新規シュードモナス属細菌およびそれを含む植物病害防除剤
【課題】本発明の課題は、植物の病害（茎葉病害、土壌病害など）に対して防除効果が高く、化学農薬のように耐性菌が出現する可能性が低い、環境汚染のない病害防除剤を提供することである。
【解決手段】シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物病害防除剤。
【解決手段】シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物病害防除剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）に属する細菌の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物の病害防除剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病害の主要な防除方法として、現在数多くの化学合成農薬が使用されている。しかしながら、これらの化学合成農薬の過剰な投与、繰り返し投与、少ない作用点などにより近年、植物病原菌の化学合成農薬への耐性化が問題となっている。また、環境問題や健康問題などの観点からも化学合成農薬への過度な依存は問題視されつつある。また、土壌病害の防除では、土壌が介在するため薬剤が直接に病原菌に作用しにくく、有効な薬剤が少ないとされ、その被害は現在、拡大傾向にある。
【０００３】
近年、農園芸植物の病害防除法として、安全性や効果の持続性を考慮して、病害を引き起こす病原菌と拮抗する微生物を用いる病害防除法が注目され、研究開発が行われている。拮抗微生物の中でも、シュードモナス属細菌については多くの研究がなされ、以下のような例が報告されている。
１．シュードモナス フルオレッセンスによるウリ科野菜の苗立枯病防除例（特許文献１）
２．シュードモナス グルメ菌株によるナス科野菜の土壌病害防除例（特許文献２）
３．シュードモナス グルメ菌株によるフザリウム病害の防除例（特許文献３）
４．シュードモナス セパシア（AGF-158菌株）によるイネ苗床病害の防除例（特許文献４）
５．シュードモナス エスピー（CAB02菌株）によるイネ苗立枯れ性病害の防除例（特許文献５）
６．シュードモナス エスピー（CGF-72菌株）によるフザリウム病害、バーティシリウム病害防除例（特許文献６）
７．シュードモナス フルオレッセンス菌株とシュードモナス プチダ菌株による小麦の茎葉汚染病害の防除例（特許文献７）
８．シュードモナス フルオレッセンスによる花部や茎葉部の灰色かび病の防除例（特許文献８）
【０００４】
しかしながら、対象とする病害は土壌病害または茎葉病害に限定された発明であり、土壌病害および茎葉病害の両者に対して防除効果を発揮できる、病害対象の広いシュードモナス属細菌の例はほとんど報告されていない。従来、シュードモナス ロデシアは、多環芳香族などの難分解性物質を分解する菌として知られているのみであり、農業分野での使用はされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭63−190806号公報
【特許文献２】特開昭63-246306号公報
【特許文献３】特開平2-59504号公報
【特許文献４】特開平7-25716号公報
【特許文献５】特開平9-124427号公報
【特許文献６】特開平9-255513号公報
【特許文献７】特開平2-149507号公報
【特許文献８】特開2004-346028号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、植物の病害（茎葉病害、土壌病害など）に対して防除効果が高く、化学農薬のように耐性菌が出現する可能性が低い、環境汚染のない病害防除剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物病害防除剤を提供する。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物病害防除剤。
（２）シュードモナス ロデシアがＣＢ２−４菌株（FERM P-21748）又はその変異株である（１）に記載の植物病害防除剤。
（３）シュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株(FERM P-21748）。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のシュードモナス ロデシアはこれまで農業用病害防除剤としては報告例のない新規な菌株であり、レタス根腐病、芝ピシウム病害などの土壌病害に加え、キュウリ灰色かび病、キュウリうどんこ病などの茎葉病害にも防除効果を持つ、実用性の高い微生物である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の植物病害防除剤は、シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体を含む。本発明に用いるシュードモナス ロデシアとしては、植物の茎葉病害および土壌病害の発病を顕著に抑制することができるシュードモナス ロデシアの菌株またはその変異株が挙げられる。本発明の菌株又は変異株は、好ましくは、シュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株またはその変異株である。
【００１１】
本発明のシュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）ＣＢ２−４菌株は、キュウリ灰色かび病、キュウリうどんこ病などの茎葉病害、および芝ピシウム病害、レタス根腐れ病などの土壌病害の発病を顕著に抑制することができる。本発明のシュードモナス
ロデシア ＣＢ２−４菌株は、千葉県の畑土壌より分離した。この菌株は、平成２０年１２月１１日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、FERM P-21748の受託番号で受託されている。この菌株は以下の形態学的性質を有する。
形態 ： 桿菌
グラム染色性 ： −
胞子形成 ： −
運動性 ： ＋
酸素に対する態度： 好気性
生育温度 ： ４℃〜３７℃
蛍光色素の生成 ： ＋
【００１２】
また、16S rDNA配列のBLAST検索によりシュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）基準株と１００％の相同率を示したため、シュードモナス ロデシアと同定した。ＣＢ２−４菌株の16S rDNA配列を配列番号１に示す。
【００１３】
本発明における「変異株」には、上述したような植物の茎葉病害および土壌病害の両方を防除する効果を有する菌株である限り、シュードモナス ロデシアから誘導されたいかなる変異株も含まれる。変異株は、シュードモナス ロデシアを紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなど）などを用いた人為的変異手段により変異誘発し、病害防除効果を有する株を選択することによって得ることができる。また、上記病害防除効果を有する限り、シュードモナス ロデシアの自然変異株も含まれる。
【００１４】
本発明における「病害防除」とは、植物の病害を予防又は治癒する効果を意味する。
ここでいう「植物病害を予防する」とは、土壌病害の場合には、病原菌を含む土壌でそれに感染しうる植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用しなかった植物の発病度（後述の実施例２，４参照）より、防除剤を施用した植物の発病度が低いことをいう。また、茎葉病害の場合には、病原菌を接種してそれに感染しうる植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用しなかった植物の発病度（後述の実施例２，４参照）より、防除剤を施用した植物の発病度が低いことをいう。さらに、「植物病害を治癒する」とは、病害に感染した植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用した植物の病気の程度が防除剤を施用しなかった植物における病気の程度より低下することをいう。
本発明における「植物の病害を防除する」には、具体的には、例えば後述の実施例２，４の実験を行った場合の防除価が、通常４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは９０％以上である場合が含まれる。
【００１５】
本発明における「植物」は、本発明の防除剤が対象とする病原菌が感染する植物である限り特に制限はない。本発明のシュードモナス ロデシアは、キュウリなどの植物の茎葉病害、およびレタス、芝などの植物の土壌病害の防除へ適用できる。
【００１６】
本発明における「植物の病害」は、本発明のシュードモナス ロデシアが、防除効果を発揮する植物病害であれば特に制限はないが、病原菌が植物に感染することにより引き起こされる植物の病害が好ましく、茎葉病害および土壌病害がより好ましい。
本発明において防除の対象となる茎葉病害としては、灰色かび病、うどんこ病、好ましくは、キュウリ灰色かび病、キュウリうどんこ病などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において防除の対象となる土壌病害とは、好ましくは、土壌伝染性病害であり、より詳細には、フザリウム属菌、ゴイマノマイセス属菌、リゾクトニア属菌、ピシウム属菌、バーティシリウム属菌、フィトフトラ属菌、スクレロチウム属菌、コルティシウム属、プラスモディオフォラ属菌、リゾプス属菌、トリコデルマ属菌、ミクロドチウム属菌、スクレロチニア属菌のいずれか１種以上に起因する土壌病害であるが、これらに限定されない。これらの土壌病害の具体例としては、芝ピシウム病害、レタス根腐れ病などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
シュードモナス ロデシアの培養方法は特に限定されないが、例えば、種菌培養と本培養の二段階に分けて培養することができる。種菌培養としては、例えば、蒸留水に溶解した乾燥ブイヨンを添加した試験管中で、28℃、200rpmの条件で2日間往復振とうすることにより培養することができる。本培養としては、例えば、蒸留水に溶解した乾燥ブイヨンを添加したバッフル付三角フラスコ中で、種菌培養で得られた菌体培養液を、28℃、120rpmの条件で3日間振とうすることにより培養することができる。
得られた培養物は、そのまま、または菌体を濃縮した後にショ糖懸濁液として用いることができる。本発明の好ましい実施態様において、本発明の病害防除剤は、実施例の製造例に記載されているような方法を用いて製造することができる。
本発明における「培養物」は、水や油等の液体により培養物から分離された菌体およびその濃縮物を含むものである。
【００１８】
本発明の防除剤は、シュードモナス ロデシアの菌体を、ショ糖、水等の液体に単に懸濁することにより製造することもできるが、他の成分を配合し、液剤、粉剤、粒剤、煙霧剤等の製剤として製造することもできる。他の配合成分としては、液体担体、固体担体、界面活性剤（乳化剤、分散剤、消泡剤等）、補助剤等が挙げられ、これらの1種又は２種以上を混合して使用することもできる。
【００１９】
液体担体としては、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。また、固体担体としては、例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の高分子性天然物が挙げられる。また、界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−脂肪アルコールエーテル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、アルキルスルホネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネート等が挙げられる。補助剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリオキシアチレングリコール、アラビアゴム、デンプン、乳糖などが挙げられる。
【００２０】
また、水系溶媒を担体とする液剤として製造する場合、溶媒中での菌体の水和性を向上させるために、水溶性高分子を添加することもできる。水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。さらに、シュードモナス ロデシアの植物の根部への付着性の向上、および製剤中でのシュードモナス ロデシアの安定性の向上を図るために、キシログルカン、グアーガムなどの多糖類を配合することもできる。
【００２１】
本発明の防除剤に含まれるシュードモナス ロデシアの濃度は、本発明の効果を損なわない限り特に制限はないが、製剤として１０6〜１０13 CFU/g（コロニー形成単位）、好ましくは１０8〜１０12 CFU/g（コロニー形成単位）である。また、用いるシュードモナス ロデシアの防除効果等に応じて適宜変更することができる。
また、粒剤又は粉剤の形態で本発明の防除剤を使用する場合は、防除剤の重量の１０〜５００００倍の重量になるように水またはショ糖で希釈して使用することができ、好ましくは１００〜１００００倍の重量になるように希釈して使用することができる。
また、本発明の防除剤は、上記の物質の他に、本発明の効果を妨げない限り、防除剤等に含まれるシュードモナス ロデシアの培養に用いた培地等の任意の物質を含んでいてもよい。
【００２２】
本発明の防除剤の使用方法については、特に制限はないが、剤型等の使用形態、作物や病害によって適宜選択され、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、水面施用、施設内施用、土壌混和施用、土壌潅注施用、表面処理（種子粉衣、塗布処理等）育苗箱施用法、単花処理、株元処理等の方法を挙げることができるが、好ましくは、各種剤型の防除剤を栽培植物の種子・種イモにコートする、栽培植物の花に単花処理する、栽培植物の茎葉に処理する、栽培植物の傷口箇所、剪定部に塗布処理する、土壌潅注する、土壌混和する等の方法が挙げられる。ここで、土壌に施用する場合は、本発明の防除剤を土壌に施用してから栽培植物を植えてもよく、また、栽培植物を土壌に植えた後で本発明の防除剤をその土壌に施用してもよい。
本発明の植物病害防除剤は、好ましくは、茎葉病害を防除するために、茎葉に噴霧される。本発明の植物病害防除剤は、好ましくは、土壌病害を防除するために、噴霧または潅注される。
【００２３】
また、本発明の防除剤を栽培植物に施用する場合は、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除
草剤、殺菌剤、植物生長調節剤、肥料、土壌改良資材（泥炭、腐植酸資材、ポリビニルアルコール系資材等）等を混合施用、あるいは混合せずに同時施用または交互施用することもできる。
本発明の防除剤の施用量については特に制限はないが、病害の種類、適用植物の種類、防除剤の形態等によって適宜調節することができる。例えば、液剤の防除剤を地上散布する場合には、その散布液中のシュードモナス ロデシアの濃度は、通常１０3〜１０9ＣＦＵ／ｍＬ（コロニー形成単位）、好ましくは１０5〜１０8ＣＦＵ／ｍＬ（コロニー形成単位）であり、その施用量は、０．５〜 １００Ｌ／ａとすることができる。また、粒剤、粉剤等はなんら希釈することなく製剤のままで施用することもできる。粒剤、粉剤等を地上散布する場合は、シュードモナス ロデシアの施用量が、１０8〜１０13ＣＦＵ／ａ程度となるように散布することが好ましい。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ、限定を受けないことは言うまでもない。
【００２５】
＜培養製造例＞
（種菌培養）乾燥ブイヨン「ニッスイ」（日水製薬株式会社）30ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、試験管に１０ｍｌずつ入れ滅菌後、シュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株を無菌的に移植し、28℃、200rpmの条件で2日間往復振とう培養した。
（本培養）乾燥ブイヨン（日水製薬株式会社）30ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、500mlのバッフル付三角フラスコに100mlずつ入れ滅菌後、上記した種菌培養で得られた菌体培養液を2ml無菌的に移植した。28℃、120rpmの条件で3日間振とう培養したところ、2×１０9CFU/mlのシュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株培養物が得られた。この培養物から菌体を遠心分離により濃縮した後、20％ショ糖液で懸濁し、菌数を１×１０10CFU/mlに調整し、植物病害防除剤を調製した。以後、適宜希釈しての病害防除試験に用いた。直ぐに使用しない場合、この懸濁液は−30℃で保存可能である。
【００２６】
＜実施例１＞
（キュウリ子葉を用いた灰色かび病防除試験）
グロースチャンバーで子葉が展開するまで育てたキュウリ（品種：光３号P型）より子葉を切断し、湿らせたキムタオルを敷いたタッパーに並べた。次にポテトデキストロースブロス（DIFCO社）を1.0％含有する0.2％寒天液に灰色かび病胞子1×105胞子/mlを加え、病原菌胞子液を作成した。
この病原菌胞子液に培養製造例で作成したＣＢ２−４菌株を1×106、1×107CFU/mlになるように添加し、よく攪拌したものをタッパー内のキュウリ子葉の上に各30μｌずつスポットし、フタをして湿度を100％に保った。25℃のインキュベーター内に３日間放置した後、ＣＢ２−４菌株添加区、無添加区で子葉上に形成された病斑の面積を比較することにより防除価を算出した。
その結果を表１に示した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１に示されるように、ＣＢ２−４菌株 １×１０5ＣＦＵ／ｍｌ添加区では７０％の防除価を示し、１×１０6ＣＦＵ／ｍｌ添加区、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ添加区では１００％の防除価を示すことが判明した。
【００２９】
＜実施例２＞
（キュウリうどんこ病防除試験）
キュウリうどんこ病は、キュウリうどんこ病に罹病した葉から分生子を洗い落とし、2×105個/mlの分生胞子懸濁液を作製し、これを接種源として、温室内で育てたキュウリ（品種：相模半白）の本葉３葉目にスプレーガンで噴霧接種し、所定の時間温室内で維持することにより発病させた。
うどんこ病の発病度は以下の基準で目視により病斑面積率を指数化した。
試験剤は、培養製造例で作成したＣＢ２−４菌株を1×106、1×107CFU/mlになるように水で希釈した後、展着剤グラミンS（三共アグロ(株)） 0.1％を添加して作製し、１株あたり12ｍｌをスプレーガンにて噴霧した。参考例としては化学剤モレスタン水和剤（アグロカネショウ(株)）を用いた。
各試験区は1区1ポット、3反復で実施し、発病度の平均値を算出し、その結果を表２に示した。
【００３０】
指数 １葉当たりの病斑面積
0 : 発病なし
10 : 病斑が葉面積の1〜10％
20 : 同11〜20％
30 : 同21〜30％
40 : 同31〜40％
50 : 同41〜50％
60 ： 同51〜60％
70 ： 同61〜70％
80 : 同71〜80％
90 : 同81〜90％
100 : 同91％以上
【００３１】
【表２】
【００３２】
表２に示されるように、ＣＢ２−４菌株 １×１０6ＣＦＵ／ｍｌ添加区では０％の防除価であったが、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ添加区では５０％の防除価を示すことが判明した。
【００３３】
＜実施例３＞
（芝ピシウム病害防除試験）
芝はベントグラス（品種：ハイランド）を温室内でトレー（17×21ｃｍ）で25日間育てたものを用いた。芝ピシウム病害は、芝ピシウム菌（Pythium sp.）をPDA培地で培養し、菌叢の先端部を直径4mmのアガーボーラーで打ち抜いたものを接種源とし、１トレイ当り４ヶ所に芝の地際部付近に接するように置床した。接種した植物は温室内に設置した簡易ハウス内にいれ高湿度を維持した。
接種６日後の病斑面積を比較することにより防除価を算出した。
試験剤は、培養製造例で作成したＣＢ２−４菌株を1×106、1×107CFU/mlになるように水で希釈した後、展着剤グラミンS（三共アグロ(株)） 0.1％を添加して作製し、１トレイあたり30ｍｌをスプレーガンにて噴霧した。参考例としては化学剤タチガレン（三共アグロ(株)）を用いた。
各試験区は1区1トレイ、3反復で実施し、病斑面積の平均値を算出し、その結果を表３に示した。
【００３４】
【表３】
【００３５】
表３に示されるように、ＣＢ２−４菌株 １×１０6ＣＦＵ／ｍｌ添加区では６６．５％の防除価を示し、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ添加区では７８．８％の防除価を示すことが判明した。
【００３６】
＜実施例４＞
（レタス根腐れ病防除試験）
レタス(品種:カイザー)を、育苗培土をつめた72ウエルセルトレイに播種し、16日後に試験剤を所定量潅注し、さらに5日間栽培した。レタス根腐病菌汚染土壌は、ふすま培地で培養したレタス根腐病菌（Fusarium oxysporum）を滅菌土壌に混和することにより作製した。これをポットにつめ、その中にセルトレイで作製した上記レタス苗を移植し、14日間栽培した。ここで2回目の試験剤潅注を行い、さらに18日間栽培し、レタス根部の維管束の褐変状態を評価した。発病率及び防除価は以下の基準で指数化し、算出した。
試験剤は、培養製造例で作成したＣＢ２−４菌株を1×106、1×107CFU/mlになるように水で希釈して作製し、1株あたり10ｍｌを株元に潅注処理した。参考例としは化学剤タチガレン（三共アグロ(株)）を用いた。
【００３７】
0 : 病斑なし
0.5 ： 主根維管束部に非常にわずかな褐変あり
1 : 主根維管束部にわずかな褐変あり
2 : 主根維管束に明瞭な褐変あり
3 : 主根維管束に著しい褐変あり、又は枯死
a) 発病率（％）＝100×（0.5×n0.5＋1×n1＋2×n2＋3×n3）/ 3×N
[n0.5=発病度0.5の個体数, n1=発病度1の個体数, n2=発病度2の個体数, n3=発病度3の個体数, N=試験苗数]
b) 防除価 ＝ 100×(無処理区発病率 − 処理区発病率）/ 無処理区発病率
【００３８】
試験は1区1ポット、5反復で実施し、発病度の平均値を算出し、その結果を表４に示した。
【００３９】
【表４】
【００４０】
表４に示されるように、ＣＢ２−４菌株 １×１０6ＣＦＵ／ｍｌ添加区では０％の防
除価であったが、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ添加区では４７．０％の防除価を示すことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のシュードモナス ロデシアは、土壌病害および茎葉病害などの植物病害を防除する能力を有し、産業上有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）に属する細菌の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物の病害防除剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病害の主要な防除方法として、現在数多くの化学合成農薬が使用されている。しかしながら、これらの化学合成農薬の過剰な投与、繰り返し投与、少ない作用点などにより近年、植物病原菌の化学合成農薬への耐性化が問題となっている。また、環境問題や健康問題などの観点からも化学合成農薬への過度な依存は問題視されつつある。また、土壌病害の防除では、土壌が介在するため薬剤が直接に病原菌に作用しにくく、有効な薬剤が少ないとされ、その被害は現在、拡大傾向にある。
【０００３】
近年、農園芸植物の病害防除法として、安全性や効果の持続性を考慮して、病害を引き起こす病原菌と拮抗する微生物を用いる病害防除法が注目され、研究開発が行われている。拮抗微生物の中でも、シュードモナス属細菌については多くの研究がなされ、以下のような例が報告されている。
１．シュードモナス フルオレッセンスによるウリ科野菜の苗立枯病防除例（特許文献１）
２．シュードモナス グルメ菌株によるナス科野菜の土壌病害防除例（特許文献２）
３．シュードモナス グルメ菌株によるフザリウム病害の防除例（特許文献３）
４．シュードモナス セパシア（AGF-158菌株）によるイネ苗床病害の防除例（特許文献４）
５．シュードモナス エスピー（CAB02菌株）によるイネ苗立枯れ性病害の防除例（特許文献５）
６．シュードモナス エスピー（CGF-72菌株）によるフザリウム病害、バーティシリウム病害防除例（特許文献６）
７．シュードモナス フルオレッセンス菌株とシュードモナス プチダ菌株による小麦の茎葉汚染病害の防除例（特許文献７）
８．シュードモナス フルオレッセンスによる花部や茎葉部の灰色かび病の防除例（特許文献８）
【０００４】
しかしながら、対象とする病害は土壌病害または茎葉病害に限定された発明であり、土壌病害および茎葉病害の両者に対して防除効果を発揮できる、病害対象の広いシュードモナス属細菌の例はほとんど報告されていない。従来、シュードモナス ロデシアは、多環芳香族などの難分解性物質を分解する菌として知られているのみであり、農業分野での使用はされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭63−190806号公報
【特許文献２】特開昭63-246306号公報
【特許文献３】特開平2-59504号公報
【特許文献４】特開平7-25716号公報
【特許文献５】特開平9-124427号公報
【特許文献６】特開平9-255513号公報
【特許文献７】特開平2-149507号公報
【特許文献８】特開2004-346028号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、植物の病害（茎葉病害、土壌病害など）に対して防除効果が高く、化学農薬のように耐性菌が出現する可能性が低い、環境汚染のない病害防除剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物病害防除剤を提供する。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物病害防除剤。
（２）シュードモナス ロデシアがＣＢ２−４菌株（FERM P-21748）又はその変異株である（１）に記載の植物病害防除剤。
（３）シュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株(FERM P-21748）。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のシュードモナス ロデシアはこれまで農業用病害防除剤としては報告例のない新規な菌株であり、レタス根腐病、芝ピシウム病害などの土壌病害に加え、キュウリ灰色かび病、キュウリうどんこ病などの茎葉病害にも防除効果を持つ、実用性の高い微生物である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の植物病害防除剤は、シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体を含む。本発明に用いるシュードモナス ロデシアとしては、植物の茎葉病害および土壌病害の発病を顕著に抑制することができるシュードモナス ロデシアの菌株またはその変異株が挙げられる。本発明の菌株又は変異株は、好ましくは、シュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株またはその変異株である。
【００１１】
本発明のシュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）ＣＢ２−４菌株は、キュウリ灰色かび病、キュウリうどんこ病などの茎葉病害、および芝ピシウム病害、レタス根腐れ病などの土壌病害の発病を顕著に抑制することができる。本発明のシュードモナス
ロデシア ＣＢ２−４菌株は、千葉県の畑土壌より分離した。この菌株は、平成２０年１２月１１日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、FERM P-21748の受託番号で受託されている。この菌株は以下の形態学的性質を有する。
形態 ： 桿菌
グラム染色性 ： −
胞子形成 ： −
運動性 ： ＋
酸素に対する態度： 好気性
生育温度 ： ４℃〜３７℃
蛍光色素の生成 ： ＋
【００１２】
また、16S rDNA配列のBLAST検索によりシュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）基準株と１００％の相同率を示したため、シュードモナス ロデシアと同定した。ＣＢ２−４菌株の16S rDNA配列を配列番号１に示す。
【００１３】
本発明における「変異株」には、上述したような植物の茎葉病害および土壌病害の両方を防除する効果を有する菌株である限り、シュードモナス ロデシアから誘導されたいかなる変異株も含まれる。変異株は、シュードモナス ロデシアを紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなど）などを用いた人為的変異手段により変異誘発し、病害防除効果を有する株を選択することによって得ることができる。また、上記病害防除効果を有する限り、シュードモナス ロデシアの自然変異株も含まれる。
【００１４】
本発明における「病害防除」とは、植物の病害を予防又は治癒する効果を意味する。
ここでいう「植物病害を予防する」とは、土壌病害の場合には、病原菌を含む土壌でそれに感染しうる植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用しなかった植物の発病度（後述の実施例２，４参照）より、防除剤を施用した植物の発病度が低いことをいう。また、茎葉病害の場合には、病原菌を接種してそれに感染しうる植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用しなかった植物の発病度（後述の実施例２，４参照）より、防除剤を施用した植物の発病度が低いことをいう。さらに、「植物病害を治癒する」とは、病害に感染した植物を一定期間栽培した場合に、防除剤を施用した植物の病気の程度が防除剤を施用しなかった植物における病気の程度より低下することをいう。
本発明における「植物の病害を防除する」には、具体的には、例えば後述の実施例２，４の実験を行った場合の防除価が、通常４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは９０％以上である場合が含まれる。
【００１５】
本発明における「植物」は、本発明の防除剤が対象とする病原菌が感染する植物である限り特に制限はない。本発明のシュードモナス ロデシアは、キュウリなどの植物の茎葉病害、およびレタス、芝などの植物の土壌病害の防除へ適用できる。
【００１６】
本発明における「植物の病害」は、本発明のシュードモナス ロデシアが、防除効果を発揮する植物病害であれば特に制限はないが、病原菌が植物に感染することにより引き起こされる植物の病害が好ましく、茎葉病害および土壌病害がより好ましい。
本発明において防除の対象となる茎葉病害としては、灰色かび病、うどんこ病、好ましくは、キュウリ灰色かび病、キュウリうどんこ病などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において防除の対象となる土壌病害とは、好ましくは、土壌伝染性病害であり、より詳細には、フザリウム属菌、ゴイマノマイセス属菌、リゾクトニア属菌、ピシウム属菌、バーティシリウム属菌、フィトフトラ属菌、スクレロチウム属菌、コルティシウム属、プラスモディオフォラ属菌、リゾプス属菌、トリコデルマ属菌、ミクロドチウム属菌、スクレロチニア属菌のいずれか１種以上に起因する土壌病害であるが、これらに限定されない。これらの土壌病害の具体例としては、芝ピシウム病害、レタス根腐れ病などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
シュードモナス ロデシアの培養方法は特に限定されないが、例えば、種菌培養と本培養の二段階に分けて培養することができる。種菌培養としては、例えば、蒸留水に溶解した乾燥ブイヨンを添加した試験管中で、28℃、200rpmの条件で2日間往復振とうすることにより培養することができる。本培養としては、例えば、蒸留水に溶解した乾燥ブイヨンを添加したバッフル付三角フラスコ中で、種菌培養で得られた菌体培養液を、28℃、120rpmの条件で3日間振とうすることにより培養することができる。
得られた培養物は、そのまま、または菌体を濃縮した後にショ糖懸濁液として用いることができる。本発明の好ましい実施態様において、本発明の病害防除剤は、実施例の製造例に記載されているような方法を用いて製造することができる。
本発明における「培養物」は、水や油等の液体により培養物から分離された菌体およびその濃縮物を含むものである。
【００１８】
本発明の防除剤は、シュードモナス ロデシアの菌体を、ショ糖、水等の液体に単に懸濁することにより製造することもできるが、他の成分を配合し、液剤、粉剤、粒剤、煙霧剤等の製剤として製造することもできる。他の配合成分としては、液体担体、固体担体、界面活性剤（乳化剤、分散剤、消泡剤等）、補助剤等が挙げられ、これらの1種又は２種以上を混合して使用することもできる。
【００１９】
液体担体としては、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。また、固体担体としては、例えば、カオリン、粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト、珪藻土等の天然鉱物粉末、ケイ酸、アルミナ、ケイ酸塩等の合成鉱物粉末、結晶性セルロース、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の高分子性天然物が挙げられる。また、界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン−脂肪アルコールエーテル、アルキルアリールポリグリコールエーテル、アルキルスルホネート、アルキルサルフェート、アリールスルフォネート等が挙げられる。補助剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリオキシアチレングリコール、アラビアゴム、デンプン、乳糖などが挙げられる。
【００２０】
また、水系溶媒を担体とする液剤として製造する場合、溶媒中での菌体の水和性を向上させるために、水溶性高分子を添加することもできる。水溶性高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアミン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミドなどが挙げられる。さらに、シュードモナス ロデシアの植物の根部への付着性の向上、および製剤中でのシュードモナス ロデシアの安定性の向上を図るために、キシログルカン、グアーガムなどの多糖類を配合することもできる。
【００２１】
本発明の防除剤に含まれるシュードモナス ロデシアの濃度は、本発明の効果を損なわない限り特に制限はないが、製剤として１０6〜１０13 CFU/g（コロニー形成単位）、好ましくは１０8〜１０12 CFU/g（コロニー形成単位）である。また、用いるシュードモナス ロデシアの防除効果等に応じて適宜変更することができる。
また、粒剤又は粉剤の形態で本発明の防除剤を使用する場合は、防除剤の重量の１０〜５００００倍の重量になるように水またはショ糖で希釈して使用することができ、好ましくは１００〜１００００倍の重量になるように希釈して使用することができる。
また、本発明の防除剤は、上記の物質の他に、本発明の効果を妨げない限り、防除剤等に含まれるシュードモナス ロデシアの培養に用いた培地等の任意の物質を含んでいてもよい。
【００２２】
本発明の防除剤の使用方法については、特に制限はないが、剤型等の使用形態、作物や病害によって適宜選択され、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、水面施用、施設内施用、土壌混和施用、土壌潅注施用、表面処理（種子粉衣、塗布処理等）育苗箱施用法、単花処理、株元処理等の方法を挙げることができるが、好ましくは、各種剤型の防除剤を栽培植物の種子・種イモにコートする、栽培植物の花に単花処理する、栽培植物の茎葉に処理する、栽培植物の傷口箇所、剪定部に塗布処理する、土壌潅注する、土壌混和する等の方法が挙げられる。ここで、土壌に施用する場合は、本発明の防除剤を土壌に施用してから栽培植物を植えてもよく、また、栽培植物を土壌に植えた後で本発明の防除剤をその土壌に施用してもよい。
本発明の植物病害防除剤は、好ましくは、茎葉病害を防除するために、茎葉に噴霧される。本発明の植物病害防除剤は、好ましくは、土壌病害を防除するために、噴霧または潅注される。
【００２３】
また、本発明の防除剤を栽培植物に施用する場合は、殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除
草剤、殺菌剤、植物生長調節剤、肥料、土壌改良資材（泥炭、腐植酸資材、ポリビニルアルコール系資材等）等を混合施用、あるいは混合せずに同時施用または交互施用することもできる。
本発明の防除剤の施用量については特に制限はないが、病害の種類、適用植物の種類、防除剤の形態等によって適宜調節することができる。例えば、液剤の防除剤を地上散布する場合には、その散布液中のシュードモナス ロデシアの濃度は、通常１０3〜１０9ＣＦＵ／ｍＬ（コロニー形成単位）、好ましくは１０5〜１０8ＣＦＵ／ｍＬ（コロニー形成単位）であり、その施用量は、０．５〜 １００Ｌ／ａとすることができる。また、粒剤、粉剤等はなんら希釈することなく製剤のままで施用することもできる。粒剤、粉剤等を地上散布する場合は、シュードモナス ロデシアの施用量が、１０8〜１０13ＣＦＵ／ａ程度となるように散布することが好ましい。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ、限定を受けないことは言うまでもない。
【００２５】
＜培養製造例＞
（種菌培養）乾燥ブイヨン「ニッスイ」（日水製薬株式会社）30ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、試験管に１０ｍｌずつ入れ滅菌後、シュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株を無菌的に移植し、28℃、200rpmの条件で2日間往復振とう培養した。
（本培養）乾燥ブイヨン（日水製薬株式会社）30ｇを蒸留水１Ｌに溶解し、500mlのバッフル付三角フラスコに100mlずつ入れ滅菌後、上記した種菌培養で得られた菌体培養液を2ml無菌的に移植した。28℃、120rpmの条件で3日間振とう培養したところ、2×１０9CFU/mlのシュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株培養物が得られた。この培養物から菌体を遠心分離により濃縮した後、20％ショ糖液で懸濁し、菌数を１×１０10CFU/mlに調整し、植物病害防除剤を調製した。以後、適宜希釈しての病害防除試験に用いた。直ぐに使用しない場合、この懸濁液は−30℃で保存可能である。
【００２６】
＜実施例１＞
（キュウリ子葉を用いた灰色かび病防除試験）
グロースチャンバーで子葉が展開するまで育てたキュウリ（品種：光３号P型）より子葉を切断し、湿らせたキムタオルを敷いたタッパーに並べた。次にポテトデキストロースブロス（DIFCO社）を1.0％含有する0.2％寒天液に灰色かび病胞子1×105胞子/mlを加え、病原菌胞子液を作成した。
この病原菌胞子液に培養製造例で作成したＣＢ２−４菌株を1×106、1×107CFU/mlになるように添加し、よく攪拌したものをタッパー内のキュウリ子葉の上に各30μｌずつスポットし、フタをして湿度を100％に保った。25℃のインキュベーター内に３日間放置した後、ＣＢ２−４菌株添加区、無添加区で子葉上に形成された病斑の面積を比較することにより防除価を算出した。
その結果を表１に示した。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１に示されるように、ＣＢ２−４菌株 １×１０5ＣＦＵ／ｍｌ添加区では７０％の防除価を示し、１×１０6ＣＦＵ／ｍｌ添加区、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ添加区では１００％の防除価を示すことが判明した。
【００２９】
＜実施例２＞
（キュウリうどんこ病防除試験）
キュウリうどんこ病は、キュウリうどんこ病に罹病した葉から分生子を洗い落とし、2×105個/mlの分生胞子懸濁液を作製し、これを接種源として、温室内で育てたキュウリ（品種：相模半白）の本葉３葉目にスプレーガンで噴霧接種し、所定の時間温室内で維持することにより発病させた。
うどんこ病の発病度は以下の基準で目視により病斑面積率を指数化した。
試験剤は、培養製造例で作成したＣＢ２−４菌株を1×106、1×107CFU/mlになるように水で希釈した後、展着剤グラミンS（三共アグロ(株)） 0.1％を添加して作製し、１株あたり12ｍｌをスプレーガンにて噴霧した。参考例としては化学剤モレスタン水和剤（アグロカネショウ(株)）を用いた。
各試験区は1区1ポット、3反復で実施し、発病度の平均値を算出し、その結果を表２に示した。
【００３０】
指数 １葉当たりの病斑面積
0 : 発病なし
10 : 病斑が葉面積の1〜10％
20 : 同11〜20％
30 : 同21〜30％
40 : 同31〜40％
50 : 同41〜50％
60 ： 同51〜60％
70 ： 同61〜70％
80 : 同71〜80％
90 : 同81〜90％
100 : 同91％以上
【００３１】
【表２】
【００３２】
表２に示されるように、ＣＢ２−４菌株 １×１０6ＣＦＵ／ｍｌ添加区では０％の防除価であったが、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ添加区では５０％の防除価を示すことが判明した。
【００３３】
＜実施例３＞
（芝ピシウム病害防除試験）
芝はベントグラス（品種：ハイランド）を温室内でトレー（17×21ｃｍ）で25日間育てたものを用いた。芝ピシウム病害は、芝ピシウム菌（Pythium sp.）をPDA培地で培養し、菌叢の先端部を直径4mmのアガーボーラーで打ち抜いたものを接種源とし、１トレイ当り４ヶ所に芝の地際部付近に接するように置床した。接種した植物は温室内に設置した簡易ハウス内にいれ高湿度を維持した。
接種６日後の病斑面積を比較することにより防除価を算出した。
試験剤は、培養製造例で作成したＣＢ２−４菌株を1×106、1×107CFU/mlになるように水で希釈した後、展着剤グラミンS（三共アグロ(株)） 0.1％を添加して作製し、１トレイあたり30ｍｌをスプレーガンにて噴霧した。参考例としては化学剤タチガレン（三共アグロ(株)）を用いた。
各試験区は1区1トレイ、3反復で実施し、病斑面積の平均値を算出し、その結果を表３に示した。
【００３４】
【表３】
【００３５】
表３に示されるように、ＣＢ２−４菌株 １×１０6ＣＦＵ／ｍｌ添加区では６６．５％の防除価を示し、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ添加区では７８．８％の防除価を示すことが判明した。
【００３６】
＜実施例４＞
（レタス根腐れ病防除試験）
レタス(品種:カイザー)を、育苗培土をつめた72ウエルセルトレイに播種し、16日後に試験剤を所定量潅注し、さらに5日間栽培した。レタス根腐病菌汚染土壌は、ふすま培地で培養したレタス根腐病菌（Fusarium oxysporum）を滅菌土壌に混和することにより作製した。これをポットにつめ、その中にセルトレイで作製した上記レタス苗を移植し、14日間栽培した。ここで2回目の試験剤潅注を行い、さらに18日間栽培し、レタス根部の維管束の褐変状態を評価した。発病率及び防除価は以下の基準で指数化し、算出した。
試験剤は、培養製造例で作成したＣＢ２−４菌株を1×106、1×107CFU/mlになるように水で希釈して作製し、1株あたり10ｍｌを株元に潅注処理した。参考例としは化学剤タチガレン（三共アグロ(株)）を用いた。
【００３７】
0 : 病斑なし
0.5 ： 主根維管束部に非常にわずかな褐変あり
1 : 主根維管束部にわずかな褐変あり
2 : 主根維管束に明瞭な褐変あり
3 : 主根維管束に著しい褐変あり、又は枯死
a) 発病率（％）＝100×（0.5×n0.5＋1×n1＋2×n2＋3×n3）/ 3×N
[n0.5=発病度0.5の個体数, n1=発病度1の個体数, n2=発病度2の個体数, n3=発病度3の個体数, N=試験苗数]
b) 防除価 ＝ 100×(無処理区発病率 − 処理区発病率）/ 無処理区発病率
【００３８】
試験は1区1ポット、5反復で実施し、発病度の平均値を算出し、その結果を表４に示した。
【００３９】
【表４】
【００４０】
表４に示されるように、ＣＢ２−４菌株 １×１０6ＣＦＵ／ｍｌ添加区では０％の防
除価であったが、１×１０7ＣＦＵ／ｍｌ添加区では４７．０％の防除価を示すことが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のシュードモナス ロデシアは、土壌病害および茎葉病害などの植物病害を防除する能力を有し、産業上有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物病害防除剤。
【請求項２】
シュードモナス ロデシアがＣＢ２−４菌株（FERM P-21748）又はその変異株である請求項１に記載の植物病害防除剤。
【請求項３】
シュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株(FERM P-21748）。
【請求項１】
シュードモナス ロデシア（Pseudomonas rhodesiae）の菌体またはその培養物を含むことを特徴とする植物病害防除剤。
【請求項２】
シュードモナス ロデシアがＣＢ２−４菌株（FERM P-21748）又はその変異株である請求項１に記載の植物病害防除剤。
【請求項３】
シュードモナス ロデシア ＣＢ２−４菌株(FERM P-21748）。
【公開番号】特開２０１０−２２９０５２（Ｐ２０１０−２２９０５２Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７６４５３（Ｐ２００９−７６４５３）
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（０００１８３６４６）出光興産株式会社 (2,069)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（０００１８３６４６）出光興産株式会社 (2,069)
【Ｆターム（参考）】
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