新規な標識化オリゴヌクレオチド
本発明は、フルオロフォア、クエンチャー及び少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことで特徴づけられる、第１ヌクレオチドセグメント、及び標的配列に相補的な第２ヌクレオチドセグメントを含んでなる標識化オリゴヌクレオチドに関する。また、本発明は、このようなオリゴヌクレオチドの使用、更に、このようなオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な標識化オリゴヌクレオチドに関する。本発明は、また、このようなオリゴヌクレオチドの使用、更に、このようなオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。
【０００２】
核酸及び遺伝物質に関する技術において、遺伝子、遺伝子の一部、またはヌクレオチド配列が生体、この生体の細胞抽出物、または他の生物試料に存在するかどうかを決定することがしばしば必要である。
【０００３】
核酸を検出する様々なタイプの方法は、文献に記載されている。これらの方法、特にポリヌクレオチドの検出を必要とするものは、核酸の相補鎖のペアになる特性に基づいており、一般に「核酸ハイブリダイゼーション」または単に「ハイブリダイゼーション」と呼ばれる。
【０００４】
通常、分析しなければならない生物体または疾患の特定の配列を同定した後に、試料の核酸を抽出し、興味がある配列を増幅して検出することが望ましい。多くの増幅方法と検出方法が、この目的のために開発されてきた。
【０００５】
例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、二本鎖ＤＮＡの変性、一重鎖ＤＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーション、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの酵素的伸長という３段階プロセスの反復に基づき、それによりオリゴヌクレオチドプライマーの標的物として動くものと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
【０００６】
増幅は、サイクルの終点（エンドポイントＰＣＲ）またはリアルタイム（リアルタイムＰＣＲ）において、増幅産物の蛍光標識の使用によって分析することができる。いくつかのリアルタイムＰＣＲ技術が存在する。それらのうちの１つは、ループ構造とフルオロフォアを配列の一末端に含みクエンチャーを他の末端に含むステムとを含んで成るヘアピン配列である「分子ビーコン」と呼ばれている特定のプローブを使用する。（Tyagi, S. 及び Kramer, FD., Nat. Biotechnol., 1996, 14, 303-308, Marras, SA.等, Genet Anal., 1999, 14, 151-156）。ハイブリダイゼーション温度より下では、これらの配列は、標的配列にハイブリダイズせず、「ヘアピン」構造をとる：５’末端と３’末端は近く、蛍光の放出がない。プローブがループ配列を介して、増幅された標的配列に対応するアンプリコンを認識しハイブリダイズした場合は、ステム構造は不安定化し末端は別々に遠くなり、クエンチャーはその役割をもはや果たさず、蛍光の放出がある。
【０００７】
しかしながら、特定の状況では、「分子ビーコン」プローブによる蛍光の放出は、増幅反応の間に存在するヌクレアーゼによる分解に従って、別々に動かされるフルオロフォアとクエンチャーによるバックグラウンド・ノイズによって、「寄生され」うる。これは特に「従来の」ＰＣＲの場合であり、Ｔａｑポリメラーゼ酵素自体が５’ヌクレアーゼ活性を有するためである。更に、リアルタイムＰＣＲの間、現れる「寄生性」蛍光放出に加えて、サイクルの終わりに熱安定性ポリメラーゼ酵素の残存による分子ビーコンの切断は、ポスト増幅エンドポイント温度勾配分析に影響を及ぼす。現在、このポスト増幅エンドポイント温度勾配分析は、単純な配列バリエーション、例えば分子ビーコンを使用するＳＮＰｓ（一塩基変異多型）を検出するために最も感度の高い方法である。
【０００８】
ＮＡＳＢＡは別の等温核酸増幅技術である。そして、それは３つの酵素（ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＮＡｓｅＨ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）の共同作用に基づく。増幅は、サイクルの終わりに（エンドポイントＮＡＳＢＡ）またはリアルタイムにおいて（リアルタイムＮＡＳＢＡ）、増幅産物の蛍光標識の使用によって、分子ビーコンプローブを使用して、分析される。しかしながら、エンドポイントでは、ＮＡＳＢＡの開始の間に不可欠な酵素であるＲＮＡｓｅＨの存在により、反応の終わりに、分子ビーコンにハイブリダイズする標的ＲＮＡの分解が誘発されうる。標的ＲＮＡの切断による蛍光シグナルの減少は、それとき観察される。従って、増幅エンドポイント温度傾度分析は、困難である。
【０００９】
また、ＰＣＲによるかまたはＮＡＳＢＡによるかに関係なく、蛍光放出はアンプリコン上の分子ビーコンのステム部分の非特異的のハイブリダイゼーションを通しても寄生されうる。従って、この寄生性ハイブリダイゼーションを減らすことは重要である。
【００１０】
また、最後に、分子ビーコンは、独立に増幅の標的配列の検出のために使用されうる。実際に、分子ビーコンの注入、標的転写産物上のプローブのハイブリダイゼーションを反映して発される蛍光によって生きた細胞の遺伝子の発現を分析することが可能である。しかしながら、細胞において活性のある多数のヌクレアーゼの存在はプローブの広範囲な分解を暗示し、そのため標的配列上のプローブのハイブリダイゼーションによらない蛍光放出が誘導される。
【００１１】
従って、特に従来技術の分子ビーコンの切断及び非特異的なハイブリダイゼーションの現象を減少させることによって、それらをより高感度にするために、現在の増幅技術を改良することは重要である。
【００１２】
本発明は、特異的で、安定で、ヌクレアーゼに耐性がある新規な標識化オリゴヌクレオチドを提供することによって、従来技術の全ての欠点を解決することを提案するものである。
【００１３】
この点で、本発明は、フルオロフォア、クエンチャー及び少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことで特徴づけられる、第１ヌクレオチドセグメント、標的配列に相補的な第２ヌクレオチドセグメント、及び前記第１ヌクレオチドセグメントに相補的な第３ヌクレオチドセグメントを含んでなる標識化オリゴヌクレオチドに関する。
【００１４】
好ましくは、前記第１と第３セグメントは、第２セグメントの両側にある。
【００１５】
好ましくは、本発明による標識化オリゴヌクレオチドは、前記第２セグメントが少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことを特徴とする。
【００１６】
好ましくは、前記第２セグメントは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５のαアノマーヌクレオシドを含む。
【００１７】
好ましくは、前記第２セグメントはαアノマーヌクレオシドから成る。
【００１８】
好ましくは、本発明による標識化オリゴヌクレオチドはフルオロフォアが前記オリゴヌクレオチドの一端にあり、クエンチャーが前記オリゴヌクレオチドの他端にあることを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、前記フルオロフォアはフルオレセインである。好ましくは、前記クエンチャーはダブシルである。
【００２０】
好ましくは、前記第１セグメントは３から８のヌクレオチドを含み、前記第２セグメントは１０から３５のヌクレオチドを含み、前記第３セグメントは、それがあるときは、３から８のヌクレオチドを含む。
【００２１】
また、本発明は、ポリメラーゼ酵素の５’ヌクレアーゼ活性をブロッキングするためのおよび／またはＲＮＡｓｅＨ活性をブロッキングするための、少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含んで成るオリゴヌクレオチドの使用にも関する。このような使用が非常に現実的であるのは、分子ビーコン型のプローブを使用して標的配列を検出することが可能であり、一方で同時にポリメラーゼ連鎖反応の間またはポスト増幅エンドポイント測定の間のポリメラーゼ酵素の５’ヌクレアーゼ活性による、または特にＮＡＳＢＡにおいてエンドポイント計測の間のＲＮＡｓｅＨのヌクレアーゼ活性による、その分解を回避するためである。
【００２２】
また、本発明は、生物試料における核酸物質の検出方法に関し、次の工程含んで成る：
ａ）核酸物質を生物試料から抽出すること、
ｂ）核酸物質の少なくとも一つの標的配列のアンプリコンを得るために核酸物質を増幅すること；
ｃ）本発明に係る少なくとも１つの標識化オリゴヌクレオチドを工程ｂ）と同時に、または工程ｂ）の後で使用すること；
ｄ）前記アンプリコンの存在を検出すること。
【００２３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、核酸物質はＰＣＲによって増幅される。
【００２４】
本発明の好ましい別の実施形態によれば、核酸物質はＮＡＳＢＡによって増幅される。
【００２５】
以下の定義は、本発明をより明らかに理解することを可能にする。
【００２６】
本発明の目的のために、「上流」なる用語は核酸またはポリヌクレオチド配列の５’末端側にある領域を意味し、「下流」なる用語は、前記核酸のまたは前記ポリヌクレオチド領域の３’末端側にある領域を意味する。
【００２７】
「ヌクレオチド断片」、「核酸断片」、「ヌクレオチドセグメント」、「核酸セグメント」、「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「オリゴヌクレオチド」なる用語は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ断片、天然または合成のポリヌクレオチド、合成ＤＮＡまたはＲＮＡ断片であって非修飾であるか、または少なくとも１つの修飾された塩基、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン、シュードウリジンまたはシュードイソシチジン、または他のいかなる修飾塩基であってハイブリダイズを可能にするものを意味する。各々の修飾は、組合わせて採用されてもよい。
【００２８】
「標識化オリゴヌクレオチド」または「プローブ」なる用語は、一連のヌクレオシドであって、更に前記オリゴヌクレオチドを検出するための少なくとも一つの分子含んで成るものを意味することを意図する。
【００２９】
このオリゴヌクレオチドは特に、分子認識によって作用する検出プローブであってもよい。「分子認識によって作用する検出プローブ」なる表現は、１０から１００のヌクレオチド単位、特に１５から４５のヌクレオチド単位の核酸配列であって、標的核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成するために所与の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有し、且つプローブが標的の核配列にハイブリダイズした場合にシグナルを発するものを意味することを意図する。
【００３０】
ＴｙａｇｉとＫｒａｍｅｒ（Nature Biotech, 1996, 14: 303-308）によって記載されているように、検出プローブは特に分子ビーコン検出プローブであってもよい。これらの分子ビーコンは、ハイブリダイゼーションの間、蛍光性となる。それらは、ステム−ループ構造を有し、フルオロフォアとクエンチャー基を含む。特異的なループ配列の、その相補的な標的核酸配列との結合は、ステムを展開させ、適切な波長での励起の間に蛍光シグナルが放出される。
【００３１】
検出プローブは特に、「スコルピオン（登録商標）」（Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 19 3752-3761） または、「Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）」 （Genome Research Vol 1 163-169, 2001 Myakishev M.等)タイプのプライマーに組み込まれるプローブであってもよい。
【００３２】
Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）は、５’側にステム−ルート構造を有する配列であるヌクレオチド配列であって、その構造の５’末端にフルオロフォアを、他端にダブシル型クエンチャーを有する。３’側に、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）は、標的配列に相補的で、増幅反応の間プライマーとして働く配列を有する。
【００３３】
スコルピオン（登録商標）は、５’側にステム−ループ構造を有する配列を有し、該構造の一末端にクエンチャーを、他の末端にフルオロフォアを有する配列を有する。３’側に、スコルピオン（登録商標）は、標的配列に相補的で、増幅反応の間プライマーとして働く配列を有する。従来のスコルピオン態様において、プライマー配列とステム−ループ配列の間に位置する「スペーサー」は、ポリメラーゼによるステム−ループ配列の認識を妨げることを可能にする。スコルピオンが本発明によって産生される場合、このスペーサーは任意となる。
【００３４】
本発明の目的において、「フルオロフォア」なる用語は、適切な波長（または４５０と６５０ｎｍの間）の光で励起したときに、５００と７００ｎｍの間の蛍光シグナルを発する分子を意味することを意図する。フルオロフォアは、特に、ローダミンまたはその誘導体、例えばテキサスレッド、フルオレセインまたはその誘導体、例えば５−ブロモメチルフルオレセイン、アレクサ系統のフルオロフォア、例えばアレクサ５３２、アレクサ６４７、アレクサ４０５、アレクサ７００またはアレクサ６８０、または使用する測定装置に従って適切である他のいかなるフルオロフォアであってもよい。検出プローブに利用可能なフルオロフォアは、非常に多様であり、当業者に知られている。
【００３５】
本発明の目的において、「フルオレセイン」なる用語は、４９５ｎｍ周辺の波長の光で励起したときには、５３０ｎｍ周辺の最大放出を有する蛍光シグナルを発する芳香族の化学分子を意味することを意図する。
【００３６】
本発明の目的において、「クエンチャー」なる用語は、フルオロフォアによって発される蛍光を妨げる分子を意味することを意図する。このクエンチャーは、寄生性の放出を回避するために、非蛍光性である芳香族分子から特に選択される。前記「クエンチャー」はダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）またはＤａｂｃｙｌまたは「ブラックホールクエンチャーＴＭ」であることが好ましい。ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）、Ｄａｂｃｙｌ及び「ブラックホールクエンチャーＴＭ」は、非蛍光性芳香族分子であって、それらが物理的にフルオロフォアに近接している場合に、またはＦＲＥＴによって、蛍光の放出を妨げる。
【００３７】
「αアノマーヌクレオシド」または「αヌクレオシド」または「ヌクレオシドα」なる用語は非天然のαアノマー構造を有するデオキシヌクレオシドであって、デオキシリボースのアノマー炭素によって生じる窒素含有塩基が、βヌクレオシドの場合のように平面より上にある代わりに、平面の下に位置するものを意味することを意図する。好ましくは、αヌクレオチドは、出願ＷＯ８８／０４３０１に記載されているものである。
【００３８】
「末端」なる用語は、最初または最後のヌクレオシドによって生じるフリーな水酸基によってもたらされる数、すなわち３’または５’によって、一般に定義されるオリゴヌクレオチドの合成の開始点または終止点を意味することを意図する。伸長単位（α−またはβ−ヌクレオシドホスホラミダイト）の適切な選択によって、オリゴヌクレオチドは、３’から５’方向またはその逆で合成でき、または合成の間、伸長の方向は交替しさえすることができると理解される。これは、３’−５’、５’−３’または３’−３’、５’−５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生じる。
【００３９】
「第１セグメント」なる用語は、前記第３セグメントが存在する場合には、それに相補的であり、且つ適した極性を有するヌクレオチド配列であってもよいことを意味することを意図する。
【００４０】
「第２セグメント」なる用語は、標的の配列に相補的であり、且つ適した極性を有するヌクレオチド配列を意味することを意図する。
【００４１】
「第３セグメント」なる用語は、前記第１セグメントに相補的であり、且つ適した極性を有するヌクレオチド配列を意味することを意図する。
【００４２】
また、「ステム」部分なる用語は、前記第１及び第３セグメントのために使われ、また「ループ」部分なる用語は前記第２セグメントのために使われる。この特別な実施形態により、分子ビーコン型の標識化オリゴヌクレオチドを得ることが可能となる。
【００４３】
「他の配列／領域、または相補配列にハイブリダイズ可能な配列または領域」なる表現は、公知の方法でケース毎に決定することができるハイブリダイゼーション条件下で、他の配列／領域にハイブリダイズすることができる配列または領域を意味することを意図する。また、相補配列／領域も参照されたい。他と厳密に相補的である配列または領域は、各々の塩基が、ミスマッチなしに他の配列の塩基と対になることができる配列である。 「ハイブリダイゼーション」なる用語は、適切な条件下で、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチド断片が安定且つ特異的な水素結合により二本鎖を形成することができる間のプロセスを意味することを意図する。ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェンシー、すなわち操作条件の厳密性によって決定される。ハイブリダイゼーションが行われるストリンジェンシーが高ければ高いほど、特異性が高い。ストリンジェンシーは、特に、プローブ／標的二本鎖の塩基組成の関数として、更に、２つの核酸間のミスマッチの程度によって定められる。また、ストリンジェンシーは、反応パラメータ、例えばハイブリダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度と種類、変性剤の性質と濃度及び／またはハイブリダイゼーション温度に依存してもよい。ハイブリダイゼーション反応が行われるべき条件のストリンジェンシーは使用するハイブリダイゼーションプローブに主に依存するであろう。これら全てのデータは周知であり、適切な条件は当業者によって決定されうる。
【００４４】
「極性」なる用語は、その相補配列に対するヌクレオチド配列の配向、５’から３’又は３’から５’を意味することを意図する。従って、セグメントは以下のような配向であってもよい：
アンチパラレル様式：これは天然β配置のオリゴヌクレオチドとその標的の天然β配置のオリゴヌクレオチドの場合であり、または非天然α配置のオリゴヌクレオチドとその標的の非天然α配置のオリゴヌクレオチドの場合である；
パラレル様式：これは、非天然α配置のオリゴヌクレオチドとその標的の天然β配置ののオリゴヌクレオチドの場合である。これらの極性ルールによれば、５’−３’、３’−３’または５’−５’オリゴヌクレオチドを得ることは可能であり、それは適切な分子から当業者によって合成される。
【００４５】
「ポリメラーゼ酵素」なる用語は、核酸テンプレートから相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を合成すること、及び開始オリゴヌクレオチド（またはプライマー）を使用することができる酵素を意味することを意図する。ポリメラーゼ酵素は時々ヌクレアーゼ活性を有し、複製される標的にハイブリダイズする核酸フラグメントの分解を生じる：従って、記録されるシグナルが、酵素的分解でなく分子認識だけに起因するという理由から、この活性を遮断することはリアルタイム方法において非常に関連性がある。
【００４６】
本発明のために、「核酸物質」なる用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列のような核酸配列を意味することを意図する。本発明の好ましい一実施形態によれば、核酸物質はデオキシリボ核酸配列を含む。本発明の好ましい一実施形態によれば、核酸物質は、患者から採取される生物試料から抽出される。
【００４７】
本発明の目的のために、「生物試料」なる用語は、後述するような核酸物質を含有しうる任意の試料を意味することを意図する。この生物試料は患者から採取されてもよく、特に患者の組織試料、血液試料、血清試料、唾液試料又は循環細胞試料であってもよい。また、この試料は食物試料であってもよい。この生物試料は、当業者に公知のいずれかの方法で採取することによって用意される。
本発明の目的のために、「標的配列」なる用語は、ヌクレオチド単位の連続の少なくとも一部分が、使用する検出プローブのヌクレオチド配列に特異的且つ相補的であるヌクレオチド配列を意味することを意図する。
【００４８】
本発明の目的のために、工程ａ）の間、核酸物質は、当業者に公知のいずれかのプロトコルによって生物試料から抽出される。目安として、核酸抽出は、タンパク質及び／又は細胞の脂質外被（例えば、後の反応を妨げる細胞細片）に含まれる核酸を放出するために、生物試料中に存在する細胞の溶解の工程によって行われうる。例として、混合磁気性及び物理的な細胞溶解については特許出願ＷＯ００／０５３３８、電気的細胞溶解についてはＷＯ９９／５３３０４、そして物理的な細胞溶解についてはＷＯ９９／１５３２１に記載されるように細胞溶解法を用いてもよい。
【００４９】
当業者は、他の周知の細胞溶解法、例えばヒートショック又は浸透圧ショック、又はグアニジニウム塩（米国特許第５２３４８０９号）などのカオトロピック剤を用いる化学的細胞溶解を用いてもよい。また、細胞溶解工程で放出される他の細胞性成分から核酸を分離するために、この細胞溶解の後に精製工程が続いてもよい。この工程は一般に、核酸を濃縮することを可能にし、ＤＮＡ又はＲＮＡの精製に適したものである。例として、吸着又は共有原子価によって、オリゴヌクレオチドで任意にコートされた磁性粒子を使用すること（これについては、米国特許第４６７２０４０号及び米国特許第５７５０３３８号を参照）、及びこれによってこれら磁性粒子に結合している核酸を洗浄工程によって精製することが可能である。前記核酸を続いて増幅することが求められる場合には、この核酸精製工程は特に有利である。これらの磁性粒子の特に有利な実施形態は、特許出願ＷＯ９７／４５２０２及びＷＯ９９／３５５００に記述される。核酸精製方法の他の有利な例は、シリカの使用であり、カラムの形態又は不活性粒子（Boom R. 等, J. Clin. Microbiol., 1990, No.28(3), p. 495-503）又は磁性粒子（Ｍｅｒｃｋ：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標） Ｓｉｌｉｃａ， Ｐｒｏｍｅｇａ：ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の形態のものである。他の非常に広く用いられる方法は、カラム又は常磁性粒子フォーマットでのイオン交換樹脂をベースにしたものである（Ｗｈａｔｍａｎ：ＤＥＡＥ−Ａｇａｒｏｓｅ） （Levison PR等, J. Chromatography, 1998, p. 337-344）。本発明の更に非常に関係があるが唯一でない方法は、金属酸化物支持体（Ｘｔｒａｎａ社：Ｘｔｒａ−ＢｉｎｄＴＭ ｍａｔｒｉｘ）上へ吸着させる方法である。
【００５０】
生物試料からＤＮＡを特異的に抽出することが求められる場合には、タンパク質を除去するために、フェノール、クロロフォルム及びアルコールによる抽出を実施することが可能であり、７０％アルコールでＤＮＡを沈殿させることができる。次いで、ＤＮＡは、遠心によってペレットにし、洗浄して、再懸濁してもよい。
【００５１】
本発明の目的のために、「工程ｂ）」は、少なくとも一つのポリメラーゼ酵素の作用による核酸配列の複数のコピー（またはアンプリコン）を生成する方法である。本発明の目的のために、「アンプリコン」なる用語は、酵素増幅反応の間に得られる標的配列のコピーを意味することを意図する。
【００５２】
本発明の好ましい一実施形態によれば、核酸物質はＰＣＲによって増幅され、工程ｂ）は、以下の工程を含むサイクルの連続である：
・２つの相補的なＤＮＡ標的鎖を得るための、又はＲＮＡ標的鎖を分解するための、標的配列の変性、
・少なくとも一つの増幅プライマーと、前述の変性工程の間に得られた各々の標的鎖とのハイブリダイゼーション、
・ポリメラーゼ酵素及びヌクレオシド三リン酸の存在下で、増幅プライマーがハイブリダイズした鎖に相補的な鎖の、増幅プライマーからの形成。
このサイクルは、検出できるために十分な濃度の標的配列を得るために、所定の回数が繰り返される。
【００５３】
この実施形態によれば、工程ｂ）及びｃ）は同時に又は一方の後にもう一方が実施される。
【００５４】
工程ｂ）及びｃ）が同時に行われる場合に、この実施形態は、ＰＣＲ増幅技術と検出が単一工程に組み合わさっており、特に分子ビーコンを使用する「リアルタイムＰＣＲ」によって実行されるのが好ましい。ＰＣＲ反応はチューブ内で生じ、特定の「分子ビーコン」がハイブリダイズして蛍光シグナルを発するアンプリコンを生成する。新規ＤＮＡ分子の形成は、ハイブリダイゼーション工程の間、蛍光読取り機にてシグナルを検査することによって、リアルタイムに測定される。本発明による標識オリゴヌクレオチドの使用により、検出プローブが増幅酵素（例えばＴａｑポリメラーゼ）によって分解されるのを防ぐことができ、これによって、検出の感度が上がり、技術の有効性が向上する。
【００５５】
工程ｂ）及びｃ）が一方の後にもう一方が実施される場合、ＰＣＲ反応がチューブ内で生じ、アンプリコンを生成する。この増幅工程の終わりに、分子ビーコンは反応媒体に添加されて、蛍光シグナルを発するためにハイブリダイズしうる。本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの使用により、反応チューブ中に残留的に残る耐熱性ポリメラーゼ増幅酵素によって、検出プローブが分解されるのを防ぎ、これによって検出の感度が上がり、技術の有効性を向上させることが可能となる。
【００５６】
他の本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｂ）の間、核酸物質はＮＡＳＢＡによって増幅される。
【００５７】
この実施形態によれば、工程ｂ）とｃ）は、好ましくは一方の後にもう一方が実行される。増幅工程の終わりに分子ビーコンは反応媒体に添加され、蛍光シグナルを発するためにハイブリダイズしうる。本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの使用により、反応チューブ中に残留的に残るＲＮＡｓｅＨ酵素によって、検出プローブが分解されることを防ぎ、これによって検出の感度が上がり、技術の有効性を向上させることが可能となる。
【００５８】
「工程ｄ）」は、本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドのアンプリコンへのハイブリダイゼーションの間、放たれる蛍光シグナルを検出することによって行われ、当業者に公知の任意のプロトコルによって実施されうる。
【００５９】
添付図は、例示として示すものであって、決して実質的に制限するものではない。これらによって、本発明の理解がより明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実施例１Ａに記載のように、第１セグメント、αヌクレオシド（陰影部）と合成されている第３セグメント（ステム）、及びβヌクレオシドと合成されている第２セグメント（ループ）を含んで成る、本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの例を示す。
【図２】実施例１Ｂに記載のように、第１セグメント、βヌクレオシドと合成されている第３セグメント（ステム）、及びαヌクレオシド（陰影部）と合成されている第２セグメント（ループ）を含んで成る、本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの例を示す。
【図３】実施例１Ｃに記載のように、第１セグメントと第３セグメント（ステム）、またαヌクレオシド（陰影部）と合成されている第２セグメント（ループ）を含んで成る、本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの例を示す。
【図４】実施例２Ａに記載のように、４０℃で測定した、修飾又は非修飾の分子ビーコンの正規化蛍光プロファイルを示す。
【図５】実施例２Ａに記載のように、９５℃で測定した、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで増幅中の「オリゴヌクレオチドＡ」と「ＭＢ」分子ビーコンの正規化蛍光プロファイルを示す。
【図６】実施例２Ａに記載のように、９５℃で測定した、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで増幅中の「オリゴヌクレオチドＢ」と「ＭＢ」分子ビーコンの正規化蛍光プロファイルを示す。
【図７】実施例２Ａに記載のように、９５℃で測定した、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで増幅中の「オリゴヌクレオチドＣ」と「ＭＢ」分子ビーコンの正規化蛍光プロファイルを示す。
【図８】実施例３に記載のように、ミスマッチを有するか又は有しない様々な相補的配列によって解析したプローブの蛍光の測定による熱変性プロファイルを示す。
【図９】実施例４に記載のように、ステムの一部に相補的であるか又は相補的でない標的によって解析したプローブの蛍光の測定による熱変性プロファイルを示す。
【００６１】
以下の実施例は、例示として示すものであって、決して実質的に制限するものではない。これらによって、本発明の理解がより明確になるであろう。
【実施例】
【００６２】
実施例１：本発明に係るオリゴヌクレオチドの合成方法
（開始材料）
３’にホスホラミダイト基を有する天然ヌクレオチドは、３’β-アミダイトと呼ばれている。これらのオリゴヌクレオチドは市販されており、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， 米国）から購入した。
５’にホスホラミダイト基を有する天然ヌクレオチドは、５’β-アミダイトと呼ばれており、またこれらのオリゴヌクレオチドも市販されており、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， 米国）から購入した。
３’にホスホラミダイト基を有するαアノマーヌクレオチドは、３’α-アミダイトと呼ばれており、これらは市販されており、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ社 （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， 米国）から購入した。
ＣＰＧダブシル（制御ポアガラス、ＣＰＧ）と６−フルオレセイン・ホスホラミダイトは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， 米国）により販売されている。
【００６３】
表１
【００６４】
（オリゴヌクレオチド合成）
３’β-アミダイト、５’β-アミダイト及び３’α-アミダイトをオリゴヌクレオチド合成のために使用した。前記アミダイトの反応性が非常に類似するためである。好適に、ＣＰＧダブシルと６−フルオレセイン・ホスホラミダイトを使用した。ホスホラミダイト合成方法は、ＢｅａｕｃａｇｅとＬｙｅｒ（Tetrahedron, 48, 223-2311, 1992）に記載されている。
一般に、合成される配列の第１のヌクレオシドは、３’位（または５’）において固体支持体（ＣＰＧ）に取り付けられ、ヌクレオシドの５’ＯＨ（又は３’）末端は酸に不安定なジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基によって保護される。
− 第１の脱トリチル工程において、酸処理（トリ−またはジクロロ酢酸）により、反応性ＯＨ末端を生成するためにＤＭＴ基を除去された。
− 第２のカップリング工程において、付加される塩基のホスホラミダイトは、亜リン酸トリエステル結合を生じさせるために、この第１の伸長サイトで、（５’又は３’において）縮合される。縮合は、触媒（テトラゾールまたはＳ−チオエチルテトラゾール、またはＤＣＩ等）の存在下で実施した。
− 第３のキャッピング工程において、前の縮合工程において反応しなかった−ＯＨ基は、配列の欠失を妨げるために、アシル化反応剤（無水酢酸）によってブロックされる。
− 第４の酸化工程において、亜リン酸トリエステル結合は、酸化剤（水溶性ヨウ素）を使用して、リン酸トリエステル結合に酸化した。また、亜リン酸トリエステル結合は、ホスホロチオネートにトリエステル結合を生じさせるために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬のアセトニトリル溶液によって酸化することができる。
工程１から４は、合成される配列の長さに応じ必要なだけ多くの回数を繰り返した。
【００６５】
所望の配列が終わるときに、オリゴヌクレオチドを支えている固体支持体をアンモニアの濃縮水溶液においてインキュベートした。これは、支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基とリン酸基を脱保護するためである。
このように得られた粗オリゴヌクレオチドは、２６０ｎｍ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でアッセイする前に、アセトンと過塩素酸ナトリウムの溶液により沈澱させた。次に、５０ｎｍｏｌｅの粗オリゴヌクレオチドを、Ｘｔｅｒｒａ Ｃ８ ４．６ｘ１５０ ３．５μｍカラムにおいて、アセトニトリル／ＴＥＡＡｃの勾配により、単一工程で精製した。最も純粋な分画は、ｐＨ１２のＮａＣｌの勾配で、Ｇｅｎ Ｐａｃｋ Ｆａｘカラム（Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ， ＷＡＴＥＲＳ）上のイオン交換クロマトグラフィ−によって確認した。
分画をまとめて、蒸発させ、そして混合物は使用前にＨＰＬＣで再アッセイ及び再分析した。
【００６６】
（１Ａ−αホスホラミダイトを含むオリゴヌクレオチドの前記第１及び第３セグメント（ステム部分）による本発明の第１実施形態（図１））
βアノマー配置に第２セグメントまたはループを、αアノマー配置（第１及び第３セグメント）にステムを含み、アンチパラレルα／α二本鎖を形成する、オリゴヌクレオチドを使用した（オリゴヌクレオチドＡ）。この第１の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドの合成は、ダブシル基（図１、矢印を参照）を含む末端から開始された。次にループはβ-アミダイトによって合成され、次に第３セグメントはα-アミダイトから合成された。
【００６７】
（１Ｂ−αホスホラミダイトを含むオリゴヌクレオチドの前記第２セグメント（「ループ」部分）による本発明の第２実施形態（図２））
前述の実施形態と比較して、この場合は、開始オリゴヌクレオチドは、標的（オリゴヌクレオチドＢ）とパラレル様式にハイブリダイズするαヌクレオチドを含んでいる第２セグメント（ループ）を含む。第１と第３セグメント（ステム部分）は、βヌクレオチドを含む。合成はβアミダイトから開始され、次に、残りのステムの合成のためにβアミダイトに戻る前に、ループがαアミダイトと合成される（図２、矢印を参照）。
【００６８】
（１Ｃ−αホスホラミダイトを含むオリゴヌクレオチドの前記第１、第２及び第３セグメント（「ステム」及び「ループ」部分）による本発明の第３実施形態）
前述の実施形態と比較して、この場合は、開始オリゴヌクレオチドは、αヌクレオシド（ループ及びステム）により完全に修飾される。ループのαヌクレオチドは標的にパラレル様式でハイブリダイズし、一方でステムのそれらはアンチパラレル様式で互いにハイブリダイズする（オリゴヌクレオチドＣ）。
合成は、αアミダイトにより開始し終了する（図３）。
【００６９】
実施例２：Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性による切断に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの抵抗性の研究
この実験の目的は、本発明に係る修飾オリゴヌクレオチド（実施例１のオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ及びＣ）がインビトロの酵素増幅反応においてＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されないことを証明することである。
【００７０】
（実験計画）
標的配列は、ｈＭＰＶウイルスの遺伝子配列に対応する１．２Ｋｂのインサートを含むｐＣＩＴＥプラスミドで、濃度はチューブに付き５・１０３コピーの濃度であった。
使用したプライマーとプローブは以下であった：
・センスプライマー：
５’− ＣＡＴ ＡＴＡ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＴＡ ＴＡＴ ＴＡＡ ＡＡＧ ＡＧＴ ＣＴＣ −３’（配列番号１）
・リバースプライマー：
５’− ＣＣＴ ＡＴＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ＴＣＡ Ｇ −３’（配列番号２）
・本発明の第１実施形態に係る修飾プローブ（オリゴヌクレオチドＡ）：
５’− ＦＡＭ−［ＧＣ ＴＡＣ］ ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＴＧＣＡ ［ＧＴＡ ＧＣ］−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号３）
角括弧の間のヌクレオチド配列は第１及び第３「ステム」セグメントに対応し、αアノマーヌクレオチドから成る。特に下線を施したβアノマー「ループ」配列は、インビトロ増幅において生成されるアンプリコンの配列を特異的に認識した。ＦＡＭはフルオレセイン型フルオロフォアであり、その蛍光は５３０ｎｍで検出できる。Ｄａｂｃｙｌは芳香族分子であり、物理的にＦＡＭフルオロフォアに近接してあるときに、それは蛍光の放出を妨げる。
・本発明の第２実施形態に係る修飾プローブ（オリゴヌクレオチドＢ）：
５’−ＦＡＭ−ＧＣ ＴＡＣ［ＡＣＧＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＡＣ］ ＧＴＡ ＧＣ−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号４）
角括弧の間のヌクレオチド配列は第２「ループ」セグメントに対応し、αアノマーヌクレオチドから成り、インビトロ増幅において生成されるアンプリコンの配列を特異的に認識した。
・本発明の第３実施形態に係る修飾プローブ（オリゴヌクレオチドＣ）：
５’−ＦＡＭ−［ＧＣ ＴＡＣ ＡＣＧＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＴＡ ＧＣ］−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号５）
角括弧の間のヌクレオチド配列は第１、第２及び第３セグメントに対応し、αアノマーヌクレオチドから成る。下線を施した配列は、第２「ループ」セグメントに対応し、特にインビトロ増幅において生成されるアンプリコンの配列を特異的に認識した。
・非修飾コントロールプローブ（ＭＢ）：
５’− ＦＡＭ−ＧＣ ＴＡＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＴＧＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号６）
この配列はβアノマーであり、特にインビトロ増幅において生成されるアンプリコンの配列を特異的に認識した。
【００７１】
（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでのリアルタイム検出を伴うＰＣＲ増幅：）
「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ マスター ハイブリダイゼーション プローブ」増幅キット（ロシュ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ）を用いた。反応混合物の調製は、供給元によって推奨される手順に従って実施した。２０μｌの反応量において、５・１０３コピーのプラスミドを、センス及びリバースプライマー（０．５μＭ）、修飾又は非修飾ヌクレオチドプローブ（１μＭ）、２μｌのキットのバイアル１（酵素ミックス）、０．８μｌのキットの２５ｍＭのＭｇＣｌ２及びキットのＰＣＲグレードの水を混合した。そして、反応混合物をキャピラリーチューブに入れ、それをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒに入れた。各増幅反応に関して、修飾プローブ（オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ又はＣ）の代わりに、非修飾プローブ（ＭＢ）でコントロールを実施した。また、各増幅反応に関して、標的プラスミドの代わりに、キットのＰＣＲグレードの水を添加して、コントロールを実施した（ネガティブコントロール、「ｃ-」）。
【００７２】
ＰＣＲ反応は、９５℃で８分の最初の変性に続いて、９５℃３０秒間、４０℃５秒間及び６０℃６０秒間の４０サイクルから構成された。各サイクルの各ステップの終了時に、蛍光は５３０ｎｍで読んだ。そして、蛍光の結果は、温度によって結果を分けるためにエクセルシート上に再加工し、それらを正規化し、グラフ表現を作成した。４０℃と６０℃における測定値で得たグラフは、増幅反応の間のアンプリコンとプローブとのハイブリダイゼーションを確認することに役立った。一方で、９５℃において、ハイブリダイゼーションは、プローブとアンプリコンの間で可能でなかった。ネガティブコントロールと比較して、９５℃におけるシグナルのいかなる増加は、プローブの切断によるものだけがありえる。従って、９５℃における測定値で得たグラフは、プローブがＴａｑＰｏｌの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されたか否かを証明することに役立った。
【００７３】
（結果）
４０℃におけるリアルタイム検出で得られたプロファイルを図６に示す。横軸は増幅サイクルの数を表し、縦軸は５３０ｎｍで検出された蛍光を表し、各サイクルの４０℃におけるものである。左上は「ＭＢ」；右上は「オリゴヌクレオチドＡ」；左下は「オリゴヌクレオチドＢ」；右下は「オリゴヌクレオチドＣ」である。各グラフに、対応するネガティブコントロールを示す。
【００７４】
９５℃におけるリアルタイム検出で得られたプロファイルを、図６から８に示す。各図で、修飾分子ビーコンの一つに対応するプロファイルを示し、コントロールとして、非修飾分子ビーコンのプロファイル及びネガティブサンプルに対応するプロファイルを伴に示す。
【００７５】
ハイブリダイゼーションの場合に期待される結果は、アンプリコンの数が増加する時から開始する４０℃における蛍光シグナルの指数関数的な増加である。切断が起きた場合には、９５℃での蛍光の指数関数的な増加が、ハイブリダイゼーションにより観察されるものと平行して、期待される。シグナルの線形増加または減少は、アンプリコンのいかなる検出にも対応しないが、これは後者は指数的に生じる故である。
【００７６】
４０℃のプロファイルは、修飾ヌクレオチドプローブＡ、Ｂ及びＣ、更に非修飾コントロールＭＢが特にインビトロ酵素増幅反応に由来するアンプリコンの存在を検出することを実証した。
【００７７】
９５℃のプロファイルは、ＭＢとＡプローブが増幅反応の間、特に切断されるが、一方で修飾プローブＢとＣは同じ条件下で切断されないことを実証した。
【００７８】
図５から７は、非修飾プローブ「ＭＢ」と、それぞれ修飾プローブ「オリゴヌクレオチドＡ」、「オリゴヌクレオチドＢ」及び「オリゴヌクレオチドＣ」の９５℃における蛍光の増加の比較を示す。増幅が起きた時に、蛍光の特異的な増加は、ＭＢプローブと「オリゴヌクレオチドＡ」プローブにだけ、観察することができた。増幅が起こらない時（ネガティブコントロール、「ｃ-」）及びヌクレオチドプローブの第２「ループ」セグメントが修飾された時（オリゴヌクレオチドＢとＣ）、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断がなく、従って、ネガティブコントロールと比較して蛍光に増加がない。
【００７９】
（結論）
本発明に係る第２「ループ」セグメントにおいて修飾された分子ビーコン（オリゴヌクレオチドＢとＣ）はLｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒにおけるサイクリングに由来するアンプリコンと特にハイブリダイズし、非修飾分子ビーコン「ＭＢ」によって及びステムにおいて修飾された分子ビーコン（オリゴヌクレオチドＡ）によって得られたものと同等のリアルタイム検出を引き起こした。コントロール分子ビーコン「Ｍｂ」及びステムにおいて修飾された分子ビーコン（「オリゴヌクレオチドＡ」）とは異なり、ループにおいて修飾された分子ビーコンは、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されなかった。
【００８０】
実施例３：本発明のオリゴヌクレオチドのその標的配列に対するハイブリダイゼーションの特異性の研究（図８）
（目的）
実験の目的は、α型ヌクレオチドを含むビーコンが、β型ヌクレオチドだけから構成されたビーコンより、その標的に対しより特異的であるか否かを検証することである。
特異性は、その完全に補完的な標的を有する溶液中のプローブとその配列にヌクレオチド変異（この場合はミスマッチ）を含む標的を有する溶液中のプローブ間のＴｍ（本願明細書ではΔＴｍ）の差を算出することで測定することができる。ΔＴｍは、分析される各プローブ対し及び各相補配列に対し算出される。
我々の場合は、特異性は、オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ及びＣプローブ、及び４つの相補配列であって１つはプローブの第２セグメントに完全に相補的であり他の３つは完全な相補配列に比較して１つのＣ、ＴまたはＡのミスマッチを含むものによって算出されるΔＴｍの値によって測定される。
【００８１】
（実験計画）
使用するプローブと相補配列の配列を下記の表１に記載する。
プローブを含む溶液の蛍光は、完全に相補的な標的またはミスマッチを有する標的の存在下で、ＥａｓｙＱ ｔｈｅｒｍｏａｎａｌｙｚｅｒ分光蛍光計（ビオメリューｂｖ、Ｂｏｘｔｅｌ、ＮＬ）で、６９と２７℃の間の温度の関数として、測定された。全ての測定は、Ｎａｓｂａ基本キット（ビオメリューｂｖ、Ｂｏｘｔｅｌ、ＮＬ）の緩衝水溶液において、１００ｎＭのプローブ濃度で、及び１μＭの標的濃度で、２０μＬの容量を有する溶液に実行された。
【００８２】
表１
表１：使用するプローブと相補配列の配列。ボールドイタリック体：αヌクレオチド；下線：ミスマッチ。全ての配列は、５’−３’方向に記載されている。
【００８３】
（結果）
得られた熱変性プロファイルは、図８に示す。Ｔｍは、各プロファイルの一次微分係数の最大に対応する。得られたＴｍ値を、下記の表２に示す。
表２
表２：相補配列Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＡとさまざまなプローブのＴｍ。括弧内は、完全に相補的な配列「ＣｏｍｐＧ」と他のミスマッチを含んでいる相補配列の間のΔＴｍの値。
【００８４】
オリゴヌクレオチドＡプローブの場合は、表２のΔＴｍ値はＭＢプローブより良好な特異性、＋２℃程度、を示す。図１４に見られるように、オリゴヌクレオチドＡプローブの場合、両方の場合において相補配列がβ型であるならば、特異性のこの増加は、確実に、ステム（第１と第３の相補的セグメント）のハイブリダイゼーションより大きな安定性による。
【００８５】
オリゴヌクレオチドＢ及びＣプローブの場合、使用した温度範囲においてハイブリダイゼーションが十分でなかったので、ミスマッチを含む相補配列によるＴｍ値は得ることができなかった。これは、非常に高い特異性を示しており、図８の熱変性プロファイルにおいて確認することができる。完全に相補的な配列「ｃｏｍｐＧ」だけがこれらのプローブとハイブリダイズし、その一方でミスマッチを含んでいる相補配列はハイブリダイズしないことが、これらのプロファイルにおいてわかる。オリゴヌクレオチドＡプローブによって得られた結果と比較して、これらの結果は、α型配列のハイブリダイゼーションによる特異性の増加が、オリゴヌクレオチドＢプローブではβ型でありオリゴヌクレオチドＣプローブではα型であるステムの性質から独立していることを示す。
【００８６】
（結論）
結果は、４つの修飾プローブが非修飾ＭＢプローブより高い特異性を有することを示す（表２）。我々の場合では、特異性におけるこの増加は、ステム（第１及び第３の相補的セグメント）の性質から独立である。
【００８７】
実施例４：標的配列と分子ビーコン型核酸プローブのステムとのハイブリダイゼーションの研究
（目的）
分子ビーコン型核酸プローブがその相補的標的配列とハイブリダイズするときに、また、プローブのステムが、５’側と３’側の両方において、標的とハイブリダイズできることもありうる。これは、ハイブリダイゼーションの安定性の思いがけない増大と、それゆえにプローブの特異性の減失を生じうる。本明細書に記載の実施例は、分子ビーコン型核酸プローブにおいてα−とβヌクレオチドの組合わせが、ステムの相補的標的とのハイブリダイゼーションを妨げることによってこの問題を回避することを可能にすることを示すことに役立つ。
【００８８】
（実験計画）
使用したプローブの配列は実施例３と同じであり、上の表１に記載されている。使用した相補配列を、下記の表３に記載する。
表３
表３：使用した相補的標的オリゴヌクレオチドの配列。ボールド体はプローブのループと相補的な配列である。
【００８９】
相補配列は、プローブのループに相補的な３’側の一部、且つプローブのステムの一方に、「ｃｏｍｐ＋」の場合は相補的であり、あるいは「ｃｏｍｐ−」の場合は相補的でない、５’側の一部を含む。
【００９０】
プローブの及び標的のさまざまな組合わせを含む溶液の蛍光は、ＥａｓｙＱ ｔｈｅｒｍｏａｎａｌｙｚｅｒ分光蛍光計（ビオメリューｂｖ、Ｂｏｘｔｅｌ、ＮＬ）で、６９と２７℃の間の温度の関数として測定された。全ての計測は、Ｎａｓｂａ基本キット（ビオメリューｂｖ、Ｂｏｘｔｅｌ、ＮＬ）の緩衝水溶液において、１００ｎＭのプローブ濃度で、及び１μＭの標的濃度で、２０μＬの容量を有する溶液に実行された。
【００９１】
（結果）
得られた熱変性プロファイルを、図９に示す。Ｔｍは、各プロファイルの一次微分係数の最大に対応する。得られたＴｍ値は、下記の表４に示す。
表４
表４：ｃｏｍｐ＋及びｃｏｍｐ−相補的標的とのさまざまなプローブのＴｍ
【００９２】
ループがβ型であるプローブは、ここで使用するもののように必然的にβ型の天然標的配列にアンチパラレル配向でハイブリダイズするであろう。ループがα型であるプローブは、同じβ標的配列にパラレル配向でハイブリダイズするであろう。その結果、ループの性質に従って、ステムは、ループのハイブリダイゼーションによって決定される配向で、標的の配列の反対側にそれ自体が見られる。従って、プローブのαステムは天然のβ標的にハイブリダイズすることができるのは、後者が相補的な（ｃｏｍｐ＋）場合とプローブのループもまた、α（パラレル配向）である場合のみである。同様に、プローブのβステムは天然のβ標的にハイブリダイズすることができるのは、後者が相補的な（ｃｏｍｐ＋）場合とプローブのループもまた、β（アンチパラレル配向）である場合のみである。これは、ＭＢとオリゴヌクレオチドＣプローブのステムはｃｏｍｐ＋の相補配列とハイブリダイズすることができるが、ｃｏｍｐ−の非相補配列とハイブリダイズすることができず、表４において観察できるように、Ｔｍの違いが生じることを示唆する。オリゴヌクレオチドＡとＢプローブのステムはｃｏｍｐ＋の相補配列とも、ｃｏｍｐ−の非相補配列ともハイブリダイズすることができず、表４から分かるように、Ｔｍは２つの標的と類似している。
【００９３】
（結論）
結果は、相補性が完全なときでさえも、ステムのヌクレオチドがループのヌクレオチドとはアノマーが異なる分子ビーコン型核酸プローブ（オリゴヌクレオチドＡとＢプローブ）は、ステムと標的に存在する相補配列とのハイブリダイゼーションを妨げることを示す。ハイブリダイゼーションにおける負の効果は、観察されない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な標識化オリゴヌクレオチドに関する。本発明は、また、このようなオリゴヌクレオチドの使用、更に、このようなオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。
【０００２】
核酸及び遺伝物質に関する技術において、遺伝子、遺伝子の一部、またはヌクレオチド配列が生体、この生体の細胞抽出物、または他の生物試料に存在するかどうかを決定することがしばしば必要である。
【０００３】
核酸を検出する様々なタイプの方法は、文献に記載されている。これらの方法、特にポリヌクレオチドの検出を必要とするものは、核酸の相補鎖のペアになる特性に基づいており、一般に「核酸ハイブリダイゼーション」または単に「ハイブリダイゼーション」と呼ばれる。
【０００４】
通常、分析しなければならない生物体または疾患の特定の配列を同定した後に、試料の核酸を抽出し、興味がある配列を増幅して検出することが望ましい。多くの増幅方法と検出方法が、この目的のために開発されてきた。
【０００５】
例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、二本鎖ＤＮＡの変性、一重鎖ＤＮＡに対するプライマーのハイブリダイゼーション、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの酵素的伸長という３段階プロセスの反復に基づき、それによりオリゴヌクレオチドプライマーの標的物として動くものと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
【０００６】
増幅は、サイクルの終点（エンドポイントＰＣＲ）またはリアルタイム（リアルタイムＰＣＲ）において、増幅産物の蛍光標識の使用によって分析することができる。いくつかのリアルタイムＰＣＲ技術が存在する。それらのうちの１つは、ループ構造とフルオロフォアを配列の一末端に含みクエンチャーを他の末端に含むステムとを含んで成るヘアピン配列である「分子ビーコン」と呼ばれている特定のプローブを使用する。（Tyagi, S. 及び Kramer, FD., Nat. Biotechnol., 1996, 14, 303-308, Marras, SA.等, Genet Anal., 1999, 14, 151-156）。ハイブリダイゼーション温度より下では、これらの配列は、標的配列にハイブリダイズせず、「ヘアピン」構造をとる：５’末端と３’末端は近く、蛍光の放出がない。プローブがループ配列を介して、増幅された標的配列に対応するアンプリコンを認識しハイブリダイズした場合は、ステム構造は不安定化し末端は別々に遠くなり、クエンチャーはその役割をもはや果たさず、蛍光の放出がある。
【０００７】
しかしながら、特定の状況では、「分子ビーコン」プローブによる蛍光の放出は、増幅反応の間に存在するヌクレアーゼによる分解に従って、別々に動かされるフルオロフォアとクエンチャーによるバックグラウンド・ノイズによって、「寄生され」うる。これは特に「従来の」ＰＣＲの場合であり、Ｔａｑポリメラーゼ酵素自体が５’ヌクレアーゼ活性を有するためである。更に、リアルタイムＰＣＲの間、現れる「寄生性」蛍光放出に加えて、サイクルの終わりに熱安定性ポリメラーゼ酵素の残存による分子ビーコンの切断は、ポスト増幅エンドポイント温度勾配分析に影響を及ぼす。現在、このポスト増幅エンドポイント温度勾配分析は、単純な配列バリエーション、例えば分子ビーコンを使用するＳＮＰｓ（一塩基変異多型）を検出するために最も感度の高い方法である。
【０００８】
ＮＡＳＢＡは別の等温核酸増幅技術である。そして、それは３つの酵素（ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＮＡｓｅＨ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）の共同作用に基づく。増幅は、サイクルの終わりに（エンドポイントＮＡＳＢＡ）またはリアルタイムにおいて（リアルタイムＮＡＳＢＡ）、増幅産物の蛍光標識の使用によって、分子ビーコンプローブを使用して、分析される。しかしながら、エンドポイントでは、ＮＡＳＢＡの開始の間に不可欠な酵素であるＲＮＡｓｅＨの存在により、反応の終わりに、分子ビーコンにハイブリダイズする標的ＲＮＡの分解が誘発されうる。標的ＲＮＡの切断による蛍光シグナルの減少は、それとき観察される。従って、増幅エンドポイント温度傾度分析は、困難である。
【０００９】
また、ＰＣＲによるかまたはＮＡＳＢＡによるかに関係なく、蛍光放出はアンプリコン上の分子ビーコンのステム部分の非特異的のハイブリダイゼーションを通しても寄生されうる。従って、この寄生性ハイブリダイゼーションを減らすことは重要である。
【００１０】
また、最後に、分子ビーコンは、独立に増幅の標的配列の検出のために使用されうる。実際に、分子ビーコンの注入、標的転写産物上のプローブのハイブリダイゼーションを反映して発される蛍光によって生きた細胞の遺伝子の発現を分析することが可能である。しかしながら、細胞において活性のある多数のヌクレアーゼの存在はプローブの広範囲な分解を暗示し、そのため標的配列上のプローブのハイブリダイゼーションによらない蛍光放出が誘導される。
【００１１】
従って、特に従来技術の分子ビーコンの切断及び非特異的なハイブリダイゼーションの現象を減少させることによって、それらをより高感度にするために、現在の増幅技術を改良することは重要である。
【００１２】
本発明は、特異的で、安定で、ヌクレアーゼに耐性がある新規な標識化オリゴヌクレオチドを提供することによって、従来技術の全ての欠点を解決することを提案するものである。
【００１３】
この点で、本発明は、フルオロフォア、クエンチャー及び少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことで特徴づけられる、第１ヌクレオチドセグメント、標的配列に相補的な第２ヌクレオチドセグメント、及び前記第１ヌクレオチドセグメントに相補的な第３ヌクレオチドセグメントを含んでなる標識化オリゴヌクレオチドに関する。
【００１４】
好ましくは、前記第１と第３セグメントは、第２セグメントの両側にある。
【００１５】
好ましくは、本発明による標識化オリゴヌクレオチドは、前記第２セグメントが少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことを特徴とする。
【００１６】
好ましくは、前記第２セグメントは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５のαアノマーヌクレオシドを含む。
【００１７】
好ましくは、前記第２セグメントはαアノマーヌクレオシドから成る。
【００１８】
好ましくは、本発明による標識化オリゴヌクレオチドはフルオロフォアが前記オリゴヌクレオチドの一端にあり、クエンチャーが前記オリゴヌクレオチドの他端にあることを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、前記フルオロフォアはフルオレセインである。好ましくは、前記クエンチャーはダブシルである。
【００２０】
好ましくは、前記第１セグメントは３から８のヌクレオチドを含み、前記第２セグメントは１０から３５のヌクレオチドを含み、前記第３セグメントは、それがあるときは、３から８のヌクレオチドを含む。
【００２１】
また、本発明は、ポリメラーゼ酵素の５’ヌクレアーゼ活性をブロッキングするためのおよび／またはＲＮＡｓｅＨ活性をブロッキングするための、少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含んで成るオリゴヌクレオチドの使用にも関する。このような使用が非常に現実的であるのは、分子ビーコン型のプローブを使用して標的配列を検出することが可能であり、一方で同時にポリメラーゼ連鎖反応の間またはポスト増幅エンドポイント測定の間のポリメラーゼ酵素の５’ヌクレアーゼ活性による、または特にＮＡＳＢＡにおいてエンドポイント計測の間のＲＮＡｓｅＨのヌクレアーゼ活性による、その分解を回避するためである。
【００２２】
また、本発明は、生物試料における核酸物質の検出方法に関し、次の工程含んで成る：
ａ）核酸物質を生物試料から抽出すること、
ｂ）核酸物質の少なくとも一つの標的配列のアンプリコンを得るために核酸物質を増幅すること；
ｃ）本発明に係る少なくとも１つの標識化オリゴヌクレオチドを工程ｂ）と同時に、または工程ｂ）の後で使用すること；
ｄ）前記アンプリコンの存在を検出すること。
【００２３】
本発明の好ましい一実施形態によれば、核酸物質はＰＣＲによって増幅される。
【００２４】
本発明の好ましい別の実施形態によれば、核酸物質はＮＡＳＢＡによって増幅される。
【００２５】
以下の定義は、本発明をより明らかに理解することを可能にする。
【００２６】
本発明の目的のために、「上流」なる用語は核酸またはポリヌクレオチド配列の５’末端側にある領域を意味し、「下流」なる用語は、前記核酸のまたは前記ポリヌクレオチド領域の３’末端側にある領域を意味する。
【００２７】
「ヌクレオチド断片」、「核酸断片」、「ヌクレオチドセグメント」、「核酸セグメント」、「ヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「オリゴヌクレオチド」なる用語は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ断片、天然または合成のポリヌクレオチド、合成ＤＮＡまたはＲＮＡ断片であって非修飾であるか、または少なくとも１つの修飾された塩基、例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン、シュードウリジンまたはシュードイソシチジン、または他のいかなる修飾塩基であってハイブリダイズを可能にするものを意味する。各々の修飾は、組合わせて採用されてもよい。
【００２８】
「標識化オリゴヌクレオチド」または「プローブ」なる用語は、一連のヌクレオシドであって、更に前記オリゴヌクレオチドを検出するための少なくとも一つの分子含んで成るものを意味することを意図する。
【００２９】
このオリゴヌクレオチドは特に、分子認識によって作用する検出プローブであってもよい。「分子認識によって作用する検出プローブ」なる表現は、１０から１００のヌクレオチド単位、特に１５から４５のヌクレオチド単位の核酸配列であって、標的核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成するために所与の条件下でハイブリダイゼーション特異性を有し、且つプローブが標的の核配列にハイブリダイズした場合にシグナルを発するものを意味することを意図する。
【００３０】
ＴｙａｇｉとＫｒａｍｅｒ（Nature Biotech, 1996, 14: 303-308）によって記載されているように、検出プローブは特に分子ビーコン検出プローブであってもよい。これらの分子ビーコンは、ハイブリダイゼーションの間、蛍光性となる。それらは、ステム−ループ構造を有し、フルオロフォアとクエンチャー基を含む。特異的なループ配列の、その相補的な標的核酸配列との結合は、ステムを展開させ、適切な波長での励起の間に蛍光シグナルが放出される。
【００３１】
検出プローブは特に、「スコルピオン（登録商標）」（Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 19 3752-3761） または、「Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）」 （Genome Research Vol 1 163-169, 2001 Myakishev M.等)タイプのプライマーに組み込まれるプローブであってもよい。
【００３２】
Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）は、５’側にステム−ルート構造を有する配列であるヌクレオチド配列であって、その構造の５’末端にフルオロフォアを、他端にダブシル型クエンチャーを有する。３’側に、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（登録商標）は、標的配列に相補的で、増幅反応の間プライマーとして働く配列を有する。
【００３３】
スコルピオン（登録商標）は、５’側にステム−ループ構造を有する配列を有し、該構造の一末端にクエンチャーを、他の末端にフルオロフォアを有する配列を有する。３’側に、スコルピオン（登録商標）は、標的配列に相補的で、増幅反応の間プライマーとして働く配列を有する。従来のスコルピオン態様において、プライマー配列とステム−ループ配列の間に位置する「スペーサー」は、ポリメラーゼによるステム−ループ配列の認識を妨げることを可能にする。スコルピオンが本発明によって産生される場合、このスペーサーは任意となる。
【００３４】
本発明の目的において、「フルオロフォア」なる用語は、適切な波長（または４５０と６５０ｎｍの間）の光で励起したときに、５００と７００ｎｍの間の蛍光シグナルを発する分子を意味することを意図する。フルオロフォアは、特に、ローダミンまたはその誘導体、例えばテキサスレッド、フルオレセインまたはその誘導体、例えば５−ブロモメチルフルオレセイン、アレクサ系統のフルオロフォア、例えばアレクサ５３２、アレクサ６４７、アレクサ４０５、アレクサ７００またはアレクサ６８０、または使用する測定装置に従って適切である他のいかなるフルオロフォアであってもよい。検出プローブに利用可能なフルオロフォアは、非常に多様であり、当業者に知られている。
【００３５】
本発明の目的において、「フルオレセイン」なる用語は、４９５ｎｍ周辺の波長の光で励起したときには、５３０ｎｍ周辺の最大放出を有する蛍光シグナルを発する芳香族の化学分子を意味することを意図する。
【００３６】
本発明の目的において、「クエンチャー」なる用語は、フルオロフォアによって発される蛍光を妨げる分子を意味することを意図する。このクエンチャーは、寄生性の放出を回避するために、非蛍光性である芳香族分子から特に選択される。前記「クエンチャー」はダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）またはＤａｂｃｙｌまたは「ブラックホールクエンチャーＴＭ」であることが好ましい。ダブシル（Ｄａｂｓｙｌ）、Ｄａｂｃｙｌ及び「ブラックホールクエンチャーＴＭ」は、非蛍光性芳香族分子であって、それらが物理的にフルオロフォアに近接している場合に、またはＦＲＥＴによって、蛍光の放出を妨げる。
【００３７】
「αアノマーヌクレオシド」または「αヌクレオシド」または「ヌクレオシドα」なる用語は非天然のαアノマー構造を有するデオキシヌクレオシドであって、デオキシリボースのアノマー炭素によって生じる窒素含有塩基が、βヌクレオシドの場合のように平面より上にある代わりに、平面の下に位置するものを意味することを意図する。好ましくは、αヌクレオチドは、出願ＷＯ８８／０４３０１に記載されているものである。
【００３８】
「末端」なる用語は、最初または最後のヌクレオシドによって生じるフリーな水酸基によってもたらされる数、すなわち３’または５’によって、一般に定義されるオリゴヌクレオチドの合成の開始点または終止点を意味することを意図する。伸長単位（α−またはβ−ヌクレオシドホスホラミダイト）の適切な選択によって、オリゴヌクレオチドは、３’から５’方向またはその逆で合成でき、または合成の間、伸長の方向は交替しさえすることができると理解される。これは、３’−５’、５’−３’または３’−３’、５’−５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生じる。
【００３９】
「第１セグメント」なる用語は、前記第３セグメントが存在する場合には、それに相補的であり、且つ適した極性を有するヌクレオチド配列であってもよいことを意味することを意図する。
【００４０】
「第２セグメント」なる用語は、標的の配列に相補的であり、且つ適した極性を有するヌクレオチド配列を意味することを意図する。
【００４１】
「第３セグメント」なる用語は、前記第１セグメントに相補的であり、且つ適した極性を有するヌクレオチド配列を意味することを意図する。
【００４２】
また、「ステム」部分なる用語は、前記第１及び第３セグメントのために使われ、また「ループ」部分なる用語は前記第２セグメントのために使われる。この特別な実施形態により、分子ビーコン型の標識化オリゴヌクレオチドを得ることが可能となる。
【００４３】
「他の配列／領域、または相補配列にハイブリダイズ可能な配列または領域」なる表現は、公知の方法でケース毎に決定することができるハイブリダイゼーション条件下で、他の配列／領域にハイブリダイズすることができる配列または領域を意味することを意図する。また、相補配列／領域も参照されたい。他と厳密に相補的である配列または領域は、各々の塩基が、ミスマッチなしに他の配列の塩基と対になることができる配列である。 「ハイブリダイゼーション」なる用語は、適切な条件下で、十分に相補的な配列を有する２つのヌクレオチド断片が安定且つ特異的な水素結合により二本鎖を形成することができる間のプロセスを意味することを意図する。ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェンシー、すなわち操作条件の厳密性によって決定される。ハイブリダイゼーションが行われるストリンジェンシーが高ければ高いほど、特異性が高い。ストリンジェンシーは、特に、プローブ／標的二本鎖の塩基組成の関数として、更に、２つの核酸間のミスマッチの程度によって定められる。また、ストリンジェンシーは、反応パラメータ、例えばハイブリダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度と種類、変性剤の性質と濃度及び／またはハイブリダイゼーション温度に依存してもよい。ハイブリダイゼーション反応が行われるべき条件のストリンジェンシーは使用するハイブリダイゼーションプローブに主に依存するであろう。これら全てのデータは周知であり、適切な条件は当業者によって決定されうる。
【００４４】
「極性」なる用語は、その相補配列に対するヌクレオチド配列の配向、５’から３’又は３’から５’を意味することを意図する。従って、セグメントは以下のような配向であってもよい：
アンチパラレル様式：これは天然β配置のオリゴヌクレオチドとその標的の天然β配置のオリゴヌクレオチドの場合であり、または非天然α配置のオリゴヌクレオチドとその標的の非天然α配置のオリゴヌクレオチドの場合である；
パラレル様式：これは、非天然α配置のオリゴヌクレオチドとその標的の天然β配置ののオリゴヌクレオチドの場合である。これらの極性ルールによれば、５’−３’、３’−３’または５’−５’オリゴヌクレオチドを得ることは可能であり、それは適切な分子から当業者によって合成される。
【００４５】
「ポリメラーゼ酵素」なる用語は、核酸テンプレートから相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を合成すること、及び開始オリゴヌクレオチド（またはプライマー）を使用することができる酵素を意味することを意図する。ポリメラーゼ酵素は時々ヌクレアーゼ活性を有し、複製される標的にハイブリダイズする核酸フラグメントの分解を生じる：従って、記録されるシグナルが、酵素的分解でなく分子認識だけに起因するという理由から、この活性を遮断することはリアルタイム方法において非常に関連性がある。
【００４６】
本発明のために、「核酸物質」なる用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）配列のような核酸配列を意味することを意図する。本発明の好ましい一実施形態によれば、核酸物質はデオキシリボ核酸配列を含む。本発明の好ましい一実施形態によれば、核酸物質は、患者から採取される生物試料から抽出される。
【００４７】
本発明の目的のために、「生物試料」なる用語は、後述するような核酸物質を含有しうる任意の試料を意味することを意図する。この生物試料は患者から採取されてもよく、特に患者の組織試料、血液試料、血清試料、唾液試料又は循環細胞試料であってもよい。また、この試料は食物試料であってもよい。この生物試料は、当業者に公知のいずれかの方法で採取することによって用意される。
本発明の目的のために、「標的配列」なる用語は、ヌクレオチド単位の連続の少なくとも一部分が、使用する検出プローブのヌクレオチド配列に特異的且つ相補的であるヌクレオチド配列を意味することを意図する。
【００４８】
本発明の目的のために、工程ａ）の間、核酸物質は、当業者に公知のいずれかのプロトコルによって生物試料から抽出される。目安として、核酸抽出は、タンパク質及び／又は細胞の脂質外被（例えば、後の反応を妨げる細胞細片）に含まれる核酸を放出するために、生物試料中に存在する細胞の溶解の工程によって行われうる。例として、混合磁気性及び物理的な細胞溶解については特許出願ＷＯ００／０５３３８、電気的細胞溶解についてはＷＯ９９／５３３０４、そして物理的な細胞溶解についてはＷＯ９９／１５３２１に記載されるように細胞溶解法を用いてもよい。
【００４９】
当業者は、他の周知の細胞溶解法、例えばヒートショック又は浸透圧ショック、又はグアニジニウム塩（米国特許第５２３４８０９号）などのカオトロピック剤を用いる化学的細胞溶解を用いてもよい。また、細胞溶解工程で放出される他の細胞性成分から核酸を分離するために、この細胞溶解の後に精製工程が続いてもよい。この工程は一般に、核酸を濃縮することを可能にし、ＤＮＡ又はＲＮＡの精製に適したものである。例として、吸着又は共有原子価によって、オリゴヌクレオチドで任意にコートされた磁性粒子を使用すること（これについては、米国特許第４６７２０４０号及び米国特許第５７５０３３８号を参照）、及びこれによってこれら磁性粒子に結合している核酸を洗浄工程によって精製することが可能である。前記核酸を続いて増幅することが求められる場合には、この核酸精製工程は特に有利である。これらの磁性粒子の特に有利な実施形態は、特許出願ＷＯ９７／４５２０２及びＷＯ９９／３５５００に記述される。核酸精製方法の他の有利な例は、シリカの使用であり、カラムの形態又は不活性粒子（Boom R. 等, J. Clin. Microbiol., 1990, No.28(3), p. 495-503）又は磁性粒子（Ｍｅｒｃｋ：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標） Ｓｉｌｉｃａ， Ｐｒｏｍｅｇａ：ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の形態のものである。他の非常に広く用いられる方法は、カラム又は常磁性粒子フォーマットでのイオン交換樹脂をベースにしたものである（Ｗｈａｔｍａｎ：ＤＥＡＥ−Ａｇａｒｏｓｅ） （Levison PR等, J. Chromatography, 1998, p. 337-344）。本発明の更に非常に関係があるが唯一でない方法は、金属酸化物支持体（Ｘｔｒａｎａ社：Ｘｔｒａ−ＢｉｎｄＴＭ ｍａｔｒｉｘ）上へ吸着させる方法である。
【００５０】
生物試料からＤＮＡを特異的に抽出することが求められる場合には、タンパク質を除去するために、フェノール、クロロフォルム及びアルコールによる抽出を実施することが可能であり、７０％アルコールでＤＮＡを沈殿させることができる。次いで、ＤＮＡは、遠心によってペレットにし、洗浄して、再懸濁してもよい。
【００５１】
本発明の目的のために、「工程ｂ）」は、少なくとも一つのポリメラーゼ酵素の作用による核酸配列の複数のコピー（またはアンプリコン）を生成する方法である。本発明の目的のために、「アンプリコン」なる用語は、酵素増幅反応の間に得られる標的配列のコピーを意味することを意図する。
【００５２】
本発明の好ましい一実施形態によれば、核酸物質はＰＣＲによって増幅され、工程ｂ）は、以下の工程を含むサイクルの連続である：
・２つの相補的なＤＮＡ標的鎖を得るための、又はＲＮＡ標的鎖を分解するための、標的配列の変性、
・少なくとも一つの増幅プライマーと、前述の変性工程の間に得られた各々の標的鎖とのハイブリダイゼーション、
・ポリメラーゼ酵素及びヌクレオシド三リン酸の存在下で、増幅プライマーがハイブリダイズした鎖に相補的な鎖の、増幅プライマーからの形成。
このサイクルは、検出できるために十分な濃度の標的配列を得るために、所定の回数が繰り返される。
【００５３】
この実施形態によれば、工程ｂ）及びｃ）は同時に又は一方の後にもう一方が実施される。
【００５４】
工程ｂ）及びｃ）が同時に行われる場合に、この実施形態は、ＰＣＲ増幅技術と検出が単一工程に組み合わさっており、特に分子ビーコンを使用する「リアルタイムＰＣＲ」によって実行されるのが好ましい。ＰＣＲ反応はチューブ内で生じ、特定の「分子ビーコン」がハイブリダイズして蛍光シグナルを発するアンプリコンを生成する。新規ＤＮＡ分子の形成は、ハイブリダイゼーション工程の間、蛍光読取り機にてシグナルを検査することによって、リアルタイムに測定される。本発明による標識オリゴヌクレオチドの使用により、検出プローブが増幅酵素（例えばＴａｑポリメラーゼ）によって分解されるのを防ぐことができ、これによって、検出の感度が上がり、技術の有効性が向上する。
【００５５】
工程ｂ）及びｃ）が一方の後にもう一方が実施される場合、ＰＣＲ反応がチューブ内で生じ、アンプリコンを生成する。この増幅工程の終わりに、分子ビーコンは反応媒体に添加されて、蛍光シグナルを発するためにハイブリダイズしうる。本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの使用により、反応チューブ中に残留的に残る耐熱性ポリメラーゼ増幅酵素によって、検出プローブが分解されるのを防ぎ、これによって検出の感度が上がり、技術の有効性を向上させることが可能となる。
【００５６】
他の本発明の好ましい実施形態によれば、工程ｂ）の間、核酸物質はＮＡＳＢＡによって増幅される。
【００５７】
この実施形態によれば、工程ｂ）とｃ）は、好ましくは一方の後にもう一方が実行される。増幅工程の終わりに分子ビーコンは反応媒体に添加され、蛍光シグナルを発するためにハイブリダイズしうる。本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの使用により、反応チューブ中に残留的に残るＲＮＡｓｅＨ酵素によって、検出プローブが分解されることを防ぎ、これによって検出の感度が上がり、技術の有効性を向上させることが可能となる。
【００５８】
「工程ｄ）」は、本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドのアンプリコンへのハイブリダイゼーションの間、放たれる蛍光シグナルを検出することによって行われ、当業者に公知の任意のプロトコルによって実施されうる。
【００５９】
添付図は、例示として示すものであって、決して実質的に制限するものではない。これらによって、本発明の理解がより明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実施例１Ａに記載のように、第１セグメント、αヌクレオシド（陰影部）と合成されている第３セグメント（ステム）、及びβヌクレオシドと合成されている第２セグメント（ループ）を含んで成る、本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの例を示す。
【図２】実施例１Ｂに記載のように、第１セグメント、βヌクレオシドと合成されている第３セグメント（ステム）、及びαヌクレオシド（陰影部）と合成されている第２セグメント（ループ）を含んで成る、本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの例を示す。
【図３】実施例１Ｃに記載のように、第１セグメントと第３セグメント（ステム）、またαヌクレオシド（陰影部）と合成されている第２セグメント（ループ）を含んで成る、本発明に係る標識化オリゴヌクレオチドの例を示す。
【図４】実施例２Ａに記載のように、４０℃で測定した、修飾又は非修飾の分子ビーコンの正規化蛍光プロファイルを示す。
【図５】実施例２Ａに記載のように、９５℃で測定した、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで増幅中の「オリゴヌクレオチドＡ」と「ＭＢ」分子ビーコンの正規化蛍光プロファイルを示す。
【図６】実施例２Ａに記載のように、９５℃で測定した、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで増幅中の「オリゴヌクレオチドＢ」と「ＭＢ」分子ビーコンの正規化蛍光プロファイルを示す。
【図７】実施例２Ａに記載のように、９５℃で測定した、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで増幅中の「オリゴヌクレオチドＣ」と「ＭＢ」分子ビーコンの正規化蛍光プロファイルを示す。
【図８】実施例３に記載のように、ミスマッチを有するか又は有しない様々な相補的配列によって解析したプローブの蛍光の測定による熱変性プロファイルを示す。
【図９】実施例４に記載のように、ステムの一部に相補的であるか又は相補的でない標的によって解析したプローブの蛍光の測定による熱変性プロファイルを示す。
【００６１】
以下の実施例は、例示として示すものであって、決して実質的に制限するものではない。これらによって、本発明の理解がより明確になるであろう。
【実施例】
【００６２】
実施例１：本発明に係るオリゴヌクレオチドの合成方法
（開始材料）
３’にホスホラミダイト基を有する天然ヌクレオチドは、３’β-アミダイトと呼ばれている。これらのオリゴヌクレオチドは市販されており、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， 米国）から購入した。
５’にホスホラミダイト基を有する天然ヌクレオチドは、５’β-アミダイトと呼ばれており、またこれらのオリゴヌクレオチドも市販されており、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， 米国）から購入した。
３’にホスホラミダイト基を有するαアノマーヌクレオチドは、３’α-アミダイトと呼ばれており、これらは市販されており、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ社 （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， 米国）から購入した。
ＣＰＧダブシル（制御ポアガラス、ＣＰＧ）と６−フルオレセイン・ホスホラミダイトは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， 米国）により販売されている。
【００６３】
表１
【００６４】
（オリゴヌクレオチド合成）
３’β-アミダイト、５’β-アミダイト及び３’α-アミダイトをオリゴヌクレオチド合成のために使用した。前記アミダイトの反応性が非常に類似するためである。好適に、ＣＰＧダブシルと６−フルオレセイン・ホスホラミダイトを使用した。ホスホラミダイト合成方法は、ＢｅａｕｃａｇｅとＬｙｅｒ（Tetrahedron, 48, 223-2311, 1992）に記載されている。
一般に、合成される配列の第１のヌクレオシドは、３’位（または５’）において固体支持体（ＣＰＧ）に取り付けられ、ヌクレオシドの５’ＯＨ（又は３’）末端は酸に不安定なジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基によって保護される。
− 第１の脱トリチル工程において、酸処理（トリ−またはジクロロ酢酸）により、反応性ＯＨ末端を生成するためにＤＭＴ基を除去された。
− 第２のカップリング工程において、付加される塩基のホスホラミダイトは、亜リン酸トリエステル結合を生じさせるために、この第１の伸長サイトで、（５’又は３’において）縮合される。縮合は、触媒（テトラゾールまたはＳ−チオエチルテトラゾール、またはＤＣＩ等）の存在下で実施した。
− 第３のキャッピング工程において、前の縮合工程において反応しなかった−ＯＨ基は、配列の欠失を妨げるために、アシル化反応剤（無水酢酸）によってブロックされる。
− 第４の酸化工程において、亜リン酸トリエステル結合は、酸化剤（水溶性ヨウ素）を使用して、リン酸トリエステル結合に酸化した。また、亜リン酸トリエステル結合は、ホスホロチオネートにトリエステル結合を生じさせるために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬のアセトニトリル溶液によって酸化することができる。
工程１から４は、合成される配列の長さに応じ必要なだけ多くの回数を繰り返した。
【００６５】
所望の配列が終わるときに、オリゴヌクレオチドを支えている固体支持体をアンモニアの濃縮水溶液においてインキュベートした。これは、支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、塩基とリン酸基を脱保護するためである。
このように得られた粗オリゴヌクレオチドは、２６０ｎｍ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）でアッセイする前に、アセトンと過塩素酸ナトリウムの溶液により沈澱させた。次に、５０ｎｍｏｌｅの粗オリゴヌクレオチドを、Ｘｔｅｒｒａ Ｃ８ ４．６ｘ１５０ ３．５μｍカラムにおいて、アセトニトリル／ＴＥＡＡｃの勾配により、単一工程で精製した。最も純粋な分画は、ｐＨ１２のＮａＣｌの勾配で、Ｇｅｎ Ｐａｃｋ Ｆａｘカラム（Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ， ＷＡＴＥＲＳ）上のイオン交換クロマトグラフィ−によって確認した。
分画をまとめて、蒸発させ、そして混合物は使用前にＨＰＬＣで再アッセイ及び再分析した。
【００６６】
（１Ａ−αホスホラミダイトを含むオリゴヌクレオチドの前記第１及び第３セグメント（ステム部分）による本発明の第１実施形態（図１））
βアノマー配置に第２セグメントまたはループを、αアノマー配置（第１及び第３セグメント）にステムを含み、アンチパラレルα／α二本鎖を形成する、オリゴヌクレオチドを使用した（オリゴヌクレオチドＡ）。この第１の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドの合成は、ダブシル基（図１、矢印を参照）を含む末端から開始された。次にループはβ-アミダイトによって合成され、次に第３セグメントはα-アミダイトから合成された。
【００６７】
（１Ｂ−αホスホラミダイトを含むオリゴヌクレオチドの前記第２セグメント（「ループ」部分）による本発明の第２実施形態（図２））
前述の実施形態と比較して、この場合は、開始オリゴヌクレオチドは、標的（オリゴヌクレオチドＢ）とパラレル様式にハイブリダイズするαヌクレオチドを含んでいる第２セグメント（ループ）を含む。第１と第３セグメント（ステム部分）は、βヌクレオチドを含む。合成はβアミダイトから開始され、次に、残りのステムの合成のためにβアミダイトに戻る前に、ループがαアミダイトと合成される（図２、矢印を参照）。
【００６８】
（１Ｃ−αホスホラミダイトを含むオリゴヌクレオチドの前記第１、第２及び第３セグメント（「ステム」及び「ループ」部分）による本発明の第３実施形態）
前述の実施形態と比較して、この場合は、開始オリゴヌクレオチドは、αヌクレオシド（ループ及びステム）により完全に修飾される。ループのαヌクレオチドは標的にパラレル様式でハイブリダイズし、一方でステムのそれらはアンチパラレル様式で互いにハイブリダイズする（オリゴヌクレオチドＣ）。
合成は、αアミダイトにより開始し終了する（図３）。
【００６９】
実施例２：Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性による切断に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの抵抗性の研究
この実験の目的は、本発明に係る修飾オリゴヌクレオチド（実施例１のオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ及びＣ）がインビトロの酵素増幅反応においてＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されないことを証明することである。
【００７０】
（実験計画）
標的配列は、ｈＭＰＶウイルスの遺伝子配列に対応する１．２Ｋｂのインサートを含むｐＣＩＴＥプラスミドで、濃度はチューブに付き５・１０３コピーの濃度であった。
使用したプライマーとプローブは以下であった：
・センスプライマー：
５’− ＣＡＴ ＡＴＡ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＴＡ ＴＡＴ ＴＡＡ ＡＡＧ ＡＧＴ ＣＴＣ −３’（配列番号１）
・リバースプライマー：
５’− ＣＣＴ ＡＴＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ＴＣＡ Ｇ −３’（配列番号２）
・本発明の第１実施形態に係る修飾プローブ（オリゴヌクレオチドＡ）：
５’− ＦＡＭ−［ＧＣ ＴＡＣ］ ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＴＧＣＡ ［ＧＴＡ ＧＣ］−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号３）
角括弧の間のヌクレオチド配列は第１及び第３「ステム」セグメントに対応し、αアノマーヌクレオチドから成る。特に下線を施したβアノマー「ループ」配列は、インビトロ増幅において生成されるアンプリコンの配列を特異的に認識した。ＦＡＭはフルオレセイン型フルオロフォアであり、その蛍光は５３０ｎｍで検出できる。Ｄａｂｃｙｌは芳香族分子であり、物理的にＦＡＭフルオロフォアに近接してあるときに、それは蛍光の放出を妨げる。
・本発明の第２実施形態に係る修飾プローブ（オリゴヌクレオチドＢ）：
５’−ＦＡＭ−ＧＣ ＴＡＣ［ＡＣＧＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＡＣ］ ＧＴＡ ＧＣ−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号４）
角括弧の間のヌクレオチド配列は第２「ループ」セグメントに対応し、αアノマーヌクレオチドから成り、インビトロ増幅において生成されるアンプリコンの配列を特異的に認識した。
・本発明の第３実施形態に係る修飾プローブ（オリゴヌクレオチドＣ）：
５’−ＦＡＭ−［ＧＣ ＴＡＣ ＡＣＧＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＴＡ ＧＣ］−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号５）
角括弧の間のヌクレオチド配列は第１、第２及び第３セグメントに対応し、αアノマーヌクレオチドから成る。下線を施した配列は、第２「ループ」セグメントに対応し、特にインビトロ増幅において生成されるアンプリコンの配列を特異的に認識した。
・非修飾コントロールプローブ（ＭＢ）：
５’− ＦＡＭ−ＧＣ ＴＡＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＴＧＣＡ ＧＴＡ ＧＣ−Ｄａｂｃｙｌ−３’（配列番号６）
この配列はβアノマーであり、特にインビトロ増幅において生成されるアンプリコンの配列を特異的に認識した。
【００７１】
（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでのリアルタイム検出を伴うＰＣＲ増幅：）
「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ マスター ハイブリダイゼーション プローブ」増幅キット（ロシュ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、ドイツ）を用いた。反応混合物の調製は、供給元によって推奨される手順に従って実施した。２０μｌの反応量において、５・１０３コピーのプラスミドを、センス及びリバースプライマー（０．５μＭ）、修飾又は非修飾ヌクレオチドプローブ（１μＭ）、２μｌのキットのバイアル１（酵素ミックス）、０．８μｌのキットの２５ｍＭのＭｇＣｌ２及びキットのＰＣＲグレードの水を混合した。そして、反応混合物をキャピラリーチューブに入れ、それをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒに入れた。各増幅反応に関して、修飾プローブ（オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ又はＣ）の代わりに、非修飾プローブ（ＭＢ）でコントロールを実施した。また、各増幅反応に関して、標的プラスミドの代わりに、キットのＰＣＲグレードの水を添加して、コントロールを実施した（ネガティブコントロール、「ｃ-」）。
【００７２】
ＰＣＲ反応は、９５℃で８分の最初の変性に続いて、９５℃３０秒間、４０℃５秒間及び６０℃６０秒間の４０サイクルから構成された。各サイクルの各ステップの終了時に、蛍光は５３０ｎｍで読んだ。そして、蛍光の結果は、温度によって結果を分けるためにエクセルシート上に再加工し、それらを正規化し、グラフ表現を作成した。４０℃と６０℃における測定値で得たグラフは、増幅反応の間のアンプリコンとプローブとのハイブリダイゼーションを確認することに役立った。一方で、９５℃において、ハイブリダイゼーションは、プローブとアンプリコンの間で可能でなかった。ネガティブコントロールと比較して、９５℃におけるシグナルのいかなる増加は、プローブの切断によるものだけがありえる。従って、９５℃における測定値で得たグラフは、プローブがＴａｑＰｏｌの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されたか否かを証明することに役立った。
【００７３】
（結果）
４０℃におけるリアルタイム検出で得られたプロファイルを図６に示す。横軸は増幅サイクルの数を表し、縦軸は５３０ｎｍで検出された蛍光を表し、各サイクルの４０℃におけるものである。左上は「ＭＢ」；右上は「オリゴヌクレオチドＡ」；左下は「オリゴヌクレオチドＢ」；右下は「オリゴヌクレオチドＣ」である。各グラフに、対応するネガティブコントロールを示す。
【００７４】
９５℃におけるリアルタイム検出で得られたプロファイルを、図６から８に示す。各図で、修飾分子ビーコンの一つに対応するプロファイルを示し、コントロールとして、非修飾分子ビーコンのプロファイル及びネガティブサンプルに対応するプロファイルを伴に示す。
【００７５】
ハイブリダイゼーションの場合に期待される結果は、アンプリコンの数が増加する時から開始する４０℃における蛍光シグナルの指数関数的な増加である。切断が起きた場合には、９５℃での蛍光の指数関数的な増加が、ハイブリダイゼーションにより観察されるものと平行して、期待される。シグナルの線形増加または減少は、アンプリコンのいかなる検出にも対応しないが、これは後者は指数的に生じる故である。
【００７６】
４０℃のプロファイルは、修飾ヌクレオチドプローブＡ、Ｂ及びＣ、更に非修飾コントロールＭＢが特にインビトロ酵素増幅反応に由来するアンプリコンの存在を検出することを実証した。
【００７７】
９５℃のプロファイルは、ＭＢとＡプローブが増幅反応の間、特に切断されるが、一方で修飾プローブＢとＣは同じ条件下で切断されないことを実証した。
【００７８】
図５から７は、非修飾プローブ「ＭＢ」と、それぞれ修飾プローブ「オリゴヌクレオチドＡ」、「オリゴヌクレオチドＢ」及び「オリゴヌクレオチドＣ」の９５℃における蛍光の増加の比較を示す。増幅が起きた時に、蛍光の特異的な増加は、ＭＢプローブと「オリゴヌクレオチドＡ」プローブにだけ、観察することができた。増幅が起こらない時（ネガティブコントロール、「ｃ-」）及びヌクレオチドプローブの第２「ループ」セグメントが修飾された時（オリゴヌクレオチドＢとＣ）、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断がなく、従って、ネガティブコントロールと比較して蛍光に増加がない。
【００７９】
（結論）
本発明に係る第２「ループ」セグメントにおいて修飾された分子ビーコン（オリゴヌクレオチドＢとＣ）はLｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒにおけるサイクリングに由来するアンプリコンと特にハイブリダイズし、非修飾分子ビーコン「ＭＢ」によって及びステムにおいて修飾された分子ビーコン（オリゴヌクレオチドＡ）によって得られたものと同等のリアルタイム検出を引き起こした。コントロール分子ビーコン「Ｍｂ」及びステムにおいて修飾された分子ビーコン（「オリゴヌクレオチドＡ」）とは異なり、ループにおいて修飾された分子ビーコンは、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されなかった。
【００８０】
実施例３：本発明のオリゴヌクレオチドのその標的配列に対するハイブリダイゼーションの特異性の研究（図８）
（目的）
実験の目的は、α型ヌクレオチドを含むビーコンが、β型ヌクレオチドだけから構成されたビーコンより、その標的に対しより特異的であるか否かを検証することである。
特異性は、その完全に補完的な標的を有する溶液中のプローブとその配列にヌクレオチド変異（この場合はミスマッチ）を含む標的を有する溶液中のプローブ間のＴｍ（本願明細書ではΔＴｍ）の差を算出することで測定することができる。ΔＴｍは、分析される各プローブ対し及び各相補配列に対し算出される。
我々の場合は、特異性は、オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ及びＣプローブ、及び４つの相補配列であって１つはプローブの第２セグメントに完全に相補的であり他の３つは完全な相補配列に比較して１つのＣ、ＴまたはＡのミスマッチを含むものによって算出されるΔＴｍの値によって測定される。
【００８１】
（実験計画）
使用するプローブと相補配列の配列を下記の表１に記載する。
プローブを含む溶液の蛍光は、完全に相補的な標的またはミスマッチを有する標的の存在下で、ＥａｓｙＱ ｔｈｅｒｍｏａｎａｌｙｚｅｒ分光蛍光計（ビオメリューｂｖ、Ｂｏｘｔｅｌ、ＮＬ）で、６９と２７℃の間の温度の関数として、測定された。全ての測定は、Ｎａｓｂａ基本キット（ビオメリューｂｖ、Ｂｏｘｔｅｌ、ＮＬ）の緩衝水溶液において、１００ｎＭのプローブ濃度で、及び１μＭの標的濃度で、２０μＬの容量を有する溶液に実行された。
【００８２】
表１
表１：使用するプローブと相補配列の配列。ボールドイタリック体：αヌクレオチド；下線：ミスマッチ。全ての配列は、５’−３’方向に記載されている。
【００８３】
（結果）
得られた熱変性プロファイルは、図８に示す。Ｔｍは、各プロファイルの一次微分係数の最大に対応する。得られたＴｍ値を、下記の表２に示す。
表２
表２：相補配列Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＡとさまざまなプローブのＴｍ。括弧内は、完全に相補的な配列「ＣｏｍｐＧ」と他のミスマッチを含んでいる相補配列の間のΔＴｍの値。
【００８４】
オリゴヌクレオチドＡプローブの場合は、表２のΔＴｍ値はＭＢプローブより良好な特異性、＋２℃程度、を示す。図１４に見られるように、オリゴヌクレオチドＡプローブの場合、両方の場合において相補配列がβ型であるならば、特異性のこの増加は、確実に、ステム（第１と第３の相補的セグメント）のハイブリダイゼーションより大きな安定性による。
【００８５】
オリゴヌクレオチドＢ及びＣプローブの場合、使用した温度範囲においてハイブリダイゼーションが十分でなかったので、ミスマッチを含む相補配列によるＴｍ値は得ることができなかった。これは、非常に高い特異性を示しており、図８の熱変性プロファイルにおいて確認することができる。完全に相補的な配列「ｃｏｍｐＧ」だけがこれらのプローブとハイブリダイズし、その一方でミスマッチを含んでいる相補配列はハイブリダイズしないことが、これらのプロファイルにおいてわかる。オリゴヌクレオチドＡプローブによって得られた結果と比較して、これらの結果は、α型配列のハイブリダイゼーションによる特異性の増加が、オリゴヌクレオチドＢプローブではβ型でありオリゴヌクレオチドＣプローブではα型であるステムの性質から独立していることを示す。
【００８６】
（結論）
結果は、４つの修飾プローブが非修飾ＭＢプローブより高い特異性を有することを示す（表２）。我々の場合では、特異性におけるこの増加は、ステム（第１及び第３の相補的セグメント）の性質から独立である。
【００８７】
実施例４：標的配列と分子ビーコン型核酸プローブのステムとのハイブリダイゼーションの研究
（目的）
分子ビーコン型核酸プローブがその相補的標的配列とハイブリダイズするときに、また、プローブのステムが、５’側と３’側の両方において、標的とハイブリダイズできることもありうる。これは、ハイブリダイゼーションの安定性の思いがけない増大と、それゆえにプローブの特異性の減失を生じうる。本明細書に記載の実施例は、分子ビーコン型核酸プローブにおいてα−とβヌクレオチドの組合わせが、ステムの相補的標的とのハイブリダイゼーションを妨げることによってこの問題を回避することを可能にすることを示すことに役立つ。
【００８８】
（実験計画）
使用したプローブの配列は実施例３と同じであり、上の表１に記載されている。使用した相補配列を、下記の表３に記載する。
表３
表３：使用した相補的標的オリゴヌクレオチドの配列。ボールド体はプローブのループと相補的な配列である。
【００８９】
相補配列は、プローブのループに相補的な３’側の一部、且つプローブのステムの一方に、「ｃｏｍｐ＋」の場合は相補的であり、あるいは「ｃｏｍｐ−」の場合は相補的でない、５’側の一部を含む。
【００９０】
プローブの及び標的のさまざまな組合わせを含む溶液の蛍光は、ＥａｓｙＱ ｔｈｅｒｍｏａｎａｌｙｚｅｒ分光蛍光計（ビオメリューｂｖ、Ｂｏｘｔｅｌ、ＮＬ）で、６９と２７℃の間の温度の関数として測定された。全ての計測は、Ｎａｓｂａ基本キット（ビオメリューｂｖ、Ｂｏｘｔｅｌ、ＮＬ）の緩衝水溶液において、１００ｎＭのプローブ濃度で、及び１μＭの標的濃度で、２０μＬの容量を有する溶液に実行された。
【００９１】
（結果）
得られた熱変性プロファイルを、図９に示す。Ｔｍは、各プロファイルの一次微分係数の最大に対応する。得られたＴｍ値は、下記の表４に示す。
表４
表４：ｃｏｍｐ＋及びｃｏｍｐ−相補的標的とのさまざまなプローブのＴｍ
【００９２】
ループがβ型であるプローブは、ここで使用するもののように必然的にβ型の天然標的配列にアンチパラレル配向でハイブリダイズするであろう。ループがα型であるプローブは、同じβ標的配列にパラレル配向でハイブリダイズするであろう。その結果、ループの性質に従って、ステムは、ループのハイブリダイゼーションによって決定される配向で、標的の配列の反対側にそれ自体が見られる。従って、プローブのαステムは天然のβ標的にハイブリダイズすることができるのは、後者が相補的な（ｃｏｍｐ＋）場合とプローブのループもまた、α（パラレル配向）である場合のみである。同様に、プローブのβステムは天然のβ標的にハイブリダイズすることができるのは、後者が相補的な（ｃｏｍｐ＋）場合とプローブのループもまた、β（アンチパラレル配向）である場合のみである。これは、ＭＢとオリゴヌクレオチドＣプローブのステムはｃｏｍｐ＋の相補配列とハイブリダイズすることができるが、ｃｏｍｐ−の非相補配列とハイブリダイズすることができず、表４において観察できるように、Ｔｍの違いが生じることを示唆する。オリゴヌクレオチドＡとＢプローブのステムはｃｏｍｐ＋の相補配列とも、ｃｏｍｐ−の非相補配列ともハイブリダイズすることができず、表４から分かるように、Ｔｍは２つの標的と類似している。
【００９３】
（結論）
結果は、相補性が完全なときでさえも、ステムのヌクレオチドがループのヌクレオチドとはアノマーが異なる分子ビーコン型核酸プローブ（オリゴヌクレオチドＡとＢプローブ）は、ステムと標的に存在する相補配列とのハイブリダイゼーションを妨げることを示す。ハイブリダイゼーションにおける負の効果は、観察されない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ヌクレオチドセグメント、標的配列と相補的である第２ヌクレオチドセグメント、及び前記第１ヌクレオチドセグメントと相補的である第３ヌクレオチドを含む標識化オリゴヌクレオチドであって、フルオロフォア、クエンチャー及び少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことを特徴とする標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記第１と第３セグメントが第２セグメントの両側にあることを特徴とする、請求項１に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記第２セグメントが少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
フルオロフォアが前記オリゴヌクレオチドの一端にあり、クエンチャーが前記オリゴヌクレオチドの他端にあることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記フルオロフォアがフルオレセインであることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記クエンチャーがダブシルであることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記第１セグメントが３から８ヌクレオチドを含み、前記第２セグメントが１０から３５ヌクレオチドを含み、且つ前記第３セグメントが、存在する場合には、３から８ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
ポリメラーゼ酵素の５’ヌクレアーゼ活性を遮断するため及び／またはＲＮＡｓｅＨ活性を遮断するための、少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項９】
生物試料における核酸物質の検出方法であって、
ａ）核酸物質を生物試料から抽出すること、
ｂ）核酸物質の少なくとも一つの標的配列のアンプリコンを得るために核酸物質を増幅すること、
ｃ）請求項１から７に記載の少なくとも１つの標識化オリゴヌクレオチドを工程ｂ）と同時に、または工程ｂ）の後で使用すること、
ｄ）前記アンプリコンの存在を検出すること
を含んでなる方法。
【請求項１】
第１ヌクレオチドセグメント、標的配列と相補的である第２ヌクレオチドセグメント、及び前記第１ヌクレオチドセグメントと相補的である第３ヌクレオチドを含む標識化オリゴヌクレオチドであって、フルオロフォア、クエンチャー及び少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことを特徴とする標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記第１と第３セグメントが第２セグメントの両側にあることを特徴とする、請求項１に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記第２セグメントが少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
フルオロフォアが前記オリゴヌクレオチドの一端にあり、クエンチャーが前記オリゴヌクレオチドの他端にあることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記フルオロフォアがフルオレセインであることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記クエンチャーがダブシルであることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記第１セグメントが３から８ヌクレオチドを含み、前記第２セグメントが１０から３５ヌクレオチドを含み、且つ前記第３セグメントが、存在する場合には、３から８ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
ポリメラーゼ酵素の５’ヌクレアーゼ活性を遮断するため及び／またはＲＮＡｓｅＨ活性を遮断するための、少なくとも一つのαアノマーヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項９】
生物試料における核酸物質の検出方法であって、
ａ）核酸物質を生物試料から抽出すること、
ｂ）核酸物質の少なくとも一つの標的配列のアンプリコンを得るために核酸物質を増幅すること、
ｃ）請求項１から７に記載の少なくとも１つの標識化オリゴヌクレオチドを工程ｂ）と同時に、または工程ｂ）の後で使用すること、
ｄ）前記アンプリコンの存在を検出すること
を含んでなる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５０４７４５（Ｐ２０１０−５０４７４５Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２９７４２（Ｐ２００９−５２９７４２）
【出願日】平成１９年９月２６日（２００７．９．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０５２００７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３７９２４
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２６日（２００７．９．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０５２００７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３７９２４
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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