改善されたキシロース資化能を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の変異プロモーターを含有するキメラキシロースイソメラーゼ遺伝子を導入することによって、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株を操作した。前記プロモーターは、キシロースイソメラーゼの発現の増加を指令し、そして株が、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のために操作される場合、キシロースの改善された資化能が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９８７８号明細書（本明細書において引用により援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４およびＤＥ−ＦＣ３６−０３ＧＯ１３１４６に基づく米国政府の助成により行われた。米国政府は、本発明において所定の権利を有する。さらに、米国政府は、米国エネルギー省と国立再生可能エネルギー研究所（ミッドウエスト研究所の一部局）との間の契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７に基づいて、本発明の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。より具体的には、改善されたキシロース資化能を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の遺伝子操作について記載する。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料の代替的エネルギー源を提供し、従って、現在の重要な研究の分野である。キシロースは、加水分解されたリグノセルロース材料における主要ペントースであり、従って、多量に利用可能な低コストの炭素基質を提供することができるため、エタノール、ならびに他の有用な産物を産生する微生物は、キシロースを炭素源として使用することが可能であることが望ましい。天然ではキシロースを資化しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）および他のエタノール産生細菌を、１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の導入によって、キシロース資化のために遺伝子操作することができる。
【０００５】
キシロース代謝のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）、ならびにザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）株（Ｙａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９）を操作することには成功している。しかし、典型的には、操作された株はキシロース上ではグルコース上ほど良好に増殖せず、そしてエタノールを産生しない。キシロース資化能について操作された株はキシロース培地上での継代培養によって適応され、改善されたキシロース資化能を有する株を生じており、米国特許第７，２２３，５７５号明細書ならびに同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載されている。しかし、改善のための遺伝的基礎については決定されていない。
【０００６】
改善されたキシロース資化能を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、および他のエタノール産生細菌の遺伝子操作株の必要性が依然として存在する。出願人らは、キシロース資化能のために操作され、そして改善されたキシロース資化能のために適応されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の遺伝子操作を発見し、そしてその発見を使用して、改善されたキシロース資化能のために株を操作した。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、改善されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）から発現されるキシロースイソメラーゼをコードするキメラ遺伝子で形質転換することによってキシロース資化能について遺伝子操作された細菌の株に関する。この株はまた、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子によっても形質転換される。改善されたＰｇａｐは生来のＰｇａｐより高い発現を指令し、キシロースイソメラーゼの発現について改善されたＰｇａｐを有さない株と比較して改善されたキシロース資化能を生じる。
【０００８】
本明細書では、形質転換によって導入される遺伝子を含むザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株について説明する。前記遺伝子は以下を含む：
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼをコードする作動可能に連結された単離された核酸分子。
上記の形質転換工程によって導入される遺伝子は、Ｐｇａｐの発現の増強のための変異を含むキメラ遺伝子であってもよい。
【０００９】
また、本明細書では、遺伝子、例えば、キメラ遺伝子で形質転換する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される細菌株を操作するための方法について説明する。前記キメラ遺伝子は、以下を含む；
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼ酵素をコードする作動可能に連結された単離された核酸分子。
【００１０】
本明細書では、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択されるキシロース資化細菌株を操作するための別の方法について説明する。前記方法は、任意の順序で、以下の工程を含む：
ａ）トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子またはオペロンで形質転換する工程；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現のための遺伝子またはオペロンで形質転換する工程であって、キシロースイソメラーゼ酵素は、改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターから発現され、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子である、前記工程。
【００１１】
また、本明細書では、形質転換によって導入されるキメラ遺伝子を含むザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株を培地において培養する工程を含む、キシロースを含む培地からのエタノールの産生のための方法について説明する。前記キメラ遺伝子は以下を含む：
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼをコードする作動可能に連結された単離された核酸分子。
【００１２】
さらに、本明細書では、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株について説明し、この組換え細菌株は、０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌソルビトールデヒドロゲナーゼを含む反応混合物中２０μＬの無細胞抽出物を３０℃で反応させることによって測定した際に、少なくとも約０．１μモル産物／ｍｇタンパク質／分を産生させるレベルでキシロースイソメラーゼを発現するように操作され、ここで、Ｄ−キシルロースが産物である。
【００１３】
本発明の様々な実施形態は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】トランスケトラーゼ（Ａ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｂ】トランスアルドラーゼ（Ｂ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｃ】キシロースイソメラーゼ（Ｃ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｄ】キシルロキナーゼ（Ｄ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図２】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）活性のグラフを示す。
【図３】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）活性のグラフを示す。
【図４】選択された適応キシロース資化株コロニーの理論的エタノール収率％およびキシロース資化％のグラフを示す。
【図５】５％グルコースを含むＲＭ（リッチ培地）（ＲＭＧ）で５０代まで増殖する前および後の５％キシロースを含むＲＭ（ＲＭＸ５％）上で７０時間目の適応キシロース資化株の増殖のグラフを示す。
【図６Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＺＢ１８８；（Ｂ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのプラスミド地図を示す。
【図６Ｃ】（Ｃ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図６Ｄ】（Ｄ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの略図を示す。
【図７Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＭＯＤTM−２−＜ＭＣＳ＞；（Ｂ）ｐＭＯＤ−リンカーのプラスミド地図を示す。
【図７Ｃ】（Ｃ）ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃのプラスミド地図を示す。
【図８】ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷのプラスミド地図を示す。
【図９】ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１０Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ；（Ｂ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１０Ｃ】（Ｃ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１１】Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミドを保持する３つの株（Ｘ１、Ｘ２およびＸ２）ならびにコントロールプラスミドを保持する３つの株（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のキシロース含有培地における増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１２Ａ】（Ａ）線形目盛上にプロットした、スペクチノマイシンを伴わないキシロース含有培地における株ＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１２Ｂ】（Ｂ）対数目盛上にプロットした、スペクチノマイシンを伴わないキシロース含有培地における株ＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１３Ａ】（Ａ）線形目盛上にプロットした、株ＺＷ６５８と比較した、８０１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃８−２、＃８−４、＃８−５）および６４１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃６−１、＃６−３、＃６−５）の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１３Ｂ】（Ｂ）対数目盛上にプロットした、株ＺＷ６５８と比較した、８０１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃８−２、＃８−４、＃８−５）および６４１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃６−１、＃６−３、＃６−５）の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【００１５】
表３は、キシロースイソメラーゼのＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭの表である。表３を、電子データと共に提出し、本明細書に参照として援用される。
【００１６】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００１７】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
配列番号１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ｐＺＢ４由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列であり、これはまた、株ＺＷ６４１および８ＸＬ４のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンでもある。
配列番号４は、株ＺＷ６５８由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、株８ｂ由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ＰｇａｐのｐＺＢ４変種における−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号７は、ＰｇａｐのＣＰ４変種におけるＺＷ６５８由来の−１９０変異を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号８は、ＰｇａｐのＣＰ４変種における８ｂ由来の−８９変異を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＰｇａｐのＣＰ４変種における−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＰｇａｐのＺＭ４変種におけるＺＷ６５８由来の−１９０変異を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、ＰｇａｐのＺＭ４変種における８ｂ由来の−８９変異を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、ＰｇａｐのＺＭ４変種における−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１３および１４は、ｐＺＢ４由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１５および１６は、ｐＺＢ４由来のｔａｌコード領域を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１７および１８は、Ｐｇａｐおよびｔａｌフラグメント由来のＰｇａｐｔａｌを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１９および２０は、ｐＺＢ１８６由来のｌｏｘＰ：：Ｃｍを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２２および２３は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを収容する形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２５および２６は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを含むＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組み込み体由来の１．６ｋｂのＰｇａｐｘｙｌＡ ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２７および２８は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２９〜３１は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３２および３３は、Ｓｐｅｃr−カセットを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号３５および３６は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞の異なるマルチクローニング部位を置換するために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３７および３８は、それぞれ、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡを得るため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃに挿入するための株ＺＷ８０１−４およびＺＷ６４１由来のＰｇａｐｘｙｌＡ領域の増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３９および４０は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーの完全ヌクレオチド配列である。
【００１８】
表１
キシロースイソメラーゼのタンパク質およびコード領域配列番号の概要
1このコード配列は、ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）コード配列に基づいて、ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）タンパク質（ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）タンパク質との間に３アミノ酸の差異を有する）をコードするように設計される。
2このコード配列は、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）コード配列に基づいて、サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）タンパク質（ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）タンパク質との間に２１アミノ酸の差異を有する）をコードするように設計される。
3このコード配列は、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来であり、そしてサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）タンパク質に翻訳されるが、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）コード配列は、コドン縮重による差異を有し得る。
【００１９】
表２
キシロース資化のための遺伝子およびタンパク質配列番号の概要
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書では、キシロースイソメラーゼの高発現を有するように遺伝子操作されたキシロース資化組換え細菌株、およびキシロースイソメラーゼ発現の増加のために細菌を操作するための方法について説明する。キシロースイソメラーゼの発現は、より強力なプロモーターにする少なくとも１つの変異を有する改善されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（ＺｍＰｇａｐ）によって指令される。ＺｍＰｇａｐは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４およびＺＭ４株（ＣＰ４株ＺｍＰｇａｐ：配列番号１およびＺＭ４株ＺｍＰｇａｐ：配列番号２）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対して−１９０位、−８９位、または両方の位置に変異を有する。本明細書に記載のキシロース資化組換え細菌株は、キシロース含有培地上での発酵が改善されている。キシロース含有培地で増殖させる場合、上記のように操作したエタノールまたは他の産物を産生する細菌を、産生の増加のために使用してもよい。例えば、エタノールの増量は、化石燃料の代替エネルギー源として使用することができる上記のように操作されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のようなエタノール産生菌から得ることができる。
【００２１】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義が使用される。
【００２２】
本明細書において使用する用語「含む」、「含んでいる」、「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「含有する」もしくは「含有している」またはそれらの他の任意の表現は、非排他的な包含を含むことが意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、それらの要素のみに限定される必要はなく、明確に列挙されていない他の要素、あるいはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に本来備わっている他の要素を含んでもよい。さらに、異なることを述べている場合を除き、「または」は、包含的論理和を指すものであって、排他的論理和を指すものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、次のもののいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽であること（または存在しないこと）、Ａが偽であり（または存在せず）かつＢが真であること（または存在すること）、ならびにＡおよびＢが両方とも真であること（または存在すること）。
【００２３】
また、本発明の要素または成分の前に置かれている不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または成分の事例（即ち、発生）の数に関して非制限的であることが意図される。従って、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読み取るべきであり、そして要素または成分の単数形もまた、数が明らかに単数であることを意味しない限り、複数を含む。
【００２４】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含み得る特定のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含む、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含むことができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されないが遺伝子導入により宿主生物体内に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、その遺伝子が生来存在しない生物体内に挿入された生来の遺伝子またはキメラ遺伝子を含むことができる。
【００２５】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的には、遺伝子構築物は「コード配列」を含む。「コード配列」は、具体的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２６】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００２７】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するコード（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、通常の産生レベルを超えるトランスジェニック生物体または非形質転換生物体における遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物または断片の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００２８】
本明細書において使用する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００２９】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を、宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００３０】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を含む選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。
【００３１】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００３２】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００３３】
本明細書において使用する用語「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について周知である。従って、宿主細胞において改善された発現のための遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用頻度が宿主細胞に好適なコドン使用頻度に近付くように遺伝子を設計することが望ましい。
【００３４】
用語「コドン最適化」は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域を指すため、これは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物体の典型的なコドン使用に反映するための遺伝子または核酸分子のコード領域におけるコドンの改変を指す。
【００３５】
用語「Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター」および「ＺｍＰｇａｐ」は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムにおいてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼコード領域の上流に天然に存在する塩基配列を有するプロモーター活性を有する核酸分子を指す。これらの用語は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株のプロモーター（それぞれ、配列番号１および２）、ならびにｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ（配列番号３）のような実質的に異なるレベルでの発現を指令する配列および／または長さが異なる変種を指す。
【００３６】
用語「異種の」は、目的の位置において天然では見出されないことを意味する。例えば、異種遺伝子は、宿主生物体内において天然では見出されないが遺伝子導入により宿主生物体内に導入される遺伝子を指す。例えば、キメラ遺伝子に存在する異種核酸分子は、天然では相互に関連しないコード領域およびプロモーターセグメントを有する核酸分子のような、キメラ遺伝子の他方のセグメントと関連することが天然では見出されない核酸分子である。
【００３７】
本明細書において、「単離された核酸分子」は、場合により、合成、非天然もしくは改変されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖であるＲＮＡあるいはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントからなり得る。
【００３８】
一本鎖形態の核酸フラグメントが、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他の核酸フラグメントにアニーリングすることができる場合、核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子のような別の核酸フラグメントに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ndｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にその中のＣｈａｐｔｅｒ１１およびＴａｂｌｅ１１．１（それらの全体が本明細書において参照として援用される）に例示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似のフラグメント（例えば、遠位関係の生物体由来の相同配列）〜高度に類似のフラグメント（例えば、近位関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子）をスクリーニングすることができる。ポストハイブリダイゼーション洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。好適な条件の１つの組は、室温で１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳから開始し、次いで、４５℃で３０分間の２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを反復し、次いで、５０℃で３０分間の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを２回反復する一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好適な組は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおける最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、洗浄が上記と同一である、より高い温度を使用する。高度にストリンジェントな条件の別の好適な組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での最後の２回の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のさらなる組は、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、それに続く、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄を含む。
【００３９】
ハイブリダイゼーションでは、２つの核酸が相補配列を含有することが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である。核酸にハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当該分野において周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算するための式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上掲、９．５０−９．５１を参照のこと）。より短い核酸、即ち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さは、その特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上掲、１１．７−１１．８を参照のこと）。１つの実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり；そして最も好ましくは、長さは、少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、必要であれば、プローブの長さのような要因に従って、温度および洗浄液の塩濃度を調整することができることを理解するであろう。
【００４０】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「大部分」は、当業者による配列の人による評価、またはＢＬＡＳＴのようなアルゴリズムを使用するコンピュータ自動化配列比較および同定（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））のいずれか一方によって、ポリペプチドもしくは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列もしくは遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般的に、ポリペプチドまたは核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、１０連続アミノ酸以上または３０ヌクレオチド以上の配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に対して、２０〜３０連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列依存的方法に使用してもよい。さらに、プライマーを含む特定の核酸フラグメントを得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用してもよい。従って、ヌクレオチド配列の「大部分」は、配列を含む核酸フラグメントを特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書において報告した配列の利益を有する当業者であれば、これからは、当業者に既知の目的の開示された配列のすべてまたは大部分を使用することができる。従って、本発明は、添付の配列表に報告された完全な配列、ならびに上記で定義した配列の大部分を含む。
【００４１】
用語「相補的な」は、相互にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、そしてシトシンはグアニンに相補的である。
【００４２】
用語「相同性」および「相同」は、本明細書において同義に使用される。それらは、核酸フラグメントを指し、ここで、１ヌクレオチド塩基以上の変化は、核酸フラグメントが、遺伝子発現を仲介するか、または所定の表現型を産生する能力に影響を及ぼさない。これらの用語はまた、初期の改変されていないフラグメントに対して得られた核酸フラグメントの機能的特性を実質的に変更しない１ヌクレオチド以上の欠失または挿入のような本発明の核酸フラグメントの改変を指す。従って、当業者が理解しているように、本発明は、特定の例示的配列を超えるさらなる配列をも包含することが理解される。
【００４３】
さらに、当業者は、本発明に包含される相同な核酸配列もまた、中程度のストリンジェントな条件（例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、本明細書に例示した配列、または本明細書に開示され、そして本明細書に開示された核酸配列のいずれかに機能的に等価であるヌクレオチド配列のいずれかの部分にハイブリダイズするそれらの能力によって定義されることを認識している。
【００４４】
当該分野において既知の用語「同一性パーセント」は、配列を比較することによって決定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」はまた、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関係の程度を意味し、場合により、そのような配列のストリング間の一致によって決定されるとおりであり得る。「同一性」および「類似性」は、限定されないが、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載の方法を含む既知の方法によって、容易に計算することができる。
【００４５】
同一性を決定するための好適な方法は、試験する配列間の最適な一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに編集されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎTMプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、実施することができる。配列のマルチプルアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）； Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載されている）と標識され、そしてＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎTMプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見出されるアラインメント方法に対応する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ方法」を含む数種のアルゴリズムを包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法」を使用して、実施される。マルチプルアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性パーセントの計算についてのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用する配列のアラインメント後、同じプログラムにおいて「配列距離」表を調べることによって、「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ方法」は入手可能であり、そしてＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）により記載されている）と標識され、そしてＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎTMｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見出されるアラインメント方法に対応する。マルチプルアラインメントのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用する配列のアラインメント後、同じプログラムにおいて「配列距離」表を調べることによって、「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００４６】
多くのレベルの配列同一性が他の種由来のポリペプチドを同定するのに有用であることが当業者によく理解されており、ここで、そのようなポリペプチドは、同じまたは類似の機能または活性を有する。同一性パーセントの有用な例として次のものが挙げられるが、これらに限定されない：２４％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または２４％〜１００％の任意の整数の百分率は、本発明を説明するのに有用であり得、例えば、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％。適切な核酸フラグメントは、上記の相同性を有するだけではなく、典型的には、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは、少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは、少なくとも１５０アミノ酸、なおより好ましくは、少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは、少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００４７】
用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、商業的に入手することができるか、または独立して開発することができる。典型的な配列解析ソフトウェアとして、１．）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これらに限定されない。本出願に関して、配列解析ソフトウェアを解析に使用する場合、特に断りのない限り、解析の結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されよう。本明細書において使用する「デフォルト値」とは、最初に初期化した時に本来導入されている任意の組の値またはパラメータを意味する。
【００４８】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、１９８７に記載されている。
【００４９】
改善されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの発見
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＺｍＰｇａｐまたはＰｇａｐ）のプロモーターは、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）におけるキメラ遺伝子の発現に使用されている。キシロース代謝のための遺伝子を発現させるためにこのプロモーターを使用した場合、得られるキシロース資化能は典型的には所望される効果を示さない。さらに、限定的なキシロース資化能力を有する４つのキシロース代謝酵素（キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼ）を発現するように操作された組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、改善されたキシロース資化能のためキシロース培地に対して適応された（同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載されている）。
【００５０】
出願人らは、本明細書の実施例３に記載のように、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）と呼ばれる改善されたキシロース資化株が、ＺｍＰｇａｐから発現されるオペロン（ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロン）としてゲノムに組み込まれたキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現を増加することを発見した。出願人らは、作動可能に連結されたコード領域の発現の増加を指令するプロモーターを担うＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーターに新規の１つのヌクレオチド変化が存在することをさらに発見した。ヌクレオチド変化は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ活性の増加を有さなかったＺＷ６５８に対する前駆体株におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＺｍＰｇａｐの配列と比較して、株ＺＷ６５８におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐの配列において新規のものである。それ故、この単一ヌクレオチド変化を有するＰｇａｐは改善されたプロモーターである。
【００５１】
出願人らは、さらに、４つのキシロース資化酵素をコードする遺伝子で個別に操作し、そして改善されたキシロース資化能について個別に適応されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第７，２２３，５７５号明細書に記載の株８ｂ）もまた、ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンとしてゲノムに組み込まれたキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現を増加することを発見した。出願人らは、ＺＷ６５８ Ｐｇａｐのヌクレオチド変化とは異なる位置にある８ｂ株におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐの新規の１つのヌクレオチド変化が存在することをさらに発見した。ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンによってコードされるキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現の増加に基づいて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの変異Ｐｇａｐもまた改善されたプロモーターを提供する。
【００５２】
ＺＷ６５８および８ｂ株ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐにおいて新たに同定されたヌクレオチド変化は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対してそれぞれ、−１９０および−８９位に存在する。発見した−１９０位のヌクレオチド変化はＧからＴへの変化であり、そして発見した−８９位のヌクレオチド変化はＣからＴへの変化である。
【００５３】
位置番号は配列の変動によって変化し得るため、塩基の変化の配列構成は重要な因子である。
【００５４】
−１９０位置は、配列構成：
に存在する（それぞれ、配列番号１、２、および３に対応するＣＰ４、ＺＭ４、およびｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐの位置であって、ここで、太字かつ下線を付したＧは、変異によってＴに変化した塩基である）。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列中で−１９０位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では、−２１位においてＴが欠失しているため、ｐＺＢ４において−１８９位である。
【００５５】
−８９位置は、配列構成：
に存在する（それぞれ、配列番号１、２、および３に対応するＣＰ４、ＺＭ４、およびｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐの位置であって、ここで、太字かつ下線を付したＣは、変異によってＴに変化した塩基である）。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列中で−８９位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では、−２１位においてＴが欠失しているため、ｐＺＢ４においては−８８位である。本発明のプロモーターは、−１９０位、−８９位、またはこれらの位置の両方にＺｍＰｇａｐのヌクレオチド変化を有する。好ましくは、この変化は−１９０位におけるＧからＴへの変化であり、そして−８９位におけるＣからＴへの変化である。これらの改変を含む本発明のプロモーターは、改善されたＰｇａｐｓである。
【００５６】
−１９０位および−８９位における他のヌクレオチドへの変化は、ＺｍＰｇａｐの改善された活性を提供し得る。加えて、ＺｍＰｇａｐ内の他の位置におけるヌクレオチド変化も、ＺｍＰｇａｐの改善された活性を提供し得る。
【００５７】
ＺｍＰｇａｐの天然に存在する配列は、単一の配列ではなく、プロモーターの機能に対して実質的な影響を及ぼさないいくつかの変動を配列内に有してもよい。プロモーターの機能に対して実質的な影響を及ぼさないとは、プロモーター配列が、天然のザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株に存在するＺｍＰｇａｐによって指令される発現のレベルと実質的に同様の発現レベルを指令することを意味する。配列の変動は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する−２９位のＣＰ４株およびＺＭ４株（それぞれ、配列番号１および２）（ここで、ＣＰ４ではＡが存在し、そしてＺＭ４ではＧが存在する）の間の差異のように、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の異なる単離体または株の間で自然に発生し得る。
【００５８】
天然に存在する配列の変動に加えて、機能に実質的に影響を及ぼさないヌクレオチド変化が、当業者に公知のＰＣＲ、クローニング、形質転換、および株増殖を含む日常的な操作手順の間に発生し得る。例には、−２１位においてＴの欠失を有するｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐがある。
【００５９】
プロモーターの機能に実質的に影響を及ぼさない、異なる天然の株または操作された株において生じるＺｍＰｇａｐ配列の任意のヌクレオチド変化は、ｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐに存在する−２１位後方のＴの欠失（配列番号３）のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの配列に存在し得る。それ故、プロモーターの機能に影響を及ぼす、即ち、実質的に、プロモーターの機能を改善する上記の−１９０位および−８９位における変異は、実質的に同様の活性（天然のレベル）を有するＺｍＰｇａｐ配列のいずれかにおいて作製してもよく、そして機能に影響を及ぼさない変動と共に同時に発生することができる。
【００６０】
−１９０位および／または−８９位に記載の変異を有する改善されたＰｇａｐ変異の例として、株ＺＷ６５８由来のプロモーター配列（配列番号４）、株８ｂ由来のプロモーター配列（配列番号５）、およびｐＺＢ４由来である同じＺｍＰｇａｐ変種の二重変異（配列番号６）が挙げられる。改善されたＰｇａｐ配列のさらなる例には、ＣＰ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号７、８、および９）ならびにＺＭ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号１０、１１、および１２）がある。
【００６１】
加えて、プロモーターの機能に実質的に影響を及ぼさないＺｍＰｇａｐの長さの変動も生じる。本発明は、−１９０位の変異および／または−９０の変異が追加される前の活性に実質的な変化を有さない、様々な長さのＺｍＰｇａｐｓにおけるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対して、−１９０位および／または−８９位での記載の変異を有する改善されたＰｇａｐｓを含む。
【００６２】
改善されたＰｇａｐの調製
−１９０位および／または−８９位における記載の変異は、当業者に公知に任意の方法によってＺｍＰｇａｐ核酸分子に導入することができる。例えば、変異および周囲のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてより大きなプロモーターＤＮＡフラグメントにクローニングして、変異を伴わないセグメントと置換してもよい。変異およびいくつかの隣接するプロモーター配列を含有するプライマーを、合成し、そしてＰＣＲに使用して、プロモーターフラグメントを調製してもよい。全プロモーターＤＮＡフラグメントを、共にライゲートされる複数のオリゴヌクレオチドとして合成してもよい。部位特異的変異誘発を使用して、変異を導入してもよい。加えて、ＺＷ６５８株または８ｂ株由来のＤＮＡをテンプレートして使用して、ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントとして変異プロモーターを調製してもよい。
【００６３】
改善されたＰｇａｐを使用するキシロースイソメラーゼの発現
本明細書に記載のプロモーターを、ＺｍＰｇａｐからの発現と比較してキシロースイソメラーゼの増加した発現を指令するために、キシロースイソメラーゼをコードする異種核酸分子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に作動可能に連結させることができる。キメラ遺伝子由来の改善されたＰｇａｐおよびキシロースイソメラーゼコード領域はまた、一般に３’末端制御領域を含む。末端制御領域は様々な遺伝子に由来してもよく、そしてしばしば標的宿主細胞に生来の遺伝子から採られる。キメラ遺伝子の構築は当該分野において周知である。
【００６４】
本発明において改善されたＰｇａｐからキシロースイソメラーゼを発現させるために、キメラ遺伝子において、いずれのキシロースイソメラーゼコード領域を使用してもよい。キシロースイソメラーゼ酵素は、ＥＣ５．３．１．５のグループに属する。使用することができる適切なキシロースイソメラーゼタンパク質およびコード配列の例を表１に示す。特に適切な例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（それぞれ、配列番号４２および４３）、ならびにラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（それぞれ、配列番号４４および４５）由来のものがある。
【００６５】
キシロースイソメラーゼタンパク質およびコード配列の他の多くの例が、参考文献、および当業者に周知のバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定される。さらに、本明細書に記載のコード配列または当該分野において列挙されているコード配列を使用して、天然に存在する他の相同体を同定することができる。例えば、上記のキシロースイソメラーゼをコードする核酸フラグメントのそれぞれを使用して、同じまたは他の細菌種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することもできる。配列依存的プロトコルを使用する相同遺伝子の単離は、当該分野において周知である。
【００６６】
配列依存的プロトコルの例として次のものが挙げられるが、これらに限定されない：１．）核酸ハイブリダイゼーションの方法；２．）核酸増幅技術の様々な使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１０７４（１９８５）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］；および３．）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニングの方法。
【００６７】
例えば、上記のキシロースイソメラーゼコード領域に対して類似のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列は、本核酸フラグメントのすべてまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、当業者に周知の方法論を使用して、任意の所望の細菌由来のライブラリーをスクリーニングすることによって、直接単離し得る。開示された核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当該分野において公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上掲）によって、設計および合成することができる。さらに、全配列を直接使用して、当業者に公知の方法（例えば、ランダムプライマーＤＮＡラベリング、ニックトランスレーションもしくは末端ラベリング技術）によってＤＮＡプローブを、または利用可能なインビトロ転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成することができる。さらに、本配列の一部（または全長）を増幅するために、特異的プライマーを設計し、そして使用することができる。得られた増幅産物は、増幅反応中に直接標識するか、または増幅反応後に標識することができ、そして適切なストリンジェンシーの条件下で全長ＤＮＡフラグメントを単離するためのプローブとして使用することができる。
【００６８】
典型的に、ＰＣＲ型増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、相互に相補的ではない。所望される試験条件に依存して、プライマーの配列は標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するように設計すべきである。ＰＣＲプライマーの設計方法は当該分野において共通および周知である（Ｔｈｅｉｎ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ Ｅｄ．，（１９８６）ｐｐ３３−５０，ＩＲＬ．：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｅｄ．，（１９９３）Ｖｏｌ．１５，ｐｐ３１−３９，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【００６９】
一般的に、記載の配列の２つの短いセグメントを、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードするより長い核酸フラグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸フラグメントのライブラリーに対して実施してもよく、ここで、一方のプライマーの配列が記載の核酸フラグメントから誘導され、そして他方のプライマーの配列は微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を利用することができる。
【００７０】
あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づき得る。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８（１９８８））に従い、ＰＣＲを使用して、転写物における単一のポイントと３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅することによってｃＤＮＡを作製することができる。３’および５’方向において得られるプライマーは、本配列から設計することができる。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えば、ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、特異的３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（Ｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５６７３（１９８９）；Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９））。
【００７１】
あるいは、これらのキシロースイソメラーゼをコードする配列を、相同体の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本成分として、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子フラグメントを含有することが疑わしいサンプル、および特異的ハイブリダイゼーション方法を挙げることができる。プローブは、典型的に、検出しようとする核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出しようとする核酸配列に「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５塩基〜数万塩基変動することができ、そして行おうとする特異的試験に依存する。典型的には、約１５塩基〜約３０塩基のプローブが適切である。検出しようとする核酸配列に相補的である必要があるのは、プローブのうち一部のみである。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は、完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、不完全な相補的分子間で生じ、その結果、ハイブリダイズした領域における塩基の所定の画分は、適切な相補的塩基と対合しない。
【００７２】
ハイブリダイゼーション方法については、良好に定義され、かつ当該分野において公知である。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合しなければならない。これには、無機塩または有機塩の存在下、適切な濃度および温度条件下でプローブとサンプルとを接触させることが必要である。プローブおよびサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸との間の任意の可能なハイブリダイゼーションが生じ得るのに十分に長い時間、接触させなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要とされるハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短い。カオトロピック剤が添加されていてもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって、核酸を安定化する。さらに加えて、カオトロピック剤は、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度かつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ Ｎｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１（１９９１））。適切なカオトロピック剤として、とりわけ、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムおよびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望であれば、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に、典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加することができる。
【００７３】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的に、これらは、約２０〜６０体積％、好ましくは、３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖホルムアミド、約０．１５〜１Ｍ塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍ緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲：約６〜９））、約０．０５〜０．２％界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭの間のＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）および血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識キャリア核酸、フラグメント化核酸ＤＮＡ（例えば、仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌであってもよいグリシンが含まれる。多様な極性水溶性または膨潤性の薬剤（例えば、ポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えば、ポリアクリレートもしくはポリメチルアクリレート）およびアニオン性糖ポリマー（例えば、硫酸デキストラン）を含む体積排除剤のような他の添加剤が含まれてもよい。
【００７４】
核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイ形式に応用することができる。最も適切なものの１つは、サンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、特に、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに応用することができる。サンドイッチ型アッセイの主要な構成要素は固相支持体である。固相支持体は、非標識かつ配列の一部に相補的な固定化された核酸プローブを、これに吸着した形またはこれに共有結合した形で有する。
【００７５】
バイオインフォマティックアプローチ
あるいは、キシロースイソメラーゼタンパク質はかなりよく知られており豊富に存在するため、さらなるキシロースイソメラーゼタンパク質を、Ｐｆａｍ（Ｐｆａｍ：ｃｌａｎｓ，ｗｅｂ ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ｓｅｒｖｉｃｅｓ：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ｂ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ−Ｂｏｅｃｋｌｅｒ，Ｓ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｖ．Ｈｏｌｌｉｃｈ，Ｔ．Ｌａｓｓｍａｎｎ，Ｓ．Ｍｏｘｏｎ，Ｍ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．Ｋｈａｎｎａ，Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６）Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ３４：Ｄ２４７−Ｄ２５１）で同定されたキシロースイソメラーゼタンパク質のファミリーを使用して、構築された触媒部位残基およびＰｒｏｆｉｌｅ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）に基づいて同定することができる。
【００７６】
Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭは、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージ（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）のｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを使用して調製される。Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭの元になる理論については、Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）およびＫｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．（（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１）に記載されており、この理論により、１組のタンパク質が、その組のタンパク質のアラインメントにおける各位置に存在する各アミノ酸の確率に基づいて特徴付けられる。
【００７７】
ＢＲＥＮＤＡデータベースにおいて参照される実験的に確認された機能を有する３２のキシロースイソメラーゼタンパク質配列を使用して調製されたキシロースイソメラーゼのＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭは、キシロースイソメラーゼの同定のための基礎を提供する。ＢＲＥＮＤＡは、実験的文献から抽出された酵素速度論、物理的、および生化学的特性についての詳細な情報を含有し、そして関連するデータベース（Ｃｏｌｏｇｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）へのリンクを伴う、人が管理している（ｈｕｍａｎ−ｃｕｒａｔｅｄ）データベースである。これらの３２のタンパク質の配列番号を表１に示す。これらの３２のタンパク質配列を使用して、デフォルトパラメータによるＣｌｕｓｔａｌＷを使用して多重配列アラインメント（ＭＳＡ）を作製した。ＭＳＡの結果を入力データとして使用して表３に示すＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭを調製した。この表ではアミノ酸を１文字コードによって表す。各位置の第１の線は、一致エミッションスコア：その状態において各アミノ酸が存在する確率を表す（最も高いスコアを強調して示す）。第２の線は挿入エミッションスコアを表し、そして第３の線は状態遷移スコアを表す：Ｍ→Ｍ、Ｍ→Ｉ、Ｍ→Ｄ；Ｉ→Ｍ、Ｉ→Ｉ；Ｄ→Ｍ、Ｄ→Ｄ；Ｂ→Ｍ；Ｍ→Ｅ。
【００７８】
Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭに加えて、４つの触媒部位アミノ酸がキシロースイソメラーゼに特有である：ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）キシロースイソメラーゼ配列に対する位置番号でヒスチジン５４、アスパラギン酸５７、グルタミン酸１８１、およびリジン１８３。Ｅ値が３×１０-10以下でキシロースイソメラーゼＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭに適合しこれらの４つの触媒部位残基を有する任意のタンパク質はそのコード領域を改善されたＰｇａｐを含むキメラ遺伝子中に構築して本明細書に記載のように細菌株に形質転換することができるキシロースイソメラーゼである。現在、９０％の非重複レベルに減少したＧｅｎＢａｎｋ配列データベースにおける２５１のタンパク質がこれらの基準に一致する。これらの配列は、当業者によって容易に同定することができるため、本明細書において、それらのすべてを配列番号と共に示すわけではない。利用可能になるこれらの基準に適合するさらなる配列もまた、本明細書に記載のように使用することができる。
【００７９】
当該分野において公知であるとおり、遺伝子コードの縮重によるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の変動が存在し得る。コドンを、標的宿主細胞におけるアミノ酸配列の発現のために最適化して、コードされる最適な発現を提供する。
【００８０】
キシロースイソメラーゼ発現のための細菌細胞の操作
本明細書に記載のキメラ遺伝子は、さらなる操作のために、典型的に、ベクターにおいて構築されるかまたはベクターにトランスファーされる。ベクターは、当該技術分野において周知である。あるベクターは、広範な宿主細菌において複製することが可能であり、そして接合によって移行することができる。ｐＲＫ４０４ならびに３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全かつ注釈付き配列が利用可能である。これらの誘導体は、グラム陰性菌における遺伝子操作のための価値のあるツールであることが証明されている（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ５０（１）：７４−７９（２００３））。
【００８１】
他の周知のベクターを様々な標的宿主細胞に使用することができる。種々の宿主に有用なベクターの例が、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書、１１〜１３頁（本明細書において参照として援用される）に記載されている。米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のｐＺＢ１８８のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の両方において複製することができるベクターが、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における発現に特に有用である。ベクターとして、細胞における自律複製のためのプラスミド、および細菌のゲノムに組み込もうとする構築物を担持するプラスミドを挙げることができる。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドとして、トランスポゾン、標的細菌ゲノムに対して相同の核酸配列の領域、または組み込みを支持する他の配列を挙げることができる。さらなるタイプのベクターは、例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているシステムを使用して、産生されるトランスポゾンであってもよい。所望される標的宿主および所望される機能のための適切なベクターを選択するための仕方は周知である。
【００８２】
改善されたＰｇａｐおよび作動可能に連結されたキシロースイソメラーゼコード領域を含むキメラ遺伝子を有するベクターを、凍結融解形質転換、カルシウム仲介形質転換、エレクトロポレーション、または接合を使用するような周知の方法により導入することによって、細菌細胞を操作することができる。キシロースイソメラーゼ酵素を発現させることによってキシロース資化について操作しようとする任意の細菌細胞は、本明細書に記載のように株を操作するための形質転換のための標的宿主細胞である。特に適切な宿主細胞は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）である。導入されたキメラ遺伝子は、安定に複製するプラスミド上で細胞中で維持することができるか、または導入後にゲノムに組み込むことができる。
【００８３】
細菌細胞ゲノムに組み込まれた改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子で株を操作するために、相同組換え、トランスポゾン挿入、またはトランスポソーム挿入のような当該分野において周知の方法を使用することができる。相同組換えでは、標的組み込み部位にフランキングするＤＮＡ配列を、スペクチノマイシン−耐性遺伝子または他の選択マーカー、および改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子に界接して配置し、選択マーカーおよび改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を標的ゲノム部位に挿入する。さらに、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後、耐性遺伝子がゲノムから切り出されるように、選択マーカーを部位特異的組換え部位に結合させてもよい。本明細書の実施例１および６において使用するＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）のＥＺ：：Ｔｎインビトロ転移システムを使用する転移が、改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子の組み込みに特に適切である。
【００８４】
キシロースイソメラーゼ活性
本明細書に記載の株では、キシロースイソメラーゼ活性レベルは、当該分野において先に記載のレベルより高い。これらの株は、０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌソルビトールデヒドロゲナーゼを含む反応混合物中２０μＬの無細胞抽出物を３０℃で反応させることによって測定した際に、少なくとも約０．１μモル産物／ｍｇタンパク質／分を産生させるレベルでキシロースイソメラーゼを発現するように操作され、ここで、Ｄ−キシルロースが産物である。株は、少なくとも約０．１４、０．２、または０．２５μモル産物／ｍｇタンパク質／分を産生するレベルで、キシロースイソメラーゼを発現してもよい。本明細書に記載の改善されたＰｇａｐを有する高発現プロモーターを使用して、キシロースイソメラーゼコード領域を発現させて、これらの酵素活性レベルを得てもよい。以下に記載のさらなる３つのキシロース代謝経路酵素活性の存在下でもたらされる高キシロースイソメラーゼ活性レベルは、株にキシロース含有培地上での改善された増殖を提供する。
【００８５】
全キシロース資化経路の操作
改善されたＰｇａｐおよびキシロースイソメラーゼコード領域を含むキメラ遺伝子で形質転換することに加えて、細菌株もまた、キシロース資化に必要な他の３つの酵素：キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のために操作され、米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８：３５４−３６１）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０−２４３））、およびＹａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．（（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９）に記載されている。
【００８６】
４つのすべての酵素をコードする遺伝子が存在すると、キシロース資化経路が完成してキシロース資化株を生じることが公知である。３つのさらなる酵素は、個々のキメラ遺伝子から発現させてもよく、または２つ以上のコード領域を含むオペロンから発現させてもよい。
【００８７】
キメラ遺伝子は、キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子について上記のように、プロモーター、コード領域、および３’末端制御領域を作動可能に連結させることによって、構築してもよい。当該分野において周知のとおり、プロモーターは、標的宿主細胞において活性なプロモーターとして選択される。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）において使用することができるプロモーターとして、ＺｍＰｇａｐおよびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エノラーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼのコード領域は、キシロースを資化することが可能ないずれのグラム陰性菌、例えば、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来であってもよい。使用することができるタンパク質配列およびそれらのコード領域配列の例を表２に示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のキシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素をコードする配列（それぞれ、配列番号１０７、１１９、および１３１）が好適である。これらの配列を使用して、完全なキシロース資化経路を発現させるために使用することができるキシロースイソメラーゼについて上記のようなさらなるコード配列を同定してもよい。
【００８８】
さらに、キシロースイソメラーゼについて上記のようなＰｆａｍタンパク質ファミリーおよびＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭを含むバイオインフォマティクス方法を適用して、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素を同定してもよい。これらの酵素をコードする配列は、コドン縮重による多様性を有してもよく、そしてまた、上記のように、特定の宿主における発現のために最適化されたコドンであってもよい。
【００８９】
オペロンは、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のために構築してもよい。１つ以上のコード配列を、改善されたＰｇａｐから発現されるキシロースイソメラーゼコード領域に作動可能に連結させ、オペロンを形成させてもよい。典型的には、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼは１つのオペロンから発現され、そしてトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼは本明細書の実施例１に記載のように第２のオペロンとして発現される。
【００９０】
これらの酵素は、安定に複製するプラスミド上に局在するか、またはゲノムに組み込まれたキメラ遺伝子もしくはオペロンから発現させてもよい。
【００９１】
改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する細菌株の改善された増殖
改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する本明細書に記載のキシロース資化性細菌株、例えば、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、他の糖（「混合糖」）の非存在または存在下でキシロースを含有する培地において改善された増殖を示す。混合糖類は、キシロースに加えて少なくとも１つの糖を含む。細胞の代謝のエネルギー源を提供し得る任意の糖、またはキシロースを含有する混合物に存在する任意の糖が含まれていてもよい。バイオマス糖化から産生される糖上で本発明の株を増殖させることが望ましい。典型的に、バイオマスは、例えば、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレットならびに同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国仮特許出願第６０／６７０４３７号明細書に記載のように、前処置され、次いで、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２）６６：５０６−５７７）によって概説されているように、糖化酵素で処置される。バイオマス糖化は、典型的に、キシロースとグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、および／またはアラビノースとの混合物を含み得る糖類を生成する。
【００９２】
最大限の産生および発酵効率のために、キシロースを含む高レベルの糖類を含有する培地において、本明細書に記載の株を増殖させることが望ましい。これは、バイオマス糖化糖類の直接使用、またはほとんど希釈を伴わない使用を可能にし、それによって、エタノールのような商業的規模の産生に所望される発酵容積が縮小される。より大きな濃度のエタノールのような産物が産生され得るように、高い糖類濃度が使用される。発酵培地中の混合糖の濃度は、典型的に、約１２０ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌまでの間、より典型的には、約１５０ｇ／Ｌ〜約２３５ｇ／Ｌの間である。
【００９３】
例えば、エタノールなどの商業的生産に所望される高濃度混合糖条件では、ソルビトールを発酵培地に含めてもよい。ソルビトール（Ｄ−ソルビトールおよび／またはＬ−ソルビトール）は、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載のように、約２ｍＭ〜２００ｍＭの間、典型的に、約２ｍＭ〜１００ｍＭの間、または５ｍＭ〜２０ｍＭの間の濃度で培地に存在してもよい。同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８００８１３５８号明細書に記載のように、マンニトール、ガラクチトールまたはリビトールを、ソルビトールの代わりにまたはソルビトールと組み合わせて培地に使用してもよい。
【００９４】
キシリトール培地における発酵条件下で、改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する本明細書に記載の株は、ＺｍＰｇａｐから発現されるキシロースイソメラーゼを含む株より改善された増殖を有する。正確な改善は、株のバックグランド、使用する培地、および一般的な増殖条件に依存して、変動する。例えば、本明細書の実施例８、図１３Ａに示すように、５０ｇ／Ｌキシロースを含有する培地で増殖させる場合、１時間後、改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を含む株は、改善されたＰｇａｐを伴わない株より約２〜５倍高いＯＤ６００まで増殖した。
【００９５】
改善されたキシロース資化株の発酵
改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子ならびにキシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子またはオペロンを有する操作されたキシロース資化株は、株の天然産物である産物、または株が産生するように操作された産物を産生するための発酵に使用することができる。例えば、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）は、天然のエタノール産生菌である。例として、本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によるエタノールの産生について説明する。
【００９６】
エタノール産生のためには、改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する組換えキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をキシロースを含む混合糖を含有する培地と接触させる。増殖が阻害されるほど混合糖類の濃度が高い場合、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物を含んでいる。ガラクチトールまたはリビトールを、ソルビトールまたはマンニトールの代わりに使用するか、またはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が発生し、そしてエタノールが産生される培地で増殖する。発酵は、空気、酸素、または他の気体の補充を伴わずに（嫌気性、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）発酵のような条件を含み得る）、少なくとも約２４時間稼動させるが、３０時間もしくは以上行ってもよい。エタノール産生が最大に到達するタイミングは、発酵条件に依存してばらつきがある。典型的には、インヒビターが培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。発酵は約３０℃〜約３７℃の間の温度、約４．５〜約７．５のｐＨで行ってもよい。
【００９７】
本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、キシロースを含む混合糖類を含有する培地中、実験規模の発酵槽、および商業的量のエタノールが産生される大規模化された発酵において増殖させることができる。エタノールの商業的産生が所望される場合、さまざまな培養方法論を適用することができる。例えば、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株からの大規模産生を、バッチおよび連続培養方法論の両方によって産生させることができる。古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。それ故、培養プロセスの開始時に培地に所望の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的には、「バッチ」培養は炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしば、ｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は培養が終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は、静的な対数期を通過して高増殖対数期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期へと加減する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、いくつかの系の最終産物または中間体の大部分の産生を担う。定常期または指数期後の産生は他の系において得ることができる。
【００９８】
標準的なバッチ系の１つの変形は流加培養系である。流加培養プロセスもまた、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖に適切であり、培養の進行に伴って基質を増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含む。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することが所望される場合、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は、困難であるため、これは、ｐＨ、およびＣＯ2のような排気体分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて、見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該分野において一般的かつ周知であり、その例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ．ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）（本明細書において参照として援用される）に見出すことができる。
【００９９】
エタノールの商業的産生は連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、規定された培養培地が連続的にバイオリアクターに添加され、同時に等量の順化培地が処理のために取り出される。一般的に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物および不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、当業者に公知である天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【０１００】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調節することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源のような制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、そして他のすべてのパラメータを加減することが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、それ故、培地を抜き取ることによって起きる細胞の消失は、培養における細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスのための栄養物および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大限にするための技術については、産業微生物学の分野において周知であり、さまざまな方法がＢｒｏｃｋ、上掲によって詳述されている。
【０１０１】
以下の発酵レジメンがエタノール産生に特に適切である。所望される本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、オービタルシェーカー中、約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃で振盪フラスコ中、半複合培地（ｓｅｍｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉｕｍ）で増殖させ、次いで、類似の培地を晩有する１０Ｌ種発酵槽に移す。発酵パラメータがエタノール産生に最適化されている産生発酵槽に種培養物を移す場合、ＯＤ600が３〜６の間になるまで、種培養物を種発酵槽で嫌気的に増殖させる。種タンクから産生タンクに移される典型的な播種容積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズを主材料とする製品（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源のような最小培地成分を含有する。最終濃度で約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。キシロース、およびグルコース（またはスクロース）のような少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖類は、炭素源を提供し、エタノールの率および力価を最大限にするために初期のバッチ処理された炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際して発酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、培養物が、酢酸のような毒性の副産物の形成をもたらし得るグルコースの過渡の蓄積を生じないことを確実にするために、動力学的に調整する。利用する基質から産生されるエタノールの収率を最大限にするために、最初にバッチ処理するか、または発酵過程中に供給されるリン酸塩の量によって、バイオマスの増殖を制限する。発酵は、（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、もしくは水酸化ナトリウムのような）苛性溶液および硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０で制御する。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃に制御する。発泡を最小限にするために、消泡剤（任意のクラス−シリコーンを主材料とするもの、有機物を主材料とするものなど）を、必要に応じて容器に添加する。場合により、汚染を最小限にするために、抗生物質耐性マーカーが存在する株について、カナマイシンのような抗生物質を使用してもよい。
【０１０２】
上記の条件の任意の組、および当該分野において周知であるこれらの条件におけるさらなる変形は、キシロース資化性組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノールの産生のための適切な条件である。
【実施例】
【０１０３】
実施例は、本明細書に記載の本発明を例示する。
【０１０４】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【０１０５】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍr」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍs」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐr」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐs」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＥＦＴ」は発酵経過時間を意味し、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物＋２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含有するリッチ培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4および０．２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含有する接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）を意味する。
【０１０６】
酵素アッセイのためのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の無細胞抽出物の調製
細胞を、５０ｍｌのＲＭ＋２％グルコース中、３０℃で、１晩、１．０〜１．２のＯＤ600まで増殖させた。細胞を４５００ｒｐｍで１０分間、４℃で、遠心分離により回収した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを２５ｍｌ氷冷音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で洗浄し、続いて、４５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。ペレットを２．０〜２．５ｍｌ音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールに再懸濁した。５００μＬアリコートを、１分間、エッペンドルフ遠心管中、４℃で遠心分離した。上清のほとんどを廃棄し、約１０〜２０μＬを残してペレットの乾燥を防止した。細胞を凍結し、そしてアッセイを行うまで約８０℃で貯蔵した。アッセイの前に細胞を融解し、そして５００μＬの音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールで再懸濁した。混合物を，Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０を使用して、４５秒間、６２％デューティサイクルおよび２の出力制御関数で、２回音波処理し、各音波処理の間に、約３〜５分間、サンプルを冷却した。サンプルを、１４，０００ｒｐｍで６０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ微量遠心機中、４℃で遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、４℃で保持した。タンパク質濃度を決定するためにピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡアッセイを使用した。
【０１０７】
トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）アッセイは、この酵素が他の酵素要素より不安定であるため、通常、最初に実施した。ＴＫＴアッセイの概念図を図１Ａに示す。
【０１０８】
マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３７ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、８．４ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＴＰＰ（（チアミン塩化ピロリン酸）、０．６ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、４ｍＭのＢＨＰ（βヒドロキシピルビン酸）、４Ｕ／ｍｌのＰＧＩ（ホスホグルコースイソメラーゼ）、および４Ｕ／ｍｌのＧ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＴＫＴ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１μｍｏｌのＤ−フルクトース６−リン酸／分の形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１０９】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）アッセイの基礎を図１Ｂに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３８ｍＭのＮＡＤＨ、８７ｍＭトリエタノールアミン、１７ｍＭのＥＤＴＡ、３３ｍＭのＦ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）、１．２ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、２．０Ｕ／ｍｌのＧＤＨ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、および２０Ｕ／ｍｌのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）。プレートを５分間、インキュベートし、次いで、Ａ340を３〜５分間、読み取った。ＴＡＬ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μｍｏｌのＤ−グリセルアルデヒドの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク
【０１１０】
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）アッセイの基礎を図１Ｃに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌのＳＤＨ（ソルビトールデヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位のＸＩは、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨＰ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１１１】
キシルロキナーゼ（ＸＫ）アッセイの基礎を図１Ｄに示す。
マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、２．０ｍｍのＭｇＣｌ2−６Ｈ2Ｏ、２．０ＭのＡＴＰ、０．２ＭのＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）、８．５ｍＭのＤ−キシルロース、５Ｕ／ｍｌのＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、および５Ｕ／ｍｌのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースからＤ−キシルロース−５−リン酸への形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１１２】
ＨＰＬＣ方法
分析は、ＬＣ ３ＤのＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアで行った。カラムは、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（１２５−０１２９）を備えたＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（ＨＰＬＣ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｌｕｍｎ １２５−０１４０）であった。操作条件は以下のとおりであった：
【０１１３】
【０１１４】
実施例１
キシロース発酵性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載のように、キシロース発酵性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の株を、連続的な転位事象を介して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）のゲノムに組み込むことによって構築し、続いて、キシロースを含有する選択培地に適応した。以前に、米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書に記載の８ｂと呼ばれるキシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、相同組換えおよびトランスポゾンアプローチの組み合わせを介して、選択抗生物質マーカーと共に２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔをザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）５Ｃのゲノムに組み込むことによって構築し、続いて、適応およびＮＴＧ変異誘導を行った。新たな株の調製では転位（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＥＺ：：Ｔｎインビトロ転位システム）を使用した。このアプローチは，部位特異的相同組換えとは対照的に、利点として組み込み部位の複数の選択肢および比較的高い挿入頻度を付与するからである。キシロース資化酵素をコードする４つの遺伝子を配置し、組み込みのための２つの個別のオペロン：ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔとしてクローニングした。組み込み体の選択のために、２つのＰ１ファージＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（ｌｏｘＰ）によってフランキングされる抗生物質耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍr）遺伝子を各オペロンに付着させた。２つのオペロンの組み込みを２段階の連続様式：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ、続いて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢで達成した。Ｃｍ耐性選択は、各組み込み後、プラスミド上のＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、続いて、プラスミドのキュアリングによって除去されるため、両方の組み込みに使用した。このプロセスにより、選択のために同じ抗生物質マーカーを複数回使用することが可能であった。さらに重要なことに、それは、オペロンの組み込みの選択のために導入される抗生物質マーカーの除去を可能にした。このプロセスは、商業的用途のための発酵株に対する抗生物質耐性遺伝子のネガティブな影響を排除する。
【０１１５】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの構築
米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書（その明細書の実施例９）に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）コード領域を含有する２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ消化によってｐＵＣｔａｌｔｋｔ（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）から単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＭＯＤ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクターにクローニングし、ｐＭＯＤｔｋｔを得た。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ｇａｐ（Ｐｇａｐ；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスアルドラーゼのコード領域（ｔａｌ）に次のとおりに融合することによって、Ｐｇａｐｔａｌと命名されるＰＣＲフラグメントを作製した。配列番号１３および１４のプライマーを使用して、Ｐｇａｐフラグメント（その構築については米国特許第５５１４５８３号明細書（実施例３）に記載されている）をｐＺＢ４から増幅した。ｐＺＢ４は、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢオペロンおよびＰｅｎｏ−ｔａｌ／ｔｋｔオペロンを含有する。配列番号１５および１６のプライマーを使用して、ｔａｌコード領域フラグメントをｐＺＢ４から増幅した。テンプレートとしてＰｇａｐおよびｔａｌフラグメントを使用し、配列番号１７および１８のプライマーを使用して、Ｐｇａｐｔａｌフラグメントを増幅した。このフラグメントをＸｂａＩで消化し、ｔｋｔコード領域の上流のプラスミドｐＭＯＤｔｋｔにクローニングした。Ｃｍｌｏｘ（Ｆ，ｓｆｉ）およびＣｍｌｏｘ（Ｒ，ｓｆｉ）プライマー（配列番号１９および２０）ならびにテンプレートとしてｐＺＢ１８６を使用するＰＣＲによって、ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを作製した。ｐＺＢ１８６は、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プラスミド、ならびに米国特許第５１４５８３号明細書（実施例３）およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）に記載のｐＡＣＹＣ１８４の組み合わせである。最後に、ｌｏｘＰ：：ＣｍＰＣＲフラグメントを、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔを含有するプラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入し、組み込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを形成させた。このプラスミドでは、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを、ｐＭＯＤベクターの２つのモザイク末端（ｍｏｓａｉｃ ｅｎｄ）（トランスポザーゼ結合部位）の間に挿入した。ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号２１として示す。
【０１１６】
ＺＷ１におけるｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの転位および形質転換
プラスミドｐＭＯＤは、ｐＵＣに基づくベクターであり、従って、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における非複製ベクターである。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを、Ｍｇ2+の存在下、室温で１時間、トランスポザーゼで処置し、そして（２００オーム、２５μＦおよび１６ｋＶ／ｃｍに設定したＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用する）エレクトロポレーションによってＺＷ１細胞を形質転換するために使用した。エレクトロポレートした細胞を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１ｍＭのＭｇＳＯ4を補充した１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4）からなる接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＭ）中、６時間、３０℃でインキュベートした。形質転換混合物を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＭＭ中に１５ｇ／ＬのＢａｃｔｏ寒天を含有する寒天プレート上でプレーティングし、そして３０℃で嫌気的にインキュベートした。約２日間後、形質転換体が目視で認められた。形質転換／転位頻度は、約３×１０1／μｇのＤＮＡであった。
【０１１７】
合計で３９個のＣｍr形質転換体コロニーを得た。２１個のコロニーを拾い出し、そしてＰＣＲおよび酵素活性アッセイによってさらに分析した。プライマー配列番号２２および２３を使用するＰＣＲにより、形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの存在を確認した。２１個の組込み体コロニー由来のプラスミドＤＮＡによる戻し形質転換により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で戻し形質転換体が作製されなかったことから、ｔａｌおよびｔｋｔは、ＺＷ１のゲノムに組み込まれたことが示唆された。マイクロプレート用に改変したプロトコル（一般的方法）を使用して、これらの組み込み体をトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性について試験した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイを、タンパク質濃度の決定するために使用した。形質転換体を、１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有するＲＭ培地中、５０ｍｌ円錐遠心管中で３０℃で増殖させた。酵素アッセイでは、コントロール株８ｂおよびＺＷ１も増殖させた（ＺＷ１ではＲＭ＋２％グルコースを使用した）。ＯＤ600が１．０に到達したときに細胞を回収した。細胞を１回洗浄し、そして音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭのＭｇＣｌ2）に再懸濁した。米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書に記載のように、酵素アッセイを行った。単位はμモル／分−ｍｇとして示される。１つを除いて、すべてのサンプルはトランスアルドラーゼ活性およびトランスケトラーゼ活性を有した。
【０１１８】
ｔｋｔプローブを使用して、ＰｓｔＩで消化した選択された組み込み体のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡに対し、サザンハイブリダイゼーションを実施した。ＺＷ１ ＤＮＡは、ｔｋｔプローブとはハイブリダイズしなかった。すべての組み込み体ゲノムＤＮＡサンプルにおいて共通の１．５ｋｂのバンドが認められたが、これは、ｔｋｔ中のＰｓｔＩ部位とｔａｌ中のＰｓｔＩ部位との間に予想されるＤＮＡフラグメントである。第２の認められる高分子量（６ｋｂもしくはそれ以上）のバンドは、独立した系統Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５の間で独特であり、各系統における個別のゲノム組み込み部位を示した。興味深いことに、Ｔ５のプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方ともｔｋｔプローブとハイブリダイズし、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔもまた、生来のプラスミド上のＴ５に組み込まれた可能性があることを示した。Ｃｍrマーカーを除去するためのさらなるＣｒｅ処置のためにこれらの４つの株（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５）を選択した。
【０１１９】
ｔａｌｔｋｔ組み込み体からＣｍrマーカーを除去するためのＣｒｅ処置
染色体からＣｍrマーカーを取り出すため、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５をｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅで形質転換した。このプラスミドは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＺＢ１８８［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書］の誘導体である。ｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅは、それがカナマイシン−耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン−耐性遺伝子を有することを除いて、実施例１０に記載されているＣｒｅ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅ）と同一である。２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を補充したＭＭ寒天プレート上で形質転換体を選択した。Ｓｐr耐性コロニーを拾い出して、２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＲＭ寒天プレートおよび２％グルコースおよび１２０μｇ／ｍＬのＣｍを補充したＲＭ寒天プレート上に移した。採取したコロニーの１００％がＣｍsであったことから、ＣｒｅによるＣｍrの高い効率の切り出しが示された。ＳｐrＣｍs形質転換体を、ＲＭ＋２％グルコース中、３７℃、２〜５回の連日継代で培養し、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦをキュアリングした。各継代時に細胞を希釈し、拾い出して、２００μｇ／ｍＬのＳｐを含むまたは含まない同じ培地のさらなるプレートに移すために、ＲＭ＋２％グルコース寒天プレート上にプレーティングした。ＰＣＲによってＳｐsコロニーを分析して、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦの消失を確認した。組み込み体のプラスミドがキュアリングされた子孫を、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃと命名した。これらの転位組み込み体が安定であるかどうかを調べるために、これらの４つの株を、ＲＭ＋２％グルコース中で増殖させ、次いで、１０ｍｌの同じ培地に移し、そして３７℃で、２回反復測定の試験管中で増殖させた。細胞を、１０日間連日、または約１００代まで継代した。１代および１０代継代後、コロニーを希釈し、そしてコロニー単離のためにＲＭＧプレート上にプレーティングした。試験した各株の各継代由来の１２個のコロニーが、５’Ｐｇａｐおよび３’ｔｋｔプライマー（配列番号１３および２３）を使用するコロニーＰＣＲによるＰｇａｐｔａｌｔｋｔの存在についてポジティブであった。トランスアルドラーゼ活性およびトランスケトラーゼ活性もまた、（一般的方法に記載のとおりに）１代および１０代の継代後の単離体について測定した。４つのすべての組み込み体は、非選択的倍地上の１００代目後もＴＡＬ活性およびＴＫＴ活性の両方について同様のレベルを有したことから、これらの組み込み体が遺伝的に安定であることが示唆された。
【０１２０】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの構築
次の工程は、ＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ組み込み体（Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ）にＰｇａｐｘｙｌＡＢ ｌｏｘＰ：：Ｃｍオペロンをさらに組み込むことであった。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（上記）に基づいて、組み込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを構築した。ＳａｃＩ／ＳｆｉＩ消化によってＰｇａｐｔａｌｔｋｔＤＮＡフラグメントを取り出した。ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｉＩ制限部位を含有するアダプターフラグメントを、ライゲーションによって導入した。次いで、ｐＺＢ４（米国特許第５５１４５８３号明細書）から単離したＰｇａｐｘｙｌＡＢのＮｏｔＩフラグメントを、アダプターのＮｏｔＩ部位にクローニングした。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）はｘｙｌＡによってコードされ、そしてキシルロキナーゼ（ＸＫ）はｘｙｌＢによってコードされる。ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号２４として示す。
【０１２１】
Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５ＣにおけるｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの転位および形質転換
ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの組み込みと同様のアプローチを使用して、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃを、トランスポザーゼで処置したｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ（上記）で形質転換／転位した。Ｃｍ選択後の２回の形質転換／転位実験で、６つの組み込み体（Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ２）を得た。すべてについて、２つの組のプライマー：配列番号２５、および２６、ならびに配列番号１５および１６を使用するＰＣＲによって、ｘｙｌＡＢの存在か確認されたが、但し、Ｔ２ＣｃｍＸ１およびＴ２ＣｃｍＸ６については、プライマー配列番号２５および２６を使用すると、ＰＣＲフラグメントが検出されなかった。
【０１２２】
２つのＰＣＲネガティブ系統を含む組み込み体を、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性についてアッセイした（一般的方法）。図２および３に示される結果は、６つのｘｙｌＡＢ組み込み体Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、およびＴ５ＣＣｍＸ２はすべて、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性を有したことを示した。ネガティブな親コントロールと比較して、ＸＩおよびＸＫ活性が新たに獲得された（図２）。ＴＡＬおよびＴＫＴ活性は、親コントロールと同じように維持された。すべての結果は、タンパク質が生成され、かつ機能的であることを示した。酵素活性レベルにはばらつきが認められたが、ＴＩおよびＸＫ活性は、同じプラスミドで形質転換／転位されたＺＷ１組み込み体のＴＩおよびＸＫ活性と同様であった。ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴの活性のレベルは株８ｂより低かった。
【０１２３】
ｘｙｌＡＢオペロンの組み込みを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した。６系統のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの両方を、ＳｐｈＩで消化し、そしてジゴキシゲニン標識ｘｙｌＢプローブにハイブリダイズさせた。ｘｙｌＢにおけるＳｐｈＩ部位およびｐＭＯＤベクター上の隣接するクローニング部位におけるもう１つのＳｐｈＩ部位から作製される約３ｋｂの共通のバンドは、すべてのゲノムＤＮＡサンプルに存在し、さらに、ゲノムＤＮＡサンプル中に、より高い分子量のハイブリダイズバンドが認められたことから、染色体にＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのための４つの組み込みの部位が存在することが示された。Ｔ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２は同じ組み込み部位を有するようであり、Ｔ３ＣＣｍＸ３およびＴ４ＣＣｍＸ１は同じ組み込み部位を有し得、そしてＴ５ＣＣｍＸ１およびＴ５ＣＣｍＸ２はそれぞれ個別の組み込み部位を有した。ＰｓｔＩによる同じＤＮＡの消化、それに続く、ｔｋｔプローブとのサザンハイブリダイゼーションにより、各組み込み体はそのそれぞれの親株と同じハイブリダイゼーションパターンを有したことが実証された。
【０１２４】
キシロース培地におけるＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ＰｇａｐｘｙｌＡＢ Ｃｍ組み込み体の適応
キシロース資化のための４つのすべての酵素活性が存在しているにもかかわらず、先の観察（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）では、組み込み体は、キシロース上で直ぐには増殖しないことが示された。キシロース上での増殖は、（試験管中またはプレート上のいずれかにおける）キシロース培地上での長期のインキュベーション、適応と呼ばれるプロセス後、生じ得る。
【０１２５】
株は、以下のとおりに適応させた。ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組み込み体株を、ＲＭＸ（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２０ｇ／ｌまたは２％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する）を含有する試験管、ならびにＭＭＧＸまたはＭＭＸプレート（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＭｇＳＯ4、１．５％（ｗ／ｖ）寒天、０．０２５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび４％（ｗ／ｖ）キシロースもしくは４％（ｗ／ｖ）キシロースのみ）上に播種した。低レベルのグルコースを使用して、初期の増殖を支持し、適応中の変異の可能性を増加させた。培養およびプレートの両方におけるキシロースに対する適応について少なくとも５つ試みたうちの１つが成功であった。３０℃での１０日間の嫌気的インキュベーションの後、１７および１９個のコロニーが、それぞれＴ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２細胞をプレーティングしたＭＭＧＸ上で認められた。コロニーは小さく、そしてプレート上では健常でないように見えた（透明であった）。１２個のコロニー（Ｔ３ＣＣｍＸ１プレーティング由来の４個：Ｔ３ＣＣｍＸ１１、Ｔ３ＣＣｍＸ１２、Ｔ３ＣＣｍＸ１３およびＴ３ＣＣｍＸ１１０；Ｔ３ＣＣｍＸ２プレーティング由来の８個：Ｔ３ＣＣｍＸ２４、Ｔ３ＣＣｍＸ２５、Ｔ３ＣＣｍＸ２６、Ｔ３ＣＣｍＸ２７、Ｔ３ＣＣｍＸ２８、Ｔ３ＣＣｍＸ２９、Ｔ３ＣＣｍＸ２１１およびＴ３ＣＣｍＸ２１２）をＲＭＧＣｍ１２０に播種し、そしてさらなる適応のために３ｍｌのＲＭＸに移して、キシロース上でより迅速に増殖することが可能な系統を得た。
【０１２６】
３ｍｌのＲＭＸを含有する試験管における組み込み体の適応は、３０℃で行った。ＯＤ600を、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計で絶えずモニターした。増殖が対数期の中間部に到達したら、培養をＲＭＸの新鮮な管に移した。このプロセスを７継代連続した。継代の間に増殖速度および最終ＯＤ（非線形的な読み取り）が改善された。
【０１２７】
６回目の継代において、培養物をＲＭＸプレート上から画線して、単一のコロニーを単離した。３つの組込み体：Ｔ３ＣＣｍＸ１３、Ｔ３ＣＣｍＸ２６およびＴ３ＣＣｍＸ２７が、ＲＭＸ画線プレート上で他より迅速に増殖したが、これらを、以下の表および考察でＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７と称する。最良のキシロース資化増殖体をスクリーニングするために、ＴＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７に対するそれぞれ４個の大きな（Ｌ１−４）および４個の小さな（Ｓ１−４）コロニーを選択し、そして増殖、糖資化、およびエタノール産生をモニターし得るように、ＲＭＸ試験管中で増殖させた。コロニーを、１晩、３０℃で増殖させ、続いて、２回反復測定の試験管中３ｍｌのＲＭＸにＯＤ600＝０．０５を播種した。Ｘ２７は、ＲＭＧにおいて他の培養物より遅く増殖し、６．５時間後に再度播種した。６９時間（Ｘ２７では６２．５時間）後、サンプルを、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のために採取した。図４は、６９時間目（すべてのＸ２７培養物については６２．５時間）での培養の平均エタノール収率（理論的収率の％）およびキシロース資化（％）を示す図表である。大きなコロニーと小さなコロニーとの間で、有意差は認められなかった。Ｘ２７の性能は、キシロース上のＸ２６と比較して、より良好であったが、それは、グルコース上では、より遅い増殖を示した。従って、最上位の性能を示すもの、Ｘ１３（Ｘ１３Ｌ３）およびＸ２６（Ｘ２６Ｌ１）の大きなコロニーを、ｐＨ制御された発酵におけるさらなる評価のために選択した。発酵を、ＲＭＧ（６％グルコース）、ＲＭＸ（６％キシロース）およびＲＭＧＸ（８％：４％；グルコース：キシロース）中、３７℃で、株Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１、ならびにコントロール株８ｂについて行った。ＲＭＧ（６％）およびＲＭＧＸ（８％：４％）で増殖したＸ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１によるグルコースの発酵は、かなり迅速に進行した。ＲＭＧＸ（８％：４％）におけるキシロースの発酵は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１では両方とも株８ｂと比較して緩徐であった。さらに、ＲＭＸ（６％）上、３７℃での増殖は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１の両方とも、長い停滞の後に生じた。いくらかの単離体、Ｘ１３ｂ、Ｘ１３ｃおよびＸ１３ＦＬを、ＲＭＸ（６％）発酵から回収した。これらの単離体を、本来の株Ｘ１３ａ（Ｘ１３Ｌ３の単離体）およびＸ２６と共に、本実施例において先に記載のようにＣｒｅ処置に供して、ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株からＣｍrマーカーを取り出した。得られたＣｒｅ処置されたＣｍrを含まない組込み体を：Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ１３ＦＬＣおよびＸ２６Ｃと命名した。
【０１２８】
実施例２
株ＺＷ６５８の適応および選択
先に記載のように、ＲＭＸ上、３０℃での初期のＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株の適応により、これらの条件における株の増殖が顕著に改善された。しかし、適応された株は、ＲＭＸ（６％）における３７℃での増殖および発酵の間、長い停滞を蒙る。より高い糖濃度および温度を含む好適なプロセス条件でのキシロース発酵のために組込み体をさらに改善するために、進化または適応プロセスをＲＭＸ（５％）中３７℃で継続させた。連続継代を行い、そして最も良好な資化増殖体を選択した。このプロセスで使用した組込み体は、Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ２６ＣおよびＸ１３ＦＬＣを含んだ。これらの５つの株をＲＭＸ中３０℃で６継代増殖させた後、さらに５〜１６代の継代のために３７℃でＲＭＸ（５％）に移した。すべての継代中および後、培養物をＲＭＸプレート上に画線し、そして３７℃でインキュベートして、単一のコロニーを単離した。大きなコロニーについてさらに、ＲＭＸプレート上での画線および３７℃でのインキュベートを３〜４回行い、コロニーを精製した。最終的な大きなコロニーを、ＲＭＸ（５％）における３７℃での増殖試験のために選択した。
【０１２９】
ＲＭＸ（５％）培地における３７℃での適応由来の株の評価
連続継代による適応後に単離した１８個のコロニーを、はじめに、ＲＭＸ（５％）試験管中、３７℃で試験した。１２の株を、第２の試験管評価のために選択した。比較のために、株８ｂをすべての評価に含めた。１８個のコロニーを、ＲＭＧで３７℃で１晩増殖させ、遠心分離し、そして細胞を第１の評価のために試験管中４ｍｌのＲＭＸ（５％）に３７℃で静置状態で接種した。増殖（ＯＤ600、非線形的）およびエンドポイントのＨＰＬＣ結果（低い残留キシロースおよび高エタノール）に基づいて、１２の株を第２の評価のために選択した。
【０１３０】
第２の評価の目的の１つは、キシロース上での改善された増殖の安定性および株のキシロース資化能を試験することであった。１２のすべての株を安定性研究に供して、適応された株を非選択培地に暴露して３７℃で５０代連続的に継代培養させた後にそれらが安定であるかどうかを調べた。ＲＭＧ（５％）継代培養の前および後の培養物をＲＭＸ（５％）試験管に播種し、そして評価のために３７℃で増殖させた。非線形的ＯＤを、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ６０１分光光度計により試験管の直接読み取りによってモニターした。ＲＭＧにおける５０代の増殖の前および後のＲＭＸ（５％）における増殖の７０時間目のＯＤを、図５にプロットした。結果は、ほとんどの株がＲＭＧ、３７℃において５０代後も安定であったことを示した。（定常期における）エンドポイントの上清もまた、キシロースおよびエタノール濃度についてＨＰＬＣによって分析した。これらの培養物において低い残留キシロースおよび高いエタノール濃度が認められたことから、株が増殖し、そしてキシロースを良好に発酵したという事実が支持された。
【０１３１】
上記の試験管評価（低い残留キシロース、高いエタノール濃度およびより高いＯＤ）ならびに高度の糖類における、および酢酸塩の存在下でのより良好な増殖体を選択するための高濃度のグルコースおよび／またはキシロース（２０％まで）、およびグルコースおよびキシロースと酢酸塩との混合物による以後のマイクロタイタープレート増殖スクリーニングの結果に基づいて、全体的に最も良好な性能を示した、例えば株番号２６を、ＺＷ６５８と称した。
【０１３２】
実施例３
ペントースリン酸経路酵素活性のアッセイ
組み込まれた遺伝子によってコードされる４つのキシロース資化酵素（実施例１に記載）の活性を、（実施例１の）高度の糖および３７℃における適応について選択された株のうち３つについて、一般的方法に記載のとおりに測定し、そして（実施例２の）さらに適応された株ＺＷ６５８における同じ酵素の活性と比較した。結果を、μモルの産物／ｍｇタンパク質／分で表し、表４に示す。
【０１３３】
表４．異なるキシロース資化適応Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株における酵素活性
【０１３４】
ｘｙｌＡＢオペロンの両方のメンバーについての活性レベルは、部分的に適応された前駆体株におけるレベルと比較して、さらに適応された株ＺＷ６５８において約４〜８倍増化した。ｔａｌ／ｔｋｔオペロンからの酵素の発現レベルは、ＺＷ６５８と部分的に適応された前駆体株との間で、ほとんどまたは全く変化が認められなかった。
【０１３５】
実施例４
部分的に適応された株およびＺＷ６５８におけるＸＹＬＡＢオペロンのプロモーター領域の配列比較
ｘｙｌＡＢを駆動するＧＡＰプロモーター（Ｐｇａｐ）の制御下での両方の遺伝子の産物の酵素活性レベルの明確な変化がＺＷ６５８をもたらす適応の結果として認められたため、部分的に適応された株（実施例１；その後株番号ＺＷ６４１が与えられた）およびＺＷ６５８由来のそのオペロンのプロモーター領域をＰＣＲによって増幅し、そして配列決定した。ＰＣＲフラグメントを、ｒｅｃＧコード領域由来の順方向ＰＣＲプライマー（ＰＣ１１；配列番号２７）（ここにＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンを組み込んだ）およびｘｙｌＡコード領域由来の逆方向プライマー（ＰＣ１２；配列番号２８）を使用して、調製した。得られた９６１ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマーＬＭ１２１、ＬＭ１２２、およびＬＭ１２３（配列番号２９、３０、および３１）を使用して配列決定した。ＺＷ６４１由来のプロモーター配列を配列番号３に示し、そしてＺＷ６５８由来のプロモーター配列を配列番号４に示す。これらのプロモーター配列は、両方とも、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４におけるＰｇａｐの公開された配列（配列番号１）とは１箇所の位置において異なることを見出した：ＧＡＰコード領域のＡＴＧ開始コドンから数えて上流の５’末端の方向へ−２１位の次の（Ｔの）１塩基欠失である。この配列の変化は両方の株に存在するため、それは、ＺＷ６４１のＰｇａｐとＺＷ６５８のＰｇａｐとの間の発現の差異に寄与しない。この共通の変化に加えて、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８のＰｇａｐ配列の間に１塩基対の差異も認められた。ＺＷ６４１株由来の配列におけるＸｙｌＡのコード領域開始ＡＴＧに対する−１８９位のＧが、ＺＷ６５８由来の配列ではＴに置き換えられた。２つの配列の間ではそれ以外の違いは認められず、ＧＡＰプロモーター領域におけるこの１つの塩基変化による発現レベルの違いがそのプロモーターの制御下の遺伝子によってコードされる両方のタンパク質に見出された酵素活性の増加を担うようであった。
【０１３６】
実施例５
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１においてＸＹＬＡ／Ｂオペロンを駆動する同じＰＧＡＰを有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のためのキシロースイソメラーゼ発現ベクターの構築
出発物質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）シャトルベクター（ｐＺＢ１８８）を使用して、以下に記載のように、スペクチノマイシンに対する耐性およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの発現を付与するプラスミド構築物（ｐＺＢ１８８／ａａｄａ−ＧａｐＸｙｌＡ；ここで、Ｇａｐはプロモーターを表す）を作製した（図６Ａ）。ｐＺＢ１８８の構築に関与する工程については、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に開示されている。簡単に説明すると、この７００８ｂｐのプラスミドは、２つの異なる複製開始点を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に対して１つずつ有するため、それぞれの細菌種において複製することが可能である。ｐＺＢ１８８はまた、テトラサイクリン（すなわちＴＣr−カセット）に対する耐性を付与するＤＮＡフラグメントも含む。ｐＺＢ１８８／ａａｄａ−ＧａｐＸｙｌＡの構築における第１の工程は、ｐＺＢ１８８からＴｃr−カセットを取り出し、それを、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｓｐｅｃr−カセット）で置き換えることであった。以下に詳細に説明するように、ｐＺＢ１８８からＴｃr−カセットを切り出すために、プラスミドをＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。テンプレートしてプラスミドｐＨＰ１５５７８（Ｃａｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０８２−１０８７）ならびにプライマー１（配列番号３２）および２（配列番号３３）を使用して、ＰＣＲによってＳｐｅｃr−カセットを作製した。プラスミドｐＨＰ１５５７８は、Ｓｐｅｃr−カセットおよびそのプロモーターの完全なヌクレオチド配列を含有し、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンＴｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３）の公開された配列に基づく。
プライマー１（配列番号３２）
ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴａｔｃｇａｔＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＴ
プライマー２（配列番号３３）
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴａｃｇｃｇｔＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＣ
【０１３７】
プライマー１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットのプロモーターの直ぐ上流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ４〜２２に）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＣｌａＩ部位に対応する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットの終止コドンから約１３０塩基下流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ１００２〜１０２０）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｆｌＩＩＩ部位に対応する。１０４８ｂｐのＰＣＲ作製したＳｐｅｃr−カセットをＣｌａＩおよびＡｆｌＩＩＩで二重消化し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）を使用し、および販売者の推奨するプロトコルに従って、精製した。次の工程では、（ｄａｍメチル化に対して感受性である）ＣｌａＩでの切断のための非メチル化プラスミドＤＮＡを得るための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ-、ｄａｍ-）から単離されたプラスミドｐＺＢ１８８を、ＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで二重消化して、Ｔｃr−カセットを取り出し、そして得られた大きなベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、このＤＮＡフラグメントおよびクリーンアップされたＰＣＲ産物を共にライゲートし、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００２３９）から得られた化学的にコンピテントな細胞を使用して、形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０に導入した。ＢｓｓＨＩＩおよびＡｆｌＩＩＩは適合性の「接着末端」を生成するが、両方の部位が一緒に連結されるとそれらの部位が破壊されることにさらに留意すること。形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングし、３７℃で増殖させた。正確なサイズ挿入部を有するプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩによる制限消化分析によって同定し、さらなる操作のために選択したプラスミドを以下でｐＺＢ１８８／ａａｄＡと称する。この構築物の環状図を図６Ｂに示す。
【０１３８】
次の工程では、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡをＮｃｏＩおよびＡｃｌＩの両方の酵素で切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって大きなベクターフラグメントを精製した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットとしての役割を果たす約２ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＺＢ４の構築物をＮｃｏＩおよびＣｌａＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって関連ＤＮＡフラグメントを精製することによって、プラスミドｐＺＢ４から単離した。プラスミドｐＺＢ４については、米国特許第５５１４５８３号明細書に詳述されており、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡ（配列番号３４）の略図を、図６Ｄの枠内の概念図に示す。
【０１３９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを含有するフラグメントは、それぞれ、その５’末端にＮｃｏＩ部位および３’末端にＣｌａＩ部位を有する。米国特許第５５１４５８３号明細書においてより詳細に記載されているように、このフラグメントは、キシロースイソメラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡオープンリーディングフレーム（ｎｔ６２０〜１９４２）の完全なオープンリーディングフレームに正確に融合される強力な構成性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター（ｎｔ３１６〜６１９）を含有する。それはまた、キシロースイソメラーゼ終止コドンの直後に続く小さなステムループ領域（ｎｔ１９６５〜１９９９）を含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、標準的な連結反応で、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。ＣｌａＩおよびＡｃｌＩは適合性の「接着末端」を作製するが、両方の部位が一緒に連結されるとそれらの部位が破壊されることにさらに留意すること。次いで、ライゲーション反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ-、ｄａｍ-）にエレクトロポレートして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のその後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを入手し、そして形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上でプレーティングした；増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物を有するプラスミドを有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩおよびＡｃｌＩによる制限消化分析によって同定した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１株において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのさらなる操作および過剰発現のために選択したプラスミドを以下では「ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１Ｇａｐ−ＸｙｌＡ」と称する；このプラスミド構築物の環状図を図６Ｃに示す。
【０１４０】
たとえ、配列番号３４のヌクレオチド配列が同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（ＰｇａｐＸｙｌＡ）に対応するとしても、配列番号３４のヌクレオチド配列は、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書における配列番号３４に記載のヌクレオチド配列と同一ではないに留意することが重要である。本研究における配列番号３４に開示されたＤＮＡ配列は、米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書における配列番号３４のｎｔ５９９に対応するＰｇａｐにおいて１ｂｐの欠失を有する。先の特許出願に報告されたヌクレオチド配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４のＰｇａｐの公開されたＤＮＡ配列（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１２）：５６５３−５６６２（１９８７））に基づいていたが、当時、プロモーターは再配列決定されなかった。しかし、最近、本発明者らは、ｐＺＢ４におけるＰｇａｐもまた同じヌクレオチドを欠き、そして３つのすべての特許出願に使用された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（ＰｇａｐＸｙｌＡ）が上記のこのプラスミドから駆動されることを発見した。
【０１４１】
実施例６
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４においてＸＹＬＡ／Ｂオペロンを駆動する同じＰＧＡＰを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターの作製
プラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄａ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）と同一であるが、ＺＷ６５８において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐの−１８９位に存在するＧ→Ｔ変異に対応するＰｇａｐにおける１つのヌクレオチド置換を有する。以下に記載のようにＺＷ６５８から連続的に誘導された株ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４にも同じ点変異が存在する。ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４の構築および特徴付けについては、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書に詳述されている。ＺＷ８００は、この活性を不活化するグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）酵素をコードする配列へのスペクチノマイシン耐性カセットの二重交差挿入を有するＺＷ６５８の誘導体である。ＺＷ８０１−４は、部位特異的組換えによってスペクチノマイシン耐性カセットが欠失され、タンパク質を未成熟にトランケートするインフレームの終止コドンが後に残ったＺＷ８００の誘導体である。これらの操作のいずれも、ＺＷ６５８においてＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動する変異Ｐｇａｐプロモーターのヌクレオチド配列を変異しなかった。それ故、「８０１ＧＡＰプロモーター」とは、次の株：ＺＷ６５８、ＺＷ８００、およびＺＷ８０１−４に存在するプロモーター配列を指す。
【０１４２】
ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡを作製するために使用した工程およびプラスミド中間体を、プラスミドｐＭＯＤ−リンカーを出発点として時系列で説明する。
【０１４３】
ｐＭＯＤ−リンカーの構築
プラスミドｐＭＯＤ−リンカーの前駆体は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）であった。図７Ａに示すように、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞は、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（ｏｒｉ）、およびＴｎ５トランスポザーゼが相互作用する２つのモザイク末端（ＭＥ）の間に位置するマルチクローニング部位を有する。ｐＭＯＤ−リンカーの構築における第１の工程は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞における本来のマルチクローニング部位を取り出すことであったが、これは、それを、ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩに独特の制限部位を有する新たなマルチクローニング部位で置き換えることであった。これは、プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動により大きな（約２．５Ｋｂｐの）ベクターフラグメントを精製することによって行った。次いで、新たなマルチクローニング部位を、両方ともそれらの５’末端でリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド、リンカーＢ（配列番号３５）およびリンカーＴ（配列番号３６）を共にアニーリングすることによって作製した。
【０１４４】
これらのオリゴヌクレオチドは相互に相補的であり、そして一緒にアニーリングすると両末端に一本鎖オーバーハング（小文字）を有する二本鎖のリンカーを形成し、このリンカーは、ＤＮＡフラグメントが、上記の大きなｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞ベクターフラグメントのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に連結することを可能にする。上記のように、この合成リンカーもまた、以後のクローニング工程に使用することができる３つの固有の制限部位（ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩ）を含有する。ＳｂｆＩ部位には細線で下線を付し、ＦｓｅＩ部位には太線で下線を付し、そしてＡｓｉＳＩ部位には２本の細線で下線を付す。リンカーＢおよびリンカーＴを共にアニーリングし、そして標準的なライゲーション反応において、得られたＤＮＡフラグメントをｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。連結反応混合物を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地上でプレーティングした。次いで、プラスミドＤＮＡを新たなマルチクローニング部位を含有する代表的なアンピシリン耐性コロニーから単離した。得られたプラスミド構築物（以下、「ｐＭＯＤ−リンカー」と称する）の環状図を図７Ｂに示す。
【０１４５】
ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃの構築
スペクチノマイシンに対する耐性（Ｓｐｅｃr）を付与し、そして両方の末端に野生型ｌｏｘＰ部位を有するＤＮＡフラグメントを上記のｐＭＯＤ−リンカー構築物のＡｓｉＳＩ部位とＦｓｅＩ部位との間に挿入した。ｌｏｘＰフランキングＳｐｅｃrカセットの供給源は、米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書に詳述されているプラスミドｐＬＤＨ−Ｓｐ−９ＷＷ（図８）であった。第１の工程では、ＭＯＤ−リンカープラスミドＤＮＡを、ＦｓｅＩおよびＡｓｉＳＩで連続的に消化し、そしてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＤＯ４００３）から購入したＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ−５スピンカラムキットを使用して、大きなベクターフラグメントを精製した。次に、プラスミドｐＬＤＨ−Ｓｐ−９ＷＷもまた、同じ２つの酵素で二重消化し、そしてｌｏｘＰフランキングＳｐｅｃrカセットを含有する小さな（約１．１Ｋｂｐの）ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上に置き、そして増殖は３７℃とした。次いで、プラスミドＤＮＡを正確なサイズのＤＮＡフラグメントを含有するアンピシリン耐性コロニーのうちの１つから単離し、そしてこれを以後の操作に使用した。構築物（以下、「ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ」と称する）の環状図を図７Ｃに示す。
【０１４６】
ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡの構築
Ｐｇａｐ全体、ＸｙｌＡコード領域、ならびにＸｙｌＡおよびＸｙｌＢオープンリーディングフレームの間に存在するステムループ領域を含有するＤＮＡフラグメントを、プライマー３および４（それぞれ、配列番号３７および３８）ならびに再懸濁した細胞をテンプレートとして使用して、ＺＷ８０１−４からＰＣＲ増幅した。既に記載のように、ＤＮＡ配列解析により、ＺＷ８０１−４は、組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐプロモーターにおいて−１８９位でＺＷ６５８と同じＧ→Ｔ点変異を有し、そして両方の株のＰｇａｐが同一であることが示された。
プライマー３（配列番号３７）
ＴＣＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＧＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣ
プライマー４（配列番号３８）
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃｔｇｃａｇｇＣＣＧＡＴＡＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＣＧＴＴＣＣ
【０１４７】
プライマー３（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｐｇａｐの最初の２２塩基（および配列番号３４のｎｔ３１６〜３３７）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に対応する。プライマー４（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＸｙｌＡ終止コドンの後方に存在するステムループ領域の直ぐ下流（および配列番号３４の最後の１２ｎｔ）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。
【０１４８】
ＰＣＲ産物を、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩで二重消化し、そしてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＤＯ４００３）から購入したＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ−５スピンカラムキットを使用して精製した。次に、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃを同じ２つの酵素で切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、同じ手順を使用して精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上にプレーティングし、そして増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物のプラスミドを含有する形質転換体を、テンプレートとしてプライマー３および４ならびに再懸濁したコロニーを使用するＰＣＲ（「コロニーＰＣＲ」）によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以下で、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡと称し、そしてこの構築物の環状図を図９に示す。
【０１４９】
Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡ遺伝子ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅に使用したテンプレートがＺＷ６４１の細胞懸濁液であったことを除いて、上記の同じ工程を使用して、以下、「ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ」と称するもう１つのプラスミドを作製した。ＺＷ６５８（およびＺＷ８０１−４）とＺＷ６４１とを区別するＰｇａｐにおけるＧ→Ｔ置換を除いて、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは同一である。
【０１５０】
ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡの構築
実施例６の最初の段落に記載のように、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡに同一なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターであるが、それは、ＺＷ６５８（およびＺＷ８０１−４）に組み込まれたＰｇａｐ−ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐにおける同じＧ→Ｔ置換を有する。このプラスミドを構築するため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ａ）をＭｌｕＩおよびＳａｌＩで二重消化し、そしてより小さなＤＮＡフラグメント（約１１００ｂｐ）を、アガロースゲル電気泳動およびＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、精製した。このフラグメントはＰｇａｐのＧ→Ｔ置換およびＸｙｌＡ ＯＲＦの一部を含有するが、後者の構築物を同じ２つの酵素で切断し、そして大きなベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ｂ）において対応するフラグメントを置き換えるために使用した。次いで、２つのフラグメントを共にライゲートし、そしてエレクトロポレーションを使用して、ライゲーション反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングし、そして増殖は３７℃であった。プラスミドＤＮＡをスペクチノマイシン耐性コロニーから単離し、そしてＰｇａｐプロモーターＧ→Ｔ置換の存在を、ＤＮＡ配列解析によって確認した。以後の操作に使用したプラスミド（「ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ」）を図１０Ｃに示す。
【０１５１】
実施例７
ＺＷ６４１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの過剰発現
表４における酵素活性測定値は、ＺＷ６４１からＺＷ６５８へのトランジション中にキシロースイソメラーゼ活性およびキシルロキナーゼ活性が劇的に増加することを示す。キシロースイソメラーゼが、ＺＷ６４１におけるキシロース上での増殖の律速酵素であるという仮説を試験するため、マルチコピープラスミド、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）を使用して、酵素をこの株で過剰発現させた。この実験のコントロールは、Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを欠くマルチコピープラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡで形質転換されたＺＷ６４１であった（図６Ｂ）。これらの両方のプラスミドの構築については、実施例５に記載されており、そして形質転換プロトコルは、本質的に、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書の実施例５に記載のとおりであった。簡単に説明すると、エレクトロポレーションを使用して、非メチル化プラスミドＤＮＡ（ｄｃｍ-およびｄａｍ-株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０から単離された）をＺＷ６４１に導入し、そして形質転換細胞を、２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上にプレーティングした。嫌気条件下３０℃で４８時間の培養期間後、各プラスミドについて、３つの初代形質転換体を無作為に選択し、そしてこれらを、さらなる特徴付けのために同じ増殖培地を含有する寒天プレート上にパッチした（移した）。
【０１５２】
図１１は、６４１Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミドを保持する３つの株（Ｘ１、Ｘ２およびＸ２）ならびにコントロールプラスミドを保持する３つの株（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のキシロース含有培地における増殖曲線（ＯＤ600対時間）を示す。この実験は、振盪フラスコ（１５０ｒｐｍで１５ｍｌ試験管中５ｍｌの培養液）中３０℃で実施し、そして増殖培地は、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）をも含有するｍＲＭ３−Ｘ１０（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１００ｇ／Ｌキシロース）であった。培養は、上記の段落において記載のパッチしたプレート由来の１植菌耳の細胞から開始し、そしてそれぞれの場合の初期ＯＤ600は約０．１３であった。ＺＷ６４１と同様に、コントロールプラスミドを含む３つの株はキシロース上ではほとんど増殖しなかった。全く対照的に、ＺＷ６４１を、６４１Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミド、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡで形質転換した場合、キシロース上での増殖の速度および程度（最終ＯＤ600値）の両方とも劇的に改善された。このプラスミドを有する３つのすべての株は、図１１に示す実験において同じ挙動を示したため、Ｘ１株およびＣ１株のみをさらなる特徴付けに供した。
【０１５３】
図１２は、スペクチノマイシンを伴わない同じキシロース含有増殖培地におけるＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の並列比較を示す。この実験の条件は、上記の条件と同一であったが、２０ｍｌ培養液を、５０ｍｌ試験管中で増殖させ、そして初期ＯＤ600は約１／４であった（０．０３５）。図１２Ａに示す増殖曲線を線形目盛（ＯＤ600対時間）でプロットする一方、図１２Ｂは、指数増殖速度を比較するために、対数目盛（ｌｏｇＯＤ600対時間）に対してプロットした同じ実験データを示す。この実験から、Ｘ１の指数増殖速度は、キシロース適応株ＺＷ６５８とほとんど同じ速さであること、およびこの株は、コントロールプラスミドを伴っても伴わなくても親株ＺＷ６４１よりかなり良好にキシロース上で増殖することが明らかである。それ故、（マルチコピープラスミド由来の６４１Ｐｇａｐプロモーターによって駆動される）ＺＷ６４１におけるキシロースイソメラーゼの高発現は、キシロース上での増殖に対して、キシロースイソメラーゼ活性の増加がＺＷ６５８に対して及ぼす効果（表４に示す）に類似の効果を及ぼす。Ｘ１の最終的なバイオマス収量は、ＺＷ６５８によって得られる収量の約１／２であるが、このデータから、ＺＷ６４１におけるキシロース上での増殖の律速酵素はキシロースイソメラーゼであることが明らかである。図１１および１２に示される実験から、次の他の２つの興味深い可能性がさらに示唆される：（１）ＺＷ６４１からＺＷ６５８へのトランジション中に生じるキシロースイソメラーゼ活性の大きな増加（表４）が、「キシロース適応」プロセス中に生じたキシロース上でのより良好な増殖の主な原因であったこと；および（２）キシロースイソメラーゼ活性の増加は、ＺＷ６５８に存在する染色体上に組み込まれたＰｇａｐ−ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐプロモーターにおけるＧ→Ｔ置換から生じ得たこと。
【０１５４】
実施例８
ＺＷ６４１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのトランスポゾン仲介組み込み
ＺＷ６４１および２つのプラスミド構築物（ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ）を使用して、ＺＷ６５８に組み込まれたＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＧ→Ｔ置換を有するＰｇａｐプロモーター（以後、「８０１ＧＡＰプロモーター」と称する）が、ＺＷ６４１における対応するプロモーター（以後、「６４１ＧＡＰプロモーター」と称する）より強力であるという仮説を試験した。ＺＷ６４１は、キシロース上ではほとんど増殖することができず、そしてこの株でキシロースイソメラーゼが過剰発現すると、キシロース上での増殖がより速くなる（実施例７、図１１および１２）ため、ＺＷ６４１をこれらの実験に選択した。基本理念は、（６４１ＧＡＰプロモーターまたは８０１ＧＡＰプロモーターによって駆動される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ遺伝子の追加のコピーをＺＷ６４１の染色体へ導入すること、およびどちらの構築物がキシロース上で最も速く増殖するかを調べることであった。Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅのトランスポソーム技術を使用して、２つのキメラ遺伝子の染色体組み込みを達成した。
【０１５５】
既に示したように、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、後者の構築物のＰｇａｐプロモーターにＧ→Ｔ点変異が存在することを除いて、同一のプラスミドである。両方の場合においてＤＮＡへの無作為な挿入に使用された転移因子は、２つの１９ｂｐのモザイク末端（ＭＥ）およびそれらの間に挟まれる全ＤＮＡフラグメントからなる。図９に示すように、トランスポゾンと称されるこのエレメントは、スペクチノマイシン耐性カセット（Ｓｐｅｃr）および下流のＰｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを含有する。トランスポソームを形成するために使用したプロトコルは、本質的に、ＥＺ：：ＴＮTMｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）についてのＥｐｉｃｅｎｔｒｅの取扱説明書に記載のプロトコルと同じであった。８μＬ反応物は、Ｍｇ++イオンを含まない１．５μＬの５’−リン酸化、平滑末端化されたトランスポゾンＤＮＡ（約２５０ｎｇ／μＬ）、４μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＥＺ：：ＴＮトランスポザーゼおよび２．５μＬの８０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有した。コントロールトランスポソーム反応混合物も同一であったが、但し、トランスポザーゼの代わりに４μＬの滅菌水を使用した。反応物を室温で３０分間、インキュベートし、次いで、緩徐な異性化工程に必要な２〜７日間のインキュベーション期間、４℃に移した（これにより、活性なトランスポソームが形成する；この手順を使用すれば、トランスポソームは、−２０℃で少なくとも３箇月間、安定である）。
【０１５６】
本質的に、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のプロトコルと同じ形質転換プロトコルを使用して、トランスポソームをＺＷ６４１にエレクトロポレートした。簡単に説明すると、４０μＬの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中約１０10個の細胞／ｍｌ、１μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＴｙｐｅＯｎｅTMＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎインヒビター（カタログ番号ＴＹＯ２６１Ｈ）および１μＬのコントロールまたはトランスポソーム反応混合物を含有した。エレクトロポレーターの設定は、１．６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦ、およびキュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を１．０ｍｌのＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ、および１ｍＭのＭｇＳ０4）で希釈し、そして細胞を約３時間、３０℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌１．５ｍｌ微量遠心管中、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間）によって回収し、そして上清を注意深く取り除いた。細胞ペレットを、２００μＬの液体ＭＭＧ培地に再懸濁し、そして１００μＬアリコートの各細胞懸濁液を、１．５％寒天および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレーティングした。３０℃、嫌気条件下での７２時間のインキュベーション期間後、３個のコロニーがコントロールプレート上で認められ、１３個のコロニーが６４１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソームプレート上で認められ、そして１８個のコロニーが８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソームプレート上で認められた。さらなる特徴付けのために、両方のトランスポソームプレート由来の６個のコロニーを無作為に選択し、そしてこれらを、ＭＭＸ培地および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する寒天プレート上にパッチした；増殖条件は上記のとおりであった。ＭＭＸ培地は、ＭＭＧ培地と同じであるが、但し、グルコースの代わりに５０ｇ／Ｌのキシロースを含有した。新鮮なＭＭＸ＋スペクチノマイシンプレート上での２回の増殖後、キシロース上で最も増殖した６つの株（各トランスポソームについて３つ）を、下記の実験に使用した。
【０１５７】
図１３Ａは、６４１Ｇａｐ−ＸｙｌＡトランスポソーム（＃６−１、＃６−３および＃６−５）によって得られた３つのＺＷ６４１株ならびにキシロース含有培地において８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソーム（＃８−２、＃８−４および＃８−５）を受容した３つの株の線形増殖曲線を示す。同じデータを図１３Ｂに対数目盛でプロットする。この実験は、振盪フラスコ（１５０ｒｐｍで１５ｍｌ試験管中７ｍｌ培養液）中３０℃で実施し、そしてｍＲＭ３−Ｘ１０（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１００ｇ／Ｌキシロース）が増殖培地であった。培養は、上記のパッチしたプレート由来の１植菌耳の細胞から開始し、そして初期ＯＤは極めて類似していた（約０．０２〜０．０３）。この実験のコントロールは、染色体に組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐにおけるＧ→Ｔ置換を有するキシロース適応株ＺＷ６５８であった。
【０１５８】
親株（ＺＷ６４１）と同様に、６４１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットの染色体外に組み込まれた追加のコピーを有する３つの株ではキシロース含有培地における増殖が極めて不良であったが、特に、株＃６−５の増殖速度およびバイオマス収量（ＯＤ600）の両方にいくつかの若干の改善が認められたようであった（図１２Ａと図１３Ａとを比較すること）。対照的に、８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポゾンによって得られた３つのすべての株は、キシロース上で親株よりかなり良好に増殖した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。事実、形質転換体のうちの２つ（＃８−４および＃８−５）は、この糖上において、６４１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットを含有するマルチコピープラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡを所有するＺＷ６５８およびＺＷ６４１形質転換体とほぼ同様に良好に増殖した（図１２と図１３とを比較すること）。転移は無作為な事象であり、そして６つのすべての株は、染色体の異なる場所に挿入された６４１ＧａｐＸｙｌＡまたは８０１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットを有するため、同じトランスポソームを使用してこの実験において観察された外来遺伝子発現の差異は、位置効果による可能性がある。例えば、位置効果は、＃６−１および＃６−３より良好な＃６−５の増殖、ならびに＃８−４および８−５より不良な＃８−２の増殖を説明し得る。それでも、分析した集団のサイズが小さいにもかかわらず、図１３に示す結果は、ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐプロモーターに存在するＧ→Ｔ変異が、親株ＺＷ６４１と比較して、これらの株で観察されるより高いキシロースイソメラーゼ活性およびキシロース上でのより良好な増殖を担うという見解を強力に支持する。
【０１５９】
実施例９
キシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の独立して適応させた株の導入遺伝子ＧＡＰプロモーター領域の酵素活性および配列比較
また、ＺＷ６５８に類似の遺伝子導入および株適応の経過を使用して、株８ｂ（実施例１および米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）を得たため、ペントースリン酸経路の導入遺伝子活性およびＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの配列を、この独立した株の産生について部分的およびより完全に適応された株で比較した。部分的適応株８ＸＬ４および最終適応株８ｂにおけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの産物の酵素活性を、一般的方法に記載の技術を使用して測定し、そしてμモルの産物／ｍｇタンパク質／分で表した結果を表５に示す。
【０１６０】
表５．異なるキシロース資化適応Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株における酵素活性
【０１６１】
ＺＷ６５８より以前の株がキシロース上での増殖の増強を可能にする変異を得た場合に生じた適応の場合と同様に、株８ｂではｘｙｌＡＢオペロンでの両方の遺伝子の産物の活性が、その先祖株８ＸＬ４より増加した。さらに述べると、測定した酵素活性の増加はそれほど適応されていない株より約５倍増加した。
【０１６２】
８ｂおよび８ＸＬ４株においてｘｙｌＡＢオペロンの発現を指令するＰｇａｐを配列決定した。ＰＣＲフラグメントを、プロモーターの５’末端由来の順方向ＰＣＲプライマー（ＧＡＰ−Ｆ８；配列番号３９）およびｘｙｌＡコード領域由来の逆方向プライマー（ＸｙｌＡＢ８５１Ｒ；配列番号５）を使用して調製した。得られたＰＣＲ産物を、プライマーＧＡＰ−Ｆ８、ＸｙｌＡＢ４４９Ｒ、およびＸｙｌＡＢ８５１Ｒ（配列番号３９、４１、および４０）を使用して配列決定した。ＺＷ８ＸＬ４由来のプロモーター配列を配列番号３に示し、８ｂ由来のプロモーター配列を配列番号５に示す。ＺＷ６４１およびＺＷ６５８におけるｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐにおける場合と同様に、これらのプロモーター配列もまた、両方とも、株ＣＰ４のＰｇａｐの公開された配列との間で１つの差異を有した。これらの共通の変化に加えて、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８のＰｇａｐ配列の間にも１つの塩基対の違いが認められた。８ＸＬ４と８ｂとの比較では、開始ＡＴＧに対して−１８９位でのＧからＴへの変化が認められなかった一方、開始ＡＴＧに対して−８９位においてＣからＴへの変化が生じた。
【０１６３】
株ＺＷ６５８のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列の場合と同様に、新規の配列の制御下でのコード領域からのタンパク質の産生が部分的に適応された株由来の同じプロモーターの配列よりも多く産生されることを可能にする新規の配列への適応中に、株８ｂにおいてＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列が変化した。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９８７８号明細書（本明細書において引用により援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利についての陳述
本発明は、エネルギー省から授与された契約番号０４−０３−ＣＡ−７０２２４およびＤＥ−ＦＣ３６−０３ＧＯ１３１４６に基づく米国政府の助成により行われた。米国政府は、本発明において所定の権利を有する。さらに、米国政府は、米国エネルギー省と国立再生可能エネルギー研究所（ミッドウエスト研究所の一部局）との間の契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７に基づいて、本発明の権利を有する。
【０００３】
本発明は、微生物学および遺伝子操作の分野に関する。より具体的には、改善されたキシロース資化能を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の遺伝子操作について記載する。
【背景技術】
【０００４】
微生物によるエタノールの産生は、化石燃料の代替的エネルギー源を提供し、従って、現在の重要な研究の分野である。キシロースは、加水分解されたリグノセルロース材料における主要ペントースであり、従って、多量に利用可能な低コストの炭素基質を提供することができるため、エタノール、ならびに他の有用な産物を産生する微生物は、キシロースを炭素源として使用することが可能であることが望ましい。天然ではキシロースを資化しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）および他のエタノール産生細菌を、１）キシロースからキシルロースへの変換を触媒するキシロースイソメラーゼ；２）キシルロースをリン酸化して、キシルロース５−リン酸を形成させるキシルロキナーゼ；３）トランスケトラーゼ；および４）トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の導入によって、キシロース資化のために遺伝子操作することができる。
【０００５】
キシロース代謝のためにＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３８：３５４−３６１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）、ならびにザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）株（Ｙａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９）を操作することには成功している。しかし、典型的には、操作された株はキシロース上ではグルコース上ほど良好に増殖せず、そしてエタノールを産生しない。キシロース資化能について操作された株はキシロース培地上での継代培養によって適応され、改善されたキシロース資化能を有する株を生じており、米国特許第７，２２３，５７５号明細書ならびに同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載されている。しかし、改善のための遺伝的基礎については決定されていない。
【０００６】
改善されたキシロース資化能を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、および他のエタノール産生細菌の遺伝子操作株の必要性が依然として存在する。出願人らは、キシロース資化能のために操作され、そして改善されたキシロース資化能のために適応されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の遺伝子操作を発見し、そしてその発見を使用して、改善されたキシロース資化能のために株を操作した。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、改善されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）から発現されるキシロースイソメラーゼをコードするキメラ遺伝子で形質転換することによってキシロース資化能について遺伝子操作された細菌の株に関する。この株はまた、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子によっても形質転換される。改善されたＰｇａｐは生来のＰｇａｐより高い発現を指令し、キシロースイソメラーゼの発現について改善されたＰｇａｐを有さない株と比較して改善されたキシロース資化能を生じる。
【０００８】
本明細書では、形質転換によって導入される遺伝子を含むザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株について説明する。前記遺伝子は以下を含む：
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼをコードする作動可能に連結された単離された核酸分子。
上記の形質転換工程によって導入される遺伝子は、Ｐｇａｐの発現の増強のための変異を含むキメラ遺伝子であってもよい。
【０００９】
また、本明細書では、遺伝子、例えば、キメラ遺伝子で形質転換する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される細菌株を操作するための方法について説明する。前記キメラ遺伝子は、以下を含む；
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼ酵素をコードする作動可能に連結された単離された核酸分子。
【００１０】
本明細書では、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択されるキシロース資化細菌株を操作するための別の方法について説明する。前記方法は、任意の順序で、以下の工程を含む：
ａ）トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子またはオペロンで形質転換する工程；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現のための遺伝子またはオペロンで形質転換する工程であって、キシロースイソメラーゼ酵素は、改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターから発現され、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子である、前記工程。
【００１１】
また、本明細書では、形質転換によって導入されるキメラ遺伝子を含むザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株を培地において培養する工程を含む、キシロースを含む培地からのエタノールの産生のための方法について説明する。前記キメラ遺伝子は以下を含む：
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼをコードする作動可能に連結された単離された核酸分子。
【００１２】
さらに、本明細書では、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株について説明し、この組換え細菌株は、０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌソルビトールデヒドロゲナーゼを含む反応混合物中２０μＬの無細胞抽出物を３０℃で反応させることによって測定した際に、少なくとも約０．１μモル産物／ｍｇタンパク質／分を産生させるレベルでキシロースイソメラーゼを発現するように操作され、ここで、Ｄ−キシルロースが産物である。
【００１３】
本発明の様々な実施形態は、以下の詳細な説明、図面、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】トランスケトラーゼ（Ａ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｂ】トランスアルドラーゼ（Ｂ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｃ】キシロースイソメラーゼ（Ｃ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図１Ｄ】キシルロキナーゼ（Ｄ）の酵素アッセイのストラテジーを示す。
【図２】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）およびキシルロキナーゼ（ＸＫ）活性のグラフを示す。
【図３】ＰｇａｐｘｙｌＡＢで形質転換したＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４Ｃ、およびＴ５Ｃ系統におけるトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）およびトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）活性のグラフを示す。
【図４】選択された適応キシロース資化株コロニーの理論的エタノール収率％およびキシロース資化％のグラフを示す。
【図５】５％グルコースを含むＲＭ（リッチ培地）（ＲＭＧ）で５０代まで増殖する前および後の５％キシロースを含むＲＭ（ＲＭＸ５％）上で７０時間目の適応キシロース資化株の増殖のグラフを示す。
【図６Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＺＢ１８８；（Ｂ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのプラスミド地図を示す。
【図６Ｃ】（Ｃ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図６Ｄ】（Ｄ）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの略図を示す。
【図７Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＭＯＤTM−２−＜ＭＣＳ＞；（Ｂ）ｐＭＯＤ−リンカーのプラスミド地図を示す。
【図７Ｃ】（Ｃ）ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃのプラスミド地図を示す。
【図８】ｐＬＤＨＳｐ−９ＷＷのプラスミド地図を示す。
【図９】ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１０Ａ−Ｂ】（Ａ）ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ；（Ｂ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１０Ｃ】（Ｃ）ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡのプラスミド地図を示す。
【図１１】Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミドを保持する３つの株（Ｘ１、Ｘ２およびＸ２）ならびにコントロールプラスミドを保持する３つの株（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のキシロース含有培地における増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１２Ａ】（Ａ）線形目盛上にプロットした、スペクチノマイシンを伴わないキシロース含有培地における株ＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１２Ｂ】（Ｂ）対数目盛上にプロットした、スペクチノマイシンを伴わないキシロース含有培地における株ＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１３Ａ】（Ａ）線形目盛上にプロットした、株ＺＷ６５８と比較した、８０１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃８−２、＃８−４、＃８−５）および６４１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃６−１、＃６−３、＃６−５）の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【図１３Ｂ】（Ｂ）対数目盛上にプロットした、株ＺＷ６５８と比較した、８０１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃８−２、＃８−４、＃８−５）および６４１Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡが組み込まれた３つの株（＃６−１、＃６−３、＃６−５）の増殖曲線（ＯＤ６００対時間）のグラフを示す。
【００１５】
表３は、キシロースイソメラーゼのＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭの表である。表３を、電子データと共に提出し、本明細書に参照として援用される。
【００１６】
本発明は、以下の詳細な説明、および本出願の一部をなす添付の配列の説明からさらに詳細に理解することができる。
【００１７】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
配列番号１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ｐＺＢ４由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列であり、これはまた、株ＺＷ６４１および８ＸＬ４のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンでもある。
配列番号４は、株ＺＷ６５８由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、株８ｂ由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ＰｇａｐのｐＺＢ４変種における−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号７は、ＰｇａｐのＣＰ４変種におけるＺＷ６５８由来の−１９０変異を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号８は、ＰｇａｐのＣＰ４変種における８ｂ由来の−８９変異を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＰｇａｐのＣＰ４変種における−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＰｇａｐのＺＭ４変種におけるＺＷ６５８由来の−１９０変異を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、ＰｇａｐのＺＭ４変種における８ｂ由来の−８９変異を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、ＰｇａｐのＺＭ４変種における−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を有する改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１３および１４は、ｐＺＢ４由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１５および１６は、ｐＺＢ４由来のｔａｌコード領域を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１７および１８は、Ｐｇａｐおよびｔａｌフラグメント由来のＰｇａｐｔａｌを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１９および２０は、ｐＺＢ１８６由来のｌｏｘＰ：：Ｃｍを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２２および２３は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを収容する形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２５および２６は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを含むＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組み込み体由来の１．６ｋｂのＰｇａｐｘｙｌＡ ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２７および２８は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２９〜３１は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３２および３３は、Ｓｐｅｃr−カセットを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号３５および３６は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞の異なるマルチクローニング部位を置換するために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３７および３８は、それぞれ、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡを得るため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃに挿入するための株ＺＷ８０１−４およびＺＷ６４１由来のＰｇａｐｘｙｌＡ領域の増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３９および４０は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーの完全ヌクレオチド配列である。
【００１８】
表１
キシロースイソメラーゼのタンパク質およびコード領域配列番号の概要
1このコード配列は、ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）コード配列に基づいて、ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）タンパク質（ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）タンパク質との間に３アミノ酸の差異を有する）をコードするように設計される。
2このコード配列は、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）コード配列に基づいて、サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ Ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）タンパク質（ストレプトマイセス・ルビギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）タンパク質との間に２１アミノ酸の差異を有する）をコードするように設計される。
3このコード配列は、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来であり、そしてサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）タンパク質に翻訳されるが、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）コード配列は、コドン縮重による差異を有し得る。
【００１９】
表２
キシロース資化のための遺伝子およびタンパク質配列番号の概要
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書では、キシロースイソメラーゼの高発現を有するように遺伝子操作されたキシロース資化組換え細菌株、およびキシロースイソメラーゼ発現の増加のために細菌を操作するための方法について説明する。キシロースイソメラーゼの発現は、より強力なプロモーターにする少なくとも１つの変異を有する改善されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（ＺｍＰｇａｐ）によって指令される。ＺｍＰｇａｐは、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４およびＺＭ４株（ＣＰ４株ＺｍＰｇａｐ：配列番号１およびＺＭ４株ＺｍＰｇａｐ：配列番号２）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対して−１９０位、−８９位、または両方の位置に変異を有する。本明細書に記載のキシロース資化組換え細菌株は、キシロース含有培地上での発酵が改善されている。キシロース含有培地で増殖させる場合、上記のように操作したエタノールまたは他の産物を産生する細菌を、産生の増加のために使用してもよい。例えば、エタノールの増量は、化石燃料の代替エネルギー源として使用することができる上記のように操作されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のようなエタノール産生菌から得ることができる。
【００２１】
明細書および特許請求の範囲の解釈のために、以下の略語および定義が使用される。
【００２２】
本明細書において使用する用語「含む」、「含んでいる」、「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「含有する」もしくは「含有している」またはそれらの他の任意の表現は、非排他的な包含を含むことが意図される。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、それらの要素のみに限定される必要はなく、明確に列挙されていない他の要素、あるいはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に本来備わっている他の要素を含んでもよい。さらに、異なることを述べている場合を除き、「または」は、包含的論理和を指すものであって、排他的論理和を指すものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、次のもののいずれか１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在し）かつＢが偽であること（または存在しないこと）、Ａが偽であり（または存在せず）かつＢが真であること（または存在すること）、ならびにＡおよびＢが両方とも真であること（または存在すること）。
【００２３】
また、本発明の要素または成分の前に置かれている不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または成分の事例（即ち、発生）の数に関して非制限的であることが意図される。従って、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読み取るべきであり、そして要素または成分の単数形もまた、数が明らかに単数であることを意味しない限り、複数を含む。
【００２４】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含み得る特定のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子を発現する核酸フラグメントを指す。「生来の遺伝子」または「野生型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含む、生来の遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源に由来するが天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含むことができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されないが遺伝子導入により宿主生物体内に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、その遺伝子が生来存在しない生物体内に挿入された生来の遺伝子またはキメラ遺伝子を含むことができる。
【００２５】
用語「遺伝子構築物」は、１つ以上の特定のタンパク質または機能的ＲＮＡ分子の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然にはない外来性のものであってもよい。典型的には、遺伝子構築物は「コード配列」を含む。「コード配列」は、具体的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
【００２６】
「プロモーター」または「開始制御領域」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に局在する。プロモーターは、そのままの形で生来の遺伝子から誘導することができるか、または天然に見出される多様なプロモーターから誘導される多様なエレメントからなるか、またはなお、合成ＤＮＡセグメントを含み得る。当業者であれば、多様なプロモーターは多様な組織もしくは細胞タイプ、または多様な発生段階において、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることを理解している。ほとんどの時期におけるほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターを、通常、「構成性プロモーター」と呼ぶ。
【００２７】
本明細書において使用する用語「発現」は、遺伝子に由来するコード（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能であるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、通常の産生レベルを超えるトランスジェニック生物体または非形質転換生物体における遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一または実質的に類似する外来または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能であるセンスＲＮＡ転写物または断片の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００２８】
本明細書において使用する「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まず、かつ細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００２９】
本明細書において使用する「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体への伝達を指す。伝達された核酸は、宿主細胞において維持されるプラスミドの形態であってもよく、またはある伝達された核酸を、宿主細胞のゲノムに組込んでもよい。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と呼ぶ。
【００３０】
本明細書において使用する用語「プラスミド」および「ベクター」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を含む選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。
【００３１】
用語「作動可能に連結される」は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合、コード配列に作動可能に連結される（即ち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。
【００３２】
用語「選択マーカー」は、同定因子、通常、マーカー遺伝子の効果、即ち、抗生物質に対する耐性に基づいて選択することが可能な抗生物質または化学耐性遺伝子を意味し、ここで、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡する、および／または目的の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物体を同定するために使用される。
【００３３】
本明細書において使用する用語「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。当業者は、所定のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について周知である。従って、宿主細胞において改善された発現のための遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用頻度が宿主細胞に好適なコドン使用頻度に近付くように遺伝子を設計することが望ましい。
【００３４】
用語「コドン最適化」は、様々な宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域を指すため、これは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物体の典型的なコドン使用に反映するための遺伝子または核酸分子のコード領域におけるコドンの改変を指す。
【００３５】
用語「Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター」および「ＺｍＰｇａｐ」は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ゲノムにおいてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼコード領域の上流に天然に存在する塩基配列を有するプロモーター活性を有する核酸分子を指す。これらの用語は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株のプロモーター（それぞれ、配列番号１および２）、ならびにｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ（配列番号３）のような実質的に異なるレベルでの発現を指令する配列および／または長さが異なる変種を指す。
【００３６】
用語「異種の」は、目的の位置において天然では見出されないことを意味する。例えば、異種遺伝子は、宿主生物体内において天然では見出されないが遺伝子導入により宿主生物体内に導入される遺伝子を指す。例えば、キメラ遺伝子に存在する異種核酸分子は、天然では相互に関連しないコード領域およびプロモーターセグメントを有する核酸分子のような、キメラ遺伝子の他方のセグメントと関連することが天然では見出されない核酸分子である。
【００３７】
本明細書において、「単離された核酸分子」は、場合により、合成、非天然もしくは改変されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖であるＲＮＡあるいはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントからなり得る。
【００３８】
一本鎖形態の核酸フラグメントが、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他の核酸フラグメントにアニーリングすることができる場合、核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子のような別の核酸フラグメントに「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ndｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、特にその中のＣｈａｐｔｅｒ１１およびＴａｂｌｅ１１．１（それらの全体が本明細書において参照として援用される）に例示される。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似のフラグメント（例えば、遠位関係の生物体由来の相同配列）〜高度に類似のフラグメント（例えば、近位関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子）をスクリーニングすることができる。ポストハイブリダイゼーション洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。好適な条件の１つの組は、室温で１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳから開始し、次いで、４５℃で３０分間の２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを反復し、次いで、５０℃で３０分間の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを２回反復する一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好適な組は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおける最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、洗浄が上記と同一である、より高い温度を使用する。高度にストリンジェントな条件の別の好適な組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での最後の２回の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のさらなる組は、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、それに続く、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄を含む。
【００３９】
ハイブリダイゼーションでは、２つの核酸が相補配列を含有することが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間のミスマッチが可能である。核酸にハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当該分野において周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍの値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算するための式が導き出されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上掲、９．５０−９．５１を参照のこと）。より短い核酸、即ち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さは、その特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上掲、１１．７−１１．８を参照のこと）。１つの実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり；そして最も好ましくは、長さは、少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、必要であれば、プローブの長さのような要因に従って、温度および洗浄液の塩濃度を調整することができることを理解するであろう。
【００４０】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「大部分」は、当業者による配列の人による評価、またはＢＬＡＳＴのようなアルゴリズムを使用するコンピュータ自動化配列比較および同定（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９３））のいずれか一方によって、ポリペプチドもしくは遺伝子を推定的に同定するのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列もしくは遺伝子のヌクレオチド配列を含む部分である。一般的に、ポリペプチドまたは核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、１０連続アミノ酸以上または３０ヌクレオチド以上の配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に対して、２０〜３０連続ヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列依存的方法に使用してもよい。さらに、プライマーを含む特定の核酸フラグメントを得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用してもよい。従って、ヌクレオチド配列の「大部分」は、配列を含む核酸フラグメントを特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。本明細書は、特定の真菌タンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書において報告した配列の利益を有する当業者であれば、これからは、当業者に既知の目的の開示された配列のすべてまたは大部分を使用することができる。従って、本発明は、添付の配列表に報告された完全な配列、ならびに上記で定義した配列の大部分を含む。
【００４１】
用語「相補的な」は、相互にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、そしてシトシンはグアニンに相補的である。
【００４２】
用語「相同性」および「相同」は、本明細書において同義に使用される。それらは、核酸フラグメントを指し、ここで、１ヌクレオチド塩基以上の変化は、核酸フラグメントが、遺伝子発現を仲介するか、または所定の表現型を産生する能力に影響を及ぼさない。これらの用語はまた、初期の改変されていないフラグメントに対して得られた核酸フラグメントの機能的特性を実質的に変更しない１ヌクレオチド以上の欠失または挿入のような本発明の核酸フラグメントの改変を指す。従って、当業者が理解しているように、本発明は、特定の例示的配列を超えるさらなる配列をも包含することが理解される。
【００４３】
さらに、当業者は、本発明に包含される相同な核酸配列もまた、中程度のストリンジェントな条件（例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下で、本明細書に例示した配列、または本明細書に開示され、そして本明細書に開示された核酸配列のいずれかに機能的に等価であるヌクレオチド配列のいずれかの部分にハイブリダイズするそれらの能力によって定義されることを認識している。
【００４４】
当該分野において既知の用語「同一性パーセント」は、配列を比較することによって決定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」はまた、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関係の程度を意味し、場合により、そのような配列のストリング間の一致によって決定されるとおりであり得る。「同一性」および「類似性」は、限定されないが、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載の方法を含む既知の方法によって、容易に計算することができる。
【００４５】
同一性を決定するための好適な方法は、試験する配列間の最適な一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに編集されている。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎTMプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、実施することができる。配列のマルチプルアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）； Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）により記載されている）と標識され、そしてＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎTMプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見出されるアラインメント方法に対応する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ方法」を含む数種のアルゴリズムを包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ方法」を使用して、実施される。マルチプルアラインメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性パーセントの計算についてのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸については、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用する配列のアラインメント後、同じプログラムにおいて「配列距離」表を調べることによって、「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ方法」は入手可能であり、そしてＣｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）により記載されている）と標識され、そしてＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎTMｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見出されるアラインメント方法に対応する。マルチプルアラインメントのデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用する配列のアラインメント後、同じプログラムにおいて「配列距離」表を調べることによって、「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００４６】
多くのレベルの配列同一性が他の種由来のポリペプチドを同定するのに有用であることが当業者によく理解されており、ここで、そのようなポリペプチドは、同じまたは類似の機能または活性を有する。同一性パーセントの有用な例として次のものが挙げられるが、これらに限定されない：２４％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または２４％〜１００％の任意の整数の百分率は、本発明を説明するのに有用であり得、例えば、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％。適切な核酸フラグメントは、上記の相同性を有するだけではなく、典型的には、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは、少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは、少なくとも１５０アミノ酸、なおより好ましくは、少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは、少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００４７】
用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の解析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、商業的に入手することができるか、または独立して開発することができる。典型的な配列解析ソフトウェアとして、１．）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これらに限定されない。本出願に関して、配列解析ソフトウェアを解析に使用する場合、特に断りのない限り、解析の結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されよう。本明細書において使用する「デフォルト値」とは、最初に初期化した時に本来導入されている任意の組の値またはパラメータを意味する。
【００４８】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、１９８７に記載されている。
【００４９】
改善されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの発見
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＺｍＰｇａｐまたはＰｇａｐ）のプロモーターは、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）におけるキメラ遺伝子の発現に使用されている。キシロース代謝のための遺伝子を発現させるためにこのプロモーターを使用した場合、得られるキシロース資化能は典型的には所望される効果を示さない。さらに、限定的なキシロース資化能力を有する４つのキシロース代謝酵素（キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼ）を発現するように操作された組換えＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株が、改善されたキシロース資化能のためキシロース培地に対して適応された（同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載されている）。
【００５０】
出願人らは、本明細書の実施例３に記載のように、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−７８５８）と呼ばれる改善されたキシロース資化株が、ＺｍＰｇａｐから発現されるオペロン（ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロン）としてゲノムに組み込まれたキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現を増加することを発見した。出願人らは、作動可能に連結されたコード領域の発現の増加を指令するプロモーターを担うＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーターに新規の１つのヌクレオチド変化が存在することをさらに発見した。ヌクレオチド変化は、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ活性の増加を有さなかったＺＷ６５８に対する前駆体株におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＺｍＰｇａｐの配列と比較して、株ＺＷ６５８におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐの配列において新規のものである。それ故、この単一ヌクレオチド変化を有するＰｇａｐは改善されたプロモーターである。
【００５１】
出願人らは、さらに、４つのキシロース資化酵素をコードする遺伝子で個別に操作し、そして改善されたキシロース資化能について個別に適応されたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株（米国特許第７，２２３，５７５号明細書に記載の株８ｂ）もまた、ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンとしてゲノムに組み込まれたキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現を増加することを発見した。出願人らは、ＺＷ６５８ Ｐｇａｐのヌクレオチド変化とは異なる位置にある８ｂ株におけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐの新規の１つのヌクレオチド変化が存在することをさらに発見した。ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンによってコードされるキシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼ酵素の発現の増加に基づいて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの変異Ｐｇａｐもまた改善されたプロモーターを提供する。
【００５２】
ＺＷ６５８および８ｂ株ＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐにおいて新たに同定されたヌクレオチド変化は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対してそれぞれ、−１９０および−８９位に存在する。発見した−１９０位のヌクレオチド変化はＧからＴへの変化であり、そして発見した−８９位のヌクレオチド変化はＣからＴへの変化である。
【００５３】
位置番号は配列の変動によって変化し得るため、塩基の変化の配列構成は重要な因子である。
【００５４】
−１９０位置は、配列構成：
に存在する（それぞれ、配列番号１、２、および３に対応するＣＰ４、ＺＭ４、およびｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐの位置であって、ここで、太字かつ下線を付したＧは、変異によってＴに変化した塩基である）。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列中で−１９０位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では、−２１位においてＴが欠失しているため、ｐＺＢ４において−１８９位である。
【００５５】
−８９位置は、配列構成：
に存在する（それぞれ、配列番号１、２、および３に対応するＣＰ４、ＺＭ４、およびｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐの位置であって、ここで、太字かつ下線を付したＣは、変異によってＴに変化した塩基である）。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列中で−８９位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では、−２１位においてＴが欠失しているため、ｐＺＢ４においては−８８位である。本発明のプロモーターは、−１９０位、−８９位、またはこれらの位置の両方にＺｍＰｇａｐのヌクレオチド変化を有する。好ましくは、この変化は−１９０位におけるＧからＴへの変化であり、そして−８９位におけるＣからＴへの変化である。これらの改変を含む本発明のプロモーターは、改善されたＰｇａｐｓである。
【００５６】
−１９０位および−８９位における他のヌクレオチドへの変化は、ＺｍＰｇａｐの改善された活性を提供し得る。加えて、ＺｍＰｇａｐ内の他の位置におけるヌクレオチド変化も、ＺｍＰｇａｐの改善された活性を提供し得る。
【００５７】
ＺｍＰｇａｐの天然に存在する配列は、単一の配列ではなく、プロモーターの機能に対して実質的な影響を及ぼさないいくつかの変動を配列内に有してもよい。プロモーターの機能に対して実質的な影響を及ぼさないとは、プロモーター配列が、天然のザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株に存在するＺｍＰｇａｐによって指令される発現のレベルと実質的に同様の発現レベルを指令することを意味する。配列の変動は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する−２９位のＣＰ４株およびＺＭ４株（それぞれ、配列番号１および２）（ここで、ＣＰ４ではＡが存在し、そしてＺＭ４ではＧが存在する）の間の差異のように、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の異なる単離体または株の間で自然に発生し得る。
【００５８】
天然に存在する配列の変動に加えて、機能に実質的に影響を及ぼさないヌクレオチド変化が、当業者に公知のＰＣＲ、クローニング、形質転換、および株増殖を含む日常的な操作手順の間に発生し得る。例には、−２１位においてＴの欠失を有するｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐがある。
【００５９】
プロモーターの機能に実質的に影響を及ぼさない、異なる天然の株または操作された株において生じるＺｍＰｇａｐ配列の任意のヌクレオチド変化は、ｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐに存在する−２１位後方のＴの欠失（配列番号３）のようなＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターの配列に存在し得る。それ故、プロモーターの機能に影響を及ぼす、即ち、実質的に、プロモーターの機能を改善する上記の−１９０位および−８９位における変異は、実質的に同様の活性（天然のレベル）を有するＺｍＰｇａｐ配列のいずれかにおいて作製してもよく、そして機能に影響を及ぼさない変動と共に同時に発生することができる。
【００６０】
−１９０位および／または−８９位に記載の変異を有する改善されたＰｇａｐ変異の例として、株ＺＷ６５８由来のプロモーター配列（配列番号４）、株８ｂ由来のプロモーター配列（配列番号５）、およびｐＺＢ４由来である同じＺｍＰｇａｐ変種の二重変異（配列番号６）が挙げられる。改善されたＰｇａｐ配列のさらなる例には、ＣＰ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号７、８、および９）ならびにＺＭ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号１０、１１、および１２）がある。
【００６１】
加えて、プロモーターの機能に実質的に影響を及ぼさないＺｍＰｇａｐの長さの変動も生じる。本発明は、−１９０位の変異および／または−９０の変異が追加される前の活性に実質的な変化を有さない、様々な長さのＺｍＰｇａｐｓにおけるＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対して、−１９０位および／または−８９位での記載の変異を有する改善されたＰｇａｐｓを含む。
【００６２】
改善されたＰｇａｐの調製
−１９０位および／または−８９位における記載の変異は、当業者に公知に任意の方法によってＺｍＰｇａｐ核酸分子に導入することができる。例えば、変異および周囲のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そしてより大きなプロモーターＤＮＡフラグメントにクローニングして、変異を伴わないセグメントと置換してもよい。変異およびいくつかの隣接するプロモーター配列を含有するプライマーを、合成し、そしてＰＣＲに使用して、プロモーターフラグメントを調製してもよい。全プロモーターＤＮＡフラグメントを、共にライゲートされる複数のオリゴヌクレオチドとして合成してもよい。部位特異的変異誘発を使用して、変異を導入してもよい。加えて、ＺＷ６５８株または８ｂ株由来のＤＮＡをテンプレートして使用して、ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントとして変異プロモーターを調製してもよい。
【００６３】
改善されたＰｇａｐを使用するキシロースイソメラーゼの発現
本明細書に記載のプロモーターを、ＺｍＰｇａｐからの発現と比較してキシロースイソメラーゼの増加した発現を指令するために、キシロースイソメラーゼをコードする異種核酸分子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に作動可能に連結させることができる。キメラ遺伝子由来の改善されたＰｇａｐおよびキシロースイソメラーゼコード領域はまた、一般に３’末端制御領域を含む。末端制御領域は様々な遺伝子に由来してもよく、そしてしばしば標的宿主細胞に生来の遺伝子から採られる。キメラ遺伝子の構築は当該分野において周知である。
【００６４】
本発明において改善されたＰｇａｐからキシロースイソメラーゼを発現させるために、キメラ遺伝子において、いずれのキシロースイソメラーゼコード領域を使用してもよい。キシロースイソメラーゼ酵素は、ＥＣ５．３．１．５のグループに属する。使用することができる適切なキシロースイソメラーゼタンパク質およびコード配列の例を表１に示す。特に適切な例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（それぞれ、配列番号４２および４３）、ならびにラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）（それぞれ、配列番号４４および４５）由来のものがある。
【００６５】
キシロースイソメラーゼタンパク質およびコード配列の他の多くの例が、参考文献、および当業者に周知のバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定される。さらに、本明細書に記載のコード配列または当該分野において列挙されているコード配列を使用して、天然に存在する他の相同体を同定することができる。例えば、上記のキシロースイソメラーゼをコードする核酸フラグメントのそれぞれを使用して、同じまたは他の細菌種から相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することもできる。配列依存的プロトコルを使用する相同遺伝子の単離は、当該分野において周知である。
【００６６】
配列依存的プロトコルの例として次のものが挙げられるが、これらに限定されない：１．）核酸ハイブリダイゼーションの方法；２．）核酸増幅技術の様々な使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１０７４（１９８５）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：３９２（１９９２）］；および３．）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニングの方法。
【００６７】
例えば、上記のキシロースイソメラーゼコード領域に対して類似のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列は、本核酸フラグメントのすべてまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、当業者に周知の方法論を使用して、任意の所望の細菌由来のライブラリーをスクリーニングすることによって、直接単離し得る。開示された核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、当該分野において公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上掲）によって、設計および合成することができる。さらに、全配列を直接使用して、当業者に公知の方法（例えば、ランダムプライマーＤＮＡラベリング、ニックトランスレーションもしくは末端ラベリング技術）によってＤＮＡプローブを、または利用可能なインビトロ転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成することができる。さらに、本配列の一部（または全長）を増幅するために、特異的プライマーを設計し、そして使用することができる。得られた増幅産物は、増幅反応中に直接標識するか、または増幅反応後に標識することができ、そして適切なストリンジェンシーの条件下で全長ＤＮＡフラグメントを単離するためのプローブとして使用することができる。
【００６８】
典型的に、ＰＣＲ型増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、相互に相補的ではない。所望される試験条件に依存して、プライマーの配列は標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するように設計すべきである。ＰＣＲプライマーの設計方法は当該分野において共通および周知である（Ｔｈｅｉｎ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ Ｅｄ．，（１９８６）ｐｐ３３−５０，ＩＲＬ．：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．Ｅｄ．，（１９９３）Ｖｏｌ．１５，ｐｐ３１−３９，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【００６９】
一般的に、記載の配列の２つの短いセグメントを、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同遺伝子をコードするより長い核酸フラグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて使用することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸フラグメントのライブラリーに対して実施してもよく、ここで、一方のプライマーの配列が記載の核酸フラグメントから誘導され、そして他方のプライマーの配列は微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を利用することができる。
【００７０】
あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づき得る。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８（１９８８））に従い、ＰＣＲを使用して、転写物における単一のポイントと３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅することによってｃＤＮＡを作製することができる。３’および５’方向において得られるプライマーは、本配列から設計することができる。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えば、ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、特異的３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（Ｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５６７３（１９８９）；Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９））。
【００７１】
あるいは、これらのキシロースイソメラーゼをコードする配列を、相同体の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本成分として、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子フラグメントを含有することが疑わしいサンプル、および特異的ハイブリダイゼーション方法を挙げることができる。プローブは、典型的に、検出しようとする核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出しようとする核酸配列に「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５塩基〜数万塩基変動することができ、そして行おうとする特異的試験に依存する。典型的には、約１５塩基〜約３０塩基のプローブが適切である。検出しようとする核酸配列に相補的である必要があるのは、プローブのうち一部のみである。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は、完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、不完全な相補的分子間で生じ、その結果、ハイブリダイズした領域における塩基の所定の画分は、適切な相補的塩基と対合しない。
【００７２】
ハイブリダイゼーション方法については、良好に定義され、かつ当該分野において公知である。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合しなければならない。これには、無機塩または有機塩の存在下、適切な濃度および温度条件下でプローブとサンプルとを接触させることが必要である。プローブおよびサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸との間の任意の可能なハイブリダイゼーションが生じ得るのに十分に長い時間、接触させなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要とされるハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短い。カオトロピック剤が添加されていてもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって、核酸を安定化する。さらに加えて、カオトロピック剤は、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度かつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ Ｎｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１（１９９１））。適切なカオトロピック剤として、とりわけ、塩化グアニジウム、チオシアン酸グアニジウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムおよびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望であれば、ホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に、典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加することができる。
【００７３】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的に、これらは、約２０〜６０体積％、好ましくは、３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖホルムアミド、約０．１５〜１Ｍ塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍ緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲：約６〜９））、約０．０５〜０．２％界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭの間のＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）および血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識キャリア核酸、フラグメント化核酸ＤＮＡ（例えば、仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌであってもよいグリシンが含まれる。多様な極性水溶性または膨潤性の薬剤（例えば、ポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えば、ポリアクリレートもしくはポリメチルアクリレート）およびアニオン性糖ポリマー（例えば、硫酸デキストラン）を含む体積排除剤のような他の添加剤が含まれてもよい。
【００７４】
核酸ハイブリダイゼーションは、多様なアッセイ形式に応用することができる。最も適切なものの１つは、サンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、特に、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに応用することができる。サンドイッチ型アッセイの主要な構成要素は固相支持体である。固相支持体は、非標識かつ配列の一部に相補的な固定化された核酸プローブを、これに吸着した形またはこれに共有結合した形で有する。
【００７５】
バイオインフォマティックアプローチ
あるいは、キシロースイソメラーゼタンパク質はかなりよく知られており豊富に存在するため、さらなるキシロースイソメラーゼタンパク質を、Ｐｆａｍ（Ｐｆａｍ：ｃｌａｎｓ，ｗｅｂ ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ｓｅｒｖｉｃｅｓ：Ｒ．Ｄ．Ｆｉｎｎ，Ｊ．Ｍｉｓｔｒｙ，Ｂ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ−Ｂｏｅｃｋｌｅｒ，Ｓ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｖ．Ｈｏｌｌｉｃｈ，Ｔ．Ｌａｓｓｍａｎｎ，Ｓ．Ｍｏｘｏｎ，Ｍ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．Ｋｈａｎｎａ，Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｒ．Ｅｄｄｙ，Ｅ．Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｂａｔｅｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６）Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ３４：Ｄ２４７−Ｄ２５１）で同定されたキシロースイソメラーゼタンパク質のファミリーを使用して、構築された触媒部位残基およびＰｒｏｆｉｌｅ Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）に基づいて同定することができる。
【００７６】
Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭは、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージ（Ｊａｎｅｌｉａ Ｆａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｍｐｕｓ，Ａｓｈｂｕｒｎ，ＶＡ）のｈｍｍｓｅａｒｃｈアルゴリズムを使用して調製される。Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭの元になる理論については、Ｄｕｒｂｉｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）およびＫｒｏｇｈ ｅｔ ａｌ．（（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１）に記載されており、この理論により、１組のタンパク質が、その組のタンパク質のアラインメントにおける各位置に存在する各アミノ酸の確率に基づいて特徴付けられる。
【００７７】
ＢＲＥＮＤＡデータベースにおいて参照される実験的に確認された機能を有する３２のキシロースイソメラーゼタンパク質配列を使用して調製されたキシロースイソメラーゼのＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭは、キシロースイソメラーゼの同定のための基礎を提供する。ＢＲＥＮＤＡは、実験的文献から抽出された酵素速度論、物理的、および生化学的特性についての詳細な情報を含有し、そして関連するデータベース（Ｃｏｌｏｇｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）へのリンクを伴う、人が管理している（ｈｕｍａｎ−ｃｕｒａｔｅｄ）データベースである。これらの３２のタンパク質の配列番号を表１に示す。これらの３２のタンパク質配列を使用して、デフォルトパラメータによるＣｌｕｓｔａｌＷを使用して多重配列アラインメント（ＭＳＡ）を作製した。ＭＳＡの結果を入力データとして使用して表３に示すＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭを調製した。この表ではアミノ酸を１文字コードによって表す。各位置の第１の線は、一致エミッションスコア：その状態において各アミノ酸が存在する確率を表す（最も高いスコアを強調して示す）。第２の線は挿入エミッションスコアを表し、そして第３の線は状態遷移スコアを表す：Ｍ→Ｍ、Ｍ→Ｉ、Ｍ→Ｄ；Ｉ→Ｍ、Ｉ→Ｉ；Ｄ→Ｍ、Ｄ→Ｄ；Ｂ→Ｍ；Ｍ→Ｅ。
【００７８】
Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭに加えて、４つの触媒部位アミノ酸がキシロースイソメラーゼに特有である：ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）キシロースイソメラーゼ配列に対する位置番号でヒスチジン５４、アスパラギン酸５７、グルタミン酸１８１、およびリジン１８３。Ｅ値が３×１０-10以下でキシロースイソメラーゼＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭに適合しこれらの４つの触媒部位残基を有する任意のタンパク質はそのコード領域を改善されたＰｇａｐを含むキメラ遺伝子中に構築して本明細書に記載のように細菌株に形質転換することができるキシロースイソメラーゼである。現在、９０％の非重複レベルに減少したＧｅｎＢａｎｋ配列データベースにおける２５１のタンパク質がこれらの基準に一致する。これらの配列は、当業者によって容易に同定することができるため、本明細書において、それらのすべてを配列番号と共に示すわけではない。利用可能になるこれらの基準に適合するさらなる配列もまた、本明細書に記載のように使用することができる。
【００７９】
当該分野において公知であるとおり、遺伝子コードの縮重によるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の変動が存在し得る。コドンを、標的宿主細胞におけるアミノ酸配列の発現のために最適化して、コードされる最適な発現を提供する。
【００８０】
キシロースイソメラーゼ発現のための細菌細胞の操作
本明細書に記載のキメラ遺伝子は、さらなる操作のために、典型的に、ベクターにおいて構築されるかまたはベクターにトランスファーされる。ベクターは、当該技術分野において周知である。あるベクターは、広範な宿主細菌において複製することが可能であり、そして接合によって移行することができる。ｐＲＫ４０４ならびに３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全かつ注釈付き配列が利用可能である。これらの誘導体は、グラム陰性菌における遺伝子操作のための価値のあるツールであることが証明されている（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ５０（１）：７４−７９（２００３））。
【００８１】
他の周知のベクターを様々な標的宿主細胞に使用することができる。種々の宿主に有用なベクターの例が、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書、１１〜１３頁（本明細書において参照として援用される）に記載されている。米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のｐＺＢ１８８のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の両方において複製することができるベクターが、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における発現に特に有用である。ベクターとして、細胞における自律複製のためのプラスミド、および細菌のゲノムに組み込もうとする構築物を担持するプラスミドを挙げることができる。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドとして、トランスポゾン、標的細菌ゲノムに対して相同の核酸配列の領域、または組み込みを支持する他の配列を挙げることができる。さらなるタイプのベクターは、例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているシステムを使用して、産生されるトランスポゾンであってもよい。所望される標的宿主および所望される機能のための適切なベクターを選択するための仕方は周知である。
【００８２】
改善されたＰｇａｐおよび作動可能に連結されたキシロースイソメラーゼコード領域を含むキメラ遺伝子を有するベクターを、凍結融解形質転換、カルシウム仲介形質転換、エレクトロポレーション、または接合を使用するような周知の方法により導入することによって、細菌細胞を操作することができる。キシロースイソメラーゼ酵素を発現させることによってキシロース資化について操作しようとする任意の細菌細胞は、本明細書に記載のように株を操作するための形質転換のための標的宿主細胞である。特に適切な宿主細胞は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）である。導入されたキメラ遺伝子は、安定に複製するプラスミド上で細胞中で維持することができるか、または導入後にゲノムに組み込むことができる。
【００８３】
細菌細胞ゲノムに組み込まれた改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子で株を操作するために、相同組換え、トランスポゾン挿入、またはトランスポソーム挿入のような当該分野において周知の方法を使用することができる。相同組換えでは、標的組み込み部位にフランキングするＤＮＡ配列を、スペクチノマイシン−耐性遺伝子または他の選択マーカー、および改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子に界接して配置し、選択マーカーおよび改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を標的ゲノム部位に挿入する。さらに、対応する部位特異的リコンビナーゼの発現後、耐性遺伝子がゲノムから切り出されるように、選択マーカーを部位特異的組換え部位に結合させてもよい。本明細書の実施例１および６において使用するＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）のＥＺ：：Ｔｎインビトロ転移システムを使用する転移が、改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子の組み込みに特に適切である。
【００８４】
キシロースイソメラーゼ活性
本明細書に記載の株では、キシロースイソメラーゼ活性レベルは、当該分野において先に記載のレベルより高い。これらの株は、０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌソルビトールデヒドロゲナーゼを含む反応混合物中２０μＬの無細胞抽出物を３０℃で反応させることによって測定した際に、少なくとも約０．１μモル産物／ｍｇタンパク質／分を産生させるレベルでキシロースイソメラーゼを発現するように操作され、ここで、Ｄ−キシルロースが産物である。株は、少なくとも約０．１４、０．２、または０．２５μモル産物／ｍｇタンパク質／分を産生するレベルで、キシロースイソメラーゼを発現してもよい。本明細書に記載の改善されたＰｇａｐを有する高発現プロモーターを使用して、キシロースイソメラーゼコード領域を発現させて、これらの酵素活性レベルを得てもよい。以下に記載のさらなる３つのキシロース代謝経路酵素活性の存在下でもたらされる高キシロースイソメラーゼ活性レベルは、株にキシロース含有培地上での改善された増殖を提供する。
【００８５】
全キシロース資化経路の操作
改善されたＰｇａｐおよびキシロースイソメラーゼコード領域を含むキメラ遺伝子で形質転換することに加えて、細菌株もまた、キシロース資化に必要な他の３つの酵素：キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のために操作され、米国特許第５５１４５８３号明細書、米国特許第５７１２１３３号明細書、米国特許第６５６６１０７号明細書、国際公開第９５／２８４７６号パンフレット、Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（（１９９２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８：３５４−３６１）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０−２４３））、およびＹａｎａｓｅ ｅｔ ａｌ．（（２００７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．７３：２５９２−２５９９）に記載されている。
【００８６】
４つのすべての酵素をコードする遺伝子が存在すると、キシロース資化経路が完成してキシロース資化株を生じることが公知である。３つのさらなる酵素は、個々のキメラ遺伝子から発現させてもよく、または２つ以上のコード領域を含むオペロンから発現させてもよい。
【００８７】
キメラ遺伝子は、キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子について上記のように、プロモーター、コード領域、および３’末端制御領域を作動可能に連結させることによって、構築してもよい。当該分野において周知のとおり、プロモーターは、標的宿主細胞において活性なプロモーターとして選択される。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）において使用することができるプロモーターとして、ＺｍＰｇａｐおよびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エノラーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼのコード領域は、キシロースを資化することが可能ないずれのグラム陰性菌、例えば、ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来であってもよい。使用することができるタンパク質配列およびそれらのコード領域配列の例を表２に示す。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のキシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素をコードする配列（それぞれ、配列番号１０７、１１９、および１３１）が好適である。これらの配列を使用して、完全なキシロース資化経路を発現させるために使用することができるキシロースイソメラーゼについて上記のようなさらなるコード配列を同定してもよい。
【００８８】
さらに、キシロースイソメラーゼについて上記のようなＰｆａｍタンパク質ファミリーおよびＰｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭを含むバイオインフォマティクス方法を適用して、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素を同定してもよい。これらの酵素をコードする配列は、コドン縮重による多様性を有してもよく、そしてまた、上記のように、特定の宿主における発現のために最適化されたコドンであってもよい。
【００８９】
オペロンは、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のために構築してもよい。１つ以上のコード配列を、改善されたＰｇａｐから発現されるキシロースイソメラーゼコード領域に作動可能に連結させ、オペロンを形成させてもよい。典型的には、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼは１つのオペロンから発現され、そしてトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼは本明細書の実施例１に記載のように第２のオペロンとして発現される。
【００９０】
これらの酵素は、安定に複製するプラスミド上に局在するか、またはゲノムに組み込まれたキメラ遺伝子もしくはオペロンから発現させてもよい。
【００９１】
改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する細菌株の改善された増殖
改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する本明細書に記載のキシロース資化性細菌株、例えば、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、他の糖（「混合糖」）の非存在または存在下でキシロースを含有する培地において改善された増殖を示す。混合糖類は、キシロースに加えて少なくとも１つの糖を含む。細胞の代謝のエネルギー源を提供し得る任意の糖、またはキシロースを含有する混合物に存在する任意の糖が含まれていてもよい。バイオマス糖化から産生される糖上で本発明の株を増殖させることが望ましい。典型的に、バイオマスは、例えば、国際公開第２００４／０８１１８５号パンフレットならびに同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国仮特許出願第６０／６７０４３７号明細書に記載のように、前処置され、次いで、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２）６６：５０６−５７７）によって概説されているように、糖化酵素で処置される。バイオマス糖化は、典型的に、キシロースとグルコース、フルクトース、スクロース、ガラクトース、マンノース、および／またはアラビノースとの混合物を含み得る糖類を生成する。
【００９２】
最大限の産生および発酵効率のために、キシロースを含む高レベルの糖類を含有する培地において、本明細書に記載の株を増殖させることが望ましい。これは、バイオマス糖化糖類の直接使用、またはほとんど希釈を伴わない使用を可能にし、それによって、エタノールのような商業的規模の産生に所望される発酵容積が縮小される。より大きな濃度のエタノールのような産物が産生され得るように、高い糖類濃度が使用される。発酵培地中の混合糖の濃度は、典型的に、約１２０ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌまでの間、より典型的には、約１５０ｇ／Ｌ〜約２３５ｇ／Ｌの間である。
【００９３】
例えば、エタノールなどの商業的生産に所望される高濃度混合糖条件では、ソルビトールを発酵培地に含めてもよい。ソルビトール（Ｄ−ソルビトールおよび／またはＬ−ソルビトール）は、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載のように、約２ｍＭ〜２００ｍＭの間、典型的に、約２ｍＭ〜１００ｍＭの間、または５ｍＭ〜２０ｍＭの間の濃度で培地に存在してもよい。同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８００８１３５８号明細書に記載のように、マンニトール、ガラクチトールまたはリビトールを、ソルビトールの代わりにまたはソルビトールと組み合わせて培地に使用してもよい。
【００９４】
キシリトール培地における発酵条件下で、改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する本明細書に記載の株は、ＺｍＰｇａｐから発現されるキシロースイソメラーゼを含む株より改善された増殖を有する。正確な改善は、株のバックグランド、使用する培地、および一般的な増殖条件に依存して、変動する。例えば、本明細書の実施例８、図１３Ａに示すように、５０ｇ／Ｌキシロースを含有する培地で増殖させる場合、１時間後、改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を含む株は、改善されたＰｇａｐを伴わない株より約２〜５倍高いＯＤ６００まで増殖した。
【００９５】
改善されたキシロース資化株の発酵
改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子ならびにキシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子またはオペロンを有する操作されたキシロース資化株は、株の天然産物である産物、または株が産生するように操作された産物を産生するための発酵に使用することができる。例えば、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）およびザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ）は、天然のエタノール産生菌である。例として、本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株によるエタノールの産生について説明する。
【００９６】
エタノール産生のためには、改善されたＰｇａｐ−キシロースイソメラーゼキメラ遺伝子を有する組換えキシロース資化性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）をキシロースを含む混合糖を含有する培地と接触させる。増殖が阻害されるほど混合糖類の濃度が高い場合、培地は、ソルビトール、マンニトール、またはそれらの混合物を含んでいる。ガラクチトールまたはリビトールを、ソルビトールまたはマンニトールの代わりに使用するか、またはソルビトールまたはマンニトールと組み合わせてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が発生し、そしてエタノールが産生される培地で増殖する。発酵は、空気、酸素、または他の気体の補充を伴わずに（嫌気性、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、または微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｉｃ）発酵のような条件を含み得る）、少なくとも約２４時間稼動させるが、３０時間もしくは以上行ってもよい。エタノール産生が最大に到達するタイミングは、発酵条件に依存してばらつきがある。典型的には、インヒビターが培地中に存在する場合、より長い発酵期間が必要である。発酵は約３０℃〜約３７℃の間の温度、約４．５〜約７．５のｐＨで行ってもよい。
【００９７】
本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）を、キシロースを含む混合糖類を含有する培地中、実験規模の発酵槽、および商業的量のエタノールが産生される大規模化された発酵において増殖させることができる。エタノールの商業的産生が所望される場合、さまざまな培養方法論を適用することができる。例えば、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株からの大規模産生を、バッチおよび連続培養方法論の両方によって産生させることができる。古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。それ故、培養プロセスの開始時に培地に所望の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的には、「バッチ」培養は炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしば、ｐＨおよび酸素濃度のような因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は培養が終了する時点まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は、静的な対数期を通過して高増殖対数期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期へと加減する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、いくつかの系の最終産物または中間体の大部分の産生を担う。定常期または指数期後の産生は他の系において得ることができる。
【００９８】
標準的なバッチ系の１つの変形は流加培養系である。流加培養プロセスもまた、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の増殖に適切であり、培養の進行に伴って基質を増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含む。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することが所望される場合、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は、困難であるため、これは、ｐＨ、およびＣＯ2のような排気体分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて、見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該分野において一般的かつ周知であり、その例は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ．ＭＡ、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）（本明細書において参照として援用される）に見出すことができる。
【００９９】
エタノールの商業的産生は連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、規定された培養培地が連続的にバイオリアクターに添加され、同時に等量の順化培地が処理のために取り出される。一般的に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物および不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、当業者に公知である天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【０１００】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を調節することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源のような制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、そして他のすべてのパラメータを加減することが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、それ故、培地を抜き取ることによって起きる細胞の消失は、培養における細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスのための栄養物および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大限にするための技術については、産業微生物学の分野において周知であり、さまざまな方法がＢｒｏｃｋ、上掲によって詳述されている。
【０１０１】
以下の発酵レジメンがエタノール産生に特に適切である。所望される本発明のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、オービタルシェーカー中、約１５０ｒｐｍで振盪しながら約３０℃〜約３７℃で振盪フラスコ中、半複合培地（ｓｅｍｉ−ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉｕｍ）で増殖させ、次いで、類似の培地を晩有する１０Ｌ種発酵槽に移す。発酵パラメータがエタノール産生に最適化されている産生発酵槽に種培養物を移す場合、ＯＤ600が３〜６の間になるまで、種培養物を種発酵槽で嫌気的に増殖させる。種タンクから産生タンクに移される典型的な播種容積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲である。典型的な発酵培地は、リン酸カリウム（１．０〜１０．０ｇ／ｌ）、硫酸アンモニウム（０〜２．０ｇ／ｌ）、硫酸マグネシウム（０〜５．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物またはダイズを主材料とする製品（０〜１０ｇ／ｌ）のような複合窒素源のような最小培地成分を含有する。最終濃度で約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが培地中に存在する。キシロース、およびグルコース（またはスクロース）のような少なくとも１つのさらなる糖を含む混合糖類は、炭素源を提供し、エタノールの率および力価を最大限にするために初期のバッチ処理された炭素源（５０〜２００ｇ／ｌ）の枯渇に際して発酵容器に連続的に添加する。炭素源供給速度は、培養物が、酢酸のような毒性の副産物の形成をもたらし得るグルコースの過渡の蓄積を生じないことを確実にするために、動力学的に調整する。利用する基質から産生されるエタノールの収率を最大限にするために、最初にバッチ処理するか、または発酵過程中に供給されるリン酸塩の量によって、バイオマスの増殖を制限する。発酵は、（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、もしくは水酸化ナトリウムのような）苛性溶液および硫酸またはリン酸のいずれかを使用して、ｐＨ５．０〜６．０で制御する。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃に制御する。発泡を最小限にするために、消泡剤（任意のクラス−シリコーンを主材料とするもの、有機物を主材料とするものなど）を、必要に応じて容器に添加する。場合により、汚染を最小限にするために、抗生物質耐性マーカーが存在する株について、カナマイシンのような抗生物質を使用してもよい。
【０１０２】
上記の条件の任意の組、および当該分野において周知であるこれらの条件におけるさらなる変形は、キシロース資化性組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株によるエタノールの産生のための適切な条件である。
【実施例】
【０１０３】
実施例は、本明細書に記載の本発明を例示する。
【０１０４】
一般的方法
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７）に記載されている。
【０１０５】
略語の意味は次のとおりである：「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」はピコモルを意味し、「Ｃｍ」はクロラムフェニコールを意味し、「Ｃｍr」はクロラムフェニコール耐性を意味し、「Ｃｍs」はクロラムフェニコール感受性を意味し、「Ｓｐr」はスペクチノマイシン耐性を意味し、「Ｓｐs」はスペクチノマイシン感受性を意味し、「ＸＩ」はキシロースイソメラーゼであり、「ＸＫ」はキシルロキナーゼであり、「ＴＡＬ」はトランスアルドラーゼであり、「ＴＫＴ」はトランスケトラーゼであり、「ＥＦＴ」は発酵経過時間を意味し、「ＲＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物＋２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含有するリッチ培地を意味し、「ＭＭ」は１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4および０．２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4を含有する接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）を意味する。
【０１０６】
酵素アッセイのためのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の無細胞抽出物の調製
細胞を、５０ｍｌのＲＭ＋２％グルコース中、３０℃で、１晩、１．０〜１．２のＯＤ600まで増殖させた。細胞を４５００ｒｐｍで１０分間、４℃で、遠心分離により回収した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを２５ｍｌ氷冷音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ2）で洗浄し、続いて、４５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行った。ペレットを２．０〜２．５ｍｌ音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールに再懸濁した。５００μＬアリコートを、１分間、エッペンドルフ遠心管中、４℃で遠心分離した。上清のほとんどを廃棄し、約１０〜２０μＬを残してペレットの乾燥を防止した。細胞を凍結し、そしてアッセイを行うまで約８０℃で貯蔵した。アッセイの前に細胞を融解し、そして５００μＬの音波処理用緩衝液＋１ｍＭジチオスレイトールで再懸濁した。混合物を，Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０を使用して、４５秒間、６２％デューティサイクルおよび２の出力制御関数で、２回音波処理し、各音波処理の間に、約３〜５分間、サンプルを冷却した。サンプルを、１４，０００ｒｐｍで６０分間、Ｂｅｃｋｍａｎ微量遠心機中、４℃で遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、４℃で保持した。タンパク質濃度を決定するためにピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡアッセイを使用した。
【０１０７】
トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）アッセイは、この酵素が他の酵素要素より不安定であるため、通常、最初に実施した。ＴＫＴアッセイの概念図を図１Ａに示す。
【０１０８】
マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３７ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、８．４ｍＭのＭｇＣｌ2、０．１ｍＭのＴＰＰ（（チアミン塩化ピロリン酸）、０．６ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、４ｍＭのＢＨＰ（βヒドロキシピルビン酸）、４Ｕ／ｍｌのＰＧＩ（ホスホグルコースイソメラーゼ）、および４Ｕ／ｍｌのＧ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＴＫＴ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１μｍｏｌのＤ−フルクトース６−リン酸／分の形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＰ→ＮＡＤＰＨのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１０９】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）アッセイの基礎を図１Ｂに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．３８ｍＭのＮＡＤＨ、８７ｍＭトリエタノールアミン、１７ｍＭのＥＤＴＡ、３３ｍＭのＦ６Ｐ（フルクトース−６−リン酸）、１．２ｍＭのＥ４Ｐ（エリトロース−４−リン酸）、２．０Ｕ／ｍｌのＧＤＨ（グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、および２０Ｕ／ｍｌのＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）。プレートを５分間、インキュベートし、次いで、Ａ340を３〜５分間、読み取った。ＴＡＬ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μｍｏｌのＤ−グリセルアルデヒドの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク
【０１１０】
キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）アッセイの基礎を図１Ｃに示す。マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ4、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌのＳＤＨ（ソルビトールデヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位のＸＩは、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースの形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨＰ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１１１】
キシルロキナーゼ（ＸＫ）アッセイの基礎を図１Ｄに示す。
マイクロプレートアッセイでは、２０μＬの無細胞抽出物を、次の最終濃度の成分を含んだ反応混合物の各ウェルに３０℃で添加した：０．２ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ７．５、２．０ｍｍのＭｇＣｌ2−６Ｈ2Ｏ、２．０ＭのＡＴＰ、０．２ＭのＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）、８．５ｍＭのＤ−キシルロース、５Ｕ／ｍｌのＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、および５Ｕ／ｍｌのＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）。Ａ340を、３〜５分間、プレートリーダー上で読み取った。ＸＩ活性を以下のとおりに算出した：
１単位は、３０℃における１分間あたりの１μモルのＤ−キシルロースからＤ−キシルロース−５−リン酸への形成に対応する。
Ｕ（μモル／分）＝勾配（ｄＡ340／分）＊反応物の容積（μＬ）／６２２０／０．５５ｃｍ
（ＮＡＤＨ→ＮＡＤのモルは１ｃｍキュベットにおける１Ｌあたり１モルあたり６２２０ Ａ340である）
（マイクロプレートにおける１ウェルあたり２００μＬの路長＝０．５５ｃｍ）
比活性（μモル／分−ｍｇ）＝μモル／分／タンパク質濃度（ｍｇ）
【０１１２】
ＨＰＬＣ方法
分析は、ＬＣ ３ＤのＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣおよびＡｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアで行った。カラムは、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（１２５−０１２９）を備えたＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ（ＨＰＬＣ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｌｕｍｎ １２５−０１４０）であった。操作条件は以下のとおりであった：
【０１１３】
【０１１４】
実施例１
キシロース発酵性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株の構築
同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書に記載のように、キシロース発酵性ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の株を、連続的な転位事象を介して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする４つのキシロース資化遺伝子を含有する２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔをＺＷ１（ＡＴＣＣ番号３１８２１）のゲノムに組み込むことによって構築し、続いて、キシロースを含有する選択培地に適応した。以前に、米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書に記載の８ｂと呼ばれるキシロースを発酵させるザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、相同組換えおよびトランスポゾンアプローチの組み合わせを介して、選択抗生物質マーカーと共に２つのオペロンＰｇａｐｘｙｌＡｘｙｌＢおよびＰｅｎｏｔａｌｔｋｔをザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）５Ｃのゲノムに組み込むことによって構築し、続いて、適応およびＮＴＧ変異誘導を行った。新たな株の調製では転位（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＥＺ：：Ｔｎインビトロ転位システム）を使用した。このアプローチは，部位特異的相同組換えとは対照的に、利点として組み込み部位の複数の選択肢および比較的高い挿入頻度を付与するからである。キシロース資化酵素をコードする４つの遺伝子を配置し、組み込みのための２つの個別のオペロン：ＰｇａｐｘｙｌＡＢおよびＰｇａｐｔａｌｔｋｔとしてクローニングした。組み込み体の選択のために、２つのＰ１ファージＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（ｌｏｘＰ）によってフランキングされる抗生物質耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性（Ｃｍr）遺伝子を各オペロンに付着させた。２つのオペロンの組み込みを２段階の連続様式：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ、続いて、ＰｇａｐｘｙｌＡＢで達成した。Ｃｍ耐性選択は、各組み込み後、プラスミド上のＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、続いて、プラスミドのキュアリングによって除去されるため、両方の組み込みに使用した。このプロセスにより、選択のために同じ抗生物質マーカーを複数回使用することが可能であった。さらに重要なことに、それは、オペロンの組み込みの選択のために導入される抗生物質マーカーの除去を可能にした。このプロセスは、商業的用途のための発酵株に対する抗生物質耐性遺伝子のネガティブな影響を排除する。
【０１１５】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの構築
米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書（その明細書の実施例９）に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）コード領域を含有する２．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ消化によってｐＵＣｔａｌｔｋｔ（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）から単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化したｐＭＯＤ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ベクターにクローニングし、ｐＭＯＤｔｋｔを得た。ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）ｇａｐ（Ｐｇａｐ；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーター領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスアルドラーゼのコード領域（ｔａｌ）に次のとおりに融合することによって、Ｐｇａｐｔａｌと命名されるＰＣＲフラグメントを作製した。配列番号１３および１４のプライマーを使用して、Ｐｇａｐフラグメント（その構築については米国特許第５５１４５８３号明細書（実施例３）に記載されている）をｐＺＢ４から増幅した。ｐＺＢ４は、Ｐｇａｐ−ｘｙｌＡ／ｘｙｌＢオペロンおよびＰｅｎｏ−ｔａｌ／ｔｋｔオペロンを含有する。配列番号１５および１６のプライマーを使用して、ｔａｌコード領域フラグメントをｐＺＢ４から増幅した。テンプレートとしてＰｇａｐおよびｔａｌフラグメントを使用し、配列番号１７および１８のプライマーを使用して、Ｐｇａｐｔａｌフラグメントを増幅した。このフラグメントをＸｂａＩで消化し、ｔｋｔコード領域の上流のプラスミドｐＭＯＤｔｋｔにクローニングした。Ｃｍｌｏｘ（Ｆ，ｓｆｉ）およびＣｍｌｏｘ（Ｒ，ｓｆｉ）プライマー（配列番号１９および２０）ならびにテンプレートとしてｐＺＢ１８６を使用するＰＣＲによって、ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを作製した。ｐＺＢ１８６は、生来のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）プラスミド、ならびに米国特許第５１４５８３号明細書（実施例３）およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３）に記載のｐＡＣＹＣ１８４の組み合わせである。最後に、ｌｏｘＰ：：ＣｍＰＣＲフラグメントを、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔを含有するプラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入し、組み込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを形成させた。このプラスミドでは、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ｌｏｘＰ：：Ｃｍフラグメントを、ｐＭＯＤベクターの２つのモザイク末端（ｍｏｓａｉｃ ｅｎｄ）（トランスポザーゼ結合部位）の間に挿入した。ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号２１として示す。
【０１１６】
ＺＷ１におけるｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの転位および形質転換
プラスミドｐＭＯＤは、ｐＵＣに基づくベクターであり、従って、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における非複製ベクターである。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを、Ｍｇ2+の存在下、室温で１時間、トランスポザーゼで処置し、そして（２００オーム、２５μＦおよび１６ｋＶ／ｃｍに設定したＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを使用する）エレクトロポレーションによってＺＷ１細胞を形質転換するために使用した。エレクトロポレートした細胞を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１ｍＭのＭｇＳＯ4を補充した１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4）からなる接合培地（ｍａｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＭ）中、６時間、３０℃でインキュベートした。形質転換混合物を、５０ｇ／Ｌグルコースおよび１２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補充したＭＭ中に１５ｇ／ＬのＢａｃｔｏ寒天を含有する寒天プレート上でプレーティングし、そして３０℃で嫌気的にインキュベートした。約２日間後、形質転換体が目視で認められた。形質転換／転位頻度は、約３×１０1／μｇのＤＮＡであった。
【０１１７】
合計で３９個のＣｍr形質転換体コロニーを得た。２１個のコロニーを拾い出し、そしてＰＣＲおよび酵素活性アッセイによってさらに分析した。プライマー配列番号２２および２３を使用するＰＣＲにより、形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの存在を確認した。２１個の組込み体コロニー由来のプラスミドＤＮＡによる戻し形質転換により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で戻し形質転換体が作製されなかったことから、ｔａｌおよびｔｋｔは、ＺＷ１のゲノムに組み込まれたことが示唆された。マイクロプレート用に改変したプロトコル（一般的方法）を使用して、これらの組み込み体をトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性について試験した。ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）ＢＣＡタンパク質アッセイを、タンパク質濃度の決定するために使用した。形質転換体を、１２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した２％（ｗ／ｖ）グルコースを含有するＲＭ培地中、５０ｍｌ円錐遠心管中で３０℃で増殖させた。酵素アッセイでは、コントロール株８ｂおよびＺＷ１も増殖させた（ＺＷ１ではＲＭ＋２％グルコースを使用した）。ＯＤ600が１．０に到達したときに細胞を回収した。細胞を１回洗浄し、そして音波処理用緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭのＭｇＣｌ2）に再懸濁した。米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書に記載のように、酵素アッセイを行った。単位はμモル／分−ｍｇとして示される。１つを除いて、すべてのサンプルはトランスアルドラーゼ活性およびトランスケトラーゼ活性を有した。
【０１１８】
ｔｋｔプローブを使用して、ＰｓｔＩで消化した選択された組み込み体のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡに対し、サザンハイブリダイゼーションを実施した。ＺＷ１ ＤＮＡは、ｔｋｔプローブとはハイブリダイズしなかった。すべての組み込み体ゲノムＤＮＡサンプルにおいて共通の１．５ｋｂのバンドが認められたが、これは、ｔｋｔ中のＰｓｔＩ部位とｔａｌ中のＰｓｔＩ部位との間に予想されるＤＮＡフラグメントである。第２の認められる高分子量（６ｋｂもしくはそれ以上）のバンドは、独立した系統Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５の間で独特であり、各系統における個別のゲノム組み込み部位を示した。興味深いことに、Ｔ５のプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方ともｔｋｔプローブとハイブリダイズし、Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔもまた、生来のプラスミド上のＴ５に組み込まれた可能性があることを示した。Ｃｍrマーカーを除去するためのさらなるＣｒｅ処置のためにこれらの４つの株（Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５）を選択した。
【０１１９】
ｔａｌｔｋｔ組み込み体からＣｍrマーカーを除去するためのＣｒｅ処置
染色体からＣｍrマーカーを取り出すため、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５をｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅで形質転換した。このプラスミドは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現カセットを含有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＺＢ１８８［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２４０−２４３；米国特許第５５１４５８３号明細書］の誘導体である。ｐＺＢ１８８／Ｓｐｅｃ−Ｃｒｅは、それがカナマイシン−耐性遺伝子の代わりにスペクチノマイシン−耐性遺伝子を有することを除いて、実施例１０に記載されているＣｒｅ発現ベクター（ｐＺＢ１８８／Ｋａｎ−Ｃｒｅ）と同一である。２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を補充したＭＭ寒天プレート上で形質転換体を選択した。Ｓｐr耐性コロニーを拾い出して、２％グルコースおよび２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを補充したＲＭ寒天プレートおよび２％グルコースおよび１２０μｇ／ｍＬのＣｍを補充したＲＭ寒天プレート上に移した。採取したコロニーの１００％がＣｍsであったことから、ＣｒｅによるＣｍrの高い効率の切り出しが示された。ＳｐrＣｍs形質転換体を、ＲＭ＋２％グルコース中、３７℃、２〜５回の連日継代で培養し、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦをキュアリングした。各継代時に細胞を希釈し、拾い出して、２００μｇ／ｍＬのＳｐを含むまたは含まない同じ培地のさらなるプレートに移すために、ＲＭ＋２％グルコース寒天プレート上にプレーティングした。ＰＣＲによってＳｐsコロニーを分析して、ｐＺＢ１８８ａａｄＡＣｒｅＦの消失を確認した。組み込み体のプラスミドがキュアリングされた子孫を、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃと命名した。これらの転位組み込み体が安定であるかどうかを調べるために、これらの４つの株を、ＲＭ＋２％グルコース中で増殖させ、次いで、１０ｍｌの同じ培地に移し、そして３７℃で、２回反復測定の試験管中で増殖させた。細胞を、１０日間連日、または約１００代まで継代した。１代および１０代継代後、コロニーを希釈し、そしてコロニー単離のためにＲＭＧプレート上にプレーティングした。試験した各株の各継代由来の１２個のコロニーが、５’Ｐｇａｐおよび３’ｔｋｔプライマー（配列番号１３および２３）を使用するコロニーＰＣＲによるＰｇａｐｔａｌｔｋｔの存在についてポジティブであった。トランスアルドラーゼ活性およびトランスケトラーゼ活性もまた、（一般的方法に記載のとおりに）１代および１０代の継代後の単離体について測定した。４つのすべての組み込み体は、非選択的倍地上の１００代目後もＴＡＬ活性およびＴＫＴ活性の両方について同様のレベルを有したことから、これらの組み込み体が遺伝的に安定であることが示唆された。
【０１２０】
転位のためのｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの構築
次の工程は、ＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ組み込み体（Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ）にＰｇａｐｘｙｌＡＢ ｌｏｘＰ：：Ｃｍオペロンをさらに組み込むことであった。プラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍ（上記）に基づいて、組み込みプラスミドｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを構築した。ＳａｃＩ／ＳｆｉＩ消化によってＰｇａｐｔａｌｔｋｔＤＮＡフラグメントを取り出した。ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、およびＳｆｉＩ制限部位を含有するアダプターフラグメントを、ライゲーションによって導入した。次いで、ｐＺＢ４（米国特許第５５１４５８３号明細書）から単離したＰｇａｐｘｙｌＡＢのＮｏｔＩフラグメントを、アダプターのＮｏｔＩ部位にクローニングした。キシロースイソメラーゼ（ＸＩ）はｘｙｌＡによってコードされ、そしてキシルロキナーゼ（ＸＫ）はｘｙｌＢによってコードされる。ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列を、配列番号２４として示す。
【０１２１】
Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５ＣにおけるｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍの転位および形質転換
ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍの組み込みと同様のアプローチを使用して、Ｔ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃを、トランスポザーゼで処置したｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ（上記）で形質転換／転位した。Ｃｍ選択後の２回の形質転換／転位実験で、６つの組み込み体（Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ２）を得た。すべてについて、２つの組のプライマー：配列番号２５、および２６、ならびに配列番号１５および１６を使用するＰＣＲによって、ｘｙｌＡＢの存在か確認されたが、但し、Ｔ２ＣｃｍＸ１およびＴ２ＣｃｍＸ６については、プライマー配列番号２５および２６を使用すると、ＰＣＲフラグメントが検出されなかった。
【０１２２】
２つのＰＣＲネガティブ系統を含む組み込み体を、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性についてアッセイした（一般的方法）。図２および３に示される結果は、６つのｘｙｌＡＢ組み込み体Ｔ３ＣＣｍＸ１、Ｔ３ＣＣｍＸ２、Ｔ３ＣＣｍＸ３、Ｔ４ＣＣｍＸ１、Ｔ５ＣＣｍＸ１、およびＴ５ＣＣｍＸ２はすべて、ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴ活性を有したことを示した。ネガティブな親コントロールと比較して、ＸＩおよびＸＫ活性が新たに獲得された（図２）。ＴＡＬおよびＴＫＴ活性は、親コントロールと同じように維持された。すべての結果は、タンパク質が生成され、かつ機能的であることを示した。酵素活性レベルにはばらつきが認められたが、ＴＩおよびＸＫ活性は、同じプラスミドで形質転換／転位されたＺＷ１組み込み体のＴＩおよびＸＫ活性と同様であった。ＸＩ、ＸＫ、ＴＡＬおよびＴＫＴの活性のレベルは株８ｂより低かった。
【０１２３】
ｘｙｌＡＢオペロンの組み込みを、サザンハイブリダイゼーションによって確認した。６系統のゲノムＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡの両方を、ＳｐｈＩで消化し、そしてジゴキシゲニン標識ｘｙｌＢプローブにハイブリダイズさせた。ｘｙｌＢにおけるＳｐｈＩ部位およびｐＭＯＤベクター上の隣接するクローニング部位におけるもう１つのＳｐｈＩ部位から作製される約３ｋｂの共通のバンドは、すべてのゲノムＤＮＡサンプルに存在し、さらに、ゲノムＤＮＡサンプル中に、より高い分子量のハイブリダイズバンドが認められたことから、染色体にＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのための４つの組み込みの部位が存在することが示された。Ｔ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２は同じ組み込み部位を有するようであり、Ｔ３ＣＣｍＸ３およびＴ４ＣＣｍＸ１は同じ組み込み部位を有し得、そしてＴ５ＣＣｍＸ１およびＴ５ＣＣｍＸ２はそれぞれ個別の組み込み部位を有した。ＰｓｔＩによる同じＤＮＡの消化、それに続く、ｔｋｔプローブとのサザンハイブリダイゼーションにより、各組み込み体はそのそれぞれの親株と同じハイブリダイゼーションパターンを有したことが実証された。
【０１２４】
キシロース培地におけるＺＷ１：：Ｐｇａｐｔａｌｔｋｔ ＰｇａｐｘｙｌＡＢ Ｃｍ組み込み体の適応
キシロース資化のための４つのすべての酵素活性が存在しているにもかかわらず、先の観察（米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）では、組み込み体は、キシロース上で直ぐには増殖しないことが示された。キシロース上での増殖は、（試験管中またはプレート上のいずれかにおける）キシロース培地上での長期のインキュベーション、適応と呼ばれるプロセス後、生じ得る。
【０１２５】
株は、以下のとおりに適応させた。ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ組み込み体株を、ＲＭＸ（１０ｇ／ｌ酵母抽出物、２ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、２０ｇ／ｌまたは２％（ｗ／ｖ）キシロースを含有する）を含有する試験管、ならびにＭＭＧＸまたはＭＭＸプレート（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＭｇＳＯ4、１．５％（ｗ／ｖ）寒天、０．０２５％（ｗ／ｖ）グルコースおよび４％（ｗ／ｖ）キシロースもしくは４％（ｗ／ｖ）キシロースのみ）上に播種した。低レベルのグルコースを使用して、初期の増殖を支持し、適応中の変異の可能性を増加させた。培養およびプレートの両方におけるキシロースに対する適応について少なくとも５つ試みたうちの１つが成功であった。３０℃での１０日間の嫌気的インキュベーションの後、１７および１９個のコロニーが、それぞれＴ３ＣＣｍＸ１およびＴ３ＣＣｍＸ２細胞をプレーティングしたＭＭＧＸ上で認められた。コロニーは小さく、そしてプレート上では健常でないように見えた（透明であった）。１２個のコロニー（Ｔ３ＣＣｍＸ１プレーティング由来の４個：Ｔ３ＣＣｍＸ１１、Ｔ３ＣＣｍＸ１２、Ｔ３ＣＣｍＸ１３およびＴ３ＣＣｍＸ１１０；Ｔ３ＣＣｍＸ２プレーティング由来の８個：Ｔ３ＣＣｍＸ２４、Ｔ３ＣＣｍＸ２５、Ｔ３ＣＣｍＸ２６、Ｔ３ＣＣｍＸ２７、Ｔ３ＣＣｍＸ２８、Ｔ３ＣＣｍＸ２９、Ｔ３ＣＣｍＸ２１１およびＴ３ＣＣｍＸ２１２）をＲＭＧＣｍ１２０に播種し、そしてさらなる適応のために３ｍｌのＲＭＸに移して、キシロース上でより迅速に増殖することが可能な系統を得た。
【０１２６】
３ｍｌのＲＭＸを含有する試験管における組み込み体の適応は、３０℃で行った。ＯＤ600を、スペクトロニック（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）６０１分光光度計で絶えずモニターした。増殖が対数期の中間部に到達したら、培養をＲＭＸの新鮮な管に移した。このプロセスを７継代連続した。継代の間に増殖速度および最終ＯＤ（非線形的な読み取り）が改善された。
【０１２７】
６回目の継代において、培養物をＲＭＸプレート上から画線して、単一のコロニーを単離した。３つの組込み体：Ｔ３ＣＣｍＸ１３、Ｔ３ＣＣｍＸ２６およびＴ３ＣＣｍＸ２７が、ＲＭＸ画線プレート上で他より迅速に増殖したが、これらを、以下の表および考察でＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７と称する。最良のキシロース資化増殖体をスクリーニングするために、ＴＸ１３、Ｘ２６およびＸ２７に対するそれぞれ４個の大きな（Ｌ１−４）および４個の小さな（Ｓ１−４）コロニーを選択し、そして増殖、糖資化、およびエタノール産生をモニターし得るように、ＲＭＸ試験管中で増殖させた。コロニーを、１晩、３０℃で増殖させ、続いて、２回反復測定の試験管中３ｍｌのＲＭＸにＯＤ600＝０．０５を播種した。Ｘ２７は、ＲＭＧにおいて他の培養物より遅く増殖し、６．５時間後に再度播種した。６９時間（Ｘ２７では６２．５時間）後、サンプルを、ＨＰＬＣ分析（一般的方法）のために採取した。図４は、６９時間目（すべてのＸ２７培養物については６２．５時間）での培養の平均エタノール収率（理論的収率の％）およびキシロース資化（％）を示す図表である。大きなコロニーと小さなコロニーとの間で、有意差は認められなかった。Ｘ２７の性能は、キシロース上のＸ２６と比較して、より良好であったが、それは、グルコース上では、より遅い増殖を示した。従って、最上位の性能を示すもの、Ｘ１３（Ｘ１３Ｌ３）およびＸ２６（Ｘ２６Ｌ１）の大きなコロニーを、ｐＨ制御された発酵におけるさらなる評価のために選択した。発酵を、ＲＭＧ（６％グルコース）、ＲＭＸ（６％キシロース）およびＲＭＧＸ（８％：４％；グルコース：キシロース）中、３７℃で、株Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１、ならびにコントロール株８ｂについて行った。ＲＭＧ（６％）およびＲＭＧＸ（８％：４％）で増殖したＸ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１によるグルコースの発酵は、かなり迅速に進行した。ＲＭＧＸ（８％：４％）におけるキシロースの発酵は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１では両方とも株８ｂと比較して緩徐であった。さらに、ＲＭＸ（６％）上、３７℃での増殖は、Ｘ１３Ｌ３およびＸ２６Ｌ１の両方とも、長い停滞の後に生じた。いくらかの単離体、Ｘ１３ｂ、Ｘ１３ｃおよびＸ１３ＦＬを、ＲＭＸ（６％）発酵から回収した。これらの単離体を、本来の株Ｘ１３ａ（Ｘ１３Ｌ３の単離体）およびＸ２６と共に、本実施例において先に記載のようにＣｒｅ処置に供して、ＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株からＣｍrマーカーを取り出した。得られたＣｒｅ処置されたＣｍrを含まない組込み体を：Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ１３ＦＬＣおよびＸ２６Ｃと命名した。
【０１２８】
実施例２
株ＺＷ６５８の適応および選択
先に記載のように、ＲＭＸ上、３０℃での初期のＺＷ１：：ＰｇａｐｔａｌｔｋｔＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍ株の適応により、これらの条件における株の増殖が顕著に改善された。しかし、適応された株は、ＲＭＸ（６％）における３７℃での増殖および発酵の間、長い停滞を蒙る。より高い糖濃度および温度を含む好適なプロセス条件でのキシロース発酵のために組込み体をさらに改善するために、進化または適応プロセスをＲＭＸ（５％）中３７℃で継続させた。連続継代を行い、そして最も良好な資化増殖体を選択した。このプロセスで使用した組込み体は、Ｘ１３ａＣ、Ｘ１３ｂＣ、Ｘ１３ｃＣ、Ｘ２６ＣおよびＸ１３ＦＬＣを含んだ。これらの５つの株をＲＭＸ中３０℃で６継代増殖させた後、さらに５〜１６代の継代のために３７℃でＲＭＸ（５％）に移した。すべての継代中および後、培養物をＲＭＸプレート上に画線し、そして３７℃でインキュベートして、単一のコロニーを単離した。大きなコロニーについてさらに、ＲＭＸプレート上での画線および３７℃でのインキュベートを３〜４回行い、コロニーを精製した。最終的な大きなコロニーを、ＲＭＸ（５％）における３７℃での増殖試験のために選択した。
【０１２９】
ＲＭＸ（５％）培地における３７℃での適応由来の株の評価
連続継代による適応後に単離した１８個のコロニーを、はじめに、ＲＭＸ（５％）試験管中、３７℃で試験した。１２の株を、第２の試験管評価のために選択した。比較のために、株８ｂをすべての評価に含めた。１８個のコロニーを、ＲＭＧで３７℃で１晩増殖させ、遠心分離し、そして細胞を第１の評価のために試験管中４ｍｌのＲＭＸ（５％）に３７℃で静置状態で接種した。増殖（ＯＤ600、非線形的）およびエンドポイントのＨＰＬＣ結果（低い残留キシロースおよび高エタノール）に基づいて、１２の株を第２の評価のために選択した。
【０１３０】
第２の評価の目的の１つは、キシロース上での改善された増殖の安定性および株のキシロース資化能を試験することであった。１２のすべての株を安定性研究に供して、適応された株を非選択培地に暴露して３７℃で５０代連続的に継代培養させた後にそれらが安定であるかどうかを調べた。ＲＭＧ（５％）継代培養の前および後の培養物をＲＭＸ（５％）試験管に播種し、そして評価のために３７℃で増殖させた。非線形的ＯＤを、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ６０１分光光度計により試験管の直接読み取りによってモニターした。ＲＭＧにおける５０代の増殖の前および後のＲＭＸ（５％）における増殖の７０時間目のＯＤを、図５にプロットした。結果は、ほとんどの株がＲＭＧ、３７℃において５０代後も安定であったことを示した。（定常期における）エンドポイントの上清もまた、キシロースおよびエタノール濃度についてＨＰＬＣによって分析した。これらの培養物において低い残留キシロースおよび高いエタノール濃度が認められたことから、株が増殖し、そしてキシロースを良好に発酵したという事実が支持された。
【０１３１】
上記の試験管評価（低い残留キシロース、高いエタノール濃度およびより高いＯＤ）ならびに高度の糖類における、および酢酸塩の存在下でのより良好な増殖体を選択するための高濃度のグルコースおよび／またはキシロース（２０％まで）、およびグルコースおよびキシロースと酢酸塩との混合物による以後のマイクロタイタープレート増殖スクリーニングの結果に基づいて、全体的に最も良好な性能を示した、例えば株番号２６を、ＺＷ６５８と称した。
【０１３２】
実施例３
ペントースリン酸経路酵素活性のアッセイ
組み込まれた遺伝子によってコードされる４つのキシロース資化酵素（実施例１に記載）の活性を、（実施例１の）高度の糖および３７℃における適応について選択された株のうち３つについて、一般的方法に記載のとおりに測定し、そして（実施例２の）さらに適応された株ＺＷ６５８における同じ酵素の活性と比較した。結果を、μモルの産物／ｍｇタンパク質／分で表し、表４に示す。
【０１３３】
表４．異なるキシロース資化適応Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株における酵素活性
【０１３４】
ｘｙｌＡＢオペロンの両方のメンバーについての活性レベルは、部分的に適応された前駆体株におけるレベルと比較して、さらに適応された株ＺＷ６５８において約４〜８倍増化した。ｔａｌ／ｔｋｔオペロンからの酵素の発現レベルは、ＺＷ６５８と部分的に適応された前駆体株との間で、ほとんどまたは全く変化が認められなかった。
【０１３５】
実施例４
部分的に適応された株およびＺＷ６５８におけるＸＹＬＡＢオペロンのプロモーター領域の配列比較
ｘｙｌＡＢを駆動するＧＡＰプロモーター（Ｐｇａｐ）の制御下での両方の遺伝子の産物の酵素活性レベルの明確な変化がＺＷ６５８をもたらす適応の結果として認められたため、部分的に適応された株（実施例１；その後株番号ＺＷ６４１が与えられた）およびＺＷ６５８由来のそのオペロンのプロモーター領域をＰＣＲによって増幅し、そして配列決定した。ＰＣＲフラグメントを、ｒｅｃＧコード領域由来の順方向ＰＣＲプライマー（ＰＣ１１；配列番号２７）（ここにＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンを組み込んだ）およびｘｙｌＡコード領域由来の逆方向プライマー（ＰＣ１２；配列番号２８）を使用して、調製した。得られた９６１ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマーＬＭ１２１、ＬＭ１２２、およびＬＭ１２３（配列番号２９、３０、および３１）を使用して配列決定した。ＺＷ６４１由来のプロモーター配列を配列番号３に示し、そしてＺＷ６５８由来のプロモーター配列を配列番号４に示す。これらのプロモーター配列は、両方とも、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４におけるＰｇａｐの公開された配列（配列番号１）とは１箇所の位置において異なることを見出した：ＧＡＰコード領域のＡＴＧ開始コドンから数えて上流の５’末端の方向へ−２１位の次の（Ｔの）１塩基欠失である。この配列の変化は両方の株に存在するため、それは、ＺＷ６４１のＰｇａｐとＺＷ６５８のＰｇａｐとの間の発現の差異に寄与しない。この共通の変化に加えて、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８のＰｇａｐ配列の間に１塩基対の差異も認められた。ＺＷ６４１株由来の配列におけるＸｙｌＡのコード領域開始ＡＴＧに対する−１８９位のＧが、ＺＷ６５８由来の配列ではＴに置き換えられた。２つの配列の間ではそれ以外の違いは認められず、ＧＡＰプロモーター領域におけるこの１つの塩基変化による発現レベルの違いがそのプロモーターの制御下の遺伝子によってコードされる両方のタンパク質に見出された酵素活性の増加を担うようであった。
【０１３６】
実施例５
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１においてＸＹＬＡ／Ｂオペロンを駆動する同じＰＧＡＰを有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のためのキシロースイソメラーゼ発現ベクターの構築
出発物質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）シャトルベクター（ｐＺＢ１８８）を使用して、以下に記載のように、スペクチノマイシンに対する耐性およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの発現を付与するプラスミド構築物（ｐＺＢ１８８／ａａｄａ−ＧａｐＸｙｌＡ；ここで、Ｇａｐはプロモーターを表す）を作製した（図６Ａ）。ｐＺＢ１８８の構築に関与する工程については、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に開示されている。簡単に説明すると、この７００８ｂｐのプラスミドは、２つの異なる複製開始点を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）に対して１つずつ有するため、それぞれの細菌種において複製することが可能である。ｐＺＢ１８８はまた、テトラサイクリン（すなわちＴＣr−カセット）に対する耐性を付与するＤＮＡフラグメントも含む。ｐＺＢ１８８／ａａｄａ−ＧａｐＸｙｌＡの構築における第１の工程は、ｐＺＢ１８８からＴｃr−カセットを取り出し、それを、スペクチノマイシンに対する耐性を付与するＤＮＡフラグメント（即ち、Ｓｐｅｃr−カセット）で置き換えることであった。以下に詳細に説明するように、ｐＺＢ１８８からＴｃr−カセットを切り出すために、プラスミドをＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。テンプレートしてプラスミドｐＨＰ１５５７８（Ｃａｈｏｏｎ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０８２−１０８７）ならびにプライマー１（配列番号３２）および２（配列番号３３）を使用して、ＰＣＲによってＳｐｅｃr−カセットを作製した。プラスミドｐＨＰ１５５７８は、Ｓｐｅｃr−カセットおよびそのプロモーターの完全なヌクレオチド配列を含有し、３’（９）−Ｏ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンＴｎ７ ａａｄＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３）の公開された配列に基づく。
プライマー１（配列番号３２）
ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴａｔｃｇａｔＧＧＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＴ
プライマー２（配列番号３３）
ＣＡＴＣＴＴＡＣＴａｃｇｃｇｔＴＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＣＣ
【０１３７】
プライマー１（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットのプロモーターの直ぐ上流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ４〜２２に）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＣｌａＩ部位に対応する。プライマー２（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｓｐｅｃr−カセットの終止コドンから約１３０塩基下流（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３０４３のｎｔ１００２〜１０２０）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＡｆｌＩＩＩ部位に対応する。１０４８ｂｐのＰＣＲ作製したＳｐｅｃr−カセットをＣｌａＩおよびＡｆｌＩＩＩで二重消化し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０４）を使用し、および販売者の推奨するプロトコルに従って、精製した。次の工程では、（ｄａｍメチル化に対して感受性である）ＣｌａＩでの切断のための非メチル化プラスミドＤＮＡを得るための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ-、ｄａｍ-）から単離されたプラスミドｐＺＢ１８８を、ＣｌａＩおよびＢｓｓＨＩＩで二重消化して、Ｔｃr−カセットを取り出し、そして得られた大きなベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、このＤＮＡフラグメントおよびクリーンアップされたＰＣＲ産物を共にライゲートし、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００２３９）から得られた化学的にコンピテントな細胞を使用して、形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１１０に導入した。ＢｓｓＨＩＩおよびＡｆｌＩＩＩは適合性の「接着末端」を生成するが、両方の部位が一緒に連結されるとそれらの部位が破壊されることにさらに留意すること。形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングし、３７℃で増殖させた。正確なサイズ挿入部を有するプラスミドを含有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩによる制限消化分析によって同定し、さらなる操作のために選択したプラスミドを以下でｐＺＢ１８８／ａａｄＡと称する。この構築物の環状図を図６Ｂに示す。
【０１３８】
次の工程では、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡをＮｃｏＩおよびＡｃｌＩの両方の酵素で切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって大きなベクターフラグメントを精製した後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットとしての役割を果たす約２ＫｂｐのＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＺＢ４の構築物をＮｃｏＩおよびＣｌａＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動によって関連ＤＮＡフラグメントを精製することによって、プラスミドｐＺＢ４から単離した。プラスミドｐＺＢ４については、米国特許第５５１４５８３号明細書に詳述されており、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡ（配列番号３４）の略図を、図６Ｄの枠内の概念図に示す。
【０１３９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを含有するフラグメントは、それぞれ、その５’末端にＮｃｏＩ部位および３’末端にＣｌａＩ部位を有する。米国特許第５５１４５８３号明細書においてより詳細に記載されているように、このフラグメントは、キシロースイソメラーゼをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｘｙｌＡオープンリーディングフレーム（ｎｔ６２０〜１９４２）の完全なオープンリーディングフレームに正確に融合される強力な構成性Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター（ｎｔ３１６〜６１９）を含有する。それはまた、キシロースイソメラーゼ終止コドンの直後に続く小さなステムループ領域（ｎｔ１９６５〜１９９９）を含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを、標準的な連結反応で、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡのＮｃｏＩおよびＡｃｌＩ部位の間に挿入した。ＣｌａＩおよびＡｃｌＩは適合性の「接着末端」を作製するが、両方の部位が一緒に連結されるとそれらの部位が破壊されることにさらに留意すること。次いで、ライゲーション反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０（ｄｃｍ-、ｄａｍ-）にエレクトロポレートして、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のその後の形質転換のための非メチル化プラスミドＤＮＡを入手し、そして形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上でプレーティングした；増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物を有するプラスミドを有するスペクチノマイシン耐性形質転換体を、ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩおよびＡｃｌＩによる制限消化分析によって同定した。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６４１株において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのさらなる操作および過剰発現のために選択したプラスミドを以下では「ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１Ｇａｐ−ＸｙｌＡ」と称する；このプラスミド構築物の環状図を図６Ｃに示す。
【０１４０】
たとえ、配列番号３４のヌクレオチド配列が同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（ＰｇａｐＸｙｌＡ）に対応するとしても、配列番号３４のヌクレオチド配列は、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書における配列番号３４に記載のヌクレオチド配列と同一ではないに留意することが重要である。本研究における配列番号３４に開示されたＤＮＡ配列は、米国特許出願公開第２００８０２８６８７０号明細書および米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書における配列番号３４のｎｔ５９９に対応するＰｇａｐにおいて１ｂｐの欠失を有する。先の特許出願に報告されたヌクレオチド配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＣＰ４のＰｇａｐの公開されたＤＮＡ配列（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１２）：５６５３−５６６２（１９８７））に基づいていたが、当時、プロモーターは再配列決定されなかった。しかし、最近、本発明者らは、ｐＺＢ４におけるＰｇａｐもまた同じヌクレオチドを欠き、そして３つのすべての特許出願に使用された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセット（ＰｇａｐＸｙｌＡ）が上記のこのプラスミドから駆動されることを発見した。
【０１４１】
実施例６
Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４においてＸＹＬＡ／Ｂオペロンを駆動する同じＰＧＡＰを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターの作製
プラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄａ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）と同一であるが、ＺＷ６５８において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐの−１８９位に存在するＧ→Ｔ変異に対応するＰｇａｐにおける１つのヌクレオチド置換を有する。以下に記載のようにＺＷ６５８から連続的に誘導された株ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４にも同じ点変異が存在する。ＺＷ８００およびＺＷ８０１−４の構築および特徴付けについては、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書に詳述されている。ＺＷ８００は、この活性を不活化するグルコース−フルクトースオキシドレダクターゼ（ＧＦＯＲ）酵素をコードする配列へのスペクチノマイシン耐性カセットの二重交差挿入を有するＺＷ６５８の誘導体である。ＺＷ８０１−４は、部位特異的組換えによってスペクチノマイシン耐性カセットが欠失され、タンパク質を未成熟にトランケートするインフレームの終止コドンが後に残ったＺＷ８００の誘導体である。これらの操作のいずれも、ＺＷ６５８においてＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動する変異Ｐｇａｐプロモーターのヌクレオチド配列を変異しなかった。それ故、「８０１ＧＡＰプロモーター」とは、次の株：ＺＷ６５８、ＺＷ８００、およびＺＷ８０１−４に存在するプロモーター配列を指す。
【０１４２】
ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡを作製するために使用した工程およびプラスミド中間体を、プラスミドｐＭＯＤ−リンカーを出発点として時系列で説明する。
【０１４３】
ｐＭＯＤ−リンカーの構築
プラスミドｐＭＯＤ−リンカーの前駆体は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）であった。図７Ａに示すように、ｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞は、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（ｏｒｉ）、およびＴｎ５トランスポザーゼが相互作用する２つのモザイク末端（ＭＥ）の間に位置するマルチクローニング部位を有する。ｐＭＯＤ−リンカーの構築における第１の工程は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞における本来のマルチクローニング部位を取り出すことであったが、これは、それを、ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩに独特の制限部位を有する新たなマルチクローニング部位で置き換えることであった。これは、プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動により大きな（約２．５Ｋｂｐの）ベクターフラグメントを精製することによって行った。次いで、新たなマルチクローニング部位を、両方ともそれらの５’末端でリン酸化された２つの合成オリゴヌクレオチド、リンカーＢ（配列番号３５）およびリンカーＴ（配列番号３６）を共にアニーリングすることによって作製した。
【０１４４】
これらのオリゴヌクレオチドは相互に相補的であり、そして一緒にアニーリングすると両末端に一本鎖オーバーハング（小文字）を有する二本鎖のリンカーを形成し、このリンカーは、ＤＮＡフラグメントが、上記の大きなｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞ベクターフラグメントのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に連結することを可能にする。上記のように、この合成リンカーもまた、以後のクローニング工程に使用することができる３つの固有の制限部位（ＡｓｉＳｉ、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩ）を含有する。ＳｂｆＩ部位には細線で下線を付し、ＦｓｅＩ部位には太線で下線を付し、そしてＡｓｉＳＩ部位には２本の細線で下線を付す。リンカーＢおよびリンカーＴを共にアニーリングし、そして標準的なライゲーション反応において、得られたＤＮＡフラグメントをｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞のＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。連結反応混合物を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換して、形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地上でプレーティングした。次いで、プラスミドＤＮＡを新たなマルチクローニング部位を含有する代表的なアンピシリン耐性コロニーから単離した。得られたプラスミド構築物（以下、「ｐＭＯＤ−リンカー」と称する）の環状図を図７Ｂに示す。
【０１４５】
ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃの構築
スペクチノマイシンに対する耐性（Ｓｐｅｃr）を付与し、そして両方の末端に野生型ｌｏｘＰ部位を有するＤＮＡフラグメントを上記のｐＭＯＤ−リンカー構築物のＡｓｉＳＩ部位とＦｓｅＩ部位との間に挿入した。ｌｏｘＰフランキングＳｐｅｃrカセットの供給源は、米国特許出願第１１／８６２５６６号明細書に詳述されているプラスミドｐＬＤＨ−Ｓｐ−９ＷＷ（図８）であった。第１の工程では、ＭＯＤ−リンカープラスミドＤＮＡを、ＦｓｅＩおよびＡｓｉＳＩで連続的に消化し、そしてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＤＯ４００３）から購入したＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ−５スピンカラムキットを使用して、大きなベクターフラグメントを精製した。次に、プラスミドｐＬＤＨ−Ｓｐ−９ＷＷもまた、同じ２つの酵素で二重消化し、そしてｌｏｘＰフランキングＳｐｅｃrカセットを含有する小さな（約１．１Ｋｂｐの）ＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して形質転換反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上に置き、そして増殖は３７℃とした。次いで、プラスミドＤＮＡを正確なサイズのＤＮＡフラグメントを含有するアンピシリン耐性コロニーのうちの１つから単離し、そしてこれを以後の操作に使用した。構築物（以下、「ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ」と称する）の環状図を図７Ｃに示す。
【０１４６】
ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡの構築
Ｐｇａｐ全体、ＸｙｌＡコード領域、ならびにＸｙｌＡおよびＸｙｌＢオープンリーディングフレームの間に存在するステムループ領域を含有するＤＮＡフラグメントを、プライマー３および４（それぞれ、配列番号３７および３８）ならびに再懸濁した細胞をテンプレートとして使用して、ＺＷ８０１−４からＰＣＲ増幅した。既に記載のように、ＤＮＡ配列解析により、ＺＷ８０１−４は、組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐプロモーターにおいて−１８９位でＺＷ６５８と同じＧ→Ｔ点変異を有し、そして両方の株のＰｇａｐが同一であることが示された。
プライマー３（配列番号３７）
ＴＣＡＣＴＣＡＴｇｇｃｃｇｇｃｃＧＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＧＡＡＴＣＣ
プライマー４（配列番号３８）
ＣＴＡＣＴＣＡＴｃｃｔｇｃａｇｇＣＣＧＡＴＡＴＡＣＴＴＡＴＣＧＡＴＣＧＴＴＣＣ
【０１４７】
プライマー３（順方向プライマー）の下線を付した塩基は、Ｐｇａｐの最初の２２塩基（および配列番号３４のｎｔ３１６〜３３７）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＦｓｅＩ部位に対応する。プライマー４（逆方向プライマー）の下線を付した塩基は、ＸｙｌＡ終止コドンの後方に存在するステムループ領域の直ぐ下流（および配列番号３４の最後の１２ｎｔ）にハイブリダイズする一方、小文字は、プライマーの５’末端に付加されたＳｂｆＩ部位に対応する。
【０１４８】
ＰＣＲ産物を、ＦｓｅＩおよびＳｂｆＩで二重消化し、そしてＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号ＤＯ４００３）から購入したＤＮＡ Ｃｌｅａｎ＆ＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒＴＭ−５スピンカラムキットを使用して精製した。次に、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃを同じ２つの酵素で切断し、そして得られた大きなベクターフラグメントを、同じ手順を使用して精製した。次いで、２つのＤＮＡフラグメントを共に連結し、そしてエレクトロポレーションを使用して、形質転換反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上にプレーティングし、そして増殖は３７℃であった。正確なサイズの挿入物のプラスミドを含有する形質転換体を、テンプレートとしてプライマー３および４ならびに再懸濁したコロニーを使用するＰＣＲ（「コロニーＰＣＲ」）によって同定した。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以下で、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡと称し、そしてこの構築物の環状図を図９に示す。
【０１４９】
Ｐｇａｐ−ＸｙｌＡ遺伝子ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅に使用したテンプレートがＺＷ６４１の細胞懸濁液であったことを除いて、上記の同じ工程を使用して、以下、「ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ」と称するもう１つのプラスミドを作製した。ＺＷ６５８（およびＺＷ８０１−４）とＺＷ６４１とを区別するＰｇａｐにおけるＧ→Ｔ置換を除いて、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは同一である。
【０１５０】
ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡの構築
実施例６の最初の段落に記載のように、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡに同一なＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現ベクターであるが、それは、ＺＷ６５８（およびＺＷ８０１−４）に組み込まれたＰｇａｐ−ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐにおける同じＧ→Ｔ置換を有する。このプラスミドを構築するため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ａ）をＭｌｕＩおよびＳａｌＩで二重消化し、そしてより小さなＤＮＡフラグメント（約１１００ｂｐ）を、アガロースゲル電気泳動およびＺｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ４００１、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、精製した。このフラグメントはＰｇａｐのＧ→Ｔ置換およびＸｙｌＡ ＯＲＦの一部を含有するが、後者の構築物を同じ２つの酵素で切断し、そして大きなベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって精製した後、ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図１０Ｂ）において対応するフラグメントを置き換えるために使用した。次いで、２つのフラグメントを共にライゲートし、そしてエレクトロポレーションを使用して、ライゲーション反応混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入した。形質転換体を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上でプレーティングし、そして増殖は３７℃であった。プラスミドＤＮＡをスペクチノマイシン耐性コロニーから単離し、そしてＰｇａｐプロモーターＧ→Ｔ置換の存在を、ＤＮＡ配列解析によって確認した。以後の操作に使用したプラスミド（「ｐＺＢ１８８−ａａｄＡ−８０１ＧａｐＸｙｌＡ」）を図１０Ｃに示す。
【０１５１】
実施例７
ＺＷ６４１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼの過剰発現
表４における酵素活性測定値は、ＺＷ６４１からＺＷ６５８へのトランジション中にキシロースイソメラーゼ活性およびキシルロキナーゼ活性が劇的に増加することを示す。キシロースイソメラーゼが、ＺＷ６４１におけるキシロース上での増殖の律速酵素であるという仮説を試験するため、マルチコピープラスミド、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ（図６Ｃ）を使用して、酵素をこの株で過剰発現させた。この実験のコントロールは、Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを欠くマルチコピープラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡで形質転換されたＺＷ６４１であった（図６Ｂ）。これらの両方のプラスミドの構築については、実施例５に記載されており、そして形質転換プロトコルは、本質的に、同一出願人が所有しかつ同時係属中の米国特許出願公開第２００８０１８７９７３号明細書の実施例５に記載のとおりであった。簡単に説明すると、エレクトロポレーションを使用して、非メチル化プラスミドＤＮＡ（ｄｃｍ-およびｄａｍ-株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＣ１１０から単離された）をＺＷ６４１に導入し、そして形質転換細胞を、２００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上にプレーティングした。嫌気条件下３０℃で４８時間の培養期間後、各プラスミドについて、３つの初代形質転換体を無作為に選択し、そしてこれらを、さらなる特徴付けのために同じ増殖培地を含有する寒天プレート上にパッチした（移した）。
【０１５２】
図１１は、６４１Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミドを保持する３つの株（Ｘ１、Ｘ２およびＸ２）ならびにコントロールプラスミドを保持する３つの株（Ｃ１、Ｃ２およびＣ３）のキシロース含有培地における増殖曲線（ＯＤ600対時間）を示す。この実験は、振盪フラスコ（１５０ｒｐｍで１５ｍｌ試験管中５ｍｌの培養液）中３０℃で実施し、そして増殖培地は、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍｌ）をも含有するｍＲＭ３−Ｘ１０（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１００ｇ／Ｌキシロース）であった。培養は、上記の段落において記載のパッチしたプレート由来の１植菌耳の細胞から開始し、そしてそれぞれの場合の初期ＯＤ600は約０．１３であった。ＺＷ６４１と同様に、コントロールプラスミドを含む３つの株はキシロース上ではほとんど増殖しなかった。全く対照的に、ＺＷ６４１を、６４１Ｐｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現プラスミド、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡで形質転換した場合、キシロース上での増殖の速度および程度（最終ＯＤ600値）の両方とも劇的に改善された。このプラスミドを有する３つのすべての株は、図１１に示す実験において同じ挙動を示したため、Ｘ１株およびＣ１株のみをさらなる特徴付けに供した。
【０１５３】
図１２は、スペクチノマイシンを伴わない同じキシロース含有増殖培地におけるＺＷ６４１、ＺＷ６５８、Ｘ１およびＣ１の並列比較を示す。この実験の条件は、上記の条件と同一であったが、２０ｍｌ培養液を、５０ｍｌ試験管中で増殖させ、そして初期ＯＤ600は約１／４であった（０．０３５）。図１２Ａに示す増殖曲線を線形目盛（ＯＤ600対時間）でプロットする一方、図１２Ｂは、指数増殖速度を比較するために、対数目盛（ｌｏｇＯＤ600対時間）に対してプロットした同じ実験データを示す。この実験から、Ｘ１の指数増殖速度は、キシロース適応株ＺＷ６５８とほとんど同じ速さであること、およびこの株は、コントロールプラスミドを伴っても伴わなくても親株ＺＷ６４１よりかなり良好にキシロース上で増殖することが明らかである。それ故、（マルチコピープラスミド由来の６４１Ｐｇａｐプロモーターによって駆動される）ＺＷ６４１におけるキシロースイソメラーゼの高発現は、キシロース上での増殖に対して、キシロースイソメラーゼ活性の増加がＺＷ６５８に対して及ぼす効果（表４に示す）に類似の効果を及ぼす。Ｘ１の最終的なバイオマス収量は、ＺＷ６５８によって得られる収量の約１／２であるが、このデータから、ＺＷ６４１におけるキシロース上での増殖の律速酵素はキシロースイソメラーゼであることが明らかである。図１１および１２に示される実験から、次の他の２つの興味深い可能性がさらに示唆される：（１）ＺＷ６４１からＺＷ６５８へのトランジション中に生じるキシロースイソメラーゼ活性の大きな増加（表４）が、「キシロース適応」プロセス中に生じたキシロース上でのより良好な増殖の主な原因であったこと；および（２）キシロースイソメラーゼ活性の増加は、ＺＷ６５８に存在する染色体上に組み込まれたＰｇａｐ−ＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＰｇａｐプロモーターにおけるＧ→Ｔ置換から生じ得たこと。
【０１５４】
実施例８
ＺＷ６４１における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼのトランスポゾン仲介組み込み
ＺＷ６４１および２つのプラスミド構築物（ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ）を使用して、ＺＷ６５８に組み込まれたＸｙｌＡ／Ｂオペロンの発現を駆動するＧ→Ｔ置換を有するＰｇａｐプロモーター（以後、「８０１ＧＡＰプロモーター」と称する）が、ＺＷ６４１における対応するプロモーター（以後、「６４１ＧＡＰプロモーター」と称する）より強力であるという仮説を試験した。ＺＷ６４１は、キシロース上ではほとんど増殖することができず、そしてこの株でキシロースイソメラーゼが過剰発現すると、キシロース上での増殖がより速くなる（実施例７、図１１および１２）ため、ＺＷ６４１をこれらの実験に選択した。基本理念は、（６４１ＧＡＰプロモーターまたは８０１ＧＡＰプロモーターによって駆動される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ遺伝子の追加のコピーをＺＷ６４１の染色体へ導入すること、およびどちらの構築物がキシロース上で最も速く増殖するかを調べることであった。Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅのトランスポソーム技術を使用して、２つのキメラ遺伝子の染色体組み込みを達成した。
【０１５５】
既に示したように、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡは、後者の構築物のＰｇａｐプロモーターにＧ→Ｔ点変異が存在することを除いて、同一のプラスミドである。両方の場合においてＤＮＡへの無作為な挿入に使用された転移因子は、２つの１９ｂｐのモザイク末端（ＭＥ）およびそれらの間に挟まれる全ＤＮＡフラグメントからなる。図９に示すように、トランスポゾンと称されるこのエレメントは、スペクチノマイシン耐性カセット（Ｓｐｅｃr）および下流のＰｇａｐ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キシロースイソメラーゼ発現カセットを含有する。トランスポソームを形成するために使用したプロトコルは、本質的に、ＥＺ：：ＴＮTMｐＭＯＤTM−２＜ＭＣＳ＞Ｔｒａｎｓｐｏｓｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（カタログ番号ＭＯＤ０６０２）についてのＥｐｉｃｅｎｔｒｅの取扱説明書に記載のプロトコルと同じであった。８μＬ反応物は、Ｍｇ++イオンを含まない１．５μＬの５’−リン酸化、平滑末端化されたトランスポゾンＤＮＡ（約２５０ｎｇ／μＬ）、４μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＥＺ：：ＴＮトランスポザーゼおよび２．５μＬの８０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有した。コントロールトランスポソーム反応混合物も同一であったが、但し、トランスポザーゼの代わりに４μＬの滅菌水を使用した。反応物を室温で３０分間、インキュベートし、次いで、緩徐な異性化工程に必要な２〜７日間のインキュベーション期間、４℃に移した（これにより、活性なトランスポソームが形成する；この手順を使用すれば、トランスポソームは、−２０℃で少なくとも３箇月間、安定である）。
【０１５６】
本質的に、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載のプロトコルと同じ形質転換プロトコルを使用して、トランスポソームをＺＷ６４１にエレクトロポレートした。簡単に説明すると、４０μＬの形質転換反応物は、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール中約１０10個の細胞／ｍｌ、１μＬのＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＴｙｐｅＯｎｅTMＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎインヒビター（カタログ番号ＴＹＯ２６１Ｈ）および１μＬのコントロールまたはトランスポソーム反応混合物を含有した。エレクトロポレーターの設定は、１．６ｋｖ／ｃｍ、２００Ω、および２５μＦ、およびキュベットのギャップ幅は０．１ｃｍであった。エレクトロポレーション後、形質転換物を１．０ｍｌのＭＭＧ培地（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌのトリプトン、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ、および１ｍＭのＭｇＳ０4）で希釈し、そして細胞を約３時間、３０℃で回復させた。次いで、細胞を、室温で、滅菌１．５ｍｌ微量遠心管中、遠心分離（１３，０００×ｇ、５分間）によって回収し、そして上清を注意深く取り除いた。細胞ペレットを、２００μＬの液体ＭＭＧ培地に再懸濁し、そして１００μＬアリコートの各細胞懸濁液を、１．５％寒天および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＭＭＧ培地上でプレーティングした。３０℃、嫌気条件下での７２時間のインキュベーション期間後、３個のコロニーがコントロールプレート上で認められ、１３個のコロニーが６４１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソームプレート上で認められ、そして１８個のコロニーが８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソームプレート上で認められた。さらなる特徴付けのために、両方のトランスポソームプレート由来の６個のコロニーを無作為に選択し、そしてこれらを、ＭＭＸ培地および２００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する寒天プレート上にパッチした；増殖条件は上記のとおりであった。ＭＭＸ培地は、ＭＭＧ培地と同じであるが、但し、グルコースの代わりに５０ｇ／Ｌのキシロースを含有した。新鮮なＭＭＸ＋スペクチノマイシンプレート上での２回の増殖後、キシロース上で最も増殖した６つの株（各トランスポソームについて３つ）を、下記の実験に使用した。
【０１５７】
図１３Ａは、６４１Ｇａｐ−ＸｙｌＡトランスポソーム（＃６−１、＃６−３および＃６−５）によって得られた３つのＺＷ６４１株ならびにキシロース含有培地において８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポソーム（＃８−２、＃８−４および＃８−５）を受容した３つの株の線形増殖曲線を示す。同じデータを図１３Ｂに対数目盛でプロットする。この実験は、振盪フラスコ（１５０ｒｐｍで１５ｍｌ試験管中７ｍｌ培養液）中３０℃で実施し、そしてｍＲＭ３−Ｘ１０（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ4および１００ｇ／Ｌキシロース）が増殖培地であった。培養は、上記のパッチしたプレート由来の１植菌耳の細胞から開始し、そして初期ＯＤは極めて類似していた（約０．０２〜０．０３）。この実験のコントロールは、染色体に組み込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐにおけるＧ→Ｔ置換を有するキシロース適応株ＺＷ６５８であった。
【０１５８】
親株（ＺＷ６４１）と同様に、６４１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットの染色体外に組み込まれた追加のコピーを有する３つの株ではキシロース含有培地における増殖が極めて不良であったが、特に、株＃６−５の増殖速度およびバイオマス収量（ＯＤ600）の両方にいくつかの若干の改善が認められたようであった（図１２Ａと図１３Ａとを比較すること）。対照的に、８０１ＧａｐＸｙｌＡトランスポゾンによって得られた３つのすべての株は、キシロース上で親株よりかなり良好に増殖した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。事実、形質転換体のうちの２つ（＃８−４および＃８−５）は、この糖上において、６４１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットを含有するマルチコピープラスミドｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−ＧａｐＸｙｌＡを所有するＺＷ６５８およびＺＷ６４１形質転換体とほぼ同様に良好に増殖した（図１２と図１３とを比較すること）。転移は無作為な事象であり、そして６つのすべての株は、染色体の異なる場所に挿入された６４１ＧａｐＸｙｌＡまたは８０１ＧａｐＸｙｌＡ発現カセットを有するため、同じトランスポソームを使用してこの実験において観察された外来遺伝子発現の差異は、位置効果による可能性がある。例えば、位置効果は、＃６−１および＃６−３より良好な＃６−５の増殖、ならびに＃８−４および８−５より不良な＃８−２の増殖を説明し得る。それでも、分析した集団のサイズが小さいにもかかわらず、図１３に示す結果は、ＺＷ６５８およびＺＷ８０１−４において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸｙｌＡ／Ｂオペロンを駆動するＰｇａｐプロモーターに存在するＧ→Ｔ変異が、親株ＺＷ６４１と比較して、これらの株で観察されるより高いキシロースイソメラーゼ活性およびキシロース上でのより良好な増殖を担うという見解を強力に支持する。
【０１５９】
実施例９
キシロース資化Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の独立して適応させた株の導入遺伝子ＧＡＰプロモーター領域の酵素活性および配列比較
また、ＺＷ６５８に類似の遺伝子導入および株適応の経過を使用して、株８ｂ（実施例１および米国特許出願公開第２００３０１６２２７１号明細書）を得たため、ペントースリン酸経路の導入遺伝子活性およびＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの配列を、この独立した株の産生について部分的およびより完全に適応された株で比較した。部分的適応株８ＸＬ４および最終適応株８ｂにおけるＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンの産物の酵素活性を、一般的方法に記載の技術を使用して測定し、そしてμモルの産物／ｍｇタンパク質／分で表した結果を表５に示す。
【０１６０】
表５．異なるキシロース資化適応Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株における酵素活性
【０１６１】
ＺＷ６５８より以前の株がキシロース上での増殖の増強を可能にする変異を得た場合に生じた適応の場合と同様に、株８ｂではｘｙｌＡＢオペロンでの両方の遺伝子の産物の活性が、その先祖株８ＸＬ４より増加した。さらに述べると、測定した酵素活性の増加はそれほど適応されていない株より約５倍増加した。
【０１６２】
８ｂおよび８ＸＬ４株においてｘｙｌＡＢオペロンの発現を指令するＰｇａｐを配列決定した。ＰＣＲフラグメントを、プロモーターの５’末端由来の順方向ＰＣＲプライマー（ＧＡＰ−Ｆ８；配列番号３９）およびｘｙｌＡコード領域由来の逆方向プライマー（ＸｙｌＡＢ８５１Ｒ；配列番号５）を使用して調製した。得られたＰＣＲ産物を、プライマーＧＡＰ−Ｆ８、ＸｙｌＡＢ４４９Ｒ、およびＸｙｌＡＢ８５１Ｒ（配列番号３９、４１、および４０）を使用して配列決定した。ＺＷ８ＸＬ４由来のプロモーター配列を配列番号３に示し、８ｂ由来のプロモーター配列を配列番号５に示す。ＺＷ６４１およびＺＷ６５８におけるｘｙｌＡＢオペロンのＰｇａｐにおける場合と同様に、これらのプロモーター配列もまた、両方とも、株ＣＰ４のＰｇａｐの公開された配列との間で１つの差異を有した。これらの共通の変化に加えて、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８のＰｇａｐ配列の間にも１つの塩基対の違いが認められた。８ＸＬ４と８ｂとの比較では、開始ＡＴＧに対して−１８９位でのＧからＴへの変化が認められなかった一方、開始ＡＴＧに対して−８９位においてＣからＴへの変化が生じた。
【０１６３】
株ＺＷ６５８のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列の場合と同様に、新規の配列の制御下でのコード領域からのタンパク質の産生が部分的に適応された株由来の同じプロモーターの配列よりも多く産生されることを可能にする新規の配列への適応中に、株８ｂにおいてＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列が変化した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換によって導入されたキメラ遺伝子を含むザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株であって、前記キメラ遺伝子が：
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼ酵素をコードする作動可能に連結された単離された核酸分子、を含む、前記組換え細菌株。
【請求項２】
塩基置換が：
ａ）−１９０位におけるＧからＴへの置き換え；および
ｂ）−８９位におけるＣからＴへの置き換え
である、請求項１に記載の組換え株。
【請求項３】
改善されたＰｇａｐが、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組換え株。
【請求項４】
キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子でさらに形質転換された、請求項１に記載の組換え株。
【請求項５】
キメラ遺伝子がキシルロキナーゼをコードする作動可能に連結された単離された核酸分子をさらに含んでオペロンを形成している、請求項１に記載の組換え株。
【請求項６】
キシロースイソメラーゼ酵素が、４つの触媒部位残基：ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）キシロースイソメラーゼ配列（配列番号Ｘ）に対する位置番号でヒスチジン５４、アスパラギン酸５７、グルタミン酸１８１、およびリジン１８３を有し、表３に示されるｘｙｌＡファミリーのタンパク質に関するＰｆａｍ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭを使用して調査した場合、３×１０-10以下のＥ−値パラメータを有するタンパク質である、請求項１に記載の組換え株。
【請求項７】
キシロースイソメラーゼ酵素が、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、および１０４からなる群から選択される配列に９０％アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え株。
【請求項８】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される細菌株を操作するための方法であって：
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼ酵素をコードする作動可能に連結された単離された核酸分子、を含むキメラ遺伝子で前記細菌を形質転換する工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択されるキシロース資化細菌株を操作するための方法であって、任意の順序で、以下の工程：
ａ）トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子またはオペロンで前記細菌を形質転換する工程；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現のための遺伝子またはオペロンで形質転換する工程であって、前記キシロースイソメラーゼ酵素が−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（改善されたＰｇａｐ）から発現され、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、前記工程、を含む、前記方法。
【請求項１０】
キシロースを含む培地において、請求項１に記載の組換え細菌株を培養する工程；
任意のシステムにおいてエタノール産生に適切な発酵条件を維持する工程、
それによって、培養した請求項１に記載の組換え細菌株が、キシロースをエタノールに変換することを容易にする工程、
を含む、エタノールの産生のための方法。
【請求項１１】
０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌソルビトールデヒドロゲナーゼを含む反応混合物中２０μＬの無細胞抽出物を３０℃で反応させることによって測定した際に、少なくとも約０．１μモル産物／ｍｇタンパク質／分を産生させるレベルでキシロースイソメラーゼを発現するように操作されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株であって、Ｄ−キシルロースが産物である、前記組換え細菌株。
【請求項１】
形質転換によって導入されたキメラ遺伝子を含むザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株であって、前記キメラ遺伝子が：
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼ酵素をコードする作動可能に連結された単離された核酸分子、を含む、前記組換え細菌株。
【請求項２】
塩基置換が：
ａ）−１９０位におけるＧからＴへの置き換え；および
ｂ）−８９位におけるＣからＴへの置き換え
である、請求項１に記載の組換え株。
【請求項３】
改善されたＰｇａｐが、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組換え株。
【請求項４】
キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子でさらに形質転換された、請求項１に記載の組換え株。
【請求項５】
キメラ遺伝子がキシルロキナーゼをコードする作動可能に連結された単離された核酸分子をさらに含んでオペロンを形成している、請求項１に記載の組換え株。
【請求項６】
キシロースイソメラーゼ酵素が、４つの触媒部位残基：ストレプトマイセス・アルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）キシロースイソメラーゼ配列（配列番号Ｘ）に対する位置番号でヒスチジン５４、アスパラギン酸５７、グルタミン酸１８１、およびリジン１８３を有し、表３に示されるｘｙｌＡファミリーのタンパク質に関するＰｆａｍ Ｐｒｏｆｉｌｅ ＨＭＭを使用して調査した場合、３×１０-10以下のＥ−値パラメータを有するタンパク質である、請求項１に記載の組換え株。
【請求項７】
キシロースイソメラーゼ酵素が、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、および１０４からなる群から選択される配列に９０％アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換え株。
【請求項８】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される細菌株を操作するための方法であって：
ａ）改善されたＰｇａｐである、−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含み、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、単離された核酸分子；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼ酵素をコードする作動可能に連結された単離された核酸分子、を含むキメラ遺伝子で前記細菌を形質転換する工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択されるキシロース資化細菌株を操作するための方法であって、任意の順序で、以下の工程：
ａ）トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの発現のための遺伝子またはオペロンで前記細菌を形質転換する工程；ならびに
ｂ）キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの発現のための遺伝子またはオペロンで形質転換する工程であって、前記キシロースイソメラーゼ酵素が−１９０位、−８９位、または−１９０位および−８９位の両方からなる群から選択される位置に塩基置換を有するＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（改善されたＰｇａｐ）から発現され、前記位置番号がＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株およびＺＭ４株におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの天然のＡＴＧ翻訳開始コドンに対する番号である、前記工程、を含む、前記方法。
【請求項１０】
キシロースを含む培地において、請求項１に記載の組換え細菌株を培養する工程；
任意のシステムにおいてエタノール産生に適切な発酵条件を維持する工程、
それによって、培養した請求項１に記載の組換え細菌株が、キシロースをエタノールに変換することを容易にする工程、
を含む、エタノールの産生のための方法。
【請求項１１】
０．２５６ｍＭのＮＡＤＨ、５０ｍＭキシロース、１０ｍＭのＭｇＳＯ、１０ｍＭトリエタノールアミン、および１Ｕ／ｍｌソルビトールデヒドロゲナーゼを含む反応混合物中２０μＬの無細胞抽出物を３０℃で反応させることによって測定した際に、少なくとも約０．１μモル産物／ｍｇタンパク質／分を産生させるレベルでキシロースイソメラーゼを発現するように操作されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される組換え細菌株であって、Ｄ−キシルロースが産物である、前記組換え細菌株。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ−Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ−Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ−Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ−Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ−Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ−Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５１５１０７（Ｐ２０１１−５１５１０７Ａ）
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０１９９７（Ｐ２０１１−５０１９９７）
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８１６４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０７３１
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５１０１１９６８１）アライアンス フォア サステイナブル エナジー エルエルシー (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１９日（２０１１．５．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２５日（２００９．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３８１６４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２０７３１
【国際公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【出願人】（５１０１１９６８１）アライアンス フォア サステイナブル エナジー エルエルシー (5)
【Ｆターム（参考）】
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