改変微生物
【課題】タンパク質又はポリペプチドの分泌生産量が増大された微生物、更に当該微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造法の提供。
【解決手段】ＳｅｃＡのカルボキシル末端側の６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変された改変微生物。
【解決手段】ＳｅｃＡのカルボキシル末端側の６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変された改変微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
中でも、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス リケニフォルミス（Bacillus licheniformis、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）のようなグラム陽性細菌は、アミラーゼ、プロテアーゼ及びリパーゼのような多くの細胞外酵素を分泌する能力が非常に高く、実際、多くのバチルス属の細胞外酵素が産業的に利用されている。細菌中の所定のタンパク質を分泌された形態で生産することは、分泌されたタンパク質が、通常そのネイティブの構造を維持していること、また分泌によりタンパク質の精製が容易になる等の点で、有用である。従って、斯かる細菌菌株を改良して、分泌される所定のタンパク質の分泌産生量を増やすことは、非常に有意義なことである。
【０００４】
原核生物において、外膜やペリプラズム空間に局在するタンパク質の多くは、Ｓｅｃ膜透過装置を介して細胞質膜を透過する。ＳｅｃＹ／ＳｅｃＥ／ＳｅｃＧからなるヘテロ膜タンパク質複合体と膜表在性のＳｅｃＡ２量体で構成され、ＳｅｃＤ／ＳｅｃＦ／ＹａｊＤヘテロ膜タンパク質複合体が弱く結合することで、膜透過チャンネルを形成し、ＳｅｃＡによるＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いて、タンパク質を膜透過させている。この際、大腸菌では、分泌タンパク質前駆体は分子シャペロンＳｅｃＢに認識され、細胞膜表在のＳｅｃＡへと受け渡されることが知られている。一方、枯草菌においては、分子シャペロンであるＳｅｃＢの相同因子は同定されていないが、真核生物小胞体膜透過に特徴的なＳＲＰ（シグナル認識粒子）が存在し、分泌タンパク質はＳＲＰからＳｅｃＡへ引き渡されていると考えられている。また、枯草菌ＳｅｃＡは、２つのドメインであるＮドメインとＣドメインから構成され、Ｎドメインには、ＡＴＰ結合領域Ｉ（ＡＢＳ Ｉ）とシグナルペプチド結合領域
が含まれ、Ｃドメインには、ＳｅｃＡ２量体形成及びＳｅｃＹ相互作用領域と、大腸菌ＳｅｃＢ結合領域相同領域が含まれており、両ドメインをまたぐようにＡＴＰ結合領域II（ＡＢＳ II）が存在していることが明らかにされている。
【０００５】
従来、タンパク質の分泌産生量を向上させる手段として、プロテアーゼの欠失（非特許文献１）やＰｒｓＡの強化（非特許文献２）、ＳｅｃＤ／ＳｅｃＥ／ＳｅｃＤＦの過剰発現（特許文献１）、ＳｅｃＧの過剰発現（特許文献２）等の遺伝子改変を行うことが報告されている。
しかしながら、ＳｅｃＡの一部のアミノ酸残基を欠失させることについては何ら報告されていない。
【非特許文献１】Olmos-Soto J, Contreras-Flores R. Genetic system constructedto overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Sep;62(4):369-73.
【非特許文献２】Vitikainen M, Hyyrylainen HL, Kivimaki A, Kontinen VP, Sarvas M. Secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis can be improved by engineering cell components affecting post-translocational protein folding and degradation. J Appl Microbiol. 2005;99(2):363-75.
【特許文献１】国際公開第９９／０４００７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／０４００６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの分泌生産量が増大された微生物、更に当該微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、バチルス属細菌の分泌タンパク質輸送装置の構成因子について検討したところ、ｓｅｃＡのカルボキシル末端側の２０〜３０個又は６０〜８０個のアミノ酸、特に６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変した場合に、分泌生産能が向上し、当該改変微生物がタンパク質又はポリペプチドの生産に有用であることを見出した。
ＳｅｃＡは、分泌タンパク質の菌体外への分泌に関与する因子であり、ＳｅｃＡを欠失した場合はタンパク質の生産が減少することは勿論、細胞自体が死んでしまうことから、当該分泌機構に必要不可欠な因子であると考えられていた。従って、ＳｅｃＡのアミノ酸残基の一部を欠失させた場合に、タンパク質の分泌生産能が向上したことは、全く予想外のことである。
【０００８】
本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）ｓｅｃＡのカルボキシル末端側の６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変された改変微生物。
２）上記改変微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
３）上記組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の改変微生物を用いれば、目的タンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができ、また培養液から当該タンパク質又はポリペプチドを容易に回収することができる。従って、本発明は、目的タンパク質又はポリペプチドの工業的生産に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの分泌生産量が増大された微生物、更に当該微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することに関する。
【００１１】
本発明者らは、バチルス属細菌の分泌タンパク質輸送装置の構成因子について検討したところ、ｓｅｃＡのカルボキシル末端側の２０〜３０個又は６０〜８０個のアミノ酸、特に６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変した場合に、分泌生産能が向上し、当該改変微生物がタンパク質又はポリペプチドの生産に有用であることを見出した。
ＳｅｃＡは、分泌タンパク質の菌体外への分泌に関与する因子であり、ＳｅｃＡを欠失した場合はタンパク質の生産が減少することは勿論、細胞自体が死んでしまうことから、当該分泌機構に必要不可欠な因子であると考えられていた。従って、ＳｅｃＡのアミノ酸残基の一部を欠失させた場合に、タンパク質の分泌生産能が向上したことは、全く予想外のことである。
【００１２】
本発明の改変微生物を用いれば、目的タンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができ、また培養液から当該タンパク質又はポリペプチドを容易に回収することができる。従って、本発明は、目的タンパク質又はポリペプチドの工業的生産に有用である。
【００１３】
本発明において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメータであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１４】
本発明の微生物（宿主微生物）は、ＳｅｃＡをコードする遺伝子を有するものであればよく、グラム陽性菌、グラム陰性菌のいずれでもよいが、タンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点からグラム陽性菌が好ましく、中でもバチルス(Bacillus)属細菌が好ましく、特に全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点で枯草菌が好ましい。
【００１５】
本発明の改変微生物において、改変の対象となる遺伝子はＳｅｃＡをコードする遺伝子である。
ＳｅｃＡは、細菌においてタンパク質輸送経路に関する因子（タンパク質）の一つであり、膜透過チャネル（ＳｅｃＹ／ＳｅｃＥ／ＳｅｃＧ）と共同で分泌タンパク質を菌体外に分泌するための機能を持つ。枯草菌ＳｅｃＡ（８４１アミノ酸、分子量９５．３ＫＤａ）は、２つのドメインであるＮドメインとＣドメインから構成され、Ｎドメインには、ＡＴＰ結合領域Ｉ（ＡＢＳ Ｉ）とシグナルペプチド結合領域が含まれる。一方、Ｃドメインには、ＳｅｃＡ２量体形成及びＳｅｃＹ相互作用領域と、大腸菌ＳｅｃＢ結合領域相同領域が含まれており、両ドメインをまたぐようにＡＴＰ結合領域II（ＡＢＳ II）が存在していることが知られている。
【００１６】
本発明において改変すべき好適なＳｅｃＡとしては、枯草菌のＳｅｃＡ又はこれと機能的に等価なタンパク質が挙げられ、ＳｅｃＡをコードする遺伝子としては、枯草菌のｓｅｃＡ又はこれと機能的に等価なタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
枯草菌のＳｅｃＡ又はこれと機能的に等価なタンパク質とは、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｃ）に示すタンパク質を意味する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質
【００１７】
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上同一性を有するアミノ酸配列としては、９０％以上の同一性を有するものが好ましく、更に９５％以上の同一性を有するものが好ましく、９９％以上の同一性を有するものが特に好ましい。
【００１９】
また、ＳｅｃＡと同様の機能を有するとは、ＳｅｃＡが有するＡＴＰａｓｅ活性を持ち、ＳｅｃＹ／ＳｅｃＥ複合体と結合することができる等のＳｅｃＡと実質的に同一の機能を保有することをいう。
【００２０】
枯草菌のＳｅｃＡ又はこれと機能的に等価なタンパク質をコードする遺伝子としては、上記の（Ａ）〜（Ｃ）に示すタンパク質をコードする遺伝子を云うが、好ましくは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２１】
ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor LaboratoryPress］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２２】
また、配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列としては、９０％以上の同一性を有するものが好ましく、更に９５％以上の同一性を有するものが好ましく、９９％以上の同一性を有するものが特に好ましい。
当該ＤＮＡは、自然界から得ることも可能ではあるが、さらに部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することもできる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット（タカラ）]等を用いて変異を導入し調製することができる。
【００２３】
尚、枯草菌のＳｅｃＡをコードする遺伝子（配列番号１）は、JAFAN（Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB),http://bacillus.genome.ad.jp/、2008年６月18日更新)において掲載され、また、枯草菌以外のＳｅｃＡをコードする遺伝子については、大腸菌においてColibri（http://genolist.pasteur.fr/Colibri/）データベースに掲載されている。また、TIGER（http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/CmrHomePage.cgi）には、グラム陽性菌、グラム陰性菌のゲノムが数多く掲載される。
【００２４】
本発明において欠失すべき、ＳｅｃＡのカルボキシル末端側のアミノ酸としては、２０〜３０個又は６０〜８０個のアミノ酸が挙げられるが、好ましくは６０〜８０個のアミノ酸である。
枯草菌の場合、ＳｅｃＡは８４１個のアミノ酸（配列番号２）から構成されるが、配列番号２においてアミノ酸番号８２０〜８４１番のアミノ酸を欠失すること（「Ｎ８１９」ともいう）、又は７８１〜８４１番のアミノ酸を欠失すること（「Ｎ７８０」ともいう）が好ましく、特にアミノ酸番号７８１〜８４１番のアミノ酸を欠失すること（Ｎ７８０）が好ましい。
枯草菌のＳｅｃＡは、そのカルボキシル末端側に、ＣＴＤ領域（C-Terminal region Domain；J.B.C.(2004)279(21)p22490-22497参照)をもつ。ＣＴＤ領域のＣ末端の２２個のアミノ酸は大腸菌ＳｅｃＢ結合領域相同領域であり、当該領域のＮ末端側には、アミノ酸６１個のＣＴＬ領域(C-Terminal Terminal Linker；Science(2002)297(5589)p2018-2026参照）と呼ばれている領域が存在する。この領域は、枯草菌において、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）の構成成分であるＦｆｈ（Fifty Four Homologue, SRP５４相同因子）と結合する領域である。Ｆｆｈ結合領域にあたるCTL領域は、アミノ酸番号７８１−８１９番の領域である。
従って、本発明の遺伝子改変には、これらの各領域又はこれらと相同な領域を単独或いは複数組み合わせて欠失するようにすることが包含され、このうち、Ｆｆｈ結合領域又はその相同領域を欠失するような遺伝子改変が好ましい。
【００２５】
本発明のＳｅｃＡをコードする遺伝子の改変手段としては、例えば、相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上のＳｅｃＡ遺伝子の目的の領域を分断して欠失させればよい。
【００２６】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を削除する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を用いることによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２７】
以下、より具体的に、ＤＮＡ組換え技術を用いた方法によって調製されるＳｅｃＡ部分欠失用ＤＮＡ断片を用いた削除方法について説明する。
ＳｅｃＡ部分欠失用ＤＮＡ断片は、ｓｅｃＡ遺伝子の３'末端側の遺伝子領域を一部改変した遺伝子配列である。両末端に少なくとも１個の制限酵素部位を含んでいる。制限酵素部位を利用して、このＤＮＡ断片を常法により例えば枯草菌ゲノムＤＮＡを鋳型にして制限酵素部位を含んだプライマーを用いたＰＣＲ反応で増幅して調製することができる。また、ＤＮＡ断片の３'末端側のプライマーには、欠失したいＳｅｃＡタンパク質のＣ末端領域をコードする遺伝子のすぐ上流に終始コドンをコードする遺伝子配列を挿入している。
この断片を枯草菌等の形質転換可能なグラム陽性菌へ形質転換することで相同組換えを可能とするｐＤＨ８８等のインテグレーションベクターのマルチクローニング部位に挿入してプラスミドを構築する。
このプラスミドを枯草菌等に導入して相同組換えを行うことで該プラスミドが染色体に組み込まれた株（ＳｅｃＡ部分欠失株）を得ることができる。取得した株の染色体上の遺伝子構成は、図１ａに示すとおりである。挿入株は、欠失したい領域の前に存在する終止コドンにより、染色体上から発現するＳｅｃＡタンパク質の翻訳は、途中で停止するため、希望のＳｅｃＡＣ末欠失タンパク質のみを発現することができる。
【００２８】
斯くして得られた改変微生物株に、目的とする異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００２９】
本発明の組換え微生物を用いて生産される目的タンパク質又はポリペプチドは、特に限定されず、例えば生理活性ペプチドや、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素などが挙げられる。
生理活性ペプチドとしては、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされるタンパク質、Ｇタンパク質共役型受容体、成長因子（血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等）、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等が挙げられる。
また、産業用酵素としては、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が挙げられ、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００３０】
本発明の微生物に導入される目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。
ここで、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。
【００３１】
上記の目的の異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該ＤＮＡ断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３２】
本発明の組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性は、ＳｅｃＡ遺伝子改変をしていない微生物を用いた場合と比較して、その生産性の向上が達成されている。
【００３３】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００３４】
＜使用細菌株、プラスミド及び培地＞
（１）使用菌株
枯草菌（バチルス・サブチリス）マーバーグ１６８ｔｒｐＣ２株（KunstらNature1997）
枯草菌ＳＡＮ８１９株（Ｎ８１９）；耐性マーカー（クロラムフェニコール）
枯草菌ＳＡＮ７８０株（Ｎ７８０）；耐性マーカー（クロラムフェニコール）
大腸菌（エシェリヒア・コリ）Ｃ６００株（タカラバイオ）
大腸菌（エシェリヒア・コリ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ）
【００３５】
（２）プラスミド
pＤＨ８８；ヘナーら（Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Jan;81(2):439-43.）、耐性マーカー（アンピシリン、クロラムフェニコール）
pＨＫＫ１１０１；耐性マーカー（アンピシリン、クロラムフェニコール）、ＳｅｃＡ部分欠失株（ＳＡＮ８１９株）作成用組換えベクター
ｐＨＫＫ１００２；耐性マーカー（アンピシリン、クロラムフェニコール）、ＳｅｃＡ部分欠失株（ＳＡＮ７８０株）作成用組換えベクター
ｐＷＨ１５２０；MoBiTec社、耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）
ｐＨＫＫ３２００；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入遺伝子（アミラーゼＡｍｙＥシグナルペプチド及びプロ領域
ｐＨＫＫ３２０１；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入遺伝子（アミラーゼＡｍｙＥシグナルペプチド及びプロ領域とＩＦＮα成熟体の融合タンパク質
ｐＨＫＫ３２０２；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入遺伝子（アミラーゼＡｍｙＥシグナルペプチド及びプロ領域とＩＦＮβ成熟体の融合タンパク質
【００３６】
（３）培地
Ｌ培地；バクトトリプトン(Difco)1%、イーストエクスラクト(Difco)０．５％、NaCl０．５％（和光）
２×Ｌ培地；バクトトリプトン(Difco)2%、イーストエクスラクト(Difco)１％、NaCl１％（和光）
抗生物質は以下の濃度で使用した、クロラムフェニコール１５μｇ、アンピシリン５０μｇ。ｐＷＨ１５２０のもつキシロースプロモーターの誘導のため、キシロースは終濃度０．６％で使用した。イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）は、終濃度１００μMで使用した。
【００３７】
実施例１ プラスミド及びＳｅｃＡ部分欠失株の構築
（１）ＳｅｃＡ部分欠失株作成用組換えベクター
枯草菌ＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株を作成するため、枯草菌１６８株の染色体を鋳型にプライマーｓｅｃＡＣ−０１ (gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg（配列番号
３）、大文字がＨｉｎｄIII)とＳｅｃＡＣ−０２ (gatcagaTCTAGAttaaatctcagctttcatcacaaa（配列番号４）、大文字がＸｂａＩ、下線が挿入した終止コドン）を用いてＰＣＲにて増幅したｓｅｃＡ遺伝子３'末端側３６０ｂｐをｐＤＨ８８のＨｉｎｄIII−ＸｂａＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ１００１を構築した。同様にプライマーｓｅｃＡＣ−０３(gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg（配列番号５）、大文字がＨｉｎｄIII）とｓｅｃＡＣ−０４(gatcagaTCTAGAttagatatcaaccactttgcgaac（配列番号６）、大文字がＸｂａＩ、下線が挿入した終止コドン）を用いて、ｐＨＫＫ１００２を構築した。
【００３８】
（２）ＳｅｃＡ部分欠失株の作成
枯草菌ＳＡＮ８１９は、プラスミドｐＨＫＫ１００１を枯草菌１６８株の染色体にキャンベル型に組み込むことにより取得した（図１ａ）。また、ＳＡＮ７８０株もｐＨＫＫ１００２プラスミドを用いて同様の手法で取得した。ＳＡＮ８１９及びＳＡＮ７８０の染色体上に正しく組み込まれたことは、サザンハイブリダイゼーション法により確認した。また、抗ＳｅｃＡ抗体を用いてＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株で発現するＳｅｃＡのサイズを確認した（図１ｂ）。
【００３９】
（３）ＳｅｃＡ部分欠失株の生育への影響
（２）により作成されたＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株を用いて、生育への影響を観察した。培養液には、Ｌ液体培地、Ｌプレート培地、２×Ｌ液体培地を用い（いずれの場合も終濃度１００μMＩＰＴＧを添加）、培養温度は、３０℃、３７℃、４７℃のそれぞれの温度にて培養を行った。
その結果、いずれの条件においても枯草菌ＳＡＮ８１９及びＳＡＮ７８０は、親株である枯草菌１６８株と変わらない生育を示した。
ＩＰＴＧを添加しない場合、ＳｅｃＡの下流に存在し、ＳｅｃＡとオペロンを形成するｐｒｆＢ遺伝子の影響で生育に低下が見られた。
このことから、ＳｅｃＡのＣ末端領域であるＣＴＤ（C-Terminal region domain）領域は、枯草菌の生育に必須ではないことがわかった。
【００４０】
実施例２ 異種タンパク質の発現
（１）異種タンパク質発現用ベクターの構築
異種タンパク質を菌体外に分泌させるためには、シグナル配列が必要になる。そこで、枯草菌アミラーゼ（ａｍｙＥ）タンパク質の持つシグナル配列及びプロ配列をもつ分泌タンパク質発現用基本ベクターｐＨＫＫ３２００を作成した。ｐＨＫＫ３２００を作成するため、枯草菌１６８株の染色体を鋳型にプライマーａｍｙＥＳＦ−１(ggccACTAGTcttcaaaaaatcaaa（配列番号７）、大文字がＳｐｅＩ）とａｍｙＥＳＲ−２(ggccGGTACCctcattcgatttgttcgc（配列番号８）、大文字がＫｐｎＩ）を用いてＰＣＲにて増幅したａｍｙＥ遺伝子シグナル配列及びプロ配列のコード領域１７５ｂｐをｐＷＨ１５２０のＳｐｅＩ−ＫｐｎＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ３２００を構築した。
インターフェロンα発現プラスミドを作成するため、ｐＯＲＦ５−ｈＩＦＮ−α（インビボジェン）を鋳型にプライマーｉｆｎａＦ (ggccGGTACCctcctggtgctcagctgc（配列番号９）、大文字がＫｐｎＩ）とｉｆｎａＲ(ggccGGATCCttttcattccttacttct（配列番号１０）、大文字がＢａｍＨＩ）を用いてＰＣＲにて増幅したｉｆｎα遺伝子成熟体領域を含む５２１ｂｐをｐＨＫＫ３２００のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ３２０１を構築した（図２ａ）ｂ））。
また、同様の方法で、ｐＯＲＦ−ｈＩＦＮβ（インビボジェン）を鋳型にプライマーｉｆｎｂＦ (ggccGGTACCatgagctacaactt（配列番号１１）、大文字がＫｐｎＩ）とｉｆｎｂＲ (ggccGGATCCagctcagtttcggaggta（配列番号１２）、大文字がＢａｍＨＩ）を用いてインターフェロンβ発現プラスミドｐＨＫＫ３２０２を作成した。
【００４１】
（２）異種タンパク質発現ベクター導入株の作成
形質転換法により、（１）で作成した、インターフェロンα発現ベクターpＨＫＫ３２０１及びインターフェロンβ発現プラスミドｐＨＫＫ３２０２を、それぞれＳＡＮ７８０株及びＳＡＮ８１９株に取り込ませることによって、インターフェロン発現ベクター導入株を得た。
形質転換は、ＳＰＩ培地及びＳＰＩＩ培地を用いてコンピテント法により行い、１５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に生育した菌株を形質転換体とした。
【００４２】
（３）培養
２×Ｌ培地（2%Tripton (Difco), 1% YeastExtract (Difco), 1% NaCl）培地を用いた。必要に応じてテトラサイクリン（和光）を最終濃度１５μｇ／ｍＬとなる様に添加した。培養は、前培養液を２％植菌し、３０℃にて細胞増殖期中期（ＯＤ６６０＝０．３）まで培養後、キシロースを最終濃度０．６％添加し、培養した。培養開始後２４時間後で集菌し、培養液を得た。
インターフェロンを含むサンプルは、ウエスタンブロッティング解析により検出し、検出バンドの濃淡を測定することで比較した。
【００４３】
（４）分泌タンパク質（インターフェロン（ＩＦＮ））の確認
１）ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングは、セミドライシステム（バイオラッド）を用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分離後、タンパク質をイモビロンＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。タンパク質の検出は、ＥＣＬ検出システム（アマシャム、現GEヘルスケア）を用いた。
抗インターフェロンα抗体及び抗インターフェロンβ抗体は、（PeproTech EC LTD）のものを使用した。ＨＲＰ標識二次抗体は、アマシャム（現GEヘルスケア）のものを使用した。
【００４４】
２）インターフェロン活性測定
培養２４時間後、遠心分離により細胞を取り除いた培養液を、インターフェロンを含むサンプルとした。インターフェロンの誘導は、培養開始後、ＯＤ６６０＝０．３到達時にキシロースを終濃度０．６％になるように添加することで行った。培養液を、動物細胞を用いてインターフェロン生理活性測定を行った。測定実験は、三菱ＢＣＬに委託して行われた。本実験で使用したインターフェロン発現ベクターより分泌されたインターフェロンは、生理活性を所持していた。
【００４５】
（５）分泌量評価法
培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により展開後、ＰＶＤＦ膜へブロッティングし、ＩＦＮα抗体（PeproTech EC LTD）を用いたウエスタンブロッティング法により検出した。分泌量の測定は、ウエスタンブロッティング法により検出したバンドの濃淡をＮＩＨ Ｉｍａｇｅ(National Institutes of Health, USA)により数値化し、野生株を宿主として用いた生産量をコントロールとして、変異株を宿主とした際の生産量を生産比で評価した。
【００４６】
（６）結果
ＳＡＮ７８０株、ＳＡＮ８１９株ともに親株１６８株よりもインターフェロンαの生産量が向上していた（図３）。また、インターフェロンβの生産性評価においても同様に生産量の向上が見られた（図４）。
【００４７】
（７）セルラーゼ生産性評価
ＳＡＮ７８０株及び対照として枯草菌１６８株に、Bacillus属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（FERMBP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報参照）をコードするD N A断片（3 .1kb）が、シャトルベクターpHY300PLKのＢａｍＨI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。
これによって得られた形質転換株を5 mLのLB培地で30℃にて15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2%トリプトン、1 %酵母エキス、1 %塩化ナトリウム、7.5 %マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4 - 5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、3 0℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を、上記特許文献に記載の方法、またはp-nitropheny l-β-cellotrioside（生化学工業）を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度（420nm）の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
表１に示した様に、ＳＡＮ780株を宿主として用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１ａ】ＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株のｓｅｃＡ遺伝子座近辺の遺伝子構成図。
【図１ｂ】ＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株で発現するＳｅｃＡのサイズを確認した電気泳動図。
【図２ａ】インターフェロン発現ベクターの作成方法を示した図。
【図２ｂ】インターフェロン発現ベクターｐＨＫＫ３２０１に導入した枯草菌アミラーゼＡｍｙＥシグナルペプチド及びプロ配列とインターフェロンα成熟体領域の融合タンパク質の構成を示した図。
【図３ａ】ＳＡＮ７８０株及びＳＡＮ８１９株を宿主として、ｐＨＫＫ３２０１を導入し、インターフェロンαを生産した場合のウエスタンブロッティングの検出結果を示した図。レーン１：親株１６８株を宿主とした場合、レーン２：ＡＳＮ７８０株を宿主とした場合、レーン３：ＡＳＮ８１９株を宿主とした場合。
【図３ｂ】図３ａの実験をグラフ化したもの。ウェスターンブロット上のバンド強度に基づき、インターフェロンαの相対量を示した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図４】ＳＡＮ７８０株及びＳＡＮ８１９株を宿主として、ｐＨＫＫ３２０２を導入し、インターフェロンβを生産した場合のウエスタンブロッティングの検出結果を示した図。レーン１：親株１６８株を宿主とした場合、レーン２：ＡＳＮ７８０株を宿主とした場合、レーン３：ＡＳＮ８１９株を宿主とした場合。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
中でも、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス リケニフォルミス（Bacillus licheniformis、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）のようなグラム陽性細菌は、アミラーゼ、プロテアーゼ及びリパーゼのような多くの細胞外酵素を分泌する能力が非常に高く、実際、多くのバチルス属の細胞外酵素が産業的に利用されている。細菌中の所定のタンパク質を分泌された形態で生産することは、分泌されたタンパク質が、通常そのネイティブの構造を維持していること、また分泌によりタンパク質の精製が容易になる等の点で、有用である。従って、斯かる細菌菌株を改良して、分泌される所定のタンパク質の分泌産生量を増やすことは、非常に有意義なことである。
【０００４】
原核生物において、外膜やペリプラズム空間に局在するタンパク質の多くは、Ｓｅｃ膜透過装置を介して細胞質膜を透過する。ＳｅｃＹ／ＳｅｃＥ／ＳｅｃＧからなるヘテロ膜タンパク質複合体と膜表在性のＳｅｃＡ２量体で構成され、ＳｅｃＤ／ＳｅｃＦ／ＹａｊＤヘテロ膜タンパク質複合体が弱く結合することで、膜透過チャンネルを形成し、ＳｅｃＡによるＡＴＰ加水分解のエネルギーを用いて、タンパク質を膜透過させている。この際、大腸菌では、分泌タンパク質前駆体は分子シャペロンＳｅｃＢに認識され、細胞膜表在のＳｅｃＡへと受け渡されることが知られている。一方、枯草菌においては、分子シャペロンであるＳｅｃＢの相同因子は同定されていないが、真核生物小胞体膜透過に特徴的なＳＲＰ（シグナル認識粒子）が存在し、分泌タンパク質はＳＲＰからＳｅｃＡへ引き渡されていると考えられている。また、枯草菌ＳｅｃＡは、２つのドメインであるＮドメインとＣドメインから構成され、Ｎドメインには、ＡＴＰ結合領域Ｉ（ＡＢＳ Ｉ）とシグナルペプチド結合領域
が含まれ、Ｃドメインには、ＳｅｃＡ２量体形成及びＳｅｃＹ相互作用領域と、大腸菌ＳｅｃＢ結合領域相同領域が含まれており、両ドメインをまたぐようにＡＴＰ結合領域II（ＡＢＳ II）が存在していることが明らかにされている。
【０００５】
従来、タンパク質の分泌産生量を向上させる手段として、プロテアーゼの欠失（非特許文献１）やＰｒｓＡの強化（非特許文献２）、ＳｅｃＤ／ＳｅｃＥ／ＳｅｃＤＦの過剰発現（特許文献１）、ＳｅｃＧの過剰発現（特許文献２）等の遺伝子改変を行うことが報告されている。
しかしながら、ＳｅｃＡの一部のアミノ酸残基を欠失させることについては何ら報告されていない。
【非特許文献１】Olmos-Soto J, Contreras-Flores R. Genetic system constructedto overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Sep;62(4):369-73.
【非特許文献２】Vitikainen M, Hyyrylainen HL, Kivimaki A, Kontinen VP, Sarvas M. Secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis can be improved by engineering cell components affecting post-translocational protein folding and degradation. J Appl Microbiol. 2005;99(2):363-75.
【特許文献１】国際公開第９９／０４００７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／０４００６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの分泌生産量が増大された微生物、更に当該微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、バチルス属細菌の分泌タンパク質輸送装置の構成因子について検討したところ、ｓｅｃＡのカルボキシル末端側の２０〜３０個又は６０〜８０個のアミノ酸、特に６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変した場合に、分泌生産能が向上し、当該改変微生物がタンパク質又はポリペプチドの生産に有用であることを見出した。
ＳｅｃＡは、分泌タンパク質の菌体外への分泌に関与する因子であり、ＳｅｃＡを欠失した場合はタンパク質の生産が減少することは勿論、細胞自体が死んでしまうことから、当該分泌機構に必要不可欠な因子であると考えられていた。従って、ＳｅｃＡのアミノ酸残基の一部を欠失させた場合に、タンパク質の分泌生産能が向上したことは、全く予想外のことである。
【０００８】
本発明は、以下の１）〜３）に係るものである。
１）ｓｅｃＡのカルボキシル末端側の６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変された改変微生物。
２）上記改変微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
３）上記組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の改変微生物を用いれば、目的タンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができ、また培養液から当該タンパク質又はポリペプチドを容易に回収することができる。従って、本発明は、目的タンパク質又はポリペプチドの工業的生産に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの分泌生産量が増大された微生物、更に当該微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することに関する。
【００１１】
本発明者らは、バチルス属細菌の分泌タンパク質輸送装置の構成因子について検討したところ、ｓｅｃＡのカルボキシル末端側の２０〜３０個又は６０〜８０個のアミノ酸、特に６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変した場合に、分泌生産能が向上し、当該改変微生物がタンパク質又はポリペプチドの生産に有用であることを見出した。
ＳｅｃＡは、分泌タンパク質の菌体外への分泌に関与する因子であり、ＳｅｃＡを欠失した場合はタンパク質の生産が減少することは勿論、細胞自体が死んでしまうことから、当該分泌機構に必要不可欠な因子であると考えられていた。従って、ＳｅｃＡのアミノ酸残基の一部を欠失させた場合に、タンパク質の分泌生産能が向上したことは、全く予想外のことである。
【００１２】
本発明の改変微生物を用いれば、目的タンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができ、また培養液から当該タンパク質又はポリペプチドを容易に回収することができる。従って、本発明は、目的タンパク質又はポリペプチドの工業的生産に有用である。
【００１３】
本発明において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、パラメータであるUnit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１４】
本発明の微生物（宿主微生物）は、ＳｅｃＡをコードする遺伝子を有するものであればよく、グラム陽性菌、グラム陰性菌のいずれでもよいが、タンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点からグラム陽性菌が好ましく、中でもバチルス(Bacillus)属細菌が好ましく、特に全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点で枯草菌が好ましい。
【００１５】
本発明の改変微生物において、改変の対象となる遺伝子はＳｅｃＡをコードする遺伝子である。
ＳｅｃＡは、細菌においてタンパク質輸送経路に関する因子（タンパク質）の一つであり、膜透過チャネル（ＳｅｃＹ／ＳｅｃＥ／ＳｅｃＧ）と共同で分泌タンパク質を菌体外に分泌するための機能を持つ。枯草菌ＳｅｃＡ（８４１アミノ酸、分子量９５．３ＫＤａ）は、２つのドメインであるＮドメインとＣドメインから構成され、Ｎドメインには、ＡＴＰ結合領域Ｉ（ＡＢＳ Ｉ）とシグナルペプチド結合領域が含まれる。一方、Ｃドメインには、ＳｅｃＡ２量体形成及びＳｅｃＹ相互作用領域と、大腸菌ＳｅｃＢ結合領域相同領域が含まれており、両ドメインをまたぐようにＡＴＰ結合領域II（ＡＢＳ II）が存在していることが知られている。
【００１６】
本発明において改変すべき好適なＳｅｃＡとしては、枯草菌のＳｅｃＡ又はこれと機能的に等価なタンパク質が挙げられ、ＳｅｃＡをコードする遺伝子としては、枯草菌のｓｅｃＡ又はこれと機能的に等価なタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
枯草菌のＳｅｃＡ又はこれと機能的に等価なタンパク質とは、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｃ）に示すタンパク質を意味する。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質
【００１７】
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上同一性を有するアミノ酸配列としては、９０％以上の同一性を有するものが好ましく、更に９５％以上の同一性を有するものが好ましく、９９％以上の同一性を有するものが特に好ましい。
【００１９】
また、ＳｅｃＡと同様の機能を有するとは、ＳｅｃＡが有するＡＴＰａｓｅ活性を持ち、ＳｅｃＹ／ＳｅｃＥ複合体と結合することができる等のＳｅｃＡと実質的に同一の機能を保有することをいう。
【００２０】
枯草菌のＳｅｃＡ又はこれと機能的に等価なタンパク質をコードする遺伝子としては、上記の（Ａ）〜（Ｃ）に示すタンパク質をコードする遺伝子を云うが、好ましくは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００２１】
ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor LaboratoryPress］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００２２】
また、配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列としては、９０％以上の同一性を有するものが好ましく、更に９５％以上の同一性を有するものが好ましく、９９％以上の同一性を有するものが特に好ましい。
当該ＤＮＡは、自然界から得ることも可能ではあるが、さらに部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することもできる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット（タカラ）]等を用いて変異を導入し調製することができる。
【００２３】
尚、枯草菌のＳｅｃＡをコードする遺伝子（配列番号１）は、JAFAN（Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB),http://bacillus.genome.ad.jp/、2008年６月18日更新)において掲載され、また、枯草菌以外のＳｅｃＡをコードする遺伝子については、大腸菌においてColibri（http://genolist.pasteur.fr/Colibri/）データベースに掲載されている。また、TIGER（http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/CmrHomePage.cgi）には、グラム陽性菌、グラム陰性菌のゲノムが数多く掲載される。
【００２４】
本発明において欠失すべき、ＳｅｃＡのカルボキシル末端側のアミノ酸としては、２０〜３０個又は６０〜８０個のアミノ酸が挙げられるが、好ましくは６０〜８０個のアミノ酸である。
枯草菌の場合、ＳｅｃＡは８４１個のアミノ酸（配列番号２）から構成されるが、配列番号２においてアミノ酸番号８２０〜８４１番のアミノ酸を欠失すること（「Ｎ８１９」ともいう）、又は７８１〜８４１番のアミノ酸を欠失すること（「Ｎ７８０」ともいう）が好ましく、特にアミノ酸番号７８１〜８４１番のアミノ酸を欠失すること（Ｎ７８０）が好ましい。
枯草菌のＳｅｃＡは、そのカルボキシル末端側に、ＣＴＤ領域（C-Terminal region Domain；J.B.C.(2004)279(21)p22490-22497参照)をもつ。ＣＴＤ領域のＣ末端の２２個のアミノ酸は大腸菌ＳｅｃＢ結合領域相同領域であり、当該領域のＮ末端側には、アミノ酸６１個のＣＴＬ領域(C-Terminal Terminal Linker；Science(2002)297(5589)p2018-2026参照）と呼ばれている領域が存在する。この領域は、枯草菌において、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）の構成成分であるＦｆｈ（Fifty Four Homologue, SRP５４相同因子）と結合する領域である。Ｆｆｈ結合領域にあたるCTL領域は、アミノ酸番号７８１−８１９番の領域である。
従って、本発明の遺伝子改変には、これらの各領域又はこれらと相同な領域を単独或いは複数組み合わせて欠失するようにすることが包含され、このうち、Ｆｆｈ結合領域又はその相同領域を欠失するような遺伝子改変が好ましい。
【００２５】
本発明のＳｅｃＡをコードする遺伝子の改変手段としては、例えば、相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上のＳｅｃＡ遺伝子の目的の領域を分断して欠失させればよい。
【００２６】
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を削除する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を用いることによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
【００２７】
以下、より具体的に、ＤＮＡ組換え技術を用いた方法によって調製されるＳｅｃＡ部分欠失用ＤＮＡ断片を用いた削除方法について説明する。
ＳｅｃＡ部分欠失用ＤＮＡ断片は、ｓｅｃＡ遺伝子の３'末端側の遺伝子領域を一部改変した遺伝子配列である。両末端に少なくとも１個の制限酵素部位を含んでいる。制限酵素部位を利用して、このＤＮＡ断片を常法により例えば枯草菌ゲノムＤＮＡを鋳型にして制限酵素部位を含んだプライマーを用いたＰＣＲ反応で増幅して調製することができる。また、ＤＮＡ断片の３'末端側のプライマーには、欠失したいＳｅｃＡタンパク質のＣ末端領域をコードする遺伝子のすぐ上流に終始コドンをコードする遺伝子配列を挿入している。
この断片を枯草菌等の形質転換可能なグラム陽性菌へ形質転換することで相同組換えを可能とするｐＤＨ８８等のインテグレーションベクターのマルチクローニング部位に挿入してプラスミドを構築する。
このプラスミドを枯草菌等に導入して相同組換えを行うことで該プラスミドが染色体に組み込まれた株（ＳｅｃＡ部分欠失株）を得ることができる。取得した株の染色体上の遺伝子構成は、図１ａに示すとおりである。挿入株は、欠失したい領域の前に存在する終止コドンにより、染色体上から発現するＳｅｃＡタンパク質の翻訳は、途中で停止するため、希望のＳｅｃＡＣ末欠失タンパク質のみを発現することができる。
【００２８】
斯くして得られた改変微生物株に、目的とする異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００２９】
本発明の組換え微生物を用いて生産される目的タンパク質又はポリペプチドは、特に限定されず、例えば生理活性ペプチドや、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素などが挙げられる。
生理活性ペプチドとしては、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされるタンパク質、Ｇタンパク質共役型受容体、成長因子（血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等）、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等が挙げられる。
また、産業用酵素としては、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が挙げられ、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００３０】
本発明の微生物に導入される目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。
ここで、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。
【００３１】
上記の目的の異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該ＤＮＡ断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。
【００３２】
本発明の組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性は、ＳｅｃＡ遺伝子改変をしていない微生物を用いた場合と比較して、その生産性の向上が達成されている。
【００３３】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００３４】
＜使用細菌株、プラスミド及び培地＞
（１）使用菌株
枯草菌（バチルス・サブチリス）マーバーグ１６８ｔｒｐＣ２株（KunstらNature1997）
枯草菌ＳＡＮ８１９株（Ｎ８１９）；耐性マーカー（クロラムフェニコール）
枯草菌ＳＡＮ７８０株（Ｎ７８０）；耐性マーカー（クロラムフェニコール）
大腸菌（エシェリヒア・コリ）Ｃ６００株（タカラバイオ）
大腸菌（エシェリヒア・コリ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ）
【００３５】
（２）プラスミド
pＤＨ８８；ヘナーら（Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Jan;81(2):439-43.）、耐性マーカー（アンピシリン、クロラムフェニコール）
pＨＫＫ１１０１；耐性マーカー（アンピシリン、クロラムフェニコール）、ＳｅｃＡ部分欠失株（ＳＡＮ８１９株）作成用組換えベクター
ｐＨＫＫ１００２；耐性マーカー（アンピシリン、クロラムフェニコール）、ＳｅｃＡ部分欠失株（ＳＡＮ７８０株）作成用組換えベクター
ｐＷＨ１５２０；MoBiTec社、耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）
ｐＨＫＫ３２００；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入遺伝子（アミラーゼＡｍｙＥシグナルペプチド及びプロ領域
ｐＨＫＫ３２０１；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入遺伝子（アミラーゼＡｍｙＥシグナルペプチド及びプロ領域とＩＦＮα成熟体の融合タンパク質
ｐＨＫＫ３２０２；耐性マーカー（アンピシリン、テトラサイクリン）、挿入遺伝子（アミラーゼＡｍｙＥシグナルペプチド及びプロ領域とＩＦＮβ成熟体の融合タンパク質
【００３６】
（３）培地
Ｌ培地；バクトトリプトン(Difco)1%、イーストエクスラクト(Difco)０．５％、NaCl０．５％（和光）
２×Ｌ培地；バクトトリプトン(Difco)2%、イーストエクスラクト(Difco)１％、NaCl１％（和光）
抗生物質は以下の濃度で使用した、クロラムフェニコール１５μｇ、アンピシリン５０μｇ。ｐＷＨ１５２０のもつキシロースプロモーターの誘導のため、キシロースは終濃度０．６％で使用した。イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）は、終濃度１００μMで使用した。
【００３７】
実施例１ プラスミド及びＳｅｃＡ部分欠失株の構築
（１）ＳｅｃＡ部分欠失株作成用組換えベクター
枯草菌ＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株を作成するため、枯草菌１６８株の染色体を鋳型にプライマーｓｅｃＡＣ−０１ (gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg（配列番号
３）、大文字がＨｉｎｄIII)とＳｅｃＡＣ−０２ (gatcagaTCTAGAttaaatctcagctttcatcacaaa（配列番号４）、大文字がＸｂａＩ、下線が挿入した終止コドン）を用いてＰＣＲにて増幅したｓｅｃＡ遺伝子３'末端側３６０ｂｐをｐＤＨ８８のＨｉｎｄIII−ＸｂａＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ１００１を構築した。同様にプライマーｓｅｃＡＣ−０３(gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg（配列番号５）、大文字がＨｉｎｄIII）とｓｅｃＡＣ−０４(gatcagaTCTAGAttagatatcaaccactttgcgaac（配列番号６）、大文字がＸｂａＩ、下線が挿入した終止コドン）を用いて、ｐＨＫＫ１００２を構築した。
【００３８】
（２）ＳｅｃＡ部分欠失株の作成
枯草菌ＳＡＮ８１９は、プラスミドｐＨＫＫ１００１を枯草菌１６８株の染色体にキャンベル型に組み込むことにより取得した（図１ａ）。また、ＳＡＮ７８０株もｐＨＫＫ１００２プラスミドを用いて同様の手法で取得した。ＳＡＮ８１９及びＳＡＮ７８０の染色体上に正しく組み込まれたことは、サザンハイブリダイゼーション法により確認した。また、抗ＳｅｃＡ抗体を用いてＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株で発現するＳｅｃＡのサイズを確認した（図１ｂ）。
【００３９】
（３）ＳｅｃＡ部分欠失株の生育への影響
（２）により作成されたＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株を用いて、生育への影響を観察した。培養液には、Ｌ液体培地、Ｌプレート培地、２×Ｌ液体培地を用い（いずれの場合も終濃度１００μMＩＰＴＧを添加）、培養温度は、３０℃、３７℃、４７℃のそれぞれの温度にて培養を行った。
その結果、いずれの条件においても枯草菌ＳＡＮ８１９及びＳＡＮ７８０は、親株である枯草菌１６８株と変わらない生育を示した。
ＩＰＴＧを添加しない場合、ＳｅｃＡの下流に存在し、ＳｅｃＡとオペロンを形成するｐｒｆＢ遺伝子の影響で生育に低下が見られた。
このことから、ＳｅｃＡのＣ末端領域であるＣＴＤ（C-Terminal region domain）領域は、枯草菌の生育に必須ではないことがわかった。
【００４０】
実施例２ 異種タンパク質の発現
（１）異種タンパク質発現用ベクターの構築
異種タンパク質を菌体外に分泌させるためには、シグナル配列が必要になる。そこで、枯草菌アミラーゼ（ａｍｙＥ）タンパク質の持つシグナル配列及びプロ配列をもつ分泌タンパク質発現用基本ベクターｐＨＫＫ３２００を作成した。ｐＨＫＫ３２００を作成するため、枯草菌１６８株の染色体を鋳型にプライマーａｍｙＥＳＦ−１(ggccACTAGTcttcaaaaaatcaaa（配列番号７）、大文字がＳｐｅＩ）とａｍｙＥＳＲ−２(ggccGGTACCctcattcgatttgttcgc（配列番号８）、大文字がＫｐｎＩ）を用いてＰＣＲにて増幅したａｍｙＥ遺伝子シグナル配列及びプロ配列のコード領域１７５ｂｐをｐＷＨ１５２０のＳｐｅＩ−ＫｐｎＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ３２００を構築した。
インターフェロンα発現プラスミドを作成するため、ｐＯＲＦ５−ｈＩＦＮ−α（インビボジェン）を鋳型にプライマーｉｆｎａＦ (ggccGGTACCctcctggtgctcagctgc（配列番号９）、大文字がＫｐｎＩ）とｉｆｎａＲ(ggccGGATCCttttcattccttacttct（配列番号１０）、大文字がＢａｍＨＩ）を用いてＰＣＲにて増幅したｉｆｎα遺伝子成熟体領域を含む５２１ｂｐをｐＨＫＫ３２００のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩサイトに導入し、ｐＨＫＫ３２０１を構築した（図２ａ）ｂ））。
また、同様の方法で、ｐＯＲＦ−ｈＩＦＮβ（インビボジェン）を鋳型にプライマーｉｆｎｂＦ (ggccGGTACCatgagctacaactt（配列番号１１）、大文字がＫｐｎＩ）とｉｆｎｂＲ (ggccGGATCCagctcagtttcggaggta（配列番号１２）、大文字がＢａｍＨＩ）を用いてインターフェロンβ発現プラスミドｐＨＫＫ３２０２を作成した。
【００４１】
（２）異種タンパク質発現ベクター導入株の作成
形質転換法により、（１）で作成した、インターフェロンα発現ベクターpＨＫＫ３２０１及びインターフェロンβ発現プラスミドｐＨＫＫ３２０２を、それぞれＳＡＮ７８０株及びＳＡＮ８１９株に取り込ませることによって、インターフェロン発現ベクター導入株を得た。
形質転換は、ＳＰＩ培地及びＳＰＩＩ培地を用いてコンピテント法により行い、１５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に生育した菌株を形質転換体とした。
【００４２】
（３）培養
２×Ｌ培地（2%Tripton (Difco), 1% YeastExtract (Difco), 1% NaCl）培地を用いた。必要に応じてテトラサイクリン（和光）を最終濃度１５μｇ／ｍＬとなる様に添加した。培養は、前培養液を２％植菌し、３０℃にて細胞増殖期中期（ＯＤ６６０＝０．３）まで培養後、キシロースを最終濃度０．６％添加し、培養した。培養開始後２４時間後で集菌し、培養液を得た。
インターフェロンを含むサンプルは、ウエスタンブロッティング解析により検出し、検出バンドの濃淡を測定することで比較した。
【００４３】
（４）分泌タンパク質（インターフェロン（ＩＦＮ））の確認
１）ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングは、セミドライシステム（バイオラッド）を用いて行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分離後、タンパク質をイモビロンＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写した。タンパク質の検出は、ＥＣＬ検出システム（アマシャム、現GEヘルスケア）を用いた。
抗インターフェロンα抗体及び抗インターフェロンβ抗体は、（PeproTech EC LTD）のものを使用した。ＨＲＰ標識二次抗体は、アマシャム（現GEヘルスケア）のものを使用した。
【００４４】
２）インターフェロン活性測定
培養２４時間後、遠心分離により細胞を取り除いた培養液を、インターフェロンを含むサンプルとした。インターフェロンの誘導は、培養開始後、ＯＤ６６０＝０．３到達時にキシロースを終濃度０．６％になるように添加することで行った。培養液を、動物細胞を用いてインターフェロン生理活性測定を行った。測定実験は、三菱ＢＣＬに委託して行われた。本実験で使用したインターフェロン発現ベクターより分泌されたインターフェロンは、生理活性を所持していた。
【００４５】
（５）分泌量評価法
培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により展開後、ＰＶＤＦ膜へブロッティングし、ＩＦＮα抗体（PeproTech EC LTD）を用いたウエスタンブロッティング法により検出した。分泌量の測定は、ウエスタンブロッティング法により検出したバンドの濃淡をＮＩＨ Ｉｍａｇｅ(National Institutes of Health, USA)により数値化し、野生株を宿主として用いた生産量をコントロールとして、変異株を宿主とした際の生産量を生産比で評価した。
【００４６】
（６）結果
ＳＡＮ７８０株、ＳＡＮ８１９株ともに親株１６８株よりもインターフェロンαの生産量が向上していた（図３）。また、インターフェロンβの生産性評価においても同様に生産量の向上が見られた（図４）。
【００４７】
（７）セルラーゼ生産性評価
ＳＡＮ７８０株及び対照として枯草菌１６８株に、Bacillus属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（FERMBP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報参照）をコードするD N A断片（3 .1kb）が、シャトルベクターpHY300PLKのＢａｍＨI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237をプロトプラスト形質転換法によって導入した。
これによって得られた形質転換株を5 mLのLB培地で30℃にて15時間振盪培養を行い、更にこの培養液0.6 mLを30 mLの2xL−マルトース培地（2%トリプトン、1 %酵母エキス、1 %塩化ナトリウム、7.5 %マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4 - 5水和物、15 ppmテトラサイクリン）に接種し、3 0℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を、上記特許文献に記載の方法、またはp-nitropheny l-β-cellotrioside（生化学工業）を基質として、pH7.0、温度30℃における吸光度（420nm）の変化を測定する方法により、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
表１に示した様に、ＳＡＮ780株を宿主として用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１ａ】ＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株のｓｅｃＡ遺伝子座近辺の遺伝子構成図。
【図１ｂ】ＳＡＮ８１９株及びＳＡＮ７８０株で発現するＳｅｃＡのサイズを確認した電気泳動図。
【図２ａ】インターフェロン発現ベクターの作成方法を示した図。
【図２ｂ】インターフェロン発現ベクターｐＨＫＫ３２０１に導入した枯草菌アミラーゼＡｍｙＥシグナルペプチド及びプロ配列とインターフェロンα成熟体領域の融合タンパク質の構成を示した図。
【図３ａ】ＳＡＮ７８０株及びＳＡＮ８１９株を宿主として、ｐＨＫＫ３２０１を導入し、インターフェロンαを生産した場合のウエスタンブロッティングの検出結果を示した図。レーン１：親株１６８株を宿主とした場合、レーン２：ＡＳＮ７８０株を宿主とした場合、レーン３：ＡＳＮ８１９株を宿主とした場合。
【図３ｂ】図３ａの実験をグラフ化したもの。ウェスターンブロット上のバンド強度に基づき、インターフェロンαの相対量を示した。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図４】ＳＡＮ７８０株及びＳＡＮ８１９株を宿主として、ｐＨＫＫ３２０２を導入し、インターフェロンβを生産した場合のウエスタンブロッティングの検出結果を示した図。レーン１：親株１６８株を宿主とした場合、レーン２：ＡＳＮ７８０株を宿主とした場合、レーン３：ＡＳＮ８１９株を宿主とした場合。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳｅｃＡのカルボキシル末端側の６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変された改変微生物。
【請求項２】
カルボキシル末端側のアミノ酸の欠失が、Ｆｆｈ結合領域又はその相同領域の欠失である請求項１記載の改変微生物。
【請求項３】
ＳｅｃＡが、以下の（Ａ）〜（Ｃ）に示すタンパク質である請求項１又は２記載の改変微生物。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の改変微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項５】
微生物がバチルス属細菌である請求項１〜３のいずれか１項記載の改変微生物又は請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
請求項４又は５記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項１】
ＳｅｃＡのカルボキシル末端側の６０〜８０個のアミノ酸が欠失するように遺伝子改変された改変微生物。
【請求項２】
カルボキシル末端側のアミノ酸の欠失が、Ｆｆｈ結合領域又はその相同領域の欠失である請求項１記載の改変微生物。
【請求項３】
ＳｅｃＡが、以下の（Ａ）〜（Ｃ）に示すタンパク質である請求項１又は２記載の改変微生物。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つＳｅｃＡと同様の機能を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の改変微生物株に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項５】
微生物がバチルス属細菌である請求項１〜３のいずれか１項記載の改変微生物又は請求項４記載の組換え微生物。
【請求項６】
請求項４又は５記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図１ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２７１９５６（Ｐ２００８−２７１９５６Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８５２９２（Ｐ２００８−８５２９２）
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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