改良された抗ＴｒｋＢ抗体
本発明は、チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）受容体を特異的に認識し、作動性である改良された抗体または抗原結合分子、およびそれらの使用の方法を提供する。このような分子をコードするポリヌクレオチドおよびベクターならびに該ポリヌクレオチドまたはベクターを有する宿主細胞も本発明において提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００８年１月１７日出願の米国仮特許出願６１／０２１，８２０の優先権の利益を主張する。この出願の全ての記載は、出典明示により本出願に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）の抗体および抗原結合分子アゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｉ．ＴｒｋＢ
チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）は、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣを含む１回膜貫通受容体チロシンキナーゼのファミリーに属する。これらのチロシン受容体キナーゼ（ｔｒｋ）はニューロトロフィンの活性を媒介する。ニューロトロフィンは、ニューロンの生存および発達のために必要であり、ニューロン構造およびシナプス可塑性の調節を介してシナプス伝達を調節する。ニューロトロフィンは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）を含むが、これらに限定されない（Lo, KY et al., J. Biol. Chem., 280:41744-52 (2005)）。ＴｒｋＢはＢＤＮＦの高親和性受容体である（Minichiello, et al., Neuron 21:335-45 (1998)）。ｔｒｋへのニューロトロフィンの結合は、受容体を活性化し、二量体化し、受容体の細胞内ドメインの特定のチロシン残基を自己リン酸化する（Jing, et al. Neuron 9:1067-1079 (1992); Barbacid, J. Neurobiol. 25:1386-1403 (1994); Bothwell, Ann. Rev. Neurosci. 18:223 253 (1995); Segal and Greenberg, Ann. Rev. Neurosci. 19:463 489 (1996); Kaplan and Miller, Curr. Opinion Neurobiol. 10:381 391 (2000)）。これらのホスホチロシン残基は、神経細胞死の抑制およびニューロトロフィンの他の効果を引き起こす細胞内シグナル伝達カスケードの成分に対するドッキング部位として働く。例えば、Ｓｈｃ、ＦＲＳ−２、ＳＨ２Ｂ、ｒＡＰＳおよびＰＬＣγはリン酸化チロシン残基を介してＴｒｋＢと相互作用する。これらのアダプター分子と活性化ＴｒｋＢの結合によって、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路を含むシグナル伝達経路が開始され、それによりニューロトロフィンの作用を介在する（Lo, KY et al., J. Biol. Chem., 280:41744-52 (2005)）。
【０００４】
ＩＩ．糖尿病
正常な健康状態を維持するために、ヒト血流中のグルコースの濃度は比較的に狭い範囲内（血液１デシリットルあたり６０−１２０ミリグラム）で制御されなければならない。血中グルコースがあまりに低く下がると、低血糖として知られている状態が脱力感、衰弱、頭痛、混乱および人格変化のような症状を伴って生じる。過度の血中グルコースまたは高血糖は、細胞、組織および臓器中の過剰のグルコースとタンパク質の化学反応により組織損傷を引き起こし得る。この損傷は、失明、腎不全、性的不全、アテローム性動脈硬化症および感染に対する脆弱性の増加の糖尿病性合併症を引き起こすと考えられている。
【０００５】
糖尿病は連続的な病理学的に高い血中グルコース濃度と関連する；それは米国の死の主な原因の１つであり、すべての死亡の約５％に関与する。糖尿病は２つの主なサブクラス：若年性糖尿病またはインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られているＩ型および成人発症型糖尿病または非インスリン依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られているＩＩ型に分類される。
【０００６】
ＩＩ型糖尿病の診断は症状の評価ならびに尿および血液中のグルコースの測定を含む。血中グルコース濃度決定は正確な診断のために必要である。さらに特に、空腹時の血中グルコース濃度決定は使用される標準手段である。しかしながら、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）は、絶食時の血中グルコース濃度よりもさらに高感度であると考えられている。ＩＩ型糖尿病は異常な経口耐糖能（ＯＧＴ）と関連する。したがって、一般的に糖尿病の診断のために必須ではないが、ＯＧＴＴはＩＩ型糖尿病の診断における助けとできる（Emancipator K, Am J Clin Pathol 1997 November ;112(5):665 74; 2 Diabetes Mellitus, Decision Resources Inc., March 2000）。
【０００７】
したがって、耐糖能異常は、ＩＩ型糖尿病の診断のために必要とされる量未満の空腹時の血中グルコース濃度を有するが、ＯＧＴＴ中に正常者と糖尿病患者間の血漿グルコース応答を有する個体において診断される。耐糖能異常は前糖尿病患者状態と考えられ、耐糖能異常（ＯＧＴＴにより定義される）はＩＩ型糖尿病の発症に関する強力な予測因子である（Haffner S M, Diabet Med 1997 August ; 14 Suppl 3:S12 8）。
【０００８】
ＩＩ型糖尿病は、血漿グルコース濃度の増加によって悪化する、膵臓機能の低下および／または他のインスリン関連プロセスと関連する進行性疾患である。したがって、ＩＩ型糖尿病は、通常、長期の前糖尿病相を有し、種々の病態生理学的メカニズムは、前糖尿病状態において、病的な高血糖および耐糖能異常、例えば、グルコース利用および有効性、インスリン作用および／またはインスリン生産における異常を引き起こし得る（Goldberg R B, Med Clin North Am 1998 July ;82(4):805 21）。
【０００９】
耐糖能障害と関連する前糖尿病状態は、また、腹部肥満、インスリン抵抗性、脂質異常症および高血圧に対する素因と関連し得る（Groop L, Forsblom C, Lehtovirta M, Am J Hypertens 1997 September ;10(9 Pt 2):172S 180S; Haffner S M, J Diabetes Complications 1997 March-April, 11(2):69 76; Beck-Nielsen H, Henriksen J E, Alford F, Hother-Nielson O, Diabet Med 1996 September ;13 (9 Suppl 6):S78 84）。
【００１０】
病的な高血糖または耐糖能異常の減少に焦点を合わせるＩＩ型糖尿病を発症する危険性を有する個体への早期介入は、ＩＩ型糖尿病および関連合併症への進行を予防または遅延させ得る。したがって、異常経口耐糖能および／または血中グルコース濃度の上昇を有効に処置することにより、ＩＩ型糖尿病への障害の進行を予防または抑制することができる。例えば、米国特許第７，１０９，１７４号、参照。
【００１１】
インスリンおよびスルホニルウレア（経口低血糖治療剤）は、今日、米国にて処方されている糖尿病薬剤の２つの主な種類である。インスリンは、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の両方に対して処方されているが、スルホニルウレアは、通常、ＩＩ型糖尿病のみに処方されている。スルホニルウレアは天然インスリン分泌を刺激し、インスリン抵抗性を低下させる；これらの化合物は代謝におけるインスリンの機能をもとに戻さない。スルホニルウレアを受ける約１／３の患者がそれに耐性になる。ＩＩ型糖尿病患者の中にはスルホニルウレア治療に応答しない者がいる。スルホニルウレアの最初の処置に応答する患者の５−１０％が、約１０年後に、スルホニルウレア有効性の喪失を経験する可能性がある。例えば、米国特許第７，１１５，２８４号、参照。
【００１２】
ＩＩ型糖尿病の処置のために一般的に処方されている多数の抗糖尿病剤、例えば、スルホニルウレアおよびチアゾリジンジオンは、体重増加の望ましくない副作用を有する。前糖尿病状態を有するか、または診断されたＩＩ型糖尿病を有する患者における体重増加は、代謝および内分泌腺調節異常の強調による悪影響を引き起こし、そして肥満それ自体はＩＩ型糖尿病の発症および進行性の悪化に対する極めて重要な危険因子である。したがって、体重を維持するか、または減らす抗糖尿病薬剤を使用することが望ましい。例えば、米国特許第７，１９９，１７４号、参照。
【００１３】
糖尿病、心臓疾患、卒中、高血圧およびいくつかの型の癌を含む多くの深刻な状態に関する個体の危険性を増加させるため、肥満は一般的かつ非常に深刻な公衆の健康状態問題である。２０年にわたる肥満個体のかなりの数の増加が、多大な公衆の健康意識を引き起こした。ダイエットおよびエクササイズによる肥満の減少が関連危険因子を劇的に減少させることが試験により証明されたが、肥満が食欲の増加、高カロリー食に対する好み、身体活性の減少および脂質合成代謝の増加に寄与する遺伝的に受け継がれる因子と強く関連することを考慮すると、これらの処置は広く成功していない。例えば、米国特許第７，１１５，７６７号、参照。
【００１４】
ＩＩＩ．レット症候群
１９６６年にＤｒ．Ａｎｄｒｅａｓ Ｒｅｔｔにより最初に同定されたレット症候群（ＲＴＴ）は、遅発神経発達障害から生じる深刻なＣＮＳ障害である。それは、もっぱら、１／１０，０００−１５，０００の生児出生の割合ですべての民族の女児を冒す。ＲＴＴを有するいくつかの個体は若年で死亡する；しかしながら、多数は成人になることができ、深刻な障害を受ける。患者の２５％までが心／呼吸不全で死亡する。今までのところ該疾患に対する有効な処置はない。
【００１５】
見かけ上正常発達期間後、罹患している女児は６−１８月齢にてＲＴＴ症状を発症し、今後数年にわたって進行的に悪化する。症状は、出生時は正常の頭囲、次に頭部成長の減速；後天的言語障害、コミュニケーション機能障害、認識機能障害；意図的な手の動きから型通りの手の動き（曲がりくねった手のもみ合わせ、手を洗う、拍手、軽くたたくなど）への変化；運動障害または悪化（歩行失調、硬直など）；起きている間の呼吸困難；早期乳児期からの睡眠パターン障害；筋肉疲労および筋失調症を伴う異常筋緊張；末梢血管運動神経障害；進行性側弯症または後弯症；および成長遅延を含む。
【００１６】
該障害は、また、中枢自律神経機能障害により特徴付けられ、Ｒｅｔｔ患者は以下の症状のいくつか、またはすべてを示す：呼吸停止、浅呼吸、過呼吸、遷延性無呼吸期間からなる多発性呼吸律動不整；ベースラインの心臓の迷走神経緊張の減少による心不整脈；および圧反射心臓感受性。これらの症状は致命的であり、Ｒｅｔｔ患者に突然死の危険性を与える。それらの患者は、脳幹未成熟ならびに心肺ネットワーク内の、および起きている間の視床下部または辺縁皮質からの統合的阻害の欠如を示す。さらに、脳幹ニューロトロフィンシグナル伝達（ＮＧＦおよびＢＤＮＦ）の変化がＲｅｔｔ患者において報告され、モノアミン（セロトニン、ノルエピネフリン）および神経ペプチド（サブスタンスＰ）レベルが減少する。
【００１７】
ＲＴＴは、大半の場合において、転写リプレッサーＭｅＣＰ２（メチルＣｐＧシトシン結合タンパク質２）をコードするＸ染色体関連遺伝子ｍｅｃｐ２における変異により引き起こされる単一遺伝子疾患である。ＭｅＣＰ２は優先的にメチル化ＤＮＡに結合する。
【００１８】
ニューロトロフィン因子ＢＤＮＦはＭｅＣＰ２の既知の直接標的であり、そしてノルエピネフリンおよびセロトニン神経に対する重要な栄養因子である。驚くべきことに、Ｍｅｃｐ２−ＫＯマウスは脳ＢＤＮＦが不足しており、脳ＢＤＮＦの遺伝子過剰発現が寿命を延長させ、いくつかの運動障害から救うことができる。ヒトにおいて同定されているＢＤＮＦ機能不全は、レット症候群、ウィルムス腫瘍、無虹彩、尿生殖器異常および知的障害（ＷＡＧＲ）症候群（Han, et al., N Engl J Med (2008) 359(9):918-27）、メラノコルチン受容体ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満（Farooqi and O'Rahilly, Endocrine Rev (2006) 27(7):710-18）、悪液質／筋肉消耗性症候群（Lin, et al., PloS, 3(4):e1900; WO 2007/088476）を含む。
【発明の概要】
【００１９】
発明の概要
１つの局面において、本発明はチロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に結合する抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は：
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｖ（Ｔ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｎ）ＷＦＡＹ（配列番号：３４）を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域はアミノ酸配列（Ｓ／Ｍ）ＱＧＴ（Ｈ／Ａ）（Ｅ／Ｖ／Ｉ）ＰＹＴ（配列番号：４２）を含み；そして
該抗体はＴｒｋＢアゴニストである。
【００２０】
他の局面において、本発明はＴｒｋＢに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む；
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号：２５のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号：３２および配列番号：３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号：３５、配列番号：３６および配列番号：３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号：３９のアミノ酸配列を含み；
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号：４０および配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
抗体の態様に関して、いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントは配列番号：１６と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、そして軽鎖Ｖセグメントは配列番号：２４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【００２２】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントは配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、そして軽鎖Ｖセグメントは配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【００２３】
いくつかの態様において、重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２および配列番号：３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４０および配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、重鎖ＦＲ４はヒト生殖細胞のＦＲ４である。いくつかの態様において、重鎖ＦＲ４は配列番号：５０である。いくつかの態様において、重鎖Ｊセグメントはヒト生殖細胞のＪＨ４部分配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、軽鎖ＦＲ４はヒト生殖細胞のＦＲ４である。いくつかの態様において、軽鎖ＦＲ４はヒト生殖細胞のＪｋ２部分配列ＦＧＱＧＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）である。
【００２６】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントはそれぞれ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み；
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２７のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３１のアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３８のアミノ酸配列を含み；そして
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３９のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３５を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４１を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３６を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４０を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３７を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４０を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：２９を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３５を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４１を含む。
【００３１】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：４の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域は配列番号：１１の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３２】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３３】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３４】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、そして軽鎖可変領域は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、抗体は５×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）にてＴｒｋＢに結合する。
【００３６】
いくつかの態様において、抗体はＦＡｂ’フラグメントである。いくつかの態様において、抗体はＩｇＧである。いくつかの態様において、抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの態様において、抗体はヒト定常領域を含む。
【００３７】
いくつかの態様において、抗体はチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する。
【００３８】
いくつかの態様において、抗体は配列番号：１を含む重鎖および配列番号：８を含む軽鎖を含む。
【００３９】
いくつかの態様において、抗体は配列番号：１を含む重鎖および配列番号：９を含む軽鎖を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、抗体は配列番号：１を含む重鎖および配列番号：１０を含む軽鎖を含む。
【００４１】
いくつかの態様において、抗体は配列番号：３を含む重鎖および配列番号：８を含む軽鎖を含む。
【００４２】
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体および生理学的に適合性のある賦形剤を含む薬学的に許容される組成物を提供する。薬学的に許容される組成物の態様は抗体に関して上記のとおりである。
【００４３】
いくつかの態様において、医薬組成物は、呼吸窮迫の減少または阻害において使用するための薬剤、例えば、ノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の活性化因子をさらに含む。第２の薬剤は三環式抗鬱剤、例えば、デシプラミン（ＤＭＩ）であり得る。いくつかの態様において、第２の薬剤はセロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、例えば、ブスピロン、フルオキセチンおよびレボキセチンである。いくつかの態様において、第２の薬剤はグルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子、例えば、アンパカインＣＸ５４である。いくつかの態様において、第２の薬剤はプロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）である。
【００４４】
いくつかの態様において、医薬組成物は個体における血中グルコース濃度を減少させる薬剤をさらに含む。いくつかの態様において、医薬組成物は個体における体重を減少させる薬剤をさらに含む。
【００４５】
関連局面において、本発明は、本発明の抗体を個体に投与することにより、必要とする個体におけるＢＤＮＦ機能不全による障害を処置、減少、阻害、改善および／または予防する方法を提供する。処置の方法の態様は抗体に関する上記および本明細書のとおりである。いくつかの態様において、抗体は全身的にまたは局所的に、例えば、経口的に、吸入的に、静脈内に、または腹腔内に投与される。いくつかの態様において、ＢＤＮＦ機能不全による障害は、レット症候群、ＷＡＧＲ症候群、ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満および悪液質（例えば、癌、加齢、摂食障害またはオピオイドを含む薬物誘発性嘔吐による）からなる群から選択される。
【００４６】
さらなる局面において、本発明は、必要とする個体における血中グルコース濃度および／または体重を減少させる方法であって、治療有効量の本発明の抗体を個体に投与することを含む方法を提供する。処置の方法の態様は抗体に関する上記および本明細書のとおりである。方法のさらなる態様に関して、いくつかの態様において、個体は前糖尿病である。いくつかの態様において、個体はＩ型糖尿病を有する。いくつかの態様において、個体はＩＩ型糖尿病を有する。いくつかの態様において、個体は過体重である。いくつかの態様において、個体は肥満である。
【００４７】
いくつかの態様において、方法は治療有効量の血中グルコースの減少に有効な第２の薬剤を個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、第２の薬剤はインスリン、スルホニルウレア、インスリン分泌促進剤、メトホルミン、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲδアゴニスト、ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、ＰＰＡＲα／γ／δパンアゴニスト、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの態様において、方法は治療有効量の体重または肥満の減少に有効な第２の薬剤を個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、第２の薬剤はリパーゼ阻害剤、シブトラミン、ＣＢ−１阻害剤、トピラメート、アミリン、アミリン類似体、レプチン、ＰＹＹ／ＰＹＹ類似体およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体からなる群から選択される。
【００４９】
いくつかの態様において、第２の薬剤および抗体は混合物として投与される。いくつかの態様において、第２の薬剤および抗体は別々に投与される。
【００５０】
定義
“抗体”は、非共有的に、可逆的に、特定の方法において対応する抗原に結合することができる、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドまたは免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを意味する。典型的な抗体構造単位はテトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、それぞれの対がジスルフィド結合を介して結合している１つの“軽鎖”（約２５ｋＤ）および１つの“重鎖”（約５０−７０ｋＤ）を有する。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに多種多様な免疫グロブリンの可変領域遺伝子を含む。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、これらは順に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定める。それぞれの鎖のＮ−末端は、主に抗原認識に関与する約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）なる用語は、それぞれ軽鎖および重鎖のこれらの領域を意味する。本出願において使用されるとき、“抗体”は、例えば、ＴｒｋＢに特異的な特定の結合を有する、すべての抗体の変異体およびそれらのフラグメントを含む。したがって、同じ結合特異性を有する、全長抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびこれらのフラグメントの多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）は、この概念の範囲内である。
【００５１】
“相補性決定ドメイン”または“相補性決定領域”（“ＣＤＲ”）は、互換的に、ＶＬおよびＶＨの超可変領域を意味する。ＣＤＲは、このような標的タンパク質に対して特異性を有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。それぞれのヒトＶＬまたはＶＨに３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１−３、Ｎ−末端から連続して数える）が存在し、可変ドメインの約１５−２０％を構成する。ＣＤＲは標的タンパク質のエピトープと構造的に相補的であり、したがって結合特異性に直接関与する。ＶＬまたはＶＨの残りの範囲、いわゆるフレームワーク領域は、より少ないアミノ酸配列を示す（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
【００５２】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当分野で既知の種々の定義を使用して決定される、例えば、Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTicsデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブ上のimgt.cines.fr/）およびＡｂＭ（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)、参照）。抗原結合部位の定義も、以下に記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000);およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996);およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991);およびRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
【００５３】
“結合特異性決定基”または“ＢＳＤ”なる用語は、互換的に、抗体の結合特異性を決定するために必要な相補性決定領域内の最小の連続する、または連続しないアミノ酸配列を意味する。最小の結合特異性決定基は１つ以上のＣＤＲ配列内に存在し得る。いくつかの態様において、最小の結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３配列の一部または全長内（すなわち、これにより単に決定される）に存在する。
【００５４】
本明細書において使用される“抗体軽鎖”または“抗体重鎖”は、それぞれ、ＶＬまたはＶＨを含むポリペプチドを意味する。内因性ＶＬは遺伝子セグメントＶ（可変）およびＪ（接合部）によって、そして内因性ＶＨはＶ、Ｄ（多様性）およびＪによってコードされる。ＶＬまたはＶＨのそれぞれはＣＤＲならびにフレームワーク領域を含む。本出願において、抗体軽鎖および／または抗体重鎖は、ときどき、“抗体鎖”として集合的に称され得る。これらの用語は、当業者が容易に認識することができるとき、ＶＬまたはＶＨの基本構造を壊さない変異を含む抗体鎖を含む。
【００５５】
抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により生じる多くのよく特徴付けられているフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合を消化して、それ自体ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合している軽鎖であるＦａｂ’のダイマーであるＦ（ａｂ）’２を生産する。Ｆ（ａｂ）’２を、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊するために穏やかな条件下で還元すると、Ｆ（ａｂ）’２ダイマーからＦａｂ’モノマーに変換され得る。Ｆａｂ’モノマーは本質的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂである。Fundamental Immunology 3d ed. (1993)、参照。種々の抗体フラグメントが無傷の抗体の消化なる用語において定義されるが、当業者は、このようなフラグメントが化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論を使用することによりデノボ合成され得ることを理解している。したがって、本明細書において使用される“抗体”なる用語は、また、完全な抗体の変異により生産される抗体フラグメント、または、組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ合成されるもの（例えば、一本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定されるもの（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)、参照）のいずれかを含む。
【００５６】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、当分野で既知の全ての技術を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985、参照）。一本鎖抗体の生産のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産するために適用することができる。また、遺伝子組換えマウスまたは他の生物、例えば、他の哺乳動物が、ヒト化抗体を発現させるために使用され得る。あるいは、ファージディスプレイ技術は、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種Ｆａｂフラグメントを同定するために使用することができる（例えば、McCafferty et al., 上記；Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)、参照）。
【００５７】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化するための方法は当分野で既知である。一般的に、ヒト化抗体は、それに非ヒトである源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、インポート残基として称され、これは一般的にインポート可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓの方法（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、参照）にしたがって本質的に実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に無傷のヒト可変ドメイン未満が非ヒト種由来の対応する配列により置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、いくつかの相補性決定領域（“ＣＤＲ”）残基および恐らくいくつかのフレームワーク（“ＦＲ”）残基が齧歯動物抗体の類似部位由来の残基により置換されている、一般的にヒト抗体である。
【００５８】
“キメラ抗体”は、（ａ）定常領域またはその一部が改変、置換または交換されて、抗原結合部位（可変領域）が異なる、または改変されたクラスの定常領域、エフェクター機能および／または種、または、キメラ抗体に新規特性を与える完全に異なる分子、例えば、酵素、トキシン、ホルモン、成長因子および薬物に結合するようになっている；または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なる、または改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換または交換されている、抗体分子である。
【００５９】
“可変領域”または“Ｖ領域”なる用語は、互換的にＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む重鎖または軽鎖を意味する。図１、参照。内因性可変領域は、免疫グロブリン重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子または軽鎖Ｖ−Ｊ遺伝子によってコードされる。Ｖ領域は天然、組換えまたは合成であり得る。
【００６０】
本明細書において使用される“可変セグメント”または“Ｖセグメント”なる用語は、互換的にＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を含む可変領域の部分配列を意味する。図１、参照。内因性Ｖセグメントは、免疫グロブリンＶ遺伝子によってコードされる。Ｖセグメントは天然、組換えまたは合成であり得る。
【００６１】
本明細書において使用される“Ｊセグメント”なる用語は、ＣＤＲ３のＣ末端部分およびＦＲ４を含む可変領域の部分配列を意味する。内因性Ｊセグメントは、免疫グロブリンＪ遺伝子によってコードされる。図１、参照。Ｊセグメントは天然、組換えまたは合成であり得る。
【００６２】
“ヒト化”抗体は、ヒトにおける免疫原性が低いが、非ヒト抗体の反応性を維持している抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を維持し、抗体の残りの部分をそれらのヒトのカウンターパートで置き換えることにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)、参照。
【００６３】
“対応するヒト生殖細胞配列”なる用語は、ヒト生殖細胞の免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる他のすべての評価された可変領域のアミノ酸配列と比較して、参照可変領域のアミノ酸配列または部分配列に対して決定されたもっとも高いアミノ酸配列同一性を共有する、ヒト可変領域のアミノ酸配列または部分配列をコードする核酸配列を意味する。対応するヒト生殖細胞配列は、他のすべての評価された可変領域のアミノ酸配列と比較して、参照可変領域のアミノ酸配列または部分配列に対してもっとも高いアミノ酸配列同一性を有する、ヒト可変領域のアミノ酸配列または部分配列を意味することもできる。対応するヒト生殖細胞配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワークおよび相補性決定領域、可変セグメント（上記定義のとおり）または可変領域を含む配列もしくは部分配列の他の組合せであり得る。配列同一性は、本明細書に記載されている方法を使用して、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたは他の当分野で既知のアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列をアラインして決定することができる。対応するヒト生殖細胞の核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域の核酸またはアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％の配列同一性を有し得る。対応するヒト生殖細胞配列は、例えば、一般に利用することができる国際的なImMunoGeneTicsデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブ上のimgt.cines.fr/）およびＶ−ｂａｓｅ（ワールドワイドウェブ上のvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk）を介して決定することができる。
【００６４】
抗原、例えば、タンパク質と抗体または抗体由来結合剤間の相互作用の記載の関連において使用されるとき、“特異的に（または選択的に）結合”なるフレーズは、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中で抗原の存在の決定要因となる結合反応を意味する。したがって、示される免疫アッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、特定の抗原にバックグランドに対して少なくとも２倍結合し、サンプル中に存在する多量の他の抗原に実質的に結合しない。このような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性に対して選択された抗体または薬剤を必要とし得る。この選択は、例えば、他の種（例えば、マウス）由来のＴｒｋＢ分子または他のＴｒｋサブタイプ（例えば、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣなど）と交差反応する抗体を除くことにより達成され得る。種々の免疫アッセイフォーマットが、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために日常的に使用される（特異的免疫反応性を測定するために使用することができる免疫アッセイフォーマットおよび条件の記載について、例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual(1998)、参照）。一般的に特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルに対して少なくとも２倍、さらに一般的にはバックグラウンドに対して少なくとも１０から１００倍以上のシグナルを生じる。
【００６５】
“平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）”なる用語は、結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で割られた解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を意味する。平衡解離定数は当分野で既知の何らかの方法を使用して測定することができる。本発明の抗体は、一般的に約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、いくつかの態様において、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有する。
【００６６】
本明細書において使用される“抗原結合領域”なる用語は、本発明のＴｒｋＢ結合分子のドメインを意味し、これは該分子とＴｒｋＢの特異的結合に関与する。抗原結合領域は少なくとも１つの抗体重鎖可変領域および少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域を含む。少なくとも１つのこのような抗原結合領域は本発明のそれぞれのＴｒｋＢ結合分子に存在し、そしてそれぞれの抗原結合領域は他のものと同一であっても、異なっていてもよい。いくつかの態様において、本発明のＴｒｋＢ結合分子の少なくとも１つの抗原結合領域はＴｒｋＢアゴニストとして作用する。
【００６７】
“抗体アゴニスト”または“アゴニスト”なる用語は、互換的に、受容体を活性化し、全てのまたは部分的な（例えば、少なくとも６０％）受容体介在応答を誘導することができる抗体を意味する。例えば、ＴｒｋＢのアゴニストはＴｒｋＢに結合し、ＴｒｋＢ介在シグナル伝達を誘導する。いくつかの態様において、ＴｒｋＢ抗体アゴニストは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と接触したとき、ＴｒｋＢに結合し、神経突起伸長を誘導する能力により、またはそうでなければ本明細書に記載されているように同定することができる。他の態様において、ＴｒｋＢ抗体アゴニストは、本明細書に記載されているアノイキスアッセイにおいて測定される分離−依存アポトーシスから細胞を救出することができる能力により同定することができる。本明細書に記載されているアノイキスアッセイにおいて５ｎＭ未満、例えば、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは３０ｐＭ未満のＥＣ５０を有する抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢ抗体アゴニストと考えられる。
【００６８】
“ＴｒｋＢ”または“チロシン受容体キナーゼＢ”なる用語は、互換的に、受容体チロシンキナーゼの３つのトロポミオシン−関連キナーゼ（Ｔｒｋ）ファミリーメンバーの１つを意味し、他のメンバーがＴｒｋＡおよびＴｒｋＣである。ＴｒｋＢは、神経栄養チロシン受容体キナーゼ（ＮＴＲＫ）ファミリーのメンバーであり、神経栄養チロシンキナーゼ２型受容体（ＮＴＲＫ２）としても既知である。ＴｒｋＢは、ニューロトロフィンと結合すると、それ自体およびＭＡＰＫ経路のメンバーをリン酸化する膜結合受容体である。ＴｒｋＢに対するリガンドは脳−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびニューロトロフィン−３を含む。例えば、Haniu, et al., Arch Biochem Biophys (1995) 322(1):256-264; Squinto, et al., Cell (1991) 65(5) 885-893;およびSoppet, et al., Cell (1991) 65(5) 895-903、参照。ＴｒｋＢを介するシグナル伝達は細胞分化を引き起こす。この遺伝子の変異は肥満および気分障害と関連している。ＴｒｋＢの異なるアイソフォームをコードする選択的転写スプライス変異が存在する。ＴｒｋＢの核酸およびアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 ＮＭ＿００１０１８０６４（ｇｉ：６５５０６７４４、ＰＲＩ １８−ＮＯＶ−２００７）の下に公開されている。ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 ＢＣ０７５８０４．１、Ｕ１２１４０．１、ＢＣ０３１８３５．１およびＡＦ４１０８９９．１も参照。本明細書において使用されるＴｒｋＢポリペプチドは、ＢＤＮＦまたはニューロトロフィン−３の結合により活性化され、それ自身およびＭＡＰＫ経路のメンバーをリン酸化することにより細胞内シグナル伝達を引き起こす、機能的にチロシンキナーゼ受容体である。構造的に、ＴｒｋＢアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿００１０１８０７４．１、ＡＡＢ３３１０９、ＡＡＬ６７９６８、ＡＡＬ６７９６４、ＡＡＣ５１３７１．１、ＡＡＨ３１８３５．１またはＡＡＬ６７９６５．１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。構造的に、ＴｒｋＢ核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 ＮＭ＿００１０１８０６４、Ｓ７６４７３、ＢＣ０７５８０４．１、Ｕ１２１４０．１、ＢＣ０３１８３５．１またはＡＦ４１０８９９．１の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
【００６９】
本発明のポリペプチドの“活性”は、天然細胞または組織におけるポリペプチドの構造、調節または生化学機能を意味する。ポリペプチドの活性の例は直接的活性および間接的活性の両方を含む。典型的な直接的活性は、リガンド結合、例えば、ＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（例えば、Naylor et al., Biochem Biophys Res Commun. 291(3):501-7 (2002)、参照）へのＢＤＮＦの結合、セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧまたはＣａ２＋）の生産または減少、イオン流出およびリン酸化または転写レベルの変化を含む、ポリペプチドとの直接的相互作用の結果である。ＴｒｋＢの内容における典型的な間接的活性は、ポリペプチドと他の細胞または組織成分との相互作用の結果として、ポリペプチドの指定された活性に対する細胞もしくは組織における表現型または応答の変化、例えば、全血中グルコース濃度の減少として観察される。
【００７０】
成人に対して使用されるとき、“肥満”なる用語は、３０以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する個体を意味する。成人に対して使用されるとき、“過体重”は、２５以上のＢＭＩを有する個体を意味する。子供において、年齢に対する肥満度指数のグラフを使用して、８５ｔｈ以上のＢＭＩパーセンタイルを“過体重”と考え、９５ｔｈ以上のＢＭＩパーセンタイルを“肥満”と考える。例えば、Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adult (National Heart, Lung and Blood Institute, June 17, 1998)およびPreventing and Managing the Global Epidemic of Obesity in Report of the World Health Organization Consultation of Obesity (WHO, Geneva, June 1997)、参照。
【００７１】
“前糖尿病個体”は、空腹時の血液グルコース濃度が１１０ｍｇ／ｄｌを超えるが１２６ｍｇ／ｄｌ未満であるか、または２時間ＰＧ記録が１４０ｍｇ／ｄｌを超えるが２００ｍｇ／ｄｌ未満である成人を意味する。患者由来サンプルと比較するために使用されるとき、“糖尿病患者個体”は、空腹時の血液グルコース濃度１２６ｍｇ／ｄｌを超える、または２時間ＰＧ記録が２００ｍｇ／ｄｌを超える成人を意味する。“空腹時”は、少なくとも８時間カロリー摂取していないことを意味する。“２時間ＰＧ”は、水に溶解した７５ｇの無水グルコースの当量を含むグルコース負荷後の患者の血液グルコース濃度を意味する。全体的試験は、一般的に経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）と称される。例えば、Diabets Care, 2003, 26(11): 3160-3167 (2003)、参照。
【００７２】
核酸またはタンパク質に適用するとき、“単離された”なる用語は、核酸またはタンパク質が天然状態で関連している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。それは好ましくは均質状態である。それは乾燥状態または水溶液のいずれであってもよい。純度および均質性は、一般的に分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製物に存在する優勢な種類のタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子の側面に位置しており、そして興味ある遺伝子以外のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームと分離される。“精製された”なる用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルで実質的に１本のバンドを生じることを意味する。特に、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋、さらに好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００７３】
“核酸”または“ポリヌクレオチド”なる用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを意味する。具体的に限定されていない限り、該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。他に記載のない限り、特定の核酸配列は、また、明示しなくても保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列ならびに明白に示された配列を包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を製造することにより達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【００７４】
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”なる用語は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。該用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模擬物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００７５】
“アミノ酸”なる用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬物を意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされているもの、ならびに、後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は天然アミノ酸と同様の基本的な化学構造を有する化合物を意味し、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合しているα炭素を有する。このような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を維持している。アミノ酸模擬体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を意味する。
【００７６】
“保存的に改変された変異体”はアミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、または核酸がアミノ酸配列をコードしていないとき、本質的に同一の配列を意味する。遺伝子コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が任意のあるタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードするポリペプチドを変化させることなく、記載の対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸変異体は保存的に改変された変異体の１種である“サイレント変異体”である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、また、核酸の全ての可能なサイレント変異体を意味する。当業者は、核酸のそれぞれのコドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および、通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を得るために改変できることを理解している。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異体は、それぞれの記載されている配列に暗に含まれる。
【００７７】
アミノ酸配列について、当業者は、コードされた配列中の１つのアミノ酸または数パーセントのアミノ酸を変化、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が“保存的に改変された変異体”である（該変化は化学的に同様のアミノ酸でアミノ酸の置換をもたらす）ことを理解している。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換目録は当分野で既知である。このような保存的に改変された変異体は、多型変異体、種間相同体および本発明の対立遺伝子に加えられ、除外されない。
【００７８】
下記８個のグループはそれぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)、参照）。
【００７９】
“配列同一性パーセント”は、比較ウィンドウにわたる２つの最適アライン配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列（例えば、本発明のポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で存在する位置の数を決定し、マッチしている位置の数を得、マッチしている位置の数を比較ウィンドウの位置の全数で割り、配列同一性パーセントを得るためにその結果に１００を掛けることにより計算される。
【００８０】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、“同一”または“同一性”パーセントなる用語は、同じ配列である２つ以上の配列または部分配列についていう。２つの配列が、比較ウィンドウまたは下記配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査により測定するとき指定された領域にわたり比較し、そして最大対応のために整列させたとき、特定のパーセントの同じ（すなわち、参照配列の特定の領域、または記載のないとき全体の配列にわたり、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するとき、２つの配列は“実質的に同一”である。本発明は、本明細書において例示されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１−１１のいずれかの例示された可変領域；配列番号：１２−２４のいずれかの例示された可変セグメント；配列番号：２５−４２のいずれかの例示されたＣＤＲ；配列番号：４３−６１のいずれかの例示されたＦＲ；および配列番号；６２−７３のいずれかの例示された核酸配列）と実質的に同一であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する。所望により、同一性は少なくとも約１５、２５または５０のヌクレオチド長、さらに好ましくは１００から５００または１０００以上のヌクレオチド長である領域、または参照配列の全長で存在することができる。アミノ酸配列に対して、同一または実質的同一は、少なくとも５、１０、１５または２０のアミノ酸長、所望により少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００のアミノ酸長、所望により少なくとも約１５０、２００または２５０のアミノ酸長である領域、または参照配列の全長で存在することができる。より短いアミノ酸配列、例えば、２０以下のアミノ酸に対して、実質的同一は、１または２のアミノ酸残基が本明細書に定義されている保存的置換にしたがって保存的に置換されているとき、存在する。
【００８１】
配列比較のために、一般的に１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用できるか、または代わりのパラメーターを示すことができる。次に配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して試験配列に対する配列同一性パーセントを計算する。
【００８２】
本明細書において使用される“比較ウィンドウ”は、２つの配列を最適に整列化した後、１つの配列を同数の連続位置の参照配列と比較し得る、２０から６００、通常、約５０から約２００、さらに通常、約１００から約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれかのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当分野で既知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューターでの手段（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)、参照）により行うことができる。
【００８３】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために適当であるアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはAltschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に入手できる。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化したとき、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするか、または満足させるいずれかである、検索配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高いスコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（Altschul et al., 上記参照）と呼ばれる。これらの最初の近隣ワードヒットが、それらを含有するより長いＨＳＰの検索を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、核酸配列について、パラメーターＭ（マッチする残基のペアに対するリワードスコア（reward score）；常に＞０）およびＮ（マッチしない残基に対するペナルティースコア（penalty score）；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。それぞれの方向でのワードのヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその到達した最大値から数量Ｘまで低下したとき；累積スコアが１つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの累積によってゼロもしくはそれ以下になったとき；または、いずれかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（核酸配列に対して）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、および期待値（Ｅ）１０を使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックス（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915、参照）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００８４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的分析も実施する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの基準は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の２つのマッチが偶然に起こるであろう確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、より好ましくは約０．００１未満であるとき、核酸は参照配列と類似であると考えられる。
【００８５】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である目安は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが以下に記載されているとおり第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみにより異なるとき、一般的に第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の目安は、２つの分子またはそれらの相補体が以下に記載されているとおりストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに他の目安は、配列を増幅するために同じプライマーを使用することができることである。
【００８６】
抗原結合領域がどのように本発明のＴｒｋＢ結合分子内に結合しているかの説明の文脈において使用されるとき“結合”なる用語は、領域の物理的結合に関するすべての可能な手段を含む。多数の抗原結合領域は、化学結合、例えば、共有結合（例えば、ペプチド結合またはジスルフィド結合）または非共有結合により頻繁に結合し、それらの結合は直接結合（すなわち、２つの抗原結合領域間をリンカーなしで）または間接結合（すなわち、２つ以上の抗原結合領域間を少なくとも１つのリンカー分子の助けで）のいずれかであり得る。
【００８７】
“対象”、“患者”および“個体”なる用語は、互換的に哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類哺乳動物を意味する。哺乳動物は、また、実験哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターであり得る。いくつかの態様において、哺乳動物は家畜用哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）またはペット用哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）であり得る。
【００８８】
“治療許容量”または“治療有効量”なる用語は、互換的に、所望の結果（すなわち、標的細胞のアポトーシス）をもたらすために十分な量を意味する。いくつかの態様において、治療許容量は望ましくない副作用を誘導しないか、または引き起こさない。治療許容量は、最初に低い用量を投与し、次に所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することにより決定することができる。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体の“予防有効量”および“治療有効量”は、疾患症状（例えば、ＢＤＮＦを含むＴｒｋＢリガンドの機能不全による、異常に低いレベルのＴｒｋＢシグナル伝達と関連する障害の症状）の発症を予防するか、または症状のそれぞれの重症度の低下をもたらすことができる。該用語は、また、疾患症状がない頻度および期間をそれぞれ促進または増加することができる。“予防有効量”および“治療有効量”は、また、ＴｒｋＢの不十分な活性化による障害および疾患による欠陥または不全のそれぞれを予防または改善することができる。
【００８９】
本明細書において使用される“呼吸器疾患”なる用語は、無気肺、嚢胞性線維症、レット症候群（ＲＴＴ）、喘息、無呼吸（例えば、睡眠時無呼吸）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、急性呼吸困難、多呼吸、起座呼吸、リウマチ性肺疾患、肺鬱血または浮腫、慢性閉塞性気道疾患（例えば、気腫、慢性気管支炎、気管支喘息および気管支拡張症）、低換気、ピックウィック症候群、肥満−低換気症候群、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）および高炭酸を含むが、これらに限定されない。さらに“呼吸器疾患”は、また、遺伝子異常に関連する既知のヒトの状態、例えば、シャルコー・マリー・ツース病、チェーン・ストークス呼吸障害、プラダーウィリ症候群、乳幼児突然死症候群、先天性中枢性低換気、びまん性間質性疾患（例えば、サルコイドーシス、塵肺症、過敏性肺炎、細気管支炎、グッドパスチャー症候群、特発性肺線維症、特発性肺ヘモジデリン沈着症、肺胞タンパク症、剥離性間質性肺炎、慢性間質性肺炎、線維化性肺胞炎、ハンマン・リッチ症候群、肺好酸球増多症、びまん性間質性線維症、ウェゲナー肉芽腫、リンパ腫様肉芽腫および脂質性肺炎）または腫瘍（例えば、気管支癌腫、細気管支肺胞癌腫、気管支カルチノイド、過誤腫および間葉性腫瘍）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は抗体のＶ領域を含む構造単位の概略図を説明する。重鎖は３つの遺伝子ファミリー（重鎖−Ｖ、ＤおよびＪ）によってコードされ、そして軽鎖は２つの遺伝子ファミリー（カッパまたはラムダＶおよびＪ）によってコードされる。これらの遺伝子の組換えが無傷のＶ領域で生じる。ＣＤＲ３配列は、重鎖の場合、重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子の組換え部位であり、そして軽鎖の場合、カッパまたはラムダＶおよびＪ遺伝子の組換え部位である。
【００９１】
【図２】図２は参照抗体アミノ酸配列のヒトアミノ酸配列での置換の概略図を説明する。
【００９２】
【図３】図３はＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＦａｂ結合の分析を説明する。これらのカーブの数値データを表１および２に示す。
【００９３】
【図４】図４はＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＩｇＧ結合の分析を説明する。これらのカーブの数値データを表３に示す。
【００９４】
【図５】図５はＦａｂクローンＴＲ１３４−４（配列番号：７６および８０）、ＴＲ１３５−８（配列番号：７６および８１）、ＴＲ１３９−２（配列番号：７６および８２）、ＴＲ１５１−１（配列番号：７７および８２）およびＴＲ１４４−１（配列番号：７８および８１）の整列させた可変領域のアミノ酸配列（ＦＲ１からＣＤＲ３）および生殖細胞Ｖｈ１−０２（配列番号：１５）またはＶｋＩＩ Ａ２３（配列番号：７９）の一番近い一本鎖ヒト可変領域翻訳との比較を説明する。すべてのＦａｂ Ｖｈ−領域のＦＲ４（示していない）はヒト生殖細胞系ＪＨ４由来であり、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を有する。すべてのＦａｂ Ｖｋ−領域のＦＲ４（示していない）はヒト生殖細胞系Ｊｋ２由来であり、配列ＦＧＱＧＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）を有する。ＣＤＲは囲まれており、生殖細胞配列の対応する位置とは異なる残基（ＣＤＲ３“ＢＳＤ”配列を除く）は太字である。ＣＤＲ３への親和性成熟変化は下線部分であり、Ｖｋ ＣＤＲ３における生殖細胞系残基置換はイタリック体部分である。
【００９５】
【図６】図６はＩｇＧクローンＴＲ１２７−２（配列番号：７６）、ＴＲ１４３−３（配列番号：７８）、ＴＲ１５４−２（配列番号：７７）、ＴＲ１１９−１（配列番号：８４）、ＴＲ１２９−１（配列番号：８５）およびＴＲ１３７−１（配列番号：８６）の整列させた可変領域のアミノ酸配列（ＦＲ１からＣＤＲ３）および生殖細胞Ｖｈ１−０２（配列番号：１５）またはＶｋＩＩ Ａ２３（配列番号：８３）の一番近い一本鎖ヒト可変領域翻訳との比較を説明する。すべてのＩｇＧ Ｖｈ−領域のＦＲ４（示していない）はヒト生殖細胞系ＪＨ４由来であり、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を有する。すべてのＩｇＧ Ｖｋ−領域のＦＲ４（示していない）はヒト生殖細胞系Ｊｋ２由来であり、配列ＦＧＱＧＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）を有する。ＣＤＲは囲まれており、生殖細胞配列の対応する位置とは異なる残基（ＣＤＲ３“ＢＳＤ”配列を除く）は太字である。ＣＤＲ３への親和性成熟変化は下線部分であり、Ｖｋ ＣＤＲ３における生殖細胞系残基置換はイタリック体部分である。
【００９６】
【図７】図７は、ＦａｂとヒトＶセグメントとの結合が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＡ１０Ｆ１８．２ ＩｇＧの濃度が増加することによりブロックされることを説明する。
【００９７】
【図８】図８Ａ−ＤはＮＶＰ−ＬＦＤ２５３（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４（Ｂ）、ＮＶＰ ＬＦＣ３２５（Ｃ）またはＮＶＰ−ＬＦＣ３２７（Ｄ）のヒトＦｃ−ＴｒｋＢへの結合を説明する。
【００９８】
【図９】図９Ａ−ＤはＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７のヒトＴｒｋＢ−ＦｃまたはＴｒｋＣ−Ｆｃ融合タンパク質へではなくヒトＴｒｋＢ−Ｆｃ融合タンパク質への特異的結合を示すＥＬＩＳＡアッセイを説明する。２μｇ／ｍｌにて精製されたＩｇＧを３つの異なるＴｒｋファミリーメンバー（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）との相互作用を試験することにより特異性を評価した。二次Ａｂは、ヤギ−抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ検出Ａｂのみでブロックされ、処理される複製物である。
【００９９】
【図１０】図１０Ａ−Ｄはアノイキスアッセイにおいてアゴニスト活性におけるＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７の評価を説明する。精製されたＩｇＧを４８時間、ＲＩＥ−ＴｒｋＢ細胞において評価した。（−）は抗体で処理しなかった細胞である。
【０１００】
【図１１】図１１Ａ−ＤはＩｇＧ抗体ＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７に対する代表的なＢｉａｃｏｒｅキネティックトレース(kinetic trace)を説明する。Ｆｃ−ＴｒｋＢをＢｉａｃｏｒｅチップ表面に固定した。ＩｇＧの連続希釈物をチップ上に３０μＬ／分で流した。使用可能なバッファー中で、結合相を３００秒、次に解離相を１２００秒流した。
【０１０１】
【図１２】図１２は抗ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂでの長期処理がＭｅｃｐ２−Ｂｉｒｄマウスの寿命を延ばすことを説明する。Ｍｅｃｐ２ｔｍ１．１Ｂｉｒｄ ｎｕｌｌマウスは呼吸サイクルの期間の変動の増加、速いおよび遅い呼吸頻度の期間の交代、無呼吸の発生、平均呼吸頻度（および分時換気量）の増加を含むレット症候群を有する対象の多数の核呼吸機能障害を繰り返す。結局は、該マウスは致命的な呼吸不全で死ぬ。抗体Ａ１０は、本明細書に記載されている改良された抗ＴｒｋＢ抗体アゴニストの相補性結合決定基領域（ＣＤＲ）および最小結合決定基を共有する親のマウスモノクローナル抗体を意味する。
【０１０２】
【図１３】図１３は抗ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂで処理されたＭｅｃｐ２−Ｂｉｒｄマウスにおける呼吸機能の改善を説明する。抗ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂでの処理後のＭｅｃｐ２マウスの呼吸パラメーターを全身プレチスモグラフィーにより評価した。未処理Ｍｅｃｐ２マウスは呼吸休止の増加（Ｐｅｎｈ）における年齢依存的な増加を示すが、ｍＡｂ処理動物において減少した。年齢依存的Ｐｅｎｈは、ＲＴＴ患者において表現型模写のバルサルバ法の合併症であったが、気道抵抗性の増加を示した。呼吸頻度の増加および吸気時間の減少がｍＡｂでの処理後の野生型およびＭｅｃｐ２マウスの両方で観察された。＊ｐ＜．０５、＊＊ｐ＜．０１ ｖｓ 同じ遺伝子型、反対の処理；＃ｐ＜．０５、＃＃ｐ＜．０１、＃＃＃ｐ＜．００１ ｖｓ 反対の遺伝子型、同じ処理；＄ｐ＜．０５、＄＄ｐ＜．０１、＄＄＄ｐ＜．００１ ＭｅＣＰ２−ＫＯ／Ａ１０ ｖｓ ＭｅＣＰ２−ＷＴ／ＳＡＬ。一方向ＡＮＯＶＡ、次にステューデントｔ−検定。
【０１０３】
【図１４】図１４はカニクイザルへの食物摂取および体重、次に抗ＴｒｋＢアゴニスト ｍＡｂ ＬＦＩ９８７の静脈内投与の効果を説明する。ＨＣ可変領域をサイレントＩｇＧ１骨格へ移すことにより、抗体クローンＬＦＤ２５３をＬＦＩ９８７に変換した。動物に１、５および８日目に０．３および３．０ｍｇ／ｋｇのＬＦＩ９８７を静脈注射で３回投与した。データは平均±ＳＥ；ｎ＝４−６である。繰り返し測定、次にダネット検定におけるＡｎｏｖａによる＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ベースライン、ＬＦＩ９８７は用量依存的に食物摂取および体重を有意に増加させた。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
詳細な説明
１．イントロダクション
本発明は、改良されたＴｒｋＢ作動性抗体を提供する。本発明の改良されたＴｒｋＢ作動性抗体はＴｒｋＢに特異的に結合し、ＴｒｋＢを活性化する。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体の、ＴｒｋＢアゴニストリガンド機能不全、例えば、ＢＤＮＦ機能不全による障害および疾患の症状の減少、阻害および予防における使用を見出した。本発明の抗ＴｒｋＢ作動性抗体を使用して処置できる典型的な疾患は、レット症候群、ＷＡＧＲ症候群、ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満および悪液質／消耗性症候群（例えば、癌、加齢、摂食障害または薬物による）を含む。また、抗ＴｒｋＢ作動性抗体を、必要とする対象における血中グルコース濃度を減少させるために使用することを見出した。さらに、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体を、体重増加を予防するために使用することを見出した。ＴｒｋＢ活性化が高血糖およびその関連状態、肥満、前糖尿病およびＩＩ型糖尿病を予防するために有用である。
【０１０５】
２．一般的な改良された抗ＴｒｋＢ抗体
本発明の抗体は、トロポミオシン−関連キナーゼ（Ｔｒｋ）受容体チロシンキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する。そうすることで、該抗体は、リガンド結合部位に結合し、天然リガンド（例えば、脳−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）またはニューロトロフィン−３）の結合をブロックし、アンタゴニストとして作用するか、またはアゴニストとして作用し得る。いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体はＴｒｋＢ受容体のアゴニストとして作用する。ＴｒｋＢ抗体アゴニストは、ＴｒｋＢに特異的に結合し、ＴｒｋＢ介在細胞内シグナル伝達を活性化または増加させる抗体である。抗ＴｒｋＢ抗体は所望により本発明の方法にしたがって多量体を形成し、使用することができる。抗ＴｒｋＢ抗体は、全長テトラマー抗体（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖を有する）、一本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）または１つ以上の抗原結合部位を形成し、ＴｒｋＢ−結合特異性を与える抗体フラグメントを含む、例えば、重鎖および軽鎖可変領域（例えば、Ｆａｂ’または他の同様のフラグメント）を含む分子であり得る。
【０１０６】
抗ＴｒｋＢ抗体フラグメントは組換え発現、化学合成および抗体テトラマーの酵素消化を含むが、これらに限定されない当分野で既知のいずれかの方法により生産することができ、全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生産により得ることができる。組換え発現は、当分野で既知のすべての適当な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来し得る。存在するとき、抗ＴｒｋＢ抗体の定常領域は、すべてのタイプまたはサブタイプであり得、適当なとき、本方法により処置される対象の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類または他の哺乳動物、例えば、家畜用哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）、ペット用哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）または齧歯動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ））から選択することができる。
【０１０７】
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体または抗原結合分子は、ラクダ骨格を有する一本鎖ドメイン抗原結合単位も含む。ラクダファミリーの動物は、ラクダ、ラマおよびアルパカを含む。ラクダは軽鎖を欠いている機能抗体を生産する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自発的に折り畳み、抗原結合単位として独立して機能する。その結合表面は、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲのみを含む。ラクダ抗体は慣用の抗体の親和性に相当する結合親和性を達成することができる。本明細書において例示された抗ＴｒｋＢ抗体の結合特異性を有するラクダ骨格ベース抗ＴｒｋＢ分子は、当分野で既知の方法、例えば、Dumoulin et al., Nature Struct. Biol. 11:500-515, 2002; Ghahroudi et al., FEBS Letters 414:521-526, 1997;およびBond et al., J Mol Biol. 332:643-55, 2003を使用して生産することができる。
【０１０８】
本発明の改良された抗ＴｒｋＢ抗体は、参照抗体の特異性および親和性を維持しているが、ヒト生殖細胞Ｖ領域配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するＶ領域配列を有する、加工されたヒト抗体である。米国特許公開第２００５／０２５５５５２号および米国特許公開第２００６／０１３４０９８号、参照（これら両方の文献は出典明示により本明細書に包含させる）。改良の方法は、参照抗体の可変領域から抗原結合特異性を同定するために必要とされる最小の配列情報を同定し、その情報をヒトの部分Ｖ領域遺伝子配列のライブラリーに移し、ヒト抗体Ｖ領域のエピトープ−フォーカストライブラリーを製造する。微生物ベース分泌系は、抗体Ｆａｂフラグメントのようなライブラリーメンバーを発現するために使用することができ、ライブラリーを、例えば、コロニーリフト結合アッセイを使用して、抗原−結合Ｆａｂに関してスクリーニングする。例えば、米国特許公開第２００７／００２０６８５号、参照。陽性クローンは、最も高い親和性を有するクローンを同定するために、さらに特徴付けることができる。得られた加工されたヒトＦａｂは、親である参照抗ＴｒｋＢ抗体の結合特異性を維持し、一般的に親抗体と比較して抗原に対して同等またはそれより高い親和性を有し、ヒト生殖細胞系の抗体Ｖ領域と比較して高い配列同一性であるＶ領域を有する。
【０１０９】
エピトープ−フォーカストライブラリーを製造するために必要とされる最小の結合特異性決定基（ＢＳＤ）は、一般的に、重鎖ＣＤＲ３（“ＣＤＲＨ３”）内の配列および軽鎖ＣＤＲ３（“ＣＤＲＬ３”）内の配列により示される。ＢＳＤはＣＤＲ３の一部または全長を含み得る。ＢＳＤは連続する、または連続しないアミノ酸残基を含み得る。いくつかの場合において、エピトープ−フォーカストライブラリーは、ＢＳＤおよびヒト生殖細胞系Ｊセグメント配列を含む参照抗体からの独特のＣＤＲ３−ＦＲ４領域に連結したヒトＶセグメント配列から構築される（図１および米国特許公開第２００５／０２５５５５２号、参照）。あるいは、ヒトＶセグメントライブラリーは、参照抗体Ｖセグメントの一部のみが最初にヒト配列のライブラリーにより置換される順次カセット置換により製造することができる。次に、残りの参照抗体アミノ酸配列の文脈において、結合をサポートする同定されたヒト“カセット”を、第２のライブラリースクリーンにおいて再結合し、完全なヒトＶセグメントを製造する（米国特許公開第２００６／０１３４０９８号、参照）。
【０１１０】
それぞれの場合において、参照抗体の特異性決定基を含む、対の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３セグメント、ＣＤＲ３−ＦＲ４セグメントまたはＪセグメントは、ライブラリーから得られた抗原結合剤が参照抗体のエピトープ−特異性を維持することができるように、結合特異性を抑制するために使用される。さらなる成熟変化を、最適の結合速度を有する抗体を同定するために、ライブラリー構築中にそれぞれの鎖のＣＤＲ３領域において導入することができる。得られた加工されたヒト抗体は、ヒト生殖細胞系ライブラリー由来のＶセグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内の短いＢＳＤ配列を維持し、ヒト生殖細胞系フレームワーク４（ＦＲ４）領域を有する。
【０１１１】
したがって、いくつかの態様において、抗ＴｒｋＢ抗体は、元の、または参照モノクローナル抗体由来の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３内の最小の結合配列決定基（ＢＳＤ）を含む。重鎖および軽鎖可変領域（ＣＤＲおよびＦＲ）、例えば、ＶセグメントおよびＪセグメントの残りの配列は、対応するヒト生殖細胞および親和性成熟アミノ酸配列に由来する。Ｖセグメントは、ヒトＶセグメントライブラリーから選択することができる。さらなる配列純化は親和性成熟により成し遂げることができる。
【０１１２】
他の態様において、抗ＴｒｋＢ抗体の重鎖および軽鎖は、例えば、ヒトＶセグメントライブラリーから選択される、対応するヒト生殖細胞配列由来のヒトＶセグメント（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）および元のモノクローナル抗体からのＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントを含む。ＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントは、さらに、配列セグメントを対応するヒト生殖細胞配列と置き換えることにより、および／または親和性成熟により純化され得る。例えば、ＢＳＤを取り囲むＦＲ４および／またはＣＤＲ３配列を対応するヒト生殖細胞配列で置き換えることができるが、元のモノクローナル抗体のＣＤＲ３からのＢＳＤは維持されている。
【０１１３】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖細胞配列はＶｈ１−０２である。いくつかの態様において、重鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖細胞配列はＪＨ４である。いくつかの態様において、重鎖Ｊセグメントはヒト生殖細胞ＪＨ４部分配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を含む。ヒト生殖細胞ＪＨ４由来の全長ＪセグメントはＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：７４）である。可変領域遺伝子は、免疫グロブリン可変領域遺伝子に関する標準命名にしたがって命名される。現在の免疫グロブリンの遺伝子情報は、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）、Ｖ−ｂａｓｅおよびＰｕｂＭｅｄデータベースにおけるワールドワイドウェブを介して利用することができる。Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16; Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74; Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54;およびGiudicelli, et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61も参照。
【０１１４】
いくつかの態様において、軽鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖細胞配列はＶＫＩＩ Ａ２３である。いくつかの態様において、軽鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖細胞配列はＪｋ２である。いくつかの態様において、軽鎖Ｊセグメントはヒト生殖細胞Ｊｋ２部分配列ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）を含む。ヒト生殖細胞Ｊｋ２由来の全長ＪセグメントはＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：７５）である。
【０１１５】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントはアミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（Ｇ／Ａ）Ｙ（Ｄ／Ｙ）ＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩ（Ｄ／Ｎ）Ｐ（Ｎ／Ｒ）ＳＧ（Ｇ／Ｄ）Ｔ（Ｎ／Ｒ／Ｓ）Ｙ（Ａ／Ｋ）ＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬ（Ｈ／Ｓ）ＲＬ（Ｒ／Ｔ）ＳＤＤＴＡＶＹＹＣ（Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ｒ）（配列番号：１６）と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、軽鎖Ｖセグメントはアミノ酸配列Ｄ（Ｉ／Ｖ）ＶＭＴＱ（Ｓ／Ｔ）ＰＬＳ（Ｌ／Ｓ）ＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬ（Ｌ／Ｖ）ＨＳ（Ｄ／Ｎ）ＧＮＴＹＬ（Ｎ／Ｓ）Ｗ（Ｌ／Ｙ）ＱＱ（Ｋ／Ｒ／Ｔ）ＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＫＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＡＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ（配列番号：２４）と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
【０１１６】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントは配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
【０１１７】
いくつかの態様において、軽鎖Ｖセグメントは配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２または配列番号：２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
【０１１８】
いくつかの態様において：
ｉ）重鎖ＣＤＲ３はアミノ酸配列モチーフＶ（Ｔ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｎ）ＷＦＡＹ（配列番号：３４）を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３はアミノ酸配列モチーフ（Ｓ／Ｍ）ＱＧＴ（Ｈ／Ａ）（Ｅ／Ｖ／Ｉ）ＰＹＴ（配列番号：４２）を含む。
【０１１９】
いくつかの態様において：
ｉ）重鎖ＣＤＲ３はＶＴＴＷＦＡＹ（配列番号：３２）およびＶＴＳＷＦＡＹ（配列番号：３３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＭＱＧＴＨＥＰＹＴ（配列番号：４０）およびＭＱＧＴＨＶＰＹＴ（配列番号：４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
いくつかの態様において、本発明の抗体はアミノ酸配列（Ａ／Ｇ）Ｙ（Ｄ／Ｙ）ＭＨ（配列番号：２７）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＷＩ（Ｄ／Ｎ）Ｐ（Ｎ／Ｒ）ＳＧ（Ｇ／Ｄ）Ｔ（Ｎ／Ｒ／Ｓ）Ｙ（Ａ／Ｋ）ＱＫＦＱＧ（配列番号：３１）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列Ｖ（Ｔ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｎ）ＷＦＡＹ（配列番号：３４）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【０１２１】
いくつかの態様において、本発明の抗体はアミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬ（Ｌ／Ｖ）ＨＳＮＧＮＴＹＬ（Ｎ／Ｓ）（配列番号：３８）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号：３９）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列（Ｓ／Ｍ）ＱＧＴ（Ｈ／Ａ）（Ｅ／Ｖ／Ｉ）ＰＹＴ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１２２】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＦＲ１；配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＦＲ２；配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＦＲ３；および配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定されたアミノ酸配列は、１つ以上の置換されているアミノ酸（例えば、親和性成熟から）または１つ以上の保存的に置換されているアミノ酸を有し得る。
【０１２３】
いくつかの態様において、軽鎖可変領域は配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＦＲ１；配列番号：５９のアミノ酸配列を含むＦＲ２；配列番号：６０のアミノ酸配列を含むＦＲ３；および配列番号：６１のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定されたアミノ酸配列は１つ以上の置換されているアミノ酸（例えば、親和性成熟から）または１つ以上の保存的に置換されているアミノ酸を有し得る。
【０１２４】
それらの全長にわたって、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体の可変領域は、一般的に対応するヒト生殖細胞の可変領域のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性の全可変領域（例えば、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）アミノ酸配列を有する。例えば、抗ＴｒｋＢ抗体の重鎖は、ヒト生殖細胞の可変領域Ｖｈ１−０２／ＪＨ４と少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を共有することができる。抗ＴｒｋＢ抗体の軽鎖は、ヒト生殖細胞の可変領域ＶＫＩＩ Ａ２３／Ｊｋ２と少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を共有することができる。いくつかの態様において、フレームワーク領域内のアミノ酸のみが付加され、欠失され、または置換されている。いくつかの態様において、配列同一性比較はＣＤ３を除く。
【０１２５】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：４の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および軽鎖配列番号：１１の可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１２６】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および軽鎖配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１２７】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および配列番号：８の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む（すなわち、クローン ＬＦＣ３２５）。
【０１２８】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および配列番号：９の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む（すなわち、クローン ＬＦＣ３２７）。
【０１２９】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および配列番号：１０の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む（すなわち、クローン ＬＦＤ２５３）。
【０１３０】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：３の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および配列番号：８の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む（すなわち、クローン ＬＦＤ２５４）。
【０１３１】
２０未満のアミノ酸長の同定されたアミノ酸配列に関して、所望の特異的結合および／またはアンタゴニスト活性を維持している限り、１または２つの保存的アミノ酸残基置換は許容することができる。
【０１３２】
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、一般的に約１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ未満、例えば、約１０−１０Ｍまたは１０１１Ｍ未満、いくつかの態様において、約１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でＴｒｋＢに結合する。
【０１３３】
３．ＴｒｋＢ作動性抗体を同定するためのアッセイ
作動性抗体は、抗ＴｒｋＢ抗体を製造し、次にそれぞれの抗体をＴｒｋＢ介在事象を引き起こす、例えば、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の分化および／またはデンドリマー化（dendrification）を開始する能力について試験するか、可能性のあるＴｒｋＢアゴニストでの細胞の処理に応答したアノイキス（細胞基質相互作用の喪失によるアポトーシス）からの救出を測定するか、または、ＢａＦ３／ＴｒｋＢ細胞増殖アッセイを使用することにより同定することができる。
【０１３４】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙアッセイは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を平板培養し、細胞をレチノイン酸と、可能性のある作動性抗体および／またはＢＤＮＦの存在下または非存在下で処理し、次に神経突起伸長を測定することを含む。一般的に、レチノイン酸単独は少しの神経突起伸長を誘導する。ＢＤＮＦ単独は有意な神経突起伸長を誘導せず、抗体単独は有意な神経突起伸長を誘導しない。しかしながら、レチノイン酸、ＢＤＮＦおよび抗体で処理された細胞は大規模な神経突起伸長を示す。典型的なＳＨ−ＳＹ５ＹアッセイはKaplan DR, et al., Neuron 11:321-331 (1993)に記載されている。抗ＴｒｋＢ作動性抗体に関するアッセイ試験において、ＢＤＮＦを試験抗体と置き換える。陽性対照細胞をＢＤＮＦに暴露する。
【０１３５】
ＢａＦ３造血細胞／ＴｒｋＢ細胞増殖アッセイは、ＴｒｋＢ受容体アゴニズムにより刺激される細胞の増殖を測定することを含む。例えば、ＢａＦ３細胞をＩＬ−３含有完全ＲＰＭＩ培地で増殖させ、ＴｒｋＢを発現するレトロウイルスで感染させる。細胞をＩＬ−３の非存在下で洗浄し、並べる。可能な作動性抗体および細胞生存を、適当なインキュベーション後、（例えば、発光細胞生存能力検出試薬、例えば、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ ＧｌｏＴＭを使用して）測定する。陽性対照細胞をＢＤＮＦでインキュベートする。
【０１３６】
アノイキスアッセイは、ラット腸上皮性（ＲＩＥ）／ＴｒｋＢ細胞を（例えば、ＤＭＥＭ培地中で）再懸濁し、細胞を、所望によりマルチウェル容器中で、可能性のある作動性抗体（例えば、１−２０μｇ／ｍｌの抗体の１０μｌで２．５×１０４細胞）と接触させることを含む。混合物をＢＤＮＦ対照の存在または非存在下でインキュベートし、次に細胞生存能力について（例えば、発光細胞生存能力検出試薬、例えば、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ ＧｌｏＴＭを使用して）測定する。典型的なアノイキスアッセイはDouma et al., Nature 430:1034-1039(2004)に記載されている。
【０１３７】
ＴｒｋＢアゴニストは、また、細胞をビンブラスチンおよびシスプラチン毒性から保護する能力について、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で評価することができる。このアッセイは、例えば、Scala et al., Cancer Res. 56(16):3737-42 (1996);およびJaboin et al., Cancer Res. 62(22):6756-63 (2002)に記載されている。
【０１３８】
４．抗ＴｒｋＢ作動性抗体を使用する方法
本発明の抗ＴｒｋＢ作動性抗体は、呼吸器障害および疾患、特に不十分なＴｒｋＢシグナル伝達によるもの；ＢＤＮＦ機能不全による障害および疾患；ならびに不十分なＴｒｋＢシグナル伝達による低い腸運動の疾患（例えば、炎症性腸症候群）を含む、ＴｒｋＢ活性の増加により恩恵を受ける何らかの疾患または状態を処置または改善するために使用することができる。
【０１３９】
本発明のＴｒｋＢ作動性抗体はＴｒｋＢと相互作用し、それによりＴｒｋＢ機能を調節することができる。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体は、ＴｒｋＢの１つ以上の生物学的機能を調節する（例えば、促進する）ことができる。例えば、ＴｒｋＢ作動性抗体は、ＴｒｋＢの二量体化、次にＴｒｋＢ細胞内ドメインにおいて特定のチロシン残基の自己リン酸化を調節することができる。さらなる例として、ＴｒｋＢ作動性抗体は、ＴｒｋＢ関連細胞内シグナル伝達カスケード（例えば、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路）を開始させ、神経細胞死の抑制、神経突起伸長の促進およびニューロトロフィンの他の効果を引き起こすことができる。
【０１４０】
いくつかの態様において、本明細書に記載されているＴｒｋＢ作動性抗体は、ＢＤＮＦ模擬物として作用し、ＢＤＮＦおよび他のＴｒｋＢアゴニストリガンドの栄養活性を繰り返すために使用することができ、それにより、神経保護および神経栄養効果を発揮する。本願方法の抗ＴｒｋＢ作動性抗体は、ＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合し、それによりＴｒｋＢ経路活性化およびシグナル伝達を活性化、増強または持続させることができる。いくつかの態様において、該ＴｒｋＢ作動性抗体はＴｒｋＢリガンド結合ドメインに結合し、それによりＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合する。
【０１４１】
したがって、ＴｒｋＢ作動性抗体はインビトロおよびインビボでＴｒｋＢ経路シグナル伝達を促進するために使用することができる。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体を、（例えば、罹患している対象におけるＢＤＮＦ機能不全または別のＴｒｋＢアゴニストリガンドの機能不全による）異常に低いレベルのＴｒｋＢ経路シグナル伝達と関連する障害の症状を診断、阻害、予防、改善、その障害から保護およびその障害を処置するために使用することを見出した。ＴｒｋＢシグナル伝達の異常下方調節と関連する障害の非限定的な例は、例えば、ＭｅＣＰ２（これはＢＤＮＦに直接結合する）をコードする遺伝子における変異により特徴づけられるレット症候群（ＲＴＴ）；ＴｒｋＢ機能欠失変異による深刻な肥満および発育遅延（Giles, S., et al. (2004) Nature Neuroscience 7:1187-9）、ウィルムス腫瘍、無虹彩、尿生殖器異常および知的障害（ＷＡＧＲ）症候群（Han, et al., N Engl J Med (2008) 359(9):918-27）、メラノコルチン受容体ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満（Farooqi and O'Rahilly, Endocrine Rev (2006) 27(7):710-18）、悪液質／筋肉消耗性症候群（Lin, et al., PloS, 3(4):e1900; WO 2007/088476）を含む。
【０１４２】
したがって、本発明は、治療または予防有効量の本明細書に記載されているＴｒｋＢ作動性抗体；および医薬担体を含む医薬組成物を投与することを含む、ＢＤＮＦ機能不全（例えば、レット症候群（ＲＴＴ）、ＷＡＧＲ症候群、メラノコルチン受容体ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満、悪液質／筋肉消耗性症候群）による障害および疾患を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載されている抗ＴｒｋＢ抗体は、全身的にまたは局所的に、例えば、経口的に、吸入的に、静脈内に、または腹腔内に投与される。
【０１４３】
本明細書に記載されている抗ＴｒｋＢ抗体を、また、呼吸疾患および障害、特にＴｒｋＢ活性の不十分によるものの処置、診断、予防および／または改善するために使用することを見出した。典型的な呼吸器疾患は、レット症候群、睡眠時無呼吸、ピックウィック症候群および本明細書に記載されている他のものを含む。
【０１４４】
いくつかの態様において、医薬組成物は、さらに呼吸困難（例えば、呼吸窮迫）の症状の処置、診断、予防および／または改善において使用するための別の独立した薬剤、例えば、ノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例えば、限定はしないが、三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンおよびより選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチン）、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子、例えば、アンパカイン、ＣＸ５４６、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤を含む）を含む。
【０１４５】
いくつかの態様において、呼吸器疾患または呼吸困難の症状の処置、診断、予防および／または改善に有効な治療および／または予防有効量の第２の薬剤をＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）と組み合わせて個体に投与する。いくつかの態様において、第２の薬剤およびＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）を混合物として投与する。いくつかの態様において、第２の薬剤はノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例は三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンならびにより選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチンである）、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子、例えば、アンパカイン、ＣＸ５４６、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）からなる群から選択される。
【０１４６】
本発明は、また、抗ＴｒｋＢ作動性抗体または同じものを含む医薬組成物を投与することを含む、呼吸窮迫の症状またはＴｒｋＢからの細胞内シグナル伝達の不十分による呼吸器疾患を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。該症状は呼吸窮迫（例えば、喘鳴またはゼイゼイ音、呼吸停止、浅呼吸、過呼吸、遷延性無呼吸）、血液の酸素化の低下または減少（例えば、チアノーゼ、例えば、酸素の吸収障害、血液での肺の不十分な潅流などによる）、ノルエピネフリン（ＮＥ）含有量の減少、骨髄におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現ニューロンの減少および胸痛を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、該方法は治療または予防有効量の本明細書に記載されているチロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）の抗体アゴニストを個体に投与することを含む。いくつかの態様において、該方法は治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体および医薬担体を含む医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの態様において、個体はレット症候群を有し、そして／または１つ以上の呼吸困難の症状を経験している。いくつかの態様において、個体は呼吸困難の症状に感染しやすい。
【０１４７】
いくつかの態様において、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体は、個体の高血糖および／または糖尿病またはそれらの症状を処置または軽減するために使用される。あるいは、または組合せにおいて、本発明の抗体は必要とする個体の体重を減少させるために使用することができる。いくつかの態様において、抗体は肥満を軽減するために使用される。これはインスリン抵抗性およびＩＩ型糖尿病により発症しやすい肥満個体に対して特に有効であり得る。
【０１４８】
本発明は、本明細書に記載されているＴｒｋＢ作動性抗体（または同じものを含む医薬組成物）を投与することを含む神経細胞死を抑制する方法を提供する。例えば、本発明は、また、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体を必要とする個体に投与することにより神経変性または中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を処置または予防するための方法を提供する。典型的なＣＮＳ疾患は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病またはＡＬＳ疾患を含む。
【０１４９】
ＴｒｋＢ活性の増加は、また、薬物乱用の軽減に関与している。例えば、米国特許公開第２００５／０２０３０１１号、参照。したがって、本発明は、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体を必要とする個体に投与することにより薬物（例えば、アルコール、ニコチンおよび／または麻薬）乱用および依存を軽減するための方法を提供する。
【０１５０】
いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体は一本鎖抗体である。いくつかの態様において、抗体はチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない。いくつかの態様において、抗体はニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＲに結合しない。いくつかの態様において、抗体はヒトＴｒｋＢに特異的に結合し、他の種のＴｒｋＢ（例えば、非ヒト霊長類またはマウスＴｒｋＢ）に最小限の結合をするか、あるいは結合しない。いくつかの態様において、抗体はヒトＴｒｋＢに特異的に結合し、他の種のＴｒｋＢに同様に結合する（すなわち、マウス、ラットおよび／または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）を含む他の種のＴｒｋＢと交差反応する）。
【０１５１】
５．医薬組成物
本発明は、抗ＴｒｋＢ抗体または抗原結合分子を含む、薬学的に許容される担体とともに製剤化された医薬組成物に関する。組成物はさらに挙げられている障害を処置または予防するために適当である他の治療剤を含むことができる。薬学的担体は組成物を増強または安定にするか、または組成物の製造を容易にする。薬学的に許容される担体は生理学的に適合する、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
【０１５２】
本発明の医薬組成物は、種々の当分野で既知の方法により投与することができる。投与ルートおよび／または経路は所望の結果に依存して変化する。投与は静脈内、筋肉内、腹膜内または皮下であることが好ましく、また、標的部位の近接に投与される。薬学的に許容される担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、経鼻、吸入、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適しているべきである。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性および多重特異性分子を、化合物を不活性にし得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護するために物質でコーティングし得る。
【０１５３】
抗体単独、または他の適当な成分との組合せは、吸引により投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらは“噴霧”され得る）で製造され得る。エアロゾル製剤は、許容される高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに注入され得る。
【０１５４】
いくつかの態様において、組成物は無菌および液体である。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトールおよび塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含むことにより実現することができる。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は、既知であり当分野で日常的に実施されている方法にしたがって製造することができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法により部分的に決定される。したがって、本発明の医薬組成物の適当な種々の製剤がある。抗体を製剤化し、適当な用量およびスケジュールを決定するために適用することができる方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippencott Williams & Wilkins (2006);and Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press., and in Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978（これらそれぞれを出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。医薬組成物は好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。一般的に、治療有効量または有効用量の抗ＴｒｋＢ抗体が本発明の医薬組成物において使用される。抗ＴｒｋＢ抗体は当業者に既知の慣用の方法により薬学的に許容される投与形態に製剤化される。投与レジメンは所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調節される。治療または予防有効量の決定において、低い用量を投与し、次に最小の副作用で、または望ましくない副作用がなく所望の効果が達成されるまで徐々に増加する。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、経時的に数回の分割投与で投与してもよく、または治療状況の緊急性により指示されるとき、それに伴って用量を減少または増加してもよい。とりわけ、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で調剤することが有利である。本明細書において使用される投与単位形態は処置される対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を意味し；それぞれの単位は必要な医薬担体と一緒に所望の治療効果を引き起こすように計算されたあらかじめ決められた量の活性な化合物を含む。
【０１５６】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成物および投与経路に関して所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量を得るために変化させることができる。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態および病歴ならびに因子などを含む種々の薬物動態因子に依存する。
【０１５７】
医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要な量よりも低い用量で医薬組成物において使用される本発明の抗体の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。一般的に、本発明の組成物の有効用量は、処置される特定の疾患または状態、投与様式、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の薬剤および処置が予防的または治療的であるかどうかを含む多数の異なる因子に依存して変化する。処置用量は安全性および有効性を最適化するために漸増する必要がある。抗体の投与に関して、用量は約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。典型的な処置レジメンは、２週間に１回または１月に１回または３から６月に１回の投与を含む。
【０１５８】
薬剤が核酸である態様において、典型的な用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。いくつかの態様において、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０ｍｇ／ｋｇ体重。
【０１５９】
抗体は単回または複数回で投与され得る。抗体を通常、複数回投与する。各投与間の間隔は、１週、１月、または１年ごとであり得る。間隔は、また、患者の抗ＴｒｋＢ抗体の血中レベルを測定することにより示されるように不定期であり得る。いくつかの方法において、用量は１−１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度、いくつかの方法において２５−３００μｇ／ｍｌを達成するように調節される。あるいは、抗体を持続放出製剤として投与することができ、この場合、投与頻度は少なくてよい。用量および頻度は患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般的に、ヒト化抗体がキメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。用量および投与頻度は処置が予防的または治療的であるかどうかに依存して変化し得る。予防的適用において、比較的低用量を比較的低頻度で長期間投与する。ある患者は残りの生涯、処置を受け続ける。治療的適用において、ときどき、比較的高用量を比較的短間隔で、疾患の進行を遅らせるかもしくは停止させるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで必要である。その後、患者は予防レジメンで投与され得る。
【０１６０】
ＴｒｋＢ抗体アゴニストは、体重を減少させるか、血中グルコース濃度を減少させるか、糖尿病を処置するか、もしくは糖尿病症状を緩和するか、神経変性疾患を処置するか、または薬物乱用を減少させるために有効であることが既知である薬剤と組み合わせて使用することができる。糖尿病を処置するために使用される典型的な薬剤は、例えば、インスリン；スルホニルウレア（例えば、グリピジドおよびアマリール）およびインスリン分泌促進剤（例えば、ナテグリニドおよびレパグリニド）；メトホルミン；ＰＰＡＲガンマアゴニスト（例えば、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン）ならびにＰＰＡＲアルファ、ＰＰＡＲデルタ、ＰＰＡＲアルファ／ガンマデュアルアゴニストおよびＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタパンアゴニスト；アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース）；ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（例えば、ビルダグリプチン）；およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体（例えば、エクセナチド）を含む。肥満を処置するために使用される典型的な薬剤は、例えば、リパーゼ阻害剤（例えば、オルリスタット）；シブトラミン；ＣＢ−１阻害剤（例えば、リモナバント）；トピラメート；アミリン／アミリン類似体（例えば、プラムリンチド）、レプチン、ＰＹＹ／ＰＹＹ類似体；およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体（例えば、エクセナチド）を含む。
【０１６１】
活性剤は、ＴｒｋＢ作動性抗体と共に混合物で投与することができ、また、それぞれ別々に投与することもできる。必ずしも必要ではないが、抗体薬剤および他の活性剤を同時に投与することができる。
【実施例】
【０１６２】
実施例
以下の実施例は、本願発明を限定することなく、説明のために提供する。
【０１６３】
実施例１：
以下の実施例はヒト生殖細胞のＶ領域配列と実質的にアミノ酸配列同一性を有する抗ＴｒｋＢ抗体の構築およびスクリーニングを提供する。
【０１６４】
方法
Ｖ領域のサブクローニング
Ｖ領域を元のモノクローナル抗体Ａ１０Ｆ１８．２からサブクローニングした。ＰＣＲを使用して、Ｖ−重鎖およびＶ−カッパ領域のＶ遺伝子を増幅させ、クローニングに適当な制限酵素部位を発現ベクターに取り込ませた。Ｖ領域をＦａｂフラグメントとしてクローニングし、発現ベクターから大腸菌において発現させた。参照ＦａｂをＴｒｋＢ−抗原結合に対して試験した。ＴＲ３−１と称する。
【０１６５】
Ｖ領域もＩｇＧ発現ベクターにクローニングした。ＰＣＲ増幅および付加された制限酵素認識部位を有するプライマーを使用して、Ｖｈ領域を増幅させ、ヒトＩｇＧ１定常領域を含み、アンピシリンおよびネオマイシン耐性を与える発現ベクターにてクローニングした。ＰＣＲ増幅および付加された制限酵素認識部位を有するプライマーを使用して、Ｖｋ領域を増幅させ、ヒトカッパ定常領域を含み、アンピシリンおよびハイグロマイシン耐性を与える発現ベクターにてクローニングした。これらのベクターを種々の組合せにおいて試験し、機能分析のために完全ＩｇＧの一団を生産した。
【０１６６】
抗体精製
Ｆａｂフラグメントは、発現ベクターを使用して大腸菌からの分泌により発現させた。細胞を０．６のＯＤ６００まで２×ＹＴ培地中で増殖させた。３時間、３３℃でＩＰＴＧを使用して発現を誘導した。構築されたＦａｂをペリプラズム画分から得、標準方法にしたがって、連鎖球菌タンパク質Ｇを使用するアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇ ＨＰカラム；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。ＦａｂをｐＨ２．０のバッファー中で溶離し、即座にｐＨ７．０に調節し、ｐＨ７．４のＰＢＳ（ＰＢＳはカルシウムおよびマグネシウムなしである）にて透析した。
【０１６７】
ＩｇＧを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地（無血清）から生産した。ＩｇＧを、標準方法にしたがって、タンパク質Ａを使用するアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａ ＨＰカラム；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。ＦａｂをｐＨ２．７のバッファーに溶離し、即座にｐＨ７．０に調節し、ｐＨ７．４のＰＢＳ（ＰＢＳはカルシウムおよびマグネシウムなしである）にて透析した。
【０１６８】
一般的なＥＬＩＳＡ
１００ｎｇの組換えＦｃ−ＴｒｋＢ抗原を、一晩４℃でのインキュベーションにより、９６ウェルマイクロタイタープレートに結合させた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（“ＰＢＳＴ”）中の５％のミルク溶液で１時間、３３℃でブロックした。精製されたＦａｂをＰＢＳで希釈し、５０μｌをそれぞれのウェルに加えた。１時間３３℃でインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回濯いだ。５０μｌの抗−ヒト−カッパ鎖ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ；ＰＢＳＴにて０．１ｎｇ／ｍｌに希釈された）をそれぞれのウェルに加え、プレートを４０分、３３℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回およびＰＢＳで１回洗浄した。１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（“ＴＭＢ”）基質（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれのウェルに加え、プレートを〜５分間、室温でインキュベートした。反応を停止するために、１００μｌの０．２ＮのＨ２ＳＯ４をそれぞれのウェルに加えた。プレートを分光光度計において４５０ｎｍにて読んだ。
【０１６９】
ブロッキングＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇのＦｃ−ＴｒｋＢ抗原で被覆した。２倍希釈シリーズのＡ１０Ｆ１８．２ ＩｇＧを１時間、室温で抗原とインキュベートした。非結合ＩｇＧを洗い流し、５０ｎＭのＦａｂ溶液をそれぞれのウェルに加え、１時間、室温でインキュベートした。非結合Ｆａｂを洗い流し、結合Ｆａｂを抗−ヒトカッパ−ＨＲＰコンジュゲートで検出した。
【０１７０】
コロニーリフト結合アッセイ（“ＣＬＢＡ”）
Ｆａｂフラグメントライブラリーのスクリーニングを、抗原Ｆｃ ＴｒｋＢ−被覆ニトロセルロースフィルターを使用する、本質的に（米国特許公開第２００５／０２５５５５２および２００６／０１３４０９８号）に記載されているとおりに実施した。
【０１７１】
ＦｏｒｔｅＢｉｏを使用する親和性測定
ＩｇＧおよびＦａｂフラグメントの結合速度を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを使用して分析した。組換えＦｃ−ＴｒｋＢ抗原を、製造業者の方法にしたがってＥＺ−ｌｉｎｋ ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ビオチン化した。次に抗原をストレプトアビジン−被覆センサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）と結合させた。Ｆａｂ結合を、バイオレイヤー干渉分析および製造業者により提供されたソフトウェアを使用してリアルタイムでモニタリングした。親和性を測定された結合および解離定数から計算した。
【０１７２】
Ｂｉａｃｏｒｅを使用する親和性測定
すべてのＢｉａｃｏｒｅ試薬をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部のＢｉａｃｏｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。速度結合パラメーターの決定を、光学バイオセンサー Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ５１を使用する表面プラズモン共鳴測定により行った。この技術は、受容体へのリガンドの結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）に関する微視的速度定数の非標識測定を可能にする。したがって、それはとりわけ抗体−抗原相互作用を特徴付けるために適当である。
【０１７３】
改良された抗体における結合試験を、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ−５ Ｂｉａｃｏｒｅ センサーチップ（認定されている）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００５−３０）上にＦｃ−ｈＴｒｋＢを固定することにより行った。Ｆｃ−融合タンパク質の共有結合を‘アミンカップリングキット’（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１０００−５０）にて行った。Ｆｃ−融合タンパク質を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００３−５０）中にて５μｇ／ｍｌで、１０μＬ／分の流速で、ＥＤＣ−活性化デキストラン表面に付着させた。
【０１７４】
種々の濃度の改良された抗体を、ＰＢＳプラス１００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１０００−５４）中でＦｃ−ＴｒｋＢキャプチャーチップ上に流した。得られたセンサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｓ５１評価ソフトウェアを使用して分析した。すべての濃度からのデータを１：１ ラングミュアモデルに全体的に合わせた。
【０１７５】
アノイキスアッセイ
ラット腸上皮性（ＲＩＥ）−ＴｒｋＢ細胞をアノイキスアッセイにおいて使用した。ＲＩＥ／ＴｒｋＢ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Innovative Cell Technologies Inc., San Diego、ＣＡ）を使用して分離し、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁した。細胞を無血清ＤＭＥＭで３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％のＢＳＡ（細胞培養グレード、＃Ａ８８０６−５Ｇ Ｓｉｇｍａ）貯蔵物から希釈された０．１％のＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭに再懸濁した。次に細胞を、９６ウェル Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ 超低クラスタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３４７４）に、４．２×１０５細胞／ｍＬにて６０ｍｌ／ウェル（＝２．５×１０４細胞／ウェル）で置いた。１０ｍｌのＴｒｋＢ作動性抗体（ＰＢＳ中で貯蔵）を１−２０μｇ／ｍＬの最終濃度で試験ウェルに加えた。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。１０ｍｌのヒトＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で２０ｍｇ／ｍＬで貯蔵）を１０−５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で対照ウェルに加えた。ＢＤＮＦをＤＭＥＭ（ＳＦ）／０．１％ＢＳＡで希釈した。次に細胞をさらに２４−４８時間インキュベートした。８０ｍｌ／ウェルのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Promega, Madison, WI）を加え、プレートを穏やかな振とうに付した。１５分後、液体を９６ウェル白色の透明底プレートに移し、発光を読んだ。
【０１７６】
結果
Ｖ領域のクローニングおよび発現
Ｆａｂ ＴＲ３−１は、ヒト定常領域と融合した、元の抗体、Ａ１０Ｆ１８．２からの無傷のＶ領域を有し、大腸菌から精製された。ＴｒｋＢ抗原結合の希釈ＥＬＩＳＡ試験において、クローンＦａｂは抗体濃度に依存する結合曲線を示した（データは示していない）。
【０１７７】
ライブラリー構築およびＶ領域カセット
エピトープ−フォーカストライブラリーを、結合特異性決定基（“ＢＳＤ”）を含む元の抗体からの独特のＣＤＲ３−ＦＲ４領域に結合したヒトＶセグメントライブラリー配列およびヒト生殖細胞系Ｊセグメント配列から構築した。これらの“全長”ライブラリーを、元の抗体におけるＶセグメントの一部だけを最初にヒト配列のライブラリーにより置き換えた“カセット”ライブラリーの構築のためのベースとして使用した。２つの型のカセットを構築した。Ｖ−重鎖およびＶカッパ鎖両方に関するカセットを、フレームワーク２領域内の重複している一般的な配列でのブリッジＰＣＲにより製造した。このようにして、“フロント−エンド”および“ミドル”ヒトカセットライブラリーを、ヒトＶ−重鎖１およびＶ−カッパＩＩイソ型のために構築した。ＴｒｋＢ抗原への結合を支持するヒトカセットをコロニーリフト結合アッセイにより同定し、ＥＬＩＳＡおよびＦｏｒｔｅ分析における親和性にしたがってランク付けした。次に、最も高い親和性カセットのプールを、第２のライブラリースクリーンにおいて再結合し、完全ヒトＶセグメントを生産した。
【０１７８】
ヒトＶセグメントを有する高親和性Ｆａｂのプールの同定後、親和性成熟ライブラリーを構築した。ヒトＶセグメントを有するＦａｂクローンの一団の一般的なＢＳＤ配列を、変性ＰＣＲプライマーを使用して変異させ、ライブラリーを製造した。これらの変異ライブラリーを、コロニーリフト結合アッセイを使用してスクリーニングした。選択されたＦａｂをＥＬＩＳＡおよびＦｏｒｔｅ分析で親和性に対してランク付けした。参照ＴＲ３−１ Ｆａｂと比較して、抗原に対する同様の、または改良された親和性を支持する変異を同定した。
【０１７９】
さらに、ヒト生殖細胞系への点突然変異を、ヒトＶセグメントを有するそれぞれのＦａｂの軽鎖のＣＤＲ３において行った。その位置ですべてのヒト生殖細胞系ＶｋＩＩセグメントにコードされているアミノ酸である、位置８９（Ｃｈｏｔｈｉａ番号）をＳからＭに変えた。
【０１８０】
Ｆｏｒｔｅ Ｏｃｔｅｔ分析を使用する、ヒトＴｒｋＢ抗原に対するヒトＶセグメントを有するＦａｂおよびＩｇＧの親和性
ヒトＶセグメントを有するＦａｂをコロニーリフト結合アッセイから単離し、抗原−結合ＥＬＩＳＡにより確認した。抗原−結合ＥＬＩＳＡにおいて強い陽性シグナルを示すＦａｂクローンを精製し、さらに速度により参照ＦａｂＴＲ３−１と比較して特徴付けた。結合速度を、タンパク質−タンパク質相互作用のリアルタイム非標識モニタリングのために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して分析した。代表的な速度分析は図３に示されている。計算された結合および解離定数は表１および２に示されている。
表１
【表１】
【０１８１】
表１は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ バイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＦａｂ結合の分析の要約であり、結合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）および計算された親和性（ＫＤ）を示す。
表２
【表２】
【０１８２】
表２は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ バイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＦａｂ結合の分析の要約であり、結合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）および計算された親和性（ＫＤ）を示す。
【０１８３】
ＦａｂクローンＴＲ１３４−４、ＴＲ１３５−８、ＴＲ１３９−２、ＴＲ１５１−１およびＴＲ１４４−１ならびに参照クローンＴＲ３−１のすべての速度分析は、ＴｒｋＢ抗原に対して低ナノモル親和性を示した。クローンＴＲ１３９−２およびＴＲ１５１−１は、常に、参照対照と比較して、改良されたオフレート（Ｋｄ）および高い全体的な親和性を有した。ＴＲ１４４−１、ＴＲ１３５−８およびＴＲ１３４−４は、常に、参照対照と比較して、ほぼ同じ全体的な親和性を有した。
【０１８４】
ヒトＶセグメントを有するＩｇＧを、また、ＣＨＯ細胞の一過性のトランスフェクションから製造した。ＩｇＧ製造物を精製し、さらに速度により参照ＩｇＧ Ａ１０Ｆ１８．２と比較して特徴付けた。ヒトＶセグメントを有する２つのＩｇＧに関する結合速度を、タンパク質−タンパク質相互作用のリアルタイム非標識モニタリングのために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して分析した。代表的な速度分析は図４に示されている。計算された結合および解離定数は表３に示されている。この結果は、ヒトＶセグメントを有するＩｇＧが参照Ａ１０Ｆ１８．２ ＩｇＧに等しい親和性を有する抗原に結合することを示す。
表３
【表３】
【０１８５】
表３は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ バイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＩｇＧ結合の分析の要約であり、結合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）および計算された親和性（ＫＤ）を示す。
【０１８６】
ヒト生殖細胞配列と同一性パーセント
Ｖ領域をＰＣＲ−増幅させ、制限酵素で消化させ、ＩｇＧ発現ベクターにてクローニングした。ＴＲ１３４−４、ＴＲ１４４−１およびＴＲ１４４−１からの重鎖をＰＣＲ−増幅させ、ＳａｌＩおよびＮｈｅＩで消化させた；得られたフラグメントを、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターにてクローニングし、それぞれＴＲ１２７、ＴＲ１４３およびＴＲ１５４を得た。ＴＲ１３４−４、ＴＲ１３５−８およびＴＲ１３９−２からの軽鎖をＰＣＲ−増幅させ、ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩで消化させた；得られたフラグメントを、ヒトカッパ定常領域を含む発現ベクターにてクローニングし、それぞれＴＲ１１９、ＴＲ１２９およびＴＲ１３７を得た。挿入物の同一性および完全性をＤＮＡシークエンシングにより確認した。
表４
【表４】
＊ＮＤ＝行っていない；
ａヒト生殖細胞系との同一性％はＣＤＲ３を除く
【０１８７】
表４はＩｇＧ発現ベクター内に含まれるＶ領域に対するヒト生殖細胞配列との同一性パーセントを説明する：すべてのパーセントはＣＤＲ３ ＢＳＤ配列を除くＶ領域全域の一本鎖ヒト生殖細胞配列との同一性を示す。ＦａｂのＶｈ−領域およびＶｋ−領域のそれぞれは、ヒト生殖細胞アミノ酸配列と極めて近い。
【０１８８】
エピトープ特異性を示すためのブロッキングＥＬＩＳＡ
ブロッキングＥＬＩＳＡを、方法セクションに記載されているヒトＶセグメントを含む精製されたＦａｂで行った。結果を図７に示す。すべてのＦａｂクローンの結合が、元のモノクローナル抗体Ａ１０Ｆ１８．２ ＩｇＧの濃度の増加によりブロックされ、Ｆａｂが元のモノクローナルＩｇＧのように同じエピトープに結合することを示す。
【０１８９】
ＥＬＩＳＡによるＴｒｋＢタンパク質への抗体結合
ＩｇＧ抗体ＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７を、一過性のトランスフェクションにより生産し、本明細書に記載されているとおりに精製し、Ｆｃ−ＴｒｋＢに対する特異的結合に関して評価した。ＥＬＩＳＡをヒトＴｒｋＢおよび希釈シリーズのそれぞれの抗体：ＬＦＤ２５３、ＬＦＤ２５４、ＬＦＣ３２５またはＬＦＣ３２７を使用して実施した。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＬＦＤ２５３、ＬＦＤ２５４、ＬＦＣ３２５およびＬＦＣ３２７がヒトＴｒｋＢに結合することを示す。図８、参照。
【０１９０】
ヒトＶセグメントを有するＩｇＧ（例えば、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７）は、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣではなくＴｒｋＢに特異的に結合する。２μｇ／ｍｌにて精製されたＩｇＧ抗体を３つの異なるＴｒｋファミリーメンバー（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）との相互作用を試験することにより特異性を評価した。二次Ａｂは、ヤギ−抗−ヒトＦａｂ−ＨＲＰ検出Ａｂのみでブロックされ、処理される複製物である。図９Ａ−Ｄに示されるとおり、ＬＦＤ２５３、ＬＦＤ２５４、ＬＦＣ３２５またはＬＦＣ３２７はこれらの関連Ｔｒｋファミリー受容体のいずれとも結合しない。
【０１９１】
アノイキスアッセイ：機能作動性
精製されたＩｇＧ（例えば、ＬＦＤ２５３、ＬＦＤ２５４、ＬＦＣ３２５またはＬＦＣ３２７）を、ラット腸上皮性（ＲＩＥ）−ＴｒｋＢ細胞を使用してアノイキスアッセイにおいて評価する。これらの細胞はアノイキス（分離依存アポトーシス）に感受性であるが、ＴｒｋＢ受容体の活性化で助けることができる。ＬＦＤ２５３処理は、細胞生存により測定されるとおりアノイキスからＲＩＥ−ＴｒｋＢ細胞を助けることができ、この効果は用量依存的であった。図１０Ａ−Ｄ、参照。ＬＦＤ２５３に対するこのデータから計算されたＥＣ５０は、４．１ｎｇ／ｍｌ（２８ｐＭ）である。ＬＦＤ２５４に対するこのデータから計算されたＥＣ５０は、２４．０ｎｇ／ｍｌ（１６０ｐＭ）である。ＬＦＣ３２５に対するこのデータから計算されたＥＣ５０は、４１．８ｎｇ／ｍｌ（２８０ｐＭ）である。ＬＦＣ３２７に対するこのデータから計算されたＥＣ５０は、２６．９ｎｇ／ｍｌ（１８０ｐＭ）である。
【０１９２】
Ｂｉａｃｏｒｅによる抗体親和性測定
ＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−３２７の固定化Ｆｃ−ＴｒｋＢへの結合に関する速度定数を測定した。図１１Ａ−Ｄは、それぞれのＩｇＧに対する代表的なセットのキネティックトレースの詳細を示す。図１１Ａは６２．５ｎＭから３．９にまで２倍希釈されたＬＦＤ２５３の滴定のセンサーグラムを示す。図１１Ｂは３１．２５ｎＭから１．９にまで２倍希釈されたＬＦＤ２５４の滴定のセンサーグラムを示す。図１１Ｃは３１．２５ｎＭから１．９５にまで２倍希釈されたＬＦＣ３２５の滴定のセンサーグラムを示す。図１１Ｄは３１．２５ｎＭから１．９５にまで２倍希釈されたＬＦＣ３２７の滴定のセンサーグラムを示す。表５は、実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｓ５１評価ソフトウェアを使用するラングミュアモデルに全体的に合わせたとき、得られたデータの要約を示す。この抗体は二価であるが、結合は１：１事象として処理した。
表５
【表５】
【０１９３】
表５は抗体−受容体複合体の速い結合および遅い解離速度の両方を示す。センサーグラムを全体的に扱ったとき、もっとも合うものを得た。
【０１９４】
ここに記載の実施例および態様は、説明の目的のためのみであり、それに照らした様々な修飾または変化が当業者には示唆され、それらは本発明の精神および範囲の範囲内および添付の特許請求の範囲内に包含されることは理解されるべきである。この明細書において引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためにそれら全体を引用により本明細書に包含させる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００８年１月１７日出願の米国仮特許出願６１／０２１，８２０の優先権の利益を主張する。この出願の全ての記載は、出典明示により本出願に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）の抗体および抗原結合分子アゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
Ｉ．ＴｒｋＢ
チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）は、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＣを含む１回膜貫通受容体チロシンキナーゼのファミリーに属する。これらのチロシン受容体キナーゼ（ｔｒｋ）はニューロトロフィンの活性を媒介する。ニューロトロフィンは、ニューロンの生存および発達のために必要であり、ニューロン構造およびシナプス可塑性の調節を介してシナプス伝達を調節する。ニューロトロフィンは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）を含むが、これらに限定されない（Lo, KY et al., J. Biol. Chem., 280:41744-52 (2005)）。ＴｒｋＢはＢＤＮＦの高親和性受容体である（Minichiello, et al., Neuron 21:335-45 (1998)）。ｔｒｋへのニューロトロフィンの結合は、受容体を活性化し、二量体化し、受容体の細胞内ドメインの特定のチロシン残基を自己リン酸化する（Jing, et al. Neuron 9:1067-1079 (1992); Barbacid, J. Neurobiol. 25:1386-1403 (1994); Bothwell, Ann. Rev. Neurosci. 18:223 253 (1995); Segal and Greenberg, Ann. Rev. Neurosci. 19:463 489 (1996); Kaplan and Miller, Curr. Opinion Neurobiol. 10:381 391 (2000)）。これらのホスホチロシン残基は、神経細胞死の抑制およびニューロトロフィンの他の効果を引き起こす細胞内シグナル伝達カスケードの成分に対するドッキング部位として働く。例えば、Ｓｈｃ、ＦＲＳ−２、ＳＨ２Ｂ、ｒＡＰＳおよびＰＬＣγはリン酸化チロシン残基を介してＴｒｋＢと相互作用する。これらのアダプター分子と活性化ＴｒｋＢの結合によって、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路を含むシグナル伝達経路が開始され、それによりニューロトロフィンの作用を介在する（Lo, KY et al., J. Biol. Chem., 280:41744-52 (2005)）。
【０００４】
ＩＩ．糖尿病
正常な健康状態を維持するために、ヒト血流中のグルコースの濃度は比較的に狭い範囲内（血液１デシリットルあたり６０−１２０ミリグラム）で制御されなければならない。血中グルコースがあまりに低く下がると、低血糖として知られている状態が脱力感、衰弱、頭痛、混乱および人格変化のような症状を伴って生じる。過度の血中グルコースまたは高血糖は、細胞、組織および臓器中の過剰のグルコースとタンパク質の化学反応により組織損傷を引き起こし得る。この損傷は、失明、腎不全、性的不全、アテローム性動脈硬化症および感染に対する脆弱性の増加の糖尿病性合併症を引き起こすと考えられている。
【０００５】
糖尿病は連続的な病理学的に高い血中グルコース濃度と関連する；それは米国の死の主な原因の１つであり、すべての死亡の約５％に関与する。糖尿病は２つの主なサブクラス：若年性糖尿病またはインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）としても知られているＩ型および成人発症型糖尿病または非インスリン依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）としても知られているＩＩ型に分類される。
【０００６】
ＩＩ型糖尿病の診断は症状の評価ならびに尿および血液中のグルコースの測定を含む。血中グルコース濃度決定は正確な診断のために必要である。さらに特に、空腹時の血中グルコース濃度決定は使用される標準手段である。しかしながら、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）は、絶食時の血中グルコース濃度よりもさらに高感度であると考えられている。ＩＩ型糖尿病は異常な経口耐糖能（ＯＧＴ）と関連する。したがって、一般的に糖尿病の診断のために必須ではないが、ＯＧＴＴはＩＩ型糖尿病の診断における助けとできる（Emancipator K, Am J Clin Pathol 1997 November ;112(5):665 74; 2 Diabetes Mellitus, Decision Resources Inc., March 2000）。
【０００７】
したがって、耐糖能異常は、ＩＩ型糖尿病の診断のために必要とされる量未満の空腹時の血中グルコース濃度を有するが、ＯＧＴＴ中に正常者と糖尿病患者間の血漿グルコース応答を有する個体において診断される。耐糖能異常は前糖尿病患者状態と考えられ、耐糖能異常（ＯＧＴＴにより定義される）はＩＩ型糖尿病の発症に関する強力な予測因子である（Haffner S M, Diabet Med 1997 August ; 14 Suppl 3:S12 8）。
【０００８】
ＩＩ型糖尿病は、血漿グルコース濃度の増加によって悪化する、膵臓機能の低下および／または他のインスリン関連プロセスと関連する進行性疾患である。したがって、ＩＩ型糖尿病は、通常、長期の前糖尿病相を有し、種々の病態生理学的メカニズムは、前糖尿病状態において、病的な高血糖および耐糖能異常、例えば、グルコース利用および有効性、インスリン作用および／またはインスリン生産における異常を引き起こし得る（Goldberg R B, Med Clin North Am 1998 July ;82(4):805 21）。
【０００９】
耐糖能障害と関連する前糖尿病状態は、また、腹部肥満、インスリン抵抗性、脂質異常症および高血圧に対する素因と関連し得る（Groop L, Forsblom C, Lehtovirta M, Am J Hypertens 1997 September ;10(9 Pt 2):172S 180S; Haffner S M, J Diabetes Complications 1997 March-April, 11(2):69 76; Beck-Nielsen H, Henriksen J E, Alford F, Hother-Nielson O, Diabet Med 1996 September ;13 (9 Suppl 6):S78 84）。
【００１０】
病的な高血糖または耐糖能異常の減少に焦点を合わせるＩＩ型糖尿病を発症する危険性を有する個体への早期介入は、ＩＩ型糖尿病および関連合併症への進行を予防または遅延させ得る。したがって、異常経口耐糖能および／または血中グルコース濃度の上昇を有効に処置することにより、ＩＩ型糖尿病への障害の進行を予防または抑制することができる。例えば、米国特許第７，１０９，１７４号、参照。
【００１１】
インスリンおよびスルホニルウレア（経口低血糖治療剤）は、今日、米国にて処方されている糖尿病薬剤の２つの主な種類である。インスリンは、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病の両方に対して処方されているが、スルホニルウレアは、通常、ＩＩ型糖尿病のみに処方されている。スルホニルウレアは天然インスリン分泌を刺激し、インスリン抵抗性を低下させる；これらの化合物は代謝におけるインスリンの機能をもとに戻さない。スルホニルウレアを受ける約１／３の患者がそれに耐性になる。ＩＩ型糖尿病患者の中にはスルホニルウレア治療に応答しない者がいる。スルホニルウレアの最初の処置に応答する患者の５−１０％が、約１０年後に、スルホニルウレア有効性の喪失を経験する可能性がある。例えば、米国特許第７，１１５，２８４号、参照。
【００１２】
ＩＩ型糖尿病の処置のために一般的に処方されている多数の抗糖尿病剤、例えば、スルホニルウレアおよびチアゾリジンジオンは、体重増加の望ましくない副作用を有する。前糖尿病状態を有するか、または診断されたＩＩ型糖尿病を有する患者における体重増加は、代謝および内分泌腺調節異常の強調による悪影響を引き起こし、そして肥満それ自体はＩＩ型糖尿病の発症および進行性の悪化に対する極めて重要な危険因子である。したがって、体重を維持するか、または減らす抗糖尿病薬剤を使用することが望ましい。例えば、米国特許第７，１９９，１７４号、参照。
【００１３】
糖尿病、心臓疾患、卒中、高血圧およびいくつかの型の癌を含む多くの深刻な状態に関する個体の危険性を増加させるため、肥満は一般的かつ非常に深刻な公衆の健康状態問題である。２０年にわたる肥満個体のかなりの数の増加が、多大な公衆の健康意識を引き起こした。ダイエットおよびエクササイズによる肥満の減少が関連危険因子を劇的に減少させることが試験により証明されたが、肥満が食欲の増加、高カロリー食に対する好み、身体活性の減少および脂質合成代謝の増加に寄与する遺伝的に受け継がれる因子と強く関連することを考慮すると、これらの処置は広く成功していない。例えば、米国特許第７，１１５，７６７号、参照。
【００１４】
ＩＩＩ．レット症候群
１９６６年にＤｒ．Ａｎｄｒｅａｓ Ｒｅｔｔにより最初に同定されたレット症候群（ＲＴＴ）は、遅発神経発達障害から生じる深刻なＣＮＳ障害である。それは、もっぱら、１／１０，０００−１５，０００の生児出生の割合ですべての民族の女児を冒す。ＲＴＴを有するいくつかの個体は若年で死亡する；しかしながら、多数は成人になることができ、深刻な障害を受ける。患者の２５％までが心／呼吸不全で死亡する。今までのところ該疾患に対する有効な処置はない。
【００１５】
見かけ上正常発達期間後、罹患している女児は６−１８月齢にてＲＴＴ症状を発症し、今後数年にわたって進行的に悪化する。症状は、出生時は正常の頭囲、次に頭部成長の減速；後天的言語障害、コミュニケーション機能障害、認識機能障害；意図的な手の動きから型通りの手の動き（曲がりくねった手のもみ合わせ、手を洗う、拍手、軽くたたくなど）への変化；運動障害または悪化（歩行失調、硬直など）；起きている間の呼吸困難；早期乳児期からの睡眠パターン障害；筋肉疲労および筋失調症を伴う異常筋緊張；末梢血管運動神経障害；進行性側弯症または後弯症；および成長遅延を含む。
【００１６】
該障害は、また、中枢自律神経機能障害により特徴付けられ、Ｒｅｔｔ患者は以下の症状のいくつか、またはすべてを示す：呼吸停止、浅呼吸、過呼吸、遷延性無呼吸期間からなる多発性呼吸律動不整；ベースラインの心臓の迷走神経緊張の減少による心不整脈；および圧反射心臓感受性。これらの症状は致命的であり、Ｒｅｔｔ患者に突然死の危険性を与える。それらの患者は、脳幹未成熟ならびに心肺ネットワーク内の、および起きている間の視床下部または辺縁皮質からの統合的阻害の欠如を示す。さらに、脳幹ニューロトロフィンシグナル伝達（ＮＧＦおよびＢＤＮＦ）の変化がＲｅｔｔ患者において報告され、モノアミン（セロトニン、ノルエピネフリン）および神経ペプチド（サブスタンスＰ）レベルが減少する。
【００１７】
ＲＴＴは、大半の場合において、転写リプレッサーＭｅＣＰ２（メチルＣｐＧシトシン結合タンパク質２）をコードするＸ染色体関連遺伝子ｍｅｃｐ２における変異により引き起こされる単一遺伝子疾患である。ＭｅＣＰ２は優先的にメチル化ＤＮＡに結合する。
【００１８】
ニューロトロフィン因子ＢＤＮＦはＭｅＣＰ２の既知の直接標的であり、そしてノルエピネフリンおよびセロトニン神経に対する重要な栄養因子である。驚くべきことに、Ｍｅｃｐ２−ＫＯマウスは脳ＢＤＮＦが不足しており、脳ＢＤＮＦの遺伝子過剰発現が寿命を延長させ、いくつかの運動障害から救うことができる。ヒトにおいて同定されているＢＤＮＦ機能不全は、レット症候群、ウィルムス腫瘍、無虹彩、尿生殖器異常および知的障害（ＷＡＧＲ）症候群（Han, et al., N Engl J Med (2008) 359(9):918-27）、メラノコルチン受容体ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満（Farooqi and O'Rahilly, Endocrine Rev (2006) 27(7):710-18）、悪液質／筋肉消耗性症候群（Lin, et al., PloS, 3(4):e1900; WO 2007/088476）を含む。
【発明の概要】
【００１９】
発明の概要
１つの局面において、本発明はチロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に結合する抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は：
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｖ（Ｔ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｎ）ＷＦＡＹ（配列番号：３４）を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域はアミノ酸配列（Ｓ／Ｍ）ＱＧＴ（Ｈ／Ａ）（Ｅ／Ｖ／Ｉ）ＰＹＴ（配列番号：４２）を含み；そして
該抗体はＴｒｋＢアゴニストである。
【００２０】
他の局面において、本発明はＴｒｋＢに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの態様において、抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む；
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号：２５のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号：３２および配列番号：３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１は配列番号：３５、配列番号：３６および配列番号：３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２は配列番号：３９のアミノ酸配列を含み；
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３は配列番号：４０および配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
抗体の態様に関して、いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントは配列番号：１６と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、そして軽鎖Ｖセグメントは配列番号：２４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【００２２】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントは配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、そして軽鎖Ｖセグメントは配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
【００２３】
いくつかの態様において、重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２および配列番号：３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４０および配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
いくつかの態様において、重鎖ＦＲ４はヒト生殖細胞のＦＲ４である。いくつかの態様において、重鎖ＦＲ４は配列番号：５０である。いくつかの態様において、重鎖Ｊセグメントはヒト生殖細胞のＪＨ４部分配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、軽鎖ＦＲ４はヒト生殖細胞のＦＲ４である。いくつかの態様において、軽鎖ＦＲ４はヒト生殖細胞のＪｋ２部分配列ＦＧＱＧＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）である。
【００２６】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントはそれぞれ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含み；
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２７のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３１のアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３８のアミノ酸配列を含み；そして
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３９のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３５を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４１を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３６を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４０を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３７を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４０を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：２９を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３は配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１は配列番号：３５を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２は配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３は配列番号：４１を含む。
【００３１】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：４の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域は配列番号：１１の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３２】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３３】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３４】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、そして軽鎖可変領域は配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、抗体は５×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）にてＴｒｋＢに結合する。
【００３６】
いくつかの態様において、抗体はＦＡｂ’フラグメントである。いくつかの態様において、抗体はＩｇＧである。いくつかの態様において、抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。いくつかの態様において、抗体はヒト定常領域を含む。
【００３７】
いくつかの態様において、抗体はチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する。いくつかの態様において、抗体はＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する。
【００３８】
いくつかの態様において、抗体は配列番号：１を含む重鎖および配列番号：８を含む軽鎖を含む。
【００３９】
いくつかの態様において、抗体は配列番号：１を含む重鎖および配列番号：９を含む軽鎖を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、抗体は配列番号：１を含む重鎖および配列番号：１０を含む軽鎖を含む。
【００４１】
いくつかの態様において、抗体は配列番号：３を含む重鎖および配列番号：８を含む軽鎖を含む。
【００４２】
さらなる局面において、本発明は、本発明の抗体および生理学的に適合性のある賦形剤を含む薬学的に許容される組成物を提供する。薬学的に許容される組成物の態様は抗体に関して上記のとおりである。
【００４３】
いくつかの態様において、医薬組成物は、呼吸窮迫の減少または阻害において使用するための薬剤、例えば、ノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の活性化因子をさらに含む。第２の薬剤は三環式抗鬱剤、例えば、デシプラミン（ＤＭＩ）であり得る。いくつかの態様において、第２の薬剤はセロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、例えば、ブスピロン、フルオキセチンおよびレボキセチンである。いくつかの態様において、第２の薬剤はグルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子、例えば、アンパカインＣＸ５４である。いくつかの態様において、第２の薬剤はプロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）である。
【００４４】
いくつかの態様において、医薬組成物は個体における血中グルコース濃度を減少させる薬剤をさらに含む。いくつかの態様において、医薬組成物は個体における体重を減少させる薬剤をさらに含む。
【００４５】
関連局面において、本発明は、本発明の抗体を個体に投与することにより、必要とする個体におけるＢＤＮＦ機能不全による障害を処置、減少、阻害、改善および／または予防する方法を提供する。処置の方法の態様は抗体に関する上記および本明細書のとおりである。いくつかの態様において、抗体は全身的にまたは局所的に、例えば、経口的に、吸入的に、静脈内に、または腹腔内に投与される。いくつかの態様において、ＢＤＮＦ機能不全による障害は、レット症候群、ＷＡＧＲ症候群、ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満および悪液質（例えば、癌、加齢、摂食障害またはオピオイドを含む薬物誘発性嘔吐による）からなる群から選択される。
【００４６】
さらなる局面において、本発明は、必要とする個体における血中グルコース濃度および／または体重を減少させる方法であって、治療有効量の本発明の抗体を個体に投与することを含む方法を提供する。処置の方法の態様は抗体に関する上記および本明細書のとおりである。方法のさらなる態様に関して、いくつかの態様において、個体は前糖尿病である。いくつかの態様において、個体はＩ型糖尿病を有する。いくつかの態様において、個体はＩＩ型糖尿病を有する。いくつかの態様において、個体は過体重である。いくつかの態様において、個体は肥満である。
【００４７】
いくつかの態様において、方法は治療有効量の血中グルコースの減少に有効な第２の薬剤を個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、第２の薬剤はインスリン、スルホニルウレア、インスリン分泌促進剤、メトホルミン、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲδアゴニスト、ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、ＰＰＡＲα／γ／δパンアゴニスト、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの態様において、方法は治療有効量の体重または肥満の減少に有効な第２の薬剤を個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、第２の薬剤はリパーゼ阻害剤、シブトラミン、ＣＢ−１阻害剤、トピラメート、アミリン、アミリン類似体、レプチン、ＰＹＹ／ＰＹＹ類似体およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体からなる群から選択される。
【００４９】
いくつかの態様において、第２の薬剤および抗体は混合物として投与される。いくつかの態様において、第２の薬剤および抗体は別々に投与される。
【００５０】
定義
“抗体”は、非共有的に、可逆的に、特定の方法において対応する抗原に結合することができる、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドまたは免疫グロブリンのフラグメントを含むポリペプチドを意味する。典型的な抗体構造単位はテトラマーを含む。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、それぞれの対がジスルフィド結合を介して結合している１つの“軽鎖”（約２５ｋＤ）および１つの“重鎖”（約５０−７０ｋＤ）を有する。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子ならびに多種多様な免疫グロブリンの可変領域遺伝子を含む。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、これらは順に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定める。それぞれの鎖のＮ−末端は、主に抗原認識に関与する約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）なる用語は、それぞれ軽鎖および重鎖のこれらの領域を意味する。本出願において使用されるとき、“抗体”は、例えば、ＴｒｋＢに特異的な特定の結合を有する、すべての抗体の変異体およびそれらのフラグメントを含む。したがって、同じ結合特異性を有する、全長抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびこれらのフラグメントの多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）は、この概念の範囲内である。
【００５１】
“相補性決定ドメイン”または“相補性決定領域”（“ＣＤＲ”）は、互換的に、ＶＬおよびＶＨの超可変領域を意味する。ＣＤＲは、このような標的タンパク質に対して特異性を有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。それぞれのヒトＶＬまたはＶＨに３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１−３、Ｎ−末端から連続して数える）が存在し、可変ドメインの約１５−２０％を構成する。ＣＤＲは標的タンパク質のエピトープと構造的に相補的であり、したがって結合特異性に直接関与する。ＶＬまたはＶＨの残りの範囲、いわゆるフレームワーク領域は、より少ないアミノ酸配列を示す（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
【００５２】
ＣＤＲおよびフレームワーク領域の位置は、当分野で既知の種々の定義を使用して決定される、例えば、Kabat, Chothia, international ImMunoGeneTicsデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブ上のimgt.cines.fr/）およびＡｂＭ（例えば、Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol., 273:927-748 (1997)、参照）。抗原結合部位の定義も、以下に記載されている：Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000);およびLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745 (1996);およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203:121-153 (1991);およびRees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
【００５３】
“結合特異性決定基”または“ＢＳＤ”なる用語は、互換的に、抗体の結合特異性を決定するために必要な相補性決定領域内の最小の連続する、または連続しないアミノ酸配列を意味する。最小の結合特異性決定基は１つ以上のＣＤＲ配列内に存在し得る。いくつかの態様において、最小の結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３配列の一部または全長内（すなわち、これにより単に決定される）に存在する。
【００５４】
本明細書において使用される“抗体軽鎖”または“抗体重鎖”は、それぞれ、ＶＬまたはＶＨを含むポリペプチドを意味する。内因性ＶＬは遺伝子セグメントＶ（可変）およびＪ（接合部）によって、そして内因性ＶＨはＶ、Ｄ（多様性）およびＪによってコードされる。ＶＬまたはＶＨのそれぞれはＣＤＲならびにフレームワーク領域を含む。本出願において、抗体軽鎖および／または抗体重鎖は、ときどき、“抗体鎖”として集合的に称され得る。これらの用語は、当業者が容易に認識することができるとき、ＶＬまたはＶＨの基本構造を壊さない変異を含む抗体鎖を含む。
【００５５】
抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により生じる多くのよく特徴付けられているフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは抗体のヒンジ領域のジスルフィド結合を消化して、それ自体ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合している軽鎖であるＦａｂ’のダイマーであるＦ（ａｂ）’２を生産する。Ｆ（ａｂ）’２を、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊するために穏やかな条件下で還元すると、Ｆ（ａｂ）’２ダイマーからＦａｂ’モノマーに変換され得る。Ｆａｂ’モノマーは本質的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂである。Fundamental Immunology 3d ed. (1993)、参照。種々の抗体フラグメントが無傷の抗体の消化なる用語において定義されるが、当業者は、このようなフラグメントが化学的にまたは組換えＤＮＡ方法論を使用することによりデノボ合成され得ることを理解している。したがって、本明細書において使用される“抗体”なる用語は、また、完全な抗体の変異により生産される抗体フラグメント、または、組換えＤＮＡ方法論を使用してデノボ合成されるもの（例えば、一本鎖Ｆｖ）、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定されるもの（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)、参照）のいずれかを含む。
【００５６】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、当分野で既知の全ての技術を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985、参照）。一本鎖抗体の生産のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産するために適用することができる。また、遺伝子組換えマウスまたは他の生物、例えば、他の哺乳動物が、ヒト化抗体を発現させるために使用され得る。あるいは、ファージディスプレイ技術は、選択された抗原に特異的に結合する抗体および異種Ｆａｂフラグメントを同定するために使用することができる（例えば、McCafferty et al., 上記；Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)、参照）。
【００５７】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化するための方法は当分野で既知である。一般的に、ヒト化抗体は、それに非ヒトである源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、インポート残基として称され、これは一般的にインポート可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓの方法（例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、参照）にしたがって本質的に実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に無傷のヒト可変ドメイン未満が非ヒト種由来の対応する配列により置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、いくつかの相補性決定領域（“ＣＤＲ”）残基および恐らくいくつかのフレームワーク（“ＦＲ”）残基が齧歯動物抗体の類似部位由来の残基により置換されている、一般的にヒト抗体である。
【００５８】
“キメラ抗体”は、（ａ）定常領域またはその一部が改変、置換または交換されて、抗原結合部位（可変領域）が異なる、または改変されたクラスの定常領域、エフェクター機能および／または種、または、キメラ抗体に新規特性を与える完全に異なる分子、例えば、酵素、トキシン、ホルモン、成長因子および薬物に結合するようになっている；または（ｂ）可変領域またはその一部が、異なる、または改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置換または交換されている、抗体分子である。
【００５９】
“可変領域”または“Ｖ領域”なる用語は、互換的にＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む重鎖または軽鎖を意味する。図１、参照。内因性可変領域は、免疫グロブリン重鎖Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子または軽鎖Ｖ−Ｊ遺伝子によってコードされる。Ｖ領域は天然、組換えまたは合成であり得る。
【００６０】
本明細書において使用される“可変セグメント”または“Ｖセグメント”なる用語は、互換的にＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３を含む可変領域の部分配列を意味する。図１、参照。内因性Ｖセグメントは、免疫グロブリンＶ遺伝子によってコードされる。Ｖセグメントは天然、組換えまたは合成であり得る。
【００６１】
本明細書において使用される“Ｊセグメント”なる用語は、ＣＤＲ３のＣ末端部分およびＦＲ４を含む可変領域の部分配列を意味する。内因性Ｊセグメントは、免疫グロブリンＪ遺伝子によってコードされる。図１、参照。Ｊセグメントは天然、組換えまたは合成であり得る。
【００６２】
“ヒト化”抗体は、ヒトにおける免疫原性が低いが、非ヒト抗体の反応性を維持している抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を維持し、抗体の残りの部分をそれらのヒトのカウンターパートで置き換えることにより達成することができる。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)、参照。
【００６３】
“対応するヒト生殖細胞配列”なる用語は、ヒト生殖細胞の免疫グロブリン可変領域配列によってコードされる他のすべての評価された可変領域のアミノ酸配列と比較して、参照可変領域のアミノ酸配列または部分配列に対して決定されたもっとも高いアミノ酸配列同一性を共有する、ヒト可変領域のアミノ酸配列または部分配列をコードする核酸配列を意味する。対応するヒト生殖細胞配列は、他のすべての評価された可変領域のアミノ酸配列と比較して、参照可変領域のアミノ酸配列または部分配列に対してもっとも高いアミノ酸配列同一性を有する、ヒト可変領域のアミノ酸配列または部分配列を意味することもできる。対応するヒト生殖細胞配列は、フレームワーク領域のみ、相補性決定領域のみ、フレームワークおよび相補性決定領域、可変セグメント（上記定義のとおり）または可変領域を含む配列もしくは部分配列の他の組合せであり得る。配列同一性は、本明細書に記載されている方法を使用して、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたは他の当分野で既知のアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列をアラインして決定することができる。対応するヒト生殖細胞の核酸またはアミノ酸配列は、参照可変領域の核酸またはアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％の配列同一性を有し得る。対応するヒト生殖細胞配列は、例えば、一般に利用することができる国際的なImMunoGeneTicsデータベース（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブ上のimgt.cines.fr/）およびＶ−ｂａｓｅ（ワールドワイドウェブ上のvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk）を介して決定することができる。
【００６４】
抗原、例えば、タンパク質と抗体または抗体由来結合剤間の相互作用の記載の関連において使用されるとき、“特異的に（または選択的に）結合”なるフレーズは、タンパク質および他の生物製剤の異種集団中で抗原の存在の決定要因となる結合反応を意味する。したがって、示される免疫アッセイ条件下で、特定の結合特異性を有する抗体または結合剤は、特定の抗原にバックグランドに対して少なくとも２倍結合し、サンプル中に存在する多量の他の抗原に実質的に結合しない。このような条件下での抗体または結合剤への特異的結合は、特定のタンパク質に対する特異性に対して選択された抗体または薬剤を必要とし得る。この選択は、例えば、他の種（例えば、マウス）由来のＴｒｋＢ分子または他のＴｒｋサブタイプ（例えば、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＣなど）と交差反応する抗体を除くことにより達成され得る。種々の免疫アッセイフォーマットが、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために日常的に使用される（特異的免疫反応性を測定するために使用することができる免疫アッセイフォーマットおよび条件の記載について、例えば、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual(1998)、参照）。一般的に特異的または選択的結合反応は、バックグラウンドシグナルに対して少なくとも２倍、さらに一般的にはバックグラウンドに対して少なくとも１０から１００倍以上のシグナルを生じる。
【００６５】
“平衡解離定数（ＫＤ、Ｍ）”なる用語は、結合速度定数（ｋａ、時間−１、Ｍ−１）で割られた解離速度定数（ｋｄ、時間−１）を意味する。平衡解離定数は当分野で既知の何らかの方法を使用して測定することができる。本発明の抗体は、一般的に約１０−７または１０−８Ｍ未満、例えば、約１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満、いくつかの態様において、約１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数を有する。
【００６６】
本明細書において使用される“抗原結合領域”なる用語は、本発明のＴｒｋＢ結合分子のドメインを意味し、これは該分子とＴｒｋＢの特異的結合に関与する。抗原結合領域は少なくとも１つの抗体重鎖可変領域および少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域を含む。少なくとも１つのこのような抗原結合領域は本発明のそれぞれのＴｒｋＢ結合分子に存在し、そしてそれぞれの抗原結合領域は他のものと同一であっても、異なっていてもよい。いくつかの態様において、本発明のＴｒｋＢ結合分子の少なくとも１つの抗原結合領域はＴｒｋＢアゴニストとして作用する。
【００６７】
“抗体アゴニスト”または“アゴニスト”なる用語は、互換的に、受容体を活性化し、全てのまたは部分的な（例えば、少なくとも６０％）受容体介在応答を誘導することができる抗体を意味する。例えば、ＴｒｋＢのアゴニストはＴｒｋＢに結合し、ＴｒｋＢ介在シグナル伝達を誘導する。いくつかの態様において、ＴｒｋＢ抗体アゴニストは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と接触したとき、ＴｒｋＢに結合し、神経突起伸長を誘導する能力により、またはそうでなければ本明細書に記載されているように同定することができる。他の態様において、ＴｒｋＢ抗体アゴニストは、本明細書に記載されているアノイキスアッセイにおいて測定される分離−依存アポトーシスから細胞を救出することができる能力により同定することができる。本明細書に記載されているアノイキスアッセイにおいて５ｎＭ未満、例えば、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは３０ｐＭ未満のＥＣ５０を有する抗ＴｒｋＢ抗体は、ＴｒｋＢ抗体アゴニストと考えられる。
【００６８】
“ＴｒｋＢ”または“チロシン受容体キナーゼＢ”なる用語は、互換的に、受容体チロシンキナーゼの３つのトロポミオシン−関連キナーゼ（Ｔｒｋ）ファミリーメンバーの１つを意味し、他のメンバーがＴｒｋＡおよびＴｒｋＣである。ＴｒｋＢは、神経栄養チロシン受容体キナーゼ（ＮＴＲＫ）ファミリーのメンバーであり、神経栄養チロシンキナーゼ２型受容体（ＮＴＲＫ２）としても既知である。ＴｒｋＢは、ニューロトロフィンと結合すると、それ自体およびＭＡＰＫ経路のメンバーをリン酸化する膜結合受容体である。ＴｒｋＢに対するリガンドは脳−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびニューロトロフィン−３を含む。例えば、Haniu, et al., Arch Biochem Biophys (1995) 322(1):256-264; Squinto, et al., Cell (1991) 65(5) 885-893;およびSoppet, et al., Cell (1991) 65(5) 895-903、参照。ＴｒｋＢを介するシグナル伝達は細胞分化を引き起こす。この遺伝子の変異は肥満および気分障害と関連している。ＴｒｋＢの異なるアイソフォームをコードする選択的転写スプライス変異が存在する。ＴｒｋＢの核酸およびアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 ＮＭ＿００１０１８０６４（ｇｉ：６５５０６７４４、ＰＲＩ １８−ＮＯＶ−２００７）の下に公開されている。ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 ＢＣ０７５８０４．１、Ｕ１２１４０．１、ＢＣ０３１８３５．１およびＡＦ４１０８９９．１も参照。本明細書において使用されるＴｒｋＢポリペプチドは、ＢＤＮＦまたはニューロトロフィン−３の結合により活性化され、それ自身およびＭＡＰＫ経路のメンバーをリン酸化することにより細胞内シグナル伝達を引き起こす、機能的にチロシンキナーゼ受容体である。構造的に、ＴｒｋＢアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 ＮＰ＿００１０１８０７４．１、ＡＡＢ３３１０９、ＡＡＬ６７９６８、ＡＡＬ６７９６４、ＡＡＣ５１３７１．１、ＡＡＨ３１８３５．１またはＡＡＬ６７９６５．１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。構造的に、ＴｒｋＢ核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 ＮＭ＿００１０１８０６４、Ｓ７６４７３、ＢＣ０７５８０４．１、Ｕ１２１４０．１、ＢＣ０３１８３５．１またはＡＦ４１０８９９．１の核酸配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
【００６９】
本発明のポリペプチドの“活性”は、天然細胞または組織におけるポリペプチドの構造、調節または生化学機能を意味する。ポリペプチドの活性の例は直接的活性および間接的活性の両方を含む。典型的な直接的活性は、リガンド結合、例えば、ＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）（例えば、Naylor et al., Biochem Biophys Res Commun. 291(3):501-7 (2002)、参照）へのＢＤＮＦの結合、セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧまたはＣａ２＋）の生産または減少、イオン流出およびリン酸化または転写レベルの変化を含む、ポリペプチドとの直接的相互作用の結果である。ＴｒｋＢの内容における典型的な間接的活性は、ポリペプチドと他の細胞または組織成分との相互作用の結果として、ポリペプチドの指定された活性に対する細胞もしくは組織における表現型または応答の変化、例えば、全血中グルコース濃度の減少として観察される。
【００７０】
成人に対して使用されるとき、“肥満”なる用語は、３０以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する個体を意味する。成人に対して使用されるとき、“過体重”は、２５以上のＢＭＩを有する個体を意味する。子供において、年齢に対する肥満度指数のグラフを使用して、８５ｔｈ以上のＢＭＩパーセンタイルを“過体重”と考え、９５ｔｈ以上のＢＭＩパーセンタイルを“肥満”と考える。例えば、Clinical Guidelines on the Identification, Evaluation, and Treatment of Overweight and Obesity in Adult (National Heart, Lung and Blood Institute, June 17, 1998)およびPreventing and Managing the Global Epidemic of Obesity in Report of the World Health Organization Consultation of Obesity (WHO, Geneva, June 1997)、参照。
【００７１】
“前糖尿病個体”は、空腹時の血液グルコース濃度が１１０ｍｇ／ｄｌを超えるが１２６ｍｇ／ｄｌ未満であるか、または２時間ＰＧ記録が１４０ｍｇ／ｄｌを超えるが２００ｍｇ／ｄｌ未満である成人を意味する。患者由来サンプルと比較するために使用されるとき、“糖尿病患者個体”は、空腹時の血液グルコース濃度１２６ｍｇ／ｄｌを超える、または２時間ＰＧ記録が２００ｍｇ／ｄｌを超える成人を意味する。“空腹時”は、少なくとも８時間カロリー摂取していないことを意味する。“２時間ＰＧ”は、水に溶解した７５ｇの無水グルコースの当量を含むグルコース負荷後の患者の血液グルコース濃度を意味する。全体的試験は、一般的に経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）と称される。例えば、Diabets Care, 2003, 26(11): 3160-3167 (2003)、参照。
【００７２】
核酸またはタンパク質に適用するとき、“単離された”なる用語は、核酸またはタンパク質が天然状態で関連している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。それは好ましくは均質状態である。それは乾燥状態または水溶液のいずれであってもよい。純度および均質性は、一般的に分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製物に存在する優勢な種類のタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子の側面に位置しており、そして興味ある遺伝子以外のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームと分離される。“精製された”なる用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルで実質的に１本のバンドを生じることを意味する。特に、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋、さらに好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００７３】
“核酸”または“ポリヌクレオチド”なる用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを意味する。具体的に限定されていない限り、該用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。他に記載のない限り、特定の核酸配列は、また、明示しなくても保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列ならびに明白に示された配列を包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を製造することにより達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
【００７４】
“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”なる用語は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。該用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模擬物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００７５】
“アミノ酸”なる用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬物を意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされているもの、ならびに、後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は天然アミノ酸と同様の基本的な化学構造を有する化合物を意味し、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合しているα炭素を有する。このような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を維持している。アミノ酸模擬体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を意味する。
【００７６】
“保存的に改変された変異体”はアミノ酸および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、または核酸がアミノ酸配列をコードしていないとき、本質的に同一の配列を意味する。遺伝子コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が任意のあるタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードするポリペプチドを変化させることなく、記載の対応するコドンのいずれかに変えることができる。このような核酸変異体は保存的に改変された変異体の１種である“サイレント変異体”である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列は、また、核酸の全ての可能なサイレント変異体を意味する。当業者は、核酸のそれぞれのコドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および、通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を得るために改変できることを理解している。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異体は、それぞれの記載されている配列に暗に含まれる。
【００７７】
アミノ酸配列について、当業者は、コードされた配列中の１つのアミノ酸または数パーセントのアミノ酸を変化、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が“保存的に改変された変異体”である（該変化は化学的に同様のアミノ酸でアミノ酸の置換をもたらす）ことを理解している。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換目録は当分野で既知である。このような保存的に改変された変異体は、多型変異体、種間相同体および本発明の対立遺伝子に加えられ、除外されない。
【００７８】
下記８個のグループはそれぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)、参照）。
【００７９】
“配列同一性パーセント”は、比較ウィンドウにわたる２つの最適アライン配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適アラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列（例えば、本発明のポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で存在する位置の数を決定し、マッチしている位置の数を得、マッチしている位置の数を比較ウィンドウの位置の全数で割り、配列同一性パーセントを得るためにその結果に１００を掛けることにより計算される。
【００８０】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、“同一”または“同一性”パーセントなる用語は、同じ配列である２つ以上の配列または部分配列についていう。２つの配列が、比較ウィンドウまたは下記配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査により測定するとき指定された領域にわたり比較し、そして最大対応のために整列させたとき、特定のパーセントの同じ（すなわち、参照配列の特定の領域、または記載のないとき全体の配列にわたり、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するとき、２つの配列は“実質的に同一”である。本発明は、本明細書において例示されたポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１−１１のいずれかの例示された可変領域；配列番号：１２−２４のいずれかの例示された可変セグメント；配列番号：２５−４２のいずれかの例示されたＣＤＲ；配列番号：４３−６１のいずれかの例示されたＦＲ；および配列番号；６２−７３のいずれかの例示された核酸配列）と実質的に同一であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する。所望により、同一性は少なくとも約１５、２５または５０のヌクレオチド長、さらに好ましくは１００から５００または１０００以上のヌクレオチド長である領域、または参照配列の全長で存在することができる。アミノ酸配列に対して、同一または実質的同一は、少なくとも５、１０、１５または２０のアミノ酸長、所望により少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００のアミノ酸長、所望により少なくとも約１５０、２００または２５０のアミノ酸長である領域、または参照配列の全長で存在することができる。より短いアミノ酸配列、例えば、２０以下のアミノ酸に対して、実質的同一は、１または２のアミノ酸残基が本明細書に定義されている保存的置換にしたがって保存的に置換されているとき、存在する。
【００８１】
配列比較のために、一般的に１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用できるか、または代わりのパラメーターを示すことができる。次に配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較して試験配列に対する配列同一性パーセントを計算する。
【００８２】
本明細書において使用される“比較ウィンドウ”は、２つの配列を最適に整列化した後、１つの配列を同数の連続位置の参照配列と比較し得る、２０から６００、通常、約５０から約２００、さらに通常、約１００から約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれかのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は、当分野で既知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューターでの手段（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または手動アラインメントおよび目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)、参照）により行うことができる。
【００８３】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために適当であるアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはAltschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に入手できる。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化したとき、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするか、または満足させるいずれかである、検索配列における長さＷの短いワードを同定することにより、高いスコアリング配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値（Altschul et al., 上記参照）と呼ばれる。これらの最初の近隣ワードヒットが、それらを含有するより長いＨＳＰの検索を開始するための種として作用する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、核酸配列について、パラメーターＭ（マッチする残基のペアに対するリワードスコア（reward score）；常に＞０）およびＮ（マッチしない残基に対するペナルティースコア（penalty score）；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。それぞれの方向でのワードのヒットの延長は、累積アラインメントスコアがその到達した最大値から数量Ｘまで低下したとき；累積スコアが１つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの累積によってゼロもしくはそれ以下になったとき；または、いずれかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（核酸配列に対して）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、および期待値（Ｅ）１０を使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックス（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915、参照）は、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００８４】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的分析も実施する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの基準は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の２つのマッチが偶然に起こるであろう確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満、より好ましくは約０．００１未満であるとき、核酸は参照配列と類似であると考えられる。
【００８５】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である目安は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが以下に記載されているとおり第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみにより異なるとき、一般的に第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の目安は、２つの分子またはそれらの相補体が以下に記載されているとおりストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに他の目安は、配列を増幅するために同じプライマーを使用することができることである。
【００８６】
抗原結合領域がどのように本発明のＴｒｋＢ結合分子内に結合しているかの説明の文脈において使用されるとき“結合”なる用語は、領域の物理的結合に関するすべての可能な手段を含む。多数の抗原結合領域は、化学結合、例えば、共有結合（例えば、ペプチド結合またはジスルフィド結合）または非共有結合により頻繁に結合し、それらの結合は直接結合（すなわち、２つの抗原結合領域間をリンカーなしで）または間接結合（すなわち、２つ以上の抗原結合領域間を少なくとも１つのリンカー分子の助けで）のいずれかであり得る。
【００８７】
“対象”、“患者”および“個体”なる用語は、互換的に哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類哺乳動物を意味する。哺乳動物は、また、実験哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターであり得る。いくつかの態様において、哺乳動物は家畜用哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）またはペット用哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）であり得る。
【００８８】
“治療許容量”または“治療有効量”なる用語は、互換的に、所望の結果（すなわち、標的細胞のアポトーシス）をもたらすために十分な量を意味する。いくつかの態様において、治療許容量は望ましくない副作用を誘導しないか、または引き起こさない。治療許容量は、最初に低い用量を投与し、次に所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することにより決定することができる。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体の“予防有効量”および“治療有効量”は、疾患症状（例えば、ＢＤＮＦを含むＴｒｋＢリガンドの機能不全による、異常に低いレベルのＴｒｋＢシグナル伝達と関連する障害の症状）の発症を予防するか、または症状のそれぞれの重症度の低下をもたらすことができる。該用語は、また、疾患症状がない頻度および期間をそれぞれ促進または増加することができる。“予防有効量”および“治療有効量”は、また、ＴｒｋＢの不十分な活性化による障害および疾患による欠陥または不全のそれぞれを予防または改善することができる。
【００８９】
本明細書において使用される“呼吸器疾患”なる用語は、無気肺、嚢胞性線維症、レット症候群（ＲＴＴ）、喘息、無呼吸（例えば、睡眠時無呼吸）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、急性呼吸困難、多呼吸、起座呼吸、リウマチ性肺疾患、肺鬱血または浮腫、慢性閉塞性気道疾患（例えば、気腫、慢性気管支炎、気管支喘息および気管支拡張症）、低換気、ピックウィック症候群、肥満−低換気症候群、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）および高炭酸を含むが、これらに限定されない。さらに“呼吸器疾患”は、また、遺伝子異常に関連する既知のヒトの状態、例えば、シャルコー・マリー・ツース病、チェーン・ストークス呼吸障害、プラダーウィリ症候群、乳幼児突然死症候群、先天性中枢性低換気、びまん性間質性疾患（例えば、サルコイドーシス、塵肺症、過敏性肺炎、細気管支炎、グッドパスチャー症候群、特発性肺線維症、特発性肺ヘモジデリン沈着症、肺胞タンパク症、剥離性間質性肺炎、慢性間質性肺炎、線維化性肺胞炎、ハンマン・リッチ症候群、肺好酸球増多症、びまん性間質性線維症、ウェゲナー肉芽腫、リンパ腫様肉芽腫および脂質性肺炎）または腫瘍（例えば、気管支癌腫、細気管支肺胞癌腫、気管支カルチノイド、過誤腫および間葉性腫瘍）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は抗体のＶ領域を含む構造単位の概略図を説明する。重鎖は３つの遺伝子ファミリー（重鎖−Ｖ、ＤおよびＪ）によってコードされ、そして軽鎖は２つの遺伝子ファミリー（カッパまたはラムダＶおよびＪ）によってコードされる。これらの遺伝子の組換えが無傷のＶ領域で生じる。ＣＤＲ３配列は、重鎖の場合、重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子の組換え部位であり、そして軽鎖の場合、カッパまたはラムダＶおよびＪ遺伝子の組換え部位である。
【００９１】
【図２】図２は参照抗体アミノ酸配列のヒトアミノ酸配列での置換の概略図を説明する。
【００９２】
【図３】図３はＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＦａｂ結合の分析を説明する。これらのカーブの数値データを表１および２に示す。
【００９３】
【図４】図４はＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＩｇＧ結合の分析を説明する。これらのカーブの数値データを表３に示す。
【００９４】
【図５】図５はＦａｂクローンＴＲ１３４−４（配列番号：７６および８０）、ＴＲ１３５−８（配列番号：７６および８１）、ＴＲ１３９−２（配列番号：７６および８２）、ＴＲ１５１−１（配列番号：７７および８２）およびＴＲ１４４−１（配列番号：７８および８１）の整列させた可変領域のアミノ酸配列（ＦＲ１からＣＤＲ３）および生殖細胞Ｖｈ１−０２（配列番号：１５）またはＶｋＩＩ Ａ２３（配列番号：７９）の一番近い一本鎖ヒト可変領域翻訳との比較を説明する。すべてのＦａｂ Ｖｈ−領域のＦＲ４（示していない）はヒト生殖細胞系ＪＨ４由来であり、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を有する。すべてのＦａｂ Ｖｋ−領域のＦＲ４（示していない）はヒト生殖細胞系Ｊｋ２由来であり、配列ＦＧＱＧＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）を有する。ＣＤＲは囲まれており、生殖細胞配列の対応する位置とは異なる残基（ＣＤＲ３“ＢＳＤ”配列を除く）は太字である。ＣＤＲ３への親和性成熟変化は下線部分であり、Ｖｋ ＣＤＲ３における生殖細胞系残基置換はイタリック体部分である。
【００９５】
【図６】図６はＩｇＧクローンＴＲ１２７−２（配列番号：７６）、ＴＲ１４３−３（配列番号：７８）、ＴＲ１５４−２（配列番号：７７）、ＴＲ１１９−１（配列番号：８４）、ＴＲ１２９−１（配列番号：８５）およびＴＲ１３７−１（配列番号：８６）の整列させた可変領域のアミノ酸配列（ＦＲ１からＣＤＲ３）および生殖細胞Ｖｈ１−０２（配列番号：１５）またはＶｋＩＩ Ａ２３（配列番号：８３）の一番近い一本鎖ヒト可変領域翻訳との比較を説明する。すべてのＩｇＧ Ｖｈ−領域のＦＲ４（示していない）はヒト生殖細胞系ＪＨ４由来であり、配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を有する。すべてのＩｇＧ Ｖｋ−領域のＦＲ４（示していない）はヒト生殖細胞系Ｊｋ２由来であり、配列ＦＧＱＧＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）を有する。ＣＤＲは囲まれており、生殖細胞配列の対応する位置とは異なる残基（ＣＤＲ３“ＢＳＤ”配列を除く）は太字である。ＣＤＲ３への親和性成熟変化は下線部分であり、Ｖｋ ＣＤＲ３における生殖細胞系残基置換はイタリック体部分である。
【００９６】
【図７】図７は、ＦａｂとヒトＶセグメントとの結合が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＡ１０Ｆ１８．２ ＩｇＧの濃度が増加することによりブロックされることを説明する。
【００９７】
【図８】図８Ａ−ＤはＮＶＰ−ＬＦＤ２５３（Ａ）、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４（Ｂ）、ＮＶＰ ＬＦＣ３２５（Ｃ）またはＮＶＰ−ＬＦＣ３２７（Ｄ）のヒトＦｃ−ＴｒｋＢへの結合を説明する。
【００９８】
【図９】図９Ａ−ＤはＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７のヒトＴｒｋＢ−ＦｃまたはＴｒｋＣ−Ｆｃ融合タンパク質へではなくヒトＴｒｋＢ−Ｆｃ融合タンパク質への特異的結合を示すＥＬＩＳＡアッセイを説明する。２μｇ／ｍｌにて精製されたＩｇＧを３つの異なるＴｒｋファミリーメンバー（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）との相互作用を試験することにより特異性を評価した。二次Ａｂは、ヤギ−抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰ検出Ａｂのみでブロックされ、処理される複製物である。
【００９９】
【図１０】図１０Ａ−Ｄはアノイキスアッセイにおいてアゴニスト活性におけるＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７の評価を説明する。精製されたＩｇＧを４８時間、ＲＩＥ−ＴｒｋＢ細胞において評価した。（−）は抗体で処理しなかった細胞である。
【０１００】
【図１１】図１１Ａ−ＤはＩｇＧ抗体ＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７に対する代表的なＢｉａｃｏｒｅキネティックトレース(kinetic trace)を説明する。Ｆｃ−ＴｒｋＢをＢｉａｃｏｒｅチップ表面に固定した。ＩｇＧの連続希釈物をチップ上に３０μＬ／分で流した。使用可能なバッファー中で、結合相を３００秒、次に解離相を１２００秒流した。
【０１０１】
【図１２】図１２は抗ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂでの長期処理がＭｅｃｐ２−Ｂｉｒｄマウスの寿命を延ばすことを説明する。Ｍｅｃｐ２ｔｍ１．１Ｂｉｒｄ ｎｕｌｌマウスは呼吸サイクルの期間の変動の増加、速いおよび遅い呼吸頻度の期間の交代、無呼吸の発生、平均呼吸頻度（および分時換気量）の増加を含むレット症候群を有する対象の多数の核呼吸機能障害を繰り返す。結局は、該マウスは致命的な呼吸不全で死ぬ。抗体Ａ１０は、本明細書に記載されている改良された抗ＴｒｋＢ抗体アゴニストの相補性結合決定基領域（ＣＤＲ）および最小結合決定基を共有する親のマウスモノクローナル抗体を意味する。
【０１０２】
【図１３】図１３は抗ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂで処理されたＭｅｃｐ２−Ｂｉｒｄマウスにおける呼吸機能の改善を説明する。抗ＴｒｋＢアゴニストｍＡｂでの処理後のＭｅｃｐ２マウスの呼吸パラメーターを全身プレチスモグラフィーにより評価した。未処理Ｍｅｃｐ２マウスは呼吸休止の増加（Ｐｅｎｈ）における年齢依存的な増加を示すが、ｍＡｂ処理動物において減少した。年齢依存的Ｐｅｎｈは、ＲＴＴ患者において表現型模写のバルサルバ法の合併症であったが、気道抵抗性の増加を示した。呼吸頻度の増加および吸気時間の減少がｍＡｂでの処理後の野生型およびＭｅｃｐ２マウスの両方で観察された。＊ｐ＜．０５、＊＊ｐ＜．０１ ｖｓ 同じ遺伝子型、反対の処理；＃ｐ＜．０５、＃＃ｐ＜．０１、＃＃＃ｐ＜．００１ ｖｓ 反対の遺伝子型、同じ処理；＄ｐ＜．０５、＄＄ｐ＜．０１、＄＄＄ｐ＜．００１ ＭｅＣＰ２−ＫＯ／Ａ１０ ｖｓ ＭｅＣＰ２−ＷＴ／ＳＡＬ。一方向ＡＮＯＶＡ、次にステューデントｔ−検定。
【０１０３】
【図１４】図１４はカニクイザルへの食物摂取および体重、次に抗ＴｒｋＢアゴニスト ｍＡｂ ＬＦＩ９８７の静脈内投与の効果を説明する。ＨＣ可変領域をサイレントＩｇＧ１骨格へ移すことにより、抗体クローンＬＦＤ２５３をＬＦＩ９８７に変換した。動物に１、５および８日目に０．３および３．０ｍｇ／ｋｇのＬＦＩ９８７を静脈注射で３回投与した。データは平均±ＳＥ；ｎ＝４−６である。繰り返し測定、次にダネット検定におけるＡｎｏｖａによる＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ベースライン、ＬＦＩ９８７は用量依存的に食物摂取および体重を有意に増加させた。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
詳細な説明
１．イントロダクション
本発明は、改良されたＴｒｋＢ作動性抗体を提供する。本発明の改良されたＴｒｋＢ作動性抗体はＴｒｋＢに特異的に結合し、ＴｒｋＢを活性化する。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体の、ＴｒｋＢアゴニストリガンド機能不全、例えば、ＢＤＮＦ機能不全による障害および疾患の症状の減少、阻害および予防における使用を見出した。本発明の抗ＴｒｋＢ作動性抗体を使用して処置できる典型的な疾患は、レット症候群、ＷＡＧＲ症候群、ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満および悪液質／消耗性症候群（例えば、癌、加齢、摂食障害または薬物による）を含む。また、抗ＴｒｋＢ作動性抗体を、必要とする対象における血中グルコース濃度を減少させるために使用することを見出した。さらに、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体を、体重増加を予防するために使用することを見出した。ＴｒｋＢ活性化が高血糖およびその関連状態、肥満、前糖尿病およびＩＩ型糖尿病を予防するために有用である。
【０１０５】
２．一般的な改良された抗ＴｒｋＢ抗体
本発明の抗体は、トロポミオシン−関連キナーゼ（Ｔｒｋ）受容体チロシンキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する。そうすることで、該抗体は、リガンド結合部位に結合し、天然リガンド（例えば、脳−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）またはニューロトロフィン−３）の結合をブロックし、アンタゴニストとして作用するか、またはアゴニストとして作用し得る。いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体はＴｒｋＢ受容体のアゴニストとして作用する。ＴｒｋＢ抗体アゴニストは、ＴｒｋＢに特異的に結合し、ＴｒｋＢ介在細胞内シグナル伝達を活性化または増加させる抗体である。抗ＴｒｋＢ抗体は所望により本発明の方法にしたがって多量体を形成し、使用することができる。抗ＴｒｋＢ抗体は、全長テトラマー抗体（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖を有する）、一本鎖抗体（例えば、ＳｃＦｖ）または１つ以上の抗原結合部位を形成し、ＴｒｋＢ−結合特異性を与える抗体フラグメントを含む、例えば、重鎖および軽鎖可変領域（例えば、Ｆａｂ’または他の同様のフラグメント）を含む分子であり得る。
【０１０６】
抗ＴｒｋＢ抗体フラグメントは組換え発現、化学合成および抗体テトラマーの酵素消化を含むが、これらに限定されない当分野で既知のいずれかの方法により生産することができ、全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え生産により得ることができる。組換え発現は、当分野で既知のすべての適当な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来し得る。存在するとき、抗ＴｒｋＢ抗体の定常領域は、すべてのタイプまたはサブタイプであり得、適当なとき、本方法により処置される対象の種（例えば、ヒト、非ヒト霊長類または他の哺乳動物、例えば、家畜用哺乳動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ラクダ）、ペット用哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ）または齧歯動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ））から選択することができる。
【０１０７】
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体または抗原結合分子は、ラクダ骨格を有する一本鎖ドメイン抗原結合単位も含む。ラクダファミリーの動物は、ラクダ、ラマおよびアルパカを含む。ラクダは軽鎖を欠いている機能抗体を生産する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自発的に折り畳み、抗原結合単位として独立して機能する。その結合表面は、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲのみを含む。ラクダ抗体は慣用の抗体の親和性に相当する結合親和性を達成することができる。本明細書において例示された抗ＴｒｋＢ抗体の結合特異性を有するラクダ骨格ベース抗ＴｒｋＢ分子は、当分野で既知の方法、例えば、Dumoulin et al., Nature Struct. Biol. 11:500-515, 2002; Ghahroudi et al., FEBS Letters 414:521-526, 1997;およびBond et al., J Mol Biol. 332:643-55, 2003を使用して生産することができる。
【０１０８】
本発明の改良された抗ＴｒｋＢ抗体は、参照抗体の特異性および親和性を維持しているが、ヒト生殖細胞Ｖ領域配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するＶ領域配列を有する、加工されたヒト抗体である。米国特許公開第２００５／０２５５５５２号および米国特許公開第２００６／０１３４０９８号、参照（これら両方の文献は出典明示により本明細書に包含させる）。改良の方法は、参照抗体の可変領域から抗原結合特異性を同定するために必要とされる最小の配列情報を同定し、その情報をヒトの部分Ｖ領域遺伝子配列のライブラリーに移し、ヒト抗体Ｖ領域のエピトープ−フォーカストライブラリーを製造する。微生物ベース分泌系は、抗体Ｆａｂフラグメントのようなライブラリーメンバーを発現するために使用することができ、ライブラリーを、例えば、コロニーリフト結合アッセイを使用して、抗原−結合Ｆａｂに関してスクリーニングする。例えば、米国特許公開第２００７／００２０６８５号、参照。陽性クローンは、最も高い親和性を有するクローンを同定するために、さらに特徴付けることができる。得られた加工されたヒトＦａｂは、親である参照抗ＴｒｋＢ抗体の結合特異性を維持し、一般的に親抗体と比較して抗原に対して同等またはそれより高い親和性を有し、ヒト生殖細胞系の抗体Ｖ領域と比較して高い配列同一性であるＶ領域を有する。
【０１０９】
エピトープ−フォーカストライブラリーを製造するために必要とされる最小の結合特異性決定基（ＢＳＤ）は、一般的に、重鎖ＣＤＲ３（“ＣＤＲＨ３”）内の配列および軽鎖ＣＤＲ３（“ＣＤＲＬ３”）内の配列により示される。ＢＳＤはＣＤＲ３の一部または全長を含み得る。ＢＳＤは連続する、または連続しないアミノ酸残基を含み得る。いくつかの場合において、エピトープ−フォーカストライブラリーは、ＢＳＤおよびヒト生殖細胞系Ｊセグメント配列を含む参照抗体からの独特のＣＤＲ３−ＦＲ４領域に連結したヒトＶセグメント配列から構築される（図１および米国特許公開第２００５／０２５５５５２号、参照）。あるいは、ヒトＶセグメントライブラリーは、参照抗体Ｖセグメントの一部のみが最初にヒト配列のライブラリーにより置換される順次カセット置換により製造することができる。次に、残りの参照抗体アミノ酸配列の文脈において、結合をサポートする同定されたヒト“カセット”を、第２のライブラリースクリーンにおいて再結合し、完全なヒトＶセグメントを製造する（米国特許公開第２００６／０１３４０９８号、参照）。
【０１１０】
それぞれの場合において、参照抗体の特異性決定基を含む、対の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３セグメント、ＣＤＲ３−ＦＲ４セグメントまたはＪセグメントは、ライブラリーから得られた抗原結合剤が参照抗体のエピトープ−特異性を維持することができるように、結合特異性を抑制するために使用される。さらなる成熟変化を、最適の結合速度を有する抗体を同定するために、ライブラリー構築中にそれぞれの鎖のＣＤＲ３領域において導入することができる。得られた加工されたヒト抗体は、ヒト生殖細胞系ライブラリー由来のＶセグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内の短いＢＳＤ配列を維持し、ヒト生殖細胞系フレームワーク４（ＦＲ４）領域を有する。
【０１１１】
したがって、いくつかの態様において、抗ＴｒｋＢ抗体は、元の、または参照モノクローナル抗体由来の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３内の最小の結合配列決定基（ＢＳＤ）を含む。重鎖および軽鎖可変領域（ＣＤＲおよびＦＲ）、例えば、ＶセグメントおよびＪセグメントの残りの配列は、対応するヒト生殖細胞および親和性成熟アミノ酸配列に由来する。Ｖセグメントは、ヒトＶセグメントライブラリーから選択することができる。さらなる配列純化は親和性成熟により成し遂げることができる。
【０１１２】
他の態様において、抗ＴｒｋＢ抗体の重鎖および軽鎖は、例えば、ヒトＶセグメントライブラリーから選択される、対応するヒト生殖細胞配列由来のヒトＶセグメント（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３）および元のモノクローナル抗体からのＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントを含む。ＣＤＲ３−ＦＲ４配列セグメントは、さらに、配列セグメントを対応するヒト生殖細胞配列と置き換えることにより、および／または親和性成熟により純化され得る。例えば、ＢＳＤを取り囲むＦＲ４および／またはＣＤＲ３配列を対応するヒト生殖細胞配列で置き換えることができるが、元のモノクローナル抗体のＣＤＲ３からのＢＳＤは維持されている。
【０１１３】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖細胞配列はＶｈ１−０２である。いくつかの態様において、重鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖細胞配列はＪＨ４である。いくつかの態様において、重鎖Ｊセグメントはヒト生殖細胞ＪＨ４部分配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を含む。ヒト生殖細胞ＪＨ４由来の全長ＪセグメントはＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：７４）である。可変領域遺伝子は、免疫グロブリン可変領域遺伝子に関する標準命名にしたがって命名される。現在の免疫グロブリンの遺伝子情報は、例えば、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）、Ｖ−ｂａｓｅおよびＰｕｂＭｅｄデータベースにおけるワールドワイドウェブを介して利用することができる。Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16; Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74; Exp Clin Immunogenet. 2001;18(4):242-54;およびGiudicelli, et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61も参照。
【０１１４】
いくつかの態様において、軽鎖Ｖセグメントの対応するヒト生殖細胞配列はＶＫＩＩ Ａ２３である。いくつかの態様において、軽鎖Ｊセグメントの対応するヒト生殖細胞配列はＪｋ２である。いくつかの態様において、軽鎖Ｊセグメントはヒト生殖細胞Ｊｋ２部分配列ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）を含む。ヒト生殖細胞Ｊｋ２由来の全長ＪセグメントはＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：７５）である。
【０１１５】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントはアミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ（Ｇ／Ａ）Ｙ（Ｄ／Ｙ）ＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩ（Ｄ／Ｎ）Ｐ（Ｎ／Ｒ）ＳＧ（Ｇ／Ｄ）Ｔ（Ｎ／Ｒ／Ｓ）Ｙ（Ａ／Ｋ）ＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬ（Ｈ／Ｓ）ＲＬ（Ｒ／Ｔ）ＳＤＤＴＡＶＹＹＣ（Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ｒ）（配列番号：１６）と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。いくつかの態様において、軽鎖Ｖセグメントはアミノ酸配列Ｄ（Ｉ／Ｖ）ＶＭＴＱ（Ｓ／Ｔ）ＰＬＳ（Ｌ／Ｓ）ＰＶＴＬＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬ（Ｌ／Ｖ）ＨＳ（Ｄ／Ｎ）ＧＮＴＹＬ（Ｎ／Ｓ）Ｗ（Ｌ／Ｙ）ＱＱ（Ｋ／Ｒ／Ｔ）ＰＧＱＰＰＲＬＬＩＹＫＩＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＡＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ（配列番号：２４）と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
【０１１６】
いくつかの態様において、重鎖Ｖセグメントは配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４または配列番号：１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
【０１１７】
いくつかの態様において、軽鎖Ｖセグメントは配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２または配列番号：２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を共有する。
【０１１８】
いくつかの態様において：
ｉ）重鎖ＣＤＲ３はアミノ酸配列モチーフＶ（Ｔ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｎ）ＷＦＡＹ（配列番号：３４）を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３はアミノ酸配列モチーフ（Ｓ／Ｍ）ＱＧＴ（Ｈ／Ａ）（Ｅ／Ｖ／Ｉ）ＰＹＴ（配列番号：４２）を含む。
【０１１９】
いくつかの態様において：
ｉ）重鎖ＣＤＲ３はＶＴＴＷＦＡＹ（配列番号：３２）およびＶＴＳＷＦＡＹ（配列番号：３３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３はＭＱＧＴＨＥＰＹＴ（配列番号：４０）およびＭＱＧＴＨＶＰＹＴ（配列番号：４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
いくつかの態様において、本発明の抗体はアミノ酸配列（Ａ／Ｇ）Ｙ（Ｄ／Ｙ）ＭＨ（配列番号：２７）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＷＩ（Ｄ／Ｎ）Ｐ（Ｎ／Ｒ）ＳＧ（Ｇ／Ｄ）Ｔ（Ｎ／Ｒ／Ｓ）Ｙ（Ａ／Ｋ）ＱＫＦＱＧ（配列番号：３１）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列Ｖ（Ｔ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｎ）ＷＦＡＹ（配列番号：３４）を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。
【０１２１】
いくつかの態様において、本発明の抗体はアミノ酸配列ＲＳＳＱＳＬ（Ｌ／Ｖ）ＨＳＮＧＮＴＹＬ（Ｎ／Ｓ）（配列番号：３８）を含むＣＤＲ１；アミノ酸配列ＫＩＳＮＲＦＳ（配列番号：３９）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸配列（Ｓ／Ｍ）ＱＧＴ（Ｈ／Ａ）（Ｅ／Ｖ／Ｉ）ＰＹＴ（配列番号：４２）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１２２】
いくつかの態様において、重鎖可変領域は配列番号：４３のアミノ酸配列を含むＦＲ１；配列番号：４４のアミノ酸配列を含むＦＲ２；配列番号：４９のアミノ酸配列を含むＦＲ３；および配列番号：５０のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定されたアミノ酸配列は、１つ以上の置換されているアミノ酸（例えば、親和性成熟から）または１つ以上の保存的に置換されているアミノ酸を有し得る。
【０１２３】
いくつかの態様において、軽鎖可変領域は配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＦＲ１；配列番号：５９のアミノ酸配列を含むＦＲ２；配列番号：６０のアミノ酸配列を含むＦＲ３；および配列番号：６１のアミノ酸配列を含むＦＲ４を含む。同定されたアミノ酸配列は１つ以上の置換されているアミノ酸（例えば、親和性成熟から）または１つ以上の保存的に置換されているアミノ酸を有し得る。
【０１２４】
それらの全長にわたって、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体の可変領域は、一般的に対応するヒト生殖細胞の可変領域のアミノ酸配列と少なくとも約９０％、例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性の全可変領域（例えば、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）アミノ酸配列を有する。例えば、抗ＴｒｋＢ抗体の重鎖は、ヒト生殖細胞の可変領域Ｖｈ１−０２／ＪＨ４と少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を共有することができる。抗ＴｒｋＢ抗体の軽鎖は、ヒト生殖細胞の可変領域ＶＫＩＩ Ａ２３／Ｊｋ２と少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を共有することができる。いくつかの態様において、フレームワーク領域内のアミノ酸のみが付加され、欠失され、または置換されている。いくつかの態様において、配列同一性比較はＣＤ３を除く。
【０１２５】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：４の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および軽鎖配列番号：１１の可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１２６】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および軽鎖配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１２７】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および配列番号：８の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む（すなわち、クローン ＬＦＣ３２５）。
【０１２８】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および配列番号：９の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む（すなわち、クローン ＬＦＣ３２７）。
【０１２９】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：１の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および配列番号：１０の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む（すなわち、クローン ＬＦＤ２５３）。
【０１３０】
いくつかの態様において、本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、配列番号：３の重鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する重鎖可変領域および配列番号：８の軽鎖可変領域と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む（すなわち、クローン ＬＦＤ２５４）。
【０１３１】
２０未満のアミノ酸長の同定されたアミノ酸配列に関して、所望の特異的結合および／またはアンタゴニスト活性を維持している限り、１または２つの保存的アミノ酸残基置換は許容することができる。
【０１３２】
本発明の抗ＴｒｋＢ抗体は、一般的に約１０−８Ｍまたは１０−９Ｍ未満、例えば、約１０−１０Ｍまたは１０１１Ｍ未満、いくつかの態様において、約１０−１２Ｍまたは１０−１３Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）でＴｒｋＢに結合する。
【０１３３】
３．ＴｒｋＢ作動性抗体を同定するためのアッセイ
作動性抗体は、抗ＴｒｋＢ抗体を製造し、次にそれぞれの抗体をＴｒｋＢ介在事象を引き起こす、例えば、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の分化および／またはデンドリマー化（dendrification）を開始する能力について試験するか、可能性のあるＴｒｋＢアゴニストでの細胞の処理に応答したアノイキス（細胞基質相互作用の喪失によるアポトーシス）からの救出を測定するか、または、ＢａＦ３／ＴｒｋＢ細胞増殖アッセイを使用することにより同定することができる。
【０１３４】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙアッセイは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を平板培養し、細胞をレチノイン酸と、可能性のある作動性抗体および／またはＢＤＮＦの存在下または非存在下で処理し、次に神経突起伸長を測定することを含む。一般的に、レチノイン酸単独は少しの神経突起伸長を誘導する。ＢＤＮＦ単独は有意な神経突起伸長を誘導せず、抗体単独は有意な神経突起伸長を誘導しない。しかしながら、レチノイン酸、ＢＤＮＦおよび抗体で処理された細胞は大規模な神経突起伸長を示す。典型的なＳＨ−ＳＹ５ＹアッセイはKaplan DR, et al., Neuron 11:321-331 (1993)に記載されている。抗ＴｒｋＢ作動性抗体に関するアッセイ試験において、ＢＤＮＦを試験抗体と置き換える。陽性対照細胞をＢＤＮＦに暴露する。
【０１３５】
ＢａＦ３造血細胞／ＴｒｋＢ細胞増殖アッセイは、ＴｒｋＢ受容体アゴニズムにより刺激される細胞の増殖を測定することを含む。例えば、ＢａＦ３細胞をＩＬ−３含有完全ＲＰＭＩ培地で増殖させ、ＴｒｋＢを発現するレトロウイルスで感染させる。細胞をＩＬ−３の非存在下で洗浄し、並べる。可能な作動性抗体および細胞生存を、適当なインキュベーション後、（例えば、発光細胞生存能力検出試薬、例えば、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ ＧｌｏＴＭを使用して）測定する。陽性対照細胞をＢＤＮＦでインキュベートする。
【０１３６】
アノイキスアッセイは、ラット腸上皮性（ＲＩＥ）／ＴｒｋＢ細胞を（例えば、ＤＭＥＭ培地中で）再懸濁し、細胞を、所望によりマルチウェル容器中で、可能性のある作動性抗体（例えば、１−２０μｇ／ｍｌの抗体の１０μｌで２．５×１０４細胞）と接触させることを含む。混合物をＢＤＮＦ対照の存在または非存在下でインキュベートし、次に細胞生存能力について（例えば、発光細胞生存能力検出試薬、例えば、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ ＧｌｏＴＭを使用して）測定する。典型的なアノイキスアッセイはDouma et al., Nature 430:1034-1039(2004)に記載されている。
【０１３７】
ＴｒｋＢアゴニストは、また、細胞をビンブラスチンおよびシスプラチン毒性から保護する能力について、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞で評価することができる。このアッセイは、例えば、Scala et al., Cancer Res. 56(16):3737-42 (1996);およびJaboin et al., Cancer Res. 62(22):6756-63 (2002)に記載されている。
【０１３８】
４．抗ＴｒｋＢ作動性抗体を使用する方法
本発明の抗ＴｒｋＢ作動性抗体は、呼吸器障害および疾患、特に不十分なＴｒｋＢシグナル伝達によるもの；ＢＤＮＦ機能不全による障害および疾患；ならびに不十分なＴｒｋＢシグナル伝達による低い腸運動の疾患（例えば、炎症性腸症候群）を含む、ＴｒｋＢ活性の増加により恩恵を受ける何らかの疾患または状態を処置または改善するために使用することができる。
【０１３９】
本発明のＴｒｋＢ作動性抗体はＴｒｋＢと相互作用し、それによりＴｒｋＢ機能を調節することができる。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体は、ＴｒｋＢの１つ以上の生物学的機能を調節する（例えば、促進する）ことができる。例えば、ＴｒｋＢ作動性抗体は、ＴｒｋＢの二量体化、次にＴｒｋＢ細胞内ドメインにおいて特定のチロシン残基の自己リン酸化を調節することができる。さらなる例として、ＴｒｋＢ作動性抗体は、ＴｒｋＢ関連細胞内シグナル伝達カスケード（例えば、マイトージェン活性タンパク質キナーゼ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼおよびＰＬＣγ経路）を開始させ、神経細胞死の抑制、神経突起伸長の促進およびニューロトロフィンの他の効果を引き起こすことができる。
【０１４０】
いくつかの態様において、本明細書に記載されているＴｒｋＢ作動性抗体は、ＢＤＮＦ模擬物として作用し、ＢＤＮＦおよび他のＴｒｋＢアゴニストリガンドの栄養活性を繰り返すために使用することができ、それにより、神経保護および神経栄養効果を発揮する。本願方法の抗ＴｒｋＢ作動性抗体は、ＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合し、それによりＴｒｋＢ経路活性化およびシグナル伝達を活性化、増強または持続させることができる。いくつかの態様において、該ＴｒｋＢ作動性抗体はＴｒｋＢリガンド結合ドメインに結合し、それによりＴｒｋＢへの結合に対してＢＤＮＦと競合する。
【０１４１】
したがって、ＴｒｋＢ作動性抗体はインビトロおよびインビボでＴｒｋＢ経路シグナル伝達を促進するために使用することができる。本発明のＴｒｋＢ作動性抗体を、（例えば、罹患している対象におけるＢＤＮＦ機能不全または別のＴｒｋＢアゴニストリガンドの機能不全による）異常に低いレベルのＴｒｋＢ経路シグナル伝達と関連する障害の症状を診断、阻害、予防、改善、その障害から保護およびその障害を処置するために使用することを見出した。ＴｒｋＢシグナル伝達の異常下方調節と関連する障害の非限定的な例は、例えば、ＭｅＣＰ２（これはＢＤＮＦに直接結合する）をコードする遺伝子における変異により特徴づけられるレット症候群（ＲＴＴ）；ＴｒｋＢ機能欠失変異による深刻な肥満および発育遅延（Giles, S., et al. (2004) Nature Neuroscience 7:1187-9）、ウィルムス腫瘍、無虹彩、尿生殖器異常および知的障害（ＷＡＧＲ）症候群（Han, et al., N Engl J Med (2008) 359(9):918-27）、メラノコルチン受容体ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満（Farooqi and O'Rahilly, Endocrine Rev (2006) 27(7):710-18）、悪液質／筋肉消耗性症候群（Lin, et al., PloS, 3(4):e1900; WO 2007/088476）を含む。
【０１４２】
したがって、本発明は、治療または予防有効量の本明細書に記載されているＴｒｋＢ作動性抗体；および医薬担体を含む医薬組成物を投与することを含む、ＢＤＮＦ機能不全（例えば、レット症候群（ＲＴＴ）、ＷＡＧＲ症候群、メラノコルチン受容体ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満、悪液質／筋肉消耗性症候群）による障害および疾患を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載されている抗ＴｒｋＢ抗体は、全身的にまたは局所的に、例えば、経口的に、吸入的に、静脈内に、または腹腔内に投与される。
【０１４３】
本明細書に記載されている抗ＴｒｋＢ抗体を、また、呼吸疾患および障害、特にＴｒｋＢ活性の不十分によるものの処置、診断、予防および／または改善するために使用することを見出した。典型的な呼吸器疾患は、レット症候群、睡眠時無呼吸、ピックウィック症候群および本明細書に記載されている他のものを含む。
【０１４４】
いくつかの態様において、医薬組成物は、さらに呼吸困難（例えば、呼吸窮迫）の症状の処置、診断、予防および／または改善において使用するための別の独立した薬剤、例えば、ノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例えば、限定はしないが、三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンおよびより選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチン）、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子、例えば、アンパカイン、ＣＸ５４６、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤を含む）を含む。
【０１４５】
いくつかの態様において、呼吸器疾患または呼吸困難の症状の処置、診断、予防および／または改善に有効な治療および／または予防有効量の第２の薬剤をＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）と組み合わせて個体に投与する。いくつかの態様において、第２の薬剤およびＴｒｋＢの抗体アゴニスト（または同じものを含む医薬組成物）を混合物として投与する。いくつかの態様において、第２の薬剤はノルエピネフリンおよび／またはセロトニン経路の小分子活性化因子（例は三環式抗鬱剤デシプラミン（ＤＭＩ）、セロトニン１Ａ受容体部分的アゴニスト、ブスピロンならびにより選択的な抗鬱剤フルオキセチンおよびレボキセチンである）、グルタミン酸ＡＭＰＡ受容体の活性化因子、例えば、アンパカイン、ＣＸ５４６、プロスタグランジン、プロゲステロンまたはＴｒｋＢ活性の増強剤（例えば、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤）からなる群から選択される。
【０１４６】
本発明は、また、抗ＴｒｋＢ作動性抗体または同じものを含む医薬組成物を投与することを含む、呼吸窮迫の症状またはＴｒｋＢからの細胞内シグナル伝達の不十分による呼吸器疾患を処置、診断、予防および／または改善する方法を提供する。該症状は呼吸窮迫（例えば、喘鳴またはゼイゼイ音、呼吸停止、浅呼吸、過呼吸、遷延性無呼吸）、血液の酸素化の低下または減少（例えば、チアノーゼ、例えば、酸素の吸収障害、血液での肺の不十分な潅流などによる）、ノルエピネフリン（ＮＥ）含有量の減少、骨髄におけるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現ニューロンの減少および胸痛を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、該方法は治療または予防有効量の本明細書に記載されているチロシンキナーゼ受容体Ｂ（ＴｒｋＢ）の抗体アゴニストを個体に投与することを含む。いくつかの態様において、該方法は治療または予防有効量のＴｒｋＢ作動性抗体および医薬担体を含む医薬組成物を個体に投与することを含む。いくつかの態様において、個体はレット症候群を有し、そして／または１つ以上の呼吸困難の症状を経験している。いくつかの態様において、個体は呼吸困難の症状に感染しやすい。
【０１４７】
いくつかの態様において、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体は、個体の高血糖および／または糖尿病またはそれらの症状を処置または軽減するために使用される。あるいは、または組合せにおいて、本発明の抗体は必要とする個体の体重を減少させるために使用することができる。いくつかの態様において、抗体は肥満を軽減するために使用される。これはインスリン抵抗性およびＩＩ型糖尿病により発症しやすい肥満個体に対して特に有効であり得る。
【０１４８】
本発明は、本明細書に記載されているＴｒｋＢ作動性抗体（または同じものを含む医薬組成物）を投与することを含む神経細胞死を抑制する方法を提供する。例えば、本発明は、また、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体を必要とする個体に投与することにより神経変性または中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を処置または予防するための方法を提供する。典型的なＣＮＳ疾患は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病またはＡＬＳ疾患を含む。
【０１４９】
ＴｒｋＢ活性の増加は、また、薬物乱用の軽減に関与している。例えば、米国特許公開第２００５／０２０３０１１号、参照。したがって、本発明は、本発明のＴｒｋＢ作動性抗体を必要とする個体に投与することにより薬物（例えば、アルコール、ニコチンおよび／または麻薬）乱用および依存を軽減するための方法を提供する。
【０１５０】
いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体は一本鎖抗体である。いくつかの態様において、抗体はチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない。いくつかの態様において、抗体はニューロトロフィン受容体ｐ７５ＮＲに結合しない。いくつかの態様において、抗体はヒトＴｒｋＢに特異的に結合し、他の種のＴｒｋＢ（例えば、非ヒト霊長類またはマウスＴｒｋＢ）に最小限の結合をするか、あるいは結合しない。いくつかの態様において、抗体はヒトＴｒｋＢに特異的に結合し、他の種のＴｒｋＢに同様に結合する（すなわち、マウス、ラットおよび／または非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）を含む他の種のＴｒｋＢと交差反応する）。
【０１５１】
５．医薬組成物
本発明は、抗ＴｒｋＢ抗体または抗原結合分子を含む、薬学的に許容される担体とともに製剤化された医薬組成物に関する。組成物はさらに挙げられている障害を処置または予防するために適当である他の治療剤を含むことができる。薬学的担体は組成物を増強または安定にするか、または組成物の製造を容易にする。薬学的に許容される担体は生理学的に適合する、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
【０１５２】
本発明の医薬組成物は、種々の当分野で既知の方法により投与することができる。投与ルートおよび／または経路は所望の結果に依存して変化する。投与は静脈内、筋肉内、腹膜内または皮下であることが好ましく、また、標的部位の近接に投与される。薬学的に許容される担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、経鼻、吸入、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適しているべきである。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性および多重特異性分子を、化合物を不活性にし得る酸および他の天然条件の作用から化合物を保護するために物質でコーティングし得る。
【０１５３】
抗体単独、または他の適当な成分との組合せは、吸引により投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらは“噴霧”され得る）で製造され得る。エアロゾル製剤は、許容される高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに注入され得る。
【０１５４】
いくつかの態様において、組成物は無菌および液体である。適切な流動性は、例えば、コーティング剤、例えば、レシチンの使用、分散物の場合、必要な粒径の維持および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトールおよび塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の吸収の延長は組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含むことにより実現することができる。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は、既知であり当分野で日常的に実施されている方法にしたがって製造することができる。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法により部分的に決定される。したがって、本発明の医薬組成物の適当な種々の製剤がある。抗体を製剤化し、適当な用量およびスケジュールを決定するために適用することができる方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., 2005, Lippencott Williams & Wilkins (2006);and Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press., and in Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978（これらそれぞれを出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。医薬組成物は好ましくはＧＭＰ条件下で製造される。一般的に、治療有効量または有効用量の抗ＴｒｋＢ抗体が本発明の医薬組成物において使用される。抗ＴｒｋＢ抗体は当業者に既知の慣用の方法により薬学的に許容される投与形態に製剤化される。投与レジメンは所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調節される。治療または予防有効量の決定において、低い用量を投与し、次に最小の副作用で、または望ましくない副作用がなく所望の効果が達成されるまで徐々に増加する。例えば、単回ボーラスで投与してもよく、経時的に数回の分割投与で投与してもよく、または治療状況の緊急性により指示されるとき、それに伴って用量を減少または増加してもよい。とりわけ、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で調剤することが有利である。本明細書において使用される投与単位形態は処置される対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を意味し；それぞれの単位は必要な医薬担体と一緒に所望の治療効果を引き起こすように計算されたあらかじめ決められた量の活性な化合物を含む。
【０１５６】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成物および投与経路に関して所望の治療応答を達成するために有効な活性成分の量を得るために変化させることができる。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態および病歴ならびに因子などを含む種々の薬物動態因子に依存する。
【０１５７】
医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要な量よりも低い用量で医薬組成物において使用される本発明の抗体の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。一般的に、本発明の組成物の有効用量は、処置される特定の疾患または状態、投与様式、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の薬剤および処置が予防的または治療的であるかどうかを含む多数の異なる因子に依存して変化する。処置用量は安全性および有効性を最適化するために漸増する必要がある。抗体の投与に関して、用量は約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ、さらに通常、０．０１から５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。典型的な処置レジメンは、２週間に１回または１月に１回または３から６月に１回の投与を含む。
【０１５８】
薬剤が核酸である態様において、典型的な用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。いくつかの態様において、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０ｍｇ／ｋｇ体重。
【０１５９】
抗体は単回または複数回で投与され得る。抗体を通常、複数回投与する。各投与間の間隔は、１週、１月、または１年ごとであり得る。間隔は、また、患者の抗ＴｒｋＢ抗体の血中レベルを測定することにより示されるように不定期であり得る。いくつかの方法において、用量は１−１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度、いくつかの方法において２５−３００μｇ／ｍｌを達成するように調節される。あるいは、抗体を持続放出製剤として投与することができ、この場合、投与頻度は少なくてよい。用量および頻度は患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般的に、ヒト化抗体がキメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。用量および投与頻度は処置が予防的または治療的であるかどうかに依存して変化し得る。予防的適用において、比較的低用量を比較的低頻度で長期間投与する。ある患者は残りの生涯、処置を受け続ける。治療的適用において、ときどき、比較的高用量を比較的短間隔で、疾患の進行を遅らせるかもしくは停止させるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで必要である。その後、患者は予防レジメンで投与され得る。
【０１６０】
ＴｒｋＢ抗体アゴニストは、体重を減少させるか、血中グルコース濃度を減少させるか、糖尿病を処置するか、もしくは糖尿病症状を緩和するか、神経変性疾患を処置するか、または薬物乱用を減少させるために有効であることが既知である薬剤と組み合わせて使用することができる。糖尿病を処置するために使用される典型的な薬剤は、例えば、インスリン；スルホニルウレア（例えば、グリピジドおよびアマリール）およびインスリン分泌促進剤（例えば、ナテグリニドおよびレパグリニド）；メトホルミン；ＰＰＡＲガンマアゴニスト（例えば、ロシグリタゾンおよびピオグリタゾン）ならびにＰＰＡＲアルファ、ＰＰＡＲデルタ、ＰＰＡＲアルファ／ガンマデュアルアゴニストおよびＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタパンアゴニスト；アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース）；ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（例えば、ビルダグリプチン）；およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体（例えば、エクセナチド）を含む。肥満を処置するために使用される典型的な薬剤は、例えば、リパーゼ阻害剤（例えば、オルリスタット）；シブトラミン；ＣＢ−１阻害剤（例えば、リモナバント）；トピラメート；アミリン／アミリン類似体（例えば、プラムリンチド）、レプチン、ＰＹＹ／ＰＹＹ類似体；およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体（例えば、エクセナチド）を含む。
【０１６１】
活性剤は、ＴｒｋＢ作動性抗体と共に混合物で投与することができ、また、それぞれ別々に投与することもできる。必ずしも必要ではないが、抗体薬剤および他の活性剤を同時に投与することができる。
【実施例】
【０１６２】
実施例
以下の実施例は、本願発明を限定することなく、説明のために提供する。
【０１６３】
実施例１：
以下の実施例はヒト生殖細胞のＶ領域配列と実質的にアミノ酸配列同一性を有する抗ＴｒｋＢ抗体の構築およびスクリーニングを提供する。
【０１６４】
方法
Ｖ領域のサブクローニング
Ｖ領域を元のモノクローナル抗体Ａ１０Ｆ１８．２からサブクローニングした。ＰＣＲを使用して、Ｖ−重鎖およびＶ−カッパ領域のＶ遺伝子を増幅させ、クローニングに適当な制限酵素部位を発現ベクターに取り込ませた。Ｖ領域をＦａｂフラグメントとしてクローニングし、発現ベクターから大腸菌において発現させた。参照ＦａｂをＴｒｋＢ−抗原結合に対して試験した。ＴＲ３−１と称する。
【０１６５】
Ｖ領域もＩｇＧ発現ベクターにクローニングした。ＰＣＲ増幅および付加された制限酵素認識部位を有するプライマーを使用して、Ｖｈ領域を増幅させ、ヒトＩｇＧ１定常領域を含み、アンピシリンおよびネオマイシン耐性を与える発現ベクターにてクローニングした。ＰＣＲ増幅および付加された制限酵素認識部位を有するプライマーを使用して、Ｖｋ領域を増幅させ、ヒトカッパ定常領域を含み、アンピシリンおよびハイグロマイシン耐性を与える発現ベクターにてクローニングした。これらのベクターを種々の組合せにおいて試験し、機能分析のために完全ＩｇＧの一団を生産した。
【０１６６】
抗体精製
Ｆａｂフラグメントは、発現ベクターを使用して大腸菌からの分泌により発現させた。細胞を０．６のＯＤ６００まで２×ＹＴ培地中で増殖させた。３時間、３３℃でＩＰＴＧを使用して発現を誘導した。構築されたＦａｂをペリプラズム画分から得、標準方法にしたがって、連鎖球菌タンパク質Ｇを使用するアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇ ＨＰカラム；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。ＦａｂをｐＨ２．０のバッファー中で溶離し、即座にｐＨ７．０に調節し、ｐＨ７．４のＰＢＳ（ＰＢＳはカルシウムおよびマグネシウムなしである）にて透析した。
【０１６７】
ＩｇＧを一過性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地（無血清）から生産した。ＩｇＧを、標準方法にしたがって、タンパク質Ａを使用するアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａ ＨＰカラム；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。ＦａｂをｐＨ２．７のバッファーに溶離し、即座にｐＨ７．０に調節し、ｐＨ７．４のＰＢＳ（ＰＢＳはカルシウムおよびマグネシウムなしである）にて透析した。
【０１６８】
一般的なＥＬＩＳＡ
１００ｎｇの組換えＦｃ−ＴｒｋＢ抗原を、一晩４℃でのインキュベーションにより、９６ウェルマイクロタイタープレートに結合させた。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（“ＰＢＳＴ”）中の５％のミルク溶液で１時間、３３℃でブロックした。精製されたＦａｂをＰＢＳで希釈し、５０μｌをそれぞれのウェルに加えた。１時間３３℃でインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回濯いだ。５０μｌの抗−ヒト−カッパ鎖ＨＲＰコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ；ＰＢＳＴにて０．１ｎｇ／ｍｌに希釈された）をそれぞれのウェルに加え、プレートを４０分、３３℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回およびＰＢＳで１回洗浄した。１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（“ＴＭＢ”）基質（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれのウェルに加え、プレートを〜５分間、室温でインキュベートした。反応を停止するために、１００μｌの０．２ＮのＨ２ＳＯ４をそれぞれのウェルに加えた。プレートを分光光度計において４５０ｎｍにて読んだ。
【０１６９】
ブロッキングＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇのＦｃ−ＴｒｋＢ抗原で被覆した。２倍希釈シリーズのＡ１０Ｆ１８．２ ＩｇＧを１時間、室温で抗原とインキュベートした。非結合ＩｇＧを洗い流し、５０ｎＭのＦａｂ溶液をそれぞれのウェルに加え、１時間、室温でインキュベートした。非結合Ｆａｂを洗い流し、結合Ｆａｂを抗−ヒトカッパ−ＨＲＰコンジュゲートで検出した。
【０１７０】
コロニーリフト結合アッセイ（“ＣＬＢＡ”）
Ｆａｂフラグメントライブラリーのスクリーニングを、抗原Ｆｃ ＴｒｋＢ−被覆ニトロセルロースフィルターを使用する、本質的に（米国特許公開第２００５／０２５５５５２および２００６／０１３４０９８号）に記載されているとおりに実施した。
【０１７１】
ＦｏｒｔｅＢｉｏを使用する親和性測定
ＩｇＧおよびＦａｂフラグメントの結合速度を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを使用して分析した。組換えＦｃ−ＴｒｋＢ抗原を、製造業者の方法にしたがってＥＺ−ｌｉｎｋ ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ビオチン化した。次に抗原をストレプトアビジン−被覆センサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）と結合させた。Ｆａｂ結合を、バイオレイヤー干渉分析および製造業者により提供されたソフトウェアを使用してリアルタイムでモニタリングした。親和性を測定された結合および解離定数から計算した。
【０１７２】
Ｂｉａｃｏｒｅを使用する親和性測定
すべてのＢｉａｃｏｒｅ試薬をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部のＢｉａｃｏｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。速度結合パラメーターの決定を、光学バイオセンサー Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓ５１を使用する表面プラズモン共鳴測定により行った。この技術は、受容体へのリガンドの結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）に関する微視的速度定数の非標識測定を可能にする。したがって、それはとりわけ抗体−抗原相互作用を特徴付けるために適当である。
【０１７３】
改良された抗体における結合試験を、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ−５ Ｂｉａｃｏｒｅ センサーチップ（認定されている）（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００５−３０）上にＦｃ−ｈＴｒｋＢを固定することにより行った。Ｆｃ−融合タンパク質の共有結合を‘アミンカップリングキット’（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１０００−５０）にて行った。Ｆｃ−融合タンパク質を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１００３−５０）中にて５μｇ／ｍｌで、１０μＬ／分の流速で、ＥＤＣ−活性化デキストラン表面に付着させた。
【０１７４】
種々の濃度の改良された抗体を、ＰＢＳプラス１００ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＰ２０（Ｂｉａｃｏｒｅ ＃ＢＲ−１０００−５４）中でＦｃ−ＴｒｋＢキャプチャーチップ上に流した。得られたセンサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｓ５１評価ソフトウェアを使用して分析した。すべての濃度からのデータを１：１ ラングミュアモデルに全体的に合わせた。
【０１７５】
アノイキスアッセイ
ラット腸上皮性（ＲＩＥ）−ＴｒｋＢ細胞をアノイキスアッセイにおいて使用した。ＲＩＥ／ＴｒｋＢ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Innovative Cell Technologies Inc., San Diego、ＣＡ）を使用して分離し、ＤＭＥＭ完全培地に再懸濁した。細胞を無血清ＤＭＥＭで３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％のＢＳＡ（細胞培養グレード、＃Ａ８８０６−５Ｇ Ｓｉｇｍａ）貯蔵物から希釈された０．１％のＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭに再懸濁した。次に細胞を、９６ウェル Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ 超低クラスタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３４７４）に、４．２×１０５細胞／ｍＬにて６０ｍｌ／ウェル（＝２．５×１０４細胞／ウェル）で置いた。１０ｍｌのＴｒｋＢ作動性抗体（ＰＢＳ中で貯蔵）を１−２０μｇ／ｍＬの最終濃度で試験ウェルに加えた。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。１０ｍｌのヒトＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ、０．１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で２０ｍｇ／ｍＬで貯蔵）を１０−５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で対照ウェルに加えた。ＢＤＮＦをＤＭＥＭ（ＳＦ）／０．１％ＢＳＡで希釈した。次に細胞をさらに２４−４８時間インキュベートした。８０ｍｌ／ウェルのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Promega, Madison, WI）を加え、プレートを穏やかな振とうに付した。１５分後、液体を９６ウェル白色の透明底プレートに移し、発光を読んだ。
【０１７６】
結果
Ｖ領域のクローニングおよび発現
Ｆａｂ ＴＲ３−１は、ヒト定常領域と融合した、元の抗体、Ａ１０Ｆ１８．２からの無傷のＶ領域を有し、大腸菌から精製された。ＴｒｋＢ抗原結合の希釈ＥＬＩＳＡ試験において、クローンＦａｂは抗体濃度に依存する結合曲線を示した（データは示していない）。
【０１７７】
ライブラリー構築およびＶ領域カセット
エピトープ−フォーカストライブラリーを、結合特異性決定基（“ＢＳＤ”）を含む元の抗体からの独特のＣＤＲ３−ＦＲ４領域に結合したヒトＶセグメントライブラリー配列およびヒト生殖細胞系Ｊセグメント配列から構築した。これらの“全長”ライブラリーを、元の抗体におけるＶセグメントの一部だけを最初にヒト配列のライブラリーにより置き換えた“カセット”ライブラリーの構築のためのベースとして使用した。２つの型のカセットを構築した。Ｖ−重鎖およびＶカッパ鎖両方に関するカセットを、フレームワーク２領域内の重複している一般的な配列でのブリッジＰＣＲにより製造した。このようにして、“フロント−エンド”および“ミドル”ヒトカセットライブラリーを、ヒトＶ−重鎖１およびＶ−カッパＩＩイソ型のために構築した。ＴｒｋＢ抗原への結合を支持するヒトカセットをコロニーリフト結合アッセイにより同定し、ＥＬＩＳＡおよびＦｏｒｔｅ分析における親和性にしたがってランク付けした。次に、最も高い親和性カセットのプールを、第２のライブラリースクリーンにおいて再結合し、完全ヒトＶセグメントを生産した。
【０１７８】
ヒトＶセグメントを有する高親和性Ｆａｂのプールの同定後、親和性成熟ライブラリーを構築した。ヒトＶセグメントを有するＦａｂクローンの一団の一般的なＢＳＤ配列を、変性ＰＣＲプライマーを使用して変異させ、ライブラリーを製造した。これらの変異ライブラリーを、コロニーリフト結合アッセイを使用してスクリーニングした。選択されたＦａｂをＥＬＩＳＡおよびＦｏｒｔｅ分析で親和性に対してランク付けした。参照ＴＲ３−１ Ｆａｂと比較して、抗原に対する同様の、または改良された親和性を支持する変異を同定した。
【０１７９】
さらに、ヒト生殖細胞系への点突然変異を、ヒトＶセグメントを有するそれぞれのＦａｂの軽鎖のＣＤＲ３において行った。その位置ですべてのヒト生殖細胞系ＶｋＩＩセグメントにコードされているアミノ酸である、位置８９（Ｃｈｏｔｈｉａ番号）をＳからＭに変えた。
【０１８０】
Ｆｏｒｔｅ Ｏｃｔｅｔ分析を使用する、ヒトＴｒｋＢ抗原に対するヒトＶセグメントを有するＦａｂおよびＩｇＧの親和性
ヒトＶセグメントを有するＦａｂをコロニーリフト結合アッセイから単離し、抗原−結合ＥＬＩＳＡにより確認した。抗原−結合ＥＬＩＳＡにおいて強い陽性シグナルを示すＦａｂクローンを精製し、さらに速度により参照ＦａｂＴＲ３−１と比較して特徴付けた。結合速度を、タンパク質−タンパク質相互作用のリアルタイム非標識モニタリングのために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して分析した。代表的な速度分析は図３に示されている。計算された結合および解離定数は表１および２に示されている。
表１
【表１】
【０１８１】
表１は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ バイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＦａｂ結合の分析の要約であり、結合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）および計算された親和性（ＫＤ）を示す。
表２
【表２】
【０１８２】
表２は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ バイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＦａｂ結合の分析の要約であり、結合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）および計算された親和性（ＫＤ）を示す。
【０１８３】
ＦａｂクローンＴＲ１３４−４、ＴＲ１３５−８、ＴＲ１３９−２、ＴＲ１５１−１およびＴＲ１４４−１ならびに参照クローンＴＲ３−１のすべての速度分析は、ＴｒｋＢ抗原に対して低ナノモル親和性を示した。クローンＴＲ１３９−２およびＴＲ１５１−１は、常に、参照対照と比較して、改良されたオフレート（Ｋｄ）および高い全体的な親和性を有した。ＴＲ１４４−１、ＴＲ１３５−８およびＴＲ１３４−４は、常に、参照対照と比較して、ほぼ同じ全体的な親和性を有した。
【０１８４】
ヒトＶセグメントを有するＩｇＧを、また、ＣＨＯ細胞の一過性のトランスフェクションから製造した。ＩｇＧ製造物を精製し、さらに速度により参照ＩｇＧ Ａ１０Ｆ１８．２と比較して特徴付けた。ヒトＶセグメントを有する２つのＩｇＧに関する結合速度を、タンパク質−タンパク質相互作用のリアルタイム非標識モニタリングのために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔシステムを使用して分析した。代表的な速度分析は図４に示されている。計算された結合および解離定数は表３に示されている。この結果は、ヒトＶセグメントを有するＩｇＧが参照Ａ１０Ｆ１８．２ ＩｇＧに等しい親和性を有する抗原に結合することを示す。
表３
【表３】
【０１８５】
表３は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ バイオセンサー技術を使用するバイオレイヤー干渉法による組換えＴｒｋＢ抗原へのＩｇＧ結合の分析の要約であり、結合定数（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）および計算された親和性（ＫＤ）を示す。
【０１８６】
ヒト生殖細胞配列と同一性パーセント
Ｖ領域をＰＣＲ−増幅させ、制限酵素で消化させ、ＩｇＧ発現ベクターにてクローニングした。ＴＲ１３４−４、ＴＲ１４４−１およびＴＲ１４４−１からの重鎖をＰＣＲ−増幅させ、ＳａｌＩおよびＮｈｅＩで消化させた；得られたフラグメントを、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターにてクローニングし、それぞれＴＲ１２７、ＴＲ１４３およびＴＲ１５４を得た。ＴＲ１３４−４、ＴＲ１３５−８およびＴＲ１３９−２からの軽鎖をＰＣＲ−増幅させ、ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｉＷＩで消化させた；得られたフラグメントを、ヒトカッパ定常領域を含む発現ベクターにてクローニングし、それぞれＴＲ１１９、ＴＲ１２９およびＴＲ１３７を得た。挿入物の同一性および完全性をＤＮＡシークエンシングにより確認した。
表４
【表４】
＊ＮＤ＝行っていない；
ａヒト生殖細胞系との同一性％はＣＤＲ３を除く
【０１８７】
表４はＩｇＧ発現ベクター内に含まれるＶ領域に対するヒト生殖細胞配列との同一性パーセントを説明する：すべてのパーセントはＣＤＲ３ ＢＳＤ配列を除くＶ領域全域の一本鎖ヒト生殖細胞配列との同一性を示す。ＦａｂのＶｈ−領域およびＶｋ−領域のそれぞれは、ヒト生殖細胞アミノ酸配列と極めて近い。
【０１８８】
エピトープ特異性を示すためのブロッキングＥＬＩＳＡ
ブロッキングＥＬＩＳＡを、方法セクションに記載されているヒトＶセグメントを含む精製されたＦａｂで行った。結果を図７に示す。すべてのＦａｂクローンの結合が、元のモノクローナル抗体Ａ１０Ｆ１８．２ ＩｇＧの濃度の増加によりブロックされ、Ｆａｂが元のモノクローナルＩｇＧのように同じエピトープに結合することを示す。
【０１８９】
ＥＬＩＳＡによるＴｒｋＢタンパク質への抗体結合
ＩｇＧ抗体ＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７を、一過性のトランスフェクションにより生産し、本明細書に記載されているとおりに精製し、Ｆｃ−ＴｒｋＢに対する特異的結合に関して評価した。ＥＬＩＳＡをヒトＴｒｋＢおよび希釈シリーズのそれぞれの抗体：ＬＦＤ２５３、ＬＦＤ２５４、ＬＦＣ３２５またはＬＦＣ３２７を使用して実施した。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＬＦＤ２５３、ＬＦＤ２５４、ＬＦＣ３２５およびＬＦＣ３２７がヒトＴｒｋＢに結合することを示す。図８、参照。
【０１９０】
ヒトＶセグメントを有するＩｇＧ（例えば、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−ＬＦＣ３２７）は、ＴｒｋＡまたはＴｒｋＣではなくＴｒｋＢに特異的に結合する。２μｇ／ｍｌにて精製されたＩｇＧ抗体を３つの異なるＴｒｋファミリーメンバー（ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣ）との相互作用を試験することにより特異性を評価した。二次Ａｂは、ヤギ−抗−ヒトＦａｂ−ＨＲＰ検出Ａｂのみでブロックされ、処理される複製物である。図９Ａ−Ｄに示されるとおり、ＬＦＤ２５３、ＬＦＤ２５４、ＬＦＣ３２５またはＬＦＣ３２７はこれらの関連Ｔｒｋファミリー受容体のいずれとも結合しない。
【０１９１】
アノイキスアッセイ：機能作動性
精製されたＩｇＧ（例えば、ＬＦＤ２５３、ＬＦＤ２５４、ＬＦＣ３２５またはＬＦＣ３２７）を、ラット腸上皮性（ＲＩＥ）−ＴｒｋＢ細胞を使用してアノイキスアッセイにおいて評価する。これらの細胞はアノイキス（分離依存アポトーシス）に感受性であるが、ＴｒｋＢ受容体の活性化で助けることができる。ＬＦＤ２５３処理は、細胞生存により測定されるとおりアノイキスからＲＩＥ−ＴｒｋＢ細胞を助けることができ、この効果は用量依存的であった。図１０Ａ−Ｄ、参照。ＬＦＤ２５３に対するこのデータから計算されたＥＣ５０は、４．１ｎｇ／ｍｌ（２８ｐＭ）である。ＬＦＤ２５４に対するこのデータから計算されたＥＣ５０は、２４．０ｎｇ／ｍｌ（１６０ｐＭ）である。ＬＦＣ３２５に対するこのデータから計算されたＥＣ５０は、４１．８ｎｇ／ｍｌ（２８０ｐＭ）である。ＬＦＣ３２７に対するこのデータから計算されたＥＣ５０は、２６．９ｎｇ／ｍｌ（１８０ｐＭ）である。
【０１９２】
Ｂｉａｃｏｒｅによる抗体親和性測定
ＮＶＰ−ＬＦＤ２５３、ＮＶＰ−ＬＦＤ２５４、ＮＶＰ−ＬＦＣ３２５およびＮＶＰ−３２７の固定化Ｆｃ−ＴｒｋＢへの結合に関する速度定数を測定した。図１１Ａ−Ｄは、それぞれのＩｇＧに対する代表的なセットのキネティックトレースの詳細を示す。図１１Ａは６２．５ｎＭから３．９にまで２倍希釈されたＬＦＤ２５３の滴定のセンサーグラムを示す。図１１Ｂは３１．２５ｎＭから１．９にまで２倍希釈されたＬＦＤ２５４の滴定のセンサーグラムを示す。図１１Ｃは３１．２５ｎＭから１．９５にまで２倍希釈されたＬＦＣ３２５の滴定のセンサーグラムを示す。図１１Ｄは３１．２５ｎＭから１．９５にまで２倍希釈されたＬＦＣ３２７の滴定のセンサーグラムを示す。表５は、実験をＢｉａｃｏｒｅ Ｓ５１評価ソフトウェアを使用するラングミュアモデルに全体的に合わせたとき、得られたデータの要約を示す。この抗体は二価であるが、結合は１：１事象として処理した。
表５
【表５】
【０１９３】
表５は抗体−受容体複合体の速い結合および遅い解離速度の両方を示す。センサーグラムを全体的に扱ったとき、もっとも合うものを得た。
【０１９４】
ここに記載の実施例および態様は、説明の目的のためのみであり、それに照らした様々な修飾または変化が当業者には示唆され、それらは本発明の精神および範囲の範囲内および添付の特許請求の範囲内に包含されることは理解されるべきである。この明細書において引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためにそれら全体を引用により本明細書に包含させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に結合する抗体であって、該抗体は
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｖ（Ｔ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｎ）ＷＦＡＹ（配列番号：３４）を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域はアミノ酸配列（Ｓ／Ｍ）ＱＧＴ（Ｈ／Ａ）（Ｅ／Ｖ／Ｉ）ＰＹＴ（配列番号：４２）を含み；そして
該抗体はＴｒｋＢアゴニストである抗体。
【請求項２】
重鎖Ｖセグメントが配列番号：１６と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、そして、軽鎖Ｖセグメントが配列番号：２４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖Ｖセグメントが配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、そして軽鎖Ｖセグメントが配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２および配列番号：３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４０および配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
重鎖ＦＲ４がヒト生殖細胞ＦＲ４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖ＦＲ４が配列番号：５０である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
重鎖Ｊセグメントがヒト生殖細胞ＪＨ４部分配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
軽鎖ＦＲ４がヒト生殖細胞ＦＲ４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
軽鎖ＦＲ４が配列番号：６１である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
軽鎖Ｊセグメントがヒト生殖細胞Ｊｋ２部分配列ＦＧＱＧＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントがそれぞれ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含む請求項１に記載の抗体であって：
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２７のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３１のアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３８のアミノ酸配列を含み；そして
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３９のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項１２】
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３５を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４１を含む、
請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３６を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４０を含む、
請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３７を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４０を含む、
請求項１１に記載の抗体。
【請求項１５】
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：２９を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３５を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４１を含む、
請求項１１に記載の抗体。
【請求項１６】
重鎖可変領域が配列番号：４の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域が配列番号：１１の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
重鎖可変領域が配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域が配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
重鎖可変領域が配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域が配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
重鎖可変領域が配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、そして軽鎖可変領域が配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体が５×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）にてＴｒｋＢに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体がＦＡｂ’フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の抗体。
【請求項２３】
抗体が一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項２４】
抗体がヒト定常領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２５】
抗体がチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体がＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２７】
抗体がＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体が配列番号：１を含む重鎖および配列番号：８を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
抗体が配列番号：１を含む重鎖および配列番号：９を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３０】
抗体が配列番号：１を含む重鎖および配列番号：１０を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３１】
抗体が配列番号：３を含む重鎖および配列番号：８を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３２】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＴｒｋＢに特異的に結合する抗体であって；
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号：２５のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号：３２および配列番号：３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号：３５、配列番号：３６および配列番号：３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号：３９のアミノ酸配列を含み；
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号：４０および配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項３３】
請求項１に記載の抗体および生理学的に適合性のある賦形剤を含む薬学的に許容される組成物。
【請求項３４】
医薬組成物が個体における血中グルコース濃度を減少させる薬剤をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
医薬組成物が個体における体重を減少させる薬剤をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
治療有効量の請求項１に記載の抗体を個体に投与することを含む、必要とする個体における血中グルコース濃度および／または体重を減少させる方法。
【請求項３７】
個体が前糖尿病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
個体がＩ型糖尿病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
個体がＩＩ型糖尿病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
個体が過体重である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
個体が肥満である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
治療有効量の血中グルコースを減少させるために有効な第２の薬剤を個体に投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
第２の薬剤および抗体が混合物として投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第２の薬剤および抗体が別々に投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
第２の薬剤がインスリン、スルホニルウレア、インスリン分泌促進剤、メトホルミン、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲδアゴニスト、ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、ＰＰＡＲα／γ／δパンアゴニスト、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
治療有効量の体重または肥満を減少させるために有効な第２の薬剤を個体に投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
第２の薬剤および抗体が混合物として投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
第２の薬剤が別々に投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
第２の薬剤がリパーゼ阻害剤、シブトラミン、ＣＢ−１阻害剤、トピラメート、アミリン、アミリン類似体、レプチン、ＰＹＹ／ＰＹＹ類似体およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）機能不全による障害の症状を減少させるか、または阻害する方法であって、治療有効量の請求項１に記載の抗体を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項５１】
ＢＤＮＦ機能不全による障害が、レット症候群、ウィルムス腫瘍、無虹彩、尿生殖器異常および知的障害（ＷＡＧＲ）症候群、メラノコルチン受容体ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満および悪液質／筋肉消耗性症候群からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＢＤＮＦ機能不全による障害がレット症候群である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
抗体が全身的に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項１】
チロシン受容体キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に結合する抗体であって、該抗体は
（ａ）ヒト重鎖Ｖセグメント、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ３）および重鎖フレームワーク領域４（ＦＲ４）を含む重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）ヒト軽鎖Ｖセグメント、軽鎖ＣＤＲ３および軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域を含み、
ｉ）重鎖ＣＤＲ３はアミノ酸配列Ｖ（Ｔ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ／Ｒ／Ｎ）ＷＦＡＹ（配列番号：３４）を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３可変領域はアミノ酸配列（Ｓ／Ｍ）ＱＧＴ（Ｈ／Ａ）（Ｅ／Ｖ／Ｉ）ＰＹＴ（配列番号：４２）を含み；そして
該抗体はＴｒｋＢアゴニストである抗体。
【請求項２】
重鎖Ｖセグメントが配列番号：１６と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、そして、軽鎖Ｖセグメントが配列番号：２４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖Ｖセグメントが配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４および配列番号：１５からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性を共有し、そして軽鎖Ｖセグメントが配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３からなる群から選択されるアミノ酸と少なくとも９０％の配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２および配列番号：３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；そして
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４０および配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
重鎖ＦＲ４がヒト生殖細胞ＦＲ４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖ＦＲ４が配列番号：５０である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
重鎖Ｊセグメントがヒト生殖細胞ＪＨ４部分配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５０）を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
軽鎖ＦＲ４がヒト生殖細胞ＦＲ４である、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
軽鎖ＦＲ４が配列番号：６１である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
軽鎖Ｊセグメントがヒト生殖細胞Ｊｋ２部分配列ＦＧＱＧＫＬＥＩＫ（配列番号：６１）を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
重鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｖセグメントがそれぞれ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）および相補性決定領域２（ＣＤＲ２）を含む請求項１に記載の抗体であって：
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２７のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３１のアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３８のアミノ酸配列を含み；そして
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３９のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項１２】
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３５を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４１を含む、
請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３６を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４０を含む、
請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：２８を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３７を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４０を含む、
請求項１１に記載の抗体。
【請求項１５】
ｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：２５を含み；
ｉｉ）重鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：２９を含み；
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２を含み；
ｉｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ１が配列番号：３５を含み；
ｖ）軽鎖ＶセグメントのＣＤＲ２が配列番号：３８を含み；そして
ｖｉ）軽鎖ＣＤＲ３が配列番号：４１を含む、
請求項１１に記載の抗体。
【請求項１６】
重鎖可変領域が配列番号：４の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域が配列番号：１１の可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
重鎖可変領域が配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域が配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
重鎖可変領域が配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有し、そして軽鎖可変領域が配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択される可変領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を共有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
重鎖可変領域が配列番号：１、配列番号：２および配列番号：３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、そして軽鎖可変領域が配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体が５×１０−８Ｍ未満の平衡解離定数（ＫＤ）にてＴｒｋＢに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体がＦＡｂ’フラグメントである、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の抗体。
【請求項２３】
抗体が一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項２４】
抗体がヒト定常領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２５】
抗体がチロシンキナーゼ受容体Ａまたはチロシンキナーゼ受容体Ｃに結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体がＴｒｋＢのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２７】
抗体がＴｒｋＢへの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の結合と競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体が配列番号：１を含む重鎖および配列番号：８を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
抗体が配列番号：１を含む重鎖および配列番号：９を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３０】
抗体が配列番号：１を含む重鎖および配列番号：１０を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３１】
抗体が配列番号：３を含む重鎖および配列番号：８を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３２】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域はそれぞれ以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＴｒｋＢに特異的に結合する抗体であって；
ｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号：２５のアミノ酸配列を含み；
ｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｉｉｉ）重鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号：３２および配列番号：３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｉｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号：３５、配列番号：３６および配列番号：３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
ｖ）軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号：３９のアミノ酸配列を含み；
ｖｉ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３が配列番号：４０および配列番号：４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項３３】
請求項１に記載の抗体および生理学的に適合性のある賦形剤を含む薬学的に許容される組成物。
【請求項３４】
医薬組成物が個体における血中グルコース濃度を減少させる薬剤をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
医薬組成物が個体における体重を減少させる薬剤をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
治療有効量の請求項１に記載の抗体を個体に投与することを含む、必要とする個体における血中グルコース濃度および／または体重を減少させる方法。
【請求項３７】
個体が前糖尿病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
個体がＩ型糖尿病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
個体がＩＩ型糖尿病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
個体が過体重である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
個体が肥満である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
治療有効量の血中グルコースを減少させるために有効な第２の薬剤を個体に投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
第２の薬剤および抗体が混合物として投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第２の薬剤および抗体が別々に投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
第２の薬剤がインスリン、スルホニルウレア、インスリン分泌促進剤、メトホルミン、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲδアゴニスト、ＰＰＡＲα／γデュアルアゴニスト、ＰＰＡＲα／γ／δパンアゴニスト、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
治療有効量の体重または肥満を減少させるために有効な第２の薬剤を個体に投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
第２の薬剤および抗体が混合物として投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
第２の薬剤が別々に投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
第２の薬剤がリパーゼ阻害剤、シブトラミン、ＣＢ−１阻害剤、トピラメート、アミリン、アミリン類似体、レプチン、ＰＹＹ／ＰＹＹ類似体およびＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１類似体からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）機能不全による障害の症状を減少させるか、または阻害する方法であって、治療有効量の請求項１に記載の抗体を必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項５１】
ＢＤＮＦ機能不全による障害が、レット症候群、ウィルムス腫瘍、無虹彩、尿生殖器異常および知的障害（ＷＡＧＲ）症候群、メラノコルチン受容体ＭＣ４Ｒ機能不全による肥満および悪液質／筋肉消耗性症候群からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＢＤＮＦ機能不全による障害がレット症候群である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
抗体が全身的に投与される、請求項５０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ−Ｂ】
【図８Ｃ−Ｄ】
【図９】
【図１０Ａ−Ｂ】
【図１０Ｃ−Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ−Ｂ】
【図８Ｃ−Ｄ】
【図９】
【図１０Ａ−Ｂ】
【図１０Ｃ−Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１１−５１００２１（Ｐ２０１１−５１００２１Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４３２９５（Ｐ２０１０−５４３２９５）
【出願日】平成２１年１月１６日（２００９．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１３４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９２０４９
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５０３２６１５２４）アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (158)
【氏名又は名称原語表記】ＩＲＭ，ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１６日（２００９．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１３４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９２０４９
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５０３２６１５２４）アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー (158)
【氏名又は名称原語表記】ＩＲＭ，ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]