新規ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質構築物及びＨＰＶ疾患の予防におけるそれらの使用
本開示は新規なヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質構築物およびＨＰＶ疾患の予防におけるそれらの使用を提供する。これらの構築物は、Ｌ１タンパク質内に挿入されているＨＰＶ Ｌ２ペプチドを含むＬ１タンパク質を含むキメラタンパク質である。このようなキメラタンパク質は、免疫原性組成物、例えばワクチン組成物に製剤化することができ、所望により、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰに基づくワクチンとともに製剤化することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はヒトワクチンの分野に関する。より詳しくは、本開示は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染または疾患の予防または治療のための医薬・免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスは、極めて種特異的な小型のＤＮＡ腫瘍ウイルスである。ヒトパピローマウイルスは、基底上皮（皮膚または粘膜）細胞に感染するＤＮＡウイルスである。これまでに１００を超える独特なヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型が記載されている。ＨＰＶは、一般に、皮膚の扁平上皮に特異的であるか（例え、ＨＰＶ−１およびＨＰＶ−２）または粘膜表面に特異的であるか（例えば、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１）のいずれかであり、通常は、数ヶ月間または数年間持続する良性の腫瘍（疣贅）生じる。
【０００３】
癌原性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型による持続的感染は、世界的に女性の癌による２番目に多い死因である子宮頸癌の必須要因である。遺伝子型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６６を含む「高リスク」遺伝子型が子宮頸癌を招くおそれがあり、他の粘膜肛門性器癌および頭頸部癌にも関連するという国際的な共通認識がある。世界的にみて、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８が、累積して全ての浸潤性子宮頸癌原因の７０〜８０％超を占める主要な癌原型である。
【０００４】
「低リスク」と呼ばれる他の遺伝子型による感染は良性または低悪性度の子宮頸組織変化および女性では子宮頚、膣、陰門および肛門、また男性では陰茎、陰嚢または肛門上の腫瘍である性器疣贅（尖圭コンジローム）を生じさせる。それらはまた、小児および成人の声帯に、外科的介入を必要とする上皮性腫瘍を生じさせる（若年性呼吸器系乳頭腫症または再発性呼吸器系乳頭腫症）。
【０００５】
最近、多くの国で、２種類の予防用ＨＰＶワクチンが認可された。双方とも、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８子宮頸前癌病変および癌を予防するための、個々のＨＰＶ型の組換えＬ１キャプシドタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いるものである。Ｃｅｒｖａｒｉｘ（商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）は、バキュロウイルス現ベクター系を用いてキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞基質で生産され、免疫賦活薬３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および水酸化アルミニウム塩とともに処方されたＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ ＶＬＰを含む。Ｇａｒｄａｓｉｌ（商標）（Ｍｅｒｃｋ）は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で生産され、非晶質アルミニウムヒドロキシリン酸硫酸塩とともに処方されたＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ ＶＬＰを含む。さらに、Ｇａｒｄａｓｉｌ（商標）は、性器疣贅の７５〜９０％に関連する非癌原型ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１由来のＶＬＰを含む。両ワクチンとも、癌原型ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８による感染および関連の前癌病変に対する特異的防護が無作為化臨床試験で実証されている。
【０００６】
子宮頸癌を引き起こす原因となる癌原性ＨＰＶのリストには、子宮頸癌に見られる少なくとも１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７３型のＨＰＶが含まれる（Ｍａｈｄａｖｉ ｅｔ ａｌ, ２００５； Ｑｕｉｎｔ ｅｔ ａｌ., ２００６）。
【０００７】
既存のワクチンは、これらのＨＰＶ型のいくつかによる感染および／または疾患に対する特異的防護を様々な程度で提供することができる。しかしながら、子宮頸癌を引き起こすＨＰＶ型の全てに対して適用域をさらに向上させるために他のＨＰＶ型に由来する抗原を含むか、または関連の、また無関連のＨＰＶ型に対して広い交差防護を惹起するかのいずれかのワクチンを得ることがおそらく有益であろう。ＨＰＶ５またはＨＰＶ８またはＨＰＶ３８またはこれらの２つ以上の任意の組合せなど、皮膚癌を引き起こすＨＰＶ型に対してさらに効果的なワクチンを得ることも有益であろう。
【０００８】
現在認可されているＬ１ ＶＬＰワクチンに加え、例えば、ＷＯ２００３／０９７６７３、ＷＯ２００４／０５２３９５、ＷＯ２００６／０８３９８４、ＷＯ２００９／００１８６７、Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ８０, ８４１‐８４６, Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ ２００６ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５８, ２６６‐２７２, Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ ２００９ ２５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕs Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ８−１４ｔｈ Ｍａｙ, Ｍａｌｍｏ, Ｓｗｅｄｅｎ, Ｃｏｕｒｓａｇｅｔ ｅｔ ａｌ, ２５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ８−１４ｔｈ Ｍａｙ, Ｍａｌｍｏ, Ｓｗｅｄｅｎ, Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｖａｃｃｉｎｅ ２５, ２００１‐２０１０, Ｘｕ ｅｔ ａｌ ２００６ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １５１, ２１３３‐２１４８, Ｇａｍｂｈｉｒａ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１, １３９２７−１３９３１, Ａｌｐｈｓ ｅｔ ａｌ ２００８ ＰＮＡＳ １０５, ５８５０−５， Ｋａｗａｎａ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｖａｃｃｉｎｅ ２１, ４２５６‐６０, Ｋａｗａｎａ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｖａｃｃｉｎｅ １９, １４９６‐１５０２では、Ｌ２のペプチドがＨＰＶワクチンに使用するために提案されている。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、性器疣贅に関連するさらなる癌を引き起こすＨＰＶ型および／または低リスクＨＰＶ型に対する防護をもたらす抗原を含む、ヒトパピローマウイルスに対する改良型ワクチンに関する。これらの改良型ワクチンは、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドが挿入されたキメラＬ１ポリペプチドを含む。
【００１０】
本発明の一実施形態では、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片が提供される。一実施形態では、このポリペプチドはＬ２ポリペプチドの少なくとも２つのペプチドを含む。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００１２】
本発明のキメラポリペプチドは、カプソマーまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）として提供することができる。このようなポリペプチド、カプソマーおよびＶＬＰは、免疫原性組成物として処方(製剤化)することができる。それらの製造方法、確認方法および例えばＨＰＶ感染予防用薬剤におけるそれらの使用方法が記載される。
【００１３】
本発明はさらに、
（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む少なくとも１つのキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰ
を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、各Ｌ１がそのＬ１配列中にＬ２ペプチドを含む、２以上のキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰの組合せを含む組成物を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ＨＰＶ感染に関連する障害の予防または治療に使用するための、
（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む少なくとも１つのキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰ
を含む組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、ＨＰＶ感染に関連する障害の予防または治療に使用するための、Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む、２以上のキメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰの組合せを含む組成物を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ＨＰＶ感染に関連する障害の予防または治療ための薬剤(医薬)の製造における、
（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む少なくとも１つのキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰ
の使用を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、ＨＰＶ感染に関連する障害の予防または治療のための薬剤の調製における、Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む、２以上のキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰの組合せの使用を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、Ｌ１配列中に２以上のＬ２ペプチドを含むキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰを提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する抗体を誘導する方法を提供する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する中和抗体を誘導する方法を提供する。このような方法はまた、交差中和抗体を誘導することもできる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する細胞性免疫を誘導する方法を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する中和抗体および細胞性免疫を誘導する方法を提供する。このような方法はまた交差中和抗体を誘導することもできる。
【００２４】
本発明はさらに、本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染に関連するＨＰＶ疾患を予防する方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、（ｉｉ）Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む少なくとも１つのキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰと、（ｉｉｉ）薬学上許容される希釈剤または担体と、所望により（ｉｖ）アジュバントを合わせて本明細書に記載の免疫原性組成物を作製することを含む、免疫原性組成物の調製方法を提供する。本発明はさらに、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、本明細書に記載のキメラポリペプチドの精製方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む２以上のキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰを合わせることを含む、免疫原性組成物の調製方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのペプチドエピトープを含むＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドと薬学上許容される希釈剤または担体を合わせることを含む、組成物の調製方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＣ末端切断型Ｌ１配列を示す図である。図１（ａ）および（ｂ）のＨＰＶ１６配列およびＨＰＶ１８配列のアミノ酸番号はそれぞれ、本明細書を通じ、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＬ１に関して用いられる。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図２Ａ】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｌ１の露出ループと、Ｌ１配列へのＬ２ペプチドの挿入位置の例を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きである。
【図２Ｄ】図２Ｃの続きである。
【図３Ａ】露出ループ領域およびＣ末端侵入アーム領域におけるＨＰＶ１６、１８および他の型のＬ１配列のアライメントを示す図である。一番上の配列が、図１に示されるＨＰＶ１６Ｌ１配列である。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】図３Ｂの続きである。
【図３Ｄ】図３Ｃの続きである。
【図３Ｅ】図３Ｄの続きである。
【図３Ｆ】図３Ｅの続きである。
【図３Ｇ】図３Ｆの続きである。
【図３Ｈ】図３Ｇの続きである。
【図３Ｉ】図３Ｈの続きである。
【図３Ｊ】図３Ｉの続きである。
【図３Ｋ】図３Ｊの続きである。
【図３Ｌ】図３Ｋの続きである。
【図４】種々の異なるＨＰＶ型由来のＬ２ペプチドを示す図である。
【図５】キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの精製に関するフローチャートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
序論
本開示は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染によって引き起こされる疾患の予防および治療のための組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、主要キャプシドタンパク質Ｌ１とＬ２と呼ばれる主要キャプシドタンパク質の免疫原性成分を含有するキメラポリペプチドに関する。本明細書で開示されるキメラポリペプチドは、少なくとも１つのＬ２ペプチドが挿入されたＬ１ポリペプチドを含む。Ｌ２ペプチドは、Ｌ２ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを含むように選択される。
【００３０】
一実施形態では、Ｌ１ポリペプチドは、ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドである。従って、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドが挿入された、ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む。例えば、Ｌ２ペプチドは、１８型以外のＨＰＶ型に由来することできる（すなわち、非ＨＰＶ１８型Ｌ２ペプチド）。好都合には、Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、そのペプチドが選択されたＬ２ポリペプチドを含む天然タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる。さらに、Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、少なくとも１つの付加的天然Ｌ２タンパク質に対しても免疫応答を誘導することができる。
【００３１】
一実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸１〜２００から、例えば、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸１〜１５０から選択される。特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１７〜３６を含むペプチド；ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基５６〜７５を含むペプチド；ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基９６〜１１５を含むペプチド；およびＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１０８〜１２０を含むペプチドからなる群から選択される。種々の実施形態では、Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は、配列番号１〜３１で表されるアミノ酸配列を含む。例示的な一実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ３３型Ｌ２のアミノ酸１７〜３６（ＨＰＶ１１型Ｌ２のアミノ酸１７〜３６と同一）からなる。別の例示的実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ５８型Ｌ２のアミノ酸５６〜７５（ＨＰＶ６型Ｌ２のアミノ酸５６〜７５と同一）からなる。より一般には、Ｌ２ペプチドは、少なくとも２つの異なるＨＰＶ型のＬ２ポリペプチドと同一の少なくとも８個の連続するアミノ酸（すなわち、２以上のＨＰＶ型の間のコンセンサス配列）を含むように選択することができる。
【００３２】
別の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むペプチドが挿入された、ＨＰＶ１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む。例えば、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ５８型などの癌原型ＨＰＶ由来のＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むことができる。
【００３３】
特定の実施形態では、Ｌ１ポリペプチドに挿入されてキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを形成するＬ２ペプチドは、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む。一実施形態では、Ｌ２ペプチドは、２つのシステイン間のジスルフィド結合を除去するか、またはジスルフィド結合を形成し得る２つのシステイン間のアミノ酸を除去するような、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する。好都合には、アミノ酸の挿入、欠失または置換を伴ってＬ２ペプチドを含むポリペプチドは、少なくとも１つの天然Ｌ２タンパク質（または天然に存在するＬ２ポリペプチド）に対して免疫応答を誘導することができる。
【００３４】
一実施形態では、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質は、１以上のアミノ酸のＣ末端欠失を有する。特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドの露出領域に挿入されている。種々の実施形態では、この露出ループは、ＤＥループ（例えば、アミノ酸１３２〜１４２の間）；ＦＧループ（例えば、アミノ酸１７２〜１８２の間）；ＨＩループ（例えば、アミノ酸３４５〜３５９の間）；および／またはＬ１ポリペプチドのＣ末端（例えば、アミノ酸４２９〜４４５の間）であり得る。一実施形態では、２以上のＬ２ペプチドが、Ｌ１ポリペプチド内に挿入される。例えば、２以上のＬ２ペプチドは、同じ部位に挿入することもできるし（例えば、連続する一連のアミノ酸またはコンカテマーとして）、またはＬ１ポリペプチドのＤＥループとＣ末端など、異なる部位に挿入することもできる。所望により、同じ部位に挿入される場合、２以上のＬ２ペプチドは、複数のアミノ酸を含むスペーサーによるなど、少なくとも１つの付加的アミノ酸によって連結することができる。２以上のＬ２ペプチドがＬ１ポリペプチドに挿入される場合、それらのＬ２ペプチドは同じであっても異なってもよい。一般に、Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は、天然Ｌ２ポリペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸を欠失させることなく、Ｌ１ポリペプチド内に挿入されている。他の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドの１以上のアミノ酸の欠失を伴ってＬ１ポリペプチドに挿入されている。
【００３６】
いくつかの実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２は、キメラポリペプチドの超分子アセンブリ、例えば、非晶質凝集物などのポリペプチド粒子、または例えば、カプソマーもしくはウイルス様粒子（ＶＬＰ）もしくは小型の非ＶＬＰ構造などのより規則的な構造である。
【００３７】
本開示の別の態様は、上記のようなキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このような核酸は、原核生物または真核生物発現ベクター中に提供することができる。好適な発現ベクターとしては、例えば、組換えバキュロウイルスが挙げられる。この組換え核酸、例えば、発現ベクターは、宿主細胞に導入する（例えば、感染させる、トランスフェクトするまたは形質転換させる）ことができる。このような宿主細胞もまた本開示の特徴である。これらの宿主細胞は、例えば組換えポリペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を複製することによって、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを生産するために使用可能である。所望により、このポリペプチドはその後、例えば、免疫原性組成物として処方する前に単離および／または精製することができる。
【００３８】
本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドはいずれも、ＨＰＶにより引き起こされる感染または疾患の予防または治療のための薬剤、例えば、免疫原性組成物（ワクチンなど）に使用することができる。これらの組成物は、免疫原性組成物をヒト被験体に投与することにより、ヒトにおいてＨＰＶに対する抗体を誘導する方法に用いるのに好適である。好都合には、ヒト被験体に免疫原性組成物を投与することは、ＨＰＶ感染または疾患を予防、改善または治療する抗体を誘導する。
【００３９】
従って、本開示はまた、ＨＰＶ感染または疾患の予防、改善または処置(治療)に使用するための免疫原性組成物を提供する。このような免疫原性組成物は、上記のようなキメラＬ１／Ｌ１ポリペプチド（例えば、タンパク質）、カプソマーまたはＶＬＰを薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物はまたアジュバントも含む。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、および／または３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。
【００４０】
一実施形態では、これらの組成物は、（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含んでなるか、またはそれらからなる少なくとも１つのウイルス様粒子（ＶＬＰ）；および（ｉｉ）Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドが挿入されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つのキメラポリペプチドを含む。本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドはいずれも（上述の超分子アセンブリ、ポリペプチド粒子、カプソマーおよび／またはＶＬＰＳを含む）、ＶＬＰをキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドと組み合わせて含有する組成物に使用するのに好適である。
【００４１】
一実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドと組み合わせて用いるためのＶＬＰは、Ｌ１ポリペプチドまたはその断片からなる。特定の実施形態では、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰはＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８Ｌ１ ＶＬＰである。同様に、キメラポリペプチドはまた、ＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片および／またはＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片を含み得る。
【００４２】
一実施形態では、例示的な一実施形態のこのような組成物は、Ｌ２ペプチドが挿入された、ＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、ＨＰＶ１８Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、またはＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片とＨＰＶ１８Ｌ１ポリペプチドもしくは断片の双方からなる（ｉｉ）の少なくとも１つのキメラポリペプチドを含む。上記で開示したように、これらのキメラペプチドは、Ｌ１ポリペプチドの１以上のアミノ酸のＣ末端欠失を伴ったＬ１ポリペプチドを含み得る。特定の一実施形態では、免疫原性組成物は、ＨＰＶ１６Ｌ１ ＶＬＰとＨＰＶ１８Ｌ１ ＶＬＰの双方、およびＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチドとＨＰＶ１８Ｌ１ポリペプチドの双方を含むキメラポリペプチドを含む。このような一実施形態では、ＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチドを含むキメラポリペプチド、およびＨＰＶ１８ポリペプチドを含むキメラポリペプチドは、異なるＬ２ペプチドを含むことができる。例示的Ｌ１断片は、Ｃ末端の３４個のアミノ酸を欠いたＨＰＶ１６Ｌ１、またはＣ末端の３５個のアミノ酸を欠いたＨＰＶ１８Ｌ１を含む。
【００４３】
同様に、別の実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドとともに含む２以上のキメラポリペプチドの組合せを含み得る。例えば、この組合せは、同じまたは異なるＬ１成分を有するキメラポリペプチドを含み得る。同様に、この組合せのキメラポリペプチドは、同じまたは異なるＬ２成分を含み得る。特定の一実施形態では、キメラポリペプチドは、同じＨＰＶ型のＬ１ポリペプチドを含み、Ｌ２ペプチドが異なる。
【００４４】
例示的な処方物では、免疫原性組成物は、ヒトの一用量当たり、各１０〜５０μｇの間のＶＬＰおよび／またはキメラポリペプチドを含む。一実施形態では、ＶＬＰおよび／またはキメラポリペプチドはそれぞれおよそ２０μｇの量で存在する。
【００４５】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つのキメラポリペプチドを、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つの挿入ペプチドと、または少なくとも１つの他のキメラポリペプチドと、または少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、薬学上許容される希釈剤または担体および所望によりアジュバントと一緒に合わせることにより調製することができる。
【００４６】
用語
本開示の種々の実施形態の総説を助けるため、以下の用語説明を示す。追加の用語および説明が本開示の中に示されている場合もある。
【００４７】
特に断りのない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を持つ。分子生物学の一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ, Ｇｅｎｅｓ Ｖ, ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ, １９９４ （ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）； Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ. （ｅｄｓ.）, Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ., １９９４ （ＩＳＢＮ 0-632-02182-9);およびＲｏｂｅｒｔ Ａ. Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ.）, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ, ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｉｎｃ., １９９５ （ＩＳＢＮ １−５６０８１‐５６９−８）に見出せる。
【００４８】
単数の用語「a」、「an」および「the」は、そうではないことが明示されない限り、複数の対象を含む。同様に、「または」という用語は、そうではないことが明示されない限り、「および」を含むものとする。「複数の」という用語は、２以上を指す。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示される、全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量またはモル質量値は概数であり、記述上のものであると理解すべきである。さらに、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して示される数値限界は、概数であるものとする。従って、濃度が少なくとも（例えば）２００ｐｇであると示される場合には、濃度は少なくともおよそ（または「約」または「〜」）２００ｐｇであると理解されることが意図される。
【００４９】
本明細書に記載されているものと同等または等価な方法および材料は本開示の実施または試験に使用可能であるが、以下、好適な方法および材料を記載する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。従って、文脈がそうではないことを必要としない限り、「含む（ｃｏｎｐｒｉｓｅｓ）」およびその変形（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」など）は、示された化合物または組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗原）もしくはステップまたは化合物群もしくは一連のステップの包含を意味し、他の任意の化合物、組成物、ステップまたはその群の排除を意味するのではないと理解される。省略形「例えば(e.g.)」は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ」からきたもので、本明細書では非限定例を示して用いられる。従って、省略形「ｅ.ｇ.」は、「ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ」という用語と同義である。
【００５０】
「ヒトパピローマウイルス」は、「ＨＰＶ」と略され、ヒトに感染することができるパピローマウイルス属のメンバーを表す。主要な２群のＨＰＶ（性器群および皮膚群）が存在し、それぞれが、遺伝的同一性によって分類される複数のウイルス「型」または「株」（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５８など）を含む。本開示においては、「型」は、ＨＰＶ、および／またはＨＰＶの特定の型に由来するポリペプチドを表すために使用することができる。「非」という言葉が頭に付く場合、示されたＨＰＶまたはポリペプチドは、示されたもの以外の少なくとも１つの他の型またはさらなる型のＨＰＶである。例えば、「ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチド」とは、ＨＰＶ１８型のＬ１ポリペプチドを表す。これに対し、「非ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチド」とは、ＨＰＶ１８型以外の任意の型のＬ１ポリペプチドを表す。
【００５１】
「ポリペプチド」とは、そのモノマーがアミド結合によって連結されたアミノ酸残基であるポリマーを表す。本明細書において「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの改変配列を含むものとする。「ポリペプチド」とは、具体的には、天然に存在するタンパク質、ならびに組換え生産または合成生産されたものを包含するものとする。ポリペプチドに関して「断片」とは、ポリペプチドの一部（すなわち、部分配列）を表す。「免疫原性断片」とは、全長参照タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの主要免疫原性エピトープを保持するポリペプチドのあらゆる断片を表す。ポリペプチド内の配向は一般に、個々のアミノ酸のアミノ部分およびカルボキシ部分の配向によって定義される、Ｎ末端からＣ末端方向に記載される。ポリペプチドはＮ末端またはアミノ末端からＣ末端またはカルボキシ末端に向かって翻訳される。
【００５２】
「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」とは、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの重合形態を表す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのヌクレオチドの改変形態であり得る。この用語には、一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡが含まれる。「単離されたポリヌクレオチド」とは、それが由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいて、それがすぐ隣接する両コード配列（５’末端上のものと３’末端上のもの）と隣接しないポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。核酸の５’および３’配向は、個々のヌクレオチド単位の連結に関して定義され、デオキシリボース（またはリボース）の糖環の炭素の位置に従って表される。ポリヌクレオチド配列の情報（コード）内容は、５’から３’の方向に読まれる。
【００５３】
核酸、ポリペプチドまたは別の細胞成分に関して「異種」とは、その成分が通常天然には見られないところに存在すること、および／または異なる供給源または種に由来することを示す。
【００５４】
「天然」および「天然に存在する」とは、それが天然にあるものと同じ状態で存在するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸などの要素を意味する。すなわち、その要素は人工的に改変されてない。本開示においては、種々の天然に存在するＨＰＶ型から得られる、多くの天然／天然に存在するＨＰＶ型（ならびにＨＰＶタンパク質およびポリペプチド）が存在すると理解される。
【００５５】
「変異体」は、核酸またはポリペプチドに関する場合（例えば、ＨＰＶ Ｌ１またはＬ２核酸またはポリペプチド）、参照核酸またはポリペプチドとは異なる核酸またはポリペプチドである。通常、変異体と参照核酸またはポリペプチドの間の違いは、参照物に比べて比較的少数の違いを構成する。変異体核酸は、比較される参照核酸と、１以上のヌクレオチドの付加、欠失もしくは置換によって、または人工ヌクレオチド類似体の置換によって異なり得る。同様に、変異体ポリペプチドは、比較される参照ポリペプチドと、１以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によって、またはアミノ酸類似体の置換によって異なり得る。
【００５６】
「抗原」は、動物において抗体の生産および／またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物または物質であり、動物に注射、吸収またはそうでなければ導入される組成物を含む。「抗原」とは、関連する全ての抗原性エピトープを含む。「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を表す。「主要抗原性エピトープ」または「主要エピトープ」は、機能的に有意な宿主免疫応答、例えば、抗体応答またはＴ細胞応答が生じるエピトープである。従って、病原体に対する防護免疫応答に関して、主要抗原性エピトープは、宿主免疫系によって認識された際に、病原体のよって引き起こされる疾患の防護をもたらす抗原性部分である。「Ｔ細胞エピトープ」とは、適当なＭＨＣ分子と結合した際に、Ｔ細胞が（Ｔ細胞受容体を介して）特異的に結合するエピトープを表す。「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体（またはＢ細胞受容体分子）が特異的に結合するエピトープである。
【００５７】
「免疫応答」は、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞または単球などの免疫系細胞の応答である。免疫応答は、抗原特異的中和抗体などの特異的抗体の生産をもたらすＢ細胞応答であり得る。免疫応答はまた、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答であり得る。いくつかの場合では、この応答は特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的応答」）。抗原が病原体に由来する場合には、抗原特異的応答は「病原体特異的応答」である。「防護免疫応答」は、病原体の有害な機能もしくは活性を阻害するか、病原体による感染を軽減するか、または病原体による感染の結果起こる症状（死を含む）を低減する免疫応答である。防護免疫応答は、例えば、プラーク減少アッセイもしくはＥＬＩＳＡ中和アッセイにおけるウイルス複製もしくはプラーク形成の阻害によって、またはin vivo病原体投与に対する耐性の測定によって測定することができる。
【００５８】
「アジュバント」は、免疫応答の生成を非特異的に増強する薬剤である。一般的なアジュバントとしては、抗原が吸着される無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液；油中水型および水中油型を含むエマルション（および二重エマルションおよび可逆的エマルションを含むその変形）、リポ糖類、リポ多糖類、免疫賦活核酸（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９アゴニスト）、およびこのような成分の種々の組合せが挙げられる。
【００５９】
「免疫原性組成物」は、例えば、ヒトパピローマウイルスなどの病原体に対して特異的な免疫応答を惹起することができる、ヒトまたは動物被験体（例えば、試験設定下で）に投与するのに好適なものの組成物である。従って、免疫原性組成物は、１以上の抗原（例えば、ウイルスの抗原性サブユニット、例えば、そのポリペプチド）または抗原性エピトープを含む。免疫原性組成物はまた、賦形剤、担体、および／またはアジュバントなどの免疫応答を惹起または増強することができる１以上の付加的成分を含むことができる。特定の場合において、免疫原性組成物は、病原体によって引き起こされる徴候または症状から被験体を保護する免疫応答を惹起するために投与される。いくつかの場合では、病原体によって引き起こされる徴候または疾患は、被験体が病原体に曝された後に病原体（例えば、ヒトパピローマウイルス）の複製を阻害することにより、予防（または治療、例えば、軽減または改善）される。例えば、本開示に関して、ヒトパピローマウイルスに対する防護的または待期的免疫応答を惹起することを目的に被験体または被験体集団に投与することを意図する免疫原性組成物の特定の実施形態が、ワクチン組成物またはワクチンである。
【００６０】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド
本発明は、ワクチン組成物へと処方(製剤化)することができ、ＨＰＶ感染および／または疾患に対して防護をもたらすための安全かつ効果的なワクチン組成物の必要を満たし、現在市販されているワクチンとは異なる、ポリペプチドに関する。特に、本発明は、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドの抗原性エピトープを含む少なくとも１つのペプチドが挿入されたＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドを含むキメラポリペプチドに関する。
【００６１】
本明細書で開示されるＨＰＶ Ｌ１およびＬ２ポリペプチドは、特に、高リスクの癌を引き起こすＨＰＶ型であるＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８または７３、および性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型、例えば、ＨＰＶ６または１１、および皮膚癌を引き起こす型、例えば、ＨＰＶ５型およびＨＰＶ８型、またはさらには尋常性疣贅に関連する２型および３型、および良性皮膚疣贅に関連するＨＰＶ７６型を含むＨＰＶのいずれの遺伝子型に由来してもよい。
【００６２】
例えば、一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を提供する。Ｌ２ポリペプチドのエピトープは、適切に提示された場合に、ヒトパピローマウイルス、例えば、天然に存在するヒトパピローマウイルス由来の天然（例えば、全長）Ｌ２ポリペプチドを認識する免疫応答を誘導することができるペプチドである。
【００６３】
別の実施形態では、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチド由来のアミノ酸５６〜７５を含む少なくとも１つのペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片が提供される。
【００６４】
Ｌ１ポリペプチドは、全長Ｌ１ポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、Ｌ１ポリペプチドは、Ｌ１の断片、例えば、ＮまたはＣ末端から１以上のアミノ酸が欠失することによる末端切断された断片である。よって、特定の実施形態では、Ｌ１ポリペプチドは、天然タンパク質（すなわち、天然に見られるタンパク質）に比べて一方の末端または両末端から１以上のアミノ酸が除去された末端切断型である。特定の実施形態では、Ｌ１ポリペプチドは、Ｃ末端欠失を有する。Ｌ１ ＨＰＶ１６配列の例を図１ａに示す。Ｌ１ ＨＰＶ１８配列の例を図１ｂに示す。
【００６５】
末端切断型Ｌ１タンパク質は、例えば、カプソマーまたはＶＬＰへと自己アセンブリすることができる。ウイルス様粒子は一般に、電子顕微鏡下ではＨＰＶウイルスとよく似ている。一般に、ウイルス様粒子は７２のカプソマーから構成され、これらのカプソマーは、５量体単位の５つのＬ１ポリペプチドから構成される。好適には、本明細書で用いられる少なくとも１つのＬ１タンパク質は末端切断型Ｌ１タンパク質を含み、複数のＨＰＶ ＶＬＰ、キメラポリペプチドまたはカプソマーが存在する場合には、好適には、組成物中の全てのＬ１タンパク質が末端切断型Ｌ１タンパク質である。好適には、この末端切断は核局在シグナルを除去する。好適には、この末端切断はＣ末端切断である。好適には、このＣ末端切断は、５０未満のアミノ酸、例えば４０未満のアミノ酸を除去する。特定の一実施形態では、Ｃ末端切断は、ＨＰＶ１６から３４のアミノ酸を除去し、ＨＰＶ１８から３５のアミノ酸を除去する。
【００６６】
本明細書で用いる末端切断型Ｌ１タンパク質は好適には、機能的Ｌ１タンパク質誘導体または変異体である。機能的Ｌ１タンパク質誘導体または変異体は、（所望により、適宜アジュバント添加された場合）免疫応を生じることができ、該免疫応答は、全長Ｌ１タンパク質を含むウイルス（またはそれからなるＶＬＰ）および／またはＬ１タンパク質が由来するＨＰＶ型を認識することができる。
【００６７】
本明細書で開示されるキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドにおけるＬ２ペプチドの位置は重要である。
【００６８】
本明細書で開示されるいずれの実施形態においても、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１タンパク質の露出ループの１つまたはＣ末端侵入アームに位置することができる。これらのループおよび侵入アームは、Ｌ１がカプソマーまたはウイルス様粒子の形態である場合に見られる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０００ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５, ５５７‐５６７）。
【００６９】
本明細書で開示されるいずれの実施形態においても、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１配列の以下の領域から選択される位置（ここで、これらの位置は図１に示されるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８Ｌ１参照配列に関する）、または別のＨＰＶ Ｌ１配列の等価な位置に存在することができる：
（ｉ）アミノ酸５０〜６１のＢＣループ、
（ｉｉ）アミノ酸１３２〜１４２、例えばアミノ酸１３２〜１４１、特にアミノ酸１３７〜１３８のＤＥループ、
（ｉｉｉ）アミノ酸１７２〜１８２、例えば１７６〜１８２、特に１７６〜１７９のＥＦループ、
（ｉｖ）アミノ酸２７１〜２９０、例えば２７２〜２７５、特に２７２〜２７３のＦＧループ、
（ｖ）アミノ酸３４５〜３５９、例えば３４７〜３５０、特に３４９〜３５０のＨＩループ、
（ｖｉ）アミノ酸４２９〜４４５、例えば４２３〜４４０、特に、ＨＰＶ１６では４２３〜４２４、４３１〜４３３または４３７〜４３８、ＨＰＶ１８では４２４〜４２５、４３２〜４３３または４３９〜４４０のＣ末端アーム。
【００７０】
本明細書で開示されるいずれの実施形態においても、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドは、Ｌ１アミノ酸を除去することなく、Ｌ１配列に挿入することができる。あるいは、Ｌ２ペプチドは、挿入位置においてＬ１配列からの１以上のアミノ酸の除去を伴って、Ｌ１配列に挿入することもでき、例えば、Ｌ２ペプチドが挿入されている位置において、Ｌ１配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸が除去され得る。従って、Ｌ２ペプチドはＬ１配列中の１以上のアミノ酸を置換することができ、例えば、Ｌ２ペプチドは、そのＬ２ペプチド配列と等しい長さのＬ１配列に取って代わることができる。
【００７１】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに２以上のＬ２ペプチドが存在する場合、これらは同じＨＰＶ型に由来する異なるＬ２ペプチドであってもよいし、またはそれらは、異なるＨＰＶ型の対応する領域に由来し得る場合には、異なるＨＰＶ型に由来するペプチドであってもよい。
【００７２】
一実施形態では、Ｌ２ペプチドは、例えば、カプソマーまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）または小型の非ＶＬＰ様構造などのポリペプチド粒子において、キメラポリペプチドの超分子アセンブリのアセンブリを可能とする部位に挿入される。例えば、ＶＬＰ構造を維持するためには、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドの、カプソマー間相互作用、従って、ＶＬＰコンフォメーションの維持に関与するジスルフィド架橋の形成に関与する部位に干渉しない部位に挿入される。このような超分子構造は、例えば、Ｓａｄｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ ２００３, Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０９, ３２−４０； Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ, ２００７ Ｖａｃｃｉｎｅ ２５, ２００１‐２０１０, Ｖａｒｓａｎｉ ｅｔ ａｌ ２００３, Ｊ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７, ８３８６‐８３９３, Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０００, Ｄｅｓｃｈｕｙｔｅｎｅｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０１０, Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６：５, ４０７‐４１９により記載されているように、電子顕微鏡によって評価することができる。一般に、キメラＶＬＰは、天然ＶＬＰに比べて同等または同一のサイズであり、すなわち、ＶＬＰは、Ｌ１タンパク質は全長または末端切断型であるが、Ｌ２ペプチドを含まない。キメラＶＬＰは、直径５０ｎｍの範囲であり得る。別の実施形態では、直径２０〜３５ｎｍ（２０−３５ｎｍｉｎ ｏｌｉａｍｅｔｅｒ）の間の小型の非ＶＬＰ構造が形成される。
【００７３】
Ｌ２ペプチドが挿入される部位は、コンフォメーション依存性の中和エピトープの存在を維持させ得る。中和エピトープは、ＨＰＶ１６の場合には、Ｖ５、Ｈ１６．Ｅ７０およびＵ４（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ ２００１, Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ２００３, ２００６， Ｄａｙ ｅｔ ａｌ., ２００７）、そしてＨＰＶ１６の場合にはＪ４（Ｃｏｍｂｉｔａ ｅｔ ａｌ ２００２）などのモノクローナル抗体を使用することにより検出することができる。他の中和エピトープも当技術分野で公知であり、それらの有無も同様にモノクローナル抗体を用いて確認することができる。
【００７４】
しかしながら、例えば特に、本明細書に記載される、非キメラＬ１ ＶＬＰも含む組成物では、Ｌ１ポリペプチド上に全てのＬ１中和エピトープが存在する必要はない。Ｌ２ペプチドの挿入に好適な部位は、例えば表１に示されている部位など、特にＶＬＰとして提供される場合には、Ｌ１ポリペプチドの表面にＬ２ペプチドを露出している。
【００７５】
表１および２はＨＰＶ Ｌ１露出領域（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ２００３, Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ ２００７, Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０００）を示すが、この領域は、Ｌ２ペプチドに好適な挿入部位と、それらの領域内に超可変領域を提供することができる。好適には、Ｌ２ペプチドは、Ｃ末端侵入アームか、またはＤＥループもしくはＦＧループもしくはＨＩループに挿入される。好適には、Ｌ２ペプチドは、ループまたはＣ末端アームの超可変領域に挿入される。表１に示される領域はＨＰＶ１６に関するものであり、他のＨＰＶ型のＬ１でも同様の領域が定義され、表２にはＨＰＶ１８ Ｌ２に関して定義されている。
【表１】
【表２】
【００７６】
本明細書に記載のキメラＬ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰでは、Ｌ２ペプチドを、Ｖ５モノクローナル抗体によって認識されるＨＰＶ１６のエピトープなどの免疫優性エピトープ中に、またはその領域内に挿入することが有利であり得る。この結果、その免疫優性を失った免疫優性エピトープが得られ、別のＬ１エピトープが免疫優性となり、これによってより良い交差防護が生じ得る。例えば、ＦＧループの、Ｖ５抗体によって認識されるエピトープ領域に挿入されたＬ２ペプチドはその免疫優性を失ったエピトープを生じさせ、次に主要なエピトープが免疫優性となり得る。
【００７７】
２以上のＬ２ペプチドが、本明細書に記載組成物中の別個のポリペプチド（またはカプソマーまたはＶＬＰ）に存在する場合には、それらのＬ２ペプチドは異なるＨＰＶ型に由来するＬ１にあってもよいし、または同じＨＰＶ型に由来するＬ１にあってもよい。
【００７８】
１つのポリペプチド（またはカプソマーまたはＶＬＰ）に２以上のＬ２ペプチドを含む一実施形態では、それらのＬ２ペプチドはＬ１配列内の同じ部位に挿入することもできるし、異なる部位に挿入することもできる。Ｌ２ペプチドが同じ部位に挿入される場合、同じループであってもよく、同じループの同じ超可変領域であってもよい。これらのＬ２ペプチド間に短いアミノ酸ストレッチを持つのが有利であり、Ｌ２ペプチド間に例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸を持つ。
【００７９】
これらのＬ２ペプチドは、少なくとも１つの抗原性エピトープを含むように選択される。選択されたエピトープ（Ｌ１ポリペプチドに組み込まれている場合）は一般に、その選択されたエピトープ内に存在するアミノ酸を含むＬ２ポリペプチドなどの少なくとも１つの天然Ｌ２ポリペプチドに対して免疫応答を惹起することができる。好都合には、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、少なくとも１つの付加的天然Ｌ２タンパク質に対して免疫応答を惹起することができる。
【００８０】
本明細書に記載のように使用するためのＬ２ペプチドは以下のペプチド：
Ｌ２のアミノ酸残基１７〜３６を含むペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基５６〜７５を含むペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基９６〜１１５を含むペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基１０８〜１２０を含むペプチド
から選択することができる。
【００８１】
例えば、本明細書に記載のように使用するためのＬ２ペプチドは以下のペプチド：
Ｌ２のアミノ酸残基１７〜３６からなるペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基５６〜７５からなるペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基９６〜１１５からなるペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基１０８〜１２０からなるペプチド
から選択することができる。
【００８２】
図３は、ＨＰＶ Ｌ２配列を、ＨＰＶ１６ Ｌ２ペプチドの１７〜３６番、５６〜７５番、９６〜１１５番および１０８〜１２０番のＬ２アミノ酸配列に関して、また、他の種々のＨＰＶ型の対応する領域に由来するＬ２ペプチドに関して示す。他の既知のＨＰＶ型に関して文献で得られる配列も、参照配列としてのＨＰＶ１６ Ｌ２配列に従い、さらなるＨＰＶ型由来の対応するＬ２ペプチドを設計するために使用可能である（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ （Ｂｏｅｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ., ２００３）またはＧｅｎｂａｎｋ （Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ., ２００８）参照）。
【００８３】
本明細書を通じて、ＨＰＶ１６のＬ２配列は、Ｌ２配列が由来する領域を決定するための参照配列として用いられる。符番はＮ末端のアミノ酸１から始める。なお、本明細書に示されるいずれの配列でも、左手がＮ末端であり、右手がＣ末端である。以下の特定のペプチドのリストでは、他のＨＰＶ型に由来するある特定の同じペプチドに対して実際の番号も示されている。
【００８４】
好適には、Ｌ２ペプチドは、所望により本明細書に記載のように改変されたＬ２ ５６〜７５ペプチド、例えば、配列番号８〜１５または配列番号２９を含む、またはそれからなる。Ｌ２ ５６〜７５ペプチドは、ＨＰＶ型間で実質的な配列同一性、すなわち、相同性を示す。
【００８５】
本開示によるＬ２ペプチドは、配列番号１〜３１で表される１以上の、または２以上の配列を含む、またはそれからなる。
【００８６】
Ｌ２ペプチドは、アミノ酸１７〜３６の間のアミノ酸（例えば、２０マー）のセグメント、例えば、
16型: 17-QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV-36 [配列番号1]
52型: 16-QLYQTCKASGTCPPDVIPKV-35 [配列番号2]
51型: 16-QLYSTCKAAGTCPPDVVNKV-35 [配列番号3]
6型: 16-QLYQTCKLTGTCPPDVIPKV-35 [配列番号4]
11型: 15-QLYQTCKATGTCPPDVIPKV-34 [配列番号5]
31型: 17-QLYQTCKAAGTCPSDVIPKI-36 [配列番号6]
45型: 16-DLYRTCKQSGTCPPDVINKV-35 [配列番号7]
5型: 17-HIYQTCKQAGTCPPDVINKV-36 [配列番号33]
56型: 17-QLYKTCKLSGTCPEDVVNKI-36 [配列番号34]
から選択することができる。
【００８７】
Ｌ２ペプチドはまた、アミノ酸５６〜７５の間のアミノ酸（例えば、２０マー）のセグメント、例えば、
16型: 56-GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL-75 [配列番号8]
6型: 55-GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL-74 [配列番号9]
31型: 56-GGLGIGSGSGTGGRTGYVPL-75 [配列番号10]
33型: 55-GGLGIGTGSGSGGRTGYVPI-74 [配列番号11]
45型: 55-GGLGIGTGSGSGGRTGYVPL-74 [配列番号12]
11型: 55-GGLGIGTGAGSGGRAGYIPL-74 [配列番号13]
35型: 56-GGLGIGSGSGTGGRSGYVPL-75 [配列番号14]
52型: 55-GGLGIGTGAGSGGRAGYVPL-74 [配列番号15]
5型: 56-GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL-75 [配列番号35]
から選択することができる。
【００８８】
Ｌ２ペプチドはまた２０アミノ酸よりも短くてもよく、例えば、Ｌ２ペプチドは、８アミノ酸以上、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸または３０アミノ酸まで（または８〜３０の間の整数のアミノ酸）のいずれかのアミノ酸数であり得る。例えば、Ｌ２ペプチドは、アミノ酸５６〜７５の８アミノ酸のセグメント、例えば以下の例の８マーであり得る。
【００８９】
16型: 56-GGLGIGTG-63 [配列番号29]
Ｌ２ペプチドはまた、アミノ酸９６〜１１５の間のアミノ酸（例えば、２０マー）のセグメント、例えば、
6型: 95-EPVAPSDPSIVSLIEESAII-114 [配列番号16]
52型: 95-EPIGPLEPSIVSMIEETTFI-114 [配列番号17]
31型: 96-DPVGPLDPSIVSLVEESGIV-115 [配列番号18]
16型: 96-DPVGPSDPSIVSLVEETSFI-115 [配列番号19]
58型: 95-DTVGPLDSSIVSLIEESSFI-114 [配列番号20]
45型: 94-EPVGPTDPSIVTLVEDSSVV-113 [配列番号21]
から選択することもできる。
【００９０】
Ｌ２ペプチドはまた、アミノ酸１０８〜１２０の間のアミノ酸（例えば、１３マー）のセグメント、例えば、
16型: 108-LVEETSFIDAGAP-120 [配列番号22]
18型: 106-LIEDSSVVTSGAP-118 [配列番号23]
から選択することもできる。
【００９１】
上記のペプチドはいずれも、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失または置換によって、例えば、１、２または数個のアミノ酸の付加、欠失または置換によって改変することができる。例えば、Ｌ２ペプチド１７〜３６では、２つのシステイン間の領域（２２〜２８）および一方または双方のシステインを欠失させることができる。この改変は、ＨＰＶ１６ペプチドに関して示されている（配列番号２４および２５）。別の例では、ＨＰＶ５１型ペプチド１７〜３６のＣ末端から４アミノ酸に位置する（すなわち、３２番の）バリン（Ｖ）を、上記に示される他の全てのＨＰＶ型においてこの位置に見られるアミノ酸であるイソロイシン（Ｉ）で置換することができる。
【００９２】
別の例では、５６〜７５のＬ２ペプチドは、そのＣ末端に領域ＧＧＬＧＩ（配列番号３２）が維持される限り（この領域はＨＰＶ型間の交差活性に重要であることが示されているため（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ., ２００７））、サイズを縮小することができる（例えば、配列番号２９の場合）。従って、本明細書に記載のＬ２ペプチドは配列ＧＧＧＬＧＩを含み得る。
【００９３】
所望により、グリシン残基などの１以上のアミノ酸のスペーサーもまた、Ｌ２ペプチドのＮ末端またはＣ末端に含めることができる。例えば、これらのペプチドは、１または２または３個の付加的スペーサーアミノ酸、例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端に（または２以上のＬ２ペプチドが存在する場合には、連結されるペプチドの間に）付加される１または２または３個のアミノ酸残基をさらに含むことができる。一般に、スペーサーは、免疫原性ペプチドとＬ１配列を連結させること、またはいくらかの最小距離もしくはそれらの間の他の空間的関係を設けること以外の特定の生物活性を持たない。スペーサーは、ＶＬＰの適切なコンフォメーションの保持および／またはスペーサーが存在しない時に比べて、挿入されたＬ２ペプチドの効果的もしくは改良された提示を保持するのに必要であるかまたは役立ち得る。
【００９４】
上記のペプチドはいずれも、例えば、１以上のアミノ酸の挿入（付加）、欠失または置換によって改変することができる。例えば、Ｌ２ペプチドは、天然（すなわち、天然に存在する）ＨＰＶ Ｌ２配列のＬ２配列とは異なるアミノ酸を組み込むことができる。例えば、これらのペプチドは、例えば、２つのシステイン間のジスルフィド結合および／またはこれらのシステイン間の領域の存在を除去するために、天然配列に比べて、その配列内に１または２つのアミノ酸挿入もしくは置換、または１もしくは２もしくは数個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１０個までのアミノ酸の欠失を有することができる。特定の例では、本開示のＬ２ペプチドに存在するものとしては、天然Ｌ２配列に対して、１または２つのアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換、および／または２つのシステイン残基の間の１０個までの連続するアミノ酸の欠失に限定される。
【００９５】
本明細書に記載のペプチドにおいてＬ２配列に対する改変が行われる場合、このような改変は、そのペプチドの実質的な割合または少なくとも５０％または少なくとも７０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸が天然Ｌ２配列のアミノ酸に相当するように限定され得る。
【００９６】
その代わりに、またはそれに加えて、任意の特定のＬ２ペプチドは、本明細書に記載されるように２または３またはそれを超えるＬ２ペプチドのキメラであり得る。Ｌ２配列に対するこれらの改変のいずれの場合でも、Ｌ２配列の免疫原性特性は維持される。すなわち、所望の免疫応答を惹起する、そのペプチド内のＬ２の一エピトープまたは複数のエピトープは維持される。これらの改変の目的は、Ｌ２ペプチドの特性を改良すること、例えば、他のＨＰＶ型由来のＬ２との交差反応を改良することであり得る。
【００９７】
従って、Ｌ２ペプチドは、以下のペプチド：
（ａ）１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含むＬ２のアミノ酸残基１７〜３６に相当するペプチド、
（ｂ）１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含むＬ２のアミノ酸残基５６〜７５に相当するペプチド、
（ｃ）１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含むＬ２のアミノ酸残基９６〜１１５に相当するペプチド、
（ｄ）１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含むＬ２のアミノ酸残基１０８〜１２０に相当するペプチド、
（ここで、１以上の挿入、欠失および／または置換とは、天然Ｌ２ポリペプチドに比べてのものである）
から選択することができる。
【００９８】
以下は改変を伴うＬ２ペプチドの例である。
【００９９】
16型: 17-QLYKTCPPDIIPKV-36 [配列番号24]
（２つのシステイン間に可変領域（２３〜２８）が無く、かつ、１つのシステインが欠失）
16型: 17-QLYKTCPPDVIPKV-36 [配列番号25]
（２つのシステイン間に可変領域が無く、１つのシステインが欠失し、かつ、３２番においてＩｌｅがＶａｌに置換されている（Ｉ３２Ｖ））
16型: 17-QLYKTCKQAGTCPPDVIPKV-36 [配列番号26]
（Ｉ３２Ｖを含む）
51型: 16-QLYSTCKAAGTCPPDVINKV-35 [配列番号27]
（Ｖ３３Ｉを含む）
45型: 16-DLYRTCKQSGTCPPDVIPKV-35 [配列番号28]
（Ｎ３４Ｐを含む）
【０１００】
Ｌ２ペプチドはまた、２つの異なるアミノ酸セグメント、例えば、アミノ酸１７〜３６とアミノ酸５６〜７（２０マー）例えば、
16型: 17-QLYKTPPDIIPKVGGLGIGTG-63 [配列番号30]
16型: 17-QLYKTPPDVIPKVGGLGIGTG-63 [配列番号31]
（Ｉ３２Ｖを含む）
から選択されるコンカテマーであり得る。
【０１０１】
配列番号３０および３１で表される２つのペプチドは、２つの上記ペプチドのキメラであって、両システインを欠き、システイン間の領域（２２〜２８）を欠いたペプチド１７〜３６の領域を、５６〜７５ペプチドの領域５６〜６３（ＨＰＶ間で保存されている）とともに含む。他のＨＰＶ型からも同様のペプチドを構築することができる。
【０１０２】
上記に挙げたペプチドはいずれも、本明細書に記載のＨＰＶ Ｌ１、ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰにおける、本明細書に記載のＬ１配列中のいずれの部位に含めることもできることが明らかである。
【０１０３】
本開示による組成物に複数のＬ２ペプチドが存在する場合には、これらは同じＨＰＶ型に由来する２以上の異なるＬ２ペプチド、すなわち、Ｌ２の異なる領域に由来するペプチド（オーバーラッピングを含む）であってもよいし、あるいは、異なるＨＰＶ型の同じ領域、例えば、１７〜３６領域に由来する２以上の異なるＬ２ペプチドであってもよい。３以上のＬ２ペプチドが存在する場合、これは、同じＨＰＶ型に由来する複数のペプチドと異なるＨＰＶ型に由来する複数のペプチドの双方を含み得る。
【０１０４】
本開示による組成物に２以上の異なるＬ２ペプチドが存在する場合、各ペプチドは異なるＨＰＶ型に由来するＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ、例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰに存在してもよいし、あるいはそれらは同じＨＰＶ型に由来するＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ、例えば、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰに存在してもよい。好適には、本明細書に記載のＬ２ペプチドは、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８に由来するＨＰＶ ＶＬＰに存在する。
【０１０５】
好適には、本明細書で開示される任意の実施形態において、Ｌ２ペプチドは、Ｌ２タンパク質に由来する少なくとも８個の連続するアミノ酸残基を含む。本明細書で開示される任意の実施形態において、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は、３０アミノ酸残基までの長さであり得る。
【０１０６】
本明細書で開示される任意の実施形態において、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２のＮ末端のアミノ酸１〜２００、特にＨＰＶ Ｌ２のアミノ酸１〜１５０から選択することができる。従って、これらのＬ２ペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２の領域１〜２００または１〜１５０に由来する８以上のアミノ酸残基を含んでもよく、領域１〜２００または１〜１５０に由来する８以上の連続するアミノ酸残基であり得る。
【０１０７】
本明細書において「Ｌ２ペプチドが少なくとも８個のアミノ酸残基を含み得る」とは、Ｌ２に由来する任意の８以上のアミノ酸のペプチドを表すが、ペプチドは好適には少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０またはそれを超えるアミノ酸長である。一実施形態では、本開示のＬ２ペプチドは、１００アミノ酸未満、好適には５０アミノ酸未満、または４０アミノ酸未満の短いペプチドである。例えば、これらのペプチドは、３０アミノ酸までの長さ、または２０もしくは２１アミノ酸までの長さであり得る。全長Ｌ２タンパク質は、本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに関するＬ２のペプチドであるとはみなされない。
【０１０８】
本開示のＬ２ペプチドに関する最小必要条件は、天然Ｌ２タンパク質に対して免疫応答を誘導することができるペプチドである。従って、Ｌ２ペプチドは一般に、Ｌ２ポリペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、かつ、少なくとも１つのエピトープを含む。本開示による組成物中の１以上の異なるＬ２ペプチドは、２５アミノ酸までまたは３０アミノ酸までまたは４０アミノ酸までの長さであり得る。一実施形態では、本開示による組成物に用いられる異なるＬ２ペプチドは全て、２５アミノ酸までまたは３０アミノ酸までまたは４０アミノ酸までの長さであり得る。
【０１０９】
本開示によるＬ２ペプチドは好適には、相同なＨＰＶ感染に対して、すなわち、その配列が起源するＨＰＶ型による感染に対して免疫応答を惹起することができる。
【０１１０】
好適には、Ｌ２ペプチドは、少なくとも２つの異なるＨＰＶ型に対して免疫応答を誘導することができる。ＨＰＶは、核酸の類似性に基づく型によって分類される。多くのＨＰＶ型が文献に記載されている。従って、本開示においては、Ｌ２ペプチドは、明示されたＨＰＶ型、例えば、ＨＰＶ１８型（または言及されている他の任意のＨＰＶ型）などの特に言及されているＨＰＶ型に対して免疫応答を惹起することができる。さらに、本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに関して示されているようなＬ２ペプチドは、言及されているＨＰＶ型以外のＨＰＶ型に対しても免疫応答を惹起することができる。分かりやすいように、言及されているＨＰＶ型以外のＨＰＶ型は「非ＨＰＶ型」と呼び、例えば、言及されているＨＰＶ型がＨＰＶ１８である場合、ＨＰＶ１８以外のいずれの型も、非ＨＰＶ１８型ペプチド（またはポリペプチドもしくはウイルス）と呼ぶことができる。同様に、言及されている任意のＨＰＶ型に関しても、言及されているＨＰＶ型以外の型は非ＨＰＶ型と呼ぶことができる。
【０１１１】
例えば、Ｌ２ペプチドは、異なるＨＰＶ型に由来する１以上のさらなるＬ２タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる。本明細書で開示される任意の実施形態において、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は、別のＨＰＶ型に対して交差反応、交差中和および／または交差防護応答を誘導することができる。好適には、ＨＰＶ型間で高レベルの、すなわち、２つ（またはそれを超える）型の間で８０％を超える配列同一性（「相同性」）を示すＬ２ペプチドが選択される。いくつかの場合では、Ｌ２ペプチドは、型間で８５％を超える配列同一性、または型間で９０％を超える配列同一性、または型間で９５％を超える配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、少なくとも２つのＨＰＶ型間で１００％の配列同一性を有するように選択される。このようなＬ２ペプチドは、本明細書では、Ｌ２「コンセンサス」配列と呼ぶことができる。
【０１１２】
例えば、特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ３３型とＨＰＶ１１型の間で同一の（すなわち、１００％の配列同一性を有する）コンセンサス配列である。例えば、特定の例示的実施形態では、このコンセンサス配列は、Ｌ２のアミノ酸１７〜３６間で同一である。別の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ５８型とＨＰＶ６型の間で同一のコンセンサス配列である。例えば、特定の例示的実施形態では、コンセンサス配列は、ＨＰＶ５８型とＨＰＶ６型のアミノ酸５６〜７５の間で同一である。
【０１１３】
さらなるＨＰＶ型に対して免疫応答を惹起することができる交差反応性Ｌ２ペプチドは、本開示に従って特定することができる。本明細書に示されているように、異なるＨＰＶ型に由来するＬ２配列をアラインして、ＨＰＶ型間で高い類似性を有する領域を特定することができる（図３および本明細書に示されている他の配列を参照）。このようなアライメントを行い、配列相同性が存在する場所を特定するために多くの配列プログラムが利用可能である。これにより、着目するＨＰＶ型間で最も類似性の高い、従って、おそらくそれらのＨＰＶ型のいくつかまたは全ての間で交差反応性のあるＬ２ペプチドを選択することが可能となる。
【０１１４】
本開示のＬ２ペプチドは、任意の好適な免疫原性Ｌ２ペプチドであり得る。Ｌ２ペプチドは、当技術分野で周知の標準技術によって免疫原性および交差反応性に関して試験することができる。例えば、これらのペプチド、またはこれらのペプチドを含むキメラＬ１ポリペプチド、カプソマーもしくはＶＬＰをモデル動物またはヒトに注射することができ、抗体および／または細胞性免疫応答の測定を、例えば、ＥＬＩＳＡまたはサイトカイン分析／個々の測定によって行うことができる。抗体をスクリーニングするための方法は当技術分野で周知である。ＥＬＩＳＡは、抗体の交差反応性を評価するために使用することができる。抗体の中和および交差中和特性は、例えばシュードウイルス中和アッセイを用いて試験することができる。好適なシュードウイルス中和アッセイはＤｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ ２００８およびＰａｓｔｒａｎａ ｅｔ ａｌ ２００４に記載されている。
【０１１５】
さらに、いくつかの交差反応性Ｌ２ペプチドがすでに同定されている。例えば、ＨＰＶ ６および１６の共通中和エピトープは、ＨＰＶ１６ Ｌ２の領域（ａａ）１０８〜１２０に見出されている（Ｋａｗａｎａ ｅｔ ａｌ １９９８, １９９９, ２００１）。別の例では、ウサギをＨＰＶ１６由来の（ａａ）１７〜３６、５６〜７５、９６〜１１５ Ｌ２ペプチドで免疫することで、交差中和抗体を生じさせることができた（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ ２００７, ２００８）。別の例では、ＨＰＶ１６由来のＬ２の（ａａ）１７〜３６が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける受動免疫および抗原投与の後に、防護的かつ広範な交差中和エピトープとして同定された（Ｇａｍｂｈｉｒａ ｅｔ ａｌ ２００７）。同様の防護が、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて、Ａｌｐｈｓ ｅｔ ａｌ ２００８によって、ＨＰＶ１６由来のＬ２のａａ１７〜３６を含む合成リポペプチドワクチンのよるワクチン接種の後に示された。
【０１１６】
好適には、Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は交差反応性ペプチドであり、従って、それらはＬ２ペプチドが由来するＨＰＶ遺伝子型のＬ２だけでなく、それが由来するもの以外のＨＰＶ遺伝子型に由来するＬ２タンパク質またはＬ２ペプチドも認識する免疫応答を惹起することができる。好適には、このペプチドは、１または２またはそれを超える他の遺伝子型、好適には、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８もしくは７３などの子宮頸癌、またはＨＰＶ６もしくは１１などの性器疣贅、またはＨＰＶ５、８または３８などの皮膚癌の原因に関連する遺伝子型と交差反応する。
【０１１７】
一実施形態では、１以上のＬ２ペプチドがＨＰＶ１６型またはその改変型から選択され、ＨＰＶ１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８もしくは７３から選択される型などの他の癌を引き起こす少なくとも１つのＨＰＶ型、および／またはＨＰＶ６または１１などの性器疣贅を引き起こす少なくとも１つのＨＰＶ型、および／またはＨＰＶ５、８もしくは３８などの皮膚癌を引き起こす少なくとも１つのＨＰＶ型に対して交差反応性がある。別の実施形態では、１以上のＬ２ペプチドが、ＨＰＶ１８型またはその改変型から選択される。
【０１１８】
好適には、本発明で用いられるＬ２ペプチドは、交差中和免疫応答、すなわち、Ｌ２ペプチドが由来するＨＰＶ型とは異なるＨＰＶ型のＨＰＶを中和することができる免疫応答を生じることができる。交差中和は、本明細書の実施例３で記載されるシュード中和アッセイなどの当技術分野で公知のアッセイによって試験することができる。
【０１１９】
好適には、Ｌ２ペプチドは交差防護(防御)を提供することができ、好適には、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８もしくは７３から選択される子宮頸癌に関連する１以上のＨＰＶ型、および／またはＨＰＶ６もしくは１１などの性器疣贅を引き起こす少なくとも１つのＨＰＶ型、および／またはＨＰＶ５、８もしくは３８などの皮膚癌を引き起こす少なくとも１つＨＰＶ型に対する交差中和エピトープを含む。
【０１２０】
交差防護は好適には、Ｌ２ペプチドが少なくとも２つのＨＰＶ型によって引き起こされる感染／疾患に対して防護免疫応答を生じ得る場合に起こる。例えば、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに関して提供される場合、Ｌ２は、そのＬ２ペプチドが得られた型と少なくとも１つの付加的なＨＰＶ型から防護する応答を誘導することができる。上述のように、交差防護はまた、コンセンサスＬ２ペプチドが選択され、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに関して提供される場合にも生じ得る。Ｌ２ペプチドまたはＬ１ ＶＬＰが由来するものとは異なる種々のＨＰＶ型に対する交差防護は、動物モデル、例えば、Ａｌｐｈｓ ｅｔ ａｌ ２００８に記載されているようなマウスモデルを用いて確認することができる。
【０１２１】
交差防護は、一群のＨＰＶ型の感染および／または疾患の罹患率（感染は偶発的感染または持続的感染である）を、所与のＬ２ペプチドを接種された個体と非接種群で比較することによって評価することができる。ある型または一群の型に対する完全な交差防護は本開示によれば必ずしも必要ではなく、実際には、いずれのレベルの交差防護も利益をもたらす。好適には、見られる交差防護のレベルは、匹敵する非接種群に比べ、接種群が非ワクチンＨＰＶ型または型群に伴う感染および／または疾患の５％未満、より好適には最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大３５％、最大４０％、最大４５％、最大５０％、最大５５％、最大６０％、最大６５％、最大７０％、最大８０％、最大９０％またはさらには最大１００％未満の感染および／または疾患を有するようなものである。
【０１２２】
交差防護は、ワクチン群および対照群において種々のＨＰＶ型に特異的な核酸の存在を検出することによって評価することができる。検出は、例えば、ＷＯ０３／０１４４０２（ＵＳ２００７０３１８２８Ａ１）およびその中の参照文献に記載のような技術を用いて、特に、ＨＰＶ ＤＮＡの非特異的増幅とその後のＤＮＡ型の検出については、ＷＯ９９／１４３７７（ＵＳ６４８２５８８Ｂ１）およびＫｌｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ, （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９）, ３７ （８）： ２５０８‐２５１７）に記載のようなＬｉＰＡ系を用いて行うことができる（これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、サンプル中のＨＰＶ ＤＮＡの検出には、着目する各ＨＰＶ型に特異的なプライマーを用いる型特異的ＰＣＲなどの任意の好適な方法を使用できる。好適なプライマーは当業者に公知であるか、または種々のＨＰＶ型の配列が既知であることから、容易に構築することができる。
【０１２３】
交差防護は、雄集団および／または雌集団に見られるのが好適であり、ＨＰＶ感染に関して血清反応陰性の、またはＨＰＶ１６および１８に関して血清反応陰性の女性、好適には、性活動前の青年期女性に見られるのが好適である。
【０１２４】
交差防護（ワクチン接種群と対照群に見られる防護により評価される）は、高リスク癌型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８もしくは７３の群のいずれか１つなどの癌原性型、またはひとまとめに、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４などの高リスク癌型群または実際にはこれらの高リスク癌型の全てに対して見られるのが好適である。これらの高リスク癌型の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４の考えられるあらゆる組合せが具体的に意図される。
【０１２５】
Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸
本開示のもう１つの特徴は、上述のキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子である。
【０１２６】
このような核酸は、天然には存在しない配列を有するか、またはそうでなければ２つの別個の配列セグメントの、人工的組合せによって作出された配列を有する「組換え」核酸であり得る。例えば、組換えキメラＬ１／Ｌ２核酸は、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド（またはその断片）をコードする少なくとも１つの（多くの場合では少なくとも２つの）核酸セグメントと機能的に連結された、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。この人工的組合せは、化学合成によって、またはより一般には、例えば遺伝子工学技術によるなど単離された核酸セグメントの人工的操作によって達成することができる。一貫性のため、「組換え」タンパク質は、組換え核酸によりコードされる（細菌または真核細胞などの宿主細胞に導入することができる）ものである。
【０１２７】
特定の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、選択された原核生物または真核生物宿主細胞での発現のためにコドンが至適化される。
【０１２８】
複製および発現を容易にするために、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸は、原核生物または真核生物発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞もまた本開示の特徴である。好適な宿主細胞としては、原核生物（すなわち、細菌）宿主細胞、例えば大腸菌、ならびに真菌（例えば、酵母）細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＶＥＲＯおよびＨＥＫ２９３細胞など）を含む多くの真核生物宿主細胞が挙げられる。
【０１２９】
複製および発現を容易にするために、これらの核酸は、原核生物または真核生物発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。本明細書で開示される核酸は様々なベクター（例えば、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびその他多数などのウイルスＤＮＡを含む）のいずれか１つに含めることができるが、最も一般には、ベクターはポリペプチド発現産物を生成するのに好適な発現ベクターである。発現ベクターでは、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸は一般に、ｍＲＮＡの合成を指令するよう、適当な転写制御配列（プロモーター、および所望により１以上のエンハンサー）に近接して、適当な配向で配置される。すなわち、着目するポリヌクレオチド配列は、適当な転写制御配列に機能的に連結される。このようなプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーターの前初期プロモーター、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージＴ７およびλＰＬプロモーター、および原核生物または真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは一般に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。ベクターは所望により、発現を増幅するのに適当な配列を含む。さらに、発現ベクターは所望により、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性など、または大腸菌ではカナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性などの、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する１以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【０１３０】
発現ベクターはまた、例えば翻訳効率を向上させるために付加的な発現エレメントを含むことができる。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得る。いくつかの場合では、例えば、翻訳開始コドンおよび関連の配列エレメントが、着目するポリヌクレオチド配列と同時に適当な発現ベクターに挿入される（例えば、天然開始コドン）。このような場合には、付加的な翻訳制御シグナルは必要でない。しかしながら、ポリペプチドコード配列またはその一部だけが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸の翻訳のために提供される。開始コドンは、着目するポリヌクレオチド配列の翻訳を確保するように適切なリーディングフレームに配置する。外因性の転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成双方の様々な起源のものであってよい。所望により、用いる細胞系に適当なエンハンサーを包含することによって、発現効率をさらに高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ. （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０：１２５‐６２； Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６‐５４４）。
【０１３１】
いくつかの例では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸（ベクターなど）は、宿主細胞に導入された際にコードされているポリペプチドの発現を増強および／または至適化するように選択された１以上の付加的配列エレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸は、ヒトヘルペスウイルス５イントロン配列（例えば、配列番号１３参照）などのイントロン配列を含む。イントロンは、組換え構築物に適宜配置された場合に同種および異種の核酸の発現を増強することが報告により示されている。
【０１３２】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする組換え核酸を介するものの、当業者に指針を与えるに十分な例示的手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ２ｄ ｅｄ., Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, １９８９； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ３ｄ ｅｄ., Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ, ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ., Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ, １９９２ （ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００３）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ., Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ４ｔｈ ｅｄ., Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, １９９９に見出すことができる。
【０１３３】
種々のＨＰＶ型に由来するＨＰＶ Ｌ１およびＬ２ポリペプチドをコードする例示的核酸配列が当技術分野で周知であり、例えば、多くの例が文献に記載され、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで公的に入手可能である。これらは、当業者であれば、ヒトパピローマウイルス（またはＨＰＶ）および着目する特定のタンパク質（例えば、Ｌ１またはＬ２）および型という語を用いた適当なクエリーによって容易に確認することができる。これらのＬ１およびＬ２核酸は、上記で開示される組換えキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を生産するために利用可能である。
【０１３４】
例示的Ｌ１およびＬ２ポリペプチドと配列同一性を有するキメラＬ１／Ｌ２核酸変異体をコードするさらなる核酸も、当業者により生産可能である。一般に、これらの核酸変異体は、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに（例えば、Ｌ１ポリペプチド部分に）存在するアミノ酸残基の１％、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％だけが異なるポリペプチドをコードする。すなわち、コードされるポリペプチドは、参照キメラポリペプチドと少なくとも８０％、または８５％、より一般には、少なくとも約９０％またはそれを超える、例えば９５％またはさらには９８％または９９％の配列同一性を有する。当業者であれば、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列はそれら自体、遺伝コードの縮重のために配列同一性を有することは、すぐに理解できるであろう。いくつかの例では、コードされているＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、それが由来する天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸改変を有する。このような変異は１以上のアミノ酸の付加、欠失または置換の結果であり得る。変異体は一般に、ヌクレオチド残基の約１％、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％だけが異なる。例えば、変異体キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸は、１、または２、または最大５、または最大約１０、または最大約１５、または最大約５０、または最大約１００のヌクレオチド変異（例えば、Ｌ１部分において、および／または上記のように改変Ｌ２ペプチドをコードするために）を含み得る。従って、本明細書で開示されるようなキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸に関しての変異体は一般に、天然に存在するＬ１およびＬ２成分からなる参照配列と少なくとも８０％、または８５％、より一般には、少なくとも約９０％またはそれを超える、例えば９５％、またはさらには９８％または９９％の配列同一性を有する。
【０１３５】
これまでに記載した変異体核酸の他、天然に存在するＬ１およびＬ２ポリペプチドに対応するＬ１およびＬ２配列を有するキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする１以上の核酸とハイブリダイズする核酸も、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするために使用可能である。当業者であれば、上記に述べた配列同一性％の指標の他、２つの核酸間の配列類似性のもう１つの指標がハイブリダイズ能であることが分かるであろう。２つの核酸の配列の類似性が高いほど、それらがハイブリダイズする条件のストリンジェンシーが高い。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは配列に依存し、環境パラメーターが異なれば異なる。従って、特にストリンジェンシー程度に影響するハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション方法の性質、ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さによって異なる。一般に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃〜２０℃低く選択する。Ｔｍは、５０％の標的配列が完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度である（所定のイオン強度およびｐＨ下）。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, ＮＹ, ２００１； Ｔｉｊｓｓｅｎ, Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｐａｒｔ Ｉ： Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ., ＮＹ, ＮＹ, １９９３.ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ. Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ４ｔｈ ｅｄ., Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｉｎｃ., １９９９に見出せる。
【０１３６】
本開示の目的では「ストリンジェント条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間の不一致が２５％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェント条件」は、より厳密な定義のための特定のストリンジェンシーレベルに分解することができる。従って、本明細書において「穏やかな（ｍｏｄｅｒａｔｅ）ストリンジェンシー」条件は、２５％を超える配列不一致を有する分子はハイブリダイズしない条件であり；「中ストリンジェンシー」条件は、１５％を超える不一致を有する分子はハイブリダイズしない条件であり；「高ストリンジェンシー」条件は、１０％を超える不一致を有する配列はハイブリダイズしない条件である。「極めて高いストリンジェンシー」条件は、６％を超える不一致を有する配列はハイブリダイズしない条件である。これに対して、「低ストリンジェンシー」条件下でハイブリダイズする核酸は、配列同一性が極めて低いか、または核酸の短い部分配列にしか配列同一性持たないものである。
【０１３７】
Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドの生産方法
本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、組換えタンパク質の発現および精製のための十分に確立された手順を用いて作製することができる。当業者に指針を与えるのに十分な手順は、次の参照文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, ＮＹ, ２００；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ. Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ４ｔｈ ｅｄ., Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｉｎｃ., ９９９に見出せる。付加的および具体的な詳細を以下に示す。
【０１３８】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００またはＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）などの市販のリポソームトランスフェクション試薬を使用）、リン酸カルシウム沈殿法、感染、トランスフェクションなどの様々な周知の手順のいずれかによって宿主細胞に導入される。
【０１３９】
従って、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞も本開示の特徴である。好適な宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物（すなわち、細菌）宿主細胞、ならびに真菌（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母）細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞など）を含む多数の真核生物宿主細胞が挙げられる。キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、例えば、発現ベクターなどのベクターを介して宿主細胞に導入（例えば、形質導入、形質転換またはトランスフェクト）される。上記のように、ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ、バキュロウイルスなどであり得る。適当な発現宿主の例としては、大腸菌、放線菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞；サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリスおよびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などの真菌細胞；ウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などの昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫などの哺乳類細胞；藻類細胞を含む植物細胞が挙げられる。
【０１４０】
宿主細胞は、要すれば、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または挿入されているポリヌクレオチド配列の増幅のために改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は一般に、発現のために選択された宿主細胞とともにそれまで使用されていたものであり、当業者には自明であり、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ, ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ, ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびその中に引用されている参照文献を含む、本明細書に引用されている参照文献でも明らかである。本発明の核酸に対応する発現産物はまた、植物、酵母、真菌、細菌などの非動物細胞においても生産可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ, Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌの他、細胞培養に関する詳細はＰａｙｎｅ ｅｔ ａｌ. （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｉｎｃ. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ＮＹ； Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ （ｅｄｓ） （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ, Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ, Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ （ｅｄｓ） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ （１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ, Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ, ＦＬに見出せる。
【０１４１】
細菌系では、発現生成物に意図される使用に応じて、いくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の生産に大量のポリペプチドまたはその断片が必要とされる場合には、容易に精製されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの高レベル発現を指令するベクターを用いるのが好都合である。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、着目されるコード配列、例えば、本発明で上記されるポリヌクレオチドを、ベクター中の、アミノ末端翻訳開始メチオニンの配列およびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基とインフレームで連結して触媒的に活性なβガラクトシダーゼ融合タンパク質を生産することができるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３−５５０９）；アミノ末端メチオニンがヒスチジンタグとインフレームで連結されているｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ, Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）などの多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられる。
【０１４２】
同様に、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母では、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含むいくつかのベクターが、所望の発現産物の生産に使用可能である。総説としては、Ｂｅｒｇｅｒ, Ａｕｓｕｂｅｌ, ａｎｄ, ｅ.ｇ., Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ. （１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６‐５４４）を参照。哺乳類宿主細胞では、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｓ）およびウイルスの双方に基づく系を含むいくつかの発現系を使用することができる。
【０１４３】
宿主細胞は所望により、挿入されている配列の発現を調節する能力または発現されたタンパク質を所望の様式でプロセシングするその能力に関して選択してもよい。このようなタンパク質修飾としては、限定されるものではないが、グリコシル化（ならびに、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化）が挙げられる。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの種々の宿主細胞が特定の細胞機構およびこのような翻訳後活性に特徴的なメカニズムを有し、導入された外来タンパク質の適切な修飾およびプロセシングを確保するように選択することができる。
【０１４４】
ある特定の例では、核酸は、例えば大腸菌細胞などの原核細胞での導入および発現に好適なベクターを介して細胞に導入される。発現ベクターは、好適な細菌宿主に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入される。多数の好適な大腸菌株が利用可能であり、当業者により選択可能である（例えば、ＲｏｓｅｔｔａおよびＢＬ２１（ＤＥ３）株は、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターの発現に好都合であることが分かっている）。
【０１４５】
より一般には、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、真核生物（例えば、昆虫または哺乳類細胞）における導入および発現に好適な発現ベクターに組み込む。このような核酸は、選択されたベクター／宿主細胞での発現のためにコドンが至適化されるのが好都合である。
【０１４６】
一例では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞へ導入する。昆虫細胞に感染可能な組換えバキュロウイルスは、市販のベクター、キットおよび／または系、例えば、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅから得られるＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ系を用いて作出することができる。要するに、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をｐＡｃＳＧ２導入ベクターに挿入する。次に、宿主細胞ＳＦ９（ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））を、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の線状化されたゲノムＤＮＡを含むｐＡｃＳＧ２−キメラプラスミドおよびＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄで同時トランスフェクトする。トランスフェクション後、ｐＡＣＳＧ２プラスミドとバキュロウイルスゲノムの間で相同組換えが起こり、組換えウイルスが生じる。一例では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原が、ポリヘドリンプロモーターの調節制御下（ｐＨ）で発現される。ベーシック（Ｂａ）プロモーターおよびｐ１０プロモーターなどの他のプロモーターを用いて、同様の導入ベクターを作製することができる。同様に、Ｓｆ９と近縁のＳＦ２１、およびキャベツシャクトリムシＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞系統などの別の昆虫細胞を使用することもできる。
【０１４７】
本明細書で開示される組換えキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの長期高収量生産のためには、一般に安定な発現系を用いる。例えば、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを安定発現する細胞系統を、複製エレメントまたは内因性の発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞に導入する。ベクターの導入の後、細胞を富化培地で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在は導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖と回収を可能とする。例えば、結果として安定的に形質転換された細胞の群またはコロニーは、その細胞種に適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸で形質転換された宿主細胞は所望により、コードされているタンパク質の発現および細胞培養物からの回収に好適な条件下で培養すればよい。
【０１４８】
好適な宿主細胞系統に形質導入し、宿主細胞を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。
【０１４９】
次に、分泌されたポリペプチド産物を培養培地から回収および／または精製する。「精製」（例えば、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードする核酸に関して）とは、成分をその存在が望まれない組成物から取り出すプロセスを表す。精製は相対的な用語であって、望まない成分の全ての痕跡を組成物から除去する必要はない。タンパク質生産に関して、精製は、遠心分離、透析（ｄｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティー精製または沈殿などのプロセスを含む。「精製された」とは、絶対的に純粋である必要はなく、むしろ、相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製されたポリペプチド（またはカプソマーまたはＶＬＰ）調製物は、そのポリペプチドが、その生成環境、例えば、それが本来複製される細胞内もしくは細胞集団内、または人工環境下にある場合よりも富化されているものである。実質的に純粋なキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの調製物は、所望のキメラポリペプチドがその調製物の総タンパク質含量の少なくとも５０％を占めるように精製することができる。特定の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、調製物の総タンパク質含量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれを超える割合を占める。
【０１５０】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの生産および精製においては、細胞を遠心分離により採取し、物理的または化学的手段によって破砕し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持することができる。タンパク質の発現に用いた真核生物細胞または微生物細胞は、冷凍−解凍サイクル、音波処理、機械的破砕もしくは細胞溶解剤の使用または当業者に周知のその他の方法を含む任意の便宜な方法によって破砕することができる。
【０１５１】
次に、発現されたキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを、組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸抽出、濾過、限外濾過、遠心分離、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば本明細書に示されている任意のタグ付加系を使用）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって回収および精製することができる。所望により、成熟タンパク質の立体配置を完成させる際にタンパク質の再折りたたみ工程を用いることもできる。最後に、最終精製工程で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。上記に示した参照に加え、例えば、Ｓａｎｄａｎａ （１９９７） Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｉｎｃ.； ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ. （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ, ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ, ＮＹ； Ｗａｌｋｅｒ （１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ, ＮＪ, Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ （１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ, Ｏｘｆｏｒｄ, Ｕ.Ｋ.； Ｓｃｏｐｅｓ （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ, ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ, ＮＹ； Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ, Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ, Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ, ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ, ＮＪに示されているものをはじめ、種々の精製方法が当技術分野で周知である。ＷＯ２０１０／０１２７８０（参照により本明細書に組み込まれる）は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＶＬＰの精製方法を記載している。類似の方法は、本明細書に記載されるキメラポリペプチドの精製にも適用可能である。従って、キメラポリペプチドは、宿主細胞から還元β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）バター中に抽出した後に陰イオンおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付し、その後、得られた産物を、ＢＭＥ除去により成熟させることができる。得られた産物は濾過除菌によって無菌とすることができる。
【０１５２】
免疫原性組成物および方法
本開示の別の態様は、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド（またはキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドから構成されるカプソマーもしくはＶＬＰ）を含む免疫原性組成物に関する。このような免疫原性組成物は、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを単独で、または例えば、付加的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドおよび／またはＶＬＰ（例えば、Ｌ１ ＶＬＰ）と組み合わせて含むことができる。
【０１５３】
特定の実施形態では、以上に記載され任意のキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドが免疫原性組成物の成分である。例えば、免疫原性組成物は、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチド（例えば、非ＨＰＶ１８型Ｌ２ペプチド）が挿入されているＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含むキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを含み得る。同様に、免疫原性組成物は、Ｌ２ポリペプチドのエピトープ（ｅｐｔｉｏｐｅ）を含む少なくとも１つのペプチドが（例えば、非ＨＰＶ１６型Ｌ２ペプチド）挿入されているＨＰＶ１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含むキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを含み得る。特定の例では、このＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドに挿入されているＬ２ペプチドは、Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５（ＨＰＶ１６ Ｌ２とのアライメントに関して示される）を含む（例えば、それからなる）。免疫原性組成物に使用するためのその他の好適なキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドには、上記のものがいずれも含まれる。
【０１５４】
特定の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、免疫原性組成物中に、ＨＰＶ ＶＬＰとともに存在する。例えば、一実施形態では、免疫原性組成物は、
（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つのウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１またはその断片を含む少なくとも１つのキメラポリペプチド
を含む。
【０１５５】
一実施形態では、キメラポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドである。
【０１５６】
好都合な一実施形態では、少なくとも１つのＶＬＰが、ＨＰＶ１６ ＶＬＰ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのＶＬＰが、ＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む。好都合には、このような組成物では、キメラポリペプチドは、カプソマーまたはウイルス様粒子または小型の非ＶＬＰ様構造などの超分子アセンブリに組み立てられる。
【０１５７】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）少なくとも１つのＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰと、（ｉｉ）それぞれＬ１配列中にＬ２ペプチドを含む、２つのキメラＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ、ポリペプチドまたはカプソマーを含む。好都合な一実施形態では、この２つのキメラＬ１ポリペプチド（またはカプソマーもしくはＶＬＰ）は、同じＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８）に由来するＬ１ポリペプチド中に異なるＬ２ペプチドを含むことができる。あるいは、この２つのキメラＬ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８などの異なるＨＰＶ型に由来するＬ１ポリペプチド中に同じＬ２ペプチドを含むこともできる。なおさらなる実施形態では、この２つのキメラＬ１ポリペプチドまたはカプソマーまたはＶＬＰは、異なる２つのＨＰＶ型（ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８および／またはＨＰＶ３３とＨＰＶ５８など）に由来するＬ１ポリペプチド中に異なるＬ２ペプチドを含むこともできる。特定の実施形態では、これらのＬ２ペプチドはＨＰＶ３３またはＨＰＶ５８に由来してもよく、ＨＰＶ１８ Ｌ１に挿入することができる。このような実施形態では、異なるＬ２ペプチドを２つの異なるＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｐｉｄｅｓ）に１つずつ挿入することもできるし、あるいは同じＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドの同じまたは異なる部位に挿入することもできる。
【０１５８】
特定の実施形態では、本開示による組成物に含まれるＨＰＶ ＶＬＰ（特に、ＨＰＶ Ｌ１のみのＶＬＰ）およびキメラＶＬＰ、ポリペプチドまたはカプソマーは、ＨＰＶ６ ＶＬＰ、ＨＰＶ１１ ＶＬＰ、ＨＰＶ１６ ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰの１以上を含み得る。例えば、それらはＨＰＶ１６と１８、またはＨＰＶ６と１１、または４つのＨＰＶ型の全てのＶＬＰを含み得る。好適には、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰおよびキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドはＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８に由来する。
【０１５９】
本明細書に記載のように使用するためのＨＰＶ ＶＬＰは、キメラまたは非キメラのいずれでも、Ｌ２からもまた組み立て可能であり、あるいはＬ１のみのＶＬＰであってもよい。例えば、ＶＬＰは、Ｌ１ポリペプチドとＬ２ポリペプチドの混合物から組み立て可能である（従って、Ｌ２ペプチドがＬ１配列に挿入されている、本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ＶＬＰとは同じでない）。あるいは、ＶＬＰは、本明細書で開示されるＬ１／Ｌ２ポリペプチド以外のキメラＶＬＰであってもよい。例えば、このような非Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、Ｌ１ポリペプチドと、Ｅ７などの、Ｌ１以外のＨＰＶポリペプチドの少なくとも１つの付加的配列を含み得る。
【０１６０】
本明細書で開示される、ＶＬＰ中のまたはキメラポリペプチドに由来するＨＰＶ Ｌ１は、全長ＨＰＶ Ｌ１タンパク質またはある種のＬ１誘導体、例えば断片のいずれかから、例えば、ＷＯ０３／０７７９４２（ＵＳ７４１６８４６）またはＷＯ９９／１３０５６（ＵＳ７３５１５３３）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているような、当技術分野で標準的な方法を用いて形成することができる。
【０１６１】
本明細書で開示される組成物の特定の実施形態では、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＶＬＰを含むか、またはそれらからなり、キメラＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰは、キメラＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰまたはキメラＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰまたはその双方を含むか、またはそれらからなる。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８双方のキメラＬ１ ＶＬＰが存在する場合には、それぞれの中のＬ２ペプチドは同じであっても異なってもよく、本明細書で開示されるいずれのＬ２ペプチドであってもよい。
【０１６２】
本明細書で開示される免疫原性組成物は一般に、少なくとも１つの薬学上許容される希釈剤または担体および所望によりアジュバントを含む。免疫原性組成物は、動物またはヒトに投与した際に免疫応答を生じさせる組成物であり、その免疫応答は、感染または疾患に対して必ずしも完全な防護性はないが、少なくとも感染または疾患の罹患率を低減する防護免疫応答であり得る。
【０１６３】
本明細書に記載のように使用するためのアジュバントは、アルミニウム塩を含み得る。また、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ ＭＰＬ）またはＱＳ２１などのＴｈ１型応答を刺激するアジュバントも好適である。好適には、アジュバントはアルミニウム塩であり、水酸化アルミニウムと３Ｄ ＭＰＬなどのように、３Ｄ ＭＰＬとの組合せが好適である。このようなアジュバントを含む本開示による組成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／２３１０５に記載されているように調製することができる。
【０１６４】
本明細書に記載のように使用するためのＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰおよびキメラＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰは、アジュバントを含有するアルミニウムに吸着され得る。アジュバントは、異なるＶＬＰに加えて予めそれらを吸着させた後に、それらの異なるＶＬＰを混合して最終的なワクチン製品を形成することができる。
【０１６５】
免疫原性組成物はまた、安定剤としてアルミニウムまたはアルミニウム化合物を含むこともでき、本開示はまた、ＶＬＰがアルミニウム塩に吸着された安定な組成物にも関する。ＶＬＰは、アルミニウム塩に吸着させた後は、アルミニウムの不在下よりも経時的安定性が高いことが好ましい。
【０１６６】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、経口、局所、皮下、粘膜（一般に、腟内）、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、皮内および坐剤によるなど種々の経路のいずれかによってワクチンとして投与することができる。筋肉内および皮内送達が好ましい。
【０１６７】
該ポリペプチド、および／またはカプソマーおよび／またはＶＬＰおよび他のタンパク質の用量は、各個体の状態、性、齢および体重、投与経路ならびにワクチンのＨＰＶによって異なる。
【０１６８】
本明細書に記載の組成物中に存在するポリペプチドおよび／またはＶＬＰの用量は、各個体の状態、性、齢および体重、投与経路ならびにワクチンのＨＰＶによって異なる。その量はまた、ＶＬＰ型の数によっても異なる。免疫学防護応答を生じさせるのに好適なＶＬＰの量が送達されることが好適である。好適には、各ワクチン用量は、１〜１００μｇの各ＶＬＰ、好適には、少なくとも５μｇ、または少なくとも１０μｇ、例えば、５〜５０μｇの間の各ＶＬＰ、より好適には１０〜５０μｇの各ＶＬＰ、例えば５μｇ、６μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、４０μｇまたは５０μｇを含む。特定の実施形態では、キメラおよび非キメラ双方のＶＬＰが存在する場合、これらの量は、各ＨＰＶ型に対して存在するＶＬＰの総量、すなわち、Ｌ２ペプチドを含むキメラＬ１ ＶＬＰとＬ２ペプチドを含まないＬ１ ＶＬＰの総量を表す。
【０１６９】
例えば、本開示による組成物は、一用量中に、
３０μｇのＨＰＶ１６ ＶＬＰ、
３０μｇＨＰＶ１８ ＶＬＰ、
１０μｇのＬ２ペプチド含有キメラＨＰＶ１６ ＶＬＰ
１０μｇのＬ２ペプチド含有キメラＨＰＶ１８ ＶＬＰ
を含むことができ、ここで、キメラＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＶＬＰ中のＬ２ペプチドは同じまたは異なり、同じまたは異なるＨＰＶ型に由来する、以上に記載されているようなＬ２ ５６〜７５およびＬ２ １７〜３６から選択することができる。
【０１７０】
別の例では、本開示による組成物は、一用量中に、
２０μｇのＨＰＶ１６ ＶＬＰ、
２０μｇのＨＰＶ１８ ＶＬＰ、
１０〜２０μｇのＬ２ペプチド含有キメラＨＰＶ１８ ＶＬＰ、
１０〜２０μｇのＬ２ペプチド含有キメラＨＰＶ１６ ＶＬＰ
を含むことができ、ここで、キメラＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＶＬＰ中のＬ２ペプチドは同じまたは異なり、同じまたは異なるＨＰＶ型に由来する、以上に記載されているようなＬ２ ５６〜７５およびＬ２ １７〜３６から選択することができる。
【０１７１】
好適には、上記の組成物は、アジュバント、好適には、アルミニウム塩、好適には、水酸化アルミニウム、好適には、３Ｄ−ＭＰＬなどのＴｈ１アジュバントとの組合せをさらに含む。
【０１７２】
本明細書に記載の組成物は好適には、１、２またはそれを超えるＨＰＶ遺伝子型、好適には、ＨＰＶ５、６、８、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７３の群から選択される任意の１、２または３、４、５またはそれを超えるものに対してヒトまたは動物被験体に免疫応答を生じさせる。これらの組成物は、ＨＰＶ２、３および７３型の１以上に対して免疫応答を生じさせ得ることが好都合である。
【０１７３】
本明細書に記載の組成物は好適には、１、２またはそれを超えるＨＰＶ遺伝子型、好適には、ＨＰＶ５、６、８、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７３から選択される任意の１、２またはそれを超えるものからの感染および／または疾患に対して防護を提供する。好適には、これらの組成物は、少なくともＨＰＶ１６または１８に対して、より好適には、ＨＰＶ１６および１８の双方に対して防護を提供する。
【０１７４】
好適には、本明細書に記載の組成物は、ＨＰＶ１６および１８、ならびに癌を引き起こすＨＰＶ型、性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型および皮膚癌を引き起こすＨＰＶ型から選択される少なくとも１つの他のＨＰＶ型に対して防護を提供する。好適には、これらの組成物は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に加えて以下のＨＰＶ型：ＨＰＶ５、６、８、１１、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７３の１以上に対して防護を提供する。
【０１７５】
本明細書に記載の免疫原性組成物およびワクチンは、ＨＰＶ感染および／または疾患を治療または予防するために使用可能である。例えば、この免疫原性組成物は、ウイルス量および／または子宮頸癌またはＣＩＮ ＩＩＩ後遺症に至る感染を軽減するために治療的に使用することができる。従って、本開示は、ＨＰＶ感染に関連する疾患の治療的処置および感染または疾患の予防における本明細書に記載の免疫原性組成物の使用に関する。好適には、本開示のワクチンの使用は、感染および／または疾患の予防におけるものである。本明細書において「感染」とは、好適には、偶発的感染および／または持続的感染に関する。感染は、例えば、ＰＣＲによって評価することができる。本明細書において「疾患」とは、ＨＰＶ感染に関連する細胞診の異常、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３または子宮頸癌であり得る。疾患は、例えば、組織学的検査またはｐ１６などのバイオマーカーの分析によって評価することができる。
【０１７６】
所望により、免疫原性組成物またはワクチンはまた、初期抗原または非ＨＰＶ抗原などの他のＨＰＶ抗原とともに処方または同時投与することもできる。好適には、これらの非ＨＰＶ抗原は、他の疾患、より好適には、単純ヘルペスウイルス、クラミジアおよびＨＩＶなどの性感染疾患に対して防護を提供することができる。特定の実施形態では、ワクチンは、ＨＳＶ由来のｇＤまたはその末端切断型を含む。この場合、ワクチンは、ＨＰＶおよびＨＳＶの双方に対して防護を提供する。
【０１７７】
本明細書に記載の全てのワクチンについて、ワクチンは好適には１０〜１５歳、好適には１０〜１３歳の青年期の女子のワクチン接種に用いられる。好適には、ワクチンは０〜１０歳の小児集団への投与にも好適である。ワクチンはまた、ｐａｐスメアに異常を示した女性またはＨＰＶによって引き起こされた病巣摘出術後の女性に投与することもできる。従って、このワクチンは、好適には、予防ワクチンとして血清反応陰性集団、および／または治療段階で血清反応陽性集団の双方に適用可能である。このワクチンは男性に投与することもできる。
【０１７８】
好適には、ワクチンは、２または３用量計画にて、例えば、それぞれ、０、１もしくは０、２もしくは０、３もしくは０、４もしくは０、５もしくは０、６か月計画、または０、１、６、もしくは０、２、６か月計画で送達される。ワクチン接種計画には、５〜１０年後、好適には１０年後に追加免疫注射を組み込むのが好適である。４用量以上を用いる他の計画も使用可能である。
【０１７９】
好適には、このワクチンは液体ワクチン製剤であり、ワクチンは凍結乾燥させ、投与前に再構成することができる。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：例示的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド
以下の例示的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを、分子生物学的手法を用いて作製した。これを表３にまとめる。
【表３】
【０１８１】
キメラ１：Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の１３７番と１３８番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ５８ Ｌ２ ＤＥキメラポリペプチド。
【０１８２】
キメラ２：Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の４３２番と４３３番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ５８ Ｌ２ ＣＴキメラポリペプチド。
【０１８３】
キメラ３：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の、１３７番と１３８番の間に挿入され、かつ、Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８またはＨＰＶ６に由来）が４３２番と４３３番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２およびＨＰＶ５８ Ｌ２キメラポリペプチド。
【０１８４】
キメラ４：Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の４３１番と４３２番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ５８ Ｌ２ ＣＴキメラポリペプチド。
【０１８５】
キメラ５：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の１３７番と１３８番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２ ＣＴキメラポリペプチド。
【０１８６】
キメラ６：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の２７２番と２７３番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２ Ｐ／Ｄキメラポリペプチド。
【０１８７】
キメラ７：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の、１３７番と１３８番の間に挿入され、かつ、Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLが４３１番と４３２番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２およびＨＰＶ５８ Ｌ２キメラポリペプチド。
【０１８８】
キメラ８：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の１３７番と１３８番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２ ＤＥキメラポリペプチド。
【０１８９】
キメラ９：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の４３２番と４３３番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ３３ ＣＴキメラポリペプチド。
【０１９０】
キメラ１０：Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の４３１番と４３１番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ５８ Ｌ２キメラポリペプチド。
【０１９１】
実施例２：例示的キメラの合成発現、精製および同定
組換え核酸の生産 実施例１に記載の例示的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を遺伝子合成によって得た後、それらを標準的な遺伝子操作によってバキュロウイルス発現ベクターにクローニングした。挿入部位を表３にまとめる。各Ｌ１ポリペプチドのＣ末端切断は、各Ｌ１ポリペプチドのＣ末端に存在する核局在シグナルならびにＤＮＡ結合ドメインを除去することを目的とするものであった（ＨＰＶ１６、１８のそれぞれに関して３４、３５のアミノ酸のＣ末端欠失）。本明細書において、ＨＰＶ１６および１８ Ｌ１末端切断型のアミノ酸配列はそれぞれ図１ａおよびｂに示されている。ＨＰＶ３３およびＨＶＰ５８ Ｌ２ペプチドのアミノ酸配列は図２に示されている（それぞれ図２（ａ）、図２（ｂ））。例示的キメラのアミノ酸配列は配列番号３６〜４５に示されている。
【０１９２】
細胞採取 着目するＨＰＶ１６または１８ Ｌ１／Ｌ２キメラポリペプチドをコードする組換えバキュロウイルス（ＭＯＩ０．０５〜０．５）を感染させたキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標））細胞（密度〜２００００００細胞／ｍｌ）で、例示的キメラポリペプチドを発現させた。感染４日後に細胞を低速遠心分離によって採取した。得られた細胞ペレットを−７０℃で保存した。
【０１９３】
抗原抽出 例示的キメラポリペプチドを二段階の抽出および清澄化でＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞から抽出した。細胞の抽出工程は、還元および低張バッファー（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ＋４％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ｐＨ８．５）を用いて行った。あるいは、抽出が低率である場合には、ｐＨを８．７とし洗剤Ｅｍｐｉｇｅｎ２％を加えることができる。培養容量の２分の１相当量または培養容量と同量を抽出の実施に用いた。室温で、最低でも半時間の接触時間を用いた。清澄化は遠心分離により行い、上清に濁りがあれば、任意選択の、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ ＣＯＨＣフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または等価物での濾過を行った。
【０１９４】
精製および同定 精製手順は、種々のキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド、キメラポリペプチドに関しては極めてよく似ており、陰イオン交換クロマトグラフィー（（ジまたはトリメチルアミノエチル−ＤＭＡＥまたはＴＭＡＥ）、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの工程を含む。
【０１９５】
超分子形成手順はキメラポリペプチド間で若干異なり、ＮａＣｌおよびＴｗｅｅｎの添加に若干の違いがあり、バッファー交換およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５でのゲル濾過によるＢＭＥの除去、一晩成熟および０．２２μｍでの濾過除菌を含む。
【０１９６】
精製工程は、＋４℃で一晩行うＶＬＰ成熟以外は、室温で行った。全てにＢＭＥ４％ｖ／ｖを加えたが、ＶＬＰ形成を避けるために最終バッファーには加えなかった。用いたバッファーは全て０．２２μｍフィルターで濾過した。各精製の前にゲルマトリックスを消毒し、サンプルを添加する前に適当なバッファーで平衡化した。
【０１９７】
陰イオン交換クロマトグラフィーＴＭＡＥまたはＤＭＡＥ： 清澄化した抽出物を、Ｔｒｉｓ２０ｍＭ｜ＮａＣｌ５０ｍＭ｜４％β−メルカプトエタノールＢＭＥバッファー、ｐＨ８．０±０．２で予め平衡化した陰イオン交換カラム（ジメチルアミノエチル）に適用した。結合しなかったポリペプチドを洗浄した後、Ｔｒｉｓ２０ｍＭ｜ＮａＣｌ５０〜２５０ｍＭ｜４％β−メルカプトエタノールＢＭＥバッファー、ｐＨ８．０±０．２の直線勾配で溶出を行った。抗原はＮａＣｌ勾配内で溶出され、溶出特性を２８０ｎｍでモニタリングした。回収した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｌ１／Ｌ２陽性画分をプールし、次のカラムまで＋４℃で維持した。
【０１９８】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー： 前工程の溶出液を、（ＴＲＩＳ２０ｍＭ｜ＮａＣｌ１８０ｍＭ｜４％ＢＭＥ）バッファー、ｐＨ８．０±０．２で予め平衡化したヒドロキシアパタイトＩ型（ＨＡ）カラムに適用した。
【０１９９】
サンプルを適用した後、ゲルを平衡バッファーで洗浄し、およそ１０カラム容量の（リン酸Ｎａ１００ｍＭ｜ＮａＣｌ３０ｍＭ｜４％ＢＭＥ）バッファー、ｐＨ６．０±０．２で溶出した。ＨＡ溶出液をすぐに溶出バッファーで４０ｍｌまで希釈し、室温で一晩保存した。
【０２００】
次に、ＨＡ溶出液を、（２０ｍＭリン酸Ｎａ｜５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）バッファーで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Ｍ）ゲル濾過カラム（ベッド容量１４５ｍｌ）に適用した。場合によっては、バッファーをＮａＣｌ含量１００ｍＭに変えた。溶出特性を２８０ｎｍ（ポリペプチドの場合）および２５４ｎｍ（ＢＭＥの場合）でモニタリングした。キメラＬ１／Ｌ２抗原はゲル粒子外部容量に回収され、ＢＭＥはもっと後の段階に、総容量（Ｖｔ）とは異なるスペクトルで溶出する。成熟は、＋４℃で一晩保存することによって行った。成熟後、キメラＬ１／Ｌ２抗原を含有するＳｅｐｈａｄｅｘプールを０．２２μｍ無菌フィルターで濾過し、−７０℃で保存した。場合によっては、０．０５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０を濾過前に加えた。培養物８００ｍｌからのキメラＬ１／Ｌ２抗原精製法の簡略化した流れ図を図５ａ）〜ｅ）に示す。
【０２０１】
キメラＬ１／Ｌ２抗原の電子顕微鏡（ＥＭ）による同定 電子顕微鏡を用い、対照として用いたＣ末端切断型ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ Ｌ１タンパク質によって産生されたものと同等の粒子が、ポリペプチド粒子および／またはカプソマーおよび／またはＶＬＰなどの精製キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドから生成されるかどうか、同定を行った。キメラＶＬＰの大きさは対照と同じか大きいと考えられる。精製キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド粒子は、それぞれのバッファー（表３に示す通り）で５０μｇ／ｍｌに希釈した。酢酸ウラシル（ＵＡｃ）を対比染色剤として用いる標準的二段階ネガティブ染色法（Ｈａｙａｔ Ｍ.Ａ.＆ Ｍｉｌｌｅｒ Ｓ.Ｅ.， １９９０）に従う、ＥＭネガティブ染色解析用にサンプルを調製した。要するに、炭素コーティングされたホルムバールフィルムを備えたニッケル格子（４００メッシュ）を１滴のサンプルの上に室温で１０分間浮かべ、材料を吸収させた。余分な溶液を除去し、材料を２分未満で風乾させた。次に、この格子を短時間（３０秒未満）１滴の蒸留水の上に浮かべて、着色沈殿を生じ得る塩を除去した。この格子を、Ｈａｒｒｉｓ （Ｈａｒｒｉｓ, Ｊ.Ｒ., ９４）に従って作製した染色液：水中２％ＵＡｃ（ｗ／ｖ）に１％トレハロース（ｗ／ｖ）を添加したもの１滴の上に移した。３０秒後にこの格子を吸い取り紙で吸い取って乾燥させた。この材料を完全に乾燥させ（１時間）、ＬＥＯ Ｚｅｉｓｓ ＥＭ９１２Ω下、１００ｋＶで調べた。標準的な１００Ｋ原倍率で代表的な視野の画像を採り、表４にまとめた。ＥＭの結果は、形成されたキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、＃５−Ｌ１−ＨＰＶ１６／Ｌ２ ＤＥ１７−３６と＃８−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ ＤＥ１７−３６以外、野生型ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ Ｌ１ ＶＬＰによって産生されたものと同一ではないことを示した。形成された粒子は、ＶＬＰ段階下、非晶質構造または小型で比較的均質な非ＶＬＰ構造のいずれかである。
【表４】
【０２０２】
キメラＬ１／Ｌ２抗原の抗体の同定 精製Ｌ１／Ｌ２キメラ構築物のＬ１成分の抗原性の特性決定は、Ｄｒ. Ｎｅｉｌ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ （Ｃｈｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ., １９９６, ２００１）によって提供されたハイブリドーマから精製されたＨ１６．Ｖ５（コンフォメーション特異的中和モノクローナル抗体；ＨＰＶ−１６ Ｌ１ ＶＬＰとの結合に重要なａａは２６６〜２９７および３３９〜３６５）、Ｈ１８．Ｊ４（コンフォメーション特異的中和モノクローナル抗体（ＨＰＶ−１８ Ｌ１ ＶＬＰ上のエピトープの位置は未知））またはＨ１６．Ｕ４（コンフォメーション特異的中和モノクローナル抗体、ＨＰＶ−１６ Ｌ１ ＶＬＰ上のエピトープは未知）のいずれかをコーティングとして用い、サンドイッチＥＬＩＳＡによって行った。このアッセイを用いて、ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ ＶＬＰの天然調製物に比べて、種々のキメラＬ１／Ｌ２抗原上のＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８コンフォメーション特異的エピトープの存在を証明した。精製Ｌ１／Ｌ２キメラ構築物のＬ２成分は、プレートをキメラ構築物でコーティングした後に、Ｌ２ペプチドアミノ酸１７〜３６ ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１または５６〜７５ ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６に対するウサギポリクローナルのいずれかで検出することによる直接的ＥＬＩＳＡを用いて特性決定した。このアッセイは、＃９−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ Ｃｔ１７−３６以外では、Ｌ２エピトープがキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの表面に十分露出していることを示した。
【表５】
【０２０３】
実施例３：動物モデルにおけるキメラＬ１／Ｌ２抗原の免疫原性および交差反応性の試験法
ＢＡＬＢ／ｃマウス（一般に、１群当たり少なくともマウス１５匹）を（例えば、０日目、１４日目および４２日目の３回の多回用量計画で）２または１０μｇの前記キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド単独またはＣｅｒｖａｒｉｘの同時投与で筋肉内免疫し、２週間後と６週間後の２回の追加免疫を行った。最終免疫の後、好適な期間の後（例えば、１４日目）に、ワクチン接種によって誘導された特異的Ｌ１抗体応答を、ペプチドおよび／またはタンパク質ＥＬＩＳＡによってモニタリングした。ワクチン接種によって誘導された特異的および交差反応性のＬ２抗体応答もペプチドおよび／またはタンパク質ＥＬＩＳＡによってモニタリングすることができる。参照からＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ（４パラメーター方程式を用いる）によってＥＬＩＳＡ力価を算出し、ＥＵ／ｍｌで表した。
【０２０４】
あるいは、２匹のニュージーランドホワイトウサギ（ＮＺＷ、１．５〜２ｋｇ）を、２０または１００μｇの前記キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド単独の筋肉内投与またはＣｅｒｖａｒｉｘの同時投与によって免疫した（例えば、０日目、１４日目、２８日目および４２日目の４回の多回用量計画）。これらのキメラは、ウサギの高度免疫のためにフロイントのアジュバントの代わりに用いる、製造業者のプロトコールに従って調製した油中水型エマルションであるＳｐｅｃｏｌ（Ｃｅｄｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ製）を用いて処方した。
【０２０５】
抗ＶＬＰ血清学（Ｉｇ応答） 抗ＶＬＰ１６またはＶＬＰ１８抗体の定量は、コーティング抗原としてＨＰＶ１６ ＶＬＰまたはＨＰＶ１８ ＶＬＰを用いてＥＬＩＳＡによって行う。
【０２０６】
表６および７に、それぞれマウスおよびウサギのデータをまとめる。
【表６】
【０２０７】
１００％のマウス血清が、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰと反応し、Ｌ２エピトープの挿入がＨＰＶ−Ｌ１応答に影響を及ぼさなかったことを示す。
【表７】
【０２０８】
１００％のウサギ血清が、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰと反応し、Ｌ２エピトープの挿入がＨＰＶ−Ｌ１応答に影響を及ぼさなかったことを示す。
【０２０９】
抗Ｌ２ペプチド血清学（Ｉｇ応答） 抗Ｌ２抗体の定量を、同種（Ｌ２ペプチドアミノ酸１７〜３６ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１またはＬ２ペプチドアミノ酸５６〜７５ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）または異種ＨＰＶ型に由来するＬ２ペプチド（２μｇ／ｍｌ）を用いてＥＬＩＳＡにより行い、特異的応答および交差反応性応答を評価した。交差Ｌ２抗体応答については、以下の合成Ｌ２ペプチドを用いた：ＨＰＶ−５、６、１６、３１、３５、５２および５６のアミノ酸１７〜３６、またはＨＰＶ−５８、４５、３３、５２、５、１１、５６および３５のアミノ酸５６〜７５。
【０２１０】
ＨＰＶ−Ｌ２−ペプチドのＥＬＩＳＡ測定
Ｌ２ペプチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃにより作製）をＰＢＳ中に終濃度２μｇ／ｍｌとなるように希釈し、一晩４℃で、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ, Ｎｕｎｃ, Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに吸着させた。次に、これらのプレートを３７℃で１時間、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ（飽和バッファー）とともにインキュベートした。飽和バッファーで希釈した血清を、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドでコーティングされたプレートに加え、３７℃で１時間３０分インキュベートした。これらのプレートをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、各ウェルに飽和バッファーで希釈したビオチン結合抗Ｉｇを加え、抗マウス試薬（Ｄａｋｏ, ＵＫ）に関しては１時間、または抗ウサギ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ, ＵＫ）に関しては１時間３０分、３７℃でインキュベートした。洗浄工程の後、飽和バッファーで希釈したストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ, ＵＫ）を３７℃でさらに３０分間加えた。プレートを上記で示したように洗浄し、室温で２０分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍクエン酸バッファーｐＨ４．５中、０．０４％ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ） ０．０３％Ｈ２Ｏ２の溶液とともにインキュベートした。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４９２／６２０ｎｍで読み取った。参照からＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ（４パラメーター方程式を用いる）によってＥＬＩＳＡ力価を算出し、ＥＵ／ｍｌで表した。
【０２１１】
ＨＰＶ−Ｌ１のＥＬＩＳＡ測定
ＨＰＶ−１６／１８ Ｌ１ ＶＬＰをＰＢＳ中に終濃度１μｇ／ｍｌとなるように希釈し、一晩４℃で、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ, Ｎｕｎｃ, Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに吸着させた。次に、これらのプレートを３７℃で１時間、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ（飽和バッファー）とともにインキュベートした。飽和バッファーで希釈した血清を、ＨＰＶ Ｌ１ペプチドでコーティングされたプレートに加え、３７℃で１時間３０分インキュベートした。これらのプレートをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、各ウェルに飽和バッファーで希釈したビオチン結合抗Ｉｇ（Ｄａｋｏ, ＵＫ）または抗ウサギＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）を加え、３７℃で１時間３０分インキュベートした。洗浄工程の後、飽和バッファーで希釈したストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ, ＵＫ）を３７℃でさらに３０分間加えた。プレートを上記で示したように洗浄し、室温で２０分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍクエン酸バッファーｐＨ４．５中、０．０４％ｏ−フェニレンジアミン(Sigma) ０．０３％Ｈ２Ｏ２の溶液とともにインキュベートした。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４９２／６２０ｎｍで読み取った。参照からＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ（４パラメーター方程式を用いる）によってＥＬＩＳＡ力価を算出し、ＥＵ／ｍｌで表した。
【０２１２】
表８にマウスにおける免疫原性データをまとめる。
【０２１３】
全てのキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原が、マウスにおいて有意な用量依存的にＬ２抗体応答を誘導した（力価は１６８７〜１８８７３の範囲）。これらの結果は、３回目の免疫の後と４回目の免疫の後の間で免疫原性の向上を示した（データは示されていない）。
【表８】
【０２１４】
表９および１０にペプチド配列１７〜３６および５６〜７５のそれぞれに対するウサギにおけるＥＬＩＳＡデータをまとめる。
【０２１５】
全てのキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原が、ウサギにおいて有意な用量依存的に特異的および交差反応性のＬ２抗体応答を誘導した。Ｌ２のアミノ酸１７〜３６を含むキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドで免疫されたウサギ由来の抗血清はＬ２の合成Ｌ２ペプチドアミノ酸５６〜７５と交差反応せず、また逆もそうであったことから（データは示されていない）、このＬ２応答は特異的なものであった。
【０２１６】
良好な交差反応性が、Ｌ２配列のアミノ酸１７〜３６に由来するほとんどの合成Ｌ２ペプチドで見られた（表９）。この反応性は３０番のアミノ酸に依存している可能性があり、交差反応性が低いまたは無い全ての合成アミノ酸（Ｌ２−アミノ酸１７〜３６ ＨＰＶ−３１および−５６）では、Ｐｒｏ（Ｐ）がＳまたはＥなどの異なるアミノ酸種に置き換わっていた。同様に、Ｌ２のアミノ酸配列５６〜７５の合成Ｌ２ペプチドの全てで比較的良好な交差反応性が見られた（表１０）。この反応性は７０番のアミノ酸に依存している可能性があり、Ｔｈｒ（Ｔ）がＡｌａ（Ａ）などの異なるアミノ酸に置き換わると、交差反応性ではなくなった（Ｌ２−アミノ酸５６〜７５ ＨＰＶ−１１、−５２および−５６）。
【表９】
【表１０】
【０２１７】
中和実験 ３回目および／または４回目の免疫の２週間後に、血清を中和アッセイバッファーで希釈し（８点４倍連続希釈−最初の希釈は、ウサギ血清では１／１０、マウスでは１／４０で始めた）、免疫の際に用いたものと同じおよび異なるＨＰＶ型に由来する感染性シュードウイルス（ＰｓＶ）と混合した。この混合物を４℃で１時間反応させ、少なくとも２時間前、４．５時間以内に播種した２９３ＴＴ細胞（３００００細胞／ウェル）に加えた。７２時間５％ＣＯ２で培養した後、上清を回収し、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳｅＡＰ）活性を測定した（ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）が直線範囲（例えば、７５〜１００ＲＬＵの間）に入るように至適化したことで改変した、本質的にＰａｓｔｒａｎａ ｅｔ ａｌ ２００４に記載されているような中和アッセイ）。中和力価は、血清の不在下でＰｓＶ感染によって生成されるＳｅＡＰ活性シグナルに５０％の低下をもたらす血清希釈率の逆数として表す。４０より小さい中和力価は、カットオフより下であると見なされる。
【０２１８】
表１１にマウスにおけるデータをまとめる。
【表１１】
【０２１９】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原＃５−Ｌ１−ＨＰＶ１６／Ｌ２ ＤＥ１７−３６および＃８−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ ＤＥ１７−３６での免疫は単独で、マウスにおいて試験した場合（表１０）、＃２−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ Ｃｔ５６−７５を除き、検出可能な特異的中和抗体（力価は２６２〜６９６の範囲）を誘導した。ＨＰＶ１６／１８ Ｌ１ ＶＬＰと組み合わせた場合、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原＃５−Ｌ１−ＨＰＶ１６／Ｌ２ ＤＥ１７−３６および＃８−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ ＤＥ１７−３６は、程度は低いが、なお検出可能な中和抗体を誘導した（力価は６１〜６３３の範囲）。
【表１１ｂ】
【０２２０】
表１２および１３に、それぞれＩＩＩ後およびＩＶ後１４日目におけるウサギの中和データをまとめる。
【０２２１】
Ｌ１／Ｌ２キメラ＃２（ＮａＣｌ１００ｍＭ中）以外、試験したほとんどのキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原が、ウサギにおいて検出可能な特異的および交差中和抗体を誘導した（表１２および１３）。Ｌ２ペプチド５６〜７５ ＨＰＶ５８／ＨＰＶ１１の提示は、このキメラがＥＬＩＳＡ力価を誘導したという所見にもかかわらず、中和抗体の誘導には最適でない可能性がある。キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドにおけるＬ２ペプチドの挿入は、ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ Ｌ１に対する高力価中和抗体の誘導を妨げなかった（表１１および１２）。Ｓｐｅｃｏｌ中に処方されたキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド＃８は、ミョウバン−ＭＰＬ処方物に比べておよそ２倍高い中和力価を誘導した（表１３）。Ｌ１／Ｌ２キメラ単独による免疫は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ−１８に対して有意に高い中和抗体を誘導し、これは担体タンパク質ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ Ｌ１ ＶＬＰに対する抗体応答を表す。さらに、高リスクＨＰＶ−３３、５８の良好な中和が、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド＃５で、またそれより程度は低いがキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド＃８でも見られた。さらに、低リスクＨＰＶ−６および１１の中和も、両ウサギ血清で検出された（表１３）。
【表１２】
【表１３】
【０２２２】
別の実験で、小型の非ＶＬＰとして精製したキメラ＃２、およびキメラ３を、ＡＳ０４アジュバント（ミョウバン３Ｄ−ＭＰＬ）中に処方し、個別のウサギに投与し、Ｅｌｉｓａで抗ペプチド１７〜３６および抗ペプチド５６〜７５および抗ＨＰＶ Ｌ１応答に関して調べた。２回目の免疫の後、以下のデータが得られた。
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【０２２３】
参照文献一覧
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【０２２４】
例示的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸配列
【技術分野】
【０００１】
本開示はヒトワクチンの分野に関する。より詳しくは、本開示は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染または疾患の予防または治療のための医薬・免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスは、極めて種特異的な小型のＤＮＡ腫瘍ウイルスである。ヒトパピローマウイルスは、基底上皮（皮膚または粘膜）細胞に感染するＤＮＡウイルスである。これまでに１００を超える独特なヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子型が記載されている。ＨＰＶは、一般に、皮膚の扁平上皮に特異的であるか（例え、ＨＰＶ−１およびＨＰＶ−２）または粘膜表面に特異的であるか（例えば、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１）のいずれかであり、通常は、数ヶ月間または数年間持続する良性の腫瘍（疣贅）生じる。
【０００３】
癌原性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型による持続的感染は、世界的に女性の癌による２番目に多い死因である子宮頸癌の必須要因である。遺伝子型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６６を含む「高リスク」遺伝子型が子宮頸癌を招くおそれがあり、他の粘膜肛門性器癌および頭頸部癌にも関連するという国際的な共通認識がある。世界的にみて、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８が、累積して全ての浸潤性子宮頸癌原因の７０〜８０％超を占める主要な癌原型である。
【０００４】
「低リスク」と呼ばれる他の遺伝子型による感染は良性または低悪性度の子宮頸組織変化および女性では子宮頚、膣、陰門および肛門、また男性では陰茎、陰嚢または肛門上の腫瘍である性器疣贅（尖圭コンジローム）を生じさせる。それらはまた、小児および成人の声帯に、外科的介入を必要とする上皮性腫瘍を生じさせる（若年性呼吸器系乳頭腫症または再発性呼吸器系乳頭腫症）。
【０００５】
最近、多くの国で、２種類の予防用ＨＰＶワクチンが認可された。双方とも、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８子宮頸前癌病変および癌を予防するための、個々のＨＰＶ型の組換えＬ１キャプシドタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を用いるものである。Ｃｅｒｖａｒｉｘ（商標）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）は、バキュロウイルス現ベクター系を用いてキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞基質で生産され、免疫賦活薬３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および水酸化アルミニウム塩とともに処方されたＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ ＶＬＰを含む。Ｇａｒｄａｓｉｌ（商標）（Ｍｅｒｃｋ）は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で生産され、非晶質アルミニウムヒドロキシリン酸硫酸塩とともに処方されたＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ ＶＬＰを含む。さらに、Ｇａｒｄａｓｉｌ（商標）は、性器疣贅の７５〜９０％に関連する非癌原型ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１由来のＶＬＰを含む。両ワクチンとも、癌原型ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８による感染および関連の前癌病変に対する特異的防護が無作為化臨床試験で実証されている。
【０００６】
子宮頸癌を引き起こす原因となる癌原性ＨＰＶのリストには、子宮頸癌に見られる少なくとも１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７３型のＨＰＶが含まれる（Ｍａｈｄａｖｉ ｅｔ ａｌ, ２００５； Ｑｕｉｎｔ ｅｔ ａｌ., ２００６）。
【０００７】
既存のワクチンは、これらのＨＰＶ型のいくつかによる感染および／または疾患に対する特異的防護を様々な程度で提供することができる。しかしながら、子宮頸癌を引き起こすＨＰＶ型の全てに対して適用域をさらに向上させるために他のＨＰＶ型に由来する抗原を含むか、または関連の、また無関連のＨＰＶ型に対して広い交差防護を惹起するかのいずれかのワクチンを得ることがおそらく有益であろう。ＨＰＶ５またはＨＰＶ８またはＨＰＶ３８またはこれらの２つ以上の任意の組合せなど、皮膚癌を引き起こすＨＰＶ型に対してさらに効果的なワクチンを得ることも有益であろう。
【０００８】
現在認可されているＬ１ ＶＬＰワクチンに加え、例えば、ＷＯ２００３／０９７６７３、ＷＯ２００４／０５２３９５、ＷＯ２００６／０８３９８４、ＷＯ２００９／００１８６７、Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ８０, ８４１‐８４６, Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ ２００６ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５８, ２６６‐２７２, Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ ２００９ ２５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕs Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ８−１４ｔｈ Ｍａｙ, Ｍａｌｍｏ, Ｓｗｅｄｅｎ, Ｃｏｕｒｓａｇｅｔ ｅｔ ａｌ, ２５ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ８−１４ｔｈ Ｍａｙ, Ｍａｌｍｏ, Ｓｗｅｄｅｎ, Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｖａｃｃｉｎｅ ２５, ２００１‐２０１０, Ｘｕ ｅｔ ａｌ ２００６ Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １５１, ２１３３‐２１４８, Ｇａｍｂｈｉｒａ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１, １３９２７−１３９３１, Ａｌｐｈｓ ｅｔ ａｌ ２００８ ＰＮＡＳ １０５, ５８５０−５， Ｋａｗａｎａ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｖａｃｃｉｎｅ ２１, ４２５６‐６０, Ｋａｗａｎａ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｖａｃｃｉｎｅ １９, １４９６‐１５０２では、Ｌ２のペプチドがＨＰＶワクチンに使用するために提案されている。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、性器疣贅に関連するさらなる癌を引き起こすＨＰＶ型および／または低リスクＨＰＶ型に対する防護をもたらす抗原を含む、ヒトパピローマウイルスに対する改良型ワクチンに関する。これらの改良型ワクチンは、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドが挿入されたキメラＬ１ポリペプチドを含む。
【００１０】
本発明の一実施形態では、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片が提供される。一実施形態では、このポリペプチドはＬ２ポリペプチドの少なくとも２つのペプチドを含む。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を提供する。
【００１２】
本発明のキメラポリペプチドは、カプソマーまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）として提供することができる。このようなポリペプチド、カプソマーおよびＶＬＰは、免疫原性組成物として処方(製剤化)することができる。それらの製造方法、確認方法および例えばＨＰＶ感染予防用薬剤におけるそれらの使用方法が記載される。
【００１３】
本発明はさらに、
（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む少なくとも１つのキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰ
を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、各Ｌ１がそのＬ１配列中にＬ２ペプチドを含む、２以上のキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰの組合せを含む組成物を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ＨＰＶ感染に関連する障害の予防または治療に使用するための、
（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む少なくとも１つのキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰ
を含む組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、ＨＰＶ感染に関連する障害の予防または治療に使用するための、Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む、２以上のキメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰの組合せを含む組成物を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、ＨＰＶ感染に関連する障害の予防または治療ための薬剤(医薬)の製造における、
（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む少なくとも１つのキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰ
の使用を提供する。
【００１８】
本発明はさらに、ＨＰＶ感染に関連する障害の予防または治療のための薬剤の調製における、Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む、２以上のキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰの組合せの使用を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、Ｌ１配列中に２以上のＬ２ペプチドを含むキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰを提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する抗体を誘導する方法を提供する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する中和抗体を誘導する方法を提供する。このような方法はまた、交差中和抗体を誘導することもできる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する細胞性免疫を誘導する方法を提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する中和抗体および細胞性免疫を誘導する方法を提供する。このような方法はまた交差中和抗体を誘導することもできる。
【００２４】
本発明はさらに、本発明による免疫原性組成物をヒトに投与することを含む、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染に関連するＨＰＶ疾患を予防する方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、（ｉｉ）Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む少なくとも１つのキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰと、（ｉｉｉ）薬学上許容される希釈剤または担体と、所望により（ｉｖ）アジュバントを合わせて本明細書に記載の免疫原性組成物を作製することを含む、免疫原性組成物の調製方法を提供する。本発明はさらに、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、本明細書に記載のキメラポリペプチドの精製方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、Ｌ１配列中にＬ２ペプチドを含む２以上のキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰを合わせることを含む、免疫原性組成物の調製方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのペプチドエピトープを含むＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドと薬学上許容される希釈剤または担体を合わせることを含む、組成物の調製方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＣ末端切断型Ｌ１配列を示す図である。図１（ａ）および（ｂ）のＨＰＶ１６配列およびＨＰＶ１８配列のアミノ酸番号はそれぞれ、本明細書を通じ、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＬ１に関して用いられる。
【図１Ｂ】図１Ａの続きである。
【図２Ａ】ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｌ１の露出ループと、Ｌ１配列へのＬ２ペプチドの挿入位置の例を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】図２Ｂの続きである。
【図２Ｄ】図２Ｃの続きである。
【図３Ａ】露出ループ領域およびＣ末端侵入アーム領域におけるＨＰＶ１６、１８および他の型のＬ１配列のアライメントを示す図である。一番上の配列が、図１に示されるＨＰＶ１６Ｌ１配列である。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図３Ｃ】図３Ｂの続きである。
【図３Ｄ】図３Ｃの続きである。
【図３Ｅ】図３Ｄの続きである。
【図３Ｆ】図３Ｅの続きである。
【図３Ｇ】図３Ｆの続きである。
【図３Ｈ】図３Ｇの続きである。
【図３Ｉ】図３Ｈの続きである。
【図３Ｊ】図３Ｉの続きである。
【図３Ｋ】図３Ｊの続きである。
【図３Ｌ】図３Ｋの続きである。
【図４】種々の異なるＨＰＶ型由来のＬ２ペプチドを示す図である。
【図５】キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの精製に関するフローチャートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
序論
本開示は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染によって引き起こされる疾患の予防および治療のための組成物および方法に関する。より具体的には、本開示は、主要キャプシドタンパク質Ｌ１とＬ２と呼ばれる主要キャプシドタンパク質の免疫原性成分を含有するキメラポリペプチドに関する。本明細書で開示されるキメラポリペプチドは、少なくとも１つのＬ２ペプチドが挿入されたＬ１ポリペプチドを含む。Ｌ２ペプチドは、Ｌ２ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを含むように選択される。
【００３０】
一実施形態では、Ｌ１ポリペプチドは、ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドである。従って、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドが挿入された、ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む。例えば、Ｌ２ペプチドは、１８型以外のＨＰＶ型に由来することできる（すなわち、非ＨＰＶ１８型Ｌ２ペプチド）。好都合には、Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、そのペプチドが選択されたＬ２ポリペプチドを含む天然タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる。さらに、Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、少なくとも１つの付加的天然Ｌ２タンパク質に対しても免疫応答を誘導することができる。
【００３１】
一実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸１〜２００から、例えば、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸１〜１５０から選択される。特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１７〜３６を含むペプチド；ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基５６〜７５を含むペプチド；ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基９６〜１１５を含むペプチド；およびＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１０８〜１２０を含むペプチドからなる群から選択される。種々の実施形態では、Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は、配列番号１〜３１で表されるアミノ酸配列を含む。例示的な一実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ３３型Ｌ２のアミノ酸１７〜３６（ＨＰＶ１１型Ｌ２のアミノ酸１７〜３６と同一）からなる。別の例示的実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ５８型Ｌ２のアミノ酸５６〜７５（ＨＰＶ６型Ｌ２のアミノ酸５６〜７５と同一）からなる。より一般には、Ｌ２ペプチドは、少なくとも２つの異なるＨＰＶ型のＬ２ポリペプチドと同一の少なくとも８個の連続するアミノ酸（すなわち、２以上のＨＰＶ型の間のコンセンサス配列）を含むように選択することができる。
【００３２】
別の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むペプチドが挿入された、ＨＰＶ１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む。例えば、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ５８型などの癌原型ＨＰＶ由来のＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むことができる。
【００３３】
特定の実施形態では、Ｌ１ポリペプチドに挿入されてキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを形成するＬ２ペプチドは、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む。一実施形態では、Ｌ２ペプチドは、２つのシステイン間のジスルフィド結合を除去するか、またはジスルフィド結合を形成し得る２つのシステイン間のアミノ酸を除去するような、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換を有する。好都合には、アミノ酸の挿入、欠失または置換を伴ってＬ２ペプチドを含むポリペプチドは、少なくとも１つの天然Ｌ２タンパク質（または天然に存在するＬ２ポリペプチド）に対して免疫応答を誘導することができる。
【００３４】
一実施形態では、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質は、１以上のアミノ酸のＣ末端欠失を有する。特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドの露出領域に挿入されている。種々の実施形態では、この露出ループは、ＤＥループ（例えば、アミノ酸１３２〜１４２の間）；ＦＧループ（例えば、アミノ酸１７２〜１８２の間）；ＨＩループ（例えば、アミノ酸３４５〜３５９の間）；および／またはＬ１ポリペプチドのＣ末端（例えば、アミノ酸４２９〜４４５の間）であり得る。一実施形態では、２以上のＬ２ペプチドが、Ｌ１ポリペプチド内に挿入される。例えば、２以上のＬ２ペプチドは、同じ部位に挿入することもできるし（例えば、連続する一連のアミノ酸またはコンカテマーとして）、またはＬ１ポリペプチドのＤＥループとＣ末端など、異なる部位に挿入することもできる。所望により、同じ部位に挿入される場合、２以上のＬ２ペプチドは、複数のアミノ酸を含むスペーサーによるなど、少なくとも１つの付加的アミノ酸によって連結することができる。２以上のＬ２ペプチドがＬ１ポリペプチドに挿入される場合、それらのＬ２ペプチドは同じであっても異なってもよい。一般に、Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は、天然Ｌ２ポリペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸を欠失させることなく、Ｌ１ポリペプチド内に挿入されている。他の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドの１以上のアミノ酸の欠失を伴ってＬ１ポリペプチドに挿入されている。
【００３６】
いくつかの実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２は、キメラポリペプチドの超分子アセンブリ、例えば、非晶質凝集物などのポリペプチド粒子、または例えば、カプソマーもしくはウイルス様粒子（ＶＬＰ）もしくは小型の非ＶＬＰ構造などのより規則的な構造である。
【００３７】
本開示の別の態様は、上記のようなキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このような核酸は、原核生物または真核生物発現ベクター中に提供することができる。好適な発現ベクターとしては、例えば、組換えバキュロウイルスが挙げられる。この組換え核酸、例えば、発現ベクターは、宿主細胞に導入する（例えば、感染させる、トランスフェクトするまたは形質転換させる）ことができる。このような宿主細胞もまた本開示の特徴である。これらの宿主細胞は、例えば組換えポリペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を複製することによって、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを生産するために使用可能である。所望により、このポリペプチドはその後、例えば、免疫原性組成物として処方する前に単離および／または精製することができる。
【００３８】
本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドはいずれも、ＨＰＶにより引き起こされる感染または疾患の予防または治療のための薬剤、例えば、免疫原性組成物（ワクチンなど）に使用することができる。これらの組成物は、免疫原性組成物をヒト被験体に投与することにより、ヒトにおいてＨＰＶに対する抗体を誘導する方法に用いるのに好適である。好都合には、ヒト被験体に免疫原性組成物を投与することは、ＨＰＶ感染または疾患を予防、改善または治療する抗体を誘導する。
【００３９】
従って、本開示はまた、ＨＰＶ感染または疾患の予防、改善または処置(治療)に使用するための免疫原性組成物を提供する。このような免疫原性組成物は、上記のようなキメラＬ１／Ｌ１ポリペプチド（例えば、タンパク質）、カプソマーまたはＶＬＰを薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物はまたアジュバントも含む。好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、および／または３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。
【００４０】
一実施形態では、これらの組成物は、（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含んでなるか、またはそれらからなる少なくとも１つのウイルス様粒子（ＶＬＰ）；および（ｉｉ）Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドが挿入されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つのキメラポリペプチドを含む。本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドはいずれも（上述の超分子アセンブリ、ポリペプチド粒子、カプソマーおよび／またはＶＬＰＳを含む）、ＶＬＰをキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドと組み合わせて含有する組成物に使用するのに好適である。
【００４１】
一実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドと組み合わせて用いるためのＶＬＰは、Ｌ１ポリペプチドまたはその断片からなる。特定の実施形態では、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰはＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８Ｌ１ ＶＬＰである。同様に、キメラポリペプチドはまた、ＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片および／またはＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片を含み得る。
【００４２】
一実施形態では、例示的な一実施形態のこのような組成物は、Ｌ２ペプチドが挿入された、ＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、ＨＰＶ１８Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、またはＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片とＨＰＶ１８Ｌ１ポリペプチドもしくは断片の双方からなる（ｉｉ）の少なくとも１つのキメラポリペプチドを含む。上記で開示したように、これらのキメラペプチドは、Ｌ１ポリペプチドの１以上のアミノ酸のＣ末端欠失を伴ったＬ１ポリペプチドを含み得る。特定の一実施形態では、免疫原性組成物は、ＨＰＶ１６Ｌ１ ＶＬＰとＨＰＶ１８Ｌ１ ＶＬＰの双方、およびＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチドとＨＰＶ１８Ｌ１ポリペプチドの双方を含むキメラポリペプチドを含む。このような一実施形態では、ＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチドを含むキメラポリペプチド、およびＨＰＶ１８ポリペプチドを含むキメラポリペプチドは、異なるＬ２ペプチドを含むことができる。例示的Ｌ１断片は、Ｃ末端の３４個のアミノ酸を欠いたＨＰＶ１６Ｌ１、またはＣ末端の３５個のアミノ酸を欠いたＨＰＶ１８Ｌ１を含む。
【００４３】
同様に、別の実施形態では、免疫原性組成物は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドとともに含む２以上のキメラポリペプチドの組合せを含み得る。例えば、この組合せは、同じまたは異なるＬ１成分を有するキメラポリペプチドを含み得る。同様に、この組合せのキメラポリペプチドは、同じまたは異なるＬ２成分を含み得る。特定の一実施形態では、キメラポリペプチドは、同じＨＰＶ型のＬ１ポリペプチドを含み、Ｌ２ペプチドが異なる。
【００４４】
例示的な処方物では、免疫原性組成物は、ヒトの一用量当たり、各１０〜５０μｇの間のＶＬＰおよび／またはキメラポリペプチドを含む。一実施形態では、ＶＬＰおよび／またはキメラポリペプチドはそれぞれおよそ２０μｇの量で存在する。
【００４５】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つのキメラポリペプチドを、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つの挿入ペプチドと、または少なくとも１つの他のキメラポリペプチドと、または少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、薬学上許容される希釈剤または担体および所望によりアジュバントと一緒に合わせることにより調製することができる。
【００４６】
用語
本開示の種々の実施形態の総説を助けるため、以下の用語説明を示す。追加の用語および説明が本開示の中に示されている場合もある。
【００４７】
特に断りのない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を持つ。分子生物学の一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ, Ｇｅｎｅｓ Ｖ, ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ, １９９４ （ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）； Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ. （ｅｄｓ.）, Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ., １９９４ （ＩＳＢＮ 0-632-02182-9);およびＲｏｂｅｒｔ Ａ. Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ.）, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ, ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｉｎｃ., １９９５ （ＩＳＢＮ １−５６０８１‐５６９−８）に見出せる。
【００４８】
単数の用語「a」、「an」および「the」は、そうではないことが明示されない限り、複数の対象を含む。同様に、「または」という用語は、そうではないことが明示されない限り、「および」を含むものとする。「複数の」という用語は、２以上を指す。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示される、全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量またはモル質量値は概数であり、記述上のものであると理解すべきである。さらに、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して示される数値限界は、概数であるものとする。従って、濃度が少なくとも（例えば）２００ｐｇであると示される場合には、濃度は少なくともおよそ（または「約」または「〜」）２００ｐｇであると理解されることが意図される。
【００４９】
本明細書に記載されているものと同等または等価な方法および材料は本開示の実施または試験に使用可能であるが、以下、好適な方法および材料を記載する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。従って、文脈がそうではないことを必要としない限り、「含む（ｃｏｎｐｒｉｓｅｓ）」およびその変形（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」など）は、示された化合物または組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗原）もしくはステップまたは化合物群もしくは一連のステップの包含を意味し、他の任意の化合物、組成物、ステップまたはその群の排除を意味するのではないと理解される。省略形「例えば(e.g.)」は、ラテン語の「ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ」からきたもので、本明細書では非限定例を示して用いられる。従って、省略形「ｅ.ｇ.」は、「ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ」という用語と同義である。
【００５０】
「ヒトパピローマウイルス」は、「ＨＰＶ」と略され、ヒトに感染することができるパピローマウイルス属のメンバーを表す。主要な２群のＨＰＶ（性器群および皮膚群）が存在し、それぞれが、遺伝的同一性によって分類される複数のウイルス「型」または「株」（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５８など）を含む。本開示においては、「型」は、ＨＰＶ、および／またはＨＰＶの特定の型に由来するポリペプチドを表すために使用することができる。「非」という言葉が頭に付く場合、示されたＨＰＶまたはポリペプチドは、示されたもの以外の少なくとも１つの他の型またはさらなる型のＨＰＶである。例えば、「ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチド」とは、ＨＰＶ１８型のＬ１ポリペプチドを表す。これに対し、「非ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチド」とは、ＨＰＶ１８型以外の任意の型のＬ１ポリペプチドを表す。
【００５１】
「ポリペプチド」とは、そのモノマーがアミド結合によって連結されたアミノ酸残基であるポリマーを表す。本明細書において「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、任意のアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質などの改変配列を含むものとする。「ポリペプチド」とは、具体的には、天然に存在するタンパク質、ならびに組換え生産または合成生産されたものを包含するものとする。ポリペプチドに関して「断片」とは、ポリペプチドの一部（すなわち、部分配列）を表す。「免疫原性断片」とは、全長参照タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの主要免疫原性エピトープを保持するポリペプチドのあらゆる断片を表す。ポリペプチド内の配向は一般に、個々のアミノ酸のアミノ部分およびカルボキシ部分の配向によって定義される、Ｎ末端からＣ末端方向に記載される。ポリペプチドはＮ末端またはアミノ末端からＣ末端またはカルボキシ末端に向かって翻訳される。
【００５２】
「ポリヌクレオチド」および「核酸配列」とは、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの重合形態を表す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのヌクレオチドの改変形態であり得る。この用語には、一本鎖形態および二本鎖形態のＤＮＡが含まれる。「単離されたポリヌクレオチド」とは、それが由来する生物体の天然に存在するゲノムにおいて、それがすぐ隣接する両コード配列（５’末端上のものと３’末端上のもの）と隣接しないポリヌクレオチドを意味する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。核酸の５’および３’配向は、個々のヌクレオチド単位の連結に関して定義され、デオキシリボース（またはリボース）の糖環の炭素の位置に従って表される。ポリヌクレオチド配列の情報（コード）内容は、５’から３’の方向に読まれる。
【００５３】
核酸、ポリペプチドまたは別の細胞成分に関して「異種」とは、その成分が通常天然には見られないところに存在すること、および／または異なる供給源または種に由来することを示す。
【００５４】
「天然」および「天然に存在する」とは、それが天然にあるものと同じ状態で存在するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸などの要素を意味する。すなわち、その要素は人工的に改変されてない。本開示においては、種々の天然に存在するＨＰＶ型から得られる、多くの天然／天然に存在するＨＰＶ型（ならびにＨＰＶタンパク質およびポリペプチド）が存在すると理解される。
【００５５】
「変異体」は、核酸またはポリペプチドに関する場合（例えば、ＨＰＶ Ｌ１またはＬ２核酸またはポリペプチド）、参照核酸またはポリペプチドとは異なる核酸またはポリペプチドである。通常、変異体と参照核酸またはポリペプチドの間の違いは、参照物に比べて比較的少数の違いを構成する。変異体核酸は、比較される参照核酸と、１以上のヌクレオチドの付加、欠失もしくは置換によって、または人工ヌクレオチド類似体の置換によって異なり得る。同様に、変異体ポリペプチドは、比較される参照ポリペプチドと、１以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によって、またはアミノ酸類似体の置換によって異なり得る。
【００５６】
「抗原」は、動物において抗体の生産および／またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物または物質であり、動物に注射、吸収またはそうでなければ導入される組成物を含む。「抗原」とは、関連する全ての抗原性エピトープを含む。「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を表す。「主要抗原性エピトープ」または「主要エピトープ」は、機能的に有意な宿主免疫応答、例えば、抗体応答またはＴ細胞応答が生じるエピトープである。従って、病原体に対する防護免疫応答に関して、主要抗原性エピトープは、宿主免疫系によって認識された際に、病原体のよって引き起こされる疾患の防護をもたらす抗原性部分である。「Ｔ細胞エピトープ」とは、適当なＭＨＣ分子と結合した際に、Ｔ細胞が（Ｔ細胞受容体を介して）特異的に結合するエピトープを表す。「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体（またはＢ細胞受容体分子）が特異的に結合するエピトープである。
【００５７】
「免疫応答」は、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞または単球などの免疫系細胞の応答である。免疫応答は、抗原特異的中和抗体などの特異的抗体の生産をもたらすＢ細胞応答であり得る。免疫応答はまた、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答であり得る。いくつかの場合では、この応答は特定の抗原に特異的である（すなわち、「抗原特異的応答」）。抗原が病原体に由来する場合には、抗原特異的応答は「病原体特異的応答」である。「防護免疫応答」は、病原体の有害な機能もしくは活性を阻害するか、病原体による感染を軽減するか、または病原体による感染の結果起こる症状（死を含む）を低減する免疫応答である。防護免疫応答は、例えば、プラーク減少アッセイもしくはＥＬＩＳＡ中和アッセイにおけるウイルス複製もしくはプラーク形成の阻害によって、またはin vivo病原体投与に対する耐性の測定によって測定することができる。
【００５８】
「アジュバント」は、免疫応答の生成を非特異的に増強する薬剤である。一般的なアジュバントとしては、抗原が吸着される無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液；油中水型および水中油型を含むエマルション（および二重エマルションおよび可逆的エマルションを含むその変形）、リポ糖類、リポ多糖類、免疫賦活核酸（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９アゴニスト）、およびこのような成分の種々の組合せが挙げられる。
【００５９】
「免疫原性組成物」は、例えば、ヒトパピローマウイルスなどの病原体に対して特異的な免疫応答を惹起することができる、ヒトまたは動物被験体（例えば、試験設定下で）に投与するのに好適なものの組成物である。従って、免疫原性組成物は、１以上の抗原（例えば、ウイルスの抗原性サブユニット、例えば、そのポリペプチド）または抗原性エピトープを含む。免疫原性組成物はまた、賦形剤、担体、および／またはアジュバントなどの免疫応答を惹起または増強することができる１以上の付加的成分を含むことができる。特定の場合において、免疫原性組成物は、病原体によって引き起こされる徴候または症状から被験体を保護する免疫応答を惹起するために投与される。いくつかの場合では、病原体によって引き起こされる徴候または疾患は、被験体が病原体に曝された後に病原体（例えば、ヒトパピローマウイルス）の複製を阻害することにより、予防（または治療、例えば、軽減または改善）される。例えば、本開示に関して、ヒトパピローマウイルスに対する防護的または待期的免疫応答を惹起することを目的に被験体または被験体集団に投与することを意図する免疫原性組成物の特定の実施形態が、ワクチン組成物またはワクチンである。
【００６０】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド
本発明は、ワクチン組成物へと処方(製剤化)することができ、ＨＰＶ感染および／または疾患に対して防護をもたらすための安全かつ効果的なワクチン組成物の必要を満たし、現在市販されているワクチンとは異なる、ポリペプチドに関する。特に、本発明は、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドの抗原性エピトープを含む少なくとも１つのペプチドが挿入されたＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドを含むキメラポリペプチドに関する。
【００６１】
本明細書で開示されるＨＰＶ Ｌ１およびＬ２ポリペプチドは、特に、高リスクの癌を引き起こすＨＰＶ型であるＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８または７３、および性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型、例えば、ＨＰＶ６または１１、および皮膚癌を引き起こす型、例えば、ＨＰＶ５型およびＨＰＶ８型、またはさらには尋常性疣贅に関連する２型および３型、および良性皮膚疣贅に関連するＨＰＶ７６型を含むＨＰＶのいずれの遺伝子型に由来してもよい。
【００６２】
例えば、一実施形態では、本発明は、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を提供する。Ｌ２ポリペプチドのエピトープは、適切に提示された場合に、ヒトパピローマウイルス、例えば、天然に存在するヒトパピローマウイルス由来の天然（例えば、全長）Ｌ２ポリペプチドを認識する免疫応答を誘導することができるペプチドである。
【００６３】
別の実施形態では、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチド由来のアミノ酸５６〜７５を含む少なくとも１つのペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片が提供される。
【００６４】
Ｌ１ポリペプチドは、全長Ｌ１ポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、Ｌ１ポリペプチドは、Ｌ１の断片、例えば、ＮまたはＣ末端から１以上のアミノ酸が欠失することによる末端切断された断片である。よって、特定の実施形態では、Ｌ１ポリペプチドは、天然タンパク質（すなわち、天然に見られるタンパク質）に比べて一方の末端または両末端から１以上のアミノ酸が除去された末端切断型である。特定の実施形態では、Ｌ１ポリペプチドは、Ｃ末端欠失を有する。Ｌ１ ＨＰＶ１６配列の例を図１ａに示す。Ｌ１ ＨＰＶ１８配列の例を図１ｂに示す。
【００６５】
末端切断型Ｌ１タンパク質は、例えば、カプソマーまたはＶＬＰへと自己アセンブリすることができる。ウイルス様粒子は一般に、電子顕微鏡下ではＨＰＶウイルスとよく似ている。一般に、ウイルス様粒子は７２のカプソマーから構成され、これらのカプソマーは、５量体単位の５つのＬ１ポリペプチドから構成される。好適には、本明細書で用いられる少なくとも１つのＬ１タンパク質は末端切断型Ｌ１タンパク質を含み、複数のＨＰＶ ＶＬＰ、キメラポリペプチドまたはカプソマーが存在する場合には、好適には、組成物中の全てのＬ１タンパク質が末端切断型Ｌ１タンパク質である。好適には、この末端切断は核局在シグナルを除去する。好適には、この末端切断はＣ末端切断である。好適には、このＣ末端切断は、５０未満のアミノ酸、例えば４０未満のアミノ酸を除去する。特定の一実施形態では、Ｃ末端切断は、ＨＰＶ１６から３４のアミノ酸を除去し、ＨＰＶ１８から３５のアミノ酸を除去する。
【００６６】
本明細書で用いる末端切断型Ｌ１タンパク質は好適には、機能的Ｌ１タンパク質誘導体または変異体である。機能的Ｌ１タンパク質誘導体または変異体は、（所望により、適宜アジュバント添加された場合）免疫応を生じることができ、該免疫応答は、全長Ｌ１タンパク質を含むウイルス（またはそれからなるＶＬＰ）および／またはＬ１タンパク質が由来するＨＰＶ型を認識することができる。
【００６７】
本明細書で開示されるキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドにおけるＬ２ペプチドの位置は重要である。
【００６８】
本明細書で開示されるいずれの実施形態においても、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１タンパク質の露出ループの１つまたはＣ末端侵入アームに位置することができる。これらのループおよび侵入アームは、Ｌ１がカプソマーまたはウイルス様粒子の形態である場合に見られる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０００ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５, ５５７‐５６７）。
【００６９】
本明細書で開示されるいずれの実施形態においても、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１配列の以下の領域から選択される位置（ここで、これらの位置は図１に示されるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８Ｌ１参照配列に関する）、または別のＨＰＶ Ｌ１配列の等価な位置に存在することができる：
（ｉ）アミノ酸５０〜６１のＢＣループ、
（ｉｉ）アミノ酸１３２〜１４２、例えばアミノ酸１３２〜１４１、特にアミノ酸１３７〜１３８のＤＥループ、
（ｉｉｉ）アミノ酸１７２〜１８２、例えば１７６〜１８２、特に１７６〜１７９のＥＦループ、
（ｉｖ）アミノ酸２７１〜２９０、例えば２７２〜２７５、特に２７２〜２７３のＦＧループ、
（ｖ）アミノ酸３４５〜３５９、例えば３４７〜３５０、特に３４９〜３５０のＨＩループ、
（ｖｉ）アミノ酸４２９〜４４５、例えば４２３〜４４０、特に、ＨＰＶ１６では４２３〜４２４、４３１〜４３３または４３７〜４３８、ＨＰＶ１８では４２４〜４２５、４３２〜４３３または４３９〜４４０のＣ末端アーム。
【００７０】
本明細書で開示されるいずれの実施形態においても、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドは、Ｌ１アミノ酸を除去することなく、Ｌ１配列に挿入することができる。あるいは、Ｌ２ペプチドは、挿入位置においてＬ１配列からの１以上のアミノ酸の除去を伴って、Ｌ１配列に挿入することもでき、例えば、Ｌ２ペプチドが挿入されている位置において、Ｌ１配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸が除去され得る。従って、Ｌ２ペプチドはＬ１配列中の１以上のアミノ酸を置換することができ、例えば、Ｌ２ペプチドは、そのＬ２ペプチド配列と等しい長さのＬ１配列に取って代わることができる。
【００７１】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに２以上のＬ２ペプチドが存在する場合、これらは同じＨＰＶ型に由来する異なるＬ２ペプチドであってもよいし、またはそれらは、異なるＨＰＶ型の対応する領域に由来し得る場合には、異なるＨＰＶ型に由来するペプチドであってもよい。
【００７２】
一実施形態では、Ｌ２ペプチドは、例えば、カプソマーまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）または小型の非ＶＬＰ様構造などのポリペプチド粒子において、キメラポリペプチドの超分子アセンブリのアセンブリを可能とする部位に挿入される。例えば、ＶＬＰ構造を維持するためには、Ｌ２ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドの、カプソマー間相互作用、従って、ＶＬＰコンフォメーションの維持に関与するジスルフィド架橋の形成に関与する部位に干渉しない部位に挿入される。このような超分子構造は、例えば、Ｓａｄｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ ２００３, Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０９, ３２−４０； Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ ｅｔ ａｌ, ２００７ Ｖａｃｃｉｎｅ ２５, ２００１‐２０１０, Ｖａｒｓａｎｉ ｅｔ ａｌ ２００３, Ｊ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７, ８３８６‐８３９３, Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０００, Ｄｅｓｃｈｕｙｔｅｎｅｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０１０, Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６：５, ４０７‐４１９により記載されているように、電子顕微鏡によって評価することができる。一般に、キメラＶＬＰは、天然ＶＬＰに比べて同等または同一のサイズであり、すなわち、ＶＬＰは、Ｌ１タンパク質は全長または末端切断型であるが、Ｌ２ペプチドを含まない。キメラＶＬＰは、直径５０ｎｍの範囲であり得る。別の実施形態では、直径２０〜３５ｎｍ（２０−３５ｎｍｉｎ ｏｌｉａｍｅｔｅｒ）の間の小型の非ＶＬＰ構造が形成される。
【００７３】
Ｌ２ペプチドが挿入される部位は、コンフォメーション依存性の中和エピトープの存在を維持させ得る。中和エピトープは、ＨＰＶ１６の場合には、Ｖ５、Ｈ１６．Ｅ７０およびＵ４（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ ２００１, Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ２００３, ２００６， Ｄａｙ ｅｔ ａｌ., ２００７）、そしてＨＰＶ１６の場合にはＪ４（Ｃｏｍｂｉｔａ ｅｔ ａｌ ２００２）などのモノクローナル抗体を使用することにより検出することができる。他の中和エピトープも当技術分野で公知であり、それらの有無も同様にモノクローナル抗体を用いて確認することができる。
【００７４】
しかしながら、例えば特に、本明細書に記載される、非キメラＬ１ ＶＬＰも含む組成物では、Ｌ１ポリペプチド上に全てのＬ１中和エピトープが存在する必要はない。Ｌ２ペプチドの挿入に好適な部位は、例えば表１に示されている部位など、特にＶＬＰとして提供される場合には、Ｌ１ポリペプチドの表面にＬ２ペプチドを露出している。
【００７５】
表１および２はＨＰＶ Ｌ１露出領域（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ２００３, Ｂｉｓｈｏｐ ｅｔ ａｌ ２００７, Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０００）を示すが、この領域は、Ｌ２ペプチドに好適な挿入部位と、それらの領域内に超可変領域を提供することができる。好適には、Ｌ２ペプチドは、Ｃ末端侵入アームか、またはＤＥループもしくはＦＧループもしくはＨＩループに挿入される。好適には、Ｌ２ペプチドは、ループまたはＣ末端アームの超可変領域に挿入される。表１に示される領域はＨＰＶ１６に関するものであり、他のＨＰＶ型のＬ１でも同様の領域が定義され、表２にはＨＰＶ１８ Ｌ２に関して定義されている。
【表１】
【表２】
【００７６】
本明細書に記載のキメラＬ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰでは、Ｌ２ペプチドを、Ｖ５モノクローナル抗体によって認識されるＨＰＶ１６のエピトープなどの免疫優性エピトープ中に、またはその領域内に挿入することが有利であり得る。この結果、その免疫優性を失った免疫優性エピトープが得られ、別のＬ１エピトープが免疫優性となり、これによってより良い交差防護が生じ得る。例えば、ＦＧループの、Ｖ５抗体によって認識されるエピトープ領域に挿入されたＬ２ペプチドはその免疫優性を失ったエピトープを生じさせ、次に主要なエピトープが免疫優性となり得る。
【００７７】
２以上のＬ２ペプチドが、本明細書に記載組成物中の別個のポリペプチド（またはカプソマーまたはＶＬＰ）に存在する場合には、それらのＬ２ペプチドは異なるＨＰＶ型に由来するＬ１にあってもよいし、または同じＨＰＶ型に由来するＬ１にあってもよい。
【００７８】
１つのポリペプチド（またはカプソマーまたはＶＬＰ）に２以上のＬ２ペプチドを含む一実施形態では、それらのＬ２ペプチドはＬ１配列内の同じ部位に挿入することもできるし、異なる部位に挿入することもできる。Ｌ２ペプチドが同じ部位に挿入される場合、同じループであってもよく、同じループの同じ超可変領域であってもよい。これらのＬ２ペプチド間に短いアミノ酸ストレッチを持つのが有利であり、Ｌ２ペプチド間に例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸を持つ。
【００７９】
これらのＬ２ペプチドは、少なくとも１つの抗原性エピトープを含むように選択される。選択されたエピトープ（Ｌ１ポリペプチドに組み込まれている場合）は一般に、その選択されたエピトープ内に存在するアミノ酸を含むＬ２ポリペプチドなどの少なくとも１つの天然Ｌ２ポリペプチドに対して免疫応答を惹起することができる。好都合には、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、少なくとも１つの付加的天然Ｌ２タンパク質に対して免疫応答を惹起することができる。
【００８０】
本明細書に記載のように使用するためのＬ２ペプチドは以下のペプチド：
Ｌ２のアミノ酸残基１７〜３６を含むペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基５６〜７５を含むペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基９６〜１１５を含むペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基１０８〜１２０を含むペプチド
から選択することができる。
【００８１】
例えば、本明細書に記載のように使用するためのＬ２ペプチドは以下のペプチド：
Ｌ２のアミノ酸残基１７〜３６からなるペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基５６〜７５からなるペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基９６〜１１５からなるペプチド、
Ｌ２のアミノ酸残基１０８〜１２０からなるペプチド
から選択することができる。
【００８２】
図３は、ＨＰＶ Ｌ２配列を、ＨＰＶ１６ Ｌ２ペプチドの１７〜３６番、５６〜７５番、９６〜１１５番および１０８〜１２０番のＬ２アミノ酸配列に関して、また、他の種々のＨＰＶ型の対応する領域に由来するＬ２ペプチドに関して示す。他の既知のＨＰＶ型に関して文献で得られる配列も、参照配列としてのＨＰＶ１６ Ｌ２配列に従い、さらなるＨＰＶ型由来の対応するＬ２ペプチドを設計するために使用可能である（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ （Ｂｏｅｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ., ２００３）またはＧｅｎｂａｎｋ （Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ., ２００８）参照）。
【００８３】
本明細書を通じて、ＨＰＶ１６のＬ２配列は、Ｌ２配列が由来する領域を決定するための参照配列として用いられる。符番はＮ末端のアミノ酸１から始める。なお、本明細書に示されるいずれの配列でも、左手がＮ末端であり、右手がＣ末端である。以下の特定のペプチドのリストでは、他のＨＰＶ型に由来するある特定の同じペプチドに対して実際の番号も示されている。
【００８４】
好適には、Ｌ２ペプチドは、所望により本明細書に記載のように改変されたＬ２ ５６〜７５ペプチド、例えば、配列番号８〜１５または配列番号２９を含む、またはそれからなる。Ｌ２ ５６〜７５ペプチドは、ＨＰＶ型間で実質的な配列同一性、すなわち、相同性を示す。
【００８５】
本開示によるＬ２ペプチドは、配列番号１〜３１で表される１以上の、または２以上の配列を含む、またはそれからなる。
【００８６】
Ｌ２ペプチドは、アミノ酸１７〜３６の間のアミノ酸（例えば、２０マー）のセグメント、例えば、
16型: 17-QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV-36 [配列番号1]
52型: 16-QLYQTCKASGTCPPDVIPKV-35 [配列番号2]
51型: 16-QLYSTCKAAGTCPPDVVNKV-35 [配列番号3]
6型: 16-QLYQTCKLTGTCPPDVIPKV-35 [配列番号4]
11型: 15-QLYQTCKATGTCPPDVIPKV-34 [配列番号5]
31型: 17-QLYQTCKAAGTCPSDVIPKI-36 [配列番号6]
45型: 16-DLYRTCKQSGTCPPDVINKV-35 [配列番号7]
5型: 17-HIYQTCKQAGTCPPDVINKV-36 [配列番号33]
56型: 17-QLYKTCKLSGTCPEDVVNKI-36 [配列番号34]
から選択することができる。
【００８７】
Ｌ２ペプチドはまた、アミノ酸５６〜７５の間のアミノ酸（例えば、２０マー）のセグメント、例えば、
16型: 56-GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL-75 [配列番号8]
6型: 55-GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL-74 [配列番号9]
31型: 56-GGLGIGSGSGTGGRTGYVPL-75 [配列番号10]
33型: 55-GGLGIGTGSGSGGRTGYVPI-74 [配列番号11]
45型: 55-GGLGIGTGSGSGGRTGYVPL-74 [配列番号12]
11型: 55-GGLGIGTGAGSGGRAGYIPL-74 [配列番号13]
35型: 56-GGLGIGSGSGTGGRSGYVPL-75 [配列番号14]
52型: 55-GGLGIGTGAGSGGRAGYVPL-74 [配列番号15]
5型: 56-GGLGIGTGSGTGGRTGYVPL-75 [配列番号35]
から選択することができる。
【００８８】
Ｌ２ペプチドはまた２０アミノ酸よりも短くてもよく、例えば、Ｌ２ペプチドは、８アミノ酸以上、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸または３０アミノ酸まで（または８〜３０の間の整数のアミノ酸）のいずれかのアミノ酸数であり得る。例えば、Ｌ２ペプチドは、アミノ酸５６〜７５の８アミノ酸のセグメント、例えば以下の例の８マーであり得る。
【００８９】
16型: 56-GGLGIGTG-63 [配列番号29]
Ｌ２ペプチドはまた、アミノ酸９６〜１１５の間のアミノ酸（例えば、２０マー）のセグメント、例えば、
6型: 95-EPVAPSDPSIVSLIEESAII-114 [配列番号16]
52型: 95-EPIGPLEPSIVSMIEETTFI-114 [配列番号17]
31型: 96-DPVGPLDPSIVSLVEESGIV-115 [配列番号18]
16型: 96-DPVGPSDPSIVSLVEETSFI-115 [配列番号19]
58型: 95-DTVGPLDSSIVSLIEESSFI-114 [配列番号20]
45型: 94-EPVGPTDPSIVTLVEDSSVV-113 [配列番号21]
から選択することもできる。
【００９０】
Ｌ２ペプチドはまた、アミノ酸１０８〜１２０の間のアミノ酸（例えば、１３マー）のセグメント、例えば、
16型: 108-LVEETSFIDAGAP-120 [配列番号22]
18型: 106-LIEDSSVVTSGAP-118 [配列番号23]
から選択することもできる。
【００９１】
上記のペプチドはいずれも、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失または置換によって、例えば、１、２または数個のアミノ酸の付加、欠失または置換によって改変することができる。例えば、Ｌ２ペプチド１７〜３６では、２つのシステイン間の領域（２２〜２８）および一方または双方のシステインを欠失させることができる。この改変は、ＨＰＶ１６ペプチドに関して示されている（配列番号２４および２５）。別の例では、ＨＰＶ５１型ペプチド１７〜３６のＣ末端から４アミノ酸に位置する（すなわち、３２番の）バリン（Ｖ）を、上記に示される他の全てのＨＰＶ型においてこの位置に見られるアミノ酸であるイソロイシン（Ｉ）で置換することができる。
【００９２】
別の例では、５６〜７５のＬ２ペプチドは、そのＣ末端に領域ＧＧＬＧＩ（配列番号３２）が維持される限り（この領域はＨＰＶ型間の交差活性に重要であることが示されているため（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ., ２００７））、サイズを縮小することができる（例えば、配列番号２９の場合）。従って、本明細書に記載のＬ２ペプチドは配列ＧＧＧＬＧＩを含み得る。
【００９３】
所望により、グリシン残基などの１以上のアミノ酸のスペーサーもまた、Ｌ２ペプチドのＮ末端またはＣ末端に含めることができる。例えば、これらのペプチドは、１または２または３個の付加的スペーサーアミノ酸、例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端に（または２以上のＬ２ペプチドが存在する場合には、連結されるペプチドの間に）付加される１または２または３個のアミノ酸残基をさらに含むことができる。一般に、スペーサーは、免疫原性ペプチドとＬ１配列を連結させること、またはいくらかの最小距離もしくはそれらの間の他の空間的関係を設けること以外の特定の生物活性を持たない。スペーサーは、ＶＬＰの適切なコンフォメーションの保持および／またはスペーサーが存在しない時に比べて、挿入されたＬ２ペプチドの効果的もしくは改良された提示を保持するのに必要であるかまたは役立ち得る。
【００９４】
上記のペプチドはいずれも、例えば、１以上のアミノ酸の挿入（付加）、欠失または置換によって改変することができる。例えば、Ｌ２ペプチドは、天然（すなわち、天然に存在する）ＨＰＶ Ｌ２配列のＬ２配列とは異なるアミノ酸を組み込むことができる。例えば、これらのペプチドは、例えば、２つのシステイン間のジスルフィド結合および／またはこれらのシステイン間の領域の存在を除去するために、天然配列に比べて、その配列内に１または２つのアミノ酸挿入もしくは置換、または１もしくは２もしくは数個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８もしくは１０個までのアミノ酸の欠失を有することができる。特定の例では、本開示のＬ２ペプチドに存在するものとしては、天然Ｌ２配列に対して、１または２つのアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換、および／または２つのシステイン残基の間の１０個までの連続するアミノ酸の欠失に限定される。
【００９５】
本明細書に記載のペプチドにおいてＬ２配列に対する改変が行われる場合、このような改変は、そのペプチドの実質的な割合または少なくとも５０％または少なくとも７０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％のアミノ酸が天然Ｌ２配列のアミノ酸に相当するように限定され得る。
【００９６】
その代わりに、またはそれに加えて、任意の特定のＬ２ペプチドは、本明細書に記載されるように２または３またはそれを超えるＬ２ペプチドのキメラであり得る。Ｌ２配列に対するこれらの改変のいずれの場合でも、Ｌ２配列の免疫原性特性は維持される。すなわち、所望の免疫応答を惹起する、そのペプチド内のＬ２の一エピトープまたは複数のエピトープは維持される。これらの改変の目的は、Ｌ２ペプチドの特性を改良すること、例えば、他のＨＰＶ型由来のＬ２との交差反応を改良することであり得る。
【００９７】
従って、Ｌ２ペプチドは、以下のペプチド：
（ａ）１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含むＬ２のアミノ酸残基１７〜３６に相当するペプチド、
（ｂ）１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含むＬ２のアミノ酸残基５６〜７５に相当するペプチド、
（ｃ）１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含むＬ２のアミノ酸残基９６〜１１５に相当するペプチド、
（ｄ）１以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含むＬ２のアミノ酸残基１０８〜１２０に相当するペプチド、
（ここで、１以上の挿入、欠失および／または置換とは、天然Ｌ２ポリペプチドに比べてのものである）
から選択することができる。
【００９８】
以下は改変を伴うＬ２ペプチドの例である。
【００９９】
16型: 17-QLYKTCPPDIIPKV-36 [配列番号24]
（２つのシステイン間に可変領域（２３〜２８）が無く、かつ、１つのシステインが欠失）
16型: 17-QLYKTCPPDVIPKV-36 [配列番号25]
（２つのシステイン間に可変領域が無く、１つのシステインが欠失し、かつ、３２番においてＩｌｅがＶａｌに置換されている（Ｉ３２Ｖ））
16型: 17-QLYKTCKQAGTCPPDVIPKV-36 [配列番号26]
（Ｉ３２Ｖを含む）
51型: 16-QLYSTCKAAGTCPPDVINKV-35 [配列番号27]
（Ｖ３３Ｉを含む）
45型: 16-DLYRTCKQSGTCPPDVIPKV-35 [配列番号28]
（Ｎ３４Ｐを含む）
【０１００】
Ｌ２ペプチドはまた、２つの異なるアミノ酸セグメント、例えば、アミノ酸１７〜３６とアミノ酸５６〜７（２０マー）例えば、
16型: 17-QLYKTPPDIIPKVGGLGIGTG-63 [配列番号30]
16型: 17-QLYKTPPDVIPKVGGLGIGTG-63 [配列番号31]
（Ｉ３２Ｖを含む）
から選択されるコンカテマーであり得る。
【０１０１】
配列番号３０および３１で表される２つのペプチドは、２つの上記ペプチドのキメラであって、両システインを欠き、システイン間の領域（２２〜２８）を欠いたペプチド１７〜３６の領域を、５６〜７５ペプチドの領域５６〜６３（ＨＰＶ間で保存されている）とともに含む。他のＨＰＶ型からも同様のペプチドを構築することができる。
【０１０２】
上記に挙げたペプチドはいずれも、本明細書に記載のＨＰＶ Ｌ１、ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰにおける、本明細書に記載のＬ１配列中のいずれの部位に含めることもできることが明らかである。
【０１０３】
本開示による組成物に複数のＬ２ペプチドが存在する場合には、これらは同じＨＰＶ型に由来する２以上の異なるＬ２ペプチド、すなわち、Ｌ２の異なる領域に由来するペプチド（オーバーラッピングを含む）であってもよいし、あるいは、異なるＨＰＶ型の同じ領域、例えば、１７〜３６領域に由来する２以上の異なるＬ２ペプチドであってもよい。３以上のＬ２ペプチドが存在する場合、これは、同じＨＰＶ型に由来する複数のペプチドと異なるＨＰＶ型に由来する複数のペプチドの双方を含み得る。
【０１０４】
本開示による組成物に２以上の異なるＬ２ペプチドが存在する場合、各ペプチドは異なるＨＰＶ型に由来するＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ、例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰに存在してもよいし、あるいはそれらは同じＨＰＶ型に由来するＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ、例えば、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰに存在してもよい。好適には、本明細書に記載のＬ２ペプチドは、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８に由来するＨＰＶ ＶＬＰに存在する。
【０１０５】
好適には、本明細書で開示される任意の実施形態において、Ｌ２ペプチドは、Ｌ２タンパク質に由来する少なくとも８個の連続するアミノ酸残基を含む。本明細書で開示される任意の実施形態において、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は、３０アミノ酸残基までの長さであり得る。
【０１０６】
本明細書で開示される任意の実施形態において、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２のＮ末端のアミノ酸１〜２００、特にＨＰＶ Ｌ２のアミノ酸１〜１５０から選択することができる。従って、これらのＬ２ペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２の領域１〜２００または１〜１５０に由来する８以上のアミノ酸残基を含んでもよく、領域１〜２００または１〜１５０に由来する８以上の連続するアミノ酸残基であり得る。
【０１０７】
本明細書において「Ｌ２ペプチドが少なくとも８個のアミノ酸残基を含み得る」とは、Ｌ２に由来する任意の８以上のアミノ酸のペプチドを表すが、ペプチドは好適には少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０またはそれを超えるアミノ酸長である。一実施形態では、本開示のＬ２ペプチドは、１００アミノ酸未満、好適には５０アミノ酸未満、または４０アミノ酸未満の短いペプチドである。例えば、これらのペプチドは、３０アミノ酸までの長さ、または２０もしくは２１アミノ酸までの長さであり得る。全長Ｌ２タンパク質は、本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに関するＬ２のペプチドであるとはみなされない。
【０１０８】
本開示のＬ２ペプチドに関する最小必要条件は、天然Ｌ２タンパク質に対して免疫応答を誘導することができるペプチドである。従って、Ｌ２ペプチドは一般に、Ｌ２ポリペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、かつ、少なくとも１つのエピトープを含む。本開示による組成物中の１以上の異なるＬ２ペプチドは、２５アミノ酸までまたは３０アミノ酸までまたは４０アミノ酸までの長さであり得る。一実施形態では、本開示による組成物に用いられる異なるＬ２ペプチドは全て、２５アミノ酸までまたは３０アミノ酸までまたは４０アミノ酸までの長さであり得る。
【０１０９】
本開示によるＬ２ペプチドは好適には、相同なＨＰＶ感染に対して、すなわち、その配列が起源するＨＰＶ型による感染に対して免疫応答を惹起することができる。
【０１１０】
好適には、Ｌ２ペプチドは、少なくとも２つの異なるＨＰＶ型に対して免疫応答を誘導することができる。ＨＰＶは、核酸の類似性に基づく型によって分類される。多くのＨＰＶ型が文献に記載されている。従って、本開示においては、Ｌ２ペプチドは、明示されたＨＰＶ型、例えば、ＨＰＶ１８型（または言及されている他の任意のＨＰＶ型）などの特に言及されているＨＰＶ型に対して免疫応答を惹起することができる。さらに、本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに関して示されているようなＬ２ペプチドは、言及されているＨＰＶ型以外のＨＰＶ型に対しても免疫応答を惹起することができる。分かりやすいように、言及されているＨＰＶ型以外のＨＰＶ型は「非ＨＰＶ型」と呼び、例えば、言及されているＨＰＶ型がＨＰＶ１８である場合、ＨＰＶ１８以外のいずれの型も、非ＨＰＶ１８型ペプチド（またはポリペプチドもしくはウイルス）と呼ぶことができる。同様に、言及されている任意のＨＰＶ型に関しても、言及されているＨＰＶ型以外の型は非ＨＰＶ型と呼ぶことができる。
【０１１１】
例えば、Ｌ２ペプチドは、異なるＨＰＶ型に由来する１以上のさらなるＬ２タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる。本明細書で開示される任意の実施形態において、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は、別のＨＰＶ型に対して交差反応、交差中和および／または交差防護応答を誘導することができる。好適には、ＨＰＶ型間で高レベルの、すなわち、２つ（またはそれを超える）型の間で８０％を超える配列同一性（「相同性」）を示すＬ２ペプチドが選択される。いくつかの場合では、Ｌ２ペプチドは、型間で８５％を超える配列同一性、または型間で９０％を超える配列同一性、または型間で９５％を超える配列同一性を有する。特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、少なくとも２つのＨＰＶ型間で１００％の配列同一性を有するように選択される。このようなＬ２ペプチドは、本明細書では、Ｌ２「コンセンサス」配列と呼ぶことができる。
【０１１２】
例えば、特定の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ３３型とＨＰＶ１１型の間で同一の（すなわち、１００％の配列同一性を有する）コンセンサス配列である。例えば、特定の例示的実施形態では、このコンセンサス配列は、Ｌ２のアミノ酸１７〜３６間で同一である。別の実施形態では、Ｌ２ペプチドは、ＨＰＶ５８型とＨＰＶ６型の間で同一のコンセンサス配列である。例えば、特定の例示的実施形態では、コンセンサス配列は、ＨＰＶ５８型とＨＰＶ６型のアミノ酸５６〜７５の間で同一である。
【０１１３】
さらなるＨＰＶ型に対して免疫応答を惹起することができる交差反応性Ｌ２ペプチドは、本開示に従って特定することができる。本明細書に示されているように、異なるＨＰＶ型に由来するＬ２配列をアラインして、ＨＰＶ型間で高い類似性を有する領域を特定することができる（図３および本明細書に示されている他の配列を参照）。このようなアライメントを行い、配列相同性が存在する場所を特定するために多くの配列プログラムが利用可能である。これにより、着目するＨＰＶ型間で最も類似性の高い、従って、おそらくそれらのＨＰＶ型のいくつかまたは全ての間で交差反応性のあるＬ２ペプチドを選択することが可能となる。
【０１１４】
本開示のＬ２ペプチドは、任意の好適な免疫原性Ｌ２ペプチドであり得る。Ｌ２ペプチドは、当技術分野で周知の標準技術によって免疫原性および交差反応性に関して試験することができる。例えば、これらのペプチド、またはこれらのペプチドを含むキメラＬ１ポリペプチド、カプソマーもしくはＶＬＰをモデル動物またはヒトに注射することができ、抗体および／または細胞性免疫応答の測定を、例えば、ＥＬＩＳＡまたはサイトカイン分析／個々の測定によって行うことができる。抗体をスクリーニングするための方法は当技術分野で周知である。ＥＬＩＳＡは、抗体の交差反応性を評価するために使用することができる。抗体の中和および交差中和特性は、例えばシュードウイルス中和アッセイを用いて試験することができる。好適なシュードウイルス中和アッセイはＤｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ ２００８およびＰａｓｔｒａｎａ ｅｔ ａｌ ２００４に記載されている。
【０１１５】
さらに、いくつかの交差反応性Ｌ２ペプチドがすでに同定されている。例えば、ＨＰＶ ６および１６の共通中和エピトープは、ＨＰＶ１６ Ｌ２の領域（ａａ）１０８〜１２０に見出されている（Ｋａｗａｎａ ｅｔ ａｌ １９９８, １９９９, ２００１）。別の例では、ウサギをＨＰＶ１６由来の（ａａ）１７〜３６、５６〜７５、９６〜１１５ Ｌ２ペプチドで免疫することで、交差中和抗体を生じさせることができた（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ ２００７, ２００８）。別の例では、ＨＰＶ１６由来のＬ２の（ａａ）１７〜３６が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける受動免疫および抗原投与の後に、防護的かつ広範な交差中和エピトープとして同定された（Ｇａｍｂｈｉｒａ ｅｔ ａｌ ２００７）。同様の防護が、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて、Ａｌｐｈｓ ｅｔ ａｌ ２００８によって、ＨＰＶ１６由来のＬ２のａａ１７〜３６を含む合成リポペプチドワクチンのよるワクチン接種の後に示された。
【０１１６】
好適には、Ｌ２ペプチドまたはペプチド群は交差反応性ペプチドであり、従って、それらはＬ２ペプチドが由来するＨＰＶ遺伝子型のＬ２だけでなく、それが由来するもの以外のＨＰＶ遺伝子型に由来するＬ２タンパク質またはＬ２ペプチドも認識する免疫応答を惹起することができる。好適には、このペプチドは、１または２またはそれを超える他の遺伝子型、好適には、ＨＰＶ型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８もしくは７３などの子宮頸癌、またはＨＰＶ６もしくは１１などの性器疣贅、またはＨＰＶ５、８または３８などの皮膚癌の原因に関連する遺伝子型と交差反応する。
【０１１７】
一実施形態では、１以上のＬ２ペプチドがＨＰＶ１６型またはその改変型から選択され、ＨＰＶ１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８もしくは７３から選択される型などの他の癌を引き起こす少なくとも１つのＨＰＶ型、および／またはＨＰＶ６または１１などの性器疣贅を引き起こす少なくとも１つのＨＰＶ型、および／またはＨＰＶ５、８もしくは３８などの皮膚癌を引き起こす少なくとも１つのＨＰＶ型に対して交差反応性がある。別の実施形態では、１以上のＬ２ペプチドが、ＨＰＶ１８型またはその改変型から選択される。
【０１１８】
好適には、本発明で用いられるＬ２ペプチドは、交差中和免疫応答、すなわち、Ｌ２ペプチドが由来するＨＰＶ型とは異なるＨＰＶ型のＨＰＶを中和することができる免疫応答を生じることができる。交差中和は、本明細書の実施例３で記載されるシュード中和アッセイなどの当技術分野で公知のアッセイによって試験することができる。
【０１１９】
好適には、Ｌ２ペプチドは交差防護(防御)を提供することができ、好適には、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８もしくは７３から選択される子宮頸癌に関連する１以上のＨＰＶ型、および／またはＨＰＶ６もしくは１１などの性器疣贅を引き起こす少なくとも１つのＨＰＶ型、および／またはＨＰＶ５、８もしくは３８などの皮膚癌を引き起こす少なくとも１つＨＰＶ型に対する交差中和エピトープを含む。
【０１２０】
交差防護は好適には、Ｌ２ペプチドが少なくとも２つのＨＰＶ型によって引き起こされる感染／疾患に対して防護免疫応答を生じ得る場合に起こる。例えば、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに関して提供される場合、Ｌ２は、そのＬ２ペプチドが得られた型と少なくとも１つの付加的なＨＰＶ型から防護する応答を誘導することができる。上述のように、交差防護はまた、コンセンサスＬ２ペプチドが選択され、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに関して提供される場合にも生じ得る。Ｌ２ペプチドまたはＬ１ ＶＬＰが由来するものとは異なる種々のＨＰＶ型に対する交差防護は、動物モデル、例えば、Ａｌｐｈｓ ｅｔ ａｌ ２００８に記載されているようなマウスモデルを用いて確認することができる。
【０１２１】
交差防護は、一群のＨＰＶ型の感染および／または疾患の罹患率（感染は偶発的感染または持続的感染である）を、所与のＬ２ペプチドを接種された個体と非接種群で比較することによって評価することができる。ある型または一群の型に対する完全な交差防護は本開示によれば必ずしも必要ではなく、実際には、いずれのレベルの交差防護も利益をもたらす。好適には、見られる交差防護のレベルは、匹敵する非接種群に比べ、接種群が非ワクチンＨＰＶ型または型群に伴う感染および／または疾患の５％未満、より好適には最大１０％、最大１５％、最大２０％、最大２５％、最大３０％、最大３５％、最大４０％、最大４５％、最大５０％、最大５５％、最大６０％、最大６５％、最大７０％、最大８０％、最大９０％またはさらには最大１００％未満の感染および／または疾患を有するようなものである。
【０１２２】
交差防護は、ワクチン群および対照群において種々のＨＰＶ型に特異的な核酸の存在を検出することによって評価することができる。検出は、例えば、ＷＯ０３／０１４４０２（ＵＳ２００７０３１８２８Ａ１）およびその中の参照文献に記載のような技術を用いて、特に、ＨＰＶ ＤＮＡの非特異的増幅とその後のＤＮＡ型の検出については、ＷＯ９９／１４３７７（ＵＳ６４８２５８８Ｂ１）およびＫｌｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ, （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９）, ３７ （８）： ２５０８‐２５１７）に記載のようなＬｉＰＡ系を用いて行うことができる（これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。しかしながら、サンプル中のＨＰＶ ＤＮＡの検出には、着目する各ＨＰＶ型に特異的なプライマーを用いる型特異的ＰＣＲなどの任意の好適な方法を使用できる。好適なプライマーは当業者に公知であるか、または種々のＨＰＶ型の配列が既知であることから、容易に構築することができる。
【０１２３】
交差防護は、雄集団および／または雌集団に見られるのが好適であり、ＨＰＶ感染に関して血清反応陰性の、またはＨＰＶ１６および１８に関して血清反応陰性の女性、好適には、性活動前の青年期女性に見られるのが好適である。
【０１２４】
交差防護（ワクチン接種群と対照群に見られる防護により評価される）は、高リスク癌型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８もしくは７３の群のいずれか１つなどの癌原性型、またはひとまとめに、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４などの高リスク癌型群または実際にはこれらの高リスク癌型の全てに対して見られるのが好適である。これらの高リスク癌型の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４の考えられるあらゆる組合せが具体的に意図される。
【０１２５】
Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸
本開示のもう１つの特徴は、上述のキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子である。
【０１２６】
このような核酸は、天然には存在しない配列を有するか、またはそうでなければ２つの別個の配列セグメントの、人工的組合せによって作出された配列を有する「組換え」核酸であり得る。例えば、組換えキメラＬ１／Ｌ２核酸は、ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド（またはその断片）をコードする少なくとも１つの（多くの場合では少なくとも２つの）核酸セグメントと機能的に連結された、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。この人工的組合せは、化学合成によって、またはより一般には、例えば遺伝子工学技術によるなど単離された核酸セグメントの人工的操作によって達成することができる。一貫性のため、「組換え」タンパク質は、組換え核酸によりコードされる（細菌または真核細胞などの宿主細胞に導入することができる）ものである。
【０１２７】
特定の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、選択された原核生物または真核生物宿主細胞での発現のためにコドンが至適化される。
【０１２８】
複製および発現を容易にするために、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸は、原核生物または真核生物発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞もまた本開示の特徴である。好適な宿主細胞としては、原核生物（すなわち、細菌）宿主細胞、例えば大腸菌、ならびに真菌（例えば、酵母）細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＶＥＲＯおよびＨＥＫ２９３細胞など）を含む多くの真核生物宿主細胞が挙げられる。
【０１２９】
複製および発現を容易にするために、これらの核酸は、原核生物または真核生物発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。本明細書で開示される核酸は様々なベクター（例えば、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡの組合せから得られるベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびその他多数などのウイルスＤＮＡを含む）のいずれか１つに含めることができるが、最も一般には、ベクターはポリペプチド発現産物を生成するのに好適な発現ベクターである。発現ベクターでは、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸は一般に、ｍＲＮＡの合成を指令するよう、適当な転写制御配列（プロモーター、および所望により１以上のエンハンサー）に近接して、適当な配向で配置される。すなわち、着目するポリヌクレオチド配列は、適当な転写制御配列に機能的に連結される。このようなプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーターの前初期プロモーター、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージＴ７およびλＰＬプロモーター、および原核生物または真核細胞またはそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは一般に、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含む。ベクターは所望により、発現を増幅するのに適当な配列を含む。さらに、発現ベクターは所望により、真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性など、または大腸菌ではカナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性などの、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供する１以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【０１３０】
発現ベクターはまた、例えば翻訳効率を向上させるために付加的な発現エレメントを含むことができる。これらのシグナルは、例えば、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得る。いくつかの場合では、例えば、翻訳開始コドンおよび関連の配列エレメントが、着目するポリヌクレオチド配列と同時に適当な発現ベクターに挿入される（例えば、天然開始コドン）。このような場合には、付加的な翻訳制御シグナルは必要でない。しかしながら、ポリペプチドコード配列またはその一部だけが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸の翻訳のために提供される。開始コドンは、着目するポリヌクレオチド配列の翻訳を確保するように適切なリーディングフレームに配置する。外因性の転写エレメントおよび開始コドンは、天然および合成双方の様々な起源のものであってよい。所望により、用いる細胞系に適当なエンハンサーを包含することによって、発現効率をさらに高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ ｅｔ ａｌ. （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０：１２５‐６２； Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ. （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６‐５４４）。
【０１３１】
いくつかの例では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸（ベクターなど）は、宿主細胞に導入された際にコードされているポリペプチドの発現を増強および／または至適化するように選択された１以上の付加的配列エレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸は、ヒトヘルペスウイルス５イントロン配列（例えば、配列番号１３参照）などのイントロン配列を含む。イントロンは、組換え構築物に適宜配置された場合に同種および異種の核酸の発現を増強することが報告により示されている。
【０１３２】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする組換え核酸を介するものの、当業者に指針を与えるに十分な例示的手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ２ｄ ｅｄ., Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, １９８９； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ.， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, ３ｄ ｅｄ., Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ, ２００１； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ., Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ, １９９２ （ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００３）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ., Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ４ｔｈ ｅｄ., Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, １９９９に見出すことができる。
【０１３３】
種々のＨＰＶ型に由来するＨＰＶ Ｌ１およびＬ２ポリペプチドをコードする例示的核酸配列が当技術分野で周知であり、例えば、多くの例が文献に記載され、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで公的に入手可能である。これらは、当業者であれば、ヒトパピローマウイルス（またはＨＰＶ）および着目する特定のタンパク質（例えば、Ｌ１またはＬ２）および型という語を用いた適当なクエリーによって容易に確認することができる。これらのＬ１およびＬ２核酸は、上記で開示される組換えキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を生産するために利用可能である。
【０１３４】
例示的Ｌ１およびＬ２ポリペプチドと配列同一性を有するキメラＬ１／Ｌ２核酸変異体をコードするさらなる核酸も、当業者により生産可能である。一般に、これらの核酸変異体は、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドに（例えば、Ｌ１ポリペプチド部分に）存在するアミノ酸残基の１％、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％だけが異なるポリペプチドをコードする。すなわち、コードされるポリペプチドは、参照キメラポリペプチドと少なくとも８０％、または８５％、より一般には、少なくとも約９０％またはそれを超える、例えば９５％またはさらには９８％または９９％の配列同一性を有する。当業者であれば、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列はそれら自体、遺伝コードの縮重のために配列同一性を有することは、すぐに理解できるであろう。いくつかの例では、コードされているＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、それが由来する天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸改変を有する。このような変異は１以上のアミノ酸の付加、欠失または置換の結果であり得る。変異体は一般に、ヌクレオチド残基の約１％、または２％、または５％、または１０％、または１５％、または２０％だけが異なる。例えば、変異体キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸は、１、または２、または最大５、または最大約１０、または最大約１５、または最大約５０、または最大約１００のヌクレオチド変異（例えば、Ｌ１部分において、および／または上記のように改変Ｌ２ペプチドをコードするために）を含み得る。従って、本明細書で開示されるようなキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸に関しての変異体は一般に、天然に存在するＬ１およびＬ２成分からなる参照配列と少なくとも８０％、または８５％、より一般には、少なくとも約９０％またはそれを超える、例えば９５％、またはさらには９８％または９９％の配列同一性を有する。
【０１３５】
これまでに記載した変異体核酸の他、天然に存在するＬ１およびＬ２ポリペプチドに対応するＬ１およびＬ２配列を有するキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする１以上の核酸とハイブリダイズする核酸も、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするために使用可能である。当業者であれば、上記に述べた配列同一性％の指標の他、２つの核酸間の配列類似性のもう１つの指標がハイブリダイズ能であることが分かるであろう。２つの核酸の配列の類似性が高いほど、それらがハイブリダイズする条件のストリンジェンシーが高い。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは配列に依存し、環境パラメーターが異なれば異なる。従って、特にストリンジェンシー程度に影響するハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション方法の性質、ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さによって異なる。一般に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃〜２０℃低く選択する。Ｔｍは、５０％の標的配列が完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度である（所定のイオン強度およびｐＨ下）。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, ＮＹ, ２００１； Ｔｉｊｓｓｅｎ, Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｐａｒｔ Ｉ： Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ., ＮＹ, ＮＹ, １９９３.ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ. Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ４ｔｈ ｅｄ., Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｉｎｃ., １９９９に見出せる。
【０１３６】
本開示の目的では「ストリンジェント条件」は、ハイブリダイゼーション分子と標的配列の間の不一致が２５％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェント条件」は、より厳密な定義のための特定のストリンジェンシーレベルに分解することができる。従って、本明細書において「穏やかな（ｍｏｄｅｒａｔｅ）ストリンジェンシー」条件は、２５％を超える配列不一致を有する分子はハイブリダイズしない条件であり；「中ストリンジェンシー」条件は、１５％を超える不一致を有する分子はハイブリダイズしない条件であり；「高ストリンジェンシー」条件は、１０％を超える不一致を有する配列はハイブリダイズしない条件である。「極めて高いストリンジェンシー」条件は、６％を超える不一致を有する配列はハイブリダイズしない条件である。これに対して、「低ストリンジェンシー」条件下でハイブリダイズする核酸は、配列同一性が極めて低いか、または核酸の短い部分配列にしか配列同一性持たないものである。
【０１３７】
Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドの生産方法
本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、組換えタンパク質の発現および精製のための十分に確立された手順を用いて作製することができる。当業者に指針を与えるのに十分な手順は、次の参照文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, ＮＹ, ２００；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ. Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, ４ｔｈ ｅｄ., Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｉｎｃ., ９９９に見出せる。付加的および具体的な詳細を以下に示す。
【０１３８】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００またはＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）などの市販のリポソームトランスフェクション試薬を使用）、リン酸カルシウム沈殿法、感染、トランスフェクションなどの様々な周知の手順のいずれかによって宿主細胞に導入される。
【０１３９】
従って、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞も本開示の特徴である。好適な宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物（すなわち、細菌）宿主細胞、ならびに真菌（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母）細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞など）を含む多数の真核生物宿主細胞が挙げられる。キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする組換え核酸は、例えば、発現ベクターなどのベクターを介して宿主細胞に導入（例えば、形質導入、形質転換またはトランスフェクト）される。上記のように、ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ、バキュロウイルスなどであり得る。適当な発現宿主の例としては、大腸菌、放線菌（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞；サッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリスおよびアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などの真菌細胞；ウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などの昆虫細胞；３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫などの哺乳類細胞；藻類細胞を含む植物細胞が挙げられる。
【０１４０】
宿主細胞は、要すれば、プロモーターの活性化、形質転換体の選択または挿入されているポリヌクレオチド配列の増幅のために改変された従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は一般に、発現のために選択された宿主細胞とともにそれまで使用されていたものであり、当業者には自明であり、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （１９９４） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ, ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ, ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｗｉｌｅｙ− Ｌｉｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびその中に引用されている参照文献を含む、本明細書に引用されている参照文献でも明らかである。本発明の核酸に対応する発現産物はまた、植物、酵母、真菌、細菌などの非動物細胞においても生産可能である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ, Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌの他、細胞培養に関する詳細はＰａｙｎｅ ｅｔ ａｌ. （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｉｎｃ. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ＮＹ； Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ （ｅｄｓ） （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ, Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ； Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ, Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＡｔｌａｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｓ （ｅｄｓ） Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ （１９９３） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ, Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ, ＦＬに見出せる。
【０１４１】
細菌系では、発現生成物に意図される使用に応じて、いくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体の生産に大量のポリペプチドまたはその断片が必要とされる場合には、容易に精製されるキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの高レベル発現を指令するベクターを用いるのが好都合である。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、着目されるコード配列、例えば、本発明で上記されるポリヌクレオチドを、ベクター中の、アミノ末端翻訳開始メチオニンの配列およびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基とインフレームで連結して触媒的に活性なβガラクトシダーゼ融合タンパク質を生産することができるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３−５５０９）；アミノ末端メチオニンがヒスチジンタグとインフレームで連結されているｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ, Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）などの多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられる。
【０１４２】
同様に、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母では、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨなどの構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含むいくつかのベクターが、所望の発現産物の生産に使用可能である。総説としては、Ｂｅｒｇｅｒ, Ａｕｓｕｂｅｌ, ａｎｄ, ｅ.ｇ., Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ. （１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６‐５４４）を参照。哺乳類宿主細胞では、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｓ）およびウイルスの双方に基づく系を含むいくつかの発現系を使用することができる。
【０１４３】
宿主細胞は所望により、挿入されている配列の発現を調節する能力または発現されたタンパク質を所望の様式でプロセシングするその能力に関して選択してもよい。このようなタンパク質修飾としては、限定されるものではないが、グリコシル化（ならびに、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化）が挙げられる。３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの種々の宿主細胞が特定の細胞機構およびこのような翻訳後活性に特徴的なメカニズムを有し、導入された外来タンパク質の適切な修飾およびプロセシングを確保するように選択することができる。
【０１４４】
ある特定の例では、核酸は、例えば大腸菌細胞などの原核細胞での導入および発現に好適なベクターを介して細胞に導入される。発現ベクターは、好適な細菌宿主に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入される。多数の好適な大腸菌株が利用可能であり、当業者により選択可能である（例えば、ＲｏｓｅｔｔａおよびＢＬ２１（ＤＥ３）株は、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターの発現に好都合であることが分かっている）。
【０１４５】
より一般には、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、真核生物（例えば、昆虫または哺乳類細胞）における導入および発現に好適な発現ベクターに組み込む。このような核酸は、選択されたベクター／宿主細胞での発現のためにコドンが至適化されるのが好都合である。
【０１４６】
一例では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞へ導入する。昆虫細胞に感染可能な組換えバキュロウイルスは、市販のベクター、キットおよび／または系、例えば、ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅから得られるＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ系を用いて作出することができる。要するに、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をｐＡｃＳＧ２導入ベクターに挿入する。次に、宿主細胞ＳＦ９（ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））を、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の線状化されたゲノムＤＮＡを含むｐＡｃＳＧ２−キメラプラスミドおよびＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄで同時トランスフェクトする。トランスフェクション後、ｐＡＣＳＧ２プラスミドとバキュロウイルスゲノムの間で相同組換えが起こり、組換えウイルスが生じる。一例では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原が、ポリヘドリンプロモーターの調節制御下（ｐＨ）で発現される。ベーシック（Ｂａ）プロモーターおよびｐ１０プロモーターなどの他のプロモーターを用いて、同様の導入ベクターを作製することができる。同様に、Ｓｆ９と近縁のＳＦ２１、およびキャベツシャクトリムシＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞系統などの別の昆虫細胞を使用することもできる。
【０１４７】
本明細書で開示される組換えキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの長期高収量生産のためには、一般に安定な発現系を用いる。例えば、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを安定発現する細胞系統を、複製エレメントまたは内因性の発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞に導入する。ベクターの導入の後、細胞を富化培地で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在は導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖と回収を可能とする。例えば、結果として安定的に形質転換された細胞の群またはコロニーは、その細胞種に適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸で形質転換された宿主細胞は所望により、コードされているタンパク質の発現および細胞培養物からの回収に好適な条件下で培養すればよい。
【０１４８】
好適な宿主細胞系統に形質導入し、宿主細胞を適当な細胞密度まで増殖させた後、選択されたプロモーターを適当な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。
【０１４９】
次に、分泌されたポリペプチド産物を培養培地から回収および／または精製する。「精製」（例えば、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードする核酸に関して）とは、成分をその存在が望まれない組成物から取り出すプロセスを表す。精製は相対的な用語であって、望まない成分の全ての痕跡を組成物から除去する必要はない。タンパク質生産に関して、精製は、遠心分離、透析（ｄｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティー精製または沈殿などのプロセスを含む。「精製された」とは、絶対的に純粋である必要はなく、むしろ、相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製されたポリペプチド（またはカプソマーまたはＶＬＰ）調製物は、そのポリペプチドが、その生成環境、例えば、それが本来複製される細胞内もしくは細胞集団内、または人工環境下にある場合よりも富化されているものである。実質的に純粋なキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの調製物は、所望のキメラポリペプチドがその調製物の総タンパク質含量の少なくとも５０％を占めるように精製することができる。特定の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、調製物の総タンパク質含量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれを超える割合を占める。
【０１５０】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの生産および精製においては、細胞を遠心分離により採取し、物理的または化学的手段によって破砕し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持することができる。タンパク質の発現に用いた真核生物細胞または微生物細胞は、冷凍−解凍サイクル、音波処理、機械的破砕もしくは細胞溶解剤の使用または当業者に周知のその他の方法を含む任意の便宜な方法によって破砕することができる。
【０１５１】
次に、発現されたキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを、組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿法、酸抽出、濾過、限外濾過、遠心分離、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば本明細書に示されている任意のタグ付加系を使用）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかによって回収および精製することができる。所望により、成熟タンパク質の立体配置を完成させる際にタンパク質の再折りたたみ工程を用いることもできる。最後に、最終精製工程で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。上記に示した参照に加え、例えば、Ｓａｎｄａｎａ （１９９７） Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｉｎｃ.； ａｎｄ Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ. （１９９６） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ, ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ, ＮＹ； Ｗａｌｋｅｒ （１９９６） Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ, ＮＪ, Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ （１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ, Ｏｘｆｏｒｄ, Ｕ.Ｋ.； Ｓｃｏｐｅｓ （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ, ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ, ＮＹ； Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ, Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ, Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ, ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ （１９９８） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ, ＮＪに示されているものをはじめ、種々の精製方法が当技術分野で周知である。ＷＯ２０１０／０１２７８０（参照により本明細書に組み込まれる）は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＶＬＰの精製方法を記載している。類似の方法は、本明細書に記載されるキメラポリペプチドの精製にも適用可能である。従って、キメラポリペプチドは、宿主細胞から還元β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）バター中に抽出した後に陰イオンおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付し、その後、得られた産物を、ＢＭＥ除去により成熟させることができる。得られた産物は濾過除菌によって無菌とすることができる。
【０１５２】
免疫原性組成物および方法
本開示の別の態様は、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド（またはキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドから構成されるカプソマーもしくはＶＬＰ）を含む免疫原性組成物に関する。このような免疫原性組成物は、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを単独で、または例えば、付加的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドおよび／またはＶＬＰ（例えば、Ｌ１ ＶＬＰ）と組み合わせて含むことができる。
【０１５３】
特定の実施形態では、以上に記載され任意のキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドが免疫原性組成物の成分である。例えば、免疫原性組成物は、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチド（例えば、非ＨＰＶ１８型Ｌ２ペプチド）が挿入されているＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含むキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを含み得る。同様に、免疫原性組成物は、Ｌ２ポリペプチドのエピトープ（ｅｐｔｉｏｐｅ）を含む少なくとも１つのペプチドが（例えば、非ＨＰＶ１６型Ｌ２ペプチド）挿入されているＨＰＶ１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含むキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドを含み得る。特定の例では、このＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドに挿入されているＬ２ペプチドは、Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５（ＨＰＶ１６ Ｌ２とのアライメントに関して示される）を含む（例えば、それからなる）。免疫原性組成物に使用するためのその他の好適なキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドには、上記のものがいずれも含まれる。
【０１５４】
特定の実施形態では、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、免疫原性組成物中に、ＨＰＶ ＶＬＰとともに存在する。例えば、一実施形態では、免疫原性組成物は、
（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つのウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１またはその断片を含む少なくとも１つのキメラポリペプチド
を含む。
【０１５５】
一実施形態では、キメラポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドである。
【０１５６】
好都合な一実施形態では、少なくとも１つのＶＬＰが、ＨＰＶ１６ ＶＬＰ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む。別の実施形態では、少なくとも１つのＶＬＰが、ＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む。好都合には、このような組成物では、キメラポリペプチドは、カプソマーまたはウイルス様粒子または小型の非ＶＬＰ様構造などの超分子アセンブリに組み立てられる。
【０１５７】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）少なくとも１つのＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰと、（ｉｉ）それぞれＬ１配列中にＬ２ペプチドを含む、２つのキメラＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰ、ポリペプチドまたはカプソマーを含む。好都合な一実施形態では、この２つのキメラＬ１ポリペプチド（またはカプソマーもしくはＶＬＰ）は、同じＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８）に由来するＬ１ポリペプチド中に異なるＬ２ペプチドを含むことができる。あるいは、この２つのキメラＬ１ポリペプチド、カプソマーまたはＶＬＰは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８などの異なるＨＰＶ型に由来するＬ１ポリペプチド中に同じＬ２ペプチドを含むこともできる。なおさらなる実施形態では、この２つのキメラＬ１ポリペプチドまたはカプソマーまたはＶＬＰは、異なる２つのＨＰＶ型（ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８および／またはＨＰＶ３３とＨＰＶ５８など）に由来するＬ１ポリペプチド中に異なるＬ２ペプチドを含むこともできる。特定の実施形態では、これらのＬ２ペプチドはＨＰＶ３３またはＨＰＶ５８に由来してもよく、ＨＰＶ１８ Ｌ１に挿入することができる。このような実施形態では、異なるＬ２ペプチドを２つの異なるＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｔｐｉｄｅｓ）に１つずつ挿入することもできるし、あるいは同じＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドの同じまたは異なる部位に挿入することもできる。
【０１５８】
特定の実施形態では、本開示による組成物に含まれるＨＰＶ ＶＬＰ（特に、ＨＰＶ Ｌ１のみのＶＬＰ）およびキメラＶＬＰ、ポリペプチドまたはカプソマーは、ＨＰＶ６ ＶＬＰ、ＨＰＶ１１ ＶＬＰ、ＨＰＶ１６ ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰの１以上を含み得る。例えば、それらはＨＰＶ１６と１８、またはＨＰＶ６と１１、または４つのＨＰＶ型の全てのＶＬＰを含み得る。好適には、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰおよびキメラＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドはＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８に由来する。
【０１５９】
本明細書に記載のように使用するためのＨＰＶ ＶＬＰは、キメラまたは非キメラのいずれでも、Ｌ２からもまた組み立て可能であり、あるいはＬ１のみのＶＬＰであってもよい。例えば、ＶＬＰは、Ｌ１ポリペプチドとＬ２ポリペプチドの混合物から組み立て可能である（従って、Ｌ２ペプチドがＬ１配列に挿入されている、本明細書で開示されるキメラＬ１／Ｌ２ＶＬＰとは同じでない）。あるいは、ＶＬＰは、本明細書で開示されるＬ１／Ｌ２ポリペプチド以外のキメラＶＬＰであってもよい。例えば、このような非Ｌ１／Ｌ２ポリペプチドは、Ｌ１ポリペプチドと、Ｅ７などの、Ｌ１以外のＨＰＶポリペプチドの少なくとも１つの付加的配列を含み得る。
【０１６０】
本明細書で開示される、ＶＬＰ中のまたはキメラポリペプチドに由来するＨＰＶ Ｌ１は、全長ＨＰＶ Ｌ１タンパク質またはある種のＬ１誘導体、例えば断片のいずれかから、例えば、ＷＯ０３／０７７９４２（ＵＳ７４１６８４６）またはＷＯ９９／１３０５６（ＵＳ７３５１５３３）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているような、当技術分野で標準的な方法を用いて形成することができる。
【０１６１】
本明細書で開示される組成物の特定の実施形態では、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＶＬＰを含むか、またはそれらからなり、キメラＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰは、キメラＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰまたはキメラＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰまたはその双方を含むか、またはそれらからなる。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８双方のキメラＬ１ ＶＬＰが存在する場合には、それぞれの中のＬ２ペプチドは同じであっても異なってもよく、本明細書で開示されるいずれのＬ２ペプチドであってもよい。
【０１６２】
本明細書で開示される免疫原性組成物は一般に、少なくとも１つの薬学上許容される希釈剤または担体および所望によりアジュバントを含む。免疫原性組成物は、動物またはヒトに投与した際に免疫応答を生じさせる組成物であり、その免疫応答は、感染または疾患に対して必ずしも完全な防護性はないが、少なくとも感染または疾患の罹患率を低減する防護免疫応答であり得る。
【０１６３】
本明細書に記載のように使用するためのアジュバントは、アルミニウム塩を含み得る。また、３デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ ＭＰＬ）またはＱＳ２１などのＴｈ１型応答を刺激するアジュバントも好適である。好適には、アジュバントはアルミニウム塩であり、水酸化アルミニウムと３Ｄ ＭＰＬなどのように、３Ｄ ＭＰＬとの組合せが好適である。このようなアジュバントを含む本開示による組成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／２３１０５に記載されているように調製することができる。
【０１６４】
本明細書に記載のように使用するためのＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰおよびキメラＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰは、アジュバントを含有するアルミニウムに吸着され得る。アジュバントは、異なるＶＬＰに加えて予めそれらを吸着させた後に、それらの異なるＶＬＰを混合して最終的なワクチン製品を形成することができる。
【０１６５】
免疫原性組成物はまた、安定剤としてアルミニウムまたはアルミニウム化合物を含むこともでき、本開示はまた、ＶＬＰがアルミニウム塩に吸着された安定な組成物にも関する。ＶＬＰは、アルミニウム塩に吸着させた後は、アルミニウムの不在下よりも経時的安定性が高いことが好ましい。
【０１６６】
本明細書に記載の免疫原性組成物は、経口、局所、皮下、粘膜（一般に、腟内）、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、皮内および坐剤によるなど種々の経路のいずれかによってワクチンとして投与することができる。筋肉内および皮内送達が好ましい。
【０１６７】
該ポリペプチド、および／またはカプソマーおよび／またはＶＬＰおよび他のタンパク質の用量は、各個体の状態、性、齢および体重、投与経路ならびにワクチンのＨＰＶによって異なる。
【０１６８】
本明細書に記載の組成物中に存在するポリペプチドおよび／またはＶＬＰの用量は、各個体の状態、性、齢および体重、投与経路ならびにワクチンのＨＰＶによって異なる。その量はまた、ＶＬＰ型の数によっても異なる。免疫学防護応答を生じさせるのに好適なＶＬＰの量が送達されることが好適である。好適には、各ワクチン用量は、１〜１００μｇの各ＶＬＰ、好適には、少なくとも５μｇ、または少なくとも１０μｇ、例えば、５〜５０μｇの間の各ＶＬＰ、より好適には１０〜５０μｇの各ＶＬＰ、例えば５μｇ、６μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、４０μｇまたは５０μｇを含む。特定の実施形態では、キメラおよび非キメラ双方のＶＬＰが存在する場合、これらの量は、各ＨＰＶ型に対して存在するＶＬＰの総量、すなわち、Ｌ２ペプチドを含むキメラＬ１ ＶＬＰとＬ２ペプチドを含まないＬ１ ＶＬＰの総量を表す。
【０１６９】
例えば、本開示による組成物は、一用量中に、
３０μｇのＨＰＶ１６ ＶＬＰ、
３０μｇＨＰＶ１８ ＶＬＰ、
１０μｇのＬ２ペプチド含有キメラＨＰＶ１６ ＶＬＰ
１０μｇのＬ２ペプチド含有キメラＨＰＶ１８ ＶＬＰ
を含むことができ、ここで、キメラＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＶＬＰ中のＬ２ペプチドは同じまたは異なり、同じまたは異なるＨＰＶ型に由来する、以上に記載されているようなＬ２ ５６〜７５およびＬ２ １７〜３６から選択することができる。
【０１７０】
別の例では、本開示による組成物は、一用量中に、
２０μｇのＨＰＶ１６ ＶＬＰ、
２０μｇのＨＰＶ１８ ＶＬＰ、
１０〜２０μｇのＬ２ペプチド含有キメラＨＰＶ１８ ＶＬＰ、
１０〜２０μｇのＬ２ペプチド含有キメラＨＰＶ１６ ＶＬＰ
を含むことができ、ここで、キメラＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ ＶＬＰ中のＬ２ペプチドは同じまたは異なり、同じまたは異なるＨＰＶ型に由来する、以上に記載されているようなＬ２ ５６〜７５およびＬ２ １７〜３６から選択することができる。
【０１７１】
好適には、上記の組成物は、アジュバント、好適には、アルミニウム塩、好適には、水酸化アルミニウム、好適には、３Ｄ−ＭＰＬなどのＴｈ１アジュバントとの組合せをさらに含む。
【０１７２】
本明細書に記載の組成物は好適には、１、２またはそれを超えるＨＰＶ遺伝子型、好適には、ＨＰＶ５、６、８、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７３の群から選択される任意の１、２または３、４、５またはそれを超えるものに対してヒトまたは動物被験体に免疫応答を生じさせる。これらの組成物は、ＨＰＶ２、３および７３型の１以上に対して免疫応答を生じさせ得ることが好都合である。
【０１７３】
本明細書に記載の組成物は好適には、１、２またはそれを超えるＨＰＶ遺伝子型、好適には、ＨＰＶ５、６、８、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７３から選択される任意の１、２またはそれを超えるものからの感染および／または疾患に対して防護を提供する。好適には、これらの組成物は、少なくともＨＰＶ１６または１８に対して、より好適には、ＨＰＶ１６および１８の双方に対して防護を提供する。
【０１７４】
好適には、本明細書に記載の組成物は、ＨＰＶ１６および１８、ならびに癌を引き起こすＨＰＶ型、性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型および皮膚癌を引き起こすＨＰＶ型から選択される少なくとも１つの他のＨＰＶ型に対して防護を提供する。好適には、これらの組成物は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に加えて以下のＨＰＶ型：ＨＰＶ５、６、８、１１、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６、６８および７３の１以上に対して防護を提供する。
【０１７５】
本明細書に記載の免疫原性組成物およびワクチンは、ＨＰＶ感染および／または疾患を治療または予防するために使用可能である。例えば、この免疫原性組成物は、ウイルス量および／または子宮頸癌またはＣＩＮ ＩＩＩ後遺症に至る感染を軽減するために治療的に使用することができる。従って、本開示は、ＨＰＶ感染に関連する疾患の治療的処置および感染または疾患の予防における本明細書に記載の免疫原性組成物の使用に関する。好適には、本開示のワクチンの使用は、感染および／または疾患の予防におけるものである。本明細書において「感染」とは、好適には、偶発的感染および／または持続的感染に関する。感染は、例えば、ＰＣＲによって評価することができる。本明細書において「疾患」とは、ＨＰＶ感染に関連する細胞診の異常、ＡＳＣＵＳ、ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３または子宮頸癌であり得る。疾患は、例えば、組織学的検査またはｐ１６などのバイオマーカーの分析によって評価することができる。
【０１７６】
所望により、免疫原性組成物またはワクチンはまた、初期抗原または非ＨＰＶ抗原などの他のＨＰＶ抗原とともに処方または同時投与することもできる。好適には、これらの非ＨＰＶ抗原は、他の疾患、より好適には、単純ヘルペスウイルス、クラミジアおよびＨＩＶなどの性感染疾患に対して防護を提供することができる。特定の実施形態では、ワクチンは、ＨＳＶ由来のｇＤまたはその末端切断型を含む。この場合、ワクチンは、ＨＰＶおよびＨＳＶの双方に対して防護を提供する。
【０１７７】
本明細書に記載の全てのワクチンについて、ワクチンは好適には１０〜１５歳、好適には１０〜１３歳の青年期の女子のワクチン接種に用いられる。好適には、ワクチンは０〜１０歳の小児集団への投与にも好適である。ワクチンはまた、ｐａｐスメアに異常を示した女性またはＨＰＶによって引き起こされた病巣摘出術後の女性に投与することもできる。従って、このワクチンは、好適には、予防ワクチンとして血清反応陰性集団、および／または治療段階で血清反応陽性集団の双方に適用可能である。このワクチンは男性に投与することもできる。
【０１７８】
好適には、ワクチンは、２または３用量計画にて、例えば、それぞれ、０、１もしくは０、２もしくは０、３もしくは０、４もしくは０、５もしくは０、６か月計画、または０、１、６、もしくは０、２、６か月計画で送達される。ワクチン接種計画には、５〜１０年後、好適には１０年後に追加免疫注射を組み込むのが好適である。４用量以上を用いる他の計画も使用可能である。
【０１７９】
好適には、このワクチンは液体ワクチン製剤であり、ワクチンは凍結乾燥させ、投与前に再構成することができる。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：例示的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド
以下の例示的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを、分子生物学的手法を用いて作製した。これを表３にまとめる。
【表３】
【０１８１】
キメラ１：Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の１３７番と１３８番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ５８ Ｌ２ ＤＥキメラポリペプチド。
【０１８２】
キメラ２：Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の４３２番と４３３番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ５８ Ｌ２ ＣＴキメラポリペプチド。
【０１８３】
キメラ３：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の、１３７番と１３８番の間に挿入され、かつ、Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８またはＨＰＶ６に由来）が４３２番と４３３番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２およびＨＰＶ５８ Ｌ２キメラポリペプチド。
【０１８４】
キメラ４：Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の４３１番と４３２番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ５８ Ｌ２ ＣＴキメラポリペプチド。
【０１８５】
キメラ５：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の１３７番と１３８番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２ ＣＴキメラポリペプチド。
【０１８６】
キメラ６：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の２７２番と２７３番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２ Ｐ／Ｄキメラポリペプチド。
【０１８７】
キメラ７：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の、１３７番と１３８番の間に挿入され、かつ、Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLが４３１番と４３２番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２およびＨＰＶ５８ Ｌ２キメラポリペプチド。
【０１８８】
キメラ８：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の１３７番と１３８番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ３３ Ｌ２ ＤＥキメラポリペプチド。
【０１８９】
キメラ９：Ｌ２ペプチドQLYQTCKATGTCPPDVIPKV（ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１）が、ＨＰＶ１８に由来するＣ末端切断型Ｌ１の４３２番と４３３番の間に挿入されている、ＨＰＶ１８ Ｌ１ ＨＰＶ３３ ＣＴキメラポリペプチド。
【０１９０】
キメラ１０：Ｌ２ペプチドGGLGIGTGSGTGGRTGYVPL（ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）が、ＨＰＶ１６に由来するＣ末端切断型Ｌ１の４３１番と４３１番の間に挿入されている、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＨＰＶ５８ Ｌ２キメラポリペプチド。
【０１９１】
実施例２：例示的キメラの合成発現、精製および同定
組換え核酸の生産 実施例１に記載の例示的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸を遺伝子合成によって得た後、それらを標準的な遺伝子操作によってバキュロウイルス発現ベクターにクローニングした。挿入部位を表３にまとめる。各Ｌ１ポリペプチドのＣ末端切断は、各Ｌ１ポリペプチドのＣ末端に存在する核局在シグナルならびにＤＮＡ結合ドメインを除去することを目的とするものであった（ＨＰＶ１６、１８のそれぞれに関して３４、３５のアミノ酸のＣ末端欠失）。本明細書において、ＨＰＶ１６および１８ Ｌ１末端切断型のアミノ酸配列はそれぞれ図１ａおよびｂに示されている。ＨＰＶ３３およびＨＶＰ５８ Ｌ２ペプチドのアミノ酸配列は図２に示されている（それぞれ図２（ａ）、図２（ｂ））。例示的キメラのアミノ酸配列は配列番号３６〜４５に示されている。
【０１９２】
細胞採取 着目するＨＰＶ１６または１８ Ｌ１／Ｌ２キメラポリペプチドをコードする組換えバキュロウイルス（ＭＯＩ０．０５〜０．５）を感染させたキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標））細胞（密度〜２００００００細胞／ｍｌ）で、例示的キメラポリペプチドを発現させた。感染４日後に細胞を低速遠心分離によって採取した。得られた細胞ペレットを−７０℃で保存した。
【０１９３】
抗原抽出 例示的キメラポリペプチドを二段階の抽出および清澄化でＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞から抽出した。細胞の抽出工程は、還元および低張バッファー（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ＋４％β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ｐＨ８．５）を用いて行った。あるいは、抽出が低率である場合には、ｐＨを８．７とし洗剤Ｅｍｐｉｇｅｎ２％を加えることができる。培養容量の２分の１相当量または培養容量と同量を抽出の実施に用いた。室温で、最低でも半時間の接触時間を用いた。清澄化は遠心分離により行い、上清に濁りがあれば、任意選択の、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ ＣＯＨＣフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または等価物での濾過を行った。
【０１９４】
精製および同定 精製手順は、種々のキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド、キメラポリペプチドに関しては極めてよく似ており、陰イオン交換クロマトグラフィー（（ジまたはトリメチルアミノエチル−ＤＭＡＥまたはＴＭＡＥ）、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの工程を含む。
【０１９５】
超分子形成手順はキメラポリペプチド間で若干異なり、ＮａＣｌおよびＴｗｅｅｎの添加に若干の違いがあり、バッファー交換およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５でのゲル濾過によるＢＭＥの除去、一晩成熟および０．２２μｍでの濾過除菌を含む。
【０１９６】
精製工程は、＋４℃で一晩行うＶＬＰ成熟以外は、室温で行った。全てにＢＭＥ４％ｖ／ｖを加えたが、ＶＬＰ形成を避けるために最終バッファーには加えなかった。用いたバッファーは全て０．２２μｍフィルターで濾過した。各精製の前にゲルマトリックスを消毒し、サンプルを添加する前に適当なバッファーで平衡化した。
【０１９７】
陰イオン交換クロマトグラフィーＴＭＡＥまたはＤＭＡＥ： 清澄化した抽出物を、Ｔｒｉｓ２０ｍＭ｜ＮａＣｌ５０ｍＭ｜４％β−メルカプトエタノールＢＭＥバッファー、ｐＨ８．０±０．２で予め平衡化した陰イオン交換カラム（ジメチルアミノエチル）に適用した。結合しなかったポリペプチドを洗浄した後、Ｔｒｉｓ２０ｍＭ｜ＮａＣｌ５０〜２５０ｍＭ｜４％β−メルカプトエタノールＢＭＥバッファー、ｐＨ８．０±０．２の直線勾配で溶出を行った。抗原はＮａＣｌ勾配内で溶出され、溶出特性を２８０ｎｍでモニタリングした。回収した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。Ｌ１／Ｌ２陽性画分をプールし、次のカラムまで＋４℃で維持した。
【０１９８】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー： 前工程の溶出液を、（ＴＲＩＳ２０ｍＭ｜ＮａＣｌ１８０ｍＭ｜４％ＢＭＥ）バッファー、ｐＨ８．０±０．２で予め平衡化したヒドロキシアパタイトＩ型（ＨＡ）カラムに適用した。
【０１９９】
サンプルを適用した後、ゲルを平衡バッファーで洗浄し、およそ１０カラム容量の（リン酸Ｎａ１００ｍＭ｜ＮａＣｌ３０ｍＭ｜４％ＢＭＥ）バッファー、ｐＨ６．０±０．２で溶出した。ＨＡ溶出液をすぐに溶出バッファーで４０ｍｌまで希釈し、室温で一晩保存した。
【０２００】
次に、ＨＡ溶出液を、（２０ｍＭリン酸Ｎａ｜５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）バッファーで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Ｍ）ゲル濾過カラム（ベッド容量１４５ｍｌ）に適用した。場合によっては、バッファーをＮａＣｌ含量１００ｍＭに変えた。溶出特性を２８０ｎｍ（ポリペプチドの場合）および２５４ｎｍ（ＢＭＥの場合）でモニタリングした。キメラＬ１／Ｌ２抗原はゲル粒子外部容量に回収され、ＢＭＥはもっと後の段階に、総容量（Ｖｔ）とは異なるスペクトルで溶出する。成熟は、＋４℃で一晩保存することによって行った。成熟後、キメラＬ１／Ｌ２抗原を含有するＳｅｐｈａｄｅｘプールを０．２２μｍ無菌フィルターで濾過し、−７０℃で保存した。場合によっては、０．０５％（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０を濾過前に加えた。培養物８００ｍｌからのキメラＬ１／Ｌ２抗原精製法の簡略化した流れ図を図５ａ）〜ｅ）に示す。
【０２０１】
キメラＬ１／Ｌ２抗原の電子顕微鏡（ＥＭ）による同定 電子顕微鏡を用い、対照として用いたＣ末端切断型ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ Ｌ１タンパク質によって産生されたものと同等の粒子が、ポリペプチド粒子および／またはカプソマーおよび／またはＶＬＰなどの精製キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドから生成されるかどうか、同定を行った。キメラＶＬＰの大きさは対照と同じか大きいと考えられる。精製キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド粒子は、それぞれのバッファー（表３に示す通り）で５０μｇ／ｍｌに希釈した。酢酸ウラシル（ＵＡｃ）を対比染色剤として用いる標準的二段階ネガティブ染色法（Ｈａｙａｔ Ｍ.Ａ.＆ Ｍｉｌｌｅｒ Ｓ.Ｅ.， １９９０）に従う、ＥＭネガティブ染色解析用にサンプルを調製した。要するに、炭素コーティングされたホルムバールフィルムを備えたニッケル格子（４００メッシュ）を１滴のサンプルの上に室温で１０分間浮かべ、材料を吸収させた。余分な溶液を除去し、材料を２分未満で風乾させた。次に、この格子を短時間（３０秒未満）１滴の蒸留水の上に浮かべて、着色沈殿を生じ得る塩を除去した。この格子を、Ｈａｒｒｉｓ （Ｈａｒｒｉｓ, Ｊ.Ｒ., ９４）に従って作製した染色液：水中２％ＵＡｃ（ｗ／ｖ）に１％トレハロース（ｗ／ｖ）を添加したもの１滴の上に移した。３０秒後にこの格子を吸い取り紙で吸い取って乾燥させた。この材料を完全に乾燥させ（１時間）、ＬＥＯ Ｚｅｉｓｓ ＥＭ９１２Ω下、１００ｋＶで調べた。標準的な１００Ｋ原倍率で代表的な視野の画像を採り、表４にまとめた。ＥＭの結果は、形成されたキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドは、＃５−Ｌ１−ＨＰＶ１６／Ｌ２ ＤＥ１７−３６と＃８−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ ＤＥ１７−３６以外、野生型ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ Ｌ１ ＶＬＰによって産生されたものと同一ではないことを示した。形成された粒子は、ＶＬＰ段階下、非晶質構造または小型で比較的均質な非ＶＬＰ構造のいずれかである。
【表４】
【０２０２】
キメラＬ１／Ｌ２抗原の抗体の同定 精製Ｌ１／Ｌ２キメラ構築物のＬ１成分の抗原性の特性決定は、Ｄｒ. Ｎｅｉｌ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ （Ｃｈｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ., １９９６, ２００１）によって提供されたハイブリドーマから精製されたＨ１６．Ｖ５（コンフォメーション特異的中和モノクローナル抗体；ＨＰＶ−１６ Ｌ１ ＶＬＰとの結合に重要なａａは２６６〜２９７および３３９〜３６５）、Ｈ１８．Ｊ４（コンフォメーション特異的中和モノクローナル抗体（ＨＰＶ−１８ Ｌ１ ＶＬＰ上のエピトープの位置は未知））またはＨ１６．Ｕ４（コンフォメーション特異的中和モノクローナル抗体、ＨＰＶ−１６ Ｌ１ ＶＬＰ上のエピトープは未知）のいずれかをコーティングとして用い、サンドイッチＥＬＩＳＡによって行った。このアッセイを用いて、ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ ＶＬＰの天然調製物に比べて、種々のキメラＬ１／Ｌ２抗原上のＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８コンフォメーション特異的エピトープの存在を証明した。精製Ｌ１／Ｌ２キメラ構築物のＬ２成分は、プレートをキメラ構築物でコーティングした後に、Ｌ２ペプチドアミノ酸１７〜３６ ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１または５６〜７５ ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６に対するウサギポリクローナルのいずれかで検出することによる直接的ＥＬＩＳＡを用いて特性決定した。このアッセイは、＃９−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ Ｃｔ１７−３６以外では、Ｌ２エピトープがキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドの表面に十分露出していることを示した。
【表５】
【０２０３】
実施例３：動物モデルにおけるキメラＬ１／Ｌ２抗原の免疫原性および交差反応性の試験法
ＢＡＬＢ／ｃマウス（一般に、１群当たり少なくともマウス１５匹）を（例えば、０日目、１４日目および４２日目の３回の多回用量計画で）２または１０μｇの前記キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド単独またはＣｅｒｖａｒｉｘの同時投与で筋肉内免疫し、２週間後と６週間後の２回の追加免疫を行った。最終免疫の後、好適な期間の後（例えば、１４日目）に、ワクチン接種によって誘導された特異的Ｌ１抗体応答を、ペプチドおよび／またはタンパク質ＥＬＩＳＡによってモニタリングした。ワクチン接種によって誘導された特異的および交差反応性のＬ２抗体応答もペプチドおよび／またはタンパク質ＥＬＩＳＡによってモニタリングすることができる。参照からＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ（４パラメーター方程式を用いる）によってＥＬＩＳＡ力価を算出し、ＥＵ／ｍｌで表した。
【０２０４】
あるいは、２匹のニュージーランドホワイトウサギ（ＮＺＷ、１．５〜２ｋｇ）を、２０または１００μｇの前記キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド単独の筋肉内投与またはＣｅｒｖａｒｉｘの同時投与によって免疫した（例えば、０日目、１４日目、２８日目および４２日目の４回の多回用量計画）。これらのキメラは、ウサギの高度免疫のためにフロイントのアジュバントの代わりに用いる、製造業者のプロトコールに従って調製した油中水型エマルションであるＳｐｅｃｏｌ（Ｃｅｄｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ製）を用いて処方した。
【０２０５】
抗ＶＬＰ血清学（Ｉｇ応答） 抗ＶＬＰ１６またはＶＬＰ１８抗体の定量は、コーティング抗原としてＨＰＶ１６ ＶＬＰまたはＨＰＶ１８ ＶＬＰを用いてＥＬＩＳＡによって行う。
【０２０６】
表６および７に、それぞれマウスおよびウサギのデータをまとめる。
【表６】
【０２０７】
１００％のマウス血清が、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰと反応し、Ｌ２エピトープの挿入がＨＰＶ−Ｌ１応答に影響を及ぼさなかったことを示す。
【表７】
【０２０８】
１００％のウサギ血清が、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰと反応し、Ｌ２エピトープの挿入がＨＰＶ−Ｌ１応答に影響を及ぼさなかったことを示す。
【０２０９】
抗Ｌ２ペプチド血清学（Ｉｇ応答） 抗Ｌ２抗体の定量を、同種（Ｌ２ペプチドアミノ酸１７〜３６ＨＰＶ３３／ＨＰＶ１１またはＬ２ペプチドアミノ酸５６〜７５ＨＰＶ５８／ＨＰＶ６）または異種ＨＰＶ型に由来するＬ２ペプチド（２μｇ／ｍｌ）を用いてＥＬＩＳＡにより行い、特異的応答および交差反応性応答を評価した。交差Ｌ２抗体応答については、以下の合成Ｌ２ペプチドを用いた：ＨＰＶ−５、６、１６、３１、３５、５２および５６のアミノ酸１７〜３６、またはＨＰＶ−５８、４５、３３、５２、５、１１、５６および３５のアミノ酸５６〜７５。
【０２１０】
ＨＰＶ−Ｌ２−ペプチドのＥＬＩＳＡ測定
Ｌ２ペプチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃにより作製）をＰＢＳ中に終濃度２μｇ／ｍｌとなるように希釈し、一晩４℃で、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ, Ｎｕｎｃ, Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに吸着させた。次に、これらのプレートを３７℃で１時間、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ（飽和バッファー）とともにインキュベートした。飽和バッファーで希釈した血清を、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドでコーティングされたプレートに加え、３７℃で１時間３０分インキュベートした。これらのプレートをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、各ウェルに飽和バッファーで希釈したビオチン結合抗Ｉｇを加え、抗マウス試薬（Ｄａｋｏ, ＵＫ）に関しては１時間、または抗ウサギ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ, ＵＫ）に関しては１時間３０分、３７℃でインキュベートした。洗浄工程の後、飽和バッファーで希釈したストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ, ＵＫ）を３７℃でさらに３０分間加えた。プレートを上記で示したように洗浄し、室温で２０分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍクエン酸バッファーｐＨ４．５中、０．０４％ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ） ０．０３％Ｈ２Ｏ２の溶液とともにインキュベートした。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４９２／６２０ｎｍで読み取った。参照からＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ（４パラメーター方程式を用いる）によってＥＬＩＳＡ力価を算出し、ＥＵ／ｍｌで表した。
【０２１１】
ＨＰＶ−Ｌ１のＥＬＩＳＡ測定
ＨＰＶ−１６／１８ Ｌ１ ＶＬＰをＰＢＳ中に終濃度１μｇ／ｍｌとなるように希釈し、一晩４℃で、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ−ｐｌａｔｅ, Ｎｕｎｃ, Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに吸着させた。次に、これらのプレートを３７℃で１時間、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０＋１％ＢＳＡ（飽和バッファー）とともにインキュベートした。飽和バッファーで希釈した血清を、ＨＰＶ Ｌ１ペプチドでコーティングされたプレートに加え、３７℃で１時間３０分インキュベートした。これらのプレートをＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、各ウェルに飽和バッファーで希釈したビオチン結合抗Ｉｇ（Ｄａｋｏ, ＵＫ）または抗ウサギＩｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＫ）を加え、３７℃で１時間３０分インキュベートした。洗浄工程の後、飽和バッファーで希釈したストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ, ＵＫ）を３７℃でさらに３０分間加えた。プレートを上記で示したように洗浄し、室温で２０分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５Ｍクエン酸バッファーｐＨ４．５中、０．０４％ｏ−フェニレンジアミン(Sigma) ０．０３％Ｈ２Ｏ２の溶液とともにインキュベートした。２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、４９２／６２０ｎｍで読み取った。参照からＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ（４パラメーター方程式を用いる）によってＥＬＩＳＡ力価を算出し、ＥＵ／ｍｌで表した。
【０２１２】
表８にマウスにおける免疫原性データをまとめる。
【０２１３】
全てのキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原が、マウスにおいて有意な用量依存的にＬ２抗体応答を誘導した（力価は１６８７〜１８８７３の範囲）。これらの結果は、３回目の免疫の後と４回目の免疫の後の間で免疫原性の向上を示した（データは示されていない）。
【表８】
【０２１４】
表９および１０にペプチド配列１７〜３６および５６〜７５のそれぞれに対するウサギにおけるＥＬＩＳＡデータをまとめる。
【０２１５】
全てのキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原が、ウサギにおいて有意な用量依存的に特異的および交差反応性のＬ２抗体応答を誘導した。Ｌ２のアミノ酸１７〜３６を含むキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドで免疫されたウサギ由来の抗血清はＬ２の合成Ｌ２ペプチドアミノ酸５６〜７５と交差反応せず、また逆もそうであったことから（データは示されていない）、このＬ２応答は特異的なものであった。
【０２１６】
良好な交差反応性が、Ｌ２配列のアミノ酸１７〜３６に由来するほとんどの合成Ｌ２ペプチドで見られた（表９）。この反応性は３０番のアミノ酸に依存している可能性があり、交差反応性が低いまたは無い全ての合成アミノ酸（Ｌ２−アミノ酸１７〜３６ ＨＰＶ−３１および−５６）では、Ｐｒｏ（Ｐ）がＳまたはＥなどの異なるアミノ酸種に置き換わっていた。同様に、Ｌ２のアミノ酸配列５６〜７５の合成Ｌ２ペプチドの全てで比較的良好な交差反応性が見られた（表１０）。この反応性は７０番のアミノ酸に依存している可能性があり、Ｔｈｒ（Ｔ）がＡｌａ（Ａ）などの異なるアミノ酸に置き換わると、交差反応性ではなくなった（Ｌ２−アミノ酸５６〜７５ ＨＰＶ−１１、−５２および−５６）。
【表９】
【表１０】
【０２１７】
中和実験 ３回目および／または４回目の免疫の２週間後に、血清を中和アッセイバッファーで希釈し（８点４倍連続希釈−最初の希釈は、ウサギ血清では１／１０、マウスでは１／４０で始めた）、免疫の際に用いたものと同じおよび異なるＨＰＶ型に由来する感染性シュードウイルス（ＰｓＶ）と混合した。この混合物を４℃で１時間反応させ、少なくとも２時間前、４．５時間以内に播種した２９３ＴＴ細胞（３００００細胞／ウェル）に加えた。７２時間５％ＣＯ２で培養した後、上清を回収し、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳｅＡＰ）活性を測定した（ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）が直線範囲（例えば、７５〜１００ＲＬＵの間）に入るように至適化したことで改変した、本質的にＰａｓｔｒａｎａ ｅｔ ａｌ ２００４に記載されているような中和アッセイ）。中和力価は、血清の不在下でＰｓＶ感染によって生成されるＳｅＡＰ活性シグナルに５０％の低下をもたらす血清希釈率の逆数として表す。４０より小さい中和力価は、カットオフより下であると見なされる。
【０２１８】
表１１にマウスにおけるデータをまとめる。
【表１１】
【０２１９】
キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原＃５−Ｌ１−ＨＰＶ１６／Ｌ２ ＤＥ１７−３６および＃８−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ ＤＥ１７−３６での免疫は単独で、マウスにおいて試験した場合（表１０）、＃２−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ Ｃｔ５６−７５を除き、検出可能な特異的中和抗体（力価は２６２〜６９６の範囲）を誘導した。ＨＰＶ１６／１８ Ｌ１ ＶＬＰと組み合わせた場合、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原＃５−Ｌ１−ＨＰＶ１６／Ｌ２ ＤＥ１７−３６および＃８−Ｌ１−ＨＰＶ１８／Ｌ２ ＤＥ１７−３６は、程度は低いが、なお検出可能な中和抗体を誘導した（力価は６１〜６３３の範囲）。
【表１１ｂ】
【０２２０】
表１２および１３に、それぞれＩＩＩ後およびＩＶ後１４日目におけるウサギの中和データをまとめる。
【０２２１】
Ｌ１／Ｌ２キメラ＃２（ＮａＣｌ１００ｍＭ中）以外、試験したほとんどのキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド抗原が、ウサギにおいて検出可能な特異的および交差中和抗体を誘導した（表１２および１３）。Ｌ２ペプチド５６〜７５ ＨＰＶ５８／ＨＰＶ１１の提示は、このキメラがＥＬＩＳＡ力価を誘導したという所見にもかかわらず、中和抗体の誘導には最適でない可能性がある。キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドにおけるＬ２ペプチドの挿入は、ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ Ｌ１に対する高力価中和抗体の誘導を妨げなかった（表１１および１２）。Ｓｐｅｃｏｌ中に処方されたキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド＃８は、ミョウバン−ＭＰＬ処方物に比べておよそ２倍高い中和力価を誘導した（表１３）。Ｌ１／Ｌ２キメラ単独による免疫は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ−１８に対して有意に高い中和抗体を誘導し、これは担体タンパク質ＨＰＶ−１６またはＨＰＶ−１８ Ｌ１ ＶＬＰに対する抗体応答を表す。さらに、高リスクＨＰＶ−３３、５８の良好な中和が、キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド＃５で、またそれより程度は低いがキメラＬ１／Ｌ２ポリペプチド＃８でも見られた。さらに、低リスクＨＰＶ−６および１１の中和も、両ウサギ血清で検出された（表１３）。
【表１２】
【表１３】
【０２２２】
別の実験で、小型の非ＶＬＰとして精製したキメラ＃２、およびキメラ３を、ＡＳ０４アジュバント（ミョウバン３Ｄ−ＭＰＬ）中に処方し、個別のウサギに投与し、Ｅｌｉｓａで抗ペプチド１７〜３６および抗ペプチド５６〜７５および抗ＨＰＶ Ｌ１応答に関して調べた。２回目の免疫の後、以下のデータが得られた。
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【０２２３】
参照文献一覧
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【０２２４】
例示的キメラＬ１／Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸配列
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入されたＬ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含む、ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項２】
前記Ｌ２ポリペプチドのペプチドが非ＨＰＶ１８型ペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが前記Ｌ２ポリペプチドを含む天然タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが少なくとも１つの付加的天然Ｌ２タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＨＰＶ Ｌ１タンパク質が１以上のアミノ酸のＣ末端欠失を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１ポリペプチドの露出領域内に挿入されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１タンパク質のＤＥループに挿入されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがアミノ酸１３２〜１４２の間に挿入されている、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１タンパク質のＦＧループに挿入されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがアミノ酸１７２〜１８２の間に挿入されている、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１タンパク質のＨＩループに挿入されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがアミノ酸３４５〜３５９の間に挿入されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１ポリペプチドのＣ末端内に挿入されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがアミノ酸４２９〜４４５の間に挿入されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記Ｌ１ポリペプチド内に挿入された２以上のＬ２ペプチドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記２以上のＬ２ペプチドが異なる部位に挿入されている、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記第一のＬ２ペプチドがＤＥループに挿入され、第二のＬ２ペプチドがＬ１ポリペプチドのＣ末端に挿入されている、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記２以上のＬ２ペプチドが異なっている、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが天然Ｌ２ポリペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸１〜２００から選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸１〜１５０から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１７〜３６を含むペプチド、
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基５６〜７５を含むペプチド、
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基９６〜１１５を含むペプチド、および、
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１０８〜１２０を含むペプチド、
からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがＨＰＶ３３型Ｌ２のアミノ酸１７〜３６からなる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがＨＰＶ５８型Ｌ２のアミノ酸５６〜７５からなる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが配列番号１〜３１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、１以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、１以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、１以上のアミノ酸の置換を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換が２つのシステイン間のジスルフィド結合を除去するか、またはジスルフィド結合を形成し得る２つのシステイン間のアミノ酸を除去する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが２以上のＬ２ペプチドを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記２以上のＬ２ペプチドが連続している、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記２以上のＬ２ペプチドが少なくとも１つの付加的アミノ酸によって連結されている、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記２以上のＬ２ペプチドが、複数のアミノ酸を含むスペーサーによって連結されている、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記Ｌ２ペプチドが少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、前記少なくとも８個の連続するアミノ酸が少なくとも２つのＨＰＶ型のＬ２ポリペプチドと同一の配列を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、前記Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸を欠失させることなく前記Ｌ１ポリペプチド内に挿入されている、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記少なくともＬ２ペプチドが、前記Ｌ２ポリペプチドの１以上のアミノ酸の欠失を伴って前記Ｌ１ポリペプチド内に挿入されている、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号３２〜４５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３９】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むペプチドを含む、ＨＰＶ１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項４０】
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含む前記ペプチドが、癌原型のＨＰＶから選択される、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ＨＰＶ５８型Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むペプチドが前記ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入されている、請求項３９または４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチド配列に比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチド配列に比べて、１以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチド配列に比べて、１以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチド配列に比べて、１以上のアミノ酸の置換を含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換が２つのシステイン間のジスルフィド結合を除去するか、またはジスルフィド結合を形成し得る２つのシステイン間のアミノ酸を除去する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが２以上のＬ２ペプチドを含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記２以上のＬ２ペプチドが連続している、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記２以上のＬ２ペプチドが少なくとも１つの付加的アミノ酸によって連結されている、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記２以上のＬ２ペプチドが複数のアミノ酸を含むスペーサーによって連結されている、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む前記少なくとも１つのＬ２ペプチドを含む前記ポリペプチドが、前記Ｌ２ポリペプチドを含む天然タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる、請求項４２〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記Ｌ２ペプチドが少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、前記少なくとも８個の連続するアミノ酸が少なくとも２つのＨＰＶ型のＬ２ポリペプチドと同一の配列である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むカプソマー。
【請求項５４】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項５５】
請求項１〜５４のいずれか１項に記載のタンパク質、カプソマーまたはＶＬＰと薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体とを含む、免疫原性組成物。
【請求項５６】
アジュバントをさらに含む、請求項５５に記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
前記アジュバントがアルミニウム塩を含む、請求項５６に記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
前記アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである、請求項５７に記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
３Ｄ−ＭＰＬをさらに含む、請求項５７または５８に記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項６１】
請求項５９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６２】
前記発現ベクターが組換えバキュロウイルスである、請求項６１に記載の発現ベクター。
【請求項６３】
請求項５９に記載の核酸または請求項６１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６４】
薬剤に使用するための請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
請求項６１または６２に記載の発現ベクターを細胞に導入すること、および前記細胞を前記ポリペプチドが生産される条件下で複製することを含む、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドの生産方法。
【請求項６６】
（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む、少なくとも１つのウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）前記ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む、少なくとも１つのキメラポリペプチド、
を含む組成物。
【請求項６７】
（ｉ）の前記ＶＬＰがＬ１ポリペプチドまたはその断片からなる、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
（ｉｉ）の前記少なくとも１つのキメラポリペプチドが請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５３に記載のカプソマー、または請求項５４に記載のＶＬＰである、請求項６６または６７に記載の組成物。
【請求項６９】
（ｉ）の前記ＨＰＶ ＶＬＰがＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰを含む、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
（ｉｉ）の前記少なくとも１つのキメラポリペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、および／またはＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片を含む、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
（ｉｉ）の前記少なくとも１つのキメラポリペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、ＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、またはＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片とＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片の双方からなる、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７２】
（ｉｉ）の前記少なくとも１つのキメラポリペプチドが前記Ｌ１ポリペプチドの１以上のアミノ酸のＣ末端欠失を含む、請求項６６〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７３】
（ｉ）の前記ＶＬＰがＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰとＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰの双方を含み、（ｉｉ）の前記キメラポリペプチドが、ＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドを含む少なくとも１つのキメラポリペプチドと、ＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドを含む少なくとも１つのキメラポリペプチドとを含む、請求項６６〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドを含む前記キメラポリペプチドと前記ＨＰＶ１８ポリペプチドを含む前記キメラポリペプチドが異なるＬ２ペプチドを含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む２以上のキメラポリペプチドの組合せを含む組成物。
【請求項７６】
前記キメラポリペプチドが請求項１〜５２のいずれか１項に記載されるものである、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記キメラポリペプチドが同じＨＰＶ型のＬ１ポリペプチドを含み、前記Ｌ２ペプチドが異なる、請求項７５または７６に記載の組成物。
【請求項７８】
ＶＬＰおよび／またはキメラポリペプチドがそれぞれヒト用量当たり１０〜５０μｇの量で存在する、請求項６６〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
ＶＬＰおよび／またはキメラポリペプチドがそれぞれおよそ２０μｇの量で存在する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体をさらに含む、請求項６６〜７９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
アジュバントをさらに含む、請求項８０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
前記アジュバントがアルミニウム塩を含む、請求項８１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
前記アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである、請求項８２に記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
３Ｄ−ＭＰＬをさらに含む、請求項８２または８３に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
免疫原性組成物の調製方法であって、
（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、
（ｉｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つのキメラポリペプチドと、
（ｉｉｉ）薬学上許容される希釈剤または担体と、所望により、
（ｉｖ）アジュバントと、
合わせて、請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を作製することを含む、前記方法。
【請求項８６】
ヒトに請求項５５〜５９または６６〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する抗体を誘導する方法。
【請求項８７】
ＨＰＶに対する抗体を誘導することがＨＰＶ感染または疾患を予防、改善または治療する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
ＨＰＶ感染または疾患の予防、改善または治療に使用するための、請求項５５〜５９または６６〜８４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入されたＬ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含む、ＨＰＶ１８型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項２】
前記Ｌ２ポリペプチドのペプチドが非ＨＰＶ１８型ペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが前記Ｌ２ポリペプチドを含む天然タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが少なくとも１つの付加的天然Ｌ２タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＨＰＶ Ｌ１タンパク質が１以上のアミノ酸のＣ末端欠失を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１ポリペプチドの露出領域内に挿入されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１タンパク質のＤＥループに挿入されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがアミノ酸１３２〜１４２の間に挿入されている、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１タンパク質のＦＧループに挿入されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがアミノ酸１７２〜１８２の間に挿入されている、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１タンパク質のＨＩループに挿入されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがアミノ酸３４５〜３５９の間に挿入されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが前記Ｌ１ポリペプチドのＣ末端内に挿入されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがアミノ酸４２９〜４４５の間に挿入されている、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記Ｌ１ポリペプチド内に挿入された２以上のＬ２ペプチドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記２以上のＬ２ペプチドが異なる部位に挿入されている、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記第一のＬ２ペプチドがＤＥループに挿入され、第二のＬ２ペプチドがＬ１ポリペプチドのＣ末端に挿入されている、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記２以上のＬ２ペプチドが異なっている、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが天然Ｌ２ポリペプチドの少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸１〜２００から選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸１〜１５０から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１７〜３６を含むペプチド、
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基５６〜７５を含むペプチド、
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基９６〜１１５を含むペプチド、および、
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸残基１０８〜１２０を含むペプチド、
からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがＨＰＶ３３型Ｌ２のアミノ酸１７〜３６からなる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドがＨＰＶ５８型Ｌ２のアミノ酸５６〜７５からなる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが配列番号１〜３１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、１以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、１以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチドに比べて、１以上のアミノ酸の置換を含む、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換が２つのシステイン間のジスルフィド結合を除去するか、またはジスルフィド結合を形成し得る２つのシステイン間のアミノ酸を除去する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが２以上のＬ２ペプチドを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記２以上のＬ２ペプチドが連続している、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記２以上のＬ２ペプチドが少なくとも１つの付加的アミノ酸によって連結されている、請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記２以上のＬ２ペプチドが、複数のアミノ酸を含むスペーサーによって連結されている、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記Ｌ２ペプチドが少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、前記少なくとも８個の連続するアミノ酸が少なくとも２つのＨＰＶ型のＬ２ポリペプチドと同一の配列を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、前記Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸を欠失させることなく前記Ｌ１ポリペプチド内に挿入されている、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記少なくともＬ２ペプチドが、前記Ｌ２ポリペプチドの１以上のアミノ酸の欠失を伴って前記Ｌ１ポリペプチド内に挿入されている、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号３２〜４５のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３９】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むペプチドを含む、ＨＰＶ１６型Ｌ１ポリペプチドまたはその断片。
【請求項４０】
ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含む前記ペプチドが、癌原型のＨＰＶから選択される、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
ＨＰＶ５８型Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸５６〜７５を含むペプチドが前記ＨＰＶ Ｌ１ポリペプチド内に挿入されている、請求項３９または４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチド配列に比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチド配列に比べて、１以上のアミノ酸の挿入を含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチド配列に比べて、１以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが、天然Ｌ２ポリペプチド配列に比べて、１以上のアミノ酸の置換を含む、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換が２つのシステイン間のジスルフィド結合を除去するか、またはジスルフィド結合を形成し得る２つのシステイン間のアミノ酸を除去する、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記少なくとも１つのＬ２ペプチドが２以上のＬ２ペプチドを含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記２以上のＬ２ペプチドが連続している、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記２以上のＬ２ペプチドが少なくとも１つの付加的アミノ酸によって連結されている、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記２以上のＬ２ペプチドが複数のアミノ酸を含むスペーサーによって連結されている、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む前記少なくとも１つのＬ２ペプチドを含む前記ポリペプチドが、前記Ｌ２ポリペプチドを含む天然タンパク質に対して免疫応答を誘導することができる、請求項４２〜５０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記Ｌ２ペプチドが少なくとも８個の連続するアミノ酸を含み、前記少なくとも８個の連続するアミノ酸が少なくとも２つのＨＰＶ型のＬ２ポリペプチドと同一の配列である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むカプソマー。
【請求項５４】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項５５】
請求項１〜５４のいずれか１項に記載のタンパク質、カプソマーまたはＶＬＰと薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体とを含む、免疫原性組成物。
【請求項５６】
アジュバントをさらに含む、請求項５５に記載の免疫原性組成物。
【請求項５７】
前記アジュバントがアルミニウム塩を含む、請求項５６に記載の免疫原性組成物。
【請求項５８】
前記アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである、請求項５７に記載の免疫原性組成物。
【請求項５９】
３Ｄ−ＭＰＬをさらに含む、請求項５７または５８に記載の免疫原性組成物。
【請求項６０】
請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項６１】
請求項５９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６２】
前記発現ベクターが組換えバキュロウイルスである、請求項６１に記載の発現ベクター。
【請求項６３】
請求項５９に記載の核酸または請求項６１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６４】
薬剤に使用するための請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
請求項６１または６２に記載の発現ベクターを細胞に導入すること、および前記細胞を前記ポリペプチドが生産される条件下で複製することを含む、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチドの生産方法。
【請求項６６】
（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む、少なくとも１つのウイルス様粒子（ＶＬＰ）と、
（ｉｉ）前記ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む、少なくとも１つのキメラポリペプチド、
を含む組成物。
【請求項６７】
（ｉ）の前記ＶＬＰがＬ１ポリペプチドまたはその断片からなる、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
（ｉｉ）の前記少なくとも１つのキメラポリペプチドが請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項５３に記載のカプソマー、または請求項５４に記載のＶＬＰである、請求項６６または６７に記載の組成物。
【請求項６９】
（ｉ）の前記ＨＰＶ ＶＬＰがＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰを含む、請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
（ｉｉ）の前記少なくとも１つのキメラポリペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、および／またはＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片を含む、請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７１】
（ｉｉ）の前記少なくとも１つのキメラポリペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、ＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片、またはＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片とＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドもしくはその断片の双方からなる、請求項６６〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７２】
（ｉｉ）の前記少なくとも１つのキメラポリペプチドが前記Ｌ１ポリペプチドの１以上のアミノ酸のＣ末端欠失を含む、請求項６６〜７１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７３】
（ｉ）の前記ＶＬＰがＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰとＨＰＶ１８ Ｌ１ ＶＬＰの双方を含み、（ｉｉ）の前記キメラポリペプチドが、ＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドを含む少なくとも１つのキメラポリペプチドと、ＨＰＶ１８ Ｌ１ポリペプチドを含む少なくとも１つのキメラポリペプチドとを含む、請求項６６〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ＨＰＶ１６ Ｌ１ポリペプチドを含む前記キメラポリペプチドと前記ＨＰＶ１８ポリペプチドを含む前記キメラポリペプチドが異なるＬ２ペプチドを含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む２以上のキメラポリペプチドの組合せを含む組成物。
【請求項７６】
前記キメラポリペプチドが請求項１〜５２のいずれか１項に記載されるものである、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記キメラポリペプチドが同じＨＰＶ型のＬ１ポリペプチドを含み、前記Ｌ２ペプチドが異なる、請求項７５または７６に記載の組成物。
【請求項７８】
ＶＬＰおよび／またはキメラポリペプチドがそれぞれヒト用量当たり１０〜５０μｇの量で存在する、請求項６６〜７７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７９】
ＶＬＰおよび／またはキメラポリペプチドがそれぞれおよそ２０μｇの量で存在する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項８０】
薬学上許容される賦形剤、希釈剤または担体をさらに含む、請求項６６〜７９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８１】
アジュバントをさらに含む、請求項８０に記載の免疫原性組成物。
【請求項８２】
前記アジュバントがアルミニウム塩を含む、請求項８１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８３】
前記アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである、請求項８２に記載の免疫原性組成物。
【請求項８４】
３Ｄ−ＭＰＬをさらに含む、請求項８２または８３に記載の免疫原性組成物。
【請求項８５】
免疫原性組成物の調製方法であって、
（ｉ）少なくとも１つのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、
（ｉｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｌ１ポリペプチド内に挿入された、Ｌ２ポリペプチドのエピトープを含む少なくとも１つのペプチドを含むＨＰＶ Ｌ１ポリペプチドまたはその断片を含む少なくとも１つのキメラポリペプチドと、
（ｉｉｉ）薬学上許容される希釈剤または担体と、所望により、
（ｉｖ）アジュバントと、
合わせて、請求項８０〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を作製することを含む、前記方法。
【請求項８６】
ヒトに請求項５５〜５９または６６〜８４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、ヒトにおいてＨＰＶに対する抗体を誘導する方法。
【請求項８７】
ＨＰＶに対する抗体を誘導することがＨＰＶ感染または疾患を予防、改善または治療する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
ＨＰＶ感染または疾患の予防、改善または治療に使用するための、請求項５５〜５９または６６〜８４のいずれか１項に記載の組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５３０５０５（Ｐ２０１２−５３０５０５Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６７５０（Ｐ２０１２−５１６７５０）
【出願日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９０２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９７５２
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５９０２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４９７５２
【国際公開日】平成２２年１２月２９日（２０１０．１２．２９）
【出願人】（３０５０６０２７９）グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (169)
【Ｆターム（参考）】
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