性剤を含有するＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ）連結物希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）である。典型的な較正用物質希釈剤は、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッキング剤及び抗微生物剤を含有する緩衝液を含む、ある種のキットにおいて使用されるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ^（Ｒ）ヒト較正用物質希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ， ＩＬ）である。
【０１８７】
本明細書に記載されている本開示をよりよく理解するために、以下の実施例が記載されている。これらの実施例は、本開示の例示的な実施形態を記載することを意図するものであり、いかなる意味においても、本開示の範囲を限定することを意図するものではないことを理解する。
【０１８８】
実施例
【実施例１】
【０１８９】
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原ＦＰ３（シャーガスＦＰ３ １２−３９２−１５０−１１０）に対する抗体を産生する細胞株
この実施例では、シャーガスＦＰ３組換え抗原を認識及び結合するｍＡｂを産生するハイブリドーマ細胞を作製した。ＦＰ３組換え抗原（配列番号２）でマウスを免疫化し、抗ＦＰ３抗体を産生するマウスを安楽死させ、脾細胞を採集し、骨髄腫細胞と融合し、ｍＡｂ抗ＦＰ３ハイブリドーマ細胞株を単離した。得られた細胞株ＨＢＦＰ３を作製した。
【０１９０】
免疫原の調製
シャーガスＦＰ３抗原細胞株は、イリノイ州レイク郡の種子銀行に対して、アイオワ大学のＬｏｕｉｓ Ｋｉｒｃｈｏｆｆ博士の研究室から頂いた。Ｔ７プロモーターの調節下で、ｐＥＴ発現ベクター中にこの抗原をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）をクローニングし、適切なイー・コリ宿主細胞［ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ又はＢＬ２１（ＤＥ３）］中で発現させた。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、宿主細菌ゲノム中に挿入されたλＤＥ３溶原菌によってコードされ、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあった。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現を誘導するために、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を細胞に添加し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはＴ７プロモーターに結合され、クローニングされた遺伝子の発現をもたらした。単一のコロニーを単離するために、形質転換された細胞のプレートを画線し、細胞銀行を調製した。続いて、イー・コリを増殖させ、精製のために細胞ペーストを調製した。
【０１９１】
まず、搭載の間に清澄化された上清を再循環させることによって、清澄化された上清から組換えＦＰ３抗原を精製した。第二に、高い塩緩衝液でアフィニティーカラムを洗浄することによって、固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムから、偽に結合されたきょう雑物質を除去した。第三に、イミダゾールを用いてＨｉｓタグ付加された抗原を拮抗的に除去することによって、Ｈｉｓタグ付加された（アミノ酸）組換えＦＰ３ポリペプチドをカラムから溶出した。続いて、溶出されたタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、分析した。著しいきょう雑を持たない組換えＦＰ３抗原を含有する画分をプールし、濃縮した。濃縮後、２０００ｍＬのＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００サイジングカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＦＰ３抗原をさらに精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、濃縮した。
【０１９２】
動物の免疫化
十分な力価に関して抗血清をチェックする前に、フロイントのアジュバント系を用いて、精製されたシャーガスＦＰ４組換え抗原（標的ＦＰ３配列を含有する。）で２回及び精製されたシャーガスＦＰ３組換え抗原で１回、ＲＢｆ／ｄｎＪ雌マウス（全てのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。）を免疫化した。０．９％塩化ナトリウム中に抗原を希釈し、アジュバントの等容量で乳化することによって、接種材料を調製した。０週及び３週目で、（標的ＦＰ３配列を含有する）ＦＰ４の追加免疫２０μｇをマウスに投与した。６週目に、ＦＰ３の追加免疫１０μｇをマウスに投与した。皮下から送達される一次追加免疫のためにフロイントの完全アジュバントを使用し、次の２回の皮内追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを使用した。第三の追加免疫から２週後に、特異的な抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ力価検査のために血清試料を採取し、融合実験のためにマウス＃２４１が選択された。融合の３日前に、ＦＰ３組換え抗原５μｇの前融合強化投与をマウス＃２４１に投与した。
【０１９３】
ハイブリドーマ作製（細胞融合実験）
Ｇａｌｆｒｅらに記載されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって媒介される融合技術を用いて、ハイブリドーマを開発した（Ｇａｌｆｒｅ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．１９７７．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２６６：５５０−２）。融合前の追加免疫から３日後に、ＲＢｆ／ｄｎＪマウス＃２４１を安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓からＢ細胞を灌流し、洗浄し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞の等しい数の中に再懸濁した（ＡＴＣＣ寄託ＣＲＬ−１５８１）。全細胞を沈降させ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１ｍＬを用いて融合を行い、ＨＡＴが補充された、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を加えたＧＩＢＣＯ^（Ｒ）ハイブリドーマ無血清培地（Ｈ−ＳＦＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中において３７℃で培養した。９６ウェル組織培養プレート中に細胞を播種し、湿気を有する３７℃の温置装置中で温置した。マイクロタイター酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）中での抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＰ３反応性に関して、１０から１４日後に、ハイブリッドを検査した。結果は、ハイブリッド１２−３９２が抗ＦＰ３特異的抗体を分泌することを示した。
【０１９４】
ハイブリドーマクローニング及びサブクローニング
限界希釈クローニングのために、ハイブリドーマ１２−３９２を選択した。細胞を懸濁し、次いで、１０％ＦＢＳを加えたＨ−ＳＦＭ２０ｍＬ中に、１０^４、１０^５及び１０^６系列希釈した。ウェル当り細胞懸濁物０．２ｍＬを加えた９６ウェル組織培養プレート中に各希釈を播種した。湿気を有する温置装置中において、３７℃で１０から１４日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗ＦＰ３マイクロタイターＥＩＡ中で上清を検査し、クローン１２−３９２−１５０の選択をもたらした。
【０１９５】
蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）を用いるサブクローニングのために、クローン１２−３９２−１５０を選択した。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、細胞懸濁物を染色した。１０％ＦＢＳを加えたＨ−ＳＦＭ０．２ｍＬを加えた９６ウェル組織培養プレート中に、この染色された細胞集団の上位５から８％から得られた単一の細胞単離株を堆積させた。湿気を有する温置装置中において、３７℃で１０から１４日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗ＦＰ３マイクロタイターＥＩＡ中で上清を検査し、クローン１２−３９２−１１０（ＨＢＦＰ３）の選択をもたらした。
【０１９６】
１０％ＦＢＳを加えたＨ−ＳＦＭ中、細胞継代５、８５０ｃｍ^２ローラー瓶まで、ＨＢＦＰ３を組織培養中で増殖させた。継代５細胞懸濁物を沈降させ、凍結培地中に再懸濁させ、凍結容器中に分配した。液体窒素保存タンク中に容器を保存した。
【実施例２】
【０１９７】
シャーガスＴｃＦ組換え抗原（シャーガス９−６３８−１３２−１１５）に対する抗体を産生する細胞株
免疫原源
動物の免疫化のために使用した精製されたＴｃＦ組換え抗原（ＰＥＰ２配列を含有する。）は、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から入手した。
【０１９８】
動物の免疫化
十分な力価に関して抗血清をチェックする前に、フロイントのアジュバント系を用いて、精製されたシャーガスＴｃＦ組換え抗原を用いて、ＲＢｆ／ｄｎＪ雌マウスを３回免疫化した。０．９％塩化ナトリウム中に抗原を希釈し、アジュバントの等容量で乳化することによって、接種材料を調製した。０、６及び１２週目に、ＴｃＦの追加免疫２０μｇをマウスに投与した。皮下から送達される一次追加免疫のためにフロイントの完全アジュバントを使用し、次の２回の皮内追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを使用した。第三の追加免疫から２週後に、特異的な抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ力価検査のために血清試料を採取し、これにより、融合実験のためにマウス＃１１５が選択された。融合の３日前に、ＴｃＦ組換え抗原１０μｇ及びＴｃＦＰｅｐ２ペプチド１０μｇの前融合追加免疫をマウス＃１１５に投与した。
【０１９９】
ハイブリドーマの作製
Ｇａｌｆｒｅら（Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９７７）に記載されているＰＥＧによって媒介される融合技術を用いて、ハイブリドーマを開発した。融合前の追加免疫から３日後に、ＲＢｆ／ｄｎＪマウス＃１１５を安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓からＢ細胞を灌流し、洗浄し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＴＣ寄託ＣＲＬ−１５８１）の等しい数の中に再懸濁した。全細胞を沈降させ、ＰＥＧ１ｍＬを用いて融合を行い、ＨＡＴが補充された、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を加えたＧＩＢＣＯ^（Ｒ）Ｈ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中において３７℃で培養した。９６ウェル組織培養プレート中に細胞を播種し、湿気を有する３７℃の温置装置中で温置した。マイクロタイターＥＩＡ中での抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＰｅｐ２反応性に関して、１０から１４日後に、ハイブリッドを検査した。結果は、ハイブリッド９−６３８が抗Ｐｅｐ２特異的抗体を分泌することを示した。
【０２００】
ハイブリドーマクローニング及びサブクローニング
限界希釈クローニングのために、ハイブリドーマ９−６３８を選択した。細胞を懸濁し、次いで、１０％ＦＢＳを加えたＨ−ＳＦＭ２０ｍＬ中に、１０^４、１０^５及び１０^６系列希釈した。ウェル当り細胞懸濁物０．２ｍＬを加えた９６ウェル組織培養プレート中に各希釈を播種した。湿気を有する温置装置中において、３７℃で１０から１４日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗Ｐｅｐ２マイクロタイターＥＩＡ中で上清を検査し、クローン９−６３８−１３２を選択した。
【０２０１】
ＦＡＣＳを用いたサブクローニングのために、クローン９−６３８−１３２を選択した。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を用いて、細胞懸濁物を染色した。１０％ＦＢＳを加えたＨ−ＳＦＭ０．２ｍＬを加えた９６ウェル組織培養プレート中に、この染色された細胞集団の上位１％から得られた単一の細胞単離株を堆積させた。湿気を有する温置装置中において、３７℃で１０から１４日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗Ｐｅｐ２マイクロタイターＥＩＡ中で上清を検査し、クローン９−６３８−１３２−１１５の選択をもたらした。
【０２０２】
１０％ＦＢＳを加えたＨ−ＳＦＭ中、細胞継代６、８５０ｃｍ^２ローラー瓶まで、クローン９−６３８−１３２−１１５を組織培養中で増殖させた。継代５細胞懸濁物を沈降させた。次いで、凍結溶媒中に沈降物を再懸濁し、凍結容器中に分配した。液体窒素保存タンク中に容器を保存した。
【実施例３】
【０２０３】
シャーガスＦＰ１０組換え抗原（シャーガス１０−７４５−１４０）に対する抗体を産生する細胞株
免疫原源
シャーガスＦＰ１０抗原（配列番号６）細胞株は、レイク郡の種子銀行のために、アイオワ大学のＬｏｕｉｓ Ｋｉｒｃｈｏｆ博士の研究室から入手した。この抗原をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号５）をｐＥＴ発現ベクター中にクローニングし、細胞を処理し、実施例１に概説されているように組換え抗原を精製した。
【０２０４】
動物の免疫化
十分な力価に関して抗血清をチェックする前に、フロイントのアジュバント系を用いて、精製されたシャーガスＦＰ１０組換え抗原を用いて、ＲＢｆ／ｄｎＪ雌マウスを３回免疫化した。０．９％塩化ナトリウム中に抗原を希釈し、アジュバントの等容量で乳化することによって、接種材料を調製した。０、３、及び６週目に、追加免疫２０μｇをマウスに投与した。皮下から送達される一次追加免疫のためにフロイントの完全アジュバントを使用し、次の２回の皮内追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを使用した。第三の追加免疫から２週後に、特異的な抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ力価検査のために血清試料を採取し、融合実験のためにマウス＃２３０を選択した。融合の３日前に、ＦＰ１０組換え抗原２５μｇ及びＦＰ１０組換え抗原のＬ−ドメインに相当する１４アミノ酸の合成ペプチド２５μｇからなる前融合追加免疫をマウス＃２３０に投与した。
【０２０５】
ハイブリドーマの作製
Ｇａｌｆｒｅら（Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９７７）に記載されているＰＥＧによって媒介される融合技術を用いて、ハイブリドーマを開発した。融合前の追加免疫から３日後に、ＲＢｆ／ｄｎＪマウス＃２３０を安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓からＢ細胞を灌流し、洗浄し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＴＣ寄託ＣＲＬ−１５８１）の等しい数の中に再懸濁した。全細胞を沈降させ、ＰＥＧ１ｍＬを用いて融合を行い、ＨＡＴが補充された、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を加えたＧＩＢＣＯ^（Ｒ）Ｈ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中において３７℃で培養した。９６ウェル組織培養プレート中に細胞を播種し、湿気を有する３７℃の温置装置中で温置した。ＥＩＡ中での抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＰ１０反応性に関して、１０から１４日後に、得られたハイブリドーマを検査した。１０−７４５として知られる抗アール・クルーズＦＰ１０ｍＡｂを分泌するハイブリドーマを選択した。
【０２０６】
ハイブリドーマクローニング
限界希釈クローニングのために、ハイブリドーマ１０−７４５を選択した。細胞を懸濁し、次いで、１０％ＦＢＳを加えたＨ−ＳＦＭ２０ｍＬ中に、１０^４、１０^５及び１０^６系列希釈した。ウェル当り細胞懸濁物０．２ｍＬを加えた９６ウェル組織培養プレート中に各希釈を播種した。湿気を有する温置装置中において、３７℃で１０から１４日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗ＦＰ１０マイクロタイターＥＩＡ中で上清を検査し、クローン１０−７４５−１４０の選択をもたらした。
【０２０７】
１０％を加えたＩＭＤＭ中、細胞継代２、Ｔ７５フラスコに、組織培養物中でクローン１０−７４５−１４０を増殖させた。継代２細胞懸濁物を遠心によって沈降させた。次いで、沈降物を凍結溶媒中に再懸濁し、適切に標識された凍結容器中に分配した。液体窒素保存タンク中に容器を保存した。
【実施例４】
【０２０８】
シャーガスＦＲＡ組換え抗原（シャーガスＦＲＡ８−３６７−１７１）に対する抗体を産生する細胞株
免疫原源
ＦＰ６ポリペプチド中に含まれるＦＲＡ領域（配列番号８）を含有するＴ．ｃｒｕｚｉ抗原細胞株は、レイク郡の種子銀行のために、アイオワ大学のＬｏｕｉｓ Ｋｉｒｃｈｏｆｆ博士の研究室から入手した。この抗原をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号７）をｐＥＴ発現ベクター中にクローニングし、細胞を処理し、実施例１に概説されているように組換え抗原を精製した。
【０２０９】
動物の免疫化
十分な力価に関して抗血清をチェックする前に、フロイントのアジュバント系を用いて、精製されたシャーガス組換え抗原ＦＰ６を用いて、ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを３回免疫化した。０．９％塩化ナトリウム中に抗原を希釈し、アジュバントの等容量で乳化することによって、接種材料を調製した。０、４及び１０週目に、追加免疫１０μｇをマウスに投与した。皮下から送達される一次追加免疫のためにフロイントの完全アジュバントを使用し、次の２回の皮内追加免疫のためにフロイントの不完全アジュバントを使用した。第三の追加免疫から２週後に、特異的な抗Ｔ．ｃｒｕｚｉ力価検査のために血清試料を採取し、融合実験のためにマウス＃１９０７を選択した。融合の３日前に、組換え抗原２５μｇ及び組換え抗原のＦＲＡ−ドメインに相当する合成ペプチド２５μｇからなる前融合追加免疫をマウス＃１９０７に投与した。
【０２１０】
ハイブリドーマの作製
Ｇａｌｆｒｅら（Ｇａｌｆｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９７７）に記載されているＰＥＧによって媒介される融合技術を用いて、ハイブリドーマを開発した。融合前の追加免疫から３日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス＃１９０７を安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓からＢ細胞を灌流し、洗浄し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＴＣ寄託ＣＲＬ−１５８１）の等しい数の中に再懸濁した。全細胞を沈降させ、ＰＥＧ１ｍＬを用いて融合を行い、ＨＡＴが補充された、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を加えたＧＩＢＣＯ^（Ｒ）Ｈ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中において３７℃で培養した。９６ウェル組織培養プレート中に細胞を播種し、湿気を有する３７℃の温置装置中で温置した。ＥＩＡ中での抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＲＡドメインの反応性に関して、１０から１４日後に、得られたハイブリドーマを検査した。８−３６７として知られる抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＲＡドメインｍＡｂを分泌するハイブリドーマを選択した。
【０２１１】
ハイブリドーマクローニング
限界希釈クローニングのために、ハイブリッド８−３６７を選択した。細胞を懸濁し、次いで、１０％ＦＢＳを加えたＨ−ＳＦＭ２０ｍＬ中に、１０^４、１０^５及び１０^６希釈物を系列希釈した。ウェル当り細胞懸濁物０．２ｍＬを加えた９６ウェル組織培養プレート中に各希釈を播種した。湿気を有する温置装置中において、３７℃で１０から１４日間、プレートを温置した。増殖が明白になるにつれて、抗ＦＲＡマイクロタイターＥＩＡ中で上清を検査し、クローン８−３６７−１７１を選択した。
【０２１２】
１０％ＦＢＳを加えたＩＭＤＭ中、細胞継代３、Ｔ７５フラスコに、組織培養物中でクローン８−３６７−１７１を増殖させた。継代２細胞懸濁物を沈降させ、凍結培地中に再懸濁させ、凍結容器中に分配した。液体窒素保存タンク中に容器を保存した。
【実施例５】
【０２１３】
キメラ抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＰ３ｍＡｂ（シャーガスＦＰ３ １２−３９２−１５０ＣＨＯ２５８０−１０４）を産生する細胞株
この実施例及びその後の実施例は、マウス−ヒトキメラモノクローナル抗体を発現する哺乳動物細胞株の作製に関し、以下の全般的なアプローチを採用した。所望のｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞株（実施例１から４のハイブリドーマなど）を同定した後、これらの細胞からｍＲＮＡを単離し、抗体遺伝子配列を同定した。次いで、ヒト抗体定常配列を供給するＶ_Ｌ及びＶ_Ｈ配列をｐＢＯＳベクター中にクローニングし（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｓ， Ｎａｇａｔａ Ｓ．， “ｐＥＦ−ＢＯＳ， ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０ Ｓｅｐ １１；１８（１７）：５３２２及びＵＳ ２００５／０２２７２８９（これらのベクターの使用及びベクターそのものに関するその教示に関して、参照により組み込まれる。）、次いで、得られたキメラ抗体が機能的であることを確認するために、一過性の発現系中に同時形質移入した。確認したら、Ｖ_Ｌ配列をｐＪＶ中に、Ｖ_Ｈ配列をｐＢＶ中にサブクローニングした。これらのベクターは、次いで、安定なｐＢＪ発現ベクターを構築するために使用された。ｐＪＶプラスミドはＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）から入手し、ＳＶ４０プロモーター、マウスＤＨＦＲ遺伝子、エンハンサー、プロモーター及びλｓｔｕｆｆｅｒを含む。ｐＢＶプラスミド（同じく、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡから入手）は、エンハンサー、プロモーター及びλｓｔｕｆｆｅｒを含む。次いで、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をｐＢＪで形質移入し、安定な形質移入体を選択し、分泌された抗体を再び検査した。図１は、ヒト定常領域遺伝子が付加されたベクター中にマウス可変領域遺伝子（抗原結合部分）が転移されているキメラ抗体の模式的な要約を示している。
【０２１４】
マウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の同定
標準的なｍＲＮＡ抽出プロトコールに従ってｍＲＮＡを精製するために約５×１０^６個の細胞を得るため、Ｈ−ＳＦＭ中でハイブリドーマ細胞株ＨＢＦＰ３（実施例１）を培養した。ＲＴ−ＰＣＲ反応中で、マウスＩｇプライマーの組（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とともに、精製されたｍＲＮＡをテンプレートとして使用した。陽性ＰＣＲ産物が、重鎖（Ｈ）プライマーＢ及びＣ（ＨＢ及びＨＣクローン）から並びに軽鎖（Ｌ）プライマーＡ、Ｂ、Ｃ及びＧ（ＬＡ、ＬＢ、ＬＣ及びＬＧクローン）から観察された。全ての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ ＴＯＰＯ２．１ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。形質転換された細菌細胞からプラスミドＤＮＡを精製し、適切な大きさの産物を与える各ＲＴ−ＰＣＲ反応に対して、ＥｃｏＲＩ消化によってＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ挿入物を確認した。配列の並置によってクローン間のコンセンサス配列を確認した後、正しいＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ遺伝子配列を選択した。シャーガスＴＯＰＯ−ＴＡクローンＨＢ１は正しいＶ_Ｈ遺伝子配列を含有し、シャーガスＴＯＰＯ−ＴＡクローンＬＧ３は正しいＶ_Ｌ遺伝子配列を含有した。
【０２１５】
ｐＢＯＳベクター中へのマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子のクローニング
ＴＯＰＯクローンＬＧ３からマウスＶ_Ｌ遺伝子を増幅するために、５’プライマー上にＮｒｕＩ部位とともに部分的なκシグナル配列及び３’プライマー上にＢｓｉＷＩ部位を含有するＰＣＲプライマーの対を使用した。さらに、ＴＯＰＯクローンＨＢ１からマウスＶ_Ｈ遺伝子を増幅するために、５’プライマー上に部分的な重鎖シグナル配列及びＮｒｕＩ部位並びに３’プライマー上にＳａｌＩ部位を含有するプライマーの対を使用した。ＮｒｕＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素を用いてＶ_ＬＰＣＲ産物を消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＯＳ−ｈＣｋベクター中に連結した。ＮｒｕＩ及びＳａｌＩ制限酵素を用いてＶ_ＨＰＣＲ産物を消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＯＳ−ｈＣｇｌベクター中に連結した。それぞれのベクター中のシャーガスＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ遺伝子の存在を確認するために、多数の形質転換された細菌性コロニーから得られるプラスミドの配列を決定した。シャーガス１２−３９２−１５０Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈクローン４及びシャーガス１２−３９２−１５０Ｖ_Ｌ ｐＢＯＳ−Ｌクローン５は、正しいと思われた。
【０２１６】
キメラｍＡｂの作製及び機能の確認
シャーガス１２−３９２−１５０Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈクローン１及びシャーガス１２−３９２−１５０Ｖ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−Ｌクローン４の内毒素を含まないプラスミド調製物を、電気穿孔（ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ^（Ｒ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によってＣＯＳ７Ｌ細胞中への一過性形質移入のために使用した。３日間、５％ＣＯ_２温置装置中において、３７℃で、形質移入された細胞を温置した。４０００ｒｐｍでの２０分間の遠心によって、ＣＯＳ７Ｌ細胞によって産生されるキメラ抗体を採集し、次いで、プロテインＡアフィニティーカラム（ＰＯＲＯＳＡ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて精製した。活性を確認するために、ＢＩＡＣＯＲＥ^（Ｒ）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）上での表面プラズモン共鳴を用いて、採集された抗体をアッセイした。
【０２１７】
ＣＨＯ細胞株安定発現ベクタークローニング
安定な形質移入されたＣＨＯ細胞株を作製するためのプラスミドを構築するために、シャーガス１２−３９２−１５０Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈクローン１及びシャーガス１２−３９２−１５０Ｖ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−Ｌクローン４を使用した。まず、ｐＢＯＳベクターからＶ_Ｈ−ＣＨ及びＶ_Ｌ−ＣＬ遺伝子を単離するために、ＳｒｆＩ及びＮｏｔＩを使用した。次いで、これらの断片を、それぞれ、ｐＢＶ又はｐＪＶベクター中にクローニングした。両ベクターはＡｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡ）から取得し、抗体遺伝子の発現に必要とされる制御配列を含有していた。ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ制限酵素消化によって、得られたｐＢＶ及びｐＪＶクローンを分析し、シャーガス １０−７４５Ｖ_Ｈ＿ｐＢＶクローン４及びシャーガス１２−３９２−１５０＿ｐＪＶクローン１が正しいことを測定するために配列を決定した。第二に、正しいｐＢＶ又はｐＪＶクローンの両方をＰａｃＩ及びＡｓｃＩで消化し、重及び軽鎖遺伝子の両方を含有する単一のｐＢＪプラスミドを形成するために、Ｖ_Ｈ−ＣＨ及びＶ_Ｌ−ＣＬを含有する得られたＤＮＡ断片を連結する。両抗体遺伝子の存在を確認するために、ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ消化によって、ｐＢＪクローンをスクリーニングした。シャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪクローン４に対するプラスミド地図が、図２に示されている。ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子含有領域の二本鎖ポリヌクレオチド配列（及び隣接配列）が、図３ＡからＣに示されている。
【０２１８】
欠損ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有する、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから入手したＣＨＯ細胞株Ｂ３．２を形質移入及び安定な抗体発現のために使用した。リン酸カルシウムによって媒介された形質移入を用いて、ＣＨＯＢ３．２細胞をシャーガス１２−３９２−１５０Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪクローン１で形質移入した。ｐＢＪプラスミド中に存在する機能的なＤＨＦＲ遺伝子を取り込んだ細胞を選択するために、チミジンを欠如する培地とともに、形質移入されたＣＨＯ細胞を数週間培養した。形質移入されたプール由来の各細胞を９６ウェルプレート中に分別するために、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）を使用した。クローン間の抗体産生に順位を付けるために、抗原特異的なＥＩＡを使用し、最高の生産物を増殖し、再度アッセイした。次いで、クローンを無血清培地中へ引き離した。増殖特性、抗体産生及びクローンのクローン性をモニターした。９６ウェルプレート中に各細胞を分別することによってシャーガスＦＰ３クローン１２−３９２−１５０ＣＨＯ２５８０−１０４をサブクローニングした後、精製された抗体を産生するために増殖させた。
【実施例６】
【０２１９】
キメラ抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＰｅｐ２エピトープ（抗ＴｃＦ及び抗ＦＰ６）ｍＡｂ（シャーガスＰｅｐ２クローン９−６３８−１９２８）を産生する細胞株
マウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の同定
標準的なｍＲＮＡ抽出プロトコールに従ってｍＲＮＡを精製するための約５×１０^６個の細胞を得るために、Ｈ−ＳＦＭ中でハイブリドーマ細胞株ＨＢＰｅｐ２（実施例２）を培養した。ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、マウスＩｇプライマーの組（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに、精製されたｍＲＮＡをテンプレートとして使用した。陽性ＰＣＲ産物が、重鎖（Ｈ）プライマーＢ及びＥ（ＨＢ及びＨＥクローン）から並びに軽鎖（Ｌ）プライマーＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ（ＬＢ、ＬＣ、ＬＤ、ＬＥ、ＬＦ及びＬＧクローン）から観察された。全ての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲＴＯＰＯ２．１ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。形質転換された細菌細胞からプラスミドＤＮＡを精製し、適切な大きさの産物を与える各ＲＴ−ＰＣＲ反応に対して、ＥｃｏＲＩ消化によって、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ挿入物を確認した。配列の並置によってクローン間のコンセンサス配列を確認した後、正しいＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ遺伝子配列を選択した。シャーガスＴＯＰＯ−ＴＡクローンＨＥ２は正しいＶ_Ｈ遺伝子配列を含有し、シャーガスＴＯＰＯ−ＴＡクローンＬＧ１は正しいＶ_Ｌ遺伝子配列を含有した。
【０２２０】
ｐＢＯＳベクター中へのマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子のクローニング
ＴＯＰＯクローンＬＧ１からマウスＶ_Ｌ遺伝子を増幅するために、５’プライマー上に部分的なκシグナル配列及びＮｒｕＩ部位並びに３’プライマー上にＢｓｉＷＩ部位を含有するＰＣＲプライマーの対を使用した。さらに、ＴＯＰＯクローンＨＥ２からマウスＶ_Ｈ遺伝子を増幅するために、５’プライマー上に部分的な重鎖シグナル配列及びＮｒｕＩ部位並びに３’プライマー上にＳａｌＩ部位を含有するプライマーの対を使用した。ＮｒｕＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素を用いてＶ_ＬＰＣＲ産物を消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＯＳ−ｈＣｋベクター中に連結した。ＮｒｕＩ及びＳａｌＩ制限酵素を用いてＶ_ＨＰＣＲ産物を消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＯＳ−ｈＣｇ１ベクター中に連結した。それぞれのベクター中のシャーガスＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ遺伝子の存在を確認するために、多数の形質転換された細菌性コロニーから得られるプラスミドの配列を決定した。シャーガス９−６３８Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−ＨクローンＡ２及びシャーガス９−６３８Ｖ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−ＬクローンＢ６は、正しいと思われた。
【０２２１】
キメラｍＡｂの作製及び機能の確認
シャーガス９−６３８Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−ＨクローンＡ２及びシャーガス９−６３８Ｖ_Ｌ ｐＢＯＳ−ＬクローンＢ６の内毒素を含まないプラスミド調製物を、電気穿孔（ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ^（Ｒ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によってＣＯＳ７Ｌ細胞中への一過性形質移入のために使用した。３日間、５％ＣＯ_２温置装置中において、３７℃で、形質移入された細胞を温置した。４０００ｒｐｍでの２０分間の遠心によって、ＣＯＳ７Ｌ細胞によって産生されるキメラ抗体を採集し、次いで、プロテインＡアフィニティーカラム（ＰＯＲＯＳＡ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて精製した。活性を確認するために、ＢＩＡＣＯＲＥ^（Ｒ）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）上での表面プラズモン共鳴を用いて、採集された抗体をアッセイした。親和性は、約２．６ｎＭであった。
【０２２２】
ＣＨＯ細胞株安定発現ベクタークローニング
安定な形質移入されたＣＨＯ細胞株を作製するためのプラスミドを構築するために、シャーガス９−６３８Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−ＨクローンＡ２及びシャーガス９−６３８Ｖ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−ＬクローンＢ６を使用した。まず、ｐＢＯＳベクターからＶ_Ｈ−ＣＨ及びＶ_Ｌ−ＣＬ遺伝子を単離するために、ＳｒｆＩ及びＮｏｔＩを使用した。次いで、これらの断片を、それぞれ、ｐＢＶ又はｐＪＶｂベクター中にクローニングした。ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ制限酵素消化によって、得られたｐＢＶ及びｐＪＶクローンを分析し、シャーガス９−６３８Ｖ_Ｈ＿ｐＢＶクローン１０及びシャーガス９−６３８＿ｐＪＶクローン１０が正しいことを測定するために配列を決定した。第二に、正しいｐＢＶ又はｐＪＶクローンの両方をＰａｃＩ及びＡｓｃＩで消化し、重及び軽鎖遺伝子の両方を含有する単一のｐＢＪプラスミドを形成するために、Ｖ_Ｈ−ＣＨ及びＶ_Ｌ−ＣＬを含有する得られたＤＮＡ断片を連結した。両抗体遺伝子の存在を確認するために、ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ消化によって、ｐＢＪクローンをスクリーニングした。シャーガス９−６３８Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪクローン２に対するプラスミドマップが図４に示されている。
【０２２３】
欠損ＤＨＦＲ遺伝子を含有する、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから入手したＣＨＯ細胞株Ｂ３．２を形質移入及び安定な抗体発現のために使用した。リン酸カルシウムによって媒介された形質移入を用いて、ＣＨＯＢ３．２細胞をシャーガス９−６３８Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪクローン２で形質移入した。ｐＢＪプラスミド中に存在する機能的なＤＨＦＲ遺伝子を取り込んだ細胞を選択するために、チミジンを欠如する培地とともに、形質移入されたＣＨＯ細胞を数週間培養した。形質移入されたプール由来の各細胞を９６ウェルプレート中に分別するために、ＦＡＣＳを使用した。クローン間の抗体産生に順位を付けるために、抗原特異的なＥＩＡを使用し、最高の生産物を増殖し、再度アッセイした。次いで、クローンを無血清培地中に引き離した。増殖特性、抗体産生及びクローンのクローン性をモニターした。シャーガスＰｅｐ２クローン９−６３８−１１４５を選択し、９６ウェルプレート中に各細胞を分別することによって再度サブクローニングし、次いで、精製された抗体を生産するために、シャーガスＰｅｐ２クローン９−６３８−１９２８を増殖させた。
【実施例７】
【０２２４】
キメラ抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＰ１０ｍＡｂ（シャーガスＦＰ１０１０−７４５−３７９６）抗体を産生する細胞株
マウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の同定
標準的なｍＲＮＡ抽出プロトコールに従ってｍＲＮＡを精製するための約５×１０^６個の細胞を得るため、Ｈ−ＳＦＭ中でハイブリドーマ細胞株ＨＢＦＰ１０（実施例３）を培養した。ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、マウスＩｇプライマーの組（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに、精製されたｍＲＮＡをテンプレートとして使用した。陽性ＰＣＲ産物が、重鎖（Ｈ）プライマーＢから（ＨＢクローン）並びに軽鎖（Ｌ）プライマーＢ、Ｃ及びＧ（ＬＢ、ＬＣ及びＬＧクローン）から観察された。全ての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲＴＯＰＯ２．１ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。形質転換された細菌細胞からプラスミドＤＮＡを精製し、適切な大きさの産物を与える各ＲＴ−ＰＣＲ反応に対して、ＥｃｏＲＩ消化によって、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ挿入物を確認した。配列の並置によってクローン間のコンセンサス配列を確認した後、正しいＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ遺伝子配列を選択した。シャーガスＴＯＰＯ−ＴＡクローンＨＢ３は正しいＶ_Ｈ遺伝子配列を含有し、シャーガスＴＯＰＯ−ＴＡクローンＬＧ１は正しいＶ_Ｌ遺伝子配列を含有した。
【０２２５】
ｐＢＯＳベクター中へのマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子のクローニング
ＴＯＰＯクローンＬＧ１からマウスＶ_Ｌ遺伝子を増幅するために、５’プライマー上に部分的なκシグナル配列及びＮｒｕＩ部位並びに３’プライマー上にＢｓｉＷＩ部位を含有するＰＣＲプライマーの対を使用した。さらに、ＴＯＰＯクローンＨＢ３からマウスＶ_Ｈ遺伝子を増幅するために、５’プライマー上に部分的な重鎖シグナル配列及びＮｒｕＩ部位並びに３’プライマー上にＳａｌＩ部位を含有するＰＣＲプライマーの対を使用した。ＮｒｕＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素を用いてＶ_ＬＰＣＲ産物を消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＯＳ−ｈＣｋベクター中に連結した。ＮｒｕＩ及びＳａｌＩ制限酵素を用いてＶ_ＨＰＣＲ産物を消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＯＳ−ｈＣｇ１ベクター中に連結した。それぞれのベクター中のシャーガスＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ遺伝子の存在を確認するために、多数の形質転換された細菌性コロニーから得られるプラスミドの配列を決定した。シャーガス１０−７４５Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈクローン４及びシャーガス１０−７４５Ｖ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−Ｌクローン５は、正しいと思われた。
【０２２６】
キメラｍＡｂの作製及び機能の確認
シャーガス１０−７４５Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈクローン４及びシャーガス１０−７４５Ｖ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−Ｌクローン５の内毒素を含まないプラスミド調製物を、電気穿孔（ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ^（Ｒ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によってＣＯＳ７Ｌ細胞中への一過性形質移入のために使用した。３日間、５％ＣＯ_２温置装置中において、３７℃で、形質移入された細胞を温置した。４０００ｒｐｍでの２０分間の遠心によって、ＣＯＳ７Ｌ細胞によって産生されるキメラ抗体を採集し、次いで、プロテインＡアフィニティーカラム（ＰＯＲＯＳＡ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて精製した。活性を確認するために、ＢＩＡＣＯＲＥ^（Ｒ）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））上での表面プラズモン共鳴を用いて、採集された抗体をアッセイした。
【０２２７】
ＣＨＯ細胞株安定発現ベクタークローニング
安定な形質移入されたＣＨＯ細胞株を作製するためのプラスミドを構築するために、シャーガス１０−７４５Ｖ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈクローン４及びシャーガス１０−７４５Ｖ_Ｌ ｐＢＯＳ−Ｌクローン５を使用した。まず、ｐＢＯＳベクターからＶ_Ｈ−ＣＨ及びＶ_Ｌ−ＣＬ遺伝子を単離するために、ＳｒｆＩ及びＮｏｔＩを使用した。次いで、これらの断片を、それぞれ、ｐＢＶ又はｐＪＶベクター中にクローニングした。ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ制限酵素消化によって、得られたｐＢＶ及びｐＪＶクローンを分析し、シャーガス １０−７４５Ｖ_Ｈ＿ｐＢＶクローン１及びシャーガス１０−７４５＿ｐＪＶクローン１が正しいことを測定するために配列を決定した。第二に、正しいｐＢＶ又はｐＪＶクローンの両方をＰａｃＩ及びＡｓｃＩで消化し、重及び軽鎖遺伝子の両方を含有する単一のｐＢＪプラスミドを形成するために、Ｖ_Ｈ−ＣＨ及びＶ_Ｌ−ＣＬを含有する得られたＤＮＡ断片を連結した。両抗体遺伝子の存在を確認するために、ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ消化によって、ｐＢＪクローンをスクリーニングした。シャーガス１０−７４５Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪクローン１に対するプラスミドマップが図５に示されている。
【０２２８】
欠損ＤＨＦＲ遺伝子を含有する、Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから入手したＣＨＯ細胞株Ｂ３．２を形質移入及び安定な抗体発現のために使用した。リン酸カルシウムによって媒介された形質移入を用いて、ＣＨＯＢ３．２細胞をシャーガス１０−７４５Ｍｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪクローン１で形質移入した。ｐＢＪプラスミド中に存在する機能的なＤＨＦＲ遺伝子を取り込んだ細胞を選択するために、チミジンを欠如する培地とともに、形質移入されたＣＨＯ細胞を数週間培養した。形質移入されたプール由来の各細胞を９６ウェルプレート中に分別するために、ＦＡＣＳを使用した。クローン間の抗体産生に順位を付けるために、抗原特異的なＥＩＡを使用し、最高の生産物を増殖し、再度アッセイした。次いで、クローンを無血清培地中に引き離した。増殖特性、抗体産生及びクローンのクローン性をモニターした。所望であれば、９６ウェルプレート中に各細胞を分別することによってシャーガスＦＰ１０クローン１０−７４５−３６４９をサブクローニングした後、精製された抗体を産生するために増殖させた。
【実施例８】
【０２２９】
キメラ抗Ｔ．ｃｒｕｚｉＦＲＡｍＡｂを産生する細胞株（理論実施例）
マウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列の同定
標準的なｍＲＮＡ抽出プロトコールに従ってｍＲＮＡを精製するための約５×１０^６個の細胞を得るために、Ｈ−ＳＦＭ中でハイブリドーマ細胞株ＨＢＦＲＡ（実施例４）を培養する。ＲＴ−ＰＣＲ反応のために、マウスＩｇプライマーの組（Ｎｏｖａｇｅｎ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）とともに、精製されたｍＲＮＡをテンプレートとして使用する。重鎖（Ｈ）プライマー及び軽鎖（Ｌ）プライマーから、陽性ＰＣＲ産物が観察される。全ての陽性ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲＴＯＰＯ２．１ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングする。形質転換された細菌細胞からプラスミドＤＮＡを精製し、適切な大きさの産物を与える各ＲＴ−ＰＣＲ反応に対して、ＥｃｏＲＩ消化によって、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ挿入物を確認する。配列の並置によってクローン間のコンセンサス配列を確認した後、正しいＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ遺伝子配列を選択する。
【０２３０】
ｐＢＯＳベクター中へのマウスＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子のクローニング
ＴＯＰＯからマウスＶ_Ｌ遺伝子を増幅するために、５’プライマー上に部分的なκシグナル配列及びＮｒｕＩ部位並びに３’プライマー上にＢｓｉＷＩ部位を含有するＰＣＲプライマーの対を使用する。さらに、ＴＯＰＯクローンからマウスＶ_Ｈ遺伝子を増幅するために、５’プライマー上に部分的な重鎖シグナル配列及びＮｒｕＩ部位並びに３’プライマー上にＳａｌＩ部位を含有するプライマーの対を使用する。ＮｒｕＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素を用いてＶ_ＬＰＣＲ産物を消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＯＳ−ｈＣｋベクター中に連結する。ＮｒｕＩ及びＳａｌＩ制限酵素を用いてＶ_ＨＰＣＲ産物を消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＯＳ−ｈＣｇ１ベクター中に連結する。それぞれのベクター（シャーガスＶ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈ及びシャーガスＶ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−Ｌ）中のシャーガスＶ_Ｈ又はＶ_Ｌ遺伝子の何れかの存在を確認するために、多数の形質転換された細菌性コロニーから得られるプラスミドの配列を決定した。
【０２３１】
キメラｍＡｂの作製及び機能の確認
シャーガスＶ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈ及びシャーガスＶ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−Ｌの内毒素を含まないプラスミド調製物を、電気穿孔（ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ^（Ｒ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）又は他の形質移入法によってＣＯＳ７Ｌ細胞中への一過性形質移入のために使用した。約３日間、５％ＣＯ_２温置装置中において、３７℃で、形質移入された細胞を温置する。４０００ｒｐｍでの２０分間の遠心によって、ＣＯＳ７Ｌ細胞によって産生されるキメラ抗体を採集し、次いで、プロテインＡアフィニティーカラム（ＰＯＲＯＳＡ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ； Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて精製する。活性を確認するために、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^（Ｒ）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での表面プラズモン共鳴を用いて、採集された抗体をアッセイする。
【０２３２】
ＣＨＯ細胞株安定発現ベクタークローニング
安定な形質移入されたＣＨＯ細胞株を作製するためのプラスミドを構築するために、シャーガスＶ_Ｈ＿ｐＢＯＳ−Ｈ及びシャーガスＶ_Ｌ＿ｐＢＯＳ−Ｌを使用する。まず、ｐＢＯＳベクターからＶ_Ｈ−ＣＨ及びＶ_Ｌ−ＣＬ遺伝子を単離するために、ＳｒｆＩ及びＮｏｔＩを使用する。次いで、これらの断片を、それぞれ、ｐＢＶ又はｐＪＶベクター中にクローニングする。ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ制限酵素消化によって、得られたｐＢＶ及びｐＪＶクローンを分析し、クローンが正しいことを決定するために配列を決定する。第二に、正しいｐＢＶ又はｐＪＶクローンの両方をＰａｃＩ及びＡｓｃＩで消化し、重及び軽鎖遺伝子の両方を含有する単一のｐＢＪプラスミドを形成するために、得られたＶ_Ｈ−ＣＨ及びＶ_Ｌ−ＣＬを含有する得られたＤＮＡ断片を連結する。両抗体遺伝子の存在を確認するために、ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ消化によって、ｐＢＪクローンをスクリーングし、シャーガスＭｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪを得た。
【０２３３】
ＣＨＯＢ３．２などの欠損ＤＨＦＲ遺伝子を含有するＣＨＯ細胞株を、形質転換及び安定な抗体発現のために使用する。リン酸カルシウムによって媒介される形質移入又は他の形質移入プロトコールを用いて、ＣＨＯＢ３．２細胞をシャーガスＭｕ−Ｈｕ＿ｐＢＪによって形質移入する。ｐＢＪプラスミド中に存在する機能的なＤＨＦＲ遺伝子を取り込む細胞を選択するために、チミジンを欠如する培地とともに、形質移入されたＣＨＯ細胞を数週間培養する。形質移入されたプール由来の各細胞を９６ウェルプレート中に分別するために、ＦＡＣＳを使用することができる。クローン間の抗体産生に順位を付けるために、抗原特異的なＥＩＡを使用することが可能であり、最高の生産物を増殖し、再度アッセイする。次いで、クローンを無血清培地中へ引き離す。増殖特性、抗体産生及びクローンのクローン性をモニターする。所望であれば、９６ウェルプレート中に各細胞を分別することによって細胞株クローンをサブクローニングした後、精製された抗体を産生するために増殖させることができる。
【実施例９】
【０２３４】
シャーガス抗原ＴｃＦに対する組換えキメラシャーガス抗体の速度論／親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００上の高密度ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ捕捉バイオセンサーを用いて、速度論／親和性を測定した。まず、１０μＬ／分の流速で５分間、カルボキシメチル−デキストラン６ｇ／Ｌ及び６ｇ／ＬＢＳＡを加えたＨＢＳ−ＥＰから構成される走行緩衝液（以下、「走行緩衝液」と称される。）（Ｆｌｕｋａ）によって、フローセルを平衡化した。次に、それぞれ走行緩衝液中に希釈された組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体、すなわち、９−６３８−１３２（ＴｃＦ及びＦＰ６中のＰｅｐ２エピトープ）、１０−７４５−１４０（ＦＰ１０）及び１２−３９２−１５０（ＦＰ３）を、各フローセル上に注射し、１つのフローセルを参照フローセルとしてブランクとして残し、バイオセンサーによって捕捉した。１００μＬ／分まで緩衝液の流速を増加し、走行緩衝液中の０から１００ｎＭまでの様々な濃度の抗原１５０μＬの注入前に、フローセルを１０分間洗浄し、続いて、走行緩衝液のみで６０から３６０秒間洗浄した。次いで、１００ｍＭＨ_３ＰＯ_４の３３μＬ注射３回で、抗ヒトＩｇＧ捕捉バイオセンサーを再生し、各シャーガス抗原の全ての濃度が２つ組みで検査されるまで上記工程を繰り返した。センサーグラムによって、各抗原注射に対して結合速度論、会合（ｋ_ａ）及び解離（ｋ_ｄ）をモニターし、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって、速度論／親和性を測定した。シャーガスＴｃＦ抗原内のＰｅｐ２エピトープとの組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体間の相互作用は、下表１４に示されている。
【０２３５】
【表１４】

【実施例１０】
【０２３６】
シャーガス抗原ＦＰ３及びＦＰ１０に対する組換えキメラシャーガス抗体の速度論／親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００上の高密度抗Ｈｉｓ_４捕捉バイオセンサーを用いて、速度論／親和性を測定した。まず、５０μＬ／分の流速で５分間、１％ＢＳＡ及び１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＨＢＳ−ＥＰ緩衝液から構成される走行緩衝液（上記実施例９で定義されている。）によって、フローセルを平衡化した。次に、シャーガス抗原（各抗原は、Ｈｉｓ_６タグを含有する。）、すなわち、ＦＰ１０及びＦＰ３を走行緩衝液中にそれぞれ希釈し、各フローセル上に注入し、１つのフローセルを参照フローセルとしてブランクとして残し、バイオセンサーによって捕捉した。緩衝液流速を１００μＬ／分まで増加させ、走行緩衝液中の０から３００ｎＭまでの様々な濃度で、続いて、走行緩衝液単独で、６０から３６０秒間、組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体（すなわち、９−６３８−１３２（ＴｃＦ及びＦＰ６中のＰｅｐ２エピトープ）、１０−７４５−１４０（ＦＰｌＯ）及び１２−３９２−１５０（ＦＰ３））のそれぞれの１５０μＬを注射する前に、フローセルを５分間洗浄した。次いで、２．５ｍＭＨ_３ＰＯ_４が添加されたＧｅｎｔｌｅ Ａｂ／Ａｇ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）の３５μＬ注射を２回及び５ｍＭＨ_３ＰＯ_４の２５μＬ注射２回で、抗Ｈｉｓ４捕捉バイオセンサーを再生し、各キメラ抗シャーガス抗体の全ての濃度が２つ組みで検査されるまで上記工程を繰り返した。センサーグラムによって、各抗体注射に対して結合速度論、会合（ｋ_ａ）及び解離（ｋ_ｄ）をモニターし、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって、速度論／親和性を測定した。シャーガスＦＰ１０抗原と組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体間の相互作用は、下表１５に示されている。シャーガスＦＰ３抗原と組換えキメラ抗シャーガスモノクローナル抗体間の相互作用は、下表１６に示されている。
【０２３７】
【表１５】

【０２３８】
【表１６】

【実施例１１】
【０２３９】
シャーガス抗原に対するマウスシャーガス抗体の速度論／親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００上の高密度ウサギ抗マウスＩｇＧ捕捉バイオセンサーを用いて、速度論／親和性を測定した。まず、５μＬ／分で５分間、１％ＢＳＡ、１％カルボキシメチル−デキストラン（「走行緩衝液」）（Ｆｌｕｋａ）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０が添加されたＨＢＳ−ＥＰ緩衝液から構成される走行緩衝液で、フローセルを平衡化した。次に、走行緩衝液中に希釈された各マウス抗シャーガス抗体（すなわち、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）８−３６７−１７１（ＦＲＡ）、９−６３８−１３２（ＴｃＦ及びＦＰ６中のＰｅｐ２エピトープ）、１０−７４５−１４０（ＦＰ１０）及び１２−３９２−１５０（ＦＰ３））を各フローセル上に注射し、バイオセンサーによって捕捉した。６０μＬ／分まで緩衝液の流速を増加し、走行緩衝液中の０から２００ｎＭまでの様々な濃度のシャーガス抗原１５０μＬの注入前に、５分間洗浄し、続いて、６０から３６０秒間、走行緩衝液のみで６０から３６０秒間洗浄した。次いで、１０μＬ／分になるように流速を変化させ、次いで、１０ｍＭグリシンｐＨ１．７の３０μＬ注入１回で抗マウスＩｇＧ捕捉バイオセンサーを再生し、各シャーガス抗原の全ての濃度が２つ組みで検査されるまで、上記工程を繰り返した。センサーグラムによって、各抗原注射に対して結合速度論、会合（ｋ_ａ）及び解離（ｋ_ｄ）をモニターし、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって、速度論／親和性を測定した。
【０２４０】
シャーガス抗原ＦＲＡ、ＦＰ６、ＴｃＦ及びＦＰ３に対して、抗シャーガスｍＡｂ１０−７４５−１４０を含有するフローセルを参照フローセルとして使用した。シャーガス抗原ＦＰ１０に対して、抗シャーガスｍＡｂ９−６３８−１３２を含有するフローセルを参照フローセルとして使用した。シャーガスＦＲＡ抗原自体とモノクローナル抗シャーガス抗体間の相互作用が、下表１７に示されている。ＦＲＡ及びシャーガスＦＰ６抗原のシャーガスＰＥＰ２エピトープとモノクローナル抗シャーガス抗体間の相互作用が、下表１８に示されている。シャーガスＴｃＦ抗原のシャーガスＰＥＰ２エピトープとモノクローナル抗シャーガス抗体間の相互作用が、下表１９に示されている。シャーガスＦＰ１０抗原とモノクローナル抗シャーガス抗体間の相互作用は、下表２０に示されている。シャーガスＦＰ３抗原とモノクローナル抗シャーガス抗体間の相互作用は、下表２１に示されている。
【０２４１】
【表１７】

【０２４２】
【表１８】

【０２４３】
【表１９】

【０２４４】
【表２０】

【０２４５】
【表２１】

【０２４６】
主題を実施し、上記目的及び利点並びに本開示に固有の目的及び利点が得られるように、本開示が適切に改変されることが当業者に容易に理解される。本明細書に記載されている分子複合体及び方法、手技、処置、分子、具体的な化合物は、好ましい実施形態の現時点での代表例であり、例示であって、本開示の範囲に対する限定を意図するものではない。本開示の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書中に開示されている開示に対して様々な置換及び修飾を施し得ることが、当業者に自明である。
【０２４７】
本明細書に挙げられている全ての特許及び公報は、本開示が属する分野における当業者の水準を示唆するものである。全ての特許及び公報は、それぞれの各公報が参照により組み込まれるものと具体的且つ個別的に記されている場合と同じ程度まで、参照により、本明細書に組み込まれる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する１つ以上の抗体を含む免疫診断試薬であって、前記１つ以上の抗体は、ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドに対して特異的な抗体からなる群から選択される、免疫診断試薬。
【請求項２】
免疫診断試薬が前記抗体の２つ以上を含む、請求項１に記載の免疫診断試薬。
【請求項３】
免疫診断試薬が
（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＲＡであり、並びにさらに、抗体が約７．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約７．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約４．０×１０^−３ｓ^−１から約３．０×１０^−１ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約５．７×１０^−１０Ｍから約４．３×１０^−７Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＰｅｐ２であり、並びにさらに、抗体が約１．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１から約８．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約６．０×１０^−３ｓ^−１から約４．０×１０^−２ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約７．５×１０^−１０Ｍから約４．０×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ１０であり、並びにさらに、抗体が（ａ）約５．０×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１から約３．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、（ｂ）約１．０×１０^−４ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び（ｃ）約３．３×１０^−１０Ｍから約１．６×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ３であり、並びにさらに、抗体が約２．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約６．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約２．０×１０^−５ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約３．３×１０^−１２Ｍから約４．０×１０^−９Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ
からなる群から選択される抗体を含む、請求項１から２の何れかに記載の免疫診断試薬。
【請求項４】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１から３の何れかに記載の免疫診断試薬。
【請求項５】
免疫診断試薬が
（ａ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｂ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｃ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｄ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｅ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｆ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｇ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｈ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｉ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｊ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｋ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｌ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｍ）配列番号２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｎ）配列番号４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｏ）配列番号６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；及び
（ｐ）配列番号８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体
からなる群から選択されるキメラ抗体を含む、請求項１から４の何れかに記載の免疫診断試薬。
【請求項６】
前記キメラ抗体が
（１）
（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；及び
（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域：
（２）
（ａ）配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｂ）配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｃ）配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；及び
（ｄ）配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域：又は
（３）
（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；並びに
（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域：
を含む、請求項５に記載の免疫診断試薬。
【請求項７】
前記キメラ抗体が、
（ａ）アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から選択される細胞株によって発現されるキメラ抗体；又は
（ｂ）アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３７、ＰＴＡ−８１３９、ＰＴＡ−８１４１及びＰＴＡ−８１４２からなる群から選択される細胞株によって発現されるキメラ抗体；
と実質的に同一である、請求項６に記載の免疫診断試薬。
【請求項８】
免疫診断試薬が検出試薬、標準化試薬及び陽性対照試薬からなる群から選択される試薬である、請求項１から８の何れかに記載の免疫診断試薬。
【請求項９】
ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
抗体が
（ａ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＲＡであり、並びにさらに、抗体が約７．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約７．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約４．０×１０^−３ｓ^−１から約３．０×１０^−１ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約５．７×１０^−１０Ｍから約４．３×１０^−７Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｂ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＰｅｐ２であり、並びにさらに、前記抗体が約１．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１から約８．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約６．０×１０^−３ｓ^−１から約４．０×１０^−２ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約７．５×１０^−１０Ｍから約４．０×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｃ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ１０であり、並びにさらに、抗体が（ａ）約５．０×１０^４Ｍ^−１ｓ^−１から約３．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、（ｂ）約１．０×１０^−４ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び（ｃ）約３．３×１０^−１０Ｍから約１．６×１０^−８Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；
（ｄ）Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドがＦＰ３であり、並びにさらに、抗体が約２．０×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１から約６．０×１０^６Ｍ^−１ｓ^−１の間の会合速度定数（ｋ_ａ）、約２．０×１０^−５ｓ^−１から約８．０×１０^−４ｓ^−１の間の解離速度定数（ｋ_ｄ）及び約３．３×１０^−１２Ｍから約４．０×１０^−９Ｍの間の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）からなる群から選択される少なくとも１つの結合定数を有する、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合する抗体；並びに
（ｅ）（ａ）から（ｄ）の任意の組み合わせ
からなる群から選択される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体がキメラ抗体である、請求項９又は１０の抗体。
【請求項１２】
（ａ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｂ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｃ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｄ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｅ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｆ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｇ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｈ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｉ）配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｊ）配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｋ）配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；及び
（ｌ）配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
からなる群から選択される、請求項１１に記載のキメラ抗体。
【請求項１３】
キメラ抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖Ｆｖ抗体、アフィニティー成熟された抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合されたＦｖ及び抗イディオタイプ抗体又はこれらの断片からなる群から選択される１つである、請求項９から１２のキメラ抗体。
【請求項１４】
抗体がモノクローナルである、請求項９から１３のキメラ抗体。
【請求項１５】
キメラ抗体が
（ａ）アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から選択される細胞株によって発現されるキメラ抗体；又は
（ｂ）アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３７、ＰＴＡ−８１３９、ＰＴＡ−８１４１及びＰＴＡ−８１４２からなる群から選択される細胞株によって発現される抗体；
と実質的に同一である、請求項９から１４のキメラ抗体。
【請求項１６】
Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体を発現する細胞株であって、前記細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関に寄託され並びにＰＴＡ−８１３６、ＰＴＡ−８１３８及びＰＴＡ−８１４０からなる群から選択される細胞株からなる群から選択される、細胞株。
【請求項１７】
請求項１に記載の免疫診断試薬を感度パネルとして使用することを含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉ検出アッセイを標準化する方法。
【請求項１８】
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を検出するための方法であって、
（ａ）キメラ抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原を含有すると疑われる検査試料を請求項４に記載の免疫診断試薬と接触させる工程；及び
（ｂ）前記Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の存在の指標として形成された何れかのキメラ抗体：抗原複合体を検出する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
キメラ抗体が検出可能な標識を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
抗体：抗原複合体が二次抗体又はその断片と接触され、前記二次抗体又はその断片が検出可能な標識を含む、請求項１８の方法。
【請求項２１】
Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体を検出するための方法であって、
（ａ）抗原：抗体複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体を含有すると疑われる検査試料を、Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗体に対して特異的な１つ以上のＴ．ｃｒｕｚｉ抗原と接触させる工程、及び
（ｂ）前記Ｔ．ｃｒｕｚｉ抗原の存在を示唆するものとして形成された何れかの抗原：抗体複合体を検出する工程
を含み
請求項４に記載の免疫診断試薬は、陽性対照又は標準化試薬として、前記方法において使用される、方法。
【請求項２２】
請求項１の免疫診断試薬を含む、Ｔ．ｃｒｕｚｉを検出するための診断キット。
【請求項２３】
ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
前記キメラ抗体が
（ａ）配列番号２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｂ）配列番号４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｃ）配列番号６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；及び
（ｄ）配列番号８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
ポリペプチドが
（１）
（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；及び
（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域：
（２）
（ａ）配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｂ）配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｃ）配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；及び
（ｄ）配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域：又は
（３）
（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；並びに
（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域：
を含む、請求項２４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
ＦＰ３、Ｐｅｐ２、ＦＰ１０及びＦＲＡポリペプチドによって構成されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドからなる群から選択されるＴ．ｃｒｕｚｉポリペプチドの診断的に適切な領域に特異的に結合するキメラ抗体の一部をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記キメラ抗体が
（ａ）配列番号２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｂ）配列番号４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；
（ｃ）配列番号６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体；及び
（ｄ）配列番号８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列によって構成されるエピトープに特異的に結合するキメラ抗体
からなる群から選択される、請求項２６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ポリペプチドが
（１）
（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；及び
（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域；
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域：
（２）
（ａ）配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｂ）配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｃ）配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；及び
（ｄ）配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
からなる群から選択されるＶ_Ｌ領域：
（３）
（ａ）配列番号１０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号１２に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｂ）配列番号１４に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号１６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；
（ｃ）配列番号１８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号２０に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域；並びに
（ｄ）配列番号２８に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号２６に記載されている配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域
からなる群から選択されるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域：
を含む、請求項２６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号１、３、５又は７に記載されているアミノ酸によって含まれるＴ．ｃｒｕｚｉアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するＴ．ｃｒｕｚｉアミノ酸配列を含む抗原を精製する方法であって、
（ａ）キメラ抗体：抗原複合体の形成を可能とする条件下で、Ｔ．ｃｒｕｚｉポリペプチドを含有すると疑われる試料を請求項１に記載の免疫診断試薬と接触させること；
（ｂ）形成されたキメラ抗体：抗原複合体を単離すること；及び
（ｃ）抗体から抗原を分離すること；
を含む、方法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４】

【図５】

【公表番号】特表２０１１−５０７５５３（Ｐ２０１１−５０７５５３Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４０８７２（Ｐ２０１０−５４０８７２）
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８８１９９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８６３９８
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】