改善された特性を有する再構成サーファクタント
本発明は、脂質担体、ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのポリペプチドアナログ、ならびに３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドを含む再構成サーファクタントに関する。本発明はまた、その医薬組成物、ならびにＲＤＳおよび他の呼吸障害の予防および／または処置のためのその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質担体、ならびにネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃの特定のポリペプチドアナログと３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドとの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【０００２】
本発明はまた、対応する医薬組成物、ならびにＲＤＳおよび他の呼吸障害の予防および／または処置のためのその使用に関する。
【０００３】
発明の背景
ヒトの肺は、多数の小さな気嚢（肺胞と呼ばれる）から構成されており、そこで気体は血液と肺の空気空間との間で交換される。健常な個体において、この交換は、肺が呼気の終末に虚脱することを防止するタンパク質含有サーファクタント複合体の存在によって媒介される。
【０００４】
肺サーファクタント複合体は、主として脂質から構成され、そして微量の種々のタンパク質を含む。適当なレベルのこの複合体の非存在の結果、肺の機能障害が生じる。この症候群は呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）と呼ばれ、そしてこれは一般に早産児を冒す。
【０００５】
前記症候群は、動物の肺から抽出された改変天然サーファクタント調製物を用いて有効に処置される。
【０００６】
市販の改変サーファクタント調製物は、例えば、ブタ肺由来のクロサーフ（Curosurf）、仔ウシ肺洗浄液から抽出されたインファサーフ（Infasurf）および化学改変天然ウシ肺抽出物であるサーバンタ（Survanta）である。
【０００７】
これらのサーファクタント調製物の主成分は、リン脂質、例えば１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（一般にジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）として知られる）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）ならびにサーファクタント疎水性タンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ）である。
【０００８】
動物組織由来のサーファクタント調製物の欠点（例えば、複雑な製造および滅菌プロセスならびに可能な免疫反応の誘発）に起因して、改変天然サーファクタントの組成を模倣する合成サーファクタントが開発されている。
【０００９】
前記合成サーファクタントは再構成サーファクタントとして知られている。
【００１０】
しかし、ネイティブな疎水性タンパク質は合成するには大きすぎ、構造的に複雑であり、そして純粋形態で不安定であるので、臨床的に活性な再構成サーファクタントの開発は厄介であることが判明した。
【００１１】
前記のネイティブな疎水性タンパク質と置き換えるために、その配列に部分的に対応するいくつかの合成ポリペプチドおよびそのアナログが先行技術において提案されており、そして例えばＷＯ８９／０６６５７、ＷＯ９２／２２３１５、ＷＯ９５／３２９９２、ＵＳ６，６６０，８３３、ＥＰ４１３，９５７、ＷＯ９１／１８０１５およびＷＯ００／４７６２３において開示されている。
【００１２】
しかし、利用可能な文献によれば、動物研究において、再構成サーファクタントを用いる処置は呼気の終末にわずかな肺気量（lung gas volume）およびわずかな程度の肺胞開存性（alveolar patency）を生じ、そして改変天然サーファクタントを用いて達成されるものに匹敵するインビボ活性を達成するためには呼気終末陽性換気（positive end expiratory pressure；ＰＥＥＰ）を用いた換気が必要とされる（Johansson J et al J Appl Physiol 2003, 95, 2055-2063; Davis AJ et al Am J Respir Crit Care Med 1998; 157, 553-559）。
【００１３】
利用可能な再構成サーファクタント調製物は、実際、呼気の終末に肺胞において安定なリン脂質膜を形成することができない。
【００１４】
それゆえ、肺コンプライアンス（lung compliance）に関して改善された特性を有する再構成サーファクタントに対する満たされていない必要性がなお存在する。
【００１５】
特に、肺胞の安定性を保証し、従ってＰＥＥＰを用いる換気を必要とすることなしに呼気の終末に肺胞の安定性を維持することができる再構成サーファクタント調製物に対する必要性が存在する。
【００１６】
肺コンプライアンスに関して、特にＰＥＥＰを用いる換気を必要とすることなしに呼気の終末に肺胞開存性を有効に維持する能力に関して、改善された特性を有する再構成サーファクタント調製物を提供するために、ネイティブなＳＰ−Ｃタンパク質の特定のポリペプチドアナログが、３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基が交互に生じる配列を含む特定のポリペプチドと有利に組み合わされ得ることがここに見出され、そしてこれが本発明の目的である。
【００１７】
ＰＥＥＰを適用することなしに外因性サーファクタント調製物を用いて未熟新生児を処置したＲＤＳのモデルにおいて、前記ポリペプチドの組み合わせは、呼気の終末での肺胞開存性の指標である肺気量に対して作用する。
【００１８】
発明の概要
本発明は、脂質担体、ならびにネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃの特定のポリペプチドアナログと３〜８個、好ましくは４〜５個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドとの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【００１９】
特に、本発明は、以下を含む再構成サーファクタントに関する：
ａ）脂質担体；
ｂ）一般式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
Ｘは、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｓは、エステル結合を介して側鎖に連結された１２〜２２個の炭素原子、好ましくは１６個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されており；
Ωは、Ｍまたは硫黄原子上で酸化されたＭ、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、１〜８の値を有する整数であり；
ｂは、１〜１９の値を有する整数であり；
ｅ、ｆ、ｇおよびｐは、０または１の値を有する整数であり；
ただし、ＸａＢＸｂは、最大２２アミノ酸を有する配列である］
で表される配列を有する少なくとも２０アミノ酸残基かつ４０アミノ酸残基以下のポリペプチド；
ｃ）一般式（ＩＩ）：
【化２】
［式中、
Ｕは、Ｌ、Ｉ、ｎＬ、Ｖ、Ａ、ＭおよびＦからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、ＨおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、３〜８、好ましくは４〜５の値を有する整数であり；そして
ｘは、２〜６、好ましくは３〜４の値を有する整数である］
で表される配列を含む少なくとも１２アミノ酸残基かつ６０アミノ酸残基以下のポリペプチド。
【００２０】
本発明はまた、前記ポリペプチドの薬学的に許容され得る塩ならびにそのブロックされたＮおよび／またはＣ末端誘導体（例えばアセチル化およびアミド化を介する）を含む。
【００２１】
本発明はまた、本発明の再構成サーファクタントを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、医薬としての上記の再構成サーファクタントの使用に関する。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、サーファクタント欠乏または機能不全に関連する疾患、および他の呼吸障害の予防および／または処置のための上記の再構成サーファクタントの使用に言及される。
【００２４】
本発明のなおさらなる局面によれば、未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、サーファクタント欠乏または機能不全に関連する他の疾患、および他の呼吸障害を予防および／または処置する方法であって、有効量の上記の再構成サーファクタントの投与を含む方法に言及される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒトタンパク質ＳＰ−Ｃのアミノ酸配列を示す。Ｃｙｓ残基はネイティブなＳＰ−Ｃにおいてパルミトイル化されている。
【図２】図２は、ポリペプチドＫＬ４のらせん車輪（helical wheel）表示を示す。塩基性アミノ酸残基を丸で囲む。
【図３】図３は、肺気量（ｍｌ／ｋｇ）に関する結果を示す。
【図４】図４は、時間／圧に応じての一回換気量（tidal volume）（ｍｌ／ｋｇ）に関する結果を示す。
【００２６】
定義
外因性サーファクタント調製物を用いるインビボ処置後の呼吸機能を以下の２つのパラメーターを測定することによって行う：
ｉ）肺コンプライアンスの指標である一回換気量、および
ｉｉ）呼気の終末での肺胞空気膨張または開存性の、従って呼気の終末での肺胞における安定なリン脂質膜を形成する能力の指標である肺気量。
【００２７】
本明細書において使用する、特定の疾患を処置するための化合物の有効量は、疾患に関連する症状を寛解させるか、または何らか様式で低下させるために十分な量である。前記の量は疾患の種類および重篤度ならびに患者の状態（体重、性別、年齢）に依存する。
【００２８】
本明細書において使用する「再構成サーファクタント」という用語は、組換え技術または合成方法を通じて作製されたサーファクタントタンパク質のポリペプチドアナログが加えられた脂質担体を意味する。
【００２９】
本明細書において使用する「脂質担体」という用語は、リン脂質および場合によりさらなる脂質成分、例えば中性脂質（例えばトリアシルグリセロール）、遊離脂肪酸および／またはコレステロールの混合物を意味する。
【００３０】
本明細書において使用する「ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのポリペプチドアナログ」という用語は、ポリペプチドが脂質担体との混合物中で肺サーファクタント活性を示す限り、ネイティブなタンパク質と比較して１個以上のアミノ酸が欠失しているかまたは他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００３１】
アミノ酸配列を、遊離アミノ基を有するアミノ酸を左端にし（アミノ末端）、そして遊離カルボキシル基を有するアミノ酸を右端にして（カルボキシ末端）、３文字コードに従って示す。
【００３２】
本明細書において同定される全てのアミノ酸残基は天然のＬ立体配置にあり、そして本明細書において同定される配列は下記の対応表に示すようなアミノ酸残基のための標準的な略語に従って報告される。
【００３３】
対応表
アミノ酸 シンボル
１文字 ３文字
グリシン Ｇ Ｇｌｙ
Ｌ−プロリン Ｐ Ｐｒｏ
Ｌ−イソロイシン Ｉ Ｉｌｅ
Ｌ−ロイシン Ｌ Ｌｅｕ
Ｌ−チロシン Ｙ Ｔｙｒ
Ｌ−システイン Ｃ Ｃｙｓ
Ｌ−トリプトファン Ｗ Ｔｒｐ
Ｌ−アラニン Ａ Ａｌａ
Ｌ−リジン Ｋ Ｌｙｓ
Ｌ−アルギニン Ｒ Ａｒｇ
Ｌ−グルタミン Ｑ Ｇｌｕ
Ｌ−メチオニン Ｍ Ｍｅｔ
Ｌ−セリン Ｓ Ｓｅｒ
Ｌ−バリン Ｖ Ｖａｌ
Ｌ−アスパラギン Ｎ Ａｓｎ
Ｌ−アスパラギン酸 Ｄ Ａｓｐ
Ｌ−グルタミン酸 Ｅ Ｇｌｕ
Ｌ−ヒスチジン Ｈ Ｈｉｓ
Ｌ−トレオニン Ｔ Ｔｈｒ
Ｌ−フェニルアラニン Ｆ Ｐｈｅ
Ｌ−ノルロイシン − ｎＬｅｕ
Ｌ−オルニチン − Ｏｒｎ
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、脂質担体、ならびに一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドと３〜８個、好ましくは４〜５個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドとの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【００３５】
本発明者らは、実際、ＰＥＥＰを適用することなしに外因性サーファクタント調製物を用いて未熟新生児を処置したＲＤＳのモデルにおいて、一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドとの組み合わせで、一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドが、呼気の終末での肺胞開存性の指標である肺気量に対して好都合に作用することを見出した。
【００３６】
本発明の再構成サーファクタント調製物は、一回換気量によって表現される呼吸機能を改変天然サーファクタントの投与後に達成されるものに匹敵する程度まで改善させることが判明した。
【００３７】
有利には、ネイティブなタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログは、少なくとも２０アミノ酸残基かつ４０アミノ酸残基以下のポリペプチドであり、そして一般式（Ｉ）：
【化３】
［式中、
Ｘは、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｓは、エステル結合を介して側鎖に連結された１２〜２２個の炭素原子、好ましくは１６個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されており；
Ωは、Ｍまたは硫黄原子上で酸化されたＭ、Ｉ、Ｌ、ＱおよびｎＬからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、１〜８の値を有する整数であり；
ｂは、１〜１９の値を有する整数であり；
ｅ、ｆ、ｇおよびｐは、０または１の値を有する整数であり；
ただし、ＸａＢＸｂは、最大２２アミノ酸、好ましくは１０〜２２アミノ酸を有する配列である］
で表される配列を有する。
【００３８】
好ましくは、一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドは、少なくとも３０アミノ酸かつ３５アミノ酸以下、より好ましくは３３アミノ酸以下からなる。
【００３９】
特定の実施態様において、一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドは、３０または３３または３５アミノ酸からなる。
【００４０】
好ましくは、ＳＰ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、ｅおよびｎが０であり、そしてｇが１である一般式（Ｉａ）：
【化４】
［式中、
Ｘ、ＢおよびΩは上記で定義するとおりであり；
ａは、１であり；
ｂは、１４であり；
ｆおよびｐは０または１である］
で表される。
【００４１】
より好ましくは、ＳＰ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、ｆが１である一般式（Ｉｂ）：
【化５】
［式中、
Ｘ、Ｂ、Ω、ａおよびｂは上記で定義するとおりであり；
ｐは、０または１である］
で表される。
【００４２】
さらにより好ましくは、ＳＰ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、一般式（Ｉｃ）：
【化６】
［式中、
Ωは上記で定義するとおりであり；
ｐは、０または１である］
で表される。
【００４３】
式（Ｉｃ）で表されるポリペプチドの例を以下に報告する：
【化７】
【００４４】
ポリペプチド（Ｉｄ）は先行技術においてＳＰ−Ｃ３３ともいわれている。
【００４５】
最も好ましくは、ＳＰ−Ｃアナログは、式（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）および（Ｉｈ）を有するポリペプチドの群より選択されるポリペプチドである。
【００４６】
最も好ましいポリペプチドは式（Ｉｆ）を有する。
【００４７】
有利には、３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基が交互に生じる配列を含むポリペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基かつ６０アミノ酸残基以下、好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基かつ３５アミノ酸残基以下からなり、そして一般式（ＩＩ）：
【化８】
［式中、
Ｕは、Ｌ、Ｉ、ｎＬ、Ｖ、Ａ、ＭおよびＦからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、ＨおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、４〜５、好ましくは４の値の整数であり；そして
ｘは、３〜４、好ましくは４の値を有する整数である］
で表される。
【００４８】
好ましいポリペプチドの群は、ＵがＬまたはＩであり、ＢがＫまたはＲであり、ａが４または５、好ましくは４であり、そしてｘが３または４、好ましくは４である配列を含むかまたは該配列からなる。
【００４９】
特に好ましいポリペプチドは、当技術分野においてＫＬ４といわれており、そして以下に報告する配列を有するものである：
【化９】
【００５０】
特に好ましいポリペプチドの別の例は、本明細書においてＫＬ５という以下に報告する配列を有するものである：
【化１０】
【００５１】
実際、ＫＬ５は、ＫＬ４のものと類似のペプチドの全体的らせん外周の周囲の荷電残基の分布を示すことが見出された。
【００５２】
好ましいポリペプチドのさらなる例は、式（ＩＩＩ）：
【化１１】
を有するものである。
【００５３】
一般式（ＩＩＩａ）で表されるポリペプチドの例は、当技術分野においてＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）といわれているものである：
【化１２】
【００５４】
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるポリペプチドを、固相ペプチド合成についてのJ.M. Steward and J.D. Young, “Solid Phase Peptide Synthesis”, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969、およびJ. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides”, Vol.2, p. 46, Academic Press (New York), 1983、ならびに古典的溶液合成についてのE. Schroder and K. Kubke, “The Peptides”, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965に記載されるもののような任意の公知の技術によって調製し得る。ポリペプチド合成技術の概要を、J. Stuart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 3d Ed., Neurath, H. et al., Eds., p. 104-237, Academic Press, New York, NY (1976)中に見出し得る。
【００５５】
そのような合成における使用のために適切な保護基は、上記のテキストおよびJ.F.W. McOmie, Protective Grouts in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973)中に見出される。
【００５６】
一般に、これらの方法は、１つ以上のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基の成長中のペプチド鎖への逐次的な付加を含む。通常、第１のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを適切な選択的に除去可能な保護基によって保護する。
【００５７】
例としての固相合成を使用して、保護または誘導体化されたアミノ酸を、その非保護カルボキシル基またはアミノ基を通して不活性固体支持体に結合させる。次いで、アミノまたはカルボキシル保護基を選択的に除去し、そして適切に保護された相補（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を混合し、そして固体支持体に既に結合されている残基とアミド結合を形成させるために適切な条件下で反応させる。次いで、アミノまたはカルボキシル保護基をこの新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、次いで次のアミノ酸（適切に保護されている）を付加する、等。
【００５８】
全ての所望のアミノ酸を適正な配列で連結させた後、いずれもの残存する末端および側鎖保護基（および固体支持体）を逐次的にかまたは同時に除去して、最終ポリペプチドを得る。
【００５９】
特に、一般式（Ｉ）および（ＩＩＩ）で表されるポリペプチドをＷＯ００／４７６２３に開示される方法に従って調製し得、一方、一般式（ＩＩ）で表される配列からなるポリペプチドをＷＯ９２／２２３１５に記載の方法に従って調製し得る。
【００６０】
本発明の再構成サーファクタントを一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるポリペプチドおよび脂質の溶液または懸濁液を混合し、次に混合物を乾燥させることによって調製し得るか、そうでなければそれを凍結乾燥または噴霧乾燥によって調製し得る。
【００６１】
好ましくは、一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドおよび一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドは、本発明の再構成サーファクタント中に、固定された量および量比で、固定された組み合わせとして存在する。
【００６２】
再構成サーファクタントに対する一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるポリペプチドの割合は変動し得る。有利には、各々のポリペプチドは、サーファクタントの重量に基づいて０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１〜５％、最も好ましくは１〜３％の量で存在し得る。
【００６３】
有利には、脂質担体は、天然肺サーファクタント調製物中に含まれるリン脂質、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）のようなホスファチジルコリン（ＰＣ）、ならびにパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）のようなホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含む。
【００６４】
有利に使用することができる他のリン脂質は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。
【００６５】
特定の実施態様において、脂質担体は、さらなる成分、例えば中性脂質（例えばトリアシルグリセロール）、遊離脂肪酸および／またはコレステロールを含み得る。
【００６６】
有利には、本発明による再構成サーファクタントは、９０〜９９％（重量）、好ましくは９２〜９８％、より好ましくは９４〜９６％の脂質担体、および１〜１０％（重量）、好ましくは２〜８％、より好ましくは４〜６％の両方のペプチドの合計を含む。
【００６７】
本発明の特定の実施態様において、再構成サーファクタントは、９６％（重量）の脂質担体、２％（重量）の一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドおよび２％（重量）の一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドを含む。
【００６８】
脂質担体中に含まれるリン脂質は、好ましくは、９５：５〜５０：５０、好ましくは８０：２０〜６０：４０の範囲の重量比の、ＤＰＰＣ、およびＰＯＰＧまたはそのＰＯＰＣとの混合物より選択されるパルミトイルオレオイルリン脂質からなる混合物である。ＰＯＰＧに対するＤＰＰＣの重量比は、好ましくは７５：２５〜６５：３５の範囲であり、より好ましくは６８：３１である。ＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ：ＰＯＰＣ混合物の場合、リン脂質は、好ましくは、６０：２０：２０または６８：１５：１６の重量比で使用される。
【００６９】
好ましい実施態様において、再構成サーファクタントは、１〜５％（重量）の一般式（Ｉａ）で表されるポリペプチド、１〜５％（重量）の式（ＩＩ）で表されるポリペプチド、ならびに６８：３１の重量比のＤＰＰＣおよびＰＯＰＧの混合物を含む。
【００７０】
さらにより好ましい実施態様において、再構成サーファクタントは、１．５〜３％（重量）の（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）および（Ｉｈ）からなる群より選択されるポリペプチド、より好ましくはポリペプチド（Ｉｆ）、１．５〜３％（重量）の一般式（ＩＩ）で表されるペプチド、ならびに６８：３１の重量比のＤＰＰＣおよびＰＯＰＧの混合物を含む。
【００７１】
本発明の再構成サーファクタントの投与は、従来どおり、好ましくは気管内投与（注入もしくはボーラス）によってかまたは噴霧によって行われる。
【００７２】
再構成サーファクタントの有効用量は、投与の手段、疾患の型および重篤度、ならびに処置が予防的であるかまたは治療的であるかどうかを含む多くの様々な要因に応じて変動する。一般に、用量は、０．０１ｍｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは４０〜２００ｍｇ／ｋｇである。当業者は、至適用量およびその投与の頻度を容易に決定することができる。
【００７３】
本発明はまた、本発明の再構成サーファクタントを含む医薬組成物に関する。前記組成物は、有利には、液剤、分散剤、懸濁剤または乾燥散剤の形態で投与される。好ましくは、前記組成物は、適切な溶媒または再懸濁媒体中に溶解または懸濁された再構成サーファクタントを含む。
【００７４】
好ましくは、前記医薬組成物は、使い捨てガラスバイアル中の緩衝生理食塩水溶液中の懸濁剤として供給される。有利には、再構成サーファクタントの濃度（リン脂質含量として表現される）は、約２〜約１６０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜８０ｍｇ／ｍｌのサーファクタントの範囲である。
【００７５】
より低い粘度を達成するために、前記組成物は、電解質、例えばカルシウム、マグネシウムおよび／またはナトリウム塩（例えば塩化カルシウムまたは塩化ナトリウム）をさらに含み得る。
【００７６】
本発明による医薬組成物は、未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）またはサーファクタント欠乏もしくは機能不全に関連する他の疾患（急性肺傷害（ＡＬＩ）、成人におけるＲＤＳ（ＡＲＤＳ）、胎便吸引症候群（ＭＡＳ）および気管支肺形成不全（ＢＰＤ）を含む）の予防および／または処置に適切である。
【００７７】
それはまた、肺炎、気管支炎、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、喘息および嚢胞性線維症のような他の呼吸障害の予防および／または処置のために、そして滲出性中耳炎（膠耳（glue ear））の処置のために有用であり得る。
【００７８】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例証する。
【００７９】
実施例
ポリペプチドＳＰ−Ｃ３３およびＫＬ４に基づく再構成サーファクタントを用いるインビボ実験
サーファクタント調製物を、妊娠期間２７日での子宮摘出によって得た未熟新生ウサギにおいてアッセイする。実験を呼気終末陽性換気（ＰＥＥＰ）を適用することなしに行う。
【００８０】
ＳＰ−Ｃアナログとして、ＷＯ００／４７６２３に記載されるように調製されるＳＰ−Ｃ３３といわれるポリペプチドを使用する。
【００８１】
タンパク質ＳＰ−Ｂのアナログとして、ＷＯ９２／２２３１５の教示に従って調製されるＫＬ４といわれるポリペプチドを使用した。
【００８２】
動物を、６８：３１（ｗ／ｗ）の比率のＤＰＰＣ：ＰＯＰＧからなるリン脂質混合物との組み合わせで２％ＳＰ−Ｃ３３または２％ＳＰ−Ｃ３３＋２％ＫＬ４を含む再構成サーファクタント調製物２００ｍｇ／ｋｇ（８０ｍｇ／ｍｌ）を用いて出生時に処置する。
【００８３】
クロサーフ（登録商標）（８０ｍｇ／ｍｌ）で処置した動物を陽性対照とし、そして非処置同腹仔を陰性対照とする。
【００８４】
未熟新生ウサギを、標準化された一連のピークガス注入圧を用いて平行して換気する。肺を開けるために、圧を最初に３５ｃｍＨ２Ｏに１分間設定する。この補充手技の後、圧を２５ｃｍＨ２Ｏに１５分間低下させ、さらに２０および１５ｃｍＨ２Ｏに低下させる。最後に、圧を再度２５ｃｍＨ２Ｏに５分間上昇させ、その後肺を窒素を用いてさらに５分間換気し、次いで気量測定のために切除する。
【００８５】
ｍｌ／ｋｇとして表現される肺気量および一回換気量の両方を測定し、そして結果（中央値として与える）をそれぞれ図４および５に報告する。
【００８６】
図３は、２％ＫＬ４との組み合わせで２％（ｗ／ｗ）ＳＰ−Ｃ３３を含む再構成サーファクタント調製物で処置した動物が、２％（ｗ／ｗ）ＳＰ−Ｃ３３を与えた動物よりも高い肺気量を有していたことを示し、このことはＳＰ−Ｃ３３サーファクタントへ２％（ｗ／ｗ）ＫＬ４を加えることにより肺気量の増大が生じたことを示す。
【００８７】
前記結果は、本発明の再構成サーファクタントが、タンパク質ＳＰ−Ｃのアナログのみを含む再構成サーファクタント調製物よりも良好な呼気の終末での肺胞におけるリン脂質膜の安定化を提供することを実証する。
【００８８】
さらに、図４は、本発明の再構成サーファクタント調製物が、一回換気量として表現される呼吸機能を有意に改善することが判明したことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質担体、ならびにネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃの特定のポリペプチドアナログと３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドとの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【０００２】
本発明はまた、対応する医薬組成物、ならびにＲＤＳおよび他の呼吸障害の予防および／または処置のためのその使用に関する。
【０００３】
発明の背景
ヒトの肺は、多数の小さな気嚢（肺胞と呼ばれる）から構成されており、そこで気体は血液と肺の空気空間との間で交換される。健常な個体において、この交換は、肺が呼気の終末に虚脱することを防止するタンパク質含有サーファクタント複合体の存在によって媒介される。
【０００４】
肺サーファクタント複合体は、主として脂質から構成され、そして微量の種々のタンパク質を含む。適当なレベルのこの複合体の非存在の結果、肺の機能障害が生じる。この症候群は呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）と呼ばれ、そしてこれは一般に早産児を冒す。
【０００５】
前記症候群は、動物の肺から抽出された改変天然サーファクタント調製物を用いて有効に処置される。
【０００６】
市販の改変サーファクタント調製物は、例えば、ブタ肺由来のクロサーフ（Curosurf）、仔ウシ肺洗浄液から抽出されたインファサーフ（Infasurf）および化学改変天然ウシ肺抽出物であるサーバンタ（Survanta）である。
【０００７】
これらのサーファクタント調製物の主成分は、リン脂質、例えば１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（一般にジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）として知られる）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）ならびにサーファクタント疎水性タンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ）である。
【０００８】
動物組織由来のサーファクタント調製物の欠点（例えば、複雑な製造および滅菌プロセスならびに可能な免疫反応の誘発）に起因して、改変天然サーファクタントの組成を模倣する合成サーファクタントが開発されている。
【０００９】
前記合成サーファクタントは再構成サーファクタントとして知られている。
【００１０】
しかし、ネイティブな疎水性タンパク質は合成するには大きすぎ、構造的に複雑であり、そして純粋形態で不安定であるので、臨床的に活性な再構成サーファクタントの開発は厄介であることが判明した。
【００１１】
前記のネイティブな疎水性タンパク質と置き換えるために、その配列に部分的に対応するいくつかの合成ポリペプチドおよびそのアナログが先行技術において提案されており、そして例えばＷＯ８９／０６６５７、ＷＯ９２／２２３１５、ＷＯ９５／３２９９２、ＵＳ６，６６０，８３３、ＥＰ４１３，９５７、ＷＯ９１／１８０１５およびＷＯ００／４７６２３において開示されている。
【００１２】
しかし、利用可能な文献によれば、動物研究において、再構成サーファクタントを用いる処置は呼気の終末にわずかな肺気量（lung gas volume）およびわずかな程度の肺胞開存性（alveolar patency）を生じ、そして改変天然サーファクタントを用いて達成されるものに匹敵するインビボ活性を達成するためには呼気終末陽性換気（positive end expiratory pressure；ＰＥＥＰ）を用いた換気が必要とされる（Johansson J et al J Appl Physiol 2003, 95, 2055-2063; Davis AJ et al Am J Respir Crit Care Med 1998; 157, 553-559）。
【００１３】
利用可能な再構成サーファクタント調製物は、実際、呼気の終末に肺胞において安定なリン脂質膜を形成することができない。
【００１４】
それゆえ、肺コンプライアンス（lung compliance）に関して改善された特性を有する再構成サーファクタントに対する満たされていない必要性がなお存在する。
【００１５】
特に、肺胞の安定性を保証し、従ってＰＥＥＰを用いる換気を必要とすることなしに呼気の終末に肺胞の安定性を維持することができる再構成サーファクタント調製物に対する必要性が存在する。
【００１６】
肺コンプライアンスに関して、特にＰＥＥＰを用いる換気を必要とすることなしに呼気の終末に肺胞開存性を有効に維持する能力に関して、改善された特性を有する再構成サーファクタント調製物を提供するために、ネイティブなＳＰ−Ｃタンパク質の特定のポリペプチドアナログが、３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基が交互に生じる配列を含む特定のポリペプチドと有利に組み合わされ得ることがここに見出され、そしてこれが本発明の目的である。
【００１７】
ＰＥＥＰを適用することなしに外因性サーファクタント調製物を用いて未熟新生児を処置したＲＤＳのモデルにおいて、前記ポリペプチドの組み合わせは、呼気の終末での肺胞開存性の指標である肺気量に対して作用する。
【００１８】
発明の概要
本発明は、脂質担体、ならびにネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃの特定のポリペプチドアナログと３〜８個、好ましくは４〜５個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドとの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【００１９】
特に、本発明は、以下を含む再構成サーファクタントに関する：
ａ）脂質担体；
ｂ）一般式（Ｉ）：
【化１】
［式中、
Ｘは、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｓは、エステル結合を介して側鎖に連結された１２〜２２個の炭素原子、好ましくは１６個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されており；
Ωは、Ｍまたは硫黄原子上で酸化されたＭ、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、１〜８の値を有する整数であり；
ｂは、１〜１９の値を有する整数であり；
ｅ、ｆ、ｇおよびｐは、０または１の値を有する整数であり；
ただし、ＸａＢＸｂは、最大２２アミノ酸を有する配列である］
で表される配列を有する少なくとも２０アミノ酸残基かつ４０アミノ酸残基以下のポリペプチド；
ｃ）一般式（ＩＩ）：
【化２】
［式中、
Ｕは、Ｌ、Ｉ、ｎＬ、Ｖ、Ａ、ＭおよびＦからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、ＨおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、３〜８、好ましくは４〜５の値を有する整数であり；そして
ｘは、２〜６、好ましくは３〜４の値を有する整数である］
で表される配列を含む少なくとも１２アミノ酸残基かつ６０アミノ酸残基以下のポリペプチド。
【００２０】
本発明はまた、前記ポリペプチドの薬学的に許容され得る塩ならびにそのブロックされたＮおよび／またはＣ末端誘導体（例えばアセチル化およびアミド化を介する）を含む。
【００２１】
本発明はまた、本発明の再構成サーファクタントを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、医薬としての上記の再構成サーファクタントの使用に関する。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、サーファクタント欠乏または機能不全に関連する疾患、および他の呼吸障害の予防および／または処置のための上記の再構成サーファクタントの使用に言及される。
【００２４】
本発明のなおさらなる局面によれば、未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、サーファクタント欠乏または機能不全に関連する他の疾患、および他の呼吸障害を予防および／または処置する方法であって、有効量の上記の再構成サーファクタントの投与を含む方法に言及される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒトタンパク質ＳＰ−Ｃのアミノ酸配列を示す。Ｃｙｓ残基はネイティブなＳＰ−Ｃにおいてパルミトイル化されている。
【図２】図２は、ポリペプチドＫＬ４のらせん車輪（helical wheel）表示を示す。塩基性アミノ酸残基を丸で囲む。
【図３】図３は、肺気量（ｍｌ／ｋｇ）に関する結果を示す。
【図４】図４は、時間／圧に応じての一回換気量（tidal volume）（ｍｌ／ｋｇ）に関する結果を示す。
【００２６】
定義
外因性サーファクタント調製物を用いるインビボ処置後の呼吸機能を以下の２つのパラメーターを測定することによって行う：
ｉ）肺コンプライアンスの指標である一回換気量、および
ｉｉ）呼気の終末での肺胞空気膨張または開存性の、従って呼気の終末での肺胞における安定なリン脂質膜を形成する能力の指標である肺気量。
【００２７】
本明細書において使用する、特定の疾患を処置するための化合物の有効量は、疾患に関連する症状を寛解させるか、または何らか様式で低下させるために十分な量である。前記の量は疾患の種類および重篤度ならびに患者の状態（体重、性別、年齢）に依存する。
【００２８】
本明細書において使用する「再構成サーファクタント」という用語は、組換え技術または合成方法を通じて作製されたサーファクタントタンパク質のポリペプチドアナログが加えられた脂質担体を意味する。
【００２９】
本明細書において使用する「脂質担体」という用語は、リン脂質および場合によりさらなる脂質成分、例えば中性脂質（例えばトリアシルグリセロール）、遊離脂肪酸および／またはコレステロールの混合物を意味する。
【００３０】
本明細書において使用する「ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのポリペプチドアナログ」という用語は、ポリペプチドが脂質担体との混合物中で肺サーファクタント活性を示す限り、ネイティブなタンパク質と比較して１個以上のアミノ酸が欠失しているかまたは他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００３１】
アミノ酸配列を、遊離アミノ基を有するアミノ酸を左端にし（アミノ末端）、そして遊離カルボキシル基を有するアミノ酸を右端にして（カルボキシ末端）、３文字コードに従って示す。
【００３２】
本明細書において同定される全てのアミノ酸残基は天然のＬ立体配置にあり、そして本明細書において同定される配列は下記の対応表に示すようなアミノ酸残基のための標準的な略語に従って報告される。
【００３３】
対応表
アミノ酸 シンボル
１文字 ３文字
グリシン Ｇ Ｇｌｙ
Ｌ−プロリン Ｐ Ｐｒｏ
Ｌ−イソロイシン Ｉ Ｉｌｅ
Ｌ−ロイシン Ｌ Ｌｅｕ
Ｌ−チロシン Ｙ Ｔｙｒ
Ｌ−システイン Ｃ Ｃｙｓ
Ｌ−トリプトファン Ｗ Ｔｒｐ
Ｌ−アラニン Ａ Ａｌａ
Ｌ−リジン Ｋ Ｌｙｓ
Ｌ−アルギニン Ｒ Ａｒｇ
Ｌ−グルタミン Ｑ Ｇｌｕ
Ｌ−メチオニン Ｍ Ｍｅｔ
Ｌ−セリン Ｓ Ｓｅｒ
Ｌ−バリン Ｖ Ｖａｌ
Ｌ−アスパラギン Ｎ Ａｓｎ
Ｌ−アスパラギン酸 Ｄ Ａｓｐ
Ｌ−グルタミン酸 Ｅ Ｇｌｕ
Ｌ−ヒスチジン Ｈ Ｈｉｓ
Ｌ−トレオニン Ｔ Ｔｈｒ
Ｌ−フェニルアラニン Ｆ Ｐｈｅ
Ｌ−ノルロイシン − ｎＬｅｕ
Ｌ−オルニチン − Ｏｒｎ
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、脂質担体、ならびに一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドと３〜８個、好ましくは４〜５個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドとの組み合わせを含む再構成サーファクタントに関する。
【００３５】
本発明者らは、実際、ＰＥＥＰを適用することなしに外因性サーファクタント調製物を用いて未熟新生児を処置したＲＤＳのモデルにおいて、一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドとの組み合わせで、一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドが、呼気の終末での肺胞開存性の指標である肺気量に対して好都合に作用することを見出した。
【００３６】
本発明の再構成サーファクタント調製物は、一回換気量によって表現される呼吸機能を改変天然サーファクタントの投与後に達成されるものに匹敵する程度まで改善させることが判明した。
【００３７】
有利には、ネイティブなタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログは、少なくとも２０アミノ酸残基かつ４０アミノ酸残基以下のポリペプチドであり、そして一般式（Ｉ）：
【化３】
［式中、
Ｘは、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｓは、エステル結合を介して側鎖に連結された１２〜２２個の炭素原子、好ましくは１６個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されており；
Ωは、Ｍまたは硫黄原子上で酸化されたＭ、Ｉ、Ｌ、ＱおよびｎＬからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、１〜８の値を有する整数であり；
ｂは、１〜１９の値を有する整数であり；
ｅ、ｆ、ｇおよびｐは、０または１の値を有する整数であり；
ただし、ＸａＢＸｂは、最大２２アミノ酸、好ましくは１０〜２２アミノ酸を有する配列である］
で表される配列を有する。
【００３８】
好ましくは、一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドは、少なくとも３０アミノ酸かつ３５アミノ酸以下、より好ましくは３３アミノ酸以下からなる。
【００３９】
特定の実施態様において、一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドは、３０または３３または３５アミノ酸からなる。
【００４０】
好ましくは、ＳＰ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、ｅおよびｎが０であり、そしてｇが１である一般式（Ｉａ）：
【化４】
［式中、
Ｘ、ＢおよびΩは上記で定義するとおりであり；
ａは、１であり；
ｂは、１４であり；
ｆおよびｐは０または１である］
で表される。
【００４１】
より好ましくは、ＳＰ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、ｆが１である一般式（Ｉｂ）：
【化５】
［式中、
Ｘ、Ｂ、Ω、ａおよびｂは上記で定義するとおりであり；
ｐは、０または１である］
で表される。
【００４２】
さらにより好ましくは、ＳＰ−Ｃタンパク質のポリペプチドアナログは、一般式（Ｉｃ）：
【化６】
［式中、
Ωは上記で定義するとおりであり；
ｐは、０または１である］
で表される。
【００４３】
式（Ｉｃ）で表されるポリペプチドの例を以下に報告する：
【化７】
【００４４】
ポリペプチド（Ｉｄ）は先行技術においてＳＰ−Ｃ３３ともいわれている。
【００４５】
最も好ましくは、ＳＰ−Ｃアナログは、式（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）および（Ｉｈ）を有するポリペプチドの群より選択されるポリペプチドである。
【００４６】
最も好ましいポリペプチドは式（Ｉｆ）を有する。
【００４７】
有利には、３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基が交互に生じる配列を含むポリペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基かつ６０アミノ酸残基以下、好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基かつ３５アミノ酸残基以下からなり、そして一般式（ＩＩ）：
【化８】
［式中、
Ｕは、Ｌ、Ｉ、ｎＬ、Ｖ、Ａ、ＭおよびＦからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、ＨおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、４〜５、好ましくは４の値の整数であり；そして
ｘは、３〜４、好ましくは４の値を有する整数である］
で表される。
【００４８】
好ましいポリペプチドの群は、ＵがＬまたはＩであり、ＢがＫまたはＲであり、ａが４または５、好ましくは４であり、そしてｘが３または４、好ましくは４である配列を含むかまたは該配列からなる。
【００４９】
特に好ましいポリペプチドは、当技術分野においてＫＬ４といわれており、そして以下に報告する配列を有するものである：
【化９】
【００５０】
特に好ましいポリペプチドの別の例は、本明細書においてＫＬ５という以下に報告する配列を有するものである：
【化１０】
【００５１】
実際、ＫＬ５は、ＫＬ４のものと類似のペプチドの全体的らせん外周の周囲の荷電残基の分布を示すことが見出された。
【００５２】
好ましいポリペプチドのさらなる例は、式（ＩＩＩ）：
【化１１】
を有するものである。
【００５３】
一般式（ＩＩＩａ）で表されるポリペプチドの例は、当技術分野においてＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）といわれているものである：
【化１２】
【００５４】
一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるポリペプチドを、固相ペプチド合成についてのJ.M. Steward and J.D. Young, “Solid Phase Peptide Synthesis”, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969、およびJ. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides”, Vol.2, p. 46, Academic Press (New York), 1983、ならびに古典的溶液合成についてのE. Schroder and K. Kubke, “The Peptides”, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965に記載されるもののような任意の公知の技術によって調製し得る。ポリペプチド合成技術の概要を、J. Stuart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 3d Ed., Neurath, H. et al., Eds., p. 104-237, Academic Press, New York, NY (1976)中に見出し得る。
【００５５】
そのような合成における使用のために適切な保護基は、上記のテキストおよびJ.F.W. McOmie, Protective Grouts in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973)中に見出される。
【００５６】
一般に、これらの方法は、１つ以上のアミノ酸残基または適切に保護されたアミノ酸残基の成長中のペプチド鎖への逐次的な付加を含む。通常、第１のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを適切な選択的に除去可能な保護基によって保護する。
【００５７】
例としての固相合成を使用して、保護または誘導体化されたアミノ酸を、その非保護カルボキシル基またはアミノ基を通して不活性固体支持体に結合させる。次いで、アミノまたはカルボキシル保護基を選択的に除去し、そして適切に保護された相補（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中の次のアミノ酸を混合し、そして固体支持体に既に結合されている残基とアミド結合を形成させるために適切な条件下で反応させる。次いで、アミノまたはカルボキシル保護基をこの新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、次いで次のアミノ酸（適切に保護されている）を付加する、等。
【００５８】
全ての所望のアミノ酸を適正な配列で連結させた後、いずれもの残存する末端および側鎖保護基（および固体支持体）を逐次的にかまたは同時に除去して、最終ポリペプチドを得る。
【００５９】
特に、一般式（Ｉ）および（ＩＩＩ）で表されるポリペプチドをＷＯ００／４７６２３に開示される方法に従って調製し得、一方、一般式（ＩＩ）で表される配列からなるポリペプチドをＷＯ９２／２２３１５に記載の方法に従って調製し得る。
【００６０】
本発明の再構成サーファクタントを一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるポリペプチドおよび脂質の溶液または懸濁液を混合し、次に混合物を乾燥させることによって調製し得るか、そうでなければそれを凍結乾燥または噴霧乾燥によって調製し得る。
【００６１】
好ましくは、一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドおよび一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドは、本発明の再構成サーファクタント中に、固定された量および量比で、固定された組み合わせとして存在する。
【００６２】
再構成サーファクタントに対する一般式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるポリペプチドの割合は変動し得る。有利には、各々のポリペプチドは、サーファクタントの重量に基づいて０．５〜１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１〜５％、最も好ましくは１〜３％の量で存在し得る。
【００６３】
有利には、脂質担体は、天然肺サーファクタント調製物中に含まれるリン脂質、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）のようなホスファチジルコリン（ＰＣ）、ならびにパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）およびジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）のようなホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含む。
【００６４】
有利に使用することができる他のリン脂質は、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。
【００６５】
特定の実施態様において、脂質担体は、さらなる成分、例えば中性脂質（例えばトリアシルグリセロール）、遊離脂肪酸および／またはコレステロールを含み得る。
【００６６】
有利には、本発明による再構成サーファクタントは、９０〜９９％（重量）、好ましくは９２〜９８％、より好ましくは９４〜９６％の脂質担体、および１〜１０％（重量）、好ましくは２〜８％、より好ましくは４〜６％の両方のペプチドの合計を含む。
【００６７】
本発明の特定の実施態様において、再構成サーファクタントは、９６％（重量）の脂質担体、２％（重量）の一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドおよび２％（重量）の一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドを含む。
【００６８】
脂質担体中に含まれるリン脂質は、好ましくは、９５：５〜５０：５０、好ましくは８０：２０〜６０：４０の範囲の重量比の、ＤＰＰＣ、およびＰＯＰＧまたはそのＰＯＰＣとの混合物より選択されるパルミトイルオレオイルリン脂質からなる混合物である。ＰＯＰＧに対するＤＰＰＣの重量比は、好ましくは７５：２５〜６５：３５の範囲であり、より好ましくは６８：３１である。ＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ：ＰＯＰＣ混合物の場合、リン脂質は、好ましくは、６０：２０：２０または６８：１５：１６の重量比で使用される。
【００６９】
好ましい実施態様において、再構成サーファクタントは、１〜５％（重量）の一般式（Ｉａ）で表されるポリペプチド、１〜５％（重量）の式（ＩＩ）で表されるポリペプチド、ならびに６８：３１の重量比のＤＰＰＣおよびＰＯＰＧの混合物を含む。
【００７０】
さらにより好ましい実施態様において、再構成サーファクタントは、１．５〜３％（重量）の（Ｉｅ）、（Ｉｆ）、（Ｉｇ）および（Ｉｈ）からなる群より選択されるポリペプチド、より好ましくはポリペプチド（Ｉｆ）、１．５〜３％（重量）の一般式（ＩＩ）で表されるペプチド、ならびに６８：３１の重量比のＤＰＰＣおよびＰＯＰＧの混合物を含む。
【００７１】
本発明の再構成サーファクタントの投与は、従来どおり、好ましくは気管内投与（注入もしくはボーラス）によってかまたは噴霧によって行われる。
【００７２】
再構成サーファクタントの有効用量は、投与の手段、疾患の型および重篤度、ならびに処置が予防的であるかまたは治療的であるかどうかを含む多くの様々な要因に応じて変動する。一般に、用量は、０．０１ｍｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは４０〜２００ｍｇ／ｋｇである。当業者は、至適用量およびその投与の頻度を容易に決定することができる。
【００７３】
本発明はまた、本発明の再構成サーファクタントを含む医薬組成物に関する。前記組成物は、有利には、液剤、分散剤、懸濁剤または乾燥散剤の形態で投与される。好ましくは、前記組成物は、適切な溶媒または再懸濁媒体中に溶解または懸濁された再構成サーファクタントを含む。
【００７４】
好ましくは、前記医薬組成物は、使い捨てガラスバイアル中の緩衝生理食塩水溶液中の懸濁剤として供給される。有利には、再構成サーファクタントの濃度（リン脂質含量として表現される）は、約２〜約１６０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜８０ｍｇ／ｍｌのサーファクタントの範囲である。
【００７５】
より低い粘度を達成するために、前記組成物は、電解質、例えばカルシウム、マグネシウムおよび／またはナトリウム塩（例えば塩化カルシウムまたは塩化ナトリウム）をさらに含み得る。
【００７６】
本発明による医薬組成物は、未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）またはサーファクタント欠乏もしくは機能不全に関連する他の疾患（急性肺傷害（ＡＬＩ）、成人におけるＲＤＳ（ＡＲＤＳ）、胎便吸引症候群（ＭＡＳ）および気管支肺形成不全（ＢＰＤ）を含む）の予防および／または処置に適切である。
【００７７】
それはまた、肺炎、気管支炎、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、喘息および嚢胞性線維症のような他の呼吸障害の予防および／または処置のために、そして滲出性中耳炎（膠耳（glue ear））の処置のために有用であり得る。
【００７８】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例証する。
【００７９】
実施例
ポリペプチドＳＰ−Ｃ３３およびＫＬ４に基づく再構成サーファクタントを用いるインビボ実験
サーファクタント調製物を、妊娠期間２７日での子宮摘出によって得た未熟新生ウサギにおいてアッセイする。実験を呼気終末陽性換気（ＰＥＥＰ）を適用することなしに行う。
【００８０】
ＳＰ−Ｃアナログとして、ＷＯ００／４７６２３に記載されるように調製されるＳＰ−Ｃ３３といわれるポリペプチドを使用する。
【００８１】
タンパク質ＳＰ−Ｂのアナログとして、ＷＯ９２／２２３１５の教示に従って調製されるＫＬ４といわれるポリペプチドを使用した。
【００８２】
動物を、６８：３１（ｗ／ｗ）の比率のＤＰＰＣ：ＰＯＰＧからなるリン脂質混合物との組み合わせで２％ＳＰ−Ｃ３３または２％ＳＰ−Ｃ３３＋２％ＫＬ４を含む再構成サーファクタント調製物２００ｍｇ／ｋｇ（８０ｍｇ／ｍｌ）を用いて出生時に処置する。
【００８３】
クロサーフ（登録商標）（８０ｍｇ／ｍｌ）で処置した動物を陽性対照とし、そして非処置同腹仔を陰性対照とする。
【００８４】
未熟新生ウサギを、標準化された一連のピークガス注入圧を用いて平行して換気する。肺を開けるために、圧を最初に３５ｃｍＨ２Ｏに１分間設定する。この補充手技の後、圧を２５ｃｍＨ２Ｏに１５分間低下させ、さらに２０および１５ｃｍＨ２Ｏに低下させる。最後に、圧を再度２５ｃｍＨ２Ｏに５分間上昇させ、その後肺を窒素を用いてさらに５分間換気し、次いで気量測定のために切除する。
【００８５】
ｍｌ／ｋｇとして表現される肺気量および一回換気量の両方を測定し、そして結果（中央値として与える）をそれぞれ図４および５に報告する。
【００８６】
図３は、２％ＫＬ４との組み合わせで２％（ｗ／ｗ）ＳＰ−Ｃ３３を含む再構成サーファクタント調製物で処置した動物が、２％（ｗ／ｗ）ＳＰ−Ｃ３３を与えた動物よりも高い肺気量を有していたことを示し、このことはＳＰ−Ｃ３３サーファクタントへ２％（ｗ／ｗ）ＫＬ４を加えることにより肺気量の増大が生じたことを示す。
【００８７】
前記結果は、本発明の再構成サーファクタントが、タンパク質ＳＰ−Ｃのアナログのみを含む再構成サーファクタント調製物よりも良好な呼気の終末での肺胞におけるリン脂質膜の安定化を提供することを実証する。
【００８８】
さらに、図４は、本発明の再構成サーファクタント調製物が、一回換気量として表現される呼吸機能を有意に改善することが判明したことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質担体、ならびにネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログと３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドとの組み合わせを含む再構成サーファクタントであって、ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログは一般式（Ｉ）：
【化１３】
［式中、
Ｘは、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｓは、エステル結合を介して側鎖に連結された１２〜２２個の炭素原子、好ましくは１６個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されており；
Ωは、Ｍまたは硫黄原子上で酸化されたＭ、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、１〜８の値を有する整数であり；
ｂは、１〜１９の値を有する整数であり；
ｅ、ｆ、ｇおよびｐは、０または１の値を有する整数であり；
ただし、ＸａＢＸｂは、最大２２アミノ酸を有する配列である］
で表される配列を有する少なくとも２０アミノ酸残基かつ４０アミノ酸残基以下のポリペプチドであり；そして
反復単位の配列を含むポリペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基かつ６０アミノ酸残基以下を有しており、そして一般式（ＩＩ）：
【化１４】
［式中、
Ｕは、Ｌ、Ｉ、ｎＬ、Ｖ、Ａ、ＭおよびＦからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、ＨおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、３〜８、好ましくは４〜５の値の整数であり；そして
ｘは、２〜６、好ましくは３〜４の値を有する整数である］
で表される、再構成サーファクタント。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドおよび一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドが、固定された組み合わせで存在する、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項３】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、一般式（Ｉａ）：
【化１５】
［式中、
ａは、１であり；
ｂは、１４であり；そして
ｆおよびｐは０または１である］
で表される、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項４】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、一般式（Ｉｂ）：
【化１６】
［式中、
ｐは、０または１である］
で表される、請求項３記載の再構成サーファクタント。
【請求項５】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、一般式（Ｉｃ）：
【化１７】
［式中、
ｐは、０または１である］
で表される、請求項４記載の再構成サーファクタント。
【請求項６】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、以下：
【化１８】
からなる群より選択される、請求項５記載の再構成サーファクタント。
【請求項７】
一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドが、一般式（ＩＩＩ）：
【化１９】
［式中、
Ｕは、ＬおよびＩからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、ＫおよびＲからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；そして
Ｘは、３または４、好ましくは４の値を有する整数である］
で表される配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項８】
ポリペプチドが、下記の式：
【化２０】
を有する、請求項７記載の再構成サーファクタント。
【請求項９】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、下記の式：
【化２１】
を有し；そして
反復単位の配列を含むポリペプチドが、下記の式：
【化２２】
を有する、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項１０】
脂質担体がリン脂質の混合物を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の再構成サーファクタント。
【請求項１１】
リン脂質の混合物が、９５：５〜５０：５０の範囲の重量比の、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、およびパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）またはそのパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との混合物より選択されるパルミトイルオレオイルリン脂質からなる、請求項１０記載の再構成サーファクタント。
【請求項１２】
リン脂質の混合物が、６８：３１の重量比のＤＰＰＣおよびＰＯＰＧからなる、請求項１１記載の再構成サーファクタント。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の再構成サーファクタントを含む医薬組成物。
【請求項１４】
液剤、分散剤、懸濁剤または乾燥散剤の形態の、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１５】
水性懸濁剤の形態の、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
再構成サーファクタントを２〜１６０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１７】
再構成サーファクタントの濃度が２０〜８０ｍｇ／ｍｌである、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の再構成サーファクタントの医薬としての使用。
【請求項１９】
未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の予防および／または処置のための、あるいはサーファクタント欠乏または機能不全に関連する他の疾患の処置または予防における、請求項１〜１２のいずれか１項記載の再構成サーファクタントの使用。
【請求項２０】
サーファクタント欠乏または機能不全に関連する疾患が、急性肺傷害（ＡＬＩ）、成人におけるＲＤＳ（ＡＲＤＳ）、胎便吸引症候群（ＭＡＳ）および気管支肺形成不全（ＢＰＤ）を含む、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の予防および／または処置のための、あるいはサーファクタント欠乏または機能不全に関連する他の疾患の処置または予防における医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の再構成サーファクタントの使用。
【請求項１】
脂質担体、ならびにネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログと３〜８個の疎水性アミノ酸残基および１個の塩基性アミノ酸残基から構成される反復単位の配列を含むポリペプチドとの組み合わせを含む再構成サーファクタントであって、ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログは一般式（Ｉ）：
【化１３】
［式中、
Ｘは、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、ＹおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｓは、エステル結合を介して側鎖に連結された１２〜２２個の炭素原子、好ましくは１６個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されており；
Ωは、Ｍまたは硫黄原子上で酸化されたＭ、Ｉ、ＬおよびｎＬからなる群より選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、１〜８の値を有する整数であり；
ｂは、１〜１９の値を有する整数であり；
ｅ、ｆ、ｇおよびｐは、０または１の値を有する整数であり；
ただし、ＸａＢＸｂは、最大２２アミノ酸を有する配列である］
で表される配列を有する少なくとも２０アミノ酸残基かつ４０アミノ酸残基以下のポリペプチドであり；そして
反復単位の配列を含むポリペプチドは、少なくとも１２アミノ酸残基かつ６０アミノ酸残基以下を有しており、そして一般式（ＩＩ）：
【化１４】
［式中、
Ｕは、Ｌ、Ｉ、ｎＬ、Ｖ、Ａ、ＭおよびＦからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、Ｋ、Ｒ、ＨおよびＯｒｎからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
ａは、３〜８、好ましくは４〜５の値の整数であり；そして
ｘは、２〜６、好ましくは３〜４の値を有する整数である］
で表される、再構成サーファクタント。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で表されるポリペプチドおよび一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドが、固定された組み合わせで存在する、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項３】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、一般式（Ｉａ）：
【化１５】
［式中、
ａは、１であり；
ｂは、１４であり；そして
ｆおよびｐは０または１である］
で表される、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項４】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、一般式（Ｉｂ）：
【化１６】
［式中、
ｐは、０または１である］
で表される、請求項３記載の再構成サーファクタント。
【請求項５】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、一般式（Ｉｃ）：
【化１７】
［式中、
ｐは、０または１である］
で表される、請求項４記載の再構成サーファクタント。
【請求項６】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、以下：
【化１８】
からなる群より選択される、請求項５記載の再構成サーファクタント。
【請求項７】
一般式（ＩＩ）で表されるポリペプチドが、一般式（ＩＩＩ）：
【化１９】
［式中、
Ｕは、ＬおよびＩからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；
Ｂは、ＫおよびＲからなる群より独立して選択されるアミノ酸残基であり；そして
Ｘは、３または４、好ましくは４の値を有する整数である］
で表される配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項８】
ポリペプチドが、下記の式：
【化２０】
を有する、請求項７記載の再構成サーファクタント。
【請求項９】
ネイティブなサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃのアナログが、下記の式：
【化２１】
を有し；そして
反復単位の配列を含むポリペプチドが、下記の式：
【化２２】
を有する、請求項１記載の再構成サーファクタント。
【請求項１０】
脂質担体がリン脂質の混合物を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の再構成サーファクタント。
【請求項１１】
リン脂質の混合物が、９５：５〜５０：５０の範囲の重量比の、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、およびパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）またはそのパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との混合物より選択されるパルミトイルオレオイルリン脂質からなる、請求項１０記載の再構成サーファクタント。
【請求項１２】
リン脂質の混合物が、６８：３１の重量比のＤＰＰＣおよびＰＯＰＧからなる、請求項１１記載の再構成サーファクタント。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の再構成サーファクタントを含む医薬組成物。
【請求項１４】
液剤、分散剤、懸濁剤または乾燥散剤の形態の、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１５】
水性懸濁剤の形態の、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
再構成サーファクタントを２〜１６０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１７】
再構成サーファクタントの濃度が２０〜８０ｍｇ／ｍｌである、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の再構成サーファクタントの医薬としての使用。
【請求項１９】
未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の予防および／または処置のための、あるいはサーファクタント欠乏または機能不全に関連する他の疾患の処置または予防における、請求項１〜１２のいずれか１項記載の再構成サーファクタントの使用。
【請求項２０】
サーファクタント欠乏または機能不全に関連する疾患が、急性肺傷害（ＡＬＩ）、成人におけるＲＤＳ（ＡＲＤＳ）、胎便吸引症候群（ＭＡＳ）および気管支肺形成不全（ＢＰＤ）を含む、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
未熟出産乳児における呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の予防および／または処置のための、あるいはサーファクタント欠乏または機能不全に関連する他の疾患の処置または予防における医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の再構成サーファクタントの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５２８９９７（Ｐ２０１０−５２８９９７Ａ）
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０９７１４（Ｐ２０１０−５０９７１４）
【出願日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４０９７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４５２９８
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５９１２０１９８５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２２日（２００８．５．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００４０９７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４５２９８
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５９１２０１９８５）
【Ｆターム（参考）】
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