新規フィコエリスリンおよびその利用
【課題】これまでに知られていない励起波長で蛍光を発するフィコエリスリンを提供すること。
【解決手段】次の性質（１）〜（３）、
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有する
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発す
る
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が９
５,０００±５,０００である
を有することを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリン。
【解決手段】次の性質（１）〜（３）、
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有する
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発す
る
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が９
５,０００±５,０００である
を有することを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規フィコエリスリンおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
海藻は、その生息する水深に応じてクロロフィル以外の補助的光合成色素を含有している。特に藍藻類、紅藻類等の海藻ではフィコエリスリン、フィコシアニン等のフィコビリプロテインが主である。
【０００３】
これらフィコビリプロテインは、色素とタンパク質とが共有結合した複合体であり、可視光線を吸収し、強い蛍光を発するという性質および色素と結合するタンパク質の種類によって蛍光色が異なる性質が知られている。
【０００４】
しかしながら、これまでフィコビリプロテインとしては、スピルリナ等の藍藻類の海藻、チノリモ、サンゴモ等の紅藻類の海藻由来のものが実用化されているものの、上記したように、フィコビリプロテインは色素と結合するタンパク質の種類によって励起波長や蛍光色が異なるため、多種のフィコビリプロテインが要求されてきている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って本発明は、これまでに知られていない励起波長で蛍光を発するフィコエリスリンを提供することをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、紅藻綱（Rhodophyceae） オゴノリ目（Gracilariales）オゴノリ科（Gracilariaceae）オゴノリ属（Gracilaria）の海藻からこれまでに知られていない励起波長で蛍光を発するフィコエリスリンが得られることを見出した。また、オゴノリ属の海藻から粉砕、攪拌、遠心分離、ろ過等の簡単な手段で上記フィコエリスリンを得る方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は次の性質（１）〜（３）、
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有する
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発す
る
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が９
５,０００±５,０００である
を有することを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンである。
【０００８】
また、本発明は上記フィコエリスリンを封入した透明の容器と、照明とを組み合わせてなることを特徴とする発光オブジェである。
【０００９】
更に、本発明は上記フィコエリスリンで標識した抗体である。
【００１０】
また更に、本発明は以下の工程（ａ）〜（ｂ）、
（ａ）オゴノリ属の海藻を粉砕した後、水と混合し、当該混合物を攪拌する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を遠心分離し、その上清を得る工程
を含むことを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンの抽出方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリン（以下、単に「フィコエリスリン」ということもある）は、これまでに知られていない励起波長で蛍光を発する新規の蛍光色素である。
【００１２】
このフィコエリスリンは、従来の蛍光色素と同様に、着色料、発光オブジェ、抗体等への標識等として利用できる他、フィコエリスリンの蛍光波長がクロロフィルの利用可能な波長であることを利用して植物の成長促進装置等に利用することができる。
【００１３】
更に、本発明のフィコエリスリンの抽出方法によれば、従来よりも簡便な方法で上記フィコエリスリンを得ることができる。特に、この抽出方法に用いる原料として海洋深層水で養殖されたオゴノリ属の海藻を用いることで、効率良く大量に上記フィコエリスリンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は実施例１で調製したサンプル１の吸収スペクトル（波長２１０〜３４０ｎｍ）を示す。
【図２】図２は実施例１で調製したサンプル１の吸収スペクトル（波長３４０〜９００ｎｍ）を示す。
【図３】図３は実施例１で調製したサンプル１の蛍光スペクトル（励起波長４９４ｎｍ）を示す。
【図４】図４は実施例１で調製したサンプル１の蛍光スペクトル（励起波長５３６ｎｍ）を示す。
【図５】図５は実施例２で得られたサンプル２のｐＨを水酸化ナトリウム溶液で調整した後、３１０ｎｍの紫外線を照射した際の外観を示す（図中、左から順に、未処理、サンプル２のｐＨを５、６、６.５、８、１１、１１および１１に調整したものである）
【図６】図６は実施例２で得られたサンプル２のｐＨを塩酸溶液で調整した後、３１０ｎｍの紫外線を照射した際の外観を示す（図中、左から順に、未処理、サンプル２のｐＨを５、４.５、４、４、３および２に調整したものである）
【図７】図７は実施例２で得られたサンプル２に各種試薬を添加した後、３１０ｎｍの紫外線を照射した際の外観を示す（図中、左から順に、未処理、サンプル２にＰＢＳ、０.０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０.０５％のＮＰ４０、０.１ｍＭの塩化ナトリウムを添加したものである。）。
【図８】図８はサンプル１を封入したガラス製の容器を水槽に入れ、更に、白色ＬＥＤで照明した時の外観を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンは、フィコエリスロビリンとタンパク質が共有結合したものであり、次の性質（１）〜（３）、好ましくは（１）〜（７）を有するものである。
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有し
、好ましくは４９６±２ｎｍ、５３９±３ｎｍおよび５６６±１ｎｍに吸収極
大波長を有する
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発し
、好ましくは４９６±２ｎｍおよび５３９±３ｎｍの励起波長で５７３±１ｎｍ
の蛍光を発する
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が９
５,０００±５,０００である
（４）ｐＨ５〜７で安定である
（５）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下で安定である。
（６）０.０５％のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（商品名：Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク製）、ＮＰ４０（ナカライテスク製））等の
界面活性剤存在下で安定である。
（７）０.０１ｍＭの塩酸、０.１ｍＭの水酸化ナトリウムまたは０.１Ｍ塩化ナトリウ
ム存在下で安定である。
【００１６】
上記フィコエリスリンは、オゴノリ属の海藻、好ましくはオゴノリ（Gracilaria tikvahiae）またはクビレオゴノリ（Gracilaria blodgettii）から得られるものである。この海藻は、天然のものでも養殖のものでもよいが、施肥をした通常の表層海水（表層水）または海洋深層水（水深２００Ｍ以深から取水された海水）で養殖したものが好ましく、特に海洋深層水で養殖したものが好ましい。施肥した表層水で海藻を養殖する場合には、その条件については特に制限されず、公知の海藻の養殖の条件を用いることができる。また、海洋深層水で海藻を養殖する場合には、その条件は、例えば、須藤ら（「平成１４年度補正 沖縄産学間共同研究推進事業『沖縄海洋深層水の生理効果の検証と機能性資源としての開発業務』成果報告書、平成１６年３月、沖縄県管理法人 財団法人南西地域産業活性化センター発行、７３−７９ページ）の文献等に記載の条件を用いることができる。
【００１７】
なお、上記海藻は施肥した表層水または海洋深層水で養殖すると、天然のものや表層水のみで養殖した海藻と比べて成長が早く、フィコエリスリンの量が多くなり、特に上記海藻を海洋深層水で養殖すると海藻の収量と比較してフィコエリスリンの量が多くなる。
【００１８】
上記海藻からフィコエリスリンを得る方法は、例えば、サンら（Sun L, et al., Protein Expr. and Purif. 2009 Apr;64(2):146-54.）、ジアンら（Jian-Feng Niu, et al., Protein Expr. and Purif. 49 (2006) 23-31 ）、ルーら（Lu-Ning Liu, et al., J. Biotechnol. 2005 Mar 2;116(1):91-100）、ベルメジョら（R. Bermejo Roman a, et al., J. of Biotechnol. 93 (2002) 73-85およびJ. Chromatogr. A. 2001 May 11;917(1-2):135-145）の文献等に記載の方法で行うことができるが、特に以下の工程（ａ）〜（ｂ）を含む工程で行うことが好ましい。
（ａ）オゴノリ属の海藻を粉砕した後、水と混合し、当該混合物を攪拌する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を遠心分離し、その上清を得る工程
【００１９】
より具体的に工程（ａ）は、オゴノリ属の海藻１５ｇ（湿重量）をミルサー等の粉砕機で粉砕した後、０.１５Ｌの水と混合し、さらにミルサーで５分間の条件で粉砕して水と海藻の混合物を得る。
【００２０】
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた混合物を、遠心分離機で１０,０００ｇの条件で遠心分離し、上清を得る。なお、フィコエリスリンの抽出原料として海洋深層水で養殖したオゴノリ属の海藻を原料とした場合には、この工程まででも十分な量のフィコエリスリンを得ることができる。
【００２１】
上記工程（ａ）〜（ｂ）の後には更にフィコエリスリンを精製するため工程（ｃ）を行ってもよい。
（ｃ）工程（ｂ）で得られた上清に硫酸アンモニウムを添加し、沈殿物を回収後、再溶
解によりフィコエリスリンを得る工程
【００２２】
この工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られた上清を撹拌しながら、硫酸アンモニウムを徐々に添加してその濃度を４０飽和％にし、さらに１時間攪拌を続ける。次に、この混合液を遠心分離機で１０,０００ｇ、２０分間の条件で遠心分離し、沈殿物を得る。この沈殿物を少量の蒸留水で再溶解し、蒸留水で透析することで、沈殿物中の硫酸アンモニウムを除く。この透析後の再溶解液は、フィコエリスリンを豊富に含有するものであり、そのまま各種用途に使用できるものであるが、更に、クロマトグラフィー等の公知の手段により精製してもよい。
【００２３】
斯くして得られる本発明のフィコエリスリンは、従来の蛍光色素と同様に、着色料、発光オブジェ、抗体等への標識等として利用できる他、フィコエリスリンの蛍光波長がクロロフィルの利用可能な波長であることを利用して植物の成長促進装置等に利用することができる。
【００２４】
具体的に本発明のフィコエリスリンを着色料として利用する場合には、例えば、清涼飲料、炭酸飲料等の飲料に本発明のフィコエリスリンを１〜５質量％程度含有させればよい。この飲料は、白色ＬＥＤ等の照明の元ではオレンジ色の蛍光色を有する飲料となり、照明を落とした室内で、テーブルに設置した白色ＬＥＤにより、グラスに入れた飲料が蛍光を発する等の楽しみ方ができる。
【００２５】
また、本発明のフィコエリスリンを発光オブジェとして利用する場合には、フィコエリスリンの水溶液を封入した透明の容器と、照明とを組み合わせればよい。この発光オブジェに用いられる透明の容器とは、プラスチック、ガラス等で作製されたものが挙げられる。また、この透明の容器に封入されるフィコエリスリンの水溶液におけるフィコエリスリンの濃度は特に限定されないが、５〜２０質量％程度が好ましい。更に、照明としては、白熱灯、蛍光灯、ブラックライト、白色ＬＥＤ、有機ＥＬ等が挙げられるが、特にフィコエリスリンの励起波長に近いことから白色ＬＥＤが好ましい。
【００２６】
上記発光オブジェは、これに封入されているフィコエリスリンにより光の波長を光合成の主体であるクロロフィルが利用しやすい波長域に変換することができる。そのためこの発光オブジェは、植物の光合成の効率を上げることができ、その生長を促進することができる。将来的には、宇宙での食用野菜の栽培への、放射線のエネルギー利用が考えられる。宇宙には大量の放射線が飛び交っている。放射線をフィコエリスリンに当てて、クロロフィルが利用可能な波長の蛍光に転換することで、あえて人工光源を用いる必要のない食用野菜の栽培が可能となる。また、人体に悪影響のある宇宙線を人体に無害な人工照明に変換するのに利用可能である。
【００２７】
更に、本発明のフィコエリスリンを抗体への標識として利用する場合には、ロニックら（Kronick M. N., et al., Clinical chemistry 29: 1582-1586(1983)）およびオイブら（Oi V. T., et al., Stryer L., Journal of Cell Biology 93: 981-986(1982)）の文献等に記載の方法に基づいてフィコエリスリンを抗体に結合させればよい。このフィコエリスリンで標識した抗体は、励起光条件下で抗原をオレンジ色の蛍光により識別可能となる。そのためこの標識抗体は細胞レベルやインビトロ系での特定分子のイメージング解析に応用できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、この実施例により本発明は何ら制約されるものではない。
【００２９】
参 考 例 １
沖縄県産のクビレオゴノリの海洋深層水による養殖：
容量１トンの円形キャンパス水槽（ＦＲＰ製）に、沖縄県産のクビレオゴノリ（Gracilaria blodgettii）の母藻（クビレオゴノリの成体の先端をちぎって５ｃｍ程度にしたもの）１ｋｇを入れ、久米島の沖合い２,３００ｍ、水深６１２ｍから取水した約１０℃の海洋深層水を１９.９±１.２℃にした後、１日４回の割合で換水し、３４日間養殖した。養殖後に得られたクビレオゴノリの量は５.２５ｋｇであった。また、クビレオゴノリの生体は概ね２４ｃｍ程度の大きさであった。このクビレオゴノリは天然物および海で養殖したものと比べて生育が盛んであり、赤みも強かった。
【００３０】
参 考 例 ２
フロリダ原産のオゴノリの海洋深層水による養殖：
沖縄県産のクビレオゴノリの母藻１ｋｇをフロリダ原産のオゴノリ（Gracilaria tikvahiae）の母藻（オゴノリの成体の先端をちぎって５ｃｍ程度にしたもの）１ｋｇに代える以外は参考例１と同様にして養殖した。養殖後に得られたオゴノリ量は ２５.５５ｋｇであった。また、オゴノリの生体は概ね３０ｃｍ程度の大きさであった。このオゴノリは天然物および海で養殖したものと比べて生育が盛んであり、赤みも強かった。
【００３１】
参 考 例 ３
神奈川県産のオゴノリの海洋深層水による養殖：
沖縄県産のクビレオゴノリの母藻１ｋｇを神奈川県産のオゴノリ（種類未同定）の母藻（オゴノリの成体の先端をちぎって５ｃｍ程度にしたもの）１ｋｇに代える以外は参考例１と同様にして養殖した。養殖後に得られたオゴノリの量は５.２５ｋｇであった。また、オゴノリの生体は概ね２４ｃｍ程度の大きさであった。このオゴノリは天然物および海で養殖したものと比べて生育が盛んであり、赤みも強かった。
【００３２】
実 施 例 １
沖縄県産のクビレオゴノリからの蛍光物質の抽出：
参考例１で得られた沖縄県産のクビレオゴノリの１５ｇ（湿重量）に、蒸留水を１５０ｍｌ添加し、ミルサー（ミルサー７００Ｇ：岩谷産業製）で５分間粉砕した。その後粉砕物を遠心分離機（ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｅ：日立製作所製）で１０,０００ｇ、２０分の条件で遠心し、上清を回収した（約１５０ｍｌ）。この上清は濃いピンク色であり、フィコエリスリンの存在が示唆された。
【００３３】
次にこの上清の５０ｍｌをビーカーに入れ、スターラー（ＳＲ２００：ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）に載せて撹拌しながら硫酸アンモニウムを４０飽和％まで徐々に添加し、さらに１時間撹拌を続けた。その後、この混合液を遠心分離機で１０,０００ｇ、２０分の条件で遠心し、沈殿物を得た。この沈殿物を８ｍｌの蒸留水に再溶解し、透析チューブに封入後、含有する硫酸アンモニウムを除くために２Ｌの蒸留水中で５時間透析した。透析終了後、封入液を回収し、そのタンパク量をブラッドフォード（Bradford）法で測定したところ、９.７ｍｇであった。以下、この液を１０倍に希釈したものをサンプル１として以下の測定を行った。
【００３４】
（吸収スペクトル測定）
サンプル１の吸収スペクトルの測定を分光光度計（ＵＶ１６００：島津製作所製）を用い波長２１０〜９００ｎｍで行った。その結果を図１および図２に示した。また、この測定においてピーク検出された波長と吸光度を表１に示した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
サンプル１の吸収スペクトルは、２７７ｎｍ付近にはタンパクに由来するなだらかな吸収を有することおよび４９５ｎｍに吸収極大を有することが分かった。
【００３７】
（蛍光スペクトル測定）
サンプル１の蛍光スペクトルの測定を分光蛍光光度計（ＲＦ−１５００：島津製作所製）用い、励起波長４９４ｎｍまたは５７３ｎｍで行った。その結果を図３および図４に示した。
【００３８】
サンプル１は４９４ｎｍおよび５３９ｎｍの励起波長で５７３ｎｍの蛍光を発することが分かった。
【００３９】
（分子量測定）
サンプル１中に含まれるタンパクの分子量をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した。その結果、タンパクの分子量は約９５,０００±５,０００であった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、サンプル１にはほぼ単一のタンパクしか含まれていないことが分かった。
【００４０】
以上の測定結果から、サンプル１中に含まれるタンパクはフィコエリスリンと同定された。
【００４１】
実 施 例 ２
フロリダ原産のオゴノリからの蛍光物質の抽出：
参考例２で養殖して得られたフロリダ原産のオゴノリについて、実施例１と同様にしてろ液を調製した。このろ液に含まれるタンパク量は１０.３ｍｇであった。以下このろ液を３０倍に希釈したものをサンプル２とし、これについて実施例１と同様にして吸光スペクトル、蛍光スペクトルおよび分子量の測定を行った。その結果を以下に示した。
【００４２】
（吸光スペクトル測定）
サンプル２の吸光スペクトル測定においてピーク検出された波長と吸光度を表２に示した。なお、サンプル２の吸収スペクトルの形状はサンプル１とほぼ同じであり、２７８ｎｍ付近にはタンパクに由来するなだらかな吸収を有することおよび４９８ｎｍに吸収極大を有することが分かった。
【００４３】
【表２】
【００４４】
（蛍光スペクトル測定）
サンプル２は４９８ｎｍおよび５４２ｎｍの励起波長で５７２ｎｍの蛍光を発することが分かった。
【００４５】
（分子量測定）
サンプル２中に含まれるタンパクの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したところ、分子量は約９５,０００±５,０００であり、ほぼ沖縄産クビレオゴノリ由来のフィコエリスリンと同程度であったが、やや大きい分子量を示した。
【００４６】
以上の結果から、サンプル２中に含まれるタンパクはフィコエリスリンと同定された。
【００４７】
実 施 例 ３
神奈川県産のオゴノリからの蛍光物質の抽出：
参考例３で養殖して得られた神奈川県産のオゴノリについて、実施例１と同様にしてろ液を調製した。このろ液に含まれるタンパク量は２３.５ｍｇであった。以下このろ液を３０倍に希釈したものをサンプル３とし、これについて実施例１と同様にして吸光スペクトル、蛍光スペクトルおよび分子量の測定を行った。その結果を以下に示した。
【００４８】
（吸光スペクトル測定）
サンプル３の吸光スペクトル測定においてピーク検出された波長と吸光度を表３に示した。なお、サンプル３の吸収スペクトルの形状はサンプル１とほぼ同じであり、２７８ｎｍ付近にはタンパクに由来するなだらかな吸収を有することおよび４９４ｎｍに吸収極大を有することが分かった。
【００４９】
【表３】
【００５０】
（蛍光スペクトル測定）
サンプル３は４９４ｎｍおよび５３９ｎｍの励起波長で５７３ｎｍの蛍光を発することが分かった。
【００５１】
＜分子量＞
サンプル３中に含まれるタンパクの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したところ、分子量は約約９５,０００±５,０００であった。
【００５２】
以上の結果から、サンプル３中に含まれるタンパクはフィコエリスリンと同定された。
【００５３】
実 施 例 ４
フィコエリスリンの安定性の検討：
実施例２で得られたサンプル２中に含まれるフィコエリスリンの各種物質に対する安定性を以下の方法で検討した。
【００５４】
（アルカリ条件下での安定性）
実施例２で得られたサンプル２の１ｍｌを容量が１.５ｍｌのマイクロチューブ入れ、これに水酸化ナトリウム溶液を、最終濃度０.０１ｍＭ、０.１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭおよび１００ｍＭになるように添加した。それらの液のｐＨは、５、６、６.５、８、１１、１１および１１であった。次に、これに紫外線（波長：３１０ｎｍ）を照射し、蛍光の度合いを観察した。紫外線を照射した結果を図５に示した。
【００５５】
この結果より、サンプル２中に含まれるフィコエリスリンはｐＨ５〜６.５で安定であり、また、ｐＨ８以上では蛍光を発しないことが分かった。
【００５６】
（酸性条件下での安定性）
実施例２で得られたサンプル２の１ｍｌを容量が１.５ｍｌのマイクロチューブ入れ、これに塩酸溶液を、最終濃度０.０１ｍＭ、０.１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭおよび１００ｍＭになるように添加した。それらの液のｐＨは、５、４.５、４、４、３、２であった。次に、これに紫外線（波長：３１０ｎｍ）を照射し、蛍光の度合いを観察した。紫外線を照射した結果を図６に示した。
【００５７】
この結果より、サンプル２中に含まれるフィコエリスリンはｐＨ５で安定であり、ｐＨ４.５以下では蛍光を発しないことが分かった。
【００５８】
（各種試薬存在下での安定性）
実施例２で得られたサンプル２の０.５ｍｌを容量が１．５ｍｌのマイクロチューブ入れ、これに１０倍濃度のＰＢＳ、１０％のＴｒｉｎｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク製）、１０％のＮＰ−４０（ナカライテスク製）および５Ｍの塩化ナトリウム溶液を、それぞれ最終濃度が１倍（１００％）、０.０５％、０.０５％および０.１Ｍになるように添加し、これに紫外線（波長：３１０ｎｍ）を照射した。その結果を図７に示した。
【００５９】
この結果より、サンプル２中に含まれるフィコエリスリンは１００％ＰＢＳ、０.０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０.０５％のＮＰ４０および０.１Ｍの塩化ナトリウムの何れの条件下でも安定であることが分かった。また、ＰＢＳにおける沈殿物の量が少なかったことから、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００やＮＰ−４０といった非イオン性界面活性剤よりも、フィコエリスリンを可溶化しやすいのは塩化ナトリウム含有のリン酸緩衝液であるＰＢＳであることが分かった。
【００６０】
実 施 例 ５
発光オブジェの作製：
実施例１で得られたサンプル１の５０ｍｌを、容量１００ｍｌのガラス製の容器に封入した。この容器を水槽に入れ、蛍光灯と組み合わせて発光オブジェを作製した。発光オブジェの容器を蛍光灯で照明したところ、容器中のサンプル１はオレンジ色の蛍光を発した。また、照明を蛍光灯から白色ＬＥＤに代えたところサンプル１はより強いオレンジ色の蛍光を発した（図８）。更に、この発光オブジェは３ヶ月以上経った時点でも白色ＬＥＤでオレンジ色の蛍光を発する程度の安定性を示した。また更に、このサンプル１から発せられるオレンジ色は、植物のクロロフィルが利用できる波長の光のため、水槽内の水草の成長を促進し得る。
【００６１】
参 考 例 ４
沖縄県産のクビレオゴノリの表層水による養殖：
容量１０トンの円形キャンパス水槽（ＦＲＰ製）に、沖縄県産のクビレオゴノリ（Gracilaria blodgettii）の母藻（クビレオゴノリの成体の先端をちぎって５ｃｍ程度にしたもの）２０ｋｇを入れ、海岸より２,３００ｍ沖の水深１５ｍから取水した表層水を１日４回の割合で換水し、３４日間養殖した。養殖後に得られたクビレオゴノリの量は３７.７ｋｇであった。また、クビレオゴノリの生体は概ね１５〜２０ｃｍ程度の大きさであった。このクビレオゴノリは海洋深層水で養殖したものと比べて生育が遅く藻体の色も薄かった。
【００６２】
参 考 例 ５
沖縄県産のクビレオゴノリの施肥した表層水による養殖：
リン酸アンモウム（セントラルリン安１１４６：セントラル化成）１ｋｇと塩化カリウム０.５ｋｇを水道水１０ｌに混合したものを肥料とし、これを朝と夕刻に１回５００ｍｌの条件で表層水に施肥を行う以外は、参考例４と同様にして沖縄県産のクビレオゴノリを養殖した。養殖後に得られたクビレオゴノリの量は７７.８ｋｇであった。また、クビレオゴノリの生体は概ね２５ｃｍ程度の大きさであった。このクビレオゴノリは天然物および海で養殖したものと比べて生育が盛んであり、赤みも強かった。
【００６３】
実 施 例 ６
各養殖で得られた沖縄県産のクビレオゴノリに含まれるフィコエリスリン量
の測定：
参考例１（海洋深層水で養殖）、参考例４（表層水で養殖）および参考例５（施肥した表層水で養殖）で得られたクビレオゴノリから実施例１と同様にして上清を得た。その上清に含まれるフィコエリスリン量を平田ら（平田ら、日本食品工業学会誌、２５巻、ｐ５８４−５８６、１９７８年）の文献に記載の吸光光度法で測定した。その結果を以下に示した。
【００６４】
【表４】
【００６５】
表４より、どのような条件で養殖をしたクビレオゴノリにもフィコエリスリンが含まれていることが分かった。また、クビレオゴノリは、施肥した表層水または海洋深層水で養殖すると、表層水のみで養殖したものと比べて成長が早く、フィコエリスリンの量が多かった。また、クビレオゴノリの養殖後の収量に対するフィコエリスリンの量は、海洋深層水で養殖したものが一番多かった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のフィコエリスリンは、これまでに知られていない励起波長でオレンジ色の蛍光を発するものである。そしてこのフィコエリスリンは、従来公知の蛍光物質同様に、抗体等への標識、光の波長変換等、飲料等の着色料等の用途に利用できる。
以 上
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規フィコエリスリンおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
海藻は、その生息する水深に応じてクロロフィル以外の補助的光合成色素を含有している。特に藍藻類、紅藻類等の海藻ではフィコエリスリン、フィコシアニン等のフィコビリプロテインが主である。
【０００３】
これらフィコビリプロテインは、色素とタンパク質とが共有結合した複合体であり、可視光線を吸収し、強い蛍光を発するという性質および色素と結合するタンパク質の種類によって蛍光色が異なる性質が知られている。
【０００４】
しかしながら、これまでフィコビリプロテインとしては、スピルリナ等の藍藻類の海藻、チノリモ、サンゴモ等の紅藻類の海藻由来のものが実用化されているものの、上記したように、フィコビリプロテインは色素と結合するタンパク質の種類によって励起波長や蛍光色が異なるため、多種のフィコビリプロテインが要求されてきている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って本発明は、これまでに知られていない励起波長で蛍光を発するフィコエリスリンを提供することをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、紅藻綱（Rhodophyceae） オゴノリ目（Gracilariales）オゴノリ科（Gracilariaceae）オゴノリ属（Gracilaria）の海藻からこれまでに知られていない励起波長で蛍光を発するフィコエリスリンが得られることを見出した。また、オゴノリ属の海藻から粉砕、攪拌、遠心分離、ろ過等の簡単な手段で上記フィコエリスリンを得る方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は次の性質（１）〜（３）、
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有する
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発す
る
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が９
５,０００±５,０００である
を有することを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンである。
【０００８】
また、本発明は上記フィコエリスリンを封入した透明の容器と、照明とを組み合わせてなることを特徴とする発光オブジェである。
【０００９】
更に、本発明は上記フィコエリスリンで標識した抗体である。
【００１０】
また更に、本発明は以下の工程（ａ）〜（ｂ）、
（ａ）オゴノリ属の海藻を粉砕した後、水と混合し、当該混合物を攪拌する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を遠心分離し、その上清を得る工程
を含むことを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンの抽出方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリン（以下、単に「フィコエリスリン」ということもある）は、これまでに知られていない励起波長で蛍光を発する新規の蛍光色素である。
【００１２】
このフィコエリスリンは、従来の蛍光色素と同様に、着色料、発光オブジェ、抗体等への標識等として利用できる他、フィコエリスリンの蛍光波長がクロロフィルの利用可能な波長であることを利用して植物の成長促進装置等に利用することができる。
【００１３】
更に、本発明のフィコエリスリンの抽出方法によれば、従来よりも簡便な方法で上記フィコエリスリンを得ることができる。特に、この抽出方法に用いる原料として海洋深層水で養殖されたオゴノリ属の海藻を用いることで、効率良く大量に上記フィコエリスリンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は実施例１で調製したサンプル１の吸収スペクトル（波長２１０〜３４０ｎｍ）を示す。
【図２】図２は実施例１で調製したサンプル１の吸収スペクトル（波長３４０〜９００ｎｍ）を示す。
【図３】図３は実施例１で調製したサンプル１の蛍光スペクトル（励起波長４９４ｎｍ）を示す。
【図４】図４は実施例１で調製したサンプル１の蛍光スペクトル（励起波長５３６ｎｍ）を示す。
【図５】図５は実施例２で得られたサンプル２のｐＨを水酸化ナトリウム溶液で調整した後、３１０ｎｍの紫外線を照射した際の外観を示す（図中、左から順に、未処理、サンプル２のｐＨを５、６、６.５、８、１１、１１および１１に調整したものである）
【図６】図６は実施例２で得られたサンプル２のｐＨを塩酸溶液で調整した後、３１０ｎｍの紫外線を照射した際の外観を示す（図中、左から順に、未処理、サンプル２のｐＨを５、４.５、４、４、３および２に調整したものである）
【図７】図７は実施例２で得られたサンプル２に各種試薬を添加した後、３１０ｎｍの紫外線を照射した際の外観を示す（図中、左から順に、未処理、サンプル２にＰＢＳ、０.０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０.０５％のＮＰ４０、０.１ｍＭの塩化ナトリウムを添加したものである。）。
【図８】図８はサンプル１を封入したガラス製の容器を水槽に入れ、更に、白色ＬＥＤで照明した時の外観を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンは、フィコエリスロビリンとタンパク質が共有結合したものであり、次の性質（１）〜（３）、好ましくは（１）〜（７）を有するものである。
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有し
、好ましくは４９６±２ｎｍ、５３９±３ｎｍおよび５６６±１ｎｍに吸収極
大波長を有する
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発し
、好ましくは４９６±２ｎｍおよび５３９±３ｎｍの励起波長で５７３±１ｎｍ
の蛍光を発する
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が９
５,０００±５,０００である
（４）ｐＨ５〜７で安定である
（５）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下で安定である。
（６）０.０５％のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（商品名：Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク製）、ＮＰ４０（ナカライテスク製））等の
界面活性剤存在下で安定である。
（７）０.０１ｍＭの塩酸、０.１ｍＭの水酸化ナトリウムまたは０.１Ｍ塩化ナトリウ
ム存在下で安定である。
【００１６】
上記フィコエリスリンは、オゴノリ属の海藻、好ましくはオゴノリ（Gracilaria tikvahiae）またはクビレオゴノリ（Gracilaria blodgettii）から得られるものである。この海藻は、天然のものでも養殖のものでもよいが、施肥をした通常の表層海水（表層水）または海洋深層水（水深２００Ｍ以深から取水された海水）で養殖したものが好ましく、特に海洋深層水で養殖したものが好ましい。施肥した表層水で海藻を養殖する場合には、その条件については特に制限されず、公知の海藻の養殖の条件を用いることができる。また、海洋深層水で海藻を養殖する場合には、その条件は、例えば、須藤ら（「平成１４年度補正 沖縄産学間共同研究推進事業『沖縄海洋深層水の生理効果の検証と機能性資源としての開発業務』成果報告書、平成１６年３月、沖縄県管理法人 財団法人南西地域産業活性化センター発行、７３−７９ページ）の文献等に記載の条件を用いることができる。
【００１７】
なお、上記海藻は施肥した表層水または海洋深層水で養殖すると、天然のものや表層水のみで養殖した海藻と比べて成長が早く、フィコエリスリンの量が多くなり、特に上記海藻を海洋深層水で養殖すると海藻の収量と比較してフィコエリスリンの量が多くなる。
【００１８】
上記海藻からフィコエリスリンを得る方法は、例えば、サンら（Sun L, et al., Protein Expr. and Purif. 2009 Apr;64(2):146-54.）、ジアンら（Jian-Feng Niu, et al., Protein Expr. and Purif. 49 (2006) 23-31 ）、ルーら（Lu-Ning Liu, et al., J. Biotechnol. 2005 Mar 2;116(1):91-100）、ベルメジョら（R. Bermejo Roman a, et al., J. of Biotechnol. 93 (2002) 73-85およびJ. Chromatogr. A. 2001 May 11;917(1-2):135-145）の文献等に記載の方法で行うことができるが、特に以下の工程（ａ）〜（ｂ）を含む工程で行うことが好ましい。
（ａ）オゴノリ属の海藻を粉砕した後、水と混合し、当該混合物を攪拌する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を遠心分離し、その上清を得る工程
【００１９】
より具体的に工程（ａ）は、オゴノリ属の海藻１５ｇ（湿重量）をミルサー等の粉砕機で粉砕した後、０.１５Ｌの水と混合し、さらにミルサーで５分間の条件で粉砕して水と海藻の混合物を得る。
【００２０】
工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた混合物を、遠心分離機で１０,０００ｇの条件で遠心分離し、上清を得る。なお、フィコエリスリンの抽出原料として海洋深層水で養殖したオゴノリ属の海藻を原料とした場合には、この工程まででも十分な量のフィコエリスリンを得ることができる。
【００２１】
上記工程（ａ）〜（ｂ）の後には更にフィコエリスリンを精製するため工程（ｃ）を行ってもよい。
（ｃ）工程（ｂ）で得られた上清に硫酸アンモニウムを添加し、沈殿物を回収後、再溶
解によりフィコエリスリンを得る工程
【００２２】
この工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られた上清を撹拌しながら、硫酸アンモニウムを徐々に添加してその濃度を４０飽和％にし、さらに１時間攪拌を続ける。次に、この混合液を遠心分離機で１０,０００ｇ、２０分間の条件で遠心分離し、沈殿物を得る。この沈殿物を少量の蒸留水で再溶解し、蒸留水で透析することで、沈殿物中の硫酸アンモニウムを除く。この透析後の再溶解液は、フィコエリスリンを豊富に含有するものであり、そのまま各種用途に使用できるものであるが、更に、クロマトグラフィー等の公知の手段により精製してもよい。
【００２３】
斯くして得られる本発明のフィコエリスリンは、従来の蛍光色素と同様に、着色料、発光オブジェ、抗体等への標識等として利用できる他、フィコエリスリンの蛍光波長がクロロフィルの利用可能な波長であることを利用して植物の成長促進装置等に利用することができる。
【００２４】
具体的に本発明のフィコエリスリンを着色料として利用する場合には、例えば、清涼飲料、炭酸飲料等の飲料に本発明のフィコエリスリンを１〜５質量％程度含有させればよい。この飲料は、白色ＬＥＤ等の照明の元ではオレンジ色の蛍光色を有する飲料となり、照明を落とした室内で、テーブルに設置した白色ＬＥＤにより、グラスに入れた飲料が蛍光を発する等の楽しみ方ができる。
【００２５】
また、本発明のフィコエリスリンを発光オブジェとして利用する場合には、フィコエリスリンの水溶液を封入した透明の容器と、照明とを組み合わせればよい。この発光オブジェに用いられる透明の容器とは、プラスチック、ガラス等で作製されたものが挙げられる。また、この透明の容器に封入されるフィコエリスリンの水溶液におけるフィコエリスリンの濃度は特に限定されないが、５〜２０質量％程度が好ましい。更に、照明としては、白熱灯、蛍光灯、ブラックライト、白色ＬＥＤ、有機ＥＬ等が挙げられるが、特にフィコエリスリンの励起波長に近いことから白色ＬＥＤが好ましい。
【００２６】
上記発光オブジェは、これに封入されているフィコエリスリンにより光の波長を光合成の主体であるクロロフィルが利用しやすい波長域に変換することができる。そのためこの発光オブジェは、植物の光合成の効率を上げることができ、その生長を促進することができる。将来的には、宇宙での食用野菜の栽培への、放射線のエネルギー利用が考えられる。宇宙には大量の放射線が飛び交っている。放射線をフィコエリスリンに当てて、クロロフィルが利用可能な波長の蛍光に転換することで、あえて人工光源を用いる必要のない食用野菜の栽培が可能となる。また、人体に悪影響のある宇宙線を人体に無害な人工照明に変換するのに利用可能である。
【００２７】
更に、本発明のフィコエリスリンを抗体への標識として利用する場合には、ロニックら（Kronick M. N., et al., Clinical chemistry 29: 1582-1586(1983)）およびオイブら（Oi V. T., et al., Stryer L., Journal of Cell Biology 93: 981-986(1982)）の文献等に記載の方法に基づいてフィコエリスリンを抗体に結合させればよい。このフィコエリスリンで標識した抗体は、励起光条件下で抗原をオレンジ色の蛍光により識別可能となる。そのためこの標識抗体は細胞レベルやインビトロ系での特定分子のイメージング解析に応用できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、この実施例により本発明は何ら制約されるものではない。
【００２９】
参 考 例 １
沖縄県産のクビレオゴノリの海洋深層水による養殖：
容量１トンの円形キャンパス水槽（ＦＲＰ製）に、沖縄県産のクビレオゴノリ（Gracilaria blodgettii）の母藻（クビレオゴノリの成体の先端をちぎって５ｃｍ程度にしたもの）１ｋｇを入れ、久米島の沖合い２,３００ｍ、水深６１２ｍから取水した約１０℃の海洋深層水を１９.９±１.２℃にした後、１日４回の割合で換水し、３４日間養殖した。養殖後に得られたクビレオゴノリの量は５.２５ｋｇであった。また、クビレオゴノリの生体は概ね２４ｃｍ程度の大きさであった。このクビレオゴノリは天然物および海で養殖したものと比べて生育が盛んであり、赤みも強かった。
【００３０】
参 考 例 ２
フロリダ原産のオゴノリの海洋深層水による養殖：
沖縄県産のクビレオゴノリの母藻１ｋｇをフロリダ原産のオゴノリ（Gracilaria tikvahiae）の母藻（オゴノリの成体の先端をちぎって５ｃｍ程度にしたもの）１ｋｇに代える以外は参考例１と同様にして養殖した。養殖後に得られたオゴノリ量は ２５.５５ｋｇであった。また、オゴノリの生体は概ね３０ｃｍ程度の大きさであった。このオゴノリは天然物および海で養殖したものと比べて生育が盛んであり、赤みも強かった。
【００３１】
参 考 例 ３
神奈川県産のオゴノリの海洋深層水による養殖：
沖縄県産のクビレオゴノリの母藻１ｋｇを神奈川県産のオゴノリ（種類未同定）の母藻（オゴノリの成体の先端をちぎって５ｃｍ程度にしたもの）１ｋｇに代える以外は参考例１と同様にして養殖した。養殖後に得られたオゴノリの量は５.２５ｋｇであった。また、オゴノリの生体は概ね２４ｃｍ程度の大きさであった。このオゴノリは天然物および海で養殖したものと比べて生育が盛んであり、赤みも強かった。
【００３２】
実 施 例 １
沖縄県産のクビレオゴノリからの蛍光物質の抽出：
参考例１で得られた沖縄県産のクビレオゴノリの１５ｇ（湿重量）に、蒸留水を１５０ｍｌ添加し、ミルサー（ミルサー７００Ｇ：岩谷産業製）で５分間粉砕した。その後粉砕物を遠心分離機（ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｅ：日立製作所製）で１０,０００ｇ、２０分の条件で遠心し、上清を回収した（約１５０ｍｌ）。この上清は濃いピンク色であり、フィコエリスリンの存在が示唆された。
【００３３】
次にこの上清の５０ｍｌをビーカーに入れ、スターラー（ＳＲ２００：ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）に載せて撹拌しながら硫酸アンモニウムを４０飽和％まで徐々に添加し、さらに１時間撹拌を続けた。その後、この混合液を遠心分離機で１０,０００ｇ、２０分の条件で遠心し、沈殿物を得た。この沈殿物を８ｍｌの蒸留水に再溶解し、透析チューブに封入後、含有する硫酸アンモニウムを除くために２Ｌの蒸留水中で５時間透析した。透析終了後、封入液を回収し、そのタンパク量をブラッドフォード（Bradford）法で測定したところ、９.７ｍｇであった。以下、この液を１０倍に希釈したものをサンプル１として以下の測定を行った。
【００３４】
（吸収スペクトル測定）
サンプル１の吸収スペクトルの測定を分光光度計（ＵＶ１６００：島津製作所製）を用い波長２１０〜９００ｎｍで行った。その結果を図１および図２に示した。また、この測定においてピーク検出された波長と吸光度を表１に示した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
サンプル１の吸収スペクトルは、２７７ｎｍ付近にはタンパクに由来するなだらかな吸収を有することおよび４９５ｎｍに吸収極大を有することが分かった。
【００３７】
（蛍光スペクトル測定）
サンプル１の蛍光スペクトルの測定を分光蛍光光度計（ＲＦ−１５００：島津製作所製）用い、励起波長４９４ｎｍまたは５７３ｎｍで行った。その結果を図３および図４に示した。
【００３８】
サンプル１は４９４ｎｍおよび５３９ｎｍの励起波長で５７３ｎｍの蛍光を発することが分かった。
【００３９】
（分子量測定）
サンプル１中に含まれるタンパクの分子量をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した。その結果、タンパクの分子量は約９５,０００±５,０００であった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果より、サンプル１にはほぼ単一のタンパクしか含まれていないことが分かった。
【００４０】
以上の測定結果から、サンプル１中に含まれるタンパクはフィコエリスリンと同定された。
【００４１】
実 施 例 ２
フロリダ原産のオゴノリからの蛍光物質の抽出：
参考例２で養殖して得られたフロリダ原産のオゴノリについて、実施例１と同様にしてろ液を調製した。このろ液に含まれるタンパク量は１０.３ｍｇであった。以下このろ液を３０倍に希釈したものをサンプル２とし、これについて実施例１と同様にして吸光スペクトル、蛍光スペクトルおよび分子量の測定を行った。その結果を以下に示した。
【００４２】
（吸光スペクトル測定）
サンプル２の吸光スペクトル測定においてピーク検出された波長と吸光度を表２に示した。なお、サンプル２の吸収スペクトルの形状はサンプル１とほぼ同じであり、２７８ｎｍ付近にはタンパクに由来するなだらかな吸収を有することおよび４９８ｎｍに吸収極大を有することが分かった。
【００４３】
【表２】
【００４４】
（蛍光スペクトル測定）
サンプル２は４９８ｎｍおよび５４２ｎｍの励起波長で５７２ｎｍの蛍光を発することが分かった。
【００４５】
（分子量測定）
サンプル２中に含まれるタンパクの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したところ、分子量は約９５,０００±５,０００であり、ほぼ沖縄産クビレオゴノリ由来のフィコエリスリンと同程度であったが、やや大きい分子量を示した。
【００４６】
以上の結果から、サンプル２中に含まれるタンパクはフィコエリスリンと同定された。
【００４７】
実 施 例 ３
神奈川県産のオゴノリからの蛍光物質の抽出：
参考例３で養殖して得られた神奈川県産のオゴノリについて、実施例１と同様にしてろ液を調製した。このろ液に含まれるタンパク量は２３.５ｍｇであった。以下このろ液を３０倍に希釈したものをサンプル３とし、これについて実施例１と同様にして吸光スペクトル、蛍光スペクトルおよび分子量の測定を行った。その結果を以下に示した。
【００４８】
（吸光スペクトル測定）
サンプル３の吸光スペクトル測定においてピーク検出された波長と吸光度を表３に示した。なお、サンプル３の吸収スペクトルの形状はサンプル１とほぼ同じであり、２７８ｎｍ付近にはタンパクに由来するなだらかな吸収を有することおよび４９４ｎｍに吸収極大を有することが分かった。
【００４９】
【表３】
【００５０】
（蛍光スペクトル測定）
サンプル３は４９４ｎｍおよび５３９ｎｍの励起波長で５７３ｎｍの蛍光を発することが分かった。
【００５１】
＜分子量＞
サンプル３中に含まれるタンパクの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したところ、分子量は約約９５,０００±５,０００であった。
【００５２】
以上の結果から、サンプル３中に含まれるタンパクはフィコエリスリンと同定された。
【００５３】
実 施 例 ４
フィコエリスリンの安定性の検討：
実施例２で得られたサンプル２中に含まれるフィコエリスリンの各種物質に対する安定性を以下の方法で検討した。
【００５４】
（アルカリ条件下での安定性）
実施例２で得られたサンプル２の１ｍｌを容量が１.５ｍｌのマイクロチューブ入れ、これに水酸化ナトリウム溶液を、最終濃度０.０１ｍＭ、０.１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭおよび１００ｍＭになるように添加した。それらの液のｐＨは、５、６、６.５、８、１１、１１および１１であった。次に、これに紫外線（波長：３１０ｎｍ）を照射し、蛍光の度合いを観察した。紫外線を照射した結果を図５に示した。
【００５５】
この結果より、サンプル２中に含まれるフィコエリスリンはｐＨ５〜６.５で安定であり、また、ｐＨ８以上では蛍光を発しないことが分かった。
【００５６】
（酸性条件下での安定性）
実施例２で得られたサンプル２の１ｍｌを容量が１.５ｍｌのマイクロチューブ入れ、これに塩酸溶液を、最終濃度０.０１ｍＭ、０.１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、３０ｍＭおよび１００ｍＭになるように添加した。それらの液のｐＨは、５、４.５、４、４、３、２であった。次に、これに紫外線（波長：３１０ｎｍ）を照射し、蛍光の度合いを観察した。紫外線を照射した結果を図６に示した。
【００５７】
この結果より、サンプル２中に含まれるフィコエリスリンはｐＨ５で安定であり、ｐＨ４.５以下では蛍光を発しないことが分かった。
【００５８】
（各種試薬存在下での安定性）
実施例２で得られたサンプル２の０.５ｍｌを容量が１．５ｍｌのマイクロチューブ入れ、これに１０倍濃度のＰＢＳ、１０％のＴｒｉｎｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク製）、１０％のＮＰ−４０（ナカライテスク製）および５Ｍの塩化ナトリウム溶液を、それぞれ最終濃度が１倍（１００％）、０.０５％、０.０５％および０.１Ｍになるように添加し、これに紫外線（波長：３１０ｎｍ）を照射した。その結果を図７に示した。
【００５９】
この結果より、サンプル２中に含まれるフィコエリスリンは１００％ＰＢＳ、０.０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０.０５％のＮＰ４０および０.１Ｍの塩化ナトリウムの何れの条件下でも安定であることが分かった。また、ＰＢＳにおける沈殿物の量が少なかったことから、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００やＮＰ−４０といった非イオン性界面活性剤よりも、フィコエリスリンを可溶化しやすいのは塩化ナトリウム含有のリン酸緩衝液であるＰＢＳであることが分かった。
【００６０】
実 施 例 ５
発光オブジェの作製：
実施例１で得られたサンプル１の５０ｍｌを、容量１００ｍｌのガラス製の容器に封入した。この容器を水槽に入れ、蛍光灯と組み合わせて発光オブジェを作製した。発光オブジェの容器を蛍光灯で照明したところ、容器中のサンプル１はオレンジ色の蛍光を発した。また、照明を蛍光灯から白色ＬＥＤに代えたところサンプル１はより強いオレンジ色の蛍光を発した（図８）。更に、この発光オブジェは３ヶ月以上経った時点でも白色ＬＥＤでオレンジ色の蛍光を発する程度の安定性を示した。また更に、このサンプル１から発せられるオレンジ色は、植物のクロロフィルが利用できる波長の光のため、水槽内の水草の成長を促進し得る。
【００６１】
参 考 例 ４
沖縄県産のクビレオゴノリの表層水による養殖：
容量１０トンの円形キャンパス水槽（ＦＲＰ製）に、沖縄県産のクビレオゴノリ（Gracilaria blodgettii）の母藻（クビレオゴノリの成体の先端をちぎって５ｃｍ程度にしたもの）２０ｋｇを入れ、海岸より２,３００ｍ沖の水深１５ｍから取水した表層水を１日４回の割合で換水し、３４日間養殖した。養殖後に得られたクビレオゴノリの量は３７.７ｋｇであった。また、クビレオゴノリの生体は概ね１５〜２０ｃｍ程度の大きさであった。このクビレオゴノリは海洋深層水で養殖したものと比べて生育が遅く藻体の色も薄かった。
【００６２】
参 考 例 ５
沖縄県産のクビレオゴノリの施肥した表層水による養殖：
リン酸アンモウム（セントラルリン安１１４６：セントラル化成）１ｋｇと塩化カリウム０.５ｋｇを水道水１０ｌに混合したものを肥料とし、これを朝と夕刻に１回５００ｍｌの条件で表層水に施肥を行う以外は、参考例４と同様にして沖縄県産のクビレオゴノリを養殖した。養殖後に得られたクビレオゴノリの量は７７.８ｋｇであった。また、クビレオゴノリの生体は概ね２５ｃｍ程度の大きさであった。このクビレオゴノリは天然物および海で養殖したものと比べて生育が盛んであり、赤みも強かった。
【００６３】
実 施 例 ６
各養殖で得られた沖縄県産のクビレオゴノリに含まれるフィコエリスリン量
の測定：
参考例１（海洋深層水で養殖）、参考例４（表層水で養殖）および参考例５（施肥した表層水で養殖）で得られたクビレオゴノリから実施例１と同様にして上清を得た。その上清に含まれるフィコエリスリン量を平田ら（平田ら、日本食品工業学会誌、２５巻、ｐ５８４−５８６、１９７８年）の文献に記載の吸光光度法で測定した。その結果を以下に示した。
【００６４】
【表４】
【００６５】
表４より、どのような条件で養殖をしたクビレオゴノリにもフィコエリスリンが含まれていることが分かった。また、クビレオゴノリは、施肥した表層水または海洋深層水で養殖すると、表層水のみで養殖したものと比べて成長が早く、フィコエリスリンの量が多かった。また、クビレオゴノリの養殖後の収量に対するフィコエリスリンの量は、海洋深層水で養殖したものが一番多かった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のフィコエリスリンは、これまでに知られていない励起波長でオレンジ色の蛍光を発するものである。そしてこのフィコエリスリンは、従来公知の蛍光物質同様に、抗体等への標識、光の波長変換等、飲料等の着色料等の用途に利用できる。
以 上
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の性質（１）〜（３）、
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有する
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発す
る
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が９
５,０００±５,０００である
を有することを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリン。
【請求項２】
オゴノリ属の海藻が、オゴノリまたはクビレオゴノリである請求項１記載のフィコエリスリン。
【請求項３】
請求項１または２記載のフィコエリスリンの水溶液を封入した透明の容器と、照明とを組み合わせてなることを特徴とする発光オブジェ。
【請求項４】
植物の成長促進用である請求項３記載の発光オブジェ。
【請求項５】
請求項１または２記載のフィコエリスリンで標識した抗体。
【請求項６】
以下の工程（ａ）〜（ｂ）、
（ａ）オゴノリ属の海藻を粉砕した後、水と混合し、当該混合物を攪拌する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を遠心分離し、その上清を得る工程
を含むことを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンの抽出方法。
【請求項７】
オゴノリ属の海藻が、海洋深層水を用いて培養されたものである請求項６記載のフィコエリスリンの抽出方法。
【請求項１】
次の性質（１）〜（３）、
（１）４９６±５ｎｍ、５３９±５ｎｍおよび５６６±５ｎｍに吸収極大波長を有する
（２）４９６±５ｎｍおよび５３９±５ｎｍの励起波長で５７３±５ｎｍの蛍光を発す
る
（３）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で測定される分子量が９
５,０００±５,０００である
を有することを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリン。
【請求項２】
オゴノリ属の海藻が、オゴノリまたはクビレオゴノリである請求項１記載のフィコエリスリン。
【請求項３】
請求項１または２記載のフィコエリスリンの水溶液を封入した透明の容器と、照明とを組み合わせてなることを特徴とする発光オブジェ。
【請求項４】
植物の成長促進用である請求項３記載の発光オブジェ。
【請求項５】
請求項１または２記載のフィコエリスリンで標識した抗体。
【請求項６】
以下の工程（ａ）〜（ｂ）、
（ａ）オゴノリ属の海藻を粉砕した後、水と混合し、当該混合物を攪拌する工程
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物を遠心分離し、その上清を得る工程
を含むことを特徴とするオゴノリ属の海藻由来のフィコエリスリンの抽出方法。
【請求項７】
オゴノリ属の海藻が、海洋深層水を用いて培養されたものである請求項６記載のフィコエリスリンの抽出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１１−３７７１４（Ｐ２０１１−３７７１４Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８３３９９（Ｐ２００９−１８３３９９）
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
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