改変配列を有するレオウイルス
本発明は、改変レオウイルス核酸配列および改変レオウイルスポリペプチド配列、ならびにかかる改変核酸またはポリペプチド配列を含むレオウイルスを提供する。本発明は、改変配列を有するレオウイルスを含む医薬組成物、ならびにかかるレオウイルスを作製および使用する方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づいて、２００７年３月１２日提出の米国特許出願第６０／８９４，４２５号、および２００７年１１月２１日提出の米国特許出願第６０／９８９，５６８号に対する優先権を主張し、いずれも参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ウイルスに関連し、より具体的には改変配列を有するレオウイルスに関する。
【背景技術】
【０００３】
レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）という名称は、呼吸器および腸管オーファン（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｏｒｐｈａｎ）ウイルスの頭文字に由来し、初期単離株はヒト呼吸器および腸管から得られたが、重篤な疾患とは関連しないことを反映する。レオウイルスは、二本鎖の分節ＲＮＡゲノムを有する。ビリオン(ウイルス粒子)は、直径６０〜８０ｎｍであり、同心状の2つのカプシドシェルを有し、これらの各々は、二十面体である。哺乳動物のレオウイルスゲノムは、総ゲノムサイズが〜２３．５ｋｂｐで、１０の個々の分節において二本鎖ＲＮＡで構成される。個々のＲＮＡ分節は、サイズが異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願第６０／８９４，４２５号
【特許文献２】米国特許出願第６０／９８９，５６８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｂｉｎの１９５９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０：９６６
【非特許文献２】Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎの１９６０，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，７１：２４２、ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９６７，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ，２３：１５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
３つの血清学的に異なるが、関連する種類のレオウイルスが、哺乳動物種：１型（代表的な株は、例えば、Ｌａｎｇ（Ｔ１Ｌ）を含む）、２型（代表的な株は、例えば、Ｊｏｎｅｓ（Ｔ２Ｊ）を含む）、および３型（代表的な株は、例えば、ＤｅａｒｉｎｇまたはＡｂｎｅｙ（それぞれＴ３ＤまたはＴ３Ａ）を含む）から回収されている。３つの血清型は、中和および赤血球凝集抑制アッセイに基づいて容易に同定可能である（例えば、Ｓａｂｉｎの１９５９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０：９６６、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｒｏｓｅｎの１９６０，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，７１：２４２、ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９６７，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ，２３：１５０を参照）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書では、改変核酸およびポリペプチド配列を有するレオウイルスを提供する。配列改変は、例えば、１つもしくは複数のレオウイルスゲノム分節に改変を含む。改変配列を有するレオウイルスを含む医薬組成物、ならびにかかるレオウイルスを使用する方法も提供する。
【０００８】
一態様においては、本発明は、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するλ−３ポリペプチドを有するレオウイルス、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するσ−３ポリペプチド、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するμ−１ポリペプチド、および／または１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するμ−２ポリペプチドを提供する。かかるレオウイルスは、例えば、非自然発生的であることがある。別の態様においては、本発明は、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するレオウイルスλ−３ポリペプチド、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するレオウイルスσ−３ポリペプチド、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するレオウイルスμ−１ポリペプチド、および／または１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するレオウイルスμ−２ポリペプチドを提供する。
【０００９】
一例として、λ−３ポリペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、残基２１４におけるＶａｌ、残基２６７におけるＡｌａ、残基５５７におけるＴｈｒ、残基７５５におけるＬｙｓ、残基７５６におけるＭｅｔ、残基９２６におけるＰｒｏ、残基９６３におけるＰｒｏ、残基９７９におけるＬｅｕ、残基１０４５におけるＡｒｇ、残基１０７１におけるＶａｌ、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。アミノ酸配列が残基２１４においてＶａｌ、または残基１０７１においてＶａｌである場合、アミノ酸配列は、アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含むことに留意されたい。一実施形態においては、λ−３ポリペプチドは、配列番号１８に示される配列を含む。
【００１０】
さらなる一例として、σ−３ポリペプチドにおける１つもしくは複数のアミノ酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる、残基１４におけるＬｅｕ、残基１９８におけるＬｙｓ、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。アミノ酸配列が残基１４においてＬｅｕである場合、アミノ酸配列は、アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含むことに留意されたい。一実施形態においては、σ−３ポリペプチドは、配列番号１４に示される配列を含む。
【００１１】
さらなる一例として、μ−１ポリペプチドにおける１つもしくは複数のアミノ酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる、残基７３においてＡｓｐであり得る。一実施形態においては、μ−１ポリペプチドは、配列番号１６に示される配列を含む。
【００１２】
また一例として、アミノ酸改変μ−２ポリペプチドは、ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる、残基５２８においてＳｅｒであり得る。一実施形態においては、μ−１ポリペプチドは、配列番号１５に示される配列を含む。
【００１３】
１つもしくは複数の改変を有する本明細書で説明されるようなレオウイルスは、レオウイルスσ−２ポリペプチドをさらに含み得る。かかるσ−２ポリペプチドは、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９４６８４．１に関連して番号付けられる、７０位、１２７位、１９５位、２４１位、２５５位、２９４位、２９６位または３４０位のうちの１つもしくは複数においてＣｙｓを有し得る。一実施形態においては、σ−２ポリペプチドは、配列番号１２に示される配列を含む。
【００１４】
別の態様においては、本発明は、１つもしくは複数の核酸改変を有するＬ１ゲノム分節を有するレオウイルス、１つもしくは複数の核酸改変を有するＳ４ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ１ゲノム分節、および／または１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ２ゲノム分節を提供する。かかるレオウイルスは、例えば、非自然発生的であることがある。別の態様においては、本発明は、１つもしくは複数の核酸改変を有するＬ１ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するＳ４ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ１ゲノム分節、および／または１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ２ゲノム分節を提供する。
【００１５】
一例として、Ｌ１ゲノム分節における１つもしくは複数の核酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、６６０位におけるＴ、８１７位におけるＧ、１６８７位におけるＡ、２２８３位におけるＧ、２２８４〜２２８６位におけるＡＴＧ、２９７４位におけるＣ、２９０５位におけるＣ、２９５３位におけるＣ、３１５３位におけるＡ、または３２３１位におけるＧを提供する。一実施形態においては、Ｌ１ゲノム分節は、配列番号８に示される配列を含む。
【００１６】
さらなる一例として、Ｓ４ゲノム分節における１つもしくは複数の核酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる、７４位においてＡ、６２４位においてＡであり得る。一実施形態においては、Ｓ４ゲノム分節は、配列番号４に示される配列を含む。
【００１７】
さらなる一例として、Ｍ２ゲノム分節における核酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる、２４８位においてＣであり得る。一実施形態においては、Ｍ２ゲノム分節は、配列番号６に示される配列を含む。
【００１８】
また一例として、Ｍ１ゲノム分節における核酸改変は、ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる、１５９５位においてＴであり得る。一実施形態においては、Ｍ１ゲノム分節は、配列番号５に示される配列を含む。
【００１９】
本明細書で説明されるようなレオウイルスは、本明細書で開示される任意の改変または改変の組み合わせを含み得る。一部の実施形態においては、本明細書で説明されるようなレオウイルスは再集合体である。ある実施形態においては、本明細書で説明されるようなレオウイルスは、配列番号１〜１０に示される配列、または配列番号１１、１２、および１６〜２１、ならびに配列番号１３または１４のいずれかまたは両方に示されるポリペプチドを含む。一実施形態においては、本明細書で開示されるようなレオウイルスは、ＩＤＡＣ受入番号１９０９０７−０１として同定される。
【００２０】
本明細書で開示されるようなレオウイルスは、概して、対応する改変を含まないレオウイルスを超える増殖利点を呈する。代表的な増殖利点は、細胞溶解率の増加；プラーク作製サイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増大または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞の免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で説明されるようなレオウイルスは、医薬的に容認可能な担体とともに、医薬組成物に含み得る。かかる医薬組成物は、例えば、１つもしくは複数の化学療法薬および／または１つもしくは複数の免疫抑制剤を含むことができる。
【００２２】
さらに別の態様においては、本発明は、改良レオウイルスを作製する方法を提供する。かかる方法は、概して、レオウイルスの核酸配列を改変するステップと、１つもしくは複数の改良レオウイルスを選択するステップと、を含む。一部の実施形態においては、改変するステップは、例えば、レオウイルスに突然変異を生じさせるステップを含む。代表的な種類の突然変異誘発は、部位特異的突然変異誘発および化学的突然変異誘発を含むが、これらに限定されない。他の実施形態においては、改変するステップは、レオウイルスをヒト細胞株において培養するステップを含む。
【００２３】
本明細書において開示される方法に従って作製される改良レオウイルスは、細胞溶解率の増加；プラーク作製サイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増大または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞の免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力のために選択することができる。
【００２４】
さらに別の態様においては、本発明は、患者における増殖性疾患を治療する方法を提供する。かかる方法は、概して、本明細書で説明されるような改変レオウイルス、またはかかる改変レオウイルスを含有する医薬組成物を患者に投与するステップを含む。通常、レオウイルスは、腫瘍崩壊を生じさせるのに有効な量で投与し、１回以上投与することができる。代表的な投与経路は、例えば、直接注射、経静脈的、経脈管的、髄腔内、筋肉内、皮下的、骨盤内、局所的、経口的、経直腸的、経膣的、経鼻腔的、または吸入による。本明細書で説明されるような増殖性疾患を治療する方法は、手術、化学療法、放射線治療、および免疫抑制療法などの１つもしくは複数の処置を伴い得る。
【００２５】
別の態様においては、本発明は、本明細書で説明されるような改変配列、または改変配列を有するゲノム分節のいずれかの組み合わせを有するレオウイルスを含むキット（または製品）を提供する。キットは、本明細書で説明されるような１つもしくは複数の薬剤も含み得る。
【００２６】
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および化学的用語は、本発明が属する当該技術分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または相当する方法および材料は、本発明の実施または試験において使用できるが、適切な方法および材料は、以下に説明する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例証であり、限定することを意図しない。本明細書において言及されるすべての発行物、特許出願、特許、および別の参考文献は、それら全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本発明の１つもしくは複数の実施形態に関する詳細は、添付の図面および以下の説明に記載する。本発明の別の特徴、目的、および利点は、図面および詳細な説明、および請求項から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】代表的なＳ１セグメント（配列番号１）、Ｓ２セグメント（配列番号２）、Ｓ３セグメント（配列番号３）、およびＳ４セグメント（配列番号４）のヌクレオチド配列である。
【図２】代表的なＭ１セグメント（配列番号５）、Ｍ２セグメント（配列番号６）、およびＭ３セグメント（配列番号７）のヌクレオチド配列である。
【図３】代表的なＬ１セグメント（配列番号８）、Ｌ２セグメント（配列番号９）、およびＬ３セグメント（配列番号１０）のヌクレオチド配列である。
【図４】代表的なσ−１ポリペプチド（配列番号１１）、σ−２ポリペプチド（配列番号１２）、σ−ＮＳポリペプチド（想定されるコード化配列１、配列番号１３；想定されるコード化配列２、配列番号１４）、およびσ−３ポリペプチド（配列番号１５）のアミノ酸配列である。
【図５】代表的なμ−２ポリペプチド（配列番号１６）、μ−１ポリペプチド（配列番号１７）、およびμ−ＮＳポリペプチド（配列番号１８）のアミノ酸配列である。
【図６】代表的なλ−３ポリペプチド（配列番号１９）、λ−２ポリペプチド（配列番号２０）、およびλ−１ポリペプチド（配列番号２１）のアミノ酸配列である。
【００２９】
様々な図面における同様の参照記号は、同様の要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、レオウイルスのヌクレオチドおよびアミノ酸配列における改変を説明する。かかる改変は、ウイルスが自身で複製および／またはパッケージする能力に影響し、したがって、レオウイルスの感染性および／または複製率を変更するように任意に選択する。
【００３１】
改変配列を有するレオウイルスおよび作製方法
任意の３型哺乳動物オルトレオウイルス（本明細書では単に「レオウイルス」と称する）からのゲノム分節のいずれかを、本明細書で開示されるように改変することができる。代表的な３型哺乳動物オルトレオウイルスは、ＤｅａｒｉｎｇおよびＡｂｎｅｙ株を含むが、これらに限定されない。例えば、ＡＴＣＣ受入番号ＶＲ−２３２およびＶＲ−８２４を参照されたい。本明細書で開示されるように改変できるレオウイルスは、自然発生的レオウイルス（例えば、患者など自然のソースから単離される）および再集合体レオウイルス（例えば、米国特許第７，１６３，６７８を参照）を含む。
【００３２】
レオウイルスの異なるゲノム分節に対する代表的な改変、およびコード化されたポリペプチドにおけるそれらの発現を表１に示す。表１に示される改変は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写活性、および／またはＲＮＡ結合に関連した分節コード化ポリペプチドの配列における改変（改変の数および改変の多くが持つ非保守的性質の両方）を示す。例えば、本明細書で開示される新規改変の多くは、Ｌ１ゲノム分節に位置する。野生型Ｌ１ゲノム分節は、１，２６７アミノ酸（１４２ｋＤａ）タンパク質特異的λ−３をコード化する。λ−３は、レオウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの触媒サブユニットを表し、レオウイルス粒子内のプラスおよびマイナス鎖ＲＮＡ合成の両方を媒介する。さらなる改変は、Ｍ２ゲノム分節において観察された。野生型Ｍ２ゲノム分節は、粒子結合転写の調節に関与する、７０８アミノ酸（７６ｋＤａ）タンパク質特異的μ−１をコード化する。加えて、改変は、それぞれσ−３およびμ−２をコード化し、転写または一本鎖または二本鎖ＲＮＡ結合に関与するＳ４およびＭ１ゲノム分節においても観察された。
【００３３】
したがって、本開示は、１つもしくは複数の核酸改変をそれぞれのゲノム分節に含みＬ１、Ｓ４、Ｍ１、Ｍ２またはかかるゲノム分節のいずれかの組み合わせを提供する。本明細書では、１つもしくは複数の核酸改変を有するレオウイルスＬ１ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するレオウイルスＳ４ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するレオウイルスＭ１ゲノム分節、および／または１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ２ゲノム分節を提供する。
【００３４】
レオウイルスＬ１ゲノム分節は、例えば、１つもしくは複数の以下のヌクレオチド：６６０位におけるＴ、８１７位におけるＧ、１６８７位におけるＡ、２２８３位におけるＧ、２２８４〜２２８６位におけるＡＴＧ、２７９４位におけるＣ、２９０５位におけるＣ、２９５３位におけるＣ、３１５３位におけるＡ、または３２３１位におけるＧのうちの１つもしくは複数のいずれかの組み合わせを含む（ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる）。レオウイルスＳ４ゲノム分節は、例えば、１つもしくは複数の以下のヌクレオチド：７４位におけるＡまたは６２４位におけるＡのいずれかの組み合わせを有する（ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる）。レオウイルスＭ１ゲノム分節は、例えば、１５９５位におけるＴヌクレオチドを有する（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる）。レオウイルスＭ２ゲノム分節は、例えば、２４８位におけるＣヌクレオチドを有する（ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる）。指示された位置における指示されたヌクレオチドは、一般のデータベースで入手可能な別の対応する配列と比較した場合の改変を表す（例えば、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１、Ｋ０２７３９、ＡＦ４６１６８４．１、およびＭ２０１６１．１）。
【００３５】
レオウイルスλ−３ポリペプチドは、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸残基：残基２１４におけるＶａｌ、残基２６７におけるＡｌａ、残基５５７におけるＴｈｒ、残基７５５におけるＬｙｓ、残基７５６におけるＭｅｔ、残基９２６におけるＰｒｏ、残基９６３におけるＰｒｏ、残基９７９におけるＬｅｕ、残基１０４５におけるＡｒｇ、または残基１０７１におけるＶａｌのいずれかの組み合わせを有する（ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる）。ポリペプチド配列が残基２１４においてＶａｌまたは残基１０７１においてＶａｌを含む場合、ポリペプチド配列は、アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含むことに留意されたい。レオウイルスσ−３ポリペプチドは、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸残基：残基１４におけるＬｅｕまたは残基１９８におけるＬｙｓのいずれかの組み合わせを有する（ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる）。ポリペプチド配列が残基１４においてＬｅｕを含む場合、ポリペプチド配列は、アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含むことに留意されたい。レオウイルスμ−１ポリペプチドは、例えば、残基７３においてＡｓｐを有する（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる）。レオウイルスμ−２ポリペプチドは、例えば、残基５２８においてＳｅｒを有する（ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる）。指示された位置における指示されたアミノ酸は、一般のデータベースで入手可能な別の対応する配列と比較した場合の改変を表す（例えば、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１、Ｋ０２７３９、ＡＦ４６１６８４．１、およびＭ２０１６１．１）。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「非自然発生的」レオウイルスは、例えば、野生分離株（例えば、患者）に由来する野生型配列と比較して、少なくとも１つの核酸またはアミノ酸改変を有するレオウイルスである。「非自然発生的」レオウイルスは、研究室において操作または改変されたウイルスを意味する。かかる操作または改変されたレオウイルスは、実験室株または突然変異型を含む。これらの型は、核酸および／またはアミノ酸配列において、例えば、ＤｅａｒｉｎｇおよびＡｂｎｅｙ株（例えば、それぞれＡＴＣＣ ＶＲ−８２４およびＶＦ−２３２）から区別できる。１つもしくは複数のゲノム分節, コード化したポリペプチド, または両方に対する代表的な改変を本明細書で開示する。本明細書で記載される１つもしくは複数の改変を含むゲノム分節またはポリペプチドに加えて、レオウイルスは、Ｓ２ゲノム分節を任意に含み、σ−２ポリペプチドをコード化する。σ−２ポリペプチドは、例えば、以下の位置（ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９４６８４．１に関連して番号付けられる）：７０位、１２７位、１９５位、２４１位、２５５位、２９４位、２９６位、または３４０位、のうちの１つもしくは複数またはすべてにおいてＣｙｓを有する。
【００３７】
改変は、概して核酸レベルで生じ、コード化したポリペプチドにおいて発現し得るか、またはしない場合がある。核酸に対する改変は、単発性または多発性ヌクレオチド転位（プリンからプリンまたはピリミジンからピリミジン）または塩基転換（プリンからピリミジンまたはその逆）、および単発性または多発性ヌクレオチド欠失または挿入を含むが、これらに限定されない。核酸における改変は、コード化したポリペプチドにおける１つもしくは複数の保守的または非保守的アミノ酸置換、その地点からコード化される全く異なるポリペプチドをもたらす翻訳の読み枠におけるシフト（フレームシフト）、切断されたポリペプチドをもたらす早期終止コドン（「切断」）を生じ得るか、またはレオウイルス核酸における改変は、コード化したポリペプチドを全く変更しない場合がある（「サイレント」または「ナンセンス」）。保守的および非保守的アミノ酸置換に関する開示は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ，１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２３３：７１６−３８、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１９、および米国特許第４，５５４，１０１を参照されたい。
【００３８】
レオウイルス粒子からの核酸は、例えば、市販の標準手法を使用して単離する。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｃｈ５２，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｋｎｉｐｅ ＆ Ｈｏｗｌｅｙ，ｅｄｓ．，２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓも参照されたい。本明細書で使用されるように、「単離」核酸は、それらが通常関連する別の核酸から本質的に分離される核酸を意味する。したがって、「単離」核酸は、本質的に非レオウイルス（例えば、宿主細胞）核酸を含まないレノウイルス核酸、または本質的に別のゲノム分節に対応する核酸を含まないレノウイルスゲノム分節を含むが、これらに限定されない。加えて、単離核酸は、組み換えまたは合成核酸などの人工核酸を含む。
【００３９】
改変は、当該技術分野において既知の任意の数の方法を使用して、レオウイルスの核酸に生成する。例えば、部位特異的突然変異誘発を使用して、レオウイルス核酸配列を改変することができる。部位特異的突然変異誘発の最も一般的な方法の１つは、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発である。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発において、配列において望ましい変更をコード化するオリゴヌクレオチドは、対象となるＤＮＡの１つの鎖にアニールさせ、ＤＮＡ合成を開始するためのプライマとして作用する。この方法において、配列変更を含むオリゴヌクレオチドは、新しく合成された鎖に組み込まれる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７、Ｌｅｗｉｓ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３４３９、Ｂｏｈｎｓａｃｋ，１９９６，Ｍｅｔｈ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，５７：１、Ｄｅｎｇ ＆ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，１９９２，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００：８１、ａｎｄ Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，５７：１５７を参照されたい。
【００４０】
当該技術分野における別の方法を日常的に使用して、改変を配列に導入する。例えば、改変核酸は、ＰＣＲまたは化学合成を使用して生成するか、またはアミノ酸配列に望ましい変更を有するポリペプチドは、化学的に合成することができる。例えば、ＢａｎｇおよびＫｅｎｔの２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：５０１４−９およびその参考文献を参照されたい。レオウイルスが通常増殖しない細胞型（例えば、ヒト細胞）および／または化学的突然変異誘発に関する選択（例えば、ＲｕｄｄおよびＬｅｍａｙの２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８６：１４８９−９７を参照）を使用して、レオウイルスの核酸に改変を生成することもできる。例えば、表１に示される改変は、典型的にはレオウイルスを培養する技術において使用されないヒト細胞（例えば、ヒト胎児肝臓（ＨＥＫ）２９３細胞）上でレオウイルスを培養することによって生成した。それに対して、レオウイルスを培養するために一般に使用される細胞は、例えば、Ｔｙｌｅｒの“Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ”Ｃｈ ５３，ｐａｇｅ １７３１−２，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ編の２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて説明される。本明細書で説明される改変は、レオウイルスによるヒト細胞への適合を表す。これらのプラーク精製ステップそれぞれにおいて、最大プラーク（三重プラーク精製）を選択することによる選択ステップもあり、これらの細胞において、増殖または毒性利点があった。
【００４１】
１つもしくは複数の改変をレオウイルス核酸またはポリペプチドに導入した後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ウイルス粒子を再構成する。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈ ５２，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｋｎｉｐｅ ＆ Ｈｏｗｌｅｙ ｅｄｓ．，２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３９（４）：７９１−８１０、および米国特許第７，１８６，５４２号、第７，０４９，１２７号、第６，８０８，９１６号、および第６，５２８，３０５号を参照されたい。配列に１つもしくは複数の改変を有するレオウイルスは、例えば、マウスＬ９２９細胞または腫瘍性細胞（例えば、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−２２）、ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−３０）、またはＭＤＡ ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ１３２細胞）において培養し、例えば、１つもしくは複数の改変を含まないレオウイルスを超える増殖利点を示し得る任意の数の性質に基づいて選択する。細胞株（腫瘍性またはその他）における培養および／または動物モデル系の感染に続いて、レオウイルスを選択する。
【００４２】
かかる性質は、溶解率の増加；プラーク作製サイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増加または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞の免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力を含むが、これらに限定されない。追加として、改変配列を有するレオウイルスは、例えば、活性Ｒａｓ経路を有する哺乳動物細胞を溶解性感染させる能力のために選択する。例えば、米国特許第７，０５２，８３２号を参照されたい。
【００４３】
レオウイルス粒子は、当該技術分野において既知の任意の数の方法を使用して取得する。例えば、レオウイルスをＬ９２９マウス線維芽細胞またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）において培養し、標準手法を使用してウイルス粒子を精製する。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈ ５２，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｋｎｉｐｅ ＆ Ｈｏｗｌｅｙ ｅｄｓ．，２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｓｍｉｔｈｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３９（４）：７９１−８１０、および米国特許第７，１８６，５４２号、第７，０４９，１２７号、第６，８０８，９１６号、および第６，５２８，３０５号を参照されたい。本明細書で使用されるように、「精製された」ウイルス粒子は、それに自然に付随する細胞構成要素から本質的に分離されるウイルス粒子を意味する。通常、ウイルス粒子は、それらが乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）であり、ウイルスが自然に関連するタンパク質および別の細胞構成要素を含まない場合に「精製された」と見なされる。
【００４４】
表１に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸改変を含む、図１、２、および３（配列番号１〜１０）に示される核酸配列および図４、５、および６（配列番号１１〜２０）に示されるアミノ酸配列を有するレオウイルスは、２００７年９月１９日にカナダ国際寄託当局（ＩＤＡＣ，カナダ公衆衛生局国立微生物学研究所，１０１５ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｔ．，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ Ｃａｎａｄａ Ｒ３Ｅ ３Ｒ２）に寄託され、受入番号１９０９０７−０１が付与された。本寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に基づいて維持される。本寄託は例示的であり、単に当業者に対する便宜目的で行い、寄託が特許性を必要とすることを是認するものではない（例えば、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２に基づく）。
【００４５】
改変配列を有するレオウイルスを使用する方法
前述したように（例えば、米国特許第６，１１０，４６１号、第６，１３６，３０７号、第６，２６１，５５５号、第６，３４４，１９５号、第６，５７６，２３４号、および第６，８１１，７７５号）、レオウイルスは、宿主細胞のＲａｓ経路機構を使用して、二本鎖ＲＮＡ活性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）を下方制御し、したがって細胞内で複製する。これらの発見に基づいて、レオウイルスを使用して哺乳動物における増殖性疾患を治療するための方法が開発されている。代表的な哺乳動物は、マウス、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトを含む。本明細書で使用されるように、「患者」は増殖性疾患を有する任意の哺乳動物を含む。
【００４６】
「増殖性疾患」は、細胞が正常な組織の増殖よりも速く増殖する、任意の細胞性疾患である。したがって、「増殖細胞」は、正常細胞よりも速く増殖している細胞である。増殖性疾患は、腫瘍とも称される新生物を含むが、これに限定されない。新生物は、膵癌、乳癌、脳腫瘍（例えば、膠芽細胞腫）、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、腎癌、副腎癌、肝臓癌、神経線維腫症、および白血病を含むが、これらに限定されない。新生物は、充実性新生物（例えば、非上皮性悪性腫瘍または癌腫）または細網内皮系（例えば、リンパ腫または白血病）に影響する癌性増殖を含む。別の増殖性疾患は、神経線維腫症を含むが、これに限定されない。
【００４７】
一般に、レオウイルスが治療として使用される増殖性疾患において、増殖細胞の少なくとも一部は、Ｒａｓ遺伝子（またはＲａｓシグナル経路の要素）が、直接（例えば、Ｒａｓにおける活性突然変異による）または間接的に（例えば、Ｒａｓ経路における上流または下流要素の活性化による）活性化される突然変異を有する。Ｒａｓ経路における上流要素の活性化は、例えば、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはＳｏｓを用いる形質転換を含む。例えば、Ｗｉｅｓｓｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｗｉｔｔｉｎｇｈｏｆｅｒ，１９９４，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，６（３）：２４７−２６７、ａｎｄ Ｂａｒｂａｃｉｄ，１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，７７９−８２７を参照されたい。Ｒａｓ経路における下流要素の活性化は、例えば、Ｂ−Ｒａｆ内の突然変異を含む。例えば、Ｂｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：６９９７−７０００を参照されたい。加えて、レオウイルスは、ＰＫＲの突然変異または調節障害によって引き起こされる増殖性疾患を治療するために有用である。例えば、Ｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ Ｊ，１７：３３５１−６６２を参照されたい。
【００４８】
本明細書で開示されるような改変配列を有するレオウイルスは、増殖性疾患を有する哺乳動物に投与する。本明細書で使用されるように、投与は、レオウイルスが増殖細胞に接触するようなレオウイルスの送達を意味する。レオウイルスが投与される経路は、疾患の種類および増殖細胞の位置に依存する。様々な投与経路を採用することができる。例えば、アクセス可能な充実性新生物の場合、レオウイルスは、直接注射によって投与する。造血新生物の場合、例えば、レオウイルスは、経静脈的または経脈管的に投与する。ある新生物、例えば、転移または脳腫瘍などの体内で容易にアクセスできない新生物の場合、レオウイルスは、哺乳動物の体を通して全身的に輸送され、それによって新生物に到達するような方法で（例えば、髄腔内、経静脈的、筋肉内、皮下的、または経腹膜的に）投与する。レオウイルスは、例えば、局部的（例えば、黒色腫の場合）、経口的（例えば、口腔または食道新生物の場合）、直腸的（例えば、結腸直腸新生物の場合）、経膣的（例えば、子宮頚部または膣新生物の場合）、経鼻的、または吸引によって（例えば、肺新生物の場合）、局所的にも投与する。レオウイルスは、１つもしくは複数の経路によって、および／または個体における１つもしくは複数の位置に任意に投与する。
【００４９】
標的投与を使用して、レオウイルスを投与できる。例えば、レオウイルスを含む樹状細胞を被験体に投与できる。例えば、米国特許公開第２００８／００１４１８３号を参照されたい。標的送達の別の実施例においては、担体細胞を使用して、増殖性疾患の細胞を標的し、それらが担持するレオウイルスの免疫認識を回避する。例えば、Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１４：３７−４４、および国際公開第ＷＯ２００８／００９１１５号を参照されたい。
【００５０】
本明細書で開示されるような改変配列を有するレオウイルスは、増殖性疾患を治療するために十分な量（例えば、「有効量」）で投与する。改変配列を有するレオウイルスを増殖細胞に投与することが、疾患の１つもしくは複数の症状または臨床的徴候に影響する場合、例えば、治療を行わない場合における兆候または症状と比較して、細胞の溶解（例えば、「腫瘍崩壊」）が増大する、増殖細胞数が減少する、新生物のサイズまたは進行が減退する、新生物に関連した疼痛が低減する場合に、増殖性疾患は「治療される」。本明細書で使用されるように、「腫瘍崩壊」という用語は、増殖細胞の少なくとも１０％が溶解される（例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または７５％が溶解される）ことを意味する。溶解のパーセンテージは、例えば、哺乳動物の新生物のサイズまたは増殖細胞数の減少を測定する、または（例えば、増殖細胞のバイオプシから）生体外の細胞溶解量を測定することによって決定することができる。
【００５１】
改変配列を有するレオウイルスの有効量は、個別基準で決定され、少なくとも一部は、使用される特定のレオウイルス；個体の体格、年齢、性別；および増殖細胞のサイズおよび別の性質に基づく。例えば、ヒトの治療の場合、存在する増殖細胞または新生物の種類、サイズ、および数に基づいて、レオウイルスの約１０３〜１０１２プラーク作製単位（ＰＦＵ）を使用する。有効量は、体重１ｋｇ当たり約１．０ＰＦＵ〜体重１ｋｇ当たり約１０１５ＰＦＵであり得る（例えば、体重１ｋｇ当たり約１０２ＰＦＵ〜体重１ｋｇ当たり約１０１３ＰＦＵ）。レオウイルスは、１回量または多回量（例えば、２回、３回、４回、６回、またはそれ以上）で投与する。多回量は、同時にまたは（例えば、数日または数週間の期間をかけて）連続して投与する。改変配列を有するレオウイルスを用いる治療は、数日から数ヶ月、または疾患の減退が達成されるまで継続する。
【００５２】
本明細書で開示されるような改変配列を有するレオウイルスは、手術または増殖細胞（例えば、新生物）の除去と併せて、任意に投与されると考えられる。改変配列を有するレオウイルスは、放射線治療と併せて、または放射線治療に加えて、任意に投与されることも考えられる。さらに、改変配列を有するレオウイルスは、周知の抗癌性化合物、化学療法薬、および／または免疫抑制剤と併せて、またはそれらに加えて、任意に投与されると考えられる。かかる薬剤は、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、ヒドロキシウレア、ゲムシタビン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン（エピルビシン、イリノテカン、およびドキソルビシン）、ハーセプチンなどの受容体に対する抗体、エトポシドまたはカンプトセシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、プレグナソーム、カルボプラチンおよびシスプラチンなどのプラチナ化合物、タキソールおよびタキソテールなどのタキサン、タモキシフェンおよび抗エストロゲンなどのホルモン治療薬、インターロイキン、インターフェロン、アロマターゼ阻害薬、黄体ホルモン薬、ＬＨＲＨ類似体、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、ラパマイシンおよびその誘導体；例えば、Ｈｏｍｉｃｓｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６５：６８８２−９０、ａｎｄ Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，４：６２１−３５）を参照）、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
さらに改変配列を有するレオウイルスは、内皮透過性を増加させる、および／または間質液圧を減少させることができる薬剤と併せて投与されると考えられる。かかる薬剤は、例えば、ＴＮＦ−αを含む。例えば、Ｓａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：１７５−１８２を参照されたい。改変配列を有するレオウイルスは、本明細書で説明される治療法および薬剤のいずれかの組み合わせと併せて投与することができると考えられる。
【００５４】
医薬組成物
少なくとも１つが本明細書で説明されるような改変配列を有する、１つもしくは複数のレオウイルスを含む医薬組成物を提供する。例えば、米国特許第６，５７６，２３４号を参照されたい。少なくとも１つが改変配列を有する１つもしくは複数のレオウイルスに加えて、医薬組成物は、典型的には医薬的に容認可能な担体を含む。医薬的に容認可能な担体は、レオウイルスに対する媒体、担体、または培地として作用する固体、半固体、または液体材料を含む。したがって、例えば、改変配列を有するレオウイルスを含む組成物は、錠剤、ピル、粉末、トローチ剤、小袋、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、乳液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体としてまたは液体培地中）、例えば、重量で最大１０％の活性成分を含有する軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射液、および無菌パッケージ化粉末の形態である。
【００５５】
適切な担体の一部の実施例は、リン酸緩衝化生理食塩水または別の生理的に容認可能な緩衝液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ剤、およびメチルセルロースを含む。医薬組成物は、追加として、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油などの平滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、安息香酸メチルおよび安息香酸プロピルヘキセドリンなどの保存剤、甘味剤、および香料添加剤を含み得るが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物を配合して、当該技術分野において既知の処置を採用することによって投与した後に、改変配列を有するレオウイルスの迅速に、持続的に、または遅延的に放出できる。以下に説明する代表的な製剤に加えて、医薬組成物に使用するための別の適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ ＆ Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｅｎｓ）に見出される。
【００５６】
錠剤などの固体組成物を調製する場合、改変配列を有するレオウイルスは、医薬担体と混合して固体組成物を作製する。任意に、錠剤またはピルをコーティングするか、または別の方法で化合して、持続性作用の利益を提供する剤形を提供する。例えば、錠剤またはピルは、内部投与および外部投与成分を含み、後者は、前者を覆うエンベロープ形体である。２つの成分は、例えば、胃内の分解に耐えるように機能する腸溶層によって分離され、内部成分が無傷で十二指腸を通過し、または遅延放出することを可能にする。かかる腸溶層またはコーティングには様々な材料が使用され、かかる材料は、多くのポリマー酸、およびポリマー酸とセラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料との混合物を含む。
【００５７】
経口投与または注入用の改変配列を有するレオウイルスを含む液体製剤は、一般に、水溶液、適切に味を付けたシロップ、水性または油性懸濁液、およびコーン油、綿実油、ごま油、ココナッツ油、またはピーナッツ油などの食用油を含む味を付けた乳化剤、ならびにエリキシル剤および同様の医薬用賦形剤を含む。
【００５８】
吸入用または吹き入れ用の組成物は、医薬的に容認可能な水性または有機溶媒中の溶液および懸濁液、またはそれらの混合物、および粉末を含む。これらの液体または固体組成物は、本明細書で説明されるような適切な医薬的に容認可能な賦形剤を任意に含む。かかる組成物は、例えば、局所または全身的作用のために、経口または経鼻呼吸経路によって投与する。医薬的に容認可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によって噴霧する。噴霧した溶液は、例えば、噴霧装置、付属のフェイスマスクテント、または、間欠型正圧呼吸器から直接吸入する。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、例えば、適切な方法で製剤を送達する装置から、経口的または経鼻的に投与する。
【００５９】
本明細書で教示される方法で採用する別の製剤は、経皮的送達装置（「パッチ」）を採用する。かかる経皮的パッチを使用して、改変配列を有するレオウイルスを連続的または断続的に注入する。医薬剤を送達するための経皮パッチの構成および使用は、当該技術分野において既知の方法に従って行う。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号を参照されたい。かかるパッチは、改変配列を有するレオウイルスの連続的、パルス、またはオンデマンド送達用に構成する。
【００６０】
改変配列を有するレオウイルスは、任意に、投与前（例えば、医薬組成物に含める前）に、（例えば、キモトリプシンまたはトリプシンなどのプロテアーゼで処理することにより）化学的または生化学的に前処理する。プロテアーゼを用いた前処理は、ウイルスの外皮またはカプシドを取り除き、ウイルスの感染性を高めるために使用することができる。追加として、または代替として、改変配列を有するレオウイルスは、リポソームまたはミセルでコーティングし、レオウイルスに対する免疫を発達させた哺乳動物における免疫学的応答を低減または回避する。かかるレオウイルスは、「免疫保護レオウイルス」と称される。例えば、米国特許第６，５６５，８３１号および第７，０１４，８４７号を参照されたい。
【００６１】
改変配列を有するレオウイルスまたはかかるレオウイルスを含む医薬組成物は、キットにパッケージ化することができる。キットは、任意に１つもしくは複数の化学療法剤および／または免疫抑制剤（例えば、抗アンチ受容体抗体）を含むと考えられる。医薬組成物、例えば、単位剤形で製剤化される。「単位剤形」という用語は、ヒト被験体および他の哺乳動物に対する単位用量として適切な物理的に不連続な単位を意味し、各単位は、適切な医薬的に容認可能な担体に関連して、望ましい治療効果を生成するように計算された既定量の改変配列を有するレオウイルスを含有する。
【００６２】
本発明に従って、従来の分子生物学、微小生物学、生化学および組み換えＤＮＡ技術は、当該技術の範囲内で採用し得る。かかる技術は、文献において完全に説明する。本発明は、以下の実施例においてさらに説明し、請求項において説明する発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１−シークエンシングおよび解析
レオウイルスを産生するための培養は、懸濁適合したＨＥＫ２９３Ｓ万能細胞バンク（ＭＣＢ）から開始した。ＨＥＫ２９３細胞は、Ｌ−グルタミンで補充した無血清培地（ＨＥＫ２９３ ＳＦＭＩＩ）において維持した。ＨＥＫ２９３細胞は、３つの１５Ｌスピナーフラスコに増殖および播種し、３つのフラスコがそれぞれ１２Ｌになるまでさらに拡大した。レオウイルスによるＨＥＫ２９３の感染は、ウイルスを細胞培地に直接接種することによって行った。ＨＥＫ２９３Ｓ細胞の存続性が感染後２０〜５０％まで減少した際にウイルスを採取した。３つのスピナーすべてから得たウイルス材料を単一の無菌容器に貯留し、攪拌して均一混合液を作製した。３リットルの貯留した細胞懸濁液を除去し、円錐チューブに移して、最大３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、１００ｍＬの精製調節培地を用いて細胞を再懸濁し、アルコール−ドライアイス浴で３回スナップ凍結した後、種ストックとして使用するために無菌のラベル付きクリオバイアルに充填した。
【００６４】
ウイルスストックは、３回のプラーク精製を行うことによって調製した。付着したＨＥＫ２９３Ｓ細胞を６ウェル組織培養プレートに置き、上述の種ストックで感染させて、最大プラークのうちの２つを選んだ。これらの２つのプラークを個々に増幅および採取し、最大プラークのうちの２つを再度選んだ。この処置は、計３回再度繰り返した。２つのプラークのうち、１つは、後の拡大のための種ストックとして選択した。
【００６５】
培養は、上述の同一の懸濁液で適合したＨＥＫ２９３Ｓ ＭＣＢから開始し、Ｌ−グルタミンで補充した同一のＨＥＫ２９３無血清培地（ＨＥＫ２９３ ＳＦＭＩＩ）中で維持した。細胞をＴフラスコから最大多発性３Ｌスピナーフラスコまで増殖させた。感染は、ＨＥＫ２９３ ＳＦＭ培地中で、プラーク精製したウイルスを最初に希釈し、次いで、８〜１２ｍＬの希釈ウイルスを細胞培地に追加することによって行った。ＨＥＫ２９３Ｓ細胞の生存性が、感染後２０〜５０％まで減少した時点でウイルスを採取し、各スピナーを顕微鏡検査したところ、微生物汚染の欠失、および細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞中に存在することを確認した。ＣＰＥは、膨張した粒状の外観を呈する細胞によって示した。スピナーから得た材料を単一の無菌容器に貯留し、攪拌して均一混合物を作製し、大量の採取試料を取り除いた。残りの貯留した細胞懸濁液を円錐チューブに移し、最大３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、４００ｍＬの精製調節培地で細胞を懸濁し、濃縮細胞懸濁液をアルコール−ドライアイス浴で３回スナップ凍結して細胞を溶解した後、シーケンシング反応で使用するために無菌のラベル付きクリオバイアルに充填した。
【００６６】
両方のＲＮＡ鎖を両方向からシークエンシングし、それぞれ１０ゲノム分節の配列を重複するコンティグから組み立てた。各ゲノム分節の集合配列をＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴサーチで使用した（ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。ＮＣＢＩデータベースで見出された３つまたは４つの異なるレオウイルス配列の配置を試験し、最高の相同量を有する配置をさらなる解析に使用した。他の報告された配列と比較して、多型または改変を表１に示す。選択したレオウイルス株に固有のそれらの改変は、表１においてアスタリスク付きで示す。
【００６７】
【表１Ａ】
【００６８】
【表１Ｂ】
【００６９】
本発明は、その詳細な説明と併せて説明しているが、前述の説明は、例証を目的とするものであって、添付の請求項の範囲によって画定される、本発明の範囲を制限するものではないことを理解されたい。別の態様、利点、および改変は、以下の請求項の範囲内である。
【００７０】
使用できる、併用できる、調製に使用できる材料、組成物、および成分または開示される方法および組成物の産物を開示する。これらおよび別の材料は、本明細書で開示し、これら材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの成分の様々な個々の組み合わせおよび集合的組み合わせのそれぞれに関する特定の参考文献が明示的に開示されない場合があるが、本明細書においてそれぞれ特異的に考慮、説明することを理解されたい。例えば、レオウイルスの特定の改変または治療計画が開示および議論し、レオウイルスに対して作製できる多数の改変または計画について論じる場合、レオウイルスおよび計画の組み合わせおよび順列のそれぞれおよびすべては、それとは反対に明記されない限り、特異的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特異的に考慮および開示する。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づいて、２００７年３月１２日提出の米国特許出願第６０／８９４，４２５号、および２００７年１１月２１日提出の米国特許出願第６０／９８９，５６８号に対する優先権を主張し、いずれも参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ウイルスに関連し、より具体的には改変配列を有するレオウイルスに関する。
【背景技術】
【０００３】
レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）という名称は、呼吸器および腸管オーファン（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｅｎｔｅｒｉｃ Ｏｒｐｈａｎ）ウイルスの頭文字に由来し、初期単離株はヒト呼吸器および腸管から得られたが、重篤な疾患とは関連しないことを反映する。レオウイルスは、二本鎖の分節ＲＮＡゲノムを有する。ビリオン(ウイルス粒子)は、直径６０〜８０ｎｍであり、同心状の2つのカプシドシェルを有し、これらの各々は、二十面体である。哺乳動物のレオウイルスゲノムは、総ゲノムサイズが〜２３．５ｋｂｐで、１０の個々の分節において二本鎖ＲＮＡで構成される。個々のＲＮＡ分節は、サイズが異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願第６０／８９４，４２５号
【特許文献２】米国特許出願第６０／９８９，５６８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓａｂｉｎの１９５９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０：９６６
【非特許文献２】Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎの１９６０，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，７１：２４２、ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９６７，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ，２３：１５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
３つの血清学的に異なるが、関連する種類のレオウイルスが、哺乳動物種：１型（代表的な株は、例えば、Ｌａｎｇ（Ｔ１Ｌ）を含む）、２型（代表的な株は、例えば、Ｊｏｎｅｓ（Ｔ２Ｊ）を含む）、および３型（代表的な株は、例えば、ＤｅａｒｉｎｇまたはＡｂｎｅｙ（それぞれＴ３ＤまたはＴ３Ａ）を含む）から回収されている。３つの血清型は、中和および赤血球凝集抑制アッセイに基づいて容易に同定可能である（例えば、Ｓａｂｉｎの１９５９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０：９６６、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｒｏｓｅｎの１９６０，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，７１：２４２、ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ，１９６７，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ，２３：１５０を参照）。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書では、改変核酸およびポリペプチド配列を有するレオウイルスを提供する。配列改変は、例えば、１つもしくは複数のレオウイルスゲノム分節に改変を含む。改変配列を有するレオウイルスを含む医薬組成物、ならびにかかるレオウイルスを使用する方法も提供する。
【０００８】
一態様においては、本発明は、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するλ−３ポリペプチドを有するレオウイルス、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するσ−３ポリペプチド、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するμ−１ポリペプチド、および／または１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するμ−２ポリペプチドを提供する。かかるレオウイルスは、例えば、非自然発生的であることがある。別の態様においては、本発明は、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するレオウイルスλ−３ポリペプチド、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するレオウイルスσ−３ポリペプチド、１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するレオウイルスμ−１ポリペプチド、および／または１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するレオウイルスμ−２ポリペプチドを提供する。
【０００９】
一例として、λ−３ポリペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、残基２１４におけるＶａｌ、残基２６７におけるＡｌａ、残基５５７におけるＴｈｒ、残基７５５におけるＬｙｓ、残基７５６におけるＭｅｔ、残基９２６におけるＰｒｏ、残基９６３におけるＰｒｏ、残基９７９におけるＬｅｕ、残基１０４５におけるＡｒｇ、残基１０７１におけるＶａｌ、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。アミノ酸配列が残基２１４においてＶａｌ、または残基１０７１においてＶａｌである場合、アミノ酸配列は、アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含むことに留意されたい。一実施形態においては、λ−３ポリペプチドは、配列番号１８に示される配列を含む。
【００１０】
さらなる一例として、σ−３ポリペプチドにおける１つもしくは複数のアミノ酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる、残基１４におけるＬｅｕ、残基１９８におけるＬｙｓ、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。アミノ酸配列が残基１４においてＬｅｕである場合、アミノ酸配列は、アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含むことに留意されたい。一実施形態においては、σ−３ポリペプチドは、配列番号１４に示される配列を含む。
【００１１】
さらなる一例として、μ−１ポリペプチドにおける１つもしくは複数のアミノ酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる、残基７３においてＡｓｐであり得る。一実施形態においては、μ−１ポリペプチドは、配列番号１６に示される配列を含む。
【００１２】
また一例として、アミノ酸改変μ−２ポリペプチドは、ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる、残基５２８においてＳｅｒであり得る。一実施形態においては、μ−１ポリペプチドは、配列番号１５に示される配列を含む。
【００１３】
１つもしくは複数の改変を有する本明細書で説明されるようなレオウイルスは、レオウイルスσ−２ポリペプチドをさらに含み得る。かかるσ−２ポリペプチドは、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９４６８４．１に関連して番号付けられる、７０位、１２７位、１９５位、２４１位、２５５位、２９４位、２９６位または３４０位のうちの１つもしくは複数においてＣｙｓを有し得る。一実施形態においては、σ−２ポリペプチドは、配列番号１２に示される配列を含む。
【００１４】
別の態様においては、本発明は、１つもしくは複数の核酸改変を有するＬ１ゲノム分節を有するレオウイルス、１つもしくは複数の核酸改変を有するＳ４ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ１ゲノム分節、および／または１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ２ゲノム分節を提供する。かかるレオウイルスは、例えば、非自然発生的であることがある。別の態様においては、本発明は、１つもしくは複数の核酸改変を有するＬ１ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するＳ４ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ１ゲノム分節、および／または１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ２ゲノム分節を提供する。
【００１５】
一例として、Ｌ１ゲノム分節における１つもしくは複数の核酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、６６０位におけるＴ、８１７位におけるＧ、１６８７位におけるＡ、２２８３位におけるＧ、２２８４〜２２８６位におけるＡＴＧ、２９７４位におけるＣ、２９０５位におけるＣ、２９５３位におけるＣ、３１５３位におけるＡ、または３２３１位におけるＧを提供する。一実施形態においては、Ｌ１ゲノム分節は、配列番号８に示される配列を含む。
【００１６】
さらなる一例として、Ｓ４ゲノム分節における１つもしくは複数の核酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる、７４位においてＡ、６２４位においてＡであり得る。一実施形態においては、Ｓ４ゲノム分節は、配列番号４に示される配列を含む。
【００１７】
さらなる一例として、Ｍ２ゲノム分節における核酸改変は、ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる、２４８位においてＣであり得る。一実施形態においては、Ｍ２ゲノム分節は、配列番号６に示される配列を含む。
【００１８】
また一例として、Ｍ１ゲノム分節における核酸改変は、ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる、１５９５位においてＴであり得る。一実施形態においては、Ｍ１ゲノム分節は、配列番号５に示される配列を含む。
【００１９】
本明細書で説明されるようなレオウイルスは、本明細書で開示される任意の改変または改変の組み合わせを含み得る。一部の実施形態においては、本明細書で説明されるようなレオウイルスは再集合体である。ある実施形態においては、本明細書で説明されるようなレオウイルスは、配列番号１〜１０に示される配列、または配列番号１１、１２、および１６〜２１、ならびに配列番号１３または１４のいずれかまたは両方に示されるポリペプチドを含む。一実施形態においては、本明細書で開示されるようなレオウイルスは、ＩＤＡＣ受入番号１９０９０７−０１として同定される。
【００２０】
本明細書で開示されるようなレオウイルスは、概して、対応する改変を含まないレオウイルスを超える増殖利点を呈する。代表的な増殖利点は、細胞溶解率の増加；プラーク作製サイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増大または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞の免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で説明されるようなレオウイルスは、医薬的に容認可能な担体とともに、医薬組成物に含み得る。かかる医薬組成物は、例えば、１つもしくは複数の化学療法薬および／または１つもしくは複数の免疫抑制剤を含むことができる。
【００２２】
さらに別の態様においては、本発明は、改良レオウイルスを作製する方法を提供する。かかる方法は、概して、レオウイルスの核酸配列を改変するステップと、１つもしくは複数の改良レオウイルスを選択するステップと、を含む。一部の実施形態においては、改変するステップは、例えば、レオウイルスに突然変異を生じさせるステップを含む。代表的な種類の突然変異誘発は、部位特異的突然変異誘発および化学的突然変異誘発を含むが、これらに限定されない。他の実施形態においては、改変するステップは、レオウイルスをヒト細胞株において培養するステップを含む。
【００２３】
本明細書において開示される方法に従って作製される改良レオウイルスは、細胞溶解率の増加；プラーク作製サイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増大または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞の免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力のために選択することができる。
【００２４】
さらに別の態様においては、本発明は、患者における増殖性疾患を治療する方法を提供する。かかる方法は、概して、本明細書で説明されるような改変レオウイルス、またはかかる改変レオウイルスを含有する医薬組成物を患者に投与するステップを含む。通常、レオウイルスは、腫瘍崩壊を生じさせるのに有効な量で投与し、１回以上投与することができる。代表的な投与経路は、例えば、直接注射、経静脈的、経脈管的、髄腔内、筋肉内、皮下的、骨盤内、局所的、経口的、経直腸的、経膣的、経鼻腔的、または吸入による。本明細書で説明されるような増殖性疾患を治療する方法は、手術、化学療法、放射線治療、および免疫抑制療法などの１つもしくは複数の処置を伴い得る。
【００２５】
別の態様においては、本発明は、本明細書で説明されるような改変配列、または改変配列を有するゲノム分節のいずれかの組み合わせを有するレオウイルスを含むキット（または製品）を提供する。キットは、本明細書で説明されるような１つもしくは複数の薬剤も含み得る。
【００２６】
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および化学的用語は、本発明が属する当該技術分野において通常の技術を有する者に一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または相当する方法および材料は、本発明の実施または試験において使用できるが、適切な方法および材料は、以下に説明する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例証であり、限定することを意図しない。本明細書において言及されるすべての発行物、特許出願、特許、および別の参考文献は、それら全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本発明の１つもしくは複数の実施形態に関する詳細は、添付の図面および以下の説明に記載する。本発明の別の特徴、目的、および利点は、図面および詳細な説明、および請求項から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】代表的なＳ１セグメント（配列番号１）、Ｓ２セグメント（配列番号２）、Ｓ３セグメント（配列番号３）、およびＳ４セグメント（配列番号４）のヌクレオチド配列である。
【図２】代表的なＭ１セグメント（配列番号５）、Ｍ２セグメント（配列番号６）、およびＭ３セグメント（配列番号７）のヌクレオチド配列である。
【図３】代表的なＬ１セグメント（配列番号８）、Ｌ２セグメント（配列番号９）、およびＬ３セグメント（配列番号１０）のヌクレオチド配列である。
【図４】代表的なσ−１ポリペプチド（配列番号１１）、σ−２ポリペプチド（配列番号１２）、σ−ＮＳポリペプチド（想定されるコード化配列１、配列番号１３；想定されるコード化配列２、配列番号１４）、およびσ−３ポリペプチド（配列番号１５）のアミノ酸配列である。
【図５】代表的なμ−２ポリペプチド（配列番号１６）、μ−１ポリペプチド（配列番号１７）、およびμ−ＮＳポリペプチド（配列番号１８）のアミノ酸配列である。
【図６】代表的なλ−３ポリペプチド（配列番号１９）、λ−２ポリペプチド（配列番号２０）、およびλ−１ポリペプチド（配列番号２１）のアミノ酸配列である。
【００２９】
様々な図面における同様の参照記号は、同様の要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、レオウイルスのヌクレオチドおよびアミノ酸配列における改変を説明する。かかる改変は、ウイルスが自身で複製および／またはパッケージする能力に影響し、したがって、レオウイルスの感染性および／または複製率を変更するように任意に選択する。
【００３１】
改変配列を有するレオウイルスおよび作製方法
任意の３型哺乳動物オルトレオウイルス（本明細書では単に「レオウイルス」と称する）からのゲノム分節のいずれかを、本明細書で開示されるように改変することができる。代表的な３型哺乳動物オルトレオウイルスは、ＤｅａｒｉｎｇおよびＡｂｎｅｙ株を含むが、これらに限定されない。例えば、ＡＴＣＣ受入番号ＶＲ−２３２およびＶＲ−８２４を参照されたい。本明細書で開示されるように改変できるレオウイルスは、自然発生的レオウイルス（例えば、患者など自然のソースから単離される）および再集合体レオウイルス（例えば、米国特許第７，１６３，６７８を参照）を含む。
【００３２】
レオウイルスの異なるゲノム分節に対する代表的な改変、およびコード化されたポリペプチドにおけるそれらの発現を表１に示す。表１に示される改変は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、転写活性、および／またはＲＮＡ結合に関連した分節コード化ポリペプチドの配列における改変（改変の数および改変の多くが持つ非保守的性質の両方）を示す。例えば、本明細書で開示される新規改変の多くは、Ｌ１ゲノム分節に位置する。野生型Ｌ１ゲノム分節は、１，２６７アミノ酸（１４２ｋＤａ）タンパク質特異的λ−３をコード化する。λ−３は、レオウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの触媒サブユニットを表し、レオウイルス粒子内のプラスおよびマイナス鎖ＲＮＡ合成の両方を媒介する。さらなる改変は、Ｍ２ゲノム分節において観察された。野生型Ｍ２ゲノム分節は、粒子結合転写の調節に関与する、７０８アミノ酸（７６ｋＤａ）タンパク質特異的μ−１をコード化する。加えて、改変は、それぞれσ−３およびμ−２をコード化し、転写または一本鎖または二本鎖ＲＮＡ結合に関与するＳ４およびＭ１ゲノム分節においても観察された。
【００３３】
したがって、本開示は、１つもしくは複数の核酸改変をそれぞれのゲノム分節に含みＬ１、Ｓ４、Ｍ１、Ｍ２またはかかるゲノム分節のいずれかの組み合わせを提供する。本明細書では、１つもしくは複数の核酸改変を有するレオウイルスＬ１ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するレオウイルスＳ４ゲノム分節、１つもしくは複数の核酸改変を有するレオウイルスＭ１ゲノム分節、および／または１つもしくは複数の核酸改変を有するＭ２ゲノム分節を提供する。
【００３４】
レオウイルスＬ１ゲノム分節は、例えば、１つもしくは複数の以下のヌクレオチド：６６０位におけるＴ、８１７位におけるＧ、１６８７位におけるＡ、２２８３位におけるＧ、２２８４〜２２８６位におけるＡＴＧ、２７９４位におけるＣ、２９０５位におけるＣ、２９５３位におけるＣ、３１５３位におけるＡ、または３２３１位におけるＧのうちの１つもしくは複数のいずれかの組み合わせを含む（ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる）。レオウイルスＳ４ゲノム分節は、例えば、１つもしくは複数の以下のヌクレオチド：７４位におけるＡまたは６２４位におけるＡのいずれかの組み合わせを有する（ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる）。レオウイルスＭ１ゲノム分節は、例えば、１５９５位におけるＴヌクレオチドを有する（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる）。レオウイルスＭ２ゲノム分節は、例えば、２４８位におけるＣヌクレオチドを有する（ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる）。指示された位置における指示されたヌクレオチドは、一般のデータベースで入手可能な別の対応する配列と比較した場合の改変を表す（例えば、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１、Ｋ０２７３９、ＡＦ４６１６８４．１、およびＭ２０１６１．１）。
【００３５】
レオウイルスλ−３ポリペプチドは、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸残基：残基２１４におけるＶａｌ、残基２６７におけるＡｌａ、残基５５７におけるＴｈｒ、残基７５５におけるＬｙｓ、残基７５６におけるＭｅｔ、残基９２６におけるＰｒｏ、残基９６３におけるＰｒｏ、残基９７９におけるＬｅｕ、残基１０４５におけるＡｒｇ、または残基１０７１におけるＶａｌのいずれかの組み合わせを有する（ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる）。ポリペプチド配列が残基２１４においてＶａｌまたは残基１０７１においてＶａｌを含む場合、ポリペプチド配列は、アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含むことに留意されたい。レオウイルスσ−３ポリペプチドは、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸残基：残基１４におけるＬｅｕまたは残基１９８におけるＬｙｓのいずれかの組み合わせを有する（ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる）。ポリペプチド配列が残基１４においてＬｅｕを含む場合、ポリペプチド配列は、アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含むことに留意されたい。レオウイルスμ−１ポリペプチドは、例えば、残基７３においてＡｓｐを有する（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる）。レオウイルスμ−２ポリペプチドは、例えば、残基５２８においてＳｅｒを有する（ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる）。指示された位置における指示されたアミノ酸は、一般のデータベースで入手可能な別の対応する配列と比較した場合の改変を表す（例えば、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１、Ｋ０２７３９、ＡＦ４６１６８４．１、およびＭ２０１６１．１）。
【００３６】
本明細書で使用されるように、「非自然発生的」レオウイルスは、例えば、野生分離株（例えば、患者）に由来する野生型配列と比較して、少なくとも１つの核酸またはアミノ酸改変を有するレオウイルスである。「非自然発生的」レオウイルスは、研究室において操作または改変されたウイルスを意味する。かかる操作または改変されたレオウイルスは、実験室株または突然変異型を含む。これらの型は、核酸および／またはアミノ酸配列において、例えば、ＤｅａｒｉｎｇおよびＡｂｎｅｙ株（例えば、それぞれＡＴＣＣ ＶＲ−８２４およびＶＦ−２３２）から区別できる。１つもしくは複数のゲノム分節, コード化したポリペプチド, または両方に対する代表的な改変を本明細書で開示する。本明細書で記載される１つもしくは複数の改変を含むゲノム分節またはポリペプチドに加えて、レオウイルスは、Ｓ２ゲノム分節を任意に含み、σ−２ポリペプチドをコード化する。σ−２ポリペプチドは、例えば、以下の位置（ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９４６８４．１に関連して番号付けられる）：７０位、１２７位、１９５位、２４１位、２５５位、２９４位、２９６位、または３４０位、のうちの１つもしくは複数またはすべてにおいてＣｙｓを有する。
【００３７】
改変は、概して核酸レベルで生じ、コード化したポリペプチドにおいて発現し得るか、またはしない場合がある。核酸に対する改変は、単発性または多発性ヌクレオチド転位（プリンからプリンまたはピリミジンからピリミジン）または塩基転換（プリンからピリミジンまたはその逆）、および単発性または多発性ヌクレオチド欠失または挿入を含むが、これらに限定されない。核酸における改変は、コード化したポリペプチドにおける１つもしくは複数の保守的または非保守的アミノ酸置換、その地点からコード化される全く異なるポリペプチドをもたらす翻訳の読み枠におけるシフト（フレームシフト）、切断されたポリペプチドをもたらす早期終止コドン（「切断」）を生じ得るか、またはレオウイルス核酸における改変は、コード化したポリペプチドを全く変更しない場合がある（「サイレント」または「ナンセンス」）。保守的および非保守的アミノ酸置換に関する開示は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ，１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２３３：７１６−３８、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１９、および米国特許第４，５５４，１０１を参照されたい。
【００３８】
レオウイルス粒子からの核酸は、例えば、市販の標準手法を使用して単離する。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｃｈ５２，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｋｎｉｐｅ ＆ Ｈｏｗｌｅｙ，ｅｄｓ．，２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓも参照されたい。本明細書で使用されるように、「単離」核酸は、それらが通常関連する別の核酸から本質的に分離される核酸を意味する。したがって、「単離」核酸は、本質的に非レオウイルス（例えば、宿主細胞）核酸を含まないレノウイルス核酸、または本質的に別のゲノム分節に対応する核酸を含まないレノウイルスゲノム分節を含むが、これらに限定されない。加えて、単離核酸は、組み換えまたは合成核酸などの人工核酸を含む。
【００３９】
改変は、当該技術分野において既知の任意の数の方法を使用して、レオウイルスの核酸に生成する。例えば、部位特異的突然変異誘発を使用して、レオウイルス核酸配列を改変することができる。部位特異的突然変異誘発の最も一般的な方法の１つは、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発である。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発において、配列において望ましい変更をコード化するオリゴヌクレオチドは、対象となるＤＮＡの１つの鎖にアニールさせ、ＤＮＡ合成を開始するためのプライマとして作用する。この方法において、配列変更を含むオリゴヌクレオチドは、新しく合成された鎖に組み込まれる。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７、Ｌｅｗｉｓ ＆ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３４３９、Ｂｏｈｎｓａｃｋ，１９９６，Ｍｅｔｈ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，５７：１、Ｄｅｎｇ ＆ Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，１９９２，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００：８１、ａｎｄ Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，５７：１５７を参照されたい。
【００４０】
当該技術分野における別の方法を日常的に使用して、改変を配列に導入する。例えば、改変核酸は、ＰＣＲまたは化学合成を使用して生成するか、またはアミノ酸配列に望ましい変更を有するポリペプチドは、化学的に合成することができる。例えば、ＢａｎｇおよびＫｅｎｔの２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：５０１４−９およびその参考文献を参照されたい。レオウイルスが通常増殖しない細胞型（例えば、ヒト細胞）および／または化学的突然変異誘発に関する選択（例えば、ＲｕｄｄおよびＬｅｍａｙの２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８６：１４８９−９７を参照）を使用して、レオウイルスの核酸に改変を生成することもできる。例えば、表１に示される改変は、典型的にはレオウイルスを培養する技術において使用されないヒト細胞（例えば、ヒト胎児肝臓（ＨＥＫ）２９３細胞）上でレオウイルスを培養することによって生成した。それに対して、レオウイルスを培養するために一般に使用される細胞は、例えば、Ｔｙｌｅｒの“Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ”Ｃｈ ５３，ｐａｇｅ １７３１−２，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ編の２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて説明される。本明細書で説明される改変は、レオウイルスによるヒト細胞への適合を表す。これらのプラーク精製ステップそれぞれにおいて、最大プラーク（三重プラーク精製）を選択することによる選択ステップもあり、これらの細胞において、増殖または毒性利点があった。
【００４１】
１つもしくは複数の改変をレオウイルス核酸またはポリペプチドに導入した後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ウイルス粒子を再構成する。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈ ５２，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｋｎｉｐｅ ＆ Ｈｏｗｌｅｙ ｅｄｓ．，２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３９（４）：７９１−８１０、および米国特許第７，１８６，５４２号、第７，０４９，１２７号、第６，８０８，９１６号、および第６，５２８，３０５号を参照されたい。配列に１つもしくは複数の改変を有するレオウイルスは、例えば、マウスＬ９２９細胞または腫瘍性細胞（例えば、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−２２）、ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−３０）、またはＭＤＡ ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ１３２細胞）において培養し、例えば、１つもしくは複数の改変を含まないレオウイルスを超える増殖利点を示し得る任意の数の性質に基づいて選択する。細胞株（腫瘍性またはその他）における培養および／または動物モデル系の感染に続いて、レオウイルスを選択する。
【００４２】
かかる性質は、溶解率の増加；プラーク作製サイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増加または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞の免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力を含むが、これらに限定されない。追加として、改変配列を有するレオウイルスは、例えば、活性Ｒａｓ経路を有する哺乳動物細胞を溶解性感染させる能力のために選択する。例えば、米国特許第７，０５２，８３２号を参照されたい。
【００４３】
レオウイルス粒子は、当該技術分野において既知の任意の数の方法を使用して取得する。例えば、レオウイルスをＬ９２９マウス線維芽細胞またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）において培養し、標準手法を使用してウイルス粒子を精製する。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈ ５２，ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｋｎｉｐｅ ＆ Ｈｏｗｌｅｙ ｅｄｓ．，２００６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｓｍｉｔｈｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３９（４）：７９１−８１０、および米国特許第７，１８６，５４２号、第７，０４９，１２７号、第６，８０８，９１６号、および第６，５２８，３０５号を参照されたい。本明細書で使用されるように、「精製された」ウイルス粒子は、それに自然に付随する細胞構成要素から本質的に分離されるウイルス粒子を意味する。通常、ウイルス粒子は、それらが乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）であり、ウイルスが自然に関連するタンパク質および別の細胞構成要素を含まない場合に「精製された」と見なされる。
【００４４】
表１に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸改変を含む、図１、２、および３（配列番号１〜１０）に示される核酸配列および図４、５、および６（配列番号１１〜２０）に示されるアミノ酸配列を有するレオウイルスは、２００７年９月１９日にカナダ国際寄託当局（ＩＤＡＣ，カナダ公衆衛生局国立微生物学研究所，１０１５ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｓｔ．，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ Ｃａｎａｄａ Ｒ３Ｅ ３Ｒ２）に寄託され、受入番号１９０９０７−０１が付与された。本寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に基づいて維持される。本寄託は例示的であり、単に当業者に対する便宜目的で行い、寄託が特許性を必要とすることを是認するものではない（例えば、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２に基づく）。
【００４５】
改変配列を有するレオウイルスを使用する方法
前述したように（例えば、米国特許第６，１１０，４６１号、第６，１３６，３０７号、第６，２６１，５５５号、第６，３４４，１９５号、第６，５７６，２３４号、および第６，８１１，７７５号）、レオウイルスは、宿主細胞のＲａｓ経路機構を使用して、二本鎖ＲＮＡ活性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）を下方制御し、したがって細胞内で複製する。これらの発見に基づいて、レオウイルスを使用して哺乳動物における増殖性疾患を治療するための方法が開発されている。代表的な哺乳動物は、マウス、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトを含む。本明細書で使用されるように、「患者」は増殖性疾患を有する任意の哺乳動物を含む。
【００４６】
「増殖性疾患」は、細胞が正常な組織の増殖よりも速く増殖する、任意の細胞性疾患である。したがって、「増殖細胞」は、正常細胞よりも速く増殖している細胞である。増殖性疾患は、腫瘍とも称される新生物を含むが、これに限定されない。新生物は、膵癌、乳癌、脳腫瘍（例えば、膠芽細胞腫）、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、腎癌、副腎癌、肝臓癌、神経線維腫症、および白血病を含むが、これらに限定されない。新生物は、充実性新生物（例えば、非上皮性悪性腫瘍または癌腫）または細網内皮系（例えば、リンパ腫または白血病）に影響する癌性増殖を含む。別の増殖性疾患は、神経線維腫症を含むが、これに限定されない。
【００４７】
一般に、レオウイルスが治療として使用される増殖性疾患において、増殖細胞の少なくとも一部は、Ｒａｓ遺伝子（またはＲａｓシグナル経路の要素）が、直接（例えば、Ｒａｓにおける活性突然変異による）または間接的に（例えば、Ｒａｓ経路における上流または下流要素の活性化による）活性化される突然変異を有する。Ｒａｓ経路における上流要素の活性化は、例えば、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはＳｏｓを用いる形質転換を含む。例えば、Ｗｉｅｓｓｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｗｉｔｔｉｎｇｈｏｆｅｒ，１９９４，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，６（３）：２４７−２６７、ａｎｄ Ｂａｒｂａｃｉｄ，１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，７７９−８２７を参照されたい。Ｒａｓ経路における下流要素の活性化は、例えば、Ｂ−Ｒａｆ内の突然変異を含む。例えば、Ｂｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：６９９７−７０００を参照されたい。加えて、レオウイルスは、ＰＫＲの突然変異または調節障害によって引き起こされる増殖性疾患を治療するために有用である。例えば、Ｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＥＭＢＯ Ｊ，１７：３３５１−６６２を参照されたい。
【００４８】
本明細書で開示されるような改変配列を有するレオウイルスは、増殖性疾患を有する哺乳動物に投与する。本明細書で使用されるように、投与は、レオウイルスが増殖細胞に接触するようなレオウイルスの送達を意味する。レオウイルスが投与される経路は、疾患の種類および増殖細胞の位置に依存する。様々な投与経路を採用することができる。例えば、アクセス可能な充実性新生物の場合、レオウイルスは、直接注射によって投与する。造血新生物の場合、例えば、レオウイルスは、経静脈的または経脈管的に投与する。ある新生物、例えば、転移または脳腫瘍などの体内で容易にアクセスできない新生物の場合、レオウイルスは、哺乳動物の体を通して全身的に輸送され、それによって新生物に到達するような方法で（例えば、髄腔内、経静脈的、筋肉内、皮下的、または経腹膜的に）投与する。レオウイルスは、例えば、局部的（例えば、黒色腫の場合）、経口的（例えば、口腔または食道新生物の場合）、直腸的（例えば、結腸直腸新生物の場合）、経膣的（例えば、子宮頚部または膣新生物の場合）、経鼻的、または吸引によって（例えば、肺新生物の場合）、局所的にも投与する。レオウイルスは、１つもしくは複数の経路によって、および／または個体における１つもしくは複数の位置に任意に投与する。
【００４９】
標的投与を使用して、レオウイルスを投与できる。例えば、レオウイルスを含む樹状細胞を被験体に投与できる。例えば、米国特許公開第２００８／００１４１８３号を参照されたい。標的送達の別の実施例においては、担体細胞を使用して、増殖性疾患の細胞を標的し、それらが担持するレオウイルスの免疫認識を回避する。例えば、Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ，１４：３７−４４、および国際公開第ＷＯ２００８／００９１１５号を参照されたい。
【００５０】
本明細書で開示されるような改変配列を有するレオウイルスは、増殖性疾患を治療するために十分な量（例えば、「有効量」）で投与する。改変配列を有するレオウイルスを増殖細胞に投与することが、疾患の１つもしくは複数の症状または臨床的徴候に影響する場合、例えば、治療を行わない場合における兆候または症状と比較して、細胞の溶解（例えば、「腫瘍崩壊」）が増大する、増殖細胞数が減少する、新生物のサイズまたは進行が減退する、新生物に関連した疼痛が低減する場合に、増殖性疾患は「治療される」。本明細書で使用されるように、「腫瘍崩壊」という用語は、増殖細胞の少なくとも１０％が溶解される（例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または７５％が溶解される）ことを意味する。溶解のパーセンテージは、例えば、哺乳動物の新生物のサイズまたは増殖細胞数の減少を測定する、または（例えば、増殖細胞のバイオプシから）生体外の細胞溶解量を測定することによって決定することができる。
【００５１】
改変配列を有するレオウイルスの有効量は、個別基準で決定され、少なくとも一部は、使用される特定のレオウイルス；個体の体格、年齢、性別；および増殖細胞のサイズおよび別の性質に基づく。例えば、ヒトの治療の場合、存在する増殖細胞または新生物の種類、サイズ、および数に基づいて、レオウイルスの約１０３〜１０１２プラーク作製単位（ＰＦＵ）を使用する。有効量は、体重１ｋｇ当たり約１．０ＰＦＵ〜体重１ｋｇ当たり約１０１５ＰＦＵであり得る（例えば、体重１ｋｇ当たり約１０２ＰＦＵ〜体重１ｋｇ当たり約１０１３ＰＦＵ）。レオウイルスは、１回量または多回量（例えば、２回、３回、４回、６回、またはそれ以上）で投与する。多回量は、同時にまたは（例えば、数日または数週間の期間をかけて）連続して投与する。改変配列を有するレオウイルスを用いる治療は、数日から数ヶ月、または疾患の減退が達成されるまで継続する。
【００５２】
本明細書で開示されるような改変配列を有するレオウイルスは、手術または増殖細胞（例えば、新生物）の除去と併せて、任意に投与されると考えられる。改変配列を有するレオウイルスは、放射線治療と併せて、または放射線治療に加えて、任意に投与されることも考えられる。さらに、改変配列を有するレオウイルスは、周知の抗癌性化合物、化学療法薬、および／または免疫抑制剤と併せて、またはそれらに加えて、任意に投与されると考えられる。かかる薬剤は、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、メトトレキサート、ヒドロキシウレア、ゲムシタビン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン（エピルビシン、イリノテカン、およびドキソルビシン）、ハーセプチンなどの受容体に対する抗体、エトポシドまたはカンプトセシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、プレグナソーム、カルボプラチンおよびシスプラチンなどのプラチナ化合物、タキソールおよびタキソテールなどのタキサン、タモキシフェンおよび抗エストロゲンなどのホルモン治療薬、インターロイキン、インターフェロン、アロマターゼ阻害薬、黄体ホルモン薬、ＬＨＲＨ類似体、ｍＴＯＲ阻害薬（例えば、ラパマイシンおよびその誘導体；例えば、Ｈｏｍｉｃｓｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６５：６８８２−９０、ａｎｄ Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，４：６２１−３５）を参照）、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
さらに改変配列を有するレオウイルスは、内皮透過性を増加させる、および／または間質液圧を減少させることができる薬剤と併せて投与されると考えられる。かかる薬剤は、例えば、ＴＮＦ−αを含む。例えば、Ｓａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１２：１７５−１８２を参照されたい。改変配列を有するレオウイルスは、本明細書で説明される治療法および薬剤のいずれかの組み合わせと併せて投与することができると考えられる。
【００５４】
医薬組成物
少なくとも１つが本明細書で説明されるような改変配列を有する、１つもしくは複数のレオウイルスを含む医薬組成物を提供する。例えば、米国特許第６，５７６，２３４号を参照されたい。少なくとも１つが改変配列を有する１つもしくは複数のレオウイルスに加えて、医薬組成物は、典型的には医薬的に容認可能な担体を含む。医薬的に容認可能な担体は、レオウイルスに対する媒体、担体、または培地として作用する固体、半固体、または液体材料を含む。したがって、例えば、改変配列を有するレオウイルスを含む組成物は、錠剤、ピル、粉末、トローチ剤、小袋、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、乳液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体としてまたは液体培地中）、例えば、重量で最大１０％の活性成分を含有する軟膏、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射液、および無菌パッケージ化粉末の形態である。
【００５５】
適切な担体の一部の実施例は、リン酸緩衝化生理食塩水または別の生理的に容認可能な緩衝液、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ剤、およびメチルセルロースを含む。医薬組成物は、追加として、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油などの平滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、安息香酸メチルおよび安息香酸プロピルヘキセドリンなどの保存剤、甘味剤、および香料添加剤を含み得るが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物を配合して、当該技術分野において既知の処置を採用することによって投与した後に、改変配列を有するレオウイルスの迅速に、持続的に、または遅延的に放出できる。以下に説明する代表的な製剤に加えて、医薬組成物に使用するための別の適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ ＆ Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｅｎｓ）に見出される。
【００５６】
錠剤などの固体組成物を調製する場合、改変配列を有するレオウイルスは、医薬担体と混合して固体組成物を作製する。任意に、錠剤またはピルをコーティングするか、または別の方法で化合して、持続性作用の利益を提供する剤形を提供する。例えば、錠剤またはピルは、内部投与および外部投与成分を含み、後者は、前者を覆うエンベロープ形体である。２つの成分は、例えば、胃内の分解に耐えるように機能する腸溶層によって分離され、内部成分が無傷で十二指腸を通過し、または遅延放出することを可能にする。かかる腸溶層またはコーティングには様々な材料が使用され、かかる材料は、多くのポリマー酸、およびポリマー酸とセラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料との混合物を含む。
【００５７】
経口投与または注入用の改変配列を有するレオウイルスを含む液体製剤は、一般に、水溶液、適切に味を付けたシロップ、水性または油性懸濁液、およびコーン油、綿実油、ごま油、ココナッツ油、またはピーナッツ油などの食用油を含む味を付けた乳化剤、ならびにエリキシル剤および同様の医薬用賦形剤を含む。
【００５８】
吸入用または吹き入れ用の組成物は、医薬的に容認可能な水性または有機溶媒中の溶液および懸濁液、またはそれらの混合物、および粉末を含む。これらの液体または固体組成物は、本明細書で説明されるような適切な医薬的に容認可能な賦形剤を任意に含む。かかる組成物は、例えば、局所または全身的作用のために、経口または経鼻呼吸経路によって投与する。医薬的に容認可能な溶媒中の組成物は、不活性ガスの使用によって噴霧する。噴霧した溶液は、例えば、噴霧装置、付属のフェイスマスクテント、または、間欠型正圧呼吸器から直接吸入する。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、例えば、適切な方法で製剤を送達する装置から、経口的または経鼻的に投与する。
【００５９】
本明細書で教示される方法で採用する別の製剤は、経皮的送達装置（「パッチ」）を採用する。かかる経皮的パッチを使用して、改変配列を有するレオウイルスを連続的または断続的に注入する。医薬剤を送達するための経皮パッチの構成および使用は、当該技術分野において既知の方法に従って行う。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号を参照されたい。かかるパッチは、改変配列を有するレオウイルスの連続的、パルス、またはオンデマンド送達用に構成する。
【００６０】
改変配列を有するレオウイルスは、任意に、投与前（例えば、医薬組成物に含める前）に、（例えば、キモトリプシンまたはトリプシンなどのプロテアーゼで処理することにより）化学的または生化学的に前処理する。プロテアーゼを用いた前処理は、ウイルスの外皮またはカプシドを取り除き、ウイルスの感染性を高めるために使用することができる。追加として、または代替として、改変配列を有するレオウイルスは、リポソームまたはミセルでコーティングし、レオウイルスに対する免疫を発達させた哺乳動物における免疫学的応答を低減または回避する。かかるレオウイルスは、「免疫保護レオウイルス」と称される。例えば、米国特許第６，５６５，８３１号および第７，０１４，８４７号を参照されたい。
【００６１】
改変配列を有するレオウイルスまたはかかるレオウイルスを含む医薬組成物は、キットにパッケージ化することができる。キットは、任意に１つもしくは複数の化学療法剤および／または免疫抑制剤（例えば、抗アンチ受容体抗体）を含むと考えられる。医薬組成物、例えば、単位剤形で製剤化される。「単位剤形」という用語は、ヒト被験体および他の哺乳動物に対する単位用量として適切な物理的に不連続な単位を意味し、各単位は、適切な医薬的に容認可能な担体に関連して、望ましい治療効果を生成するように計算された既定量の改変配列を有するレオウイルスを含有する。
【００６２】
本発明に従って、従来の分子生物学、微小生物学、生化学および組み換えＤＮＡ技術は、当該技術の範囲内で採用し得る。かかる技術は、文献において完全に説明する。本発明は、以下の実施例においてさらに説明し、請求項において説明する発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６３】
実施例１−シークエンシングおよび解析
レオウイルスを産生するための培養は、懸濁適合したＨＥＫ２９３Ｓ万能細胞バンク（ＭＣＢ）から開始した。ＨＥＫ２９３細胞は、Ｌ−グルタミンで補充した無血清培地（ＨＥＫ２９３ ＳＦＭＩＩ）において維持した。ＨＥＫ２９３細胞は、３つの１５Ｌスピナーフラスコに増殖および播種し、３つのフラスコがそれぞれ１２Ｌになるまでさらに拡大した。レオウイルスによるＨＥＫ２９３の感染は、ウイルスを細胞培地に直接接種することによって行った。ＨＥＫ２９３Ｓ細胞の存続性が感染後２０〜５０％まで減少した際にウイルスを採取した。３つのスピナーすべてから得たウイルス材料を単一の無菌容器に貯留し、攪拌して均一混合液を作製した。３リットルの貯留した細胞懸濁液を除去し、円錐チューブに移して、最大３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、１００ｍＬの精製調節培地を用いて細胞を再懸濁し、アルコール−ドライアイス浴で３回スナップ凍結した後、種ストックとして使用するために無菌のラベル付きクリオバイアルに充填した。
【００６４】
ウイルスストックは、３回のプラーク精製を行うことによって調製した。付着したＨＥＫ２９３Ｓ細胞を６ウェル組織培養プレートに置き、上述の種ストックで感染させて、最大プラークのうちの２つを選んだ。これらの２つのプラークを個々に増幅および採取し、最大プラークのうちの２つを再度選んだ。この処置は、計３回再度繰り返した。２つのプラークのうち、１つは、後の拡大のための種ストックとして選択した。
【００６５】
培養は、上述の同一の懸濁液で適合したＨＥＫ２９３Ｓ ＭＣＢから開始し、Ｌ−グルタミンで補充した同一のＨＥＫ２９３無血清培地（ＨＥＫ２９３ ＳＦＭＩＩ）中で維持した。細胞をＴフラスコから最大多発性３Ｌスピナーフラスコまで増殖させた。感染は、ＨＥＫ２９３ ＳＦＭ培地中で、プラーク精製したウイルスを最初に希釈し、次いで、８〜１２ｍＬの希釈ウイルスを細胞培地に追加することによって行った。ＨＥＫ２９３Ｓ細胞の生存性が、感染後２０〜５０％まで減少した時点でウイルスを採取し、各スピナーを顕微鏡検査したところ、微生物汚染の欠失、および細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞中に存在することを確認した。ＣＰＥは、膨張した粒状の外観を呈する細胞によって示した。スピナーから得た材料を単一の無菌容器に貯留し、攪拌して均一混合物を作製し、大量の採取試料を取り除いた。残りの貯留した細胞懸濁液を円錐チューブに移し、最大３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いで、４００ｍＬの精製調節培地で細胞を懸濁し、濃縮細胞懸濁液をアルコール−ドライアイス浴で３回スナップ凍結して細胞を溶解した後、シーケンシング反応で使用するために無菌のラベル付きクリオバイアルに充填した。
【００６６】
両方のＲＮＡ鎖を両方向からシークエンシングし、それぞれ１０ゲノム分節の配列を重複するコンティグから組み立てた。各ゲノム分節の集合配列をＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴサーチで使用した（ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。ＮＣＢＩデータベースで見出された３つまたは４つの異なるレオウイルス配列の配置を試験し、最高の相同量を有する配置をさらなる解析に使用した。他の報告された配列と比較して、多型または改変を表１に示す。選択したレオウイルス株に固有のそれらの改変は、表１においてアスタリスク付きで示す。
【００６７】
【表１Ａ】
【００６８】
【表１Ｂ】
【００６９】
本発明は、その詳細な説明と併せて説明しているが、前述の説明は、例証を目的とするものであって、添付の請求項の範囲によって画定される、本発明の範囲を制限するものではないことを理解されたい。別の態様、利点、および改変は、以下の請求項の範囲内である。
【００７０】
使用できる、併用できる、調製に使用できる材料、組成物、および成分または開示される方法および組成物の産物を開示する。これらおよび別の材料は、本明細書で開示し、これら材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示する場合、これらの成分の様々な個々の組み合わせおよび集合的組み合わせのそれぞれに関する特定の参考文献が明示的に開示されない場合があるが、本明細書においてそれぞれ特異的に考慮、説明することを理解されたい。例えば、レオウイルスの特定の改変または治療計画が開示および議論し、レオウイルスに対して作製できる多数の改変または計画について論じる場合、レオウイルスおよび計画の組み合わせおよび順列のそれぞれおよびすべては、それとは反対に明記されない限り、特異的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも特異的に考慮および開示する。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３−１】
【図３−２】
【図３−３】
【図３−４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するλ−３ポリペプチドを含むレオウイルスであって、前記１つもしくは複数のアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、残基２１４におけるＶａｌ、残基２６７におけるＡｌａ、残基５５７におけるＴｈｒ、残基７５５におけるＬｙｓ、残基７５６におけるＭｅｔ、残基９２６におけるＰｒｏ、残基９６３におけるＰｒｏ、残基９７９におけるＬｅｕ、残基１０４５におけるＡｒｇ、残基１０７１におけるＶａｌ、またはこれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択され、前記アミノ酸配列が、残基２１４におけるＶａｌ、または残基１０７１におけるＶａｌを含む場合、前記アミノ酸配列に少なくとも１つの追加改変をさらに含む、レオウイルス。
【請求項２】
前記λ−３ポリペプチドが、配列番号１９を含む、請求項１に記載のレオウイルス。
【請求項３】
１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するσ−３ポリペプチドを含むレオウイルスであって、前記１つもしくは複数のアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる、残基１４におけるＬｅｕ、残基１９８におけるＬｙｓ、またはこれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択され、前記アミノ酸配列が残基１４においてＬｅｕを含む場合、前記アミノ酸配列が、前記アミノ酸配列に少なくとも１つの追加改変をさらに含む、レオウイルス。
【請求項４】
前記σ−３ポリペプチドが、配列番号１５を含む、請求項３に記載のレオウイルス。
【請求項５】
少なくとも１つのアミノ酸改変を有するμ−１ポリペプチドを含むレオウイルスであって、前記少なくとも１つのアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる、残基７３においてＡｓｐを含む、レオウイルス。
【請求項６】
前記μ−１ポリペプチドが、配列番号１７を含む、請求項５に記載のレオウイルス。
【請求項７】
少なくとも１つのアミノ酸改変を有するμ−２ポリペプチドを含むレオウイルスであって、前記少なくとも１つのアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる、残基５２８においてＳｅｒを含む、レオウイルス。
【請求項８】
前記μ−２ポリペプチドが、配列番号１６を含む、請求項７に記載のレオウイルス。
【請求項９】
レオウイルスσ−２ポリペプチドをさらに含む、請求項１、３、５、または７に記載のレオウイルス。
【請求項１０】
前記σ−２ポリペプチドが、配列番号３０（ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９４６８４．１）に関連して番号付けられる、７０位、１２７位、１９５位、２４１位、２５５位、２９４位、２９６位、または３４０位のうちの１つもしくは複数においてＣｙｓを含む、請求項９に記載のレオウイルス。
【請求項１１】
前記σ−２ポリペプチドが、配列番号１２を含む、請求項１０に記載のレオウイルス。
【請求項１２】
前記レオウイルスが再集合体である、請求項１から１１のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス。
【請求項１３】
１つもしくは複数の核酸改変を有するＬ１ゲノム分節を含むレオウイルスであって、前記１つもしくは複数の核酸改変が、配列番号２２（ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１）に関連して番号付けられる、６６０位におけるＴ、８１７位におけるＧ、１６８７位におけるＡ、２２８３位におけるＧ、２２８４〜２２８６位におけるＡＴＧ、２７９４位におけるＣ、２９０５位におけるＣ、２９５３位におけるＣ、３１５３におけるＡ、３２３１位におけるＧから成る群より選択される、レオウイルス。
【請求項１４】
前記Ｌ１ゲノム分節が、配列番号８を含む、請求項１３に記載のレオウイルス。
【請求項１５】
１つもしくは複数の核酸改変を有するＳ４ゲノム分節を含むレオウイルスであって、前記Ｓ４ゲノム分節における前記１つもしくは複数の核酸改変が、配列番号２４（ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９）に関連して番号付けられる、７４位におけるＡおよび６２４位におけるＡから成る群より選択される、レオウイルス。
【請求項１６】
前記Ｓ４ゲノム分節が、配列番号４を含む、請求項１５に記載のレオウイルス。
【請求項１７】
少なくとも１つの核酸改変を有するＭ２ゲノム分節を含むレオウイルスであって、前記少なくとも１つの核酸改変が、配列番号２６（ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１）に関連して番号付けられる、２４８位においてＣを含む、レオウイルス。
【請求項１８】
前記Ｍ２ゲノム分節が、配列番号６を含む、請求項１７に記載のレオウイルス。
【請求項１９】
少なくとも１つの核酸改変を有するＭ１ゲノム分節を含むレオウイルスであって、前記少なくとも１つの核酸改変が、配列番号２８（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１）に関連して番号付けられる、１５９５位においてＴを含む、レオウイルス。
【請求項２０】
前記Ｍ１ゲノム分節が、配列番号５を含む、請求項１９に記載のレオウイルス。
【請求項２１】
前記レオウイルスが再集合体である、請求項１３から２０のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス。
【請求項２２】
レオウイルスλ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記レオウイルスλ−３ポリペプチドの前記配列が、１つもしくは複数のアミノ酸改変を含み、前記１つもしくは複数のアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、残基２１４におけるＶａｌ、残基２６７におけるＡｌａ、残基５５７におけるＴｈｒ、残基７５５におけるＬｙｓ、残基７５６におけるＭｅｔ、残基９２６におけるＰｒｏ、残基９６３におけるＰｒｏ、残基９７９におけるＬｅｕ、残基１０４５におけるＡｒｇ、残基１０７１におけるＶａｌ、またはこれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択され、前記アミノ酸配列が、残基２１４におけるＶａｌ、または残基１０７１におけるＶａｌを含む場合、前記アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含む、ポリペプチド。
【請求項２３】
前記λ−３ポリペプチドが、配列番号１９を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
レオウイルスσ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記レオウイルスσ−３ポリペプチドの前記配列が、１つもしくは複数のアミノ酸改変を含み、前記１つもしくは複数のアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる、残基１４におけるＬｅｕ、残基１９８におけるＬｙｓ、またはこれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択され、前記アミノ酸配列が残基１４においてＬｅｕを含む場合、前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含む、ポリペプチド。
【請求項２５】
前記σ−３ポリペプチドが、配列番号１５を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
レオウイルスμ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記レオウイルスμ−１ポリペプチドの前記配列が、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる、残基７３においてＡｓｐを含む、ポリペプチド。
【請求項２７】
前記μ−１ポリペプチドが、配列番号１７を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
レオウイルスμ−２ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記レオウイルスμ−２ポリペプチドの前記配列が、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる、残基５２８においてＳｅｒを含む、ポリペプチド。
【請求項２９】
前記μ−２ポリペプチドが、配列番号１６を含む、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２２から２９のいずれか一項に記載のポリペプチドを１つもしくは複数含む、レオウイルス。
【請求項３１】
前記レオウイルスが、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９４６８４．１に関連して番号付けられる、７０位、１２７位、１９５位、２４１位、２５５位、２９４位、２９６位、または３４０位のうちの１つもしくは複数においてＣｙｓを含むσ−２ポリペプチドをさらに含む、請求項３０に記載のレオウイルス。
【請求項３２】
前記σ−２ポリペプチドが、配列番号１２を含む、請求項３１に記載のレオウイルス。
【請求項３３】
前記レオウイルスが再集合体である、請求項３０から３２のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス。
【請求項３４】
レオウイルスＬ１ゲノム分節の核酸配列を含む核酸分子であって、前記レオウイルスＬ１ゲノム分節の前記核酸配列が、１つもしくは複数の核酸改変を含み、前記１つもしくは複数の核酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、６６０位におけるＴ、８１７位におけるＧ、１６８７位におけるＡ、２２８３位におけるＧ、２２８４〜２２８６位におけるＡＴＧ、２７９４位におけるＣ、２９０５位におけるＣ、２９５３位におけるＣ、３１５３位におけるＡ、３２３１位におけるＧから成る群より選択される、核酸分子。
【請求項３５】
前記Ｌ１ゲノム分節が、配列番号８を含む、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３６】
レオウイルスＳ４ゲノム分節の核酸配列を含む核酸分子であって、前記レオウイルスＳ４ゲノム分節の前記核酸配列が、１つもしくは複数の核酸改変を含み、前記１つもしくは複数の核酸改変が、配列番号２４（ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９）に関連して番号付けられる、７４位におけるＡおよび６２４位におけるＡから成る群より選択される、核酸分子。
【請求項３７】
前記Ｓ４ゲノム分節が、配列番号４を含む、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項３８】
レオウイルスＭ１ゲノム分節の核酸配列を含む核酸分子であって、前記レオウイルスＭ１ゲノム分節の前記核酸配列が、少なくとも１つの核酸改変を含み、前記少なくとも１つの核酸改変が、配列番号２６（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１）に関連して番号付けられる、１５９５位にＴを含む、核酸分子。
【請求項３９】
前記Ｍ１ゲノム分節が、配列番号５を含む、請求項３８に記載の核酸分子。
【請求項４０】
レオウイルスＭ２ゲノム分節の核酸配列を含む核酸分子であって、前記レオウイルスＭ２ゲノム分節の前記核酸配列が、少なくとも１つの核酸改変を含み、前記少なくとも１つの核酸改変が、配列番号２８（ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１）に関連して番号付けられる、２４８位にＣを含む、核酸分子。
【請求項４１】
前記Ｍ２ゲノム分節が、配列番号６を含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
請求項３４から４１のいずれか一項に記載の前記核酸分子のうちの１つもしくは複数を含む、レオウイルス。
【請求項４３】
前記レオウイルスが再集合体である、請求項４２に記載のレオウイルス。
【請求項４４】
配列番号１〜１０において示されるような配列を有するゲノム分節を含む、レオウイルス。
【請求項４５】
配列番号１１、１２、および１６〜２１、および配列番号１３または１４のうちの少なくとも１つにおいて示されるようなポリペプチドを含む、レオウイルス。
【請求項４６】
ＩＤＡＣ受入番号１９０９０７−０１を有する、請求項４４または４５に記載のレオウイルス。
【請求項４７】
前記レオウイルスが、改変を含まないレオウイルスを超える増殖利点を呈する、請求項１から２１、３０から３３、４２から４６のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス。
【請求項４８】
前記増殖利点が、細胞溶解率の増加；プラーク作製サイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増大または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞の免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力から成る群より選択される、請求項４７に記載のレオウイルス。
【請求項４９】
請求項１から２１、３０から３３、または４２から４８のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス、および医薬的に容認可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
１つもしくは複数の化学療法薬および／または１つもしくは複数の免疫抑制剤をさらに含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
改良レオウイルスを作製する方法であって、前記レオウイルスの核酸配列を改変するステップと、１つもしくは複数の改良レオウイルスを選択するステップと、を含む、方法。
【請求項５２】
前記改変するステップが、前記レオウイルスに突然変異を生じさせるステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記突然変異を生じさせるステップが、部位特異的突然変異誘発を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記突然変異を生じさせるステップが、化学的突然変異誘発を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記改変するステップが、前記レオウイルスをヒト細胞株において培養するステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記改良レオウイルスが、細胞溶解率の増加；プラーク作製のサイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増大または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞における免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力のために選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
患者において増殖性疾患を治療する方法であって、請求項１から２１、３０から３３、または４２から４８のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス、または請求項４９または５０に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項５８】
前記レオウイルスを、腫瘍崩壊を生じさせるために有効な量で投与する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
手術、化学療法、放射線治療、および免疫抑制療法から成る群より選択される処置のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記レオウイルスまたは医薬組成物が１回以上投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記レオウイルスまたは医薬組成物が、経静脈的、経脈管的、髄腔内、筋肉内、皮下的、骨盤内、局所的、経口的、経直腸的、経膣的、経鼻腔的、直接注射または吸入によって投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１から２１、３０から３３、または４２から４８のうちのいずれか一項に記載のレオウイルスを含むキット。
【請求項６３】
１つもしくは複数の薬剤をさらに含む、請求項６２に記載のキット。
【請求項１】
１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するλ−３ポリペプチドを含むレオウイルスであって、前記１つもしくは複数のアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、残基２１４におけるＶａｌ、残基２６７におけるＡｌａ、残基５５７におけるＴｈｒ、残基７５５におけるＬｙｓ、残基７５６におけるＭｅｔ、残基９２６におけるＰｒｏ、残基９６３におけるＰｒｏ、残基９７９におけるＬｅｕ、残基１０４５におけるＡｒｇ、残基１０７１におけるＶａｌ、またはこれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択され、前記アミノ酸配列が、残基２１４におけるＶａｌ、または残基１０７１におけるＶａｌを含む場合、前記アミノ酸配列に少なくとも１つの追加改変をさらに含む、レオウイルス。
【請求項２】
前記λ−３ポリペプチドが、配列番号１９を含む、請求項１に記載のレオウイルス。
【請求項３】
１つもしくは複数のアミノ酸改変を有するσ−３ポリペプチドを含むレオウイルスであって、前記１つもしくは複数のアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる、残基１４におけるＬｅｕ、残基１９８におけるＬｙｓ、またはこれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択され、前記アミノ酸配列が残基１４においてＬｅｕを含む場合、前記アミノ酸配列が、前記アミノ酸配列に少なくとも１つの追加改変をさらに含む、レオウイルス。
【請求項４】
前記σ−３ポリペプチドが、配列番号１５を含む、請求項３に記載のレオウイルス。
【請求項５】
少なくとも１つのアミノ酸改変を有するμ−１ポリペプチドを含むレオウイルスであって、前記少なくとも１つのアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる、残基７３においてＡｓｐを含む、レオウイルス。
【請求項６】
前記μ−１ポリペプチドが、配列番号１７を含む、請求項５に記載のレオウイルス。
【請求項７】
少なくとも１つのアミノ酸改変を有するμ−２ポリペプチドを含むレオウイルスであって、前記少なくとも１つのアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる、残基５２８においてＳｅｒを含む、レオウイルス。
【請求項８】
前記μ−２ポリペプチドが、配列番号１６を含む、請求項７に記載のレオウイルス。
【請求項９】
レオウイルスσ−２ポリペプチドをさらに含む、請求項１、３、５、または７に記載のレオウイルス。
【請求項１０】
前記σ−２ポリペプチドが、配列番号３０（ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９４６８４．１）に関連して番号付けられる、７０位、１２７位、１９５位、２４１位、２５５位、２９４位、２９６位、または３４０位のうちの１つもしくは複数においてＣｙｓを含む、請求項９に記載のレオウイルス。
【請求項１１】
前記σ−２ポリペプチドが、配列番号１２を含む、請求項１０に記載のレオウイルス。
【請求項１２】
前記レオウイルスが再集合体である、請求項１から１１のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス。
【請求項１３】
１つもしくは複数の核酸改変を有するＬ１ゲノム分節を含むレオウイルスであって、前記１つもしくは複数の核酸改変が、配列番号２２（ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１）に関連して番号付けられる、６６０位におけるＴ、８１７位におけるＧ、１６８７位におけるＡ、２２８３位におけるＧ、２２８４〜２２８６位におけるＡＴＧ、２７９４位におけるＣ、２９０５位におけるＣ、２９５３位におけるＣ、３１５３におけるＡ、３２３１位におけるＧから成る群より選択される、レオウイルス。
【請求項１４】
前記Ｌ１ゲノム分節が、配列番号８を含む、請求項１３に記載のレオウイルス。
【請求項１５】
１つもしくは複数の核酸改変を有するＳ４ゲノム分節を含むレオウイルスであって、前記Ｓ４ゲノム分節における前記１つもしくは複数の核酸改変が、配列番号２４（ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９）に関連して番号付けられる、７４位におけるＡおよび６２４位におけるＡから成る群より選択される、レオウイルス。
【請求項１６】
前記Ｓ４ゲノム分節が、配列番号４を含む、請求項１５に記載のレオウイルス。
【請求項１７】
少なくとも１つの核酸改変を有するＭ２ゲノム分節を含むレオウイルスであって、前記少なくとも１つの核酸改変が、配列番号２６（ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１）に関連して番号付けられる、２４８位においてＣを含む、レオウイルス。
【請求項１８】
前記Ｍ２ゲノム分節が、配列番号６を含む、請求項１７に記載のレオウイルス。
【請求項１９】
少なくとも１つの核酸改変を有するＭ１ゲノム分節を含むレオウイルスであって、前記少なくとも１つの核酸改変が、配列番号２８（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１）に関連して番号付けられる、１５９５位においてＴを含む、レオウイルス。
【請求項２０】
前記Ｍ１ゲノム分節が、配列番号５を含む、請求項１９に記載のレオウイルス。
【請求項２１】
前記レオウイルスが再集合体である、請求項１３から２０のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス。
【請求項２２】
レオウイルスλ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記レオウイルスλ−３ポリペプチドの前記配列が、１つもしくは複数のアミノ酸改変を含み、前記１つもしくは複数のアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、残基２１４におけるＶａｌ、残基２６７におけるＡｌａ、残基５５７におけるＴｈｒ、残基７５５におけるＬｙｓ、残基７５６におけるＭｅｔ、残基９２６におけるＰｒｏ、残基９６３におけるＰｒｏ、残基９７９におけるＬｅｕ、残基１０４５におけるＡｒｇ、残基１０７１におけるＶａｌ、またはこれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択され、前記アミノ酸配列が、残基２１４におけるＶａｌ、または残基１０７１におけるＶａｌを含む場合、前記アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含む、ポリペプチド。
【請求項２３】
前記λ−３ポリペプチドが、配列番号１９を含む、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
レオウイルスσ−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記レオウイルスσ−３ポリペプチドの前記配列が、１つもしくは複数のアミノ酸改変を含み、前記１つもしくは複数のアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９に関連して番号付けられる、残基１４におけるＬｅｕ、残基１９８におけるＬｙｓ、またはこれらのいずれかの組み合わせから成る群より選択され、前記アミノ酸配列が残基１４においてＬｅｕを含む場合、前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列に少なくとも１つの追加変更をさらに含む、ポリペプチド。
【請求項２５】
前記σ−３ポリペプチドが、配列番号１５を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
レオウイルスμ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記レオウイルスμ−１ポリペプチドの前記配列が、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１に関連して番号付けられる、残基７３においてＡｓｐを含む、ポリペプチド。
【請求項２７】
前記μ−１ポリペプチドが、配列番号１７を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
レオウイルスμ−２ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記レオウイルスμ−２ポリペプチドの前記配列が、少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、前記少なくとも１つのアミノ酸改変が、ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１に関連して番号付けられる、残基５２８においてＳｅｒを含む、ポリペプチド。
【請求項２９】
前記μ−２ポリペプチドが、配列番号１６を含む、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２２から２９のいずれか一項に記載のポリペプチドを１つもしくは複数含む、レオウイルス。
【請求項３１】
前記レオウイルスが、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿６９４６８４．１に関連して番号付けられる、７０位、１２７位、１９５位、２４１位、２５５位、２９４位、２９６位、または３４０位のうちの１つもしくは複数においてＣｙｓを含むσ−２ポリペプチドをさらに含む、請求項３０に記載のレオウイルス。
【請求項３２】
前記σ−２ポリペプチドが、配列番号１２を含む、請求項３１に記載のレオウイルス。
【請求項３３】
前記レオウイルスが再集合体である、請求項３０から３２のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス。
【請求項３４】
レオウイルスＬ１ゲノム分節の核酸配列を含む核酸分子であって、前記レオウイルスＬ１ゲノム分節の前記核酸配列が、１つもしくは複数の核酸改変を含み、前記１つもしくは複数の核酸改変が、ジェンバンク受入番号Ｍ２４７３４．１に関連して番号付けられる、６６０位におけるＴ、８１７位におけるＧ、１６８７位におけるＡ、２２８３位におけるＧ、２２８４〜２２８６位におけるＡＴＧ、２７９４位におけるＣ、２９０５位におけるＣ、２９５３位におけるＣ、３１５３位におけるＡ、３２３１位におけるＧから成る群より選択される、核酸分子。
【請求項３５】
前記Ｌ１ゲノム分節が、配列番号８を含む、請求項３４に記載の核酸分子。
【請求項３６】
レオウイルスＳ４ゲノム分節の核酸配列を含む核酸分子であって、前記レオウイルスＳ４ゲノム分節の前記核酸配列が、１つもしくは複数の核酸改変を含み、前記１つもしくは複数の核酸改変が、配列番号２４（ジェンバンク受入番号Ｋ０２７３９）に関連して番号付けられる、７４位におけるＡおよび６２４位におけるＡから成る群より選択される、核酸分子。
【請求項３７】
前記Ｓ４ゲノム分節が、配列番号４を含む、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項３８】
レオウイルスＭ１ゲノム分節の核酸配列を含む核酸分子であって、前記レオウイルスＭ１ゲノム分節の前記核酸配列が、少なくとも１つの核酸改変を含み、前記少なくとも１つの核酸改変が、配列番号２６（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１６８４．１）に関連して番号付けられる、１５９５位にＴを含む、核酸分子。
【請求項３９】
前記Ｍ１ゲノム分節が、配列番号５を含む、請求項３８に記載の核酸分子。
【請求項４０】
レオウイルスＭ２ゲノム分節の核酸配列を含む核酸分子であって、前記レオウイルスＭ２ゲノム分節の前記核酸配列が、少なくとも１つの核酸改変を含み、前記少なくとも１つの核酸改変が、配列番号２８（ジェンバンク受入番号Ｍ２０１６１．１）に関連して番号付けられる、２４８位にＣを含む、核酸分子。
【請求項４１】
前記Ｍ２ゲノム分節が、配列番号６を含む、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
請求項３４から４１のいずれか一項に記載の前記核酸分子のうちの１つもしくは複数を含む、レオウイルス。
【請求項４３】
前記レオウイルスが再集合体である、請求項４２に記載のレオウイルス。
【請求項４４】
配列番号１〜１０において示されるような配列を有するゲノム分節を含む、レオウイルス。
【請求項４５】
配列番号１１、１２、および１６〜２１、および配列番号１３または１４のうちの少なくとも１つにおいて示されるようなポリペプチドを含む、レオウイルス。
【請求項４６】
ＩＤＡＣ受入番号１９０９０７−０１を有する、請求項４４または４５に記載のレオウイルス。
【請求項４７】
前記レオウイルスが、改変を含まないレオウイルスを超える増殖利点を呈する、請求項１から２１、３０から３３、４２から４６のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス。
【請求項４８】
前記増殖利点が、細胞溶解率の増加；プラーク作製サイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増大または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞の免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力から成る群より選択される、請求項４７に記載のレオウイルス。
【請求項４９】
請求項１から２１、３０から３３、または４２から４８のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス、および医薬的に容認可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項５０】
１つもしくは複数の化学療法薬および／または１つもしくは複数の免疫抑制剤をさらに含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
改良レオウイルスを作製する方法であって、前記レオウイルスの核酸配列を改変するステップと、１つもしくは複数の改良レオウイルスを選択するステップと、を含む、方法。
【請求項５２】
前記改変するステップが、前記レオウイルスに突然変異を生じさせるステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記突然変異を生じさせるステップが、部位特異的突然変異誘発を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記突然変異を生じさせるステップが、化学的突然変異誘発を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記改変するステップが、前記レオウイルスをヒト細胞株において培養するステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記改良レオウイルスが、細胞溶解率の増加；プラーク作製のサイズの増大；ＲＮＡ複製率の増加；ＲＮＡ転写率の増加；翻訳率の増加；ウイルスアセンブリおよび／またはパッケージング率の増加；子孫ウイルス数の増加；宿主細胞によって取り込まれるレオウイルスの能力の増大；脱殻能力の増大または増強；細胞溶解の増強またはアポトーシス、壊死または自食作用を含む細胞死の誘発；ヒト腫瘍細胞株を感染、溶解、殺傷する能力の増強；哺乳動物細胞における免疫原性の低下；インターフェロン感度に対する特異的感受性；宿主に対する毒性の低下；薬物間相互作用の増強；放射線治療相互作用の増強；または効果的な腫瘍エピトープの放出能力のために選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
患者において増殖性疾患を治療する方法であって、請求項１から２１、３０から３３、または４２から４８のうちのいずれか一項に記載のレオウイルス、または請求項４９または５０に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項５８】
前記レオウイルスを、腫瘍崩壊を生じさせるために有効な量で投与する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
手術、化学療法、放射線治療、および免疫抑制療法から成る群より選択される処置のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記レオウイルスまたは医薬組成物が１回以上投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記レオウイルスまたは医薬組成物が、経静脈的、経脈管的、髄腔内、筋肉内、皮下的、骨盤内、局所的、経口的、経直腸的、経膣的、経鼻腔的、直接注射または吸入によって投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１から２１、３０から３３、または４２から４８のうちのいずれか一項に記載のレオウイルスを含むキット。
【請求項６３】
１つもしくは複数の薬剤をさらに含む、請求項６２に記載のキット。
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【公表番号】特表２０１０−５２０７５８（Ｐ２０１０−５２０７５８Ａ）
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５２９８３（Ｐ２００９−５５２９８３）
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００４８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１０００４
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０１３３２２６４）オンコリティクス バイオテク，インコーポレーテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００８／０００４８３
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１１０００４
【国際公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（５０１３３２２６４）オンコリティクス バイオテク，インコーポレーテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
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