新規な芳香環水酸化酵素及びその遺伝子
【課題】シングルポリペプチド鎖の単純な蛋白質からなる新規芳香環水酸化酵素、及びその遺伝子を見い出し、生物学的な手法によって芳香環の水酸化を工業的に行うための手段を新たに提供する。
【解決手段】環境ＤＮＡから芳香環水酸化酵素をコードする遺伝子を採取し、該遺伝子を使用して、遺伝子光学的手法により芳香環水酸化酵素を得る。該芳香環水酸化酵素はシングルポリペプチドからなり、容易かつ効率的に芳香環の水酸化を行いうる。
【解決手段】環境ＤＮＡから芳香環水酸化酵素をコードする遺伝子を採取し、該遺伝子を使用して、遺伝子光学的手法により芳香環水酸化酵素を得る。該芳香環水酸化酵素はシングルポリペプチドからなり、容易かつ効率的に芳香環の水酸化を行いうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の芳香族化合物（芳香環）の分解において最も重要な役割を果たす酵素の１つである芳香環水酸化酵素、及び該酵素をコードする遺伝子、並びにこの遺伝子群を導入・発現した微生物を利用した水酸化された芳香族化合物の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
芳香族化合物の多くは細胞に対し毒性を示し環境中において汚染物質となる。これらを分解資化する微生物は自然界に多く分離しており、これまでに数多く分離されている。好気的な条件において芳香族化合物の分解は初発酸素添加反応により開始され、共通の中間代謝産物であるカテコールを経て水と二酸化炭素にまで分解されるが、中でも初発酵素である芳香環水酸化酵素は芳香族化合物の分解において最も重要な役割を果たすことが明らかにされている（非特許文献１、２）。
【０００３】
微生物を活用する低分子化合物の製造や分解といった物質変換プロセスは、従来の化学的な変換プロセスに比べ、反応特異性（基質特性や立体特性や位置特異性）が高いこと、温和な条件（常温常圧）で反応可能であること、有害な副産物が生成しにくいことなどの特徴を有している。とりわけ酸化反応は、苛酷な化学プロセスに代替可能な酵素プロセスへの転換が求められており、酸化酵素の探索が盛んに行われている。
【０００４】
芳香族化合物は、医薬品原料、化学原料として広く利用されている。芳香環に水酸基を導入することは、芳香族化合物に様々な官能基を導入する起点でもあり、芳香族化合物の物質変換プロセスの中でもとくに重要なプロセスである。現在までに芳香環水酸化酵素に関する研究が広く行われてきたが、芳香環水酸化酵素は、通常、水酸化本体酵素（α−サブユニットとβ−サブユニットとγ−サブユニットの３つのサブユニットからなる）以外にフェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）及びフェレドキシンレダクターゼ（還元酵素）（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）という非常に複雑な多成分複合酵素（ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ）として機能を発揮することが一般的である（非特許文献３及び特許文献１、２）。
【０００５】
しかしながら、このように複雑なサブユニット構成、分子複合体は、一般に工業利用に適しておらず、シングルポリペプチド鎖からなる単純な蛋白質で同等の機能を発揮しうる蛋白質が強く求められている。そのため、これまでに知られている多成分複合酵素とは異なる単一の成分からなる新規な水酸化酵素は、水酸化された芳香族化合物の製造において非常に有用である。
【０００６】
【非特許文献１】Harayama et al., (1997) Polycyclic aromatic hydrocarbon bioremediation design. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 268-273.
【非特許文献２】Furukawa et al., (2004) Biphenyl dioxygenases: Functional versatilities and directed evolution. J. Bacteriol. 186, 5189-5196.
【非特許文献３】Gibson et al., (2000) Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 11, 236-243.
【特許文献１】WO2004/050875
【特許文献２】特開2000-69968
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解消する点にあり、シングルポリペプチド鎖の単純な蛋白質からなる新規芳香環水酸化酵素、及びその遺伝子を見い出し、生物学的な手法によって芳香環の水酸化を工業的に行うための手段を新たに提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、新規な単一成分の水酸化酵素を取得し、これを適切なベクターを用いて微生物に導入し、菌体内にこの遺伝子の保持する形質転換体を得ることが出来れば、微生物触媒による芳香族化合物の水酸化反応を簡便に行えると考え、これについて鋭意検討した結果、活性汚泥を環境試料としたＤＮＡライブラリより、単一の成分からなる新規水酸化酵素をコードするＤＮＡ断片を取得することに成功した。そして、このＤＮＡ断片を含む組換えベクターを用いて微生物を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、水酸化された芳香族化合物が生産されることを見いだして、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質。
（２）上記（１）に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）配列番号２で示される塩基配列を含むか、あるいは配列番号２で示される塩基配列において、１又は数個のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を有する塩基配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（４）配列番号２で示される塩基配列又は該塩基配列と相補の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ芳香環水酸化酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（５）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質。
（６）上記（５）に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（７）配列番号４で示される塩基配列を含むか、あるいは配列番号４で示される塩基配列において、１又は数個のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を有する塩基配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（８）配列番号４で示される塩基配列又は該塩基配列と相補の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ芳香環水酸化酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（９）上記（２）から（４）あるいは（６）から（８）のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（１０）上記（９）に記載の組換えベクターを含有する微生物。
（１１）微生物が大腸菌であることを特徴とする上記（１０）に記載の微生物。
（１２）上記（１０）又は（１１）に記載の微生物を、芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とする、水酸化された芳香族化合物の製造法。
【発明の効果】
【００１０】
通常、芳香環水酸化酵素は非常に複雑な多成分複合酵素として機能を発揮することが一般的である。これらの遺伝子を組換え微生物に導入して発現させる場合においては、その全ての成分遺伝子が発現する必要があり、何らかの理由で何れかの遺伝子のひとつでも発現が低下した場合にはそれに伴い水酸化能力が低下し、全く発現しない成分遺伝子が存在した場合には水酸化能力は完全に失われる。また、各種成分酵素はそれぞれ至適の反応条件（温度、pH等）を保有しているので、全ての成分酵素が至適である反応条件を設定することは困難であり、効率的な水酸化反応のための条件設定は非常に困難である。本発明で提供する芳香環水酸化酵素タンパク質は、シングルポリペプチド鎖からなる単純な蛋白質のため、遺伝子発現及び水酸化反応の最適化のための条件設定が飛躍的に容易になる。さらに芳香環水酸化酵素遺伝子の全長も短縮されるため、プラスミド構築や微生物導入といった遺伝子工学実験の作業においても高効率化が期待できる。以上の理由により、該タンパク質をコードする遺伝子を保持する微生物は、種々の作業や最適化のための条件設定が飛躍的に容易になり、芳香族化合物の水酸化がより簡便化、効率的になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の芳香環水酸化酵素タンパク質の具体例は、活性汚泥から構築した環境DNAライブラリーをスクリーニングして得られたDNA由来のタンパク質であって、芳香環水酸化酵素として機能するシングルポリペプチド鎖の３９７あるいは５１２アミノ酸からなるタンパク質である。そのアミノ酸配列は配列表の配列番号１および３に示される。
また、本発明の芳香環水素酵素タンパク質は、上記配列番号１および３に示されるもののみではなく、該配列番号１および３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を有し、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するような軽微な変異を有するタンパク質であっても良い。このような変異としては、自然変異のみではなく、突然変異あるいは例えば遺伝子工学的手法を用いた変異等の人為的変異も含まれる。
【００１２】
本発明の芳香環水酸化酵素タンパク質の遺伝子は、上記配列番号１および３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質あるいはその上記変異タンパク質をコードするものであれば特に制限はないが、その具体的なものとしては、配列表の配列番号２および４に示され塩基配列を有するか、あるいは上記配列番号２および４に示される塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換された塩基配列を有し、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられ、さらに、上記配列番号２および４で示される塩基配列あるいはその相補配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものであって、芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００１３】
このような遺伝子は、タンパク質はＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより、例えば、細菌由来の遺伝子をスクリーングすることにより得られる。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、配列番号２の１位から１１９４位までの塩基配列と相同性が６０％以上、好ましくは９０％以上であるＤＮＡとが特異的にハイブリダイズする条件である。ストリンジェントな条件としてより具体的には、４２℃において、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ溶液中でハイブリダイゼーションを行い、次いで、４２℃において、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄を行う条件が挙げられる。
【００１４】
本発明の遺伝子は、例えば以下の手順で得ることができる。
本発明の芳香環水酸化酵素遺伝子は、芳香環を含むと考えられる土壌、河川および海洋の水または堆積物、活性汚泥等の環境試料からＤＮＡを採取し、物理的あるいは酵素的あるいは化学的に剪断した当該ＤＮＡをプラスミド、ファージ、フォスミド等のベクターに連結し、該ベクターにより宿主微生物を形質転換し、当該組換えベクターを含む微生物ライブラリーを作製する。ここで、芳香環水酸化酵素の近傍には、連続する代謝反応を触媒するカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子が存在していることが知られていることに着目し、目的の遺伝子を保持するクローンの選択を行うことが出来る。すなわち、微生物ライブラリーにカテコールを噴霧し、黄色を呈するクローンを選択すれば、そのクローン中にカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子が含まれることが判明する。これを指標にライブラリーをスクリーニングし、近接する芳香環水酸化酵素を取得することが可能である。
【００１５】
また、このほか、配列番号２および４で示される塩基配列を基に化学合成することもできる。
さらに、上記したように、このようにして得られた遺伝子と他の遺伝子とがストリンジェント条件下、ハイブリダイズするか否かを指標としてスクリーニングすることにより、芳香環水酸化酵素遺伝子を得ることもでき、あるいは上記得られた遺伝子にそれ自体周知の変異導入法を用いて、変異体タンパク質からなる芳香環水酸化酵素遺伝子を得ることもできる。
【００１６】
本発明の芳香環水酸化酵素遺伝子は適当な発現ベクターに挿入し、微生物に導入して発現させることにより、芳香環水酸化能力を保持する微生物を作製することが可能である。使用できるベクターとしてはｐＵＣベクターなどが例示でき、また、宿主とする微生物については大腸菌ＪＭ１０９などを例示できる。
上記の芳香環水酸化酵素遺伝子を大腸菌等の微生物に導入し、発現させた組換え微生物を用いて種々の芳香族化合物と混合培養することで、これらの芳香族化合物に特異的に水酸基を導入することができる。
本発明の方法により、例えばフェノールを基質として用いた際に変換産物としてカテコールが得られるが、本発明の方法によって製造される芳香族化合物はカテコールに限定されるわけではなく、基質としては、トルエン、スチレン、クレゾール、クロロベンゼン等の芳香族化合物の他、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン等の多環芳香族化合物、２−フェニルインドール、１−フェニルピラゾール等の複素芳香環化合物等を挙げることができる。
以下に、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
〔実施例１〕
芳香環水酸化酵素遺伝子の単離及び解析
（１）環境ＤＮＡライブラリーの作製
活性汚泥より抽出した環境ＤＮＡを、ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌ Ｆｏｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）に添付のＥｎｄ−Ｒｅｐａｉｒ Ｅｎｚｙｍｅを用いて末端の平滑化を行った。その後パルスフィールド電気泳動により平均鎖長３３−４８ｋｂ付近の大きさのＤＮＡをゲルから分画した。β−アガラーゼ（ＮＥＢ社）を用いて切り出した断片からＤＮＡを精製した。
【００１８】
次いで調製したインサートＤＮＡ断片とｐＣＣ１ＦＯＳフォスミドベクター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）とで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行った。ベクターライゲーション後、ＭａｘＰｌａｎｋ Ｌａｍｂｄａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行った。宿主大腸菌としてＥＰＩ３００（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）を使用した。１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で、λファージにより形質転換した大腸菌をクロラムフェニコール耐性により選択した。
【００１９】
大腸菌のコロニーを取り、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地１ｍＬ中で、３７℃で１８時間、１２００ｒｐｍで培養した。ついで、このコロニーを採取した大腸菌の培養液のうち２００μＬを新しい８００μＬの２×ＹＴ培地に移して混合し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３０分間培養した後、１μＬのＣｏｐｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）を添加し、宿主大腸菌ＥＰＩ３００が保有するフォスミドベクターのコピー数を増加させた。さらに大腸菌を３７℃で２時間、１２００ｒｐｍで激しく振とうしながら培養した後、遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。その後、１５０μＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｌｕｓ Ｂｅｎｚｏａｔｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を添加して、大腸菌の細胞を溶解させた。続いて、遠心分離により分離された上清を細胞抽出液として得た。
【００２０】
次に、カテコール（東京化成社）を最終濃度が０．５ｍＭとなるように、５μＬずつ、１００μＬの細胞抽出液に添加し、２５℃において２５０ｒｐｍで混合しながら反応を行った。１時間および１６時間後に、カテコールの分解により、２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドの形成により黄色を示すフォスミドクローンを選択した。
【００２１】
（２）塩基配列の決定
カテコール分解活性を示すクローンより、ＦｏｓｍｉｄＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）を用いてフォスミドＤＮＡを抽出した。次いで、当該ＤＮＡをＤＮＡ断片化装置（Ｇｅｎｅ ｍａｃｈｉｎｅｓ社）を用いてランダムに断片化し、アガロースゲル電気泳動により分画後、約２ｋｂ−３ｋｂのＤＮＡを含むアガロース断片を切り出した。切り出したアガロース断片よりＤＮＡを精製後、Ｔ４ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片の平滑化を行った。平滑化したＤＮＡ断片は、脱リン酸化処理を行った５０ｎｇのｐＵＣ１１８／ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰとベクターライゲーション反応を行った後、エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。
【００２２】
作製したライブラリーの一部をライゲーション溶液１μＬ、宿主大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２５μＬを用いて、エレクトロポレーション法（Ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ、ＢＩＯ ＲＡＤ社）により大腸菌に導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【００２３】
Ｑ−Ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ社）を用いて２８８個の大腸菌白コロニーをランダムにピッキングした。９６穴のプレートに分注した１２０μＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にそれぞれ植菌し、３７℃で終夜培養を行った。上記培養液にＴｅｍｐｌｉＰｈｉＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を使用して、シーケンス用鋳型を調製した。ＴｅｍｐｌｉＰｈｉの反応は付属の取扱説明書に従った。
【００２４】
次に、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉにより調製したＤＮＡを鋳型として塩基配列の解析を行った。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）によりシークエンス反応を行った。付属の取扱説明書に従いＰＣＲ、精製を行い、ＡＢＩ３７３０ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて解析を行った。塩基配列の解析にはＡｒｔｅｍｉｓ（Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いた。
【００２５】
塩基配列のホモロジー解析を行った結果、図１に示すように、カテコール分解活性を示すフォスミドクローンの挿入断片中にはカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子の他に、芳香環水酸化酵素遺伝子が存在した。芳香環水酸化酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１および３に、ＤＮＡ塩基配列を配列番号２および４にそれぞれ示す。
【００２６】
〔実施例２〕
芳香環水酸化酵素の発現及びその活性の確認
上記実施例１で得られた配列番号２のＤＮＡが水酸化酵素をコードすることを確認する実験を行った。まず芳香環水酸化酵素遺伝子およびカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。５’末端のプライマーとしてＰＨＥ−Ｆ（配列番号５）、及び５’末端のプライマーとしてＰＨＥ−Ｒ（配列番号６）を合成した。ＰＣＲは９８℃で１０秒、６０℃で５秒、７２℃で２分の処理を１サイクルとして合計２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を精製し、さらに制限酵素ＸｂａＩで処理した。このインサートＤＮＡと、ＨｉｎｃＩＩとＸｂａＩで処理したｐＵＣ１９ベクターを合計１０μＬになるように混合し、ライゲーション反応を行った。ＤＮＡを回収し、ヒートショック法で大腸菌ＪＭ１０９株に挿入し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【００２７】
得られた大腸菌形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、さらに１００μＭのフェノールを含むＬＢ寒天培地にストリークし３７℃で終夜培養した結果、黄色を呈するコロニーが得られた。分光光度計により解析を行い、得られた黄色化合物は、３７５ｎｍに最大吸収波長を持つ２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドであることを確認した。従って配列番号２の遺伝子は、単一の成分からなる芳香環水酸化酵素をコードし、当該水酸化酵素はフェノールをカテコールに変換し、下流に存在するカテコール２，３−ジオキシゲナーゼによりカテコールが２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドに変換されていることを確認した。
【００２８】
比較として、５’末端のプライマーとしてＥＤＯ−Ｆ（配列番号７）、及び３’末端のプライマーとしてＰＨＥ−Ｒ（配列番号６）を用いて、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。上記記載の手順と同様にして得られた大腸菌形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、さらに１００μＭのフェノールを含むＬＢ寒天培地にストリークし３７℃で終夜培養した結果、黄色を呈するコロニーは得られなかった。一方、カテコールを噴霧した結果、黄色を呈するコロニーが得られた。
以上のことより、配列番号２の遺伝子が、新規な単一の成分からなる芳香環水酸化酵素をコードしていることが明らかになった。さらに、この芳香環水酸化酵素をコードする遺伝子を導入することにより、水酸化された化合物が生産されることが明らかになった。
【００２９】
〔実施例３〕
芳香環水酸化酵素の発現及びその活性の確認
上記実施例１で得られた配列番号４のＤＮＡが水酸化酵素をコードすることを確認する実験を行った。まず芳香環水酸化酵素遺伝子およびカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。５’末端のプライマーとしてＰＨＥ２−Ｆ（配列番号８）、及び５’末端のプライマーとしてＰＨＥ２−Ｒ（配列番号９）を合成した。ＰＣＲは９８℃で１０秒、６０℃で５秒、７２℃で２分の処理を１サイクルとして合計２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を精製し、さらに制限酵素ＫｐｎＩで処理した。このインサートＤＮＡと、ＫｐｎＩで処理したｐＵＣ１９ベクターを合計１０μＬになるように混合し、ライゲーション反応を行った。ＤＮＡを回収し、ヒートショック法で大腸菌ＪＭ１０９株に挿入し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【００３０】
得られた大腸菌形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、さらに１００μＭのフェノールを含むＬＢ寒天培地にストリークし３７℃で終夜培養した結果、黄色を呈するコロニーが得られた。分光光度計により解析を行い、得られた黄色化合物は、３７５ｎｍに最大吸収波長を持つ２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドであることを確認した。従って配列番号２の遺伝子は、単一の成分からなる芳香環水酸化酵素をコードし、当該水酸化酵素はフェノールをカテコールに変換し、下流に存在するカテコール２，３−ジオキシゲナーゼによりカテコールが２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドに変換されていることを確認した。
【００３１】
比較として、５’末端のプライマーとしてＥＤＯ−Ｆ（配列番号７）、及び３’末端のプライマーとしてＰＨＥ２−Ｒ（配列番号９）を用いて、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。上記記載の手順と同様にして得られた大腸菌形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、さらに１００μＭのフェノールを含むＬＢ寒天培地にストリークし３７℃で終夜培養した結果、黄色を呈するコロニーは得られなかった。一方、カテコールを噴霧した結果、黄色を呈するコロニーが得られた。
以上のことより、配列番号４の遺伝子が、新規な単一の成分からなる芳香環水酸化酵素をコードしていることが明らかになった。さらに、この芳香環水酸化酵素をコードする遺伝子を導入することにより、水酸化された化合物が生産されることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】環境ＤＮＡより得られた芳香環水酸化酵素遺伝子とカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子の位置関係及びフェノールの変換様式を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の芳香族化合物（芳香環）の分解において最も重要な役割を果たす酵素の１つである芳香環水酸化酵素、及び該酵素をコードする遺伝子、並びにこの遺伝子群を導入・発現した微生物を利用した水酸化された芳香族化合物の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
芳香族化合物の多くは細胞に対し毒性を示し環境中において汚染物質となる。これらを分解資化する微生物は自然界に多く分離しており、これまでに数多く分離されている。好気的な条件において芳香族化合物の分解は初発酸素添加反応により開始され、共通の中間代謝産物であるカテコールを経て水と二酸化炭素にまで分解されるが、中でも初発酵素である芳香環水酸化酵素は芳香族化合物の分解において最も重要な役割を果たすことが明らかにされている（非特許文献１、２）。
【０００３】
微生物を活用する低分子化合物の製造や分解といった物質変換プロセスは、従来の化学的な変換プロセスに比べ、反応特異性（基質特性や立体特性や位置特異性）が高いこと、温和な条件（常温常圧）で反応可能であること、有害な副産物が生成しにくいことなどの特徴を有している。とりわけ酸化反応は、苛酷な化学プロセスに代替可能な酵素プロセスへの転換が求められており、酸化酵素の探索が盛んに行われている。
【０００４】
芳香族化合物は、医薬品原料、化学原料として広く利用されている。芳香環に水酸基を導入することは、芳香族化合物に様々な官能基を導入する起点でもあり、芳香族化合物の物質変換プロセスの中でもとくに重要なプロセスである。現在までに芳香環水酸化酵素に関する研究が広く行われてきたが、芳香環水酸化酵素は、通常、水酸化本体酵素（α−サブユニットとβ−サブユニットとγ−サブユニットの３つのサブユニットからなる）以外にフェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）及びフェレドキシンレダクターゼ（還元酵素）（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）という非常に複雑な多成分複合酵素（ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ）として機能を発揮することが一般的である（非特許文献３及び特許文献１、２）。
【０００５】
しかしながら、このように複雑なサブユニット構成、分子複合体は、一般に工業利用に適しておらず、シングルポリペプチド鎖からなる単純な蛋白質で同等の機能を発揮しうる蛋白質が強く求められている。そのため、これまでに知られている多成分複合酵素とは異なる単一の成分からなる新規な水酸化酵素は、水酸化された芳香族化合物の製造において非常に有用である。
【０００６】
【非特許文献１】Harayama et al., (1997) Polycyclic aromatic hydrocarbon bioremediation design. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 268-273.
【非特許文献２】Furukawa et al., (2004) Biphenyl dioxygenases: Functional versatilities and directed evolution. J. Bacteriol. 186, 5189-5196.
【非特許文献３】Gibson et al., (2000) Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 11, 236-243.
【特許文献１】WO2004/050875
【特許文献２】特開2000-69968
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解消する点にあり、シングルポリペプチド鎖の単純な蛋白質からなる新規芳香環水酸化酵素、及びその遺伝子を見い出し、生物学的な手法によって芳香環の水酸化を工業的に行うための手段を新たに提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、新規な単一成分の水酸化酵素を取得し、これを適切なベクターを用いて微生物に導入し、菌体内にこの遺伝子の保持する形質転換体を得ることが出来れば、微生物触媒による芳香族化合物の水酸化反応を簡便に行えると考え、これについて鋭意検討した結果、活性汚泥を環境試料としたＤＮＡライブラリより、単一の成分からなる新規水酸化酵素をコードするＤＮＡ断片を取得することに成功した。そして、このＤＮＡ断片を含む組換えベクターを用いて微生物を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、水酸化された芳香族化合物が生産されることを見いだして、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質。
（２）上記（１）に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）配列番号２で示される塩基配列を含むか、あるいは配列番号２で示される塩基配列において、１又は数個のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を有する塩基配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（４）配列番号２で示される塩基配列又は該塩基配列と相補の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ芳香環水酸化酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（５）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質。
（６）上記（５）に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（７）配列番号４で示される塩基配列を含むか、あるいは配列番号４で示される塩基配列において、１又は数個のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を有する塩基配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（８）配列番号４で示される塩基配列又は該塩基配列と相補の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ芳香環水酸化酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（９）上記（２）から（４）あるいは（６）から（８）のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（１０）上記（９）に記載の組換えベクターを含有する微生物。
（１１）微生物が大腸菌であることを特徴とする上記（１０）に記載の微生物。
（１２）上記（１０）又は（１１）に記載の微生物を、芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とする、水酸化された芳香族化合物の製造法。
【発明の効果】
【００１０】
通常、芳香環水酸化酵素は非常に複雑な多成分複合酵素として機能を発揮することが一般的である。これらの遺伝子を組換え微生物に導入して発現させる場合においては、その全ての成分遺伝子が発現する必要があり、何らかの理由で何れかの遺伝子のひとつでも発現が低下した場合にはそれに伴い水酸化能力が低下し、全く発現しない成分遺伝子が存在した場合には水酸化能力は完全に失われる。また、各種成分酵素はそれぞれ至適の反応条件（温度、pH等）を保有しているので、全ての成分酵素が至適である反応条件を設定することは困難であり、効率的な水酸化反応のための条件設定は非常に困難である。本発明で提供する芳香環水酸化酵素タンパク質は、シングルポリペプチド鎖からなる単純な蛋白質のため、遺伝子発現及び水酸化反応の最適化のための条件設定が飛躍的に容易になる。さらに芳香環水酸化酵素遺伝子の全長も短縮されるため、プラスミド構築や微生物導入といった遺伝子工学実験の作業においても高効率化が期待できる。以上の理由により、該タンパク質をコードする遺伝子を保持する微生物は、種々の作業や最適化のための条件設定が飛躍的に容易になり、芳香族化合物の水酸化がより簡便化、効率的になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の芳香環水酸化酵素タンパク質の具体例は、活性汚泥から構築した環境DNAライブラリーをスクリーニングして得られたDNA由来のタンパク質であって、芳香環水酸化酵素として機能するシングルポリペプチド鎖の３９７あるいは５１２アミノ酸からなるタンパク質である。そのアミノ酸配列は配列表の配列番号１および３に示される。
また、本発明の芳香環水素酵素タンパク質は、上記配列番号１および３に示されるもののみではなく、該配列番号１および３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を有し、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するような軽微な変異を有するタンパク質であっても良い。このような変異としては、自然変異のみではなく、突然変異あるいは例えば遺伝子工学的手法を用いた変異等の人為的変異も含まれる。
【００１２】
本発明の芳香環水酸化酵素タンパク質の遺伝子は、上記配列番号１および３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質あるいはその上記変異タンパク質をコードするものであれば特に制限はないが、その具体的なものとしては、配列表の配列番号２および４に示され塩基配列を有するか、あるいは上記配列番号２および４に示される塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが付加、欠失又は置換された塩基配列を有し、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられ、さらに、上記配列番号２および４で示される塩基配列あるいはその相補配列を有する遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズするものであって、芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
【００１３】
このような遺伝子は、タンパク質はＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより、例えば、細菌由来の遺伝子をスクリーングすることにより得られる。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、配列番号２の１位から１１９４位までの塩基配列と相同性が６０％以上、好ましくは９０％以上であるＤＮＡとが特異的にハイブリダイズする条件である。ストリンジェントな条件としてより具体的には、４２℃において、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ溶液中でハイブリダイゼーションを行い、次いで、４２℃において、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄を行う条件が挙げられる。
【００１４】
本発明の遺伝子は、例えば以下の手順で得ることができる。
本発明の芳香環水酸化酵素遺伝子は、芳香環を含むと考えられる土壌、河川および海洋の水または堆積物、活性汚泥等の環境試料からＤＮＡを採取し、物理的あるいは酵素的あるいは化学的に剪断した当該ＤＮＡをプラスミド、ファージ、フォスミド等のベクターに連結し、該ベクターにより宿主微生物を形質転換し、当該組換えベクターを含む微生物ライブラリーを作製する。ここで、芳香環水酸化酵素の近傍には、連続する代謝反応を触媒するカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子が存在していることが知られていることに着目し、目的の遺伝子を保持するクローンの選択を行うことが出来る。すなわち、微生物ライブラリーにカテコールを噴霧し、黄色を呈するクローンを選択すれば、そのクローン中にカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子が含まれることが判明する。これを指標にライブラリーをスクリーニングし、近接する芳香環水酸化酵素を取得することが可能である。
【００１５】
また、このほか、配列番号２および４で示される塩基配列を基に化学合成することもできる。
さらに、上記したように、このようにして得られた遺伝子と他の遺伝子とがストリンジェント条件下、ハイブリダイズするか否かを指標としてスクリーニングすることにより、芳香環水酸化酵素遺伝子を得ることもでき、あるいは上記得られた遺伝子にそれ自体周知の変異導入法を用いて、変異体タンパク質からなる芳香環水酸化酵素遺伝子を得ることもできる。
【００１６】
本発明の芳香環水酸化酵素遺伝子は適当な発現ベクターに挿入し、微生物に導入して発現させることにより、芳香環水酸化能力を保持する微生物を作製することが可能である。使用できるベクターとしてはｐＵＣベクターなどが例示でき、また、宿主とする微生物については大腸菌ＪＭ１０９などを例示できる。
上記の芳香環水酸化酵素遺伝子を大腸菌等の微生物に導入し、発現させた組換え微生物を用いて種々の芳香族化合物と混合培養することで、これらの芳香族化合物に特異的に水酸基を導入することができる。
本発明の方法により、例えばフェノールを基質として用いた際に変換産物としてカテコールが得られるが、本発明の方法によって製造される芳香族化合物はカテコールに限定されるわけではなく、基質としては、トルエン、スチレン、クレゾール、クロロベンゼン等の芳香族化合物の他、ナフタレン、フェナントレン、アントラセン等の多環芳香族化合物、２−フェニルインドール、１−フェニルピラゾール等の複素芳香環化合物等を挙げることができる。
以下に、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
〔実施例１〕
芳香環水酸化酵素遺伝子の単離及び解析
（１）環境ＤＮＡライブラリーの作製
活性汚泥より抽出した環境ＤＮＡを、ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌ Ｆｏｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）に添付のＥｎｄ−Ｒｅｐａｉｒ Ｅｎｚｙｍｅを用いて末端の平滑化を行った。その後パルスフィールド電気泳動により平均鎖長３３−４８ｋｂ付近の大きさのＤＮＡをゲルから分画した。β−アガラーゼ（ＮＥＢ社）を用いて切り出した断片からＤＮＡを精製した。
【００１８】
次いで調製したインサートＤＮＡ断片とｐＣＣ１ＦＯＳフォスミドベクター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）とで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行った。ベクターライゲーション後、ＭａｘＰｌａｎｋ Ｌａｍｂｄａ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔｓ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行った。宿主大腸菌としてＥＰＩ３００（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）を使用した。１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地で、λファージにより形質転換した大腸菌をクロラムフェニコール耐性により選択した。
【００１９】
大腸菌のコロニーを取り、１２．５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地１ｍＬ中で、３７℃で１８時間、１２００ｒｐｍで培養した。ついで、このコロニーを採取した大腸菌の培養液のうち２００μＬを新しい８００μＬの２×ＹＴ培地に移して混合し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３０分間培養した後、１μＬのＣｏｐｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）を添加し、宿主大腸菌ＥＰＩ３００が保有するフォスミドベクターのコピー数を増加させた。さらに大腸菌を３７℃で２時間、１２００ｒｐｍで激しく振とうしながら培養した後、遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁した。その後、１５０μＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｌｕｓ Ｂｅｎｚｏａｔｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を添加して、大腸菌の細胞を溶解させた。続いて、遠心分離により分離された上清を細胞抽出液として得た。
【００２０】
次に、カテコール（東京化成社）を最終濃度が０．５ｍＭとなるように、５μＬずつ、１００μＬの細胞抽出液に添加し、２５℃において２５０ｒｐｍで混合しながら反応を行った。１時間および１６時間後に、カテコールの分解により、２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドの形成により黄色を示すフォスミドクローンを選択した。
【００２１】
（２）塩基配列の決定
カテコール分解活性を示すクローンより、ＦｏｓｍｉｄＭＡＸ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）を用いてフォスミドＤＮＡを抽出した。次いで、当該ＤＮＡをＤＮＡ断片化装置（Ｇｅｎｅ ｍａｃｈｉｎｅｓ社）を用いてランダムに断片化し、アガロースゲル電気泳動により分画後、約２ｋｂ−３ｋｂのＤＮＡを含むアガロース断片を切り出した。切り出したアガロース断片よりＤＮＡを精製後、Ｔ４ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片の平滑化を行った。平滑化したＤＮＡ断片は、脱リン酸化処理を行った５０ｎｇのｐＵＣ１１８／ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰとベクターライゲーション反応を行った後、エタノール沈殿を行い、１０μＬの滅菌水に溶解した。
【００２２】
作製したライブラリーの一部をライゲーション溶液１μＬ、宿主大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２５μＬを用いて、エレクトロポレーション法（Ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ、ＢＩＯ ＲＡＤ社）により大腸菌に導入した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【００２３】
Ｑ−Ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ社）を用いて２８８個の大腸菌白コロニーをランダムにピッキングした。９６穴のプレートに分注した１２０μＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地にそれぞれ植菌し、３７℃で終夜培養を行った。上記培養液にＴｅｍｐｌｉＰｈｉＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を使用して、シーケンス用鋳型を調製した。ＴｅｍｐｌｉＰｈｉの反応は付属の取扱説明書に従った。
【００２４】
次に、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉにより調製したＤＮＡを鋳型として塩基配列の解析を行った。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）によりシークエンス反応を行った。付属の取扱説明書に従いＰＣＲ、精製を行い、ＡＢＩ３７３０ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いて解析を行った。塩基配列の解析にはＡｒｔｅｍｉｓ（Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いた。
【００２５】
塩基配列のホモロジー解析を行った結果、図１に示すように、カテコール分解活性を示すフォスミドクローンの挿入断片中にはカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子の他に、芳香環水酸化酵素遺伝子が存在した。芳香環水酸化酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１および３に、ＤＮＡ塩基配列を配列番号２および４にそれぞれ示す。
【００２６】
〔実施例２〕
芳香環水酸化酵素の発現及びその活性の確認
上記実施例１で得られた配列番号２のＤＮＡが水酸化酵素をコードすることを確認する実験を行った。まず芳香環水酸化酵素遺伝子およびカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。５’末端のプライマーとしてＰＨＥ−Ｆ（配列番号５）、及び５’末端のプライマーとしてＰＨＥ−Ｒ（配列番号６）を合成した。ＰＣＲは９８℃で１０秒、６０℃で５秒、７２℃で２分の処理を１サイクルとして合計２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を精製し、さらに制限酵素ＸｂａＩで処理した。このインサートＤＮＡと、ＨｉｎｃＩＩとＸｂａＩで処理したｐＵＣ１９ベクターを合計１０μＬになるように混合し、ライゲーション反応を行った。ＤＮＡを回収し、ヒートショック法で大腸菌ＪＭ１０９株に挿入し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【００２７】
得られた大腸菌形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、さらに１００μＭのフェノールを含むＬＢ寒天培地にストリークし３７℃で終夜培養した結果、黄色を呈するコロニーが得られた。分光光度計により解析を行い、得られた黄色化合物は、３７５ｎｍに最大吸収波長を持つ２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドであることを確認した。従って配列番号２の遺伝子は、単一の成分からなる芳香環水酸化酵素をコードし、当該水酸化酵素はフェノールをカテコールに変換し、下流に存在するカテコール２，３−ジオキシゲナーゼによりカテコールが２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドに変換されていることを確認した。
【００２８】
比較として、５’末端のプライマーとしてＥＤＯ−Ｆ（配列番号７）、及び３’末端のプライマーとしてＰＨＥ−Ｒ（配列番号６）を用いて、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。上記記載の手順と同様にして得られた大腸菌形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、さらに１００μＭのフェノールを含むＬＢ寒天培地にストリークし３７℃で終夜培養した結果、黄色を呈するコロニーは得られなかった。一方、カテコールを噴霧した結果、黄色を呈するコロニーが得られた。
以上のことより、配列番号２の遺伝子が、新規な単一の成分からなる芳香環水酸化酵素をコードしていることが明らかになった。さらに、この芳香環水酸化酵素をコードする遺伝子を導入することにより、水酸化された化合物が生産されることが明らかになった。
【００２９】
〔実施例３〕
芳香環水酸化酵素の発現及びその活性の確認
上記実施例１で得られた配列番号４のＤＮＡが水酸化酵素をコードすることを確認する実験を行った。まず芳香環水酸化酵素遺伝子およびカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。５’末端のプライマーとしてＰＨＥ２−Ｆ（配列番号８）、及び５’末端のプライマーとしてＰＨＥ２−Ｒ（配列番号９）を合成した。ＰＣＲは９８℃で１０秒、６０℃で５秒、７２℃で２分の処理を１サイクルとして合計２５サイクル行った。ＰＣＲ産物を精製し、さらに制限酵素ＫｐｎＩで処理した。このインサートＤＮＡと、ＫｐｎＩで処理したｐＵＣ１９ベクターを合計１０μＬになるように混合し、ライゲーション反応を行った。ＤＮＡを回収し、ヒートショック法で大腸菌ＪＭ１０９株に挿入し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で、３７℃で終夜培養し、形質転換体を得た。
【００３０】
得られた大腸菌形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、さらに１００μＭのフェノールを含むＬＢ寒天培地にストリークし３７℃で終夜培養した結果、黄色を呈するコロニーが得られた。分光光度計により解析を行い、得られた黄色化合物は、３７５ｎｍに最大吸収波長を持つ２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドであることを確認した。従って配列番号２の遺伝子は、単一の成分からなる芳香環水酸化酵素をコードし、当該水酸化酵素はフェノールをカテコールに変換し、下流に存在するカテコール２，３−ジオキシゲナーゼによりカテコールが２−ヒドロキシムコネート セミアルデヒドに変換されていることを確認した。
【００３１】
比較として、５’末端のプライマーとしてＥＤＯ−Ｆ（配列番号７）、及び３’末端のプライマーとしてＰＨＥ２−Ｒ（配列番号９）を用いて、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。上記記載の手順と同様にして得られた大腸菌形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、１００μＭ／ｍＬのＩＰＴＧ、さらに１００μＭのフェノールを含むＬＢ寒天培地にストリークし３７℃で終夜培養した結果、黄色を呈するコロニーは得られなかった。一方、カテコールを噴霧した結果、黄色を呈するコロニーが得られた。
以上のことより、配列番号４の遺伝子が、新規な単一の成分からなる芳香環水酸化酵素をコードしていることが明らかになった。さらに、この芳香環水酸化酵素をコードする遺伝子を導入することにより、水酸化された化合物が生産されることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】環境ＤＮＡより得られた芳香環水酸化酵素遺伝子とカテコール２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子の位置関係及びフェノールの変換様式を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列を含むか、あるいは配列番号２で示される塩基配列において、１又は数個のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を有する塩基配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号２で示される塩基配列又は該塩基配列と相補の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ芳香環水酸化酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
配列番号４で示される塩基配列を含むか、あるいは配列番号４で示される塩基配列において、１又は数個のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を有する塩基配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
配列番号４で示される塩基配列又は該塩基配列と相補の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ芳香環水酸化酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項２から４および６から８のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含有する微生物。
【請求項１１】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の微生物を、芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とする、水酸化された芳香族化合物の製造法。
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
配列番号２で示される塩基配列を含むか、あるいは配列番号２で示される塩基配列において、１又は数個のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を有する塩基配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号２で示される塩基配列又は該塩基配列と相補の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ芳香環水酸化酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むか、あるいは配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項７】
配列番号４で示される塩基配列を含むか、あるいは配列番号４で示される塩基配列において、１又は数個のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を有する塩基配列を含み、かつ芳香環水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
配列番号４で示される塩基配列又は該塩基配列と相補の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ芳香環水酸化酵素を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項２から４および６から８のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含有する微生物。
【請求項１１】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の微生物を、芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とする、水酸化された芳香族化合物の製造法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２５４３４２（Ｐ２００９−２５４３４２Ａ）
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１４８６２（Ｐ２００８−２１４８６２）
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００８年度（平成２０年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００８年度（平成２０年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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