本発明は、副溝バインダー・オリゴヌクレオチドプローブ類およびそれらの使用法類を提供するものであって、それらのプローブ類は連結フルオロフォアを有するものであり、ハイブリダイゼーションしていない形ではバックグラウンドシグナルが極めて低いものである。本発明は３’−末端および５’−末端を有するオリゴヌクレオチド部分とそのヌクレオチド単位の少なくとも１個と連結基を介してオリゴヌクレオチドと共有結合している副溝バインダー部分とフルオロフォアおよびクエンチャとを含むオリゴヌクレオチドプローブ類を提供し、そのプローブは以下の式を持つものである。式中の変数は、明細書中に定義されるとおりである。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年１０月２８日出願の米国特許仮出願第６０／５１５５２３号の３５ＵＳＣ第１１９条ｅ項に基づく利益を主張するものである。この開示は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（米国連邦政府が支援する研究または開発のもとで成された発明に対する権利に関する主張）
非適用。
【０００３】
（コンパクトディスクで提出された添付の「配列表」、表またはコンピュータプログラムに関する参照）
【背景技術】
【０００４】
（技術分野）
ＤＮＡプローブ類は、配列の検出および定量のために確立されたツールである。配列検出の効率性および正確さは、そのプローブのハイブリダイゼーション特異性と感度とに依存する。蛍光は、そのハイブリダイゼーション事象を検出するための最も一般的な手段の一つである。核酸検出用の蛍光プローブ類を用いる方法は、インタクトのプローブ類のハイブリダイゼーションでトリガされた蛍光に基づくもの（たとえばＭｏｌｅｃｕａｒ Ｂｅａｃｏｎ類、およびリニアプローブ類、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および米国特許出願第１０／１６５４１０号参照）、あるいはクエンチングされていた蛍光が、ＤＮＡポリメラーゼによるプローブの分解によって発光されることに基づくもの（たとえばＴａｑＭａｎ、ＭＧＢ−Ｔａｑｍａｎを用いる方法類；尚、ＭＧＢはＥｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の商標である）のいずれかである。ＴａｑＭａｎおよびＭＧＢ−ＴａｑＭａｎを用いる方法類では、接近するＤＮＡポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼがフルオロフォアとクエンチャとの間でプローブを開裂し、それによって蛍光を放出させる。これらのタイプのプローブ類は、リアルタイムＤＮＡ増幅の検出に適している。前者のプローブ類は、増幅後の配列検出検出（走査プロット解析または熱融解）、あるいは固相フォーマットにおいても適用することができる。クエンチングされた蛍光プローブ類が固定化された固相に関しては、たとえば特許文献５および特許文献６において既に開示されており、核酸標的類の検出に使用されてきている。その開示されたハイブリダイゼーションプローブ類は、バックグランドに対するシグナル比が低かったり、ハイブリダオゼーション速度が遅く（非特許文献１）、バックグランドの蛍光（ハイブリダイズしていない状態での蛍光）が不安定で温度に依存したりするため、リアルタイム増幅に適用するには不適である。
【特許文献１】米国特許第６０３０７８７号明細書
【特許文献２】米国特許第６２１４９７９号明細書
【特許文献３】米国特許第５９２５５１７号明細書
【特許文献４】米国特許第５７２３５９１号明細書
【特許文献５】米国特許第５８７６９３０号明細書
【特許文献６】米国特許第６５９６４９０号明細書
【非特許文献１】Ｘｉａｏｈｏｎｇ Ｆａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９年，第１２１巻：２９２１−２９２２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本技術において必要とされるのは、配列特異性が高く、感度（バックグランドに対するシグナル比）が改善され、バックグランドシグナルが安定で（温度に依存しない）、ハイブリダイゼーション速度類が速い新規のオリゴヌクレオチドプローブ類である。またそのプローブ類を多様な天然または非天然のヌクレオチド類および蛍光標識類で容易に調整することができ、しかも様々な長さのものを調製できることも必要とされている。本発明はそのようなプローブ類、さらにそれらの製法類および使用も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
一態様によれば、本発明は３’−末端および５’−末端を有するオリゴヌクレオチド部分とそのヌクレオチド単位の少なくとも１個と連結基を介してオリゴヌクレオチドと共有結合している副溝バインダー部分とフルオロフォアおよびクエンチャとを含むオリゴヌクレオチドプローブ類を提供し、そのプローブは以下の式を持つものである。
【０００７】
【化８】

この式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャ、Ｆｌはフルオロフォアであり、［Ａ−Ｂ］_ｎはｎ単位の核酸オリゴマーを表わし、ｎは５−５０の整数であり、Ａは各々、独立して糖リン酸エステル主鎖、修飾糖リン酸エステル主鎖、ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）主鎖、ペプチド主鎖、あるいは核酸調製で用いられるそれらの変異体からなる群から選択される核酸主鎖成分を表わし、Ｂは各々、独立して核酸塩基、修飾塩基または塩基類縁体を表わし、Ｋは結合または連結基であり、Ｗは（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブが相補的配列にハイブリダイズする際に形成される二重鎖副溝内にＭＢが結合し、（ｉｉ）ハイブリダイズしていない形では、オリゴヌクレオチドプローブ内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドプローブがその標的配列にハイブリダイズする際にＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、ＭＢとＦｌと［Ａ−Ｂ］_ｎとの間に充分な空間を提供する３価の連結基である。
【０００８】
いくつかの実施形態ではＷは、ハイブリダイズされていない形では、オリゴヌクレオチド内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の約１０％未満であるように、ＭＢとＦｌと［Ａ−Ｂ］_ｎとの間に間隔をあけるものである。別の実施形態ではＷは、以下に示した基から選択されるメンバーである。
【０００９】
【化９】

式中、ｑは０−８の整数であり、Ａ^０、Ａ^１およびＡ^２は各々、主鎖の原子数が１−５０の連結基類（たとえばアリール、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、およびそれらを組合わせた基類）であり、波線はＭＢ、Ｑおよび［Ａ−Ｂ］_ｎ部分との結合点を示す。
【００１０】
それ以外の実施形態では、ｎは６−１８の整数であって、［Ａ−Ｂ］_ｎ部分は少なくとも３個の連続したグアニンヌクレオチドを含み、そのグアニンヌクレオチド塩基類の少なくとも１個がＰＰＧによって置換されているものがある。好ましくは［Ａ−Ｂ］_ｎ部分がＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ体、ＰＮＡまたはロックされた核酸である。さらに別の実施形態では、ｎは６−１８の整数であり、標的配列に相補的であり、プローブの少なくとも３０％がアデニン塩基とチミジン塩基とで占め、少なくとも１個の修飾塩基をプローブ内に含み、それは少なくとも１個の修飾塩基を含まないプローブと比較して、少なくとも３℃での二重鎖形成の安定性が増大するのに充分である。ある実施形態ではプローブは、少なくとも５０％がアデニン塩基およびチミジン塩基で占められる標的配列と相補的であって、修飾塩基基類を含まないプローブと比較して、少なくとも５℃での二重鎖形成の安定性が増大するのに充分な修飾塩基類を含むものである。
【００１１】
関連した態様によれば、本発明は本明細書に記載のプローブ類を用いる方法類およびそのためのアレイ類を提供する。
【００１２】
ある関連した態様によれば、本発明は以下に示すポリヌクレオチド増幅の連続モニタリング法類を提供する。
【００１３】
（ａ）標的配列を含む試料を、その標的配列領域に相補的な１種または複数のオリゴヌクレオチドプライマー類、重合反応酵素、ヌクレオチド基質類、および
【００１４】
【化１０】

で表されるオリゴヌクレオチド結合体と混合して混合物を得る。尚、式中、ＭＢは副溝バインダ、Ｑはクエンチャ、ＯＤＮは増幅された標的配列の一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。
【００１５】
（ｂ）その混合物を、対象のポリヌクレオチドの増幅に好適な諸条件のもとで温置する。
【００１６】
および
（ｃ）増幅した標的に結合体がハイブリダイズする際に産生する蛍光をモニタリングすることで連続的に増幅をモニタリングする。いくつかの好ましい実施形態では、ＭＢ部分はＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、Ｆｌ部分は蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロホアであり、そのフルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類とボディピ（ｂｏｄｉｐｉ）類縁体類とからなる群から選択されるものである。さらに別の好ましい実施形態では、Ｑ部分はモノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである。また別の好ましい実施形態では、結合体のＯＤＮ部分はヌクレオチドの長さが８−２５である。さらに別の好ましい実施形態では、結合体のＯＤＮ部分はヌクレオチドの長さが８−１８であり、Ｋが、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉからなる群から選択される１０−５０の主鎖原子長を有するリンカーである。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、以下の内容を含む遺伝子発現モニタリング法類が提供される。
【００１８】
（ａ）異なる配列類のオリゴヌクレオチドプローブ類のアレイを準備する。
【００１９】
（ｂ）ハイブリダイズ諸条件下でそのアレイとともにポリヌクレオチド群を温置する。
【００２０】
（ｃ）アレイ内のオリゴヌクレオチドプローブ類のうち、どのプローブがポリヌクレオチド群とハイブリダイズするものかを判断する。
尚、オリゴヌクレオチドプローブ類の一種以上は、以下の式のオリゴヌクレオチド結合体である。
【００２１】
【化１１】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮは増幅された標的配列の一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がそれのクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。いくつかの好ましい実施形態では、ＭＢ部分はＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、Ｆｌ部分は蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ（ｂｏｄｉｐｙ）類縁体類からなる群から選択されるものであり、Ｑ部分はモノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである。別の好ましい実施形態では、結合体は固体支持体に結合している。
【００２２】
別の関連した態様によれば、本発明は単一ヌクレオチドが異なるポリヌクレオチド類を識別する方法類を提供し、その方法は以下の内容を含む。
【００２３】
（ａ）少なくとも２種のポリヌクレオチド類の各々を、別々に以下の式のオリゴヌクレオチド結合体と温置する。
【００２４】
【化１２】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮは増幅された標的配列の一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がそれのクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるようにＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。また結合体がハイブリダイゼーション諸条件下で所定の配列を持ち、ポリヌクレオチド類のうちの１種がオリゴヌクレオチド結合体に完全に相補的な標的配列を持ち、ポリヌクレオチド類のそれの少なくとも１種はオリゴヌクレオチド結合体と単一ヌクレオチドミスマッチを有する標的配列を持つものである。
および
（ｂ）ポリヌクレオチド類の各々とオリゴヌクレオチド結合体とのハイブリダイゼーション強度を測定する。前述と同様に、ある好ましい実施形態では、ＭＢ部分はＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、Ｆｌ部分は蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ（ｂｏｄｉｐｙ）類縁体類からなる群から選択されるものであり、Ｑ部分はモノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである。
【００２５】
さらに別の好ましい実施形態では本発明は、別の一種または複数のポリヌクレオチド類の混合物内に存在し、標的配列と関連性があるが同一ではないポリヌクレオチド内の標的配列を検出する方法類を提供し、その方法は以下に内容を含むものである。
【００２６】
（ａ）ポリヌクレオチド類の混合物を、以下の式のオリゴヌクレオチド結合体と接触させる。
【００２７】
【化１３】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮはオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。またこの結合体は、そのＯＤＮ部分に完全に相補的である標的配列とのみ安定なハイブリッドを形成し、ほかのポリヌクレオチド類のいずれとも安定なハイブリッドを形成しないものである。
および
（ｂ）ハイブリッド形成時に産生する蛍光を測定し、ハイブリッドの形成が認められれば標的配列の存在が示されるものとする。前述で述べたものを含めた好ましい実施形態では、特にＭＢ部分はＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、Ｆｌ部分は蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ（ｂｏｄｉｐｙ）類縁体類からなる群から選択されるものであり、Ｑ部分はモノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである。
【００２８】
さらに別の関連した態様によれば、本発明は野生型、変異型およびヘテロ接合型の標的ポリヌクレオチド類を識別する方法類を提供し、その方法は以下の内容を含む。
【００２９】
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含有する試料を、２種類のプローブと接触させる。その第一のプローブは野生型の標的ポリヌクレオチドに特異的であり、第二のプローブは変異型の標的ポリヌクレオチドに特異的であって、それらプローブの各々は以下の式を持つものである。
【００３０】
【化１４】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮはオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がそれのクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。またこの結合体は、そのＯＤＮ部分に完全に相補的である標的配列とのみ安定なハイブリッドを形成し、ほかのポリヌクレオチド類のいずれとも安定なハイブリッドを形成しないものである。
【００３１】
（ｂ）ハイブリッド形成時に産生する蛍光を測定し、ハイブリッド形成が認められると野生型、変異型およびヘテロ接合型の標的ポリヌクレオチド類の存在または非存在が分かる。この態様によれば、第一および第二のプローブ類とそれらの各標的との間で生じる各々のハイブリッドに関する融解温度（Ｔ_ｍ）はそれぞれについて約５℃以内であることが好ましい。ほかの選ばれた実施形態では、プローブ類の各々のＯＤＮ部分は８−１８個の塩基または修飾塩基を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、プローブ類の各々のＯＤＮ部分は１０−１８の塩基または修飾塩基を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドである。また別の好ましい実施形態では、プローブ類の各々のフルオロフォア部分類は、５−ＦＡＭ^ＴＭ、６−ＦＡＭ^ＴＭ、ＴＥＴ^ＴＭ、ＪＯＥ^ＴＭ、ＨＥＸ^ＴＭ、ＶＩＣ^ＴＭ、ＮＥＤ^ＴＭ、ＴＡＭＲＡ^ＴＭ、ＲＯＸ^ＴＭとＹＹ^ＴＭとからなる群から選択されるか、あるいは本明細書に参照文書として取り上げられている米国特許仮出願第６０／６０１５９９号に記載のホスホネートフルオロホアが代わりに挙げられる。さらに別の好ましい実施形態では、プローブ類の各々のＯＤＮ部分は少なくとも１個の修飾塩基を含み、その修飾塩基は好ましくは６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、１Ｈ−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン、６−アミノ−３−プロピ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、６−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニ）ル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、６−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、４−アミノ−３−（プロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、３−プロピ−１−イニル−４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−（４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）エチン−１−オール、３−（２−アミノエチニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、５−プロピ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、５−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、６−アミノ−５−プロピ−１−イニル）−３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−アミノプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、５−［４−アミノ−３−（３−メトキシプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル］−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール、６−アミノ−１−［４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３−（３−メトキシプロピ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブチ−３−イン−１−オール、６−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−ブチ−１−イニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、５−（４−ヒドロキシ−ブチ−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン、３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミンおよび３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミンから選択される。さらに別の実施形態では、試料を増幅諸条件下で１連のプライマー類とさらに接触させる。尚、そのプライマー類の各々は、前述の修飾塩基類から選択される１−１０個の修飾塩基を含むものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（発明の詳細な記載）
（定義および略）
以下（および前述）の反応スキームおよびその記載において、ＭＢ、ＦＬ、Ｑ、ＣＰＧおよびＯＤＮの略語は各々、文脈から分かるように、「副溝バインダ」、「蛍光標識」または「フルオロフォア」、「クエンチャ」、「細孔制御ガラス」（固体支持体の例として）および「オリゴヌクレオチド」部位類または分子類を指すものである。ある式において、［Ａ−Ｂ］_ｎ群は、「ｎ」個の塩基類（Ｂ）を有し、「ｎ」個の糖類、修飾糖類またはアミノ酸類（Ａ）の主鎖に沿って連結しているオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドまたはペプチド−核酸を指すのに用いられる。「プローブ」と「結合体」との用語類は互換的に用いられ、結合した副溝バインダ、フルオロフォアおよびクエンチャを持つオリゴヌクレオチドを指すものである。
【００３３】
「蛍光標識」または「フルオロフォア」という用語類は、約４００−９００ｎｍの最大蛍光発光波長を持つ化合物類を指す。それらの化合物類には以下のものが挙げられる。尚、その最大蛍光放出波長ｎｍを括弧内に示す。Ｃｙ２^ＴＭ（５０６）、ＧＦＰ（Ｒｅｄ Ｓｈｉｆｔｅｄ）（５０７）、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯ^ＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ^ＴＭ（５１９）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ（５２２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ（登録商標）−１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３^ＴＭ（５７０）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ（５７６）、Ｐｙｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ^ＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５^ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｉｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ^ＴＭ（６１５）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯ^ＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ（登録商標）−３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５^ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）およびＣｙ５．５（６９４）が挙げられる。それ以外のフルオロフォア類としては、参照として本明細書に全体が援用されている国際公開第０３／０２３３５７号および米国特許仮出願第６０／６０１５９９号で開示されたものがある。
【００３４】
「リンカー」という用語は、分子の種々の部分を組立てる場合か、または固体支持体に分子（またはそのいくつかの部分）を共有結合させる場合に用いられる部分のことを指す。さらに付け加えると、リンカーには線状、つまり非環状の部分類、環状部分類、芳香族環類、あるいはそれらの組合わせのものが含まれる。
【００３５】
「反応性基」という用語は、少なくとも１個の求核性基または少なくとも１個の求電子性（反応性）基を持つ部分を指す。いくつかの場合、「反応性基」はその両方の基を含むこともあるが、そのような場合ではその一方または両方が、典型的には所望ではない反応を抑制するために保護基でブロックされている（Ｔ． Ｗ． ＧｒｅｅｎｅとＰ． Ｇ． Ｗｕｔｓの以下の文献を参照）。求核性基類の例としては、−ＮＨ_２、−ＮＨＮＨ_２、−ＯＮＨ_２、−ＮＨＣ＝（Ｏ）ＮＨＮＨ_２、−ＯＨまたは−ＳＨが挙げられる。求電子性反応性基類の例としては、活性化エステル基類、アクリルアミド類、アシルアジド類、ハロゲン化アシル類、アルデヒド類またはケトン類、ハロゲン化アルキル類、スルホン酸アルキルエステル類、酸無水物類、ハロゲン化アリール類、アジリジン類、ホウ酸エステル類、カルボン酸類、カルボジイミド類、ジアゾアルカン類、エポキシド類、ハロゲン化アセトアミド類、ハロゲン化トリアジン類、イミドエステル類、イソシアン酸エステル類、イソチオシアン酸エステル類、マレイミド類、ホスホルアミダイト類、ハロゲン化シリル類、スルホン酸エステル類およびハロゲン化スルホニル類が挙げられる。
【００３６】
「固体支持体」という用語は、オリゴヌクレオチド類の合成に適合しているか、または対合アッセイ類（ＤＮＡアレイ類のような）にふさわしいいずれの支持体も指すものであって、たとえばガラス、細孔制御ガラス、ポリマー素材類、ポリスチレンビーズ類、表面被覆化ガラス等が含まれる。
【００３７】
「アルキル」という用語は、用語の前に示された数の炭素原子を持つ環状および直鎖状または分岐状の１価の飽和炭化水素基、あるいは環状および直鎖状または分岐状の１価の飽和炭化水素基類が組合わされたものを指す。たとえば（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキルといえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、２−プロピル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、シクロプロピルメチル等が挙げられる。本明細書で定義される各々（たとえばアルキル、アルケニル、アルコキシ、アラールキルオキシ）については、アルキル部分における主鎖の炭素原子数が先頭に表示されない場合、その基または部分は８個またはそれより少ない炭素原子数の主鎖を持つものとされよう。「ヘテロアルキル」という用語は、先頭に表示された炭素原子数を持ち、炭素原子類間に配置された１−３個の複素原子類を持つ線状、分岐状、または飽和環状の１価の基、あるいは環状および線状または分岐状の１価の飽和炭化水素基類が組合わされたものを指す。
【００３８】
「アルキレン」という用語は、先頭に表示された炭素原子数を持つ飽和線状の２価の炭化水素基または飽和分岐状の２価の炭化水素基を意味するものである。たとえば（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキレンとはメチレン、エチレン、プロピレン、２−メチルプロピレン、ペンチレン等を含めるという意味である。「ヘテロアルキレン」という用語は、鎖内に１−５個の複素原子類（たとえばＯ，Ｎ，Ｓ，ＰおよびＳｉ）が割り込んだ、表示された炭素原子数を持つアルキレン基のことを指す。
【００３９】
「アルケニル」という用語は、先頭に表示された炭素原子数を持ち、少くなくとも１個の二重結合を含んだ線状の１価の炭化水素基または分岐状の１価の炭化水素基を指す。たとえば（Ｃ_２−Ｃ_６）アルケニルとはエテニル、プロペニル等が含まれるという意味である。
【００４０】
「アルキニル」という用語は、先頭に表示された炭素原子数を持ち、少なくとも１個の三重結合を含んだ線状の１価の炭化水素基または分岐状の１価の炭化水素基を指す。たとえば（Ｃ_２−Ｃ_６）アルキニルとはエチニル、プロピニル等が含まれるという意味である。
【００４１】
アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレンおよびヘテロアルキレン基類に対して存在する場合の置換基類には様々なものがあって、ハロゲン、オキソ、チオノ、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、ペルフルオロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルコキシおよびペルフルオロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルから選択され、その置換基数は１−４個である。尚、前述のＲ’、Ｒ’’およびＲ’’’は独立して、Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換化アリ−ルおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル、および（非置換アリール）オキシ−（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルから選択される。
【００４２】
「アリール」という用語は、非置換または独立した１−６個の置換基を持つ６−１４員環の１価または２価（たとえばアリーレン）の、単環、二環または三環の芳香族炭化水素基を意味し、置換基を持つ場合は１，２または３個が好ましく、以下に挙げた基類から選択されるものが良い。また「アリール」という用語は、前述の基類の芳香性を残しながらもその環を構成する炭素原子類が１個または複数の複素原子類または複素原子官能基類で置き換わった基類も含めた意味を持ち、たとえばピリジル、キノリニル、キナゾリニル、チエニル等が挙げられる。さらに特定の意味では、「アリール」という用語は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、チエニルおよびベンゾチアゾリル、アクリジニル、およびそれらの置換型を含めるものであるが、必ずしもそれらに限定されない。
【００４３】
アリール基類に対する置換基類には様々なものがあって、ハロゲン、−ＯＲ’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、ＮＲ’Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−Ｎ_３、−ＣＨ（ｐｈ）_２、ペルフルオロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルコキシおよびペルフルオロ（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルから選択され、その芳香環系での置換基数は、０からその開殻の原子価の数までである。尚、前述のＲ’、Ｒ’’およびＲ’’’は独立して、Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキルおよびヘテロアルキル、非置換化アリ−ルおよびヘテロアリール、（非置換アリール）−（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル、および（非置換アリール）オキシ−（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルから選択される。
【００４４】
そのアリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子類における置換基類のうちの２個は、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｑ−Ｕ−の置換基と置き換わる場合もあり、その式中のＴおよびＵは独立して−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ_２−または単結合であって、ｑは０−２の整数である。あるいはアリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子類における置換基類のうちの２個が、式−Ａ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｂ−の置換基と所望により置き換わるものがあり、その式中のＡおよびＢは独立して−ＣＨ_２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−または単結合であって、ｒは１−３の整数である。そのように形成された新たな環の単結合類のうちの１個は、所望により二重結合と置き換わる場合もある。あるいはアリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子類における置換基のうちの２個が、式−（ＣＨ_２）_ｓ−Ｘ−（ＣＨ_２）_ｔ−の置換基と所望により置き換わるものがあり、その式中、ｓおよびｔは独立して０−３の整数であって、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−である。尚、その−ＮＲ’−および−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−中の置換基Ｒ’は、ハロゲンまたは非置換（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルから選択されるものである。その上さらに、アリ−ル環類（以下のＡｒ^１およびＡｒ^２）のうちの１個がさらに別の置換化アリール基で置換されてその芳香系の共鳴能を拡張させることもでき、それによって波長の最大吸光度が増大する。尚、その場合の置換化は直接なされるか、あるいは−（ＣＲ’＝ＣＲ’）_ｎ−および−（Ｃ≡Ｃ）_ｎ−のような基類を介して成され得るものであって、その式中のｎは０−５の整数である。
【００４５】
置換基を記載する際に用いられる先頭に付く「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉを指す。
【００４６】
本発明のある化合物類またはオリゴヌクレオチド類は、塩の形で存在する場合もある。そのような塩類には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、あるいは同様な塩のような塩基付加塩類が含まれる。本発明の化合物類または修飾オリゴヌクレオチド類が比較的塩基性が強い官能基類を含有する場合、その酸付加塩類は、そのもとの中性型の化合物を充分な量の所望の酸と直接または適当な不活性溶媒中で接触させて得ることができる。許容される酸付加塩類の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、重炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸類から得られる塩類、並びに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、リンゴ酸、乳酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような有機酸類から得られる塩類が挙げられる。またアルギニン塩等のようなアミノ酸類の塩類も含まれ、グルクロン酸またはガラクツロン酸等のような有機酸類の塩類も含まれる（たとえばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７７，６６，１−１９参照）。本発明のある特定の化合物類には、その塩基付加塩類または酸付加塩類のいずれかに変換することが可能な塩基性官能基および酸性官能基の両方を含有するものもある。
【００４７】
それら化合物類の中性型類は、その塩を塩基または酸と接触させ、その親化合物を通常の手段で単離して再生させる場合もある。その親化合物の型は、極性溶媒類中での溶解性のような物理諸特性においては種々の塩型類とは異なるものではあるが、そのほかの全ての点では、それら塩類は本発明の目的にとってその親の型の化合物と同等なものである。
【００４８】
本発明のある化合物類は、非溶媒和物類の状態で、並びに水和物類を含めた溶媒和物の状態でも存在することができる。一般に溶媒和の状態のものは、非溶媒和物の状態のものと同等であって本発明の範囲内に含まれるものである。本発明のある化合物類は、多結晶または無定形の状態で存在する場合がある。一般に本発明が目的とする使用では、全ての物理的形態類は同等であり、本発明の範囲内にあるものとする。
【００４９】
本発明のある化合物類は、不斉炭素原子類（光学活性中心）または二重結合類を持ち、それらラセミ体類、ジアステレオ異性体類、幾何異性体類および個別の異性体類は、本発明の範囲に全て含まれるものである。異性体類立体の化学的測定法類および分離法類は、当業者によく知られている（“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｊ． Ｍａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２の第４章内の議論部分を参照）。
【００５０】
本発明の化合物類は、その化合物類を構成する１個または複数の原子類において原子の同位体比類が天然の場合とは異なるものを含有する場合もある。たとえば化合物類がトリチウム（^３Ｈ）、ヨウ素−１２５（^１２５Ｉ）または炭素−１４（^１４Ｃ）のような放射性同位元素で放射性標識化される場合もある。本発明の化合物類の全ての同位体性変異体類は、放射活性がある場合または無い場合（たとえば^２Ｈ）でも、本発明領域内に含まれるものである。
【００５１】
「保護性基」または「その保護された基」とは、分子マスク内の活性基に結合するとその反応性を低下させるか、または防ぐ原子群のことを指す。保護性基類の例としては、Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｗｕｔｓ， “Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， （Ｗｈｉｌｅｙ， ２ｎｄ ｅｄ． １９９１）およびＨａｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌｓ． １−８（Ｊｏｈｎ Ｗｈｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ． １９７１−１９９６）に見出すことができる。代表的なアミノ酸保護性基類には、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチルおよび置換化トリチル基類、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ニトロ−ベラチルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）等が含まれる。代表的なヒドロキシ保護性基類には、ヒドロキシ基がアシル化されるかまたはアルキル化される場合のもの、たとえばベンジルおよびトリチルエーテル類、並びにアルキルエーテル類、テトラヒドロピラニルエーテル類、トリアルキルシリルエーテル類およびアリルエーテル類、が含まれる。一般に好ましい保護性基類は、酸性の諸条件または塩基性の諸条件のもとで除去可能なもの、あるいは特別な光源（たとえば「感光性」保護性基類）の使用によって除去可能なものである。さらに加えて、適切な保護性基の選択はその分子におけるほかの機能を考慮して行われるもので、それによって保護性基の着脱によるその分子の残り部分への干渉またはそれ以外の重大な影響がなくなる。
【００５２】
前述の定義の部分で用いられた「所望の」または「所望により」とは、そのあとに説明される事象または状況が生じるのに必ずしも必要ではないことを意味し、その事象または状況が生じる場合、あるいは生じない場合の事例を含めた記述を意味するものである。たとえば「アリールが、所望によりアルキル基と共に、１個または２個置換した」とは、アルキル基の存在が必ずしも必要ではないという意味であって、アルキル基と共にアリール基が１個または２個置換した諸状況、およびアリール基がアルキル基と共には置換しない諸状況を含めた記述を意味する。
【００５３】
本発明の実施には、別に示す場合を除いて、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチドの合成および修飾、バイオ結合体化学、核酸対合、分子生物学、微生物学、遺伝学、組換えＤＮＡ、および本分野の技術中に存在するような関連領域における従来技術を用いることになろう。これらの技術類については、文献で充分に説明されている。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， “ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ”， ２ｎｄ． Ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）； Ａｕｓｕｂｅｌら、“ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９８７， １９８８， １９８９， １９９０， １９９１， １９９２， １９９３， １９９４， １９９５， １９９６）； Ｇａｉｔ（ｅｄ．）， “ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ”， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９８４）； Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）， “ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ”， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）を参照のこと。
【００５４】
「Ｅｃｌｉｐｓｅ^ＴＭプローブ」という用語は、一般的にはＭＢ−Ｑ−５’−ＯＤＮ−Ｆｌプローブのことを指す。そのＭＢリガンドとは、ジヒドロピロロインドール−カルボン酸トリアミドのことである。これに対して、「ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＭＧＢ^ＴＭプローブ」とは、ＭＢ−Ｑ−３’−ＯＤＮ−Ｆｌプローブのことである。Ｅｃｌｉｐｓｅ^ＴＭおよびＭＧＢ^ＴＭは、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡの商標であり、ＴａｑＭａｎ（登録商標）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡの登録商標である。
【００５５】
（全般）
副溝バインダ・オリゴヌクレオチド結合体類（または「プローブ類」）は、最近になって記載された（国際公開第９９／５１６２１号参照）。これらの結合体類は、相補的なＤＮＡと超安定化二重鎖を形成するものである。特に短いＭＢプローブ類の配列特異性は、ＰＣＲのような高温での諸適用に優れている。国際公開第０３／０６２４４５号で開示された５’−副溝バインダ−クエンチャ−オリゴヌクレオチド−フルオロホア（ＭＢ−Ｑ−５’−ＯＤＮ−Ｆｌ）プローブ類は、７桁の大きさのダイナミックレンジを示し、リアルタイムＰＣＲ増幅反応類において、試料あたり５コピー超の最終感度を持つものである。大変驚きべきことに、一方の末端に副溝結合性フルオロホア基を、およびもう一方の末端にクエンチャを含有するプローブ類は、国際公開第０３／０６２４４５号のプローブ類と比較して感度が改善され、バックグランドシグナル（非対合状態のプローブの蛍光）が有意に低下し、特に蛍光原性２’−リボデオキシヌクレオチド類を用いるアッセイ法類に有用であることが認められる。これらのプローブ類は、図１に示されるように、相補的な標的に対合すると蛍光を発し、国際公開第０３／０６２４４５号に記載のプローブ類（図３）と比較してバックグランドシグナルが１／１０−１／５０の低さである。さらに本発明のプローブ類は、国際公開第０３／０６２４４５号に記載のプローブ類（図４参照）と比較して（温度依存性の）バックグランドシグナルの安定性が有意に高い。この特性は、ＰＣＲ後の一塩基多型解析のような融解プロフィール解析に伴う適用に特に有用であるものである。
【００５６】
５’−ＭＢ−クエンチャ基が均一増幅中にＴａｑポリメラーゼによる５’−ヌクレアーゼ消化を防ぐということは、以前から知られていたことである。本新規プローブ類は、ＭＢ−Ｆｌ−が５’末端で結合すると、同様な５’−ヌクレアーゼ抵抗性を持つものである。それゆえ本新規プローブ類は、５’−ヌクレアーゼ抵抗性が必須であるアッセイ類で用いることができる。３’−ＭＢ−Ｆｌプローブ類は、シグナル生成のためにはプローブの部分的または完全な分解が必要とされるＴａｑＭａｎのようなアッセイで用いることができる。５’−および３’−ＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑのいずれも、非リアルタイム／ポストＰＣＲアッセイ類で用いることもできる。さらに固相ベースのアッセイ類（ＤＮＡアレイ類のような）にも、本発明のプローブ類は適用される（図２）。
【００５７】
本発明のＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑプローブ／結合体類は、プローブが非対合状態では少なくとも１種の一本鎖高次構造で存在するように構築されているものである。非対合状態のランダムコイル型においては、クエンチャとＭＢとは、フルオロホアの蛍光を失わせるのに充分なほどフルオロフォアに近づいている。本プローブ類は、副溝バインダ（図５ａ）とクエンチャ（図５ｂ）との両方が蛍光クエンチングに関係するようにも構築されるものである。
【００５８】
本プローブ／結合体類には、標的ポリヌクレオチド対合時に、ＭＢがＤＮＡの副溝内に隠れ、クエンチャがフルオロフォアの蛍光をクエンチングするのに充分なほどにはフルオロフォアに接近して配置できないような高次構造が採用されている。これらの対合および非対合の高次構造を採用することによって、本プローブは、ハイブリダイズした状態とハイブリダイズしていない状態とで実質的に異なる蛍光シグナル強度類を示すものである。その結果として、本プローブがその蛍光強度の変化に基づいて対合状態なのか、または非対合状態なのかを決定することができ、そのようなプローブ類の使用によって、均一系アッセイ類（ＰＣＲ増幅反応のような）または不均一系アッセイ類（ＤＮＡアレイ類のような）における核酸標的類の標的検出が可能になる。
【００５９】
本発明の副溝バインダ−フルオロホア−オリゴヌクレオチド−クエンチャの結合体類は、線状の配列（式ＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑで提示されるように）、あるいは分岐状の配列で存在することが可能であり、後者ではフルオロホアと副溝バインダとが、ＯＤＮ、ＦｌおよびＭＢを連結させる１個の連結基に結合しているものである。それら配列類の各々は、線状状態の略号（ＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ）が用いられる場合を含めた意味を持つ。さらに、ＭＢ部分とＦｌ部分とがオリゴヌクレオチド末端の一方に結合る場合に、クエンチャ部分はもう一方の末端に結合することができるか、あるいは本結合体のクエンチング機構が干渉されないような長さでオリゴヌクレオチドの内部に連結配置される。一般的にこれは適した連結基（以下の実施例参照）の使用、あるいは５−アミノプロピルウリジンのような塩基リンカー類の使用によって達成することができる。その結果、本発明は、ＯＤＮとＱとの間の連結基類がクエンチャとフルオロホアとの間の適当な分離距離類を提供するように選択される一方で、オリゴヌクレオチド部分の対合能類も損わない、いくつかの好ましい実施形態類を提供する。
【００６０】
前に示したように、本発明の結合体類（またはプローブ類）は、対合に基づく多様な検出アッセイ類に有用であるが、ＰＣＲを介してしばしば実施されるオリゴヌクレオチド増幅の「リアルタイム」検出において特に有用性が見出されるものである。さらには、本発明のプローブ類および結合体類は、標的オリゴヌクレオチド類の増幅後の検出にも有用である。
【００６１】
（実施形態の説明）
（プローブ類および結合体類）
前述の見解では、本発明は、最も一般的にはＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑで示されるプローブ類または結合体類、一面ではオリゴヌクレオチドプローブ類（またはオリゴヌクレオチド結合体類、以後本明細書では「プローブ類／結合体類」「プローブ類」または「結合体類」と記す）ともいえる、を提供するものである。前述のように、プローブ類の線状での表記は、副溝バインダおよびフルオロホアまたは蛍光放出化剤がオリゴヌクレオチド部分の一方の末端に結合し、クエンチャがオリゴヌクレオチド部分のもう一方の末端に結合していることを示すことを意味するものである。これらの共有結合したいずれの部分類についても、接続は直接か、連結基を介してのどちらも可能である。多くの実施形態では連結基類は、提供するものが好ましい。また相互作用性部分類（たとえばフルオロホアおよびクエンチャ）間、あるいは反応性部分類（たとえばプローブが標的配列に対合することによって形成される副溝内に、非共有結合する意味での副溝バインダ類）の間に充分な空間を提供するものが好ましい。
【００６２】
プローブ類および結合体類に関する本明細書に記載の成分類の大部分は、関連出願類（たとえば米国特許第６３３９１４７号、第６４８６３０３号および第６４７２１５３号、並びに国際公開第０１／６４９５８号および国際公開第０３／０６２４４５号参照）に既に記載されているものであるが、本発明に有益な効果がもたらされるのに用いられる組立て順および連結基類は、空間的な関係および柔軟性に対する新たな基準を示すものである。
【００６３】
それにより、一群の実施例ではＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑプローブまたは結合体は、以下の式で表される。
【００６４】
【化１５】

式中のＭＢは副溝バインダ、Ｑはクエンチャ、Ｗは三価の連結基、ＯＤＮはオリゴヌクレオチドまたは修飾化オリゴヌクレオチド、Ｋは結合または連結基、およびＦｌはフルオロフォアである。
【００６５】
さらに特別の場合では、Ｋが連結基である場合、一般的にはＣ，Ｏ，Ｎ，Ｓ，ＰおよびＳｉから選択される１−５０個の主鎖原子類（連続的なライン内に加わるＯＤＮ成分とＱ成分との間の原子類のみを、但し全ての環原子類、を含め、側鎖の原子類または基類を除いて、数える）を持つものであろう。連結基Ｗは一般には、Ｃ，Ｏ，Ｎ，Ｓ，ＰおよびＳｉから選択される主鎖原子の数が約３−１００の三価のリンカーを示すものであろう。さらにＷは、分岐状脂肪族鎖、ヘテロアルキル鎖、１個または複数の置換化環構成体、あるいはそれらの組合わせを含むことができる。いくつかの実施形態ではＷは、分岐状の官能基含有の連結基類を持つか、あるいは持たないアミノ酸のような三官能性部分のことを示す。したがって、Ｗが連結基として提供されても、いくつかの実施形態ではＷは、Ｆｌの一部とみなされる場合がある基であろう。その連結基類の各々は、ほかの成分類と同じく、以下においてさらに詳細に議論されるであろう。
【００６６】
さらに好ましい一群の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体は以下の式を有するものである。
【００６７】
【化１６】

式中、ＭＢ、Ｗ、ＫおよびＦｌは前述の意味を持つものであり、［Ａ−Ｂ］_ｎは核酸オリゴマー（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらのいずれかを組合わせたものであって、修飾塩基類または修飾糖類を持つものも含める）を示し、そのＡは核酸調製の際に用いられる糖リン酸エステル主鎖、修飾糖リン酸エステル主鎖、ロックされた核酸主鎖、ペプチド性主鎖またはそれらの変異体を示し、Ｂは以下でさらに詳しく述べるような核酸塩基、修飾塩基または塩基類縁物質を示す。下付きのｎは約３−約１００の整数、好ましくは６−約５０の整数、さらに好ましくは８−約２５の整数である。
【００６８】
式ＩＩに戻って、Ｑは式Ａｒ^１−（Ｕ＝Ｕ−Ａｒ^３）_ｚ−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ^２のことである。そのＡｒ^１、Ａｒ^２およびＡｒ^３は、アリール基類を示す。Ｑはアルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ等のような少なくとも１種の強力な電子供与基、とニトロ、シアノ、カルボニル、カルボキシ、スルホニル、トリフルオロメチル等のような少なくとも１種の強力な電子吸引基とを持つものである。Ａｒ^１、Ａｒ^２およびＡｒ^３については、さらにアルキル、シクロアルキル、アリール、置換化アリールやハロゲンが置換したものも含めることができる。下付きのｚは０または１、好ましくは０である。ｚが１である時、Ｕは独立して、ＣＨ、Ｃ（Ｒ）とＮとから選択され、そのＲは（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキル基である。またＫは、直接または置換基類を介してＡｒ^１、Ａｒ^２またはＡｒ^３のうちの１個と接続する。Ａｒ^１、Ａｒ^２およびＡｒ^３の各々に対応するアリール基類は、好ましくはフェニル基類である。
【００６９】
さらになお好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体は以下の式を持つものである。
【００７０】
【化１７】

式中、Ａｒ^１、Ａｒ^２、Ｗ、Ｋ、Ｆｌ、Ａ、Ｂおよび下付きのｎは、前に挙げた意味を持つものであり、Ｒ^ａ，Ｒ^ｂ，Ｒ^ｃ，Ｒ^ｄ，Ｒ^ｅおよびＲ^ｆは、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキル、ＯＲ^ｇ、Ｎ（Ｒ^ｇ）_２、Ｎ^＋（Ｒ^ｇ）_３、ＳＲ^ｇ、ＣＯＲ^ｇ、ＣＯ_２Ｒ^ｇ、ＣＯＮ（Ｒ^ｇ）_２、（ＣＨ_２）_０−６ＳＯ_３⁻、（ＣＨ_２）_０−６ＣＯ_２⁻、（ＣＨ_２）_０−６ＯＰＯ_３^−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_０−６ＣＯ_２⁻、およびそれらのエステル類並びに塩類から選択される置換基類を示し、各々のＲ^ｇは独立して、Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキルである。またＲ^ｈはＨ、またはＣ，Ｎ，Ｏ，ＰとＳとから選択される１−３０個の原子類を持つ環状、非環状またはそれらを組合わせた基（典型的には固相合成で用いられる連結基の足跡部分）であって、可能な価数を満たす付加ハロゲン原子類を持つものである。またＱは前述の意味を持つものである。
【００７１】
またさらになお好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ／結合体は以下の式を持つものである。
【００７２】
【化１８】

式中、Ｗ，Ｋ，Ｆｌ，Ａ，Ｂは前述の意味を持つものであり、Ｒ^０、Ｒ^１およびＲ^２は電子吸引基を示し、Ｒ^３およびＲ^４はＨ、またはハロゲン、アルキル、オキシアルキル、アルキルオキシを示し、Ｒ^５はアルキルまたはヒドロキシアルキルを示し、下付きのｎは１−２０の整数である。特に好ましい実施形態では、Ｒ^０＝ＮＯ_２；Ｒ^１＝Ｃｌ；Ｒ^２＝Ｒ^３＝Ｒ^４＝Ｈ；Ｒ^５＝ＣＨ_３；およびＹ＝５である。
【００７３】
特に好ましい一群の実施形態では、ＷとＫとのリンカー類は以下の式を持つものである。
【００７４】
【化１９】

式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅは各々、ＭＢリガンド、フルオロホア、ＯＤＮ両末端およびクエンチャに対する連結点である。
【００７５】
前述の基類について、ある好ましい実施形態では、ＫおよびＷはプローブ／結合体に対して特に蛍光が増強するように選択され、プローブのオリゴヌクレオチド部分の長さに依存するであろう。よって１８員またはそれ以上のヌクレオチド類（修飾ヌクレオチド類または類縁体類を含めての）を有するプローブ類に対しては、Ｋは単結合または約２０原子長までの連結基であり得る。さらに好ましくは、Ｋはプロリノールである。特に好ましい実施形態では、Ｋは式ＩＶｃのような置換プロリノールリンカーである。約１８員未満のヌクレオチド類（修飾ヌクレオチド類または類縁体類を含めての）を有するオリゴヌクレオチド結合体類に対しては、さらに長い（たとえば１５，２０，３０，４０またはそれ以上の主鎖原子長）の基が好ましい。
【００７６】
また式Ｉで挙げたように、Ｗは三官能性の連結基を示す。よって５員またはそれ以上のヌクレオチド類（修飾ヌクレオチド類または類縁体類を含めての）を有するプローブ類に対しては、ＯＤＮ、ＦｌとＭＢとの間に適当な結合、Ｗには柔軟性および間隔設定を提供するための多様な構造体類が含まれ得る。Ｗは、Ｃ，Ｎ，Ｓ，Ｐ，ＳｉおよびＯから選択される約１００原子長までの連結基であり得、可能な価数を満たす付加水素原子類を含むものである（以下にさらに詳しく議論する）。
【００７７】
それ以外の好ましいプローブ類または結合体類は、式Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩａ、およびＩＩＩｂ、並びにＩＶの各々において、そのＯＤＮ部分が３個またはそれ以上の連続したグアニン塩基類から選択され、そのグアニン塩基類の少なくとも１個が修飾塩基、好ましくはＰＰＧに置き換わった場合のものである。なおいっそう好ましくは、ＯＤＮ部分はＲＮＡ，キメラ体、ＰＮＡまたはロックされた核酸である。
【００７８】
さらにそれ以外の好ましいプローブ類または結合体類は、式Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩａおよびＩＩＩｂ、並びにＩＶの各々において、そのＯＤＮ部分がＡとＴとの塩基類を３０％またはそれ以上持つ標的配列に相補的なものから選択され、そのＯＤＮが少なくとも約３℃での二重鎖（プローブ／標的対合体）の安定性を増大させるのに充分な少なくとも１個の修飾塩基を含有する場合のものである。さらに好ましくは、そのＯＮＤ部分がＡとＴとの塩基類を５０％またはそれ以上持つ標的配列に相補的なものから選択され、そのＯＤＮが少なくとも約５℃での二重鎖（プローブ／標的対合体）の安定性を増大させるのに充分な修飾塩基類を含有する場合である。なおさらに好ましくは、ＯＤＮ部分がＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ体、ＰＮＡまたは固定化核酸である場合である。
【００７９】
本発明のプローブ類および結合体類は、当業者に知られた固相法類を用いて一般的には調製されるものである。その組立ては、５’側から３’側への方向、あるいは３’側から５’側への方向のいすれかで行なうことができ、たとえばＯＤＮモノマー類、フルオロフォア類、クエンチャ類および副溝バインダ類を結合させるのに適したホスホルアミダイト試薬類を用いて行なうことができる。別な組立て法類には、たとえばエステル結合類、アミド結合類、ジスルフィド結合類、エーテル結合類、チオエーテル結合類等を調製するためのよく知られた官能基縮合反応法が含まれる。一般的に出発物質類は市販されているものであるか、あるいはそれらから、たとえばＭａｒｃｈら、“ＡＤＶＡＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ−Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”， ４ｔｈ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， （１９９２）に記載の、適当な官能基操作類を用いるなどする、簡単な方法で調製することができるものである。
【００８０】
本発明のプローブ類／結合体類についてのさらに一般的な規定に立ち戻ると、以下の議論は、本明細書で用いることが可能なタイプのオリゴヌクレオチド類、クエンチング剤類またはクエンチャ類、副溝バインダ類、フルオロフォア類および連結基類を例示するものである。
【００８１】
（オリゴヌクレオチド類および修飾オリゴヌクレオチド類）
オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸という用語類は相互互換的に、修飾ヌクレオチド類または非天然に生じるヌクレオチド類を含有するポリマー類を含めた一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ（またはその両方）ポリマー類のことを指すのに用いられるか、あるいはそれらを含めたＤＮＡまたはＲＮＡと安定な塩基対を形成することが可能なそのほかのいずれものタイプのポリマー類のことを指すのにも用いられるが、それらに限定されることなく、さらにＮｉｅｌｓｅｎらがＳｃｉｅｎｃｅ ２５４： １４９７−１５００（１９９１）に発表したペプチド核酸類、ビシクロＤＮＡオリボマー類（Ｂｏｌｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：４６６０−４６６７（１９９６））およびそれらの関連構造体類も指す場合がある。本発明の結合体類の一つの実施形態では、ＭＢ部分とフルオロホアとはオリゴマーの５’末端で結合していて、クエンチング剤類は３’末端で結合している。
【００８２】
本発明において好ましいのは、一本鎖であって長さが１００ヌクレオチド類またはそれ以下、より好ましくは５０ヌクレオチド類またはそれ以下、さらになお好ましくは３０ヌクレオチド類またはそれ以下、最も好ましくは２０ヌクレオチド類またはそれ以下の長さであって下限が約５ヌクレオチド類の長さであるＤＮＡオリゴヌクレオチド類である。
【００８３】
フルオロフォア／クエンチャ含有のオリゴヌクレオチド結合体類と副溝バインダとを組合わせたものは、天然に生じる塩基類であるアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルに加えて、一種または複数の修飾塩基類も含む場合がある。修飾塩基類とは、１個または複数の官能基類の付加または欠失、複素環構造の違い（即ち複素原子による炭素原子の置換、またはその逆）および／または塩基への１個または複数のリンカーアーム構造体類の結合によって、天然に生じる塩基類とは異なる塩基類とみなされるものである。好ましい修飾ヌクレオチド類は、ピリミジン構造またはプリン構造をベースとするものであり、後者の場合さらに好ましくは７−デアザプリン類およびそれらの誘導体類、並びにピラゾロピリミジン類（国際公開第９０／１４３５３号に記載）であって、米国特許第６１２７１２１号に記載のものも挙げられる。ユニバーサルおよび非識別性の塩基類は、共同出願中の米国特許出願第６０／５０８７９２号（全面的に参照文献に編入）に記載されている。
【００８４】
本発明において用いるのに最も好ましい修飾塩基類には、グアニン類似体である６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ｐｐＧまたはＰＰＧ、Ｓｕｐｅｒ Ｇとも略される）、およびアデニン類似体である４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ｐｐＡまたはＰＰＡと略される）が含まれる。またキサンチン類似体である１Ｈ−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン（ｐｐＸ）も用いることができる。３−プロピ−１イニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、（ＮＨ_２）_２ＰＰＰＡ、も本発明で用いるのに好ましい別の修飾塩基として示される。これらの塩基類似体類は、オリゴヌクレオチド内に存在すると、対合反応を強化し、識別ミスマッチを改善するものである。天然に生じる塩基類、修飾塩基類および塩基類似体類の全ての互変異性型類は、本発明のオリゴヌクレオチド結合体類に含まれる場合があるものである。本発明において有用なそのほかの修飾塩基類には、６−アミノ−３−プロピ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＰＰＰＧ；６−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−５−ヒドロキシピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＨＯＰＰＰＧ；６−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＮＨ_２ＰＰＰＧ；４−アミノ−３−（プロピ−１−イニル）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＰＰＰＡ；４−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＨＯＰＰＰＡ；４−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ＮＨ_２ＰＰＰＡ；３−プロピ−１−イニルピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、（ＮＨ_２）_２ＰＰＰＡＯＨ；３−（２−アミノエチニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、（ＮＨ_２）_２ＰＰＰＡＮＨ_２；５−プロピ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、ＰＵ；５−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、ＨＯＰＵ；６−アミノ−５−プロピ−１−イニル−３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＰＣ；６−アミノ−５−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−アミノプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＨＯＰＣ；６−アミノ−５−（３−アミノプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、ＮＨ_２ＰＣ；５−［４−アミノ−３−（３−メトキシプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル］−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール、ＣＨ_３ＯＰＰＰＡ；６−アミノ−１−［４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３−（３−メトキシプロピ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、ＣＨ_３ＯＰＰＰＧ；４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブチ−３−イル−１−オール、Ｓｕｐｅｒ Ａ；６−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−ブチ−１−イニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン；５−（４−ヒドロキシ−ブチ−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、Ｓｕｐｅｒ Ｔ；３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ_２）_２ＰＰＡＩ）；３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ_２）_２ＰＰＡＢｒ）；３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン（（ＮＨ_２）_２ＰＰＡＣｌ）；３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＩ）；３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＢｒ）；および３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン（ＰＰＡＣｌ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記の修飾塩基にはユニバーサル塩基類も含まれる場合がある。ユニバーサル塩基については、いずれも参考文献に取り上げられているが、Ｌｏａｋｅｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２９： ２４３７−２４４７（２００１）； Ｗｕら、ＪＡＣＳ， ２２：７６２１−７６３２（２０００）およびＳｅｅｌａら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８：３２２４−３２３２（２００１）で公表されたものが含まれる場合がある。
【００８５】
別の好ましい一群の実施形態では修飾塩基類は、ブローブ内に直接、または式ＶおよびＶＩを有するホスホルアミド類のうちの１種を用いて間接的に導入して用いられる。
【００８６】
【化２０】

式中、Ａ^Ｘは、フルオロフォア類、クエンチャ類または副溝バインダ類を含めた基から選択されるリガンドである。Ｒ^ｊおよびＲ^ｋは各々独立して、Ｈ，ＮＨ_２および保護化アミノ基からなる群から選択され、Ｒ^ｎはＨ，ＦおよびＯＲ^ｍｌからなる群から選択される構成メンバーであって、そのＲ^ｍｌはＨ，（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキルおよびヒドロキシ保護性基とからなる群から選択される構成員である。またＲ^ｐはＨと（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキルからなる群から選択される構成メンバーであるか、あるいは所望によりＯ，ＳおよびＮからなる群から選択される１−３個の複素原子類を有する５−７員環を形成するようにＲ^ｎと結合しているものである。Ｒ^ｌはＯＨ、保護化ヒドロキシ基およびＯ−Ｐ^ｌからなる群から選択される構成員であって、そのＰ^ｌはホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネート基である。またＲ^ｍはＯＨ、保護化ヒドロキシ基およびＯ−Ｐ^２からなる群から選択される構成員であって、そのＰ^２はホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート、モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである。またＲ^０は、Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，ＳおよびＰから選択される主鎖原子数約２−３０のリンカーであって、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニルおよびアリール基類を単独または組合わせて含有することも可能なものである。
【００８７】
前記の修飾塩基類に付け加えて、本発明のオリゴヌクレオチド類は、全てのヌクレオチド間結合類が天然に生じるホスホジエステル結合類である糖主鎖すなわちグリコシド部分類、好ましくは２−デオキシリボフラノシド類を含むことができる。しかしながら代替の実施形態では、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース基類がほかの糖類、たとえばβ−Ｄ−リボフラノースに置き換わっている。さらにβ−Ｄ−リボフラノースは、そのリボース部分の２位のＯＨがＣ_１−６アルキル基またはＣ_２−６アルケニル基ででアルキル化された状態（２−（Ｏ−Ｃ_１−６アルキル）リボースまたは２−（Ｏ−Ｃ_２−６アルケニル）リボース）、あるいはフルオロ基に置き換わった状態（２−フルオロリボース）で存在する場合もある。本発明において有用な関連するオリゴマー形成性糖類には、「ロック化」したもの、即ち４’位のＣ、と２’位のＣにある酸素原子との間にメチレン架橋を持つものが挙げられる。オリゴヌクレオチドの対合に適合性のあるそのほかの糖部類については当業者に知られており、α−Ｄ−アラビノフラノシド類、α−２’−デオキシリボフラノシド類または２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシド類が挙げられるが、それらに限定されない。α−Ｄ−アラビノフラニシド類を含有するオリゴヌクレオチド類は、米国特許第５１７７１９６号の記載にあるような方法で調製することができる。２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシド類を含有するオリゴヌクレオチド類については、ＣｈｅｎらによってＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２３： ２６６１−２６６８ （１９９５）に記載されている。ロックされた核酸類に関する合成手順類（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ．， ４５５−４５６（１９９８）； Ｗｅｎｇｅｌ Ｊ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， ３２：３０１−３１０ （１９９８））および２’−ハロゲン化−２’−デオキシリボ−フラノシド類含有のオリゴヌクレオチド類に関する合成手順類（Ｐａｌｉｓｓａら、Ｚ． Ｃｈｅｍ．， ２７： ２１６（１９８７））も既に記載されているものである。本明細書に記載の修飾オリゴヌクレオチド類のリン酸エステル主鎖についても、ホスホロチオエート結合類および／またはメチルホスホネート類および／またはホスホロアミデート類を含有するオリゴヌクレオチド類のように修飾することができる（Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２３： ２６６２−２６６８（１９９５））。オリゴヌクレオチド結合類を組合わせたものも、本発明の企図するものである。さらに別の主鎖の修飾についても、当業者に知られている。
【００８８】
別の一群の実施形態では、本明細書に記載の修飾塩基類は、Ｔ_ｍ類のバランスをとり、識別ミスマッチが改善された修飾オリゴヌクレオチド類を提供するために、ＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラ体類内に取り込まれるものである。ＤＮＡおよびＤＮＡ類似体類の種々の修飾型類は、プローブ類およびプライマー類としてのＤＮＡ分子類の使用の際の不都合点のいくつかを克服する目的でこれまで用いられてきた。それらの中にペプチド核酸類（ＰＮＡ類、ポリアミド核酸類としても知られる）がある。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４： １４９７−１５００ （１９９１）。ＰＮＡ類は、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるような複素環塩基単位類を含み、それら塩基単位類はＤＮＡおよびＲＮＡで特徴的な糖−リン酸エステル主鎖のかわりにポリアミド主鎖によって連結している。ＰＮＡ類は相補的なＤＮＡおよびＲＮＡ標的配列類に対合することができ、対応する核酸プローブよりも実際には強くハイブリダイズするものである。ＰＮＡオリゴマー類およびそれらの合成に用いられる反応性モノマー類の合成については、米国特許第５５３９０８２号、第５７１４３３１号、第５７７３５７１号、第５７３６３３６号および第５７６６８５５号に既に記載されている。ＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラ体の合成およびＰＮＡ用モノマー類の合成への代替手順については、既に要約がある。Ｕｈｉｍａｎｎら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３７： ２７９６−２８２３ （１９９８）。したがってＤＮＡ、ＰＮＡまたはＤＮＡ／ＰＮＡキメラ体のＴ_ｍのバランスをとるために通常の塩基類、非置換ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類（たとえばＰＰＧおよびＰＰＡ）、３位置換ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン類、修飾プリン類、修飾ピリミジン類、５位に置換ピリミジン類、ユニバーサル／識別塩基類、糖修飾、主鎖修飾あるいは副溝バインダを、どのように組合わせて用いても、本発明の企図するものである。核酸、ＰＮＡおよびＰＮＡ／ＤＮＡキメラ体類の合成に要求される修飾塩基モノマー単位類の合成に必要な合成法類は、当業者が利用できるものであり、本明細書中の方法類およびＵｈｌｍａｎｎら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：２７９６−２８２３（１９９８）が参照される。
【００８９】
本明細書に記載の使用類に関しては、前記のようにオリゴヌクレオチド類および修飾オリゴヌクレオチド類が、５−１００個の塩基を持つものが好ましく、より好ましくは５−５０個の塩基、さらに好ましくは５−３０個の塩基、なお好ましくは５−２０個の塩基をもつものである。いくつかの実施形態では、プローブ類／結合体類のオリゴヌクレオチド部類は、５−１５個の塩基を持つことになろう。またいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド部類は６，７，８，９，１０，１１，１２，１３または１４個の塩基または修飾塩基類を持つことになろう。
【００９０】
熱力学的諸特性に基づき、修飾塩基類、副溝バインダ類、フルオロホア類および／またはクエンチャ類を直接用いるかまたは組合わせることを可能にするアルゴリズムを用い、予測どおりにプローブ類およびプライマー類が設計できることは、共同出願中の米国特許出願第１０／０３２３０７号、２００１年１２月２１日提出、で既に記載されている。したがって核酸、ＰＮＡまたはＤＮＡ／ＰＮＡキメラ体との対合生成物のＴ_ｍ値のバランスをとるため、通常の塩基類、非置換のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類（たとえばＰＰＧおよびＰＰＡ）、３位置換基化ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類修飾プリン類、修飾ピリミジン類、５位置換基化ピリミジン類、ユニバーサル／識別塩基類、糖修飾、主鎖修飾あるいは副溝バインダを、どのように組合わせて用いても、本発明の企図するものである。
【００９１】
（副溝バインダ類）
本発明のプローブ類／結合体類は、共有結合した副溝バインダ（ＭＢ）を持つことも可能であろう。種々の適当な副溝バインダ類については、既に文献に記載されている。たとえばＫｕｔｙａｖｉｎら、米国特許第５８０１１５５号； Ｗｅｍｍｅｒ， Ｄ．Ｅ．およびＤｅｒｖａｎ Ｐ． Ｂ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７： ３５５−３６１ （１９９７）； Ｗａｌｋｅｒ， Ｗ． Ｌ．，Ｋｏｐｋａ， Ｊ． Ｌ．およびＧｏｏｄｓｅｌｌ， Ｄ． Ｓ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ４４：３２３−３３４ （１９９７）； Ｚｉｍｍｅｒ， Ｃ ＆ Ｗａｈｎｅｒｔ， Ｕ．Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏ． ４７： ３１−１１２ （１９８６）、並びにＢ． Ｓ． Ｐ．， Ｄｏｎｄｈｉ， Ｓ． Ｍ．，およびＬｏｗｎ， Ｊ． Ｗ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐ．， ８４： １−１１１ （１９９９）を参照のこと。
【００９２】
リンカー類を介してオリゴヌクレオチド類に副溝バインダ類（以下に述べるフルオロホア類およびクエンチャ類のようなレポータ群類も同じく）を結合させる適当な方法類は、たとえば米国特許第ＲＥ３８４１６号、第５５１２６７７号、第５４１９９６６号、第５６９６２５１号、第５５８５４８１号、第５９４２６１０号および第５７３６６２６号に記載されている。
【００９３】
ＭＢは一般には内部塩基に結合しているか（米国特許第ＲＥ３８４１６号および第６０８４１０２号］、あるいは適当な連結基を介してオリゴヌクレオチド部分の５’末端または３’末端に結合している。５’末端での結合には、対合物が安定であるという利点ばかりでなく、増幅反応類中のヌクレアーゼによるプローブの分解を抑制するという利点も存在する。
【００９４】
ＭＢ−オリゴヌクレオチド結合体内のＭＢの配置は、その結合体の識別特性類にも影響する可能性がある。二重鎖内の対にならない領域は、誤った対を形成した塩基（類）の近位で副溝の形態に変化をもたらすであろう。ＭＢは完全にマッチしたＤＮＡ二重鎖の副溝内に最もうまく嵌るので、副溝内の形状の変化をもたらす不正対合類は、ＭＢの不正対合含有領域への結合強度を減少させることになろう。それゆえその対合物に対するＭＢの安定化能が低下することで、ＭＢの、完全にマッチした二重鎖からの不正対合識別能が上がるであろう。他方で、ＭＢ−オリゴヌクレオチド結合体に相補的な領域の外側で不正対合が存在する場合は、長さが同じ非結合体化オリゴヌクレオチドおよびＭＢ−結合体化オリゴヌクレオチドの識別能については、ほとんど同じと予想される。オリゴヌクレオチドプローブの一塩基対不正対合類識別能は、その長さに依存するため、不正対合類を識別するには長さが短いオリゴヌクレオチド類の方がより有効である。これに関連してＭＢ−オリゴヌクレオチド結合体類を使用することの一義的な利点は、従来法で用いられるオリゴヌクレオチド類（即ち２０員またはそれ以下）と比較してさらに短く、識別力類がより強いオリゴヌクレオチド類を用いることが可能である事実にあり、それはＭＢと結合体することの著しい安定化効果によるものである。
【００９５】
一群の実施形態では、ＭＢはＣＣ１０６５、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］デンゾジアゼピン類似体類からなる群から選択される。
【００９６】
さらに好ましい副溝バインダ類としては、以下の式類のものから選択される。
【００９７】
【化２１】

式中、下付きのｍは２−５の整数、下付きのｒは２−１０の整数であって、Ｒ^ａおよびＲ^ｂは各々独立して、オリゴヌクレオチドに（直接またはフルオロフォアを介して間接的に）連結する基、Ｈ，−ＯＲ^ｃ、−ＮＲ^ｃＲ^ｄ，−ＣＯＯＲ^ｃまたは−ＣＯＮＲ^ｃＲ^ｄであって、そのＲ^ｃおよびＲ^ｄは各々、Ｈ，（Ｃ_１−Ｃ_１２）ヘテロアルキル、（Ｃ_２−Ｃ_１２）ヘテロアルケニル、（Ｃ_２−Ｃ_１２）ヘテロアルキニル、（Ｃ_１−Ｃ_１２）アルキル、（Ｃ_２−Ｃ_１２）アルケニル、（Ｃ_２−Ｃ_１２）アルキニル、アリール（Ｃ_１−Ｃ_１２）アルキルおよびアリールから選択される。但し、Ｒ^ａおよびＲ^ｂのうち一方は、ＯＤＮまたはＦｌに連結する基を表す。環部類の各々には、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキル、ＯＲ^ｇ、Ｎ（Ｒ^ｇ）_２、Ｎ^＋（Ｒ^ｇ）_３、ＳＲ^ｇ、ＣＯＲ^ｇ、ＣＯ_２Ｒ^ｇ、ＣＯＮ（Ｒ^ｇ）_２、（ＣＨ_２）_０−６ＳＯ_３⁻、（ＣＨ_２）_０−６ＣＯ_２⁻、（ＣＨ_２）_０−６ＯＰＯ_３^−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_０−６ＣＯ_２⁻、並びにそれらのエステル類および塩類から選択される１個または複数の置換基類が置換することも可能であって、そのＲ^ｇは各々独立して、Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキルである。
【００９８】
特に好ましくは副溝バインダ類には、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキサミド（ＣＤＰＩ_３）のトリマー、Ｎ−メチルピロール−４−カルボキシ−２−アミド（ＭＰＣ_５）のペンタマー、および不正対合識別性が増大するそれ以外の副溝バインダ類が含まれる。本発明の実施において有用性が見出されるであろうそのほかのＭＢ部類については、特許権共同所有の米国特許第５８０１１５５号および米国特許第６７２７３５６号に開示されている。ある実施形態では、ＭＢ類は、結合した水溶性増大性基類（たとえば糖類、アミノ酸類、カルボン酸置換基類、またはスルホン酸置換基類等）を持つことも可能である。共同出願中の米国特許出願第１０／５０７２６７号（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７４６７に基づく）を参照のこと。
【００９９】
（クエンチャ類）
近年開発された検出方法類には、プローブ対合を検出するための蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法の方が、蛍光強度直接検出法よりもむしろ繁用されている。このタイプのアッセイ、すなわちＦＲＥＴとは、クエンチャ分子の吸収スペクトルがドナー側であるフルオロフォアの発光スペクトルと重なり、その二つの分子が接近した位置にある際に、ドナーフルオロフォア（レポータ）とアクセプタ分子（クエンチャ）との間に生じるものである。ドナーフルオロホアの励起状態のエネルギーは、共鳴双極子で誘導された双極子相互作用によって隣接するアクセプタに転移される。そのアクセプタ分子がフルオロホアである場合では、その蛍光は時には増大する場合がある。ドナー分子とアクセプタ分子との間のエネルギー転移効率は、それらの分子間の距離に大きく依存する。この関係を記述する方程式類は既知である。フォースタ距離（Ｒ_０）とは、エネルギー転移効率が５０％である場合のドナー分子とアクセプタ分子との間の距離として記述されるものである。衝突・荷電転移クエンチングのような、蛍光クエンチングの別のメカニズム類も知られている。クエンチャとフルオロホアとの組合わせ類、およびそれらのオリゴヌクレオチド類への結合の選択に関する本技術領域の広範な指標（Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ．Ｐ．，“ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ”， ６ｔｈ．Ｅｄ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６； 米国特許第３９９６３４５号および第４３５１７６０号 等）が存在する。好ましいクエンチャ類には、本明細書に参考文書として取り上げられている、特許権共同所有の米国特許第６７２７３５６号に記載されているものがある。さらに特に、刊行物類（たとえばＴｈｉｅｌら、Ｊ． ｆｕｒ ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍｉｅ，３２８： ４９７−５１４ （１９８６）； 米国特許第４３２４７２１号および第４０５４５６０号； Ｔｉｍｍ， Ｍｅｌｌｉａｎｄ Ｔｅｘｔｉｌｂｅｒｉｃｈｔｅ，９： １０９０−１０９６ （１９６９）； Ｈａｌｌａｓ， Ｊ．Ｓ．Ｄ．Ｃ． ２８５−２９４（１９７９）； Ｂｅｙｅｒら、Ｊ． Ｐｒａｋｔ． Ｃｈｅｍ． ２４： １００−１０４（１９６４）； Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓら、Ｃｈｅｍ． Ｅｕｒｏｐ． Ｊ． ３： １７１９−１７２７ （１９９７）並びにＭｏｒｌｅｙら、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ａ．， １０２： ５８０２−５８０８（１９９８）； Ｈａａｋら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｍｉｎｉｐｒｉｎｔ １０： ２７０１−２７３５（１９９８）およびＲｕｇｇｌｉら、Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， ２６： ８１４−８２６ （１９４３）を参照）から引用される既知の化学反応類に基づき、プローブ類内に導入するための適当な官能基類を持つ構造体類へ容易に修飾することができるクエンチャ類の構造類類が、以下の表１に挙げられる。種々の位置で置換基類の異なる組合わせ類を有する追加構造体類（モノアゾ色素類およびビスアゾ色素類）も表１の化合物類、および色素化学領域で既知の方法類（ｔｈｅ Ｃｏｌｏｒ Ｉｎｄｅｘ， Ｉｓｓｕｅ３ ｏｎ ＣＤＤ ＲＯＭ， ｐｐ． ４００９−４３２４； Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｙｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｉｓｔｓ， Ｂｒａｄｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｄｃ．ｏｒｇ．ｕｋに要約があり、並びに本明細書に参考文書として取り上げられている国際公開第０１／８６００１号および米国特許第６７９０９４５号も参照）に基づき調製することができる。
【０１００】
【表１−１】

【０１０１】
【表１−２】

前述のクエンチャ類は、約４００−８００ｎｍの波長領域をカバーするもので、それらの多くはＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ結合体に結合した時に、改善されたクエンチングを示す。またそれらを改変した考えものには、オリゴヌクレオチド類または固体支持体にクエンチャを結合させるのに用いるのに好ましい連結基として−ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ）で表されるものがあるが、別の適したリンカー類の例も当業者に知られているか、または本明細書で提供されるものであり、あるいは表１中のようなクエンチャ誘導体類からさらに調製可能なものである。
【０１０２】
本明細書において本発明の企図する各々に好適なクエンチャ類は、前記表中のものから選択されるが、並びにビスアゾクエンチャ類（米国特許第６７９０９４５号）およびＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．から提供される色素類（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ^ＴＭクエンチャ類：ＢＨ−１、ＢＨ−２およびＢＨ−３として）、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡおよびカルボキシテトラメチルローダミンからも選択される。
【０１０３】
（フルオロフォア類）
本発明において有用なフルオロホア類は、三官能性リンカーＷ（式ＩＩ中）に結合させるために誘導化済みの一般的な有機蛍光色素類である。当業者の一部には、それ自体が典型的には有機色素でもあり、蛍光性である場合またはそうでない場合のクエンチャとの組合せて、適したフルオロフォア類が選択されることが分かるであろう。
【０１０４】
特別なプローブ類に適したフルオロフォア−クエンチャ対類を選択するための、文献中で利用できる多くの実際上の指標となるものが存在する。たとえばＣｌｅｇｇの論文（前述）； Ｗｕらの論文（前述）； Ｐｅｓｃｅらが編集した“ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ”（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７１）； Ｗｈｉｔｅらの“ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ”（Ｍａｒｃｅｒ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７０）等を参照のこと。文献には、蛍光性および色素原性（クエンチング）分子類の網羅的なリスト類、並びにそれらのフルオロフォア−クエンチャ対類選択に関連性がある光学特性類を提供する参照文献類、たとえばＢｅｒｌｍａｎｎの“ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ”、２ｎｄ． Ｅｄ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，“ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）； Ｂｉｓｈｏｐ編集のＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７５）； Ｈａｕｇｌａｎｄの“ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ”（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、１９９２）； Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍの“ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ”（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９４９）など、も含まれる。さらに加えて、一般的な反応性基類を介して共有結合させるための、フルオロフォア類およびクエンチャ類の誘導化法類もよく知られている。たとえばＨａｕｇｌａｎｄの著書（前述）； Ｕｌｌｍａｎらの米国特許第３９９６３４５号； Ｋｈａｎｎａらの米国特許第４３５１７６０号等を参照のこと。
【０１０５】
好ましいフルオロホア類には、キサンチン色素類をベースとするものがあり、直接またはリンカー基を介してオリゴヌクレオチドに結合させるのに役立つ置換基類を持つ、多様なものが市販されている。別のグループの蛍光性化合物類には、α位またはβ位にアミノ基を持つナフチルアミン類がある。そのようなナフチルアミノ化合物類の中には、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネ−トが含まれる。別の色素類には、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジのようなアクリジン類、Ｎ−（ｐ−（２−ベンズオキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンズオキサジアゾール類、スチルベン類、ピレン類等が含まれる。さらに別の適するホスホロホア類には、レゾルフィン色素類、ローダミン色素類、シアニン色素類およびＢＯＤＩＰＹ色素類が含まれる。
【０１０６】
これらの色素類、およびオリゴヌクレオチド類に結合させるのに適した連結方法論類については、多くの参照文献類、たとえばＫｈａｎｎａらの特許（前述）； ＭａｒｓｈａｌｌのＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．，７： ２９９−３０３（１９７５）； Ｍｅｎｃｈｅｎらの米国特許第５１８８９３４号； Ｍｅｎｃｈｅｎらの欧州特許出願第８７３１０２５６．０号；およびＢｅｒｇｏｔらの国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５、に記載されている。
【０１０７】
さらに特別には、本明細書に記載のフルオロフォア類は、たとえば化学法または酵素法を用いてオリゴヌクレオチド部分類に結合させることができる。例としては、反応性の化学基類を特異的な部位でオリゴヌクレオチド類内に組込む方法類が、当業者によく知られている。特異的な部位に配置された反応性化学基を含有するオリゴヌクレオチド類は、標識の結合に補完的な反応性基に結合した標識と共に、化学的技法類によってプローブに化合させることができる（たとえば求核性の反応性基を含有するオリゴヌクレオチドは、求電子性の反応性基に結合した標識と反応することが可能である）。標識類およびオリゴヌクレオチドに標識を結合させる方法類の例については、たとえば米国特許第５８２４７９６号、米国特許第５２１００１５号、Ｋｅｓｓｌｅｒ（編）の“Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９２； Ｋｒｉｃｋａ（編）の“Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９２； Ｈｏｗａｒｄ（編）の“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，１９９３、に記載されている。オリゴヌクレオチドを非特異的に化学標識化するには、たとえばヌクレオチド塩基の特別な官能基と反応する化学物質にオリゴヌクレオチドを化合させ、同時にまたは引続いてそのオリゴヌクレオチドを標識と反応させて行なうことができる。たとえばＤｒａｐｅｒら、（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９： １７７４−１７８１を参照のこと。オリゴヌクレオチド内に標識を酵素によって組込むには、標識化前駆体類を用いてオリゴヌクレオチドを酵素で修飾するかまたは重合させるか、あるいは既存のオリゴヌクレオチドに酵素で標識を付加して行なうことができる。たとえば米国特許第５４４９７６７号を参照のこと。修飾用の酵素類の例としては、ＤＮＡポリメラーゼ類、逆転写酵素類、ＲＮＡポリメラーゼ類等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。既存のオリゴヌクレオチドに標識を付加させることが可能な酵素類の例としては、キナーゼ類、末端転移酵素類、リガーゼ類、グリコシラーゼ類等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１０８】
本発明の各観点に対して好ましいフルオロホア類は、Ｃｙ色素類、ＢＯＤＩＰＹ類似体類、５−ＦＡＭ^ＴＭ、６−ＦＡＭ^ＴＭ、ＴＥＴ^ＴＭ、ＪＯＥ^ＴＭ、ＨＥＸ^ＴＭ、ＶＩＣ^ＴＭ、ＮＥＤ^ＴＭ、ＴＡＭＲＡ^ＴＭ、ＲＯＸ^ＴＭ、Ｂｏｔｈｅｌｌ Ｂｌｕｅ^ＴＭおよびＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ^ＴＭ（ＹＹ）から選択される。これらのフルオロホア類は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡおよびＥｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから一般に入手することができるものである。
【０１０９】
（連結基）
オリゴヌクレオチド類の５’末端または３’末端に、フルオロフォア類、クエンチャ類および副溝バインダ類を結合させるための種々の連結基類およびその連結法類は、当業者に知られている。たとえばＥｃｋｓｔｅｉｎ著の“ＯＬＩＧＯＮＵＫＵＲＥＯＴＩＤＥ ＡＮＤ ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ”（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３０５−５３２１（１９８７）； Ｓｈａｒｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：３０１９［１９９１］； Ｇｉｕｓｉら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２：２２３−２２７（１９９３）； Ｆｕｎｇら、米国特許第４７５７１４１号； Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，米国特許第４７３９０４４号； Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３１：１５４３−１５４６（１９９０）； Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８３７（１９８７）； Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１７：７１８７−７１９４（１９８９）等を参照のこと。さらにそのほかにも、合成の際にオリゴヌクレオチドに結合可能な市販の連結基類、たとえばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから市販されているもの、も使用することができる。オリゴヌクレオチド部分にフルオロホアを結合させる別の方法論類には、ホスホルアミダイト部分で誘導化された色素類を用いて固相合成を終了させるホスホルアミダイト化学の使用が含まれる。たとえばＷｏｏら、米国特許第５２３１１９１号； Ｈｏｂｂｓ，Ｊｒ．，米国特許第４９９７９２８号； Ｒｅｅｄら、国際公開第０１／４２５０５号；米国特許第６６５３４７３号および米国特許出願第１０／０２６３７４号を参照のこと。
【０１１０】
多くの一般的な方法類を用いることができるが、オリゴヌクレオチドの長さ、副溝バインダ類、フルオロフォア−クエンチャ対類等のような別の因子類と組合わせてある連結基類を選択する場合には、その選択は本発明の考えを構成するものになる。
【０１１１】
本発明のプローブ類および結合体類は、一般には一つまたは二つのタイプの連結基を持つであろう。式１の場合では、文字Ｋは二価の連結基を表し、一方、Ｗは三価の連結基を表す。特別な連結基類としては、それらの合成のしやすさ、固相合成における有用性、プローブの構築および使用の際の安定性をもって一般に選択され、その物理学的パラメータ類の各々は、そのフルオロフォアとクエンチャとの間に適切な間隔を空けるような、あるいはプローブが対合する際に形成される副溝に副溝バインダが非共有的に相互作用できるような適当な長さの連結鎖を提供するようなプローブまたは結合体に与えられるものである。
【０１１２】
より特別には、Ｋはそのプローブ／結合体部分のクエンチャとオリゴヌクレオチドとの間の直接結合であるか、あるいはＣ，Ｏ，Ｎ，Ｓ，ＰおよびＳｉから選択される１−３０個の主鎖原子を有する二価の連結基である。Ｋの好ましい構造は、以下の式で表されるものがある。
【０１１３】
【化２２】

この式中、Ｑは前述に挙げた意味を持つクエンチャ部分を表わし、波線はプローブまたは結合体の残余部分との結合点を示す。
【０１１４】
三価の連結基Ｗには、ＯＤＮ、ＦｌおよびＭＢの間に適した結合と柔軟性とを提供するための種々の構造類が含まれ得る。ある群の実施形態では、Ｗは以下の式を有する三価の官能基である。
【０１１５】
【化２３】

式中、ＺはＣ，Ｎ，Ｓ，Ｐ，ＳｉおよびＯから選択される１−１０個の脂肪族または環状の部分、あるいはアリールであり、Ａ^０、Ａ^１およびＡ^２の構成成分類は各々独立して、単結合、あるいはＣ，Ｎ，Ｓ，Ｐ，ＳｉおよびＯから選択される１−５０個の原子類を有する連結／スペーサ部分であって、可能な原子価を満たすための付加水素原子類を持つものから選択される。さらにＡ^０、Ａ^１およびＡ^２の各々は、環状の構成成分類、非環状の（線状または分岐状の）アルキル構成成分類（不飽和アルキル成分類を含めた）、アリール構成成分類またはそれらの組合せを持つことも可能である。
【０１１６】
（好ましい色素リンカー類）
【０１１７】
【化２４】

式中のＡ^０、Ａ^１およびＡ^２の各々は、前述に規定されたものであって、標識は一般にはクエンチャのことであり、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、プローブまたはコンジュケートの残余部分への結合サイト類のことである。たとえばＲ^ｘとＲ^ｙとは、プローブ結合体のＭＢ部分類およびＯＤＮ（または［Ａ−Ｂ］_ｎ）部類でありえる。しかしながら、本発明は、本明細書に記載のプローブ類／結合体類を調製するのに有用な試薬類にも向けられるものである。したがって、本発明のいくつかの観点において、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙの各々は独立して、Ｈ，ホスホルアミダイト、ＰＥＰエステル、ＮＨＳエステル、固体支持体、およびオリゴヌクレオチド合成に影響を及ぼさない保護基でブロックされた１個の原子から選択されるものである。ある当業者には、前述の式（Ｗに関する）中の環部類の各々がＨ，ハロゲン、（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキル、ＯＲ^ｇ、Ｎ（Ｒ^ｇ）_２、Ｎ^＋（Ｒ^ｇ）_３、ＳＲ^ｇ、ＣＯＲ^ｇ、ＣＯ_２Ｒ^ｇ，ＣＯＮ（Ｒ^ｇ）_２、（ＣＨ_２）_０−６ＳＯ_３⁻、（ＣＨ_２）_０−６ＣＯ_２⁻、（ＣＨ_２）_０−６ＯＰＯ_３^−２およびＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ_２）_０−６ＣＯ_２⁻、並びにそれらのエステル類および塩類から選択される１個または複数の置換基類で置換され得ることがわかるであろう。尚、式中の各々のＲ^ｇは独立して、Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_８）アルキルである。
【０１１８】
構造式Ｉ中で副溝バインダとＯＤＮとに接続する複数価のＷリンカーは、さらに以下のような連結基を持つ場合もある。
【０１１９】
【化２５】

式中の下付きのｒは、０−５の整数、好ましくは１、最も好適には２であり、Ｒはアルキル、好ましくはメチルである。
【０１２０】
（合成中間体類およびオリゴヌクレオチド結合体の調製）
反応スキーム類１−８には、ＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ結合体類の製法類、および本発明において有用な多くの合成中間体類の製法類が図説されている。それらスキーム類には、固相支持体、並びにその際に使用可能な連結性ホスホルアミダイト誘導体類の調製について説明されており、たとえばそれらは本発明のプローブ類を調製するための自動合成装置で有用なものである。
【０１２１】
【化２６】

反応スキーム１は、既知の方法類で合成されたＮＨ_２−Ｗ（−Ｆｌ）−ＯＤＮ−Ｋ−Ｑ１を出発物質とするＭＢ−Ｗ（−Ｆｌ）−ＯＤＮ−Ｋ−Ｑ ２結合体調製への合成後のアプローチを説明するものである。修飾化オリゴヌクレオチド（２）を得るために、結合体１中のＷ上のアミノ基を、文献（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．，６：４１８−４２６ （１９９５））に記載されたような方法によってＣＤＰＩ_３の活性化エステルで誘導化した。フルオロフォアとしてはフルオレセイン、クエンチャとしてはＥｃｌｉｐｓｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ製）とした。この特別な例では、ＭＢリガンドとフルオロホアとをＤＮＡプローブの５’末端に配置し、クエンチャを３’末端に配置するようにした。またアミノ基を末端に持つプローブ前駆物質を合成するために５’−ホスホルアミダイト類を用いることで逆の操作も可能である。
【０１２２】
図６は、市販のオリゴヌクレオチド合成装置上で、本発明のプローブ類（結合体類）の組立てを自動化するアプローチを説明するものである。このスキームは、反応スキーム１の場合と同一の、ＭＢリガンド、フルオロホアおよびクエンチャに関する配向性とリンカー構造類とを有するプローブ類について説明を与えるものである。このアプローチでは、ＭＢリガンドは開裂性リンカーを介して固体支持体（Ｓ）に結合する。ＭＢはそのＭＢ部分の遠位末端に、末端にジヒドロキシ基を有する第二リンカーを持つことも可能であり、その２個のヒドロキシ基類のうちの一方はＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）で保護されており、もう一方は遊離状態またはＤＭＴｒ基を脱保護化せずに取り除くことが可能な基（Ｒ）で保護されているものである。この支持体を用いると、フルオロホアはフルオロフォア・ホスホルアミダイト試薬の使用で最初に遊離の（またはＤＭＴｒ保護化以外の）ヒドロキシ基で合体する。通常のオリゴヌクレオチド合成の第二段階では、市販のホスホルアミダイト塩基類を用い、既知のクエンチャ・ホスホルアミダイト試薬類でクエンチャ部分を最後に合体させる。最終の第三段階では、完全に組立てられたプローブ類を脱保護化し、標準的、またはそのために調整された脱保護条件下で固体支持体から開裂させる。
【０１２３】
反応スキーム２および３は、図６での説明のようにＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑコンジゲート類の合成において用いられる開裂性リンカーでＭＢ固体支持体を調製する一つの方法を提供するものである。さらに特別には、この二つのスキームは、ブロックされたジヒドロキシ連結基含有のＭＢ試薬が連結反応する開裂性リンカー（反応スキーム２）を用いる固体支持体の合成を説明するものである。さらに特別には、それらのスキーム類は、自動オリゴヌクレオチド合成装置上での合成に要求される所望のＭＢ固体支持体１４の調製を説明するものである。
【０１２４】
（反応スキーム２）の第一部分において、ペンタフルオロフェニルで活性化した固体支持体７は、コハク酸モノベンジルを出発物質として合成された。中間体３は、４−クロロ酪酸ｔ−ブチル（４−クロロブリリル・クロリドとｔ−ブタノールとから調製される）との反応によってコハク酸モノベンジルから合成された（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．，６６：４１１５−４１２１（２００１））。そのベンジル基は触媒による水素化によって取り除かれ、次に遊離カルボキシル基はトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ−ＴＦＡ）と反応してＰＥＰエステル４を提供した。このＰＦＰエステルを用い、アミノ基で修飾された固体支持体を、ｔ−ブチル基で保護された支持体５に変換された。最後に末端のカルボキシル基が脱保護されて固体支持体６が提供され、そのカルボキシル基はＰＦＰエステルに変換され、ＰＦＰで活性化した支持体７が得られた。
【０１２５】
【化２７】

第二部分（反応スキーム３）では、自動化されたオリゴヌクレオチド合成に要求されるＭＢ固体支持体１４は、ｔ−Ｂｏｃで保護されたＤＰＩモノマー誘導体を出発物質として合成された。Ｆｍｏｃで保護されたＤＰＩモノマー誘導体９は、ＤＰＩ誘導体８からトリフルオロ酢酸を用いてそのＢｏｃ保護基を除去し、次に９−フルオロニルメトキシカルボニル・クロリド（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）と反応させて調製した。さらにその物質はＰＥＰ−ＴＦＡと、さらにＤＭＴｒで保護された２−（５−アミノペンチル）プロパン−１，３−ジオールと連続して反応してＦｍｏｃ−ＤＰＩＰＥＰ−エステル１０およびジオール連結化ＤＰＩ誘導体１１が得られた。１１のＦｍｏｃ基は除去され、第二のＦｍｏｃ−ＤＰＩＰＥＰ−エステルと連結してＦｍｏｃ−ＤＰＩ_２中間体が得られた。さらにもう一方の脱保護化および連結によってＦｍｏｃで保護されたＭＧＢリガンド（ジヒドロシクロピロロインドール・トリアミドＤＰＩ_３１２；尚、ＭＧＢはＥｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの商標である）が提供された。１２のＦｍｏｃを除去することでアミン含有ＤＰＩ_３リガンド１３が得られた。固体支持体７とＤＰＩ_３−中間体１３とを反応させて開裂性リンカーを有するＤＰＩ_３固体支持体１４が製造された。その固体支持体１４は、種々のＦｌとＱとの組合わせを有するＭＧＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ結合体類を合成するのに用いられた。ある好ましい組合わせのものは、フルオロフォアとしてのフルオレセインとＥｃｌｉｐｓｅ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから購入）とを用いて合成された。
【０１２６】
【化２８】

図７は、合成装置上でＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ結合体類を組立てるのに特に好ましい経路をスキームを用いて示すものである。このアプローチでは、ＭＢリガンドは、開裂性リンカーを介して固体支持体（Ｓ）に結合する。そのＭＢもＭＢ部分の遠位末端で第二リンカー内に末端を持つものであり、その中のヒドロキシ基はＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）で保護されている。第一段階では、この脱ブロック化支持体を用い、ＤＭＴｒで保護されたヒドロキシ基を含む三官能性フルオロホア・フォスフォルアミダイトが結合する。第二段階では、市販のフォスフォルアミダイト塩基類を用い、既知のクエンチャ・ホスホルアミダイト試薬類を使用してクエンチャ部分を最終的に合体させることを伴う通常のオリゴヌクレオチド合成が行なわれる。最後に第三段階で、完全に組立てられたプローブ類を脱保護し、標準的またはこのために調整された脱保護条件を用いて固体支持体から開裂させる。
【０１２７】
反応スキーム４および５は、図７で説明されるようなＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑの合成で用いられ、開裂性リンカーを持つＭＢ固体支持体の好ましい製法を提示するものである。さらに特別には、これらのスキーム類は、自動オリゴヌクレオチド合成装置上で合成するのに有用な、ヒドロキシ基がブロックされた連結基２０を含む含むＭＢ試薬と反応する、開裂性リンカー（反応スキーム４）を有する固体支持体の合成を説明するものである。
【０１２８】
最初の部分（反応スキーム）では、ＤＭＴでブロックされた固体支持体２０は、ＤＰＩ部分８のメチルエステルを出発物質として合成された。中間体１５は、８のメチルエステルを６−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキサノイル−４−ニトロフェニルエステルと反応させてＤＰＩ部分のＮ−末端でＤＭＴ−ヒドロキシヘキサン酸リンカーを導入することによって合成された。そのメチルエステル１５をけん化し、ＰＥＰ−ＴＦＡと反応させてＤＭＴｒ−ヒドロキシヘキサノイル−ＤＰＩＰＥＰエステル１６が提供され、それはさらにＤＰＩ_２ニトロフェニルエチルエステル１７と反応（米国特許出願公開２００２／００３４７５４号参照）してＤＭＴｒ−ヒドロキシヘキサノイル−ＤＰＩ_３ＮＰＥエステル１８が得られる。そのＮＰＥ基は、１，８−ジアゾビシクル［５．４．０］ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）を用いて除去され、遊離のカルボキシ基はＰＥＰ−ＴＦＡで活性化され、それによって適当なアミノ修飾化固体支持体に連結するのに適したＤＭＴｒヒドロキシヘキサノイル−ＤＰＩ_３ＰＥＰエステル１９が生成し、ＤＭＴ−ヒドロキシヘキサノリル−ＤＰＩ_３固体支持体２０が得られる。アミノ修飾化固体支持体のこの特別な例では、ＭＭＴ−アミノペンチルジグリコラート固体支持体２２が、そのＭＭＴ基の脱保護化後に用いられた。ある当業者には、オリゴヌクレオチド類合成の技術分野で用いられるいずれの固体支持体、たとえば孔径が制御されたガラス、ポリスチレン、ナイロンなど、も本質的に使用可能可能なことがわかるであろう。
【０１２９】
【化２９】

第二の部分（反応スキーム５）では、ＭＭＴ−アミノペンチルジグリコラート支持体２２（反応スキーム４中で２０を調製するのに用いられた）は、５−アミノペンタノールを出発物質として調製された。５−アミノペンタノールは、塩化モノメトキシトリチル（ＭＭＴ−Ｃｌ）と反応して保護化されてＭＭＴ−アミノペンタノールとなり、次に無水ジグリコール酸と反応してＭＭＴ−アミノペンチルジグリコラート２１が得られた。この合成中間体は、アミド結合形成に適したカップリング試薬類の存在下で、アミン含有固体支持体（アミノメチルポリスチレンまたは長鎖アミノアルキルＣＰＧ（孔径制御ガラス）のような）と連結反応し、要求されるＭＭＴ−アミノペンチルジグリコラート支持体２２が得られた。そのＭＭＴ基を、ジクロロメタンに溶解したトリクロロ酢酸溶液で処理して除去後、反応スキーム４中、ＭＢ−ＰＥＰエステル１９と反応させた。
【０１３０】
【化３０】

反応スキーム６は、蛍光原性ホスホルアミダイト３１の合成法を説明するものである。５−ヒドロキシ−イソフタル酸ジメチルエステルとヘキサエチレングリコールとは、アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）とトリフェニルホスフィンとの存在下で結合体を形成してヒドロキシ中間体２３となった。２３を塩化トシルと反応させてトシルエステル２４が得られ、アジ化ナトリウムと反応させてアジ化物誘導体２５が得られた。ＬｉＡｌＨ_４で還元することでエステル類のヒドロキシメチル基類への還元と、アジ化物の第一級アミンへの還元とが同時に行なわれ、アミノジオール２６が得られた。２６のアミノ基は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル・クロリド（ＦｍｏｃＣｌ）と反応してブロック化されて２７が得られ、次にそのヒドロキシル基類のうちの１個をＤＭＴＣｌでブロックして２８が得られた。Ｆｍｏｃ基の脱ブロック化後に２９中の遊離アミノ基を、ＰＥＰ−ジピバロイルフルオレセイン−６−カルボキシレートと反応（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９７）１６（１＆２），１０７−１１４）させて３０が得られた。最終段階でヒドロキシ前駆物質３０は、ホスホルアミダイト３１に変換された。
【０１３１】
【化３１】

反応スキーム７は、好ましい蛍光原性ホスホルアミダイト４１の合成について説明するものである。第一段階では、４−ヒドロキシ安息香酸メチルが、アゾジカルボン酸ジエチルとトリフェニルホスフィンとの存在下でヘキサエチレングリコールと反応してヒドロキシ中間体３２が得られた。次に塩化トシルと反応してトシルエステル３３が得られた。そのトシルエステルはアジ化ナトリウムと反応してアジ化物３４に変換した。次に触媒による還元（Ｈ_２／１０％Ｐｄ−Ｃ）によってアミン３５が生成した。その化合物３５は水酸化ナトリウムで処理され、エステル基がけん化した。続いてＦｍｏｃクロリドで処理されて酸３６が得られた。酸３６は、ＰＥＰ−ＴＦＡと反応してＰＥＰエステル３７に変換した。次にそのエステルは、ＤＭＴ−ヒドロキシプロリノール３８と反応してＦｍｏｃ中間体３９が得られた。３９のアミノ基は、ＤＢＵで処理されて遊離体となり、次にペンタフルオロフェニルジピバロイルフルオレセイン−６−カルボキシレートと反応してヒドロキシ誘導体４０が得られた。４０のホスホルアミダイト４１への変換は、ホスホルアミダイト部分の標準的な導入法に従って行なわれた。
【０１３２】
【化３２】

反応スキーム８は、固体支持体２０、フルオレセインホスホルアミダイト４１およびＥｃｌｉｐｓｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒホスホルアミダイト４２（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｉｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから購入）を用いる、特に好ましいＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ結合体４３の段階的な組立てについて説明するものである。
【０１３３】
【化３３】

本発明のさらに別の観点では、前述のプローブ類を組立てるには、誘導化固体支持体類、クエンチャ類、フルオロフォア類および副溝バインダ類が用いられる。とりわけ、連結基類（保護化または非保護化状態）が結合した化合物であって、溶液相または固相での組立てに用いられる、典型的にはホスホルアミダイトのような、誘導体類を提供するもの（たとえば米国特許第６７９０９４５号、米国特許第６０８４１０２号、国際公開第０３／０２３３５７号および国際公開第０１／６４９５８号）が特に好ましい。
【０１３４】
（使用方法）
関連するある態様によれば、本発明はポリヌクレオチドの増幅を連続的にモニタリングする方法類を提供するものであって、以下の内容を含む。
【０１３５】
（ａ）標的配列を含む試料を、その標的配列領域に相補的な１種または複数のオリゴヌクレオチドプライマー類、重合反応酵素、ヌクレオチド基質類、および式
【０１３６】
【化３４】

で表されるオリゴヌクレオチド結合体と混合して混合物を得る。尚、この式中、ＭＢは副溝バインダ、Ｑはクエンチャ、ＯＤＮは増幅された標的配列の一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロホアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満、さらに好ましくは５％未満、尚好ましくは２％未満、および最も好ましい実施形態では１％未満であって、およびｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、尚好ましくは少なくとも８０％、および最も好ましい実施形態では少なくとも９０％であるようにＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。
【０１３７】
（ｂ）その混合物を、対象のポリヌクレオチドの増幅に好適な諸条件のもとで温置する。
【０１３８】
および
（ｃ）増幅した標的に結合体がハイブリダイズする際に発生する蛍光をモニタリングすることで連続的に増幅をモニタリングする。いくつかの好ましい実施形態では、ＭＢ部分はＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、Ｆｌ部分は蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ（ｂｏｄｉｐｙ）類縁体類からなる群から選択されるものである。さらに別の好ましい実施形態では、Ｑ部分はモノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである。また別の好ましい実施形態では、結合体のＯＤＮ部分はヌクレオチドの長さが８−２５である。さらに別の好ましい実施形態では、結合体のＯＤＮ部分はヌクレオチドの長さが８−１５であり、Ｋが、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉからなる群から選択されて主鎖が原子数１０−５０の長さのリンカーである。
【０１３９】
本発明の別の関連する態様によれば、以下の内容を含む遺伝子発現モニタリング法類が提供される。
【０１４０】
（ａ）異なる配列類のオリゴヌクレオチドプローブ類のアレイを準備する。
【０１４１】
（ｂ）ハイブリダイゼーション諸条件下でそのアレイと、ポリヌクレオチド群を温置する。
【０１４２】
（ｃ）アレイ内のオリゴヌクレオチドプローブ類のうち、どのプローブがポリヌクレオチド群とハイブリダイズするのかを判断する。
尚、オリゴヌクレオチドプローブ類の一種以上は、以下の式のオリゴヌクレオチド結合体である。
【０１４３】
【化３５】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮは増幅された標的配列の一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満、さらに好ましくは５％未満、尚好ましくは２％未満、および最も好ましい実施形態では１％未満であって、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、尚好ましくは少なくとも８０％および最も好ましい実施形態では少なくとも９０％であるように、ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。いくつかの好ましい実施形態では、ＭＢ部分はＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、Ｆｌ部分は蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ（ｂｏｄｉｐｙ）類縁体類からなる群から選択されるものであり、Ｑ部分はモノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである。別の好ましい実施形態では、結合体は固体担体に結合している。
【０１４４】
別の関連した態様によれば、本発明は単一ヌクレオチドが異なるポリヌクレオチド類を識別する方法類を提供し、その方法は以下の内容を含む。
【０１４５】
（ａ）少なくとも２種のポリヌクレオチド類の各々を別々に、以下の式のオリゴヌクレオチド結合体とともに温置する。
【０１４６】
【化３６】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮは増幅された標的配列の一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満、さらに好ましくは５％未満、尚好ましくは２％未満、および最も好ましい実施形態では１％未満であって、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がそれのクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、尚好ましくは少なくとも８０％、および最も好ましい実施形態では少なくとも９０％であるように、ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。また結合体がハイブリダイゼーション諸条件下で所定の配列を持ち、ポリヌクレオチド類のうちの１種がオリゴヌクレオチド結合体に完全に相補的な標的配列を有し、ポリヌクレオチド類の別の少なくとも１種はオリゴヌクレオチド結合体と単一ヌクレオチドミスマッチを有する標的配列を持つものである。
および
（ｂ）ポリヌクレオチド類の各々とオリゴヌクレオチド結合体とのハイブリダイゼーション強度を測定する。前述と同様に、ある好ましい実施形態では、ＭＢ部分はＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、Ｆｌ部分は蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類とボディピ（ｂｏｄｉｐｙ）類縁体類とからなる群から選択されるものであり、Ｑ部分はモノアゾ色素類およびビスアゾ色素類からなる群から選択されるメンバーである。
【０１４７】
さらに別の関連する態様によれば、本発明は別の一種または複数のポリヌクレオチド類の混合物中に存在し、標的配列と関連性があるが同一ではないポリヌクレオチド内の標的配列を検出する方法類を提供し、その方法は以下に内容を含むものである。
【０１４８】
（ａ）ポリヌクレオチド類の混合物を、以下の式のオリゴヌクレオチド結合体と接触させる。
【０１４９】
【化３７】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮはオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングせれていない蛍光の１０％未満、さらに好ましくは５％未満、尚好ましくは２％未満、および最も好ましい実施形態では１％未満であって、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、尚好ましくは少なくとも８０％、および最も好ましい実施形態では少なくとも９０％であるように、ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。またその結合体は、そのＯＤＮ部分に完全に相補的である標的配列とのみ安定なハイブリッドを形成し、ほかのポリヌクレオチド類のいずれとも安定なハイブリッドを形成しない。
および
（ｂ）ハイブリッド形成時に発生する蛍光を測定し、ハイブリッドの形成が認められれば標的配列の存在が示されるものとする。前述のものを含めた好ましい実施形態では、特にＭＢ部分はＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、Ｆｌ部分は蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ（ｂｏｄｉｐｙ）類縁体類からなる群から選択されるものであり、Ｑ部分はモノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである。
【０１５０】
さらに別の関連した態様によれば、本発明は野生型、変異型およびヘテロ接合型の標的ポリヌクレオチド類を識別する方法類を提供し、その方法は以下の内容を含む。
【０１５１】
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含有する試料を、２種類のプローブと接触させる。その第一のプローブは野生型の標的ポリヌクレオチドに特異的であり、第二のプローブは変異型の標的ポリヌクレオチドに特異的であって、それらプローブの各々は以下の式を持つものである。
【０１５２】
【化３８】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮはオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、そのオリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満、さらに好ましくは５％未満、なお好ましくは２％未満、および最も好ましい実施形態では１％未満であって、ｉｉｉ）そのオリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、尚好ましくは少なくとも８０％、および最も好ましい実施形態では少なくとも９０％であるように、ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である。またその結合体は、そのＯＤＮ部分に完全に相補的である標的配列とのみ安定なハイブリッドを形成し、ほかのポリヌクレオチド類のいずれとも安定なハイブリッドを形成しない。
【０１５３】
（ｂ）ハイブリッド形成時に産生する蛍光を測定し、ハイブリッド形成が認められると野生型、変異型およびヘテロ接合型の標的ポリヌクレオチド類の存在または非存在が分かる。この態様によれば、第一および第二のプローブ類とそれらの各標的との間で生じる各々のハイブリッドに関する融解温度（Ｔ_ｍ）はそれぞれについて約５℃以内であることが好ましい。ほかの選ばれた実施形態では、プローブ類の各々のＯＤＮ部分は８−１８個の塩基または修飾塩基を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、プローブ類の各々のＯＤＮ部分は１０−１５の塩基または修飾塩基を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドである。また別の好ましい実施形態では、プローブの各々のフルオロホア部類は、５−ＦＡＭ^ＴＭ、６−ＦＡＭ^ＴＭ、ＴＥＴ^ＴＭ、ＪＯＥ^ＴＭ、ＨＥＸ^ＴＭ、ＶＩＣ^ＴＭ、ＮＥＤ^ＴＭ、ＴＡＭＲＡ^ＴＭ、ＲＯＸ^ＴＭおよびＹＹ^ＴＭからなる群から選択される。さらに別の好ましい実施形態では、プローブ類の各々のＯＤＮ部分は少なくとも１個の修飾塩基を含む。さらに別の実施形態では、試料を増幅諸条件下で１対のプライマー類とさらに接触させる。尚、そのプライマー類の各々は、前述の修飾塩基類から選択される１−１０個の修飾塩基を含むものである。
【０１５４】
前述の実施形態類に加えて、列挙されたプローブ類および方法類で用いられる好ましい構成成分類（たとえばＭＢ、Ｆｌ、Ｗ、ＯＤＮ、ＫおよびＱ）とは、本発明のプローブ類および結合体類に関してすでに記載された構成成分類のことである。従って、好ましいプローブ類および結合体類は、たとえば式ＩＩ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂおよびＩＶｃに提供されるものである。
【実施例】
【０１５５】
（物質類および方法類）
（鋳型類）
１０２種の非血縁性のＣｅｎｔｒｅ Ｅｔｕｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｈｕｍａｉｎｅ（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ試料は、Ｃｏｒｉｅｌｌ医学研究所（ｈｔｔｐ：／／ｌｏｃｕｓ．ｕｍｄｎｊ．ｅｄｕ／）から得たものである。用いた鋳型類のリストは、ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ５００ｃａｎｃｅｒ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．において入手可能なものである。
【０１５６】
（オリゴヌクレオチド類）
ＰＣＲプライマー類は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いて合成した。ＭＢ−Ｆｌ−５’−ＯＤＮ−Ｑプローブ類は、５’→３’方向にオリゴヌクレオチドセグメント類が合成されるように設計された５’−β−シアノエチルホスホルアミダイト類（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製，ヴァージニア州）を用いて、副溝バインダで修飾されたポリスチレン支持体（スキーム４の化合物２０）上で自動ＤＮＡ合成によって調製した。オリゴヌクレオチドの合成は、０．０２Ｍヨウ素溶液を用い、機器製造メーカーから供給されたプロトコールに従ってＡＢＩ３９００合成装置上で行なった。修飾塩基類のホスホルアミダイト類は、既に開示された方法類（国際公開第０３０２２８５９号および国際公開第０１６４９５８号）に基づき合成した。ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ類は、既に記載の方法（Ａｆｏｎｉｎａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３２，９４０−９４９（２００２））のように合成した。６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ^ＴＭレポーター性色素類は、対応するホスホルアミダイト類（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製、ヴァージニア州、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）を用いてＭＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ合成の最終段階で導入した。ホスホルアミダイト４１は、反応スキーム８で示したように、本発明のプローブ内にフルオレセイン基を導入するのに用いた。Ｅｐｏｃｈ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ＣＰＧおよび６−カルボキシフルオレセイン（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ製、ヴァージニア州、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ類の合成に用いた。標準的な５’−ＤＭＴホスホルアミダイト類をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ類の合成に用いた。全てのオリゴヌクレオチド類は、逆相ＨＰＬＣで精製した。
【０１５７】
［Ｇ／Ｃ］多型を示すＡＲＮＴ−０１標的配列、設計されたプローブ類およびプライマー類を表２に示す。
【０１５８】
【表２】

（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００またはＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７９００機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）のいずれかで実施した。ＰＣＲは、５０℃、２分温置後に、（９５℃−３０秒；５６℃−３０秒；７６℃−３０秒）の３ステップを５０サイクルを行い、最後に９５℃で２分温置して実施した。その反応混合物には、０．２５μＭのＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−ＱまたはＭＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ^ＴＭプローブ、そのプローブと同一鎖に相補的である１００ｎＭのプライマー、１μＭの反対鎖プライマー、１２５μＭのｄＡＴＰ、１２５μＭのｄＣＴＰ、１２５μＭのｄＴＴＰ、２５０μＭのｄＵＴＰ、０．２５ＵのＪｕｍｐＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ製）および０．１２５ＵのＡｍｐＥｒａｓｅウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）含有の１Ｘ ＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）、４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）を含み、全容量１０μｌで反応を行なった。蛍光シグナルの上昇は、反応のアニーリング段階中に記録した。
【０１５９】
（実施例１）
本実施例は、ＭＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ類と比較して改善された本発明のプローブ類のバックグランド−シグナル比を説明するものである。そのために、遊離のプローブ類および合成相補体類との対合後のプローブ類の蛍光シグナルを計測した。そのプローブ類および合成相補体類の配列類を図３に示す。実験は、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光測定器で行い、励起波長はＦＡＭに関しては４９６ｎｍまたはＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（ＹＹ）に関しては５３０ｎｍとし、蛍光放出波長はＦＡＭに関しては５１８ｎｍまたはＹＹに関しては５５０ｎｍとした。また５ｎｍの励起および放出のスリット類を用いた。バックグランドの蛍光は、０．１μＭのプローブ（ＭＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブまたは本発明の新規プローブのいずれか）、４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）を含有する溶液で記録した。二重鎖の形成については、０．５μＭ（最終濃度）の相補体を加えて行なった。蛍光の計測に先立ち、反応液を６０℃に予備加熱し、次いで２０℃に冷却した。
【０１６０】
（実施例２）
本実施例は、本発明のプローブ類の、ＭＧＢ−Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ類のものと比較して改善され、温度を関数とするバックグランド蛍光（非対合状態のプローブの蛍光）の安定性について説明するものである（図４参照）。その実験は、温度調整されたセルが装着されたＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光測定器で実施し、励起波長はＦＡＭに対しては４９６ｎｍまたはＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（ＹＹ）に対しては５３０ｎｍとし、蛍光放出波長はＦＡＭに対しては５１８ｎｍまたはＹＹに対しては５５０ｎｍとした。また５ｎｍの励起および放出のスリット類を用いた。溶液類としては、０．２μＭのプローブ（ＭＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブまたは本発明の新規プローブ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）を含むものとした。
【０１６１】
（プローブ配列類：）
Ｅｃｌｉｐｓｅ＃１ ＭＢ−Ｑ−５’−ＣＡＧＡＧＡＣＡＴＡＣＡ^＊ＣＣＡ−ＦＡＭ（またはＹＹ）
Ｅｃｌｉｐｓｅ＃２ ＭＢ−Ｑ−５’−Ｇ^＊ＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣ−ＦＡＭ（またはＹＹ）
新規プローブ＃１ ＭＢ−ＦＡＭ（またはＹＹ）−５’−Ｇ^＊ＴＣＡＧＡＧ^＊ＡＣＡＴＡＣＡ^＊ＣＣ−Ｑ
新規プローブ＃２ ＭＢ−ＦＡＭ（またはＹＹ）−５’−Ｇ^＊ＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣ−Ｑ
尚、Ｇ^＊はＰＰＧであり、Ａ^＊はヒドロキシブチニル−ジアミノピラゾロピリミジン修飾化塩基である。
【０１６２】
（実施例３）
本実施例は、ａ）結合体した副溝バインダの蛍光クエンチ能およびｂ）副溝バインダとＥｃｌｉｐｓｅクエンチャとの両方を包含する協調化蛍光クエンチのメカニズムについて説明するものである（図５参照）。実験の諸条件は、実施例１および２に記載のものとした。
【０１６３】
（プローブ配列類：）
ＭＢ−ＦＡＭ−５’−Ｇ^＊ＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣ−クエンチャ、またはそのクエンチャ部分のないもの
相補的配列：
３’−ＴＡＣＣＴＡＡＣＴＡＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡ
（実施例４）
本実施例は、２Ｘ１０^−７Ｍの一定のプローブ濃度における本発明の新規プローブの融解挙動の、ＭＧＢ−Ｅｃｌｉｐｓｅプローブのものと比較して上昇した感度について説明するものであって、相補体濃度は１Ｘ１０^−７Ｍから２．５Ｘ１０^−１０Ｍの間で変えて行なった。
【０１６４】
プローブ類および相補体配列を以下に示す。
【０１６５】
新規プローブと相補体との配列類：
ＭＢ−ＦＡＭ−ｇＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣ−Ｑ 新規プローブ
ＴＡＣＣＴＡＡＣ−−−ＴＡＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡ 相補体１
ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブと相補体との配列類：
ＭＢ−Ｑ−ｇＡＴＧＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣ−ＦＡＭ ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ
ＴＡＣＣＴＡＡＣ−−−ＴＡＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡ 相補体２
蛍光原性融解分析は、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光測定器において、１ＸＰＣＲ緩衝液中で実施し、励起波長４９６ｎｍおよび蛍光発光波長５１８ｎｍを採用し、５ｎｍの励起スリットおよび５ｎｍの放出スリットで行なった。プローブ／相補体の異なる二重鎖類は、２Ｘ１０^−７Ｍの一定のプローブ濃度で形成させ、一方、相補体の濃度は１Ｘ１０^−７Ｍと２．５Ｘ１０^−１０Ｍとの間で変えて行なった。本発明の新規プローブとＭＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブとの挙動に関する融解曲線での比較については、図８に示す。この図は、これら２種のプローブタイプの挙動の融解曲線での比較に基づき、感度が実質的に上昇することを示すものである。
【０１６６】
（実施例５）
本実施例は、本発明のプローブアッセイの遺伝子型判定能を説明するものである。１０２種の非血縁性のＣｅｔｒｅ Ｅｔｕｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｈｕｍａｉｎｅ（ＣＥＰＨ）ＤＮＡ試料について、ＡＲＮＴ−０１対立遺伝子（Ｇ／Ｃ）の存在に関する遺伝子型判定を実施し、ＭＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブと本発明のプローブとのアッセイの比較を行なった。各々の不正対合に特異的な対応プローブ類を表２に示す。各試料は、前記ＰＣＲアッセイで野生型および変異型の標的に特異的なプローブ類を用いて分析した。そのＤＮＡ試料のＰＣＲ−エンドポイント−スキャッタプロットによる遺伝子型判定解析については、図９に示す。本発明のアッセイのスキャッタプロット（図９ａ）では、すべてのＤＮＡ試料類の正確な遺伝子型判定が成され、非鋳型対照類、野生型、ヘテロ接合体および変異型のＤＮＡ試料類間を明確に分けることができる。これに対してＭＢ Ｅｃｌｉｐｓｅアッセイ（図９ｂ）では、非鋳型対照とヘテロ接合体とのＤＮＡ試料類は明確には分けられない。
【０１６７】
（実施例６）
（本発明のプローブ類とＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ類との対合速度論的比較）
この実施例は、本発明のプローブ類がＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ類よりも速く各々の標的類に対合することを示すものである。新規プローブ類およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ類の対合速度論は、ある温度範囲（３０−５５℃）を通じて、ハイスピ−ド分析用の分光光度計アクセサリ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ、英国、Ｓｕｒｒｅｙ）を用いて研究した。その際のプローブおよび標的の濃度は各々、１Ｘ１０^−７Ｍおよび２Ｘ１０^−７Ｍとした。そのプローブ類および標的の配列類を以下に示す。
ＭＢ−ＦＡＭ−ｇＴＣＡＧＡｇＡＣＡＴＡＣａＣＣ−Ｑ（本発明のプローブ）
ＦＡＭ−ＣＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＡＧＡＣＡＴＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧ−Ｑ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ）および
ＧＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＧ（標的相補体）。
尚、基幹配列類を下線で示し、「ａ」および「ｇ」は各々、Ｓｕｐｅｒ ＡおよびＳｕｐｅｒ Ｇである。
【０１６８】
プローブ類は、同じ鋳型に対して同様なＴ_ｍｓ値を持つように設計されたものである。以下の表に示すように、Ｐｌｅｉａｄｅｓプローブ類の反応速度定数類によって計測されるような対合速度は、研究した全ての温度域においてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ類のそれよりも実質的に速いものであった。４５℃および５５℃では、本発明のプローブの反応速度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎのそれよりも各々、約５倍および約３倍速いものであった。
【０１６９】
【表３】

（実施例７）
本実施例は、ＰＥＰで活性化された固体支持体７の合成を説明するものである。
【０１７０】
（４−クロロ酪酸ｔ−ブチル）
エーテル（１００ｍｌ）中、塩化４−クロロブチリル（９３ｇ、０．６６モル）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（８０ｇ、０．６６モル）とｔ−ブタノール（０．６６モル）との混合物を、５時間還流した。反応混合物を冷却し、エーテルで希釈し、さらに水、１０％クエン酸水溶液、および飽和ＮａＣｌ水溶液で順に洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。溶媒を蒸発させて得られた粗製生成物を減圧下（１０ｍｍＨｇ）で蒸留した。５７−５８℃で気化した精製品（７９ｇ、収率６７％）を採集した。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ３．６４（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．９３（ｑ，２Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）であった。
【０１７１】
（３−［（ｔ−ブチル）オキシカルボニル］プロピルフェニルメチルブタン−１，４−ジオエート ３）
ＤＭＦ １００ｍｌ中に溶解した４−クロロ酪酸ｔ−ブチル（８．９ｇ、５０ミリモル）とモノベンジルコハク酸セシウム（コハク酸モノベンジルとＣｓＯＨとから調製される）（５０ミリモル）とを含む溶液を８０℃で２日間加熱した。ＤＭＦを蒸発させ、シリカ上（移動相：ヘキサン−酢酸エチル）でクロマグラフィーを行い、無色液体としての２．５ｇの表題化合物３（収率１４％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ７．３５（ｓ，５Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），３．９９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．５８（ｍ，４Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．９３（ｑ，２Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ）であった。
【０１７２】
（３−［（ｔ−ブチル）オキシカルボニル］プロピル−２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニルブタン−１，４−ジオエート ４）
化合物３（２．０ｇ、５．７ミリモル）を、ＴＨＦ（１００ｍｌ）中、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒０．２ｇの存在下、水素圧４０ｐｓｉで２０時間、水素化した。Ｃｅｌｉｔｅでろ過して触媒を除去し、ろ液を濃縮した。得られた酸を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２ ２０ｍｌに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（０．８８ｇ、６．８ミリモル）を加えた後、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．９ｇ、６．８ミリモル）を加えた。室温で１時間、放置後、溶媒を蒸発させ、残渣をシリカ上（移動相：酢酸エチル−ヘキサン）でクロマトグラフィーを行い、粘性液状の２．２ｇの化合物４（収率９１％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ４．０５（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．７８（ｑ，２Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ）であった。
【０１７３】
（ＰＥＰで活性化された固体支持体７の調製）
２５ｍｌのＤＭＦ中に溶解した化合物４（０．５３ｇ、１．２４ミリモル）とジイソプロピルエチルアミン（１ｍｌ）とを含む溶液に、長鎖アルキルアミン（ＬＣＡＡ）ＣＰＧ（５．０ｇ、５００Å、１２４μｍｏｌ／ｇ）を加えた。ＣＰＧを３０時間、渦巻き攪拌した。ピリジン（１０ｍｌ）と無水酢酸（５ｍｌ）とを加え、さらにＣＰＧを１時間渦巻き攪拌した。ＣＰＧをＤＭＦで洗浄後、エーテルで洗浄した。減圧下で乾燥してＣＰＧ５を得た。
【０１７４】
ＣＰＧ５（５．０ｇ）を２５ｍｌのＴＦＡ中に懸濁させた。それを１時間、渦巻き攪拌後、ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。それを乾燥してＣＰＧ６を得た。
【０１７５】
支持体６（５．０ｇ）を２５ｍｌの無水ＣＨ_２Ｃｌ_２中に懸濁させ、ジイソプロピルエチルアミン（２ｍｌ）とＰＥＰ−ＴＦＡ（１ｍｌ）とで処理した。その支持体を１時間、渦巻き攪拌した。過剰量の試薬類および副生成物をろ過して除去し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。得られたＰＥＰ活性化ＣＰＧ７を乾燥した。
【０１７６】
（実施例８）
（３−［（フルオレン−９−イルメチル）オキシカルボニル］ピロロ［３，２−ｅ］インドリン−７−カルボン酸 ９）
３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）ピロロ［３，２−ｅ］インドリン−７−カルボン酸８（０．７６ｇ、３．４ミリモル）（Ｂｏｇｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５２：１５２１（１９８７））を、５ｍｌのＴＦＡで１時間処理して脱保護化した。ＴＦＡを蒸発させ、得られたトリフルオロ酢酸エステルを、１１％Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液（１０ｍｌ）とＴＨＦ ５ｍｌとの混合液に溶解した。クロロギ酸９−フルオレニルメチル（０．７５ｇ、２．９ミリモル）を加え、反応混合物を３時間、攪拌した。反応混合物を水（２００ｍｌ）で希釈し、エチルエーテル（２Ｘ５０ｍｌ）で抽出した。水相に１Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを１−２に酸性化した。沈殿した生成物を遠心分離して収集し、水洗し、減圧下で乾燥して灰黄色の固体としての０．８６ｇの化合物９を得た（収率８３％）。
【０１７７】
（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル−３−［（フルオレン−９−イルメチル）オキシカルボニル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート １０）
無水ＤＭＦ４ｍｌに溶解した化合物９（０．３ｇ、０．７ミリモル）とトリエチルアミン（０．３ｍｌ、２．１ミリモル）とを含む溶液に、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（０．３ｍｌ、１．７５ミリモル）を加えた。１時間後にＤＭＦを蒸発させ、残渣をシリカ上、２％アセトン／塩化メチレン溶離液でクロマトグラフィーを行なった。精製物含有画分を濃縮し、乾燥して黄色固体としての０．２９ｇのＰＥＰエステルを得た（収率７０％）。
【０１７８】
（化合物１１の合成）
ピリジン２０ｍｌに溶解した化合物１０（１．２ｇ、２．０ミリモル）とモノ−Ｏ−ＤＭＴ−４−アミノブチリル−１，３−プロパンジオール（１．２ｇ、２．６６ミリモル）（米国特許第５９４２６１０号参照）とを含む溶液を、室温で２４時間、放置した。反応混合物を濃縮し、酢酸エチルに再溶解し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。粗生成物をシリカ上、酢酸エチルを溶離液としてクロマトグラフィーを行なった。溶媒を蒸発させて１．６ｇの所望の化合物１１を得た（収率９３％）。
【０１７９】
（実施例９）
本実施例は、固体支持体２０の調製を説明するものである。
【０１８０】
（３−｛６−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］ヘキサノイル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボン酸メチル １５）
Ｂｏｇｅｒらの方法（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、５２：１５２１（１９８７））に従って調製したメチルピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（２．７ｇ、１２．５ミリモル）、４−ニトロフェニル−４−［ビス（４−メトキフェニル）フェニルメトキシ］ヘキサノエート（６．９ｇ、１２．５ミリモル）とトリエチルアミン（２ｍｌ）とを無水ＤＭＦ５０ｍｌに溶解した溶液を、室温で５時間撹拌した後、濃縮した。生成した油状物を室温で一晩（約１５時間）放置した。その油状物を酢酸エチルと５％炭酸水素ナトリウム水溶液との間で分配させた。有機相を炭酸水素ナトリウム希薄水溶液で２回洗浄し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を除去して得られた粗生成物について、酢酸エチルから再結晶させた。結晶性生成物１５の収量は５．９ｇ（収率７５％）であった。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ１１．９４（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．４−７．２（ｍ、１０Ｈ），７．０７（ｓ，１Ｈ），６．８７（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ，４Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．２８（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），２．９６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．５８（ｍ，４Ｈ），１．４１（ｍ，２Ｈ）であった。
【０１８１】
（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル−３−｛６−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］ヘキサノイル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート １６）
化合物１５（３．２ｇ、５．０６ミリモル）、水酸化リチウム一水和物（０．６ｇ、１４．３ミリモル）、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）、ＴＨＦ（２０ｍｌ）と水（１０ｍｌ）との混合物を、４５℃で１２時間、撹拌した後、濃縮した。その残渣を、冷却した１０％クエン酸水溶液と酢酸エチルとの間で分配させた。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、５ｍｌのトリエチルアミンで処理し、濃縮して固体物質３．７ｇを得た。その固体をＤＭＦ（２Ｘ５０ｍｌ）と共に蒸発させて残留水分を除去し、無水ＤＭＦ４０ｍｌに再溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍｌ）を加えた後、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（ＰＥＰ−ＴＦＡ）（０．９ｍｌ、５．２ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で一晩、放置後に濃縮し、シリカ上、ヘキサン−酢酸エチル１：１で溶離させてクロマトグラフィーを行なった。精製生成物含有画分類を濃縮し、減圧下で乾燥して淡黄色、無定形固体としての２．５ｇの表題化合物１６を得た（収率６９％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ１２．４５（ｓ，１Ｈ），８．３６（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｓ，１Ｈ），７．４−７．２（ｍ，１０Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，４Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．５９（ｍ，４Ｈ），１．４２（ｍ，２Ｈ）であった。
【０１８２】
（２−（４−ニトロフェニル）エチル−３−（｛３−［（３−｛６−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］ヘキサノイル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル）カルボニル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル｝カルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート １８）
無水ＤＭＦ１０ｍｌに溶解した２−（４−ニトロフェニル）エチル−３−（ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イルカルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート・トリフルオロアセテート１７［ＤＰＩ_２ＮＰＥエステル、米国特許出願公開第２００２／００３４７５４号］（０．９１ｇ、１．４ミリモル）とジイソプロピルエチレンジアミン（０．４９ｍｌ、２．８ミリモル）とを含む溶液に、ＰＥＰエステル１６（１．１ｇ、１．４ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で２４時間、放置して沈殿生成物を含む濃厚懸濁物を得た。メタノール（５０ｍｌ）を加えて沈殿した生成物をろ集し、メタノールで洗浄後、エーテルで洗浄した。減圧下で乾燥して灰白色固体としての１．４５ｇの化合物１８を得た（収率９１％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ１１．９９（ｓ，１Ｈ），１１．７８（ｓ，１Ｈ），１１．７０（ｓ，１Ｈ），８．４−８．１（ｍ，５Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５−７．２（ｍ，１２Ｈ），７．０９（ｓ，２Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，４Ｈ），４．６（ｍ，６Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．４３（ｍ，４Ｈ），３．３１（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），１．５９（ｍ，４Ｈ），１．４１（ｍ，２Ｈ）であった。
【０１８３】
（３−（｛３−［（３−｛６−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］ヘキサノイル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル）カルボニル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル｝カルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボン酸ペンタフルオロフェニル １９）
ニトロフェニルエチルエステル１８（１．３９ｇ、１．２２ミリモル）を、無水ＤＭＦ２０ｍｌ中、６．６ミリモルのＤＢＵで５０℃、２時間、処理して脱保護化した。ＤＭＦを蒸発させ、残渣をメタノールと共に粉砕した。不溶性物質をメタノールで洗浄しながらろ集し、減圧下で一晩、乾燥した。得られた固体を２０ｍｌのＤＭＦに再溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍｌ、８．６ミリモル）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（１．０ｍｌ、５．８ミリモル）で処理した。室温で２時間、攪拌後にＤＭＦを蒸発させ、残渣をメタノールと共に粉砕した。沈殿した生成物をろ集し、メタノールで洗浄し、減圧下で乾燥して黄色固体としての１．４１ｇの所望のＰＥＰエステル１９を得た（収率１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）データは、δ１２．５４（ｓ，１Ｈ），１１．８０（ｓ，１Ｈ），１１．７０（ｓ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．５５８（ｓ，１Ｈ），７．５−７．２（ｍ，１２Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，４Ｈ），４．６（ｍ，４Ｈ），４．１１（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．４３（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），１．５７（ｍ，４Ｈ），１．４０（ｍ，２Ｈ）であった。
【０１８４】
Ｎ−ＭＭＴ−アミノペンチル・ジグリコレートＣＰＧ２２は、アミノプロピル類似体（米国特許出願公開第２００２／００３４７５４号）と同じように調製した。
【０１８５】
（５−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルアミノ］ペンタン−１−オール）
ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍｌ）中に溶解した塩化モノメトキシトリチル（７．７ｇ、２４．９ミリモル）の溶液を、別の無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍｌ）中に溶解した５−アミノ−１−ペンタノール（５．２ｇ、５０ミリモル）の、冷却（氷／水）し攪拌中の溶液に添加用漏斗を経由して加えた。反応混合物を室温にまで加温し、１時間、反応させた。反応混合物を同量以上のＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、水で抽出した。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。溶媒を蒸発させて得られた粗生成物を、シリカ上（溶離液：酢酸エチル−ヘキサン）でクロマトグラフィーを行い、６．１ｇの５−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルアミノ］ペンタン−１−オールを得た。
【０１８６】
（２−｛［（５−｛［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミノ｝ペンチル）オキシカルボニル］メトキシ｝酢酸・トリエチルアンモニウム塩 ２１）
塩化メチレン２０ｍｌに、３．０ｇ（８ミリモル）の５−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルアミノ］ペンタン−１−オールを、トリエチルアミン１．３ｍｌ（９．４ミリモル）と無水ジグリコール酸１．１ｇ（９．５ミリモル）と共に溶解した。その混合物を一晩、撹拌後、濃縮した。残渣を、シリカ上、９３％塩化メチレン−５％メタノール−３％トリエチルアミンで溶離させてクロマトグラフィーを行なった。生成物類含有の画分類を合わせて、溶媒を蒸発させた。乾燥ＤＭＦと共に蒸発させて微量の残留水分を除去した。生成物の収率は、おそらく１００％であった。それを２４ｍｌのＤＭＦに溶解して最終濃度を約０．３３Ｍとした。
【０１８７】
（Ｎ−ＭＭＴ−アミノペンチル・ジグリコレートＣＰＧ２２の合成）
１００ｍｌ容の丸底フラスコ内で、予めＤＭＦ（１．６６ミリモル）に溶解した化合物２１の０．３３Ｍ溶液５ｍｌと１０ｇのＬＣＡＡ−ＣＰＧとを化合させた。別に２．５ｍｌのジイソプロピルエチルアミン、０．１１ｇ（０．８ミリモル）のＨＯＢＴと０．６３ｇ（１．６６ミリモル）のＨＢＴＵとから成る溶液を調製し、前述のＣＰＧに加えた。そのＣＰＧを旋回型振とう器（１５０ｒｐｍ）上で１６時間、渦巻き攪拌した。焼結ガラス漏斗上でろ集し、ＤＭＦ（２Ｘ１００ｍｌ）、アセトニトリル（２Ｘ１００ｍｌ）およびエーテル（２Ｘ１００ｍｌ）で洗浄した。減圧下で乾燥後、ＣＰＧをピリジン４０ｍｌと無水酢酸５ｍｌとで処理して未反応のアミノ基類にキャップをつけた。２時間、渦巻き攪拌後、ＣＰＧをろ集し、前述のように洗浄した。減圧下で一晩、乾燥後に、そのＣＰＧの３−５ｍｇについて、７０％過塩素酸：メタノール（１：１）混液２５ｍｌで処理してＭＭＴ装填量の分析を行った。放出されたＭＭＴカチオンの吸光度（Ａ）は、波長４７２ｎｍで記録し、以下の計算式に従ってＭＭＴ装填量を算出した。
【０１８８】
ＭＭＴ装填量（μｍｏｌ／ｇ）＝Ａ（４７２ｎｍ）× 液量（ｍｌ）× １４．３／ＣＰＧ重量（ｍｇ）
（ＭＧＢリガンド支持体２０）
４ｇのＮ−ＭＭＴ−アミノペンチル・ジグリコレートＣＰＧ２２を、中孔性焼結ガラス漏斗内で計量した。そのＣＰＧを、３％ＴＣＡ／ＤＣＭ溶液２５ｍｌで処理して脱トリチル化した。スパチュラで簡単に攪拌後、反応混合物を５分間反応させ、ろ過した（黄変した）。この工程をろ液が透明になるまで４回繰返した。そのＣＰＧを塩化メチレン４Ｘ４０ｍｌで洗浄した。ろ液をデカントして有機廃液とし、ＣＰＧを２０％トリエチルアミン／アセトニトリル混液４０ｍｌで処理して中和化した。スパチュラで簡単に攪拌後、混合物をろ過し、アセトニトリル２Ｘ４０ｍｌおよびエ−テル２Ｘ４０ｍｌで洗浄した。微量の残留エーテル分を減圧下（オイルポンプ）で除去した。脱トリチル化したＣＰＧは、直ちに次の固定化反応に用いた。
【０１８９】
ＭＧＢ−ＰＥＰエステル１９（０．２０ｇ、１８０マイクロモル）を、１２ｍｌの乾燥ＤＭＳＯと共に振とうした。１５分後、その溶液を、４ｇの脱トリチル化ジグリコレートＣＰＧに加えた（５０ｍｌ容の丸底フラスコ内）。２ｍｌのトリエチルアミンを加え、混合物を密栓して旋回型ミキサー上で１４時間、渦巻き攪拌した。ＣＰＧをろ集し、２Ｘ５０ｍｌのＤＭＳＯ、２Ｘ５０ｍｌのアセトニトリル、および２×５０ｍｌのエーテルで洗浄した。微量の残留エーテル分を減圧下（オイルポンプ）で除去した。そのＣＰＧを、１０ｍｌの乾燥ピリジン、１ｍｌの１−メチルイミダゾールと１ｍｌの無水酢酸とで処理して未反応のアミノ基類をアセチル化した。１時間、渦巻き攪拌後にＣＰＧをろ集し、２Ｘ５０ｍｌのＤＭＦ、２Ｘ５０ｍｌのアセトニトリル、および２Ｘ５０ｍｌのエーテルで洗浄した。微量の残留エーテル分を減圧下（オイルポンプ）で除去した。そのＣＰＧのうち３−５ｍｇについて、７０％過塩素酸：メタノール（１：１）混液２５ｍｌ中で処理してＣＰＧのＤＭＴ装填量を分析した。放出したＤＭＴカチオンの吸光度（Ａ）を波長４９８ｎｍで記録し、以下の計算式を用いてＣＰＧ １ｇ当り４５μｍｏｌになるようにＤＭＴ装填レベルを算出した。
【０１９０】
ＤＭＴ装填量（μｍｏｌ／ｇ）＝Ａ_４９８ × 容量（ｍｌ）×１４．３÷ＣＰＧ重量（ｍｇ）
（実施例１０）
本実施例は、フォスホルアミダイト３１の調製を説明するものである。
【０１９１】
（５−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトクシ）エトキシ］エトキシ｝−３−（メトキシカルボニル）安息香酸メチル ２３）
無水ＴＨＦ２５０ｍｌに溶解した５−ヒドロキシイソフタル酸ジメチル（２１ｇ、１００ミリモル）、ヘキサエチレングリコール（３２ｇ、１１３ミリモル）とトリフェニルホスフィン（３４ｇ、１３０ミリモル）とを含む溶液に、攪拌しながらアゾジカルボン酸ジエチル（２２．７ｇ、１３０ミリモル）を３分以上かけて加えた。２時間反応させた後、反応混合物を濃縮し、残渣をエチルエーテル２００ｍｌに懸濁した。０℃で３０分冷却後、沈殿したトリフェニルホスフィン・オキシドをろ過して除去し、ろ液を濃縮した。得られた混合物をシリカ上で、第一の溶離液として酢酸エチルによってＰｈ_３ＰＯと対称性ビス置換ヘキサエチレングリコール副生成物とを分離し、第二の溶離液として５％メタノール／酢酸エチル混液によって所望のモノ置換化ヘキサエチレングリコール誘導体を溶離させてクロマトグラフィーを行った。溶媒を蒸発させ、高減圧下で乾燥して粘性油状物としての１４．８ｇの表題化合物を得た（収率３１％）。その^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）データは、δ８．０８（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，２Ｈ），４．５８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２５（ｍ，２Ｈ），３．９０（ｓ，６Ｈ），３．７６（ｍ，２Ｈ），３．６０（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｍ，１６Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ）であった。
【０１９２】
（５−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝−３−（メトキシカルボニル）安息香酸メチル（２５））
無水ピリジン１００ｍｌに溶解した化合物２３（１４．８ｇ、３１．２ミリモル）の溶液を冷却（氷／水浴）し、攪拌しながら塩化ｐ−トルエンスルフォニル（７．１ｇ、３７．４４ミリモル）を分割して加えた。０℃で一晩放置後に反応混合物を、加熱浴を用いずに約３０ｍｌまで濃縮し、酢酸エチル（２００ｍｌ）と３Ｎ ＮａＨＳＯ_４水溶液（２００ｍｌ）との間で分配させた。水相をさらに酢酸エチル（１００ｍｌ）で洗浄し、有機性洗液類を合わせた後、それを飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＮａＳＯ_４上で乾燥した。それを濃縮して粘性油状物としての１７．８ｇの粗製トシルエステル体２４を得た。この生成物は、さらに精製することなく次の段階で用いた。
【０１９３】
その粗製トシルエステル体２４（１７．８ｇ、２８．３ミリモル）を無水ＤＭＦ２２０ｍｌに溶解した溶液に、アジ化ナトリウム（４．０ｇ、６１．５ミリモル）を加えた。反応混合物を５０℃で５時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物質を水（１００ｍｌ）と酢酸エチル（２００ｍｌ）との間で分配させた。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。溶媒を蒸発させて得られた粗製生成物を、シリカ上、酢酸エチルで溶離させるクロマトグラフィーを行なった。生成物を含む画分類を濃縮し、減圧下で乾燥して無色、油状物としての１０．１ｇの所望のアジ化物２５を得た（収率６７％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）データは、δ８．０８（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｓ，２Ｈ），４．２４（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｓ，６Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），３．５９（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ），３．５１（ｍ，１６Ｈ），３．３８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，２Ｈ）であった。
【０１９４】
（Ｎ−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［３，５−ビス（ヒドロキシメチル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エチル］（フルオレン−９−イルメトキシ）カルボキシアミド（２７））
水素化リチウムアルミニウム（１０．０ｇ、２６３．５ミリモル）を、アルゴン中、３回に分けて無水ＴＨＦ２５０ｍｌ中に懸濁させた。その懸濁物を０℃に冷却（氷／水浴）し、予め乾燥ＴＨＦ１００ｍｌに溶解したアジ化物２５（１０．１ｇ、２０．２ミリモル）の溶液を攪拌しながら徐々に（約５分かけて）加えた。反応混合物を室温まで加温し、さらに２時間、攪拌を続けた。水（２０ｍｌ）を滴加（最初は極めてゆっくりと）して過剰なＬｉＡｌＨ４を消失させ、反応混合物を濃縮して半固形の物質を得た。その物質から、２−プロパノールで抽出し、ろ過して所望のアミノジオール体を単離した。その固体類をさらに２−プロパノールで、洗液類中に生成物が検出されなくなるまで、洗浄（４Ｘ２００ｍｌ）した。抽出液を濃縮して粗製アミノジオール２６（８．２ｇ）を得、さらに精製せずに次の段階に用いた。
【０１９５】
ＤＭＦ８０ｍｌに溶解した粗製アミン２６（８．２ｇ、１９．６ミリモル）の溶液を冷却（氷／水浴）し、攪拌しながらＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．６ｇ、２０ミリモル）を加え、次に９−フルオレニルメチル・クロロホルメート（５．２ｇ、２０ミリモル）加えた。反応混合物を０℃で３０分、攪拌した。ＤＭＦを蒸発させ、得られた油状物を酢酸エチル（３００ｍｌ）と水（１００ｍｌ）との間で分配させた。水相をさらに酢酸エチルで洗浄した。有機相類を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濃縮した。その混合物をシリカ上、ＣＨ_２Ｃｌ_２、２．５％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２，５％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２および１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２で順に溶離させてクロマトグラフィーを行なった。精製生成物含有の画分類を濃縮し、無色、粘性シロップ状の９．２５ｇの化合物２７を得た（収率７２％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ７．８９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｓ，２Ｈ），５．１６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，４Ｈ），４．３０（ｍ，２Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），３．５（ｍ，１６Ｈ），３．４１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ）であった。
【０１９６】
（Ｎ−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（５−｛［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル｝−３−（ヒドロキシメチル）フェノキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトクシ｝エチル）（フルオレン−９−イルメトキシ）カルボキシアミド（２８））
無水ピリジン１７５ｍｌに溶解したジオール化合物２７（１２．６ｇ、１９．７ミリモル）の溶液を冷却（氷／水浴）し、攪拌しながら塩化ジメトキシトリチル（６．６６ｇ、１９．６ミリモル）を分割して加えた。反応混合物を室温にまで加温した。室温で１５時間放置後、反応混合物を濃縮し、酢酸エチルと冷却１０％クエン酸水溶液との間で分配させた。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。その混合物から、シリカゲルカラムでのＭｅＯＨ（０→１０％）／酢酸エチルのグラジエント溶離による精製によって所望のモノ−ＤＭＴ置換化ジオール化合物２８を単離した。精製生成物の画分類を濃縮し、減圧下で乾燥して高粘性のシロップ状の８．０ｇの表題化合物２８を得た（収率４３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）データは、δ７．８９（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．６９（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５−７．２（ｍ，１３Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），５．１９（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），４．２９（ｍ，２Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｍ，４Ｈ），３．７４（ｓ＋ｍ，８Ｈ），３．５（ｍ，１６Ｈ），３．４１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．１４（ｍ，２Ｈ）であった。
【０１９７】
（５−［Ｎ−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（５−｛［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル｝−３−（ヒドロキシメチル）フェノキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エチル）カルバモイル］−１５−（２，２−ジメチルプロパノイルオキシ）−１−オキソスピロ［３−ヒドロイソベンゾフラン−３，９’−キサンテン］−１２−イル−２，２−ジメチルプロパノエート（３０））
無水ＣＨ_２Ｃｌ_２１００ｍｌに溶解したＦｍｏｃ保護化モノＤＭＴ−アミノジオール２８の溶液に、攪拌しながらＤＢＵ（３ｍｌ、２０ミリモル）を加えた。３０分攪拌後、反応混合物を濃縮し、シリカ上、第一の溶離液としてＣＨ_２Ｃｌ_２で保護基成分を分離し、第二の溶離液としてＭｅＯＨ：Ｅｔ_３Ｎ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０：５：８５）で所望の生成物を溶離させてクロマトグラフィーを行なった。溶媒を蒸発させ、残渣を減圧下で乾燥させて粘性油状物としてのアミン化合物２９を得た。
【０１９８】
ＣＨ_２Ｃｌ_２３０ｍｌに溶解したアミン２９（２ミリモル）とトリエチルアミン（２ミリモル）との溶液を、予め無水ＴＨＦ１０ｍｌに溶解したジピバロイルフルオレセイン−６−カルボン酸ペンタフルオロフェニル（ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥ ＆ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ（１９９７）１６（１＆２）、１０７−１１４）の冷却（０℃）した溶液に、攪拌しながら加えた。０℃で３時間、攪拌後、溶媒を蒸発させ、残渣をシリカ上、ＭｅＯＨ（０→５％）／酢酸エチルのグラジエントで溶離させてクロマトグラフィーを行なった。精製生成物の画分類を濃縮し、乾燥して無色無定形固体としての２．１ｇの化合物３０を得た（収率８５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ８．７６（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｍ，９Ｈ），６．９５（ｍ，９Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｓ，１Ｈ），５．２０（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），４．０５（ｍ，４Ｈ），３．７４（ｓ＋ｍ，８Ｈ），３．６−３．３（ｍ，２０Ｈ），１．３１（ｓ，１８Ｈ）であった。
【０１９９】
（５−｛Ｎ−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［５−｛［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル｝−３−（｛［ビス（メチエチル）アミノ］（２−シアノエトキシ）フォスフィノオキシ｝メチル）フェノキシ］エトキシ｝エトキシ）エトキシ］エトキシ｝エトキシ）エチル］カルバモイル｝−１５−（２，２−ジメチルプロパノイルオキシ）−１−オキソスピロ［３−ヒドロイソベンゾフラン−３，９’−キサンテン］−１２−イル−２，２−ジメチルプロパノエート（３１））
無水ＣＨ_２Ｃｌ_２５０ｍｌに溶解した化合物３０（３．１ｇ、１．６８ミリモル）の溶液に、ジイソプロピルアンモニウム・テトラゾリド（０．４３ｇ、２．５ミリモル）を加え、続いて２−シアノエチルテトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．７６ｇ、２．５ミリモル）を加えた。反応混合物を一晩撹拌後、濃縮し、シリカ（予めＥｔ_３Ｎ＋ＥｔＯＡｃで洗浄したもの）上、酢酸エチルで溶離させてクロマトグラフィーを行なった。精製生成物の画分類を濃縮し、高減圧下で乾燥して無色の無定形固体としての１．８ｇの化合物３１を得た（収率７５％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ８．７６（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．４４（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｍ，９Ｈ），６．９５（ｍ，９Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），６．７５（ｓ，１Ｈ），４．６６（ｍ，２Ｈ），４．０３（ｍ，４Ｈ），３．７４（ｓ＋ｍ，８Ｈ），３．６−３．３（ｍ，２４Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），１．２９（ｓ，１８Ｈ），１．１４（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，１２）；および^３１Ｐ ＮＭＲのデータはδ１４８（ｓ）であった。
【０２００】
（実施例１）
本実施例は、ホスホルアミダイト４１の調製を説明するものである。
【０２０１】
（化合物３２の合成）
無水ＴＨＦ２００ｍｌに溶解した４−ヒドロキシ安息香酸メチル（１５．２ｇ、０．１モル）、ヘキサ（エチレングリコール）（３２ｇ、０．１１モル）とトリフェニルホスフィン（３４ｇ、０．１３モル）との溶液に、攪拌しながらアゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ）（２０．５ｍｌ、０．１３モル）を滴加した。２時間攪拌後、反応混合物を濃縮し、残渣をエーテル（２００ｍｌ）に懸濁してトリフェニルホスフィン・オキシドを沈殿させた。その懸濁液を冷却し、固型分をろ別した。ろ液を濃縮し、得られた油状物をシリカ上でメタノール（０→５％）／酢酸エチルのグラジエントで溶離させてクロマトグラフィーを行った。精製生成物の画分を濃縮し、減圧下で乾燥して無色のシロップ状の１１．９ｇの化合物３２を得た（収率２９％）。その^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）のデータは、δ７．８９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），３．６５−３．３５（ｍ，２０Ｈ）であった。
【０２０２】
（化合物３３の合成）
化合物３２（１２．９ｇ、３１．２ミリモル）を、無水ピリジン（２Ｘ１００ｍｌ）と共に蒸発させて乾燥後、無水ピリジン１００ｍｌに溶解し、０−３℃（氷−水浴）に冷却した。この溶液に、攪拌しながら塩化ｐ−トルエンスルフォニル（７．１ｇ、３７．４４ミリモル）を分割して加えた。反応混合物を０℃で１６時間、攪拌後、濃縮用フラスコで冷却（０−２０℃）しながら濃縮した。残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）と３Ｎ ＮａＨＳＯ_４水溶液（２００ｍｌ）との間で分配させた。有機相を、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。それを濃縮して１６．１ｇの所望のトシルエステル３３を得た。この物質は充分に純粋であり、さらに精製せずに次の反応に用いた。
【０２０３】
（化合物３４の合成）
ＤＭＦ２２０ｍｌに溶解した化合物３３（１６．１ｇ、２８．２ミリモル）の溶液に、アジ化ナトリウム（４．０ｇ、６１．５ミリモル）を加えた。その反応混合物を５０℃で５時間、攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を水（１００ｍｌ）と酢酸エチル（２００ｍｌ）との間で分配させた。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。溶媒を蒸発させて得られた物質を、シリカ上、酢酸エチルで溶離させてクロマトグラフィーを行なった。生成物含有の画分類を濃縮して無色粘性油状物としての１０．５ｇのアジ化物３４を得た（収率８５％）。
【０２０４】
（化合物３５の合成）
メタノール２５０ｍｌに溶解した化合物３４（７．０ｇ、１５．９ミリモル）の溶液を、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒の存在下、水素圧４５ｐｓｉで１時間、水素化した。Ｃｅｌｉｔｅでろ過して触媒を除去した。溶媒を蒸発させて無色、粘性油状の６．５５ｇのアミン３５を得た（収率９９％）。
【０２０５】
（化合物３６の合成）
アミン化合物３５（６．５ｇ、１５．６ミリモル）を、１Ｎ ＮａＯＨ３２ｍｌに溶解した。室温で１時間、放置後、５０ｍｌの水と１５．６ミリモルのＮａＨＣＯ_３とを加えた。その溶液を、氷−水浴を用いて０℃に冷却した。その溶液に、予めＴＨＦ５０ｍｌに溶解したＦｍｏｃ−Ｃｌ（４．９ｇ、１８．７ミリモル）の溶液を加えた。生成したエマルションを０℃で２時間、撹拌後、濃縮し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２に酸性化した。その混合物を酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。濃縮して得られた粘性シロップ状物を、シリカ上、ＭｅＯＨ（０→５％）／ジクロロメタンのグラジエントで溶離させてクロマトグラフィーを行なった。９．１ｇの所望の酸化合物３６を得た（収率９３％）。
【０２０６】
（化合物３７の合成）
無水ジクロロメタン１５０ｍｌに溶解した化合物３６（９．１ｇ、４．６ミリモル）とピリジン（１．５ｍｌ）との溶液に、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（ＰＥＰ−ＴＦＡ）２．６ｍｌ（１５．１ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で３時間、放置後、濃縮した。残渣を、シリカ上、酢酸エチルで溶離させてクロマトグラフィーを行なった。精製生成物の画分類を濃縮して無色粘性油状の８．５ｇのＰＥＰエステル３７を得た（収率７３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）データは、δ８．１０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２５（ｍ，５Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，２Ｈ），３．６６−３．５０（ｍ，６Ｈ），３．４９（ｓ，１０Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），３．１３（ｍ，２Ｈ）であった。
【０２０７】
（化合物３９の合成）
ジクロロメタン１００ｍｌに、化合物３７（４．０ｇ、５．０６ミリモル）、ピリジン（０．５ｍｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍｌ）とＤＭＴ−ヒドロキシプロリノール（３８）（Ｎ−ＦＭＯＣ−ヒドロキシプロリンをＢＨ_３で還元し、次にその第一級ヒドロキシ基をＤＭＴで保護して調製される）（２．５ｇ。５．６ミリモル）とを溶解して溶液を調製した。その反応混合物を、含有するＰＥＰエステル３７がＴＬＣ分析（酢酸エチル）でほとんど検出されなくなるまで、最大５０時間まで反応を継続させた。反応後の溶液を１０％クエン酸水溶液、および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。溶媒を蒸発させて得られた物質をシルカ上、メタノール（０→５％）／ジクロロメタンのグラジエントで溶離させてクロマトグラフィーを行なった。精製生成物の画分類を濃縮して無定形の白色固体としての４．７ｇの所望の化合物３９を得た（収率９０％）。
【０２０８】
（化合物４０の合成）
ジクロロメタン（２５ｍｌ）とトリエチルアミン（２５ｍｌ）との混液に溶解した化合物３９（４．６ｇ、４．４ミリモル）の溶液を、５０℃で２４時間、加熱した。反応混合物を濃縮し、無水ジクロロメタン６０ｍｌに再溶解させた。ジイソプロピルエチルアミンを加え、溶液を０℃（氷−水浴）に冷却した。その冷溶液に、ジピバロイルフルオレセイン−６−カルボン酸ペンタフルオロフェニル（２．９ｇ、４．０８ミリモル）を分割して加えた。反応混合物を０℃で１時間、撹拌後、濃縮した。精製した物質をシリカ上、メタノール（０→２．５％）／ジクロロメタンのグラジエントで溶離させてクロマトグラフィーを行なった。生成物含有の画分類を濃縮して無定形の白色固体としての４．８ｇの化合物４０を得た（収率８８％）。
【０２０９】
（化合物４１の合成）
無水ジクロロメタン８０ｍｌに溶解した化合物４０（４．７ｇ、３．５ミリモル）の溶液に、ジイソプロピルアンモニウム・テトラゾリド１．５２ｇを加え、続いて２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（２．３５ｇ、７．８ミリモル）を加えた。３時間攪拌後、反応混合物を濃縮し、酢酸エチルと５％ＮａＨＣＯ_３水溶液との間で分配させた。有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄後、Ｎａ_２ＳＯ_４を通して乾燥した。溶媒を蒸発させて得られた物質を少量の酢酸エチルに溶解し、２倍容の無水ヘキサン中に加えて沈殿を形成させた。それをヘキサンと共に粉砕後、ろ過し、乾燥して白色無定形固体としての４．６ｇの所望のホスホルアミダイト４１を得た（収率８６％）。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１は、クエンチング氏、相補的核酸標的にハイブリダイズする溶液状態の本発明のプローブ（ＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ）の概略図を示すものであってそのフルオロフォアとクエンチャとは蛍光が可能となるように空間的に分離されている。
【図２】図２は、固体支持体に固定化された本発明の固定化プローブ（ＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑ）を図解するものである。ハイブリダイズされていないプローブの蛍光は効率的にクエンチされている。クエンチャ（Ｑ）とフルオロホア（Ｆｌ）とは近接配置されている。プローブが相補的な核酸標的にハイブリダイズすると、ＱとＦｌとは空間的に分かれて蛍光が生じるようになる。ＭＢリガンドは、二重鎖の副溝内に結合することで安定化する副溝バインダーである。
【図３】図３は、４種類のＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ類の場合と比較しての、４種類の異なる標的にハイブリダイズした本発明の４種のプローブの蛍光シグナル、蛍光バックグランドおよびシグナル／バックグランド比に関するものである。
【図４】図４は、本発明の２種類のプローブ、並びにフルオレセイン（ＦＡＭ）またはＹａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（ＹＹ）でそれぞれ標識化した２種類のＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅプローブの温度上昇時のバックグランドシグナルの安定性を比較したものである。プローブ類の配列は、Ｅｃｌｉｐｓｅ＃１が５’−ＣＡＧＡＧＡＣＡＴＡＣＡ＊ＣＣＡ、Ｅｃｌｉｐｓｅ＃２が５’−Ｇ＊ＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣ、新規プローブ＃１が５’−Ｇ＊ＴＣＡＧＡＧ＊ＡＣＡＴＡＣＡ＊ＣＣ、および新規プローブ＃２が５’−Ｇ＊ＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣであり、Ａ＊は４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブチ−３−イン−１−オールであり、Ｇ＊は６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンである。
【図５】図５ａは、溶液状態および相補的標的に結合した状態でのＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮの温度に対する蛍光バックグランドの変化を示す。図５ｂは、溶液状態および相補的配列に結合した状態でのＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮおよびＭＢ−Ｆｌ−ＯＤＮ−Ｑの蛍光スペクトル類を示す。
【図６】図６は、固体担体表面に本発明の結合体を分岐させて組立てる手順を概略図で示す。
【図７】図７は、固体担体表面に本発明の結合体を線状に組立てる手立てを概略図で示す。
【図８】図８は、新規プローブの挙動をＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｒｏｂｅのそれと比較した融解曲線を示す。Ａ．は、３種の異なる相補物濃度（ａ）１ｘ１０^−７Ｍ、ｂ）２ｘ１０^−８Ｍ、ｃ）４ｘ１０^−９Ｍ）において、右の列のＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｒｏｂｅと、左の列の新規プローブとを比較して各々、グラフに示すもので、プローブ濃度は一定（２ｘ１０^−７Ｍ）とした。Ｂ．は、一定のプローブ濃度、２ｘ１０^−７Ｍでの、３種の異なる相補物濃度（ａ）４ｘ１０^−９Ｍ、ｂ）１ｘ１０^−９Ｍ、ｃ）１．６ｘ１０^−１０Ｍ）における、右の列のＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｒｏｂｅと、左の列の新規プローブとを比較するものである。注目すべきは感度が１０倍上昇したことである。
【図９】図９は、１０２種のＡＲＮＴ−０１ＤＮＡ試料のリアルタイムエンドポイントＰＣＲ分析の遺伝子型分類用スキャッタプロット類を示す。図９ａは、野生型プローブをＦＡＭで標識化し、変異型プローブをＹＹで標識化した時の、本発明の新規プローブ結合体の挙動を表わす。図９ｂは、野生型プローブをＦＡＭで標識化し、変異型プローブをＹＹで標識化した時の、ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｒｏｂｅ類の挙動を表わす。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’−末端および５’−末端を有するオリゴヌクレオチド部分と、該ヌクレオチド単位の少なくとも１個と連結基を介してオリゴヌクレオチドに共有結合している副溝バインダー部分と、フルオロフォアおよびクエンチャとを含むオリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブは以下の式を有し、
【化１】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャ、Ｆｌはフルオロフォアであり、［Ａ−Ｂ］_ｎはｎ単位の核酸オリゴマーを表し、ｎは５−５０の整数であり、Ａは各々、独立して糖リン酸エステル主鎖、修飾糖リン酸エステル主鎖、ロックされた核酸主鎖、ペプチド主鎖、あるいは核酸調製で用いられるそれらの変異体から成る群から選択される核酸主鎖成分を表わし、Ｂは各々、独立して核酸塩基、修飾塩基または塩基類縁体を表わし、Ｋは結合または連結基であり、Ｗは（ｉ）該オリゴヌクレオチドプローブがそれの相補的配列にハイブリダイズする際に形成される二重鎖副溝内にＭＢが結合し、（ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、該オリゴヌクレオチドプローブ内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、（ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチドプローブがその標的配列にハイブリダイズする際にＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、該ＭＢとＦｌと［Ａ−Ｂ］_ｎとの間に充分な空間を提供する３価の連結基である、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２】
Ｗが、ハイブリダイズされていない形では、Ｆｌの蛍光がクエンチ化されていない蛍光の３０％未満であるように、ＭＢとＦｌと［Ａ−Ｂ］_ｎとの間に空間を提供する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３】
Ｗが、
【化２】

からなる群から選択されるメンバーであり、
式中、ｑは０−８の整数であり、Ａ^０、Ａ^１およびＡ^２は各々、主鎖の原子数が１−５０の連結基類であって、アリール、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレンおよびそれらの組合せからなる群から選択される部位を伴うものであり、該波線はＭＢ、Ｑおよび［Ａ−Ｂ］_ｎ部分との結合点を示す、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４】
ｎが６−１８の整数であり、前記［Ａ−Ｂ］_ｎ部分が少なくとも３個の連続したグアニンヌクレオチドを含み、該グアニンヌクレオチド塩基類の少なくとも１個がＰＰＧで置き換わったものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項５】
前記［Ａ−Ｂ］_ｎ部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ体、ＰＮＡまたはロックされた核酸である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６】
ｎが６−１８の整数であり、前記プローブが少なくとも３０％のアデニン塩基およびチミン塩基を有する標的配列に相補的であり、該プローブが少なくとも１個の修飾塩基を含み、該少なくとも１個の修飾塩基は該少なくとも１個の修飾塩基を含まないプローブと比較して少なくとも３℃での二重鎖形成の安定性を増大させるのに充分である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項７】
前記［Ａ−Ｂ］_ｎ部分がＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ体、ＰＮＡまたはロックされた核酸である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
前記プローブが、少なくとも５０％のアデニン塩基およびチミジン塩基を有する標的配列に相補的であり、該プローブが少なくとも１個の修飾塩基を含み、これは該少なくとも１個の修飾塩基を含まないプローブと比較して少なくとも５℃での二重鎖形成の安定性を増大させるのに充分である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
前記ＷおよびＫが各々、式ＩＶｂおよび式ＩＶｃを有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド増幅の連続モニタリングの方法であって、
（ａ）標的配列を含む試料を、その標的配列の領域に相補的な１種または複数のオリゴヌクレオチドプライマー、重合反応酵素、ヌクレオチド基質類、および
【化３】

で表されるオリゴヌクレオチド結合体と混合して混合物を得る工程であって、式中、ＭＢは副溝バインダ、Ｑはクエンチャ、ＯＤＮは増幅された該標的配列の一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、該オリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、該ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である工程と、
（ｂ）該混合物を、該ポリヌクレオチドの増幅に好適な諸条件のもとで温置する工程と
（ｃ）増幅した標的に結合体がハイブリダイズする際に産生する蛍光をモニタリングすることで連続的に該増幅をモニタリングする工程とを含む方法。
【請求項１１】
前記ＭＢ部分が、ＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｆｌ部分が、蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアがクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ類縁体類からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｑ部分が、モノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合体の前記ＯＤＮ部分が、ヌクレオチド長８−２５である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合体の前記ＯＤＮ部分が、ヌクレオチド長８−１８であって、Ｋが、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＰおよびＳｉからなる群から選択される１０−５０の主鎖原子長を有するリンカーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＷおよびＫが各々、式ＩＶｂおよび式ＩＶｃを持つ、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現モニタリングの方法であって、
（ａ）異なる配列類のオリゴヌクレオチドプローブ類のアレイを準備する工程と
（ｂ）ハイブリダイゼーション諸条件下で該アレイとともに、ポリヌクレオチド群を温置する工程と
（ｃ）該アレイ内の該オリゴヌクレオチドプローブ類のうち、どのプローブが該ポリヌクレオチド群とハイブリダイズするのかを判断する工程とを包含し、
該オリゴヌクレオチドプローブ類の一種以上は、以下の式のオリゴヌクレオチド結合体であって、
【化４】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮは増幅された標的配列に一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、該オリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハシブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、該ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基である、方法。
【請求項１８】
前記ＭＢ部分が、ＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、前記Ｆｌ部分が、蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、そのフルオロフォアがクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ類縁体類からなる群から選択されるものであり、前記Ｑ部分が、モノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合体が固体支持体に結合している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＷおよびＫが各々、式ＩＶｂおよび式ＩＶｃを持つ請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
単一ヌクレオチドが異なるポリヌクレオチド類を識別する方法であって、
（ａ）少なくとも２種のポリヌクレオチド類の各々を別々に、以下の式のオリゴヌクレオチド結合体とともに温置する工程であって、
【化５】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮは増幅された標的配列の一部に相補的である配列を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズしていない形では、該オリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、該ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基であり、該結合体がハイブリダイゼーション諸条件下で所定の配列を持ち、該ポリヌクレオチド類のうちの１種が該オリゴヌクレオチド結合体に完全に相補的な標的配列を持ち、該ポリヌクレオチド類の別の少なくとも１種は該オリゴヌクレオチド結合体と単一ヌクレオチドミスマッチを有する標的配列を持つ工程、および
（ｂ）該ポリヌクレオチド類の各々と該オリゴヌクレオチド結合体とのハイブリダイゼーション強度を測定する工程を包含する方法。
【請求項２２】
前記ＭＢ部分が、ＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、前記Ｆｌ部分が、蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、該フルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ類縁体類からなる群から選択されるものであり、前記Ｑ部分が、モノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＷおよびＫが各々、式ＩＶｂおよび式ＩＶｃを持つ、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチド内の標的配列を検出する方法であって、該ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチド類の混合物中に存在し、該混合物中の該別のポリヌクレオチド類の一種以上が、該標的配列と関連性があるが同一ではなく、該方法は、
（ａ）ポリヌクレオチド類の該混合物を、以下の式のオリゴヌクレオチド結合体と接触させる工程であって、
【化６】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮはオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、該オリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、該ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基であり、該結合体は、該ＯＤＮ部分に完全に相補的である標的配列とのみ安定なハイブリッドを形成し、ほかのポリヌクレオチド類のいずれとも安定なハイブリッドを形成しない工程、および
（ｂ）ハイブリッド形成時に産生する蛍光を測定し、ハイブリッドの形成が認められれば該標的配列の存在が示される工程を包含する方法。
【請求項２５】
前記ＭＢ部分が、ＣＣ１０６５類似体類、レキシトロプシン類、ジスタマイシン、ネトロプシン、ベレニル、デュオカルマイシン、ペンタミジン、４，６−ジアミノ−２−フェニルインドールおよびピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン類縁体類からなる群から選択され、前記Ｆｌ部分が、蛍光発光波長が約４００−約８００ｎｍであるフルオロフォアであり、該フルオロフォアはクマリン類、レゾルフィン類、キサンテン類、ベンゾキサンテン類、シアニン類およびボディピ類縁体類からなる群から選択されるものであり、前記Ｑ部分が、モノアゾ色素類とビスアゾ色素類とからなる群から選択されるメンバーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＷおよびＫが各々、式ＩＶｂおよび式ＩＶｃを持つ、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
野生型、変異型およびヘテロ接合型の標的ポリヌクレオチド類を識別する方法であって、
（ａ）標的ポリヌクレオチドを含有する試料を、２種類のプローブと接触させる工程であって、第一のプローブは該野生型の標的ポリヌクレオチドに特異的であり、第二のプローブは該変異型の標的ポリヌクレオチドに特異的であって、それらプローブの各々は以下の式を持つものであり、
【化７】

式中、ＭＢは副溝バインダー、Ｑはクエンチャであり、ＯＤＮはオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドであり、Ｋは結合または連結基であり、Ｆｌはフルオロフォアであり、Ｗはｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハイブリダイズする際に副溝内にＭＢが結合し、ｉｉ）ハイブリダイズされていない形では、該オリゴヌクレオチド結合体内のＦｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の１０％未満であり、ｉｉｉ）該オリゴヌクレオチド結合体が該標的配列にハイブリダイズする際に、Ｆｌの蛍光がクエンチングされていない蛍光の少なくとも５０％であるように、該ＭＢとＦとＯＤＮの各成分との間に充分な間隔をあける３価の連結基であり、該結合体は、該ＯＤＮ部分に完全に相補的である標的配列とのみ安定な対ハイブリッドを形成し、ほかのポリヌクレオチド類のいずれとも安定なハイブリッドを形成しない、工程、および
（ｂ）ハイブリッド形成時に産生する蛍光を測定し、ハイブリッド形成が認められると該野生型、変異型およびヘテロ接合型の標的ポリヌクレオチド類の存在または非存在が分かる工程を含む方法。
【請求項２８】
前記第一および第二のプローブ類とそれらの各標的との間で生じる各々のハイブリッドに関する融解温度（Ｔ_ｍ）はそれぞれについて約５℃以内である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブ類の各々の前記ＯＤＮ部分が、８−１８個の塩基または修飾塩基を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記プローブ類の各々の前記ＯＤＮ部分が、１０−１５の塩基または修飾塩基を持つオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記プローブ類の各々の前記フルオロフォア部分が、５−ＦＡＭ^ＴＭ、６−ＦＡＭ^ＴＭ、ＴＥＴ^ＴＭ、ＪＯＥ^ＴＭ、ＨＥＸ^ＴＭ、ＶＩＣ^ＴＭ、ＮＥＤ^ＴＭ、ＴＡＭＲＡ^ＴＭ、ＲＯＸ^ＴＭおよびＹＹ^ＴＭからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記プローブ類の各々の前記ＯＤＮ部分が、少なくとも１個の修飾塩基を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
各修飾塩基が独立して、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、１Ｈ−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン、６−アミノ−３−プロピ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、６−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、６−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、４−アミノ−３−（プロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、３−プロピ−１−イニル−４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−（４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）エチン−１−オール、３−（２−アミノエチニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、５−プロピ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、５−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、６−アミノ−５−プロピ−１−イニル−３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−アミノプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、５−［４−アミノ−３−（３−メトキシプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル］−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール、６−アミノ−１−［４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３−（３−メトキシプロピ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブチ−３−イル−１−オール、６−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−ブチ−１−イニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、５−（４−ヒドロキシ−ブチ−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン、３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミンおよび３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミンからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料を増幅諸条件下で１連のプライマー類とさらに接触させる工程を包含し、該プライマー類の各々が、６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン、４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、１Ｈ−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン、６−アミノ−３−プロピ−１−イニル−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、６−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、６−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、４−アミノ−３−（プロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、４−アミノ−３−（３−アミノプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、３−プロピ−１−イニル−４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、２−（４，６−ジアミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）エチン−１−オール、３−（２−アミノエチニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、５−プロピ−１−イニル−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、５−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２，４−ジオン、６−アミノ−５−プロピ−１−イニル−３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−ヒドロキシプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、６−アミノ−５−（３−アミノプロピ−１−イニル）−１，３−ジヒドロピリミジン−２−オン、５−［４−アミノ−３−（３−メトキシプロピ−１−イニル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル］−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール、６−アミノ−１−［４−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３−（３−メトキシプロピ−１−イニル）−５−ヒドロピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、４−（４，６−ジアミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−ブチ−３−イル−１−オール、６−アミノ−３−（４−ヒドロキシ−ブチ−１−イニル）−１，５−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン、５−（４−ヒドロキシ−ブチ−１−イニル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン、３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミン、３−ブロモ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミンおよび３−クロロ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イルアミンからなる群から選択される１−１０個の修飾塩基類を含む、請求項２７に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【公表番号】特表２００７−５０９６３４（Ｐ２００７−５０９６３４Ａ）
【公表日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３８５５４（Ｐ２００６−５３８５５４）
【出願日】平成１６年１０月２７日（２００４．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７９８１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４３１２７
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【出願人】（５００４６１５７２）エポック・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド (4)
【住所又は居所原語表記】２１７２０２３ＲＤ　ＤＲＩＶＥ，Ｓ．Ｅ．，ＳＵＩＴＥ　１５０，ＢＯＴＨＥＬＬ，ＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ　９８０２１，ＵＮＩＴＥＤ　ＳＴＡＴＥＳ　ＯＦ　ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】