改良ケトレダクターゼポリペプチドおよび関連ポリヌクレオチド
本発明は、ケトンの立体特異的還元において用いるための、増強されたケトレダクターゼ活性および熱安定性を有する種々のポリペプチドに関する。さらに、本発明は、ケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、このポリヌクレオチドは、宿主細胞において増強された発現を提供する、そのポリヌクレオチドのコドンを最適化したバージョンを含む。別の局面において、本発明は、ヌクレオチド構築物、ベクターおよび本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、酵素学の分野、特にケトレダクターゼの酵素学の分野に関する。より正確にはいえば、本発明は、増強された酵素活性を有するケトレダクターゼポリペプチド、および、改良ケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
キラルγ−置換β−ヒドロキシ酪酸エステルは、薬の合成において商業的に重要な中間体である。これらの中間体は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターの合成において光学活性中間体（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、およびロスバスタチン）として利用され得る。いくつかのγ−置換β−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する方法が記載されている。例えば、シアン化ナトリウムとの反応前に保護基によるヒドロキシ基の保護を必要とする４−ブロモ−３−ヒドロキシブチレートから、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸を生成する方法が報告されている（非特許文献１）。Ｉｓｂｅｌｌら（非特許文献２）は、トレオニンの一水和物カルシウム塩と臭化水素とを反応させて、トレオニンのジブロモ形態を生成し、次いでブロモヒドリンに変換することによって、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを合成する方法をさらに報告している（非特許文献２）。上記ブロモヒドリンのヒドロキシ基は、シアン化ナトリウムで反応させる前に保護される（非特許文献２）。あいにく、保護する工程および脱保護する工程を必要とする方法は、商業的に提供することが現実的ではない。
【０００３】
４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを利用する最新のシアノヒドリン合成経路が、開発されている。これらの経路は、商業上実施するのに比較的費用がかかる多くの工程を必要とする。
【０００４】
（ケトレダクターゼの説明）
（ＫＲＥＤの特徴付け）
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロキラルケトン基質から光学活性アルコールを合成するのに有用である。ＫＲＥＤは、代表的には、ケトン基質を対応するアルコール産物に変換するが、ＫＲＥＤはまた、逆反応（アルコール基質が対応するケトン／アルデヒド産物に酸化される反応）を触媒し得る。ＫＲＥＤのような酵素によるケトンの還元およびアルコールの酸化は、補因子（最も一般的には、還元型ニコチンアミドアニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ））を、酸化反応のために必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子ドナーとして働き、他方で、ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、電子受容体として働く。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドレゲナーゼが（その酸化された状態および還元された状態にある）、リン酸化補因子または非リン酸化補因子のいずれかを受け取るが、両方を受け取らないことが、しばしば観察される。
【０００５】
ＫＲＥＤ酵素は、幅広い細菌および酵母の範囲において見出され得る（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；Ｌｉｅｓｅを参照のこと）。いくつかのＫＲＥＤ遺伝子およびＫＲＥＤ酵素の配列が報告されている（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４））。
【０００６】
（所望されるＫＲＥＤの特性）
生細胞における代謝は、デノボ合成および再生により還元反応のための補因子の十分な供給を保証する。したがって、生体触媒によるケトンの還元のために全細胞を使用することは、有利であり得るが、微生物は、代表的には、低い鏡像異性過剰率の少量の産物を導き得る多数のケトレダクターゼを有する。この理由から、Ｗｏｎｇらは、半精製したケトレダクターゼ酵素を研究し、そして、より質の高い産物が得られ得ることを見出した（非特許文献６）。
【０００７】
インビトロ酵素還元の間、細胞機構が存在しない場合、補因子の再生は、化学量論量のこれらの高価な分子の必要性を回避することが必要とされる。ケトンを還元するための酵素の使用は、従って、二つの酵素（ＫＲＥＤおよび補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）再生酵素）、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼなど）を必要とする。酵素は、一般的に、プロセス条件下での酵素の低い活性（例えば、非特許文献７；非特許文献８）、不十分な安定性（非特許文献９；非特許文献１０）、ならびに基質の阻害または産物の阻害に対する脆弱性（非特許文献１１；非特許文献１２）に起因して、高価であると考えられる。上述のとおり、補因子は、産業プロセスのためには高価な試薬であり、それらの使用が効果的でなければ、生物学的還元プロセスに多大なコストを加え得る。
【０００８】
これら多くの認識された経済的問題を回避するために、全微生物細胞は、しばしば、生体触媒による還元のための好ましい触媒として考えられている。なぜなら、この全微生物細胞は、代表的には、補因子および補因子再生酵素を含むからである。４−クロロアセトアセテートエステルの不斉還元については、ｂａｋｅｒ酵母で記載され（非特許文献１３；非特許文献１４）、かつ多くの他の微生物でも記載されている（特許文献１；特許文献２；および特許文献３）。しかしながら、微生物細胞を用いる高基質濃度で行われない還元は、効果的ではなく、競合反応に起因する減少した収量の問題があり、そして低い鏡像異性過剰率（「ｅ．ｅ）を与える）（特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；および特許文献９）。
【０００９】
ＫＲＥＤおよびＧＤＨをコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉのような成長の速い微生物へ導入することは、ケトンの還元についてのより活性な全細胞触媒をもたらした。Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ由来のカルボニルレダクターゼ遺伝子およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＧＤＨ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ内でクローン化され、エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートを産出させた。有意な生産性を達成するために、ＮＡＤＰ補因子は、触媒に対して十分な活性を提供するために、反応に加えられた。反応の最後には、キラル産物が抽出され、そして、一般的な手法（例えば、クロマトグラフィーおよび蒸留）によって精製される。この手法は、天然の生物を使用するプロセスについての改善であるが、ＮＡＤＰが必要な添加物であり続けるような、経済的な生産についての重要な欠点がのこり、そして、微生物細胞を含む反応混合物から産物を純粋な形態で単離するために、重要なプロセスへの投資が必要とされる。
【００１０】
酵素還元プロセスおよび全細胞還元プロセスの両方におけるこれらの記載を考慮すると、本発明の目的は、酵素の産出、それらのアミノ酸配列、ならびに、クリーンな反応プロセスでエチル−４−クロロ−３−ケトブチレートおよび他のケトンを効果的かつ経済的に還元することを促進するような配列をコードする遺伝子を記載することであった。従って、微生物の還元は、代表的には、５ｇ／Ｌ以上の細胞濃度を必要とするが、１ｇ／Ｌを下回る酵素濃度で、好ましくは、０．５ｇ／Ｌを下回る酵素濃度でこれらの反応を触媒する、新しい酵素が記載される。加えて、記載された酵素は、２０時間より短い時間で、少量の補因子しか必要としない、少なくとも１００ｇ／Ｌの基質の完全変換を触媒する。
【００１１】
上記で参照された特許および刊行物、ならびに、本明細書中の至るところで引用された全ての他の特許および刊行物は、本明細書中にその全体が参考として明確に援用される。
【特許文献１】米国特許第５，５５９，０３０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７００，６７０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９１，６８５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４１３，９２１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５５９，０３０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７００，６７０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，８９１，６８５号明細書
【特許文献８】米国特許第６，２１８，１５６号明細書
【特許文献９】米国特許第６，４４８，０５２号明細書
【非特許文献１】Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，Ｂ３７，３４１（１９８３）
【非特許文献２】Ｉｓｂｅｌｌら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，７２：３０１（１９７９）
【非特許文献３】ＫｒａｕｓおよびＷａｌｄｍａｎ、Ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第１巻および第２巻、ＶＣＨ Ｗｅｉｎｈｅｉｍ １９９５
【非特許文献４】Ｆａｂｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．２０００
【非特許文献５】ＨｕｍｍｅｌおよびＫｕｌａ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９ １８４：１−１３
【非特許文献６】Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １９８５ １０７：４０２８−４０３１
【非特許文献７】ＳｕｔｈｅｒｌａｎｄおよびＷｉｌｌｉｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８ ６３：７７６４
【非特許文献８】Ｂｕｓｔｉｌｌｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｓｙｍ ２００２ １３：１６８１
【非特許文献９】Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０ ５６：２３７４
【非特許文献１０】Ｂｒａｄｓｈａｗら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２ ５７：１５２６
【非特許文献１１】Ｋａｔａｏｋａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ ４８：６９９
【非特許文献１２】Ｋｉｔａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９ ６５：５２０７
【非特許文献１３】Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３ １０５：５９２５−５９２６；
【非特許文献１４】Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（Ｓ）１９８４：１３２−１３３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、種々の局面を有する。一つの局面において、本発明は、配列番号２のＫＲＥＤと比較して増強されたＫＲＥＤ活性を有するケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）ポリペプチドに関し、この増強されたＫＲＥＤ活性は、この配列番号２のＫＲＥＤ活性の好ましくは少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜約２５倍の活性である。このような活性は、ＮＡＤＰＨが酸化されて同時にケトンが対応するアルコールに還元されることに起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定される。別の局面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関し、このような活性は、ＮＡＤＰＨの吸光度またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定されるか（例えば、実施例４）、あるいは、結合アッセイにおいて生成された産物から測定される（例えば、実施例５）。このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号５０６、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５３６、および配列番号５３８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％相同である。別の局面において、本発明は、配列番号２のＫＲＥＤと比較して増加したＫＲＥＤ残存活性を有するケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）ポリペプチドに関し、５０℃にて１５〜２４時間処理した後、この増加したＫＲＥＤ活性は、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜１００倍、より代表的には１．５〜約６０倍である。このような活性は、ＮＡＤＰＨが酸化されて同時にケトンが対応するアルコールに還元されることに起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定される。なお別の局面において、本発明は、配列番号２のＫＲＥＤと比較して増加したＫＲＥＤ残存活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関し、５０℃にて１５〜２４時間処理した後、この増加したＫＲＥＤ活性は、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜１００倍、より代表的には１．５〜約６０倍である。このような活性は、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定されるか（例えば、実施例４）、あるいは、結合アッセイにおいて生成された産物から測定される（例えば、実施例５）。このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号５０６、配列番号５２０、および配列番号５２６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％相同であり、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％相同である。一つの実施形態において、本発明はまた、本明細書中に記載される、単離されかつ精製された形態のＫＲＥＤポリペプチド改変体に関する。別の実施形態において、上記単離されかつ精製されたＫＲＥＤポリペプチド改変体は、凍結乾燥形態にある。なお別に実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるＫＲＥＤポリペプチド改変体および適切なキャリア（代表的には緩衝溶液、より代表的には６．０と８．０との間のｐＨを有する緩衝溶液）を含む組成物に関する。この緩衝化ＫＲＥＤ組成物が凍結乾燥形態であることもまた、本発明の範囲内である。
【００１３】
別の局面において、本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体は、配列番号２のＣａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅのケトレダクターゼについて報告された配列とは、１個〜２０個のアミノ酸残基、代表的には１個〜１０個のアミノ酸残基、より代表的には１個〜９個のアミノ酸残基、さらにより代表的には１個〜８個のアミノ酸残基、最も代表的には１個〜７個のアミノ酸残基が異なる。別の局面において、本発明は、ＫＲＥＤポリペプチド（好ましくは、単離されかつ精製された）に関し、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜２５倍のＫＲＥＤ活性を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、Ａ２Ｖ；Ｋ３Ｅ；Ｆ５ＬまたはＦ５Ｃ；Ｎ７Ｋ；Ｅ９ＧまたはＥ９Ｋ；Ａ１２Ｖ；Ｐ１３Ｌ；Ｐ１４Ａ；Ａ１６ＧまたはＡ１６Ｖ；Ｔ１８Ａ；Ｋ１９Ｉ；Ｎ２０ＤまたはＮ２０Ｓ；Ｅ２１Ｋ；Ｓ２２ＮまたはＳ２２Ｔ；Ｑ２４ＨまたはＱ２４Ｒ；Ｖ２５Ａ；Ｎ３２ＳまたはＮ３２Ｄ；Ａ３６Ｔ；Ｓ４１Ｇ；Ｓ４２Ｎ；Ｉ４５Ｌ；Ａ４８Ｔ；Ｖ５６Ａ；Ｖ６０Ｉ；Ｙ６４Ｈ；Ｎ６５Ｋ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５ＹまたはＮ６５Ｓ；Ｓ６６ＧまたはＳ６６Ｒ；Ｈ６７ＬまたはＨ６７Ｑ；Ｄ６８ＧまたはＤ６８Ｎ；Ｇ７１Ｄ；Ｅ７４ＫまたはＥ７４Ｇ；Ｋ７８Ｒ；Ｋ７９Ｒ；Ｋ８５Ｒ；Ａ８６Ｖ；Ｎ９０Ｄ；Ｓ９３ＮまたはＳ９３Ｃ；Ｄ９５Ｎ、Ｄ９５Ｇ、Ｄ９５Ｖ、Ｄ９５ＹまたはＤ９５Ｅ；Ｋ９８Ｒ；Ｑ９９Ｌ、Ｑ９９Ｒ、またはＱ９９Ｈ；Ｔ１００Ａ；Ｉ１０１Ｖ；Ｑ１０３Ｒ；Ｉ１０５ＶまたはＩ１０５Ｔ；Ｋ１０６ＲまたはＫ１０６Ｑ；Ｈ１１０Ｙ、Ｈ１１０ＣまたはＨ１１０Ｒ；Ｖ１１４Ａ；Ａ１１６Ｇ；Ｉ１２０Ｖ；Ｋ１２４Ｒ；Ｄ１２９ＧまたはＤ１２９Ｎ；Ｄ１３１ＧまたはＤ１３１Ｖ；Ｄ１３２Ｎ；Ｋ１３４Ｍ、Ｋ１３４Ｖ、Ｋ１３４ＥまたはＫ１３４Ｒ；Ｄ１３７ＮまたはＤ１３７Ｇ；Ｑ１３８Ｌ；Ｖ１４０Ｉ；Ｄ１４３Ｎ；Ｌ１４４Ｆ；Ｋ１４５Ｒ；Ｖ１４７Ａ；Ｖ１５０Ａ；Ｈ１５３ＹまたはＨ１５３Ｑ；Ｈ１５７Ｙ；Ｆ１５８ＬまたはＦ１５８Ｙ；Ｒ１５９Ｋ；Ｅ１６０ＧまたはＥ１６０Ｖ；Ｆ１６２ＹまたはＦ１６２Ｓ；Ｅ１６３ＧまたはＥ１６３Ｋ；Ｅ１６５Ｄ、Ｅ１６５ＧまたはＥ１６５Ｋ；Ｋ１６７ＩまたはＫ１６７Ｒ；Ａ１７０Ｓ；Ｖ１７２Ｉ；Ｆ１７３Ｃ；Ｍ１７７ＶまたはＭ１７７Ｔ；Ｈ１８０Ｙ；Ｖ１８４Ｉ；Ｔ１９０Ａ；Ａ１９３Ｖ；Ａ１９４Ｖ；Ｆ２０１Ｌ；Ｋ２０３Ｒ；Ｆ２０９Ｙ；Ｖ２１８Ｉ；Ｎ２２４Ｓ；Ｅ２２６Ｋ、Ｅ２２６ＧまたはＥ２２６Ｄ；Ｓ２２８Ｔ；Ｄ２２９Ａ；Ｖ２３１ＩまたはＶ２３１Ａ；Ｑ２２３ＫまたはＱ２２３Ｒ；Ｅ２３４ＧまたはＥ２３４Ｄ；Ｔ２３５ＫまたはＴ２３５Ａ；Ｎ２３７Ｙ；Ｋ２３８ＲまたはＫ２３８Ｅ；Ｔ２５１Ａ；Ｖ２５５Ａ；Ｆ２６０Ｌ；Ａ２６２Ｖ；Ｔ２７２Ａ；Ｉ２７４Ｌ；Ｉ２７５ＬまたはＩ２７５Ｖ；およびＰ２８３Ｒのうちの１〜２０個の残基の変化、好ましくは１〜７個の残基の変化を有する配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
上記実施形態の好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの１．５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００１５】
【化１】
を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＥＲＤポリペプチドに関する。
【００１６】
本出願において、ＫＲＥＤポリペプチドのすべての配列番号には、偶数がつけられ、ポリヌクレオチドのすべての配列番号には、奇数がつけられている。さらに、特定の配列番号（偶数）の各ポリペプチドは、直前の配列番号（奇数）のポリヌクレオチドによってコードされる。従って、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされる。
【００１７】
さらに好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドよりも５〜約２５倍高いケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００１８】
【化２】
を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００１９】
なおさらに好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドよりも９〜約２５倍高いケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００２０】
【化３】
を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００２１】
最も好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドよりも１３〜約２５倍高いケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００２２】
【化４】
を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドよりも１．５〜約２５倍高いケトレダクターゼ活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、
（ａ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列（以下「相同ポリペプチド」）を有するか；
（ｂ）（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるか（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照のこと）；
（ｃ）１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のポリペプチド改変体であるか；
（ｄ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のポリペプチドからの少なくとも２２０アミノ酸残基のフラグメントであるか；あるいは、
（ｅ）５０℃にてｐＨ７で６０分間インキュベーションした後に、最初のＫＲＥＤ活性の６０％より多くを保持する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドであるか；
のいずれかである、ＫＲＥＤポリペプチドである。
【００２４】
本発明の新規ＫＲＥＤポリペプチドはまた、野生型ケトレダクターゼ（配列番号２）よりも熱安定性を高められている。熱安定性は、細胞溶解産物を５０℃にて２０〜２４時間熱処置（本明細書中以下で、熱処置）した後に残存する、初期の（未処置）ＫＲＥＤ活性（例えば、実施例４）の百分率で決定された。比較によると、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチド骨格（ＣＲ２−５）は、熱処理後、その初期のＫＲＥＤ活性の１０％が維持された。従って、熱処置後、その処理前の活性を２０％超えたＫＲＥＤ活性を示したＫＲＥＤポリペプチドはいずれも、熱安定性が高められたと考えられた。好ましくは、本発明のＫＲＥＤポリペプチドの熱処理後に残存するＫＲＥＤ活性は、少なくとも５０％の活性（すなわち、処理前の活性の少なくとも５０％）、そして最も好ましくは少なくとも１００％の活性（熱処理前後の活性が等しい）であった。（配列番号２）の野生型ＫＲＥＤポリペプチドであるＣＲ２−５におけるＫＲＥＤ活性と比較した本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体についての「活性」を、表１に列挙している。種々のＫＲＥＤポリペプチドの各々の細胞溶解産物を５０℃にて２０〜２４時間熱処理した後の、本発明の種々のＫＲＥＤポリペプチドについての熱安定性もまた、表１に列挙している。
【００２５】
従って、高められた熱安定性と高められたＫＲＥＤ活性との組合せに基づくと、本発明の好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号９２、配列番号９８、配列番号２６４、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７６、配列番号２８８、配列番号２９４、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３１０、配列番号３１８、配列番号３２４、配列番号３２８、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３４４、配列番号５０６、配列番号５２６、または配列番号５４２を有する。また、配列番号９２、配列番号９８、配列番号２６４、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７６、配列番号２８８、配列番号２９４、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３１０、配列番号３１８、配列番号３２４、配列番号３２８、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３４４、配列番号５０６、配列番号５２６、または配列番号５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、配列番号９１、配列番号９７、配列番号２６３、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７５、配列番号２８７、配列番号２９３、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０９、配列番号３１７、配列番号３２３、配列番号３２７、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号５０５、配列番号５２５、または配列番号５４１のポリヌクレオチド、または、それらのコドンを最適化したバージョン）も本発明の範囲内である。
【００２６】
増強されたＫＲＥＤ活性に基づいた別の実施形態において、本発明の好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１５１％を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４４、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列を有する。本発明のさらに好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも５００％を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列を有する。同様に、本発明はまた、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のポリヌクレオチド）に関する。
【００２７】
高められたＫＲＥＤ活性および／または高められた熱安定性をもたらすように置換されている、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチド（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｓｅ供給源）の種々の残基位置は、本明細書中の表４に要約される。高められたＫＲＥＤ活性および／または５０℃における熱安定性が実証されている、多数の発明性のあるＫＲＥＤポリペプチドについてのアミノ酸配列は、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１２４、配列番号２０６、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２として本明細書中に開示される。
【００２８】
第二の局面において、本発明は、上述の発明性のあるＫＲＥＤポリペプチドのうちの一つをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、それぞれ、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１２３、配列番号２０５、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３２１、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３４３、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３５、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４１、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のポリヌクレオチド）のいずれにも関する。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のポリヌクレオチドに関し、それぞれが、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０または配列番号５４２の新規性のあるＫＲＥＤポリペプチドをコードする。
【００３０】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、または配列番号５２５のポリヌクレオチドに関し、それぞれが、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、または配列番号５２６のＫＲＥＤポリペプチドをコードする。
【００３１】
なおさらに好ましい実施形態において、本発明は、配列番号５０５、配列番号５１９、配列番号５２５、配列番号５３５、および配列番号５３７のポリヌクレオチドに関し、それぞれが、配列番号５０６、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５３６、および配列番号５３８のＫＲＥＤポリペプチドをコードする。
【００３２】
第三の局面において、本発明は、核酸構築物、ベクター、または、プロモーターに作動可能に連結した本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関する。
【００３３】
第四の局面において、本発明は、
（ａ）ポリペプチドの産生のために適切な条件下で、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物を含む宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）そのポリペプチドを回収する工程
を包含する、本発明のＫＲＥＤポリペプチドを作製する方法に関する。
【００３４】
前述の要旨、および本発明の特定の実施形態の以下の詳細な説明は、添付された図面とともに読む場合、より一層理解される。本発明を図示する目的で、図面中に、特定の実施形態が示される。しかしながら、添付された図面中に示された配置および手段は、本発明を限定するものでないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に用いられる場合、用語「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、ケトンの還元を触媒する能力を有するポリペプチドについて本明細書中で援用するために互換可能に用いられる。好ましくは、β−ケト酸中のケトンが、還元剤として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を利用して、立体特異的様式で、対応するβ−ヒドロキシ酸になる。
【００３６】
本発明は、多様な局面を有する。一つの局面において、本発明は、配列番号２のＫＲＥＤと比較して増強されたＫＲＥＤ活性を有するケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）ポリペプチドに関し、このポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の好ましくは少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜約２５倍の活性を有する。このような活性は、ＮＡＤＰＨが酸化されて同時にケトンが対応するアルコールに還元されることに起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定される。別の局面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドの１．５倍、代表的には１．５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関し、このような活性は、ＮＡＤＰＨの吸光度またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定されるか（例えば、実施例４）、あるいは、結合アッセイにおいて生成された産物から測定される（例えば、実施例５）。このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号５０６、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５３６、および配列番号５３８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％相同である。
【００３７】
一つの実施形態において、本発明はまた、本明細書中のどこかに記載される、単離されかつ精製された形態のＫＲＥＤポリペプチド改変体に関する。別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載された凍結乾燥形態のＫＲＥＤポリペプチド改変体に関する。なお別に実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるＫＲＥＤポリペプチド改変体および適切なキャリア（代表的には緩衝溶液、より代表的には６．０と８．０との間のｐＨを有する緩衝溶液）を含む組成物に関する。
【００３８】
別の局面において、本発明は、ＫＲＥＤポリペプチド（好ましくは、単離されかつ精製された）に関し、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜２５倍のＫＲＥＤ活性を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、Ａ２Ｖ；Ｋ３Ｅ；Ｆ５ＬまたはＦ５Ｃ；Ｎ７Ｋ；Ｅ９ＧまたはＥ９Ｋ；Ａ１２Ｖ；Ｐ１３Ｌ；Ｐ１４Ａ；Ａ１６ＧまたはＡ１６Ｖ；Ｔ１８Ａ；Ｋ１９Ｉ；Ｎ２０ＤまたはＮ２０Ｓ；Ｅ２１Ｋ；Ｓ２２ＮまたはＳ２２Ｔ；Ｑ２４ＨまたはＱ２４Ｒ；Ｖ２５Ａ；Ｎ３２ＳまたはＮ３２Ｄ；Ａ３６Ｔ；Ｓ４１Ｇ；Ｓ４２Ｎ；Ｉ４５Ｌ；Ａ４８Ｔ；Ｖ５６Ａ；Ｖ６０Ｉ；Ｙ６４Ｈ；Ｎ６５Ｋ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５ＹまたはＮ６５Ｓ；Ｓ６６ＧまたはＳ６６Ｒ；Ｈ６７ＬまたはＨ６７Ｑ；Ｄ６８ＧまたはＤ６８Ｎ；Ｇ７１Ｄ；Ｅ７４ＫまたはＥ７４Ｇ；Ｋ７８Ｒ；Ｋ７９Ｒ；Ｋ８５Ｒ；Ａ８６Ｖ；Ｎ９０Ｄ；Ｓ９３ＮまたはＳ９３Ｃ；Ｄ９５Ｎ、Ｄ９５Ｇ、Ｄ９５Ｖ、Ｄ９５ＹまたはＤ９５Ｅ；Ｋ９８Ｒ；Ｑ９９Ｌ、Ｑ９９Ｒ、またはＱ９９Ｈ；Ｔ１００Ａ；Ｉ１０１Ｖ；Ｑ１０３Ｒ；Ｉ１０５ＶまたはＩ１０５Ｔ；Ｋ１０６ＲまたはＫ１０６Ｑ；Ｈ１１０Ｙ、Ｈ１１０ＣまたはＨ１１０Ｒ；Ｖ１１４Ａ；Ａ１１６Ｇ；Ｉ１２０Ｖ；Ｋ１２４Ｒ；Ｄ１２９ＧまたはＤ１２９Ｎ；Ｄ１３１ＧまたはＤ１３１Ｖ；Ｄ１３２Ｎ；Ｋ１３４Ｍ、Ｋ１３４Ｖ、Ｋ１３４ＥまたはＫ１３４Ｒ；Ｄ１３７ＮまたはＤ１３７Ｇ；Ｑ１３８Ｌ；Ｖ１４０Ｉ；Ｄ１４３Ｎ；Ｌ１４４Ｆ；Ｋ１４５Ｒ；Ｖ１４７Ａ；Ｖ１５０Ａ；Ｈ１５３ＹまたはＨ１５３Ｑ；Ｈ１５７Ｙ；Ｆ１５８ＬまたはＦ１５８Ｙ；Ｒ１５９Ｋ；Ｅ１６０ＧまたはＥ１６０Ｖ；Ｆ１６２ＹまたはＦ１６２Ｓ；Ｅ１６３ＧまたはＥ１６３Ｋ；Ｅ１６５Ｄ、Ｅ１６５ＧまたはＥ１６５Ｋ；Ｋ１６７ＩまたはＫ１６７Ｒ；Ａ１７０Ｓ；Ｖ１７２Ｉ；Ｆ１７３Ｃ；Ｍ１７７ＶまたはＭ１７７Ｔ；Ｈ１８０Ｙ；Ｖ１８４Ｉ；Ｔ１９０Ａ；Ａ１９３Ｖ；Ａ１９４Ｖ；Ｆ２０１Ｌ；Ｋ２０３Ｒ；Ｆ２０９Ｙ；Ｖ２１８Ｉ；Ｎ２２４Ｓ；Ｅ２２６Ｋ、Ｅ２２６ＧまたはＥ２２６Ｄ；Ｓ２２８Ｔ；Ｄ２２９Ａ；Ｖ２３１ＩまたはＶ２３１Ａ；Ｑ２２３ＫまたはＱ２２３Ｒ；Ｅ２３４ＧまたはＥ２３４Ｄ；Ｔ２３５ＫまたはＴ２３５Ａ；Ｎ２３７Ｙ；Ｋ２３８ＲまたはＫ２３８Ｅ；Ｔ２５１Ａ；Ｖ２５５Ａ；Ｆ２６０Ｌ；Ａ２６２Ｖ；Ｔ２７２Ａ；Ｉ２７４Ｌ；Ｉ２７５ＬまたはＩ２７５Ｖ；およびＰ２８３Ｒのうちの１〜２０個の残基の変化、好ましくは１〜７個の残基の変化を有する配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
別に指定がなければ、用語「同一性パーセント」、「同一性％」、「同一性パーセント」および「同一性％」は、アミノ酸配列同一性％について本明細書中で援用するために互換可能に用いられ得る。このアミノ酸配列同一性％は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ ｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍを用いて決定される。すなわち、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ（導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックス；同一性％＝部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割った、第一配列と第二配列との間の同一残基の数のための動的計画法アルゴリズム）を用いて決定された。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【００４０】
使用にあたって、本発明の増強されたＫＲＥＤポリペプチドは、好ましくは、ＫＲＥＤポリペプチドのための補因子の継続的な供給源を提供する補因子再生系と共役される。図１を参照のこと。本明細書中で用いられる「補因子」とは、目的の反応を触媒するよう酵素と相乗的に作用する非タンパク化合物をいう。例えば、補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、酵素（例えば、本発明のＫＲＥＤポリペプチド）とともに利用され、そして、３−ケト−酪酸エステル／アミドの立体特異的還元を触媒し、それらの対応する３−ヒドロキシ酪酸エステル／アミドとし、かつ、α−ハロケトンをそれらの対応するハロヒドリンとし、そして補因子再生系（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ／グルコース）とともに利用される。
【００４１】
用語「補因子再生系」とは、本明細書中において、利用された補因子をその反応前の状態へ戻すよう再生する反応に関与する一連の反応物をいう。ある一つの例は、酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰを補因子の還元された形態（例えば、それぞれ、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ）に戻す再生である。次いで還元された（再生された）補因子は、還元された基質および酸化された（利用された）補因子を立体特異的に生成するために、基質および酵素（例えば、ケトレダクターゼ）と再度反応できることが再度可能になる。後者は、補因子再生系によって再生される。適切な補因子再生系としては、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼとギ酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとグルコース−６−リン酸、第二級アルコールデヒドロゲナーゼとイソプロピルアルコールなどが挙げられ、これらすべては、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ／ＮＡＤＨのいずれかとともに用いられる。従って、例えば、４−ハロ−３−ケト−酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ケト−酪酸アミドは、所望のヒドロキシ化合物およびＮＡＤＰ（またはＮＡＤ）を生成するために、本発明のＫＲＥＤポリペプチドおよびＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）により還元される場合、生じたＮＡＤＰ（またはＮＡＤ）は、グルコースおよび補因子再生系として作用するグルコースデヒドロゲナーゼの触媒量によって、還元されて（再生されて）その元の形態（ＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ））に戻る。グルコース脱水素補因子再生系の上述の作用は、図１中に例示される。
【００４２】
本明細書中で用いられる用語「共役した」は、ケトレダクターゼ基質の還元における補因子の還元型形態の使用のことをいう。そして、この用語は、同じ補因子の還元型形態を産出する補因子再生系の構成成分（例えば、グルコース）の酸化において、上述の反応で産出した同じ補因子の酸化型を同時に使用することをいう。したがって、図１中では、ケトレダクターゼ酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系と共役されるように示される。
【００４３】
上述の実施形態の好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの１．５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００４４】
【化５】
を有することにより配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００４５】
さらに好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００４６】
【化６】
を有することにより配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００４７】
なおさらに好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの９〜約２５倍のケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００４８】
【化７】
を有することにより配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００４９】
最も好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの１３〜約２５倍のケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００５０】
【化８】
を有することにより配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００５１】
本発明のＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＣ．ｍａｇｎｏｌｉａｅに由来するＫＲＥＤポリペプチド骨格のＫＲＥＤ活性よりも、１．５倍〜約２５倍高い増強されたＫＲＥＤ活性（例えば、実施例４の方法によって測定される）を有する。そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２とは、１個〜２０個のアミノ酸残基、代表的には、１個〜１０個のアミノ酸残基、より代表的には、１個〜９個のアミノ酸残基、さらにより代表的には、１個〜８個のアミノ酸残基、最も代表的には、１個〜７個のアミノ酸残基異なる。好ましくは、本発明のＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチド骨格のＫＲＥＤ活性よりも、９倍〜約２５倍高い、より好ましくは、１３倍〜約２５倍高い増強されたＫＲＥＤ活性を有する。
【００５２】
別の局面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドの１．５〜約２５倍のケトレダクターゼ活性を有する配列番号２のＫＲＥＤポリペプチドに関し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、
（ａ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列（以下「相同ポリペプチド」）を有するか；
（ｂ）（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖
のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるか（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照のこと）；
（ｃ）１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０または配列番号５４２のポリペプチドの改変体であるか；
（ｄ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のポリペプチドからの少なくとも２２０アミノ酸残基のフラグメントであるか；あるいは、
（ｅ）５０℃にてｐＨ７で６０分間インキュベーションした後に、最初のＫＲＥＤ活性の６０％より多くを保持する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドであるか；
のいずれかである。
【００５３】
本発明の新規ＫＲＥＤポリペプチドはまた、野生型ケトレダクターゼ（配列番号２）よりも熱安定性を高められている。熱安定性は、細胞溶解産物をｐＨ７で５０℃にて２０時間〜２４時間熱処置（本明細書中以下で、熱処置）した後に残存する、初期の（未処置）ＫＲＥＤ活性の百分率（例えば、実施例４）で決定された。比較によると、配列番号２の野生型ＫＲＥＤポリペプチド（ＣＲ２−５）は、熱処理後、その初期のＫＲＥＤ活性の１０％が維持された。従って、熱処置後、その処理前の活性の２０％を超えたＫＲＥＤ活性を示したＫＲＥＤポリペプチドはいずれも、熱安定性が高められたと考えられた。好ましくは、本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体の熱処理後のＫＲＥＤ活性は、少なくとも５０％の残存活性、そして最も好ましくは１００％の活性（熱処理前後の活性が等しい）であった。（配列番号２）の野生型ＫＲＥＤポリペプチドであるＣＲ２−５におけるＫＲＥＤ活性と比較した本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体についての「活性％」を、表１に列挙している。種々のＫＲＥＤポリペプチドの各々の細胞溶解産物を５０℃にて２０時間〜２４時間熱処理した後の、本発明の種々のＫＲＥＤポリペプチドについての熱安定性もまた、表１に列挙している。
【００５４】
【表１】
従って、増強された熱安定性および増強されたＫＲＥＤ活性の組合せに基づき、本発明の好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号３４４、配列番号４４０、配列番号５０６、配列番号５２６、または配列番号５４２を有する。配列番号３４４、配列番号４４０、配列番号５０６、配列番号５２６、または配列番号５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、それぞれ配列番号３４３、配列番号４３９、配列番号５０５、配列番号５２５、または配列番号５４１、あるいは、それらのコドン最適化バージョン）もまた本発明の範囲内である。
【００５５】
増強されたＫＲＥＤ活性に基づいた別の実施形態において、本発明の好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１５１％を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４４、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列を有する。本発明のさらに好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも５００％を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列を有する。同様に、本発明はまた、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のポリヌクレオチド）に関する。
【００５６】
本発明のさらに好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも９００％を有し、そして、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３６、配列番号５３８、または配列番号５４０のアミノ酸配列を有する。
【００５７】
なおさらに好ましい本発明のＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１３００％を有し、そして、配列番号５３６、配列番号５３８を有する。代表的には、本発明の上述のＫＲＥＤポリペプチドは、溶解産物として測定された場合、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチドよりも２５００％より少ないＫＲＥＤ活性を有する。上述で参照されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた好ましく、そして、このポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドがコードするポリペプチドよりもそれぞれ一つ前の整数値である配列番号を有する。
【００５８】
なお別の局面において、本発明は、共役化学反応において増強された活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００５９】
別の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖
のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるＫＲＥＤポリペプチドに関する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【００６０】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドについて、低程度から最高程度までのストリンジェンシー条件が、以下のように定義され、その後、標準的なサザンブロット手順を実施する：（低程度のストリンジェンシーでは２５％のホルムアミド、中程度および準高程度のストリンジェンシーでは３５％のホルムアミド、または高程度および最高程度のストリンジェンシーでは５０％のホルムアミドのうちのいずれかで、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、切断かつ変性されたサケ精子ＤＮＡ２００μｇ／ｍｌ中において、４２℃でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション）。長さが少なくとも１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドについて、キャリア物質は、最終的に、少なくとも５０℃で（低程度のストリンジェンシー）、少なくとも５５℃で（中程度のストリンジェンシー）、少なくとも６０℃で（準高程度のストリンジェンシー）、少なくとも６５℃で（高程度のストリンジェンシー）、少なくとも７０℃で（最高程度のストリンジェンシー）で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いてそれぞれ１５分間、三回洗浄される。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のポリペプチド改変体に関する。このポリペプチド改変体は、配列番号２の野生型ＫＲＥＤのＫＲＥＤ活性の１．５倍〜２５倍を有する（例えば、実施例４の方法によって決定される）。好ましくは、アミノ酸の変化は軽度のものであり、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／または活性に有意な影響を与えない保存的なアミノ酸置換である。この保存的なアミノ酸置換は、わずかな欠失（代表的には１〜６個のアミノ酸）、わずかなアミノ末端伸長もしくはわずかなカルボキシル末端伸長、小さなリンカーペプチド、あるいは、正味電荷または別の機能（例えば、ポリ−ヒスチジン路、抗原のエピトープもしくは結合領域）の変化によって、精製が促進するわずかな伸長である。
【００６２】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（レクチン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、ならびに、低分子アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、およびメチオニン）の群のうちである。一般的に当該分野で公知である特定の活性を変化させないアミノ酸置換が、（例えば、Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、１９７９，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．に記載される最も一般的に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙ、ならびに、これらの逆の交換である。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２の野生型ＫＲＥＤのＫＲＥＤ活性の１．５〜約２５倍を有する上述の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のフラグメントに関し、これらは、実施例４の方法によって決定された。「フラグメント」という用語は、カルボキシ末端、アミノ末端、またはその両方からの１〜１０個のアミノ酸残基の欠失を有するポリペプチドを意味する。好ましくは、この欠失は、カルボキシ末端からの１〜１０個の残基の欠失であり、より好ましくは、この欠失は、カルボキシ末端からの１〜５個の残基の欠失である。
【００６４】
なお別の実施形態において、本発明は、上記の「詳細な説明」において記載されるような（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＫＲＥＤポリペプチドに関する。このＫＲＥＤポリペプチドは、５０℃、ｐＨ７で２０時間〜２４時間インキュベーション後、最初の（インキュベーション前の）ＫＲＥＤ活性を２０％より高く維持する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、その最初の活性の少なくとも２０％を維持し、より好ましくは、５０℃、ｐＨ７で２０時間〜２４時間インキュベーション後、最初の活性の少なくとも５０％を維持する。熱処理前および熱処理後の溶解産物（実施例３において調製されるような溶解産物）に関する最初のＫＲＥＤ活性および残存ＫＲＥＤ活性は、ＫＲＥＤ活性アッセイ（例えば、本明細書中の実施例４において記載されるようなアッセイ）によって容易に決定される。
【００６５】
（ポリヌクレオチド）
その第２の局面において、本発明は、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。遺伝子コードの縮重を考慮すれば、本発明はまた、配列番号４２、配列番号７２、配列番号７６、配列番号９６、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４４、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０または配列番号５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドに関する。
【００６６】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号４１、配列番号７１、配列番号７５、配列番号９５、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３２１、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３４３、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３５、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４１、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９または配列番号５４１のポリヌクレオチドに関し、これらのポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４２、配列番号７２、配列番号７６、配列番号９６、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４４、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０または配列番号５４２の新規ＫＲＥＤポリペプチドをコードする。
【００６７】
特に好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２５４のポリペプチドをコードする配列番号２５３のポリヌクレオチドならびに配列番号３０３および配列番号３４３のコドン最適化ポリヌクレオチドに関し、これらの最適化ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける配列番号２５４のポリペプチドの増強された発現を提供する非表現突然変異を含む。特に、配列番号２５３から配列番号３４３へと移るコドン最適化は、以下の非表現置換からなっていた：Ａ１６Ｔ、Ｇ１７Ｃ、Ｃ３０Ｔ、Ｔ３３９Ａ、Ｃ６００Ｔ、Ｔ７３８ＣおよびＴ７４４Ｃ。これらの非表現置換は、上記細胞溶解産物から（例えば、実施例３）そのＫＲＥＤ活性によって測定される場合（例えば、実施例４）の、上記ＫＲＥＤポリペプチドの発現の２．５倍の増強をもたらした。
【００６８】
本発明の改善されたＫＲＥＤポリヌクレオチドおよび改善されたＫＲＥＤポリペプチドを作製するには、骨格として使用するためにＫＲＥＤポリペプチドをコードする１つ以上の野生型ポリヌクレオチドを用いて開始する。ポリヌクレオチドに対して適用される場合、用語「野生型」とは、その核酸フラグメントが天然から単離された形態からのいずれの変異も含まないことを意味する。ポリペプチド（またはタンパク質）に対して適用される場合、上記用語「野生型」とは、そのタンパク質が天然に見られる活性レベルで活性であることを意味し、代表的には、天然に見られるアミノ酸配列を含む。従って、上記用語「野生型」または「親配列」は、本発明の操作前の開始配列または参照配列を示す。
【００６９】
改善されるべき出発物質としての天然に生じるＫＲＥＤの適切な供給源は、本明細書中に記載されるＫＲＥＤ活性に対して生物のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、容易に同定される。例えば、実施例４を参照のこと。天然に生じるＫＲＥＤ酵素は、広範囲の細菌および酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＡＦ１６０７９９；ＧＩ ６５３９７３４））において見られる。ＫＲＥＤの特に適切な供給源は、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅである。本発明において、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅの野生型ＫＲＥＤポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８として公開されているＣａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ由来のＫＲＥＤに対する公知のポリペプチド配列に基づいて、６０マーのオリゴマーから構築された。上記親ポリヌクレオチド配列は、ＣＲ２−５（配列番号１）と呼ばれ、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化されたコドンであり、従って、上記野生型ポリヌクレオチド配列とは実質的に異なっていた。上記コドン最適化ポリヌクレオチドは、ｌａｃプロモーター遺伝子およびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下にある上記発現ベクターｐＣＫ１１０９００（図３に示される）のＳｆｉＩクローニング部位にクローニングされた。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んだ。いくつかのクロ−ンは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０において活性なケトレダクターゼを発現することが見出され、そしてその遺伝子は、配列決定されてそれらのＤＮＡ配列が確かめられた。ＣＲ２−５と呼ばれる配列（配列番号１）は、全ての実験およびライブラリー構築のための開始点として利用される親配列であった。
【００７０】
一旦、適切な出発物質（例えば、配列番号１のポリヌクレオチド）が同定されると、未知のＫＲＥＤ活性を有する、天然に生じずかつ変異および／または進化された酵素は、周知の変異誘発または直接的な進化的方法のうちのいずれか１つを用いて、容易に生成される。例えば、Ｌｉｎｇら、「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７−７８（１９９７）；Ｄａｌｅら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５７：３６９−７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ、「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３７：１−７（１９８６）；Ｋｒａｍｅｒら、「Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ」、Ｃｅｌｌ、３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｗｅｌｌｓら、「Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｎｏｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ」、Ｇｅｎｅ、３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：２８４−２９０（１９９９）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ＡＺＴ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：２５９−２６４（１９９９）；Ｃｒａｍｅｒｉら、「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｔｅ、３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｓｅｎａｔｅ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：４３６−４３８（１９９７）；Ｚｈａｎｇら、「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｒｕｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３１５−３１９（１９９６）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、「Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９−３９１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；ＷＯ ９５／２２６２５；ＷＯ ９７／００７８；ＷＯ ９７／３５９６６；ＷＯ ９８／２７２３０；ＷＯ ００／４２６５１；ＷＯ ０１／７５７６７および２００３年３月２５日にＡｒｎｏｌｄらに対して発行され、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｒｅａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と題された米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと。
【００７１】
これらの方法のいずれもが、ＫＲＥＤポリヌクレオチドを生成するために適用され得る。多様性を最大にするために、上に記載される技術のうちのいくつかは、連続的に使用され得る。代表的には、シャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）されたポリヌクレオチドのライブラリーは、１つの変異誘発技術もしくは発展的技術によって作製され、そしてそれらの発現産物は、最も高いＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドを見つけるためにスクリーニングされる。本発明において、配列番号７５を有するポリヌクレオチドは、補因子としてＮＡＤＨを用いたスクリーニングされたライブラリー由来の最も期待できる候補であった。しかし、上記ポリペプチドの図３のプラスミドｐＣＫ１１０９００からのより良好な発現を得るために、配列番号７５のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化されたコドンであるオリゴマーを用いて再合成された。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号７７の配列を有していた。
【００７２】
それ以降、第２の変異誘発技術または進化的技術は、第２のライブラリーを作製するために配列番号７７のコドン最適化ポリヌクレオチドに対して適用され、この第２のライブラリーは、次いで、同じ技術によってＫＲＥＤ活性に対してスクリーニングされた。得られたクローンをスクリーニングすることは、３つのクローン、配列番号１２３、配列番号２０３および配列番号２２３の単離をもたらし、これらのクローンは、それぞれ、配列番号１２４、配列番号２０４および配列番号２２４のＫＲＥＤポリペプチドをコードし、ＮＡＤＨ（配列番号１２４）またはＮＡＤＰＨ（配列番号２０４および配列番号２２４）を補因子として使用すると、配列番号２の野生型ポリペプチドの３．１倍と４．３倍との間のＫＲＥＤ活性を有する。変異させ、そしてスクリーニングするプロセスは、所望される活性、熱安定性および補因子選択性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに達するまで、必要とされるだけ多くの回数反復され得、このプロセスは、点変異の挿入を含む。
【００７３】
図３のプラスミドｐＣＫ１１０９００からの配列番号１２３のポリヌクレオチドのより良好な発現を得るために、配列番号１２３のポリペプチドは、上記ベクターのＳｆｉＩ部位および上記ＫＲＥＤ ｍＲＮＡの５’末端でＲＮＡヘアピンループ形成を導き得るヌクレオチドを置換するために、オリゴマーを用いて再増幅された。具体的には、オリゴは、上記ｐＣＫ１１０９００ベクターの５’−ＳｆｉＩ部位を変化させ、そしてコードＫＲＥＤポリペプチドの６位の残基におけるセリンのためのＡＧＣコドンを、セリンをまたコードしたＴＣＣコドンで置換することにより、これらの潜在的なステムループ構造を阻害するように設計された。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、その形質転換および培養された宿主細胞の溶解産物におけるＫＲＥＤ活性により測定される場合、上記ＫＲＥＤポリペプチドの約２と２分の１（２．５）倍高い発現をもたらした。
【００７４】
補因子としてＮＡＤＰＨを用いて第３ラウンドライブラリーをスクリーニングした後、配列番号２５３を有するポリヌクレオチドは、最も期待できる候補であった。しかし、図３のｐＣＫ１１０９００プラスミドからの上記ポリヌクレオチドのより良好な発現を得るために、上記配列番号２５３のポリヌクレオチドは、進化した技術を適用することによってさらに改善され、そして上記配列番号１２３についてと同様に、ヘアピン形成ヌクレオチドが除去されたベクター中で、クローニングされた。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号３０３および配列番号３４３のポリヌクレオチドを含んでいた。
【００７５】
シャッフル技術または進化した技術を適用する代わりに、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、公知の合成方法に従う標準的な固相方法によって調製され得る。代表的には、約１００塩基までのフラグメントは、独立して合成され、次いで（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション方法またはポリメラーゼ媒介性方法によって）結合されて、本質的に、任意の所望される連続配列を形成する。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、自動合成方法において代表的に実施される場合、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−６９により記載される古典的なホスホロアミダイト方法またはＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−０５により記載される方法（例えば、自動合成法において代表的に実施されるような方法）を用いて、化学合成によって調製され得る。上記ホスホロアミダイト方法に従って、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクター中にクローニングされる。さらに、本質的に、任意の核酸は、任意の種々の市販供給源（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡおよび他の多くの市販供給源）から特別注文され得る。
【００７６】
（核酸構築物／発現カセット／発現ベクター）
別の局面において、本発明は、核酸構築物に関し、この核酸構築物は、核酸構築物を生じるために遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列に作動可能に連結された、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、発現ベクターまたは発現カセット）を含む。その後、得られた核酸構築物（例えば、発現ベクターまたは発現カセット）は、上記ポリヌクレオチド改変体によりコードされたＫＲＥＤポリペプチドの究極的な発現のために、適切な宿主細胞に挿入された。
【００７７】
「核酸構築物」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子として本明細書中で規定され、天然に存在する遺伝子から単離されるかまたは改変されて、そうでなければ天然に存在しない様式で組み合わされ、かつ並列される核酸のセグメントを含む。上記用語、核酸構築物は、その核酸構築物が、本発明のコード配列（ポリヌクレオチド）の発現のために必要とされる全ての制御配列を含む場合、用語、発現カセットまたは発現ベクターを含む。
【００７８】
用語「コード配列」は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチド配列として、本明細書中で規定される。ゲノムコード配列の境界は、一般的に、そのｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームのすぐ上流に位置するリボソーム結合部位（原核生物）またはＡＴＧ開始コドン（真核生物）、およびそのｍＲＮＡの３’末端のオープンリーディングフレームのすぐ下流に位置する転写終結配列によって決定される。コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび組み換え核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、種々の方法で操作されて、そのポリペプチドの発現を提供し得る。上記単離されたポリヌクレオチドのそのベクターへの挿入前の操作は、その発現ベクターに依存して、所望され得るかまたは必要とされ得る。組み換えＤＮＡ法を利用してポリペプチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当該分野において周知である。
【００８０】
用語「制御配列」は、本発明のポリペプチドの発現のために必要かまたは有利な全ての構成要素を含むことが、本明細書中で規定される。各制御配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブであっても外来性であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低でも、上記制御配列は、プロモーターならびに転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。上記制御配列は、その制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特定の制限部位を導入する目的のために、リンカーが提供され得る。
【００８１】
用語「作動可能に連結された」は、制御配列が、上記ＤＮＡ配列のコード配列に対する位置に適切に位置され、それにより、その制御配列がポリペプチドを発現させる配置として、本明細書中で規定される。
【００８２】
上記制御配列は、適切なプロモーター配列であり得る。上記「プロモーター配列」は、それに続くより長いコード領域の発現のために宿主細胞によって認識される、比較的短い核酸配列である。上記プロモーター配列は、上記ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。上記プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、これらの核酸配列としては、変異プロモーター、トランケートプロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられ、そしてこれらの核酸配列は、その宿主細胞に対して相同性または異種性のいずれかの細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００８３】
細菌宿主細胞のために、本発明の核酸構築物を転写させるために適切なプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核生物βラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）から得られるプロモーターならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８０：２１−２５）が挙げられる。さらなるプロモーターは、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４−９４；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出に記載されている。
【００８４】
糸状菌宿主細胞のために、本発明の核酸構築物を転写させるために適切なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ アスパラギン酸プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 天然αアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 酸安定αアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ リパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ アルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ トリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ アセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ チロシン様プロテアーゼ（ＷＯ ９６／００７８７）の遺伝子から得られるプロモーターならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 天然αアミラーゼの遺伝子由来のプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ トリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターとのハイブリッド）、ならびにそれらの変異プロモーター、トランケートプロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
【００８５】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセラーゼキナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されている。
【００８６】
上記制御配列はまた、適切な転写終結配列（宿主細胞によって認識されて転写を終結する配列）であり得る。上記終結配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的である任意のターミネーターは、本発明において使用され得る。
【００８７】
糸状菌宿主細胞のために好ましいターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ グルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ アントラニレートシンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ αグルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ チロシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００８８】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ エノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ シトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、前出に記載されている。
【００８９】
上記制御配列はまた、適切なリーダー配列（上記宿主細胞による翻訳のために重要な、ｍＲＮＡの非翻訳領域）であり得る。上記リーダー配列は、上記ペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列は、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ トリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセラーゼキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【００９０】
上記制御配列はまた、ポリアデニル化配列（上記核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、そして転写される際に上記宿主細胞によってシグナルとして認識されて、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する配列）であり得る。選択された宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列は、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ グルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ アントラニレートシンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ チロシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ αグルコシダーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ、１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：５９８３−５９９０に記載されている。
【００９１】
上記制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結され、そしてその制御配列がコードされたポリペプチドをその細胞の分泌経路に向けるアミノ酸配列をコードする、シグナルペプチドコード領域であり得る。上記核酸配列のコード配列の５’末端は、本来、シグナルペプチドコード領域を含み得、このシグナルペプチドコード領域は、翻訳リーディングフレームにおいて、その分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、天然に連結されている。あるいは、上記コード配列の５’末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含み得る。上記外来性シグナルペプチドコード領域は、そのコード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない場合に、必要とされ得る。
【００９２】
あるいは、上記外来性シグナルペプチドコード領域は、そのポリペプチドの分泌を促進するために、その天然シグナルペプチドコード領域を、単に置換し得る。しかし、その発現ポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
【００９３】
細菌宿主細胞のために有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣ１Ｂ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ サブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ βラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａ、１９９３、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７に記載されている。
【００９４】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ グルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ アスパラギン酸プロテアーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ セルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ リパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００９５】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、前出に記載されている。
【００９６】
上記制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはいくつかの場合、チモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般的に不活性であり、そしてそのプロポリペプチドからそのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。上記プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ 中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ アスパラギン酸プロテアーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ラクターゼ（ＷＯ ９５／３３８３６）の遺伝子から得られる。
【００９７】
シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてそのシグナルペプチド領域は、そのプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【００９８】
調節配列を付加することがまた、所望され得、この調節配列は、上記宿主細胞の増殖に対する上記ポリペプチドの発現の調節を可能にする。調節系の例は、化学的または生理的刺激に応答してスイッチを入れられるかまたはスイッチを消されるべき遺伝子の発現を引き起こす調節系であり、これらの刺激としては、調節化合物の存在が挙げられる。原核生物宿主細胞において、適切な調節配列としては、ｌａｃオペレーター系、ｔａｃオペレーター系およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞において、適切な調節系としては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌において、適切な調節配列としては、ＴＡＫＡαアミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ グルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ グルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【００９９】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にする調節配列である。真核生物系において、これらとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および重金属によって増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列は、上記調節配列に作動可能に連結される。
【０１００】
従って、別の局面において、本発明はまた、組み換え発現ベクターに関し、この組み換え発現ベクターは、それらが導入されるべき宿主の型に依存して、（本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする）本発明のポリヌクレオチド、および１つ以上の発現調節領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター）、複製起点などを含む。上に記載される種々の核酸配列および制御配列は、一緒に結合されて組み換え発現ベクターを生成し得、この組み換え発現ベクターは、１つ以上の都合のよい制限部位を含み得、このような部位において上記ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にし得る。あるいは、本発明の核酸配列は、上記配列を含む核酸配列または核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって、発現され得る。上記発現ベクターの作製において、上記コード配列は、そのベクター中に位置し、それにより、そのコード配列は、発現のための適切な制御配列と作動可能に連結される。
【０１０１】
上記組み換え発現ベクターは、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得、これらのベクターは、組み換えＤＮＡ手順に都合よく供され得、そして上記ポリペプチド配列の発現をもたらし得る。上記ベクターの選択は、代表的に、そのベクターと、そのベクターが導入されるべき宿主細胞との適合性に依存する。上記ベクターは、直線状でも閉じられた環状プラスミドでもよい。
【０１０２】
上記発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外存在物として存在し、その複製は、染色体の複製に依存しないベクター）（例えば、プラスミド）であっても、染色体外エレメントであっても、ミニ染色体（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）であっても、人工染色体であってもよい。上記ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、上記ベクターは、上記宿主細胞に導入されると、そのゲノムに統合され、そしてそのベクターが統合された染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、上記宿主細胞のゲノムに導入されるべきＤＮＡ全体を一緒に含む、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが、使用され得る。
【０１０３】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の選択を容易にする１つ以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その選択マーカーの産物が、バイオサイド耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養素要求株に対する原栄養菌などを提供する遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子または抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性（実施例１）またはテトラサイクリン耐性）を与えるマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。
【０１０４】
糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）ならびにそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞における使用のためには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が好ましい。
【０１０５】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、そのベクターの上記宿主細胞のゲノムへの統合またはそのゲノムに非依存的なその細胞におけるそのベクターの自己複製を許容するエレメントを含む。上記宿主細胞ゲノムへの統合のために、上記ベクターは、相同組み換えまたは非相同組み換えによるそのベクターのゲノムへの統合のために、上記ポリプチドまたはそのベクターの任意の他のエレメントをコードする核酸配列に頼り得る。
【０１０６】
あるいは、上記発現ベクターは、相同組み換えによって上記宿主細胞のゲノムに統合させるためのさらなる核酸配列を含み得る。上記さらなる核酸配列は、上記ベクターが、染色体における正確な位置で上記宿主細胞ゲノムに統合されることを可能にする。正確な位置での統合の可能性を上昇するために、上記統合エレメントは、好ましくは、充分な数の核酸（例えば、１００塩基対〜１０，０００塩基対、好ましくは、４００塩基対〜１０，０００塩基対、そして最も好ましくは、８００塩基対〜１０，０００塩基対）を含むべきであり、これらの核酸は、対応する標的配列と高度に相同性であって、相同組み換えの可能性を上昇させる。上記統合エレメントは、上記宿主細胞のゲノムにおける標的配列と同種である、任意の配列であり得る。さらに、上記統合エレメントは、非コード核酸配列であってもコード核酸配列であってもよい。一方、上記ベクターは、非相同組み換えによって上記宿主細胞のゲノム中に統合され得る。
【０１０７】
自己複製のために、上記ベクターは、そのベクターが問題となる宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌複製起点の例は、（図３のプラスミドにおいて示されるような）Ｐ１５Ａ ｏｒｉまたはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（プラスミドは、Ｐ１５Ａ ｏｒｉを有する）もしくはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を許容するｐＡＣＹＣ１８４およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０もしくはｐＡＭ．β．１の複製起点である。酵母宿主細胞における使用のための複製起点の例は、２ｍｉｃｒｏｎ複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせおよびＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。上記複製起点は、上記宿主細胞においてその複製起点の機能を温度感受性にする変異を有する複製起点であり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ、１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：１４３３を参照のこと）。
【０１０８】
本発明の核酸配列の１つより多くのコピーは、上記宿主細胞に挿入されて、その遺伝子産物の生成を増大させる。上記核酸配列のコピー数の上昇は、その配列の少なくとも１つのさらなるコピーを上記宿主細胞のゲノムに統合することによるか、またはその核酸配列とともに増幅可能選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ得、増幅可能選択マーカー遺伝子を含む場合、その選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、それにより、その核酸配列のさらなるコピーを含む細胞が、適切な選択因子の存在下でその細胞を培養することにより選択され得る。
【０１０９】
上に記載されたエレメントを連結するために使用されて、本発明の組み換え核酸構築物および発現ベクターを構築する手順は、当業者に周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【０１１０】
本発明における使用のための発現ベクターの多くは、市販される。適切な市販発現ベクターとしては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ．からのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭＴＭ発現ベクターが挙げられ、この発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位ならびにｐＢＲ３２２複製起点およびＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを含む。他の適切な発現ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ ＣＡから市販されるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら、１９８７、Ｇｅｎｅ ５７、１９３−２０１）に由来するプラスミドである。
【０１１１】
（宿主細胞）
別の局面において、本発明は、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、このポリヌクレオチドは、その宿主細胞におけるそのＫＲＥＤポリペプチドの発現のために、１つ以上の制御配列に作動可能に連結される。本発明の発現ベクターによってコードされる上記ＫＲＥＤポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当該分野において周知であり、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ登録番号 ２０１１７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＳ細胞、２９３細胞およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；および植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上に記載される宿主細胞のための適切な培養培地および培養条件は、当該分野において周知である。
【０１１２】
例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０を、本発明のポリヌクレオチド改変体を発現するための発現ベクターによって形質転換した。上記発現ベクターを、本発明のＫＲＥＤポリヌクレオチド改変体をプラスミドｐＣＫ１１０９００に作動可能に連結することによって作製し、このプラスミドｐＣＫ１１０９００は、ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に結合される。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいた。上記形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０を、クロラムフェニコールを含有する適切な培養培地下で培養し、それにより、その発現ベクターを発現した形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のみが、生存した。例えば、実施例１を参照のこと。
【０１１３】
（精製）
本発明のＫＲＥＤポリペプチドが上記ポリヌクレオチド改変体によって発現されると、そのポリペプチドを、タンパク質精製のための任意の１つ以上の周知技術（リゾチーム処理、音波破砕、濾過、塩の適用、超遠心分離、アフィニティークロマトグラフィーなどを含む）を用いて、上記細胞および／または培養培地から精製した。細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のタンパク質の溶解および高効率抽出のための適切な溶液は、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、商標名ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＢＴＭで市販される。化学的プロセスにおける適用のために、細胞溶解産物から上記ＫＲＥＤポリペプチドを充分に精製するための適切なプロセスは、本明細書中の実施例３において開示される。
【０１１４】
（スクリーニング）
増強したＫＲＥＤ活性について、上記発現ライブラリーから上記ＫＲＥＤポリペプチドのクローンをスクリーニングすることは、代表的に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋に変換されるのに伴う（吸光度または蛍光の減少を介した）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少速度をモニタリングする、標準的な生物化学的技術を用いて実施される。この反応において、上記ケトレダクターゼが、ケトン基質を対応するヒドロキシル基に立体特異的に還元するにつれて、上記ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、そのケトレダクターゼによって使い果たされる（酸化される）。単位時間あたりのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少速度は、吸光度または蛍光の減少により測定される場合、一定量の上記溶解産物（またはそれから作製された凍結乾燥粉末）における、上記ＫＲＥＤポリペプチドの相対（酵素）活性を示す。このような手順は、本明細書中の実施例４に記載されている。
【０１１５】
第１ラウンドの変異後に得られたライブラリーは、スクリーニングされて、そして最も優れたＫＲＥＤポリペプチド（配列番号７６）は、配列番号２のＣ．ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＫＲＥＤ骨格と比較して、Ｈ６７Ｑ変異およびＦ１５８Ｙ変異を有していた。次いで、配列番号７６をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７５）は、オリゴマーから再合成されて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンが最適化された。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号７７の配列を有していた。
【０１１６】
その後、第２の変異誘発技術または進化技術は、配列番号７７のコドン最適化ポリヌクレオチドに適用されて、第２のライブラリーを生成し、この第２のライブラリーは、次いで、同様の技術によってＫＲＥＤ活性についてスクリーニングされた。得られたクローンをスクリーニングすることは、補因子としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのいずれかを用いて、配列番号２の野生型ポリペプチドの１．５倍と４．３倍の間のＫＲＥＤ活性を実証する、３つのクローンの単離をもたらした。これらのクローンは、親であるＣ．ｍａｇｎｏｏｌｉａｅベースの配列番号２のＫＲＥＤ骨格と比較したそれらの変異および活性に沿って、以下の表２に列挙される。
【０１１７】
【表２】
本発明のＫＲＥＤポリヌクレオチドは、変異または進化させられてライブラリーを生成し得、このライブラリーは、スクリーニングされて、補因子（または、ＮＡＤＰＨよりはむしろＮＡＤＨ）として他の化合物を選択的に受容する能力を有する、それらの改変ＫＲＥＤポリペプチドを同定し得る。特に、Ｅ２２６Ｇ変異は、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへの補因子選択性における変化を引き起こすことが発見され（配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１１４、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１３０、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１６６、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号２０８および配列番号２１０）、Ｅ２２６Ｄ（配列番号１２８および配列番号１３８）およびＥ２２６Ｋ（配列番号２１６）についても同様であった。
【０１１８】
本発明のＫＲＥＤポリヌクレオチドは、変異または進化させられてライブラリーを生成し得、このライブラリーは、スクリーニングされて、増強した熱安定性を有するそれらの改変ＫＲＥＤポリペプチドを同定し得る。特に、置換：Ｐ１４Ａ、Ｖ１４０Ｉ、Ｖ１８４Ｉ、Ａ１９４Ｖ（配列番号９２、配列番号２７６、配列番号３３４、配列番号３４４、配列番号５０６、配列番号５２６および配列番号５４２）は、配列番号２のポリペプチドと比較して、増強した熱安定性を提供することが発見された。
【０１１９】
その後、第３ラウンドライブラリーが調製され、そして本明細書中に記載されるようにＫＲＥＤ活性についてスクリーニングされた。上記第３ラウンドライブラリー由来の４つのクローンは、上記第２ラウンドライブラリーの最も優れた候補の２倍の活性を有しており、これらは表３に列挙される。配列番号２５３を有するポリヌクレオチドは、最も期待できる候補であった。この配列番号２５３を有するポリヌクレオチドは、配列番号２のＫＲＥＤ骨格と比較して２つの変異、Ｓ４２ＮおよびＡ１９４Ｖを有し、そして補因子としてＮＡＤＰＨを用いて、配列番号２の野生型ＫＲＥＤと比較して最初のＫＲＥＤ活性の３倍の上昇を提供する、ＫＲＥＤポリペプチドを発現した。
【０１２０】
【表３】
変異プロセスおよびスクリーニングプロセスは、所望される活性、熱安定性および補因子選択性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに達するまで、必要とされるだけ多くの回数反復され得、このプロセスは、点変異の挿入を含む。
【０１２１】
図３のプラスミドｐＣＫ１１０９００からの上記ポリヌクレオチド（配列番号１２３）のより良好な発現を得るために、配列番号１２３のポリヌクレオチドは、オリゴマーを用いて再増幅されて、上記ベクターのＳｆｉＩ部位および上記ＫＲＥＤ ｍＲＮＡの５’末端においてＲＮＡヘアピンループ形成を導き得るヌクレオチドを置換した。具体的には、オリゴは、上記ｐＣＫ１１０９００ベクターの５’−ＳｆｉＩ部位を変化させ、そしてコードＫＲＥＤポリペプチドの６位の残基におけるセリンのためのＡＧＣコドンを、セリンをまたコードしたＴＣＣコドンで置換することにより、これらの潜在的なステムループ構造を阻害するように設計された。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、その形質転換され、かつ培養された宿主細胞の溶解産物におけるＫＲＥＤ活性により測定される場合、上記ＫＲＥＤポリペプチドの約３倍高い発現をもたらした。第３ラウンドライブラリーのスクリーニング後、配列番号２５３を有するポリヌクレオチドは、最も期待できる候補であった。しかし、図３のプラスミドｐＣＫ１１０９００からの上記ポリヌクレオチドのより良好な発現を得るために、上記配列番号２５３のポリヌクレオチドは、進化技術を適用することによってさらに改善され、そして上記配列番号１２３についてと同様に、ヘアピン形成ヌクレオチドが除去されたベクター中にクローニングされた。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号３０３および配列番号３４３のポリヌクレオチドを含んでいた。
【０１２２】
さらに、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な生成のために、コドンが最適化され得る。当業者は、広い範囲の生物のためのコドン選択性情報を提供する表および他の参考文献が、容易に入手可能であることを理解する。例えば、ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、編、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ｐ．２０４７〜２０６６（１９６６）を参照のこと。
【０１２３】
一般的に、ＫＲＥＤを発現する形質転換細胞のスクリーニングは、２工程プロセスである。第１に、上記細胞を物理的に分離し、次いで、どの細胞が所望の特性を保有し、そしてどの細胞が所望の特性を保有しないかを決定する。選択は、スクリーニング様式であり、この様式において、同定および物理的な分離は、選択マーカーの発現によって同時に達成され、この選択マーカーは、いくつかの遺伝的環境において、そのマーカーを発現している細胞を生存させ、他方、他の細胞は死ぬ（または逆もまた同様）。例示的なスクリーニングマーカーとしては、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質が挙げられる。選択マーカーとしては、薬物耐性遺伝子およびトキシン耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコール、アンピシリンなどに対する耐性）が挙げられる。自発的な選択は、天然の進化の過程で生じ得るかまたは生じるが、本方法においては、選択は、人間によって実施される。
【０１２４】
本明細書中で開示される方法によって作製されるＫＲＥＤポリヌクレオチドは、実施例４に記載のプロトコールに従ってスクリーニングされ、本発明の改善されたＫＲＥＤポリペプチドとして包含するために適切な、増強した活性を有するＫＲＥＤポリヌクレオチドを同定する。
【０１２５】
以下の配列は、配列番号２の野生型Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＫＲＥＤポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８にもまた、開示される）と比較した本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体の多様性を要約し、ここで、「Ｘ」として表されその後に残基番号が続く、１つ以上のアミノ酸残基は、置換されて本発明のＫＲＥＤポリペプチドを生じる：
【０１２６】
【化９】
本発明のＫＲＥＤポリペプチドについての種々の残基位置における変化の多様性は、以下の表４において、矢印の右に示され、そして配列番号２のＣ．ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＫＲＥＤポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８、ＧＩ：１１３６０５３８）に対応するアミノ酸残基は、その矢印の左に示される：
【０１２７】
【表４−１】
【０１２８】
【表４−２】
【０１２９】
【表４−３】
【実施例】
【０１３０】
（実施例１：ケトレダクターゼの発現のための発現構築物の構築）
Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅケトレダクターゼの遺伝子のアナログを、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンを最適化し、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８として開示される公知の配列に基づいて合成した。上記アナログ遺伝子を、６０マーのオリゴマーを用いて合成し、そしてｌａｃプロモーター遺伝子およびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下にある発現ベクター（図３のｐＣＫ１１０９００）中にクローン化して、プラスミドｐＫＲＥＤを作製した。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいた。いくつかのクローンは、（実施例４の方法により）活性なケトレダクターゼを発現したことが見出され、そして上記合成遺伝子を配列決定した。ＣＲ２−５と呼ばれる配列（配列番号１）を、全てのさらなる変異およびシャッフリングのための出発物質として使用した。ＣＲ２−５は、野生型Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅケトレダクターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８）と約６０％の核酸同一性を有していた。
【０１３１】
（実施例２：ＫＲＥＤの生成）
通気性振盪発酵槽において、０．５２８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、７．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、３．７ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物、０．０５ｇ／Ｌの硫酸鉄および３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸銅四水和物、０．１ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム十水和物および０．５ｇ／ＬのＥＤＴＡを含有する）を含有する１０．０Ｌの増殖培地を、３０℃の温度まで上昇させた。
【０１３２】
上記発酵槽に、ＬＢ、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む振盪フラスコにおいて増殖した、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐＣＲ２−５）の対数増殖期後期の培養物を植え付けて、６００ｎｍ（ＯＤ６００）で０．５〜２．０の初期吸光度とした。その発酵槽を、５００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで振盪し、そして空気を、１．０Ｌ／分〜１５．０Ｌ／分で発酵管に供給し、そしてその培養物のｐＨを、２０％ｖ／ｖ水酸化アンモニウムを添加することによって７．０に制御した。上記培養物が４０のＯＤ６００に達した後、その温度を２５℃まで低下させ、そして１ｍＭの最終濃度までイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加することによって、グルコースデヒドロゲナーゼの発現を誘導した。上記培養物を、さらに１５時間増殖させた。誘導後、細胞を遠心分離によって採取し、そして１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。その細胞ペーストを、その後の回復プロセスにおいて直接使用するか、または使用まで−８０℃に保存した。
【０１３３】
（実施例３：（凍結乾燥された）ケトレダクターゼ酵素調製物）
上記細胞ペーストを、細胞ペーストの湿重量の１容量に対して３倍容量の１００ｍＭ トリス／硫酸塩（ｐＨ７．２）中に懸濁し、その後、Ｓｏｒｖａｌ １２ＢＰにおいて４０分間、５０００ｇで遠心分離することによって洗浄した。上記洗浄した細胞ペーストを、２倍容量の１００ｍＭ トリス／硫酸塩（ｐＨ７．２）に懸濁した。第１のパスについて１４，０００ｐｓｉｇを用い、そして第２のパスについて８，０００ｐｓｉｇを用いた２パスのホモジナイザーに上記懸濁液を通すことによって、細胞内ＫＲＥＤを細胞から放出させた。上記溶解産物を室温まで温め、次いで、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ｐＨ７．２）の１０％ｗ／ｖ溶液をその溶解産物に添加して、０．７５％ｗ／ｖの最終ＰＥＩ濃度とし、そして３０分間攪拌した。上記処理したホモジネートを、Ｂｅｃｋｍａｎ実験用遠心分離機において、６０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上記上清をデカントし、そして容器に再懸濁して、−２０℃で凍らせ、凍結乾燥した。
【０１３４】
（実施例４：ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）酵素活性アッセイ）
細胞を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中で一晩増殖させた。その培養物を、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する新鮮なＴＢ中に１０倍希釈し、３０℃で２時間増殖させた後、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび８ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を含有する１／８容量のＴＢを添加した。その培養物（０．５ｍｌ）を、３０℃でさらに６時間増殖させた。
【０１３５】
溶解緩衝液は、１００ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍｇ／ｍｌ ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ） Ｂ）、２μｌのＤｎａｓｅ（２０００Ｕ／ｍｌ）、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含む。
【０１３６】
細胞を、遠心分離によってペレットにし、そして、室温で２時間振盪することにより、０．２５ｍｌの溶解緩衝液中に溶解する。
【０１３７】
アッセイ混合物は、１容量の１００ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ〜０．２ｍＭのＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ、６００ｍＭのグルコースおよび６００ｍＭのグルコン酸と、１容量のエチル−４−クロロ−３−ケト−ブチレート（ＥＣＫＢ）（１部）および酢酸ブチル（２部）の溶液とを、１０分間混合し、そしてその相を分離させることによって得られた水相である。上記反応を、１００ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）中に予め溶解した溶液としてケトレダクターゼ酵素を添加することによって、開始した。反応の進行を、時間の関数として、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することによるかまたは４４０ｎｍの蛍光の光放射によって追跡した。その結果を、時間に対する吸光度単位または相対蛍光単位（ＲＦＵ）（ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ）としてプロットし、そのプロットの傾き（吸光度単位／分またはＲＦＵ／分）を決定した。
【０１３８】
本発明は、特定の実施形態に対する参照とともに記載されるが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされ得、そして等価物が置換され得ることを、当業者は理解する。さらに、多くの改変が、本発明の範囲から逸脱することなく、特定の状況または特定の物質を本発明の教示に適合するようになされ得る。従って、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されることなく、添付の特許請求の範囲内にある全ての実施形態を含むことが意図される。
【０１３９】
（実施例５ ＫＲＥＤ／ＧＤＨ結合化学アッセイ）
ｐＨ電極制御自動滴定器を備える１００ｍＬの容器に、１００ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７、２５ｍＬ）中のグルコース（７．５ｇ）の溶液を注いだ。この溶液に、上記２つの酵素（１００ｍｇ ＫＲＥＤ；５０ｍｇ ＧＤＨ）およびＮＡＤＰ（６．２５ｍｇ）を注いだ。次いで、酢酸ブチル（１０ｍＬ）を注いだ。最後に、酢酸ブチル（１０ｍＬ）中の４−クロロアセト酢酸エチル（６ｇ）を、その容器に注いだ。４Ｍ ＮａＯＨを、（６．８５のｐＨを、下限値として設定した）自動滴定器によって必要に応じて滴下して、そのｐＨを常に７．０に調整した。水酸化物（ｃａｕｓｔｉｃ）が必要とされなくなった時に、その反応は完了した。その反応速度を、単位時間あたりの添加された塩基の量を測定することによるか、またはその反応混合物のサンプルをとり、そのサンプルを等しい容量の酢酸エチルで３回抽出し、そしてその合わせた有機層をガスクロマトグラフィーで分析して、単位時間あたりの（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの量を決定することによって、決定した。
【０１４０】
本発明は、特定の実施形態に対する参照とともに記載されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされ得、そして等価物が置換され得ることを、当業者は理解する。さらに、多くの改変が、その範囲から逸脱することなく、特定の状況または特定の物質を本発明の教示に適合させるようになされ得る。従って、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されることなく、添付の特許請求の範囲内にある全ての実施形態を含むことが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、酸化還元サイクルを例示する。このサイクル中、ケトレダクターゼは、還元剤ＮＡＤＰＨ存在下でβケトンを還元して、対応するβ−ヒドロキシ誘導体およびＮＡＤＰとし、そして、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）は、酸化されてグルコン酸となるグルコース存在下で、ＮＡＤＰを還元しＮＡＤＰＨに戻す。この反応で生成されるグルコン酸は、水酸化ナトリウムで中和されグルコン酸ナトリウムとなる。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｇ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｈ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図３】図３は、Ｐ１５Ａ複製起点（Ｐ１５Ａ ｏｒｉ）、ｌａｃＩ、ＣＡＰ結合部位、ｌａｃプロモーター（ｌａｃ）、Ｔ７リボソーム結合部位（Ｔ７ｇ１０ ＲＢＳ）、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｍＲ）を含む本発明の４０３６ｂｐの発現ベクター（ｐＣＫ１１０９００）である。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、酵素学の分野、特にケトレダクターゼの酵素学の分野に関する。より正確にはいえば、本発明は、増強された酵素活性を有するケトレダクターゼポリペプチド、および、改良ケトレダクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
キラルγ−置換β−ヒドロキシ酪酸エステルは、薬の合成において商業的に重要な中間体である。これらの中間体は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターの合成において光学活性中間体（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、およびロスバスタチン）として利用され得る。いくつかのγ−置換β−ヒドロキシ酪酸エステルを生成する方法が記載されている。例えば、シアン化ナトリウムとの反応前に保護基によるヒドロキシ基の保護を必要とする４−ブロモ−３−ヒドロキシブチレートから、４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸を生成する方法が報告されている（非特許文献１）。Ｉｓｂｅｌｌら（非特許文献２）は、トレオニンの一水和物カルシウム塩と臭化水素とを反応させて、トレオニンのジブロモ形態を生成し、次いでブロモヒドリンに変換することによって、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを合成する方法をさらに報告している（非特許文献２）。上記ブロモヒドリンのヒドロキシ基は、シアン化ナトリウムで反応させる前に保護される（非特許文献２）。あいにく、保護する工程および脱保護する工程を必要とする方法は、商業的に提供することが現実的ではない。
【０００３】
４−ブロモ−３−ヒドロキシ酪酸エチルを利用する最新のシアノヒドリン合成経路が、開発されている。これらの経路は、商業上実施するのに比較的費用がかかる多くの工程を必要とする。
【０００４】
（ケトレダクターゼの説明）
（ＫＲＥＤの特徴付け）
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロキラルケトン基質から光学活性アルコールを合成するのに有用である。ＫＲＥＤは、代表的には、ケトン基質を対応するアルコール産物に変換するが、ＫＲＥＤはまた、逆反応（アルコール基質が対応するケトン／アルデヒド産物に酸化される反応）を触媒し得る。ＫＲＥＤのような酵素によるケトンの還元およびアルコールの酸化は、補因子（最も一般的には、還元型ニコチンアミドアニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ））を、酸化反応のために必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子ドナーとして働き、他方で、ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、電子受容体として働く。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドレゲナーゼが（その酸化された状態および還元された状態にある）、リン酸化補因子または非リン酸化補因子のいずれかを受け取るが、両方を受け取らないことが、しばしば観察される。
【０００５】
ＫＲＥＤ酵素は、幅広い細菌および酵母の範囲において見出され得る（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；Ｌｉｅｓｅを参照のこと）。いくつかのＫＲＥＤ遺伝子およびＫＲＥＤ酵素の配列が報告されている（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４））。
【０００６】
（所望されるＫＲＥＤの特性）
生細胞における代謝は、デノボ合成および再生により還元反応のための補因子の十分な供給を保証する。したがって、生体触媒によるケトンの還元のために全細胞を使用することは、有利であり得るが、微生物は、代表的には、低い鏡像異性過剰率の少量の産物を導き得る多数のケトレダクターゼを有する。この理由から、Ｗｏｎｇらは、半精製したケトレダクターゼ酵素を研究し、そして、より質の高い産物が得られ得ることを見出した（非特許文献６）。
【０００７】
インビトロ酵素還元の間、細胞機構が存在しない場合、補因子の再生は、化学量論量のこれらの高価な分子の必要性を回避することが必要とされる。ケトンを還元するための酵素の使用は、従って、二つの酵素（ＫＲＥＤおよび補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）再生酵素）、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼなど）を必要とする。酵素は、一般的に、プロセス条件下での酵素の低い活性（例えば、非特許文献７；非特許文献８）、不十分な安定性（非特許文献９；非特許文献１０）、ならびに基質の阻害または産物の阻害に対する脆弱性（非特許文献１１；非特許文献１２）に起因して、高価であると考えられる。上述のとおり、補因子は、産業プロセスのためには高価な試薬であり、それらの使用が効果的でなければ、生物学的還元プロセスに多大なコストを加え得る。
【０００８】
これら多くの認識された経済的問題を回避するために、全微生物細胞は、しばしば、生体触媒による還元のための好ましい触媒として考えられている。なぜなら、この全微生物細胞は、代表的には、補因子および補因子再生酵素を含むからである。４−クロロアセトアセテートエステルの不斉還元については、ｂａｋｅｒ酵母で記載され（非特許文献１３；非特許文献１４）、かつ多くの他の微生物でも記載されている（特許文献１；特許文献２；および特許文献３）。しかしながら、微生物細胞を用いる高基質濃度で行われない還元は、効果的ではなく、競合反応に起因する減少した収量の問題があり、そして低い鏡像異性過剰率（「ｅ．ｅ）を与える）（特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；および特許文献９）。
【０００９】
ＫＲＥＤおよびＧＤＨをコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉのような成長の速い微生物へ導入することは、ケトンの還元についてのより活性な全細胞触媒をもたらした。Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ由来のカルボニルレダクターゼ遺伝子およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＧＤＨ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ内でクローン化され、エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートを産出させた。有意な生産性を達成するために、ＮＡＤＰ補因子は、触媒に対して十分な活性を提供するために、反応に加えられた。反応の最後には、キラル産物が抽出され、そして、一般的な手法（例えば、クロマトグラフィーおよび蒸留）によって精製される。この手法は、天然の生物を使用するプロセスについての改善であるが、ＮＡＤＰが必要な添加物であり続けるような、経済的な生産についての重要な欠点がのこり、そして、微生物細胞を含む反応混合物から産物を純粋な形態で単離するために、重要なプロセスへの投資が必要とされる。
【００１０】
酵素還元プロセスおよび全細胞還元プロセスの両方におけるこれらの記載を考慮すると、本発明の目的は、酵素の産出、それらのアミノ酸配列、ならびに、クリーンな反応プロセスでエチル−４−クロロ−３−ケトブチレートおよび他のケトンを効果的かつ経済的に還元することを促進するような配列をコードする遺伝子を記載することであった。従って、微生物の還元は、代表的には、５ｇ／Ｌ以上の細胞濃度を必要とするが、１ｇ／Ｌを下回る酵素濃度で、好ましくは、０．５ｇ／Ｌを下回る酵素濃度でこれらの反応を触媒する、新しい酵素が記載される。加えて、記載された酵素は、２０時間より短い時間で、少量の補因子しか必要としない、少なくとも１００ｇ／Ｌの基質の完全変換を触媒する。
【００１１】
上記で参照された特許および刊行物、ならびに、本明細書中の至るところで引用された全ての他の特許および刊行物は、本明細書中にその全体が参考として明確に援用される。
【特許文献１】米国特許第５，５５９，０３０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７００，６７０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９１，６８５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４１３，９２１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５５９，０３０号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７００，６７０号明細書
【特許文献７】米国特許第５，８９１，６８５号明細書
【特許文献８】米国特許第６，２１８，１５６号明細書
【特許文献９】米国特許第６，４４８，０５２号明細書
【非特許文献１】Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，Ｂ３７，３４１（１９８３）
【非特許文献２】Ｉｓｂｅｌｌら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．，７２：３０１（１９７９）
【非特許文献３】ＫｒａｕｓおよびＷａｌｄｍａｎ、Ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第１巻および第２巻、ＶＣＨ Ｗｅｉｎｈｅｉｍ １９９５
【非特許文献４】Ｆａｂｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．２０００
【非特許文献５】ＨｕｍｍｅｌおよびＫｕｌａ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９ １８４：１−１３
【非特許文献６】Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １９８５ １０７：４０２８−４０３１
【非特許文献７】ＳｕｔｈｅｒｌａｎｄおよびＷｉｌｌｉｓ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８ ６３：７７６４
【非特許文献８】Ｂｕｓｔｉｌｌｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｓｙｍ ２００２ １３：１６８１
【非特許文献９】Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０ ５６：２３７４
【非特許文献１０】Ｂｒａｄｓｈａｗら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２ ５７：１５２６
【非特許文献１１】Ｋａｔａｏｋａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７ ４８：６９９
【非特許文献１２】Ｋｉｔａら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９ ６５：５２０７
【非特許文献１３】Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３ １０５：５９２５−５９２６；
【非特許文献１４】Ｓａｎｔａｎｉｅｌｌｏ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．（Ｓ）１９８４：１３２−１３３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、種々の局面を有する。一つの局面において、本発明は、配列番号２のＫＲＥＤと比較して増強されたＫＲＥＤ活性を有するケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）ポリペプチドに関し、この増強されたＫＲＥＤ活性は、この配列番号２のＫＲＥＤ活性の好ましくは少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜約２５倍の活性である。このような活性は、ＮＡＤＰＨが酸化されて同時にケトンが対応するアルコールに還元されることに起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定される。別の局面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関し、このような活性は、ＮＡＤＰＨの吸光度またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定されるか（例えば、実施例４）、あるいは、結合アッセイにおいて生成された産物から測定される（例えば、実施例５）。このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号５０６、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５３６、および配列番号５３８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％相同である。別の局面において、本発明は、配列番号２のＫＲＥＤと比較して増加したＫＲＥＤ残存活性を有するケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）ポリペプチドに関し、５０℃にて１５〜２４時間処理した後、この増加したＫＲＥＤ活性は、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜１００倍、より代表的には１．５〜約６０倍である。このような活性は、ＮＡＤＰＨが酸化されて同時にケトンが対応するアルコールに還元されることに起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定される。なお別の局面において、本発明は、配列番号２のＫＲＥＤと比較して増加したＫＲＥＤ残存活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関し、５０℃にて１５〜２４時間処理した後、この増加したＫＲＥＤ活性は、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜１００倍、より代表的には１．５〜約６０倍である。このような活性は、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定されるか（例えば、実施例４）、あるいは、結合アッセイにおいて生成された産物から測定される（例えば、実施例５）。このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号５０６、配列番号５２０、および配列番号５２６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％相同であり、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％相同である。一つの実施形態において、本発明はまた、本明細書中に記載される、単離されかつ精製された形態のＫＲＥＤポリペプチド改変体に関する。別の実施形態において、上記単離されかつ精製されたＫＲＥＤポリペプチド改変体は、凍結乾燥形態にある。なお別に実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるＫＲＥＤポリペプチド改変体および適切なキャリア（代表的には緩衝溶液、より代表的には６．０と８．０との間のｐＨを有する緩衝溶液）を含む組成物に関する。この緩衝化ＫＲＥＤ組成物が凍結乾燥形態であることもまた、本発明の範囲内である。
【００１３】
別の局面において、本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体は、配列番号２のＣａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅのケトレダクターゼについて報告された配列とは、１個〜２０個のアミノ酸残基、代表的には１個〜１０個のアミノ酸残基、より代表的には１個〜９個のアミノ酸残基、さらにより代表的には１個〜８個のアミノ酸残基、最も代表的には１個〜７個のアミノ酸残基が異なる。別の局面において、本発明は、ＫＲＥＤポリペプチド（好ましくは、単離されかつ精製された）に関し、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜２５倍のＫＲＥＤ活性を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、Ａ２Ｖ；Ｋ３Ｅ；Ｆ５ＬまたはＦ５Ｃ；Ｎ７Ｋ；Ｅ９ＧまたはＥ９Ｋ；Ａ１２Ｖ；Ｐ１３Ｌ；Ｐ１４Ａ；Ａ１６ＧまたはＡ１６Ｖ；Ｔ１８Ａ；Ｋ１９Ｉ；Ｎ２０ＤまたはＮ２０Ｓ；Ｅ２１Ｋ；Ｓ２２ＮまたはＳ２２Ｔ；Ｑ２４ＨまたはＱ２４Ｒ；Ｖ２５Ａ；Ｎ３２ＳまたはＮ３２Ｄ；Ａ３６Ｔ；Ｓ４１Ｇ；Ｓ４２Ｎ；Ｉ４５Ｌ；Ａ４８Ｔ；Ｖ５６Ａ；Ｖ６０Ｉ；Ｙ６４Ｈ；Ｎ６５Ｋ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５ＹまたはＮ６５Ｓ；Ｓ６６ＧまたはＳ６６Ｒ；Ｈ６７ＬまたはＨ６７Ｑ；Ｄ６８ＧまたはＤ６８Ｎ；Ｇ７１Ｄ；Ｅ７４ＫまたはＥ７４Ｇ；Ｋ７８Ｒ；Ｋ７９Ｒ；Ｋ８５Ｒ；Ａ８６Ｖ；Ｎ９０Ｄ；Ｓ９３ＮまたはＳ９３Ｃ；Ｄ９５Ｎ、Ｄ９５Ｇ、Ｄ９５Ｖ、Ｄ９５ＹまたはＤ９５Ｅ；Ｋ９８Ｒ；Ｑ９９Ｌ、Ｑ９９Ｒ、またはＱ９９Ｈ；Ｔ１００Ａ；Ｉ１０１Ｖ；Ｑ１０３Ｒ；Ｉ１０５ＶまたはＩ１０５Ｔ；Ｋ１０６ＲまたはＫ１０６Ｑ；Ｈ１１０Ｙ、Ｈ１１０ＣまたはＨ１１０Ｒ；Ｖ１１４Ａ；Ａ１１６Ｇ；Ｉ１２０Ｖ；Ｋ１２４Ｒ；Ｄ１２９ＧまたはＤ１２９Ｎ；Ｄ１３１ＧまたはＤ１３１Ｖ；Ｄ１３２Ｎ；Ｋ１３４Ｍ、Ｋ１３４Ｖ、Ｋ１３４ＥまたはＫ１３４Ｒ；Ｄ１３７ＮまたはＤ１３７Ｇ；Ｑ１３８Ｌ；Ｖ１４０Ｉ；Ｄ１４３Ｎ；Ｌ１４４Ｆ；Ｋ１４５Ｒ；Ｖ１４７Ａ；Ｖ１５０Ａ；Ｈ１５３ＹまたはＨ１５３Ｑ；Ｈ１５７Ｙ；Ｆ１５８ＬまたはＦ１５８Ｙ；Ｒ１５９Ｋ；Ｅ１６０ＧまたはＥ１６０Ｖ；Ｆ１６２ＹまたはＦ１６２Ｓ；Ｅ１６３ＧまたはＥ１６３Ｋ；Ｅ１６５Ｄ、Ｅ１６５ＧまたはＥ１６５Ｋ；Ｋ１６７ＩまたはＫ１６７Ｒ；Ａ１７０Ｓ；Ｖ１７２Ｉ；Ｆ１７３Ｃ；Ｍ１７７ＶまたはＭ１７７Ｔ；Ｈ１８０Ｙ；Ｖ１８４Ｉ；Ｔ１９０Ａ；Ａ１９３Ｖ；Ａ１９４Ｖ；Ｆ２０１Ｌ；Ｋ２０３Ｒ；Ｆ２０９Ｙ；Ｖ２１８Ｉ；Ｎ２２４Ｓ；Ｅ２２６Ｋ、Ｅ２２６ＧまたはＥ２２６Ｄ；Ｓ２２８Ｔ；Ｄ２２９Ａ；Ｖ２３１ＩまたはＶ２３１Ａ；Ｑ２２３ＫまたはＱ２２３Ｒ；Ｅ２３４ＧまたはＥ２３４Ｄ；Ｔ２３５ＫまたはＴ２３５Ａ；Ｎ２３７Ｙ；Ｋ２３８ＲまたはＫ２３８Ｅ；Ｔ２５１Ａ；Ｖ２５５Ａ；Ｆ２６０Ｌ；Ａ２６２Ｖ；Ｔ２７２Ａ；Ｉ２７４Ｌ；Ｉ２７５ＬまたはＩ２７５Ｖ；およびＰ２８３Ｒのうちの１〜２０個の残基の変化、好ましくは１〜７個の残基の変化を有する配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
上記実施形態の好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの１．５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００１５】
【化１】
を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＥＲＤポリペプチドに関する。
【００１６】
本出願において、ＫＲＥＤポリペプチドのすべての配列番号には、偶数がつけられ、ポリヌクレオチドのすべての配列番号には、奇数がつけられている。さらに、特定の配列番号（偶数）の各ポリペプチドは、直前の配列番号（奇数）のポリヌクレオチドによってコードされる。従って、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされる。
【００１７】
さらに好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドよりも５〜約２５倍高いケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００１８】
【化２】
を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００１９】
なおさらに好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドよりも９〜約２５倍高いケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００２０】
【化３】
を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００２１】
最も好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドよりも１３〜約２５倍高いケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００２２】
【化４】
を有することによって配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドよりも１．５〜約２５倍高いケトレダクターゼ活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、
（ａ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列（以下「相同ポリペプチド」）を有するか；
（ｂ）（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるか（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照のこと）；
（ｃ）１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のポリペプチド改変体であるか；
（ｄ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のポリペプチドからの少なくとも２２０アミノ酸残基のフラグメントであるか；あるいは、
（ｅ）５０℃にてｐＨ７で６０分間インキュベーションした後に、最初のＫＲＥＤ活性の６０％より多くを保持する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドであるか；
のいずれかである、ＫＲＥＤポリペプチドである。
【００２４】
本発明の新規ＫＲＥＤポリペプチドはまた、野生型ケトレダクターゼ（配列番号２）よりも熱安定性を高められている。熱安定性は、細胞溶解産物を５０℃にて２０〜２４時間熱処置（本明細書中以下で、熱処置）した後に残存する、初期の（未処置）ＫＲＥＤ活性（例えば、実施例４）の百分率で決定された。比較によると、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチド骨格（ＣＲ２−５）は、熱処理後、その初期のＫＲＥＤ活性の１０％が維持された。従って、熱処置後、その処理前の活性を２０％超えたＫＲＥＤ活性を示したＫＲＥＤポリペプチドはいずれも、熱安定性が高められたと考えられた。好ましくは、本発明のＫＲＥＤポリペプチドの熱処理後に残存するＫＲＥＤ活性は、少なくとも５０％の活性（すなわち、処理前の活性の少なくとも５０％）、そして最も好ましくは少なくとも１００％の活性（熱処理前後の活性が等しい）であった。（配列番号２）の野生型ＫＲＥＤポリペプチドであるＣＲ２−５におけるＫＲＥＤ活性と比較した本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体についての「活性」を、表１に列挙している。種々のＫＲＥＤポリペプチドの各々の細胞溶解産物を５０℃にて２０〜２４時間熱処理した後の、本発明の種々のＫＲＥＤポリペプチドについての熱安定性もまた、表１に列挙している。
【００２５】
従って、高められた熱安定性と高められたＫＲＥＤ活性との組合せに基づくと、本発明の好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号９２、配列番号９８、配列番号２６４、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７６、配列番号２８８、配列番号２９４、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３１０、配列番号３１８、配列番号３２４、配列番号３２８、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３４４、配列番号５０６、配列番号５２６、または配列番号５４２を有する。また、配列番号９２、配列番号９８、配列番号２６４、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７６、配列番号２８８、配列番号２９４、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３１０、配列番号３１８、配列番号３２４、配列番号３２８、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３４４、配列番号５０６、配列番号５２６、または配列番号５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、配列番号９１、配列番号９７、配列番号２６３、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７５、配列番号２８７、配列番号２９３、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０９、配列番号３１７、配列番号３２３、配列番号３２７、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号５０５、配列番号５２５、または配列番号５４１のポリヌクレオチド、または、それらのコドンを最適化したバージョン）も本発明の範囲内である。
【００２６】
増強されたＫＲＥＤ活性に基づいた別の実施形態において、本発明の好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１５１％を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４４、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列を有する。本発明のさらに好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも５００％を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列を有する。同様に、本発明はまた、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のポリヌクレオチド）に関する。
【００２７】
高められたＫＲＥＤ活性および／または高められた熱安定性をもたらすように置換されている、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチド（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｓｅ供給源）の種々の残基位置は、本明細書中の表４に要約される。高められたＫＲＥＤ活性および／または５０℃における熱安定性が実証されている、多数の発明性のあるＫＲＥＤポリペプチドについてのアミノ酸配列は、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１２４、配列番号２０６、配列番号２２４、配列番号２２６、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２として本明細書中に開示される。
【００２８】
第二の局面において、本発明は、上述の発明性のあるＫＲＥＤポリペプチドのうちの一つをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、それぞれ、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１２３、配列番号２０５、配列番号２２３、配列番号２２５、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３２１、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３４３、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３５、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４１、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のポリヌクレオチド）のいずれにも関する。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のポリヌクレオチドに関し、それぞれが、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０または配列番号５４２の新規性のあるＫＲＥＤポリペプチドをコードする。
【００３０】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、または配列番号５２５のポリヌクレオチドに関し、それぞれが、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、または配列番号５２６のＫＲＥＤポリペプチドをコードする。
【００３１】
なおさらに好ましい実施形態において、本発明は、配列番号５０５、配列番号５１９、配列番号５２５、配列番号５３５、および配列番号５３７のポリヌクレオチドに関し、それぞれが、配列番号５０６、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５３６、および配列番号５３８のＫＲＥＤポリペプチドをコードする。
【００３２】
第三の局面において、本発明は、核酸構築物、ベクター、または、プロモーターに作動可能に連結した本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関する。
【００３３】
第四の局面において、本発明は、
（ａ）ポリペプチドの産生のために適切な条件下で、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物を含む宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）そのポリペプチドを回収する工程
を包含する、本発明のＫＲＥＤポリペプチドを作製する方法に関する。
【００３４】
前述の要旨、および本発明の特定の実施形態の以下の詳細な説明は、添付された図面とともに読む場合、より一層理解される。本発明を図示する目的で、図面中に、特定の実施形態が示される。しかしながら、添付された図面中に示された配置および手段は、本発明を限定するものでないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に用いられる場合、用語「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、ケトンの還元を触媒する能力を有するポリペプチドについて本明細書中で援用するために互換可能に用いられる。好ましくは、β−ケト酸中のケトンが、還元剤として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を利用して、立体特異的様式で、対応するβ−ヒドロキシ酸になる。
【００３６】
本発明は、多様な局面を有する。一つの局面において、本発明は、配列番号２のＫＲＥＤと比較して増強されたＫＲＥＤ活性を有するケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）ポリペプチドに関し、このポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の好ましくは少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜約２５倍の活性を有する。このような活性は、ＮＡＤＰＨが酸化されて同時にケトンが対応するアルコールに還元されることに起因する、ＮＡＤＰＨの吸光度の減少またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定される。別の局面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドの１．５倍、代表的には１．５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関し、このような活性は、ＮＡＤＰＨの吸光度またはＮＡＤＰＨの蛍光の減少から測定されるか（例えば、実施例４）、あるいは、結合アッセイにおいて生成された産物から測定される（例えば、実施例５）。このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号５０６、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５３６、および配列番号５３８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％相同である。
【００３７】
一つの実施形態において、本発明はまた、本明細書中のどこかに記載される、単離されかつ精製された形態のＫＲＥＤポリペプチド改変体に関する。別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載された凍結乾燥形態のＫＲＥＤポリペプチド改変体に関する。なお別に実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるＫＲＥＤポリペプチド改変体および適切なキャリア（代表的には緩衝溶液、より代表的には６．０と８．０との間のｐＨを有する緩衝溶液）を含む組成物に関する。
【００３８】
別の局面において、本発明は、ＫＲＥＤポリペプチド（好ましくは、単離されかつ精製された）に関し、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍、代表的には１．５〜５０倍、より代表的には１．５〜２５倍のＫＲＥＤ活性を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、Ａ２Ｖ；Ｋ３Ｅ；Ｆ５ＬまたはＦ５Ｃ；Ｎ７Ｋ；Ｅ９ＧまたはＥ９Ｋ；Ａ１２Ｖ；Ｐ１３Ｌ；Ｐ１４Ａ；Ａ１６ＧまたはＡ１６Ｖ；Ｔ１８Ａ；Ｋ１９Ｉ；Ｎ２０ＤまたはＮ２０Ｓ；Ｅ２１Ｋ；Ｓ２２ＮまたはＳ２２Ｔ；Ｑ２４ＨまたはＱ２４Ｒ；Ｖ２５Ａ；Ｎ３２ＳまたはＮ３２Ｄ；Ａ３６Ｔ；Ｓ４１Ｇ；Ｓ４２Ｎ；Ｉ４５Ｌ；Ａ４８Ｔ；Ｖ５６Ａ；Ｖ６０Ｉ；Ｙ６４Ｈ；Ｎ６５Ｋ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５ＹまたはＮ６５Ｓ；Ｓ６６ＧまたはＳ６６Ｒ；Ｈ６７ＬまたはＨ６７Ｑ；Ｄ６８ＧまたはＤ６８Ｎ；Ｇ７１Ｄ；Ｅ７４ＫまたはＥ７４Ｇ；Ｋ７８Ｒ；Ｋ７９Ｒ；Ｋ８５Ｒ；Ａ８６Ｖ；Ｎ９０Ｄ；Ｓ９３ＮまたはＳ９３Ｃ；Ｄ９５Ｎ、Ｄ９５Ｇ、Ｄ９５Ｖ、Ｄ９５ＹまたはＤ９５Ｅ；Ｋ９８Ｒ；Ｑ９９Ｌ、Ｑ９９Ｒ、またはＱ９９Ｈ；Ｔ１００Ａ；Ｉ１０１Ｖ；Ｑ１０３Ｒ；Ｉ１０５ＶまたはＩ１０５Ｔ；Ｋ１０６ＲまたはＫ１０６Ｑ；Ｈ１１０Ｙ、Ｈ１１０ＣまたはＨ１１０Ｒ；Ｖ１１４Ａ；Ａ１１６Ｇ；Ｉ１２０Ｖ；Ｋ１２４Ｒ；Ｄ１２９ＧまたはＤ１２９Ｎ；Ｄ１３１ＧまたはＤ１３１Ｖ；Ｄ１３２Ｎ；Ｋ１３４Ｍ、Ｋ１３４Ｖ、Ｋ１３４ＥまたはＫ１３４Ｒ；Ｄ１３７ＮまたはＤ１３７Ｇ；Ｑ１３８Ｌ；Ｖ１４０Ｉ；Ｄ１４３Ｎ；Ｌ１４４Ｆ；Ｋ１４５Ｒ；Ｖ１４７Ａ；Ｖ１５０Ａ；Ｈ１５３ＹまたはＨ１５３Ｑ；Ｈ１５７Ｙ；Ｆ１５８ＬまたはＦ１５８Ｙ；Ｒ１５９Ｋ；Ｅ１６０ＧまたはＥ１６０Ｖ；Ｆ１６２ＹまたはＦ１６２Ｓ；Ｅ１６３ＧまたはＥ１６３Ｋ；Ｅ１６５Ｄ、Ｅ１６５ＧまたはＥ１６５Ｋ；Ｋ１６７ＩまたはＫ１６７Ｒ；Ａ１７０Ｓ；Ｖ１７２Ｉ；Ｆ１７３Ｃ；Ｍ１７７ＶまたはＭ１７７Ｔ；Ｈ１８０Ｙ；Ｖ１８４Ｉ；Ｔ１９０Ａ；Ａ１９３Ｖ；Ａ１９４Ｖ；Ｆ２０１Ｌ；Ｋ２０３Ｒ；Ｆ２０９Ｙ；Ｖ２１８Ｉ；Ｎ２２４Ｓ；Ｅ２２６Ｋ、Ｅ２２６ＧまたはＥ２２６Ｄ；Ｓ２２８Ｔ；Ｄ２２９Ａ；Ｖ２３１ＩまたはＶ２３１Ａ；Ｑ２２３ＫまたはＱ２２３Ｒ；Ｅ２３４ＧまたはＥ２３４Ｄ；Ｔ２３５ＫまたはＴ２３５Ａ；Ｎ２３７Ｙ；Ｋ２３８ＲまたはＫ２３８Ｅ；Ｔ２５１Ａ；Ｖ２５５Ａ；Ｆ２６０Ｌ；Ａ２６２Ｖ；Ｔ２７２Ａ；Ｉ２７４Ｌ；Ｉ２７５ＬまたはＩ２７５Ｖ；およびＰ２８３Ｒのうちの１〜２０個の残基の変化、好ましくは１〜７個の残基の変化を有する配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
別に指定がなければ、用語「同一性パーセント」、「同一性％」、「同一性パーセント」および「同一性％」は、アミノ酸配列同一性％について本明細書中で援用するために互換可能に用いられ得る。このアミノ酸配列同一性％は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ ｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍを用いて決定される。すなわち、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ（導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックス；同一性％＝部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割った、第一配列と第二配列との間の同一残基の数のための動的計画法アルゴリズム）を用いて決定された。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【００４０】
使用にあたって、本発明の増強されたＫＲＥＤポリペプチドは、好ましくは、ＫＲＥＤポリペプチドのための補因子の継続的な供給源を提供する補因子再生系と共役される。図１を参照のこと。本明細書中で用いられる「補因子」とは、目的の反応を触媒するよう酵素と相乗的に作用する非タンパク化合物をいう。例えば、補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、酵素（例えば、本発明のＫＲＥＤポリペプチド）とともに利用され、そして、３−ケト−酪酸エステル／アミドの立体特異的還元を触媒し、それらの対応する３−ヒドロキシ酪酸エステル／アミドとし、かつ、α−ハロケトンをそれらの対応するハロヒドリンとし、そして補因子再生系（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ／グルコース）とともに利用される。
【００４１】
用語「補因子再生系」とは、本明細書中において、利用された補因子をその反応前の状態へ戻すよう再生する反応に関与する一連の反応物をいう。ある一つの例は、酸化された補因子ＮＡＤまたはＮＡＤＰを補因子の還元された形態（例えば、それぞれ、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ）に戻す再生である。次いで還元された（再生された）補因子は、還元された基質および酸化された（利用された）補因子を立体特異的に生成するために、基質および酵素（例えば、ケトレダクターゼ）と再度反応できることが再度可能になる。後者は、補因子再生系によって再生される。適切な補因子再生系としては、グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼとギ酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとグルコース−６−リン酸、第二級アルコールデヒドロゲナーゼとイソプロピルアルコールなどが挙げられ、これらすべては、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ／ＮＡＤＨのいずれかとともに用いられる。従って、例えば、４−ハロ−３−ケト−酪酸エステルまたは４−ハロ−３−ケト−酪酸アミドは、所望のヒドロキシ化合物およびＮＡＤＰ（またはＮＡＤ）を生成するために、本発明のＫＲＥＤポリペプチドおよびＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）により還元される場合、生じたＮＡＤＰ（またはＮＡＤ）は、グルコースおよび補因子再生系として作用するグルコースデヒドロゲナーゼの触媒量によって、還元されて（再生されて）その元の形態（ＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ））に戻る。グルコース脱水素補因子再生系の上述の作用は、図１中に例示される。
【００４２】
本明細書中で用いられる用語「共役した」は、ケトレダクターゼ基質の還元における補因子の還元型形態の使用のことをいう。そして、この用語は、同じ補因子の還元型形態を産出する補因子再生系の構成成分（例えば、グルコース）の酸化において、上述の反応で産出した同じ補因子の酸化型を同時に使用することをいう。したがって、図１中では、ケトレダクターゼ酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ補因子再生系と共役されるように示される。
【００４３】
上述の実施形態の好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの１．５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００４４】
【化５】
を有することにより配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００４５】
さらに好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの５〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００４６】
【化６】
を有することにより配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００４７】
なおさらに好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの９〜約２５倍のケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００４８】
【化７】
を有することにより配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００４９】
最も好ましい局面において、本発明は、溶解産物として測定された場合に配列番号２のポリペプチドの１３〜約２５倍のケトレダクターゼ活性を有するが、以下のアミノ酸置換セットのうちの一つを有することおよび対応する配列番号
【００５０】
【化８】
を有することにより配列番号２のポリペプチドとは異なる、ＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００５１】
本発明のＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＣ．ｍａｇｎｏｌｉａｅに由来するＫＲＥＤポリペプチド骨格のＫＲＥＤ活性よりも、１．５倍〜約２５倍高い増強されたＫＲＥＤ活性（例えば、実施例４の方法によって測定される）を有する。そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２とは、１個〜２０個のアミノ酸残基、代表的には、１個〜１０個のアミノ酸残基、より代表的には、１個〜９個のアミノ酸残基、さらにより代表的には、１個〜８個のアミノ酸残基、最も代表的には、１個〜７個のアミノ酸残基異なる。好ましくは、本発明のＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチド骨格のＫＲＥＤ活性よりも、９倍〜約２５倍高い、より好ましくは、１３倍〜約２５倍高い増強されたＫＲＥＤ活性を有する。
【００５２】
別の局面において、本発明は、配列番号２のポリペプチドの１．５〜約２５倍のケトレダクターゼ活性を有する配列番号２のＫＲＥＤポリペプチドに関し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、
（ａ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の相同性、好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９７％、そして、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列（以下「相同ポリペプチド」）を有するか；
（ｂ）（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖
のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるか（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照のこと）；
（ｃ）１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０または配列番号５４２のポリペプチドの改変体であるか；
（ｄ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のポリペプチドからの少なくとも２２０アミノ酸残基のフラグメントであるか；あるいは、
（ｅ）５０℃にてｐＨ７で６０分間インキュベーションした後に、最初のＫＲＥＤ活性の６０％より多くを保持する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドであるか；
のいずれかである。
【００５３】
本発明の新規ＫＲＥＤポリペプチドはまた、野生型ケトレダクターゼ（配列番号２）よりも熱安定性を高められている。熱安定性は、細胞溶解産物をｐＨ７で５０℃にて２０時間〜２４時間熱処置（本明細書中以下で、熱処置）した後に残存する、初期の（未処置）ＫＲＥＤ活性の百分率（例えば、実施例４）で決定された。比較によると、配列番号２の野生型ＫＲＥＤポリペプチド（ＣＲ２−５）は、熱処理後、その初期のＫＲＥＤ活性の１０％が維持された。従って、熱処置後、その処理前の活性の２０％を超えたＫＲＥＤ活性を示したＫＲＥＤポリペプチドはいずれも、熱安定性が高められたと考えられた。好ましくは、本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体の熱処理後のＫＲＥＤ活性は、少なくとも５０％の残存活性、そして最も好ましくは１００％の活性（熱処理前後の活性が等しい）であった。（配列番号２）の野生型ＫＲＥＤポリペプチドであるＣＲ２−５におけるＫＲＥＤ活性と比較した本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体についての「活性％」を、表１に列挙している。種々のＫＲＥＤポリペプチドの各々の細胞溶解産物を５０℃にて２０時間〜２４時間熱処理した後の、本発明の種々のＫＲＥＤポリペプチドについての熱安定性もまた、表１に列挙している。
【００５４】
【表１】
従って、増強された熱安定性および増強されたＫＲＥＤ活性の組合せに基づき、本発明の好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号３４４、配列番号４４０、配列番号５０６、配列番号５２６、または配列番号５４２を有する。配列番号３４４、配列番号４４０、配列番号５０６、配列番号５２６、または配列番号５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、それぞれ配列番号３４３、配列番号４３９、配列番号５０５、配列番号５２５、または配列番号５４１、あるいは、それらのコドン最適化バージョン）もまた本発明の範囲内である。
【００５５】
増強されたＫＲＥＤ活性に基づいた別の実施形態において、本発明の好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１５１％を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４４、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列を有する。本発明のさらに好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも５００％を有し、そして、このＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のアミノ酸配列を有する。同様に、本発明はまた、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のポリヌクレオチド）に関する。
【００５６】
本発明のさらに好ましいＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも９００％を有し、そして、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３６、配列番号５３８、または配列番号５４０のアミノ酸配列を有する。
【００５７】
なおさらに好ましい本発明のＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のＫＲＥＤ活性の少なくとも１３００％を有し、そして、配列番号５３６、配列番号５３８を有する。代表的には、本発明の上述のＫＲＥＤポリペプチドは、溶解産物として測定された場合、配列番号２のＫＲＥＤポリペプチドよりも２５００％より少ないＫＲＥＤ活性を有する。上述で参照されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた好ましく、そして、このポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドがコードするポリペプチドよりもそれぞれ一つ前の整数値である配列番号を有する。
【００５８】
なお別の局面において、本発明は、共役化学反応において増強された活性を有するＫＲＥＤポリペプチドに関する。
【００５９】
別の実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖
のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるＫＲＥＤポリペプチドに関する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。
【００６０】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドについて、低程度から最高程度までのストリンジェンシー条件が、以下のように定義され、その後、標準的なサザンブロット手順を実施する：（低程度のストリンジェンシーでは２５％のホルムアミド、中程度および準高程度のストリンジェンシーでは３５％のホルムアミド、または高程度および最高程度のストリンジェンシーでは５０％のホルムアミドのうちのいずれかで、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、切断かつ変性されたサケ精子ＤＮＡ２００μｇ／ｍｌ中において、４２℃でプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション）。長さが少なくとも１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドについて、キャリア物質は、最終的に、少なくとも５０℃で（低程度のストリンジェンシー）、少なくとも５５℃で（中程度のストリンジェンシー）、少なくとも６０℃で（準高程度のストリンジェンシー）、少なくとも６５℃で（高程度のストリンジェンシー）、少なくとも７０℃で（最高程度のストリンジェンシー）で、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いてそれぞれ１５分間、三回洗浄される。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、または配列番号５４２のポリペプチド改変体に関する。このポリペプチド改変体は、配列番号２の野生型ＫＲＥＤのＫＲＥＤ活性の１．５倍〜２５倍を有する（例えば、実施例４の方法によって決定される）。好ましくは、アミノ酸の変化は軽度のものであり、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／または活性に有意な影響を与えない保存的なアミノ酸置換である。この保存的なアミノ酸置換は、わずかな欠失（代表的には１〜６個のアミノ酸）、わずかなアミノ末端伸長もしくはわずかなカルボキシル末端伸長、小さなリンカーペプチド、あるいは、正味電荷または別の機能（例えば、ポリ−ヒスチジン路、抗原のエピトープもしくは結合領域）の変化によって、精製が促進するわずかな伸長である。
【００６２】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（レクチン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、ならびに、低分子アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、およびメチオニン）の群のうちである。一般的に当該分野で公知である特定の活性を変化させないアミノ酸置換が、（例えば、Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈおよびＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ、１９７９，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．に記載される最も一般的に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙ、ならびに、これらの逆の交換である。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２の野生型ＫＲＥＤのＫＲＥＤ活性の１．５〜約２５倍を有する上述の（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のフラグメントに関し、これらは、実施例４の方法によって決定された。「フラグメント」という用語は、カルボキシ末端、アミノ末端、またはその両方からの１〜１０個のアミノ酸残基の欠失を有するポリペプチドを意味する。好ましくは、この欠失は、カルボキシ末端からの１〜１０個の残基の欠失であり、より好ましくは、この欠失は、カルボキシ末端からの１〜５個の残基の欠失である。
【００６４】
なお別の実施形態において、本発明は、上記の「詳細な説明」において記載されるような（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＫＲＥＤポリペプチドに関する。このＫＲＥＤポリペプチドは、５０℃、ｐＨ７で２０時間〜２４時間インキュベーション後、最初の（インキュベーション前の）ＫＲＥＤ活性を２０％より高く維持する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、その最初の活性の少なくとも２０％を維持し、より好ましくは、５０℃、ｐＨ７で２０時間〜２４時間インキュベーション後、最初の活性の少なくとも５０％を維持する。熱処理前および熱処理後の溶解産物（実施例３において調製されるような溶解産物）に関する最初のＫＲＥＤ活性および残存ＫＲＥＤ活性は、ＫＲＥＤ活性アッセイ（例えば、本明細書中の実施例４において記載されるようなアッセイ）によって容易に決定される。
【００６５】
（ポリヌクレオチド）
その第２の局面において、本発明は、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に関する。遺伝子コードの縮重を考慮すれば、本発明はまた、配列番号４２、配列番号７２、配列番号７６、配列番号９６、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４４、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０または配列番号５４２のＫＲＥＤポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドに関する。
【００６６】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号４１、配列番号７１、配列番号７５、配列番号９５、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７１、配列番号２７３、配列番号２７５、配列番号２７７、配列番号２７９、配列番号２８１、配列番号２８３、配列番号２８５、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９１、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号２９７、配列番号２９９、配列番号３０１、配列番号３０３、配列番号３０５、配列番号３０７、配列番号３０９、配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１５、配列番号３１７、配列番号３１９、配列番号３２１、配列番号３２３、配列番号３２５、配列番号３２７、配列番号３２９、配列番号３４３、配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３５、配列番号３３７、配列番号３３９、配列番号３４１、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９または配列番号５４１のポリヌクレオチドに関し、これらのポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４２、配列番号７２、配列番号７６、配列番号９６、配列番号２６２、配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号２６８、配列番号２７０、配列番号２７２、配列番号２７４、配列番号２７６、配列番号２７８、配列番号２８０、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８６、配列番号２８８、配列番号２９０、配列番号２９２、配列番号２９４、配列番号２９６、配列番号２９８、配列番号３００、配列番号３０２、配列番号３０４、配列番号３０６、配列番号３０８、配列番号３１０、配列番号３１２、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１８、配列番号３２０、配列番号３２２、配列番号３２４、配列番号３２６、配列番号３２８、配列番号３３０、配列番号３４４、配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３６、配列番号３３８、配列番号３４０、配列番号３４２、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号３９８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０または配列番号５４２の新規ＫＲＥＤポリペプチドをコードする。
【００６７】
特に好ましい実施形態において、本発明は、配列番号２５４のポリペプチドをコードする配列番号２５３のポリヌクレオチドならびに配列番号３０３および配列番号３４３のコドン最適化ポリヌクレオチドに関し、これらの最適化ポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける配列番号２５４のポリペプチドの増強された発現を提供する非表現突然変異を含む。特に、配列番号２５３から配列番号３４３へと移るコドン最適化は、以下の非表現置換からなっていた：Ａ１６Ｔ、Ｇ１７Ｃ、Ｃ３０Ｔ、Ｔ３３９Ａ、Ｃ６００Ｔ、Ｔ７３８ＣおよびＴ７４４Ｃ。これらの非表現置換は、上記細胞溶解産物から（例えば、実施例３）そのＫＲＥＤ活性によって測定される場合（例えば、実施例４）の、上記ＫＲＥＤポリペプチドの発現の２．５倍の増強をもたらした。
【００６８】
本発明の改善されたＫＲＥＤポリヌクレオチドおよび改善されたＫＲＥＤポリペプチドを作製するには、骨格として使用するためにＫＲＥＤポリペプチドをコードする１つ以上の野生型ポリヌクレオチドを用いて開始する。ポリヌクレオチドに対して適用される場合、用語「野生型」とは、その核酸フラグメントが天然から単離された形態からのいずれの変異も含まないことを意味する。ポリペプチド（またはタンパク質）に対して適用される場合、上記用語「野生型」とは、そのタンパク質が天然に見られる活性レベルで活性であることを意味し、代表的には、天然に見られるアミノ酸配列を含む。従って、上記用語「野生型」または「親配列」は、本発明の操作前の開始配列または参照配列を示す。
【００６９】
改善されるべき出発物質としての天然に生じるＫＲＥＤの適切な供給源は、本明細書中に記載されるＫＲＥＤ活性に対して生物のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、容易に同定される。例えば、実施例４を参照のこと。天然に生じるＫＲＥＤ酵素は、広範囲の細菌および酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｓａｌｍｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＡＦ１６０７９９；ＧＩ ６５３９７３４））において見られる。ＫＲＥＤの特に適切な供給源は、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅである。本発明において、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅの野生型ＫＲＥＤポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８として公開されているＣａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅ由来のＫＲＥＤに対する公知のポリペプチド配列に基づいて、６０マーのオリゴマーから構築された。上記親ポリヌクレオチド配列は、ＣＲ２−５（配列番号１）と呼ばれ、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化されたコドンであり、従って、上記野生型ポリヌクレオチド配列とは実質的に異なっていた。上記コドン最適化ポリヌクレオチドは、ｌａｃプロモーター遺伝子およびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下にある上記発現ベクターｐＣＫ１１０９００（図３に示される）のＳｆｉＩクローニング部位にクローニングされた。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んだ。いくつかのクロ−ンは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０において活性なケトレダクターゼを発現することが見出され、そしてその遺伝子は、配列決定されてそれらのＤＮＡ配列が確かめられた。ＣＲ２−５と呼ばれる配列（配列番号１）は、全ての実験およびライブラリー構築のための開始点として利用される親配列であった。
【００７０】
一旦、適切な出発物質（例えば、配列番号１のポリヌクレオチド）が同定されると、未知のＫＲＥＤ活性を有する、天然に生じずかつ変異および／または進化された酵素は、周知の変異誘発または直接的な進化的方法のうちのいずれか１つを用いて、容易に生成される。例えば、Ｌｉｎｇら、「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７−７８（１９９７）；Ｄａｌｅら、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５７：３６９−７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ、「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３７：１−７（１９８６）；Ｋｒａｍｅｒら、「Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ」、Ｃｅｌｌ、３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｗｅｌｌｓら、「Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｎｏｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ」、Ｇｅｎｅ、３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：２８４−２９０（１９９９）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ＡＺＴ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７：２５９−２６４（１９９９）；Ｃｒａｍｅｒｉら、「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｔｅ、３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｓｅｎａｔｅ ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：４３６−４３８（１９９７）；Ｚｈａｎｇら、「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｒｕｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３１５−３１９（１９９６）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、「Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９−３９１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；ＷＯ ９５／２２６２５；ＷＯ ９７／００７８；ＷＯ ９７／３５９６６；ＷＯ ９８／２７２３０；ＷＯ ００／４２６５１；ＷＯ ０１／７５７６７および２００３年３月２５日にＡｒｎｏｌｄらに対して発行され、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｒｅａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と題された米国特許第６，５３７，７４６号を参照のこと。
【００７１】
これらの方法のいずれもが、ＫＲＥＤポリヌクレオチドを生成するために適用され得る。多様性を最大にするために、上に記載される技術のうちのいくつかは、連続的に使用され得る。代表的には、シャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）されたポリヌクレオチドのライブラリーは、１つの変異誘発技術もしくは発展的技術によって作製され、そしてそれらの発現産物は、最も高いＫＲＥＤ活性を有するポリペプチドを見つけるためにスクリーニングされる。本発明において、配列番号７５を有するポリヌクレオチドは、補因子としてＮＡＤＨを用いたスクリーニングされたライブラリー由来の最も期待できる候補であった。しかし、上記ポリペプチドの図３のプラスミドｐＣＫ１１０９００からのより良好な発現を得るために、配列番号７５のポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化されたコドンであるオリゴマーを用いて再合成された。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号７７の配列を有していた。
【００７２】
それ以降、第２の変異誘発技術または進化的技術は、第２のライブラリーを作製するために配列番号７７のコドン最適化ポリヌクレオチドに対して適用され、この第２のライブラリーは、次いで、同じ技術によってＫＲＥＤ活性に対してスクリーニングされた。得られたクローンをスクリーニングすることは、３つのクローン、配列番号１２３、配列番号２０３および配列番号２２３の単離をもたらし、これらのクローンは、それぞれ、配列番号１２４、配列番号２０４および配列番号２２４のＫＲＥＤポリペプチドをコードし、ＮＡＤＨ（配列番号１２４）またはＮＡＤＰＨ（配列番号２０４および配列番号２２４）を補因子として使用すると、配列番号２の野生型ポリペプチドの３．１倍と４．３倍との間のＫＲＥＤ活性を有する。変異させ、そしてスクリーニングするプロセスは、所望される活性、熱安定性および補因子選択性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに達するまで、必要とされるだけ多くの回数反復され得、このプロセスは、点変異の挿入を含む。
【００７３】
図３のプラスミドｐＣＫ１１０９００からの配列番号１２３のポリヌクレオチドのより良好な発現を得るために、配列番号１２３のポリペプチドは、上記ベクターのＳｆｉＩ部位および上記ＫＲＥＤ ｍＲＮＡの５’末端でＲＮＡヘアピンループ形成を導き得るヌクレオチドを置換するために、オリゴマーを用いて再増幅された。具体的には、オリゴは、上記ｐＣＫ１１０９００ベクターの５’−ＳｆｉＩ部位を変化させ、そしてコードＫＲＥＤポリペプチドの６位の残基におけるセリンのためのＡＧＣコドンを、セリンをまたコードしたＴＣＣコドンで置換することにより、これらの潜在的なステムループ構造を阻害するように設計された。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、その形質転換および培養された宿主細胞の溶解産物におけるＫＲＥＤ活性により測定される場合、上記ＫＲＥＤポリペプチドの約２と２分の１（２．５）倍高い発現をもたらした。
【００７４】
補因子としてＮＡＤＰＨを用いて第３ラウンドライブラリーをスクリーニングした後、配列番号２５３を有するポリヌクレオチドは、最も期待できる候補であった。しかし、図３のｐＣＫ１１０９００プラスミドからの上記ポリヌクレオチドのより良好な発現を得るために、上記配列番号２５３のポリヌクレオチドは、進化した技術を適用することによってさらに改善され、そして上記配列番号１２３についてと同様に、ヘアピン形成ヌクレオチドが除去されたベクター中で、クローニングされた。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号３０３および配列番号３４３のポリヌクレオチドを含んでいた。
【００７５】
シャッフル技術または進化した技術を適用する代わりに、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、公知の合成方法に従う標準的な固相方法によって調製され得る。代表的には、約１００塩基までのフラグメントは、独立して合成され、次いで（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション方法またはポリメラーゼ媒介性方法によって）結合されて、本質的に、任意の所望される連続配列を形成する。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、自動合成方法において代表的に実施される場合、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−６９により記載される古典的なホスホロアミダイト方法またはＭａｔｔｈｅｓら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−０５により記載される方法（例えば、自動合成法において代表的に実施されるような方法）を用いて、化学合成によって調製され得る。上記ホスホロアミダイト方法に従って、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクター中にクローニングされる。さらに、本質的に、任意の核酸は、任意の種々の市販供給源（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ、Ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡおよび他の多くの市販供給源）から特別注文され得る。
【００７６】
（核酸構築物／発現カセット／発現ベクター）
別の局面において、本発明は、核酸構築物に関し、この核酸構築物は、核酸構築物を生じるために遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列に作動可能に連結された、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、発現ベクターまたは発現カセット）を含む。その後、得られた核酸構築物（例えば、発現ベクターまたは発現カセット）は、上記ポリヌクレオチド改変体によりコードされたＫＲＥＤポリペプチドの究極的な発現のために、適切な宿主細胞に挿入された。
【００７７】
「核酸構築物」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子として本明細書中で規定され、天然に存在する遺伝子から単離されるかまたは改変されて、そうでなければ天然に存在しない様式で組み合わされ、かつ並列される核酸のセグメントを含む。上記用語、核酸構築物は、その核酸構築物が、本発明のコード配列（ポリヌクレオチド）の発現のために必要とされる全ての制御配列を含む場合、用語、発現カセットまたは発現ベクターを含む。
【００７８】
用語「コード配列」は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチド配列として、本明細書中で規定される。ゲノムコード配列の境界は、一般的に、そのｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームのすぐ上流に位置するリボソーム結合部位（原核生物）またはＡＴＧ開始コドン（真核生物）、およびそのｍＲＮＡの３’末端のオープンリーディングフレームのすぐ下流に位置する転写終結配列によって決定される。コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび組み換え核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、種々の方法で操作されて、そのポリペプチドの発現を提供し得る。上記単離されたポリヌクレオチドのそのベクターへの挿入前の操作は、その発現ベクターに依存して、所望され得るかまたは必要とされ得る。組み換えＤＮＡ法を利用してポリペプチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当該分野において周知である。
【００８０】
用語「制御配列」は、本発明のポリペプチドの発現のために必要かまたは有利な全ての構成要素を含むことが、本明細書中で規定される。各制御配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列に対してネイティブであっても外来性であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低でも、上記制御配列は、プロモーターならびに転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナルを含む。上記制御配列は、その制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特定の制限部位を導入する目的のために、リンカーが提供され得る。
【００８１】
用語「作動可能に連結された」は、制御配列が、上記ＤＮＡ配列のコード配列に対する位置に適切に位置され、それにより、その制御配列がポリペプチドを発現させる配置として、本明細書中で規定される。
【００８２】
上記制御配列は、適切なプロモーター配列であり得る。上記「プロモーター配列」は、それに続くより長いコード領域の発現のために宿主細胞によって認識される、比較的短い核酸配列である。上記プロモーター配列は、上記ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。上記プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、これらの核酸配列としては、変異プロモーター、トランケートプロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられ、そしてこれらの核酸配列は、その宿主細胞に対して相同性または異種性のいずれかの細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００８３】
細菌宿主細胞のために、本発明の核酸構築物を転写させるために適切なプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ αアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＢ遺伝子ならびに原核生物βラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）から得られるプロモーターならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ８０：２１−２５）が挙げられる。さらなるプロモーターは、「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４−９４；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出に記載されている。
【００８４】
糸状菌宿主細胞のために、本発明の核酸構築物を転写させるために適切なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ アスパラギン酸プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 天然αアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 酸安定αアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ リパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ アルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ トリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ アセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ チロシン様プロテアーゼ（ＷＯ ９６／００７８７）の遺伝子から得られるプロモーターならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 天然αアミラーゼの遺伝子由来のプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ トリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターとのハイブリッド）、ならびにそれらの変異プロモーター、トランケートプロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
【００８５】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセラーゼキナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されている。
【００８６】
上記制御配列はまた、適切な転写終結配列（宿主細胞によって認識されて転写を終結する配列）であり得る。上記終結配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的である任意のターミネーターは、本発明において使用され得る。
【００８７】
糸状菌宿主細胞のために好ましいターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ グルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ アントラニレートシンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ αグルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ チロシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００８８】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ エノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ シトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、前出に記載されている。
【００８９】
上記制御配列はまた、適切なリーダー配列（上記宿主細胞による翻訳のために重要な、ｍＲＮＡの非翻訳領域）であり得る。上記リーダー配列は、上記ペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択された宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列は、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ トリオースホスフェートイソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３−ホスホグリセラーゼキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【００９０】
上記制御配列はまた、ポリアデニル化配列（上記核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、そして転写される際に上記宿主細胞によってシグナルとして認識されて、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する配列）であり得る。選択された宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列は、本発明において使用され得る。糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ グルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ アントラニレートシンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ チロシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ αグルコシダーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ、１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：５９８３−５９９０に記載されている。
【００９１】
上記制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結され、そしてその制御配列がコードされたポリペプチドをその細胞の分泌経路に向けるアミノ酸配列をコードする、シグナルペプチドコード領域であり得る。上記核酸配列のコード配列の５’末端は、本来、シグナルペプチドコード領域を含み得、このシグナルペプチドコード領域は、翻訳リーディングフレームにおいて、その分泌ポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、天然に連結されている。あるいは、上記コード配列の５’末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含み得る。上記外来性シグナルペプチドコード領域は、そのコード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない場合に、必要とされ得る。
【００９２】
あるいは、上記外来性シグナルペプチドコード領域は、そのポリペプチドの分泌を促進するために、その天然シグナルペプチドコード領域を、単に置換し得る。しかし、その発現ポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。
【００９３】
細菌宿主細胞のために有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣ１Ｂ １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ αアミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ サブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ βラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａ、１９９３、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５７：１０９−１３７に記載されている。
【００９４】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ 中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ グルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ アスパラギン酸プロテアーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ セルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ リパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００９５】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、前出に記載されている。
【００９６】
上記制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られたポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはいくつかの場合、チモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般的に不活性であり、そしてそのプロポリペプチドからそのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換され得る。上記プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ 中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ アスパラギン酸プロテアーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ ラクターゼ（ＷＯ ９５／３３８３６）の遺伝子から得られる。
【００９７】
シグナルペプチド領域およびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてそのシグナルペプチド領域は、そのプロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
【００９８】
調節配列を付加することがまた、所望され得、この調節配列は、上記宿主細胞の増殖に対する上記ポリペプチドの発現の調節を可能にする。調節系の例は、化学的または生理的刺激に応答してスイッチを入れられるかまたはスイッチを消されるべき遺伝子の発現を引き起こす調節系であり、これらの刺激としては、調節化合物の存在が挙げられる。原核生物宿主細胞において、適切な調節配列としては、ｌａｃオペレーター系、ｔａｃオペレーター系およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞において、適切な調節系としては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌において、適切な調節配列としては、ＴＡＫＡαアミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ グルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ グルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【００９９】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にする調節配列である。真核生物系において、これらとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および重金属によって増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする核酸配列は、上記調節配列に作動可能に連結される。
【０１００】
従って、別の局面において、本発明はまた、組み換え発現ベクターに関し、この組み換え発現ベクターは、それらが導入されるべき宿主の型に依存して、（本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードする）本発明のポリヌクレオチド、および１つ以上の発現調節領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター）、複製起点などを含む。上に記載される種々の核酸配列および制御配列は、一緒に結合されて組み換え発現ベクターを生成し得、この組み換え発現ベクターは、１つ以上の都合のよい制限部位を含み得、このような部位において上記ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にし得る。あるいは、本発明の核酸配列は、上記配列を含む核酸配列または核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって、発現され得る。上記発現ベクターの作製において、上記コード配列は、そのベクター中に位置し、それにより、そのコード配列は、発現のための適切な制御配列と作動可能に連結される。
【０１０１】
上記組み換え発現ベクターは、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得、これらのベクターは、組み換えＤＮＡ手順に都合よく供され得、そして上記ポリペプチド配列の発現をもたらし得る。上記ベクターの選択は、代表的に、そのベクターと、そのベクターが導入されるべき宿主細胞との適合性に依存する。上記ベクターは、直線状でも閉じられた環状プラスミドでもよい。
【０１０２】
上記発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外存在物として存在し、その複製は、染色体の複製に依存しないベクター）（例えば、プラスミド）であっても、染色体外エレメントであっても、ミニ染色体（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）であっても、人工染色体であってもよい。上記ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、上記ベクターは、上記宿主細胞に導入されると、そのゲノムに統合され、そしてそのベクターが統合された染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、上記宿主細胞のゲノムに導入されるべきＤＮＡ全体を一緒に含む、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミド、あるいはトランスポゾンが、使用され得る。
【０１０３】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、形質転換細胞の選択を容易にする１つ以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その選択マーカーの産物が、バイオサイド耐性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養素要求株に対する原栄養菌などを提供する遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子または抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性（実施例１）またはテトラサイクリン耐性）を与えるマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。
【０１０４】
糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）ならびにそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞における使用のためには、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が好ましい。
【０１０５】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、そのベクターの上記宿主細胞のゲノムへの統合またはそのゲノムに非依存的なその細胞におけるそのベクターの自己複製を許容するエレメントを含む。上記宿主細胞ゲノムへの統合のために、上記ベクターは、相同組み換えまたは非相同組み換えによるそのベクターのゲノムへの統合のために、上記ポリプチドまたはそのベクターの任意の他のエレメントをコードする核酸配列に頼り得る。
【０１０６】
あるいは、上記発現ベクターは、相同組み換えによって上記宿主細胞のゲノムに統合させるためのさらなる核酸配列を含み得る。上記さらなる核酸配列は、上記ベクターが、染色体における正確な位置で上記宿主細胞ゲノムに統合されることを可能にする。正確な位置での統合の可能性を上昇するために、上記統合エレメントは、好ましくは、充分な数の核酸（例えば、１００塩基対〜１０，０００塩基対、好ましくは、４００塩基対〜１０，０００塩基対、そして最も好ましくは、８００塩基対〜１０，０００塩基対）を含むべきであり、これらの核酸は、対応する標的配列と高度に相同性であって、相同組み換えの可能性を上昇させる。上記統合エレメントは、上記宿主細胞のゲノムにおける標的配列と同種である、任意の配列であり得る。さらに、上記統合エレメントは、非コード核酸配列であってもコード核酸配列であってもよい。一方、上記ベクターは、非相同組み換えによって上記宿主細胞のゲノム中に統合され得る。
【０１０７】
自己複製のために、上記ベクターは、そのベクターが問題となる宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌複製起点の例は、（図３のプラスミドにおいて示されるような）Ｐ１５Ａ ｏｒｉまたはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（プラスミドは、Ｐ１５Ａ ｏｒｉを有する）もしくはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を許容するｐＡＣＹＣ１８４およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０もしくはｐＡＭ．β．１の複製起点である。酵母宿主細胞における使用のための複製起点の例は、２ｍｉｃｒｏｎ複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組み合わせおよびＡＲＳ４とＣＥＮ６との組み合わせである。上記複製起点は、上記宿主細胞においてその複製起点の機能を温度感受性にする変異を有する複製起点であり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ、１９７８、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ７５：１４３３を参照のこと）。
【０１０８】
本発明の核酸配列の１つより多くのコピーは、上記宿主細胞に挿入されて、その遺伝子産物の生成を増大させる。上記核酸配列のコピー数の上昇は、その配列の少なくとも１つのさらなるコピーを上記宿主細胞のゲノムに統合することによるか、またはその核酸配列とともに増幅可能選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ得、増幅可能選択マーカー遺伝子を含む場合、その選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、それにより、その核酸配列のさらなるコピーを含む細胞が、適切な選択因子の存在下でその細胞を培養することにより選択され得る。
【０１０９】
上に記載されたエレメントを連結するために使用されて、本発明の組み換え核酸構築物および発現ベクターを構築する手順は、当業者に周知である（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【０１１０】
本発明における使用のための発現ベクターの多くは、市販される。適切な市販発現ベクターとしては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ．からのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭＴＭ発現ベクターが挙げられ、この発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位ならびにｐＢＲ３２２複製起点およびＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを含む。他の適切な発現ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ ＣＡから市販されるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（Ｌａｔｈｅら、１９８７、Ｇｅｎｅ ５７、１９３−２０１）に由来するプラスミドである。
【０１１１】
（宿主細胞）
別の局面において、本発明は、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、このポリヌクレオチドは、その宿主細胞におけるそのＫＲＥＤポリペプチドの発現のために、１つ以上の制御配列に作動可能に連結される。本発明の発現ベクターによってコードされる上記ＫＲＥＤポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当該分野において周知であり、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ登録番号 ２０１１７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＳ細胞、２９３細胞およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；および植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上に記載される宿主細胞のための適切な培養培地および培養条件は、当該分野において周知である。
【０１１２】
例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０を、本発明のポリヌクレオチド改変体を発現するための発現ベクターによって形質転換した。上記発現ベクターを、本発明のＫＲＥＤポリヌクレオチド改変体をプラスミドｐＣＫ１１０９００に作動可能に連結することによって作製し、このプラスミドｐＣＫ１１０９００は、ｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に結合される。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５Ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいた。上記形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０を、クロラムフェニコールを含有する適切な培養培地下で培養し、それにより、その発現ベクターを発現した形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞のみが、生存した。例えば、実施例１を参照のこと。
【０１１３】
（精製）
本発明のＫＲＥＤポリペプチドが上記ポリヌクレオチド改変体によって発現されると、そのポリペプチドを、タンパク質精製のための任意の１つ以上の周知技術（リゾチーム処理、音波破砕、濾過、塩の適用、超遠心分離、アフィニティークロマトグラフィーなどを含む）を用いて、上記細胞および／または培養培地から精製した。細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のタンパク質の溶解および高効率抽出のための適切な溶液は、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、商標名ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＢＴＭで市販される。化学的プロセスにおける適用のために、細胞溶解産物から上記ＫＲＥＤポリペプチドを充分に精製するための適切なプロセスは、本明細書中の実施例３において開示される。
【０１１４】
（スクリーニング）
増強したＫＲＥＤ活性について、上記発現ライブラリーから上記ＫＲＥＤポリペプチドのクローンをスクリーニングすることは、代表的に、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨがＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋に変換されるのに伴う（吸光度または蛍光の減少を介した）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少速度をモニタリングする、標準的な生物化学的技術を用いて実施される。この反応において、上記ケトレダクターゼが、ケトン基質を対応するヒドロキシル基に立体特異的に還元するにつれて、上記ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、そのケトレダクターゼによって使い果たされる（酸化される）。単位時間あたりのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少速度は、吸光度または蛍光の減少により測定される場合、一定量の上記溶解産物（またはそれから作製された凍結乾燥粉末）における、上記ＫＲＥＤポリペプチドの相対（酵素）活性を示す。このような手順は、本明細書中の実施例４に記載されている。
【０１１５】
第１ラウンドの変異後に得られたライブラリーは、スクリーニングされて、そして最も優れたＫＲＥＤポリペプチド（配列番号７６）は、配列番号２のＣ．ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＫＲＥＤ骨格と比較して、Ｈ６７Ｑ変異およびＦ１５８Ｙ変異を有していた。次いで、配列番号７６をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号７５）は、オリゴマーから再合成されて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンが最適化された。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号７７の配列を有していた。
【０１１６】
その後、第２の変異誘発技術または進化技術は、配列番号７７のコドン最適化ポリヌクレオチドに適用されて、第２のライブラリーを生成し、この第２のライブラリーは、次いで、同様の技術によってＫＲＥＤ活性についてスクリーニングされた。得られたクローンをスクリーニングすることは、補因子としてＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨのいずれかを用いて、配列番号２の野生型ポリペプチドの１．５倍と４．３倍の間のＫＲＥＤ活性を実証する、３つのクローンの単離をもたらした。これらのクローンは、親であるＣ．ｍａｇｎｏｏｌｉａｅベースの配列番号２のＫＲＥＤ骨格と比較したそれらの変異および活性に沿って、以下の表２に列挙される。
【０１１７】
【表２】
本発明のＫＲＥＤポリヌクレオチドは、変異または進化させられてライブラリーを生成し得、このライブラリーは、スクリーニングされて、補因子（または、ＮＡＤＰＨよりはむしろＮＡＤＨ）として他の化合物を選択的に受容する能力を有する、それらの改変ＫＲＥＤポリペプチドを同定し得る。特に、Ｅ２２６Ｇ変異は、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへの補因子選択性における変化を引き起こすことが発見され（配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１１４、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１３０、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４６、配列番号１６６、配列番号１７８、配列番号１８８、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号２０８および配列番号２１０）、Ｅ２２６Ｄ（配列番号１２８および配列番号１３８）およびＥ２２６Ｋ（配列番号２１６）についても同様であった。
【０１１８】
本発明のＫＲＥＤポリヌクレオチドは、変異または進化させられてライブラリーを生成し得、このライブラリーは、スクリーニングされて、増強した熱安定性を有するそれらの改変ＫＲＥＤポリペプチドを同定し得る。特に、置換：Ｐ１４Ａ、Ｖ１４０Ｉ、Ｖ１８４Ｉ、Ａ１９４Ｖ（配列番号９２、配列番号２７６、配列番号３３４、配列番号３４４、配列番号５０６、配列番号５２６および配列番号５４２）は、配列番号２のポリペプチドと比較して、増強した熱安定性を提供することが発見された。
【０１１９】
その後、第３ラウンドライブラリーが調製され、そして本明細書中に記載されるようにＫＲＥＤ活性についてスクリーニングされた。上記第３ラウンドライブラリー由来の４つのクローンは、上記第２ラウンドライブラリーの最も優れた候補の２倍の活性を有しており、これらは表３に列挙される。配列番号２５３を有するポリヌクレオチドは、最も期待できる候補であった。この配列番号２５３を有するポリヌクレオチドは、配列番号２のＫＲＥＤ骨格と比較して２つの変異、Ｓ４２ＮおよびＡ１９４Ｖを有し、そして補因子としてＮＡＤＰＨを用いて、配列番号２の野生型ＫＲＥＤと比較して最初のＫＲＥＤ活性の３倍の上昇を提供する、ＫＲＥＤポリペプチドを発現した。
【０１２０】
【表３】
変異プロセスおよびスクリーニングプロセスは、所望される活性、熱安定性および補因子選択性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに達するまで、必要とされるだけ多くの回数反復され得、このプロセスは、点変異の挿入を含む。
【０１２１】
図３のプラスミドｐＣＫ１１０９００からの上記ポリヌクレオチド（配列番号１２３）のより良好な発現を得るために、配列番号１２３のポリヌクレオチドは、オリゴマーを用いて再増幅されて、上記ベクターのＳｆｉＩ部位および上記ＫＲＥＤ ｍＲＮＡの５’末端においてＲＮＡヘアピンループ形成を導き得るヌクレオチドを置換した。具体的には、オリゴは、上記ｐＣＫ１１０９００ベクターの５’−ＳｆｉＩ部位を変化させ、そしてコードＫＲＥＤポリペプチドの６位の残基におけるセリンのためのＡＧＣコドンを、セリンをまたコードしたＴＣＣコドンで置換することにより、これらの潜在的なステムループ構造を阻害するように設計された。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、その形質転換され、かつ培養された宿主細胞の溶解産物におけるＫＲＥＤ活性により測定される場合、上記ＫＲＥＤポリペプチドの約３倍高い発現をもたらした。第３ラウンドライブラリーのスクリーニング後、配列番号２５３を有するポリヌクレオチドは、最も期待できる候補であった。しかし、図３のプラスミドｐＣＫ１１０９００からの上記ポリヌクレオチドのより良好な発現を得るために、上記配列番号２５３のポリヌクレオチドは、進化技術を適用することによってさらに改善され、そして上記配列番号１２３についてと同様に、ヘアピン形成ヌクレオチドが除去されたベクター中にクローニングされた。得られたコドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号３０３および配列番号３４３のポリヌクレオチドを含んでいた。
【０１２２】
さらに、本発明のＫＲＥＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な生成のために、コドンが最適化され得る。当業者は、広い範囲の生物のためのコドン選択性情報を提供する表および他の参考文献が、容易に入手可能であることを理解する。例えば、ＨｅｎａｕｔおよびＤａｎｃｈｉｎ、「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら、編、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ｐ．２０４７〜２０６６（１９６６）を参照のこと。
【０１２３】
一般的に、ＫＲＥＤを発現する形質転換細胞のスクリーニングは、２工程プロセスである。第１に、上記細胞を物理的に分離し、次いで、どの細胞が所望の特性を保有し、そしてどの細胞が所望の特性を保有しないかを決定する。選択は、スクリーニング様式であり、この様式において、同定および物理的な分離は、選択マーカーの発現によって同時に達成され、この選択マーカーは、いくつかの遺伝的環境において、そのマーカーを発現している細胞を生存させ、他方、他の細胞は死ぬ（または逆もまた同様）。例示的なスクリーニングマーカーとしては、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質が挙げられる。選択マーカーとしては、薬物耐性遺伝子およびトキシン耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコール、アンピシリンなどに対する耐性）が挙げられる。自発的な選択は、天然の進化の過程で生じ得るかまたは生じるが、本方法においては、選択は、人間によって実施される。
【０１２４】
本明細書中で開示される方法によって作製されるＫＲＥＤポリヌクレオチドは、実施例４に記載のプロトコールに従ってスクリーニングされ、本発明の改善されたＫＲＥＤポリペプチドとして包含するために適切な、増強した活性を有するＫＲＥＤポリヌクレオチドを同定する。
【０１２５】
以下の配列は、配列番号２の野生型Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＫＲＥＤポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８にもまた、開示される）と比較した本発明のＫＲＥＤポリペプチド改変体の多様性を要約し、ここで、「Ｘ」として表されその後に残基番号が続く、１つ以上のアミノ酸残基は、置換されて本発明のＫＲＥＤポリペプチドを生じる：
【０１２６】
【化９】
本発明のＫＲＥＤポリペプチドについての種々の残基位置における変化の多様性は、以下の表４において、矢印の右に示され、そして配列番号２のＣ．ｍａｇｎｏｌｉａｅ ＫＲＥＤポリペプチド（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８、ＧＩ：１１３６０５３８）に対応するアミノ酸残基は、その矢印の左に示される：
【０１２７】
【表４−１】
【０１２８】
【表４−２】
【０１２９】
【表４−３】
【実施例】
【０１３０】
（実施例１：ケトレダクターゼの発現のための発現構築物の構築）
Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅケトレダクターゼの遺伝子のアナログを、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドンを最適化し、そしてＧｅｎＢａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８として開示される公知の配列に基づいて合成した。上記アナログ遺伝子を、６０マーのオリゴマーを用いて合成し、そしてｌａｃプロモーター遺伝子およびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下にある発現ベクター（図３のｐＣＫ１１０９００）中にクローン化して、プラスミドｐＫＲＥＤを作製した。上記発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含んでいた。いくつかのクローンは、（実施例４の方法により）活性なケトレダクターゼを発現したことが見出され、そして上記合成遺伝子を配列決定した。ＣＲ２−５と呼ばれる配列（配列番号１）を、全てのさらなる変異およびシャッフリングのための出発物質として使用した。ＣＲ２−５は、野生型Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａｅケトレダクターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号 ＪＣ７３３８）と約６０％の核酸同一性を有していた。
【０１３１】
（実施例２：ＫＲＥＤの生成）
通気性振盪発酵槽において、０．５２８ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、７．５ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム三水和物、３．７ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物、０．０５ｇ／Ｌの硫酸鉄および３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液（２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸銅四水和物、０．１ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム十水和物および０．５ｇ／ＬのＥＤＴＡを含有する）を含有する１０．０Ｌの増殖培地を、３０℃の温度まで上昇させた。
【０１３２】
上記発酵槽に、ＬＢ、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む振盪フラスコにおいて増殖した、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐＣＲ２−５）の対数増殖期後期の培養物を植え付けて、６００ｎｍ（ＯＤ６００）で０．５〜２．０の初期吸光度とした。その発酵槽を、５００ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍで振盪し、そして空気を、１．０Ｌ／分〜１５．０Ｌ／分で発酵管に供給し、そしてその培養物のｐＨを、２０％ｖ／ｖ水酸化アンモニウムを添加することによって７．０に制御した。上記培養物が４０のＯＤ６００に達した後、その温度を２５℃まで低下させ、そして１ｍＭの最終濃度までイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加することによって、グルコースデヒドロゲナーゼの発現を誘導した。上記培養物を、さらに１５時間増殖させた。誘導後、細胞を遠心分離によって採取し、そして１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。その細胞ペーストを、その後の回復プロセスにおいて直接使用するか、または使用まで−８０℃に保存した。
【０１３３】
（実施例３：（凍結乾燥された）ケトレダクターゼ酵素調製物）
上記細胞ペーストを、細胞ペーストの湿重量の１容量に対して３倍容量の１００ｍＭ トリス／硫酸塩（ｐＨ７．２）中に懸濁し、その後、Ｓｏｒｖａｌ １２ＢＰにおいて４０分間、５０００ｇで遠心分離することによって洗浄した。上記洗浄した細胞ペーストを、２倍容量の１００ｍＭ トリス／硫酸塩（ｐＨ７．２）に懸濁した。第１のパスについて１４，０００ｐｓｉｇを用い、そして第２のパスについて８，０００ｐｓｉｇを用いた２パスのホモジナイザーに上記懸濁液を通すことによって、細胞内ＫＲＥＤを細胞から放出させた。上記溶解産物を室温まで温め、次いで、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ｐＨ７．２）の１０％ｗ／ｖ溶液をその溶解産物に添加して、０．７５％ｗ／ｖの最終ＰＥＩ濃度とし、そして３０分間攪拌した。上記処理したホモジネートを、Ｂｅｃｋｍａｎ実験用遠心分離機において、６０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。上記上清をデカントし、そして容器に再懸濁して、−２０℃で凍らせ、凍結乾燥した。
【０１３４】
（実施例４：ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）酵素活性アッセイ）
細胞を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中で一晩増殖させた。その培養物を、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する新鮮なＴＢ中に１０倍希釈し、３０℃で２時間増殖させた後、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび８ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を含有する１／８容量のＴＢを添加した。その培養物（０．５ｍｌ）を、３０℃でさらに６時間増殖させた。
【０１３５】
溶解緩衝液は、１００ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍｇ／ｍｌ ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ） Ｂ）、２μｌのＤｎａｓｅ（２０００Ｕ／ｍｌ）、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメチルスルホニル）を含む。
【０１３６】
細胞を、遠心分離によってペレットにし、そして、室温で２時間振盪することにより、０．２５ｍｌの溶解緩衝液中に溶解する。
【０１３７】
アッセイ混合物は、１容量の１００ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭ〜０．２ｍＭのＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ、６００ｍＭのグルコースおよび６００ｍＭのグルコン酸と、１容量のエチル−４−クロロ−３−ケト−ブチレート（ＥＣＫＢ）（１部）および酢酸ブチル（２部）の溶液とを、１０分間混合し、そしてその相を分離させることによって得られた水相である。上記反応を、１００ｍＭ トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）中に予め溶解した溶液としてケトレダクターゼ酵素を添加することによって、開始した。反応の進行を、時間の関数として、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することによるかまたは４４０ｎｍの蛍光の光放射によって追跡した。その結果を、時間に対する吸光度単位または相対蛍光単位（ＲＦＵ）（ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ）としてプロットし、そのプロットの傾き（吸光度単位／分またはＲＦＵ／分）を決定した。
【０１３８】
本発明は、特定の実施形態に対する参照とともに記載されるが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされ得、そして等価物が置換され得ることを、当業者は理解する。さらに、多くの改変が、本発明の範囲から逸脱することなく、特定の状況または特定の物質を本発明の教示に適合するようになされ得る。従って、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されることなく、添付の特許請求の範囲内にある全ての実施形態を含むことが意図される。
【０１３９】
（実施例５ ＫＲＥＤ／ＧＤＨ結合化学アッセイ）
ｐＨ電極制御自動滴定器を備える１００ｍＬの容器に、１００ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７、２５ｍＬ）中のグルコース（７．５ｇ）の溶液を注いだ。この溶液に、上記２つの酵素（１００ｍｇ ＫＲＥＤ；５０ｍｇ ＧＤＨ）およびＮＡＤＰ（６．２５ｍｇ）を注いだ。次いで、酢酸ブチル（１０ｍＬ）を注いだ。最後に、酢酸ブチル（１０ｍＬ）中の４−クロロアセト酢酸エチル（６ｇ）を、その容器に注いだ。４Ｍ ＮａＯＨを、（６．８５のｐＨを、下限値として設定した）自動滴定器によって必要に応じて滴下して、そのｐＨを常に７．０に調整した。水酸化物（ｃａｕｓｔｉｃ）が必要とされなくなった時に、その反応は完了した。その反応速度を、単位時間あたりの添加された塩基の量を測定することによるか、またはその反応混合物のサンプルをとり、そのサンプルを等しい容量の酢酸エチルで３回抽出し、そしてその合わせた有機層をガスクロマトグラフィーで分析して、単位時間あたりの（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの量を決定することによって、決定した。
【０１４０】
本発明は、特定の実施形態に対する参照とともに記載されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされ得、そして等価物が置換され得ることを、当業者は理解する。さらに、多くの改変が、その範囲から逸脱することなく、特定の状況または特定の物質を本発明の教示に適合させるようになされ得る。従って、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されることなく、添付の特許請求の範囲内にある全ての実施形態を含むことが、意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、酸化還元サイクルを例示する。このサイクル中、ケトレダクターゼは、還元剤ＮＡＤＰＨ存在下でβケトンを還元して、対応するβ−ヒドロキシ誘導体およびＮＡＤＰとし、そして、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）は、酸化されてグルコン酸となるグルコース存在下で、ＮＡＤＰを還元しＮＡＤＰＨに戻す。この反応で生成されるグルコン酸は、水酸化ナトリウムで中和されグルコン酸ナトリウムとなる。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｇ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図２Ｈ】図２Ａ〜２Ｈは、合わせて、それらの配列番号により同定された本発明のＫＲＥＤポリペプチドと、示された５つの先行技術文献（図２Ａの列１〜列５）のＫＲＥＤポリペプチドとのアミノ酸同一性％を比較する表を提供する。第一の先行技術文献（ＷＯ２００１５５３４２）のアミノ酸配列は、配列番号２（ＣＲ２−０５）として提供される。図２Ａ〜２Ｈを作成するために、Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ：導入ギャップ＝−２２．１８３および伸長ギャップ＝−１．３９６のギャップペナルティを有するＰＡＭ１２０マトリックスのための動的計画法アルゴリズムを使用して、アライメントを行った。同一性％は、第一配列と第二配列との間の同一残基の数を、部分一致を示すアライメント（ギャップを有する）（ｐ）において第一配列の長さで割ったものと等しい。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ.およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．「Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照のこと。
【図３】図３は、Ｐ１５Ａ複製起点（Ｐ１５Ａ ｏｒｉ）、ｌａｃＩ、ＣＡＰ結合部位、ｌａｃプロモーター（ｌａｃ）、Ｔ７リボソーム結合部位（Ｔ７ｇ１０ ＲＢＳ）、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｍＲ）を含む本発明の４０３６ｂｐの発現ベクター（ｐＣＫ１１０９００）である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍のＫＲＥＤ活性を有し、かつ、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同性である、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項２】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するが、配列番号２の骨格と、Ａ２Ｖ；Ｋ３Ｅ；Ｆ５ＬまたはＦ５Ｃ；Ｎ７Ｋ；Ｅ９ＧまたはＥ９Ｋ；Ａ１２Ｖ；Ｐ１３Ｌ；Ｐ１４Ａ；Ａ１６ＧまたはＡ１６Ｖ；Ｔ１８Ａ；Ｋ１９Ｉ；Ｎ２０ＤまたはＮ２０Ｓ；Ｅ２１Ｋ；Ｓ２２ＮまたはＳ２２Ｔ；Ｑ２４ＨまたはＱ２４Ｒ；Ｖ２５Ａ；Ｎ３２ＳまたはＮ３２Ｄ；Ａ３６Ｔ；Ｓ４１Ｇ；Ｓ４２Ｎ；Ｉ４５Ｌ；Ａ４８Ｔ；Ｖ５６Ａ；Ｖ６０Ｉ；Ｙ６４Ｈ；Ｎ６５Ｋ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５ＹまたはＮ６５Ｓ；Ｓ６６ＧまたはＳ６６Ｒ；Ｈ６７ＬまたはＨ６７Ｑ；Ｄ６８ＧまたはＤ６８Ｎ；Ｇ７１Ｄ；Ｅ７４ＫまたはＥ７４Ｇ；Ｋ７８Ｒ；Ｋ７９Ｒ；Ｋ８５Ｒ；Ａ８６Ｖ；Ｎ９０Ｄ；Ｓ９３ＮまたはＳ９３Ｃ；Ｄ９５Ｎ、Ｄ９５Ｇ、Ｄ９５Ｖ、Ｄ９５ＹまたはＤ９５Ｅ；Ｋ９８Ｒ；Ｑ９９Ｌ、Ｑ９９Ｒ、またはＱ９９Ｈ；Ｔ１００Ａ；Ｉ１０１Ｖ；Ｑ１０３Ｒ；Ｉ１０５ＶまたはＩ１０５Ｔ；Ｋ１０６ＲまたはＫ１０６Ｑ；Ｈ１１０Ｙ、Ｈ１１０ＣまたはＨ１１０Ｒ；Ｖ１１４Ａ；Ａ１１６Ｇ；Ｉ１２０Ｖ；Ｋ１２４Ｒ；Ｄ１２９ＧまたはＤ１２９Ｎ；Ｄ１３１ＧまたはＤ１３１Ｖ；Ｄ１３２Ｎ；Ｋ１３４Ｍ、Ｋ１３４Ｖ、Ｋ１３４ＥまたはＫ１３４Ｒ；Ｄ１３７ＮまたはＤ１３７Ｇ；Ｑ１３８Ｌ；Ｖ１４０Ｉ；Ｄ１４３Ｎ；Ｌ１４４Ｆ；Ｋ１４５Ｒ；Ｖ１４７Ａ；Ｖ１５０Ａ；Ｈ１５３ＹまたはＨ１５３Ｑ；Ｈ１５７Ｙ；Ｆ１５８ＬまたはＦ１５８Ｙ；Ｒ１５９Ｋ；Ｅ１６０ＧまたはＥ１６０Ｖ；Ｆ１６２ＹまたはＦ１６２Ｓ；Ｅ１６３ＧまたはＥ１６３Ｋ；Ｅ１６５Ｄ、Ｅ１６５ＧまたはＥ１６５Ｋ；Ｋ１６７ＩまたはＫ１６７Ｒ；Ａ１７０Ｓ；Ｖ１７２Ｉ；Ｆ１７３Ｃ；Ｍ１７７ＶまたはＭ１７７Ｔ；Ｈ１８０Ｙ；Ｖ１８４Ｉ；Ｔ１９０Ａ；Ａ１９３Ｖ；Ａ１９４Ｖ；Ｆ２０１Ｌ；Ｋ２０３Ｒ；Ｆ２０９Ｙ；Ｖ２１８Ｉ；Ｎ２２４Ｓ；Ｅ２２６Ｋ、Ｅ２２６ＧまたはＥ２２６Ｄ；Ｓ２２８Ｔ；Ｄ２２９Ａ；Ｖ２３１ＩまたはＶ２３１Ａ；Ｑ２２３ＫまたはＱ２２３Ｒ；Ｅ２３４ＧまたはＥ２３４Ｄ；Ｔ２３５ＫまたはＴ２３５Ａ；Ｎ２３７Ｙ；Ｋ２３８ＲまたはＫ２３８Ｅ；Ｔ２５１Ａ；Ｖ２５５Ａ；Ｆ２６０Ｌ；Ａ２６２Ｖ；Ｔ２７２Ａ；Ｉ２７４Ｌ；Ｉ２７５ＬまたはＩ２７５Ｖ；およびＰ２８３Ｒからなる群より選択される１〜２０個の残基の変化とを有する、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項３】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２からなる群より選択されるアミノ酸を有する、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項４】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍〜約２５倍のケトレダクターゼ活性を有し、そして、該ＫＲＥＤポリペプチドは、
（ａ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するか；
（ｂ）（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるか；
（ｃ）１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のポリペプチド改変体であるか；
（ｄ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のポリペプチドからの少なくとも２２０アミノ酸残基フラグメントであるか；あるいは、
（ｅ）５０℃にてｐＨ７で６０分間インキュベーションした後に、最初のＫＲＥＤ活性の６０％より多くを保持する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドであるか；
のいずれかである、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項５】
請求項１、２、３または４のうちのいずれか１項に記載のＫＲＥＤポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求５に記載のポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、遺伝子発現を制御する一つ以上の異種調節配列に対して作動可能に連結されている、ヌクレオチド構築物。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによってコードされる前記ＫＲＥＤポリペプチドの発現の制御配列に対して作動可能に結合されており、該ベクターは、宿主細胞内で該ＫＲＥＤポリペプチドを発現するように該宿主細胞を形質転換し得る、ベクター。
【請求項８】
前記ＫＲＥＤポリペプチドをコードする請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドは、該宿主細胞内で該ＫＲＥＤポリペプチドの発現のための一つ以上の制御配列に対して作動可能に連結されている、宿主細胞。
【請求項９】
単離されかつ精製された、請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１０】
凍結乾燥形態の請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１１】
緩衝化媒体中に請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１２】
補因子としてＮＡＤＨを用いることについて増加した特異性を有する請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、配列番号２の骨格を有し、Ｅ２２６が変異している、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、Ｅ２２６がＧ、Ｄ、またはＫである、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１４】
増加した熱安定性を有する請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２の骨格を有し、Ｐ１４、Ｖ１４０、Ｖ１８４またはＡ１９４が変異している、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、Ｐ１４がＡであるか、またはＶ１４０がＩであるか、またはＶ１８４がＩであるか、またはＡ１９４がＶである、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍のＫＲＥＤ活性を有し、かつ、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同性である、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項２】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍〜約２５倍のＫＲＥＤ活性を有するが、配列番号２の骨格と、Ａ２Ｖ；Ｋ３Ｅ；Ｆ５ＬまたはＦ５Ｃ；Ｎ７Ｋ；Ｅ９ＧまたはＥ９Ｋ；Ａ１２Ｖ；Ｐ１３Ｌ；Ｐ１４Ａ；Ａ１６ＧまたはＡ１６Ｖ；Ｔ１８Ａ；Ｋ１９Ｉ；Ｎ２０ＤまたはＮ２０Ｓ；Ｅ２１Ｋ；Ｓ２２ＮまたはＳ２２Ｔ；Ｑ２４ＨまたはＱ２４Ｒ；Ｖ２５Ａ；Ｎ３２ＳまたはＮ３２Ｄ；Ａ３６Ｔ；Ｓ４１Ｇ；Ｓ４２Ｎ；Ｉ４５Ｌ；Ａ４８Ｔ；Ｖ５６Ａ；Ｖ６０Ｉ；Ｙ６４Ｈ；Ｎ６５Ｋ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５ＹまたはＮ６５Ｓ；Ｓ６６ＧまたはＳ６６Ｒ；Ｈ６７ＬまたはＨ６７Ｑ；Ｄ６８ＧまたはＤ６８Ｎ；Ｇ７１Ｄ；Ｅ７４ＫまたはＥ７４Ｇ；Ｋ７８Ｒ；Ｋ７９Ｒ；Ｋ８５Ｒ；Ａ８６Ｖ；Ｎ９０Ｄ；Ｓ９３ＮまたはＳ９３Ｃ；Ｄ９５Ｎ、Ｄ９５Ｇ、Ｄ９５Ｖ、Ｄ９５ＹまたはＤ９５Ｅ；Ｋ９８Ｒ；Ｑ９９Ｌ、Ｑ９９Ｒ、またはＱ９９Ｈ；Ｔ１００Ａ；Ｉ１０１Ｖ；Ｑ１０３Ｒ；Ｉ１０５ＶまたはＩ１０５Ｔ；Ｋ１０６ＲまたはＫ１０６Ｑ；Ｈ１１０Ｙ、Ｈ１１０ＣまたはＨ１１０Ｒ；Ｖ１１４Ａ；Ａ１１６Ｇ；Ｉ１２０Ｖ；Ｋ１２４Ｒ；Ｄ１２９ＧまたはＤ１２９Ｎ；Ｄ１３１ＧまたはＤ１３１Ｖ；Ｄ１３２Ｎ；Ｋ１３４Ｍ、Ｋ１３４Ｖ、Ｋ１３４ＥまたはＫ１３４Ｒ；Ｄ１３７ＮまたはＤ１３７Ｇ；Ｑ１３８Ｌ；Ｖ１４０Ｉ；Ｄ１４３Ｎ；Ｌ１４４Ｆ；Ｋ１４５Ｒ；Ｖ１４７Ａ；Ｖ１５０Ａ；Ｈ１５３ＹまたはＨ１５３Ｑ；Ｈ１５７Ｙ；Ｆ１５８ＬまたはＦ１５８Ｙ；Ｒ１５９Ｋ；Ｅ１６０ＧまたはＥ１６０Ｖ；Ｆ１６２ＹまたはＦ１６２Ｓ；Ｅ１６３ＧまたはＥ１６３Ｋ；Ｅ１６５Ｄ、Ｅ１６５ＧまたはＥ１６５Ｋ；Ｋ１６７ＩまたはＫ１６７Ｒ；Ａ１７０Ｓ；Ｖ１７２Ｉ；Ｆ１７３Ｃ；Ｍ１７７ＶまたはＭ１７７Ｔ；Ｈ１８０Ｙ；Ｖ１８４Ｉ；Ｔ１９０Ａ；Ａ１９３Ｖ；Ａ１９４Ｖ；Ｆ２０１Ｌ；Ｋ２０３Ｒ；Ｆ２０９Ｙ；Ｖ２１８Ｉ；Ｎ２２４Ｓ；Ｅ２２６Ｋ、Ｅ２２６ＧまたはＥ２２６Ｄ；Ｓ２２８Ｔ；Ｄ２２９Ａ；Ｖ２３１ＩまたはＶ２３１Ａ；Ｑ２２３ＫまたはＱ２２３Ｒ；Ｅ２３４ＧまたはＥ２３４Ｄ；Ｔ２３５ＫまたはＴ２３５Ａ；Ｎ２３７Ｙ；Ｋ２３８ＲまたはＫ２３８Ｅ；Ｔ２５１Ａ；Ｖ２５５Ａ；Ｆ２６０Ｌ；Ａ２６２Ｖ；Ｔ２７２Ａ；Ｉ２７４Ｌ；Ｉ２７５ＬまたはＩ２７５Ｖ；およびＰ２８３Ｒからなる群より選択される１〜２０個の残基の変化とを有する、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項３】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２からなる群より選択されるアミノ酸を有する、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項４】
ＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも１．５倍〜約２５倍のケトレダクターゼ活性を有し、そして、該ＫＲＥＤポリペプチドは、
（ａ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０４、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するか；
（ｂ）（ｉ）配列番号２２３、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２５１、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５９、配列番号３０３、配列番号３４３、配列番号３５３、配列番号３５７、配列番号３５９、配列番号３６３、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３８１、配列番号３８５、配列番号３８７、配列番号３９９、配列番号４０７、配列番号４３７、配列番号４３９、配列番号４４７、配列番号４６９、配列番号４８３、配列番号４８５、配列番号４８７、配列番号４８９、配列番号５０１、配列番号５０５、配列番号５０７、配列番号５１１、配列番号５１３、配列番号５１５、配列番号５１７、配列番号５１９、配列番号５２１、配列番号５２３、配列番号５２５、配列番号５２７、配列番号５２９、配列番号５３１、配列番号５３３、配列番号５３５、配列番号５３７、配列番号５３９、または配列番号５４１のヌクレオチド配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖のうちのいずれかと、中程度のストリンジェンシー条件下においてハイブリダイズする核酸配列によってコードされるか；
（ｃ）１〜６個のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む、配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のポリペプチド改変体であるか；
（ｄ）配列番号２２４、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５０、配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５６、配列番号２６０、配列番号３０３、配列番号３４４、配列番号３５４、配列番号３５８、配列番号３６０、配列番号３６４、配列番号３６８、配列番号３７４、配列番号３８２、配列番号３８６、配列番号３８８、配列番号４００、配列番号４０８、配列番号４３８、配列番号４４０、配列番号４４８、配列番号４７０、配列番号４８４、配列番号４８６、配列番号４８８、配列番号４９０、配列番号５０２、配列番号５０６、配列番号５０８、配列番号５１２、配列番号５１４、配列番号５１６、配列番号５１８、配列番号５２０、配列番号５２２、配列番号５２４、配列番号５２６、配列番号５２８、配列番号５３０、配列番号５３２、配列番号５３４、配列番号５３６、配列番号５３８、配列番号５４０、および配列番号５４２のポリペプチドからの少なくとも２２０アミノ酸残基フラグメントであるか；あるいは、
（ｅ）５０℃にてｐＨ７で６０分間インキュベーションした後に、最初のＫＲＥＤ活性の６０％より多くを保持する、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドであるか；
のいずれかである、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項５】
請求項１、２、３または４のうちのいずれか１項に記載のＫＲＥＤポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求５に記載のポリヌクレオチドを含むヌクレオチド構築物であって、遺伝子発現を制御する一つ以上の異種調節配列に対して作動可能に連結されている、ヌクレオチド構築物。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによってコードされる前記ＫＲＥＤポリペプチドの発現の制御配列に対して作動可能に結合されており、該ベクターは、宿主細胞内で該ＫＲＥＤポリペプチドを発現するように該宿主細胞を形質転換し得る、ベクター。
【請求項８】
前記ＫＲＥＤポリペプチドをコードする請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、該ポリヌクレオチドは、該宿主細胞内で該ＫＲＥＤポリペプチドの発現のための一つ以上の制御配列に対して作動可能に連結されている、宿主細胞。
【請求項９】
単離されかつ精製された、請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１０】
凍結乾燥形態の請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１１】
緩衝化媒体中に請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドを含む、組成物。
【請求項１２】
補因子としてＮＡＤＨを用いることについて増加した特異性を有する請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、配列番号２の骨格を有し、Ｅ２２６が変異している、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、Ｅ２２６がＧ、Ｄ、またはＫである、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１４】
増加した熱安定性を有する請求項１に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、該ＫＲＥＤポリペプチドは、配列番号２の骨格を有し、Ｐ１４、Ｖ１４０、Ｖ１８４またはＡ１９４が変異している、ＫＲＥＤポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載のＫＲＥＤポリペプチドであって、Ｐ１４がＡであるか、またはＶ１４０がＩであるか、またはＶ１８４がＩであるか、またはＡ１９４がＶである、ＫＲＥＤポリペプチド。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５０２１２４（Ｐ２００７−５０２１２４Ａ）
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３４４８（Ｐ２００６−５２３４４８）
【出願日】平成１６年８月１１日（２００４．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６６５５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１７１３５
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０６０３８２５７）コデクシス， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１１日（２００４．８．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６６５５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１７１３５
【国際公開日】平成１７年２月２４日（２００５．２．２４）
【出願人】（５０６０３８２５７）コデクシス， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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