新規免疫増強組成物
【課題】新規の免疫増強組成物を提供する。
【解決手段】有効成分として、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を含む。
【解決手段】有効成分として、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の免疫増強組成物に関する。本発明の免疫増強組成物は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。更には、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。
【背景技術】
【０００２】
キノコには種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、例えば、特公昭５７−１２３０号公報（特許文献１）及び特許第２７６７５２１号明細書（特許文献２）には、マツタケに含有される各種の抗腫瘍性物質が開示されている。前記特公昭５７−１２３０号公報には、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水又は希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、及びエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示されている。また、前記特許第２７６７５２１号明細書には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量＝１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公昭５７−１２３０号公報
【特許文献２】特許第２７６７５２１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、市販されている種々の食用キノコについて、その熱水抽出液の種々の生理活性を比較検討したところ、マツタケを含む多くの食用キノコにおいてサルコーマ１８０細胞の増殖抑制活性が認められたのに対して、免疫増強活性に関しては、マツタケだけが非常に高い活性を示すことを新たに見出した。また、マツタケ熱水抽出液だけでなく、マツタケのアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分も、免疫増強活性を示すことを新たに見出した。このようなマツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の免疫増強活性は、これまで全く知られておらず、本発明はこうした知見によるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は、マツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ）熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分に関する。
【０００６】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、免疫増強組成物、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）組成物、腫瘍増殖抑制組成物、インターロイキン１２誘導組成物、ＴＧＦ−β活性抑制組成物、及び活性酸素捕捉組成物に関する。
【０００７】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、免疫増強機能性食品、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）機能性食品、腫瘍増殖抑制機能性食品、インターロイキン１２誘導機能性食品、ＴＧＦ−β活性抑制機能性食品、及び活性酸素捕捉機能性食品に関する。
【０００８】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫を増強する方法に関する。
【０００９】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）が必要な対象に、有効量で投与することを含む、キラー活性（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性）を誘導する方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、腫瘍増殖抑制が必要な対象に、有効量で投与することを含む、腫瘍増殖を抑制する方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、インターロイキン１２誘導が必要な対象に、有効量で投与することを含む、インターロイキン１２を誘導する方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、ＴＧＦ−β活性抑制が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ＴＧＦ−β活性を抑制する方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、活性酸素捕捉が必要な対象に、有効量で投与することを含む、活性酸素を捕捉する方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、免疫増強組成物又は免疫増強機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１５】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）組成物又はキラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１６】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、腫瘍増殖抑制組成物又は腫瘍増殖抑制機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１７】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、インターロイキン１２誘導組成物又はインターロイキン１２誘導機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１８】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、ＴＧＦ−β活性抑制組成物又はＴＧＦ−β活性抑制機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１９】
更に、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、活性酸素捕捉組成物又は活性酸素捕捉機能性食品を製造するための使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】吸着画分Ｄ２の１Ｈ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
【図２】吸着画分Ｄ２の１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
【図３】吸着画分Ｄ２の円偏光二色性分析により得られたＣＤスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
マツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ）から熱水抽出し、陰イオン交換樹脂吸着させて得ることのできる本発明の新規画分は、熱水抽出工程を経由するにもかかわらず、優れた免疫増強活性を示す。また、マツタケ熱水抽出液も優れた免疫増強活性を示す。更に、マツタケのアルカリ溶液抽出液も優れた免疫増強活性を示し、前記アルカリ溶液抽出液を、陰イオン交換樹脂吸着させて得ることのできる本発明の新規画分も優れた免疫増強活性を示す。
従って、本発明による免疫増強組成物は、（１）マツタケ熱水抽出液、（２）マツタケのアルカリ溶液抽出液、（３）マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分、あるいは、（４）マツタケのアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、有効成分として含有し、更に、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体を含有する。
【００２２】
本発明の免疫増強組成物における有効成分である、マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、これに限定されるものではないが、例えば、マツタケを熱水で抽出し（以下、熱水抽出工程と称する）、得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させた後（以下、陰イオン交換樹脂吸着工程と称する）、適当な溶離液により吸着画分を溶出する（以下、溶出工程と称する）ことにより、得ることができる。
【００２３】
熱水抽出工程に用いる前記マツタケとしては、例えば、天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、又は培養により得られるマツタケの菌糸体若しくは培養物（Ｂｒｏｔｈ）を挙げることができる。培養に用いる前記マツタケとしては、例えば、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で樹立及び維持しているマツタケＣＭ６２７−１株を挙げることができる。
前記マツタケとして子実体又は菌糸体を用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。
【００２４】
熱水抽出工程に用いる熱水の温度は、６０〜１００℃であることが好ましく、８０〜９８℃であることがより好ましい。また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、マツタケの状態（すなわち、子実体、菌糸体、又は培養物のいずれの状態であるか、あるいは、破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、１〜６時間であり、２〜３時間であることが好ましい。
【００２５】
熱水抽出工程で得られた抽出液は、不溶物が混在する状態で、そのまま、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることもできるが、不溶物を除去してから、あるいは、不溶物を除去し、更に、抽出液中の低分子画分を除去してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることが好ましい。例えば、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、得られる上清のみを、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。あるいは、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。
【００２６】
陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることのできる陰イオン交換樹脂としては、公知の陰イオン交換樹脂を用いることができ、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース又はトリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）セルロースを挙げることができる。
【００２７】
溶出工程に用いる溶離液は、陰イオン交換樹脂吸着工程に用いる陰イオン交換樹脂の種類に応じて適宜決定することができ、例えば、塩化ナトリウム水溶液などを挙げることができる。
【００２８】
溶出工程により溶出される画分は、そのまま、本発明の免疫増強組成物の有効成分として用いることができるが、通常、溶離液に由来する塩を含有するので、それを除去するために、更に透析を実施することが好ましい。
【００２９】
本発明の免疫増強組成物における有効成分であるマツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、これに限定されるものではないが、例えば、以下に示す理化学的性質を有する。なお、以下に示す各数値は、マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の一態様である、後述の実施例２で調製した吸着画分Ｄ２の理化学的性質であり、後述する実施例における「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」に記載の各測定方法に基づく数値である。
【００３０】
（１）糖質含量：グルコース換算値として１３％である。
（２）タンパク質含量：アルブミン換算値として８６％である。
（３）糖組成：マンノース４７．７μｇ／ｍｇ、ガラクトース３２．４３μｇ／ｍｇ、グルコース２５．０９μｇ／ｍｇ、アラビノース１２．０９μｇ／ｍｇ、リボース８．３０μｇ／ｍｇ、キシロース３．７５μｇ／ｍｇ、及びラムノース０．４４μｇ／ｍｇである。
【００３１】
（４）アミノ酸組成：アスパラギン酸及びアスパラギン１４．１２ｍｏｌ％、トレオニン６．３９ｍｏｌ％、セリン７．６４ｍｏｌ％、グルタミン酸及びグルタミン１３．８３ｍｏｌ％、グリシン１４．０３ｍｏｌ％、アラニン７．７７ｍｏｌ％、バリン５．３６ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．８７ｍｏｌ％、メチオニン１．１１ｍｏｌ％、イソロイシン３．７０ｍｏｌ％、ロイシン５．２０ｍｏｌ％、チロシン１．５１ｍｏｌ％、フェニルアラニン２．２８ｍｏｌ％、リシン４．０５ｍｏｌ％、ヒスチジン１．６７ｍｏｌ％、アルギニン２．５２ｍｏｌ％、及びプロリン７．９３ｍｏｌ％である。
（５）分子量分布：約４．５万〜１００万の間に幅広く分布する。その中でピークトップが５つ存在し、それぞれの推定分子量は、約４．５万、約１２万、約１６万、約３８万、及び１００万以上である。
（６）等電点：等電点電気泳動法により、３本のピークが検出される。メインバンドは４．８付近（４．５〜５．２）であり、その他のバンドは、７．６付近（７．３５〜８．０）及び９．２付近（８．６５〜９．３）である。
【００３２】
（７）紫外分光分析：２４０〜２６０ｎｍにピークが見出された［測定条件は、後述の「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」（７）を参照のこと］。
（８）１Ｈ一次元ＮＭＲ分析：図１に示すスペクトル［測定条件は、後述の「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」（８）（ｉ）を参照のこと］を示す。
（９）１３Ｃ一次元ＮＭＲ分析：図２に示すスペクトル［測定条件は、後述の「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」（８）（ii）を参照のこと］を示す。
（１０）円偏光二色性分析：図３に示すスペクトル［測定条件は、後述の「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」（９）を参照のこと］を示す。Ｃｈｅｎらの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１，４１２０−４１３１（１９７２）］に従って２次構造を解析したところ、αヘリックス１７％、βシート１８％、及び不規則構造６５％である。
【００３３】
本発明の免疫増強組成物における有効成分である、マツタケのアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、これに限定されるものではないが、先に説明した、マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の製造方法に準じた方法により得ることができる。すなわち、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の前記製造方法と同様の方法により、調製することができる。例えば、マツタケをアルカリ溶液で抽出し（以下、アルカリ溶液抽出工程と称する）、得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させた後（すなわち、陰イオン交換樹脂吸着工程）、適当な溶離液により吸着画分を溶出する（すなわち、溶出工程）ことにより、得ることができる。
【００３４】
アルカリ溶液抽出工程に用いるアルカリ溶液としては、これに限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。前記アルカリ溶液のｐＨは、８〜１３であることが好ましく、９〜１２であることがより好ましい。アルカリ溶液抽出工程は、０〜２０℃で実施することが好ましく、０〜１５℃で実施することがより好ましい。アルカリ抽出工程で得られた抽出液は、中和処理を実施してから次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。
【００３５】
本発明の免疫増強組成物は、有効成分としてのマツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
【００３６】
本発明の有効成分である、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、免疫増強活性、例えば、キラー活性（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性）の誘導活性、腫瘍増殖抑制活性、サイトカイン（特にはインターロイキン１２）誘導活性、ＴＧＦ−β活性抑制活性、又は活性酸素捕捉活性を有する。
【００３７】
従って、本発明の有効成分である、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、免疫増強が必要な対象、例えば、キラー活性（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性）の誘導が必要な対象、腫瘍増殖抑制が必要な対象、サイトカイン（特にはインターロイキン１２）誘導が必要な対象、ＴＧＦ−β活性抑制が必要な対象、又は活性酸素捕捉が必要な対象に、有効量で投与することができる。
【００３８】
また、本発明の有効成分である、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、免疫増強組成物又は免疫増強機能性食品、例えば、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）組成物若しくはキラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）機能性食品、腫瘍増殖抑制組成物若しくは腫瘍増殖抑制機能性食品、インターロイキン１２誘導組成物若しくはインターロイキン１２誘導機能性食品、ＴＧＦ−β活性抑制組成物若しくはＴＧＦ−β活性抑制機能性食品、又は活性酸素捕捉組成物若しくは活性酸素捕捉機能性食品を製造するために使用することができる。
【００３９】
本発明による免疫増強組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００４０】
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００４１】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分としての前記画分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明による免疫増強組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明による免疫増強組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００４２】
本発明による免疫増強組成物は、これに限定されるものではないが、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明による免疫増強組成物を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
【００４３】
また、形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。更には、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、添加剤（例えば、食品添加剤）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤等に添加することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
《実施例１：キノコ熱水抽出液の生物活性試験》
（１）キノコ熱水抽出液の調製
市販の岩手県産マツタケ子実体２５０ｇを凍結乾燥して水分を除去した後、粉砕して粉末３５ｇを得た。
１リットル容量のビーカーに、前記粉末の一部（２０ｇ）と純水８００ｍＬとを加え、スターラー撹拌下、９３〜９８℃のウオーターバス中で３時間抽出した。抽出終了後、室温まで冷却し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間）により、上清を得た。
上清を得た後の沈殿部には、純水５００ｍＬを加え、前記と同様の処理を行なった。この操作を計３回行ない、各操作で得られた上清と、先に得られた上清とを一緒にした後、分子量３５００分画の透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，米国）に入れ、水道水の流水中で２日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した後、凍結乾燥を行ない、粉末１．１２ｇを得た。
更に、市販食用キノコ１３種類につき、前記と同様の処理を行ない、それぞれ、粉末を得た。キノコの種類と収率（対乾燥菌体質量％）を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
（２）キノコ熱水抽出液の生物活性検定
前項（１）で粉体として得られた食用キノコ抽出液を、マウスに経口投与し、腸管リンパ球のキラー活性誘導に及ぼす影響を検討した。すなわち、腫瘍細胞を盲腸壁に移植したマウスから、腸間膜リンパ節細胞を取り出し、試験管内で前記腫瘍細胞で再刺激した時のキラー活性を測定することにより、生物活性を検定した。用いた腫瘍細胞は、マウス白血病細胞Ｐ８１５及びＢ７／Ｐ８１５細胞であり、これらは九州大学生体防御医学研究所原田守博士から供与された細胞株を、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で継代維持している。動物は日本ＳＬＣから購入した雌性ＤＢＡ／２マウスであり、予備飼育した後、８週齢で実験に用いた。
【００４８】
予め、ペントバルビタール（大日本製薬）５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与して麻酔状態にしたマウスを固定し、その腹部をはさみとピンセットとで開き、盲腸部を取り出し、１／８Ｇの歯科用注射針（旗印本木注射針）を装着した１ｍＬ容注射筒を用いて、Ｂ７／Ｐ８１５細胞（１×１０６個／５０μＬ）を盲腸壁下に移植し、解剖用ホッチキスを用いて腹部を閉じた。麻酔からさめたマウスを飼育ケージに入れ、通常の飼育環境下で飼育した。そして、腫瘍細胞移植翌日から、経口投与用ゾンデを用いて、各サンプル５００ｍｇ／ｋｇ／日を連日１０日間経口投与した（１群当たり５〜１０匹）。
【００４９】
最終投与の翌日にマウスを屠殺し、腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）、５×１０−５ｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノール、２０ｍｍｏｌ／Ｌの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、及び３０μｇ／ｍＬゲンタマイシンをそれぞれ添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整し、エフェクター細胞として用いた。
【００５０】
一方、刺激細胞は、以下の手順で調製した。すなわち、Ｐ８１５細胞又はＢ７／Ｐ８１５細胞を１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中に５×１０６個／ｍＬになるように懸濁し、マイトマイシンＣ（シグマ）を５０μｇ／ｍＬになるように加え、５％炭酸ガス培養器中で３０分間反応させた後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄し、細胞濃度を１×１０５個／ｍＬに調整した。
【００５１】
混合リンパ球・腫瘍細胞反応（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、以下の条件で検討した。
すなわち、９６ウエルの細胞培養用平底マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７２；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，米国）に、前記エフェクター細胞及び／又は刺激細胞を０．１ｍＬずつ加え、５％炭酸ガス培養器中で３日間培養し、細胞をフィルター上に回収した。なお、エフェクター細胞及び刺激細胞の両方を加える場合には、両者の細胞数比を１２．５（エフェクター細胞数／刺激細胞数）とした。本測定系においては、前記エフェクター細胞が、混合リンパ球・腫瘍細胞反応における「リンパ球」として機能し、前記刺激細胞が「腫瘍細胞」として機能する。培養終了の２４時間前に、プレートの各ウエルに３Ｈ−チミジン（アマシャムジャパン）３７ｋＢｑを加えた。回収した細胞を５％トリクロロ酢酸で充分に洗浄した後、乾燥し、液体用バイアルに入れ、液体シンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで、放射能活性を測定した。
【００５２】
スティミュレーション・インデックス（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ；Ｓ．Ｉ．）は、式：
［Ｓ．Ｉ．］＝（Ｂｍｉｘ−Ｂｓ）／（Ｂｅ−Ｂｓ）
［式中、Ｂｍｉｘは、エフェクター細胞及び刺激細胞混合培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｓは、刺激細胞単独培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｅは、エフェクター細胞単独培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）である］
により算出した。
【００５３】
一方、リンパ球・腫瘍細胞の混合培養による細胞傷害活性誘導反応（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ Ｍｉｘｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、以下の条件で検討した。
すなわち、２４ウエルの細胞培養用マイクロプレート（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌａｓｔａｒ）（Ｃｏｓｔａｒ ３５２４；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，米国）に、前記エフェクター細胞及び刺激細胞（エフェクター細胞数／刺激細胞数＝１２．５）を１．０ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で３日間培養した。培養終了後、細胞を回収し、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した。顕微鏡を用いて、細胞懸濁液中のエフェクター細胞数のみを計数し、エフェクター細胞数を２．５×１０６個／ｍＬに調整した。
一方、別に用意したＰ８１５細胞をクロム酸ナトリウム（アマシャムジャパン）と３７℃で２０分間反応させた。未結合の放射性物質を１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄することにより除去し、放射性クロム標識腫瘍細胞を５×１０４／ｍＬに調整した。
【００５４】
前記エフェクター細胞又はその２倍希釈系列と放射性クロム標識腫瘍細胞とを試験管に０．１ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。反応終了後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地をそれぞれの試験管に１．５ｍＬずつ加え、ミキサーでよく混合した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ，５分間，４℃）して上清を分離し、放射能活性をガンマカウンターを用いて測定した。
【００５５】
特異的傷害率［Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｙｓｉｓ；Ｓ．Ｌ．（単位＝％）］は式：
［Ｓ．Ｌ．（％）］＝｛（Ｂ−Ｂｆ）／（Ｂｍａｘ−Ｂｆ）｝×１００
［式中、Ｂは実験群上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｆは自然遊離群上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｍａｘは最大遊離群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）である］
により算出した。なお、自然遊離群とは、放射性クロム標識腫瘍細胞単独培養群を意味し、最大遊離群とは、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）処置放射性クロム標識腫瘍細胞群を意味する。
【００５６】
前項（１）で調製したサンプルの混合リンパ球・腫瘍細胞反応、あるいは、リンパ球・腫瘍細胞の混合培養による細胞傷害活性誘導反応に及ぼす影響を測定した結果（エフェクター細胞数／腫瘍細胞数が１２．５の時の値）を表２に示す。マツタケ子実体由来のサンプルで有意の増強がみられた。なお、コントロール群には純水０．２ｍＬを経口投与した。表２において、＊はコントロール群に対してｐ＜０．０５で有意差のあることを示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
《実施例２：マツタケ熱水抽出液及びその陰イオン交換樹脂吸着画分の調製》
呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で樹立及び維持しているマツタケＣＭ６２７−１株菌糸体を滅菌済み培地（３％グルコース，０．３％酵母エキス，ｐＨ６．０）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ１０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で４週間培養を行なった。得られた培養物をホモゲナイザーにかけた後、スターラー撹拌下、９３〜９８℃のウオーターバス中で３時間抽出した。抽出終了後、室温まで冷却し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）により、上清を得た。
沈殿部には純水５００ｍＬを加え、前記と同様の処理を行なった。この操作を計３回行ない、全ての上清を合わせて、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、水道水の流水中で３日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、粉末（画分Ｄ）３．９ｇを得た。
【００５９】
次に、前記粉末（画分Ｄ）を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、予め前記緩衝液で平衡化させておいたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラム（口径＝２ｃｍ，高さ＝２０ｃｍ）にアプライし、次いで、前記緩衝液１００ｍＬを流し、非吸着画分Ｄ１（以下、単に「Ｄ１画分」と称することがある）を得た。次いで、前記緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを加えた溶液２００ｍＬを調製し、前記カラムにかけ、吸着物を溶出し、吸着画分Ｄ２（以下、単に「Ｄ２画分」と称することがある）を得た。得られた非吸着画分及び吸着画分溶液をそれぞれ、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、純水中で３日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、非吸着画分Ｄ１粉末１．９ｇ及び吸着画分Ｄ２粉末１．５ｇを得た。
【００６０】
前記「キノコ熱水抽出液の生物活性試験」（２）と同様の方法によりそれぞれの画分の免疫活性を調べたところ、表３に示すように、吸着画分Ｄ２に活性が確認された。なお、表３において、＊はコントロール群に対してｐ＜０．０１で有意差のあることを示し、＊＊はコントロール群に対してｐ＜０．０５で有意差のあることを示す。また、画分Ｄは、ＤＥＡＥセルロースカラムにかける前の画分を意味する。
【００６１】
【表３】
【００６２】
［吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討］
Ｄ２画分の理化学的性質を検討した。測定方法及びその結果を以下に示す。
【００６３】
（１）糖質の定量
フェノール硫酸法を用いる比色により定量した。Ｄ２画分の糖質含量は、グルコース換算値として１３％であった。
【００６４】
（２）タンパク質の定量
銅フォリン法を用いる比色により定量した。Ｄ２画分のタンパク質含量は、アルブミン換算値として８６％であった。
【００６５】
（３）糖質の組成分析
封入管にＤ２画分１．０ｍｇと２ｍｏｌ／Ｌトリフルオロ酢酸０．２ｍＬとを入れ、１００℃で６時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固し、残渣を得た。残渣を純水５００μＬに溶解し、純水で２倍又は１０倍希釈した。この溶液５０μＬに内部標準物質ヘプトース５００ｎｇを添加し、カラムＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧＬＣ−９Ａ １５ｃｍ×４．６ｍｍＩＤ（東ソー）と検出器分光光度計ＲＦ−５３５（島津製作所）とを装着した高速液体クロマト装置ＬＣ−９Ａ（島津製作所）にアプライした。カラム温度は７０℃であり、移動相及びその流速は０．５Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．７）及び０．４ｍＬ／分であった。ポストカラム標識の条件は、反応試薬として１％アルギニン／３％ホウ酸を用い、流速は０．５ｍＬ／分であり、反応温度は１５０℃であり、検出波長はＥＸ３２０ｎｍ及びＥＭ４３０ｎｍである。
糖組成は、多い方から順に、マンノース４７．７μｇ／ｍｇ、ガラクトース３２．４３μｇ／ｍｇ、グルコース２５．０９μｇ／ｍｇ、アラビノース１２．０９μｇ／ｍｇ、リボース８．３０μｇ／ｍｇ、キシロース３．７５μｇ／ｍｇ、及びラムノース０．４４μｇ／ｍｇであった。
【００６６】
（４）アミノ酸組成分析
封入管にＤ２画分１．０ｍｇと６ｍｏｌ／Ｌ塩酸０．１ｍＬとを入れ、１１０℃で２２時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固し、残渣を得た。残渣を純水１．０ｍＬに溶解し、その５０μＬをアミノ酸分析に用いた。装置は日立Ｌ−８５００型アミノ酸分析計（日立製作所）であり、ニンヒドリン発色により定量した。
アミノ酸組成は、アスパラギン酸及びアスパラギン１４．１２ｍｏｌ％、トレオニン６．３９ｍｏｌ％、セリン７．６４ｍｏｌ％、グルタミン酸及びグルタミン１３．８３ｍｏｌ％、グリシン１４．０３ｍｏｌ％、アラニン７．７７ｍｏｌ％、バリン５．３６ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．８７ｍｏｌ％、メチオニン１．１１ｍｏｌ％、イソロイシン３．７０ｍｏｌ％、ロイシン５．２０ｍｏｌ％、チロシン１．５１ｍｏｌ％、フェニルアラニン２．２８ｍｏｌ％、リシン４．０５ｍｏｌ％、ヒスチジン１．６７ｍｏｌ％、アルギニン２．５２ｍｏｌ％、及びプロリン７．９３ｍｏｌ％であった。
【００６７】
（５）分子量分布の測定
Ｄ２画分１．０ｍｇを純水１．０ｍＬに溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液を得た。この濾液を、カラムＡｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−６２０ ５０ｃｍ×７．６ｍｍＩＤ（旭化成）、示差屈折計検出器ＲＩＤ−６Ａ（島津製作所）、及び紫外部検出器ＳＰＤ−６Ａ（島津製作所）を装着した高速液体クロマト装置ＬＣ−９Ａ（島津製作所）にアプライした。カラム温度は室温であり、移動相及びその流速は純水及び０．５ｍＬ／分であった。
分子量分布は、約４．５万〜１００万の間に幅広く分布した。その中でピークトップが５つ見いだされ、それぞれの推定分子量は、約４．５万、約１２万、約１６万、約３８万、及び１００万以上であった。
【００６８】
（６）等電点分析
Ｄ２画分１９０μｇを純水２０μＬに溶解した後、その半量に４０％（体積／体積）程度のサッカロースを加え、電気泳動を実施した。電気泳動の条件は以下のとおりである。ゲル：ＩＥＦ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ（４％，ｐＨ３〜１０；テフコ社）
泳動用緩衝液：（陰極）０．０４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、（陽極）０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液
泳動条件：１００Ｖで３０分間泳動を行ない、続いて、３００Ｖで２０分間泳動を行ない、更に、５００Ｖで４０分間泳動を行なった。
ＰＩマーカー：各バンドが１．３５ｇ（ファルマシア）
【００６９】
３本のブロードなピークが検出された。メインバンドは４．８付近（４．５〜５．２）で、その他に７．６付近（７．３５〜８．０）と９．２付近（８．６５〜９．３）にバンドがあった。
【００７０】
（７）紫外分光分析（ＵＶ）
純水に溶解し、０．５ｍｇ／１０ｍＬ濃度で測定した。装置として、２５００ＰＣ（島津製作所）を使用した。２４０〜２６０ｎｍにピークが見出された。
【００７１】
（８）核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）
測定条件は以下のとおりである。
（ｉ）１Ｈ一次元ＮＭＲ測定
測定装置としては、ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−５００型（Ｖａｒｉａｎ社）を使用した。溶媒としてＤ化塩酸グアニジウムＤ２Ｏ溶液を使用した。濃度は４ｍｏｌ／Ｌであり、内部標準としてＤＳＳを用い、温度は２３℃で測定を実施した。
【００７２】
得られたスペクトルを図１に示す。糖の１位のプロトンに特徴的な４．５ｐｐｍ〜５．０ｐｐｍ付近に、ガラクトース又はグルコースのα１位と考えられるピークが観測された。また、５．０〜５．２ｐｐｍ付近に、ガラクトース又はグルコースのβ１位と考えられるピークが観測された。
【００７３】
（ii）１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定
観測周波数は１５０．８ＭＨｚで測定した。濃度は２０．３ｍｇ／０．７５ｍＬであり、内部標準は重メタノール（３％重水溶液，δ＝４９ｐｐｍ）であり、温度は４５℃であり、デカップリングは１Ｈ完全デカップリングである条件で測定を実施した。
結果を図２に示す。１０３〜１０４ｐｐｍ付近のブロードなピークは、ガラクトース又はグルコースの１位の炭素で、β型でグルコシド結合したものと考えられる。１０２．９６ｐｐｍ及び１０２．５１ｐｐｍの各ピークは、それぞれマンノースのα１位とβ１位でクルコシド結合したものと考えられる。９９．１７ｐｐｍのピークは、ガラクトース又はグルコースのα１位で、やはりグルコシド結合したものと考えられる。
【００７４】
１位以外については、６０〜８０ｐｐｍのピークの化学シフトを解析した。各単糖の化学シフトを比較すると、ガラクトース又はグルコースのβ２位の炭素、あるいは、マンノースの２位（α，β）の炭素が変化していると考えられた。また、ガラクトース又はグルコースのα型の炭素については、化学シフトが単糖と比較して変化しているものが見当たらないので、６位が変化し、マンノースの４位のシグナル（６７．８ｐｐｍ）と重なっていると推定した（このピークの強度が大きいことから推測した）。以上のことから、１位以外で結合に関与していると推定される糖の位置は、ガラクトース又はグルコースの２位（β型）と６位（α型）、あるいは、マンノースの２位（α、β型）である。但し、ピークが全般的にブロードで、Ｓ／Ｎも悪いため、解析の精度は高くない。
【００７５】
（１０）円偏光二色性分析（ＣＤ）
測定条件は以下のとおりである。
測定装置としてＪＡＳＣＯＪ−５００Ａを使用し、溶媒として水を使用した。タンパク質濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬであり、波長範囲は２００〜２５０ｎｍであり、セル長は１ｍｍであり、温度は室温（２４℃）であり、積算回数は８回である条件で測定を実施した。
【００７６】
得られたＣＤスペクトルを図３に示す。ＣＤ値（縦軸）は、平均残基楕円率［θ］で示した。［θ］の単位はｄｅｇ・ｃｍ２・ｄｅｃｉｍｏｌ−１となる。［θ］に換算する際の平均残基分子量は１０３．４５を用いた（アミノ酸分析から求めた）。２次構造の解析は、Ｃｈｅｎらの方法に従って算出したところ、αヘリックス１７％、βシート１８％、及び不規則構造６５％であった。
【００７７】
［吸着画分Ｄ２の生物活性評価例］
（１）吸着画分Ｄ２のサルコーマ１８０腫瘍増殖抑制活性
動物としては、日本クレア（株）から購入した雌性ＩＣＲマウスを用い、腫瘍としては、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で雌性ＩＣＲマウスの腹腔内で継代維持しているサルコーマ１８０細胞を用いた。すなわち、５週齢の雌性ＩＣＲマウスの腋窩部皮下に、サルコーマ１８０細胞を１０６個移植した（１群＝１０匹）。移植後翌日から、前記実施例２で得られた吸着画分Ｄ２の所定量（１．０ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，又は５０ｍｇ／ｋｇ）を隔日に１０回、腹腔内投与し、移植後２５日目にマウスを屠殺して腫瘍結節を摘出し、重量を測定した。対照としては生理食塩水投与群を設けた。
【００７８】
増殖抑制率（単位＝％）は、式：
［増殖抑制率（％）］＝｛（Ｗｃ−Ｗ）／Ｗｃ｝×１００
［式中、Ｗはサンプル処置群の平均結節重量（単位＝ｇ）であり、Ｗｃは生理食塩水処置群の平均結節重量（単位＝ｇ）である］
により算出した。
結果を表４に示す。なお、＊はコントロール群に対してｐ＜０．０５で有意差のあることを示す。表４から明らかなように、Ｄ２画分投与により有意の増殖抑制がみられた。
【００７９】
【表４】
【００８０】
（２）吸着画分Ｄ２のサイトカイン誘導活性
８週齢の雌性ＤＢＡ／２マウスを屠殺後脱血し、腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、細胞数を２×１０６個／ｍＬに調整した。前記実施例２で得られた吸着画分Ｄ２を培地に溶解し、フィルターで除菌し、サンプル溶液２５０μｇ／ｍＬを調製した。９６ウエルの細胞培養用平底マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７２；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，米国）に、前記細胞及びサンプルを０．１ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で１８時間培養した後、遠心分離により、上清を分離した。そして、培養上清中の総（ｔｏｔａｌ）インターロイキン１２含量を、市販測定キット（Ｉｎｔｅｒｔｅｓｔ １２Ｘ；Ｇｅｎｚｙｍｅ社，米国）を用いて測定した。結果を表５に示す。表５から明らかなように、Ｄ２画分には、インターロイキン１２誘導活性が認められた。
【００８１】
【表５】
【００８２】
（３）吸着画分Ｄ２の免疫抑制物質ＴＧＦ−β結合活性
タンパク質吸着の少ないポリプロピレンチューブ（マルチシリコナイズチューブ，Ｓａｆｅ Ｓｅａｌ Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｔｕｂｅ；フナコシ）中で、ヒト遺伝子組み替えトランスフォーミング増殖因子β１［Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β１（以下、ＴＧＦ−β１）；フナコシ］標品を２％アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１００ｎｇ／ｍＬ溶液に調整した。一方、前記実施例２で得られた吸着画分Ｄ２を２％アルブミン含有リン酸緩衝液に溶解させ、２ｍｇ／ｍＬ濃度に調整した。前記ＴＧＦ−β１溶液とＤ２画分溶液とを０．５ｍＬずつ、タンパク質吸着の少ないチューブに入れ、２２℃で３時間反応させた。反応終了後、反応液中のＴＧＦ−β１含量を、市販の測定キット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ β１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；フナコシ）を用いて測定した。
【００８３】
結合率（単位＝％）は、式：
［結合率（％）］＝｛（Ｔｃ−Ｔ）／Ｔｃ｝×１００
［式中、ＴはＤ２画分添加群のＴＧＦ−β１実測値（単位＝ｎｇ／ｍＬ）であり、Ｔｃは２％アルブミン含有リン酸緩衝液添加群のＴＧＦ−β１実測値（単位＝ｎｇ／ｍＬ）である］
により算出した。
結果を表６に示す。Ｄ２画分添加群では、Ｄ２画分とＴＧＦβ１との結合が認められた。
【００８４】
【表６】
【００８５】
（４）吸着画分Ｄ２の活性酸素捕捉活性
３．０ｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン溶液１０００μＬ、２Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム）溶液５μＬ、８ｍｇ／ｍＬ−Ｄ２画分５００μＬ、及びＲＰＭＩ１６４０培地４９５μＬを試験管に入れた後、２７０μｍｏｌ／Ｌの２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−α］ピラジン−３−オン（ＣＬＡ−ｐｈｅｎｙｌ；東京化成）溶液１２０μＬを添加した。続いて、反応槽を３７℃に保ったケミルミネッセンスメーター（アロカ）に入れ、３０分間反応させ、発生するケミルミネッセンス量を経時的に測定した。
【００８６】
捕捉活性（単位＝％）は、式：
［捕捉活性（％）］＝｛（Ｃｃ−Ｃ）／Ｃｃ｝×１００
［式中、ＣはＤ２画分添加群のケミルミネッセンス量であり、Ｃｃはリン酸緩衝液添加群（対照群）のケミルミネッセンス量である］
により算出した。結果を表７に示す。表７から明らかなように、Ｄ２画分に活性酸素捕捉活性が認められた。
【００８７】
【表７】
【００８８】
（５）吸着画分Ｄ２の抗腫瘍活性
呉羽化学工業株式会社生物医学研究所において５０ｍＬ容の細胞培養用フラスコ（３０１４；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）中で継代維持しているスイスアルビノ３Ｔ３株及びＳＶ４０形質転換３Ｔ３細胞株［大日本製薬株式会社ラボラトリープロダクツ部（大阪）より入手］を、０．１２５％トリプシン溶液（シグマ社）で数分間処理することによりフラスコ器壁から遊離させた。洗浄後、１０％ウシ胎児血清（５６℃で３０分間処理したもの）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地に懸濁し、２×１０３個／ｍＬに調整した後、０．１ｍＬずつ、９６ウエルの細胞培養用平底マイクロテストプレート（３０７２；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）の各ウエルに分注した。
【００８９】
３７℃の５％炭酸ガス培養容器内で２４時間培養した後、前記実施例２で得られた吸着画分Ｄ２の所定量又は培地０．１ｍＬを加え、更に２４時間培養した。なお、培養終了６時間前に、３Ｈ−チミジン（アマシャムジャパン）１μＣｉ／ウエルを添加した。培養終了後、細胞を濾紙上に回収し、５％三塩化酢酸で充分に洗浄した後、乾燥させ、細胞に取り込まれた放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。吸着画分Ｄ２の５０％阻止濃度（ＬＤ５０）は、ＳＶ４０形質転換３Ｔ３細胞株で約５０μｇ／ｍＬであり、スイスアルビノ３Ｔ３株で約４０μｇ／ｍＬであった。また、ＭＴＴ法によりＬＤ５０を測定したところ、３Ｈ−チミジン法により得られた前記結果とほぼ同様の結果が得られた。
【００９０】
《実施例３：マツタケアルカリ溶液抽出液及びその陰イオン交換樹脂吸着画分の調製》
前記実施例２と同様の方法で調製したマツタケＣＭ６２７−１株菌糸体培養物を、ホモゲナイザーにかけた後、全体の濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌになるまで水酸化ナトリウム溶液を添加した。スターラー撹拌下、２２℃で１時間抽出した。抽出終了後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）により、上清を得た。
沈澱部に０．３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加え、前記と同様の処理を行ない、上清を得た。更に、沈澱部に０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加え、前記と同様の処理を行ない、上清を得た。全ての上清を合わせて、前記上清に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え、ｐＨを７．０に調整した後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、水道水の流水中で３日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、粉末（以下、画分Ａと称する）４．３ｇを得た。
【００９１】
次に、前記粉末（画分Ａ）を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、予め前記緩衝液で平衡化させておいたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラム（口径＝２ｃｍ，高さ＝２０ｃｍ）にアプライし、次いで、前記緩衝液１００ｍＬを流し、非吸着画分Ａ１（以下、単に「Ａ１画分」と称することがある）を得た。次いで、前記緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを加えた溶液２００ｍＬを調製し、前記カラムにかけ、吸着物を溶出し、吸着画分Ａ２（以下、単に「Ａ２画分」と称することがある）を得た。得られた非吸着画分及び吸着画分溶液をそれぞれ、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、純水中で３日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、非吸着画分Ａ１粉末及び吸着画分Ａ２粉末を得た。
【００９２】
［画分Ａの生物活性評価例］
前記「キノコ熱水抽出液の生物活性試験」（２）と同様の方法によりＴ細胞増強活性を評価したところ、画分Ａ投与群（投与量＝２５０ｍｇ／ｋｇ）の活性は、混合リンパ球・腫瘍細胞反応において１３０％（コントロール群に対する％）であり、リンパ球・腫瘍細胞混合培養による細胞傷害活性誘導反応において１３１％（コントロール群に対する％）であった。
また、前記「吸着画分Ｄ２の生物活性評価例」（２）と同様の方法によりサイトカイン誘導活性を評価したところ、培地コントロール群の総インターロイキン１２含量が検出限界以下であったのに対して、画分Ａ添加群の総インターロイキン１２含量は６９ｐｇ／ｍＬであった。
更に、前記「吸着画分Ｄ２の生物活性評価例」（３）と同様の方法によりＴＧＦ−β結合活性を評価したところ、画分Ａの結合活性は２６％であった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の免疫増強組成物によれば、免疫能を増強することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の免疫増強組成物に関する。本発明の免疫増強組成物は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。更には、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。
【背景技術】
【０００２】
キノコには種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、例えば、特公昭５７−１２３０号公報（特許文献１）及び特許第２７６７５２１号明細書（特許文献２）には、マツタケに含有される各種の抗腫瘍性物質が開示されている。前記特公昭５７−１２３０号公報には、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水又は希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、及びエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示されている。また、前記特許第２７６７５２１号明細書には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量＝１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公昭５７−１２３０号公報
【特許文献２】特許第２７６７５２１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、市販されている種々の食用キノコについて、その熱水抽出液の種々の生理活性を比較検討したところ、マツタケを含む多くの食用キノコにおいてサルコーマ１８０細胞の増殖抑制活性が認められたのに対して、免疫増強活性に関しては、マツタケだけが非常に高い活性を示すことを新たに見出した。また、マツタケ熱水抽出液だけでなく、マツタケのアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分も、免疫増強活性を示すことを新たに見出した。このようなマツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の免疫増強活性は、これまで全く知られておらず、本発明はこうした知見によるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は、マツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ）熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分に関する。
【０００６】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、免疫増強組成物、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）組成物、腫瘍増殖抑制組成物、インターロイキン１２誘導組成物、ＴＧＦ−β活性抑制組成物、及び活性酸素捕捉組成物に関する。
【０００７】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、免疫増強機能性食品、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）機能性食品、腫瘍増殖抑制機能性食品、インターロイキン１２誘導機能性食品、ＴＧＦ−β活性抑制機能性食品、及び活性酸素捕捉機能性食品に関する。
【０００８】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫を増強する方法に関する。
【０００９】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）が必要な対象に、有効量で投与することを含む、キラー活性（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性）を誘導する方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、腫瘍増殖抑制が必要な対象に、有効量で投与することを含む、腫瘍増殖を抑制する方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、インターロイキン１２誘導が必要な対象に、有効量で投与することを含む、インターロイキン１２を誘導する方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、ＴＧＦ−β活性抑制が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ＴＧＦ−β活性を抑制する方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、活性酸素捕捉が必要な対象に、有効量で投与することを含む、活性酸素を捕捉する方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、免疫増強組成物又は免疫増強機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１５】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）組成物又はキラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１６】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、腫瘍増殖抑制組成物又は腫瘍増殖抑制機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１７】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、インターロイキン１２誘導組成物又はインターロイキン１２誘導機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１８】
また、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、ＴＧＦ−β活性抑制組成物又はＴＧＦ−β活性抑制機能性食品を製造するための使用に関する。
【００１９】
更に、本発明は、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の、活性酸素捕捉組成物又は活性酸素捕捉機能性食品を製造するための使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】吸着画分Ｄ２の１Ｈ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
【図２】吸着画分Ｄ２の１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
【図３】吸着画分Ｄ２の円偏光二色性分析により得られたＣＤスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
マツタケ（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ）から熱水抽出し、陰イオン交換樹脂吸着させて得ることのできる本発明の新規画分は、熱水抽出工程を経由するにもかかわらず、優れた免疫増強活性を示す。また、マツタケ熱水抽出液も優れた免疫増強活性を示す。更に、マツタケのアルカリ溶液抽出液も優れた免疫増強活性を示し、前記アルカリ溶液抽出液を、陰イオン交換樹脂吸着させて得ることのできる本発明の新規画分も優れた免疫増強活性を示す。
従って、本発明による免疫増強組成物は、（１）マツタケ熱水抽出液、（２）マツタケのアルカリ溶液抽出液、（３）マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分、あるいは、（４）マツタケのアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、有効成分として含有し、更に、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体を含有する。
【００２２】
本発明の免疫増強組成物における有効成分である、マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、これに限定されるものではないが、例えば、マツタケを熱水で抽出し（以下、熱水抽出工程と称する）、得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させた後（以下、陰イオン交換樹脂吸着工程と称する）、適当な溶離液により吸着画分を溶出する（以下、溶出工程と称する）ことにより、得ることができる。
【００２３】
熱水抽出工程に用いる前記マツタケとしては、例えば、天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、又は培養により得られるマツタケの菌糸体若しくは培養物（Ｂｒｏｔｈ）を挙げることができる。培養に用いる前記マツタケとしては、例えば、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で樹立及び維持しているマツタケＣＭ６２７−１株を挙げることができる。
前記マツタケとして子実体又は菌糸体を用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。
【００２４】
熱水抽出工程に用いる熱水の温度は、６０〜１００℃であることが好ましく、８０〜９８℃であることがより好ましい。また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、マツタケの状態（すなわち、子実体、菌糸体、又は培養物のいずれの状態であるか、あるいは、破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、１〜６時間であり、２〜３時間であることが好ましい。
【００２５】
熱水抽出工程で得られた抽出液は、不溶物が混在する状態で、そのまま、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることもできるが、不溶物を除去してから、あるいは、不溶物を除去し、更に、抽出液中の低分子画分を除去してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることが好ましい。例えば、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、得られる上清のみを、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。あるいは、不溶物が混在する熱水抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。
【００２６】
陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることのできる陰イオン交換樹脂としては、公知の陰イオン交換樹脂を用いることができ、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース又はトリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）セルロースを挙げることができる。
【００２７】
溶出工程に用いる溶離液は、陰イオン交換樹脂吸着工程に用いる陰イオン交換樹脂の種類に応じて適宜決定することができ、例えば、塩化ナトリウム水溶液などを挙げることができる。
【００２８】
溶出工程により溶出される画分は、そのまま、本発明の免疫増強組成物の有効成分として用いることができるが、通常、溶離液に由来する塩を含有するので、それを除去するために、更に透析を実施することが好ましい。
【００２９】
本発明の免疫増強組成物における有効成分であるマツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、これに限定されるものではないが、例えば、以下に示す理化学的性質を有する。なお、以下に示す各数値は、マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の一態様である、後述の実施例２で調製した吸着画分Ｄ２の理化学的性質であり、後述する実施例における「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」に記載の各測定方法に基づく数値である。
【００３０】
（１）糖質含量：グルコース換算値として１３％である。
（２）タンパク質含量：アルブミン換算値として８６％である。
（３）糖組成：マンノース４７．７μｇ／ｍｇ、ガラクトース３２．４３μｇ／ｍｇ、グルコース２５．０９μｇ／ｍｇ、アラビノース１２．０９μｇ／ｍｇ、リボース８．３０μｇ／ｍｇ、キシロース３．７５μｇ／ｍｇ、及びラムノース０．４４μｇ／ｍｇである。
【００３１】
（４）アミノ酸組成：アスパラギン酸及びアスパラギン１４．１２ｍｏｌ％、トレオニン６．３９ｍｏｌ％、セリン７．６４ｍｏｌ％、グルタミン酸及びグルタミン１３．８３ｍｏｌ％、グリシン１４．０３ｍｏｌ％、アラニン７．７７ｍｏｌ％、バリン５．３６ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．８７ｍｏｌ％、メチオニン１．１１ｍｏｌ％、イソロイシン３．７０ｍｏｌ％、ロイシン５．２０ｍｏｌ％、チロシン１．５１ｍｏｌ％、フェニルアラニン２．２８ｍｏｌ％、リシン４．０５ｍｏｌ％、ヒスチジン１．６７ｍｏｌ％、アルギニン２．５２ｍｏｌ％、及びプロリン７．９３ｍｏｌ％である。
（５）分子量分布：約４．５万〜１００万の間に幅広く分布する。その中でピークトップが５つ存在し、それぞれの推定分子量は、約４．５万、約１２万、約１６万、約３８万、及び１００万以上である。
（６）等電点：等電点電気泳動法により、３本のピークが検出される。メインバンドは４．８付近（４．５〜５．２）であり、その他のバンドは、７．６付近（７．３５〜８．０）及び９．２付近（８．６５〜９．３）である。
【００３２】
（７）紫外分光分析：２４０〜２６０ｎｍにピークが見出された［測定条件は、後述の「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」（７）を参照のこと］。
（８）１Ｈ一次元ＮＭＲ分析：図１に示すスペクトル［測定条件は、後述の「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」（８）（ｉ）を参照のこと］を示す。
（９）１３Ｃ一次元ＮＭＲ分析：図２に示すスペクトル［測定条件は、後述の「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」（８）（ii）を参照のこと］を示す。
（１０）円偏光二色性分析：図３に示すスペクトル［測定条件は、後述の「吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討」（９）を参照のこと］を示す。Ｃｈｅｎらの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１，４１２０−４１３１（１９７２）］に従って２次構造を解析したところ、αヘリックス１７％、βシート１８％、及び不規則構造６５％である。
【００３３】
本発明の免疫増強組成物における有効成分である、マツタケのアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、これに限定されるものではないが、先に説明した、マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の製造方法に準じた方法により得ることができる。すなわち、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、マツタケ熱水抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の前記製造方法と同様の方法により、調製することができる。例えば、マツタケをアルカリ溶液で抽出し（以下、アルカリ溶液抽出工程と称する）、得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させた後（すなわち、陰イオン交換樹脂吸着工程）、適当な溶離液により吸着画分を溶出する（すなわち、溶出工程）ことにより、得ることができる。
【００３４】
アルカリ溶液抽出工程に用いるアルカリ溶液としては、これに限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。前記アルカリ溶液のｐＨは、８〜１３であることが好ましく、９〜１２であることがより好ましい。アルカリ溶液抽出工程は、０〜２０℃で実施することが好ましく、０〜１５℃で実施することがより好ましい。アルカリ抽出工程で得られた抽出液は、中和処理を実施してから次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。
【００３５】
本発明の免疫増強組成物は、有効成分としてのマツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
【００３６】
本発明の有効成分である、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、免疫増強活性、例えば、キラー活性（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性）の誘導活性、腫瘍増殖抑制活性、サイトカイン（特にはインターロイキン１２）誘導活性、ＴＧＦ−β活性抑制活性、又は活性酸素捕捉活性を有する。
【００３７】
従って、本発明の有効成分である、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体と共に、免疫増強が必要な対象、例えば、キラー活性（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性）の誘導が必要な対象、腫瘍増殖抑制が必要な対象、サイトカイン（特にはインターロイキン１２）誘導が必要な対象、ＴＧＦ−β活性抑制が必要な対象、又は活性酸素捕捉が必要な対象に、有効量で投与することができる。
【００３８】
また、本発明の有効成分である、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、免疫増強組成物又は免疫増強機能性食品、例えば、キラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）組成物若しくはキラー活性誘導（好ましくは腸管リンパ球のキラー活性誘導）機能性食品、腫瘍増殖抑制組成物若しくは腫瘍増殖抑制機能性食品、インターロイキン１２誘導組成物若しくはインターロイキン１２誘導機能性食品、ＴＧＦ−β活性抑制組成物若しくはＴＧＦ−β活性抑制機能性食品、又は活性酸素捕捉組成物若しくは活性酸素捕捉機能性食品を製造するために使用することができる。
【００３９】
本発明による免疫増強組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
【００４０】
これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
【００４１】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分としての前記画分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明による免疫増強組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明による免疫増強組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
【００４２】
本発明による免疫増強組成物は、これに限定されるものではないが、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明による免疫増強組成物を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
【００４３】
また、形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、機能性食品や健康食品（飲料を含む）、又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。更には、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、添加剤（例えば、食品添加剤）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤等に添加することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
《実施例１：キノコ熱水抽出液の生物活性試験》
（１）キノコ熱水抽出液の調製
市販の岩手県産マツタケ子実体２５０ｇを凍結乾燥して水分を除去した後、粉砕して粉末３５ｇを得た。
１リットル容量のビーカーに、前記粉末の一部（２０ｇ）と純水８００ｍＬとを加え、スターラー撹拌下、９３〜９８℃のウオーターバス中で３時間抽出した。抽出終了後、室温まで冷却し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間）により、上清を得た。
上清を得た後の沈殿部には、純水５００ｍＬを加え、前記と同様の処理を行なった。この操作を計３回行ない、各操作で得られた上清と、先に得られた上清とを一緒にした後、分子量３５００分画の透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，米国）に入れ、水道水の流水中で２日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した後、凍結乾燥を行ない、粉末１．１２ｇを得た。
更に、市販食用キノコ１３種類につき、前記と同様の処理を行ない、それぞれ、粉末を得た。キノコの種類と収率（対乾燥菌体質量％）を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
（２）キノコ熱水抽出液の生物活性検定
前項（１）で粉体として得られた食用キノコ抽出液を、マウスに経口投与し、腸管リンパ球のキラー活性誘導に及ぼす影響を検討した。すなわち、腫瘍細胞を盲腸壁に移植したマウスから、腸間膜リンパ節細胞を取り出し、試験管内で前記腫瘍細胞で再刺激した時のキラー活性を測定することにより、生物活性を検定した。用いた腫瘍細胞は、マウス白血病細胞Ｐ８１５及びＢ７／Ｐ８１５細胞であり、これらは九州大学生体防御医学研究所原田守博士から供与された細胞株を、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で継代維持している。動物は日本ＳＬＣから購入した雌性ＤＢＡ／２マウスであり、予備飼育した後、８週齢で実験に用いた。
【００４８】
予め、ペントバルビタール（大日本製薬）５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与して麻酔状態にしたマウスを固定し、その腹部をはさみとピンセットとで開き、盲腸部を取り出し、１／８Ｇの歯科用注射針（旗印本木注射針）を装着した１ｍＬ容注射筒を用いて、Ｂ７／Ｐ８１５細胞（１×１０６個／５０μＬ）を盲腸壁下に移植し、解剖用ホッチキスを用いて腹部を閉じた。麻酔からさめたマウスを飼育ケージに入れ、通常の飼育環境下で飼育した。そして、腫瘍細胞移植翌日から、経口投与用ゾンデを用いて、各サンプル５００ｍｇ／ｋｇ／日を連日１０日間経口投与した（１群当たり５〜１０匹）。
【００４９】
最終投与の翌日にマウスを屠殺し、腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）、５×１０−５ｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノール、２０ｍｍｏｌ／Ｌの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、及び３０μｇ／ｍＬゲンタマイシンをそれぞれ添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調整し、エフェクター細胞として用いた。
【００５０】
一方、刺激細胞は、以下の手順で調製した。すなわち、Ｐ８１５細胞又はＢ７／Ｐ８１５細胞を１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中に５×１０６個／ｍＬになるように懸濁し、マイトマイシンＣ（シグマ）を５０μｇ／ｍＬになるように加え、５％炭酸ガス培養器中で３０分間反応させた後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄し、細胞濃度を１×１０５個／ｍＬに調整した。
【００５１】
混合リンパ球・腫瘍細胞反応（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、以下の条件で検討した。
すなわち、９６ウエルの細胞培養用平底マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７２；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，米国）に、前記エフェクター細胞及び／又は刺激細胞を０．１ｍＬずつ加え、５％炭酸ガス培養器中で３日間培養し、細胞をフィルター上に回収した。なお、エフェクター細胞及び刺激細胞の両方を加える場合には、両者の細胞数比を１２．５（エフェクター細胞数／刺激細胞数）とした。本測定系においては、前記エフェクター細胞が、混合リンパ球・腫瘍細胞反応における「リンパ球」として機能し、前記刺激細胞が「腫瘍細胞」として機能する。培養終了の２４時間前に、プレートの各ウエルに３Ｈ−チミジン（アマシャムジャパン）３７ｋＢｑを加えた。回収した細胞を５％トリクロロ酢酸で充分に洗浄した後、乾燥し、液体用バイアルに入れ、液体シンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで、放射能活性を測定した。
【００５２】
スティミュレーション・インデックス（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ；Ｓ．Ｉ．）は、式：
［Ｓ．Ｉ．］＝（Ｂｍｉｘ−Ｂｓ）／（Ｂｅ−Ｂｓ）
［式中、Ｂｍｉｘは、エフェクター細胞及び刺激細胞混合培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｓは、刺激細胞単独培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｅは、エフェクター細胞単独培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）である］
により算出した。
【００５３】
一方、リンパ球・腫瘍細胞の混合培養による細胞傷害活性誘導反応（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ Ｍｉｘｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、以下の条件で検討した。
すなわち、２４ウエルの細胞培養用マイクロプレート（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌａｓｔａｒ）（Ｃｏｓｔａｒ ３５２４；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，米国）に、前記エフェクター細胞及び刺激細胞（エフェクター細胞数／刺激細胞数＝１２．５）を１．０ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で３日間培養した。培養終了後、細胞を回収し、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した。顕微鏡を用いて、細胞懸濁液中のエフェクター細胞数のみを計数し、エフェクター細胞数を２．５×１０６個／ｍＬに調整した。
一方、別に用意したＰ８１５細胞をクロム酸ナトリウム（アマシャムジャパン）と３７℃で２０分間反応させた。未結合の放射性物質を１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄することにより除去し、放射性クロム標識腫瘍細胞を５×１０４／ｍＬに調整した。
【００５４】
前記エフェクター細胞又はその２倍希釈系列と放射性クロム標識腫瘍細胞とを試験管に０．１ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。反応終了後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地をそれぞれの試験管に１．５ｍＬずつ加え、ミキサーでよく混合した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ，５分間，４℃）して上清を分離し、放射能活性をガンマカウンターを用いて測定した。
【００５５】
特異的傷害率［Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｙｓｉｓ；Ｓ．Ｌ．（単位＝％）］は式：
［Ｓ．Ｌ．（％）］＝｛（Ｂ−Ｂｆ）／（Ｂｍａｘ−Ｂｆ）｝×１００
［式中、Ｂは実験群上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｆは自然遊離群上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｍａｘは最大遊離群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）である］
により算出した。なお、自然遊離群とは、放射性クロム標識腫瘍細胞単独培養群を意味し、最大遊離群とは、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）処置放射性クロム標識腫瘍細胞群を意味する。
【００５６】
前項（１）で調製したサンプルの混合リンパ球・腫瘍細胞反応、あるいは、リンパ球・腫瘍細胞の混合培養による細胞傷害活性誘導反応に及ぼす影響を測定した結果（エフェクター細胞数／腫瘍細胞数が１２．５の時の値）を表２に示す。マツタケ子実体由来のサンプルで有意の増強がみられた。なお、コントロール群には純水０．２ｍＬを経口投与した。表２において、＊はコントロール群に対してｐ＜０．０５で有意差のあることを示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
《実施例２：マツタケ熱水抽出液及びその陰イオン交換樹脂吸着画分の調製》
呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で樹立及び維持しているマツタケＣＭ６２７−１株菌糸体を滅菌済み培地（３％グルコース，０．３％酵母エキス，ｐＨ６．０）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ１０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で４週間培養を行なった。得られた培養物をホモゲナイザーにかけた後、スターラー撹拌下、９３〜９８℃のウオーターバス中で３時間抽出した。抽出終了後、室温まで冷却し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）により、上清を得た。
沈殿部には純水５００ｍＬを加え、前記と同様の処理を行なった。この操作を計３回行ない、全ての上清を合わせて、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、水道水の流水中で３日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、粉末（画分Ｄ）３．９ｇを得た。
【００５９】
次に、前記粉末（画分Ｄ）を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、予め前記緩衝液で平衡化させておいたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラム（口径＝２ｃｍ，高さ＝２０ｃｍ）にアプライし、次いで、前記緩衝液１００ｍＬを流し、非吸着画分Ｄ１（以下、単に「Ｄ１画分」と称することがある）を得た。次いで、前記緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを加えた溶液２００ｍＬを調製し、前記カラムにかけ、吸着物を溶出し、吸着画分Ｄ２（以下、単に「Ｄ２画分」と称することがある）を得た。得られた非吸着画分及び吸着画分溶液をそれぞれ、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、純水中で３日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、非吸着画分Ｄ１粉末１．９ｇ及び吸着画分Ｄ２粉末１．５ｇを得た。
【００６０】
前記「キノコ熱水抽出液の生物活性試験」（２）と同様の方法によりそれぞれの画分の免疫活性を調べたところ、表３に示すように、吸着画分Ｄ２に活性が確認された。なお、表３において、＊はコントロール群に対してｐ＜０．０１で有意差のあることを示し、＊＊はコントロール群に対してｐ＜０．０５で有意差のあることを示す。また、画分Ｄは、ＤＥＡＥセルロースカラムにかける前の画分を意味する。
【００６１】
【表３】
【００６２】
［吸着画分Ｄ２の理化学的性質の検討］
Ｄ２画分の理化学的性質を検討した。測定方法及びその結果を以下に示す。
【００６３】
（１）糖質の定量
フェノール硫酸法を用いる比色により定量した。Ｄ２画分の糖質含量は、グルコース換算値として１３％であった。
【００６４】
（２）タンパク質の定量
銅フォリン法を用いる比色により定量した。Ｄ２画分のタンパク質含量は、アルブミン換算値として８６％であった。
【００６５】
（３）糖質の組成分析
封入管にＤ２画分１．０ｍｇと２ｍｏｌ／Ｌトリフルオロ酢酸０．２ｍＬとを入れ、１００℃で６時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固し、残渣を得た。残渣を純水５００μＬに溶解し、純水で２倍又は１０倍希釈した。この溶液５０μＬに内部標準物質ヘプトース５００ｎｇを添加し、カラムＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧＬＣ−９Ａ １５ｃｍ×４．６ｍｍＩＤ（東ソー）と検出器分光光度計ＲＦ−５３５（島津製作所）とを装着した高速液体クロマト装置ＬＣ−９Ａ（島津製作所）にアプライした。カラム温度は７０℃であり、移動相及びその流速は０．５Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．７）及び０．４ｍＬ／分であった。ポストカラム標識の条件は、反応試薬として１％アルギニン／３％ホウ酸を用い、流速は０．５ｍＬ／分であり、反応温度は１５０℃であり、検出波長はＥＸ３２０ｎｍ及びＥＭ４３０ｎｍである。
糖組成は、多い方から順に、マンノース４７．７μｇ／ｍｇ、ガラクトース３２．４３μｇ／ｍｇ、グルコース２５．０９μｇ／ｍｇ、アラビノース１２．０９μｇ／ｍｇ、リボース８．３０μｇ／ｍｇ、キシロース３．７５μｇ／ｍｇ、及びラムノース０．４４μｇ／ｍｇであった。
【００６６】
（４）アミノ酸組成分析
封入管にＤ２画分１．０ｍｇと６ｍｏｌ／Ｌ塩酸０．１ｍＬとを入れ、１１０℃で２２時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固し、残渣を得た。残渣を純水１．０ｍＬに溶解し、その５０μＬをアミノ酸分析に用いた。装置は日立Ｌ−８５００型アミノ酸分析計（日立製作所）であり、ニンヒドリン発色により定量した。
アミノ酸組成は、アスパラギン酸及びアスパラギン１４．１２ｍｏｌ％、トレオニン６．３９ｍｏｌ％、セリン７．６４ｍｏｌ％、グルタミン酸及びグルタミン１３．８３ｍｏｌ％、グリシン１４．０３ｍｏｌ％、アラニン７．７７ｍｏｌ％、バリン５．３６ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．８７ｍｏｌ％、メチオニン１．１１ｍｏｌ％、イソロイシン３．７０ｍｏｌ％、ロイシン５．２０ｍｏｌ％、チロシン１．５１ｍｏｌ％、フェニルアラニン２．２８ｍｏｌ％、リシン４．０５ｍｏｌ％、ヒスチジン１．６７ｍｏｌ％、アルギニン２．５２ｍｏｌ％、及びプロリン７．９３ｍｏｌ％であった。
【００６７】
（５）分子量分布の測定
Ｄ２画分１．０ｍｇを純水１．０ｍＬに溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液を得た。この濾液を、カラムＡｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−６２０ ５０ｃｍ×７．６ｍｍＩＤ（旭化成）、示差屈折計検出器ＲＩＤ−６Ａ（島津製作所）、及び紫外部検出器ＳＰＤ−６Ａ（島津製作所）を装着した高速液体クロマト装置ＬＣ−９Ａ（島津製作所）にアプライした。カラム温度は室温であり、移動相及びその流速は純水及び０．５ｍＬ／分であった。
分子量分布は、約４．５万〜１００万の間に幅広く分布した。その中でピークトップが５つ見いだされ、それぞれの推定分子量は、約４．５万、約１２万、約１６万、約３８万、及び１００万以上であった。
【００６８】
（６）等電点分析
Ｄ２画分１９０μｇを純水２０μＬに溶解した後、その半量に４０％（体積／体積）程度のサッカロースを加え、電気泳動を実施した。電気泳動の条件は以下のとおりである。ゲル：ＩＥＦ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ（４％，ｐＨ３〜１０；テフコ社）
泳動用緩衝液：（陰極）０．０４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、（陽極）０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液
泳動条件：１００Ｖで３０分間泳動を行ない、続いて、３００Ｖで２０分間泳動を行ない、更に、５００Ｖで４０分間泳動を行なった。
ＰＩマーカー：各バンドが１．３５ｇ（ファルマシア）
【００６９】
３本のブロードなピークが検出された。メインバンドは４．８付近（４．５〜５．２）で、その他に７．６付近（７．３５〜８．０）と９．２付近（８．６５〜９．３）にバンドがあった。
【００７０】
（７）紫外分光分析（ＵＶ）
純水に溶解し、０．５ｍｇ／１０ｍＬ濃度で測定した。装置として、２５００ＰＣ（島津製作所）を使用した。２４０〜２６０ｎｍにピークが見出された。
【００７１】
（８）核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）
測定条件は以下のとおりである。
（ｉ）１Ｈ一次元ＮＭＲ測定
測定装置としては、ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ−５００型（Ｖａｒｉａｎ社）を使用した。溶媒としてＤ化塩酸グアニジウムＤ２Ｏ溶液を使用した。濃度は４ｍｏｌ／Ｌであり、内部標準としてＤＳＳを用い、温度は２３℃で測定を実施した。
【００７２】
得られたスペクトルを図１に示す。糖の１位のプロトンに特徴的な４．５ｐｐｍ〜５．０ｐｐｍ付近に、ガラクトース又はグルコースのα１位と考えられるピークが観測された。また、５．０〜５．２ｐｐｍ付近に、ガラクトース又はグルコースのβ１位と考えられるピークが観測された。
【００７３】
（ii）１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定
観測周波数は１５０．８ＭＨｚで測定した。濃度は２０．３ｍｇ／０．７５ｍＬであり、内部標準は重メタノール（３％重水溶液，δ＝４９ｐｐｍ）であり、温度は４５℃であり、デカップリングは１Ｈ完全デカップリングである条件で測定を実施した。
結果を図２に示す。１０３〜１０４ｐｐｍ付近のブロードなピークは、ガラクトース又はグルコースの１位の炭素で、β型でグルコシド結合したものと考えられる。１０２．９６ｐｐｍ及び１０２．５１ｐｐｍの各ピークは、それぞれマンノースのα１位とβ１位でクルコシド結合したものと考えられる。９９．１７ｐｐｍのピークは、ガラクトース又はグルコースのα１位で、やはりグルコシド結合したものと考えられる。
【００７４】
１位以外については、６０〜８０ｐｐｍのピークの化学シフトを解析した。各単糖の化学シフトを比較すると、ガラクトース又はグルコースのβ２位の炭素、あるいは、マンノースの２位（α，β）の炭素が変化していると考えられた。また、ガラクトース又はグルコースのα型の炭素については、化学シフトが単糖と比較して変化しているものが見当たらないので、６位が変化し、マンノースの４位のシグナル（６７．８ｐｐｍ）と重なっていると推定した（このピークの強度が大きいことから推測した）。以上のことから、１位以外で結合に関与していると推定される糖の位置は、ガラクトース又はグルコースの２位（β型）と６位（α型）、あるいは、マンノースの２位（α、β型）である。但し、ピークが全般的にブロードで、Ｓ／Ｎも悪いため、解析の精度は高くない。
【００７５】
（１０）円偏光二色性分析（ＣＤ）
測定条件は以下のとおりである。
測定装置としてＪＡＳＣＯＪ−５００Ａを使用し、溶媒として水を使用した。タンパク質濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬであり、波長範囲は２００〜２５０ｎｍであり、セル長は１ｍｍであり、温度は室温（２４℃）であり、積算回数は８回である条件で測定を実施した。
【００７６】
得られたＣＤスペクトルを図３に示す。ＣＤ値（縦軸）は、平均残基楕円率［θ］で示した。［θ］の単位はｄｅｇ・ｃｍ２・ｄｅｃｉｍｏｌ−１となる。［θ］に換算する際の平均残基分子量は１０３．４５を用いた（アミノ酸分析から求めた）。２次構造の解析は、Ｃｈｅｎらの方法に従って算出したところ、αヘリックス１７％、βシート１８％、及び不規則構造６５％であった。
【００７７】
［吸着画分Ｄ２の生物活性評価例］
（１）吸着画分Ｄ２のサルコーマ１８０腫瘍増殖抑制活性
動物としては、日本クレア（株）から購入した雌性ＩＣＲマウスを用い、腫瘍としては、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で雌性ＩＣＲマウスの腹腔内で継代維持しているサルコーマ１８０細胞を用いた。すなわち、５週齢の雌性ＩＣＲマウスの腋窩部皮下に、サルコーマ１８０細胞を１０６個移植した（１群＝１０匹）。移植後翌日から、前記実施例２で得られた吸着画分Ｄ２の所定量（１．０ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，又は５０ｍｇ／ｋｇ）を隔日に１０回、腹腔内投与し、移植後２５日目にマウスを屠殺して腫瘍結節を摘出し、重量を測定した。対照としては生理食塩水投与群を設けた。
【００７８】
増殖抑制率（単位＝％）は、式：
［増殖抑制率（％）］＝｛（Ｗｃ−Ｗ）／Ｗｃ｝×１００
［式中、Ｗはサンプル処置群の平均結節重量（単位＝ｇ）であり、Ｗｃは生理食塩水処置群の平均結節重量（単位＝ｇ）である］
により算出した。
結果を表４に示す。なお、＊はコントロール群に対してｐ＜０．０５で有意差のあることを示す。表４から明らかなように、Ｄ２画分投与により有意の増殖抑制がみられた。
【００７９】
【表４】
【００８０】
（２）吸着画分Ｄ２のサイトカイン誘導活性
８週齢の雌性ＤＢＡ／２マウスを屠殺後脱血し、腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、細胞数を２×１０６個／ｍＬに調整した。前記実施例２で得られた吸着画分Ｄ２を培地に溶解し、フィルターで除菌し、サンプル溶液２５０μｇ／ｍＬを調製した。９６ウエルの細胞培養用平底マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７２；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，米国）に、前記細胞及びサンプルを０．１ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で１８時間培養した後、遠心分離により、上清を分離した。そして、培養上清中の総（ｔｏｔａｌ）インターロイキン１２含量を、市販測定キット（Ｉｎｔｅｒｔｅｓｔ １２Ｘ；Ｇｅｎｚｙｍｅ社，米国）を用いて測定した。結果を表５に示す。表５から明らかなように、Ｄ２画分には、インターロイキン１２誘導活性が認められた。
【００８１】
【表５】
【００８２】
（３）吸着画分Ｄ２の免疫抑制物質ＴＧＦ−β結合活性
タンパク質吸着の少ないポリプロピレンチューブ（マルチシリコナイズチューブ，Ｓａｆｅ Ｓｅａｌ Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｔｕｂｅ；フナコシ）中で、ヒト遺伝子組み替えトランスフォーミング増殖因子β１［Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β１（以下、ＴＧＦ−β１）；フナコシ］標品を２％アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１００ｎｇ／ｍＬ溶液に調整した。一方、前記実施例２で得られた吸着画分Ｄ２を２％アルブミン含有リン酸緩衝液に溶解させ、２ｍｇ／ｍＬ濃度に調整した。前記ＴＧＦ−β１溶液とＤ２画分溶液とを０．５ｍＬずつ、タンパク質吸着の少ないチューブに入れ、２２℃で３時間反応させた。反応終了後、反応液中のＴＧＦ−β１含量を、市販の測定キット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ β１ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ；フナコシ）を用いて測定した。
【００８３】
結合率（単位＝％）は、式：
［結合率（％）］＝｛（Ｔｃ−Ｔ）／Ｔｃ｝×１００
［式中、ＴはＤ２画分添加群のＴＧＦ−β１実測値（単位＝ｎｇ／ｍＬ）であり、Ｔｃは２％アルブミン含有リン酸緩衝液添加群のＴＧＦ−β１実測値（単位＝ｎｇ／ｍＬ）である］
により算出した。
結果を表６に示す。Ｄ２画分添加群では、Ｄ２画分とＴＧＦβ１との結合が認められた。
【００８４】
【表６】
【００８５】
（４）吸着画分Ｄ２の活性酸素捕捉活性
３．０ｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン溶液１０００μＬ、２Ｕ／ｍＬキサンチンオキシダーゼ（ベーリンガーマンハイム）溶液５μＬ、８ｍｇ／ｍＬ−Ｄ２画分５００μＬ、及びＲＰＭＩ１６４０培地４９５μＬを試験管に入れた後、２７０μｍｏｌ／Ｌの２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−α］ピラジン−３−オン（ＣＬＡ−ｐｈｅｎｙｌ；東京化成）溶液１２０μＬを添加した。続いて、反応槽を３７℃に保ったケミルミネッセンスメーター（アロカ）に入れ、３０分間反応させ、発生するケミルミネッセンス量を経時的に測定した。
【００８６】
捕捉活性（単位＝％）は、式：
［捕捉活性（％）］＝｛（Ｃｃ−Ｃ）／Ｃｃ｝×１００
［式中、ＣはＤ２画分添加群のケミルミネッセンス量であり、Ｃｃはリン酸緩衝液添加群（対照群）のケミルミネッセンス量である］
により算出した。結果を表７に示す。表７から明らかなように、Ｄ２画分に活性酸素捕捉活性が認められた。
【００８７】
【表７】
【００８８】
（５）吸着画分Ｄ２の抗腫瘍活性
呉羽化学工業株式会社生物医学研究所において５０ｍＬ容の細胞培養用フラスコ（３０１４；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）中で継代維持しているスイスアルビノ３Ｔ３株及びＳＶ４０形質転換３Ｔ３細胞株［大日本製薬株式会社ラボラトリープロダクツ部（大阪）より入手］を、０．１２５％トリプシン溶液（シグマ社）で数分間処理することによりフラスコ器壁から遊離させた。洗浄後、１０％ウシ胎児血清（５６℃で３０分間処理したもの）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地に懸濁し、２×１０３個／ｍＬに調整した後、０．１ｍＬずつ、９６ウエルの細胞培養用平底マイクロテストプレート（３０７２；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）の各ウエルに分注した。
【００８９】
３７℃の５％炭酸ガス培養容器内で２４時間培養した後、前記実施例２で得られた吸着画分Ｄ２の所定量又は培地０．１ｍＬを加え、更に２４時間培養した。なお、培養終了６時間前に、３Ｈ−チミジン（アマシャムジャパン）１μＣｉ／ウエルを添加した。培養終了後、細胞を濾紙上に回収し、５％三塩化酢酸で充分に洗浄した後、乾燥させ、細胞に取り込まれた放射能を液体シンチレーションカウンターで測定した。吸着画分Ｄ２の５０％阻止濃度（ＬＤ５０）は、ＳＶ４０形質転換３Ｔ３細胞株で約５０μｇ／ｍＬであり、スイスアルビノ３Ｔ３株で約４０μｇ／ｍＬであった。また、ＭＴＴ法によりＬＤ５０を測定したところ、３Ｈ−チミジン法により得られた前記結果とほぼ同様の結果が得られた。
【００９０】
《実施例３：マツタケアルカリ溶液抽出液及びその陰イオン交換樹脂吸着画分の調製》
前記実施例２と同様の方法で調製したマツタケＣＭ６２７−１株菌糸体培養物を、ホモゲナイザーにかけた後、全体の濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌになるまで水酸化ナトリウム溶液を添加した。スターラー撹拌下、２２℃で１時間抽出した。抽出終了後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，２０分間，４℃）により、上清を得た。
沈澱部に０．３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加え、前記と同様の処理を行ない、上清を得た。更に、沈澱部に０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を加え、前記と同様の処理を行ない、上清を得た。全ての上清を合わせて、前記上清に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え、ｐＨを７．０に調整した後、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、水道水の流水中で３日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、粉末（以下、画分Ａと称する）４．３ｇを得た。
【００９１】
次に、前記粉末（画分Ａ）を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、予め前記緩衝液で平衡化させておいたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラム（口径＝２ｃｍ，高さ＝２０ｃｍ）にアプライし、次いで、前記緩衝液１００ｍＬを流し、非吸着画分Ａ１（以下、単に「Ａ１画分」と称することがある）を得た。次いで、前記緩衝液に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを加えた溶液２００ｍＬを調製し、前記カラムにかけ、吸着物を溶出し、吸着画分Ａ２（以下、単に「Ａ２画分」と称することがある）を得た。得られた非吸着画分及び吸着画分溶液をそれぞれ、透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，分子量３５００分画）に入れ、純水中で３日間透析した。透析膜内液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行ない、非吸着画分Ａ１粉末及び吸着画分Ａ２粉末を得た。
【００９２】
［画分Ａの生物活性評価例］
前記「キノコ熱水抽出液の生物活性試験」（２）と同様の方法によりＴ細胞増強活性を評価したところ、画分Ａ投与群（投与量＝２５０ｍｇ／ｋｇ）の活性は、混合リンパ球・腫瘍細胞反応において１３０％（コントロール群に対する％）であり、リンパ球・腫瘍細胞混合培養による細胞傷害活性誘導反応において１３１％（コントロール群に対する％）であった。
また、前記「吸着画分Ｄ２の生物活性評価例」（２）と同様の方法によりサイトカイン誘導活性を評価したところ、培地コントロール群の総インターロイキン１２含量が検出限界以下であったのに対して、画分Ａ添加群の総インターロイキン１２含量は６９ｐｇ／ｍＬであった。
更に、前記「吸着画分Ｄ２の生物活性評価例」（３）と同様の方法によりＴＧＦ−β結合活性を評価したところ、画分Ａの結合活性は２６％であった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の免疫増強組成物によれば、免疫能を増強することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、免疫増強（但し、腫瘍増殖抑制を除く）組成物。
【請求項２】
前記免疫増強が、キラー活性誘導、インターロイキン１２誘導、ＴＧＦ−β活性抑制、又は活性酸素捕捉である、請求項１に記載の免疫増強組成物。
【請求項３】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、キラー活性誘導組成物。
【請求項４】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、インターロイキン１２誘導組成物。
【請求項５】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、ＴＧＦ−β活性抑制組成物。
【請求項６】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、活性酸素捕捉組成物。
【請求項１】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、免疫増強（但し、腫瘍増殖抑制を除く）組成物。
【請求項２】
前記免疫増強が、キラー活性誘導、インターロイキン１２誘導、ＴＧＦ−β活性抑制、又は活性酸素捕捉である、請求項１に記載の免疫増強組成物。
【請求項３】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、キラー活性誘導組成物。
【請求項４】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、インターロイキン１２誘導組成物。
【請求項５】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、ＴＧＦ−β活性抑制組成物。
【請求項６】
マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、活性酸素捕捉組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２０９１５１（Ｐ２００９−２０９１５１Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４１７６４（Ｐ２００９−１４１７６４）
【出願日】平成２１年６月１５日（２００９．６．１５）
【分割の表示】特願２００１−５４９６７５（Ｐ２００１−５４９６７５）の分割
【原出願日】平成１２年１２月２８日（２０００．１２．２８）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１５日（２００９．６．１５）
【分割の表示】特願２００１−５４９６７５（Ｐ２００１−５４９６７５）の分割
【原出願日】平成１２年１２月２８日（２０００．１２．２８）
【出願人】（０００００１１００）株式会社クレハ (477)
【Ｆターム（参考）】
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