改変樹状細胞
レンチウイルスの樹状細胞への感染は、未変性Ｔ細胞を分極させてＴｈ１経路に沿って発達させる、抗原提示細胞として作用する樹状細胞の能力を損なう。この損傷は、樹状細胞に、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０ ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードするベクターを含むレンチウイルスを感染させることによって回復する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００２年１１月７日出願の、「樹状細胞機能の調節」（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．）と題する米国仮出願第６０／４２４，６０２号の優先権を主張する。
連邦の援助を受けた研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた認可番号Ｐ５０ ＨＬ５９４１２の下、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
技術分野
本発明は分子生物学、遺伝子治療、免疫学、およびウイルス学の分野に関連する。特には、本発明は、レンチウイルスベクター（ＬＶｓ）で樹状細胞に形質導入して樹状細胞の機能を調節するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなＬＶｓは動物における疾患に関連するが、外来性核酸を宿主細胞に移動させるそれらの能力は疾患を治療するように設計された遺伝子治療実験に活用されている。遺伝子治療適用に対しては、ＬＶｓは他のベクターを上回る幾つかの利点を提供する。例えば、ＨＩＶから誘導されるＬＶｓは、分裂性および非分裂性細胞の両者に感染する能力を含めて、野生型ウイルスのものに類似する細胞侵入およびゲノム統合プロセスに従事する。分裂および非分裂細胞の両者に感染する利点は、ＬＶｓを従来のオンコレトロウイルスベクターと比較して非常に一般的な遺伝子移動媒体とする。効率的な統合、広範な宿主細胞向性および低い組織特異性は、ＬＶｓをアデノ随伴ウイルスベクターのような他のベクターよりも効率的かつ有用なものとする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＬＶｓは、免疫療法およびワクチン用途において用いるため、樹状細胞（ＤＣ）への遺伝子の移動に用いられている。専門的抗原提示細胞であるＤＣは、活発なＴ細胞応答を誘導するそれらの能力のため、そのような用途において一般的である。しかしながら、以下に報告されるように、ＬＶｓで形質導入されたＤＣは、未変性Ｔ細胞を活性化する能力の低下を示すことが発見された。ＬＶｓ形質導入の後、ＤＣは、ＩＬ−１０の上方調節およびＴ細胞同時刺激分子の下方調節を含めて、サイトカイン応答および表面マーカー発現の変化を示した。これらの知見と一致して、ＬＶｓで形質導入されたＤＣは、未変性Ｔ細胞をＴｈ１効果細胞に分極するそれらの能力が損なわれた−免疫療法およびワクチン用途におけるＬＶｓ形質導入ＤＣの使用を制限し得る効果。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要約
本発明は、ＤＣ機能のＬＶｓ誘導損傷を克服するための方法および組成物の発見に関する。本発明をなすにあたり、ＨＩＶ／レンチウイルス感染によって生じるＤＣ誘導Ｔ細胞機能不全を克服するため、可溶性サイトカインおよび免疫調節因子の適用を含む一連の免疫調節の方策が研究された。レンチウイルス免疫調節性ウイルスのような免疫調節因子をＤＣに送達することにより、ＨＩＶ（レンチウイルス）感染によって生じるＤＣおよびＴ細胞機能不全を矯正することができる。具体的には、ＤＣに、ＩＬ−７、ＩＬ−１２またはＩＬ−１０ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードするベクターを含むレンチウイルスで感染させることにより、損傷を受けたＴｈ１応答が回復する。この技術は、患者における治療、ワクチン接種またはベクター適用の間のＤＣのＨＩＶ感染に関連する免疫抑制の問題を克服するための明確な免疫療法用処方を提供する。
【０００６】
したがって、本発明は、レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列およびＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。ＩＬ−７、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される作用因子をコードするヌクレオチド配列を含む精製核酸が導入されている樹状細胞（例えば、レンチウイルスが感染しているもの）も本発明内にある。
【０００７】
本発明の別の側面は、樹状細胞のＴ細胞活性化能力を調節する方法を特徴とする。この方法は、樹状細胞と会合するＩＬ−７、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−１２の量を調節する工程を含む。例えば、この工程は、細胞と会合するＩＬ−７および／またはＩＬ−１２の量の増加、および／または細胞と会合するＩＬ−１０の量の減少を含むことができる。樹状細胞と会合するサイトカインの量の調節は、細胞を可溶性サイトカインと接触させること、可溶性サイトカインを細胞から除去すること、またはサイトカインをコードする精製核酸もしくはサイトカインの発現を減少させる作用因子（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンス核酸）を細胞に導入することによって達成することができる。
【０００８】
ここで用いられる、「核酸」という熟語は２つ以上のヌクレオチドの鎖、例えば、ＲＮＡ（リボ核酸）およびＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を意味する。「精製」核酸分子は、核酸が天然に生じる細胞または生物体内の他の核酸配列から実質的に分離または単離されているものである（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％混入がない）。この用語は、例えば、ベクターに組み込まれている組換え核酸分子、プラスミド、ウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムを含む。精製核酸の例には、ｃＤＮＡｓ、ゲノム核酸の断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成される核酸、ゲノム核酸の制限酵素処理によって形成される核酸、組換え核酸、および化学的に合成された核酸分子が含まれる。
【０００９】
ここで用いられる、「ベクター」という用語は、核酸および／またはウイルス粒子を輸送することができる構成要素、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターを指す。
【００１０】
特に定義されない限り、ここで用いられるすべての技術的用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術を有するものが通常理解するものと同じ意味を有する。分子生物学の用語の通常理解される定義は、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に見出すことができる。ウイルス学の用語の通常理解される定義は、Ｇｒａｎｏｆｆ ａｎｄ Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９９；およびＴｉｄｏｎａ ａｎｄ Ｄａｒａｉ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２に見出すことができる。微生物学の通常理解される定義は、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２に見出すことができる。
【００１１】
ここに記載されるものに類似するか、または等価である方法や物質は、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法や物質は以下に記載される。ここで言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それら全体の参照によって受け入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が支配するだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明は、ＤＣのＴ細胞活性化能力のＬＶ誘導損傷を克服するための方法および組成物を提供する。以下に記載される好ましい態様は、これらの組成物および方法の適用を説明する。それでもなお、これらの態様の記載から、本発明の他の側面は、以下に示される記載に基づいてなされ、および／または実施することができる。
【００１３】
生物学的方法
従来の分子生物学の技術を含む方法がここに記載される。そのような技術は一般に当該技術において公知であり、方法論の論文、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的に更新）に詳細に記載されている。核酸を化学的に合成するための方法は、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２，１９８１、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１において考察されている。核酸の化学的合成は、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置で行うことができる。免疫学的方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２に記載されている。遺伝子移動および遺伝子治療の従来の方法を本発明において用いるために適用することもできる。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），ｅｄ．Ｐ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９７；およびＲｅｔｒｏ−ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｃ．Ｐ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９６を参照のこと。
【００１４】
核酸／ＬＶｓ
本発明は、レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列および（例えば、ＬＶ誘導Ｔ細胞活性化損傷を克服する）ＤＣ機能調節の可能な作用因子をコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は、好ましくは、ＬＶの形態をとる。幾つかの異なる型のＬＶｓは、天然に生じるレンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）および他のものに基づくものが含まれることが知られている。米国特許第６，２０７，４５５号を参照のこと。本発明は、ＨＩＶ−１ベースのベクターを用いて記載されるが、他のレンチウイルスに由来する他のベクターもここに記載される情報を適用することによって用いることができる。多くの利点のため、ＨＩＶ−１ベースのベクターには遺伝子治療適用に対する備えがあり、これらが現時点で好ましい。
【００１５】
本発明のＬＶｓは、例えば制限された宿主細胞向性を克服するため、偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）されていてもよい。例えば、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）のウイルスエンベロープで偽型化されているＬＶｓを用いることができる。安全性を高めるため、自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＶを用いることもできる。例えば、ＳＩＮ ＬＶｓは、３’Ｕ３プロモーターを不活性化し、かつ宿主染色体への統合に重要である５’統合結合部位を除く全ての３’Ｕ３配列を欠失させることによって作製することができる。本発明のベクターの設計に特に好ましい構築体は図１に示されるｐＴＹＦである。
【００１６】
ＤＣ機能の調節が可能な作用因子をコードする第２ヌクレオチド配列は、ＩＬ−７またはＩＬ−１２（両者ともＬＶｓ誘導ＤＣ損傷を克服することがここで示される）のようなサイトカインをコードするものであり得る。ＩＬ−１２、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−７をコードするＬＶｓを含むレンチウイルスがＤＣ機能の調節（例えば、レンチウイルス感染ＤＣによる損傷Ｔｈ１応答の矯正）に用いられる。好ましいＬＶｓには、ｐＴＹＦ−ＩＬ−１２ビ−シストロンベクター、ｐＴＹＦ−ＩＬ１２−ＧＭ−ＣＳＦトリ−シストロンベクター、およびｐＴＹＦ−ＩＬ−７が含まれる。本発明の好ましいレンチウイルスはＬＶｓ ｐＴＹＦ−ＩＬ−１２ビ−シストロンベクター、ｐＴＹＦ−ＩＬ１２−ＧＭ−ＣＳＦトリ−シストロンベクター、およびｐＴＹＦ−ＩＬ−７を含み、かつそれらの宿主細胞向性を広範化するようにＶＳＶ−Ｇで偽型化されている（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｇａｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １，２３７−２５１，２００１；Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３（５），４６８−７５，２００１を参照）。
【００１７】
ここに記載される実験において用いられるウイルスベクター（および対応するウイルス）は、ＭＬＶベースおよびＳＩＮレンチウイルス（ＨＩＶ−１）ベースのベクターである。図１は、ＬＶｓ ｐＴＹＦ−ＣＤ８０、ｐＴＹＦ−ＣＤ８６、ｐＴＹＦ−Ｆｌｔ３−Ｌ、ｐＴＹＦ−ＩＬ−７、ｐＴＹＦ−ＣＤ４０Ｌ、ｐＴＹＦ−ＩＬ−１２、およびｐＴＹＦ−ＩＬ−１２／ＧＭＣＳＦの構造を示す。ＳＩＮ ＬＶｓをクローニングするための出発プラスミドはｐＴＹＦ、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）を特徴とするＳＩＮベクターである。ｃＰＰＴ配列の封入はウイルスベクターの活性を約３倍高めることが示されている。ＳＩＮ ＬＶｓは、３’短縮末端反復配列（ＬＴＲ）の後ろに挿入された、３’ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）も含む。これらのＳＩＮ ＬＶｓは幾つかのサイトカインをコードし、これにはＩＬ−１２、ＩＬ−１２プラスＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−７の他に、免疫調節分子、例えば、ＣＤ８０またはＣＤ８６（Ｌｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｈａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３８４−３９０、２００２；およびＣａｒｒｅｎｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ａａｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：２９−５３，２００２）およびＦｌｔ３−Ｌが含まれる。ウイルスベクター内に含まれるヒトサイトカインｃＤＮＡ配列は、ＲＴ−ＰＣＲにより、ヒト末梢血リンパ球から（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＩＬ−７）またはヒト腫瘍細胞（Ｆｌｔ３−リガンドに関してＴＥ６７１細胞）から増幅される。ＩＬ−１２遺伝子は２つの成分、ＩＬ−１２ＡおよびＩＬ−１２Ｂを有する。ＤＣ機能の調節において用いるには、両ＩＬ−１２成分のｃＤＮＡｓを、これら２つのｃＤＮＡの間にリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を伴って、ビ−シストロンベクターに同時にクローン化する。ｐＴＹＦ−ＩＬ−１２−ＧＭＣＳＦベクターについては、２つの異なるＩＲＥＳ要素をＩＬ−１２Ｂ／ＩＬ−１２ＡおよびＩＬ−１２Ａ／ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡｓの間に配置してトリ−シストロン発現ベクターを産生する。ウイルスベクター内の遺伝子はあらゆる適切なプロモーター（例えば、強力プロモーター、例えば、ヒト伸長因子１アルファ、ＥＦ１ａ）の制御の下に置くことができる。ｐＴＹＦベクターの構築については、Ｚａｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：７２０９−７２１９；およびＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：７１５−７２８を参照のこと。ＭＬＶベクター（および対応するウイルス）は、Ｚａｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７２０９−７２１９，２００２に記載されるように構築した。
【００１８】
組換えＬＶｓおよびビリオンの構築は、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９５：２４９９−２５０４，２０００；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：７１５−７２８，１９９９；Ｅｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：９１５０−９１５５，２０００；Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７，１９９６；Ｐａｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，９：７６７−７６８，１９９８；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３：１１８４２−１１８４７，１９９６；Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３：１５２６６−１５２７１，１９９６；およびＣｈｉｎｎａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９６：１３０９−１３１６，２０００において考察されている。ＳＩＮベクターの設計は、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−８１５７，１９９８；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０，１９９８；Ｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６１：１２０−１３２，１９９９；Ｍａｎｇｅｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８３０７−８３１５，２０００；および Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：４３９−４４７，２０００に記載されている。
【００１９】
樹状細胞
本発明は、免疫調節性作用因子、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を有する精製核酸が導入されているＤＣを提供する。用いることができるＤＣには、哺乳動物ＤＣ、例えば、マウス、ラット、モルモット、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他のサル（ａｐｅ および ｍｏｎｋｅｙ）種）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、およびヒトから誘導されるものが含まれる。ＤＣは、哺乳動物被検体内のもの（すなわち、イン・ビボ）であっても、イン・ビトロ培養物中のもの（例えば、被検体への生体外送達のためにイン・ビトロで培養されるもの）であってもよい。本発明によるＤＣは、免疫調節性作用因子、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を有する精製核酸を含む。好ましいＤＣにおいては、この核酸が発現し、ポリペプチドまたはＲＮＡを生じる。
【００２０】
ＤＣはあらゆる適切な供給源から得ることができ、これには皮膚、脾臓、骨髄、もしくは他のリンパ系器官、リンパ節、または血液が含まれる。好ましくは、ＤＣは、本発明における使用のため、血液または骨髄から得られる。典型的には、ＤＣは、外来性顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４での刺激の後、骨髄および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる。骨髄細胞からＤＣを得る方法およびＤＣを培養する方法は、Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２，１９９２；および Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０：２４７−２５３，２００２に記載されている。造血性前駆細胞（Ｍｏｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２０：２５６−２６５，２００３）および単球（Ｎｏｕｒｉ−Ｓｈｉｒａｚｉ ａｎｄ Ｇｕｉｎｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７４：１０３５−１０４４，２００２）からＤＣを培養するための方法も当該技術分野において公知である。ＤＣを産生するための大規模単球濃縮手順の一例がＰｕｌｌａｒｋａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６７：１７３−１８３，２００２）に記載されている。ＤＣは、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析においてＤＣ特異的マーカーを用いて、異種細胞試料から単離することができる（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｌｉｐｓｋｙ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４０１６−４０２８，１９９４；Ｃａｎｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８８：４２１５−４２２８，１９９６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９５：２３３７−２３４５，２０００）。未成熟ＤＣは、同時刺激分子、ＣＤ８０／８６、ＣＤ４０の低レベル発現；Ｔ細胞活性を誘導する能力の低さ；ＩＬ−１２ｐ７０を産生する能力のなさ；および調節性もしくは反応不顕性Ｔ細胞を誘導する可能性を特徴とする。これと比較して、成熟ＤＣはＩＬ−１２ｐ７０を産生し、高レベルのＭＨＣクラスII抗原、ＣＤ８０／８６、およびＣＤ４０、ＩＬ−１２ｐ７０産生を発現する。単離ＤＣだけではなくＤＣを含む細胞の集団も、ＤＣの成長および増殖を許容するあらゆる適切なイン・ビトロ培養法を用いて、培養することができる。
【００２１】
ＤＣ機能の調節
本発明はＤＣ機能を調節するための方法も提供する。ＤＣは未変性Ｔヘルパー細胞を刺激し、異なる免疫応答を仲介するＩＦＮ−ガンマ−産生Ｔｈ１またはＩＬ−４−産生Ｔｈ２効果細胞のいずれかに分化させる。Ｔｈ応答の歪みはＬＶｓでのＤＣの形質導入から、およびレンチウイルスでの感染によって生じる。特には、レンチウイルス形質導入およびレンチウイルス感染ＤＣがＴｈ１応答の損傷およびＩＬ−４−産生Ｔｈ２応答の増強に向かう未変性Ｔｈ細胞の分化を促す。本発明の組成物および方法は、ＤＣにサイトカイン（例えば、免疫原）を提供することによってＤＣの免疫賦活能力を改善する（例えば、Ｔｈ１応答を回復する）のに用いることができる。適切なサイトカインの例にはＩＬ−１２およびＩＬ−７が含まれる。Ｔｈ１応答を増強する他のサイトカインも本発明において用いることができる。
【００２２】
ＤＣ機能（例えば、Ｔｈ１応答を回復する）を調節するため、ＤＣ細胞を、レンチウイルスから誘導されるヌクレオチド配列およびレンチウイルスから誘導されない少なくとも１つの導入遺伝子を含む精製核酸を含有するＬＶと接触させる。この導入遺伝子は、Ｔｈ１応答を増強するいかなるサイトカインであってもよく、これにはＩＬ−１２およびＩＬ−７が含まれる。
【００２３】
ＤＣ機能の調節の一例においては、ＤＣを、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２プラスＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−７をコードするベクターを含むレンチウイルスに感染させる。この例においては、未成熟ＤＣをＭｏｃｋ（２９３Ｔ上清）、ＴＹＦ−ＰＬＡＰ、ＴＹＦ−ＩＬ−１２、ＴＹＦ−ＩＬ１２−ＧＭ−ＣＳＦ、またはＴＹＦ−ＩＬ−７に感染させる。ＬＰＳ（８０ｎｇ／ｍｌ）プラスＴＮＦ−アルファ（２０ｕ／ｍｌ）で２４時間成熟させた後、ＤＣを収穫し、未変性ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共に１：２０のＤＣ／Ｔ比で同時培養する。同時培養の５日後、Ｔ細胞をＩＬ−２（２５ｕ／ｍｌ）の存在下でさらに７日間増殖させる。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下でイオノマイシンおよびＰＭＡでの再刺激の６時間後に細胞内ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−４染色することにより、Ｔｈｉ、Ｔｈ２およびＴｈ０集団を測定する。免疫調節性分子、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−７をコードするＬＶｓは、レンチウイルス感染ＤＣによる損傷Ｔｈ１応答を有効に矯正する。
【００２４】
被検体における免疫応答の調節
被検体における免疫応答を増加および減少させるための組成物および方法は、多くの異なる障害を治療するための様々なＤＣベースの免疫療法策において用いることができる。成熟ＤＣは、Ｔ細胞応答を開始する（例えば、細胞毒性Ｔリンパ球の誘導）ための組織化リンパ組織への抗原輸送に有効に介在する、鍵となる抗原提示細胞集団である。ＤＣの正常機能はＴ細胞に抗原を提示することであり、次にそれはその抗原源を特異的に認識して最終的に排除する。ＤＣは、癌および感染性疾患のための治療用および予防用ワクチンの両者として用いられる。そのようなワクチンは、強力な細胞性免疫応答を誘発するように設計される。ＤＣ生物学、ＤＣへの遺伝子移動、およびＤＣ免疫療法は、Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ ａｎｄ Ｐｉｓａ，Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．１９：１９７−２１１，２００２；Ｈｅｒｒｅｒａ ａｎｄ Ｐｅｒｅｚ−Ｏｔｅｙｚａ，Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｅｓｐ．２０２：５５２−５５４，２００２；および Ｏｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１１：６４５−６６０，２００２において概説されている。
【００２５】
細胞毒性および１型ヘルパー（Ｔｈ１）細胞応答の誘導は慢性感染性疾患または癌を標的とするワクチンにとって非常に望ましい（Ｐ．Ｍｏｉｎｇｅｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８：１８９−１９８，２００２）。Ｔｈ１細胞およびそれらの作用を上方調節するインターロイキンを発現する改変ＤＣは病原に対する耐性を高めるのに用いることができる（Ｊ．Ｗ．Ｈａｄｄｅｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６：７０３−７１０，１９９４）。ＨＴＶ感染の治療には、例えば、ＤＣは、ＨＩＶ特異的免疫が開始および増強されるように、生体外および生体内の両者で標的される（Ｐｉｇｕｅｔ ａｎｄ Ｂｌａｕｖｅｌｔ Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１９：３６５−３６９，２００２）。
【００２６】
ＨＩＶ治療に加えて、本発明の改変ＤＣは、癌免疫治療において用いることができる。第２のリンパ系器官および休止している未変性Ｔ細胞に腫瘍抗原を提示するように操作されているＤＣは腫瘍特異的Ｔ細胞の産生に有用である（Ａ．Ｆ．Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１０４３−１０５５，２００２）。例えば、ミエローマ関連抗原を発現するように改変されたＤＣは複数のミエローマの抗癌療法として有用である（Ｂｕｃｈｌｅｒ ａｎｄ Ｈａｊｅｋ Ｍｅｄ． Ｏｎｃｏｌ． １９：２１３−２１８， ２００２）。特定のサイトカインまたはケモカインを発現するＤＣは、実質的に改善された成熟状態、イン・ビボで第２のリンパ系器官に移動する能力、およびイン・ビボで腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激して腫瘍免疫を誘導する能力を提示することが示されている。したがって、サイトカインを発現するように改変されているＤＣは、腫瘍免疫の誘導に有用であり、腫瘍抗原を発現するように改変されているＤＣと組み合わせて用いられる。癌免疫療法におけるＤＣの治療上の役割は、Ｌｅｍｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８７：６２−６６，２００２；Ａ．Ｆ．Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１０４３−１０５５，２００２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１７：６０１−６１９，２００２；Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：２６５−２７３，１９９８；Ｄ．Ａｖｉｇａｎ，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１３：５１−６４，１９９９、およびＳｙｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１０：６０１−６０８，２００１において概説されている。
【００２７】
ＤＣベースのワクチン方策の一例においては、免疫源をコードするＬＶは、ＤＣの改変に用いられ、これはその免疫源の発現および休止している未変性Ｔ細胞へのその提示が生じる。そのような抗原提示策は単独で、または、広範な免疫応答を誘発するため、組み合わせて混合免疫化療法の一部として用いることができる。患者へのＤＣの送達を含む免疫化の異なる方策が、Ｏｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１１：６４５−６６０，２００２に記載されている。
【００２８】
改変ＤＣは、自己免疫障害（例えば、関節炎、喘息、アトピー性皮膚炎）を治療するためのＴ細胞（Ｔｈ１および／またはＴｈ２）応答の調節に用いることもできる。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞のバランスは多くの自己免疫障害において重要なものである。Ｔｈ１細胞活性は関節リウマチおよびインシュリン依存性糖尿病の患者の関節において優勢であり、それに対してＴｈ２細胞優勢応答は、アトピー性障害（例えば、アレルギー）、器官特異的自己免疫疾患（１型糖尿病および甲状腺疾患）、クローン病、同種移植拒絶（例えば、急性腎臓同種移植拒絶）、および幾つかの説明されていない再発性流産の病因に関与する（Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８５：９−１８，２０００）。同種移植拒絶は、宿主免疫系が同種非自己抗原を検出したときに生じる。同種移植拒絶を予防または治療するため、改変ＤＣを組織特異的抗原に対する寛容性の誘導に用いることができる（Ｂ．Ａｒｎｏｌｄ Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１０９−１１４，２００２）。免疫抑制性分子を発現するＤＣも同種移植拒絶の治療として用いることができる（Ｌｕ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７３：Ｓ１９−２２，２００２）。
【００２９】
改変ＤＣは、さらに、微生物病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、およびぜん虫）に対する免疫応答の誘導に用いることができる。例えば、微生物病原体から誘導されるペプチド抗原を発現するようにＤＣを改変することができる。そのようなＤＣによる抗原の提示はその病原体に対する活発な免疫応答を刺激し得る。
【実施例】
【００３０】
本発明を以下の具体的な例によってさらに説明する。これらの例は説明のためだけに提供されるものであり、いかなる意味においても本発明の範囲または内容を制限するものと解釈されるべきではない。
【００３１】
（実施例１）−材料および方法
単球誘導樹状細胞の産生。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、従来記載されるように（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１１：１５７−１６９，１９９５）、健常ドナーのバフィーコート（Ｃｉｖｉｔａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＦＬ、ＵＳＡ）から Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）における勾配密度遠心によって単離した。ＤＣをＰＢＭＣから、Ｔｈｕｍｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：１−１５，１９９９）に従い、以下の改変を施して調製した。第０日に、ウェル当たり５００万個のＰＢＭＣを１２ウェル培養プレート内の血清非含有ＡＩＭ−Ｖ培地に播種した。３７℃で１時間インキュベートした後、非接着細胞を穏やかに洗い流し、残留する接着単球細胞をＡＩＭ−Ｖ培地において第１日までさらに培養した。緩やかに接着する細胞を乱さないように培養培地を慎重に除去し、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（５６０ｕ／ｍｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．Ｆｌａｎｄｅｓ ＮＪ）およびＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する新たなＡＩＭ−Ｖ培地（ウェル当たり１ｍｌ）を添加して細胞を３７℃、ＣＯ２５％下、インキュベーター内で培養した。第３日に、ＧＭ−ＣＳＦ（５６０ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有する１ｍｌの新鮮なＡＩＭ−Ｖ培地を培養物に添加した。第５日に、非接着細胞を穏やかなピペット処理によって収穫した。洗浄後、ＤＣを後に使用するために凍結するか、または直ちに使用した。
【００３２】
未成熟ＤＣのレンチウイルス形質導入およびＤＣ成熟。第５日に、未成熟ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ（５６０ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）を補足した２００ｕｌの培地を収容する２４ウェルプレートにおいて、ウェル当たり５×１０５で平板培養した。ＤＣの形質導入は、濃縮ＬＶｓを細胞に５０−１００の感染効率（ＭＯＩ）で添加することによって行った。それらの細胞を３０分毎に穏やかに振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした後、１ｍｌのＤＣ培地を添加し、その培養物をウイルスベクターと共にさらに１２時間インキュベートした。リポ多糖（ＬＰＳ）を最終濃度８０ｎｇ／ｍｌで、且つＴＮＦ−アルファを最終濃度２０ｕ／ｍｌで、ＤＣ培養物に２４時間添加することによって、ＤＣ成熟を誘導した。２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＡＩＭ−Ｖ培地と共に３７℃、ＣＯ２５％下、インキュベーター内で２０分間インキュベートした後、成熟ＤＣを収穫した。細胞を３回洗浄し、次の実験に用いた。
【００３３】
抗体染色およびフローサイトメトリー。フローサイトメトリーによって細胞表面マーカーの発現を分析するため、ＤＣを正常マウス血清と共に１０分間、次いで、ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｔｕｌ４９、マウスＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣ標識、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＴＵ３６、マウスＩｇＧ２ｂ、ＦＩＴＣ標識、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＣＤ１ａ（ＨＩ４９、マウスＩｇＧ１ｋ、ＡＰＣ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８０（Ｌ３０７．４、マウスＩｇＧ１ｋ、Ｃｙｃｈｒｏｍｅ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８６（ＲＭＭＰ−２、ラットＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣ標識、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＩＣＡＭ−１（１５．２、ＦＩＴＣ標識、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（ｅＢ−ｈ２０９、ラットＩｇＧ２ａ，ｋ、ＡＰＣ標識、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１１ｃ（Ｂ１ｙ−６、マウスＩｇＧ１、ＰＥ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ４０（５Ｃ３、マウスＩｇＧ１，ｋ、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ１２３（マウスＩｇＧ１、ｋ、ＰＥ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８３（ＨＢ１５ｅ、マウスＩｇＧ１，ｋ、Ｒ−ＰＥ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含む、蛍光色素結合抗ヒトモノクローナル抗体と共に３０分間インキュベートした。対応するイソ型対照抗体も各染色条件に含めた。２回の洗浄の後、細胞をＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドに再懸濁させて固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣＥＬＬＱＵＥＳＴプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。前方および測方光散乱特性によって生細胞を通過させ、陽性細胞のパーセンテージおよび集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。
【００３４】
ＲＮＡの単離、標識およびアレー・ハイブリダイゼーション。レトロウイルスまたはアデノウイルスベクターに感染させた後、細胞を収穫してＴｒｉｚｏｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で溶解した。製造者のプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従い、全ＲＮＡを単離して標識し、Ａｔｌａｓ Ａｒｒａｙフィルターへのハイブリダイゼーションの準備を行った。ハイブリダイゼーションは１５ｕｇの標識ｃＤＮＡ産生物を用いて一晩行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、アレーフィルターを、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ ４８６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて走査し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｔｌａｓ Ａｒｒａｙ 画像解析ソフトウェアを用いて定量的に解析した。
【００３５】
ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の半定量および定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＤＣをＬＶｓで形質導入し、上述のように成熟させた。Ｔｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔを用いて全ＲＮＡを精製した。半定量ＲＴ−ＰＣＲについては、標準一工程ＲＴ−ＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のプライマー並びにヒトＧＡＰＤＨの対照プライマーを用いて行った。定量ＲＴ−ＰＣＲ分析については、ＤＣの全ＲＮＡをＴｒｉｒｅａｇｅｎｔキットを用いて単離し、オリゴ−ｄＴおよびＡＭＶ逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡに転写し、かつリアルタイムＲＴ−ＰＣＲをＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ ７０００ ＰＣＲサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で行った。ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１０、ＧＡＰＤＨの確証済みＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ（６ＦＡＭ標識）はＡＢＩから購入した。ＰＣＲ混合物は製造者の使用説明書（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＡＢＩ）に従って調製し、サーマルサイクラーの条件は以下の通りであった：１×９５℃ １０分、４０−５０サイクル変性（９５℃ １５秒）および一体化したアニーリング／伸長（６０℃ １分）。試料のサイクル閾値を、連続希釈した標準と比較することにより相対的定量を行った。
【００３６】
未変性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の調製。ＣＤ４＋ Ｔ細胞単離Ｒｏｓｅｔｔｅカクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる陰性選択により、ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＰＢＭＣから製造者の使用説明書に従って調製した。簡潔に述べると、無菌２００ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ遠心管において、４５ｍｌバフィーコート（約５×１０８ＰＢＭＣ）を２．２５ｍｌ ＣＤ４＋ Ｔ細胞濃縮Ｒｏｓｅｔｔｅカクテルと共に２５℃で２５分間インキュベートした。その後、２％ＦＢＳを含有する４５ｍＬのＰＢＳを添加してバフィーコートを希釈した。穏やかに混合した後、３０ｍｌの希釈バフィーコートを５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ管内の１５ｍＬ Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅの頂部に移して層を形成させ、１，２００ｇで２５分間遠心した。非ロゼット化細胞をＦｉｃｏｌｌ界面で収穫してＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、カウントして将来的な使用のために液体窒素中に分割単位で凍結保存した。単離ＣＤ４＋ Ｔ細胞の純度は一貫して９５％を上回った。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ未変性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−細胞の陰性選択に基づき、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）磁気アフィニティカラムを用いて製造者の使用説明書に従って精製した。
【００３７】
Ｔｈ機能のイン・ビトロ誘導および細胞内サイトカイン染色。イン・ビトロＤＣ：Ｔ細胞同時培養法は、Ｃａｒｏｎ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６７；３６８２−３６８６，２００１）に従った。簡潔に述べると、精製未変性ＣＤ４ Ｔ細胞を同種成熟ＤＣと共に異なる比（２０：１ないし１０：１）で血清非含有ＡＩＭ−Ｖ培地において同時培養した。第５日に５０ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を添加し、培養物を増殖させて３週間まで毎日ｒｈＩＬ−２含有ＡＴＭ−Ｖ培地を供給した。第１２日の後、静止状態のＴ細胞を洗浄し、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌまたは０．０１６２ｕＭ）およびイオノマイシン（１ｕｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で５時間再刺激した。培養の最後の２．５時間にＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（１．５ｕｇ／ｍｌ）を添加した。その後、細胞を固定し、透過化し、ＦＩＴＣ標識抗−ＩＦＮ−γおよびＰＥ標識抗−ＩＬ−４ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において分析した。
【００３８】
ＤＣ介在混合リンパ球反応（ＭＬＲ）。ウェル当たり１０，０００細胞ないしウェル当たり３１３細胞の、ＤＣの連続希釈を１×１０５同種ＣＤ４ Ｔ細胞と共に９６ウェルＵ底プレートにおいて合計２００ｕｌで５日間培養した。Ｔ細胞の増殖を、２０ｕｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６溶液を製造者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って各ウェルに添加することにより監視し、４９０ｎｍでのＯＤ読み取り値を得た。
【００３９】
ＬＶｓ構築および産生。プラスミド構築。この研究に用いられるオンコレトロウイルス（ＭＬＶ）およびＬＶｓ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１ ＳＩＮ）は、従来記載される通りに構築した（Ｚａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７２０９−７２１９，２００２）。すべてのＨＩＶ−１ ＳＩＮベクター（ｐＴＹ）は、３’短縮末端反復配列（ＬＴＲ）の後ろに挿入された３’ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）を有する。ＮｏｔＩ消化ｐＨＥＦを、ＵＦ Ｐｏｗｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＣｅｎｔｅｒのＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅから入手したヒト化ｅＧＦＰ構築体から誘導されたＮｏｔＩ消化ｅＧＦＰ断片とライゲートすることにより、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）発現プラスミド、ｐＨＥＦｅＧＦＰを構築した。ｐＴＶｄｌ．ＥＦｅＧＦＰに由来するｅＧＦＰ断片（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ）をｐＴＹＥＦｎｌａｃＺに挿入し、核ｌａｃＺ（ｎｌａｃＺ）遺伝子を置換することによってｐＴＹＥＦｅＧＦＰを作製した。ｐＴＶｄｌ．ＥＦｎｌａｃＺのｎｌａｃＺ断片（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ）をｐＨＥＦｅＧＦＰから単離されたｅＧＦＰ断片（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ）で置換することにより、ｐＴＶｄｌ．ＥＦｅＧＦＰを産生した。ＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ構築体はｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づくもので、サイトメガロウイルス最初期プロモーターがヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターで置換されていた。サイトカイン遺伝子またはＴ細胞同時刺激遺伝子を発現するレンチウイルスベクターは、これらの遺伝子をコードするｃＤＮＡをｐＴＹＦ−ＥＦ形質導入ベクター内の上記のようにＥＦ１αプロモーターの後ろに挿入することによって構築した。
【００４０】
（実施例２）−結果
ウイルス形質導入後の細胞性応答のｃＤＮＡマイクロアレー分析。ウイルス形質導入に対する細胞応答を、ＨＩＶ−１（ＬＶｓ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびアデノウイルス（Ａｄ）ベクターを含む異なるウイルスベクターを一次ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において比較することによって分析した。ＨＩＶ−１およびＭＬＶベクターの両者はＤＮＡ同時形質移入によって調製され、従来記載されるように（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｇａｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１：２３７−２５１，２００１；Ｚａｉｓｓ ｅｔ ａｌ、前出）、ウイルス遺伝子はベクターゲノム内に含まれていなかった。Ａｄベクターは、アデノウイルス遺伝子の大部分を含むＥｌＡ欠失ベクター系に基づくものであった（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｖｏｌ．７，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，ｐｐ．１０９−１２８，１９９１）。ＨＵＶＥＣは少継代（＜５）で維持し、２−３の感染効率（ｍｏｉ）で形質導入した。細胞および導入遺伝子のパッケージ化から生じる可変性を最少化するため、この研究において用いられる３種類全てのウイルスベクターは、ｌａｃＺレポーター遺伝子を担持し、かつ２９３細胞において産生された。ＨＵＶＥＣの細胞性応答は、１，１７６ヒトｃＤＮＡ、９つのハウスキーピング対照ｃＤＮＡおよび陰性対照を各々含む、４つのＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｈｕｍａｎ Ａｔｌａｓ Ａｒｒａｙ １．２ブロットの組を用いて研究した。
【００４１】
ＨＵＶＥＣをｍｏｃｋ（対照２９３上清）、ＬＶｓ、ＭＬＶおよびＡｄベクターで形質導入した。感染の２４時間後に全ポリＡ＋ＲＮＡを収穫し、逆転写酵素によって３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識して、４つの同一のＣｌｏｎｔｅｃｈ Ａｔｌａｓ Ｈｕｍａｎ Ａｒｒａｙ １．２ ｃＤＮＡブロットにハイブリダイズさせた。それらの結果をＣｌｏｎｔｅｃｈ ＡｔｌａｓＩｍａｇｅ １．５ソフトウェアおよび対比較を用いて解析した。上方または下方調節された遺伝子を、２倍を上回るか、または１０，０００シグナル強度を上回るあらゆる登録された変化からソフトウェアを用いて任意に決定し、視認比較によって確認した。これらの結果をＣｌｏｎｔｅｃｈによって任意に設定された６つの遺伝子プール群にまとめた：細胞サイクルおよび癌遺伝子、シグナル伝達、アポトーシスおよびＧＴＰａｓｅ、転写および表面シグナル伝達、接着−受容体−ケモカイン、並びにストレス応答−インターロイキン−インターフェロン。下記表１を参照のこと。ＬＶｓはＭＬＶおよびＡｄベクターよりも転写および表面シグナル伝達遺伝子を強化するものと思われ、かつ、興味深いことに、免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０が、ＭＬＶおよびＬＶｓ形質導入の後に上方調節された。
【００４２】
表１．ＨＵＶＥＣにおける遺伝子発現に対するウイルス形質導入の効果。６種類の任意に定義された機能的遺伝子を、上方調節（↑）、下方調節（↓）または不変（−）で示される遺伝子発現における変化の重なりと共に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ＬＶｓ形質導入後のＤＣ表面マーカー発現の分析。異なる抗体およびフローサイトメトリーを用いるＬＶｓ形質導入後のＤＣ上の表面マーカー発現。末梢血単球（ＰＢＭ）誘導未成熟ＤＣを、ｍｏｃｋ（対照２９３上清）、空のＬＶｓ粒子（ウイルスゲノムなしにＨＩＶ−１キャプシドおよびＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む粒子）、ＬＶｓ、およびＭＬＶを含むベクターで形質導入した。ベクター粒子内に存在するウイルスタンパク質がＤＣ表現型の変化を誘導するかどうかを見るため、空のＬＶｓも試験した。ＬＰＳプラスＴＮＦ−αで２４時間処理した後、ＤＣを抗体染色およびフローサイトメトリーのために収穫した、これらの結果を表２にまとめる。試験した表面分子のうち、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１およびＤＣ−ＳＩＧＮは、ＬＶｓ形質導入後に下方調節されたが、空のＬＶｓまたはＭＬＶを用いたときにはされなかった。ＰＬＡＰまたはＣｒｅレポーター遺伝子を担持する異なるＬＶｓの調製品を試験したとき、同じ結果が得られた。
【００４５】
【表２】
結果はフローサイトメトリー後の幾何平均蛍光として示される。アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定による差の有意性を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【００４６】
ＬＶｓ形質導入損傷ＤＣ介在Ｔｈ１免疫。ヒトＤＣおよび未変性Ｔ細胞を用いるイン・ビトロＤＣ機能アッセイを行った。ＤＣをＰＢＭから培養においてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で産生し、ＰＢＭ誘導第５日（ｄ５）ＤＣを、ＰＬＡＰレポーター遺伝子を担持するＬＶｓで感染させた。感染したＤＣをＰＬＡＰ活性について第７日に分析した。この条件下で、９０％を上回るＤＣが、ｍｏｉ〜３０−８０においてＬＶｓで形質導入された。ＩＬ−１０の発現がＬＶｓ感染後のＤＣにおいて影響を受けるかどうかをみるため、第５日ＤＣをＬＶｓで感染させ、そのＤＣを第６日にＬＰＳで処理し、翌日にＩＬ−１０の発現について、抗−ＩＬ−１０モノクローナル抗体およびフローサイトメトリーを用いる細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）によって分析した。ＨＵＶＥＣのＬＶｓ形質導入と同様に、ＤＣにおけるＩＬ−１０の上方調節がＬＶｓ感染後に観察された。
【００４７】
ＬＶｓ感染後のＤＣの機能をさらに特徴付けるため、未変性ＣＤ４＋ Ｔ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製し、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳ誘導成熟後の同種ＰＢＭ誘導ＤＣと共に同時培養した。第５日にこれらのＤＣにＬＶｓまたはＭＬＶを感染させ、誘導して成熟させ、未変性ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共に同時培養した。これらのＴ細胞を増殖させ、ＤＣプライミングの後に７日にわたって休止させた。Ｔｈ応答を分析するため、休止Ｔ細胞を第７日および第９日にイオノマイシンおよびＰＭＡとの同時培養の後に再活性化し、上述のようにＩＦＮ−γおよびＩＬ−４に対する抗体を用いる細胞内染色（ＩＣＣＳ）を施した。これらの結果は、ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ１細胞集団が、対照についての第７日の７２％および第９日の７５％から、ＬＶｓ形質導入ＤＣについての第７日の２７％および第９日の２２％まで劇的に減少し、これに対してＴｈ２集団は不変のままであったことを示した。同様ではあるが著しさでは劣る効果がＭＬＶ形質導入ＤＣについて観察された。
【００４８】
免疫調節性遺伝子をコードするＬＶｓによるＤＣ免疫の改変。ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６のｃＤＮＡを図１に示されるようにＬＶｓにクローン化した。ＤＣを、レポーター遺伝子（ＬＶ−ＰＬＡＰ）、ＣＤ８０ ｃＤＮＡ（ＬＶ−ＣＤ８０）またはＣＤ８６ ｃＤＮＡ（ＬＶ−ＣＤ８６）を担持するＬＶｓで形質導入し、１２時間後にＬＰＳおよびＴＮＦ−αで処理した。形質導入ＤＣを、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現について、抗−ＣＤ８０および抗−ＣＤ８６抗体を用いるフローサイトメトリーによってＬＶｓ形質導入の３６時間後に分析した。ＣＤ８０およびＣＤ８６発現の両者とも、ＬＶ−ＰＬＡＰ感染の後、ＣＤ８０については４１％から３５％に、ＣＤ８６については６１％から４９％に減少した。しかしながら、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、ＣＤ８０（３５％から４４％）およびＣＤ８６（４９％から７６％）をコードするＬＶｓでの形質導入の後に、それぞれ、上方調節された。
【００４９】
他の実験においては、ｍｏｃｋ、ＬＶｓ−ＰＬＡＰ、ＬＶｓ−ＰＬＡＰプラスＬＶｓ−ＣＤ８０またはＬＶｓ−ＰＬＡＰプラスＬＶｓ−ＣＤ８６で形質導入したＤＣを未変性ＣＤ４ Ｔ細胞と共に同時培養した。８日後、Ｔ細胞を再活性化し、上述のように抗−ＩＬ−４および−ＩＦＮ−γ抗体を用いてＩＣＣＳおよびフローサイトメトリーによって分析した。それらの結果は、ＬＶｓ形質導入の後、Ｔｈ１集団が２４％から１３％に減少したことを示し、この損傷はＤＣにおけるＣＤ８０およびＣＤ８６の上方調節によっては矯正することができなかった（それぞれ、１３％から１２％および１３％）。
【００５０】
他の実験においては、可溶性ＩＬ−１２および／またはＦＬをＤＣ培養に補足することによってＤＣのＴｈ１活性化機能を強化できるどうかを研究し、ここで、これらのサイトカインはウイルス形質導入およびＤＣ：Ｔ細胞同時培養を通して個別に、または一緒にＤＣ培養に添加された。同時培養したＴ細胞を、Ｔｈ分析のため、第６日および第７日に再活性化した。ＩＬ−４およびＩＮＦ−α ＩＣＣＳによるＴ細胞の第６日および第７日分析の両者の結果は、ＬＶｓ感染後のＴｈ１応答の損傷を確認した（それぞれ、３７．５％および２０％から１５．６％および１０％）。しかしながら、外来性ＩＬ−１２のみの補足はＴｈ１応答の損傷を部分的に矯正し（それぞれ、１５．６％および１０％から、ＩＬ−１２単独について１９．１％および１１．７％、ＩＬ−１２＋ＦＬについて１８．７％および１３．２％）、ＦＬ単独には効果がなかった（それぞれ、１５．６％および１０．０％から１４．６％および８．８％）。より高濃度の可溶性ＩＬ−１２を用いる他の実験においては、Ｔｈ１応答の損傷は完全に矯正された。
【００５１】
重要なサイトカインの強化された内在性発現でＤＣを操作するため、ＦＬ、ＩＬ−７、ＣＤ４０Ｌ、ビ−シストロン性ＩＬ−１２、およびトリ−シストロン性ＩＬ−１２／ＧＭ−ＣＳＦを含む異なるサイトカインをコードするＬＶｓを構築して試験した（図１）。ＤＣを、レポーター遺伝子のみを担持するＬＶｓで形質導入し、または異なるサイトカインを発現するＬＶｓと共に同時形質導入した。ＬＶｓ形質導入ＤＣのＴｈ機能は、ＤＣ：Ｔ細胞同時培養アッセイによって研究し、１２日後にＴ細胞を上述のように再活性化してＩＣＣＳおよびフローサイトメトリーによって分析した。それらの結果は、ＬＶｓレポーターベクター形質導入単独がＴｈ１発生の減少を導くことを示した（５４．６％から３７．７％）。しかしながら、ビシストロン性ＩＬ−１２、トリシストロン性ＩＬ−１２／ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−７をコードするＬＶｓとのＤＣの同時形質導入は、それぞれ３７．７％から５６．２％、５６．２％および５０．７％に、Ｔｈ１応答を有効に増強した。他の免疫調節性遺伝子、例えば、ＦＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＣＤ４０ＬをコードするＬＶｓは、いかなる矯正効果をも示さなかった。
【００５２】
ＩＬ−１０を標的とする小妨害性ＲＮＡを発現するＬＶｓによるＤＣ機能の調節。ＩＬ−１０を標的とする小妨害性ＲＮＡをコードするＬＶｓを構築した。ＩＬ−１０ ｍＲＮＡにおける２つの領域をＲＮＡ妨害標的部位に選択した（図２）。ｓｉＲＮＡ発現カセットをヒトＨ１ ｐｏｌIIIプロモーターによって駆動させ、ＬＶｓに逆方向にクローン化した。このＬＶ−ｓｉＲＮＡベクターは、力価測定を可能にするためのｐｏｌIII ｓｉＲＮＡに隣接したｎｌａｃＺレポーター遺伝子を持っている。ＤＣをレポーターＬＶｓおよびＩＬ−１０を標的とするＬＶｓ−ｓｉＲＮＡで同時形質導入した後、ＩＬ−１０の発現について上述のようにＬＰＳ処理およびＩＣＣＳの後に分析した。これらの結果もまた、ＬＶｓ形質導入単独は、ＩＬ−１０の発現を上方調節し、それに対してＩＬ−１０を標的とするＬＶ−ｓｉＲＮＡとの同時形質導入は、ＩＬ−１０の発現を下方調節した。次に、これら２つのＩＬ−１０ ＬＶｓ−ｓｉＲＮＡ構築体をＬＶｓ−同時形質導入およびＤＣ：Ｔ同時培養Ｔｈ１機能アッセイにおいてＬＶｓ−ＩＬ−７と比較した。同時培養未変性Ｔ細胞を活性化し、２０日間休止させた後、再活性化およびＴｈサイトカイン分析を行った。ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ ＩＣＣＳの結果は、ＩＬ−１０ ＬＶｓ−ｓｉＲＮＡベクターが両者ともＴｈ１応答を増強し、＃２ ＩＬ−１０ ＬＶｓ−ｓｉＲＮＡがＬＶ−ＩＬ−７に匹敵するか、もしくはそれを上回るレベルのＴｈ１応答の増強を示すことを立証した。これは、別のＴｈ１サイトカインＴＮＦα ＩＣＣＳの分析でさらに検証された。
【００５３】
他の態様
本発明をそれらの詳細な説明と共に記載したが、上述の記載は説明を目的とするものであり、添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。例えば、ＬＶ誘導ＤＣ損傷を克服する作用因子は、非レンチウイルス法を用いて、例えば、他のウイルスベクターまたは非ベクターベースの方法を用いて標的ＤＣに導入することができる。他の態様、利点、および変形は以下の請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明において用いられる様々なベクター構築体を示す高度に模式化された図である。
【図２】ＩＬ−１０ ＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡを示す高度に模式化された図である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２００２年１１月７日出願の、「樹状細胞機能の調節」（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．）と題する米国仮出願第６０／４２４，６０２号の優先権を主張する。
連邦の援助を受けた研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた認可番号Ｐ５０ ＨＬ５９４１２の下、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
技術分野
本発明は分子生物学、遺伝子治療、免疫学、およびウイルス学の分野に関連する。特には、本発明は、レンチウイルスベクター（ＬＶｓ）で樹状細胞に形質導入して樹状細胞の機能を調節するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなＬＶｓは動物における疾患に関連するが、外来性核酸を宿主細胞に移動させるそれらの能力は疾患を治療するように設計された遺伝子治療実験に活用されている。遺伝子治療適用に対しては、ＬＶｓは他のベクターを上回る幾つかの利点を提供する。例えば、ＨＩＶから誘導されるＬＶｓは、分裂性および非分裂性細胞の両者に感染する能力を含めて、野生型ウイルスのものに類似する細胞侵入およびゲノム統合プロセスに従事する。分裂および非分裂細胞の両者に感染する利点は、ＬＶｓを従来のオンコレトロウイルスベクターと比較して非常に一般的な遺伝子移動媒体とする。効率的な統合、広範な宿主細胞向性および低い組織特異性は、ＬＶｓをアデノ随伴ウイルスベクターのような他のベクターよりも効率的かつ有用なものとする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＬＶｓは、免疫療法およびワクチン用途において用いるため、樹状細胞（ＤＣ）への遺伝子の移動に用いられている。専門的抗原提示細胞であるＤＣは、活発なＴ細胞応答を誘導するそれらの能力のため、そのような用途において一般的である。しかしながら、以下に報告されるように、ＬＶｓで形質導入されたＤＣは、未変性Ｔ細胞を活性化する能力の低下を示すことが発見された。ＬＶｓ形質導入の後、ＤＣは、ＩＬ−１０の上方調節およびＴ細胞同時刺激分子の下方調節を含めて、サイトカイン応答および表面マーカー発現の変化を示した。これらの知見と一致して、ＬＶｓで形質導入されたＤＣは、未変性Ｔ細胞をＴｈ１効果細胞に分極するそれらの能力が損なわれた−免疫療法およびワクチン用途におけるＬＶｓ形質導入ＤＣの使用を制限し得る効果。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要約
本発明は、ＤＣ機能のＬＶｓ誘導損傷を克服するための方法および組成物の発見に関する。本発明をなすにあたり、ＨＩＶ／レンチウイルス感染によって生じるＤＣ誘導Ｔ細胞機能不全を克服するため、可溶性サイトカインおよび免疫調節因子の適用を含む一連の免疫調節の方策が研究された。レンチウイルス免疫調節性ウイルスのような免疫調節因子をＤＣに送達することにより、ＨＩＶ（レンチウイルス）感染によって生じるＤＣおよびＴ細胞機能不全を矯正することができる。具体的には、ＤＣに、ＩＬ−７、ＩＬ−１２またはＩＬ−１０ＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡをコードするベクターを含むレンチウイルスで感染させることにより、損傷を受けたＴｈ１応答が回復する。この技術は、患者における治療、ワクチン接種またはベクター適用の間のＤＣのＨＩＶ感染に関連する免疫抑制の問題を克服するための明確な免疫療法用処方を提供する。
【０００６】
したがって、本発明は、レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列およびＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。ＩＬ−７、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される作用因子をコードするヌクレオチド配列を含む精製核酸が導入されている樹状細胞（例えば、レンチウイルスが感染しているもの）も本発明内にある。
【０００７】
本発明の別の側面は、樹状細胞のＴ細胞活性化能力を調節する方法を特徴とする。この方法は、樹状細胞と会合するＩＬ−７、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−１２の量を調節する工程を含む。例えば、この工程は、細胞と会合するＩＬ−７および／またはＩＬ−１２の量の増加、および／または細胞と会合するＩＬ−１０の量の減少を含むことができる。樹状細胞と会合するサイトカインの量の調節は、細胞を可溶性サイトカインと接触させること、可溶性サイトカインを細胞から除去すること、またはサイトカインをコードする精製核酸もしくはサイトカインの発現を減少させる作用因子（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンス核酸）を細胞に導入することによって達成することができる。
【０００８】
ここで用いられる、「核酸」という熟語は２つ以上のヌクレオチドの鎖、例えば、ＲＮＡ（リボ核酸）およびＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を意味する。「精製」核酸分子は、核酸が天然に生じる細胞または生物体内の他の核酸配列から実質的に分離または単離されているものである（例えば、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００％混入がない）。この用語は、例えば、ベクターに組み込まれている組換え核酸分子、プラスミド、ウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムを含む。精製核酸の例には、ｃＤＮＡｓ、ゲノム核酸の断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成される核酸、ゲノム核酸の制限酵素処理によって形成される核酸、組換え核酸、および化学的に合成された核酸分子が含まれる。
【０００９】
ここで用いられる、「ベクター」という用語は、核酸および／またはウイルス粒子を輸送することができる構成要素、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターを指す。
【００１０】
特に定義されない限り、ここで用いられるすべての技術的用語は、本発明が属する技術分野における通常の技術を有するものが通常理解するものと同じ意味を有する。分子生物学の用語の通常理解される定義は、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に見出すことができる。ウイルス学の用語の通常理解される定義は、Ｇｒａｎｏｆｆ ａｎｄ Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９９；およびＴｉｄｏｎａ ａｎｄ Ｄａｒａｉ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２に見出すことができる。微生物学の通常理解される定義は、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２に見出すことができる。
【００１１】
ここに記載されるものに類似するか、または等価である方法や物質は、本発明の実施または試験において用いることができるが、適切な方法や物質は以下に記載される。ここで言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それら全体の参照によって受け入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が支配するだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
詳細な説明
本発明は、ＤＣのＴ細胞活性化能力のＬＶ誘導損傷を克服するための方法および組成物を提供する。以下に記載される好ましい態様は、これらの組成物および方法の適用を説明する。それでもなお、これらの態様の記載から、本発明の他の側面は、以下に示される記載に基づいてなされ、および／または実施することができる。
【００１３】
生物学的方法
従来の分子生物学の技術を含む方法がここに記載される。そのような技術は一般に当該技術において公知であり、方法論の論文、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的に更新）に詳細に記載されている。核酸を化学的に合成するための方法は、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２，１９８１、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１において考察されている。核酸の化学的合成は、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置で行うことができる。免疫学的方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２に記載されている。遺伝子移動および遺伝子治療の従来の方法を本発明において用いるために適用することもできる。例えば、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｔ．Ｂｌａｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９９；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），ｅｄ．Ｐ．Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９７；およびＲｅｔｒｏ−ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｃ．Ｐ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９６を参照のこと。
【００１４】
核酸／ＬＶｓ
本発明は、レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列および（例えば、ＬＶ誘導Ｔ細胞活性化損傷を克服する）ＤＣ機能調節の可能な作用因子をコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は、好ましくは、ＬＶの形態をとる。幾つかの異なる型のＬＶｓは、天然に生じるレンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）および他のものに基づくものが含まれることが知られている。米国特許第６，２０７，４５５号を参照のこと。本発明は、ＨＩＶ−１ベースのベクターを用いて記載されるが、他のレンチウイルスに由来する他のベクターもここに記載される情報を適用することによって用いることができる。多くの利点のため、ＨＩＶ−１ベースのベクターには遺伝子治療適用に対する備えがあり、これらが現時点で好ましい。
【００１５】
本発明のＬＶｓは、例えば制限された宿主細胞向性を克服するため、偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）されていてもよい。例えば、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）のウイルスエンベロープで偽型化されているＬＶｓを用いることができる。安全性を高めるため、自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＶを用いることもできる。例えば、ＳＩＮ ＬＶｓは、３’Ｕ３プロモーターを不活性化し、かつ宿主染色体への統合に重要である５’統合結合部位を除く全ての３’Ｕ３配列を欠失させることによって作製することができる。本発明のベクターの設計に特に好ましい構築体は図１に示されるｐＴＹＦである。
【００１６】
ＤＣ機能の調節が可能な作用因子をコードする第２ヌクレオチド配列は、ＩＬ−７またはＩＬ−１２（両者ともＬＶｓ誘導ＤＣ損傷を克服することがここで示される）のようなサイトカインをコードするものであり得る。ＩＬ−１２、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−７をコードするＬＶｓを含むレンチウイルスがＤＣ機能の調節（例えば、レンチウイルス感染ＤＣによる損傷Ｔｈ１応答の矯正）に用いられる。好ましいＬＶｓには、ｐＴＹＦ−ＩＬ−１２ビ−シストロンベクター、ｐＴＹＦ−ＩＬ１２−ＧＭ−ＣＳＦトリ−シストロンベクター、およびｐＴＹＦ−ＩＬ−７が含まれる。本発明の好ましいレンチウイルスはＬＶｓ ｐＴＹＦ−ＩＬ−１２ビ−シストロンベクター、ｐＴＹＦ−ＩＬ１２−ＧＭ−ＣＳＦトリ−シストロンベクター、およびｐＴＹＦ−ＩＬ−７を含み、かつそれらの宿主細胞向性を広範化するようにＶＳＶ−Ｇで偽型化されている（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｇａｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １，２３７−２５１，２００１；Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｅ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３（５），４６８−７５，２００１を参照）。
【００１７】
ここに記載される実験において用いられるウイルスベクター（および対応するウイルス）は、ＭＬＶベースおよびＳＩＮレンチウイルス（ＨＩＶ−１）ベースのベクターである。図１は、ＬＶｓ ｐＴＹＦ−ＣＤ８０、ｐＴＹＦ−ＣＤ８６、ｐＴＹＦ−Ｆｌｔ３−Ｌ、ｐＴＹＦ−ＩＬ−７、ｐＴＹＦ−ＣＤ４０Ｌ、ｐＴＹＦ−ＩＬ−１２、およびｐＴＹＦ−ＩＬ−１２／ＧＭＣＳＦの構造を示す。ＳＩＮ ＬＶｓをクローニングするための出発プラスミドはｐＴＹＦ、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）を特徴とするＳＩＮベクターである。ｃＰＰＴ配列の封入はウイルスベクターの活性を約３倍高めることが示されている。ＳＩＮ ＬＶｓは、３’短縮末端反復配列（ＬＴＲ）の後ろに挿入された、３’ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）も含む。これらのＳＩＮ ＬＶｓは幾つかのサイトカインをコードし、これにはＩＬ−１２、ＩＬ−１２プラスＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−７の他に、免疫調節分子、例えば、ＣＤ８０またはＣＤ８６（Ｌｉａｎｇ ａｎｄ Ｓｈａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３８４−３９０、２００２；およびＣａｒｒｅｎｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ａａｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：２９−５３，２００２）およびＦｌｔ３−Ｌが含まれる。ウイルスベクター内に含まれるヒトサイトカインｃＤＮＡ配列は、ＲＴ−ＰＣＲにより、ヒト末梢血リンパ球から（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２およびＩＬ−７）またはヒト腫瘍細胞（Ｆｌｔ３−リガンドに関してＴＥ６７１細胞）から増幅される。ＩＬ−１２遺伝子は２つの成分、ＩＬ−１２ＡおよびＩＬ−１２Ｂを有する。ＤＣ機能の調節において用いるには、両ＩＬ−１２成分のｃＤＮＡｓを、これら２つのｃＤＮＡの間にリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を伴って、ビ−シストロンベクターに同時にクローン化する。ｐＴＹＦ−ＩＬ−１２−ＧＭＣＳＦベクターについては、２つの異なるＩＲＥＳ要素をＩＬ−１２Ｂ／ＩＬ−１２ＡおよびＩＬ−１２Ａ／ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡｓの間に配置してトリ−シストロン発現ベクターを産生する。ウイルスベクター内の遺伝子はあらゆる適切なプロモーター（例えば、強力プロモーター、例えば、ヒト伸長因子１アルファ、ＥＦ１ａ）の制御の下に置くことができる。ｐＴＹＦベクターの構築については、Ｚａｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６：７２０９−７２１９；およびＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：７１５−７２８を参照のこと。ＭＬＶベクター（および対応するウイルス）は、Ｚａｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７２０９−７２１９，２００２に記載されるように構築した。
【００１８】
組換えＬＶｓおよびビリオンの構築は、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９５：２４９９−２５０４，２０００；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：７１５−７２８，１９９９；Ｅｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７：９１５０−９１５５，２０００；Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−２６７，１９９６；Ｐａｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，９：７６７−７６８，１９９８；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３：１１８４２−１１８４７，１９９６；Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３：１５２６６−１５２７１，１９９６；およびＣｈｉｎｎａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９６：１３０９−１３１６，２０００において考察されている。ＳＩＮベクターの設計は、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−８１５７，１９９８；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０，１９９８；Ｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６１：１２０−１３２，１９９９；Ｍａｎｇｅｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８３０７−８３１５，２０００；および Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：４３９−４４７，２０００に記載されている。
【００１９】
樹状細胞
本発明は、免疫調節性作用因子、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を有する精製核酸が導入されているＤＣを提供する。用いることができるＤＣには、哺乳動物ＤＣ、例えば、マウス、ラット、モルモット、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他のサル（ａｐｅ および ｍｏｎｋｅｙ）種）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、およびヒトから誘導されるものが含まれる。ＤＣは、哺乳動物被検体内のもの（すなわち、イン・ビボ）であっても、イン・ビトロ培養物中のもの（例えば、被検体への生体外送達のためにイン・ビトロで培養されるもの）であってもよい。本発明によるＤＣは、免疫調節性作用因子、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、またはＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を有する精製核酸を含む。好ましいＤＣにおいては、この核酸が発現し、ポリペプチドまたはＲＮＡを生じる。
【００２０】
ＤＣはあらゆる適切な供給源から得ることができ、これには皮膚、脾臓、骨髄、もしくは他のリンパ系器官、リンパ節、または血液が含まれる。好ましくは、ＤＣは、本発明における使用のため、血液または骨髄から得られる。典型的には、ＤＣは、外来性顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４での刺激の後、骨髄および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる。骨髄細胞からＤＣを得る方法およびＤＣを培養する方法は、Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２，１９９２；および Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０：２４７−２５３，２００２に記載されている。造血性前駆細胞（Ｍｏｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２０：２５６−２６５，２００３）および単球（Ｎｏｕｒｉ−Ｓｈｉｒａｚｉ ａｎｄ Ｇｕｉｎｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７４：１０３５−１０４４，２００２）からＤＣを培養するための方法も当該技術分野において公知である。ＤＣを産生するための大規模単球濃縮手順の一例がＰｕｌｌａｒｋａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６７：１７３−１８３，２００２）に記載されている。ＤＣは、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析においてＤＣ特異的マーカーを用いて、異種細胞試料から単離することができる（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｌｉｐｓｋｙ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４０１６−４０２８，１９９４；Ｃａｎｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８８：４２１５−４２２８，１９９６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９５：２３３７−２３４５，２０００）。未成熟ＤＣは、同時刺激分子、ＣＤ８０／８６、ＣＤ４０の低レベル発現；Ｔ細胞活性を誘導する能力の低さ；ＩＬ−１２ｐ７０を産生する能力のなさ；および調節性もしくは反応不顕性Ｔ細胞を誘導する可能性を特徴とする。これと比較して、成熟ＤＣはＩＬ−１２ｐ７０を産生し、高レベルのＭＨＣクラスII抗原、ＣＤ８０／８６、およびＣＤ４０、ＩＬ−１２ｐ７０産生を発現する。単離ＤＣだけではなくＤＣを含む細胞の集団も、ＤＣの成長および増殖を許容するあらゆる適切なイン・ビトロ培養法を用いて、培養することができる。
【００２１】
ＤＣ機能の調節
本発明はＤＣ機能を調節するための方法も提供する。ＤＣは未変性Ｔヘルパー細胞を刺激し、異なる免疫応答を仲介するＩＦＮ−ガンマ−産生Ｔｈ１またはＩＬ−４−産生Ｔｈ２効果細胞のいずれかに分化させる。Ｔｈ応答の歪みはＬＶｓでのＤＣの形質導入から、およびレンチウイルスでの感染によって生じる。特には、レンチウイルス形質導入およびレンチウイルス感染ＤＣがＴｈ１応答の損傷およびＩＬ−４−産生Ｔｈ２応答の増強に向かう未変性Ｔｈ細胞の分化を促す。本発明の組成物および方法は、ＤＣにサイトカイン（例えば、免疫原）を提供することによってＤＣの免疫賦活能力を改善する（例えば、Ｔｈ１応答を回復する）のに用いることができる。適切なサイトカインの例にはＩＬ−１２およびＩＬ−７が含まれる。Ｔｈ１応答を増強する他のサイトカインも本発明において用いることができる。
【００２２】
ＤＣ機能（例えば、Ｔｈ１応答を回復する）を調節するため、ＤＣ細胞を、レンチウイルスから誘導されるヌクレオチド配列およびレンチウイルスから誘導されない少なくとも１つの導入遺伝子を含む精製核酸を含有するＬＶと接触させる。この導入遺伝子は、Ｔｈ１応答を増強するいかなるサイトカインであってもよく、これにはＩＬ−１２およびＩＬ−７が含まれる。
【００２３】
ＤＣ機能の調節の一例においては、ＤＣを、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２プラスＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−７をコードするベクターを含むレンチウイルスに感染させる。この例においては、未成熟ＤＣをＭｏｃｋ（２９３Ｔ上清）、ＴＹＦ−ＰＬＡＰ、ＴＹＦ−ＩＬ−１２、ＴＹＦ−ＩＬ１２−ＧＭ−ＣＳＦ、またはＴＹＦ−ＩＬ−７に感染させる。ＬＰＳ（８０ｎｇ／ｍｌ）プラスＴＮＦ−アルファ（２０ｕ／ｍｌ）で２４時間成熟させた後、ＤＣを収穫し、未変性ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共に１：２０のＤＣ／Ｔ比で同時培養する。同時培養の５日後、Ｔ細胞をＩＬ−２（２５ｕ／ｍｌ）の存在下でさらに７日間増殖させる。Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下でイオノマイシンおよびＰＭＡでの再刺激の６時間後に細胞内ＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−４染色することにより、Ｔｈｉ、Ｔｈ２およびＴｈ０集団を測定する。免疫調節性分子、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−７をコードするＬＶｓは、レンチウイルス感染ＤＣによる損傷Ｔｈ１応答を有効に矯正する。
【００２４】
被検体における免疫応答の調節
被検体における免疫応答を増加および減少させるための組成物および方法は、多くの異なる障害を治療するための様々なＤＣベースの免疫療法策において用いることができる。成熟ＤＣは、Ｔ細胞応答を開始する（例えば、細胞毒性Ｔリンパ球の誘導）ための組織化リンパ組織への抗原輸送に有効に介在する、鍵となる抗原提示細胞集団である。ＤＣの正常機能はＴ細胞に抗原を提示することであり、次にそれはその抗原源を特異的に認識して最終的に排除する。ＤＣは、癌および感染性疾患のための治療用および予防用ワクチンの両者として用いられる。そのようなワクチンは、強力な細胞性免疫応答を誘発するように設計される。ＤＣ生物学、ＤＣへの遺伝子移動、およびＤＣ免疫療法は、Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ ａｎｄ Ｐｉｓａ，Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．１９：１９７−２１１，２００２；Ｈｅｒｒｅｒａ ａｎｄ Ｐｅｒｅｚ−Ｏｔｅｙｚａ，Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｅｓｐ．２０２：５５２−５５４，２００２；および Ｏｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１１：６４５−６６０，２００２において概説されている。
【００２５】
細胞毒性および１型ヘルパー（Ｔｈ１）細胞応答の誘導は慢性感染性疾患または癌を標的とするワクチンにとって非常に望ましい（Ｐ．Ｍｏｉｎｇｅｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９８：１８９−１９８，２００２）。Ｔｈ１細胞およびそれらの作用を上方調節するインターロイキンを発現する改変ＤＣは病原に対する耐性を高めるのに用いることができる（Ｊ．Ｗ．Ｈａｄｄｅｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１６：７０３−７１０，１９９４）。ＨＴＶ感染の治療には、例えば、ＤＣは、ＨＩＶ特異的免疫が開始および増強されるように、生体外および生体内の両者で標的される（Ｐｉｇｕｅｔ ａｎｄ Ｂｌａｕｖｅｌｔ Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１９：３６５−３６９，２００２）。
【００２６】
ＨＩＶ治療に加えて、本発明の改変ＤＣは、癌免疫治療において用いることができる。第２のリンパ系器官および休止している未変性Ｔ細胞に腫瘍抗原を提示するように操作されているＤＣは腫瘍特異的Ｔ細胞の産生に有用である（Ａ．Ｆ．Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１０４３−１０５５，２００２）。例えば、ミエローマ関連抗原を発現するように改変されたＤＣは複数のミエローマの抗癌療法として有用である（Ｂｕｃｈｌｅｒ ａｎｄ Ｈａｊｅｋ Ｍｅｄ． Ｏｎｃｏｌ． １９：２１３−２１８， ２００２）。特定のサイトカインまたはケモカインを発現するＤＣは、実質的に改善された成熟状態、イン・ビボで第２のリンパ系器官に移動する能力、およびイン・ビボで腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激して腫瘍免疫を誘導する能力を提示することが示されている。したがって、サイトカインを発現するように改変されているＤＣは、腫瘍免疫の誘導に有用であり、腫瘍抗原を発現するように改変されているＤＣと組み合わせて用いられる。癌免疫療法におけるＤＣの治療上の役割は、Ｌｅｍｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８７：６２−６６，２００２；Ａ．Ｆ．Ｏｃｈｓｅｎｂｅｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１０４３−１０５５，２００２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１７：６０１−６１９，２００２；Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：２６５−２７３，１９９８；Ｄ．Ａｖｉｇａｎ，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１３：５１−６４，１９９９、およびＳｙｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１０：６０１−６０８，２００１において概説されている。
【００２７】
ＤＣベースのワクチン方策の一例においては、免疫源をコードするＬＶは、ＤＣの改変に用いられ、これはその免疫源の発現および休止している未変性Ｔ細胞へのその提示が生じる。そのような抗原提示策は単独で、または、広範な免疫応答を誘発するため、組み合わせて混合免疫化療法の一部として用いることができる。患者へのＤＣの送達を含む免疫化の異なる方策が、Ｏｎａｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１１：６４５−６６０，２００２に記載されている。
【００２８】
改変ＤＣは、自己免疫障害（例えば、関節炎、喘息、アトピー性皮膚炎）を治療するためのＴ細胞（Ｔｈ１および／またはＴｈ２）応答の調節に用いることもできる。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞のバランスは多くの自己免疫障害において重要なものである。Ｔｈ１細胞活性は関節リウマチおよびインシュリン依存性糖尿病の患者の関節において優勢であり、それに対してＴｈ２細胞優勢応答は、アトピー性障害（例えば、アレルギー）、器官特異的自己免疫疾患（１型糖尿病および甲状腺疾患）、クローン病、同種移植拒絶（例えば、急性腎臓同種移植拒絶）、および幾つかの説明されていない再発性流産の病因に関与する（Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８５：９−１８，２０００）。同種移植拒絶は、宿主免疫系が同種非自己抗原を検出したときに生じる。同種移植拒絶を予防または治療するため、改変ＤＣを組織特異的抗原に対する寛容性の誘導に用いることができる（Ｂ．Ａｒｎｏｌｄ Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１０９−１１４，２００２）。免疫抑制性分子を発現するＤＣも同種移植拒絶の治療として用いることができる（Ｌｕ ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７３：Ｓ１９−２２，２００２）。
【００２９】
改変ＤＣは、さらに、微生物病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、およびぜん虫）に対する免疫応答の誘導に用いることができる。例えば、微生物病原体から誘導されるペプチド抗原を発現するようにＤＣを改変することができる。そのようなＤＣによる抗原の提示はその病原体に対する活発な免疫応答を刺激し得る。
【実施例】
【００３０】
本発明を以下の具体的な例によってさらに説明する。これらの例は説明のためだけに提供されるものであり、いかなる意味においても本発明の範囲または内容を制限するものと解釈されるべきではない。
【００３１】
（実施例１）−材料および方法
単球誘導樹状細胞の産生。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、従来記載されるように（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１１：１５７−１６９，１９９５）、健常ドナーのバフィーコート（Ｃｉｖｉｔａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＦＬ、ＵＳＡ）から Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）における勾配密度遠心によって単離した。ＤＣをＰＢＭＣから、Ｔｈｕｍｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２３：１−１５，１９９９）に従い、以下の改変を施して調製した。第０日に、ウェル当たり５００万個のＰＢＭＣを１２ウェル培養プレート内の血清非含有ＡＩＭ−Ｖ培地に播種した。３７℃で１時間インキュベートした後、非接着細胞を穏やかに洗い流し、残留する接着単球細胞をＡＩＭ−Ｖ培地において第１日までさらに培養した。緩やかに接着する細胞を乱さないように培養培地を慎重に除去し、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（５６０ｕ／ｍｌ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｃ．Ｆｌａｎｄｅｓ ＮＪ）およびＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する新たなＡＩＭ−Ｖ培地（ウェル当たり１ｍｌ）を添加して細胞を３７℃、ＣＯ２５％下、インキュベーター内で培養した。第３日に、ＧＭ−ＣＳＦ（５６０ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有する１ｍｌの新鮮なＡＩＭ−Ｖ培地を培養物に添加した。第５日に、非接着細胞を穏やかなピペット処理によって収穫した。洗浄後、ＤＣを後に使用するために凍結するか、または直ちに使用した。
【００３２】
未成熟ＤＣのレンチウイルス形質導入およびＤＣ成熟。第５日に、未成熟ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ（５６０ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）を補足した２００ｕｌの培地を収容する２４ウェルプレートにおいて、ウェル当たり５×１０５で平板培養した。ＤＣの形質導入は、濃縮ＬＶｓを細胞に５０−１００の感染効率（ＭＯＩ）で添加することによって行った。それらの細胞を３０分毎に穏やかに振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした後、１ｍｌのＤＣ培地を添加し、その培養物をウイルスベクターと共にさらに１２時間インキュベートした。リポ多糖（ＬＰＳ）を最終濃度８０ｎｇ／ｍｌで、且つＴＮＦ−アルファを最終濃度２０ｕ／ｍｌで、ＤＣ培養物に２４時間添加することによって、ＤＣ成熟を誘導した。２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＡＩＭ−Ｖ培地と共に３７℃、ＣＯ２５％下、インキュベーター内で２０分間インキュベートした後、成熟ＤＣを収穫した。細胞を３回洗浄し、次の実験に用いた。
【００３３】
抗体染色およびフローサイトメトリー。フローサイトメトリーによって細胞表面マーカーの発現を分析するため、ＤＣを正常マウス血清と共に１０分間、次いで、ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｔｕｌ４９、マウスＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣ標識、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＴＵ３６、マウスＩｇＧ２ｂ、ＦＩＴＣ標識、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＣＤ１ａ（ＨＩ４９、マウスＩｇＧ１ｋ、ＡＰＣ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８０（Ｌ３０７．４、マウスＩｇＧ１ｋ、Ｃｙｃｈｒｏｍｅ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８６（ＲＭＭＰ−２、ラットＩｇＧ２ａ、ＦＩＴＣ標識、Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＩＣＡＭ−１（１５．２、ＦＩＴＣ標識、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＤＣ−ＳＩＧＮ（ｅＢ−ｈ２０９、ラットＩｇＧ２ａ，ｋ、ＡＰＣ標識、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１１ｃ（Ｂ１ｙ−６、マウスＩｇＧ１、ＰＥ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ４０（５Ｃ３、マウスＩｇＧ１，ｋ、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ１２３（マウスＩｇＧ１、ｋ、ＰＥ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８３（ＨＢ１５ｅ、マウスＩｇＧ１，ｋ、Ｒ−ＰＥ標識、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含む、蛍光色素結合抗ヒトモノクローナル抗体と共に３０分間インキュベートした。対応するイソ型対照抗体も各染色条件に含めた。２回の洗浄の後、細胞をＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドに再懸濁させて固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣＥＬＬＱＵＥＳＴプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。前方および測方光散乱特性によって生細胞を通過させ、陽性細胞のパーセンテージおよび集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。
【００３４】
ＲＮＡの単離、標識およびアレー・ハイブリダイゼーション。レトロウイルスまたはアデノウイルスベクターに感染させた後、細胞を収穫してＴｒｉｚｏｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で溶解した。製造者のプロトコル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従い、全ＲＮＡを単離して標識し、Ａｔｌａｓ Ａｒｒａｙフィルターへのハイブリダイゼーションの準備を行った。ハイブリダイゼーションは１５ｕｇの標識ｃＤＮＡ産生物を用いて一晩行った。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、アレーフィルターを、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ ４８６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて走査し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ａｔｌａｓ Ａｒｒａｙ 画像解析ソフトウェアを用いて定量的に解析した。
【００３５】
ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の半定量および定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。ＤＣをＬＶｓで形質導入し、上述のように成熟させた。Ｔｒｉ−ｒｅａｇｅｎｔを用いて全ＲＮＡを精製した。半定量ＲＴ−ＰＣＲについては、標準一工程ＲＴ−ＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ヒトＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のプライマー並びにヒトＧＡＰＤＨの対照プライマーを用いて行った。定量ＲＴ−ＰＣＲ分析については、ＤＣの全ＲＮＡをＴｒｉｒｅａｇｅｎｔキットを用いて単離し、オリゴ−ｄＴおよびＡＭＶ逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡに転写し、かつリアルタイムＲＴ−ＰＣＲをＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ ７０００ ＰＣＲサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で行った。ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１０、ＧＡＰＤＨの確証済みＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブ（６ＦＡＭ標識）はＡＢＩから購入した。ＰＣＲ混合物は製造者の使用説明書（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＡＢＩ）に従って調製し、サーマルサイクラーの条件は以下の通りであった：１×９５℃ １０分、４０−５０サイクル変性（９５℃ １５秒）および一体化したアニーリング／伸長（６０℃ １分）。試料のサイクル閾値を、連続希釈した標準と比較することにより相対的定量を行った。
【００３６】
未変性ＣＤ４＋ Ｔ細胞の調製。ＣＤ４＋ Ｔ細胞単離Ｒｏｓｅｔｔｅカクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる陰性選択により、ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＰＢＭＣから製造者の使用説明書に従って調製した。簡潔に述べると、無菌２００ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ遠心管において、４５ｍｌバフィーコート（約５×１０８ＰＢＭＣ）を２．２５ｍｌ ＣＤ４＋ Ｔ細胞濃縮Ｒｏｓｅｔｔｅカクテルと共に２５℃で２５分間インキュベートした。その後、２％ＦＢＳを含有する４５ｍＬのＰＢＳを添加してバフィーコートを希釈した。穏やかに混合した後、３０ｍｌの希釈バフィーコートを５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ管内の１５ｍＬ Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅの頂部に移して層を形成させ、１，２００ｇで２５分間遠心した。非ロゼット化細胞をＦｉｃｏｌｌ界面で収穫してＰＢＳ（２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、カウントして将来的な使用のために液体窒素中に分割単位で凍結保存した。単離ＣＤ４＋ Ｔ細胞の純度は一貫して９５％を上回った。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ未変性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−細胞の陰性選択に基づき、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）磁気アフィニティカラムを用いて製造者の使用説明書に従って精製した。
【００３７】
Ｔｈ機能のイン・ビトロ誘導および細胞内サイトカイン染色。イン・ビトロＤＣ：Ｔ細胞同時培養法は、Ｃａｒｏｎ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６７；３６８２−３６８６，２００１）に従った。簡潔に述べると、精製未変性ＣＤ４ Ｔ細胞を同種成熟ＤＣと共に異なる比（２０：１ないし１０：１）で血清非含有ＡＩＭ−Ｖ培地において同時培養した。第５日に５０ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を添加し、培養物を増殖させて３週間まで毎日ｒｈＩＬ−２含有ＡＴＭ−Ｖ培地を供給した。第１２日の後、静止状態のＴ細胞を洗浄し、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌまたは０．０１６２ｕＭ）およびイオノマイシン（１ｕｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で５時間再刺激した。培養の最後の２．５時間にＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（１．５ｕｇ／ｍｌ）を添加した。その後、細胞を固定し、透過化し、ＦＩＴＣ標識抗−ＩＦＮ−γおよびＰＥ標識抗−ＩＬ−４ｍＡｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において分析した。
【００３８】
ＤＣ介在混合リンパ球反応（ＭＬＲ）。ウェル当たり１０，０００細胞ないしウェル当たり３１３細胞の、ＤＣの連続希釈を１×１０５同種ＣＤ４ Ｔ細胞と共に９６ウェルＵ底プレートにおいて合計２００ｕｌで５日間培養した。Ｔ細胞の増殖を、２０ｕｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６溶液を製造者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って各ウェルに添加することにより監視し、４９０ｎｍでのＯＤ読み取り値を得た。
【００３９】
ＬＶｓ構築および産生。プラスミド構築。この研究に用いられるオンコレトロウイルス（ＭＬＶ）およびＬＶｓ（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１ ＳＩＮ）は、従来記載される通りに構築した（Ｚａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７２０９−７２１９，２００２）。すべてのＨＩＶ−１ ＳＩＮベクター（ｐＴＹ）は、３’短縮末端反復配列（ＬＴＲ）の後ろに挿入された３’ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）を有する。ＮｏｔＩ消化ｐＨＥＦを、ＵＦ Ｐｏｗｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＣｅｎｔｅｒのＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅから入手したヒト化ｅＧＦＰ構築体から誘導されたＮｏｔＩ消化ｅＧＦＰ断片とライゲートすることにより、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）発現プラスミド、ｐＨＥＦｅＧＦＰを構築した。ｐＴＶｄｌ．ＥＦｅＧＦＰに由来するｅＧＦＰ断片（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ）をｐＴＹＥＦｎｌａｃＺに挿入し、核ｌａｃＺ（ｎｌａｃＺ）遺伝子を置換することによってｐＴＹＥＦｅＧＦＰを作製した。ｐＴＶｄｌ．ＥＦｎｌａｃＺのｎｌａｃＺ断片（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ）をｐＨＥＦｅＧＦＰから単離されたｅＧＦＰ断片（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ）で置換することにより、ｐＴＶｄｌ．ＥＦｅＧＦＰを産生した。ＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ構築体はｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づくもので、サイトメガロウイルス最初期プロモーターがヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーターで置換されていた。サイトカイン遺伝子またはＴ細胞同時刺激遺伝子を発現するレンチウイルスベクターは、これらの遺伝子をコードするｃＤＮＡをｐＴＹＦ−ＥＦ形質導入ベクター内の上記のようにＥＦ１αプロモーターの後ろに挿入することによって構築した。
【００４０】
（実施例２）−結果
ウイルス形質導入後の細胞性応答のｃＤＮＡマイクロアレー分析。ウイルス形質導入に対する細胞応答を、ＨＩＶ−１（ＬＶｓ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびアデノウイルス（Ａｄ）ベクターを含む異なるウイルスベクターを一次ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において比較することによって分析した。ＨＩＶ−１およびＭＬＶベクターの両者はＤＮＡ同時形質移入によって調製され、従来記載されるように（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｇａｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１：２３７−２５１，２００１；Ｚａｉｓｓ ｅｔ ａｌ、前出）、ウイルス遺伝子はベクターゲノム内に含まれていなかった。Ａｄベクターは、アデノウイルス遺伝子の大部分を含むＥｌＡ欠失ベクター系に基づくものであった（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｃ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｖｏｌ．７，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，ｐｐ．１０９−１２８，１９９１）。ＨＵＶＥＣは少継代（＜５）で維持し、２−３の感染効率（ｍｏｉ）で形質導入した。細胞および導入遺伝子のパッケージ化から生じる可変性を最少化するため、この研究において用いられる３種類全てのウイルスベクターは、ｌａｃＺレポーター遺伝子を担持し、かつ２９３細胞において産生された。ＨＵＶＥＣの細胞性応答は、１，１７６ヒトｃＤＮＡ、９つのハウスキーピング対照ｃＤＮＡおよび陰性対照を各々含む、４つのＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｈｕｍａｎ Ａｔｌａｓ Ａｒｒａｙ １．２ブロットの組を用いて研究した。
【００４１】
ＨＵＶＥＣをｍｏｃｋ（対照２９３上清）、ＬＶｓ、ＭＬＶおよびＡｄベクターで形質導入した。感染の２４時間後に全ポリＡ＋ＲＮＡを収穫し、逆転写酵素によって３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識して、４つの同一のＣｌｏｎｔｅｃｈ Ａｔｌａｓ Ｈｕｍａｎ Ａｒｒａｙ １．２ ｃＤＮＡブロットにハイブリダイズさせた。それらの結果をＣｌｏｎｔｅｃｈ ＡｔｌａｓＩｍａｇｅ １．５ソフトウェアおよび対比較を用いて解析した。上方または下方調節された遺伝子を、２倍を上回るか、または１０，０００シグナル強度を上回るあらゆる登録された変化からソフトウェアを用いて任意に決定し、視認比較によって確認した。これらの結果をＣｌｏｎｔｅｃｈによって任意に設定された６つの遺伝子プール群にまとめた：細胞サイクルおよび癌遺伝子、シグナル伝達、アポトーシスおよびＧＴＰａｓｅ、転写および表面シグナル伝達、接着−受容体−ケモカイン、並びにストレス応答−インターロイキン−インターフェロン。下記表１を参照のこと。ＬＶｓはＭＬＶおよびＡｄベクターよりも転写および表面シグナル伝達遺伝子を強化するものと思われ、かつ、興味深いことに、免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０が、ＭＬＶおよびＬＶｓ形質導入の後に上方調節された。
【００４２】
表１．ＨＵＶＥＣにおける遺伝子発現に対するウイルス形質導入の効果。６種類の任意に定義された機能的遺伝子を、上方調節（↑）、下方調節（↓）または不変（−）で示される遺伝子発現における変化の重なりと共に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ＬＶｓ形質導入後のＤＣ表面マーカー発現の分析。異なる抗体およびフローサイトメトリーを用いるＬＶｓ形質導入後のＤＣ上の表面マーカー発現。末梢血単球（ＰＢＭ）誘導未成熟ＤＣを、ｍｏｃｋ（対照２９３上清）、空のＬＶｓ粒子（ウイルスゲノムなしにＨＩＶ−１キャプシドおよびＶＳＶ−Ｇエンベロープを含む粒子）、ＬＶｓ、およびＭＬＶを含むベクターで形質導入した。ベクター粒子内に存在するウイルスタンパク質がＤＣ表現型の変化を誘導するかどうかを見るため、空のＬＶｓも試験した。ＬＰＳプラスＴＮＦ−αで２４時間処理した後、ＤＣを抗体染色およびフローサイトメトリーのために収穫した、これらの結果を表２にまとめる。試験した表面分子のうち、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１およびＤＣ−ＳＩＧＮは、ＬＶｓ形質導入後に下方調節されたが、空のＬＶｓまたはＭＬＶを用いたときにはされなかった。ＰＬＡＰまたはＣｒｅレポーター遺伝子を担持する異なるＬＶｓの調製品を試験したとき、同じ結果が得られた。
【００４５】
【表２】
結果はフローサイトメトリー後の幾何平均蛍光として示される。アスタリスク（＊）はスチューデントｔ検定による差の有意性を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【００４６】
ＬＶｓ形質導入損傷ＤＣ介在Ｔｈ１免疫。ヒトＤＣおよび未変性Ｔ細胞を用いるイン・ビトロＤＣ機能アッセイを行った。ＤＣをＰＢＭから培養においてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で産生し、ＰＢＭ誘導第５日（ｄ５）ＤＣを、ＰＬＡＰレポーター遺伝子を担持するＬＶｓで感染させた。感染したＤＣをＰＬＡＰ活性について第７日に分析した。この条件下で、９０％を上回るＤＣが、ｍｏｉ〜３０−８０においてＬＶｓで形質導入された。ＩＬ−１０の発現がＬＶｓ感染後のＤＣにおいて影響を受けるかどうかをみるため、第５日ＤＣをＬＶｓで感染させ、そのＤＣを第６日にＬＰＳで処理し、翌日にＩＬ−１０の発現について、抗−ＩＬ−１０モノクローナル抗体およびフローサイトメトリーを用いる細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）によって分析した。ＨＵＶＥＣのＬＶｓ形質導入と同様に、ＤＣにおけるＩＬ−１０の上方調節がＬＶｓ感染後に観察された。
【００４７】
ＬＶｓ感染後のＤＣの機能をさらに特徴付けるため、未変性ＣＤ４＋ Ｔ細胞を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製し、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳ誘導成熟後の同種ＰＢＭ誘導ＤＣと共に同時培養した。第５日にこれらのＤＣにＬＶｓまたはＭＬＶを感染させ、誘導して成熟させ、未変性ＣＤ４＋ Ｔ細胞と共に同時培養した。これらのＴ細胞を増殖させ、ＤＣプライミングの後に７日にわたって休止させた。Ｔｈ応答を分析するため、休止Ｔ細胞を第７日および第９日にイオノマイシンおよびＰＭＡとの同時培養の後に再活性化し、上述のようにＩＦＮ−γおよびＩＬ−４に対する抗体を用いる細胞内染色（ＩＣＣＳ）を施した。これらの結果は、ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ１細胞集団が、対照についての第７日の７２％および第９日の７５％から、ＬＶｓ形質導入ＤＣについての第７日の２７％および第９日の２２％まで劇的に減少し、これに対してＴｈ２集団は不変のままであったことを示した。同様ではあるが著しさでは劣る効果がＭＬＶ形質導入ＤＣについて観察された。
【００４８】
免疫調節性遺伝子をコードするＬＶｓによるＤＣ免疫の改変。ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６のｃＤＮＡを図１に示されるようにＬＶｓにクローン化した。ＤＣを、レポーター遺伝子（ＬＶ−ＰＬＡＰ）、ＣＤ８０ ｃＤＮＡ（ＬＶ−ＣＤ８０）またはＣＤ８６ ｃＤＮＡ（ＬＶ−ＣＤ８６）を担持するＬＶｓで形質導入し、１２時間後にＬＰＳおよびＴＮＦ−αで処理した。形質導入ＤＣを、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現について、抗−ＣＤ８０および抗−ＣＤ８６抗体を用いるフローサイトメトリーによってＬＶｓ形質導入の３６時間後に分析した。ＣＤ８０およびＣＤ８６発現の両者とも、ＬＶ−ＰＬＡＰ感染の後、ＣＤ８０については４１％から３５％に、ＣＤ８６については６１％から４９％に減少した。しかしながら、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、ＣＤ８０（３５％から４４％）およびＣＤ８６（４９％から７６％）をコードするＬＶｓでの形質導入の後に、それぞれ、上方調節された。
【００４９】
他の実験においては、ｍｏｃｋ、ＬＶｓ−ＰＬＡＰ、ＬＶｓ−ＰＬＡＰプラスＬＶｓ−ＣＤ８０またはＬＶｓ−ＰＬＡＰプラスＬＶｓ−ＣＤ８６で形質導入したＤＣを未変性ＣＤ４ Ｔ細胞と共に同時培養した。８日後、Ｔ細胞を再活性化し、上述のように抗−ＩＬ−４および−ＩＦＮ−γ抗体を用いてＩＣＣＳおよびフローサイトメトリーによって分析した。それらの結果は、ＬＶｓ形質導入の後、Ｔｈ１集団が２４％から１３％に減少したことを示し、この損傷はＤＣにおけるＣＤ８０およびＣＤ８６の上方調節によっては矯正することができなかった（それぞれ、１３％から１２％および１３％）。
【００５０】
他の実験においては、可溶性ＩＬ−１２および／またはＦＬをＤＣ培養に補足することによってＤＣのＴｈ１活性化機能を強化できるどうかを研究し、ここで、これらのサイトカインはウイルス形質導入およびＤＣ：Ｔ細胞同時培養を通して個別に、または一緒にＤＣ培養に添加された。同時培養したＴ細胞を、Ｔｈ分析のため、第６日および第７日に再活性化した。ＩＬ−４およびＩＮＦ−α ＩＣＣＳによるＴ細胞の第６日および第７日分析の両者の結果は、ＬＶｓ感染後のＴｈ１応答の損傷を確認した（それぞれ、３７．５％および２０％から１５．６％および１０％）。しかしながら、外来性ＩＬ−１２のみの補足はＴｈ１応答の損傷を部分的に矯正し（それぞれ、１５．６％および１０％から、ＩＬ−１２単独について１９．１％および１１．７％、ＩＬ−１２＋ＦＬについて１８．７％および１３．２％）、ＦＬ単独には効果がなかった（それぞれ、１５．６％および１０．０％から１４．６％および８．８％）。より高濃度の可溶性ＩＬ−１２を用いる他の実験においては、Ｔｈ１応答の損傷は完全に矯正された。
【００５１】
重要なサイトカインの強化された内在性発現でＤＣを操作するため、ＦＬ、ＩＬ−７、ＣＤ４０Ｌ、ビ−シストロン性ＩＬ−１２、およびトリ−シストロン性ＩＬ−１２／ＧＭ−ＣＳＦを含む異なるサイトカインをコードするＬＶｓを構築して試験した（図１）。ＤＣを、レポーター遺伝子のみを担持するＬＶｓで形質導入し、または異なるサイトカインを発現するＬＶｓと共に同時形質導入した。ＬＶｓ形質導入ＤＣのＴｈ機能は、ＤＣ：Ｔ細胞同時培養アッセイによって研究し、１２日後にＴ細胞を上述のように再活性化してＩＣＣＳおよびフローサイトメトリーによって分析した。それらの結果は、ＬＶｓレポーターベクター形質導入単独がＴｈ１発生の減少を導くことを示した（５４．６％から３７．７％）。しかしながら、ビシストロン性ＩＬ−１２、トリシストロン性ＩＬ−１２／ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−７をコードするＬＶｓとのＤＣの同時形質導入は、それぞれ３７．７％から５６．２％、５６．２％および５０．７％に、Ｔｈ１応答を有効に増強した。他の免疫調節性遺伝子、例えば、ＦＬ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＣＤ４０ＬをコードするＬＶｓは、いかなる矯正効果をも示さなかった。
【００５２】
ＩＬ−１０を標的とする小妨害性ＲＮＡを発現するＬＶｓによるＤＣ機能の調節。ＩＬ−１０を標的とする小妨害性ＲＮＡをコードするＬＶｓを構築した。ＩＬ−１０ ｍＲＮＡにおける２つの領域をＲＮＡ妨害標的部位に選択した（図２）。ｓｉＲＮＡ発現カセットをヒトＨ１ ｐｏｌIIIプロモーターによって駆動させ、ＬＶｓに逆方向にクローン化した。このＬＶ−ｓｉＲＮＡベクターは、力価測定を可能にするためのｐｏｌIII ｓｉＲＮＡに隣接したｎｌａｃＺレポーター遺伝子を持っている。ＤＣをレポーターＬＶｓおよびＩＬ−１０を標的とするＬＶｓ−ｓｉＲＮＡで同時形質導入した後、ＩＬ−１０の発現について上述のようにＬＰＳ処理およびＩＣＣＳの後に分析した。これらの結果もまた、ＬＶｓ形質導入単独は、ＩＬ−１０の発現を上方調節し、それに対してＩＬ−１０を標的とするＬＶ−ｓｉＲＮＡとの同時形質導入は、ＩＬ−１０の発現を下方調節した。次に、これら２つのＩＬ−１０ ＬＶｓ−ｓｉＲＮＡ構築体をＬＶｓ−同時形質導入およびＤＣ：Ｔ同時培養Ｔｈ１機能アッセイにおいてＬＶｓ−ＩＬ−７と比較した。同時培養未変性Ｔ細胞を活性化し、２０日間休止させた後、再活性化およびＴｈサイトカイン分析を行った。ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ ＩＣＣＳの結果は、ＩＬ−１０ ＬＶｓ−ｓｉＲＮＡベクターが両者ともＴｈ１応答を増強し、＃２ ＩＬ−１０ ＬＶｓ−ｓｉＲＮＡがＬＶ−ＩＬ−７に匹敵するか、もしくはそれを上回るレベルのＴｈ１応答の増強を示すことを立証した。これは、別のＴｈ１サイトカインＴＮＦα ＩＣＣＳの分析でさらに検証された。
【００５３】
他の態様
本発明をそれらの詳細な説明と共に記載したが、上述の記載は説明を目的とするものであり、添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。例えば、ＬＶ誘導ＤＣ損傷を克服する作用因子は、非レンチウイルス法を用いて、例えば、他のウイルスベクターまたは非ベクターベースの方法を用いて標的ＤＣに導入することができる。他の態様、利点、および変形は以下の請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明において用いられる様々なベクター構築体を示す高度に模式化された図である。
【図２】ＩＬ−１０ ＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡを示す高度に模式化された図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列およびＴ細胞を活性化する樹状細胞の能力を調節することができる作用因子をコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２】
第２ヌクレオチド配列がＩＬ−７をコードする請求項１の核酸。
【請求項３】
第２ヌクレオチド配列がＩＬ−１２をコードする請求項１の核酸。
【請求項４】
第２ヌクレオチド配列がｓｉＲＮＡをコードする請求項１の核酸。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡがＩＬ−１０に特異的である請求項４の核酸。
【請求項６】
核酸がレンチウイルスベクター内に含まれる請求項１の核酸。
【請求項７】
レンチウイルスベクターがビリオン内に含まれる請求項６の核酸。
【請求項８】
精製核酸の導入されている樹状細胞であって、該精製核酸はＴ細胞を活性化する樹状細胞の能力を調節することができる作用因子をコードするヌクレオチド配列を含む樹状細胞。
【請求項９】
細胞がレンチウイルスベクターを含む請求項８の樹状細胞。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列がＩＬ−７をコードする請求項８の樹状細胞。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列がＩＬ−１２をコードする請求項８の樹状細胞。
【請求項１２】
ヌクレオチド配列がｓｉＲＮＡをコードする請求項８の樹状細胞。
【請求項１３】
ｓｉＲＮＡがＩＬ−１０に特異的である請求項１２の樹状細胞。
【請求項１４】
レンチウイルスベクターが、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される作用因子をコードするヌクレオチド配列を含む請求項９の樹状細胞。
【請求項１５】
樹状細胞のＴ細胞活性化能力を調節するための方法であって、樹状細胞と会合する少なくとも１種類のサイトカインの量を調節する工程を含む方法。
【請求項１６】
少なくとも１種類のサイトカインがＩＬ−７、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２からなる群より選択される請求項１５の方法。
【請求項１７】
細胞と会合するＩＬ−７の量が増加される請求項１６の方法。
【請求項１８】
細胞と会合するＩＬ−１２の量が増加される請求項１６の方法。
【請求項１９】
細胞と会合するＩＬ−１０の量が減少される請求項１６の方法。
【請求項２０】
樹状細胞と会合する少なくとも１種類のサイトカインの量を調節する工程が、細胞を可溶性サイトカインと接触させることを含む請求項１５の方法。
【請求項２１】
樹状細胞と会合する少なくとも１種類のサイトカインの量を調節する工程が、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される作用因子をコードするヌクレオチド配列を含む精製核酸を樹状細胞に導入することを含む請求項１５の方法。
【請求項２２】
レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列およびｓｉＲＮＡをコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２３】
樹状細胞における遺伝子の発現を調節するための方法であって、レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列およびｓｉＲＮＡをコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸を樹状細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項１】
レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列およびＴ細胞を活性化する樹状細胞の能力を調節することができる作用因子をコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２】
第２ヌクレオチド配列がＩＬ−７をコードする請求項１の核酸。
【請求項３】
第２ヌクレオチド配列がＩＬ−１２をコードする請求項１の核酸。
【請求項４】
第２ヌクレオチド配列がｓｉＲＮＡをコードする請求項１の核酸。
【請求項５】
ｓｉＲＮＡがＩＬ−１０に特異的である請求項４の核酸。
【請求項６】
核酸がレンチウイルスベクター内に含まれる請求項１の核酸。
【請求項７】
レンチウイルスベクターがビリオン内に含まれる請求項６の核酸。
【請求項８】
精製核酸の導入されている樹状細胞であって、該精製核酸はＴ細胞を活性化する樹状細胞の能力を調節することができる作用因子をコードするヌクレオチド配列を含む樹状細胞。
【請求項９】
細胞がレンチウイルスベクターを含む請求項８の樹状細胞。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列がＩＬ−７をコードする請求項８の樹状細胞。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列がＩＬ−１２をコードする請求項８の樹状細胞。
【請求項１２】
ヌクレオチド配列がｓｉＲＮＡをコードする請求項８の樹状細胞。
【請求項１３】
ｓｉＲＮＡがＩＬ−１０に特異的である請求項１２の樹状細胞。
【請求項１４】
レンチウイルスベクターが、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される作用因子をコードするヌクレオチド配列を含む請求項９の樹状細胞。
【請求項１５】
樹状細胞のＴ細胞活性化能力を調節するための方法であって、樹状細胞と会合する少なくとも１種類のサイトカインの量を調節する工程を含む方法。
【請求項１６】
少なくとも１種類のサイトカインがＩＬ−７、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２からなる群より選択される請求項１５の方法。
【請求項１７】
細胞と会合するＩＬ−７の量が増加される請求項１６の方法。
【請求項１８】
細胞と会合するＩＬ−１２の量が増加される請求項１６の方法。
【請求項１９】
細胞と会合するＩＬ−１０の量が減少される請求項１６の方法。
【請求項２０】
樹状細胞と会合する少なくとも１種類のサイトカインの量を調節する工程が、細胞を可溶性サイトカインと接触させることを含む請求項１５の方法。
【請求項２１】
樹状細胞と会合する少なくとも１種類のサイトカインの量を調節する工程が、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１０に特異的なｓｉＲＮＡからなる群より選択される作用因子をコードするヌクレオチド配列を含む精製核酸を樹状細胞に導入することを含む請求項１５の方法。
【請求項２２】
レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列およびｓｉＲＮＡをコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２３】
樹状細胞における遺伝子の発現を調節するための方法であって、レンチウイルスから誘導される第１ヌクレオチド配列およびｓｉＲＮＡをコードする第２ヌクレオチド配列を含む核酸を樹状細胞に導入する工程を含む方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５０５２８０（Ｐ２００６−５０５２８０Ａ）
【公表日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５１８４２（Ｐ２００４−５５１８４２）
【出願日】平成１５年１１月７日（２００３．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３５４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４４１４７
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０５１６６３０６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月７日（２００３．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３５４８２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４４１４７
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０５１６６３０６）
【Ｆターム（参考）】
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