持続性ウイルス感染を治療するための併用療法
本発明は、持続性ウイルス感染を治療するための併用療法に関する。特に、そのような感染を除去するためのワクチンおよびＩＬ−１０またはＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）アンタゴニストの組み合わせが提供される。一実施形態において、本発明は、慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法を提供し、この方法は、慢性または持続性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む。１つの実施形態では、ウイルスに対するワクチンと免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストとの組み合わせは、慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続性ウイルス感染を治療するための併用療法を提供する。特に、そのような感染をより効率的に除去するためのワクチンとＩＬ−１０またはＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）アンタゴニストの組み合わせが提供される。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染は、感染を除去するために極めて重要である強固なＴ細胞応答の引き金を引く。しかし、一部のウイルス感染に応答して、抗ウイルス性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞はウイルス抗原に対して不応答性となり、物理的に除去されるかまたは非機能性状態もしくは「枯渇」状態で存続する。この枯渇状態は、抗ウイルス性および免疫刺激性サイトカインを産生する、ウイルス感染細胞を溶解する、または増殖する能力の欠如によって特徴づけられる（たとえば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４参照）。
【０００３】
持続的なＴ細胞応答が、ヒトにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染ならびにマウスにおけるリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染の除去および制御と強く相関するという事実によって明らかにされたように、Ｔ細胞機能の多パラメータ喪失は持続を直接促進する（たとえば、Ｂａｒｂｅｒ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４３９：６８２−６８７；Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：１３０１−１３０９；Ｅｊｍａｅｓら（２００６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：２４６１−２４７１；Ｏｌｄｓｔｏｎｅら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：２３９−２４３；Ｔｈｉｍｍｅら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１３９５−１４０５；ＧａｎｄｈｉとＷａｌｋｅｒ（２００２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：１４９−１７２；およびＳｈｏｕｋｒｙら（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：３９１−４２４参照）。現在まで、抗ウイルスＴ細胞活性を報告し、持続性ウイルス感染を制御するワクチンはごくわずかしか成功を収めていない（たとえば、Ａｕｔｒａｎら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：２０５−２０８参照）。
【０００４】
最近、遺伝子欠損および抗体遮断試験に基づき、ＩＬ−１０が、ウイルス感染を除去するかまたは持続させるかを決定する単一支配的因子として同定された（たとえば、Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）前出；およびＥｊｍａｅｓら（２００６）前出参照）。確立された持続性感染の間およびＴ細胞枯渇後のＩＬ−１０の抗体遮断は、ウイルスの除去促進を導くＴ細胞機能を回復させた。持続性ウイルス感染の間に、プログラム細胞死−１：プログラム細胞死−リガンド１（ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１）の相互作用はＴ細胞機能をさらに制限し、ＰＤ−Ｌ１の抗体遮断はＴ細胞活性を刺激することができる（たとえば、Ｂａｒｂｅｒら（２００５）前出参照）。提案された１つの方策は、持続性ウイルス感染を除去するためのＩＬ−１０およびＰＤ−１経路の二重拮抗作用である（たとえば、Ｍａｒｉｎｉｃとｖｏｎ Ｈｅｒｒａｔｈ（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１１６−１２４参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｚａｊａｃら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８８：２２０５−２２１３
【非特許文献２】Ｇａｌｌｉｍｏｒｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：１３８３−１３９３
【非特許文献３】Ｗｈｅｒｒｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００３）７７：４９１１−４９２７
【非特許文献４】Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００６）１１６：１６７５−１６８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＩＬ−１０の発現上昇は、ヒトにおける多くの持続性ウイルス感染（たとえばＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ）において認められ、Ｔ細胞応答性の低下およびウイルス複製の制御の失敗と直接相関する。それゆえ、持続性ウイルス感染においてＩＬ−１０活性をよりよく制御する必要がある。本発明は、そのような感染を治療するためにＩＬ−１０アンタゴニストを使用する併用療法を提供することによってこの必要性に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、一部には、ワクチンと組み合わせたＩＬ−１０活性の中和が、抗ウイルス性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を有意に刺激し、ウイルス複製を制御するように相乗作用的に組み合わさるという驚くべきデータに基づく。さらに、ＩＬ−１０およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の両方の中和も、持続性ウイルス感染モデルにおけるウイルス負荷の減少において相乗作用を示した。
【０００８】
本発明は、慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法であって、慢性または持続性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ウイルスに対するワクチンと免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストとの組み合わせは、慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す。さらなる実施形態では、免疫抑制性サイトカインはＩＬ−１０である。加えて、免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストは、可溶性ＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）ポリペプチドを含む。ある実施形態では、可溶性ＩＬ−１０Ｒポリペプチドは、抗体分子のＦｃ部分を含む、異種ポリペプチドを含有するか、またはペグ化されている。もう１つの実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）抗体またはその抗体フラグメントである。中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体は、ヒト化抗体または完全なヒト抗体を含む、モノクローナル抗体であり得る。さらなる実施形態では、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖおよび一本鎖抗体フラグメントからなる群より選択される。本発明は、慢性または持続性ウイルス感染が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶおよびＬＣＭＶからなる群より選択されることを企図する。１つの実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンである。選択的実施形態では、免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストは、ウイルスに対するワクチンの前に投与される。
【０００９】
本発明は、慢性または持続性ウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物であって、（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに（ｂ）免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに（ｂ）免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび薬学的に受容可能な担体を含むキットを包含する。
【００１１】
本発明は、慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法であって、持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。特に、ウイルスに対するワクチンと中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントの組み合わせは、慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す。１つの実施形態では、中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体は、ヒト化抗体または完全なヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。１つの実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンである。中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体と組み合わせたワクチンの投与は、ワクチンまたは抗体治療単独と比較した場合、ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の２倍の増加またはＩＦＮ−γを産生するウイルス特異的Ｔ細胞の５倍の増加を生じさせ得る。併用治療は、治療前レベルと比較してウイルス力価を２４分の１に減少させ得る。ある実施形態では、中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントは、ウイルスに対するワクチンの前に投与される。
【００１２】
本発明は、慢性または持続性ウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物であって、（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに（ｂ）中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物を包含する。
【００１３】
また、（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに（ｂ）中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能な担体を含むキットも、本発明によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１ａ〜１ｄは、ＩＬ−１０Ｒの遮断が治療的ワクチン接種による抗ウイルスＴ細胞応答の有効な刺激を可能にすることを示す。図１ａは、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体治療とＤＮＡワクチン接種の概略図を示す。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを、未処置のままにする、ＤＮＡワクチン（ＬＶＭＶ−ＧＰ全体をコードする）で処置する、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置する、またはＤＮＡワクチンプラス抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で共処置する、のいずれかを実施した。抗ＩＬ−１０Ｒ処置は、感染後２５日目に開始し、２〜３日ごとに２週間継続した。ＤＮＡワクチン接種は感染後２９日目と３４日目に実施した。次に、感染後３９日目にＴ細胞応答を分析した。図１ｂは、エクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量したサイトカイン産生を示す。フロープロットは、ＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。データは各群につき４匹のマウスを代表する。図１ｃは、各々の処置レジメン後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１、ＧＰ２７６〜２８６およびＮＰ３９６〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示す。円は個々のマウスを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図１ｄは、アイソタイプ処置群（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示し、４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図１Ｂ】図１ａ〜１ｄは、ＩＬ−１０Ｒの遮断が治療的ワクチン接種による抗ウイルスＴ細胞応答の有効な刺激を可能にすることを示す。図１ａは、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体治療とＤＮＡワクチン接種の概略図を示す。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを、未処置のままにする、ＤＮＡワクチン（ＬＶＭＶ−ＧＰ全体をコードする）で処置する、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置する、またはＤＮＡワクチンプラス抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で共処置する、のいずれかを実施した。抗ＩＬ−１０Ｒ処置は、感染後２５日目に開始し、２〜３日ごとに２週間継続した。ＤＮＡワクチン接種は感染後２９日目と３４日目に実施した。次に、感染後３９日目にＴ細胞応答を分析した。図１ｂは、エクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量したサイトカイン産生を示す。フロープロットは、ＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。データは各群につき４匹のマウスを代表する。図１ｃは、各々の処置レジメン後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１、ＧＰ２７６〜２８６およびＮＰ３９６〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示す。円は個々のマウスを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図１ｄは、アイソタイプ処置群（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示し、４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図１Ｃ】図１ａ〜１ｄは、ＩＬ−１０Ｒの遮断が治療的ワクチン接種による抗ウイルスＴ細胞応答の有効な刺激を可能にすることを示す。図１ａは、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体治療とＤＮＡワクチン接種の概略図を示す。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを、未処置のままにする、ＤＮＡワクチン（ＬＶＭＶ−ＧＰ全体をコードする）で処置する、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置する、またはＤＮＡワクチンプラス抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で共処置する、のいずれかを実施した。抗ＩＬ−１０Ｒ処置は、感染後２５日目に開始し、２〜３日ごとに２週間継続した。ＤＮＡワクチン接種は感染後２９日目と３４日目に実施した。次に、感染後３９日目にＴ細胞応答を分析した。図１ｂは、エクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量したサイトカイン産生を示す。フロープロットは、ＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。データは各群につき４匹のマウスを代表する。図１ｃは、各々の処置レジメン後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１、ＧＰ２７６〜２８６およびＮＰ３９６〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示す。円は個々のマウスを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図１ｄは、アイソタイプ処置群（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示し、４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図１Ｄ】図１ａ〜１ｄは、ＩＬ−１０Ｒの遮断が治療的ワクチン接種による抗ウイルスＴ細胞応答の有効な刺激を可能にすることを示す。図１ａは、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体治療とＤＮＡワクチン接種の概略図を示す。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを、未処置のままにする、ＤＮＡワクチン（ＬＶＭＶ−ＧＰ全体をコードする）で処置する、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置する、またはＤＮＡワクチンプラス抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で共処置する、のいずれかを実施した。抗ＩＬ−１０Ｒ処置は、感染後２５日目に開始し、２〜３日ごとに２週間継続した。ＤＮＡワクチン接種は感染後２９日目と３４日目に実施した。次に、感染後３９日目にＴ細胞応答を分析した。図１ｂは、エクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量したサイトカイン産生を示す。フロープロットは、ＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。データは各群につき４匹のマウスを代表する。図１ｃは、各々の処置レジメン後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１、ＧＰ２７６〜２８６およびＮＰ３９６〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示す。円は個々のマウスを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図１ｄは、アイソタイプ処置群（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示し、４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図２Ａ】図２ａ〜２ｂは、ＣＤ４ Ｔ細胞応答がＩＬ−１０Ｒ遮断とワクチン接種によって増強されることを示す。図２ａは、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを図１で述べたように処置し、分析したことを示す。サイトカイン産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度をエクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量した。フロープロットは、各々の処置（感染後３９日目）後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を示す。図２ｂは、図２Ｂで述べたように定量したＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数を示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図２ｂは、アイソタイプ処置と比較した各処置レジメン後のＩＬ−２産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示す。個々のバーは、各群につき４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均値±ＳＤを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】図２ａ〜２ｂは、ＣＤ４ Ｔ細胞応答がＩＬ−１０Ｒ遮断とワクチン接種によって増強されることを示す。図２ａは、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを図１で述べたように処置し、分析したことを示す。サイトカイン産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度をエクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量した。フロープロットは、各々の処置（感染後３９日目）後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を示す。図２ｂは、図２Ｂで述べたように定量したＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数を示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図２ｂは、アイソタイプ処置と比較した各処置レジメン後のＩＬ−２産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示す。個々のバーは、各群につき４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均値±ＳＤを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図３Ａ】図３ａおよび３ｂは、ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断がＴ細胞機能を回復することを示す。感染の前に、マウスにＬＣＭＶ特異的ＴｃＲ ｔｇ（図３ａ）ＣＤ８＋（Ｐ１４）および（図３ｂ）ＣＤ４＋（ＳＭＡＲＴＡ）Ｔ細胞を接種し、その後ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３に感染させた。マウスを、図１ａで述べたようにアイソタイプ対照抗体、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体および／またはＤＮＡワクチンで処置した。棒グラフは、感染後３９日目のＰ１４およびＳＭＡＲＴＡ細胞の数の倍数増加を示す。個々のバーは、各群につき５匹のマウスの平均±ＳＤを示す。＊：アイソタイプおよびＤＮＡワクチン単独と比較して平均数の有意の（ｐ＜０．０５）増加。＊＊：他のすべての条件と比較して有意の（ｐ＜０．０５）増加。
【図３Ｂ】図３ａおよび３ｂは、ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断がＴ細胞機能を回復することを示す。感染の前に、マウスにＬＣＭＶ特異的ＴｃＲ ｔｇ（図３ａ）ＣＤ８＋（Ｐ１４）および（図３ｂ）ＣＤ４＋（ＳＭＡＲＴＡ）Ｔ細胞を接種し、その後ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３に感染させた。マウスを、図１ａで述べたようにアイソタイプ対照抗体、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体および／またはＤＮＡワクチンで処置した。棒グラフは、感染後３９日目のＰ１４およびＳＭＡＲＴＡ細胞の数の倍数増加を示す。個々のバーは、各群につき５匹のマウスの平均±ＳＤを示す。＊：アイソタイプおよびＤＮＡワクチン単独と比較して平均数の有意の（ｐ＜０．０５）増加。＊＊：他のすべての条件と比較して有意の（ｐ＜０．０５）増加。
【図４】図４ａ〜４ｂは、免疫抑制環境を軽減し、Ｔ細胞応答を刺激することによる持続性ウイルス感染の制御の促進を示す。図４ａは、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを図１ａで述べたように感染させ、処置したことを示す。棒グラフは、各々の処置レジメンに応答した血清ウイルス力価の倍数減少を示す。倍数減少は、感染後２５日目（すなわち処置前）の各マウスにおけるウイルス力価を感染後３３日目（すなわち処置期間中）のウイルス力価で除することによって決定した。バーは、各群につき３匹のマウスの平均±ＳＤを示し、各群につき３〜６匹のマウスに関する３回の別々の実験を代表する。図４ｂは、感染後２５日目（灰色の円）および４０日目（白色の円）（すべての治療処置の完了後）に血清ウイルス力価を定量したことを示す。各々の円は１匹のマウスを表し、グラフは３回の実験からのデータを含む。破線はアッセイの検出のレベル（２００ＰＦＵ／ｍｌ）を示す。＊は、未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較して感染後４０日目のウイルス力価の有意の（ｐ＜０．０５）低下を示す。＊＊は、他のすべての処置群と比較して４０日目にウイルス力価が有意に（ｐ＜０．０５）低下したことを示す。各々の群の上部の数字は、感染後２５日目から４０日目までの間のウイルス力価の平均倍数低下を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＬＣＭＶ Ｃｌ １３感染後４０日目および以下の処置：ａ）アイソタイプ対照抗体；ｂ）抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体単独；ｃ）抗ＰＤ−Ｌ１遮断抗体単独；または４）抗ＩＬ−１０Ｒ抗体と抗ＰＤ−Ｌ１遮断抗体による共処置後の、脾臓におけるＴｈｙ１．１＋ ｔｇウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（Ｐ１４細胞）の頻度を示す。処置は感染後２５日目に開始し、３日ごとに合計５回の処置を実施した。右側のグラフは、各々の処置レジメン後のＰ１４細胞の数を示す。図５Ａおよび５Ｂからのデータは、各処置群につき４〜５匹のマウスおよび２回の実験を代表する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＬＣＭＶ Ｃｌ １３感染後４０日目の脾臓におけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生Ｐ１４細胞のパーセンテージを示す。棒グラフは、アイソタイプ処置（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生Ｐ１４細胞の数の平均倍数増加±ＳＤ（＊；ｐ＜０．０５）を示す。図５Ａおよび５Ｂからのデータは、各処置群につき４〜５匹のマウスおよび２回の実験を代表する。
【図６】図６Ａは、ＩＬ−１０Ｒ／ＰＤ−Ｌ１二重遮断後の持続性ウイルス感染の除去を示す。ＬＣＭＶ Ｃｌ １３マウスを指示されている抗体で処置し、処置前の２５日目（暗い円）、および処置停止後３日目に当たる４０日目（白い円）に血清ウイルス力価を定量した。各々の円は各群内の１匹のマウスを表し、グラフは３回の実験からのデータを含む。破線はアッセイの検出のレベル（２００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌ血清）を示す。各群の上部の数字は、２５日目から４０日目までの間のウイルス力価の平均倍数低下を示す（＊は、アイソタイプ処置と比較したウイルス力価の低下（ｐ＜０．０５）である；＊＊は、他のすべての処置群と比較したウイルス力価の低下（ｐ、０．０５）である）。図６Ｂは、前述した処置レジメン後の、ＬＣＭＶ Ｃｌ １３感染後４０日目の肝ウイルス力価を示す。
【図７】図７は、指示されている組織中に存在するＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１およびＬＣＭＶ−ＧＰ２７６〜２８６四量体陽性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の総数の定量的測定を示す。（＊−ｐ＜０．０５；＊＊−ｐ＜０．０１；および＊＊＊−ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
添付の特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」のような語の単数形態は、文脈上明らかに異なる指示が為されない限り、対応する複数の言及を包含する。
【００１６】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、各々個々の公表文献、特許出願または特許が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的且つ個別に指示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
Ｉ．定義
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性、遺伝子発現を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性の調節等を表し得るまたは意味し得る。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、たとえば接着を調節するもしくは維持するうえでの活性、または細胞の構造、たとえば細胞膜もしくは細胞骨格を維持するうえでの活性を意味し得る。「活性」はまた、比活性、たとえば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］等を意味し得る。
【００１８】
本明細書で使用される「慢性ウイルス感染」または「持続性ウイルス感染」は、致死的であることが判明せずに、長期間にわたって、通常は数週間、数ヶ月間または数年間、宿主に感染し、宿主の細胞内で増殖することができる、ヒトまたは他の動物のウイルス感染を意味する。慢性感染を生じさせる、そして本発明に従って治療し得るウイルスの中には、そのすべてが重大な臨床疾患を生じさせ得る、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスおよび他のヘルペスウイルス、Ｂ型およびＣ型肝炎のウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）ならびに他の肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ならびにＨＩＶがある。長期的な感染は、最終的に、患者にとって致死的であり得る疾患、たとえばＣ型肝炎ウイルスの場合は肝癌の誘発を導き得る。本発明に従って治療し得る他の慢性ウイルス感染は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびに腫瘍に関連し得るもののような他のウイルス、または動物の場合は、様々な動物ウイルス疾患、たとえばペット動物または農業において重要な農業動物のウイルス疾患を含む。
【００１９】
「治療有効量」は、患者にとっての利益を示すのに十分な量で投与されるＩＬ−１０アンタゴニストおよびワクチンを意味する。そのような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。投与される実際の量および投与速度と時間経過は、治療される対象の性質と重症度に依存する。
【００２０】
「ワクチン」は、レシピエントにおいて防御免疫を惹起するために使用できる組成物（タンパク質またはベクター；後者はまた、大まかに「ＤＮＡワクチン」とも称され得るが、ＲＮＡベクターも使用できる）を指す。一部の個体は強固なもしくは防御免疫応答を開始することができないことがあり、または一部の場合、いかなる免疫応答も開始できないことがあり得るので、有効であるために、本発明のワクチンは集団の一部において免疫を惹起できることに留意すべきである。この不可能性は、個体の遺伝的背景から、または免疫不全状態（後天性もしくは先天性）または免疫抑制（たとえば臓器拒絶反応を予防するもしくは自己免疫状態を抑制するための免疫抑制薬による治療、または免疫媒介性免疫抑制）のために生じ得る。効果は動物モデルにおいて立証することができる。
【００２１】
「免疫療法」は、病原体特異的免疫応答の活性化に基づく治療レジメンを指す。ワクチンは免疫療法の１つの形態であり得る。
【００２２】
「保護する」は、対象においてウイルス感染を、たとえば持続性または慢性ウイルス感染を、適宜に、予防するまたは治療することまたはその両方を意味するために本明細書で使用される。それゆえ、別の作用物質、たとえばＩＬ−１０アンタゴニストと組み合わせたワクチンの予防的または治療的投与は、そのような持続性ウイルス感染から受容対象を保護することができる。ワクチンまたは免疫療法の治療的投与は、たとえば、ウイルス関連新生物のような疾患または障害を治療するために、感染に関連する病因からレシピエントを保護することができ、ウイルス関連新生物は、ホジキンリンパ腫、地方病性バーキットリンパ腫、鼻咽喉癌、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、子宮平滑筋肉腫、および肝細胞癌を含む。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチドワクチン」という用語は、原因因子、たとえばウイルスからの免疫原性ポリペプチドおよび、一般に、アジュバントを含有するワクチンを指す。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原を緩やかに放出する組織貯留所としておよびまた免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性化剤としての機能を果たすことができる（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，１９８４，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，ｐ．３８４）。しばしば、アジュバントなしでの、抗原単独による一次抗原投与では、体液性または細胞性免疫応答を惹起することができない。アジュバントは、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルまたは炭化水素エマルション、ならびにＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。好ましい合成アジュバントの一例はＱＳ−２１である。あるいは、または加えて、本明細書で述べるような免疫刺激タンパク質が、アジュバントとしてまたはワクチンに対する免疫応答を高めるために提供され得る。好ましくは、アジュバントは薬学的に受容可能である。
【００２４】
「ＤＮＡワクチン」という用語は、組換えベクターによって送達されるワクチンを指すために本明細書で使用される。本明細書で使用される代替的な、そしてより説明的な用語は、「ベクターワクチン」（レトロウイルスおよびレンチウイルスなどの一部の潜在的ベクターはＲＮＡウイルスであり、また一部の場合はＤＮＡではなく非ウイルスＲＮＡを細胞に送達することができるため）である。一般に、ベクターはインビボで投与されるが、樹状細胞のような適切な抗原提示細胞のエクスビボでの形質導入も、形質導入細胞のインビボでの投与を伴って、企図される。以下で述べるベクター系は、本発明の免疫原性ポリペプチドの発現のためのベクターの送達にとって理想的である。
【００２５】
本明細書で使用される「ヒトにおける発現のためのベクター」は、ベクターが、少なくとも、ヒト細胞において有効であるプロモーターを含むこと、および好ましくは、ベクターがヒトにおいて安全且つ有効であることを意味する。そのようなベクターは、たとえば、免疫を発現することに関与しない外来遺伝子を含まない。ベクターがウイルスベクターである場合は、複製および強固な感染の発症を可能にする領域を含まず、インビボでの複製能力の発現を回避するように遺伝子操作される。そのようなベクターは、好ましくはヒトにおける使用のために安全である；より好ましい実施形態では、ベクターは、臨床試験またはヒトにおける使用に関して政府の規制機関（食品医薬品局のような）によって承認されている。
【００２６】
「免疫原性ポリペプチド」という用語は、免疫原性であり、動物に投与された場合防御免疫応答を惹起するウイルスタンパク質またはその部分を指す。それゆえ、ウイルス免疫防御抗原は全長タンパク質である必要はない。防御免疫応答は一般に、ＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞レベルでの細胞性免疫を含む。
【００２７】
「免疫原性」という用語は、ポリペプチドが体液性または細胞性免疫応答、好ましくはその両方を惹起できることを意味する。免疫原性ポリペプチドはまた、抗原性である。分子は、それが免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができる場合、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸のエピトープを含む。本明細書ではエピトープとも称される、ポリペプチドの抗原性部分は、抗体もしくはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である部分であり得るか、または免疫のために抗原性部分を担体ポリペプチドに結合することによって分子に対する抗体を作製するために使用される部分であり得る。抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である必要はない、すなわち、担体なしで免疫応答を惹起できる必要はない。
【００２８】
「突然変異体」および「突然変異」という用語は、遺伝物質、たとえばＤＮＡの何らかの検出可能な変化、またはそのような変化の何らかの過程、機構もしくは結果を意味する。これは、遺伝子の構造（たとえばＤＮＡ配列）が変化する遺伝子突然変異、何らかの突然変異過程から生じる何らかの遺伝子またはＤＮＡ、および改変された遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現される発現産物（たとえばタンパク質）を包含する。「変異体」という用語も、改変されたまたは変化した遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞等、すなわちあらゆる種類の突然変異体を指示するために使用され得る。
【００２９】
「治療する」という用語は、対象において疾患の少なくとも１つの症状を軽減するまたは緩和することを意味するために本明細書で使用される。
【００３０】
本明細書で使用される「治癒する」または「治癒」という用語は、当技術分野で認められている基準に従ってウイルス感染に関連する疾患、障害または状態の症状を実質的に除去することを指す。本明細書で使用される「治癒された」という用語は、疾患、障害または状態に関連する症状が実質的に存在しない状態を指す。
【００３１】
本出願において使用される「対象」という用語は、鳥類および哺乳動物のような、免疫系を有する動物を意味する。哺乳動物は、イヌ、ネコ、げっ歯動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよび霊長動物を含む。鳥類は、家禽、鳴禽、猛禽等を含む。本発明は、それゆえ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、類人猿、サル、ニワトリ、シチメンチョウ、カナリア、ワシ、タカ、フクロウ、および特にヒトにおけるウイルス感染に関連する疾患、障害または状態を治療するために有用である。それゆえ、本発明は、獣医学において、たとえばペット動物、家畜、動物園の実験動物、および野生動物を治療するために使用できる。本発明は、ヒト医学適用のために特に望ましい。
【００３２】
「併用療法」という用語は、ウイルスに対するワクチンおよび免疫抑制性サイトカインに対するアンタゴニストの有効量の投与を含む、ウイルス感染、好ましくは慢性または持続性ウイルス感染、たとえばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ等を治療するための療法を指す。また、ＩＬ−１０とＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストの組み合わせも包含される。本発明の併用療法は、１またはそれ以上の抗ウイルス薬を含み得る。加えて、本発明の併用療法は、持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスへの起こり得る急性暴露後に、これまで感染していない個体において予防的手段として使用することができる。化合物のそのような予防的使用の例としては、母親から乳児へのウイルス伝播の予防および、たとえば作業者がウイルス含有血液製剤に暴露される医療環境における事故のような、伝播の可能性が存在する他の状況が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、本発明の併用療法は、これまでは感染していない個体であるが、高危険度個体での全身療法または局所殺菌薬として暴露の危険度が高い個体における予防的手段として使用できる。
【００３３】
本明細書で使用される「相乗作用」は、２つの治療実体を組み合わせた作用がそれらの個別での作用の総計よりも大きい現象である。
【００３４】
「相乗作用的」という用語は、何らかの２またはそれ以上の単一薬剤の相加作用よりも有効である組み合わせを指す。「相乗効果」は、ウイルス感染を治療するまたは予防するために単一療法において抗ウイルス薬のより低い量または用量を使用できることを指す。より低い用量は、典型的には効果の減少を伴わずに毒性の低下をもたらす。加えて、相乗効果は、効果を改善する、たとえば抗ウイルス活性を改善することができるか、または抗ウイルス薬に対する何らかのウイルス耐性を回避するまたは程度を低減することができる。ワクチンまたはその薬学的に受容可能な組成物と免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な組成物との間の相乗効果は、たとえば以下で述べるように、従来の抗ウイルスアッセイから決定することができる。アッセイの結果は、併用指数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）を得るためのＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの組み合わせ法（ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙ，（１９８４）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５）および“Ｄｏｓｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒｓ”ソフトウエア（ＣｈｏｕとＣｈｏｕ，１９８７，Ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ Ｍａｎｕａｌ．ｐ１９−６４．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して解析することができる。１未満の併用指数値は相乗作用を示し、１より大きい併用指数値は拮抗作用を指示し、１に等しい併用指数値は相加作用を示す。これらのアッセイの結果はまた、ＰｒｉｔｃｈａｒｄとＳｈｉｐｍａｎ（ＰｒｉｔｃｈａｒｄとＳｈｉｐｍａｎ（１９９０）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：１８１−２０６）の方法を使用して解析することもできる。
【００３５】
「抗ウイルス活性」という用語は、非感染細胞へのウイルス伝播の阻害、ウイルスの複製の阻害、ウイルスが宿主内に定着することの防止、またはウイルス感染によって引き起こされる疾患の症状を改善することもしくは緩和することを指す。これらの作用は、ウイルス負荷の低減または死亡率および／もしくは罹病率の低下によって証明することができ、それらのアッセイを以下で説明する。抗ウイルス物質または抗ウイルス薬は抗ウイルス活性を有し、単独でまたは多剤併用療法の一部として持続性または慢性ウイルス感染を治療するために有用である。
【００３６】
本明細書で使用されるまたは結合体化されていない形態の「インターロイキン−１０」すなわち「ＩＬ−１０」は、ホモ二量体を形成するように非共有結合的に連結された２つのサブユニットを含むタンパク質である。「ＩＬ−１０受容体１」、「ＩＬ−１０Ｒ」または「ＩＬ−１０Ｒ１」は、ＩＬ−１０に対する特異性を付与するＩＬ−１０受容体複合体の１つのサブユニットを指す。本明細書で使用される場合、特に指示のない限り、「インターロイキン−１０」、「ＩＬ−１０」およびＩＬ−１０Ｒは、ヒトもしくはマウスＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒを表し得る。ＩＬ−１０抗体は、たとえば米国特許第６，２３９，２６０号において説明されており；ヒト化抗ＩＬ−１０抗体は、たとえば米国特許公開公報第２００５／０１０１７７０号において説明されており；ＩＬ−１０Ｒポリペプチドは、たとえば米国特許第５，９８５，８２８号において説明されており；そしてＩＬ−１０Ｒ抗体は、たとえば米国特許第５，８６３，７９６号において説明されており、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
「ＰＤ−１」は、プログラム細胞死受容体１を指す。Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−４としても知られる「ＰＤ−Ｌ１」は、ＰＤ−１の結合パートナーの１つである。本明細書で使用される場合、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１はヒトまたはマウスタンパク質を指す。ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチド配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ２５８０７で提供され、そのマウスポリペプチド配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ３１８１０で提供される。ヒトＰＤ−１ポリペプチド配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００９で提供され、マウスＰＤ−１ポリペプチド配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ２０６０３で提供される。
【００３８】
本明細書で使用される「可溶性受容体」は、受容体タンパク質の細胞外ドメインである。
【００３９】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異種タンパク質をコードする少なくとも２つの異種遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現される雑種タンパク質である。たとえば、融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域と融合した、ＩＬ−１０Ｒ１ポリペプチドの少なくとも一部、たとえば細胞外ドメインを含み得る。
【００４０】
「ペグ化」または「ＰＥＧ」タンパク質は、結合が安定であるように、リンカーを介してＩＬ−１０タンパク質の１またはそれ以上のアミノ酸残基に共有結合的に連結された１またはそれ以上のポリエチレングリコール分子を有するタンパク質またはポリペプチドである。「モノペグ化」および「モノＰＥＧ」という用語は、１個のポリエチレングリコール分子が、リンカーを介して多量体タンパク質の１つのサブユニット上の１個のアミノ酸残基に共有結合的に連結されていることを意味する。ＰＥＧ部分の平均分子量は、好ましくは約５，０００〜約５０，０００ダルトンである。タンパク質またはポリペプチドへのＰＥＧ結合の方法または部位は重要ではないが、好ましくは、ペグ化は生物活性分子の活性を変化させないかまたはごくわずかだけ変化させる。好ましくは、半減期の上昇は生物活性の低下を上回る。たとえば、ペグ化ＩＬ−１０ＲまたはＰＥＧ−ＩＬ−１０Ｒは、少なくとも１つのＰＥＧ分子に共有結合的に連結されたＩＬ−１０Ｒの細胞外ドメインを含み得る。
【００４１】
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、およびリガンド特異的結合ドメインを保持するかまたは前記ドメインを含むように修飾されている限り、抗体フラグメントを包含する。本明細書における抗体は、対象とする「抗原」を標的する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原（腫瘍関連糖脂質抗原など；米国特許第５，０９１，１７８号参照）に対する抗体も企図される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（たとえば受容体）または増殖因子のようなリガンドであり得る。例示的な抗原としては、それらのポリペプチドが含まれる。
【００４２】
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の部分、一般にその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；一本鎖抗体分子；二重特異性抗体；直鎖状抗体；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち少量存在し得る天然に起こり得る突然変異を除き、集団を構成する個々の抗体が同一である集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位を標的する。さらに、典型的には種々の抗原決定基（エピトープ）を標的する種々の抗体を含有する従来の（ポリクローナル）抗体製剤と異なり、各々のモノクローナル抗体は抗原上の単一決定基を標的する。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の性質を示し、何らかの特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（たとえば米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、たとえばＣｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に述べられている手法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００４４】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定種に由来するまたは特定抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同であり、一方鎖の残りの部分は別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、それらが所望生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。
【００４５】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」という用語は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（すなわち軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４６】
非ヒト（たとえばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長動物などの非ヒト種（ドナー抗体）に由来する超可変領域残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体では認められない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改善するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、場合により免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６参照。１つの実施形態では、ヒト化ＩＬ−１０抗体は米国特許公開公報第２００５／０１０１７７０号に記載されているとおりである。
【００４７】
ＩＩ．概要
本発明は、ワクチンと免疫抑制性サイトカインに対するアンタゴニストの組み合わせで慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法を提供する。
【００４８】
免疫抑制環境が持続性ウイルス感染の間のワクチン接種に対するＴ細胞応答性にどのような影響を及ぼすかを測定するため、以下で述べるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをリンパ球脈絡髄膜炎ウイルスクローン１３（ＬＣＭＶ Ｃｌ １３）に感染させた。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３による感染は、抗ウイルス免疫を抑制し、ウイルスの持続を導くＩＬ−１０の高レベル発現を速やかに誘導する（たとえば、Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）前出；Ｅｊｍａｅｓら（２００６）前出；およびＡｈｍｅｄら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：５２１−５４０参照）。ＩＬ−１０が治療的ワクチン接種に対する応答性を阻害するかどうかを測定するため、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３持続性感染マウスを、１）アイソタイプ対照抗体単独で処置した；２）アイソタイプ対照抗体で処置し、ＬＣＭＶの全長糖タンパク質（ＧＰ）配列をコードするＤＮＡプラスミドでワクチン接種した；３）抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置した；または４）抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体プラスＤＮＡワクチン接種の組み合わせで処置した。抗体処置は、Ｃｌ １３感染後２５日目に開始し、３日ごとに５〜６回の処置を実施した。ＤＮＡワクチン接種は、ウイルス感染後２９日目と３４日目（すなわち抗ＩＬ−１０Ｒ治療の開始後４日目と９日目）に実施した。処置レジメンを図１ａに示す。
【００４９】
治療的ワクチン接種が持続性感染の間のＴ細胞応答を刺激できないことと一致して（たとえば、Ｗｈｅｒｒｙら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８９６０−８９６８参照）、ＤＮＡワクチン接種単独では、未処置動物と比較してウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度または数に影響を及ぼさなかった（図１ｂおよびｃ）。他方で、ＩＬ−１０Ｒ遮断は単独で、複数のＬＣＭＶエピトープに対するＩＦＮ−γ産生ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度と数を増加させ（図１ｂおよびｃ）、ＩＬ−１０が持続性感染の間を通じてＴ細胞活性を抑制することおよびＩＬ−１０活性の遮断単独でＴ細胞免疫をブーストできることを示した。重要な点として、ＤＮＡワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、ＤＮＡワクチンまたは抗ＩＬ−１０Ｒ治療単独と比較してＴ細胞応答を著しく増強した（図１ｃ）。抗ＩＬ−１０ＲプラスＤＮＡワクチンの２剤併用療法は、ＩＦＮ−γ産生ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度の２倍増加および細胞数の５倍以上の増加を誘導した。ＣＤ８ Ｔ細胞免疫の同様の増強がＭＨＣクラスＩ四量体染色によって認められた。ＩＬ−１０Ｒ遮断単独で、アイソタイプ処置と比較してＬＣＭＶ核タンパク質（ＮＰ）３９５〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を増加させたが、ＤＮＡワクチン（ＬＣＭＶ−ＧＰエピトープだけを含み、ＬＣＭＶ−ＮＰエピトープを含まない）プラス抗ＩＬ−１０Ｒ治療は、ＬＣＭＶ−ＮＰ３９５〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を増強せず、Ｔ細胞刺激がＤＮＡワクチンによるものであり、免疫活性化上昇の二次作用に起因するのではないことを明らかにした（図１ｃ）。ＬＣＭＶ−ＧＰをコードしない親対照ＤＮＡプラスミドによるワクチン接種は、ＩＬ−１０Ｒ遮断と組み合わせた場合もＴ細胞応答をさらに増強することはできず、Ｔ細胞活性の上昇が外来ＤＮＡの導入から生じたのではないことを示した。
【００５０】
ＩＬ−１０Ｒ遮断とそれに続くワクチン接種は、機能性ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を有意に増加させた（図１ｄ）。ワクチン接種単独ではウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞機能を増強せず、ＩＬ−１０Ｒ遮断は単独でＴＮＦ−α産生ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を約２倍だけ増加させたが、ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、ＴＮＦ−αを産生する機能性ＣＤ８ Ｔ細胞数の４倍増加を刺激した（図１ｄ）。前記処置は、ＴＮＦ−α産生ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を実質的に増加させなかった。むしろ、機能性のサイトカイン産生ＣＤ８ Ｔ細胞の絶対数の増加だけが認められた（図１ｄ）。
【００５１】
ＩＬ−１０Ｒ遮断単独では、ＣＤ８ Ｔ細胞に関して認められたほど著明ではないＣＤ４ Ｔ細胞への作用を及ぼし、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４ Ｔ細胞数の小さいが有意の（ｐ＜０．０５）１．５〜２倍増加を誘導した（図２ａおよびｂ）。他方で、ＩＬ−１０Ｒ遮断プラスＤＮＡワクチン療法は、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度および特に数（アイソタイプ処置と比較して６倍の増加）を有意に増加させた（図２ａおよびｂ）。ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数の同様の増加が、ＭＨＣクラスＩＩ四量体を使用して認められた（データは示していない）。さらに、ＤＮＡワクチンまたは抗ＩＬ−１０Ｒ治療のいずれか単独では、ＩＬ−２産生ＣＤ４ Ｔ細胞の数に控えめな影響を及ぼしたが、併用治療はこれらの機能性細胞の数の４倍増加を刺激した（図２ｂ）。これらのデータは、その他の点では無効のワクチン接種が、ＩＬ−１０媒介性免疫抑制が中和された場合、持続性ウイルス感染において強固なＴ細胞応答を刺激し得ることを明らかにする。
【００５２】
Ｔ細胞機能上昇が、それまで枯渇していたＴ細胞の再活性化によるのかまたはナイーブＴ細胞前駆体の新たなプライミングからであるのかを調べるため、Ｔｈｙ１．１＋Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）トランスジェニック（ｔｇ）ＣＤ４ Ｔ細胞（ＳＭＡＲＴＡ細胞；ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０ペプチドに特異的）およびＴｈｙ１．１＋ ＴｃＲトランスジェニックＣＤ８ Ｔ細胞（Ｐ１４細胞；ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１ペプチドに特異的）をＴｈｙ１．２＋ Ｃ５７ＢＬ／８マウスに共移入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）し、その後マウスをＬＣＭＶ−Ｃｌ １３に感染させた。共移入は、感染の初期から存在し、Ｔｈｙ１．１対Ｔｈｙ１．２発現に基づいて内因性（すなわち宿主由来）抗ウイルスＴ細胞から区別することができる、ＬＣＭＶ特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の分析を可能にした。それらが内因性ＣＤ４（図２）およびＣＤ８（図１）Ｔ細胞対応物に対しても同様に応答することを確実にするため、これらのｔｇ Ｔ細胞の生理的な数を移入した（たとえば、Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６：１６７５−１６８５参照）。
【００５３】
内因性Ｔ細胞応答（図１および２）と同様に、ＤＮＡワクチン単独はウイルス特異的ｔｇ ＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞の数を増加させなかったが、ＩＬ−１０Ｒ遮断はｔｇ ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の数のそれぞれ２倍および４倍増加を刺激した（図３）。ＤＮＡワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、アイソタイプ対照またはＤＮＡワクチン単独で処置したマウスと比較してｔｇウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の劇的な６倍増加を誘導し、ＩＬ−１０Ｒ遮断単独と比較した場合は〜３倍増加を誘導した（図３ａ）。
【００５４】
同様に、ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、アイソタイプ対照またはワクチン単独と比較してウイルス特異的ｔｇ ＣＤ４ Ｔ細胞の数の１１倍増加、およびＩＬ−１０Ｒ遮断治療単独と比較して４倍増加を刺激した（図３ｂ）。それらの内因性対応物と同じように、併用療法は機能性ウイルス特異的Ｔ細胞（すなわちＴＮＦ−α産生ｔｇ ＣＤ８ Ｔ細胞およびＩＬ−２産生ｔｇ ＣＤ４ Ｔ細胞）の数も増加させた。それゆえ、ＩＬ−１０Ｒ遮断は、それまで枯渇していたＴ細胞がワクチン接種に応答することを可能にする。
【００５５】
ＩＬ−１０Ｒ遮断およびワクチン接種後の機能性ウイルス特異的Ｔ細胞の数の増加が感染の制御を増強したかどうかを測定するため、処置後（すなわち感染後および、それゆえ、３回の抗ＩＬ−１０Ｒ抗体処置後および／または単回ＤＮＡワクチン接種後３３日目）にウイルス力価を定量し、治療前レベルと比較した。Ｔ細胞応答を刺激できなかったことと一致して、ＤＮＡワクチン接種単独はウイルス複製の制御に影響を及ぼさなかった（図４ａ）。これに対し、ＩＬ−１０Ｒ遮断はウイルス力価の１５分の１の低下を誘導した（図４ａ）。
【００５６】
ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、ウイルス力価の２４分の１の低下を誘導し、併用療法から生じるＴ細胞応答の増強がＩＬ−１０Ｒ遮断単独よりも良好なウイルス複製抑制能力を備えることを示した。共処置後のウイルス除去の促進がわずかに１回のＤＮＡワクチン接種後に認められたことに留意すべきであり、免疫抑制シグナルが中和された場合Ｔ細胞が速やかに応答性になることを示唆した。処置後、ウイルス力価は感染後４０日間を通じてアイソタイプおよびＤＮＡワクチン接種マウスにおけるのと同様であったが、ウイルス複製は抗ＩＬ−１０Ｒ処置マウスにおいて有意に低下し（ｐ＜０．０５）、治療の開始から終了までに１７分の１に低下した（図４ｂ）。重要な点として、抗ＩＬ−１０ＲおよびＤＮＡワクチン共処置マウスにおけるウイルス複製の初期制御促進は、持続性ウイルス感染を制御し、除去する能力の増強をもたらし、最終的には治療の終了後ウイルス複製の４９分の１の低下を生じさせた（図４ｂ）。
【００５７】
ＩＬ−１０Ｒ遮断単独またはＤＮＡワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断後にウイルス感染を除去する一部の動物の能力には相違があった（図４ｂ）。一部の動物は治療後完全にウイルス感染を除去したが、別の同様に処置した動物はまだウイルス複製を保持していた。図４ｂは多数の実験からの統合データを示すことおよび治療前ウイルス力価が実験によって異なっていたことに留意すべきである。しかし、一般により高い治療前ウイルス力価を有する動物は治療後のより高いレベルのウイルス複製に対応し、結果は実験内で有意であった。治療後のウイルス除去の反応速度の相違は、マウスの性別または年齢によるものではなかった。重要な点として、ウイルス複製はＩＬ−１０Ｒ遮断後不在のままであり（感染後＞１５０日間）、処置マウスはその後の再感染から保護された（データは示していない）。興味深いことに、３日ごとの抗ＩＬ−１０Ｒ抗体処置は、持続性ウイルス感染の制御を導くＴ細胞応答をブーストしたが、週に１回の処置は、所要用量の２倍の抗体による処置を含めて、無効であった。それゆえ、抗体治療の時期は治療効果のための重要な決定因子である。対照ＤＮＡワクチン（すなわちＬＣＭＶ ＧＰをコードしない）と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、抗ＩＬ−１０Ｒ処置単独と比較してウイルス力価に影響を及ぼさず、やはりＤＮＡワクチンの作用増強はＬＣＭＶ特異的細胞の刺激に起因することを明らかにした。それゆえ、ＩＬ−１０媒介性免疫抑制を中和することは、持続性ウイルス感染を制御する高い能力を備えた強固なウイルス特異的Ｔ細胞応答の誘導を促進する。
【００５８】
ウイルス媒介性免疫抑制経路に拮抗する併用療法は、抗ウイルスＴ細胞活性の回復とブースティング、ならびに単剤と比較した場合の相乗作用を示した。１つのそのような併用療法は、前述したＬＣＭＶマウスにおいて持続性ウイルス感染を除去するための、ＩＬ−１０Ｒに対する抗体とＰＤ−Ｌ１に対する抗体の使用であった。マウスモデルにおけるＰＤ−Ｌ１およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の投与は、それまで枯渇していたウイルス特異的Ｔ細胞のレベルを上昇させ（図５ａ参照）、ＩＮＦ−γ／ＴＮＦ−α産生細胞のレベルも上昇させた（図５ｂ参照）。
【００５９】
また、ＩＬ−１０Ｒ／ＰＤ−Ｌ１の二重遮断も、持続性ウイルス複製を制御する能力の増強を導くと判定された。ＩＬ−１０およびＰＤ−Ｌ１抗体を単独でまたは組み合わせて投与する２週間の治療レジメン後、併用療法を受けたマウスは、単剤治療および対照動物と比較してウイルス除去の有意の上昇を示した（たとえば図６ａ参照）。ウイルス力価も、アイソタイプ対照処置動物と比較して抗体処置動物の肝臓において低下した（図６ｂ参照）。ＩＬ−１０とＰＤ−Ｌ１の拮抗作用の組み合わせは、各々の処置単独よりも有効に、枯渇したＣＤ８＋ Ｔ細胞の回復を誘導すると思われる（たとえば図７参照）。
【００６０】
ＩＩＩ．発現ベクター
多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせ（すなわち発現系）が、本発明の免疫原性ポリペプチドを発現するときに使用され得る。有用な発現ベクターは、たとえば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントで構成され得る。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体および公知の細菌プラスミド、たとえば大腸菌プラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ＳＶ４０およびｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０，１９８８）、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；Ｓｔｒｅｐ．ｇａｒｄｏｎｉｉのようなグラム陽性ベクター；ファージＤＮＡＳ、たとえばファージｌの数多くの誘導体、たとえばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；２ｍプラスミドまたはその誘導体のような酵母プラスミド；昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターのような、真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するように改変されたプラスミドのような、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター等が含まれる。
【００６１】
タンパク質またはポリペプチドの発現は、当技術分野で公知の何らかのプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得るが、これらの調節エレメントは発現のために選択される宿主において機能性でなければならない。遺伝子発現を制御するために使用し得るプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）；“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ” ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４，１９８０も参照のこと；Ｇａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の真菌からのプロモーターエレメント；およびリンパ系細胞において活性である、造血組織特異性を示す制御領域、特に免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら（１９８４）Ｃｅｌｌ ３８：６４７；Ａｄａｍｅｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６）；骨髄系細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；造血幹細胞分化因子プロモーター；エリスロポエチン受容体プロモーター（Ｍａｏｕｃｈｅら（１９９１）Ｂｌｏｏｄ １５：２５５７）等；ならびに粘膜上皮細胞特異性を示す制御領域を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
好ましいベクター、特にインビトロでの細胞アッセイおよびインビボまたはエクスビボでのワクチン接種のための好ましいベクターは、ウイルスベクター、たとえばレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、鶏痘ウイルス、ＡＶポックスウイルス、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスおよび望ましい細胞向性を有する他の組換えウイルスである。特定の実施形態では、ワクシニアウイルスベクターが樹状細胞を感染させるために使用される。もう１つの特定の実施形態では、ＥＢＮＡ−１を発現するバキュロウイルスベクターが作製される。それゆえ、免疫原性ポリペプチドをコードするベクターは、ウイルスベクターを使用してまたはＤＮＡの直接導入を通して、インビボ、エクスビボまたはインビトロで導入することができる。標的組織における発現は、ウイルスベクターもしくは受容体リガンドのような、トランスジェニックベクターを特定細胞に標的することによって、または組織特異的プロモーターを使用することによって、またはその両方によって実施され得る。標的化遺伝子送達は、１９９５年１０月公開の国際特許公報第ＷＯ９５／２８４９４号に記載されている。
【００６３】
インビボまたはエクスビボでのターゲティングおよびワクチン接種手順のために一般的に使用されるウイルスベクターは、ＤＮＡに基づくベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、使用するための方法は当技術分野において公知である（たとえば、ＭｉｌｌｅｒとＲｏｓｍａｎ（１９９２）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０参照）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損性である、すなわちそれらは標的細胞において自律複製することができない。好ましくは、複製欠損ウイルスは最小ウイルスである、すなわちゲノムをキャプシド形成してウイルス粒子を生成するために必要なそのゲノムの配列だけを保持する。
【００６４】
ＤＮＡウイルスベクターは、たとえば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス等のような、しかしこれらに限定されない、弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスを含む。特定ベクターの例としては、欠損ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０；１９９４年９月２９日公開の国際特許公報第ＷＯ９４／２１８０７号；１９９４年４月２日公開の国際特許公報第ＷＯ９２／０５２６３号）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０によって述べられたベクターのような（Ｌａ Ｓａｌｌｅら（１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０も参照のこと）、弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ関連ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
様々な会社が商業的にウイルスベクターを生産しており、Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ，Ｐａ．；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶおよびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；レンチウイルスベクター）、ならびにＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ；アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
アデノウイルスベクター。アデノウイルスは、本発明の核酸を様々な細胞型に効率的に送達するように改変され得る真核生物ＤＮＡウイルスである。様々な血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型のうちで、本発明の範囲内では、２型もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（国際特許公報第ＷＯ９４／２６９１４号参照）を使用することが好ましい。本発明の範囲内で使用できる動物起源のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、マウス（例：Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５（１）：８１−９０）、ヒツジ、ブタ、鳥類およびサル（例：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスを含む。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（たとえばＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００））である。様々な複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記述されている（国際特許公報第ＷＯ９４／２６９１４号、同第ＷＯ９５／０２６９７号、同第ＷＯ９４／２８９３８号、同第ＷＯ９４／２８１５２号、同第ＷＯ９４／１２６４９号、同第ＷＯ９５／０２６９７号、同第ＷＯ９６／２２３７８号）。本発明による複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の何らかの手法によって作製できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら（１９９１）Ｇｅｎｅ １０１：１９５；欧州特許第ＥＰ １８５ ５７３号；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７；Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）。組換えアデノウイルスはヒト樹状細胞のための効率的で非撹乱性のベクターである（Ｚｈｏｎｇら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：９６４−７２；ＤｉＮｉｃｏｌａら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｍ Ｔｈｅｒ．５：３５０−６，１９９８）。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の標準分子生物学手法を用いて回収され、精製される。
【００６７】
アデノ関連ウイルス。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、それらが感染する細胞のゲノム内に安定且つ部位特異的に組み込まれ得る、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の増殖、形態または分化へのいかなる作用も誘導することなく広いスペクトルの細胞に感染することができ、ヒトの病理に関与しないと思われる。ＡＡＶゲノムはクローン化され、配列決定され、特徴づけられている。遺伝子をインビトロおよびインビボで移入するためのＡＡＶに由来するベクターの使用が記述されている（国際特許公報第ＷＯ９１／１８０８８号；国際特許公報第ＷＯ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、欧州特許第ＥＰ ４８８ ５２８号参照）。本発明による複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域に隣接された対象とする核酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を担持するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（たとえばアデノウイルス）に感染している細胞系に同時トランスフェクトすることによって作製できる。作製されたＡＡＶ組換え体は、その後、標準的な手法によって精製される。これらのウイルスベクターも、ヒト樹状細胞への遺伝子導入のために有効である（ＤｉＮｉｃｏｌａら、前出）。
【００６８】
レトロウイルス。もう１つの実施形態では、遺伝子を、たとえばＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５，１２４，２６３号；欧州特許第ＥＰ ４５３２４２号、同第ＥＰ １７８２２０号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによる、１９９５年３月１６日公開の国際特許公報第ＷＯ９５／０７３５８号；およびＫｕｏら（１９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：８４５に記載されているように、レトロウイルスベクターに導入することができる。レトロウイルスは分裂細胞に感染する組込み型ウイルスである。レトロウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、キャプシド形成配列および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は一般に全体的または部分的に欠失しており、対象とする異種核酸配列で置換されている。これらのベクターは、種々のタイプのレトロウイルスから、たとえばＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフレンドウイルスから構築できる。適切なパッケージング細胞系は先行技術において記述されており、特にＰＡ３１７細胞系（米国特許第４，８６１，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系（国際特許公報第ＷＯ９０／０２８０６号）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系（国際特許公報第ＷＯ８９／０７１５０号）が挙げられる。加えて、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の修飾ならびにｇａｇ遺伝子の一部を含み得る広範囲のキャプシド形成配列を含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１６３９）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準的な手法によって精製される。
【００６９】
レトロウイルスベクターはまた、１サイクルのレトロウイルス複製を許容し、トランスフェクション効率を増強する、ＤＮＡウイルスによっても導入され得る（国際特許公報第ＷＯ９５／２２６１７号、同第ＷＯ９５／２６４１１号、同第ＷＯ９６／３９０３６号、同第ＷＯ９７／１９１８２号参照）。
【００７０】
レンチウイルスベクター。もう１つの実施形態では、レンチウイルスベクターが、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含むいくつかの組織型における導入遺伝子の直接送達および持続的発現のための作用因子として使用できる。このベクターは、分裂および非分裂細胞をこれらの組織に効率よく形質導入し、対象とする遺伝子の長期的な発現を維持することができる。総説については、Ｎａｌｄｉｎｉ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４５７−６３参照；また、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−８０も参照のこと。レンチウイルスパッケージング細胞株が使用可能であり、一般に当技術分野で公知である。それらは、遺伝子治療のための高力価レンチウイルスベクターの生産を促進する。一例は、１０６ＩＵ／ｍｌ以上の力価で少なくとも３〜４日間ウイルス粒子を生成することができるテトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇ偽型化レンチウイルスパッケージング細胞株である（Ｋａｆｒｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５７６−５８４）。誘導性細胞株によって生産されるベクターは、インビトロおよびインビボで非分裂細胞を効率的に形質導入するために必要に応じて濃縮できる。
【００７１】
ワクシニアウイルスベクター。ワクシニアウイルスはポックスウイルスファミリーの成員であり、その大きなサイズと複雑さによって特徴づけられる。ワクシニアウイルスＤＮＡは二本鎖であり、ＤＮＡの変性時に一本鎖の環が形成されるように末端で架橋されている。このウイルスは、痘瘡に対するワクチン中で約２００年間使用されており、ワクチンにおいて使用した場合のウイルスの性質は公知である（Ｐａｏｌｅｔｔｉ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１１３４９−５３；およびＥｌｌｎｅｒ（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２６：２６３−９）。ワクシニアウイルスによるワクチン接種の危険度は周知で、明確に定義されており、このウイルスは比較的良性とみなされる。ワクシニアウイルスベクターは、外来遺伝子の挿入と発現のために使用できる。外来遺伝子をワクシニアベクターに挿入し、ワクシニアウイルスの合成組換え体を作製する基本的な手法が記述されている（米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７６９，３３０号および同第５，３６４，７７３号参照）。多数の外来（すなわち非ワクシニア）遺伝子がワクシニアにおいて発現されており、しばしば防御免疫を生じさせる（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ、ＢａｒｒｅｔｔおよびＫａｉ（１９９８）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１７：６４１−５３により総説されている；Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９９７）Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５９：３１１−２２；ならびにＯｓｔｅｒｈａｕｓら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１４７９−８１：およびＧｈｅｒａｒｄｉら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６７２４−３３参照）。ワクシニアウイルスは免疫不全または免疫抑制個体への投与には不適切であると考えられる。本発明において使用し得る選択的なポックスウイルスは、鶏痘ウイルス、ＡＶポックスウイルスおよび改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスを含む。
【００７２】
非ウイルスベクター。もう１つの実施形態では、ベクターは、リポフェクションによって、裸のＤＮＡとして、または他のトランスフェクション促進物質（ペプチド、ポリマー等）を用いてインビボで導入することができる。合成カチオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクション用のリポソームを作製するために使用できる（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７；ＦｅｌｇｎｅｒとＲｉｎｇｏｌｄ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８；Ｍａｃｋｅｙら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１；Ｕｌｍｅｒら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８参照）。核酸の移入のための有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公報第ＷＯ９５／１８８６３号および同第ＷＯ９６／１７８２３号、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。脂質は、ターゲティングのために他の分子に化学的に結合し得る（Ｍａｃｋｅｙら、前出参照）。標的ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合し得る。
【００７３】
他の分子、たとえばカチオン性オリゴペプチド（たとえば国際特許公報第ＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド（たとえば国際特許公報第ＷＯ９６／２５５０８号）、またはカチオン性ポリマー（たとえば国際特許公報第ＷＯ９５／２１９３１号）も、インビボで核酸のトランスフェクションを促進するために有用である。
【００７４】
あるいは、遺伝子治療のための非ウイルスＤＮＡベクターは、当技術分野で公知の方法、たとえば電気穿孔法、微量注入法、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用（パーティクルガントランスフェクション；たとえば、米国特許第５，２０４，２５３号、同第５，８５３，６６３号、同第５，８８５，７９５号および同第５，７０２，３８４参照、ならびにＳａｎｆｏｒｄ，ＴＩＢ−ＴＥＣＨ，６：２９９−３０２，１９８８；Ｆｙｎａｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１４７８−１１４８２；およびＹａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１５６８−９５７２参照）、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用（たとえば、Ｗｕら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕとＷｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０参照）。受容体を介したＤＮＡ送達アプローチも使用できる（Ｃｕｒｉｅｌら（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４；ＷｕとＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）。米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号は、哺乳動物における、トランスフェクション促進剤を使用しない外来ＤＮＡ配列の送達を開示する。最近、エレクトロトランスファーと称される、比較的低電圧で高い効率のインビボＤＮＡ導入手法が記述された（Ｍｉｒら（１９９８）Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３２１：８９３；国際特許公報第ＷＯ９９／０１１５７号；同第ＷＯ９９／０１１５８号；同第ＷＯ９９／０１１７５号）。
【００７５】
ＩＶ．ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒアンタゴニスト
ＩＬ−１０のアンタゴニストは、標準的なワクチン療法と共に投与される。本明細書で使用されるＩＬ−１０のアンタゴニストは、中和抗体またはそのフラグメント、ＩＬ−１０アンチセンスＤＮＡ、ＩＬ−１０Ｒ可溶性受容体および／または受容体融合タンパク質（たとえばＦｃ融合タンパク質）、ＩＬ−１０Ｒに結合するが、受容体複合体のシグナル伝達を生じさせないＩＬ−１０突然変異体タンパク質を包含する。１つの特定の実施形態では、ＩＬ−１０Ｒ融合タンパク質が企図される。
【００７６】
Ｖ．抗体
本発明により精製される好ましいタンパク質は抗体である。本明細書における抗体は、対象とする抗原を標的する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の利益をもたらし得る。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（たとえばサイトカイン受容体）または増殖因子もしくはサイトカインのようなリガンドであり得る。
【００７７】
本明細書における抗体は、対象とする抗原、たとえばヒトＩＬ−１０Ｒを標的する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原（腫瘍関連糖脂質抗原など；米国特許第５，０９１，１７８号参照）に対する抗体も企図される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（たとえばサイトカイン受容体）または増殖因子もしくはサイトカインのようなリガンドであり得る。
【００７８】
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの多回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物において惹起される。二官能性試薬または誘導体化剤、たとえばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲとＲ１は異なるアルキル基である］を使用して、抗原を、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビターに結合することは有用であり得る。
【００７９】
たとえば、タンパク質または結合体１００μｇまたは５μｇ（それぞれウサギまたはマウスに関して）を３容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、その溶液を多数の部位に皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、フロイント完全アジュバント中の最初の量の１／５〜１／１０の抗原または結合体を多数の部位に皮下注射することにより、動物をブーストする。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価に関して検定する。力価が横ばい状態に達するまで動物をブーストする。好ましくは、同じ抗原の結合体であるが、異なるタンパク質に結合したおよび／または異なる架橋試薬を介して結合した結合体で動物をブーストする。結合体はまた、組換え細胞培養中でタンパク質融合物として作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤も免疫応答を増強するために適切に使用される。
【００８０】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５によって最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して作製し得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製し得る。
【００８１】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、たとえばハムスターもしくはマカクザルなどを本明細書中で前述したように免疫し、免疫のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次に、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００８２】
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含有する適切な培地に接種し、増殖させる。たとえば、親骨髄腫細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する（ＨＡＴ培地）。
【００８３】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系統、たとえばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡより入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびにｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡより入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【００８４】
ハイブリドーマ細胞が増殖中である培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関して検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によってまたは放射免疫検定法（ＲＩＡ）もしくは固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって測定される。
【００８５】
所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。このための適切な培地としては、たとえばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
【００８６】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、たとえば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地、腹水または血清から適切に分離される。好ましくは、本明細書で述べるプロテインＡクロマトグラフィー手順が使用される。
【００８７】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ひとたび単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに組み込むことができ、次にそれを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得ることができる。
【００８８】
ＤＮＡはまた、たとえば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１）、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結することによって修飾し得る。
【００８９】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドで抗体の定常ドメインを置換するか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインをそれらで置換して、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製する。
【００９０】
さらなる実施形態では、モノクローナル抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４に記載されている手法を使用して生成される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７は、それぞれファージライブラリーを使用したマウスおよびヒト抗体の単離を述べている。その後の公表文献は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６）を述べている。ゆえに、これらの手法は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なハイブリドーマ手法に対する実施可能な代替法である。
【００９１】
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称され、典型的には「輸入」可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は、基本的には、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって実施できる。従って、そのような「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応する配列によって置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際に、ヒト化抗体は、典型的には一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のＦＲ残基がげっ歯動物抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００９２】
ヒト化抗体を作製するときに使用される、軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯動物のものに最も近いヒト配列をヒト化抗体のためのヒトＦＲとして受け入れる（Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６）。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖の特定サブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定フレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体のために使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３）。
【００９３】
抗体が、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化されることはさらに重要である。この目標を達成するため、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列および様々な概念的ヒト化生成物を分析する工程によって作製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を描画し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する高い親和性のような所望抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列および輸入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は抗体結合への影響に直接且つ最も実質的に関与する。
【００９４】
あるいは、今や、免疫したとき、内因性免疫グロブリン産生を伴わずにヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（たとえばマウス）を作製することが可能である。たとえば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じさせることが記述されている。そのような生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原誘発したときヒト抗体の産生をもたらす。たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ．３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら（１９９３）Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３；およびＤｕｃｈｏｓａｌら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８参照。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７；Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９）。
【００９５】
抗体フラグメントの作製のために様々な手法が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは無傷抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（たとえば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１参照）。しかし、これらのフラグメントは、今や、組換え宿主細胞によって直接生成され得る。たとえば、抗体フラグメントは、前記で論じた抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収し、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７）。もう１つのアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの作製のための他の手法は当業者に明白である。他の実施形態では、選択抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。国際特許公報第ＷＯ９３／１６１８５号参照。
【００９６】
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。そのような分子は通常２つの抗原とだけ結合するが（すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合この表現に包含される。
【００９７】
二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野において公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な作製は、２本の鎖が異なる特異性を有する、２本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ．３０５：５３７−５３９）。免疫グロブリン重鎖と軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、そのうち１つだけが正しい二重特異性構造を有する。通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって実施される正しい分子の精製はかなり面倒であり、生成物の収率は低い。同様の手順が、国際特許公報第ＷＯ９３／０８８２９号およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９に開示されている。
【００９８】
国際特許公報第ＷＯ９６／２７０１１号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子の対の間の境界（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように操作することができる。好ましい境界は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の境界からの１またはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（たとえばチロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（たとえばアラニンまたはトレオニン）で置換することにより、大きな側鎖と同一または類似のサイズの代償的な「キャビティー（ｃａｖｉｔｉｅｓ）」が第２抗体分子の境界上に形成される。これにより、ホモ二量体のような他の望ましくない最終生成物に比べてヘテロ二量体の収率を高めるための機構が提供される。
【００９９】
二重特異性抗体としては、架橋抗体または「ヘテロ結合体」抗体が含まれる。たとえば、ヘテロ結合体中の抗体の１つはアビジンに結合し、他方はビオチンに結合することができる。そのような抗体は、たとえば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的するため（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の治療のために（国際特許公報第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／２００３７３号および欧州特許第ＥＰ ０３０８９号）提案された。ヘテロ結合体抗体は、何らかの従来の架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号において多くの架橋手法と共に開示されている。
【０１００】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製するための手法も文献に記載されている。たとえば、二重特異性抗体は化学結合を用いて作製できる。Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１は、無傷抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を述べている。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、生成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用できる。
【０１０１】
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収が容易になり、それらのフラグメントを化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製を述べている。各々のＦａｂ’フラグメントを大腸菌から別々に分泌させ、二重特異性抗体を形成するためにインビトロで直接化学結合に供した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１０２】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製し、単離するための様々な手法も記述されている。たとえば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が作製された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。この抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次に再酸化して、抗体のヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の作製のためにも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８によって述べられた「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための選択的な機構を提供した。前記フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間での対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインとＶＬドメインは別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合することを強いられ、それにより２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の方策も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８参照。あるいは、抗体は、Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２に記載されているような「直鎖状抗体」であり得る。簡単に述べると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対の縦列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。米国特許公開公報第ＵＳ２００７／００７１６７５号に記載されている、二重可変ドメイン抗体（Ｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）も企図される。
【０１０３】
１つの実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、たとえば、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第ＵＳ２００５／０１０１７７０号および同第ＵＳ２００７／０１７８０９７号に記載されているヒト化抗ＩＬ−１０抗体である。
【０１０４】
ＶＩ．ワクチン接種および免疫治療方法
慢性または持続性ウイルス感染に対して対象をワクチン接種するために様々な方法が使用できる。ポリペプチドワクチン製剤は、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、真皮下（ｓ．ｄ．）、皮内（ｉ．ｄ．）経路によって、またはエクスビボでの抗原提示細胞への投与とそれに続く対象への前記細胞の投与によって送達することができる。対象への投与の前に、抗原提示細胞を誘導して成熟させてもよい。
【０１０５】
同様に、たとえば遺伝子銃または直接注入による、裸のＤＮＡおよびＲＮＡ送達のような、前述した遺伝子送達方法のいずれもがベクターワクチンを対象に投与するために使用できる。
【０１０６】
ワクチン接種の有効性は、免疫刺激分子、たとえば免疫刺激性、免疫増強性もしくはプロ炎症性サイトカイン、リンホカインまたはケモカインをワクチンと共に、特にベクターワクチンと共に同時投与することによって増強され得る（ＳａｌｇａｌｌｅｒとＬｏｄｇｅ（１９９８）Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６８：１２２）。たとえば、サイトカインまたはサイトカイン遺伝子、たとえばインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド（Ｌｙｍａｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５：１９２）、ならびにいくつかの鍵となる共刺激分子またはそれらの遺伝子（たとえばＢ７．１、Ｂ７．２）が使用できる。これらの免疫刺激分子は、タンパク質として全身的または局所的に送達され得るか、または分子の発現をコードするベクターの発現によって送達され得る。あるいは、本明細書で述べるように、ワクチンは、免疫抑制分子、たとえばＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒのアンタゴニストと共に投与することができる。免疫原性ポリペプチドの送達に関して前述した手法が免疫刺激分子についても使用できる。
【０１０７】
ワクチン接種および特に免疫療法は、樹状細胞のターゲティングを通して達成され得る（Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２８：５３１；Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９；Ｔａｉｔｅら（１９９９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：６５３；Ａｖｉｇａｎ（１９９９）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１３：５１；ＤｉＮｉｃｏｌａら（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：２６５）。樹状細胞はＴ細胞依存性免疫の活性化において決定的な役割を果たす。増殖中の樹状細胞は、免疫原性形態のタンパク質抗原をインサイチューで捕捉し、次に、Ｔ細胞によって認識され得る形態でこれらの抗原を提示して、Ｔ細胞を刺激するために使用できる（たとえば、Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６）Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９−８６２；Ｉｎａｂａら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２１６３−７３および米国特許第５，８５１，７５６号参照）。エクスビボでの刺激のためには、樹状細胞を培養皿に塗布し、抗原が樹状細胞に結合するのに十分な量で十分な期間、抗原に暴露する（抗原でパルスする）。加えて、樹状細胞を、Ｚｈｏｎｇら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：９６４−７２；Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：７００−７；Ｄｉｅｂｏｌｄら（１９９９ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：７７５−８６；ＦｒａｎｃｏｔｔｅとＵｒｂａｉｎ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８１４９および米国特許第５，８９１，４３２号（Ｃａｓａｒｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１４８１−６）によって述べられたように様々な物理的または化学的手段を使用してＤＮＡでトランスフェクトし得る。パルスした細胞を、次に、たとえば静脈内注射によって、治療を受けている対象に移植することができる。好ましくは、自己樹状細胞、すなわち治療を受けている対象から得た樹状細胞を使用するが、タイプ適合性ドナーからまたは所望ＭＨＣ分子を発現する（および好ましくは望ましくないＭＨＣ分子の発現を抑制する）ように樹状細胞を遺伝子操作することによって入手し得る、ＭＨＣクラスＩＩ適合性樹状細胞を使用することも可能であり得る。
【０１０８】
好ましくは、樹状細胞は、慢性または持続性感染を引き起こすウイルスに関連するウイルスペプチドの発現のためにインビボで特異的に標的される。抗原提示を媒介する受容体、たとえばＤＥＣ−２０５（Ｓｗｉｇｇａｒｄら（１９９５）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：３０２−１１；Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９）およびＦｃ受容体を利用することにより、インビボで樹状細胞を標的するために様々な方策が使用可能である。前記で論じた標的ウイルスベクターも使用できる。加えて、樹状細胞は、ウイルスベクターによる感染後、インビボでの移植の前に、インビトロで誘導して成熟させてもよい。
【０１０９】
粘膜ワクチンストラテジは、感染がしばしば粘膜を介して起こるので、多くの病原性ウイルスに対して特に有効である。加えて、組換えワクシニアウイルスワクチンの粘膜送達は、以前の痘瘡ワクチン接種によるポックスウイルスに対する既存免疫を克服できると考えられる（Ｂｅｌｙａｋｏｖら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４５１２−７）。粘膜は、ＥＢＮＡ−１ワクチンおよび免疫療法にとっての重要な標的である樹状細胞を保有する。それゆえ、ポリペプチドおよびＤＮＡワクチンの両方について粘膜ワクチン接種法が企図される。粘膜はワクチンの局所送達によって標的され得るが、様々な方策が免疫原性タンパク質を粘膜に送達するために使用されてきた（これらの方策には、たとえば、タンパク質を標的するベクターとして特異的粘膜標的タンパク質を使用することによる、または粘膜標的タンパク質と混合してワクチンベクターを送達することによる、ＤＮＡワクチンの送達も含まれる）。
【０１１０】
たとえば、特定の実施形態では、免疫原性ポリペプチドまたはベクターワクチンは、コレラ毒素Ｂおよび／もしくはコレラ毒素Ａ／Ｂキメラのようなコレラ毒素と混合して、またはコレラ毒素との結合体もしくはキメラ融合タンパク質として投与することができる（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：４３２２−３２；ＪｏｂｌｉｎｇとＨｏｌｍｅｓ（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６０：４９１５−２４）。コレラ毒素Ｂサブユニットの使用に基づく粘膜ワクチンが記述されている（ＬｅｂｅｎｓとＨｏｌｍｇｒｅｎ（１９９４）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ８２：２１５−２７）。もう１つの実施形態では、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）との混合物を粘膜ワクチン接種のために調製することができる。
【０１１１】
他の粘膜免疫法としては、免疫原をマイクロカプセルに封入すること（米国特許第５，０７５，１０９号、同第５，８２０，８８３号および同第５，８５３，７６３号）ならびに免疫増強性膜担体を使用すること（国際特許公報第ＷＯ９８／０５５８号）が含まれる。経口投与される免疫原の免疫原性は、赤血球（ｒｂｃ）もしくはｒｂｃゴーストを使用すること（米国特許第５，６４３，５７７号）、またはブルータング（ｂｌｕｅ ｔｏｎｇｕｅ）抗原を使用すること（米国特許第５，６９０，９３８号）によって増強され得る。標的免疫原の全身投与も粘膜免疫を生じさせることができる（米国特許第５，５１８，７２５号参照）。
【０１１２】
ＶＩＩ．医薬組成物および投与
本発明による、および本発明に従った使用のための医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に受容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の物質を含有し得る。そのような物質は非毒性であるべきであり、有効成分の効果を妨げてはならない。担体または他の物質の正確な性質は投与の経路に依存し、投与の経路は、好ましくは注射、たとえば皮膚、皮下または皮内注射によってであるが、当業者にとって好都合ないかなる経路によってもよい。
【０１１３】
注射に関して、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。薬学的に受容可能であり、好ましいと考えられる適切な希釈剤は既に前記で論じている。
【０１１４】
医薬組成物が錠剤、カプセル、粉末または液体形態であり得る場合、経口投与を使用し得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体担体を含有し得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含有する。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール類、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールも含有され得る。
【０１１５】
ワクチンは、たとえば気道の適切な部分に移動する大きさの粒子を含む、適切な製剤を使用して、エアロゾルによって気道に投与し得る。これは、水性懸濁液ではなく乾燥粉末でもよい。
【０１１６】
本発明の組成物は、魚類、両生類、鳥類および哺乳動物（哺乳動物としてはサル、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコおよびヒトが含まれるが、これらに限定されない）を含む、いかなる動物にも投与できる。組成物は、たとえば筋肉内、経口、皮下、皮内、膣内、直腸または鼻内投与のような、何らかの適切な投与方法によって投与され得る。好ましい投与方法は、経口、静脈内、皮下、筋肉内または皮内投与である。最も好ましい方法は、皮下投与を含む非経口投与である。
【０１１７】
必要な場合はブースター投与を含む、投与の頻度、および免疫に関連する他の技術は当業者に周知であり、既に記述または決定されていない場合は、過度の実験を必要とせずに実施できる。たとえば、本発明の組成物の適切な免疫防御性で非毒性且つ固有の免疫応答誘導量は、従来のワクチン中の抗原の有効量の範囲内であり得る。しかし、何らかの特定対象についての特定用量レベルは、対象の年齢、全般的健康状態、性別および食事を含む様々な因子に依存する。用量レベルに影響を及ぼす他の因子としては、投与の時間、投与の経路、投与される何らかの他の薬剤の相乗作用性、相加性または拮抗性相互作用、および求められる防御の量または免疫応答の誘導のレベルが含まれるが、これらに限定されない。たとえば、混合ワクチンでは、本発明のワクチンの用量は、その他のワクチン成分の干渉を相殺するように高める必要があり得る。
【０１１８】
本発明の組成物、たとえばウイルス特異的ワクチンとＩＬ−１０アンタゴニストを含有する治療用ワクチンは、当業者に周知の方法を用いて他のワクチンと組み合わせて使用できる。ウイルスワクチンとしては、ウイルスまたは疾患に対するもの、たとえば肝炎、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルス、痘瘡ウイルス、ＨＩＶ、水痘、耳下腺炎および麻疹に対するものが含まれるが、これらに限定されない。特定ウイルスへの暴露およびその後のワクチンまたは混合ワクチンの投与の様々なレジメンが含まれ、本明細書で提供される開示に基づき、当業者に周知の方法を使用して決定され得る。
【０１１９】
ウイルス特異的Ｔｈ１免疫応答を誘導する突然変異ウイルスまたは他の作用物質を、薬学的に受容可能な担体または希釈剤と共に投与することができる。そのような薬学的に受容可能な担体または希釈剤の例としては、水、リン酸緩衝食塩水または重炭酸ナトリウム緩衝液が含まれる。多くの他の許容される担体または希釈剤も当技術分野において公知である。
【０１２０】
ＶＩＩＩ．キット
本発明はさらに、ウイルスに対するワクチンおよび／またはその薬学的に受容可能な組成物ならびに免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび／またはその薬学的に受容可能な組成物、ならびに投与のための指示を含むキットを対象とする。特定の実施形態では、ワクチンと中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体は、別々にまたは一緒に包装され得る。さらに、キットは他の生物学的製剤も含み得る。
【０１２１】
本発明の広い範囲は以下の実施例を参照して最もよく理解され、それらの実施例は本発明を特定の実施形態に限定することを意図しない。
【実施例】
【０１２２】
Ｉ．一般的方法
生化学および分子生物学の標準的な方法は、たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されているまたは参照されている。標準的な方法はまた、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹにも認められ、これは、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、糖結合体およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を述べている。
【０１２３】
免疫沈降法、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含む、タンパク質精製のための方法が記述されている。Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化も記述されている。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ．，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１参照。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製、精製およびフラグメント化は記述されている。Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、前出。リガンド／受容体相互作用を特徴づけるための標準的な手法は利用可能である。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
【０１２４】
蛍光活性化細胞選別検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含む、フローサイトメトリーのための方法は利用可能である。たとえば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ参照。たとえば診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチドならびに抗体を含む、核酸を修飾するのに適した蛍光試薬が使用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ。
【０１２５】
免疫系の組織学的検査の標準的な方法は記述されている。たとえば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編集）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照。
【０１２６】
たとえば抗原性フラグメント、リーダー配列、タンパク質の折りたたみ、機能性ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウエアパッケージおよびデータベースは利用可能である。たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎら（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０参照。
【０１２７】
ＩＩ．マウスおよびウイルス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｔｈｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｙ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）より入手した。使用したＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４＋ ＴｃＲトランスジェニック（ＳＭＡＲＴＡ）マウスおよびＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的Ｃ８＋トランスジェニック（Ｐ１４）マウスは、Ｏｘｅｎｉｕｓら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３９０−４００に記載されている。すべてのマウスをＮＩＨおよびＩＡＣＵＣガイドラインに従って病原体不含条件に収容した。
【０１２８】
マウスを静脈内経路で２×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＬＣＭＶ−ＡｒｍまたはＬＣＭＶ−Ｃｌ １３に感染させた。ウイルス株を調製し、Ｂｏｒｒｏｗら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１０５９−１０７０に述べられているようにウイルス力価を定量した。すべての実験は各群につき３〜６匹のマウスを含み、少なくとも３回反復された。
【０１２９】
ＩＩＩ．Ｔ細胞の単離と移入
ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を、負の選択によりそれぞれナイーブＳＭＡＲＴＡおよびＰ１４マウスの脾臓から精製した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）。各々の集団からの１０００の精製細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内経路で共移入した。これらのトランスジェニックＴ細胞集団の各々は、四量体分析および細胞内サイトカイン染色に基づき、それらの内因性（すなわち宿主由来）Ｔ細胞対応物と同様に挙動する（たとえば、Ｗｈｅｒｒｙら（２００３）前出；およびＢｏｒｒｏｗら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１０５９−１０７０参照）。ＳＭＡＲＴＡおよびＰ１４細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定されたＴｈｙ１．１＋細胞の頻度に脾細胞の総数を乗じることによって決定した。
【０１３０】
ＩＩＩ．定量的ＰＣＲ
全脾単核細胞からのＲＮＡを得て、Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）前出に述べられているように増幅した。ＲＮＡ発現を投入濃度（ｉｎｐｕｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）によって正規化し、Ｑｉａｇｅｎ ＯＮＥ−ＳＴＥＰ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して増幅した。ＩＬ−１０ ＲＮＡを増幅するためにＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤリアルタイムＩＬ−Ｉ０発現キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＩＬ−１０ ＲＮＡを定量するため、Ｃｌ １３感染脾細胞からの全脾ＲＮＡの１０倍連続希釈（１μｇ対１ｐｇ全ＲＮＡ、標準曲線：ｒ２＞０．９９）によって標準曲線を作成し、ＩＬ−１０ ＲＮＡの相対数を決定した。増幅はＡＢＩ７７００増幅器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。
【０１３１】
ＩＶ．細胞内サイトカイン分析およびフローサイトメトリー
脾細胞を、５０Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１ｍｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）の存在下に、５μｇ／ｍｌのＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０または２μｇ／ｍｌのＭＨＣクラスＩ拘束性ＬＣＭＶ−ＮＰ３９６〜４０４、ＧＰ３３〜４１またはＧＰ２７６〜２８５ペプチド（すべて９９％純粋；Ｓｙｎｐｅｐ．）で５時間刺激した。ＩＬ−２のエクスビボ投与はサイトカイン産生を変化させなかった。細胞をＣＤ４（クローンＲＭ４−５；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＣＤ８（クローン５３−６．７；Ｃａｌｔａｇ）の表面発現に関して染色した。細胞を固定し、透過処理し、ＴＮＦ−αに対する抗体（クローンＭＰ６−ＸＴ２２；ＡＴＣＣ）、ＩＦＮ−γに対する抗体（クローンＸＭＧ１．２；ＡＴＣＣ）およびＩＬ−２に対する抗体（クローンＪＥＳ６−５Ｈ４；ＡＴＣＣ）で染色した。Ｄｉｇｉｔａｌ ＬＳＦ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施した。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ四量体を、Ｈｏｍａｎｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：９１３−９１９に記載されているように生成した。四量体またはＩＦＮ−γ細胞の頻度に脾臓内の細胞の総数を乗じることによってウイルス特異的Ｔ細胞の絶対数を決定した。
【０１３２】
Ｖ．インビボでのＩＬ−１０ＲおよびＰＤ−Ｌ１特異的抗体処置
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染後２５日目または３０日目から開始して３日ごとに５回の処置を継続し、２５０μｇ／マウスのＩＬ−１０Ｒ特異的抗体（クローン１Ｂ１．３ａ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によっておよび／または２００ｍｇ／マウスのＰＤ−Ｌ１特異的抗体（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）をｉ．ｐ．注射によって投与した。ラットＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（抗大腸菌β−ガラクトシダーゼＭａｂ、クローンＫＭ１．ＧＬ１１３；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）による処置は、Ｔ細胞応答またはウイルス複製に影響を及ぼさなかった。
【０１３３】
ＶＩ．ＤＮＡワクチン接種
プラスミドｐＣＭＶ−ＧＰは、全長ＬＣＭＶ糖タンパク質をコードする。親対照ベクター、ｐＣＭＶはＬＣＭＶ配列を含まない。ｐＣＭＶ−ＧＰおよび親ｐＣＭＶベクターの両方が、Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６８４−２６８８に記述されている。ｐＣＭＶ−ＧＰは、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞ＬＣＭＶ糖タンパク質エピトープの両方をコードするが、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞ＬＣＭＶ核タンパク質エピトープをコードしない。並行して、プラスミドを大腸菌で増殖させ、内毒素不含プラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染後２９日目と３４日目にＤＮＡ注射（食塩水中のプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／マウス）の５０μｌ注射を両側前脛骨筋内に）を実施した。
【０１３４】
ＶＩＩ．統計分析
ＳｉｇｍａＳｔａｔ ２．０ソフトウエア（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒ，Ｉｎｃ．）を使用してスチューデントｔ検定を実施した。
【０１３５】
本明細書中のすべての引用は、各々個々の公表文献または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることを具体的且つ個別に指示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
当業者に明白であるように、本発明の多くの修正および変形が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく実施され得る。本明細書で述べる特定の実施形態は単なる例として提供され、本発明は、添付の特許請求の範囲の規定によって、そのような特許請求の範囲が与える全範囲の等価物と共に、限定されるものである。そして、本発明は、本明細書中で例として提示された特定の実施形態によって限定されない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続性ウイルス感染を治療するための併用療法を提供する。特に、そのような感染をより効率的に除去するためのワクチンとＩＬ−１０またはＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）アンタゴニストの組み合わせが提供される。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染は、感染を除去するために極めて重要である強固なＴ細胞応答の引き金を引く。しかし、一部のウイルス感染に応答して、抗ウイルス性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞はウイルス抗原に対して不応答性となり、物理的に除去されるかまたは非機能性状態もしくは「枯渇」状態で存続する。この枯渇状態は、抗ウイルス性および免疫刺激性サイトカインを産生する、ウイルス感染細胞を溶解する、または増殖する能力の欠如によって特徴づけられる（たとえば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４参照）。
【０００３】
持続的なＴ細胞応答が、ヒトにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染ならびにマウスにおけるリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染の除去および制御と強く相関するという事実によって明らかにされたように、Ｔ細胞機能の多パラメータ喪失は持続を直接促進する（たとえば、Ｂａｒｂｅｒ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４３９：６８２−６８７；Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１２：１３０１−１３０９；Ｅｊｍａｅｓら（２００６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３：２４６１−２４７１；Ｏｌｄｓｔｏｎｅら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：２３９−２４３；Ｔｈｉｍｍｅら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１３９５−１４０５；ＧａｎｄｈｉとＷａｌｋｅｒ（２００２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３：１４９−１７２；およびＳｈｏｕｋｒｙら（２００４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：３９１−４２４参照）。現在まで、抗ウイルスＴ細胞活性を報告し、持続性ウイルス感染を制御するワクチンはごくわずかしか成功を収めていない（たとえば、Ａｕｔｒａｎら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５：２０５−２０８参照）。
【０００４】
最近、遺伝子欠損および抗体遮断試験に基づき、ＩＬ−１０が、ウイルス感染を除去するかまたは持続させるかを決定する単一支配的因子として同定された（たとえば、Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）前出；およびＥｊｍａｅｓら（２００６）前出参照）。確立された持続性感染の間およびＴ細胞枯渇後のＩＬ−１０の抗体遮断は、ウイルスの除去促進を導くＴ細胞機能を回復させた。持続性ウイルス感染の間に、プログラム細胞死−１：プログラム細胞死−リガンド１（ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１）の相互作用はＴ細胞機能をさらに制限し、ＰＤ−Ｌ１の抗体遮断はＴ細胞活性を刺激することができる（たとえば、Ｂａｒｂｅｒら（２００５）前出参照）。提案された１つの方策は、持続性ウイルス感染を除去するためのＩＬ−１０およびＰＤ−１経路の二重拮抗作用である（たとえば、Ｍａｒｉｎｉｃとｖｏｎ Ｈｅｒｒａｔｈ（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１１６−１２４参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｚａｊａｃら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８８：２２０５−２２１３
【非特許文献２】Ｇａｌｌｉｍｏｒｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：１３８３−１３９３
【非特許文献３】Ｗｈｅｒｒｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００３）７７：４９１１−４９２７
【非特許文献４】Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００６）１１６：１６７５−１６８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＩＬ−１０の発現上昇は、ヒトにおける多くの持続性ウイルス感染（たとえばＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ）において認められ、Ｔ細胞応答性の低下およびウイルス複製の制御の失敗と直接相関する。それゆえ、持続性ウイルス感染においてＩＬ−１０活性をよりよく制御する必要がある。本発明は、そのような感染を治療するためにＩＬ−１０アンタゴニストを使用する併用療法を提供することによってこの必要性に応えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、一部には、ワクチンと組み合わせたＩＬ−１０活性の中和が、抗ウイルス性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を有意に刺激し、ウイルス複製を制御するように相乗作用的に組み合わさるという驚くべきデータに基づく。さらに、ＩＬ−１０およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の両方の中和も、持続性ウイルス感染モデルにおけるウイルス負荷の減少において相乗作用を示した。
【０００８】
本発明は、慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法であって、慢性または持続性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ウイルスに対するワクチンと免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストとの組み合わせは、慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す。さらなる実施形態では、免疫抑制性サイトカインはＩＬ−１０である。加えて、免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストは、可溶性ＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）ポリペプチドを含む。ある実施形態では、可溶性ＩＬ−１０Ｒポリペプチドは、抗体分子のＦｃ部分を含む、異種ポリペプチドを含有するか、またはペグ化されている。もう１つの実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）抗体またはその抗体フラグメントである。中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体は、ヒト化抗体または完全なヒト抗体を含む、モノクローナル抗体であり得る。さらなる実施形態では、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖおよび一本鎖抗体フラグメントからなる群より選択される。本発明は、慢性または持続性ウイルス感染が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶおよびＬＣＭＶからなる群より選択されることを企図する。１つの実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンである。選択的実施形態では、免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストは、ウイルスに対するワクチンの前に投与される。
【０００９】
本発明は、慢性または持続性ウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物であって、（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに（ｂ）免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに（ｂ）免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび薬学的に受容可能な担体を含むキットを包含する。
【００１１】
本発明は、慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法であって、持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。特に、ウイルスに対するワクチンと中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントの組み合わせは、慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す。１つの実施形態では、中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体は、ヒト化抗体または完全なヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。１つの実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンである。中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体と組み合わせたワクチンの投与は、ワクチンまたは抗体治療単独と比較した場合、ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の２倍の増加またはＩＦＮ−γを産生するウイルス特異的Ｔ細胞の５倍の増加を生じさせ得る。併用治療は、治療前レベルと比較してウイルス力価を２４分の１に減少させ得る。ある実施形態では、中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントは、ウイルスに対するワクチンの前に投与される。
【００１２】
本発明は、慢性または持続性ウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物であって、（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに（ｂ）中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物を包含する。
【００１３】
また、（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに（ｂ）中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能な担体を含むキットも、本発明によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１ａ〜１ｄは、ＩＬ−１０Ｒの遮断が治療的ワクチン接種による抗ウイルスＴ細胞応答の有効な刺激を可能にすることを示す。図１ａは、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体治療とＤＮＡワクチン接種の概略図を示す。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを、未処置のままにする、ＤＮＡワクチン（ＬＶＭＶ−ＧＰ全体をコードする）で処置する、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置する、またはＤＮＡワクチンプラス抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で共処置する、のいずれかを実施した。抗ＩＬ−１０Ｒ処置は、感染後２５日目に開始し、２〜３日ごとに２週間継続した。ＤＮＡワクチン接種は感染後２９日目と３４日目に実施した。次に、感染後３９日目にＴ細胞応答を分析した。図１ｂは、エクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量したサイトカイン産生を示す。フロープロットは、ＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。データは各群につき４匹のマウスを代表する。図１ｃは、各々の処置レジメン後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１、ＧＰ２７６〜２８６およびＮＰ３９６〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示す。円は個々のマウスを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図１ｄは、アイソタイプ処置群（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示し、４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図１Ｂ】図１ａ〜１ｄは、ＩＬ−１０Ｒの遮断が治療的ワクチン接種による抗ウイルスＴ細胞応答の有効な刺激を可能にすることを示す。図１ａは、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体治療とＤＮＡワクチン接種の概略図を示す。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを、未処置のままにする、ＤＮＡワクチン（ＬＶＭＶ−ＧＰ全体をコードする）で処置する、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置する、またはＤＮＡワクチンプラス抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で共処置する、のいずれかを実施した。抗ＩＬ−１０Ｒ処置は、感染後２５日目に開始し、２〜３日ごとに２週間継続した。ＤＮＡワクチン接種は感染後２９日目と３４日目に実施した。次に、感染後３９日目にＴ細胞応答を分析した。図１ｂは、エクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量したサイトカイン産生を示す。フロープロットは、ＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。データは各群につき４匹のマウスを代表する。図１ｃは、各々の処置レジメン後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１、ＧＰ２７６〜２８６およびＮＰ３９６〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示す。円は個々のマウスを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図１ｄは、アイソタイプ処置群（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示し、４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図１Ｃ】図１ａ〜１ｄは、ＩＬ−１０Ｒの遮断が治療的ワクチン接種による抗ウイルスＴ細胞応答の有効な刺激を可能にすることを示す。図１ａは、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体治療とＤＮＡワクチン接種の概略図を示す。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを、未処置のままにする、ＤＮＡワクチン（ＬＶＭＶ−ＧＰ全体をコードする）で処置する、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置する、またはＤＮＡワクチンプラス抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で共処置する、のいずれかを実施した。抗ＩＬ−１０Ｒ処置は、感染後２５日目に開始し、２〜３日ごとに２週間継続した。ＤＮＡワクチン接種は感染後２９日目と３４日目に実施した。次に、感染後３９日目にＴ細胞応答を分析した。図１ｂは、エクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量したサイトカイン産生を示す。フロープロットは、ＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。データは各群につき４匹のマウスを代表する。図１ｃは、各々の処置レジメン後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１、ＧＰ２７６〜２８６およびＮＰ３９６〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示す。円は個々のマウスを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図１ｄは、アイソタイプ処置群（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示し、４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図１Ｄ】図１ａ〜１ｄは、ＩＬ−１０Ｒの遮断が治療的ワクチン接種による抗ウイルスＴ細胞応答の有効な刺激を可能にすることを示す。図１ａは、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体治療とＤＮＡワクチン接種の概略図を示す。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを、未処置のままにする、ＤＮＡワクチン（ＬＶＭＶ−ＧＰ全体をコードする）で処置する、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置する、またはＤＮＡワクチンプラス抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で共処置する、のいずれかを実施した。抗ＩＬ−１０Ｒ処置は、感染後２５日目に開始し、２〜３日ごとに２週間継続した。ＤＮＡワクチン接種は感染後２９日目と３４日目に実施した。次に、感染後３９日目にＴ細胞応答を分析した。図１ｂは、エクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量したサイトカイン産生を示す。フロープロットは、ＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示す。データは各群につき４匹のマウスを代表する。図１ｃは、各々の処置レジメン後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１、ＧＰ２７６〜２８６およびＮＰ３９６〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を示す。円は個々のマウスを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図１ｄは、アイソタイプ処置群（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示し、４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均±標準偏差（ＳＤ）である。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図２Ａ】図２ａ〜２ｂは、ＣＤ４ Ｔ細胞応答がＩＬ−１０Ｒ遮断とワクチン接種によって増強されることを示す。図２ａは、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを図１で述べたように処置し、分析したことを示す。サイトカイン産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度をエクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量した。フロープロットは、各々の処置（感染後３９日目）後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を示す。図２ｂは、図２Ｂで述べたように定量したＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数を示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図２ｂは、アイソタイプ処置と比較した各処置レジメン後のＩＬ−２産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示す。個々のバーは、各群につき４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均値±ＳＤを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】図２ａ〜２ｂは、ＣＤ４ Ｔ細胞応答がＩＬ−１０Ｒ遮断とワクチン接種によって増強されることを示す。図２ａは、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを図１で述べたように処置し、分析したことを示す。サイトカイン産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度をエクスビボでのペプチド刺激と細胞内染色によって定量した。フロープロットは、各々の処置（感染後３９日目）後のＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を示す。図２ｂは、図２Ｂで述べたように定量したＩＦＮ−γ産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数を示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５、＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。図２ｂは、アイソタイプ処置と比較した各処置レジメン後のＩＬ−２産生ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数の平均倍数増加を示す。個々のバーは、各群につき４〜６匹のマウスを含む３回の実験の平均値±ＳＤを示す。＊：未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較してｐ＜０．０５。＊＊：他のすべての処置群と比較してｐ＜０．０５。
【図３Ａ】図３ａおよび３ｂは、ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断がＴ細胞機能を回復することを示す。感染の前に、マウスにＬＣＭＶ特異的ＴｃＲ ｔｇ（図３ａ）ＣＤ８＋（Ｐ１４）および（図３ｂ）ＣＤ４＋（ＳＭＡＲＴＡ）Ｔ細胞を接種し、その後ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３に感染させた。マウスを、図１ａで述べたようにアイソタイプ対照抗体、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体および／またはＤＮＡワクチンで処置した。棒グラフは、感染後３９日目のＰ１４およびＳＭＡＲＴＡ細胞の数の倍数増加を示す。個々のバーは、各群につき５匹のマウスの平均±ＳＤを示す。＊：アイソタイプおよびＤＮＡワクチン単独と比較して平均数の有意の（ｐ＜０．０５）増加。＊＊：他のすべての条件と比較して有意の（ｐ＜０．０５）増加。
【図３Ｂ】図３ａおよび３ｂは、ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断がＴ細胞機能を回復することを示す。感染の前に、マウスにＬＣＭＶ特異的ＴｃＲ ｔｇ（図３ａ）ＣＤ８＋（Ｐ１４）および（図３ｂ）ＣＤ４＋（ＳＭＡＲＴＡ）Ｔ細胞を接種し、その後ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３に感染させた。マウスを、図１ａで述べたようにアイソタイプ対照抗体、抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体および／またはＤＮＡワクチンで処置した。棒グラフは、感染後３９日目のＰ１４およびＳＭＡＲＴＡ細胞の数の倍数増加を示す。個々のバーは、各群につき５匹のマウスの平均±ＳＤを示す。＊：アイソタイプおよびＤＮＡワクチン単独と比較して平均数の有意の（ｐ＜０．０５）増加。＊＊：他のすべての条件と比較して有意の（ｐ＜０．０５）増加。
【図４】図４ａ〜４ｂは、免疫抑制環境を軽減し、Ｔ細胞応答を刺激することによる持続性ウイルス感染の制御の促進を示す。図４ａは、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染マウスを図１ａで述べたように感染させ、処置したことを示す。棒グラフは、各々の処置レジメンに応答した血清ウイルス力価の倍数減少を示す。倍数減少は、感染後２５日目（すなわち処置前）の各マウスにおけるウイルス力価を感染後３３日目（すなわち処置期間中）のウイルス力価で除することによって決定した。バーは、各群につき３匹のマウスの平均±ＳＤを示し、各群につき３〜６匹のマウスに関する３回の別々の実験を代表する。図４ｂは、感染後２５日目（灰色の円）および４０日目（白色の円）（すべての治療処置の完了後）に血清ウイルス力価を定量したことを示す。各々の円は１匹のマウスを表し、グラフは３回の実験からのデータを含む。破線はアッセイの検出のレベル（２００ＰＦＵ／ｍｌ）を示す。＊は、未処置およびＤＮＡワクチン接種単独と比較して感染後４０日目のウイルス力価の有意の（ｐ＜０．０５）低下を示す。＊＊は、他のすべての処置群と比較して４０日目にウイルス力価が有意に（ｐ＜０．０５）低下したことを示す。各々の群の上部の数字は、感染後２５日目から４０日目までの間のウイルス力価の平均倍数低下を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＬＣＭＶ Ｃｌ １３感染後４０日目および以下の処置：ａ）アイソタイプ対照抗体；ｂ）抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体単独；ｃ）抗ＰＤ−Ｌ１遮断抗体単独；または４）抗ＩＬ−１０Ｒ抗体と抗ＰＤ−Ｌ１遮断抗体による共処置後の、脾臓におけるＴｈｙ１．１＋ ｔｇウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（Ｐ１４細胞）の頻度を示す。処置は感染後２５日目に開始し、３日ごとに合計５回の処置を実施した。右側のグラフは、各々の処置レジメン後のＰ１４細胞の数を示す。図５Ａおよび５Ｂからのデータは、各処置群につき４〜５匹のマウスおよび２回の実験を代表する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＬＣＭＶ Ｃｌ １３感染後４０日目の脾臓におけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生Ｐ１４細胞のパーセンテージを示す。棒グラフは、アイソタイプ処置（１に設定する）と比較した各処置群におけるＴＮＦ−α産生Ｐ１４細胞の数の平均倍数増加±ＳＤ（＊；ｐ＜０．０５）を示す。図５Ａおよび５Ｂからのデータは、各処置群につき４〜５匹のマウスおよび２回の実験を代表する。
【図６】図６Ａは、ＩＬ−１０Ｒ／ＰＤ−Ｌ１二重遮断後の持続性ウイルス感染の除去を示す。ＬＣＭＶ Ｃｌ １３マウスを指示されている抗体で処置し、処置前の２５日目（暗い円）、および処置停止後３日目に当たる４０日目（白い円）に血清ウイルス力価を定量した。各々の円は各群内の１匹のマウスを表し、グラフは３回の実験からのデータを含む。破線はアッセイの検出のレベル（２００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌ血清）を示す。各群の上部の数字は、２５日目から４０日目までの間のウイルス力価の平均倍数低下を示す（＊は、アイソタイプ処置と比較したウイルス力価の低下（ｐ＜０．０５）である；＊＊は、他のすべての処置群と比較したウイルス力価の低下（ｐ、０．０５）である）。図６Ｂは、前述した処置レジメン後の、ＬＣＭＶ Ｃｌ １３感染後４０日目の肝ウイルス力価を示す。
【図７】図７は、指示されている組織中に存在するＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１およびＬＣＭＶ−ＧＰ２７６〜２８６四量体陽性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の総数の定量的測定を示す。（＊−ｐ＜０．０５；＊＊−ｐ＜０．０１；および＊＊＊−ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
添付の特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」のような語の単数形態は、文脈上明らかに異なる指示が為されない限り、対応する複数の言及を包含する。
【００１６】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、各々個々の公表文献、特許出願または特許が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的且つ個別に指示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１７】
Ｉ．定義
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性、遺伝子発現を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性の調節等を表し得るまたは意味し得る。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、たとえば接着を調節するもしくは維持するうえでの活性、または細胞の構造、たとえば細胞膜もしくは細胞骨格を維持するうえでの活性を意味し得る。「活性」はまた、比活性、たとえば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］等を意味し得る。
【００１８】
本明細書で使用される「慢性ウイルス感染」または「持続性ウイルス感染」は、致死的であることが判明せずに、長期間にわたって、通常は数週間、数ヶ月間または数年間、宿主に感染し、宿主の細胞内で増殖することができる、ヒトまたは他の動物のウイルス感染を意味する。慢性感染を生じさせる、そして本発明に従って治療し得るウイルスの中には、そのすべてが重大な臨床疾患を生じさせ得る、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスおよび他のヘルペスウイルス、Ｂ型およびＣ型肝炎のウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）ならびに他の肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ならびにＨＩＶがある。長期的な感染は、最終的に、患者にとって致死的であり得る疾患、たとえばＣ型肝炎ウイルスの場合は肝癌の誘発を導き得る。本発明に従って治療し得る他の慢性ウイルス感染は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびに腫瘍に関連し得るもののような他のウイルス、または動物の場合は、様々な動物ウイルス疾患、たとえばペット動物または農業において重要な農業動物のウイルス疾患を含む。
【００１９】
「治療有効量」は、患者にとっての利益を示すのに十分な量で投与されるＩＬ−１０アンタゴニストおよびワクチンを意味する。そのような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも改善であり得る。投与される実際の量および投与速度と時間経過は、治療される対象の性質と重症度に依存する。
【００２０】
「ワクチン」は、レシピエントにおいて防御免疫を惹起するために使用できる組成物（タンパク質またはベクター；後者はまた、大まかに「ＤＮＡワクチン」とも称され得るが、ＲＮＡベクターも使用できる）を指す。一部の個体は強固なもしくは防御免疫応答を開始することができないことがあり、または一部の場合、いかなる免疫応答も開始できないことがあり得るので、有効であるために、本発明のワクチンは集団の一部において免疫を惹起できることに留意すべきである。この不可能性は、個体の遺伝的背景から、または免疫不全状態（後天性もしくは先天性）または免疫抑制（たとえば臓器拒絶反応を予防するもしくは自己免疫状態を抑制するための免疫抑制薬による治療、または免疫媒介性免疫抑制）のために生じ得る。効果は動物モデルにおいて立証することができる。
【００２１】
「免疫療法」は、病原体特異的免疫応答の活性化に基づく治療レジメンを指す。ワクチンは免疫療法の１つの形態であり得る。
【００２２】
「保護する」は、対象においてウイルス感染を、たとえば持続性または慢性ウイルス感染を、適宜に、予防するまたは治療することまたはその両方を意味するために本明細書で使用される。それゆえ、別の作用物質、たとえばＩＬ−１０アンタゴニストと組み合わせたワクチンの予防的または治療的投与は、そのような持続性ウイルス感染から受容対象を保護することができる。ワクチンまたは免疫療法の治療的投与は、たとえば、ウイルス関連新生物のような疾患または障害を治療するために、感染に関連する病因からレシピエントを保護することができ、ウイルス関連新生物は、ホジキンリンパ腫、地方病性バーキットリンパ腫、鼻咽喉癌、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、子宮平滑筋肉腫、および肝細胞癌を含む。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチドワクチン」という用語は、原因因子、たとえばウイルスからの免疫原性ポリペプチドおよび、一般に、アジュバントを含有するワクチンを指す。「アジュバント」という用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。アジュバントは、抗原を緩やかに放出する組織貯留所としておよびまた免疫応答を非特異的に増強するリンパ系活性化剤としての機能を果たすことができる（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，１９８４，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，ｐ．３８４）。しばしば、アジュバントなしでの、抗原単独による一次抗原投与では、体液性または細胞性免疫応答を惹起することができない。アジュバントは、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルまたは炭化水素エマルション、ならびにＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。好ましい合成アジュバントの一例はＱＳ−２１である。あるいは、または加えて、本明細書で述べるような免疫刺激タンパク質が、アジュバントとしてまたはワクチンに対する免疫応答を高めるために提供され得る。好ましくは、アジュバントは薬学的に受容可能である。
【００２４】
「ＤＮＡワクチン」という用語は、組換えベクターによって送達されるワクチンを指すために本明細書で使用される。本明細書で使用される代替的な、そしてより説明的な用語は、「ベクターワクチン」（レトロウイルスおよびレンチウイルスなどの一部の潜在的ベクターはＲＮＡウイルスであり、また一部の場合はＤＮＡではなく非ウイルスＲＮＡを細胞に送達することができるため）である。一般に、ベクターはインビボで投与されるが、樹状細胞のような適切な抗原提示細胞のエクスビボでの形質導入も、形質導入細胞のインビボでの投与を伴って、企図される。以下で述べるベクター系は、本発明の免疫原性ポリペプチドの発現のためのベクターの送達にとって理想的である。
【００２５】
本明細書で使用される「ヒトにおける発現のためのベクター」は、ベクターが、少なくとも、ヒト細胞において有効であるプロモーターを含むこと、および好ましくは、ベクターがヒトにおいて安全且つ有効であることを意味する。そのようなベクターは、たとえば、免疫を発現することに関与しない外来遺伝子を含まない。ベクターがウイルスベクターである場合は、複製および強固な感染の発症を可能にする領域を含まず、インビボでの複製能力の発現を回避するように遺伝子操作される。そのようなベクターは、好ましくはヒトにおける使用のために安全である；より好ましい実施形態では、ベクターは、臨床試験またはヒトにおける使用に関して政府の規制機関（食品医薬品局のような）によって承認されている。
【００２６】
「免疫原性ポリペプチド」という用語は、免疫原性であり、動物に投与された場合防御免疫応答を惹起するウイルスタンパク質またはその部分を指す。それゆえ、ウイルス免疫防御抗原は全長タンパク質である必要はない。防御免疫応答は一般に、ＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞レベルでの細胞性免疫を含む。
【００２７】
「免疫原性」という用語は、ポリペプチドが体液性または細胞性免疫応答、好ましくはその両方を惹起できることを意味する。免疫原性ポリペプチドはまた、抗原性である。分子は、それが免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体のような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができる場合、「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５個、好ましくは少なくとも約１０個のアミノ酸のエピトープを含む。本明細書ではエピトープとも称される、ポリペプチドの抗原性部分は、抗体もしくはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である部分であり得るか、または免疫のために抗原性部分を担体ポリペプチドに結合することによって分子に対する抗体を作製するために使用される部分であり得る。抗原性である分子は、それ自体が免疫原性である必要はない、すなわち、担体なしで免疫応答を惹起できる必要はない。
【００２８】
「突然変異体」および「突然変異」という用語は、遺伝物質、たとえばＤＮＡの何らかの検出可能な変化、またはそのような変化の何らかの過程、機構もしくは結果を意味する。これは、遺伝子の構造（たとえばＤＮＡ配列）が変化する遺伝子突然変異、何らかの突然変異過程から生じる何らかの遺伝子またはＤＮＡ、および改変された遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現される発現産物（たとえばタンパク質）を包含する。「変異体」という用語も、改変されたまたは変化した遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞等、すなわちあらゆる種類の突然変異体を指示するために使用され得る。
【００２９】
「治療する」という用語は、対象において疾患の少なくとも１つの症状を軽減するまたは緩和することを意味するために本明細書で使用される。
【００３０】
本明細書で使用される「治癒する」または「治癒」という用語は、当技術分野で認められている基準に従ってウイルス感染に関連する疾患、障害または状態の症状を実質的に除去することを指す。本明細書で使用される「治癒された」という用語は、疾患、障害または状態に関連する症状が実質的に存在しない状態を指す。
【００３１】
本出願において使用される「対象」という用語は、鳥類および哺乳動物のような、免疫系を有する動物を意味する。哺乳動物は、イヌ、ネコ、げっ歯動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジおよび霊長動物を含む。鳥類は、家禽、鳴禽、猛禽等を含む。本発明は、それゆえ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、類人猿、サル、ニワトリ、シチメンチョウ、カナリア、ワシ、タカ、フクロウ、および特にヒトにおけるウイルス感染に関連する疾患、障害または状態を治療するために有用である。それゆえ、本発明は、獣医学において、たとえばペット動物、家畜、動物園の実験動物、および野生動物を治療するために使用できる。本発明は、ヒト医学適用のために特に望ましい。
【００３２】
「併用療法」という用語は、ウイルスに対するワクチンおよび免疫抑制性サイトカインに対するアンタゴニストの有効量の投与を含む、ウイルス感染、好ましくは慢性または持続性ウイルス感染、たとえばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ等を治療するための療法を指す。また、ＩＬ−１０とＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストの組み合わせも包含される。本発明の併用療法は、１またはそれ以上の抗ウイルス薬を含み得る。加えて、本発明の併用療法は、持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスへの起こり得る急性暴露後に、これまで感染していない個体において予防的手段として使用することができる。化合物のそのような予防的使用の例としては、母親から乳児へのウイルス伝播の予防および、たとえば作業者がウイルス含有血液製剤に暴露される医療環境における事故のような、伝播の可能性が存在する他の状況が挙げられ得るが、これらに限定されない。さらに、本発明の併用療法は、これまでは感染していない個体であるが、高危険度個体での全身療法または局所殺菌薬として暴露の危険度が高い個体における予防的手段として使用できる。
【００３３】
本明細書で使用される「相乗作用」は、２つの治療実体を組み合わせた作用がそれらの個別での作用の総計よりも大きい現象である。
【００３４】
「相乗作用的」という用語は、何らかの２またはそれ以上の単一薬剤の相加作用よりも有効である組み合わせを指す。「相乗効果」は、ウイルス感染を治療するまたは予防するために単一療法において抗ウイルス薬のより低い量または用量を使用できることを指す。より低い用量は、典型的には効果の減少を伴わずに毒性の低下をもたらす。加えて、相乗効果は、効果を改善する、たとえば抗ウイルス活性を改善することができるか、または抗ウイルス薬に対する何らかのウイルス耐性を回避するまたは程度を低減することができる。ワクチンまたはその薬学的に受容可能な組成物と免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストまたはその薬学的に受容可能な組成物との間の相乗効果は、たとえば以下で述べるように、従来の抗ウイルスアッセイから決定することができる。アッセイの結果は、併用指数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）を得るためのＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの組み合わせ法（ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙ，（１９８４）Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５）および“Ｄｏｓｅ Ｅｆｆｅｃｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒｓ”ソフトウエア（ＣｈｏｕとＣｈｏｕ，１９８７，Ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ Ｍａｎｕａｌ．ｐ１９−６４．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して解析することができる。１未満の併用指数値は相乗作用を示し、１より大きい併用指数値は拮抗作用を指示し、１に等しい併用指数値は相加作用を示す。これらのアッセイの結果はまた、ＰｒｉｔｃｈａｒｄとＳｈｉｐｍａｎ（ＰｒｉｔｃｈａｒｄとＳｈｉｐｍａｎ（１９９０）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：１８１−２０６）の方法を使用して解析することもできる。
【００３５】
「抗ウイルス活性」という用語は、非感染細胞へのウイルス伝播の阻害、ウイルスの複製の阻害、ウイルスが宿主内に定着することの防止、またはウイルス感染によって引き起こされる疾患の症状を改善することもしくは緩和することを指す。これらの作用は、ウイルス負荷の低減または死亡率および／もしくは罹病率の低下によって証明することができ、それらのアッセイを以下で説明する。抗ウイルス物質または抗ウイルス薬は抗ウイルス活性を有し、単独でまたは多剤併用療法の一部として持続性または慢性ウイルス感染を治療するために有用である。
【００３６】
本明細書で使用されるまたは結合体化されていない形態の「インターロイキン−１０」すなわち「ＩＬ−１０」は、ホモ二量体を形成するように非共有結合的に連結された２つのサブユニットを含むタンパク質である。「ＩＬ−１０受容体１」、「ＩＬ−１０Ｒ」または「ＩＬ−１０Ｒ１」は、ＩＬ−１０に対する特異性を付与するＩＬ−１０受容体複合体の１つのサブユニットを指す。本明細書で使用される場合、特に指示のない限り、「インターロイキン−１０」、「ＩＬ−１０」およびＩＬ−１０Ｒは、ヒトもしくはマウスＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒを表し得る。ＩＬ−１０抗体は、たとえば米国特許第６，２３９，２６０号において説明されており；ヒト化抗ＩＬ−１０抗体は、たとえば米国特許公開公報第２００５／０１０１７７０号において説明されており；ＩＬ−１０Ｒポリペプチドは、たとえば米国特許第５，９８５，８２８号において説明されており；そしてＩＬ−１０Ｒ抗体は、たとえば米国特許第５，８６３，７９６号において説明されており、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
「ＰＤ−１」は、プログラム細胞死受容体１を指す。Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−４としても知られる「ＰＤ−Ｌ１」は、ＰＤ−１の結合パートナーの１つである。本明細書で使用される場合、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１はヒトまたはマウスタンパク質を指す。ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチド配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ２５８０７で提供され、そのマウスポリペプチド配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ３１８１０で提供される。ヒトＰＤ−１ポリペプチド配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００９で提供され、マウスＰＤ−１ポリペプチド配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＩ２０６０３で提供される。
【００３８】
本明細書で使用される「可溶性受容体」は、受容体タンパク質の細胞外ドメインである。
【００３９】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの異種タンパク質をコードする少なくとも２つの異種遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現される雑種タンパク質である。たとえば、融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域と融合した、ＩＬ−１０Ｒ１ポリペプチドの少なくとも一部、たとえば細胞外ドメインを含み得る。
【００４０】
「ペグ化」または「ＰＥＧ」タンパク質は、結合が安定であるように、リンカーを介してＩＬ−１０タンパク質の１またはそれ以上のアミノ酸残基に共有結合的に連結された１またはそれ以上のポリエチレングリコール分子を有するタンパク質またはポリペプチドである。「モノペグ化」および「モノＰＥＧ」という用語は、１個のポリエチレングリコール分子が、リンカーを介して多量体タンパク質の１つのサブユニット上の１個のアミノ酸残基に共有結合的に連結されていることを意味する。ＰＥＧ部分の平均分子量は、好ましくは約５，０００〜約５０，０００ダルトンである。タンパク質またはポリペプチドへのＰＥＧ結合の方法または部位は重要ではないが、好ましくは、ペグ化は生物活性分子の活性を変化させないかまたはごくわずかだけ変化させる。好ましくは、半減期の上昇は生物活性の低下を上回る。たとえば、ペグ化ＩＬ−１０ＲまたはＰＥＧ−ＩＬ−１０Ｒは、少なくとも１つのＰＥＧ分子に共有結合的に連結されたＩＬ−１０Ｒの細胞外ドメインを含み得る。
【００４１】
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、およびリガンド特異的結合ドメインを保持するかまたは前記ドメインを含むように修飾されている限り、抗体フラグメントを包含する。本明細書における抗体は、対象とする「抗原」を標的する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原（腫瘍関連糖脂質抗原など；米国特許第５，０９１，１７８号参照）に対する抗体も企図される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（たとえば受容体）または増殖因子のようなリガンドであり得る。例示的な抗原としては、それらのポリペプチドが含まれる。
【００４２】
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の部分、一般にその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；一本鎖抗体分子；二重特異性抗体；直鎖状抗体；および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち少量存在し得る天然に起こり得る突然変異を除き、集団を構成する個々の抗体が同一である集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位を標的する。さらに、典型的には種々の抗原決定基（エピトープ）を標的する種々の抗体を含有する従来の（ポリクローナル）抗体製剤と異なり、各々のモノクローナル抗体は抗原上の単一決定基を標的する。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の性質を示し、何らかの特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されるべきではない。たとえば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（たとえば米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、たとえばＣｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７に述べられている手法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００４４】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定種に由来するまたは特定抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同であり、一方鎖の残りの部分は別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、それらが所望生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。
【００４５】
本明細書で使用される場合の「超可変領域」という用語は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち軽鎖可変ドメイン内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））および／または「超可変ループ」からのアミノ酸残基（すなわち軽鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン内の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４６】
非ヒト（たとえばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長動物などの非ヒト種（ドナー抗体）に由来する超可変領域残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体では認められない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改善するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、場合により免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９；およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６参照。１つの実施形態では、ヒト化ＩＬ−１０抗体は米国特許公開公報第２００５／０１０１７７０号に記載されているとおりである。
【００４７】
ＩＩ．概要
本発明は、ワクチンと免疫抑制性サイトカインに対するアンタゴニストの組み合わせで慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法を提供する。
【００４８】
免疫抑制環境が持続性ウイルス感染の間のワクチン接種に対するＴ細胞応答性にどのような影響を及ぼすかを測定するため、以下で述べるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをリンパ球脈絡髄膜炎ウイルスクローン１３（ＬＣＭＶ Ｃｌ １３）に感染させた。ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３による感染は、抗ウイルス免疫を抑制し、ウイルスの持続を導くＩＬ−１０の高レベル発現を速やかに誘導する（たとえば、Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）前出；Ｅｊｍａｅｓら（２００６）前出；およびＡｈｍｅｄら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：５２１−５４０参照）。ＩＬ−１０が治療的ワクチン接種に対する応答性を阻害するかどうかを測定するため、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３持続性感染マウスを、１）アイソタイプ対照抗体単独で処置した；２）アイソタイプ対照抗体で処置し、ＬＣＭＶの全長糖タンパク質（ＧＰ）配列をコードするＤＮＡプラスミドでワクチン接種した；３）抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体で処置した；または４）抗ＩＬ−１０Ｒ遮断抗体プラスＤＮＡワクチン接種の組み合わせで処置した。抗体処置は、Ｃｌ １３感染後２５日目に開始し、３日ごとに５〜６回の処置を実施した。ＤＮＡワクチン接種は、ウイルス感染後２９日目と３４日目（すなわち抗ＩＬ−１０Ｒ治療の開始後４日目と９日目）に実施した。処置レジメンを図１ａに示す。
【００４９】
治療的ワクチン接種が持続性感染の間のＴ細胞応答を刺激できないことと一致して（たとえば、Ｗｈｅｒｒｙら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８９６０−８９６８参照）、ＤＮＡワクチン接種単独では、未処置動物と比較してウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度または数に影響を及ぼさなかった（図１ｂおよびｃ）。他方で、ＩＬ−１０Ｒ遮断は単独で、複数のＬＣＭＶエピトープに対するＩＦＮ−γ産生ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度と数を増加させ（図１ｂおよびｃ）、ＩＬ−１０が持続性感染の間を通じてＴ細胞活性を抑制することおよびＩＬ−１０活性の遮断単独でＴ細胞免疫をブーストできることを示した。重要な点として、ＤＮＡワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、ＤＮＡワクチンまたは抗ＩＬ−１０Ｒ治療単独と比較してＴ細胞応答を著しく増強した（図１ｃ）。抗ＩＬ−１０ＲプラスＤＮＡワクチンの２剤併用療法は、ＩＦＮ−γ産生ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度の２倍増加および細胞数の５倍以上の増加を誘導した。ＣＤ８ Ｔ細胞免疫の同様の増強がＭＨＣクラスＩ四量体染色によって認められた。ＩＬ−１０Ｒ遮断単独で、アイソタイプ処置と比較してＬＣＭＶ核タンパク質（ＮＰ）３９５〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を増加させたが、ＤＮＡワクチン（ＬＣＭＶ−ＧＰエピトープだけを含み、ＬＣＭＶ−ＮＰエピトープを含まない）プラス抗ＩＬ−１０Ｒ治療は、ＬＣＭＶ−ＮＰ３９５〜４０４特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を増強せず、Ｔ細胞刺激がＤＮＡワクチンによるものであり、免疫活性化上昇の二次作用に起因するのではないことを明らかにした（図１ｃ）。ＬＣＭＶ−ＧＰをコードしない親対照ＤＮＡプラスミドによるワクチン接種は、ＩＬ−１０Ｒ遮断と組み合わせた場合もＴ細胞応答をさらに増強することはできず、Ｔ細胞活性の上昇が外来ＤＮＡの導入から生じたのではないことを示した。
【００５０】
ＩＬ−１０Ｒ遮断とそれに続くワクチン接種は、機能性ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を有意に増加させた（図１ｄ）。ワクチン接種単独ではウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞機能を増強せず、ＩＬ−１０Ｒ遮断は単独でＴＮＦ−α産生ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を約２倍だけ増加させたが、ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、ＴＮＦ−αを産生する機能性ＣＤ８ Ｔ細胞数の４倍増加を刺激した（図１ｄ）。前記処置は、ＴＮＦ−α産生ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を実質的に増加させなかった。むしろ、機能性のサイトカイン産生ＣＤ８ Ｔ細胞の絶対数の増加だけが認められた（図１ｄ）。
【００５１】
ＩＬ−１０Ｒ遮断単独では、ＣＤ８ Ｔ細胞に関して認められたほど著明ではないＣＤ４ Ｔ細胞への作用を及ぼし、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４ Ｔ細胞数の小さいが有意の（ｐ＜０．０５）１．５〜２倍増加を誘導した（図２ａおよびｂ）。他方で、ＩＬ−１０Ｒ遮断プラスＤＮＡワクチン療法は、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度および特に数（アイソタイプ処置と比較して６倍の増加）を有意に増加させた（図２ａおよびｂ）。ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の数の同様の増加が、ＭＨＣクラスＩＩ四量体を使用して認められた（データは示していない）。さらに、ＤＮＡワクチンまたは抗ＩＬ−１０Ｒ治療のいずれか単独では、ＩＬ−２産生ＣＤ４ Ｔ細胞の数に控えめな影響を及ぼしたが、併用治療はこれらの機能性細胞の数の４倍増加を刺激した（図２ｂ）。これらのデータは、その他の点では無効のワクチン接種が、ＩＬ−１０媒介性免疫抑制が中和された場合、持続性ウイルス感染において強固なＴ細胞応答を刺激し得ることを明らかにする。
【００５２】
Ｔ細胞機能上昇が、それまで枯渇していたＴ細胞の再活性化によるのかまたはナイーブＴ細胞前駆体の新たなプライミングからであるのかを調べるため、Ｔｈｙ１．１＋Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）トランスジェニック（ｔｇ）ＣＤ４ Ｔ細胞（ＳＭＡＲＴＡ細胞；ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０ペプチドに特異的）およびＴｈｙ１．１＋ ＴｃＲトランスジェニックＣＤ８ Ｔ細胞（Ｐ１４細胞；ＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１ペプチドに特異的）をＴｈｙ１．２＋ Ｃ５７ＢＬ／８マウスに共移入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｒ）し、その後マウスをＬＣＭＶ−Ｃｌ １３に感染させた。共移入は、感染の初期から存在し、Ｔｈｙ１．１対Ｔｈｙ１．２発現に基づいて内因性（すなわち宿主由来）抗ウイルスＴ細胞から区別することができる、ＬＣＭＶ特異的ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の分析を可能にした。それらが内因性ＣＤ４（図２）およびＣＤ８（図１）Ｔ細胞対応物に対しても同様に応答することを確実にするため、これらのｔｇ Ｔ細胞の生理的な数を移入した（たとえば、Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６：１６７５−１６８５参照）。
【００５３】
内因性Ｔ細胞応答（図１および２）と同様に、ＤＮＡワクチン単独はウイルス特異的ｔｇ ＣＤ８またはＣＤ４ Ｔ細胞の数を増加させなかったが、ＩＬ−１０Ｒ遮断はｔｇ ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の数のそれぞれ２倍および４倍増加を刺激した（図３）。ＤＮＡワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、アイソタイプ対照またはＤＮＡワクチン単独で処置したマウスと比較してｔｇウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数の劇的な６倍増加を誘導し、ＩＬ−１０Ｒ遮断単独と比較した場合は〜３倍増加を誘導した（図３ａ）。
【００５４】
同様に、ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、アイソタイプ対照またはワクチン単独と比較してウイルス特異的ｔｇ ＣＤ４ Ｔ細胞の数の１１倍増加、およびＩＬ−１０Ｒ遮断治療単独と比較して４倍増加を刺激した（図３ｂ）。それらの内因性対応物と同じように、併用療法は機能性ウイルス特異的Ｔ細胞（すなわちＴＮＦ−α産生ｔｇ ＣＤ８ Ｔ細胞およびＩＬ−２産生ｔｇ ＣＤ４ Ｔ細胞）の数も増加させた。それゆえ、ＩＬ−１０Ｒ遮断は、それまで枯渇していたＴ細胞がワクチン接種に応答することを可能にする。
【００５５】
ＩＬ−１０Ｒ遮断およびワクチン接種後の機能性ウイルス特異的Ｔ細胞の数の増加が感染の制御を増強したかどうかを測定するため、処置後（すなわち感染後および、それゆえ、３回の抗ＩＬ−１０Ｒ抗体処置後および／または単回ＤＮＡワクチン接種後３３日目）にウイルス力価を定量し、治療前レベルと比較した。Ｔ細胞応答を刺激できなかったことと一致して、ＤＮＡワクチン接種単独はウイルス複製の制御に影響を及ぼさなかった（図４ａ）。これに対し、ＩＬ−１０Ｒ遮断はウイルス力価の１５分の１の低下を誘導した（図４ａ）。
【００５６】
ワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、ウイルス力価の２４分の１の低下を誘導し、併用療法から生じるＴ細胞応答の増強がＩＬ−１０Ｒ遮断単独よりも良好なウイルス複製抑制能力を備えることを示した。共処置後のウイルス除去の促進がわずかに１回のＤＮＡワクチン接種後に認められたことに留意すべきであり、免疫抑制シグナルが中和された場合Ｔ細胞が速やかに応答性になることを示唆した。処置後、ウイルス力価は感染後４０日間を通じてアイソタイプおよびＤＮＡワクチン接種マウスにおけるのと同様であったが、ウイルス複製は抗ＩＬ−１０Ｒ処置マウスにおいて有意に低下し（ｐ＜０．０５）、治療の開始から終了までに１７分の１に低下した（図４ｂ）。重要な点として、抗ＩＬ−１０ＲおよびＤＮＡワクチン共処置マウスにおけるウイルス複製の初期制御促進は、持続性ウイルス感染を制御し、除去する能力の増強をもたらし、最終的には治療の終了後ウイルス複製の４９分の１の低下を生じさせた（図４ｂ）。
【００５７】
ＩＬ−１０Ｒ遮断単独またはＤＮＡワクチン接種と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断後にウイルス感染を除去する一部の動物の能力には相違があった（図４ｂ）。一部の動物は治療後完全にウイルス感染を除去したが、別の同様に処置した動物はまだウイルス複製を保持していた。図４ｂは多数の実験からの統合データを示すことおよび治療前ウイルス力価が実験によって異なっていたことに留意すべきである。しかし、一般により高い治療前ウイルス力価を有する動物は治療後のより高いレベルのウイルス複製に対応し、結果は実験内で有意であった。治療後のウイルス除去の反応速度の相違は、マウスの性別または年齢によるものではなかった。重要な点として、ウイルス複製はＩＬ−１０Ｒ遮断後不在のままであり（感染後＞１５０日間）、処置マウスはその後の再感染から保護された（データは示していない）。興味深いことに、３日ごとの抗ＩＬ−１０Ｒ抗体処置は、持続性ウイルス感染の制御を導くＴ細胞応答をブーストしたが、週に１回の処置は、所要用量の２倍の抗体による処置を含めて、無効であった。それゆえ、抗体治療の時期は治療効果のための重要な決定因子である。対照ＤＮＡワクチン（すなわちＬＣＭＶ ＧＰをコードしない）と組み合わせたＩＬ−１０Ｒ遮断は、抗ＩＬ−１０Ｒ処置単独と比較してウイルス力価に影響を及ぼさず、やはりＤＮＡワクチンの作用増強はＬＣＭＶ特異的細胞の刺激に起因することを明らかにした。それゆえ、ＩＬ−１０媒介性免疫抑制を中和することは、持続性ウイルス感染を制御する高い能力を備えた強固なウイルス特異的Ｔ細胞応答の誘導を促進する。
【００５８】
ウイルス媒介性免疫抑制経路に拮抗する併用療法は、抗ウイルスＴ細胞活性の回復とブースティング、ならびに単剤と比較した場合の相乗作用を示した。１つのそのような併用療法は、前述したＬＣＭＶマウスにおいて持続性ウイルス感染を除去するための、ＩＬ−１０Ｒに対する抗体とＰＤ−Ｌ１に対する抗体の使用であった。マウスモデルにおけるＰＤ−Ｌ１およびＩＬ−１０に対する遮断抗体の投与は、それまで枯渇していたウイルス特異的Ｔ細胞のレベルを上昇させ（図５ａ参照）、ＩＮＦ−γ／ＴＮＦ−α産生細胞のレベルも上昇させた（図５ｂ参照）。
【００５９】
また、ＩＬ−１０Ｒ／ＰＤ−Ｌ１の二重遮断も、持続性ウイルス複製を制御する能力の増強を導くと判定された。ＩＬ−１０およびＰＤ−Ｌ１抗体を単独でまたは組み合わせて投与する２週間の治療レジメン後、併用療法を受けたマウスは、単剤治療および対照動物と比較してウイルス除去の有意の上昇を示した（たとえば図６ａ参照）。ウイルス力価も、アイソタイプ対照処置動物と比較して抗体処置動物の肝臓において低下した（図６ｂ参照）。ＩＬ−１０とＰＤ−Ｌ１の拮抗作用の組み合わせは、各々の処置単独よりも有効に、枯渇したＣＤ８＋ Ｔ細胞の回復を誘導すると思われる（たとえば図７参照）。
【００６０】
ＩＩＩ．発現ベクター
多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせ（すなわち発現系）が、本発明の免疫原性ポリペプチドを発現するときに使用され得る。有用な発現ベクターは、たとえば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントで構成され得る。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体および公知の細菌プラスミド、たとえば大腸菌プラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ＳＶ４０およびｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０，１９８８）、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；Ｓｔｒｅｐ．ｇａｒｄｏｎｉｉのようなグラム陽性ベクター；ファージＤＮＡＳ、たとえばファージｌの数多くの誘導体、たとえばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、たとえばＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；２ｍプラスミドまたはその誘導体のような酵母プラスミド；昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターのような、真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するように改変されたプラスミドのような、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター等が含まれる。
【００６１】
タンパク質またはポリペプチドの発現は、当技術分野で公知の何らかのプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得るが、これらの調節エレメントは発現のために選択される宿主において機能性でなければならない。遺伝子発現を制御するために使用し得るプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）；“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ” ｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４，１９８０も参照のこと；Ｇａｌ ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の真菌からのプロモーターエレメント；およびリンパ系細胞において活性である、造血組織特異性を示す制御領域、特に免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら（１９８４）Ｃｅｌｌ ３８：６４７；Ａｄａｍｅｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６）；骨髄系細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；造血幹細胞分化因子プロモーター；エリスロポエチン受容体プロモーター（Ｍａｏｕｃｈｅら（１９９１）Ｂｌｏｏｄ １５：２５５７）等；ならびに粘膜上皮細胞特異性を示す制御領域を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
好ましいベクター、特にインビトロでの細胞アッセイおよびインビボまたはエクスビボでのワクチン接種のための好ましいベクターは、ウイルスベクター、たとえばレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、鶏痘ウイルス、ＡＶポックスウイルス、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスおよび望ましい細胞向性を有する他の組換えウイルスである。特定の実施形態では、ワクシニアウイルスベクターが樹状細胞を感染させるために使用される。もう１つの特定の実施形態では、ＥＢＮＡ−１を発現するバキュロウイルスベクターが作製される。それゆえ、免疫原性ポリペプチドをコードするベクターは、ウイルスベクターを使用してまたはＤＮＡの直接導入を通して、インビボ、エクスビボまたはインビトロで導入することができる。標的組織における発現は、ウイルスベクターもしくは受容体リガンドのような、トランスジェニックベクターを特定細胞に標的することによって、または組織特異的プロモーターを使用することによって、またはその両方によって実施され得る。標的化遺伝子送達は、１９９５年１０月公開の国際特許公報第ＷＯ９５／２８４９４号に記載されている。
【００６３】
インビボまたはエクスビボでのターゲティングおよびワクチン接種手順のために一般的に使用されるウイルスベクターは、ＤＮＡに基づくベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、使用するための方法は当技術分野において公知である（たとえば、ＭｉｌｌｅｒとＲｏｓｍａｎ（１９９２）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０参照）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損性である、すなわちそれらは標的細胞において自律複製することができない。好ましくは、複製欠損ウイルスは最小ウイルスである、すなわちゲノムをキャプシド形成してウイルス粒子を生成するために必要なそのゲノムの配列だけを保持する。
【００６４】
ＤＮＡウイルスベクターは、たとえば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス等のような、しかしこれらに限定されない、弱毒化または欠損ＤＮＡウイルスを含む。特定ベクターの例としては、欠損ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０；１９９４年９月２９日公開の国際特許公報第ＷＯ９４／２１８０７号；１９９４年４月２日公開の国際特許公報第ＷＯ９２／０５２６３号）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０によって述べられたベクターのような（Ｌａ Ｓａｌｌｅら（１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０も参照のこと）、弱毒化アデノウイルスベクター；および欠損アデノ関連ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
様々な会社が商業的にウイルスベクターを生産しており、Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ，Ｐａ．；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶおよびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；レンチウイルスベクター）、ならびにＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ；アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
アデノウイルスベクター。アデノウイルスは、本発明の核酸を様々な細胞型に効率的に送達するように改変され得る真核生物ＤＮＡウイルスである。様々な血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型のうちで、本発明の範囲内では、２型もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（国際特許公報第ＷＯ９４／２６９１４号参照）を使用することが好ましい。本発明の範囲内で使用できる動物起源のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、マウス（例：Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５（１）：８１−９０）、ヒツジ、ブタ、鳥類およびサル（例：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスを含む。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（たとえばＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００））である。様々な複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記述されている（国際特許公報第ＷＯ９４／２６９１４号、同第ＷＯ９５／０２６９７号、同第ＷＯ９４／２８９３８号、同第ＷＯ９４／２８１５２号、同第ＷＯ９４／１２６４９号、同第ＷＯ９５／０２６９７号、同第ＷＯ９６／２２３７８号）。本発明による複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の何らかの手法によって作製できる（Ｌｅｖｒｅｒｏら（１９９１）Ｇｅｎｅ １０１：１９５；欧州特許第ＥＰ １８５ ５７３号；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２９１７；Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）。組換えアデノウイルスはヒト樹状細胞のための効率的で非撹乱性のベクターである（Ｚｈｏｎｇら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（３）：９６４−７２；ＤｉＮｉｃｏｌａら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｍ Ｔｈｅｒ．５：３５０−６，１９９８）。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の標準分子生物学手法を用いて回収され、精製される。
【００６７】
アデノ関連ウイルス。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、それらが感染する細胞のゲノム内に安定且つ部位特異的に組み込まれ得る、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは、細胞の増殖、形態または分化へのいかなる作用も誘導することなく広いスペクトルの細胞に感染することができ、ヒトの病理に関与しないと思われる。ＡＡＶゲノムはクローン化され、配列決定され、特徴づけられている。遺伝子をインビトロおよびインビボで移入するためのＡＡＶに由来するベクターの使用が記述されている（国際特許公報第ＷＯ９１／１８０８８号；国際特許公報第ＷＯ９３／０９２３９号；米国特許第４，７９７，３６８号、米国特許第５，１３９，９４１号、欧州特許第ＥＰ ４８８ ５２８号参照）。本発明による複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域に隣接された対象とする核酸配列を含むプラスミドと、ＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を担持するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（たとえばアデノウイルス）に感染している細胞系に同時トランスフェクトすることによって作製できる。作製されたＡＡＶ組換え体は、その後、標準的な手法によって精製される。これらのウイルスベクターも、ヒト樹状細胞への遺伝子導入のために有効である（ＤｉＮｉｃｏｌａら、前出）。
【００６８】
レトロウイルス。もう１つの実施形態では、遺伝子を、たとえばＡｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５，１２４，２６３号；欧州特許第ＥＰ ４５３２４２号、同第ＥＰ １７８２２０号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによる、１９９５年３月１６日公開の国際特許公報第ＷＯ９５／０７３５８号；およびＫｕｏら（１９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：８４５に記載されているように、レトロウイルスベクターに導入することができる。レトロウイルスは分裂細胞に感染する組込み型ウイルスである。レトロウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、キャプシド形成配列および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は一般に全体的または部分的に欠失しており、対象とする異種核酸配列で置換されている。これらのベクターは、種々のタイプのレトロウイルスから、たとえばＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフレンドウイルスから構築できる。適切なパッケージング細胞系は先行技術において記述されており、特にＰＡ３１７細胞系（米国特許第４，８６１，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系（国際特許公報第ＷＯ９０／０２８０６号）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系（国際特許公報第ＷＯ８９／０７１５０号）が挙げられる。加えて、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲ内の修飾ならびにｇａｇ遺伝子の一部を含み得る広範囲のキャプシド形成配列を含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１６３９）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準的な手法によって精製される。
【００６９】
レトロウイルスベクターはまた、１サイクルのレトロウイルス複製を許容し、トランスフェクション効率を増強する、ＤＮＡウイルスによっても導入され得る（国際特許公報第ＷＯ９５／２２６１７号、同第ＷＯ９５／２６４１１号、同第ＷＯ９６／３９０３６号、同第ＷＯ９７／１９１８２号参照）。
【００７０】
レンチウイルスベクター。もう１つの実施形態では、レンチウイルスベクターが、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含むいくつかの組織型における導入遺伝子の直接送達および持続的発現のための作用因子として使用できる。このベクターは、分裂および非分裂細胞をこれらの組織に効率よく形質導入し、対象とする遺伝子の長期的な発現を維持することができる。総説については、Ｎａｌｄｉｎｉ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４５７−６３参照；また、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−８０も参照のこと。レンチウイルスパッケージング細胞株が使用可能であり、一般に当技術分野で公知である。それらは、遺伝子治療のための高力価レンチウイルスベクターの生産を促進する。一例は、１０６ＩＵ／ｍｌ以上の力価で少なくとも３〜４日間ウイルス粒子を生成することができるテトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇ偽型化レンチウイルスパッケージング細胞株である（Ｋａｆｒｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５７６−５８４）。誘導性細胞株によって生産されるベクターは、インビトロおよびインビボで非分裂細胞を効率的に形質導入するために必要に応じて濃縮できる。
【００７１】
ワクシニアウイルスベクター。ワクシニアウイルスはポックスウイルスファミリーの成員であり、その大きなサイズと複雑さによって特徴づけられる。ワクシニアウイルスＤＮＡは二本鎖であり、ＤＮＡの変性時に一本鎖の環が形成されるように末端で架橋されている。このウイルスは、痘瘡に対するワクチン中で約２００年間使用されており、ワクチンにおいて使用した場合のウイルスの性質は公知である（Ｐａｏｌｅｔｔｉ（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１１３４９−５３；およびＥｌｌｎｅｒ（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２６：２６３−９）。ワクシニアウイルスによるワクチン接種の危険度は周知で、明確に定義されており、このウイルスは比較的良性とみなされる。ワクシニアウイルスベクターは、外来遺伝子の挿入と発現のために使用できる。外来遺伝子をワクシニアベクターに挿入し、ワクシニアウイルスの合成組換え体を作製する基本的な手法が記述されている（米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７６９，３３０号および同第５，３６４，７７３号参照）。多数の外来（すなわち非ワクシニア）遺伝子がワクシニアにおいて発現されており、しばしば防御免疫を生じさせる（Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ、ＢａｒｒｅｔｔおよびＫａｉ（１９９８）Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１７：６４１−５３により総説されている；Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９９７）Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５９：３１１−２２；ならびにＯｓｔｅｒｈａｕｓら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１４７９−８１：およびＧｈｅｒａｒｄｉら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６７２４−３３参照）。ワクシニアウイルスは免疫不全または免疫抑制個体への投与には不適切であると考えられる。本発明において使用し得る選択的なポックスウイルスは、鶏痘ウイルス、ＡＶポックスウイルスおよび改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスを含む。
【００７２】
非ウイルスベクター。もう１つの実施形態では、ベクターは、リポフェクションによって、裸のＤＮＡとして、または他のトランスフェクション促進物質（ペプチド、ポリマー等）を用いてインビボで導入することができる。合成カチオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクション用のリポソームを作製するために使用できる（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３−７４１７；ＦｅｌｇｎｅｒとＲｉｎｇｏｌｄ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：３８７−３８８；Ｍａｃｋｅｙら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７−８０３１；Ｕｌｍｅｒら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４８参照）。核酸の移入のための有用な脂質化合物および組成物は、国際特許公報第ＷＯ９５／１８８６３号および同第ＷＯ９６／１７８２３号、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。脂質は、ターゲティングのために他の分子に化学的に結合し得る（Ｍａｃｋｅｙら、前出参照）。標的ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合し得る。
【００７３】
他の分子、たとえばカチオン性オリゴペプチド（たとえば国際特許公報第ＷＯ９５／２１９３１号）、ＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド（たとえば国際特許公報第ＷＯ９６／２５５０８号）、またはカチオン性ポリマー（たとえば国際特許公報第ＷＯ９５／２１９３１号）も、インビボで核酸のトランスフェクションを促進するために有用である。
【００７４】
あるいは、遺伝子治療のための非ウイルスＤＮＡベクターは、当技術分野で公知の方法、たとえば電気穿孔法、微量注入法、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用（パーティクルガントランスフェクション；たとえば、米国特許第５，２０４，２５３号、同第５，８５３，６６３号、同第５，８８５，７９５号および同第５，７０２，３８４参照、ならびにＳａｎｆｏｒｄ，ＴＩＢ−ＴＥＣＨ，６：２９９−３０２，１９８８；Ｆｙｎａｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１４７８−１１４８２；およびＹａｎｇら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１５６８−９５７２参照）、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用（たとえば、Ｗｕら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；ＷｕとＷｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１−１４６２４；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２７２６−２７３０参照）。受容体を介したＤＮＡ送達アプローチも使用できる（Ｃｕｒｉｅｌら（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４；ＷｕとＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）。米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号は、哺乳動物における、トランスフェクション促進剤を使用しない外来ＤＮＡ配列の送達を開示する。最近、エレクトロトランスファーと称される、比較的低電圧で高い効率のインビボＤＮＡ導入手法が記述された（Ｍｉｒら（１９９８）Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３２１：８９３；国際特許公報第ＷＯ９９／０１１５７号；同第ＷＯ９９／０１１５８号；同第ＷＯ９９／０１１７５号）。
【００７５】
ＩＶ．ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒアンタゴニスト
ＩＬ−１０のアンタゴニストは、標準的なワクチン療法と共に投与される。本明細書で使用されるＩＬ−１０のアンタゴニストは、中和抗体またはそのフラグメント、ＩＬ−１０アンチセンスＤＮＡ、ＩＬ−１０Ｒ可溶性受容体および／または受容体融合タンパク質（たとえばＦｃ融合タンパク質）、ＩＬ−１０Ｒに結合するが、受容体複合体のシグナル伝達を生じさせないＩＬ−１０突然変異体タンパク質を包含する。１つの特定の実施形態では、ＩＬ−１０Ｒ融合タンパク質が企図される。
【００７６】
Ｖ．抗体
本発明により精製される好ましいタンパク質は抗体である。本明細書における抗体は、対象とする抗原を標的する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の利益をもたらし得る。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（たとえばサイトカイン受容体）または増殖因子もしくはサイトカインのようなリガンドであり得る。
【００７７】
本明細書における抗体は、対象とする抗原、たとえばヒトＩＬ−１０Ｒを標的する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害に罹患している哺乳動物への抗体の投与は、その哺乳動物において治療上の利益をもたらし得る。しかし、非ポリペプチド抗原（腫瘍関連糖脂質抗原など；米国特許第５，０９１，１７８号参照）に対する抗体も企図される。抗原がポリペプチドである場合、それは膜貫通分子（たとえばサイトカイン受容体）または増殖因子もしくはサイトカインのようなリガンドであり得る。
【００７８】
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連抗原およびアジュバントの多回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物において惹起される。二官能性試薬または誘導体化剤、たとえばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲとＲ１は異なるアルキル基である］を使用して、抗原を、免疫される種において免疫原性であるタンパク質、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビターに結合することは有用であり得る。
【００７９】
たとえば、タンパク質または結合体１００μｇまたは５μｇ（それぞれウサギまたはマウスに関して）を３容量のフロイント完全アジュバントと組み合わせ、その溶液を多数の部位に皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性結合体または誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、フロイント完全アジュバント中の最初の量の１／５〜１／１０の抗原または結合体を多数の部位に皮下注射することにより、動物をブーストする。７〜１４日後、動物から採血し、血清を抗体力価に関して検定する。力価が横ばい状態に達するまで動物をブーストする。好ましくは、同じ抗原の結合体であるが、異なるタンパク質に結合したおよび／または異なる架橋試薬を介して結合した結合体で動物をブーストする。結合体はまた、組換え細胞培養中でタンパク質融合物として作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤も免疫応答を増強するために適切に使用される。
【００８０】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５によって最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して作製し得るか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製し得る。
【００８１】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、たとえばハムスターもしくはマカクザルなどを本明細書中で前述したように免疫し、免疫のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次に、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００８２】
このようにして作製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１またはそれ以上の物質を含有する適切な培地に接種し、増殖させる。たとえば、親骨髄腫細胞が酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する（ＨＡＴ培地）。
【００８３】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系統、たとえばＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡより入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、ならびにｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡより入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【００８４】
ハイブリドーマ細胞が増殖中である培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生に関して検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法によってまたは放射免疫検定法（ＲＩＡ）もしくは固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって測定される。
【００８５】
所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によってサブクローニングし、標準的な方法によって増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。このための適切な培地としては、たとえばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖させてもよい。
【００８６】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、たとえば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地、腹水または血清から適切に分離される。好ましくは、本明細書で述べるプロテインＡクロマトグラフィー手順が使用される。
【００８７】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（たとえば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ひとたび単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに組み込むことができ、次にそれを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得ることができる。
【００８８】
ＤＮＡはまた、たとえば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコード配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１）、または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部または一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結することによって修飾し得る。
【００８９】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドで抗体の定常ドメインを置換するか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインをそれらで置換して、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作製する。
【００９０】
さらなる実施形態では、モノクローナル抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４に記載されている手法を使用して生成される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７は、それぞれファージライブラリーを使用したマウスおよびヒト抗体の単離を述べている。その後の公表文献は、鎖シャフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６）を述べている。ゆえに、これらの手法は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なハイブリドーマ手法に対する実施可能な代替法である。
【００９１】
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称され、典型的には「輸入」可変ドメインから取り込まれる。ヒト化は、基本的には、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって実施できる。従って、そのような「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応する配列によって置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際に、ヒト化抗体は、典型的には一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のＦＲ残基がげっ歯動物抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００９２】
ヒト化抗体を作製するときに使用される、軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯動物抗体の可変ドメインの配列を公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に、げっ歯動物のものに最も近いヒト配列をヒト化抗体のためのヒトＦＲとして受け入れる（Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６）。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖の特定サブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定フレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体のために使用してもよい（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３）。
【００９３】
抗体が、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化されることはさらに重要である。この目標を達成するため、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列および様々な概念的ヒト化生成物を分析する工程によって作製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配座構造を描画し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する高い親和性のような所望抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列および輸入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は抗体結合への影響に直接且つ最も実質的に関与する。
【００９４】
あるいは、今や、免疫したとき、内因性免疫グロブリン産生を伴わずにヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（たとえばマウス）を作製することが可能である。たとえば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じさせることが記述されている。そのような生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原誘発したときヒト抗体の産生をもたらす。たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ．３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら（１９９３）Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３；およびＤｕｃｈｏｓａｌら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：２５８参照。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーから誘導することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７；Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３０９）。
【００９５】
抗体フラグメントの作製のために様々な手法が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントは無傷抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（たとえば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１参照）。しかし、これらのフラグメントは、今や、組換え宿主細胞によって直接生成され得る。たとえば、抗体フラグメントは、前記で論じた抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収し、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７）。もう１つのアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの作製のための他の手法は当業者に明白である。他の実施形態では、選択抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。国際特許公報第ＷＯ９３／１６１８５号参照。
【００９６】
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。そのような分子は通常２つの抗原とだけ結合するが（すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合この表現に包含される。
【００９７】
二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野において公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な作製は、２本の鎖が異なる特異性を有する、２本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ．３０５：５３７−５３９）。免疫グロブリン重鎖と軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、そのうち１つだけが正しい二重特異性構造を有する。通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって実施される正しい分子の精製はかなり面倒であり、生成物の収率は低い。同様の手順が、国際特許公報第ＷＯ９３／０８８２９号およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９に開示されている。
【００９８】
国際特許公報第ＷＯ９６／２７０１１号に記載されている別のアプローチによれば、抗体分子の対の間の境界（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化するように操作することができる。好ましい境界は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の境界からの１またはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（たとえばチロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（たとえばアラニンまたはトレオニン）で置換することにより、大きな側鎖と同一または類似のサイズの代償的な「キャビティー（ｃａｖｉｔｉｅｓ）」が第２抗体分子の境界上に形成される。これにより、ホモ二量体のような他の望ましくない最終生成物に比べてヘテロ二量体の収率を高めるための機構が提供される。
【００９９】
二重特異性抗体としては、架橋抗体または「ヘテロ結合体」抗体が含まれる。たとえば、ヘテロ結合体中の抗体の１つはアビジンに結合し、他方はビオチンに結合することができる。そのような抗体は、たとえば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的するため（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の治療のために（国際特許公報第ＷＯ９１／００３６０号、同第ＷＯ９２／２００３７３号および欧州特許第ＥＰ ０３０８９号）提案された。ヘテロ結合体抗体は、何らかの従来の架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号において多くの架橋手法と共に開示されている。
【０１００】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製するための手法も文献に記載されている。たとえば、二重特異性抗体は化学結合を用いて作製できる。Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１は、無傷抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を述べている。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、生成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための作用物質として使用できる。
【０１０１】
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収が容易になり、それらのフラグメントを化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製を述べている。各々のＦａｂ’フラグメントを大腸菌から別々に分泌させ、二重特異性抗体を形成するためにインビトロで直接化学結合に供した。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１０２】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製し、単離するための様々な手法も記述されている。たとえば、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が作製された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。この抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次に再酸化して、抗体のヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の作製のためにも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８によって述べられた「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための選択的な機構を提供した。前記フラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインの間での対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインとＶＬドメインは別のフラグメントの相補的なＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合することを強いられ、それにより２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の方策も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８参照。あるいは、抗体は、Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２に記載されているような「直鎖状抗体」であり得る。簡単に述べると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対の縦列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。米国特許公開公報第ＵＳ２００７／００７１６７５号に記載されている、二重可変ドメイン抗体（Ｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）も企図される。
【０１０３】
１つの実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、たとえば、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第ＵＳ２００５／０１０１７７０号および同第ＵＳ２００７／０１７８０９７号に記載されているヒト化抗ＩＬ−１０抗体である。
【０１０４】
ＶＩ．ワクチン接種および免疫治療方法
慢性または持続性ウイルス感染に対して対象をワクチン接種するために様々な方法が使用できる。ポリペプチドワクチン製剤は、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、真皮下（ｓ．ｄ．）、皮内（ｉ．ｄ．）経路によって、またはエクスビボでの抗原提示細胞への投与とそれに続く対象への前記細胞の投与によって送達することができる。対象への投与の前に、抗原提示細胞を誘導して成熟させてもよい。
【０１０５】
同様に、たとえば遺伝子銃または直接注入による、裸のＤＮＡおよびＲＮＡ送達のような、前述した遺伝子送達方法のいずれもがベクターワクチンを対象に投与するために使用できる。
【０１０６】
ワクチン接種の有効性は、免疫刺激分子、たとえば免疫刺激性、免疫増強性もしくはプロ炎症性サイトカイン、リンホカインまたはケモカインをワクチンと共に、特にベクターワクチンと共に同時投与することによって増強され得る（ＳａｌｇａｌｌｅｒとＬｏｄｇｅ（１９９８）Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６８：１２２）。たとえば、サイトカインまたはサイトカイン遺伝子、たとえばインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド（Ｌｙｍａｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５：１９２）、ならびにいくつかの鍵となる共刺激分子またはそれらの遺伝子（たとえばＢ７．１、Ｂ７．２）が使用できる。これらの免疫刺激分子は、タンパク質として全身的または局所的に送達され得るか、または分子の発現をコードするベクターの発現によって送達され得る。あるいは、本明細書で述べるように、ワクチンは、免疫抑制分子、たとえばＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒのアンタゴニストと共に投与することができる。免疫原性ポリペプチドの送達に関して前述した手法が免疫刺激分子についても使用できる。
【０１０７】
ワクチン接種および特に免疫療法は、樹状細胞のターゲティングを通して達成され得る（Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２８：５３１；Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９；Ｔａｉｔｅら（１９９９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １３：６５３；Ａｖｉｇａｎ（１９９９）Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１３：５１；ＤｉＮｉｃｏｌａら（１９９８）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：２６５）。樹状細胞はＴ細胞依存性免疫の活性化において決定的な役割を果たす。増殖中の樹状細胞は、免疫原性形態のタンパク質抗原をインサイチューで捕捉し、次に、Ｔ細胞によって認識され得る形態でこれらの抗原を提示して、Ｔ細胞を刺激するために使用できる（たとえば、Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６）Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９−８６２；Ｉｎａｂａら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２１６３−７３および米国特許第５，８５１，７５６号参照）。エクスビボでの刺激のためには、樹状細胞を培養皿に塗布し、抗原が樹状細胞に結合するのに十分な量で十分な期間、抗原に暴露する（抗原でパルスする）。加えて、樹状細胞を、Ｚｈｏｎｇら（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：９６４−７２；Ｖａｎ Ｔｅｎｄｅｌｏｏら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：７００−７；Ｄｉｅｂｏｌｄら（１９９９ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：７７５−８６；ＦｒａｎｃｏｔｔｅとＵｒｂａｉｎ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８１４９および米国特許第５，８９１，４３２号（Ｃａｓａｒｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１４８１−６）によって述べられたように様々な物理的または化学的手段を使用してＤＮＡでトランスフェクトし得る。パルスした細胞を、次に、たとえば静脈内注射によって、治療を受けている対象に移植することができる。好ましくは、自己樹状細胞、すなわち治療を受けている対象から得た樹状細胞を使用するが、タイプ適合性ドナーからまたは所望ＭＨＣ分子を発現する（および好ましくは望ましくないＭＨＣ分子の発現を抑制する）ように樹状細胞を遺伝子操作することによって入手し得る、ＭＨＣクラスＩＩ適合性樹状細胞を使用することも可能であり得る。
【０１０８】
好ましくは、樹状細胞は、慢性または持続性感染を引き起こすウイルスに関連するウイルスペプチドの発現のためにインビボで特異的に標的される。抗原提示を媒介する受容体、たとえばＤＥＣ−２０５（Ｓｗｉｇｇａｒｄら（１９９５）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：３０２−１１；Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９６）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９）およびＦｃ受容体を利用することにより、インビボで樹状細胞を標的するために様々な方策が使用可能である。前記で論じた標的ウイルスベクターも使用できる。加えて、樹状細胞は、ウイルスベクターによる感染後、インビボでの移植の前に、インビトロで誘導して成熟させてもよい。
【０１０９】
粘膜ワクチンストラテジは、感染がしばしば粘膜を介して起こるので、多くの病原性ウイルスに対して特に有効である。加えて、組換えワクシニアウイルスワクチンの粘膜送達は、以前の痘瘡ワクチン接種によるポックスウイルスに対する既存免疫を克服できると考えられる（Ｂｅｌｙａｋｏｖら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：４５１２−７）。粘膜は、ＥＢＮＡ−１ワクチンおよび免疫療法にとっての重要な標的である樹状細胞を保有する。それゆえ、ポリペプチドおよびＤＮＡワクチンの両方について粘膜ワクチン接種法が企図される。粘膜はワクチンの局所送達によって標的され得るが、様々な方策が免疫原性タンパク質を粘膜に送達するために使用されてきた（これらの方策には、たとえば、タンパク質を標的するベクターとして特異的粘膜標的タンパク質を使用することによる、または粘膜標的タンパク質と混合してワクチンベクターを送達することによる、ＤＮＡワクチンの送達も含まれる）。
【０１１０】
たとえば、特定の実施形態では、免疫原性ポリペプチドまたはベクターワクチンは、コレラ毒素Ｂおよび／もしくはコレラ毒素Ａ／Ｂキメラのようなコレラ毒素と混合して、またはコレラ毒素との結合体もしくはキメラ融合タンパク質として投与することができる（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：４３２２−３２；ＪｏｂｌｉｎｇとＨｏｌｍｅｓ（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６０：４９１５−２４）。コレラ毒素Ｂサブユニットの使用に基づく粘膜ワクチンが記述されている（ＬｅｂｅｎｓとＨｏｌｍｇｒｅｎ（１９９４）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ８２：２１５−２７）。もう１つの実施形態では、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）との混合物を粘膜ワクチン接種のために調製することができる。
【０１１１】
他の粘膜免疫法としては、免疫原をマイクロカプセルに封入すること（米国特許第５，０７５，１０９号、同第５，８２０，８８３号および同第５，８５３，７６３号）ならびに免疫増強性膜担体を使用すること（国際特許公報第ＷＯ９８／０５５８号）が含まれる。経口投与される免疫原の免疫原性は、赤血球（ｒｂｃ）もしくはｒｂｃゴーストを使用すること（米国特許第５，６４３，５７７号）、またはブルータング（ｂｌｕｅ ｔｏｎｇｕｅ）抗原を使用すること（米国特許第５，６９０，９３８号）によって増強され得る。標的免疫原の全身投与も粘膜免疫を生じさせることができる（米国特許第５，５１８，７２５号参照）。
【０１１２】
ＶＩＩ．医薬組成物および投与
本発明による、および本発明に従った使用のための医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に受容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の物質を含有し得る。そのような物質は非毒性であるべきであり、有効成分の効果を妨げてはならない。担体または他の物質の正確な性質は投与の経路に依存し、投与の経路は、好ましくは注射、たとえば皮膚、皮下または皮内注射によってであるが、当業者にとって好都合ないかなる経路によってもよい。
【０１１３】
注射に関して、有効成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。薬学的に受容可能であり、好ましいと考えられる適切な希釈剤は既に前記で論じている。
【０１１４】
医薬組成物が錠剤、カプセル、粉末または液体形態であり得る場合、経口投与を使用し得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体担体を含有し得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含有する。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール類、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールも含有され得る。
【０１１５】
ワクチンは、たとえば気道の適切な部分に移動する大きさの粒子を含む、適切な製剤を使用して、エアロゾルによって気道に投与し得る。これは、水性懸濁液ではなく乾燥粉末でもよい。
【０１１６】
本発明の組成物は、魚類、両生類、鳥類および哺乳動物（哺乳動物としてはサル、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコおよびヒトが含まれるが、これらに限定されない）を含む、いかなる動物にも投与できる。組成物は、たとえば筋肉内、経口、皮下、皮内、膣内、直腸または鼻内投与のような、何らかの適切な投与方法によって投与され得る。好ましい投与方法は、経口、静脈内、皮下、筋肉内または皮内投与である。最も好ましい方法は、皮下投与を含む非経口投与である。
【０１１７】
必要な場合はブースター投与を含む、投与の頻度、および免疫に関連する他の技術は当業者に周知であり、既に記述または決定されていない場合は、過度の実験を必要とせずに実施できる。たとえば、本発明の組成物の適切な免疫防御性で非毒性且つ固有の免疫応答誘導量は、従来のワクチン中の抗原の有効量の範囲内であり得る。しかし、何らかの特定対象についての特定用量レベルは、対象の年齢、全般的健康状態、性別および食事を含む様々な因子に依存する。用量レベルに影響を及ぼす他の因子としては、投与の時間、投与の経路、投与される何らかの他の薬剤の相乗作用性、相加性または拮抗性相互作用、および求められる防御の量または免疫応答の誘導のレベルが含まれるが、これらに限定されない。たとえば、混合ワクチンでは、本発明のワクチンの用量は、その他のワクチン成分の干渉を相殺するように高める必要があり得る。
【０１１８】
本発明の組成物、たとえばウイルス特異的ワクチンとＩＬ−１０アンタゴニストを含有する治療用ワクチンは、当業者に周知の方法を用いて他のワクチンと組み合わせて使用できる。ウイルスワクチンとしては、ウイルスまたは疾患に対するもの、たとえば肝炎、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルス、痘瘡ウイルス、ＨＩＶ、水痘、耳下腺炎および麻疹に対するものが含まれるが、これらに限定されない。特定ウイルスへの暴露およびその後のワクチンまたは混合ワクチンの投与の様々なレジメンが含まれ、本明細書で提供される開示に基づき、当業者に周知の方法を使用して決定され得る。
【０１１９】
ウイルス特異的Ｔｈ１免疫応答を誘導する突然変異ウイルスまたは他の作用物質を、薬学的に受容可能な担体または希釈剤と共に投与することができる。そのような薬学的に受容可能な担体または希釈剤の例としては、水、リン酸緩衝食塩水または重炭酸ナトリウム緩衝液が含まれる。多くの他の許容される担体または希釈剤も当技術分野において公知である。
【０１２０】
ＶＩＩＩ．キット
本発明はさらに、ウイルスに対するワクチンおよび／またはその薬学的に受容可能な組成物ならびに免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび／またはその薬学的に受容可能な組成物、ならびに投与のための指示を含むキットを対象とする。特定の実施形態では、ワクチンと中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体は、別々にまたは一緒に包装され得る。さらに、キットは他の生物学的製剤も含み得る。
【０１２１】
本発明の広い範囲は以下の実施例を参照して最もよく理解され、それらの実施例は本発明を特定の実施形態に限定することを意図しない。
【実施例】
【０１２２】
Ｉ．一般的方法
生化学および分子生物学の標準的な方法は、たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されているまたは参照されている。標準的な方法はまた、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹにも認められ、これは、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、糖結合体およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を述べている。
【０１２３】
免疫沈降法、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含む、タンパク質精製のための方法が記述されている。Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化も記述されている。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ．，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１参照。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作製、精製およびフラグメント化は記述されている。Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、前出。リガンド／受容体相互作用を特徴づけるための標準的な手法は利用可能である。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。
【０１２４】
蛍光活性化細胞選別検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含む、フローサイトメトリーのための方法は利用可能である。たとえば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ参照。たとえば診断試薬としての使用のための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチドならびに抗体を含む、核酸を修飾するのに適した蛍光試薬が使用可能である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ。
【０１２５】
免疫系の組織学的検査の標準的な方法は記述されている。たとえば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編集）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照。
【０１２６】
たとえば抗原性フラグメント、リーダー配列、タンパク質の折りたたみ、機能性ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウエアパッケージおよびデータベースは利用可能である。たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎら（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０参照。
【０１２７】
ＩＩ．マウスおよびウイルス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｔｈｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｏｌｏｎｙ（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）より入手した。使用したＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０特異的ＣＤ４＋ ＴｃＲトランスジェニック（ＳＭＡＲＴＡ）マウスおよびＬＣＭＶ−ＧＰ３３〜４１特異的Ｃ８＋トランスジェニック（Ｐ１４）マウスは、Ｏｘｅｎｉｕｓら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３９０−４００に記載されている。すべてのマウスをＮＩＨおよびＩＡＣＵＣガイドラインに従って病原体不含条件に収容した。
【０１２８】
マウスを静脈内経路で２×１０８プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＬＣＭＶ−ＡｒｍまたはＬＣＭＶ−Ｃｌ １３に感染させた。ウイルス株を調製し、Ｂｏｒｒｏｗら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１０５９−１０７０に述べられているようにウイルス力価を定量した。すべての実験は各群につき３〜６匹のマウスを含み、少なくとも３回反復された。
【０１２９】
ＩＩＩ．Ｔ細胞の単離と移入
ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を、負の選択によりそれぞれナイーブＳＭＡＲＴＡおよびＰ１４マウスの脾臓から精製した（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）。各々の集団からの１０００の精製細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内経路で共移入した。これらのトランスジェニックＴ細胞集団の各々は、四量体分析および細胞内サイトカイン染色に基づき、それらの内因性（すなわち宿主由来）Ｔ細胞対応物と同様に挙動する（たとえば、Ｗｈｅｒｒｙら（２００３）前出；およびＢｏｒｒｏｗら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１０５９−１０７０参照）。ＳＭＡＲＴＡおよびＰ１４細胞の数を、フローサイトメトリーによって測定されたＴｈｙ１．１＋細胞の頻度に脾細胞の総数を乗じることによって決定した。
【０１３０】
ＩＩＩ．定量的ＰＣＲ
全脾単核細胞からのＲＮＡを得て、Ｂｒｏｏｋｓら（２００６）前出に述べられているように増幅した。ＲＮＡ発現を投入濃度（ｉｎｐｕｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）によって正規化し、Ｑｉａｇｅｎ ＯＮＥ−ＳＴＥＰ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して増幅した。ＩＬ−１０ ＲＮＡを増幅するためにＡＳＳＡＹＳ−ＯＮ−ＤＥＭＡＮＤリアルタイムＩＬ−Ｉ０発現キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＩＬ−１０ ＲＮＡを定量するため、Ｃｌ １３感染脾細胞からの全脾ＲＮＡの１０倍連続希釈（１μｇ対１ｐｇ全ＲＮＡ、標準曲線：ｒ２＞０．９９）によって標準曲線を作成し、ＩＬ−１０ ＲＮＡの相対数を決定した。増幅はＡＢＩ７７００増幅器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。
【０１３１】
ＩＶ．細胞内サイトカイン分析およびフローサイトメトリー
脾細胞を、５０Ｕ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１ｍｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）の存在下に、５μｇ／ｍｌのＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＬＣＭＶ−ＧＰ６１〜８０または２μｇ／ｍｌのＭＨＣクラスＩ拘束性ＬＣＭＶ−ＮＰ３９６〜４０４、ＧＰ３３〜４１またはＧＰ２７６〜２８５ペプチド（すべて９９％純粋；Ｓｙｎｐｅｐ．）で５時間刺激した。ＩＬ−２のエクスビボ投与はサイトカイン産生を変化させなかった。細胞をＣＤ４（クローンＲＭ４−５；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＣＤ８（クローン５３−６．７；Ｃａｌｔａｇ）の表面発現に関して染色した。細胞を固定し、透過処理し、ＴＮＦ−αに対する抗体（クローンＭＰ６−ＸＴ２２；ＡＴＣＣ）、ＩＦＮ−γに対する抗体（クローンＸＭＧ１．２；ＡＴＣＣ）およびＩＬ−２に対する抗体（クローンＪＥＳ６−５Ｈ４；ＡＴＣＣ）で染色した。Ｄｉｇｉｔａｌ ＬＳＦ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリー分析を実施した。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ四量体を、Ｈｏｍａｎｎら（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：９１３−９１９に記載されているように生成した。四量体またはＩＦＮ−γ細胞の頻度に脾臓内の細胞の総数を乗じることによってウイルス特異的Ｔ細胞の絶対数を決定した。
【０１３２】
Ｖ．インビボでのＩＬ−１０ＲおよびＰＤ−Ｌ１特異的抗体処置
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染後２５日目または３０日目から開始して３日ごとに５回の処置を継続し、２５０μｇ／マウスのＩＬ−１０Ｒ特異的抗体（クローン１Ｂ１．３ａ；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によっておよび／または２００ｍｇ／マウスのＰＤ−Ｌ１特異的抗体（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）をｉ．ｐ．注射によって投与した。ラットＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（抗大腸菌β−ガラクトシダーゼＭａｂ、クローンＫＭ１．ＧＬ１１３；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）による処置は、Ｔ細胞応答またはウイルス複製に影響を及ぼさなかった。
【０１３３】
ＶＩ．ＤＮＡワクチン接種
プラスミドｐＣＭＶ−ＧＰは、全長ＬＣＭＶ糖タンパク質をコードする。親対照ベクター、ｐＣＭＶはＬＣＭＶ配列を含まない。ｐＣＭＶ−ＧＰおよび親ｐＣＭＶベクターの両方が、Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６８４−２６８８に記述されている。ｐＣＭＶ−ＧＰは、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞ＬＣＭＶ糖タンパク質エピトープの両方をコードするが、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞ＬＣＭＶ核タンパク質エピトープをコードしない。並行して、プラスミドを大腸菌で増殖させ、内毒素不含プラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＬＣＭＶ−Ｃｌ １３感染後２９日目と３４日目にＤＮＡ注射（食塩水中のプラスミドＤＮＡ（１００μｇ／マウス）の５０μｌ注射を両側前脛骨筋内に）を実施した。
【０１３４】
ＶＩＩ．統計分析
ＳｉｇｍａＳｔａｔ ２．０ソフトウエア（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒ，Ｉｎｃ．）を使用してスチューデントｔ検定を実施した。
【０１３５】
本明細書中のすべての引用は、各々個々の公表文献または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることを具体的且つ個別に指示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
当業者に明白であるように、本発明の多くの修正および変形が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく実施され得る。本明細書で述べる特定の実施形態は単なる例として提供され、本発明は、添付の特許請求の範囲の規定によって、そのような特許請求の範囲が与える全範囲の等価物と共に、限定されるものである。そして、本発明は、本明細書中で例として提示された特定の実施形態によって限定されない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法であって、該持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記ウイルスに対するワクチンと前記免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストとの組み合わせが、前記慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す、請求項１に記載の治療の方法。
【請求項３】
前記免疫抑制性サイトカインがＩＬ−１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストが、可溶性ＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記可溶性ＩＬ−１０Ｒポリペプチドが異種ポリペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記異種ポリペプチドが抗体分子のＦｃ部分を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性ＩＬ−１０Ｒポリペプチドがペグ化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストが、中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）抗体またはその抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体がモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体がヒト化されているかまたは完全にヒトのものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖおよび一本鎖抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記慢性または持続性ウイルス感染が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶおよびＬＣＭＶからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクチンがＤＮＡワクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストを前記ウイルスに対するワクチンの前に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
慢性または持続性ウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物であって、
（ａ）該持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに
（ｂ）免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび薬学的に受容可能な担体
を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに
（ｂ）免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび薬学的に受容可能な担体
を含むキット。
【請求項１７】
慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法であって、該持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記ウイルスに対するワクチンと前記中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントとの組み合わせが、前記慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す、請求項１７に記載の治療の方法。
【請求項１９】
前記中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体がヒト化されているかまたは完全にヒトのものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ワクチンがＤＮＡワクチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体と組み合わせて前記ワクチンを投与することが、ワクチンまたは抗体治療単独と比較した場合ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の２倍の増加を生じさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＦＮ−γ産生ウイルス特異的Ｔ細胞が、ワクチンまたは抗体治療単独と比較した場合５倍増加する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体と組み合わせて前記ワクチンを投与することが、治療前レベルと比較してウイルス力価を２４分の１に減少させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントを前記ウイルスに対するワクチンの前に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
慢性または持続性ウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物であって、
（ａ）該持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに
（ｂ）中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能な担体
を含有する医薬組成物。
【請求項２７】
（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに
（ｂ）中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能な担体
を含むキット。
【請求項１】
慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法であって、該持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記ウイルスに対するワクチンと前記免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストとの組み合わせが、前記慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す、請求項１に記載の治療の方法。
【請求項３】
前記免疫抑制性サイトカインがＩＬ−１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストが、可溶性ＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記可溶性ＩＬ−１０Ｒポリペプチドが異種ポリペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記異種ポリペプチドが抗体分子のＦｃ部分を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性ＩＬ−１０Ｒポリペプチドがペグ化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストが、中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０受容体（ＩＬ−１０Ｒ）抗体またはその抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体がモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体がヒト化されているかまたは完全にヒトのものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖおよび一本鎖抗体フラグメントからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記慢性または持続性ウイルス感染が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶおよびＬＣＭＶからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクチンがＤＮＡワクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストを前記ウイルスに対するワクチンの前に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
慢性または持続性ウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物であって、
（ａ）該持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに
（ｂ）免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび薬学的に受容可能な担体
を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに
（ｂ）免疫抑制性サイトカインのアンタゴニストおよび薬学的に受容可能な担体
を含むキット。
【請求項１７】
慢性または持続性ウイルス感染を治療する方法であって、該持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンの有効量を中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントと組み合わせて、治療を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記ウイルスに対するワクチンと前記中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントとの組み合わせが、前記慢性または持続性ウイルス感染の治療において相乗作用を示す、請求項１７に記載の治療の方法。
【請求項１９】
前記中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体がヒト化されているかまたは完全にヒトのものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ワクチンがＤＮＡワクチンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体と組み合わせて前記ワクチンを投与することが、ワクチンまたは抗体治療単独と比較した場合ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の２倍の増加を生じさせる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＦＮ−γ産生ウイルス特異的Ｔ細胞が、ワクチンまたは抗体治療単独と比較した場合５倍増加する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記中和ＩＬ−１０またはＩＬ−１０Ｒ抗体と組み合わせて前記ワクチンを投与することが、治療前レベルと比較してウイルス力価を２４分の１に減少させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントを前記ウイルスに対するワクチンの前に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
慢性または持続性ウイルス感染の治療における使用のための医薬組成物であって、
（ａ）該持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに
（ｂ）中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能な担体
を含有する医薬組成物。
【請求項２７】
（ａ）持続性または慢性ウイルス感染の原因因子であるウイルスに対するワクチンおよび薬学的に受容可能な担体；ならびに
（ｂ）中和ＩＬ−１０もしくはＩＬ−１０Ｒ抗体またはその抗体フラグメントおよび薬学的に受容可能な担体
を含むキット。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５０２１６３（Ｐ２０１１−５０２１６３Ａ）
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３２２１２（Ｐ２０１０−５３２２１２）
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１６１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８８８８
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ スクリプス リサーチ インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１６１４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５８８８８
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ スクリプス リサーチ インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】
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