新規微生物およびそれを用いたカロテノイド類の製造方法
【課題】
カロテノイド類であるカンタキサンチンを簡便に抽出、精製することができるカンタキサンチン選択合成細菌および、培養法によるカンタキサンチンの製造方法を提供する。
【解決の手段】
生産されるβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、カンタキサンチンが前記カロテノイド類の合計量の９０重量％以上しめ、カンタキサンチンを選択的に生産するカロテノイド生産性パラコッカス属細菌、およびそれを用いて培養し、培養後の菌体または培養液からカロテノイド類を回収するカンタキサンチンの製造方法を用いる。
カロテノイド類であるカンタキサンチンを簡便に抽出、精製することができるカンタキサンチン選択合成細菌および、培養法によるカンタキサンチンの製造方法を提供する。
【解決の手段】
生産されるβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、カンタキサンチンが前記カロテノイド類の合計量の９０重量％以上しめ、カンタキサンチンを選択的に生産するカロテノイド生産性パラコッカス属細菌、およびそれを用いて培養し、培養後の菌体または培養液からカロテノイド類を回収するカンタキサンチンの製造方法を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規微生物およびそれを用いたカロテノイド類、特にカンタキサンチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、β−カロテン等のカロテノイドは天然物由来の色素として食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等に添加され利用されている。あるいは、抗酸化機能が注目され抗酸化物質としても広く利用されている。これらのカロテノイド類は、植物、動物、微生物に広く分布し、天然において数百種類同定されてきた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
機能性カロテノイドを合成する微生物として、横山らによってアグロバクテリウム属（後に、パラコッカス属に再分類された）に属する細菌が報告された（例えば、非特許文献２参照）。同細菌は機能性カロテノイドであるアスタキサンチンを高含量に合成することが特徴である。また、同細菌においてはアスタキサンチンの生合成経路の解明が行われ、遺伝子レベルまでの詳細な機構が報告された（例えば、非特許文献３参照）。報告された生合成経路によると、カロテノイドは基本代謝物であるメバロン酸を出発物質としてイソプレノイド生合成系の代謝合成経路を通り、生じた炭素数１５のファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、さらに、生じたファルネシルピロリン酸に炭素数５のイソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）と縮合することにより、炭素数２０のゲラニルゲラニル２リン酸（ＧＧＰＰ）が合成される。次いで、２分子のゲラニルゲラニル２リン酸が縮合して、フィトエン（ｐｈｙｔｏｅｎｅ）が合成される。フィトエンは一連の不飽和反応により、リコペン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）に変換され、さらに、このリコペンは環化反応によりβ−カロテン（ｃａｒｏｔｅｎｅ）に合成される。次いで、β−カロテンがケト化反応により酸化されるとカンタキサンチン（ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ）となり、β−カロテンが水酸化されるとゼアキサンチン（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）となる。さらに、ケト化、水酸化による酸化反応が進み、アスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）が合成される。以上のカロテノイド生合成経路を図１に図示する。
【０００４】
一方で一部の微生物においては前述のβ−カロテンをケト化する酵素をコードする遺伝子を有せず、ゼアキサンチンのみを選択的に合成することが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。カンタキサンチンについても同様に考えると、β−カロテン水酸化酵素が欠損等している微生物が存在すればカンタキサンチンを選択的に合成することが可能であるが、カンタキサンチンを選択的に合成する新規微生物分離は報告されていない。
【０００５】
カンタキサンチンは機能性カロテノイドとして養殖魚・鶏卵等の色揚剤として有用であるが、カロテノイド抽出物から精製し利用されているに過ぎない。カロテノイド抽出物には、カンタキサンチンと化学的物性が類似したカロテノイド類が多く含まれ、さらに、抽出・精製を困難にしている（例えば、特許文献１および２参照）。そこで、カンタキサンチンを高含量に蓄積する微生物等の含有物が望まれていた。
【特許文献１】特開平６−２３７７８７号公報
【特許文献２】特開２００３−３０４８７５号公報
【非特許文献１】Ｅｒｉｃ Ａ． Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ， Ａｄｂａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ５３， ｐ１１９−１７８（１９９５）．
【非特許文献２】Ａ． Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ａｎｄ ４−ｋｅｔｏｚｅａｘａｎｔｈｉｎ ｂｙ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５８： １８４２−１８４４（１９９４）．
【非特許文献３】Ｎ． Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｌｅｖｅｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １７７： ６５７５−６５８４（１９９５）．
【非特許文献４】Ｌ． Ｐａｓａｍｏｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ Ｒ１５３４， ＧＥＮＥ， １８５： ３５−４１（１９９７）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、カロテノイド類であるカンタキサンチンを簡便に抽出、精製することができるカンタキサンチン選択合成細菌を提供することを目的とする。また、本発明は培養法によるカンタキサンチンの製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、カロテノイド類を生産するパラコッカス属細菌に変異を導入することにより、カンタキサンチンを選択的に合成することを見出し本発明に至った。すなわち、本発明は、カロテノイド生産パラコッカス属細菌の育種により得られることを特徴とするカンタキサンチンを選択的に合成するパラコッカス属細菌である。また、本発明は、そのような細菌を培養し、菌体または培養液からカンタキサンチンを回収することを特徴とするカンタキサンチンの製造方法である。すなわち、本発明は以下に関するものである。
【０００８】
（１）カンタキサンチンを選択的に生産するカロテノイド生産性パラコッカス属細菌。
【０００９】
（２）生産されるβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、カンタキサンチンが前記カロテノイド類の合計量の９０重量％以上しめる（１）の細菌。
【００１０】
（３）アスタキサンチン合成微生物の変異処理によりβ−カロテン水酸化酵素遺伝子に変異が導入され、β−カロテン水酸化酵素活性が低下することによりカンタキサンチンを選択的に合成する事ができる生産能を有する細菌。
【００１１】
（４）アスタキサンチン合成微生物の変異処理によりβ−カロテン水酸化酵素遺伝子に変異が導入され、β−カロテン水酸化酵素遺伝子が欠損することによりカンタキサンチン選択的に合成する事ができる生産能を有する細菌。
【００１２】
（５）菌体にカンタキサンチンを１重量％（乾重量換算）以上含むカロテノイド類合成細菌。
【００１３】
（６）（１）に記載の細菌が、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＡＯ５３８株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０７）であるのパラコッカス属細菌。
【００１４】
（７）（１）ないし（６）の何れかに記載の細菌を培養し、培養後の菌体または培養液からカロテノイド類を回収する、カロテノイドの製造方法。
【００１５】
（８）カロテノイド類がカンタキサンチンである（７）に記載のカロテノイド類の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のカロテノイド類の製造方法により、食品または飼料として有用なカンタキサンチンを工業規模において製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明に使用する微生物としては、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に属し、カンタキサンチン合成能を有する微生物であれば野生株でも変異株でもよく、通常の変異処理により変異させた変異株でも、自然突然変異株でも、何れも用いることができる。本発明に用いる野生株としてはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｎ８１１０６株（特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１４０２３）を挙げることができる。本発明においてはカロテノイド類を合成する野生株あるいは変異株に変異をせしめてカンタキサンチン合成を選択的に行う微生物がさらに好ましい。
【００１９】
本発明においては、アスタキサンチン合成能を有する微生物への変異導入によりカンタキサンチン合成能を付与することができる。図１に図示した通り、アスタキサンチン合成能を有する微生物においては、β−カロテンを水酸化およびケト化し最終生産物であるアスタキサンチンを合成する。すなわち、カンタキサンチンを選択的に合成するためにはβ−カロテン水酸化酵素をコードする遺伝子であるｃｒｔＺに変異を導入し、水酸化酵素の活性を低下させればよい。あるいはβ−カロテン水酸化酵素をコードする遺伝子であるｃｒｔＺに変異を導入し、該遺伝子が機能しないように破壊等すればよい。
【００２０】
本発明において変異を導入する細菌としては、カロテノイド類を高含量に細胞内に蓄積しても、高い増殖能を有するカロテノイド代謝アナログ耐性を有する細菌がさらに好ましい。カロテノイド代謝アナログとしては、当業者としては周知のα−ヨノン（ｉｏｎｏｎｅ）またはβ−ヨノン（ｉｏｎｏｎｅ）を例示することができるが、カロテノイド類の蓄積による細胞内調節機構の調節を解除する物質であればこれらの物質に限定されない。本明細書において「耐性を有する」とは、親株が生育阻害を受ける濃度の薬剤存在下でも生育しうることをいう。
【００２１】
変異処理とは、変異原物質や紫外線で細胞を処理することによって変異を加速させる当業者には周知な方法である。変異原物質を例示するとＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル等の化合物を挙げることができる。
【００２２】
また、本発明においては、β−カロテン水酸化酵素遺伝子を破壊、欠損してもよい。破壊、欠損する方法としては、当業者としては周知の遺伝子工学的手法の一つである相同組換え法等により、ターゲットとなる遺伝子に適当なＤＮＡを挿入する方法などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２３】
本発明においては、変異処理後、変異株を分離し、所望の機能を評価する育種を繰返すことが好ましい。育種方法の一例をあげると、予め培養して得たパラコッカス属細菌ＴＳＴＴ０５２株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６９０）の菌体をこれらの変異原物質の水溶液に懸濁して一定時間放置した後に遠心分離などの方法で菌体を回収して変異原物質を除去する。その後平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する。コロニーの選択は色調の濃いコロニーを選択、分離後液体培養を行ない、次いで、菌体からカロテノイドを抽出してカロテノイド生成量や組成をＨＰＬＣなどで分析し、生産性の向上した菌株を絞り込むことにより優良な菌株を得ることができる。
【００２４】
本発明ではパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に属し、カンタキサンチン合成能を有する微生物であれば野生株でも変異株でもよく、例を挙げれば本願発明者らによって樹立されたパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ． ＴＳＡＯ５３８株がある（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０７）。
【００２５】
この菌株は、下記の菌学的性質を有するものである。なお、＋は陽性を示し、−は陰性を示す。
（ａ）細胞形態 短桿菌 ０．７−０．８× １．０−１．２μｍ
（ｂ）胞子 −
（ｃ）運動性 −
（ｄ）コロニー形態
１）培地：表１に示す組成の培地
２）直径： １．０ ｍｍ
３）色調： オレンジ色
４）隆起状態： レンズ状
５）形： 円形
６）周縁： 全縁
７）表面形状： スムーズ
８）透明度： 不透明
９）粘稠度： バター様
（ｅ）生理的性質
１）カタラーゼ ＋
２）オキシダーゼ −
３）グルコースからの酸／ガス発生 −／−
４）グルコースにおけるＯ／Ｆテスト −／−
（ｆ）基質の利用性
１）メタノール −
２）エタノール −
３）ブタノール ＋
４）メチルアミン −
５）グリセロール −
６）グルコース ＋
７）フルクトース ＋
８）ガラクトース ＋
９）リボース −
１０）マルトース ＋
１１）スクロース ＋
１２）ラクトース −
１３）マンニトール ＋
１４）イノシトール −
１５）キシロース −
１６）マンノース −
１７）ソルビトール ＋
１８）アラビノース −
１９）トレハロース ＋
２０）グルコン酸 −
２１）酢酸 −
２２）乳酸 ＋
２３）クエン酸 −
２４）コハク酸 ＋Ｗ
２５）マロン酸 ＋Ｗ
２６）ピルビン酸 ＋Ｗ
２７）トリメチル−Ｎ−オキサイド −
２８）チオ硫酸 −
【００２６】
本発明において、選択的に合成できるとは、カロテノイド類を合成する微生物においてカンタキサンチンが分離、精製することが容易となる程度にカンタキサンチンが合成されればよく、好適には、生産されるβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、カンタキサンチンがカロテノイド類の合計量の９０重量％以上しめるものである。なお、カロテノイド類とは、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３‘−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン等であり、さらに、その微生物内に蓄積されるその他のカロテノイド類を含む。
【００２７】
本発明において、優良菌株は適当な菌株を評価し決定することができる。固体培地を利用した場合には、任意のコロニーをピックアップし、液体培養を行い、増殖能、カロテノイド生産能を評価することにより評価可能である。
【００２８】
本発明の方法で使用された微生物は従来方法として知られている栄養培地中で培養することができる。なお、本発明に用いる培地としては、細菌が増殖しカロテノイド類を生産し得るものであればいずれを使用してもよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・２水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００２９】
培養工程で使用される菌株は、公知方法に従って、画線培養プレートから発酵容器に移すことができる。好適な方法は、寒天平板培地、斜面寒天培地およびフラスコ培養液を用いた方法である。
【００３０】
本発明のカンタキサンチン等のカロテノイドを製造せしめる条件での新規微生物の培養の条件については、いずれの一般方法を用いて実施してもよい。本方法の好適な実施態様としては、培養は培養液中で行うことが好ましい。この液内培養に関しては通常の液内培養で用いられる条件を使用してもよい。好適には、培養温度を１０〜３５℃に、培地のｐＨを６〜９の範囲に設定し、２０〜２００時間発酵させるのが好ましい。培養温度については培養初期、中期、後期に区別してそれぞれの段階で温度を変えてもよい。本発明の栄養培地を使用した好適な条件は、培養温度２０〜２７℃、ｐＨが約７．０、培養時間が５０〜１５０時間である。
【００３１】
培地のｐＨは６．５〜８．０に調整されるが、好ましくは約７．０である。ｐＨの調整には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム若しくはアンモニアの水溶液を使用するが、これらの物に限定されない。
【００３２】
本発明におけるカロテノイド類の分析方法は、菌体または培養液から安定に効率良く回収されれば特に限定はなく、例えば抽出溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等がよい。抽出されたカロテノイドの定量は、各種カロテノイドが分離され定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行なうことが好ましい。
【００３３】
培養後に、菌体又は培養液からカロテノイド類および／またはカンタキサンチンを回収するには、たとえば、遠心分離操作等により培養液から菌体を分離し、適当な有機溶媒によりそれぞれから抽出すればよい。有機溶媒はメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等が挙げられる。好適にはアセトンを例示できる。さらには、液体クロマトグラフィー等を利用して高純度に分離、精製することも可能である。液体クロマトグラフィーの分離原理としてはイオン交換、疎水性相互作用、分子ふるい等を挙げることができる。好ましくは、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーである。または、超臨界流体抽出によって細胞から抽出する。
【００３４】
あるいは、培養終了後、菌体を培地から、例えば、遠心分離操作、デカンテーションまたはろ過等の方法を用いて分離してもよい。得られた菌体は、使用し易い粘度にまで水を加えてスラリーとする。カンタキサンチン等のカロテノイド類の分解を防ぐためには、このスラリー中適当な添加剤を加えてもよい。添加剤としてはアスコルビン酸等の酸化防止剤を例示することができるが、これらには限定されない。その後、調製スラリーを例えばガラスビーズ、ジルコニアビーズを用いた破砕機または高圧ホモジナイザーを使用して均一化し、後に使用するため乾燥しておく。好ましい乾燥法はスプレー乾燥法である。
【００３５】
この菌体を、例えば、このまま養殖魚等の飼料中へ添加してもよい。または、前述したように極性有機溶媒等により抽出して使用してもよい。カンタキサンチン等のカロテノイドを抽出した後に残った、ほとんど色素を含まない細胞体は、家禽を飼育するうえで理想的な蛋白質およびビタミン類の供給源として使用することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
パラコッカス属細菌への変異導入および変異株のプレート評価
パラコッカス属細菌ＴＳＴＴ０５２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６９０）を表１において表す液体培地５ｍｌに植菌し、２５℃、１５０ｒｐｍで１日間振とう培養を行った。この培養液のうち１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１５，０００回転、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（緩衝液Ａ）１ｍｌに懸濁し、次いで３ｍｇ／ｍｌのＮ‐メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジニジン（以下ＮＴＧと略記する）水溶液１０μｌを加え、３０〜６０分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰返してＮＴＧを除去した。さらに、０．５ｍｌ緩衝液Ａに菌体を懸濁し、表１に示す培地３ｍｌに植菌して４〜５時間培養した。得られた培養液を、表１に示す組成の培地にさらに寒天を添加し固化させたプレートに適当量スプレッドし、２５℃で５日間培養を行った。培養３日目から、コロニーを目視により確認することができ、コロニーの赤色の濃淡を区別することも可能となった。
【００３８】
（実施例２）
パラコカッカス属細菌変異株の培養
実施例１で得られた菌株をランダムに選択し、表１において示す培養液５ｍｌに植菌し、２５℃、１日間培養後した。次いで、表１に示した組成の培地６０ｍｌを１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに入れ滅菌し、先に培養した培養液２ｍｌを植菌した。２５℃で７日間振とう（１００ｒｐｍ）培養後、培養液を適宜抜き取り、濁度（ＯＤ６６０ ｎｍ）およびカロテノイドの定量を行った。カロテノイドの定量は以下の様に行なった。まず培養液１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、１５，０００回転、５分間遠心分離して菌体ペレットを得た。この菌体に２０μｌの純水に懸濁し、次いで２００μｌのジメチルフォルムアミドおよび５００μｌのアセトンを加え振とうしてカロテノイドを抽出した。この抽出液を１５，０００回転、５分間遠心分離により残渣を除去後、ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）で各種カロテノイドを定量した。なおカロテノイドの分離はＡ液として純水とメタノールの５対９５の混合溶媒、Ｂ液としてメタノールとテトラヒドロフランの７対３の混合溶媒を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＡ液を５分間カラムに通過させた後、同じ流速Ａ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配を行ない、さらにＢ液を５分間通過させることにより行なった。カンタキサンチン濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のカンタキサンチン標準試薬で作成した検量線より濃度を算出した。評価した変異株のなかから、カンタキサンチン選択合成を確認することができた新規変異株としてＴＳＡＯ５３８株（特許生物寄託センター寄託した菌株であり、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０７）を分離した。カンタキサンチンであることは標準試薬のＨＰＬＣ上の保持時間から確認した。図２にＴＳＡＯ５３８株の抽出カロテノイドのＨＰＬＣパターンと標準試薬のそれを図示した。図２の通り、ＴＳＡＯ５３８株の抽出カロテノイドは標準試薬のカンタキサンチンのピークと重なり、選択的にカンタキサンチンを合成するこが確認できた。
【００３９】
同様にして培養した変異導入前の株であるＴＳＴＴ０５２株の培養４日目のカロテノイド類の生成パターンを図３に示した。図２および図３の通り、ＴＳＡＯ５３８株はＴＳＴＴ０５２株とは異なり、カンタキサンチンを選択的に合成し、カロテノイド類に占めるカンタキサンチンの割合は９０％を超えた。選択合成割合は、ＨＰＬＣ法（例えば、非特許文献２参照）により、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、エキネノンの生産量を求め、それに対するカンタキサンチンの生産量として算出した。結果を表２に示す。
【００４０】
図４にＴＳＡＯ５３８株のカンタキサンチン合成における時間変化を示したグラフを図示した。図４の通り、ＴＳＡＯ５３８株は培養の経過と共に、カンタキサンチンを合成し、培養５日目においてもカンタキサンチンを分解することなく細胞内に含有していた。培養４日目においては菌体あたりのカンタキサンチン含有量は約１．２重量％であった。重量％は乾燥菌体の重量を求めることにより算出した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の新規なカンタキサンチン選択合成細菌は、カロテノイド類であるカンタキサンチンを簡単に抽出、精製することができるので、食品または飼料として有用なカンタキサンチンを工業規模で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】フィトエンから始まり、β−カロテンを化学修飾し、最終的にアスタキサンチンを生産する経路図である。
【図２】ＴＳＡＯ５３８株から抽出したカロテノイド類のＨＰＬＣチャートであり、図中、Ｘ軸（横軸）は保持時間（単位は分）を示し、Ｙ軸（縦軸）ＨＰＬＣピーク強度（単位はｍＶ（任意強度））を示す。
【図３】ＴＳＴＴ０５２株から抽出したカロテノイド類のＨＰＬＣチャートであり、図中、Ｘ軸（横軸）は保持時間（単位は分）を示し、Ｙ軸（縦軸）ＨＰＬＣピーク強度（単位はｍＶ（任意強度））を示す。
【図４】ＴＳＡＯ５３８株の培養経過を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養日数（単位は日）を示し、Ｙ軸（左側縦軸）はＯＤ６６０ｎｍの吸光度値、Ｙ軸（右側縦軸）はカロテノイドの濃度（単位はｍｇ／Ｌ）を示す。
【符号の説明】
【００４５】
１：培養経過に伴うＯＤ６６０ｎｍにおける吸光度値（▲）
２：培養経過に伴う総カロテノイド濃度（●）
３：カンタキサンチンの濃度（○）
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規微生物およびそれを用いたカロテノイド類、特にカンタキサンチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスタキサンチン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、カンタキサンチン、アドニキサンチン、β−カロテン等のカロテノイドは天然物由来の色素として食品、医薬品、医薬部外品、化粧品等に添加され利用されている。あるいは、抗酸化機能が注目され抗酸化物質としても広く利用されている。これらのカロテノイド類は、植物、動物、微生物に広く分布し、天然において数百種類同定されてきた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
機能性カロテノイドを合成する微生物として、横山らによってアグロバクテリウム属（後に、パラコッカス属に再分類された）に属する細菌が報告された（例えば、非特許文献２参照）。同細菌は機能性カロテノイドであるアスタキサンチンを高含量に合成することが特徴である。また、同細菌においてはアスタキサンチンの生合成経路の解明が行われ、遺伝子レベルまでの詳細な機構が報告された（例えば、非特許文献３参照）。報告された生合成経路によると、カロテノイドは基本代謝物であるメバロン酸を出発物質としてイソプレノイド生合成系の代謝合成経路を通り、生じた炭素数１５のファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、さらに、生じたファルネシルピロリン酸に炭素数５のイソペンテニル２リン酸（ＩＰＰ）と縮合することにより、炭素数２０のゲラニルゲラニル２リン酸（ＧＧＰＰ）が合成される。次いで、２分子のゲラニルゲラニル２リン酸が縮合して、フィトエン（ｐｈｙｔｏｅｎｅ）が合成される。フィトエンは一連の不飽和反応により、リコペン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）に変換され、さらに、このリコペンは環化反応によりβ−カロテン（ｃａｒｏｔｅｎｅ）に合成される。次いで、β−カロテンがケト化反応により酸化されるとカンタキサンチン（ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ）となり、β−カロテンが水酸化されるとゼアキサンチン（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）となる。さらに、ケト化、水酸化による酸化反応が進み、アスタキサンチン（ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）が合成される。以上のカロテノイド生合成経路を図１に図示する。
【０００４】
一方で一部の微生物においては前述のβ−カロテンをケト化する酵素をコードする遺伝子を有せず、ゼアキサンチンのみを選択的に合成することが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。カンタキサンチンについても同様に考えると、β−カロテン水酸化酵素が欠損等している微生物が存在すればカンタキサンチンを選択的に合成することが可能であるが、カンタキサンチンを選択的に合成する新規微生物分離は報告されていない。
【０００５】
カンタキサンチンは機能性カロテノイドとして養殖魚・鶏卵等の色揚剤として有用であるが、カロテノイド抽出物から精製し利用されているに過ぎない。カロテノイド抽出物には、カンタキサンチンと化学的物性が類似したカロテノイド類が多く含まれ、さらに、抽出・精製を困難にしている（例えば、特許文献１および２参照）。そこで、カンタキサンチンを高含量に蓄積する微生物等の含有物が望まれていた。
【特許文献１】特開平６−２３７７８７号公報
【特許文献２】特開２００３−３０４８７５号公報
【非特許文献１】Ｅｒｉｃ Ａ． Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ， Ａｄｂａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ５３， ｐ１１９−１７８（１９９５）．
【非特許文献２】Ａ． Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ａｎｄ ４−ｋｅｔｏｚｅａｘａｎｔｈｉｎ ｂｙ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ， Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５８： １８４２−１８４４（１９９４）．
【非特許文献３】Ｎ． Ｍｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎｄ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｌｅｖｅｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １７７： ６５７５−６５８４（１９９５）．
【非特許文献４】Ｌ． Ｐａｓａｍｏｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ Ｒ１５３４， ＧＥＮＥ， １８５： ３５−４１（１９９７）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、カロテノイド類であるカンタキサンチンを簡便に抽出、精製することができるカンタキサンチン選択合成細菌を提供することを目的とする。また、本発明は培養法によるカンタキサンチンの製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、カロテノイド類を生産するパラコッカス属細菌に変異を導入することにより、カンタキサンチンを選択的に合成することを見出し本発明に至った。すなわち、本発明は、カロテノイド生産パラコッカス属細菌の育種により得られることを特徴とするカンタキサンチンを選択的に合成するパラコッカス属細菌である。また、本発明は、そのような細菌を培養し、菌体または培養液からカンタキサンチンを回収することを特徴とするカンタキサンチンの製造方法である。すなわち、本発明は以下に関するものである。
【０００８】
（１）カンタキサンチンを選択的に生産するカロテノイド生産性パラコッカス属細菌。
【０００９】
（２）生産されるβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、カンタキサンチンが前記カロテノイド類の合計量の９０重量％以上しめる（１）の細菌。
【００１０】
（３）アスタキサンチン合成微生物の変異処理によりβ−カロテン水酸化酵素遺伝子に変異が導入され、β−カロテン水酸化酵素活性が低下することによりカンタキサンチンを選択的に合成する事ができる生産能を有する細菌。
【００１１】
（４）アスタキサンチン合成微生物の変異処理によりβ−カロテン水酸化酵素遺伝子に変異が導入され、β−カロテン水酸化酵素遺伝子が欠損することによりカンタキサンチン選択的に合成する事ができる生産能を有する細菌。
【００１２】
（５）菌体にカンタキサンチンを１重量％（乾重量換算）以上含むカロテノイド類合成細菌。
【００１３】
（６）（１）に記載の細菌が、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＡＯ５３８株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０７）であるのパラコッカス属細菌。
【００１４】
（７）（１）ないし（６）の何れかに記載の細菌を培養し、培養後の菌体または培養液からカロテノイド類を回収する、カロテノイドの製造方法。
【００１５】
（８）カロテノイド類がカンタキサンチンである（７）に記載のカロテノイド類の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のカロテノイド類の製造方法により、食品または飼料として有用なカンタキサンチンを工業規模において製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明に使用する微生物としては、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に属し、カンタキサンチン合成能を有する微生物であれば野生株でも変異株でもよく、通常の変異処理により変異させた変異株でも、自然突然変異株でも、何れも用いることができる。本発明に用いる野生株としてはＰａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｎ８１１０６株（特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１４０２３）を挙げることができる。本発明においてはカロテノイド類を合成する野生株あるいは変異株に変異をせしめてカンタキサンチン合成を選択的に行う微生物がさらに好ましい。
【００１９】
本発明においては、アスタキサンチン合成能を有する微生物への変異導入によりカンタキサンチン合成能を付与することができる。図１に図示した通り、アスタキサンチン合成能を有する微生物においては、β−カロテンを水酸化およびケト化し最終生産物であるアスタキサンチンを合成する。すなわち、カンタキサンチンを選択的に合成するためにはβ−カロテン水酸化酵素をコードする遺伝子であるｃｒｔＺに変異を導入し、水酸化酵素の活性を低下させればよい。あるいはβ−カロテン水酸化酵素をコードする遺伝子であるｃｒｔＺに変異を導入し、該遺伝子が機能しないように破壊等すればよい。
【００２０】
本発明において変異を導入する細菌としては、カロテノイド類を高含量に細胞内に蓄積しても、高い増殖能を有するカロテノイド代謝アナログ耐性を有する細菌がさらに好ましい。カロテノイド代謝アナログとしては、当業者としては周知のα−ヨノン（ｉｏｎｏｎｅ）またはβ−ヨノン（ｉｏｎｏｎｅ）を例示することができるが、カロテノイド類の蓄積による細胞内調節機構の調節を解除する物質であればこれらの物質に限定されない。本明細書において「耐性を有する」とは、親株が生育阻害を受ける濃度の薬剤存在下でも生育しうることをいう。
【００２１】
変異処理とは、変異原物質や紫外線で細胞を処理することによって変異を加速させる当業者には周知な方法である。変異原物質を例示するとＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル等の化合物を挙げることができる。
【００２２】
また、本発明においては、β−カロテン水酸化酵素遺伝子を破壊、欠損してもよい。破壊、欠損する方法としては、当業者としては周知の遺伝子工学的手法の一つである相同組換え法等により、ターゲットとなる遺伝子に適当なＤＮＡを挿入する方法などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００２３】
本発明においては、変異処理後、変異株を分離し、所望の機能を評価する育種を繰返すことが好ましい。育種方法の一例をあげると、予め培養して得たパラコッカス属細菌ＴＳＴＴ０５２株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６９０）の菌体をこれらの変異原物質の水溶液に懸濁して一定時間放置した後に遠心分離などの方法で菌体を回収して変異原物質を除去する。その後平板培地上で培養し、優良菌株のコロニーを選択する。コロニーの選択は色調の濃いコロニーを選択、分離後液体培養を行ない、次いで、菌体からカロテノイドを抽出してカロテノイド生成量や組成をＨＰＬＣなどで分析し、生産性の向上した菌株を絞り込むことにより優良な菌株を得ることができる。
【００２４】
本発明ではパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属に属し、カンタキサンチン合成能を有する微生物であれば野生株でも変異株でもよく、例を挙げれば本願発明者らによって樹立されたパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ． ＴＳＡＯ５３８株がある（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０７）。
【００２５】
この菌株は、下記の菌学的性質を有するものである。なお、＋は陽性を示し、−は陰性を示す。
（ａ）細胞形態 短桿菌 ０．７−０．８× １．０−１．２μｍ
（ｂ）胞子 −
（ｃ）運動性 −
（ｄ）コロニー形態
１）培地：表１に示す組成の培地
２）直径： １．０ ｍｍ
３）色調： オレンジ色
４）隆起状態： レンズ状
５）形： 円形
６）周縁： 全縁
７）表面形状： スムーズ
８）透明度： 不透明
９）粘稠度： バター様
（ｅ）生理的性質
１）カタラーゼ ＋
２）オキシダーゼ −
３）グルコースからの酸／ガス発生 −／−
４）グルコースにおけるＯ／Ｆテスト −／−
（ｆ）基質の利用性
１）メタノール −
２）エタノール −
３）ブタノール ＋
４）メチルアミン −
５）グリセロール −
６）グルコース ＋
７）フルクトース ＋
８）ガラクトース ＋
９）リボース −
１０）マルトース ＋
１１）スクロース ＋
１２）ラクトース −
１３）マンニトール ＋
１４）イノシトール −
１５）キシロース −
１６）マンノース −
１７）ソルビトール ＋
１８）アラビノース −
１９）トレハロース ＋
２０）グルコン酸 −
２１）酢酸 −
２２）乳酸 ＋
２３）クエン酸 −
２４）コハク酸 ＋Ｗ
２５）マロン酸 ＋Ｗ
２６）ピルビン酸 ＋Ｗ
２７）トリメチル−Ｎ−オキサイド −
２８）チオ硫酸 −
【００２６】
本発明において、選択的に合成できるとは、カロテノイド類を合成する微生物においてカンタキサンチンが分離、精製することが容易となる程度にカンタキサンチンが合成されればよく、好適には、生産されるβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、カンタキサンチンがカロテノイド類の合計量の９０重量％以上しめるものである。なお、カロテノイド類とは、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３‘−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン等であり、さらに、その微生物内に蓄積されるその他のカロテノイド類を含む。
【００２７】
本発明において、優良菌株は適当な菌株を評価し決定することができる。固体培地を利用した場合には、任意のコロニーをピックアップし、液体培養を行い、増殖能、カロテノイド生産能を評価することにより評価可能である。
【００２８】
本発明の方法で使用された微生物は従来方法として知られている栄養培地中で培養することができる。なお、本発明に用いる培地としては、細菌が増殖しカロテノイド類を生産し得るものであればいずれを使用してもよく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕等の天然成分や、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩等やグルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン等のアミノ酸類が、無機塩にはリン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム等のリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、塩化第１鉄、塩化第２鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム・２水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類として酵母エキスやビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシン等が使用できる。
【００２９】
培養工程で使用される菌株は、公知方法に従って、画線培養プレートから発酵容器に移すことができる。好適な方法は、寒天平板培地、斜面寒天培地およびフラスコ培養液を用いた方法である。
【００３０】
本発明のカンタキサンチン等のカロテノイドを製造せしめる条件での新規微生物の培養の条件については、いずれの一般方法を用いて実施してもよい。本方法の好適な実施態様としては、培養は培養液中で行うことが好ましい。この液内培養に関しては通常の液内培養で用いられる条件を使用してもよい。好適には、培養温度を１０〜３５℃に、培地のｐＨを６〜９の範囲に設定し、２０〜２００時間発酵させるのが好ましい。培養温度については培養初期、中期、後期に区別してそれぞれの段階で温度を変えてもよい。本発明の栄養培地を使用した好適な条件は、培養温度２０〜２７℃、ｐＨが約７．０、培養時間が５０〜１５０時間である。
【００３１】
培地のｐＨは６．５〜８．０に調整されるが、好ましくは約７．０である。ｐＨの調整には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム若しくはアンモニアの水溶液を使用するが、これらの物に限定されない。
【００３２】
本発明におけるカロテノイド類の分析方法は、菌体または培養液から安定に効率良く回収されれば特に限定はなく、例えば抽出溶媒としてはメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等がよい。抽出されたカロテノイドの定量は、各種カロテノイドが分離され定量性に優れる高速液体クロマトグラフィーにより行なうことが好ましい。
【００３３】
培養後に、菌体又は培養液からカロテノイド類および／またはカンタキサンチンを回収するには、たとえば、遠心分離操作等により培養液から菌体を分離し、適当な有機溶媒によりそれぞれから抽出すればよい。有機溶媒はメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロフォルム、ジメチルフォルムアミド、ジメチルスルフォキシド等が挙げられる。好適にはアセトンを例示できる。さらには、液体クロマトグラフィー等を利用して高純度に分離、精製することも可能である。液体クロマトグラフィーの分離原理としてはイオン交換、疎水性相互作用、分子ふるい等を挙げることができる。好ましくは、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーである。または、超臨界流体抽出によって細胞から抽出する。
【００３４】
あるいは、培養終了後、菌体を培地から、例えば、遠心分離操作、デカンテーションまたはろ過等の方法を用いて分離してもよい。得られた菌体は、使用し易い粘度にまで水を加えてスラリーとする。カンタキサンチン等のカロテノイド類の分解を防ぐためには、このスラリー中適当な添加剤を加えてもよい。添加剤としてはアスコルビン酸等の酸化防止剤を例示することができるが、これらには限定されない。その後、調製スラリーを例えばガラスビーズ、ジルコニアビーズを用いた破砕機または高圧ホモジナイザーを使用して均一化し、後に使用するため乾燥しておく。好ましい乾燥法はスプレー乾燥法である。
【００３５】
この菌体を、例えば、このまま養殖魚等の飼料中へ添加してもよい。または、前述したように極性有機溶媒等により抽出して使用してもよい。カンタキサンチン等のカロテノイドを抽出した後に残った、ほとんど色素を含まない細胞体は、家禽を飼育するうえで理想的な蛋白質およびビタミン類の供給源として使用することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）
パラコッカス属細菌への変異導入および変異株のプレート評価
パラコッカス属細菌ＴＳＴＴ０５２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０６９０）を表１において表す液体培地５ｍｌに植菌し、２５℃、１５０ｒｐｍで１日間振とう培養を行った。この培養液のうち１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、１５，０００回転、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。この菌体をｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（緩衝液Ａ）１ｍｌに懸濁し、次いで３ｍｇ／ｍｌのＮ‐メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアジニジン（以下ＮＴＧと略記する）水溶液１０μｌを加え、３０〜６０分間静置した。その後、遠心分離して上清を除去し、緩衝液Ａに再懸濁する操作を２回繰返してＮＴＧを除去した。さらに、０．５ｍｌ緩衝液Ａに菌体を懸濁し、表１に示す培地３ｍｌに植菌して４〜５時間培養した。得られた培養液を、表１に示す組成の培地にさらに寒天を添加し固化させたプレートに適当量スプレッドし、２５℃で５日間培養を行った。培養３日目から、コロニーを目視により確認することができ、コロニーの赤色の濃淡を区別することも可能となった。
【００３８】
（実施例２）
パラコカッカス属細菌変異株の培養
実施例１で得られた菌株をランダムに選択し、表１において示す培養液５ｍｌに植菌し、２５℃、１日間培養後した。次いで、表１に示した組成の培地６０ｍｌを１００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに入れ滅菌し、先に培養した培養液２ｍｌを植菌した。２５℃で７日間振とう（１００ｒｐｍ）培養後、培養液を適宜抜き取り、濁度（ＯＤ６６０ ｎｍ）およびカロテノイドの定量を行った。カロテノイドの定量は以下の様に行なった。まず培養液１ｍｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、１５，０００回転、５分間遠心分離して菌体ペレットを得た。この菌体に２０μｌの純水に懸濁し、次いで２００μｌのジメチルフォルムアミドおよび５００μｌのアセトンを加え振とうしてカロテノイドを抽出した。この抽出液を１５，０００回転、５分間遠心分離により残渣を除去後、ＴＳＫｇｅｌ−ＯＤＳ８０ＴＭカラム（東ソー社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと略記する）で各種カロテノイドを定量した。なおカロテノイドの分離はＡ液として純水とメタノールの５対９５の混合溶媒、Ｂ液としてメタノールとテトラヒドロフランの７対３の混合溶媒を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でＡ液を５分間カラムに通過させた後、同じ流速Ａ液からＢ液へ５分間の直線濃度勾配を行ない、さらにＢ液を５分間通過させることにより行なった。カンタキサンチン濃度は４７０ｎｍの吸光度をモニターし、既知濃度のカンタキサンチン標準試薬で作成した検量線より濃度を算出した。評価した変異株のなかから、カンタキサンチン選択合成を確認することができた新規変異株としてＴＳＡＯ５３８株（特許生物寄託センター寄託した菌株であり、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０７）を分離した。カンタキサンチンであることは標準試薬のＨＰＬＣ上の保持時間から確認した。図２にＴＳＡＯ５３８株の抽出カロテノイドのＨＰＬＣパターンと標準試薬のそれを図示した。図２の通り、ＴＳＡＯ５３８株の抽出カロテノイドは標準試薬のカンタキサンチンのピークと重なり、選択的にカンタキサンチンを合成するこが確認できた。
【００３９】
同様にして培養した変異導入前の株であるＴＳＴＴ０５２株の培養４日目のカロテノイド類の生成パターンを図３に示した。図２および図３の通り、ＴＳＡＯ５３８株はＴＳＴＴ０５２株とは異なり、カンタキサンチンを選択的に合成し、カロテノイド類に占めるカンタキサンチンの割合は９０％を超えた。選択合成割合は、ＨＰＬＣ法（例えば、非特許文献２参照）により、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、β−カロテン、フェニコキサンチン、アドニキサンチン、エキネノンの生産量を求め、それに対するカンタキサンチンの生産量として算出した。結果を表２に示す。
【００４０】
図４にＴＳＡＯ５３８株のカンタキサンチン合成における時間変化を示したグラフを図示した。図４の通り、ＴＳＡＯ５３８株は培養の経過と共に、カンタキサンチンを合成し、培養５日目においてもカンタキサンチンを分解することなく細胞内に含有していた。培養４日目においては菌体あたりのカンタキサンチン含有量は約１．２重量％であった。重量％は乾燥菌体の重量を求めることにより算出した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の新規なカンタキサンチン選択合成細菌は、カロテノイド類であるカンタキサンチンを簡単に抽出、精製することができるので、食品または飼料として有用なカンタキサンチンを工業規模で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】フィトエンから始まり、β−カロテンを化学修飾し、最終的にアスタキサンチンを生産する経路図である。
【図２】ＴＳＡＯ５３８株から抽出したカロテノイド類のＨＰＬＣチャートであり、図中、Ｘ軸（横軸）は保持時間（単位は分）を示し、Ｙ軸（縦軸）ＨＰＬＣピーク強度（単位はｍＶ（任意強度））を示す。
【図３】ＴＳＴＴ０５２株から抽出したカロテノイド類のＨＰＬＣチャートであり、図中、Ｘ軸（横軸）は保持時間（単位は分）を示し、Ｙ軸（縦軸）ＨＰＬＣピーク強度（単位はｍＶ（任意強度））を示す。
【図４】ＴＳＡＯ５３８株の培養経過を示す図であり、図中、Ｘ軸（横軸）は培養日数（単位は日）を示し、Ｙ軸（左側縦軸）はＯＤ６６０ｎｍの吸光度値、Ｙ軸（右側縦軸）はカロテノイドの濃度（単位はｍｇ／Ｌ）を示す。
【符号の説明】
【００４５】
１：培養経過に伴うＯＤ６６０ｎｍにおける吸光度値（▲）
２：培養経過に伴う総カロテノイド濃度（●）
３：カンタキサンチンの濃度（○）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンタキサンチンを選択的に生産するカロテノイド生産性パラコッカス属細菌。
【請求項２】
生産されるβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、カンタキサンチンが前記カロテノイド類の合計量の９０重量％以上しめることを特徴とする請求項１記載の細菌。
【請求項３】
アスタキサンチン合成細菌の変異処理によりβ−カロテン水酸化酵素遺伝子に変異が導入され、β−カロテン水酸化酵素活性が低下することによりカンタキサンチンを選択的に合成する生産能を有する細菌。
【請求項４】
アスタキサンチン合成細菌の変異処理によりβ−カロテン水酸化酵素遺伝子に変異が導入され、β−カロテン水酸化酵素遺伝子が欠損することによりカンタキサンチンを選択的に合成する生産能を有する細菌。
【請求項５】
菌体にカンタキサンチンを１重量％（乾重量換算）以上含むカロテノイド類合成細菌。
【請求項６】
細菌が、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＡＯ５３８株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０７）である請求項１記載のパラコッカス属細菌。
【請求項７】
請求項１ないし６の何れか一項に記載の細菌を培養し、培養後の菌体または培養液からカロテノイド類を回収することを特徴とするカロテノイド類の製造方法。
【請求項８】
カロテノイド類が、カンタキサンチンである請求項７に記載のカロテノイド類の製造方法。
【請求項１】
カンタキサンチンを選択的に生産するカロテノイド生産性パラコッカス属細菌。
【請求項２】
生産されるβ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、ゼアキサンチン、フェニコキサンチン、アドニキサンチンおよびアスタキサンチンを含むカロテノイド類において、カンタキサンチンが前記カロテノイド類の合計量の９０重量％以上しめることを特徴とする請求項１記載の細菌。
【請求項３】
アスタキサンチン合成細菌の変異処理によりβ−カロテン水酸化酵素遺伝子に変異が導入され、β−カロテン水酸化酵素活性が低下することによりカンタキサンチンを選択的に合成する生産能を有する細菌。
【請求項４】
アスタキサンチン合成細菌の変異処理によりβ−カロテン水酸化酵素遺伝子に変異が導入され、β−カロテン水酸化酵素遺伝子が欠損することによりカンタキサンチンを選択的に合成する生産能を有する細菌。
【請求項５】
菌体にカンタキサンチンを１重量％（乾重量換算）以上含むカロテノイド類合成細菌。
【請求項６】
細菌が、カロテノイド生産性パラコッカス属細菌ＴＳＡＯ５３８株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０７０７）である請求項１記載のパラコッカス属細菌。
【請求項７】
請求項１ないし６の何れか一項に記載の細菌を培養し、培養後の菌体または培養液からカロテノイド類を回収することを特徴とするカロテノイド類の製造方法。
【請求項８】
カロテノイド類が、カンタキサンチンである請求項７に記載のカロテノイド類の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−１８１４５１（Ｐ２００７−１８１４５１Ａ）
【公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４５６５３（Ｐ２００６−２４５６５３）
【出願日】平成１８年９月１１日（２００６．９．１１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１１日（２００６．９．１１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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