新規微生物、マガキ餌料用の該新規微生物および該新規微生物を用いたマガキの養殖方法
【課題】新規微生物、マガキ餌料用の該新規微生物および該新規微生物を用いたマガキの養殖方法を提供する。
【解決手段】パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株（以下、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄと略記）、および殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ、ならびにパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを単独でまたはキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）と混合して用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法。前記混合物中に占めるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの量は１／４〜３／４であることが好ましい。
【解決手段】パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株（以下、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄと略記）、および殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ、ならびにパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを単独でまたはキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）と混合して用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法。前記混合物中に占めるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの量は１／４〜３／４であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パブロバ目に属する新規微生物であるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株、マガキ餌料用の該新規株、該新規株を用いたマガキの養殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二枚貝をはじめとする魚介類の養殖においては、その種類に応じて種々の養殖用餌料が用いられているが、一般的に、養殖に要するコストに占める割合は餌料代が最も高く、低コストで魚介類の養殖を行うためには、養殖のごく初期の段階から、安価かつ成長促進効果の高い餌料を選択して用いることが重要である。
このような中、マガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ、以下、マガキと略記）の養殖においては、珪藻類であるキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）が餌料として一般的に良く用いられ（特許文献１参照）、特にマガキの孵化直後においては、キートセラス カリストランスと海洋微細藻類の一種であるパブロバ ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ、以下、パブロバ ルテリと略記）との混合餌料が用いられることがある。
【特許文献１】特開平６−１０５６５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記餌料を用いて養殖を行っても、マガキの成長促進効果は十分満足できるものではなく、従来とは異なるマガキ養殖用餌料の開発が望まれている。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、新規微生物、マガキ餌料用の該新規微生物および該新規微生物を用いたマガキの養殖方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株である。
【０００５】
請求項２に記載の発明は、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表されるパブロバ目に属する藻類である。
【０００６】
請求項３に記載の発明は、殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株である。
【０００７】
請求項４に記載の発明は、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表される塩基配列と９６％以上の相同性を有し、殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ目に属する藻類である。
【０００８】
請求項５に記載の発明は、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株を用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法である。
【０００９】
請求項６に記載の発明は、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株とキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）との混合物を用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法である。
【００１０】
請求項７に記載の発明は、前記混合物中に占めるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株の量が１／４〜３／４である請求項４に記載の殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規株であるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株を提供でき、さらに、該新規株を単独でまたはキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）と混合してマガキ養殖の餌料として用いることで、マガキの成長促進効果を高め、良質なマガキを低コストで養殖することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株（以下、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄと略記する）は、淡水や陸上にも見られるが、主に海水中に微細浮遊生物として見出される。そして後述の実施例に示すように、海水中より採取したサンプルを培養および単菌化することで得られる。
【００１３】
本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託手続きを行い、平成１７年１０月３１日付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７０４として受領されたが、「混在菌による汚染が確認されたため」との理由により受託証不交付となった。そして現在、本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、電源開発株式会社において、分譲可能な状態で保存されている。
【００１４】
本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、後述の実施例で述べるように、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表される塩基配列を有する。また、本発明は、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表されるパブロバ目に属する藻類、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表される塩基配列と９６％以上の相同性を有し、殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ目に属する藻類を含む。
【００１５】
（培養的性質）
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの培養的性質は以下に示す通りである。すなわち、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、肉汁寒天平板培養、肉汁液体培養、肉汁ゼラチン穿刺培養、リトマス・ミルクのいずれにおいても生育させることはできず、以下に示す組成の人工合成培地にて培養することができる。
培地組成；硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｍｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１２ ０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸ナトリウム五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ、人工海水（千寿製薬株式会社製）３７ｇ／ｌの液体培地
なお、前記組成の培地に、例えば、粉末寒天１２ｇ／ｌを添加し作製した寒天培地を用いることもできる。
【００１６】
培地のｐＨは７．９が好ましく、培地を滅菌前にｐＨ調整する。培地の滅菌条件は、オートクレーブで１２１℃、１０分間であることが好ましい。
また、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは好気性であり、培養方法は通気・撹拌培養が好ましい。この時の通気量は２Ｌ／分程度が好ましい。
さらに、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは海洋微細藻類であり光要求性を有するため、培養中は照度６０００ｌｕｘ程度の光照射が必要である。ただし、明暗周期は不要である。
また、培養温度は２５℃程度であることが好ましく、以上のような条件下で６日間培養することにより、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを良好に生育させることができる。
【００１７】
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、前記条件にて６日間培養後に植え継ぎを行うことで継代培養することができる。
また、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの保管は、凍結乾燥法、Ｌ−乾燥法および凍結法（−８０℃程度）のいずれも適さないため、前記組成の液体培地を用いてウェルプレートにより、約１ヶ月の間隔で適宜植え継ぎを行うことで保管する。保管中は、前記条件にて静置培養にて、２００ｌｕｘ程度の光照射を行う。保管温度は２５℃程度が好ましい。
【００１８】
本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、殻高１．５ｍｍ以上のマガキの養殖において餌料として用いることができる。ここで殻高とは、稚貝の貝殻における蝶番から先端までの長さを指す。すなわち、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、孵化直後ではなく孵化から所定の生育期間を経過したマガキの稚貝に対する餌料として好適に用いることができる。この時用いるマガキの大きさは、殻高１．５ｍｍ以上のものであれば特に限定されないが、殻高１．５ｍｍ〜６．５ｍｍのものであることが好ましい。ただし、本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、特に後述のように他の海洋微細藻類との混合餌料として用いた場合には、稚貝の生育を促進させる効果が高いことから、殻高が１．５ｍｍを超えたらできるだけ早期に給餌を開始することがより好ましい。
【００１９】
また、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄのマガキに対する餌料効果は、マガキの殻高の伸張および乾重量値の増加をもって確認することができる。ここで乾重量値とは、所定の条件により乾燥された軟体部を含めたマガキの重量を示す。
【００２０】
マガキに対するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの給餌方法は、単独給餌でも良いが、特定の他の海洋微細藻類との混合給餌が好ましい。
混合給餌の場合には、混合する対象の餌料は、マガキに対する餌料効果を有するものであれば特に限定されず、種々の海洋微細藻類等を用いることができるが、なかでもキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ、以下、キートセラス カリストランスと略記）であることが好ましい。
【００２１】
このような混合餌料を用いる場合には、混合餌料中に占める本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの量は、特に限定されないが、１／４〜３／４であることが好ましく、１／２であることがより好ましい。ここで、「量」とは、細胞数のことを示す。パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを１／２含有する混合餌料を用いてマガキの養殖を行うと、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄおよび混合対象である餌料をそれぞれ単独で給餌した場合よりも、マガキの生育をより促進させる相乗効果が得られ、特に混合する対象の餌料がキートセラス カリストランスの場合に有効である。
【００２２】
給餌する際のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの養殖水中における密度は特に限定されず、養殖水中におけるマガキの密度に応じて適宜選定すれば良い。具体的には、例えば、単独給餌の場合、養殖水中におけるマガキの密度が２５〜１５０個／５０００ｍｌである場合には、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの養殖水中における密度は、３〜１２万細胞／ｍｌであることが好ましい。混合給餌である場合には、混合餌料の密度を３〜１２万細胞／ｍｌとすればよく、したがって、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの密度は、上記密度に混合餌料中の混合比率を乗じた値となる。なお、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは単細胞藻類であるため、前記密度の単位「細胞／ｍｌ」は、「個／ｍｌ」と同義である。
【００２３】
マガキに対するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの給餌回数は特に限定されず、１回の給餌に供するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの量に応じて適宜調整すれば良い。例えば、給餌する際のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの養殖水中における密度が、前記の好ましい値である時は、給餌回数は１回／日で十分である。
【００２４】
上記の点を除けば、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを給餌する際の条件およびマガキ稚貝の養殖方法は、従来公知の条件および方法を適用すれば良い。
【００２５】
一般的にパブロバ目の藻類は、環境変化の影響を受けやすく安定性に劣るため、長期の保存に適さないことが知られている。しかし、本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、冷暗所（例えば、４℃）において保存することで、良好な状態を維持できる。したがって、保存安定性の面でも、マガキ稚貝の餌料として好適に用いることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
（パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの獲得）
硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｍｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１２ ０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸ナトリウム五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ、人工海水（千寿製薬株式会社製）３７ｇ／ｌ、粉末寒天１２ｇ／ｌを添加し作製した寒天培地へ、２００２年１１月、北九州市若松区脇田海岸の海水から採取したサンプル１００μｌを添加しスクリーニングを行った。
【００２８】
（形態的性質）
前記培地上で、２５℃、２０日間培養した結果、直径０．２ｍｍ程度の茶色の海洋微細藻類のコロニーが得られた。コロニーの形は点状で、隆起のない扁平状であった。周縁は全縁であり、表面はスムーズな形状であった。また、コロニーは不透明でバター様の粘稠度であった。
変異によるコロニー形態の変化は見られず、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化も見られなかった。
【００２９】
コロニーを形成している海洋微細藻類は、大きさが６〜８μｍの単細胞藻類であり、黄褐色で二本の鞭型鞭毛とハプトネマを有していた。また、色素体としてクロロフィルａ、ｃ１、ｃ２およびｃ３を有しており、管状クリステ型のミトコンドリアを有していた。
以上の性質から、得られた海洋微細藻類は、ハプト藻綱の藻類であると判断された。
さらに、得られた海洋微細藻類は、不等長の鞭毛を有し、長鞭毛が細毛（非管状毛）またはこぶ状鱗片で被われており、細胞が有機質または石灰化した鱗片で覆われていないことが確認された。これらの形態的性質はハプト藻綱パブロバ目の藻類に特有で、その他のハプト藻綱の藻類であるイソクリシス目、円石藻目およびプリムネシウム目には見られないことから、得られた海洋微細藻類は、ハプト藻綱パブロバ目に分類される藻類であると判断された。
【００３０】
（塩基配列）
上記で得られた海洋微細藻類から、従来公知の方法に従ってキアゲンのキットを用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、１８Ｓｒ ＤＮＡの領域を増幅させてシーケンス解析を行い、１８Ｓｒ ＤＮＡの領域の塩基配列を測定した。得られた１８Ｓｒ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
【００３１】
（系統解析）
得られた１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を、公共のデータベースである日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）と照合して相同性を検索し、系統解析を行った。その結果得られた系統樹を図７に示す。
その結果、得られた海洋微細藻類は、パブロバ目に分類され、しかも単独分岐していることから、新種の藻類であるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄであると判断された。
【００３２】
（アミノ酸組成）
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄのアミノ酸組成について、トリプトファン以外のアミノ酸はアミノ酸自動分析法により、トリプトファンは高速液体クロマトグラフ法によりそれぞれ分析を行い、近縁種であるパブロバ ルテリと比較した。結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
（脂肪酸組成）
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの脂肪酸組成について、ガスクロマトグラフ法により分析を行い、近縁種であるパブロバ ルテリと比較した。結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
（基礎成分組成）
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの基礎成分組成を下記の方法により解析し、近縁種であるパブロバ ルテリと比較した。結果を図９に示す。
水分 常圧加熱乾燥法
粗タンパク質 ケルダール法
粗脂肪 ジエチルエーテル抽出法
粗繊維 静置法
粗灰分 直接灰化法
可溶無窒素物 全体収支から換算
総カロテン 高速液体クロマトグラフ法
α−カロテン 高速液体クロマトグラフ法
β−カロテン 高速液体クロマトグラフ法
総アスコルビン酸 高速液体クロマトグラフ法
【００３７】
【表３】
【００３８】
（実施例２）
（パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの餌料効果の確認）
実施例１で用いた採取サンプルを、前記培地を用いて２５℃の条件下で７〜１０日間静置培養を行い、茶、緑色のコロニーを形成する海洋微細藻類を獲得した。これらの海洋微細藻類を単菌化するため、１ｍｌの前記成分を含む液体培地に海洋微細藻類を植菌し、静置培養を行い生育させ、増殖したものを新たに１ｍｌの前記液体培地に植菌して生育させる操作を繰り返すことで、海洋微細藻類を単菌化した。その結果、得られた海洋微細藻類５００株程度中に、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄが含まれていた。培養時のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの増殖曲線を図１に示す。
【００３９】
得られたパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを試験餌料区として、稚貝養殖に一般的に用いられる珪藻であるキートセラス カリストランス（日清マリンテック株式会社製）を対照餌料区として、餌料効果の比較検討を行った。
飼育稚貝には、殻高２〜６ｍｍ前後のマガキの着底稚貝を用いた。試験前の稚貝は、自然海水を流した状態で５日ほど無給餌により馴致して保存した。
【００４０】
８ｌ容量プラスチック水槽を、温度調整した飼育水５ｌ（ここで飼育水とは、最終的に１μｍのカートリッジで濾過した後、０．４５μｍのカートリッジで濾過した空気により十分曝気しながら、２３℃に調整された海水を示す）で満たし、この水槽内に１００個体の前記稚貝を載せたフィルタートレイを収容した。稚貝を載せたフィルタートレイは、水槽のほぼ中央の高さに位置するように設置した。各試験餌料区および対照餌料区では、１系列ごとに三つの水槽を用意し、稚貝の殻高値（成長率）は、三つの水槽中の稚貝の平均値により算出した。
【００４１】
給餌は1日1回行い、毎日の給餌前に、あらかじめ餌料である海洋微細藻類の飼育水中における細胞密度を計測し、飼育水中へ海洋微細藻類を、細胞密度が５万細胞／ｍｌとなるように調整して添加した。なおここで、細胞密度とは餌料密度のことを指し、これは他の実施例でも同様である。また、２日目以降は、まず各水槽の残餌量を計測し、各飼育水槽を洗浄済みの水槽と交換後に、温度調整した濾過海水で全換水後に給餌を行った。稚貝を載せたフィルタートレイは２日ごとに交換した。２３℃の恒温飼育室内で１４日間上記操作により稚貝を飼育し、飼育中は飼育水へ通気を行わなかった。
【００４２】
稚貝生育状況による試験続行の可否については、各試験餌料区および対照餌料区の７日目の稚貝の殻高値により判断した。
【００４３】
殻高成長率の計測および算出方法は以下の通りである。すなわち、各水槽で飼育している稚貝１００個体のうち３０個体について、蝶番から貝殻先端までの長さを殻高として実体顕微鏡下で計測した。計測は飼育０日目から開始し、原則として２日ごとに行った。飼育０日目の平均殻高に対する飼育日数ごとの平均殻高の増加分（％）を殻高成長率として算出し評価した。
【００４４】
試験最終日までの殻高成長率は、キートセラス カリストランス試験餌料区では２５．４±４．０％、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験餌料区では１８．６±３．９％と示された。
キートセラス カリストランスとパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの間で、殻高成長率に有意差は示されなかったことから、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは稚貝に対してキートセラス カリストランスと同等程度の餌料効果を有していることが確認された。
【００４５】
（比較例１）
実施例２で述べた方法で海水中から獲得し単菌化した海洋微細藻類５００株程度のうち、プリムネシウム ネマメテクム（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ ｎｅｍａｍｅｔｈｅｃｕｍ）、ナンノクロリス マキュレイト（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｃｕｌａｔｅ）、パブロバ ギランス（Ｐａｖｌｏｖａ ｇｙｒａｎｓ）を試験餌料区として、キートセラス カリストランス（日清マリンテック株式会社製）を対照餌料区として、実施例２と同様の方法で餌料効果の比較検討を行った。
その結果、前記試験餌料区の株はいずれも稚貝の生育に貢献することができず、餌料効果が示されなかった。
【００４６】
（実施例３）
（マガキ稚貝のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄに対する嗜好性の確認）
実施例２で獲得し単菌化したパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを試験餌料区として、稚貝養殖に一般的に用いられる珪藻であるキートセラス カリストランス（日清マリンテック株式会社製）を対照餌料区として、マガキ稚貝の嗜好性の比較検討を行った。
【００４７】
飼育稚貝には、殻高２〜６ｍｍ前後のマガキの着底稚貝を用いた。試験前の稚貝は、自然海水を流した状態で５日ほど無給餌により馴致して保存した。
【００４８】
８ｌ容量プラスチック水槽を、温度調整した飼育水５ｌ（ここで飼育水とは、最終的に１μｍのカートリッジで濾過した後、０．４５μｍのカートリッジで濾過した空気により十分曝気しながら、２３℃に調整された海水を示す）で満たし、この水槽内に４０個体の前記稚貝を載せたフィルタートレイを収容した。稚貝を載せたフィルタートレイは、水槽のほぼ中央の高さに位置するように設置した。各試験餌料区および対照餌料区では、１系列ごとに三つの水槽を用意し、稚貝の殻高値（成長率）は、三つの水槽中の稚貝の平均値により算出した。
【００４９】
給餌は1日1回行い、毎日の給餌前に、あらかじめ餌料である海洋微細藻類の細胞密度を計測し、飼育水中へ海洋微細藻類を、細胞密度が１０万細胞／ｍｌとなるように調整して添加した。２日目以降は、各飼育水槽を洗浄済の水槽と交換後に、温度調整した濾過海水で全換水後に給餌を行った。稚貝を載せたフィルタートレイは２日ごとに交換した。２３℃の恒温飼育室内で１０日間上記操作により稚貝を飼育し、飼育中は飼育水へ通気を行わなかった。
【００５０】
０〜２４時間までの飼育時間経過による飼育水中の餌料密度の減少過程を把握するため、目的密度となるように調整した後の水槽中の餌料密度を測定した。経時による稚貝の摂餌量変化を確認するために、２４時間後および２日目以降の残餌量計測を行った。試料のサンプリングは、水槽の飼育水を十分攪拌した後に実施した。餌料である海洋微細藻類は、稚貝の飼育中に飼育水槽内壁や水槽内機材への非特異的な吸着は見られず、餌料密度の減少は、餌料が飼育稚貝により取込まれたことによると考えられた。
【００５１】
残餌量計測方法は以下の通りである。すなわち、（１）試料のサンプリングにはパスツールピペットを用い、水槽内からランダムに３〜５回サンプリングし、1つのエッペンチューブに採取した。（２）餌料である海洋微細藻類が有動である場合は、１％ホルマリンを容積当たり１％添加し動きを止めた。（３）エッペンチューブ内のサンプリングした試料について、残餌量を３回計測しその平均値を用いた。しかし、計測結果の誤差が大きい場合は、再度計測を行って測定精度を高めた。
【００５２】
求められた残餌料の、飼育開始時の餌料に対する割合を算出して残餌率とし、該残餌率の経時変化をグラフにプロットしたものを図２に示す。図２より、給餌後の稚貝の餌料取り込みによる餌料密度の減少は、対照餌料区であるキートセラス カリストランスと試験餌料区であるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの間で大きな差は確認されなかったことから、稚貝はパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄに対して、キートセラス カリストランスと同程度の嗜好性を示すことが確認された。
【００５３】
（実施例４）
（パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの安定性の確認）
一般的にパブロバ目の藻類は、輸送等による環境変化の影響を受けやすく安定性に劣るため、供給餌料としては適さないとされてきた。そこでパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの安定性を以下の方法により確認した。すなわち、実施例２で獲得し単菌化したパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを用いて、培養の植継ぎ条件として２００ｍｌ三角フラスコにおける通気培養を７日間、５００ｍｌ扁平フラスコにおける通気培養を４日間、１０ｌ瓶における通気培養を５日間行い、細胞密度が５００〜１０００万細胞／ｍｌの培養液を得た。該培養液１０ｌを用いて、１１０００Ｇ、１０分の条件で遠心分離を行い、細胞密度が１億細胞／ｍｌになるまで濃縮し、該濃縮菌体液を冷暗所（４℃）で１０日間保存して、この間の細胞密度を計測した。結果を図３に示す。
【００５４】
図３に示すように、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、冷暗所（４℃）で１０日間保存した場合でも、この間、細胞密度が殆ど低下することなく、細胞自体も良好な状態を維持できることから、餌料として十分な安定性を有していることが確認された。
【００５５】
（実施例５）
（マガキ稚貝に対するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの単独給餌および混合給餌試験）
実施例１で獲得し単菌化したパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ、およびパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの近縁種であるパブロバ ルテリ、稚貝養殖に一般的に用いられる珪藻であるキートセラス カリストランス（日清マリンテック株式会社製）を用いて、マガキ稚貝に対する単独給餌試験および混合給餌試験を行った。
【００５６】
試験区は、単独給餌試験区としてキートセラス カリストランス試験区、パブロバ ルテリ試験区、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区、さらに各餌料を混合した混合給餌試験区として５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区の５つを設定した。なお、ここで「％」とは「細胞個数（濃度）％」のことを指す。
【００５７】
飼育稚貝には、殻高２〜６ｍｍ前後のマガキの着底稚貝を用いた。試験前の稚貝は、自然海水を流した状態で５日ほど無給餌により馴致して保存した。
【００５８】
８ｌ容量プラスチック水槽を、温度調整した飼育水５ｌ（ここで飼育水とは、最終的に１μｍのカートリッジで濾過した後、０．４５μｍのカートリッジで濾過した空気により十分曝気しながら、２３℃に調整された海水を示す）で満たし、この水槽内に４０個体の前記稚貝を載せたフィルタートレイを収容した。稚貝を載せたフィルタートレイは、水槽のほぼ中央の高さに位置するように設置した。各試験餌料区および対照餌料区では、１系列ごとに三つの水槽を用意し、稚貝の殻高値（成長率）は、三つの水槽中の稚貝の平均値により算出した。
【００５９】
給餌は1日1回行い、毎日の給餌前に、あらかじめ餌料である海洋微細藻類の細胞密度を計測し、飼育水中へ海洋微細藻類を、細胞密度が１０万細胞／ｍｌとなるように調整して添加した。２日目以降は、各飼育水槽を洗浄済の水槽と交換後に、温度調整した濾過海水で全換水後に給餌を行った。稚貝を載せたフィルタートレイは２日ごとに交換した。２３℃の恒温飼育室内で１０日間上記操作により稚貝を飼育し、飼育中は飼育水へ通気を行わなかった。
【００６０】
稚貝生育状況による試験続行の可否については、各試験餌料区および対照餌料区の７日目の稚貝の成長率により判断した。
【００６１】
まず、単独給餌および混合給餌に対する稚貝の生残率を確認した。
稚貝の生残率の測定および算出方法は以下の通りである。すなわち、殻高計測時に開口して死亡した個体を取り除き、各水槽でその個体数について記録した。そして、この数値を用いて、飼育開始時の個体数に対する生残個体数の割合を算出し生残率とした。
【００６２】
その結果、試験最終日までの各水槽での生残率は８８〜１００％の範囲にあり、餌料間で生残率に差は認められなかった。
【００６３】
次に、単独給餌および混合給餌に対する稚貝の嗜好性を確認した。
０〜２４時間までの飼育時間経過による飼育水中の餌料密度の減少過程を把握するため、目的密度となるように調整した後の水槽中の餌料密度を測定した。経時による稚貝の摂餌量変化を確認するために、２４時間後および２日目以降の残餌量計測を行った。試料のサンプリングは、水槽の飼育水を十分攪拌した後に実施した。餌料である海洋微細藻類は、稚貝の飼育中に飼育水槽内壁や水槽内機材への非特異的な吸着は見られず、餌料密度の減少は、餌料が飼育稚貝により取込まれたことによると考えられた。
【００６４】
残餌量計測方法は以下の通りである。すなわち、（１）試料のサンプリングにはパスツールピペットを用い、水槽内からランダムに３〜５回サンプリングし、1つのエッペンチューブに採取した。（２）餌料である海洋微細藻類が有動である場合は、１％ホルマリンを容積当たり１％添加し動きを止めた。（３）エッペンチューブ内のサンプリングした試料について、残餌量を３回計測しその平均値を用いた。しかし、計測結果の誤差が大きい場合は、再度計測を行って測定精度を高めた。
【００６５】
求められた残餌料の、飼育開始時の餌料に対する割合を算出して残餌率とし、該残餌率の経時変化をグラフにプロットしたものを図４に示す。図４より、給餌後の稚貝の餌料取り込みによる残餌率の減少は、単独給餌試験区で比較すると、キートセラス カリストランスとパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの間で大きな差は確認されなかった。しかし、パブロバ ルテリでは、前記二つの単独給餌試験区よりも残餌率が高く、すなわち、摂餌量が少ないことを示した。
一方、混合給餌試験区の間でも大きな残餌率の差は確認されなかった。
【００６６】
以上から、稚貝は、単独給餌においてパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄに対して、キートセラス カリストランスと同程度の嗜好性を示し、混合給餌においても、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリと、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとで同程度の嗜好性を示した。
【００６７】
続いて、単独給餌および混合給餌の稚貝に対する餌料効果を確認した。
殻高成長率の計測および算出方法は以下の通りである。すなわち、各水槽で飼育している稚貝４０個体すべてについて、蝶番から貝殻先端までの長さを殻高として実体顕微鏡下で計測した。計測は飼育０日目から開始し、原則として２日ごとに行った。飼育０日目の平均殻高に対する飼育日数ごとの平均殻高の増加分（％）を殻高成長率として算出し評価した。結果を図５に示す。
【００６８】
図５より、試験最終日までの殻高成長率は、単独給餌試験区では、キートセラス カリストランス試験区で２４．３±１．９％、パブロバ ルテリ試験区で−０．３±１．９％、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区で１９．３±４．０％と示された。すなわち、キートセラス カリストランス試験区とパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区では約２０％の殻高成長率を示したが、パブロバ ルテリ試験区では稚貝の殻高を全く成長させることができないという結果が示された。
また、キートセラス カリストランス試験区とパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区との間で、殻高成長率に有意差は確認されず、稚貝の殻高成長に対して同等程度の餌料効果を有していることが確認された。
【００６９】
一方、混合給餌試験区では、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区では２６．３±３．０％、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区では５２．２±８．９％と示された。
【００７０】
５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区の殻高成長率は、それぞれの単独給餌試験区の殻高成長率の平均値の２．２倍の値であり、混合給餌することによる相乗効果を有することが確認された。
これに対し、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区の殻高成長率は、それぞれの単独給餌試験区の殻高成長率の平均値の２．４倍の値であり、混合給餌することによる相乗効果を有し、その効果が５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区よりも高いこと、さらに、５２．２±８．９％という極めて高い殻高成長率を示すことから、キートセラス カリストランスとパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの混合物は、マガキの餌料として極めて優れたものであることが確認された。
【００７１】
続いて、単独給餌および混合給餌に対する稚貝の乾重量増加率を確認した。
乾重量値計測および算出方法は以下の通りである。すなわち、飼育終了後の稚貝の表面を脱塩水で洗浄した後ガラスシャーレに載せ、乾燥器温度６０℃で衝量が得られるまで稚貝を乾燥させた。乾燥後、秤で稚貝の総重量を計測し、シャーレに収容した個体数で割ることで稚貝１個体当たりの乾燥重量を算出した。ここで乾重量値とは、軟体部を含めた稚貝の重量を示す。さらに、飼育前の乾重量値に対する、飼育終了後の乾重量値の増加率を算出し、グラフにプロットしたものを図６に示す。
【００７２】
図６より、乾重量増加率は、単独給餌試験区では、キートセラス カリストランス試験区で６５．８±２７．８％、パブロバ ルテリ試験区で−１１．７±６．７％、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区で５９．８±２１．３％と示された。すなわち、キートセラス カリストランス試験区とパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区では、約６０％の乾重量増加率を示したが、パブロバ ルテリ試験区では軟体部を含めて餌料効果が示されず、稚貝の生育に全く寄与することができないという結果が示された。
また、キートセラス カリストランス試験区とパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区との間で、乾重量増加率に有意差は確認されず、軟体部を含めた稚貝の生育に対して同等程度の餌料効果を有していることが確認された。
【００７３】
一方、混合給餌試験区では、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区では５４．１±１１．８％、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区では１７７．３±２９．３％と示された。
【００７４】
５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区の乾重量増加率は、それぞれの単独給餌試験区の乾重量増加率の平均値の２．０倍の値であり、混合給餌することによる相乗効果を有することが確認された。
これに対し、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区の乾重量増加率は、それぞれの単独給餌試験区の殻高成長率の平均値の２．８倍の値であり、混合給餌することによる相乗効果を有し、その効果が５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区よりも高いこと、さらに、１７７．３±２９．３％という極めて高い殻高成長率を示すことから、キートセラス カリストランスとパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの混合物は、軟体部を含めた稚貝の生育に有用であり、マガキの餌料として極めて優れたものであることが確認された。
【００７５】
以上により、本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、保存安定性に優れ、マガキ稚貝の餌料として有用であり、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを用いた本発明の養殖方法で高品質のマガキが生産できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、従来よりも短期間でかつ低コストでマガキを養殖することができるので、本発明は水産業において有用であり、安価で高品質なマガキを供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】実施例２における、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの増殖曲線を示すグラフである。
【図２】実施例３における、マガキ稚貝のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄに対する嗜好性の試験結果を示すグラフである。
【図３】実施例４における、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの安定性の試験結果を示すグラフである。
【図４】実施例５における、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの単独給餌および混合給餌に対するマガキ稚貝の嗜好性の試験結果を示すグラフである。
【図５】実施例５における、マガキ稚貝に対するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの単独給餌および混合給餌の餌料効果を示すグラフである。
【図６】実施例５における、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの単独給餌および混合給餌によるマガキ稚貝の乾重量増加の結果を示すグラフである。
【図７】パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの系統解析結果を示す系統樹である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パブロバ目に属する新規微生物であるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株、マガキ餌料用の該新規株、該新規株を用いたマガキの養殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二枚貝をはじめとする魚介類の養殖においては、その種類に応じて種々の養殖用餌料が用いられているが、一般的に、養殖に要するコストに占める割合は餌料代が最も高く、低コストで魚介類の養殖を行うためには、養殖のごく初期の段階から、安価かつ成長促進効果の高い餌料を選択して用いることが重要である。
このような中、マガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ、以下、マガキと略記）の養殖においては、珪藻類であるキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）が餌料として一般的に良く用いられ（特許文献１参照）、特にマガキの孵化直後においては、キートセラス カリストランスと海洋微細藻類の一種であるパブロバ ルテリ（Ｐａｖｌｏｖａ ｌｕｔｈｅｒｉ、以下、パブロバ ルテリと略記）との混合餌料が用いられることがある。
【特許文献１】特開平６−１０５６５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記餌料を用いて養殖を行っても、マガキの成長促進効果は十分満足できるものではなく、従来とは異なるマガキ養殖用餌料の開発が望まれている。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、新規微生物、マガキ餌料用の該新規微生物および該新規微生物を用いたマガキの養殖方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株である。
【０００５】
請求項２に記載の発明は、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表されるパブロバ目に属する藻類である。
【０００６】
請求項３に記載の発明は、殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株である。
【０００７】
請求項４に記載の発明は、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表される塩基配列と９６％以上の相同性を有し、殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ目に属する藻類である。
【０００８】
請求項５に記載の発明は、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株を用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法である。
【０００９】
請求項６に記載の発明は、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株とキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）との混合物を用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法である。
【００１０】
請求項７に記載の発明は、前記混合物中に占めるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株の量が１／４〜３／４である請求項４に記載の殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規株であるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株を提供でき、さらに、該新規株を単独でまたはキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）と混合してマガキ養殖の餌料として用いることで、マガキの成長促進効果を高め、良質なマガキを低コストで養殖することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳しく説明する。
本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株（以下、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄと略記する）は、淡水や陸上にも見られるが、主に海水中に微細浮遊生物として見出される。そして後述の実施例に示すように、海水中より採取したサンプルを培養および単菌化することで得られる。
【００１３】
本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託手続きを行い、平成１７年１０月３１日付けで受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０７０４として受領されたが、「混在菌による汚染が確認されたため」との理由により受託証不交付となった。そして現在、本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、電源開発株式会社において、分譲可能な状態で保存されている。
【００１４】
本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、後述の実施例で述べるように、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表される塩基配列を有する。また、本発明は、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表されるパブロバ目に属する藻類、１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表される塩基配列と９６％以上の相同性を有し、殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ目に属する藻類を含む。
【００１５】
（培養的性質）
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの培養的性質は以下に示す通りである。すなわち、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、肉汁寒天平板培養、肉汁液体培養、肉汁ゼラチン穿刺培養、リトマス・ミルクのいずれにおいても生育させることはできず、以下に示す組成の人工合成培地にて培養することができる。
培地組成；硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｍｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１２ ０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸ナトリウム五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ、人工海水（千寿製薬株式会社製）３７ｇ／ｌの液体培地
なお、前記組成の培地に、例えば、粉末寒天１２ｇ／ｌを添加し作製した寒天培地を用いることもできる。
【００１６】
培地のｐＨは７．９が好ましく、培地を滅菌前にｐＨ調整する。培地の滅菌条件は、オートクレーブで１２１℃、１０分間であることが好ましい。
また、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは好気性であり、培養方法は通気・撹拌培養が好ましい。この時の通気量は２Ｌ／分程度が好ましい。
さらに、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは海洋微細藻類であり光要求性を有するため、培養中は照度６０００ｌｕｘ程度の光照射が必要である。ただし、明暗周期は不要である。
また、培養温度は２５℃程度であることが好ましく、以上のような条件下で６日間培養することにより、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを良好に生育させることができる。
【００１７】
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、前記条件にて６日間培養後に植え継ぎを行うことで継代培養することができる。
また、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの保管は、凍結乾燥法、Ｌ−乾燥法および凍結法（−８０℃程度）のいずれも適さないため、前記組成の液体培地を用いてウェルプレートにより、約１ヶ月の間隔で適宜植え継ぎを行うことで保管する。保管中は、前記条件にて静置培養にて、２００ｌｕｘ程度の光照射を行う。保管温度は２５℃程度が好ましい。
【００１８】
本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、殻高１．５ｍｍ以上のマガキの養殖において餌料として用いることができる。ここで殻高とは、稚貝の貝殻における蝶番から先端までの長さを指す。すなわち、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、孵化直後ではなく孵化から所定の生育期間を経過したマガキの稚貝に対する餌料として好適に用いることができる。この時用いるマガキの大きさは、殻高１．５ｍｍ以上のものであれば特に限定されないが、殻高１．５ｍｍ〜６．５ｍｍのものであることが好ましい。ただし、本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、特に後述のように他の海洋微細藻類との混合餌料として用いた場合には、稚貝の生育を促進させる効果が高いことから、殻高が１．５ｍｍを超えたらできるだけ早期に給餌を開始することがより好ましい。
【００１９】
また、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄのマガキに対する餌料効果は、マガキの殻高の伸張および乾重量値の増加をもって確認することができる。ここで乾重量値とは、所定の条件により乾燥された軟体部を含めたマガキの重量を示す。
【００２０】
マガキに対するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの給餌方法は、単独給餌でも良いが、特定の他の海洋微細藻類との混合給餌が好ましい。
混合給餌の場合には、混合する対象の餌料は、マガキに対する餌料効果を有するものであれば特に限定されず、種々の海洋微細藻類等を用いることができるが、なかでもキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ、以下、キートセラス カリストランスと略記）であることが好ましい。
【００２１】
このような混合餌料を用いる場合には、混合餌料中に占める本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの量は、特に限定されないが、１／４〜３／４であることが好ましく、１／２であることがより好ましい。ここで、「量」とは、細胞数のことを示す。パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを１／２含有する混合餌料を用いてマガキの養殖を行うと、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄおよび混合対象である餌料をそれぞれ単独で給餌した場合よりも、マガキの生育をより促進させる相乗効果が得られ、特に混合する対象の餌料がキートセラス カリストランスの場合に有効である。
【００２２】
給餌する際のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの養殖水中における密度は特に限定されず、養殖水中におけるマガキの密度に応じて適宜選定すれば良い。具体的には、例えば、単独給餌の場合、養殖水中におけるマガキの密度が２５〜１５０個／５０００ｍｌである場合には、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの養殖水中における密度は、３〜１２万細胞／ｍｌであることが好ましい。混合給餌である場合には、混合餌料の密度を３〜１２万細胞／ｍｌとすればよく、したがって、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの密度は、上記密度に混合餌料中の混合比率を乗じた値となる。なお、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは単細胞藻類であるため、前記密度の単位「細胞／ｍｌ」は、「個／ｍｌ」と同義である。
【００２３】
マガキに対するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの給餌回数は特に限定されず、１回の給餌に供するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの量に応じて適宜調整すれば良い。例えば、給餌する際のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの養殖水中における密度が、前記の好ましい値である時は、給餌回数は１回／日で十分である。
【００２４】
上記の点を除けば、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを給餌する際の条件およびマガキ稚貝の養殖方法は、従来公知の条件および方法を適用すれば良い。
【００２５】
一般的にパブロバ目の藻類は、環境変化の影響を受けやすく安定性に劣るため、長期の保存に適さないことが知られている。しかし、本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、冷暗所（例えば、４℃）において保存することで、良好な状態を維持できる。したがって、保存安定性の面でも、マガキ稚貝の餌料として好適に用いることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
（パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの獲得）
硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｍｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１２ ０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸ナトリウム五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ、人工海水（千寿製薬株式会社製）３７ｇ／ｌ、粉末寒天１２ｇ／ｌを添加し作製した寒天培地へ、２００２年１１月、北九州市若松区脇田海岸の海水から採取したサンプル１００μｌを添加しスクリーニングを行った。
【００２８】
（形態的性質）
前記培地上で、２５℃、２０日間培養した結果、直径０．２ｍｍ程度の茶色の海洋微細藻類のコロニーが得られた。コロニーの形は点状で、隆起のない扁平状であった。周縁は全縁であり、表面はスムーズな形状であった。また、コロニーは不透明でバター様の粘稠度であった。
変異によるコロニー形態の変化は見られず、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化も見られなかった。
【００２９】
コロニーを形成している海洋微細藻類は、大きさが６〜８μｍの単細胞藻類であり、黄褐色で二本の鞭型鞭毛とハプトネマを有していた。また、色素体としてクロロフィルａ、ｃ１、ｃ２およびｃ３を有しており、管状クリステ型のミトコンドリアを有していた。
以上の性質から、得られた海洋微細藻類は、ハプト藻綱の藻類であると判断された。
さらに、得られた海洋微細藻類は、不等長の鞭毛を有し、長鞭毛が細毛（非管状毛）またはこぶ状鱗片で被われており、細胞が有機質または石灰化した鱗片で覆われていないことが確認された。これらの形態的性質はハプト藻綱パブロバ目の藻類に特有で、その他のハプト藻綱の藻類であるイソクリシス目、円石藻目およびプリムネシウム目には見られないことから、得られた海洋微細藻類は、ハプト藻綱パブロバ目に分類される藻類であると判断された。
【００３０】
（塩基配列）
上記で得られた海洋微細藻類から、従来公知の方法に従ってキアゲンのキットを用いてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、１８Ｓｒ ＤＮＡの領域を増幅させてシーケンス解析を行い、１８Ｓｒ ＤＮＡの領域の塩基配列を測定した。得られた１８Ｓｒ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
【００３１】
（系統解析）
得られた１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を、公共のデータベースである日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）と照合して相同性を検索し、系統解析を行った。その結果得られた系統樹を図７に示す。
その結果、得られた海洋微細藻類は、パブロバ目に分類され、しかも単独分岐していることから、新種の藻類であるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄであると判断された。
【００３２】
（アミノ酸組成）
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄのアミノ酸組成について、トリプトファン以外のアミノ酸はアミノ酸自動分析法により、トリプトファンは高速液体クロマトグラフ法によりそれぞれ分析を行い、近縁種であるパブロバ ルテリと比較した。結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
（脂肪酸組成）
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの脂肪酸組成について、ガスクロマトグラフ法により分析を行い、近縁種であるパブロバ ルテリと比較した。結果を表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
（基礎成分組成）
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの基礎成分組成を下記の方法により解析し、近縁種であるパブロバ ルテリと比較した。結果を図９に示す。
水分 常圧加熱乾燥法
粗タンパク質 ケルダール法
粗脂肪 ジエチルエーテル抽出法
粗繊維 静置法
粗灰分 直接灰化法
可溶無窒素物 全体収支から換算
総カロテン 高速液体クロマトグラフ法
α−カロテン 高速液体クロマトグラフ法
β−カロテン 高速液体クロマトグラフ法
総アスコルビン酸 高速液体クロマトグラフ法
【００３７】
【表３】
【００３８】
（実施例２）
（パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの餌料効果の確認）
実施例１で用いた採取サンプルを、前記培地を用いて２５℃の条件下で７〜１０日間静置培養を行い、茶、緑色のコロニーを形成する海洋微細藻類を獲得した。これらの海洋微細藻類を単菌化するため、１ｍｌの前記成分を含む液体培地に海洋微細藻類を植菌し、静置培養を行い生育させ、増殖したものを新たに１ｍｌの前記液体培地に植菌して生育させる操作を繰り返すことで、海洋微細藻類を単菌化した。その結果、得られた海洋微細藻類５００株程度中に、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄが含まれていた。培養時のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの増殖曲線を図１に示す。
【００３９】
得られたパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを試験餌料区として、稚貝養殖に一般的に用いられる珪藻であるキートセラス カリストランス（日清マリンテック株式会社製）を対照餌料区として、餌料効果の比較検討を行った。
飼育稚貝には、殻高２〜６ｍｍ前後のマガキの着底稚貝を用いた。試験前の稚貝は、自然海水を流した状態で５日ほど無給餌により馴致して保存した。
【００４０】
８ｌ容量プラスチック水槽を、温度調整した飼育水５ｌ（ここで飼育水とは、最終的に１μｍのカートリッジで濾過した後、０．４５μｍのカートリッジで濾過した空気により十分曝気しながら、２３℃に調整された海水を示す）で満たし、この水槽内に１００個体の前記稚貝を載せたフィルタートレイを収容した。稚貝を載せたフィルタートレイは、水槽のほぼ中央の高さに位置するように設置した。各試験餌料区および対照餌料区では、１系列ごとに三つの水槽を用意し、稚貝の殻高値（成長率）は、三つの水槽中の稚貝の平均値により算出した。
【００４１】
給餌は1日1回行い、毎日の給餌前に、あらかじめ餌料である海洋微細藻類の飼育水中における細胞密度を計測し、飼育水中へ海洋微細藻類を、細胞密度が５万細胞／ｍｌとなるように調整して添加した。なおここで、細胞密度とは餌料密度のことを指し、これは他の実施例でも同様である。また、２日目以降は、まず各水槽の残餌量を計測し、各飼育水槽を洗浄済みの水槽と交換後に、温度調整した濾過海水で全換水後に給餌を行った。稚貝を載せたフィルタートレイは２日ごとに交換した。２３℃の恒温飼育室内で１４日間上記操作により稚貝を飼育し、飼育中は飼育水へ通気を行わなかった。
【００４２】
稚貝生育状況による試験続行の可否については、各試験餌料区および対照餌料区の７日目の稚貝の殻高値により判断した。
【００４３】
殻高成長率の計測および算出方法は以下の通りである。すなわち、各水槽で飼育している稚貝１００個体のうち３０個体について、蝶番から貝殻先端までの長さを殻高として実体顕微鏡下で計測した。計測は飼育０日目から開始し、原則として２日ごとに行った。飼育０日目の平均殻高に対する飼育日数ごとの平均殻高の増加分（％）を殻高成長率として算出し評価した。
【００４４】
試験最終日までの殻高成長率は、キートセラス カリストランス試験餌料区では２５．４±４．０％、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験餌料区では１８．６±３．９％と示された。
キートセラス カリストランスとパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの間で、殻高成長率に有意差は示されなかったことから、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは稚貝に対してキートセラス カリストランスと同等程度の餌料効果を有していることが確認された。
【００４５】
（比較例１）
実施例２で述べた方法で海水中から獲得し単菌化した海洋微細藻類５００株程度のうち、プリムネシウム ネマメテクム（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ ｎｅｍａｍｅｔｈｅｃｕｍ）、ナンノクロリス マキュレイト（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｃｕｌａｔｅ）、パブロバ ギランス（Ｐａｖｌｏｖａ ｇｙｒａｎｓ）を試験餌料区として、キートセラス カリストランス（日清マリンテック株式会社製）を対照餌料区として、実施例２と同様の方法で餌料効果の比較検討を行った。
その結果、前記試験餌料区の株はいずれも稚貝の生育に貢献することができず、餌料効果が示されなかった。
【００４６】
（実施例３）
（マガキ稚貝のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄに対する嗜好性の確認）
実施例２で獲得し単菌化したパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを試験餌料区として、稚貝養殖に一般的に用いられる珪藻であるキートセラス カリストランス（日清マリンテック株式会社製）を対照餌料区として、マガキ稚貝の嗜好性の比較検討を行った。
【００４７】
飼育稚貝には、殻高２〜６ｍｍ前後のマガキの着底稚貝を用いた。試験前の稚貝は、自然海水を流した状態で５日ほど無給餌により馴致して保存した。
【００４８】
８ｌ容量プラスチック水槽を、温度調整した飼育水５ｌ（ここで飼育水とは、最終的に１μｍのカートリッジで濾過した後、０．４５μｍのカートリッジで濾過した空気により十分曝気しながら、２３℃に調整された海水を示す）で満たし、この水槽内に４０個体の前記稚貝を載せたフィルタートレイを収容した。稚貝を載せたフィルタートレイは、水槽のほぼ中央の高さに位置するように設置した。各試験餌料区および対照餌料区では、１系列ごとに三つの水槽を用意し、稚貝の殻高値（成長率）は、三つの水槽中の稚貝の平均値により算出した。
【００４９】
給餌は1日1回行い、毎日の給餌前に、あらかじめ餌料である海洋微細藻類の細胞密度を計測し、飼育水中へ海洋微細藻類を、細胞密度が１０万細胞／ｍｌとなるように調整して添加した。２日目以降は、各飼育水槽を洗浄済の水槽と交換後に、温度調整した濾過海水で全換水後に給餌を行った。稚貝を載せたフィルタートレイは２日ごとに交換した。２３℃の恒温飼育室内で１０日間上記操作により稚貝を飼育し、飼育中は飼育水へ通気を行わなかった。
【００５０】
０〜２４時間までの飼育時間経過による飼育水中の餌料密度の減少過程を把握するため、目的密度となるように調整した後の水槽中の餌料密度を測定した。経時による稚貝の摂餌量変化を確認するために、２４時間後および２日目以降の残餌量計測を行った。試料のサンプリングは、水槽の飼育水を十分攪拌した後に実施した。餌料である海洋微細藻類は、稚貝の飼育中に飼育水槽内壁や水槽内機材への非特異的な吸着は見られず、餌料密度の減少は、餌料が飼育稚貝により取込まれたことによると考えられた。
【００５１】
残餌量計測方法は以下の通りである。すなわち、（１）試料のサンプリングにはパスツールピペットを用い、水槽内からランダムに３〜５回サンプリングし、1つのエッペンチューブに採取した。（２）餌料である海洋微細藻類が有動である場合は、１％ホルマリンを容積当たり１％添加し動きを止めた。（３）エッペンチューブ内のサンプリングした試料について、残餌量を３回計測しその平均値を用いた。しかし、計測結果の誤差が大きい場合は、再度計測を行って測定精度を高めた。
【００５２】
求められた残餌料の、飼育開始時の餌料に対する割合を算出して残餌率とし、該残餌率の経時変化をグラフにプロットしたものを図２に示す。図２より、給餌後の稚貝の餌料取り込みによる餌料密度の減少は、対照餌料区であるキートセラス カリストランスと試験餌料区であるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの間で大きな差は確認されなかったことから、稚貝はパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄに対して、キートセラス カリストランスと同程度の嗜好性を示すことが確認された。
【００５３】
（実施例４）
（パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの安定性の確認）
一般的にパブロバ目の藻類は、輸送等による環境変化の影響を受けやすく安定性に劣るため、供給餌料としては適さないとされてきた。そこでパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの安定性を以下の方法により確認した。すなわち、実施例２で獲得し単菌化したパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを用いて、培養の植継ぎ条件として２００ｍｌ三角フラスコにおける通気培養を７日間、５００ｍｌ扁平フラスコにおける通気培養を４日間、１０ｌ瓶における通気培養を５日間行い、細胞密度が５００〜１０００万細胞／ｍｌの培養液を得た。該培養液１０ｌを用いて、１１０００Ｇ、１０分の条件で遠心分離を行い、細胞密度が１億細胞／ｍｌになるまで濃縮し、該濃縮菌体液を冷暗所（４℃）で１０日間保存して、この間の細胞密度を計測した。結果を図３に示す。
【００５４】
図３に示すように、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、冷暗所（４℃）で１０日間保存した場合でも、この間、細胞密度が殆ど低下することなく、細胞自体も良好な状態を維持できることから、餌料として十分な安定性を有していることが確認された。
【００５５】
（実施例５）
（マガキ稚貝に対するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの単独給餌および混合給餌試験）
実施例１で獲得し単菌化したパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ、およびパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの近縁種であるパブロバ ルテリ、稚貝養殖に一般的に用いられる珪藻であるキートセラス カリストランス（日清マリンテック株式会社製）を用いて、マガキ稚貝に対する単独給餌試験および混合給餌試験を行った。
【００５６】
試験区は、単独給餌試験区としてキートセラス カリストランス試験区、パブロバ ルテリ試験区、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区、さらに各餌料を混合した混合給餌試験区として５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区の５つを設定した。なお、ここで「％」とは「細胞個数（濃度）％」のことを指す。
【００５７】
飼育稚貝には、殻高２〜６ｍｍ前後のマガキの着底稚貝を用いた。試験前の稚貝は、自然海水を流した状態で５日ほど無給餌により馴致して保存した。
【００５８】
８ｌ容量プラスチック水槽を、温度調整した飼育水５ｌ（ここで飼育水とは、最終的に１μｍのカートリッジで濾過した後、０．４５μｍのカートリッジで濾過した空気により十分曝気しながら、２３℃に調整された海水を示す）で満たし、この水槽内に４０個体の前記稚貝を載せたフィルタートレイを収容した。稚貝を載せたフィルタートレイは、水槽のほぼ中央の高さに位置するように設置した。各試験餌料区および対照餌料区では、１系列ごとに三つの水槽を用意し、稚貝の殻高値（成長率）は、三つの水槽中の稚貝の平均値により算出した。
【００５９】
給餌は1日1回行い、毎日の給餌前に、あらかじめ餌料である海洋微細藻類の細胞密度を計測し、飼育水中へ海洋微細藻類を、細胞密度が１０万細胞／ｍｌとなるように調整して添加した。２日目以降は、各飼育水槽を洗浄済の水槽と交換後に、温度調整した濾過海水で全換水後に給餌を行った。稚貝を載せたフィルタートレイは２日ごとに交換した。２３℃の恒温飼育室内で１０日間上記操作により稚貝を飼育し、飼育中は飼育水へ通気を行わなかった。
【００６０】
稚貝生育状況による試験続行の可否については、各試験餌料区および対照餌料区の７日目の稚貝の成長率により判断した。
【００６１】
まず、単独給餌および混合給餌に対する稚貝の生残率を確認した。
稚貝の生残率の測定および算出方法は以下の通りである。すなわち、殻高計測時に開口して死亡した個体を取り除き、各水槽でその個体数について記録した。そして、この数値を用いて、飼育開始時の個体数に対する生残個体数の割合を算出し生残率とした。
【００６２】
その結果、試験最終日までの各水槽での生残率は８８〜１００％の範囲にあり、餌料間で生残率に差は認められなかった。
【００６３】
次に、単独給餌および混合給餌に対する稚貝の嗜好性を確認した。
０〜２４時間までの飼育時間経過による飼育水中の餌料密度の減少過程を把握するため、目的密度となるように調整した後の水槽中の餌料密度を測定した。経時による稚貝の摂餌量変化を確認するために、２４時間後および２日目以降の残餌量計測を行った。試料のサンプリングは、水槽の飼育水を十分攪拌した後に実施した。餌料である海洋微細藻類は、稚貝の飼育中に飼育水槽内壁や水槽内機材への非特異的な吸着は見られず、餌料密度の減少は、餌料が飼育稚貝により取込まれたことによると考えられた。
【００６４】
残餌量計測方法は以下の通りである。すなわち、（１）試料のサンプリングにはパスツールピペットを用い、水槽内からランダムに３〜５回サンプリングし、1つのエッペンチューブに採取した。（２）餌料である海洋微細藻類が有動である場合は、１％ホルマリンを容積当たり１％添加し動きを止めた。（３）エッペンチューブ内のサンプリングした試料について、残餌量を３回計測しその平均値を用いた。しかし、計測結果の誤差が大きい場合は、再度計測を行って測定精度を高めた。
【００６５】
求められた残餌料の、飼育開始時の餌料に対する割合を算出して残餌率とし、該残餌率の経時変化をグラフにプロットしたものを図４に示す。図４より、給餌後の稚貝の餌料取り込みによる残餌率の減少は、単独給餌試験区で比較すると、キートセラス カリストランスとパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの間で大きな差は確認されなかった。しかし、パブロバ ルテリでは、前記二つの単独給餌試験区よりも残餌率が高く、すなわち、摂餌量が少ないことを示した。
一方、混合給餌試験区の間でも大きな残餌率の差は確認されなかった。
【００６６】
以上から、稚貝は、単独給餌においてパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄに対して、キートセラス カリストランスと同程度の嗜好性を示し、混合給餌においても、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリと、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとで同程度の嗜好性を示した。
【００６７】
続いて、単独給餌および混合給餌の稚貝に対する餌料効果を確認した。
殻高成長率の計測および算出方法は以下の通りである。すなわち、各水槽で飼育している稚貝４０個体すべてについて、蝶番から貝殻先端までの長さを殻高として実体顕微鏡下で計測した。計測は飼育０日目から開始し、原則として２日ごとに行った。飼育０日目の平均殻高に対する飼育日数ごとの平均殻高の増加分（％）を殻高成長率として算出し評価した。結果を図５に示す。
【００６８】
図５より、試験最終日までの殻高成長率は、単独給餌試験区では、キートセラス カリストランス試験区で２４．３±１．９％、パブロバ ルテリ試験区で−０．３±１．９％、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区で１９．３±４．０％と示された。すなわち、キートセラス カリストランス試験区とパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区では約２０％の殻高成長率を示したが、パブロバ ルテリ試験区では稚貝の殻高を全く成長させることができないという結果が示された。
また、キートセラス カリストランス試験区とパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区との間で、殻高成長率に有意差は確認されず、稚貝の殻高成長に対して同等程度の餌料効果を有していることが確認された。
【００６９】
一方、混合給餌試験区では、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区では２６．３±３．０％、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区では５２．２±８．９％と示された。
【００７０】
５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区の殻高成長率は、それぞれの単独給餌試験区の殻高成長率の平均値の２．２倍の値であり、混合給餌することによる相乗効果を有することが確認された。
これに対し、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区の殻高成長率は、それぞれの単独給餌試験区の殻高成長率の平均値の２．４倍の値であり、混合給餌することによる相乗効果を有し、その効果が５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区よりも高いこと、さらに、５２．２±８．９％という極めて高い殻高成長率を示すことから、キートセラス カリストランスとパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの混合物は、マガキの餌料として極めて優れたものであることが確認された。
【００７１】
続いて、単独給餌および混合給餌に対する稚貝の乾重量増加率を確認した。
乾重量値計測および算出方法は以下の通りである。すなわち、飼育終了後の稚貝の表面を脱塩水で洗浄した後ガラスシャーレに載せ、乾燥器温度６０℃で衝量が得られるまで稚貝を乾燥させた。乾燥後、秤で稚貝の総重量を計測し、シャーレに収容した個体数で割ることで稚貝１個体当たりの乾燥重量を算出した。ここで乾重量値とは、軟体部を含めた稚貝の重量を示す。さらに、飼育前の乾重量値に対する、飼育終了後の乾重量値の増加率を算出し、グラフにプロットしたものを図６に示す。
【００７２】
図６より、乾重量増加率は、単独給餌試験区では、キートセラス カリストランス試験区で６５．８±２７．８％、パブロバ ルテリ試験区で−１１．７±６．７％、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区で５９．８±２１．３％と示された。すなわち、キートセラス カリストランス試験区とパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区では、約６０％の乾重量増加率を示したが、パブロバ ルテリ試験区では軟体部を含めて餌料効果が示されず、稚貝の生育に全く寄与することができないという結果が示された。
また、キートセラス カリストランス試験区とパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区との間で、乾重量増加率に有意差は確認されず、軟体部を含めた稚貝の生育に対して同等程度の餌料効果を有していることが確認された。
【００７３】
一方、混合給餌試験区では、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区では５４．１±１１．８％、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区では１７７．３±２９．３％と示された。
【００７４】
５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区の乾重量増加率は、それぞれの単独給餌試験区の乾重量増加率の平均値の２．０倍の値であり、混合給餌することによる相乗効果を有することが確認された。
これに対し、５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ試験区の乾重量増加率は、それぞれの単独給餌試験区の殻高成長率の平均値の２．８倍の値であり、混合給餌することによる相乗効果を有し、その効果が５０％キートセラス カリストランス＋５０％パブロバ ルテリ試験区よりも高いこと、さらに、１７７．３±２９．３％という極めて高い殻高成長率を示すことから、キートセラス カリストランスとパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄとの混合物は、軟体部を含めた稚貝の生育に有用であり、マガキの餌料として極めて優れたものであることが確認された。
【００７５】
以上により、本発明のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄは、保存安定性に優れ、マガキ稚貝の餌料として有用であり、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄを用いた本発明の養殖方法で高品質のマガキが生産できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、従来よりも短期間でかつ低コストでマガキを養殖することができるので、本発明は水産業において有用であり、安価で高品質なマガキを供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】実施例２における、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの増殖曲線を示すグラフである。
【図２】実施例３における、マガキ稚貝のパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄに対する嗜好性の試験結果を示すグラフである。
【図３】実施例４における、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの安定性の試験結果を示すグラフである。
【図４】実施例５における、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの単独給餌および混合給餌に対するマガキ稚貝の嗜好性の試験結果を示すグラフである。
【図５】実施例５における、マガキ稚貝に対するパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの単独給餌および混合給餌の餌料効果を示すグラフである。
【図６】実施例５における、パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの単独給餌および混合給餌によるマガキ稚貝の乾重量増加の結果を示すグラフである。
【図７】パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄの系統解析結果を示す系統樹である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株。
【請求項２】
１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表されるパブロバ目に属する藻類。
【請求項３】
殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株。
【請求項４】
１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表される塩基配列と９６％以上の相同性を有し、殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ目に属する藻類。
【請求項５】
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株を用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法。
【請求項６】
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株とキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）との混合物を用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法。
【請求項７】
前記混合物中に占めるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株の量が１／４〜３／４である請求項４に記載の殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法。
【請求項１】
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株。
【請求項２】
１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表されるパブロバ目に属する藻類。
【請求項３】
殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株。
【請求項４】
１８Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列が配列番号１で表される塩基配列と９６％以上の相同性を有し、殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖に用いるパブロバ目に属する藻類。
【請求項５】
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株を用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法。
【請求項６】
パブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株とキートセラス カリストランス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ）との混合物を用いる殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法。
【請求項７】
前記混合物中に占めるパブロバ エスピーＪＰＣＣ４２Ｄ（Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．ＪＰＣＣ４２Ｄ）株の量が１／４〜３／４である請求項４に記載の殻高１．５ｍｍ以上のマガキ（Ｇｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）の養殖方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２２８７０９（Ｐ２００８−２２８７０９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７７２７３（Ｐ２００７−７７２７３）
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【出願人】（０００２１７６８６）電源開発株式会社 (207)
【出願人】（３９６０１６４７８）財団法人かき研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２３日（２００７．３．２３）
【出願人】（０００２１７６８６）電源開発株式会社 (207)
【出願人】（３９６０１６４７８）財団法人かき研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
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