新規鳥類アストロウイルス
本発明は、獣医ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、新規鳥類アストロウイルス；この新規ウイルスに対する抗体もしくはその断片；新規鳥類アストロウイルスの、抗原調製物、タンパク質及びＤＮＡ分子；新規ウイルスもしくはその抗原性調製物、タンパク質又はＤＮＡの、ワクチン；このようなワクチンの製造のための方法；及び診断キットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、新規鳥類アストロウイルス；新規ウイルスに対する抗体又はその断片；新規鳥類アストロウイルスの、抗原性調製物、タンパク質及びＤＮＡ分子；新規ウイルスもしくはその抗原性調製物、タンパク質又はＤＮＡの、ワクチン；このようなワクチンの製造のための方法及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アストロウイルスは、プラスセンスの、１本鎖ＲＮＡゲノムを有する、小型で球形のエンベロープのないウイルスである。殆どのアストロウイルスは、下痢、嘔吐、吸収不良、全身的倦怠感及び成長遅延をもたらす、ある種の腸炎を引き起こすことに関連付けられてきた。感染は、幼若、老齢又は免疫不全個体など、体力がないヒト又は動物では致死となり得る。Ｍａｔｓｕｉ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ（Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、１９９６：Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓら編、ＩＳＢＮ：７８１７０２５３４、第２６章）及び：Ｍｏｓｅｒ及びＳｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ（２００５、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８、ｐ．４−１０）参照。
【０００３】
また、アストロウイルス種又は株それ自身の間で毒性に差があるので、アストロウイルス誘発性病態の重症度は変動し得る。これにより、アストロウイルスのうち一部は第二の病原体として作用し、それら自身では無症候性の疾患しか引き起こさず、一方で、別の病原体からの疾患のさらなる原因がある場合のみ、疾患の完全な臨床兆候を呈すると考えられるようになった。
【０００４】
アストロウイルス感染に対する免疫が達成される機構も完全には明確になっておらず；ウイルス中和抗体は、防御及び免疫学的記憶の一端を担っていると思われるが、おそらく、アストロウイルス感染に対する免疫反応の唯一のエフェクターではない。これは、Ｍ．Ｋｏｃｉ（２００５、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８、ｐ．１１−１６）により概説されている。
【０００５】
アストロウイルスは、世界中で検出されており、多岐にわたる動物から単離された。同様に、ある一定の標的動物に感染するアストロウイルス種の中で、いくつかの血清型が述べられている。分類学的に、アストロウイルス科は、２種類の主要な属、哺乳動物アストロウイルス：Ｍａｍアストロウイルス及び鳥類アストロウイルス：Ａｖアストロウイルスに分類される。現在のところ、Ａｖアストロウイルス属は、正式に認識される種：鳥類腎炎ウイルス１及び２（ＡＮＶ１、２）（ニワトリより）及びシチメンチョウアストロウイルス１及び２（ＴＡｓｔＶ１、２）を含む。
【０００６】
いくつかのさらなる鳥類アストロウイルスが、アヒル、ニワトリ、ダチョウ及びシチメンチョウから単離されてきた。例えば、ニワトリアストロウイルス２（ＣＡｓｔＶ２）は、Ｂａｘｅｎｄａｌｅ及びＭｅｂａｔｓｉｏｎ（２００４、Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３３、ｐ．３６４−３７０；及び国際特許出願ＷＯ２００４／０２７０５３）により記載されており、Ｔｏｄｄらは、ＣＡｓｔＶ２と近縁であるＣＡｓｔＶ３（ＷＯ２００７／０７７４６４）について述べた。これらのアストロウイルスは、Ｋｏｃｉ及びＳｃｈｕｌｚ−Ｃｈｅｒｒｙ（２００２、Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３１、ｐ．２１３−２２７）により概説されるように、まだ正式には分類されていない。
【０００７】
アストロウイルスは、生活環境において非常に安定であり、例えばこれらは、通常の脂質−溶媒及び界面活性剤に耐性を有し得、幅広いｐＨ耐性を有し、比較的温度に対して安定である。この事実から、それらの高い感染性及び糞口経路による易伝染性と組み合わせて、アストロウイルス又はそれらに対する抗体が非常に多くのヒト及び動物界で見出され得る理由が説明される。
【０００８】
これらの小型ＲＮＡウイルスの分類及び命名は、新しい実験データに適合させるために改訂が必要とされた場合に頻繁に変更されてきた。例えば、アヒルアストロウイルス（ＤＡｓｔＶ）は、かつてはピコルナウイルスとして分類され、肝炎を引き起こすので、元来、アヒル肝炎ウイルスＩＩと呼ばれていた。同様に、ＡＮＶ１は、以前、ピコルナウイルス、特にエンテロウイルスと記載されていたが、しかし、Ａｖアストロウイルスと再分類された（Ｉｍａｄａら、２０００、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、ｐ．８４８７−８４９３）。ＡＮＶ１はまた、ニワトリアストロウイルス１（ＣＡｓｔＶ１）とも呼ばれ、腎炎を引き起こす。
【０００９】
ウイルスゲノムの配列及び構成における新しい情報の活用時に、これらのウイルスの再分類が求められた。特に、アストロウイルス科に対して、物理学的、電子顕微鏡的及び生化学的特徴が、ピコルナ−、カリシ−又はへぺウイルス科（Ｅ型肝炎様ウイルス）などのその他のいわゆる「小型球形ウイルス」又は「エンテロウイルス様ウイルス」から又はさらにはアストロウイルスの病徴とよく類似した病徴を引き起こす、レオ−、ロタ−又はコロナウイルスなどのエンベロープのあるＲＮＡウイルスから、アストロウイルス科を区別するためには十分ではないことが多いことが分かった。これは、このような特性評価の結果が、使用される方法及び条件で変動するからである。従って、これらは、正しい決定を行うには十分に一貫していない。
【００１０】
一方、免疫学的特性評価と組み合わせた、遺伝子型決定などの分子生物学的な特性評価は、正しい分類群に微生物を割り当てるのに十分詳しく、再現可能である（Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌら、２０００、Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、７ｔｈ Ｒｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＣＴＶ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、理想的には、このような決定は、ヌクレオチド配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ及び血清学的分類アッセイに基づく。
【００１１】
アストロウイルス科のＲＮＡゲノムは、概ね約７ｋｂの大きさであり、このウイルス科に対して典型的であるゲノム構成を有する。Ｊｉａｎｇら（１９９３、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、ｖｏｌ．９０、ｐ．１０５３９−１０５４３）及びＫｏｃｉら（２０００、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、ｐ．６１７３−６１７７）参照。現時点の理解によると、このゲノムは、５’から３’に向かって、３つの明らかに認識可能なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を組み込む。
ＯＲＦ１ａ：は、約３ｋＢの大きさであり、セリンプロテアーゼモチーフを有する非構造タンパク質をコードする。
ＯＲＦ１ｂ：は、約１．５ｋＢの大きさであり、ＯＲＦ１ａと部分的に重複し、非構造ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。
ＯＲＦ２：は、約２ｋｂサブゲノムＲＮＡを介して、構造ウイルスタンパク質をコードする。発現されるポリタンパク質は、おそらく、ウイルスアセンブリ前により小さい部分に切断され、とりわけキャプシド又はコートタンパク質を含む。
【００１２】
３つのＯＲＦのうち、ＯＲＦ１ｂは、公開されているアストロウイルスヌクレオチド配列の中で比較して、最も保存されたヌクレオチド配列を有し、ＯＲＦ２は配列中で最も変化しやすいＯＲＦである。
【００１３】
オランダ、ドイツ及びアラブ首長国連邦での養鶏場において、ニワトリ及びシチメンチョウが、下痢、試料効率及び成長の低下ならびに肢の関節及び腱の腫脹及び疼痛を伴う問題を発現するという、ある特定の疾患問題が１９８７年から現在までの間、観察された。これらの問題は、様々な齢の、及び明らかな相互のつながりのない様々な農場の、ブロイラー、種畜及び産卵用鳥類で見られた。
【００１４】
第１週齢から数ヶ月齢の鳥類において跛行が観察された。動物は、下肢の膝節（足首）関節及び腱シャフト（ｔｅｎｄｏｎ ｓｈａｆｔ）の腫脹（両方とも、透明で僅かに粘性のある液体が過剰に貯留）及び関節炎の症状を呈した。飼料利用及び成長速度の低下がこれらの鳥類で観察されたが、これはおそらく、運動器官の問題の結果であろう。最悪の場合、鳥類はもはや動くことができず、それにより、摂餌又は摂水不可能となり、結果的に死亡した。これらの肢の異常は、体重がより重いブロイラー型の鳥類の行動で最も顕著であったが、しかし、持続的な経済的損失は全てのタイプの鳥類で深刻であった。
【００１５】
さらにより問題であったのは、主に幼若鳥類で、また抱卵齢の鳥類でも観察された下痢であった。症状は、消化不良から明白な腸炎まで様々であり、その結果、飼料効率が低下し；成長が低下するか又はさらに体重が減少し；産卵数が減少し（「産卵減少」）；低質の卵数が増加し；死亡率が上昇した。
【００１６】
いくつかの農場で、数年にわたりその問題が観察され、その結果、明確な原因なく、低生産性状態が持続した。
【００１７】
死後の検査時に、数例において、砂嚢のびらん又は肝臓の腫脹により示されるものなど、腸又は肢関節以外の身体部位も冒されていたことが分かった。
【００１８】
これらの症状に対する原因を検出するために、管理及び食餌の点を調べたが、管理及び食餌は、これらの場合に観察された問題とは関連し得なかった。また、特にレオウイルス（このウイルスは、吸収不良及び関節の問題を引き起こすことが周知であるため）による感染に関与し得る病原体を調べた。しかし、様々なアッセイを使用したにもかかわらず、多くの場合において、レオウイルスは検出できなかった。
【００１９】
細菌：サルモネラ、マイコプラズマ、ヘモフィルス及びパスツレラ；及びウイルス：アデノウイルス、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群（ＥＤＳ）及び鳥類インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）などの、同様の問題を引き起こすことが知られているものに対して、通常的に又は特異的に何れかでいくつかのその他の病原体も調べた。
【００２０】
今日まで、どの原因物質も、重症度にかかわらず観察された肢及び腸の問題、動物の福祉に対する問題及び結果として生じるこれらの養鶏場の経済効率低下に関連し得なかった。
【００２１】
結果的に、観察される疾患−症状に関連する物質を同定する、及び疾患の予防及び原因物質の同定をもたらす、ワクチン及び診断法を提供することが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２７０５３号
【特許文献２】国際公開第２００７／０７７４６４号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｉ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ他編、ＩＳＢＮ：７８１７０２５３４、１９９６年
【非特許文献２】Ｍｏｓｅｒ及びＳｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８、２００５年、ｐ．４−１０
【非特許文献３】Ｍ．Ｋｏｃｉ、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８、２００５年、ｐ．１１−１６
【非特許文献４】Ｂａｘｅｎｄａｌｅ及びＭｅｂａｔｓｉｏｎ、Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３３、２００４年、ｐ．３６４−３７０
【非特許文献５】Ｋｏｃｉ及びＳｃｈｕｌｚ−Ｃｈｅｒｒｙ、Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３１、２００２年、ｐ．２１３−２２７
【非特許文献６】Ｉｍａｄａ他、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、２０００年、ｐ．８４８７−８４９３
【非特許文献７】Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ他、Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、７ｔｈ Ｒｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＣＴＶ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年
【非特許文献８】Ｊｉａｎｇ他、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、ｖｏｌ．９０、１９９３年、ｐ．１０５３９−１０５４３
【非特許文献９】Ｋｏｃｉ他、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、２０００年、ｐ．６１７３−６１７７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
驚くべきことに、腸及び運動器官疾患に罹患しているニワトリ及びシチメンチョウにおいて新しいウイルスが発見された。様々な齢、型及び起源の罹患鳥類の、関節及び腱の両方から、ならびに様々な内部器官から、このウイルスを単離することができた。この単離ウイルスは、同様に、健康な試験動物の感染時に疾患の同様の症状を誘導し、罹患試験動物から再単離することができ、それによりコッホの条件を満たした。
【００２５】
ウイルス及び家禽でそれが引き起こす疾患の問題、特に、関節及び腱の疾患ならびに胃腸管の疾患を検出及び治療するための、診断アッセイ及びワクチンを開発するために、この新しいウイルスを使用することができる。
【００２６】
この新規ウイルスを多くの方法で分析し、驚くべきことにアストロウイルスとして同定された。ニワトリ及びシチメンチョウにおけるその罹患率のため、これは鳥類アストロウイルスとして仮に認定される。
【００２７】
本明細書中に記載の新しいウイルスがエンベロープのないものであるという事実は、多くのその他の特性評価の中でも、クロロホルムでの２回の連続抽出を行い、その後、抽出されたウイルス試料が有胚ニワトリＳＰＦ卵において特異的な病原効果を依然として引き起こし得たという結果から得られた。
【００２８】
この新しいウイルスにおけるＲＮＡゲノムの存在は、さらなる分析に対して使用可能な核酸が、ＤＮＡ単離及び通常のＰＣＲ後ではなく、ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ後にのみ得ることができたという事実から示された。
【００２９】
驚くべきことに、最も近縁（まだ区別可能である）種は、ＡＮＶ１型のウイルスであることが分かり、従って本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスは、仮にＡＮＶ３ウイルスとして分類される、鳥類腎炎ウイルスの新規の群に相当する。
【００３０】
しかし、発明者らは、驚くべきことに、ＡＮＶ１及びその他の（アストロ）ウイルスから本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスを区別し、それ自身の新規の別個の群に属するものとして新規鳥類アストロウイルスの異なる分離株の特徴を独自に示す、多くの特性を見出した。
【００３１】
主要な特徴的性質は、ヌクレオチド配列分析により及びＰＣＲアッセイにより同定可能である特異的なヌクレオチド配列の存在に関する。
【００３２】
胚の感染時に誘発される別個の病的症状もまた観察された。特異的な免疫学的相違は、ＶＮ−又はＩＦＴ−アッセイを用いた血清型決定により検出可能であった。これら全ては、実験結果及び詳細とともに下記で述べる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、選択されたいくつかの本発明による鳥類アストロウイルスの分離株からのＯＲＦ１ａの一部分のｃＤＮＡ配列の多重アラインメントを示す。参照は分離株１９からの配列である。外側参照は、ＡＮＶ１参照ウイルスのゲノムのｃＤＮＡ配列の対応部（配列番号１）である。囲み付きの部分は、ＡＮＶ１ ＯＲＦ１ａに存在しない１２個のヌクレオチド領域を示す。
【図１−１】図１−１は、選択されたいくつかの本発明による鳥類アストロウイルスの分離株からのＯＲＦ１ａの一部分のｃＤＮＡ配列の多重アラインメントを示す。参照は分離株１９からの配列である。外側参照は、ＡＮＶ１参照ウイルスのゲノムのｃＤＮＡ配列の対応部（配列番号１）である。囲み付きの部分は、ＡＮＶ１ ＯＲＦ１ａに存在しない１２個のヌクレオチド領域を示す。
【図２】図２は、図１で列挙されるｃＤＮＡ配列のコンピュータ翻訳により作成された、推定アミノ酸配列の多重アラインメントを示す。囲み付きの部分は、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａによりコードされるタンパク質に存在しない４個のアミノ酸を示す。
【図３】図３は、図１で与えられるヌクレオチド配列アラインメントの結果の樹状図を示す。
【図４】図４は、本発明の鳥類アストロウイルスに特有である１２個のヌクレオチド領域（太字で表示）の位置に関する、プライマー配列番号３０及び３１のハイブリッド形成領域の図解である。
【図５】図５は、臭化エチジウム染色され、ＵＶ光で照射されたアガロースゲル（このゲル上でいくつかのｃＤＮＡ試料におけるプライマー配列番号３０及び３１を用いたＰＣＲアッセイ産物の電気泳動を行った。）の写真を示す。陽性ＰＣＲの予想産物であるおよそ２６０塩基対のバンドがレーン５でのみはっきりと見られた。配列番号３のプライマーを用いて、前進（ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ）ＲＴ反応を行った。 レーン１：陰性対照（ＰＣＲ反応においてｃＤＮＡなし）。 レーン２：未感染ニワトリからの肝臓ホモジェネート。 レーン３：ＡＮＶ１；１９９１のＧｅｒｍａｎ分離株、増幅１ｘＣＡＭ、４ｘ卵黄嚢、尿膜腔液を回収。 レーン４：ＣＡｓｔＶ２；番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９３２でＣＮＣＭに寄託されたウイルス由来、尿膜腔液。 レーン５：本発明による鳥類アストロウイルスの分離株１９、尿膜腔液。 Ｍ：ＤＮＡサイズマーカーレーン：２００、４００、６００、８００、１０００ｂｐなどでのバンド。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、鳥類腎炎ウイルスのＯＲＦ１ａと比較した場合に、１２個のヌクレオチドの挿入物（この挿入物は、配列番号１のヌクレオチド番号２４８５及び２４８６に対応するヌクレオチドの間に位置する。）を含有することを特徴とする、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａゲノム領域を有する、単離新規鳥類アストロウイルスに関する。
【００３５】
好ましい「鳥類」生物は家禽であり；より好ましい鳥類生物は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル及びガチョウからなる群から選択される。最も好ましいのはニワトリである。
【００３６】
「アストロウイルス」という用語は、本発明による新しいウイルスの群の、アストロウイルス科の分類学的ファミリーに属しているものとして現在記載されている及び／又は分類されているウイルスに対する関係を示す。しかし、当業者は、新しい知見により、新しい又はその他の分類群への再分類が行われ得るので、このような分類学的分類が、時を経て変化し得ることを認識しよう。しかし、これは、本発明によるウイルスの特徴を変更せず、その分類のみが変更されるので、このような再分類生物は、本発明の範囲内に留まる。
【００３７】
特に、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスから亜種、株、分離株、遺伝子型、血清型、変異体又はサブタイプなどにさらに分類される全てのウイルスを包含する。
【００３８】
従って、本発明の場合、「アストロウイルス」とは、アストロウイルスとして分類されるウイルスの特徴的特性を有するウイルスである。このような特徴的特性は、例えば、分子生物学的、生化学的及び生物学的特性；例えば、１ａ、１ｂ及び２として同定可能なＯＲＦを含むプラスセンス１本鎖ＲＮＡゲノムを有すること；約２８−３０ｎｍのエンベロープのないビリオンであること；及び腸炎を引き起こすことに関する。
【００３９】
「ゲノム領域」という用語は、本発明による新規鳥類アストロウイルスの遺伝物質の一部を指すものとする。このような領域は、核酸からなり；本発明による新規鳥類アストロウイルスの場合、この核酸はＲＮＡである。
【００４０】
本発明による新規鳥類アストロウイルスのゲノムは、全てのその他のアストロウイルス科と同様に、ＯＲＦ１ａ、１ｂ及び２として認識可能であり、それに対応する領域を含む。
【００４１】
しかし、驚くべきことに、新規鳥類アストロウイルスが、そのＯＲＦ１ａゲノム領域において、ＡＮＶ１又は（鳥類）アストロウイルスの何らかのその他の型のＯＲＦ１ａには存在しないいくつかのヌクレオチドを有することが分かった。これらのヌクレオチドは、１２個のヌクレオチドの直線状及び連続的ストレッチの形態で存在し、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａ配列と比較した場合、この領域への挿入物に相当する。この１２個のヌクレオチド「挿入物」は、本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスの群の試験した全分離株のＯＲＦ１ａに存在した。
【００４２】
本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスの分離株のＯＲＦ１ａにおいてこの１２個のヌクレオチド挿入物が存在する場所は、Ｉｍａｄａら（２０００、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、ｐ．８４８７−８４９３）により記載された、参照ＡＮＶ１株のゲノム配列に対して記載されるとおりの付番を参照することにより示される。このＡＮＶ１株のゲノム配列のｃＤＮＡ配列はまた、受入番号ＡＢ０３３９９８下でＧｅｎＢａｎｋとして知られるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのインターネットのヌクレオチド−データベースからも利用可能であり、配列番号１として本明細書中で表される。
【００４３】
本発明による新規鳥類アストロウイルスの全分離株に対して、ＯＲＦ１ａのこの１２個のヌクレオチド挿入物は、配列番号１のヌクレオチド番号２４８５及び２４８６に対応するヌクレオチドの間にあった。
【００４４】
現在のところ、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａに存在しない本発明による新規鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａのこの１２個のヌクレオチド挿入物が、この新規鳥類アストロウイルスの挙動に影響するか否か、どのように影響するかは分かっていない。理論に縛られるものではないが、発明者らは、１２個のヌクレオチド、従って、ＯＲＦ１ａインタクトの翻訳フレームを維持する４個のトリプレットの挿入物が存在するという事実により、コードされる４個のさらなるアミノ酸がＯＲＦ１ａから発現される非構造タンパク質において組み込まれるようになるということを推測する。ウイルスの病態生物学的な挙動、例えばその毒性及びその、腸ならびに肢、関節及び腱の疾患を引き起こす能力にこれが影響する可能性は大いにある。
【００４５】
それにもかかわらず、これらの１２個のヌクレオチドが本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａゲノム領域に存在するが、ＡＮＶ１又はその他の（鳥類）アストロウイルスのＯＲＦ１ａには存在しないということから、ウイルスのこの新規群に対する陽性遺伝子マーカーがもたらされる。
【００４６】
当技術分野で周知のように、遺伝子マーカーは、生物の遺伝物質の特徴であり、ある一定のゲノム位置に存在し、これは、ある種の区別又は関係付けを行うために有用であり、技術的手段により検出可能である。この場合のように、同定しようとする群に特性が存在する場合、それは、その群に対する「陽性の」遺伝子マーカーである。
【００４７】
本発明による新規鳥類アストロウイルスの特徴である１２個のヌクレオチド挿入物のヌクレオチド配列は、本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスの全分離株に対して同一ではないが、大きさ及び位置は同一であった。この１２個のヌクレオチド挿入物のヌクレオチド配列のコンセンサスは、５’−ＴＣＹＧＧＤＭＡＲＹＹＴ−３’であり、配列番号２として本明細書中で表される。
【００４８】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、１２個のヌクレオチドの挿入物が配列番号２で与えられるような核酸配列を有することを特徴とする。
【００４９】
当業者は、配列番号２の配列がいわゆる「変性」プライマー配列であることを知っており、このことから、位置（ここで：Ｙ、Ｄ、Ｍ及びＲ）があり、ここで、多くのヌクレオチドのうち１つが存在し得ることが示される。変性塩基を示すための一般に使用されるコードはＩＵＰＡＣコードであり（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８５、ｖｏｌ．２２９、ｐ．２８１−２８６で公開）、ここで：Ｒ＝Ｇ又はＡ；Ｙ＝Ｔ又はＣ；Ｍ＝Ａ又はＣ；Ｋ＝Ｇ又はＴ；Ｓ＝Ｇ又はＣ；Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｈ＝Ａ、Ｃ又はＴ；Ｂ＝Ｇ、Ｔ又はＣ；Ｖ＝Ｇ、Ｃ又はＡ；Ｄ＝Ｇ、Ａ又はＴ；及びＮ＝Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣである。
【００５０】
本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスに対して、この検出可能な遺伝子マーカーが存在することによって、例えばＤＮＡ配列決定又はＰＣＲを介して検出することにより、新規ウイルス及びその新規群の同定が可能となる。
【００５１】
ＤＮＡ配列決定は周知の技術であり、標準的プロトコール及び例えば高速自動配列決定のための装置は広く利用可能である。最も一般的には、このようなプロトコールは、ＰＣＲに基づく「サイクル−配列決定」と、それに続いく高解像度の電気泳動を使用する。
【００５２】
アストロウイルス科などのＲＮＡウイルスの核酸配列決定に対して、ＲＮＡ配列決定がまだ実行可能ではないので、調べようとする核酸は、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の形態である必要がある。ｃＤＮＡの調製に対して、多くの標準的プロトコール及び市販のキットが利用可能である。このようなプロトコールは、逆転写酵素を使用する。一般に、コピー作製プロセスを開始するためにプライマーが使用される。
【００５３】
ＲＴ反応のための適切なプライマーの例は、本明細書中で配列番号３として与えられるＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、５’−ＴＣＧ ＷＴＳ ＣＴＡ ＣＹＣ−３’である。発明者らは、このプライマーをプライマー１７と呼ぶ。
【００５４】
このプライマーは、多くの鳥類アストロウイルスのゲノムの遠く離れた３’領域とハイブリッド形成する（配列番号１のヌクレオチド番号６７３１に相当するヌクレオチドから始まり、逆方向に進む。）。
【００５５】
図１は、本発明による鳥類アストロウイルスの選択されたいくつかの分離株からの、ＯＲＦ１ａの一部分のｃＤＮＡ配列の多重アラインメントを示す。これらは、配列番号１で表されるようなＡＮＶ１参照ウイルスのゲノムの対応部分と並べられる。囲みのある領域で明らかに見られるように、全ての分離株は、ＡＮＶ１ ＯＲＦ１ａには存在しない１２個のヌクレオチド領域を保持する。本発明による鳥類アストロウイルスの分離株のＯＲＦ１ａ ｃＤＮＡ配列の配列番号は表１で列挙する。
【００５６】
同様に、図２は、図１で列挙されるｃＤＮＡ配列のコンピュータ翻訳により作製されるような推定アミノ酸配列の多重アラインメントを示す。囲みのある領域で明らかに見られるように、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａによりコードされるタンパク質は、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａによりコードされるタンパク質には存在しない４個のアミノ酸を含有する。本発明による鳥類アストロウイルスの分離株の翻訳ＯＲＦ１ａ配列の配列番号を表１で列挙する。
【００５７】
本発明による鳥類アストロウイルスの分離株に関して：上述のような肢及び／又は腸疾患に罹患しているニワトリ及びシチメンチョウから、長期間にわたり多数の野生分離株を回収した。これらの分離株のうち、多くを分析し、これが、本明細書中に記載のような鳥類アストロウイルスの新規群の発見に繋がった。しかし、その群で生じる天然の変異に関して新規鳥類アストロウイルスを定義するために、分析した全分離株のうち選択したもののみを本明細書中で示す。
【００５８】
表１は、本明細書中に記載の本発明による鳥類アストロウイルスの分離株の説明を与える。また、表１で、分離株のうち選択されたもの由来のＯＲＦ１ａ、１ｂ及び２からのｃＤＮＡ及び推定タンパク質配列の配列番号を列挙する。
【００５９】
【表１】
【００６０】
本発明による鳥類アストロウイルスの分離株は、１以上の器官から又は肢の関節もしくは腱からの試料を採取することによって、腸又は肢の問題がある鳥類から得ることができる。必要に応じてこの試料をホモジェナイズ処理し、例えば、適切な緩衝液、好ましくは抗生物質を含有する緩衝液と混合することができる。
【００６１】
このような分離株のウイルス力価を増幅するために、鳥類細胞株又は有胚鳥類卵などの様々な基質を使用することができる。卵を使用する場合、縣濁液を有胚鳥類卵に接種し、そこで培養することができる。漿尿膜（ＣＡＭ）において又は卵黄嚢への又は尿膜液腔へなど、様々な接種経路が可能である。好ましくは、接種の最初の数ラウンドは卵黄嚢に対して行い、以降の接種は（必要に応じて）、尿膜に行い得る。約５−７日有胚ニワトリＳＰＦ卵を使用することができる。このような技術は、全て、当業者にとって周知であり、適切な質及び齢のＳＰＦニワトリ卵は、例えばＳｐａｆａｓ（Ｒ）又はＬｏｈｍａｎｎ（Ｒ）から市販されている。
【００６２】
適切な条件下で２−７日間温置した後、胚、ＣＡＭ又は（好ましくは）尿膜腔液を回収し得る。必要に応じて、卵黄嚢又は尿膜腔液への接種により、卵での増幅のさらなるラウンドを行い得る。最後に、大量の本発明による鳥類アストロウイルスを含有する尿膜腔液を回収し得る。
【００６３】
ＯＲＦ１ａの代表的部分の両鎖のＰＣＲ配列決定のために、次のプライマーを都合よく使用することができる：
配列番号２８：５’−ＡＡＡ ＧＧＫ ＡＡＧ ＡＣＤ ＡＡＧ ＡＲＲ ＲＡＣ ＭＧ−３’及び
配列番号２９：５’−ＴＣＧ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＴＣＴ ＴＣＡ−３’。
【００６４】
発明者らは、これらの配列決定プライマーをそれぞれプライマー、Ｆ−ＩＩ及びＲ−ＩＩ−３と呼ぶ。配列番号２８は、ｎｔ２１７１に対応するヌクレオチドから始まるさらに先の部分とハイブリッド形成し（配列番号１）；配列番号２９は、配列番号１のｎｔ２６４０から始まり逆方向に進むヌクレオチドとハイブリッド形成する（表４参照）。このようにして、ＡＮＶ１に存在しない１２個のヌクレオチドを含む本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａのゲノム領域が、配列決定されるＯＲＦ１ａの部分によりカバーされる。
【００６５】
決定されたＤＮＡ配列のコンピュータ分析のために、これらは、プライマーそれ自身から、変性配列を含有しないようにトリミングされる。また、比較される配列は、代表的アラインメントを達成するために、同等な長さである必要がある。また、切り取られた配列の全長にわたりこのアラインメントが行われるべきである。これは、例えば、プライマー配列番号２８及び２９を使用する場合において、比較しようとする配列の長さが約４００−４２５ヌクレオチドであることを意味する。
【００６６】
このような操作及びアラインメントの都合の良いコンピュータプログラムは、ＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒＴＭ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ ＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌソフトウェアＴＭによる。）であり、あるいは、多重アラインメントに対してインターネット：「ＣｌｕｓｔａｌＷ」及び翻訳に対して「Ｔｒａｎｓｌａｔｅ」を介して（両者とも、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇでアクセス可能）又はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖの「Ｂｌａｓｔ」プログラムを介して利用可能である。好ましくは、初期設定スコアリングパラメータを使用する。
【００６７】
本発明による鳥類アストロウイルスの多くの分離株に対して、プライマー配列番号２８及び２９を用いてｃＤＮＡ配列決定を行った。結果として得られるトリミング処理済みヌクレオチド配列のうち選択されたものを、表１で表されるように、配列番号４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６におけるものとして本明細書中で与える。
【００６８】
参照として１６１３１９と付番されたニワトリからのある分離株（発明者らはこれを「分離株１９と呼ぶ。」の配列を用いて、これらの配列を互いに整列（アライン）させた。また、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能なその他のアストロウイルスからのＯＲＦ１ａの対応部分のいくつかのＤＮＡ配列を整列（アライン）させた：例えばＡＮＶ１（ＡＢ０３３９９８、配列番号１）、シチメンチョウアストロウイルス１（ＴＡｓｔＶ１）（Ｙ１５９３６）、シチメンチョウアストロウイルス２（ＡＦ２０６６６３）、ヒツジアストロウイルス（Ｙ１５９３７）、ミンクアストロウイルス（ＡＹ１７９５０９）及びヒトアストロウイルス（Ｚ２５７７１）；ハイフンの間は、個々のＧｅｎＢａｎｋ受入番号である。
【００６９】
これらのその他のアストロウイルスＯＲＦ１ａ配列のうち、ＡＮＶ１のみが、特に配列番号１からのｎｔ２２１３−２６０７の部分で、有意であった配列同一性を有した（これは、５０％を優に越えるヌクレオチド配列同一性％を意味する。）。残りのその他のアストロウイルスのうち、ＴＡｓｔＶ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｙ１５９３６）のみが、ヌクレオチド番号２４５０−２８５６の一部において検出可能な配列同一性があったが、これはあまり顕著ではなかった。これを表２で表す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
これらのヌクレオチド配列アラインメントの結果の樹状図を図３で示す。
【００７２】
従って、驚くべきことに、本発明による新規鳥類アストロウイルス群は、全てのその他のアストロウイルス、鳥類又は哺乳類とは距離を置いていることが分かった（配列番号４に対応するＯＲＦ１ａ ＤＮＡ配列の領域と比較した場合、それらは８８％以上のヌクレオチド配列同一性を有する。）。
【００７３】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一性を有する領域を含むことを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスに関する。
【００７４】
より好ましくは、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、配列番号４と少なくとも８９％のヌクレオチド配列同一性、さらにより好ましくは９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％（好ましい順に）の同一性を有する領域を含むことを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスに関する。
【００７５】
配列番号４の次に、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６で記載される部分的ＯＲＦ１ａヌクレオチド配列の何れか１つは、さらなる好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスの特徴を明らかにするために役立ち得る。
【００７６】
表２で与えられるようなＯＲＦ１ａからのヌクレオチド配列の多重アラインメントと同様に、表２のトリミング済み核酸配列、配列番号４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６からの推定アミノ酸配列のアラインメントを行うことができる。コンピュータにより翻訳された得られるアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号５、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７として与えられる。参照配列は、配列番号５、分離株１９のＯＲＦ１ａの一部の推定アミノ酸配列である。配列番号５の全長にわたり整列（アライン）させて、Ａｌｉｇｎ＋プログラムを用いてアラインメントをまた行った。結果を表３で与える。
【００７７】
【表３】
【００７８】
詳細なアミノ酸アラインメントを図２で表す。
【００７９】
このアミノ酸配列分析の結果は、表２の結果と同等の結果を示し、本発明による鳥類アストロウイルスの分離株からのアミノ酸配列は、その他の鳥類アストロウイルスと比較した場合より、それら自身の中で関連性が高い。配列番号５に対する本発明による鳥類アストロウイルスの様々な分離株のアミノ酸配列の同一性％は９３から９９％の間であり、一方、ＡＮＶ１に対する同一性は８８％とより低い。
【００８０】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有する領域を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスに関する。
【００８１】
より好ましくは、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、配列番号５と少なくとも９４％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性（望ましい順）を有する領域を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスに関する。
【００８２】
配列番号５の次に、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７で記載される部分的ＯＲＦ１ａ推定翻訳ヌクレオチド配列の何れか１つは、さらなる好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスの特徴を明らかにするために役立ち得る。
【００８３】
ヌクレオチド配列決定及びアラインメントに加えて、本発明による鳥類アストロウイルスの陽性遺伝子マーカーは、例えば腸又は運動器官疾患に罹患している鳥類からの試料において、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａには存在しない、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａ領域における１２個のヌクレオチドの存在を検出するためのＰＣＲ試験を用いることにより、同定することができる。
【００８４】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスは、配列番号３０及び３１で表されるプライマーのセットを用いたＰＣＲアッセイにおいて、その鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａから、約２６０ヌクレオチドのＰＣＲ産物が生じ得ることを特徴とする。
【００８５】
使用すべきＰＣＲプライマーは、
配列番号３０：５’−ＧＴＹ ＣＴＹ ＡＣＣ ＧＡＲ ＧＡＲ ＧＡＲ ＴＡＹ Ｃ−３’
配列番号３１：５’−ＡＡＤ ＧＴＴ ＡＴＹ ＣＴＣ ＣＴＡ ＲＧＢ ＴＫＨ Ｃ−３’である。
【００８６】
発明者らは、これらのプライマーをそれぞれプライマー２９及び３０と呼ぶ。これらのプライマーは、ＡＮＶ１（配列番号１）ヌクレオチド番号２２５２以降に対応するヌクレオチドとハイブリッド形成し、ヌクレオチド番号２４９９から逆方向に進むものとハイブリッド形成する。
【００８７】
生成されたＰＣＲ産物は、約２６０ヌクレオチドのバンドとしてゲル上で見ることができる（これは、プライマーそれら自身の長さを含んでいる。）。このバンドは、出発物質が本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａ領域を含むＤＮＡを含有する場合のみ、生成されるが、これは、ただ、これらが、ＡＮＶ１ ＯＲＦ１ａには存在しない１２個のヌクレオチドを含むからである。１２個のヌクレオチド領域の位置に関する、プライマー配列番号３０及び３１の特異的結合の図解を図４で与える。
【００８８】
このようなＰＣＲアッセイにおいて、特異性及び感度は、使用される特異的ＰＣＲプライマーにより、特にプライマーの配列及び長さにより、決定される。次に、当業者にとって周知であるように、温度及び反応段階の時間などの反応及びサイクリング条件を適応させることによって、選択性及び感度の最適化を達成することができる。
【００８９】
これら及びその他の分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ、ＮＹ、２００３、ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）；Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：「ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０８７９６９６５４０）；及び「ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」：Ｊ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ及びＤ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）のような標準的教科書で詳述されている。
【００９０】
都合良く、ｃＤＮＡを生成させるために必要なＲＴ反応にプライマー配列番号３０及び３１を用いたＰＣＲ反応を組み合わせ、これに直接従い；実施例に記載のように、組み合わせアッセイをＲＴ−ＰＣＲアッセイにする。
【００９１】
記載のようなＲＴ−ＰＣＲアッセイが発明者らにより様々な試料に適用され；本発明による新規鳥類アストロウイルスの分離株の試料を用いて、陽性の結果が得られ；「陽性」ＰＣＲの結果は、適切な陽性及び陰性対照試料に関連して、電気泳動後におよそ２６０塩基対の反応産物が見られるというものである。しかし、関連する鳥類アストロウイルスＡＮＶ１及びニワトリアストロウイルス２（ＣＡｓｔＶ２）から調製されるＲＴ−ＰＣＲ試料は、一貫して配列番号３０及び３１のプライマーを用いたＰＣＲにおいて陰性であることが分かった。
【００９２】
このようなＰＣＲ試験結果の例は図５で表すが、これは、臭化エチジウム染色、ＵＶ光照射、アガロースゲル（このゲル上で、プライマー配列番号３０及び３１を用いたＰＣＲのＰＣＲ産物を流した。）の写真を示す。分離株１９の試料のみが陽性反応を示し、陰性対照と同じように、ＡＮＶ１又はＣＡｓｔＶ２を含有する試料は陰性であった。
【００９３】
驚くべきことに、本発明による鳥類アストロウイルスでの有胚鳥類卵の感染及び温置時に非常に顕著で著しい病理学的効果が観察され：疾患に冒された胚は、肢及び翼端が鮮赤色になった。これは以前に観察又は記載されたことはなかった。さらに、感染した胚は、その他のしかしそれほど特徴的ではない特性：全身的に薄赤色になり、腹部の浮腫及び肝臓の著しい腫脹を示し、暗赤／紫色の変色が見られた。
【００９４】
この特異的病理は、有胚ＳＰＦニワトリ卵の感染から約２−７日後に観察され、接種されたウイルス力価に依存して、殆ど必ず、胚の死亡を招いた。
【００９５】
比較のために、同様の試験条件を用いて、有胚卵へのＡＮＶ１の接種を同時に行った。ＡＮＶ１もまた、肝臓の腫脹を誘発したが、この場合、肝臓はさらに暗い色で、胚の全体的な色は暗赤色となった。しかし、ＡＮＶ１は、本発明による鳥類アストロウイルスの分離株に対して見られた肢及び翼端の特異的な鮮赤色を誘発しなかった。
【００９６】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスは、約５−７日有胚ニワトリＳＰＦ卵に接種し、続いて２−７日間又は必要に応じてそれより長い温置を行った際に、ニワトリ胚の翼端の赤色変化を誘発することができることを特徴とする。
【００９７】
記載のように、有胚ＳＰＦニワトリ卵及びそれらの温置のための装置が市販されている。通常、有胚ニワトリ卵の温置は、加湿雰囲気の孵化器中、約３５−３９℃で行われる。
【００９８】
接種は、例えば、ＣＡＭ、卵黄嚢又は尿膜経路など、何らかの都合の良い経路によるものであり得る。
【００９９】
当業者が認めるように、例えば接種されたウイルス量が非常に少ない（ウイルスの「取り込み」ができない）かもしくは非常に多い（変色が起こり得る前に死亡）か、又は胚の質がウイルス複製を可能とするのに十分ではないという偶発的な例において、肢及び翼端の特異的な鮮赤色の変色を見ることができない場合があり得る。一般に、この特異的な鮮赤色の変色は、約１０から約１０＾６ＥＩＤ５０／卵（ＥＩＤ５０＝卵感染性用量５０％）の間の接種時に観察され得る。
【０１００】
参照試料として使用し、寄託するために、分離株１９と命名された本発明による鳥類アストロウイルスのある特定の分離株をさらに精製し増幅させた。ニワトリ胚肝臓（ＣＥＬ）細胞での限界希釈により、この分離株を精製した。各時点で、ＣＥＬ細胞においてｃｐｅを依然として誘発する最大希釈物を継代した。次に、有胚ＳＰＦニワトリ卵の尿膜腔における３ラウンドのウイルス増幅によりこの精製ウイルスを増幅した。尿膜腔液を回収し、凍結保存した。有胚ニワトリＳＰＦ卵においてこの精製ウイルスの滴定を行い、６．１Ｌｏｇ１０ ＥＩＤ５０／ｍＬの力価を有することが分かった。この材料を標準的安定化緩衝液中で凍結乾燥させ、−２０℃で保存した。無菌であることを確認した。次に、このウイルス材料の試料をＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅの「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ」（ＣＮＣＭ）に、ＣＮＣＭ Ｉ−３８９５の寄託番号で２００８年１月２３日に寄託した。
【０１０１】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスは、番号ＣＮＣＭ Ｉ−３８９５でＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託したようなウイルスである。
【０１０２】
精製し、増幅し、寄託した試料は、「分離株１９」という名称の分離株であったが、しかし、表１に記載の本発明による鳥類アストロウイルスの分離株の何れか１つを本発明による鳥類アストロウイルスの新規群に対する参照試料として使用することができる。
【０１０３】
インビトロ培養に対して及び本発明による鳥類アストロウイルスの試験に対して、いくつかの培養系を使用することができ、例えば（鳥類）細胞株（ＣＥＬ又はニワトリ胚腎臓（ＣＥＫ）細胞のような初代細胞）が有利に使用され得る。有胚ニワトリＳＰＦ卵からのＣＥＬ又はＣＥＫ細胞培養の調製は当業者にとって周知である。
【０１０４】
特に、ＣＥＫ細胞は、ウイルス増殖を監視し、ウイルス量及び生存能を測定するために非常に適している。本発明による鳥類アストロウイルスがこれらの細胞で生じさせる細胞変性効果（ｃｐｅ）が不規則であるとしても、感染細胞は、単層から丸まり、細胞溶解へと進む球形の細胞として明確に見ることができる。
【０１０５】
従って、ウイルス試料の連続希釈及びｃｐｅを依然として引き起こす最大ウイルス希釈物のスコア化を用いて、ウイルス滴定アッセイを考案することができる。次に、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（Ｄ．Ｆｉｎｎｅｙ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ、Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ ＆ Ｃｏ．、Ｌｏｎｄｅｎ、ＩＳＢＮ０１９５２０５６７７に記載）により計算した場合の組織培養感染用量５０％（ＴＣＩ５０）／ｍＬとしてウイルス力価を表すことができる。このような技術は全て当業者にとって周知である。
【０１０６】
このようにして、様々な試験及び目的に対して、本ウイルスを組織培養フラスコ又はマイクロタイタープレートで培養することができる。一般に、ウイルス試験又は滴定での使用前に、細胞上で数回の継代を行うことにより、野外から分離されたウイルスをこのような細胞上でのインビトロ培養に最初に適応させることは有利である。
【０１０７】
あるいは、有胚卵、好ましくはニワトリＳＰＦ卵において、試験及び滴定を行うことができる。６日有胚ＳＰＦニワトリ卵の卵黄嚢への希釈率漸増ウイルス試料の接種により、例えばウイルス滴定を行うことができる。感染したか又は死亡した胚の数をスコア化した後、例えばＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（前出）を用いて、試験試料の得られた力価をＥＩＤ５０／ｍＬで表すことができる。
【０１０８】
寄託ウイルスに対して、多くの実験的試験ニワトリにおいて、実験室条件下で、孵化したニワトリ及びシチメンチョウに対して病変を引き起こすその能力を確認した。複数経路：筋肉内、経口及び眼を介して接種を行った。接種されたニワトリののうち数羽が、疾患の重篤な徴候を発現し、一方で、擬似感染ニワトリは症状がなかった。観察された症状は、死亡、全身的機能低下及び軽度から重度の下痢であった。組織病理学において、腎炎及び腸炎が観察された。肢又は関節の疾患は観察されなかったが、これらの実験に対して使用されたニワトリは幼若すぎるか（３−６週）及び／又はこのような問題が顕在化するには十分に重くはなかったので（産卵ＳＰＦニワトリ）、これらの疾患はまた予想され得なかった。
【０１０９】
さらなる特性評価：ＯＲＦ１ｂ及びＯＲＦ２のために、寄託ウイルスのうち、ゲノムのさらなる領域のヌクレオチド配列を本明細書中で与える。個々のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を配列番号５−８として本明細書中で与える（表１参照）。
【０１１０】
これらのさらなるヌクレオチド配列を決定するために使用された様々なプライマーを配列番号３２−３４として本明細書中で与え、表４で記載し；便宜上これらの表には、本明細書中に記載のその他のＰＣＲ−及び配列決定プライマーも含まれる。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
参照として寄託ウイルス試料を用いた、本発明による鳥類アストロウイルスのさらなる特性評価を行うためのさらなる方法は、血清型決定により、好ましくはＶＮ−又はＩＦＴ−アッセイを用いることにより、その免疫学的特性を決定することによるものである。
【０１１３】
全ての試験において、様々なその他の鳥類ウイルス：レオウイルス、家禽アデノウイルス（１、２、４、５及び８型）、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、鳥類エンテロウイルス（分離株１８２１／９及びＦＰ３）、産卵低下症候群及び鳥類インフルエンザウイルスに特異的な抗体により中和され得ず、この抗体と特異的に結合しなかったので、本新規鳥類アストロウイルスは、その他の鳥類ウイルスとは免疫学的に別個のものであることが証明された。これはまた、鳥類アストロウイルス、ＡＮＶ１又はＣＡｓｔＶ２に特異的な抗体に対する場合も当てはまり、一方で、これらの血清は、それらのドナーウイルス：ＡＮＶ１及びＣＡｓｔＶ２をそれぞれ、最大１：６４０又は１：１０２４０の希釈率で、効果的に中和した。
【０１１４】
しかし、寄託分離株１９ウイルスの試料は、分離株１９ウイルスを実験的に感染させたＳＰＦニワトリにおいて分離株１９に対して作製されたニワトリ抗血清により効果的及び選択的に中和された。免疫促進接種を行った後、特異的抗血清を得ることができた。このアッセイでのウイルス中和に対して使用された読み出し情報は、中和による胚の病状の阻止であった。
【０１１５】
特異的抗体のみが本発明による鳥類アストロウイルスを認識し、中和したという免疫学的実験の結果から、これらのウイルスが新規の特有なウイルス血清型に属することが明らかとなる。
【０１１６】
これは、例えばさらに好ましい実施形態において実施され得、この場合、本発明による鳥類アストロウイルスは、ウイルス中和アッセイにおいて、Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に、番号ＣＮＣＭ Ｉ−３８９５のもと寄託されたようなアストロウイルスの試料に対する抗体によって中和され得ることを特徴とする。
【０１１７】
本発明による寄託ウイルスを用いた抗体の作製に対する代替的アプローチもまた可能である。例えば、本発明による鳥類アストロウイルスである（それ由来である）ことについて調べようとするウイルス−試料は、それ自身、抗体を誘導するために使用され得、次に、本発明による鳥類アストロウイルスへの抗体の結合又はさらに中和能について抗体を同様に試験し得る。都合良く、このような抗体は、本発明による寄託ウイルスの試料において試験することができる。
【０１１８】
この目的に対して、試験ウイルス又はその断片もしくは調製物を動物に接種することができる。このような抗体の作製のために使用される動物は、原理的に、あらゆる動物であり得るが、しかし好ましくはマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ又はニワトリが使用される。例えば都合良く本発明による寄託ウイルスの試料をＣＮＣＭに注文することによって、本発明による鳥類アストロウイルスに対する結合又は中和について、このようにして作製される抗体を試験することができる。これを例えば卵、ＣＥＫ又はＣＥＬ細胞又はその他の基質で培養し、最終的に試験ウイルス試料を用いて作製された抗体と温置し得る。例えばＩＦＴ又はＶＮアッセイによって、抗体結合の検出を行うことができる。
【０１１９】
従って、これは、本発明による鳥類アストロウイルスであるか又はそれ由来であるような、生もしくは不活性化ウイルス又はそれらの断片もしくは調製物の同定及び特性評価のための方法を構成する。
【０１２０】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明は、ＶＮアッセイにおいて本発明による寄託アストロウイルスの試料を中和することができる抗体を誘導することができることを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスを提供する。
【０１２１】
ＶＮアッセイを設定するためのプロトコールは当技術分野で周知であり、当業者の通常の能力の範囲内である。ＶＮアッセイに対する選択及び詳細は上記で記載されている。
【０１２２】
本発明による鳥類アストロウイルスに特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイの結果から明らかなように、本発明はまた、本発明による鳥類アストロウイルスに結合することができ、中和することができる抗体も提供する。
【０１２３】
従って、本発明のその他の態様は、ウイルス中和アッセイにおいて本発明による鳥類アストロウイルスを中和することができる抗体又はその断片である。
【０１２４】
本発明によるこのような抗体は、当業者にとって全て周知であり利用可能な様々な方法において取得及び産生され得る。例えばこの抗体は、上述のような（反復）接種によって実験動物において産生され得る。
【０１２５】
あるいは、ハイブリドーマ技術におけるように、不死化Ｂ−リンパ球細胞により抗体が産生され得る。古典的ハイブリドーマ技術に対して現在、技術が向上したことにより、例えば融合前に所望の脾臓細胞の量を向上させることによって、正の選択（パニング）とそれに続くサイトカイン混合物との培養での増殖によって、この技術はより効率的及び高生産性になった。また、古典的なポリエチレングリコール融合から電気融合に変更することによって、融合技術も向上した。
【０１２６】
さらなる代替的アプローチにおいて、分子生物学的技術の使用及び組み換え発現系での発現を通じて、抗体を得ることができる。分子生物学的技術により、治療しようとする標的種からの抗体の特徴によりよく合致させるためのこのような抗体の適応又は異なる特異性を有する２つの結合領域を有する抗体の設計が可能となる。発現系の開発によって、植物での発現など、大量発現系発現系の設定が可能となる。
【０１２７】
組み換え発現系もまた当技術分野で周知であり、例えば、細菌（例えば大腸菌（エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）など）、酵母（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、昆虫（スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）、トリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ））、哺乳動物（例えばチャイニーズハムスター卵巣）又は植物（タバコ、ジャガイモなど）細胞を使用する。発現させようとする異種配列を有する発現コンストラクトでこれらの細胞を形質転換し得る。また、発現させようとする核酸を含む組み換え微生物を用いた複合系が知られており、ここで、微生物は、所望のタンパク質を所望の規模でインビトロで産生させるために細胞上で培養し得る。一例として、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系が挙げられる。最後に、いわゆる細胞不含発現系が、適切な組み換えＤＮＡ分子の細胞不含発現のために市販されている。
【０１２８】
「抗体又はその断片」という用語は、両方の完全な免疫グロブリン分子又はその一部が本発明による抗体の範囲内であるとみなされることを示すものとする。本発明による抗体の断片は、本発明による鳥類アストロウイルスのエピトープに依然として結合し得るタンパク質分子である。例としては、ＦＡＢ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ又はＦｄ断片（全て当技術分野で周知である。）が挙げられる。
【０１２９】
このような断片は、例えば化学的又は酵素消化により、無傷の抗体から得られ得る。あるいは、このような断片は、例えば、組み換え発現系、例えばファージディスプレイ系から得られ得る。
【０１３０】
当業者にとって周知であるように、ウイルスへの抗体又はその断片の結合は、ウイルス粒子におけるエピトープの認識を包含する。殆どの場合、これらのエピトープは、ウイルス粒子上で提示される分子の直線状又は三次元配置により形成される。結果として、これらの調製物又は断片が依然として正しい形態の正しいエピトープを含有し、提示する限り、ウイルス又はその断片の調製物は、本発明による抗体又はその断片により結合され得る。本発明による鳥類アストロウイルスの場合、免疫系に最も顕著に提示されるウイルスタンパク質は、ＯＲＦ２からコードされるキャプシドタンパク質である。
【０１３１】
当業者にとってまた当然のことながら、本発明による抗体が動物の接種を介して作製される場合、得られる動物血清はポリクローナル抗血清であり、これは、抗血清が、多岐にわたるエピトープに結合し得る抗体の混合物を含有することを意味する。実際には、これは多重結合をもたらし、よって、これらが、無傷の生ウイルス粒子において通常利用可能である全てのエピトープを保持し得ないか又は正しく提示し得ないとしても、ウイルスタンパク質の調製物又は断片の効率的な結合が可能になる。
【０１３２】
あるいは、本発明による抗体は、例えばハイブリドーマ技術により作製されるように、モノクローナル抗体であり得るか又は本発明による抗体は、Ｆａｂ断片などの抗体断片であり得る。この場合、本抗体又は断片は、それが通常は単一エピトープに特異的に結合するのみであるので、様々なエピトープを認識する能力が非常に低下している。その結果として、この特定のエピトープが存在しないか又はウイルス断片又は調製物上で提示されない場合、これは、このようなモノクローナル抗体又は抗体断片が全く結合し得ない。
【０１３３】
本発明による鳥類アストロウイルスの特性評価のために、診断のために、治療のために及び／又は品質保証目的のために、様々な方法で本発明による抗体を使用することができる。
【０１３４】
本発明は、工業規模での本発明による鳥類アストロウイルスの作製を提供する。これは、インビボ又はインビトロ系で、宿主細胞においてこのウイルスを培養することにより達成され得る。インビトロ系は、初代又は不死化細胞株を含む。初代細胞の例は、ＣＥＫ又はＣＥＬ細胞である。不死化細胞株の例はＬＭＨ細胞株である（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．４７、ｐ．４４６０−４４６４）。インビボ系の例は、有胚鳥類卵で又は接種済み鳥類での培養である。特に、細胞又は卵での培養は都合良く規模を拡大することができ；例えば細胞培養をフラスコ、ローラーボトル又はさらには発酵槽などの様々な大きさの容器で維持することができる。あらゆる規模の細胞培養技術のための技術及び装置が周知であり、市販業者から容易に入手可能である。
【０１３５】
従って、本発明は、さらなる態様において、本発明による鳥類アストロウイルスを感染させた宿主細胞を提供する。
【０１３６】
また、本発明は、適切な系における本発明による鳥類アストロウイルスの増殖及びウイルス材料を回収することを含む、本発明による鳥類アストロウイルスを産生させる方法を提供する。
【０１３７】
本発明による鳥類アストロウイルスの本明細書中に記載の特性評価は、無傷の複製可能な形態のこのような鳥類アストロウイルスを単に指すだけではない。当業者が認識するように、本発明は、多くの様々な形態のこのウイルスの調製物を提供する。これらには、例えば、本発明による鳥類アストロウイルスが不活性化されている調製物又はこのようなウイルスが、例えば抽出、溶解、消化、ホモジェナイズ処理又は超音波処理によって、１以上の方法で（生物）化学的又は物理的に断片化されている調製物が含まれる。
【０１３８】
ウイルスを不活性化するための方法は周知であり、例えば、ホルマリン、β−エタノールイミン又はβ−プロピオラクトン；また加熱及びＵＶ光、Ｘ線又は放射活性放射線での照射による不活性化など、化学的又は物理的不活性化を含む。
【０１３９】
断片化のための方法もまた、例えば抽出又はＴｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘ−１００など界面活性剤での溶解；トリプシンでの消化；凍結融解又は加圧型細胞破壊装置によるホモジェナイズ処理；又は超音波による超音波処理など、数多く知られている。
【０１４０】
このような調製物の出発材料は、精製された（生又は不活性化）本発明による鳥類アストロウイルスと、それだけでなく本発明による宿主細胞又は、本発明による宿主細胞もしくは鳥類アストロウイルスを含む細胞培養物もしくはその一部であり得る。例えばこのような細胞培養物の一部は、遠心した細胞培養物の上清又はペレットであり得る。明らかに、これらの細胞培養物又はその一部は、それら自身、記載のような抽出物、溶解物、消化物、ホモジェネート又は超音波処理物などの調製物へ変換され得る。
【０１４１】
本発明による鳥類アストロウイルスのこのような調製物は、本発明による鳥類アストロウイルスの１以上の抗原及びエピトープを含有する。
【０１４２】
従って、さらなる態様において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスから取得可能な抗原性調製物に関する。
【０１４３】
本発明による抗原性調製物は、本発明による抗体又はその一部により結合され得るか又はそれ自身、結合もしくは中和抗体又はその一部を誘発するために使用され得る。これは、下記に記載のように、ワクチン及び診断において有利に適用され得る。
【０１４４】
本発明による抗原性調製物は、例えば、本発明による鳥類アストロウイルスからのタンパク質又はこのようなタンパク質の一部である。これらのタンパク質又はその一部は、このようなウイルスからの単離により得ることができる。しかし、これらのタンパク質又はその一部は、都合良く、本発明による鳥類アストロウイルスからの核酸を用いて、組み換えＤＮＡ発現技術によっても作製され得る。例えば、配列番号４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６の何れか１つで記載されるようなＯＲＦ１ａ領域の一部の核酸配列が使用され得；記載のように、これらのｃＤＮＡ配列は、配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一をそれらが有することに関連する。
【０１４５】
従って、本発明は、さらなる態様において、配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一性を有する領域を含むＤＮＡ分子を提供する。
【０１４６】
また、ＯＲＦ１ｂ又はＯＲＦ２の核酸は配列番号６又は８に記載のように使用され得る。
【０１４７】
このような核酸配列及びｃＤＮＡ断片は、当技術分野で周知のＤＮＡ技術を用いて、例えばさらなる操作のための組み換えＤＮＡ分子へのサブクローニングにより、クローニングされ、発現され得る。組み換えＤＮＡ分子は、細菌プラスミドなどのベクターであり得る。好ましくは、本発明による鳥類アストロウイルスからの核酸は、適切な宿主細胞又は発現系でのその発現を可能にするプロモーターなどの発現調節配列に操作可能に連結される。あるいは、本核酸、ｃＤＮＡ又は組み換えＤＮＡ分子は、細菌又はウイルスなどの生きている組み換え担体微生物に導入され得る。
【０１４８】
同様に、配列番号５、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７及びそれらの関連物に記載の推定アミノ酸配列に基づき、本発明は、さらなる態様において、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有する領域を含むタンパク質を提供する。
【０１４９】
これらの実施形態は、下記に記載のようにワクチン及び診断の応用において非常に実用的で有利な有益性を有する。
【０１５０】
ウイルスなどの生又は不活性化微生物病原体から又はこのような微生物の断片から、ワクチンを調製することができる。このような微生物は、一般に、細胞、器官又は組織、有胚卵上で又は宿主動物において温置することによって、より小さいか又はより大きい体積で工業的に産生される。微生物を含む縣濁液を回収した後、ワクチンへとこの縣濁液を処方し、最終製品を包装する。品質、量及び無菌性に対する大規模な試験の後、このようなワクチン製品を販売開始する。
【０１５１】
ワクチン学における一般的な技術及び検討事項は当技術分野で周知であり、例えば政府規制において及び「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編、１９９７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ＩＳＢＮ：０４４４８１９６８１）及び「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ、ＵＳＡ、ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）などのハンドブックにおいて記載されている。
【０１５２】
ワクチンは、当技術分野で、医薬的に許容可能な担体中に免疫原性化合物を含む医薬組成物を表すことが一般に知られている。免疫原性化合物は、標的の免疫系の活性化を誘導することができる、生又は不活性化微生物又はそれらのサブユニットである。
【０１５３】
驚くべきことに、本発明による鳥類アストロウイルス及び抗原性調製物、宿主細胞、抗体、核酸、タンパク質ならびにそれらの調製、培養、同定及び定量のための方法が、ワクチンにおいて又は診断目的に対して適用され得ることが分かった。このようなワクチンは、鳥類アストロウイルスによる感染から標的動物を保護するために又はこのウイルスの複製もしくはそれが引き起こす疾患の症状を軽減するために役立つ。このような診断アッセイにより、例えば動物の現地試料又はウイルス調製物におけるウイルス又はその抗原の検出が可能になる。
【０１５４】
ワクチン及び診断薬を組み合わせることで、本発明による鳥類アストロウイルスによる感染及び／又は疾患に対する同定及び防御が可能になる。
【０１５５】
本発明による鳥類アストロウイルスをニワトリに接種した、記載の動物実験により、ワクチン能が明らかになった。これにより、高特異性抗体が産生されるようになる。さらに、これらの抗体は、本発明による鳥類アストロウイルスを特異的に中和することができることが明らかになった。当技術分野で周知であるように、中和抗体の誘導は、有効で免疫防御的なワクチンの実現可能性において重要な段階である。
【０１５６】
試験動物の反復接種は、産生される抗体レベルに対する免疫促進を与えただけではなく、攻撃感染ともなり、この攻撃感染は、試験において多数の鳥により耐性が示され、克服され得た。
【０１５７】
従って、本発明による鳥類アストロウイルス又はその一部は、適切な医薬組成物中で処方され得、ワクチンとして鳥類に対して適用され得る。
【０１５８】
例えば、ワクチン接種反応の許容可能なレベルで十分な防御効果をワクチンが与えるように、ワクチンの効率及び安全性を微調整することによりこのワクチンをさらに最適化することは、当業者にとって実現可能である。これは、ワクチン用量を適応させることによって又は別の形態もしくは処方でワクチンを使用することによって又はワクチンのその他の構成物質（例えば安定化剤又はアジュバント）を適応させることによって又は異なる経路を介した適用によって、行うことができる。
【０１５９】
本発明に対するワクチンの周知の変異体は、例えば生きているか又は不活性化形態の新規鳥類アストロウイルスを使用し得；本発明による抗原性調製物及び／又はタンパク質を使用する場合、サブユニットワクチンであり得；本発明による抗体又はその断片を使用する場合、受動ワクチン（ｐａｓｓｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ）の形態であり得るか；又は本発明によるＤＮＡ分子を使用する場合、ＤＮＡワクチンの形態であり得る。
【０１６０】
従って、本発明の別の態様は、鳥類アストロウイルス、抗体又はその断片、抗原性調製物、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるものである。）と、医薬的に許容可能な担体と、を含むワクチンを提供する。
【０１６１】
同様に、本発明は、家禽用ワクチンでの使用のための化合物又は組成物に対するさらなる態様に関し、この化合物又は組成物は、鳥類アストロウイルス、抗体もしくはその断片、抗原性調製物、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるものである。）である。
【０１６２】
さらなる態様において、本発明は、家禽用ワクチンの製造のための化合物又は組成物の使用に関し、この化合物又は組成物は、鳥類アストロウイルス、抗体もしくはその断片、抗原性調製物、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるものである。）である。
【０１６３】
さらなる態様において、本発明は、家禽用ワクチンの製造のための方法に関し、この場合、化合物又は組成物は、適切な医薬担体と混合され、この化合物又は組成物は、鳥類アストロウイルス、抗体もしくはその断片、抗原性調製物、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるものである。）である。
【０１６４】
「医薬的に許容可能な担体」は、例えば、目的に適切な、滅菌水、生理食塩水又は緩衝液であり得る。より複雑な形態において、担体は、それ自身、アジュバント、さらなる抗原、サイトカインなどのその他の化合物を含み得る。
【０１６５】
本発明によるワクチンは、予防的及び治療的処置両方のために使用され得る。
【０１６６】
「ワクチン」という用語は、本発明による鳥類アストロウイルスの免疫学的に有効な量の存在及び医薬的に許容可能な担体の存在を意味する。
【０１６７】
本発明によるワクチンに対する「免疫学的に有効な量」を構成するものは、所望の効果及び鳥類アストロウイルスの特徴及び標的生物に依存する。有効量の決定は、例えばワクチン接種後又は攻撃感染後に免疫学的反応を監視することにより、例えば、非ワクチン接種動物で見られる反応と比較して、標的の疾患の臨床兆候、血清型パラメーターを監視することにより、又は病原体を再分離することにより、十分に通常の実施者の技術の範囲内である。
【０１６８】
ワクチン中で、非常に大量の、本発明による、鳥類アストロウイルス、抗原性調製物、抗体もしくはその断片、ＤＮＡ分子又はタンパク質を使用することは、免疫学的に非常に有効ではあるが、営利的な理由に対してあまり魅力的ではない。本発明によるワクチン中に含まれる本発明によるこれらの化合物又は組成物の何れかの好ましい量は、ワクチンの最終体積の０．１から９０％の間である。より好ましくは、この量は、１から５０％、１から２５％及び１から１０％の間である（好ましい順）。
【０１６９】
不活性化又はサブユニットワクチンの場合、本発明による化合物又は組成物は、ＥＬＩＳＡ単位で表され得る。有効であるＥＬＩＳＡ単位の量は、ある一定の効率を与える標準化試料のＥＬＩＳＡ単位に関連して決定される必要がある。
【０１７０】
本発明による生ワクチンの場合、鳥類アストロウイルスワクチン用量を定量する都合の良い方法であるものに依存して、ｐｆｕ（プラーク形成単位）、ｃｆｕ（コロニー形成単位）、ＴＣＩＤ５０、ＥＩＤ５０又はＥＬＤ５０（胚致死量５０％）の量を使用することができる。例えば、１から１０＾６ＥＩＤ５０／ワクチン投与量の間の範囲の鳥類アストロウイルス生ワクチン用量を有利に使用することができ；好ましくは１０から１０＾５ ＥＩＤ５０／投与量の間、より好ましくは１０＾２から１０＾４ ＥＩＤ５０／投与量の間の範囲である。
【０１７１】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスが生きている形態である、本発明によるワクチンに関する。
【０１７２】
生ワクチンは、一般に、微生物それ自身が複製するので、僅かな量の接種材料しか必要としないという有利な特性がある。また、これは、一般に、正確な免疫学的記憶のある確固たる有効な免疫反応を誘導する。
【０１７３】
当技術分野で公知のように、生ワクチンは、都合良く、弱毒化生ワクチンとして適用され得、これは、元のウイルス分離株と比較して、ワクチンウイルスの毒性又は病原性が減弱させられていることを意味する。ウイルス弱毒化のための方法は当技術分野で公知であり、例えば動物を通じるか又は細胞培養にわたる連続的継代；化学的弱毒化；又は分子生物学的技術による弱毒化が含まれる。
【０１７４】
代替的な好ましい実施形態において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスが不活性化されている本発明によるワクチンに関する。
【０１７５】
ウイルス不活性化のための方法及び材料は、上記で述べられている。このような不活性化ワクチンは一般に、何らかの潜在的に病原性のある、複製する生きている鳥類アストロウイルスに宿主を曝露しないので、生ワクチンよりも安全であるという長所を有する。
【０１７６】
さらに好ましい実施形態において、本発明によるワクチンはアジュバントをさらに含む。
【０１７７】
アジュバントは、非特異的な形式で宿主の免疫反応を促進する免疫刺激性物質である。多くの様々なアジュバントが当技術分野で公知である。よく使用されるアジュバントの例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖類、いくつかのグルカン又はグリカン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（Ｒ）、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）である。これらは、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョン、ｏ／ｗエマルジョン及びｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンなどの様々なエマルジョンと組み合わせることができる。油性エマルジョンでの使用に適切な油性アジュバントは、例えば鉱物油又は代謝可能な油である。鉱物油は、例えばＢａｙｏｌ（Ｒ）、Ｍａｒｃｏｌ（Ｒ）及びＤｒａｋｅｏｌ（Ｒ）であり；代謝可能な油は、例えばピーナツ油、大豆油などの植物油又は魚油スクアレンなどの動物性の油である。あるいは、ＥＰ３８２，２７１に記載のようなビタミンＥ（トコフェロール）可溶化物が有利に使用され得る。
【０１７８】
非常に適切なｏ／ｗエマルジョンは、例えば５−５０％ｗ／ｗ水相及び９５−５０％ｗ／ｗ油性アジュバントから始まって得られ、より好ましくは２０−５０％ｗ／ｗ水相及び８０−５０％ｗ／ｗ油性アジュバントが使用される。
【０１７９】
添加されるアジュバント量は、アジュバントそれ自身の性質及び製造者により提供されるこのような量に関する情報に依存する。
【０１８０】
不活性化ワクチンと組み合わせてアジュバントを使用することが一般的な方法である一方で、いくつかの生ワクチンは、アジュバントを含むことからの利益も得られることが示されている。従って、この実施形態もまた本発明の範囲内である。
【０１８１】
さらに好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、安定化剤をさらに含む。
【０１８２】
例えば、分解から本発明によるワクチンを保護するために、品質保持期限を延長するために又は凍結乾燥効率を向上させるために、本発明によるワクチンに安定化剤を添加し得る。有用な安定化剤は、とりわけＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら、１９５０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．５９、ｐ．５０９）、脱脂粉乳、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース）、タンパク質（アルブミン又はカゼインなど）又はその分解産物、緩衝液（アルカリ金属リン酸塩など）及びポリアミン（スペルミンなど）である。
【０１８３】
また、チメロサール、メルチオレート又はゲンタマイシンなど、保存料も添加し得る。
【０１８４】
さらに、本ワクチンは、１以上の適切な界面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ（Ｒ）又はＴｗｅｅｎ（Ｒ）を含み得る。
【０１８５】
本ワクチンはまたいわゆる「ビヒクル」も含み得る。ビヒクルは、それに共有結合されずに、本発明によるポリペプチド又はタンパク質が付着する化合物である。このようなビヒクルは、とりわけ、バイオマイクロカプセル、マイクロアルギン酸塩、リポソーム及びマクロゾル（ｍａｃｒｏｓｏｌ）（全て当技術分野で公知）である。このようなビヒクルの特別な形態は、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）である。
【０１８６】
言うまでもないが、その他の安定化剤、担体、希釈剤、エマルジョンなどを本発明によるワクチンと混合することもまた本発明の範囲内である。このような添加物は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ」及び「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（両者とも前出）などの周知のハンドブックに記載されている。
【０１８７】
複数の免疫学的物質がこのようにして一度に投与され得るので（時間が短縮され、労働コストが低下し、ワクチン接種される標的動物の不快感が減少する。）、混合ワクチンとして本発明によるワクチンを処方することは非常に有効である。
【０１８８】
このような混合ワクチンは、本発明によるワクチンを、（生又は不活性化）ウイルス、細菌、寄生生物又はその一部（タンパク質、炭水化物又は抗原をコードすることが可能な核酸など）などの別の抗原性化合物と組み合わせることにより達成される。本発明によるワクチンは鳥類標的動物を対象とするので、これは、その他の家禽病原体であるか又はそれ由来であるさらなる抗原と有利に組み合わせられる。
【０１８９】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、家禽に対して病原性のある微生物から得ることができる少なくとも１つのさらなる抗原を含んでいる。
【０１９０】
多くの鳥類病原が知られているが、より関連する獣医学−経済的病原体の一部は、
ウイルス：伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、鳥類インフルエンザ、アデノウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（即ちガンボロウイルス）、ニワトリ貧血ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、家禽ポックスウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス性腸炎）、ハトポックスウイルス、マレック病、鳥類白血病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鳥類肺炎ウイルス及びレオウイルス；
細菌：大腸菌（エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、サルモネラ種、オルニトバクテリウム・リニトラキアレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｉｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィリス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリシペロスリクス・ルシオパチエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エリシペラス種、マイコプラズマ種及びクロストリジウム種；
寄生生物：エイメリア；
真菌：例えばアスペルギルス
などである。
【０１９１】
また、例えば本発明による鳥類アストロウイルスの変異体に対してより広く有効である混合ワクチンを形成するための、２以上の本発明による鳥類アストロウイルスの本発明によるワクチンにおける組み合わせも考えられる。混合ワクチンを形成するために使用され得る鳥類アストロウイルスの例は、表１に記載の分離株である。
【０１９２】
本発明によるワクチンは、家禽への投与に適切であり、所望の適用経路及び所望の効果と合致する何らかの形態を取り得る。
【０１９３】
本発明によるワクチンの調製は、当業者とって周知の手段により行われる。好ましくは、本発明によるワクチンは、縣濁液、溶液、分散液、エマルジョンなどの注射に適切な形態で処方される。一般に、このようなワクチンは滅菌調製される。
【０１９４】
多くの投与方法（全て当技術分野で公知）が適用され得る。本発明によるワクチンは、不活性化される場合、好ましくは注射により投与され、生ワクチンである場合、好ましくは食餌、噴霧又は飲用水を介してなど、大量適用の方法により投与される。
【０１９５】
本発明によるワクチンの投与のためのプロトコールは、理想的には、その他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに組み込まれる。
【０１９６】
本発明によるワクチンに対する好ましい標的は、鳥類動物である。より好ましい標的は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル及びガチョウからなる群から選択される。最も好ましい標的はニワトリである。
【０１９７】
本発明によるワクチンを標的生物に適用するための投与スキームは、ワクチンの処方と適合する方式で及び免疫学的に有効となるような量での、単回又は複数回投与（これは同時に又は連続的に投与され得る。）であり得る。
【０１９８】
齢、体重、性別、免疫学的状況及びワクチン接種しようとする鳥類標的のその他のパラメーターは重要ではないが、健康な標的にワクチン接種すること及び飼育現場での感染を予防するためにできるだけ早急にワクチン接種することは明らかに有利である。従って、例えば、孵化した日又はさらに早く、孵化の３−４日前に；例えばニワトリに対して胚発生（ＥＤ）第１８日又はシチメンチョウに対して第２４日ＥＤで、まだ卵内にいる間に、家禽にワクチン接種することができる。
【０１９９】
安定性の又は経済的理由から、本発明によるワクチンは凍結乾燥され得る。一般に、これにより０℃以上の温度、例えば４℃で長期保存できるようになる。凍結乾燥のための手順は当業者にとって公知であり、様々な規模の凍結乾燥のための装置が市販されている。
【０２００】
従って、好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは凍結乾燥形態である。
【０２０１】
凍結乾燥ワクチン組成物を再構成するために、生理学的に許容可能な希釈剤中でこれを懸濁する。このような希釈剤は、例えば滅菌水又は生理食塩水（（リン酸緩衝）食塩水など）のような単純なものであり得るか、又は、希釈剤は、ＥＰ３８２，２７１に記載のような、トコフェロールなどの補助的化合物を既に含有し得る。より複雑な形態において、本凍結乾燥ワクチンは、例えばＥＰ１，１４０，１５２に記載のようなエマルジョン中で懸濁され得る。
【０２０２】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明による凍結乾燥ワクチンの再構成によって得ることができるワクチン組成物に関する。
【０２０３】
ワクチンにおける本発明による化合物及び組成物の様々な使用に加えて、これらはまた、例えば動物の現地試料又はウイルス調製物において、本発明によるウイルス又はその抗原又は核酸を検出するために、診断にも有利に適用され得る。
【０２０４】
これはまた、上述のようなＩＦＴ及びＶＮアッセイによる血清型決定実験の結果によっても明らかにされ、この実験において、本発明の範囲内に包含されるウイルス（表１に記載のような分離株）とそうではないもの（中でも：ＡＮＶ１、ＣＡｓｔＶ２、レオウイルスなど）との間で差別化するために、本発明による寄託鳥類アストロウイルスに対する抗血清が適用された。同様に、記載のＰＣＲ実験によって、本発明による鳥類アストロウイルスの選択的同定能が明らかになった。
【０２０５】
当業者が認識するように、これは、本発明による抗体に適用されるだけでなく、本発明によるその他の化合物及び組成物にも適用される。このような診断アッセイは、例えば、抗原について試験するために本発明による抗体又はその断片を使用するか又はそれに対する抗体について試験するために抗原（本発明による、ウイルス、抗原性調製物又はタンパク質）を使用するか又はハイブリッド形成又はＰＣＲアッセイを設定するために核酸（ウイルスからのＲＮＡ又は本発明によるＤＮＡ分子）を使用する。
【０２０６】
従って、さらなる態様において、本発明は、鳥類アストロウイルス、抗原性調製物、抗体又はその断片、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるもの）を含む診断キットに関する。
【０２０７】
「診断キット」という用語は、例えば、多くの成分及び診断テストを行うための消耗品及び説明書を含む（全て市販可能な包装形態）、市販用の包装に関する特性を指す。
【０２０８】
従って、このような診断キットは、例えば、抗体ＥＬＩＳＡに必要とされる材料を含む。このような試験において、例えば、ＥＬＩＳＡプレートのウェルは、本発明による鳥類アストロウイルス又はその調製物もしくはタンパク質に対する抗体の検出用の、抗体ＥＬＩＳＡキットを形成するために、本発明による鳥類アストロウイルスで被覆されている。試験試料との温置後、（存在するならば）この試験試料の免疫グロブリンに反応性がある標識化抗体をウェルに添加する。次に、呈色反応により、試験試料中の特異的抗体の有無が明らかになる。
【０２０９】
同様に、例えば本発明によるウイルス、抗原性調製物又はタンパク質で被覆されたマイクロタイタープレートを含む、抗原ＥＬＩＳＡキットが考案され得る。
【０２１０】
このような免疫アッセイの設計は変更され得る。例えば、この免疫アッセイは、直接結合の代わりに競合に基づき得る。さらに、このような試験はまた、装置の固体支持体の代わりに、粒子状物質又は細胞性物質も使用し得る。この試験で形成される抗体−抗原複合体の検出で使用されるのは、標識化抗体のみであり得、この標識は、例えば、酵素又は蛍光、化学発光、放射活性又は色素分子であり得る。
【０２１１】
有利に、本発明によるワクチン及び診断法は、ここで、ある一定の領域又は動物集団における本発明による鳥類アストロウイルスの根絶のためのアプローチを考案するために連携して使用され得る。
【０２１２】
ここで、次の非限定実施例を参照して、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２１３】
（実施例１）
現地試料からの鳥類アストロウイルスの単離
本発明による鳥類アストロウイルスの多くの分離株を、オランダ及びドイツの様々な農場からのニワトリ及びシチメンチョウから単離した。典型例として、試料番号１６１３１９（「分離株１９」）の単離をここで詳述する。
【０２１４】
餌消費の低下、産卵低下及び２級卵の増加を示す、オランダの農場の３６週齢の４羽の産卵雌ニワトリ由来の気管のプールから、分離株１９アストロウイルスを単離した。これらはまた、全般的に、消化不良、下痢及び運動性の問題があった。
【０２１５】
４羽のニワトリの気管のプール組織（０．５−１．０ｇ）を「ライジング液（ｒｉｓｉｎｇ −ｍｅｄｉｕｍ）」（５００ｍＬ ＨＢＳＳ［ハンクス基本塩類溶液］＋２ｍＬベンジルペニシリンナトリウム（１．０００．０００Ｉ．Ｅ／ｍＬ）＋８ｍＬストレプトマイシン（２５０ｍｇ／ｍＬ）＋０,５ｍＬファンギゾン（２．０００μｇ／ｍＬ）＋ＮａＨＣＯ３ ２ｍＬ ７．５％含有）約１０ｍＬと混合し、２分間ストマッカーを用いてホモジェナイズ処理した。２−８℃で２０００ｘｇで１５分間、縣濁液を遠心した。次に、４５０ｎｍフィルターを用いて上清をろ過した。
【０２１６】
得られた液体を４羽の８−９日有胚ニワトリＳＰＦ卵（１ｍＬ／卵）の尿膜腔、４羽の５−６日有胚ＳＰＦ卵（１ｍＬ／卵）の卵黄及び４羽の９日有胚ＳＰＦ卵（０．５ｍＬ／卵）のＣＡＭに接種し、３６．５から３８．５℃で４０から５５％湿度で温置した。この卵を毎日光に透かして調べた。接種１日以内に起こる胚の死亡は非特異的とみなした。
【０２１７】
卵黄嚢接種卵の胚は、接種後第７日で何ら異常は示さなかった。そうではあるが、卵黄液を回収し、２回目の継代に使用した。
【０２１８】
１回目の継代から回収した卵黄液４ｍＬ（１ｍＬ／卵）を「継代液（ＨＢＳＳ ９０ｍＬ＋２ｍＬベンジルペニシリンナトリウム（１．０００．０００Ｉ．Ｅ／ｍＬ）＋８ｍＬストレプトマイシン（２５０ｍｇ／ｍＬ）＋０，５ｍＬファンギゾン（２．０００μｇ／ｍＬ）＋ＮａＨＣＯ３ ２ｍＬ ７．５％含有）０．５ｍＬと混合した。この混合液から、１ｍＬ／卵を５羽の５日有胚ＳＰＦ卵の卵黄に接種し、３６．５から３８．５℃で４０から５５％湿度で温置した。これらの卵を毎日光に透かして調べた。
【０２１９】
接種後第６日目に、１個の胚が死亡し、身体の赤みが見られた。寒天ゲル沈降（ＡＧＰ）アッセイでこの卵からの尿膜腔液をレオウイルスに対して試験し；それは、レオウイルスに対して陰性であった。
【０２２０】
異常胚があったこの卵の卵黄約４から５ｍＬを回収し２回目の継代と同じようにさらなる継代に使用した。
【０２２１】
３回目の継代において、接種後第５日目に、３つの胚が死亡し、それらのうち２つで身体の赤みが見られた。プールした尿膜腔液はレオウイルス及びアデノウイルス１型に対してＡＧＰで陰性であった。
【０２２２】
さらなる継代において、胚が死亡するか又は接種後により早く症状を発現したので、分離株の力価が上昇した。６回目及び７回目の継代で、肢及び翼端の典型的な鮮赤色染色が明らかになった。
【０２２３】
一貫して、尿膜腔液は、ＩＢＤＶ、レオウイルス、アデノウイルス、ＮＤＶ、ＡＩＶ及びＩＢＶに対するＨＡ又はＡＧＰ試験で陰性であった。また、ＩＢＤＶに対するＰＣＲアッセイも陰性であった。
【０２２４】
回収したＣＡＭ及び尿膜腔液を−８０℃で凍結保存し、さらなる特徴評価のために使用した。
【０２２５】
（実施例２）
ウイルスＲＮＡ単離：
トータルウイルスＲＮＡの単離のために、製造者の説明書に従い、ＱＩＡａｍｐ（Ｒ）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡミニキット（ＱｉａＧｅｎＴＭ）を使用した。簡単に説明すると、尿膜腔液又は組織又は胚ホモジェネート（通常、５−５０％ｗ／ｖの間の量）などの１４０μＬウイルス含有液を予め調製した抽出緩衝液及び担体ＲＮＡと混合した。室温で１０分間、これを温置した。次に、純エタノール（９６−１００％）を添加し、混合し、混合物をＱＩＡａｍｐミニスピンカラム（２ｍＬ回収チューブ中）に入れた。１分間、６０００ｘｇでこれを遠心した。フロースルーを廃棄した。純エタノールを含有する洗浄緩衝液でこのカラムを洗浄した。最後に、６０μＬ溶出緩衝液でこのカラムを溶出した。一般に、ＲＮＡ単離の後、直接、ＲＴ反応を介してｃＤＮＡの産生を行った。
【０２２６】
標準的アガロース／ホルムアミドＲＮＡゲル−電気泳動によりアストロウイルスＲＮＡの存在を確認した。
【０２２７】
（実施例３）
ＲＴ反応を介したｃＤＮＡの産生
製造者の説明書に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（Ｒ）Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｅａｄｓを用いて、第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。簡単に述べると、トータルウイルスＲＮＡ単離物からの溶出ＲＮＡ２９μＬを６５℃で１０分間及び氷上で２分間、変性させた。２個のビーズを含有するチューブにこれを添加し、１０μＭプライマー１７（配列番号３）４μＬを添加し、３３μＬの最終体積とした。これを室温で１分間温置し、慎重にピペット操作することによって混合し、３７℃で１時間温置した。さらなる使用まで、ｃＤＮＡを−２０℃以下で凍結保存した。
【０２２８】
（実施例４）
ＰＣＲ反応
ＲＴ反応からのｃＤＮＡから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを調製するために、ＰＣＲを使用した。また、本発明による鳥類アストロウイルスが試料中に存在するか否かを特異的に同定するために、診断型の検出アッセイとしてＰＣＲを使用した。
【０２２９】
ＰＣＲ反応成分は、ＨＴ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭＬｔｄ．から得た：Ｓｕｐｅｒｔａｑ（Ｒ）緩衝液（１０ｘ濃縮液）を１ｘ濃縮で使用し；Ｓｕｐｅｒｔａｑ（Ｒ）Ｐｌｕｓポリメラーゼ酵素（５Ｕ／μＬ）を１Ｕ／μＬで使用し、予混合ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）を２ｍＭで使用。ＲＮＡｓｅ不含蒸留水中でこれらを混合した。
【０２３０】
使用したプライマーは、表４で列挙されるようなものであった。プライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ（オランダ）により合成され、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中で１００μＭのプライマー保存溶液を調製し、希釈標準保存溶液は、直接使用するために１０μＭ希釈液であった。
【０２３１】
標準的ＰＣＲに対して、次の成分を使用した：２７μＬ Ａｑｕａ ｄｅｓｔ．、５μＬ １０ｘＳｕｐｅｒｔａｑ Ｐｌｕｓ緩衝液；１μＬ（＝１単位）Ｓｕｐｅｒｔａｑ Ｐｌｕｓ酵素；５μＬ ２ｍＭ ｄＮＴＰ混合液；フォワード及びリバースプライマー各５μＬ（１０μＭ）；及び最後に、ＲＴ反応混合物からのｃＤＮＡ２μＬ；５０μＬの総体積に達した。
【０２３２】
例えばプライマーＦ−ＩＩ及びＲ−ＩＩ−３（配列番号２８、２９）でＯＲＦ１ａを増幅するための又はプライマー２０及び２１（配列番号３２、３３）を用いることによりＯＲＦ１ｂを増幅するための典型的な反応条件は、
９５℃で−１分、
９４℃で３０秒間；４８℃で１分；及び７２℃で４０秒を４０サイクル
７２℃で１０分間
２０℃で保持
であった。
【０２３３】
ＮＢ：全てのＰＣＲ温度は±約１℃である。
【０２３４】
最適化中、いくつかの変更を行った：４０サイクルの代わりに４５サイクルとし、アニーリング温度に対する変更及びサイクル段階の時間に対する変更：３０秒又は１分間の長さで、４６から５３℃の間の温度を使用した。
【０２３５】
本発明による鳥類アストロウイルスの特異的検出のために、プライマー２９及び３０（配列番号３０、３１）を用いて、サイクル相に対して使用される最適条件は、５１℃で３０秒間のアニーリング温度で４５サイクルであった。その他の条件は、プライマー２０／２１反応に対するものと同じであった。
【０２３６】
サイクル配列決定反応のためのＰＣＲ反応は、基本的に異なる設定であった：９６℃で１０秒間；５０℃で５秒間；及び６０℃で２分間を２５サイクル、下記参照。
【０２３７】
（実施例５）
アガロースゲル−電気泳動によるＤＮＡ分析、精製及びサブクローニング：
産生されたＰＣＲ産物の検出及び視覚化のために、アガロースゲル−電気泳動を使用した。また、これは、切り出し及び抽出によりＰＣＲ産物を精製するために役立ち、これらの単離されたＰＣＲ産物の配列決定又はサブクローニングが可能になった。
【０２３８】
簡単に述べると、１００ｍＬアガロース溶液あたり０．５ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウム溶液約５０μＬを含有するＴＡＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中で０．８％アガロース（低電気浸透タイプ）ゲルを作製した。ＰＣＲ産物の試料を標準的試料ローディング緩衝液（グリセロール／ＳＤＳ／／ブロモフェノールブルー）と１：１０で混合した。典型的に、ＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃＴＭからのＳｍａｒｔＬａｄｄｅｒ（Ｒ）を用いたマーカーレーンが含まれた。通常は２０ｘ２０ｘ１ｃｍゲルに対して１００Ｖで１時間又は青色色素が寒天の端に到達するまで、ＴＡＥ緩衝液中に浸して電気泳動を行った。ＵＶ光により可視化した。デジタルカメラでゲルの写真を撮影した。
【０２３９】
切り出され精製されたバンドのＤＮＡの濃度を評価するために、ＤＮＡマーカーラダーの様々な量を保持するいくつかのレーンの横で試料を電気泳動する場合にも、寒天ゲル電気泳動を使用した。
【０２４０】
微量遠心又はＱＩＡｖａｃ（Ｒ）真空マニホールドの何れかを用いて、製造者の説明書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（Ｒ）ゲル抽出キット（ＱｉａＧｅｎＴＭ）を用いて、アガロースゲルから、ＰＣＲ産物の特異的バンドの精製を行った。
【０２４１】
アガロースゲルから切り出し、精製したＤＮＡバンドを、クローニング、配列決定、発現又はハイブリッド形成−検出アッセイなどのさらなる使用のために細菌プラスミドにサブクローニングした。製造者の説明書に従い、ＴＯＰＯ−ＴＡ（Ｒ）ベクター及びＴＯＰＯ−ＴＡ（Ｒ）クローニングキット（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を用いて、プラスミドＰＣＲ２．１にＤＮＡ断片をクローニングした。
【０２４２】
（実施例６）
ＤＮＡ配列決定
Ｂｉｇ Ｄｙｅ（Ｒ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ）及びＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ３１０自動配列決定装置を用いて、全て製造者の説明書に従い、標準的ＰＣＲサイクル配列決定により、ＤＮＡ配列決定を行った。
【０２４３】
一般的には、配列決定反応において、２０μＬの総体積まで、蒸留水中で８μＬ Ｂｉｇ Ｄｙｅ（Ｒ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１０μＭプライマー１μＬとともに、ＤＮＡ（精製ＰＣＲ産物又はベクター中のクローニング断片）２０から７０ｎｇを使用した。配列決定のために使用したプライマーは、通常、ｃＤＮＡからｄｓＤＮＡ産物を調製するためにＰＣＲで使用されたものと同じであった。
【０２４４】
サイクル配列決定ＰＣＲは、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で２分間を２５サイクル行うことによるものであった。
【０２４５】
ＰＣＲ後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｒ）チューブ及び微量遠心を用いて、製造者の説明書に従い、Ｄｙｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏを除去するために、ＤｙｅＥｘ（Ｒ）スピンカラム（ＱｉａＧｅｎＴＭ）を用いて試料を精製した。４０μＬの総体積になるように、最終溶出物を蒸留水により１：２で再懸濁した。
【０２４６】
次に、Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎバージョン１．０．４及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓバージョン３ソフトウェアを用いて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでの分析により、配列決定を行った。
【０２４７】
いくつかのプログラムを用いて配列分析を行ったが、最もよく使用したものは、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｒ）（Ｇｅｎｅ ＣｏｄｅｓＴＭ）及びＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒ（Ｒ）（Ｓｃｉ．Ｅｄ．ＳｏｆｔｗａｒｅＴＭ）であった。使用した変性ＰＣＲプライマーに基づき導入されたヌクレオチド読み取りを除去するために、最初と最後の配列を切り取った。
【０２４８】
配列番号４−２６（偶数）で本明細書中で与えられるＤＮＡ配列は、多重配列決定反応由来のコンセンサス配列である。大抵の場合、この配列はまた、フォワード及びリバース配列決定プライマーを用いて２本鎖の両方からも読み取り；配列番号８のみ、一方の鎖のみから決定した。平均重複性はヌクレオチド個あたり約４ｘであった。
【０２４９】
（実施例７）
有胚ニワトリ卵におけるアストロウイルスの滴定
２３Ｇ１”針を用いて、６日有胚ＳＰＦニワトリ卵の卵黄嚢にアストロウイルス縣濁液の連続１０倍希釈液を接種した。続いて、３７℃で７日間、孵卵器中でこの卵を温置した。
【０２５０】
この卵を毎日、光に透かして調べた。接種後２４時間以内に起こる死亡は非特異的とみなし、従って、初期に死亡した胚を含有するこのような卵を廃棄し、感染性力価の計算から除外した。
【０２５１】
接種後２から７日までに死亡した胚を本発明によるアストロウイルスでの感染に対する病変の特徴の有無について調べた（これは、死亡した胚が鮮赤色の肢及び翼端及び腫脹した暗赤色の肝臓を呈したか否かということであった。）。Ｓｐｅａｒｍａｎ及びＫａｒｂｅｒの方法に基づくコンピュータプログラムを用いて、感染性力価を計算し、ＥＬＤ５０／ｍＬで表した。
【０２５２】
（実施例８）
有胚ニワトリ卵におけるアストロウイルスの産生
９日有胚ＳＰＦニワトリ卵の卵黄嚢に２２Ｇ１ １／２”針を用いて、卵１個あたりアストロウイルス１０＾５ ＥＬＤ５０を接種した。続いて、孵卵器でこの卵を３７℃温置した。
【０２５３】
温置２４時間後に、この卵を光に透かして調べた。２４時間以内に起こった死亡は非特異的とみなし、これらの卵を除外した。
【０２５４】
温置４８時間後に、残っている全ての卵の尿膜腔液を回収した。この尿膜腔液を−６０℃以下で凍結保存した。
【０２５５】
上述のような有胚ニワトリ卵中で又は細胞での滴定により、感染性力価を明らかにした。
【０２５６】
（実施例９）
初代細胞の作製
胚から肝臓を単離することによって、１４−１６日有胚ＳＰＦニワトリ卵からＣＥＬ細胞を調製した。ＰＢＳ／フェノールレッドで肝臓を洗浄し、ＰＢＳ中にトリプシンを含有する溶液中で室温で８−１０分間温置した。１００μｍガーゼを通して上清を回収した。これを２回以上繰り返し、次に、遠心により細胞を回収し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する適切な富化培地中で再懸濁した。
【０２５７】
約１８日ＳＰＦニワトリ胚からの腎臓を用いて、同様にＣＥＫ細胞を調製した。この腎臓の外皮を穏やかに剥ぎ、洗浄し、室温で２０分間、１回トリプシン処理した。次にＣＥＫ細胞をろ過し、培地＋ＦＣＳ中で処理した。
【０２５８】
（実施例１０）
ＩＦＴアッセイ
ある一定の抗血清の異種間の特異性を調べるために、ならびにウイルス滴定のために、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）を使用した。通常、マイクロタイタープレート中で初代細胞においてＩＦＴを行った。
【０２５９】
ＣＥＫ細胞をＩＦＴに対して使用した場合、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中で１０＾５細胞／１００μＬでこれらを播種した。この細胞を２％ＦＣＳ及び抗生物質入りの標準的な富化培地中に入れ、これを５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で温置した。翌日、細胞上にウイルスを接種した。
【０２６０】
滴定の目的で、ウイルスの連続希釈液を使用した。次に、さらに２日間プレートを温置した。次いで、上清を除去し、細胞を−７０℃の純エタノールで固定した。このプレートを使用まで−２０℃で保存し得た。滴定に対してウイルスを可視化するために、特異的抗血清でこのプレートを染色した。従って、このプレートを室温に順応させ、アルコールを捨てて、このプレートをＰＢＳで洗浄した。良好な蛍光を与えるがバックグラウンドが強すぎないことが知られている強度で抗−アストロウイルス血清の希釈液を調製した。次に、この第一の抗血清をプレートに添加し、加湿雰囲気中、３７℃で１時間温置した。次いで、ＰＢＳで３回、このプレートを洗浄した。次に、第二の抗体結合物を調製した（ヤギ抗−ニワトリＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合物（ＮｏｒｄｉｃＴＭ））。これを必要とされる希釈でプレートに添加し、３７℃で１時間再び温置した。この温置後、プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＰＢＳ：グリセロールの１：１混合物を添加した。次に、蛍光顕微鏡による読み取りまで、４℃にて暗所でプレートを保存した。陽性シグナルは、細胞層でのｃｐｅの兆候に相互に関連する、特異的蛍光の検出である。
【０２６１】
血清の特徴評価及び種の交差反応試験のために、ＣＥＫ又はＣＥＬ細胞を用いて、同様にしてマイクロタイタープレートを調製した。翌日、試験しようとする様々なウイルス、例えば本発明によるアストロウイルス分離株、またＡＮＶ１及びＣＡｓｔＶ２ならびにその他の鳥類病原体：レオウイルス、ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＦＰＶ、アデノウイルス、ＡＩＶなど、をこれらに感染させた。ウイルス量は、固定量又は希釈液（都合の良いあらゆるもの）であった。このプレートを２−３日間温置した。
【０２６２】
ある一定の抗血清の様々なウイルスへの結合能を試験するために、血清をこのプレート上で温置し、結合物と温置することによってシグナルを増強させた。結合−対−バックグラウンドシグナルの最適化のために、様々なウイルスの様々な希釈液においてＰＢＳ中の抗血清のいくつかの希釈液を試験した。
【０２６３】
（実施例１１）
アストロウイルスでのニワトリの感染
飼育現場で観察される疾患症状を再現するため及びこれらの二次感染動物から微生物を再単離するための実験設定において、ニワトリで、本発明による鳥類アストロウイルスを試験した。これは、試験される分離株を、病原性及び毒性が強い微生物及び観察される飼育現場での症状の原因となる感染因子として確立するために、コッホの条件に適合させるのに役立つ。
【０２６４】
また、続く攻撃感染に対して、生の接種材料によるワクチン接種効率を試験するために、ニワトリを繰り返し感染させた。
【０２６５】
最後に、接種されたアストロウイルスに対する特異的なポリクローナル抗血清を得るために、実験的に感染させたニワトリから総血清を分離した。
【０２６６】
この目的に対して、白色レグホン品種のＳＰＦ産卵ニワトリ及び雄雌両方を３週齢で陰圧アイソレーターに移した。無作為選択により動物を処置群に割り当て、二重の翼バンドにより個々に標識した。標準的な餌及び飲用水を自由に摂取できるようにした。
【０２６７】
免疫状態を調べるために、一定間隔で実験を通じて、また第０日にも、血液試料を採取した。次に、１５羽のニワトリに３種類の経路：１０＾５ ＥＩＤ５０／０．２ｍＬ用量及び１０＾５．４ ＥＩＤ５０／０．５ｍＬ用量で、眼内経路により及び筋肉内経路により各０．２ｍＬ、ならびに経口経路により０．５ｍＬを接種した。接種材料は、注射用水中で再懸濁した、寄託したような分離株１９アストロウイルスであった。対照及びセンチネルとして使用するために、同じアイソレーターに入れた５羽のニワトリには接種しなかった。疾患の臨床兆候又は死亡について、動物を毎日調べた。
【０２６８】
接種後（ｐ．ｉ．）第２０日に、何羽かのニワトリの採血を行い、死後組織病理試験に供した。ｐ．ｉ．第２３日に、接種材料の同様の用量を用いてその他の（既に接種済み）ニワトリに免疫促進を行った。さらに２３日後、実験を終了し、生存動物から採血し、試験した。
【０２６９】
一部のニワトリには最初に接種を行わなかったが、接種／感染ニワトリと同じアイソレーター中で飼育し、予想通り、これらのニワトリはアストロウイルスの水平伝播を通じて感染した。
【０２７０】
（実施例１１ａ）
組織病理学的結果
動物試験の組織病理学的結果は次のとおりであった：２羽のニワトリが死亡し、５羽のニワトリ（そのうち３羽が対照）が下痢を発症した。組織病理学において、数羽のニワトリが、既にｐ．ｉ．第７日から、程度の差はあれ、腎臓及び腸管に対する重度の病変を示した。腎臓では、最も顕著な兆候として、重度の間質性腎炎及び尿細管変性が見られた。胸腺及び嚢ではリンパ球溶解が見られ；膵臓では、アポトーシス及び腺房萎縮が見られ；十二指腸では絨毛が鈍化し融合していた。
【０２７１】
未接種対照ニワトリの水平感染から、アストロウイルス接種材料の毒性及び感染性が明らかになった。
【０２７２】
（実施例１１ｂ）
ＰＣＲの結果
本発明による鳥類アストロウイルスの兆候について、ＰＣＲにより、全ニワトリの腎臓試料を試験した。ホモジェナイズ処理及びＲＮＡ単離後、ＲＴ試料を調製した。配列番号３０及び３１のプライマーを用いて、ＰＣＲによりこれらを試験した。感染動物の全試料は、本発明による鳥類アストロウイルスを同定する特異的な２６０ｂｐバンドを提示したことから、試験において陽性となった。適切な陽性及び陰性対照が含まれた。
【０２７３】
これにより、死亡及び組織病理学的兆候の原因物質が本発明による鳥類アストロウイルスであったことが分かった。観察された症状、腎炎及び下痢は、飼育現場で見られたものと一致した。肢に対する問題は再現することができず；おそらく、使用した鳥がこのような問題を発現するには痩せすぎており及び／又はアイソレーターにおけるＳＰＦニワトリの状態が、飼育現場の鳥が直面する多重感染圧を十分に模していなかったからであろう。
【０２７４】
（実施例１１ｃ）
ＶＮの結果
ｐ．ｉ．第０日、第２０日及び第４６日から、３７℃で１時間、ニワトリ抗血清とともにアストロウイルス分離株１９の固定量を温置した。次に、６日有胚ＳＰＦ卵にこれらのウイルス試料を接種し、数日間温置した。卵接種後第４日に、第０日血清で処置したウイルスを接種した胚が死亡し、本発明による鳥類アストロウイルスによる感染の典型的兆候を示した。
【０２７５】
しかし、第２０日又は第４６日に採取された血清と温置したウイルスは、胚に影響を与えなかった。これにより、分離株１９ウイルスが特異的ニワトリ抗血清により効果的に中和され得ることが分かる。
【０２７６】
また、これは、本発明による鳥類アストロウイルスでの生接種において、ＶＮ能を有する有効な抗血清がニワトリにおいて誘導され得ることを証明する。
【０２７７】
（実施例１１ｄ）
ＩＦＴの結果
ニワトリポリクローナル抗血清を用いた交差反応ＩＦＴアッセイの結果から、抗−分離株１９抗血清が、本発明による鳥類アストロウイルスのウイルス分離株以外、ウイルスを何も認識しなかったことが明らかになった。
【０２７８】
同様に、ＡＮＶ１又はＣＡｓｔＶ２に特異的な抗血清は、同様にそれらが作製された特異的ウイルスのみを認識した。同様に、抗−ＡＮＶ１も抗−ＣｈＡｓｔＶ２血清も本発明による鳥類アストロウイルスのウイルス分離株に結合しなかったことは重要であった。これは、試験された最大抗体量（希釈率が最小の試料）にさえも当てはまった。
【０２７９】
また、その他の鳥類病原体、最も重要なものとしてはレオウイルス、に対する抗血清は、本発明による鳥類アストロウイルスのウイルス分離株に結合できず、本発明による鳥類アストロウイルスのウイルス分離株に対する抗血清もその他の鳥類病原体に結合できなかった。
【０２８０】
これにより、本発明による鳥類アストロウイルスがそれ自身の新規の特有な血清型であることが明らかとなり、従って、特有な分子生物学的差異が同定されたことが確認された。
【０２８１】
ＣＥＫ細胞が入ったプレートに、分離株１９アストロウイルス、第３継代、ウイルスの連続１０倍希釈物を感染させた。２日後、このプレートを固定し、様々な抗血清で染色した。
【０２８２】
−接種後第３３日からの抗分離株１９血清プール、ＰＢＳ中で１：２０
−ニワトリにおいて作製された抗ＡＮＶ１（ＳＥ−０２７／２株）、ＰＢＳ中１：２０（このＡＮＶ１はＧｅｒｍａｎ ＡＮＶ１分離株であり、特異的領域のＤＮＡ配列決定において、本明細書中で使用されるＧｅｎＢａｎｋからの参照ＡＮＶ１配列と非常に近縁であると思われる。）。
【０２８３】
−ニワトリにおいて作製された抗ＣＡｓｔＶ２（ＴＳ９Ｌ株）、ＰＢＳ中１：５００（このＣＡｓｔＶ／１は、寄託番号Ｉ−２９３２でＰａｒｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＣＮＣＭに寄託された試料由来であった。）。
【０２８４】
−陰性対照、ＰＢＳのみ。
【０２８５】
【表５】
【０２８６】
（実施例１２）
さらなるワクチン接種試験
不活性化ワクチン：
抗原用量を最適化するために、不活性化された本発明によるアストロウイルスのアジュバント付加ワクチンで、シチメンチョウ及びニワトリにワクチン接種する。
【０２８７】
記載のようにアストロウイルス分離株１９をＣＥＬ上で培養し、標準的プロトコールに従い、温度及びｐＨ調節下でβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いて不活性化する。標準的プロトコールを用いて、軽油及び適切な乳化剤からなる標準的ｗ／ｏエマルジョンへと、不活性化アストロウイルスをホモジェナイズ処理する。
【０２８８】
シチメンチョウ及びニワトリを隔離ユニットで飼育する：各群に２０羽の動物が含有されるように、それらが手に寄って来たとおりに、１２０羽の２週齢の在来シチメンチョウを６つの個別の群（群１−６）に割り当てる。３週齢で、不活性化アストロウイルス分離株１９を含有するｗ／ｏエマルジョンワクチンで、第１−４群のシチメンチョウに筋肉内経路によりワクチン接種する。同じｗ／ｏエマルジョンワクチンで、第５群のシチメンチョウに皮下経路によりワクチン接種し、第６群のシチメンチョウはワクチン接種せず、対照として使用する。
【０２８９】
同様に、各群に２０羽のニワトリが含有されるように、それらが手に寄って来たとおりに、１８０羽の１週齢ＳＰＦ産卵ニワトリを９つの個別の群（第７−１５群）に割り当てる。３週齢で、不活性化アストロ３型ウイルスを含有するｗ／ｏエマルジョンワクチンで、第７−１０群のニワトリに筋肉内経路によりワクチン接種する。同じワクチンで、第１１−１４群のニワトリに皮下経路によりワクチン接種し、第１５群のニワトリはワクチン接種せず、対照として使用する。
【０２９０】
実験開始前及びワクチン接種後第４、８及び１２週に、全てのシチメンチョウ及びニワトリから血液試料を採取する。ＣＥＬ細胞上でのＩＦＴにより、又はＶＮアッセイにより、本発明によるアストロウイルスに対して特異的な抗体の有無及びそれらの力価について血清を調べる。
【０２９１】
例えば、さらに６−１２ヶ月アイソレーター中でワクチン接種鳥類を維持することによって、適切であれば免疫試験の持続時間を含むように、このプロトコールを容易に改変することができ、次に、感染に従うアストロウイルスでの攻撃感染を適用する。
【０２９２】
生ワクチン：
本発明による生アストロウイルスの用量でニワトリにワクチン接種し、続いてアストロウイルス生ワクチンに対する適用経路を最適化するために、アストロウイルスを用いて病原体接種を行う。
【０２９３】
各群に２０羽のニワトリが含有されるように、１００羽の１日齢の市販のＭＤＡ＋（母性由来抗体陽性）種畜ニワトリを５つの個別群に割り当てる。１日齢で、点眼、散霧、エアロゾル噴霧又は飲用水を介して、尿膜腔液からの生アストロウイルス分離株１９で、第１−４群のニワトリにワクチン接種する。第５群のニワトリはワクチン接種せず、非ワクチン接種対照として使用する。ワクチン接種後第４週に、全てのニワトリに対して本発明によるアストロウイルスにより病原体接種を行う。アストロウイルス感染に特徴的な臨床兆候及び／又は死亡の発生について、病原体接種後３週間の間、全ニワトリを毎日観察する。病原体接種から２１日後、残った全ニワトリを屠殺し、組織病理学試験に供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、新規鳥類アストロウイルス；新規ウイルスに対する抗体又はその断片；新規鳥類アストロウイルスの、抗原性調製物、タンパク質及びＤＮＡ分子；新規ウイルスもしくはその抗原性調製物、タンパク質又はＤＮＡの、ワクチン；このようなワクチンの製造のための方法及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アストロウイルスは、プラスセンスの、１本鎖ＲＮＡゲノムを有する、小型で球形のエンベロープのないウイルスである。殆どのアストロウイルスは、下痢、嘔吐、吸収不良、全身的倦怠感及び成長遅延をもたらす、ある種の腸炎を引き起こすことに関連付けられてきた。感染は、幼若、老齢又は免疫不全個体など、体力がないヒト又は動物では致死となり得る。Ｍａｔｓｕｉ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ（Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、１９９６：Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓら編、ＩＳＢＮ：７８１７０２５３４、第２６章）及び：Ｍｏｓｅｒ及びＳｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ（２００５、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８、ｐ．４−１０）参照。
【０００３】
また、アストロウイルス種又は株それ自身の間で毒性に差があるので、アストロウイルス誘発性病態の重症度は変動し得る。これにより、アストロウイルスのうち一部は第二の病原体として作用し、それら自身では無症候性の疾患しか引き起こさず、一方で、別の病原体からの疾患のさらなる原因がある場合のみ、疾患の完全な臨床兆候を呈すると考えられるようになった。
【０００４】
アストロウイルス感染に対する免疫が達成される機構も完全には明確になっておらず；ウイルス中和抗体は、防御及び免疫学的記憶の一端を担っていると思われるが、おそらく、アストロウイルス感染に対する免疫反応の唯一のエフェクターではない。これは、Ｍ．Ｋｏｃｉ（２００５、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８、ｐ．１１−１６）により概説されている。
【０００５】
アストロウイルスは、世界中で検出されており、多岐にわたる動物から単離された。同様に、ある一定の標的動物に感染するアストロウイルス種の中で、いくつかの血清型が述べられている。分類学的に、アストロウイルス科は、２種類の主要な属、哺乳動物アストロウイルス：Ｍａｍアストロウイルス及び鳥類アストロウイルス：Ａｖアストロウイルスに分類される。現在のところ、Ａｖアストロウイルス属は、正式に認識される種：鳥類腎炎ウイルス１及び２（ＡＮＶ１、２）（ニワトリより）及びシチメンチョウアストロウイルス１及び２（ＴＡｓｔＶ１、２）を含む。
【０００６】
いくつかのさらなる鳥類アストロウイルスが、アヒル、ニワトリ、ダチョウ及びシチメンチョウから単離されてきた。例えば、ニワトリアストロウイルス２（ＣＡｓｔＶ２）は、Ｂａｘｅｎｄａｌｅ及びＭｅｂａｔｓｉｏｎ（２００４、Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３３、ｐ．３６４−３７０；及び国際特許出願ＷＯ２００４／０２７０５３）により記載されており、Ｔｏｄｄらは、ＣＡｓｔＶ２と近縁であるＣＡｓｔＶ３（ＷＯ２００７／０７７４６４）について述べた。これらのアストロウイルスは、Ｋｏｃｉ及びＳｃｈｕｌｚ−Ｃｈｅｒｒｙ（２００２、Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３１、ｐ．２１３−２２７）により概説されるように、まだ正式には分類されていない。
【０００７】
アストロウイルスは、生活環境において非常に安定であり、例えばこれらは、通常の脂質−溶媒及び界面活性剤に耐性を有し得、幅広いｐＨ耐性を有し、比較的温度に対して安定である。この事実から、それらの高い感染性及び糞口経路による易伝染性と組み合わせて、アストロウイルス又はそれらに対する抗体が非常に多くのヒト及び動物界で見出され得る理由が説明される。
【０００８】
これらの小型ＲＮＡウイルスの分類及び命名は、新しい実験データに適合させるために改訂が必要とされた場合に頻繁に変更されてきた。例えば、アヒルアストロウイルス（ＤＡｓｔＶ）は、かつてはピコルナウイルスとして分類され、肝炎を引き起こすので、元来、アヒル肝炎ウイルスＩＩと呼ばれていた。同様に、ＡＮＶ１は、以前、ピコルナウイルス、特にエンテロウイルスと記載されていたが、しかし、Ａｖアストロウイルスと再分類された（Ｉｍａｄａら、２０００、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、ｐ．８４８７−８４９３）。ＡＮＶ１はまた、ニワトリアストロウイルス１（ＣＡｓｔＶ１）とも呼ばれ、腎炎を引き起こす。
【０００９】
ウイルスゲノムの配列及び構成における新しい情報の活用時に、これらのウイルスの再分類が求められた。特に、アストロウイルス科に対して、物理学的、電子顕微鏡的及び生化学的特徴が、ピコルナ−、カリシ−又はへぺウイルス科（Ｅ型肝炎様ウイルス）などのその他のいわゆる「小型球形ウイルス」又は「エンテロウイルス様ウイルス」から又はさらにはアストロウイルスの病徴とよく類似した病徴を引き起こす、レオ−、ロタ−又はコロナウイルスなどのエンベロープのあるＲＮＡウイルスから、アストロウイルス科を区別するためには十分ではないことが多いことが分かった。これは、このような特性評価の結果が、使用される方法及び条件で変動するからである。従って、これらは、正しい決定を行うには十分に一貫していない。
【００１０】
一方、免疫学的特性評価と組み合わせた、遺伝子型決定などの分子生物学的な特性評価は、正しい分類群に微生物を割り当てるのに十分詳しく、再現可能である（Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌら、２０００、Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、７ｔｈ Ｒｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＣＴＶ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、理想的には、このような決定は、ヌクレオチド配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイ及び血清学的分類アッセイに基づく。
【００１１】
アストロウイルス科のＲＮＡゲノムは、概ね約７ｋｂの大きさであり、このウイルス科に対して典型的であるゲノム構成を有する。Ｊｉａｎｇら（１９９３、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、ｖｏｌ．９０、ｐ．１０５３９−１０５４３）及びＫｏｃｉら（２０００、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、ｐ．６１７３−６１７７）参照。現時点の理解によると、このゲノムは、５’から３’に向かって、３つの明らかに認識可能なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を組み込む。
ＯＲＦ１ａ：は、約３ｋＢの大きさであり、セリンプロテアーゼモチーフを有する非構造タンパク質をコードする。
ＯＲＦ１ｂ：は、約１．５ｋＢの大きさであり、ＯＲＦ１ａと部分的に重複し、非構造ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。
ＯＲＦ２：は、約２ｋｂサブゲノムＲＮＡを介して、構造ウイルスタンパク質をコードする。発現されるポリタンパク質は、おそらく、ウイルスアセンブリ前により小さい部分に切断され、とりわけキャプシド又はコートタンパク質を含む。
【００１２】
３つのＯＲＦのうち、ＯＲＦ１ｂは、公開されているアストロウイルスヌクレオチド配列の中で比較して、最も保存されたヌクレオチド配列を有し、ＯＲＦ２は配列中で最も変化しやすいＯＲＦである。
【００１３】
オランダ、ドイツ及びアラブ首長国連邦での養鶏場において、ニワトリ及びシチメンチョウが、下痢、試料効率及び成長の低下ならびに肢の関節及び腱の腫脹及び疼痛を伴う問題を発現するという、ある特定の疾患問題が１９８７年から現在までの間、観察された。これらの問題は、様々な齢の、及び明らかな相互のつながりのない様々な農場の、ブロイラー、種畜及び産卵用鳥類で見られた。
【００１４】
第１週齢から数ヶ月齢の鳥類において跛行が観察された。動物は、下肢の膝節（足首）関節及び腱シャフト（ｔｅｎｄｏｎ ｓｈａｆｔ）の腫脹（両方とも、透明で僅かに粘性のある液体が過剰に貯留）及び関節炎の症状を呈した。飼料利用及び成長速度の低下がこれらの鳥類で観察されたが、これはおそらく、運動器官の問題の結果であろう。最悪の場合、鳥類はもはや動くことができず、それにより、摂餌又は摂水不可能となり、結果的に死亡した。これらの肢の異常は、体重がより重いブロイラー型の鳥類の行動で最も顕著であったが、しかし、持続的な経済的損失は全てのタイプの鳥類で深刻であった。
【００１５】
さらにより問題であったのは、主に幼若鳥類で、また抱卵齢の鳥類でも観察された下痢であった。症状は、消化不良から明白な腸炎まで様々であり、その結果、飼料効率が低下し；成長が低下するか又はさらに体重が減少し；産卵数が減少し（「産卵減少」）；低質の卵数が増加し；死亡率が上昇した。
【００１６】
いくつかの農場で、数年にわたりその問題が観察され、その結果、明確な原因なく、低生産性状態が持続した。
【００１７】
死後の検査時に、数例において、砂嚢のびらん又は肝臓の腫脹により示されるものなど、腸又は肢関節以外の身体部位も冒されていたことが分かった。
【００１８】
これらの症状に対する原因を検出するために、管理及び食餌の点を調べたが、管理及び食餌は、これらの場合に観察された問題とは関連し得なかった。また、特にレオウイルス（このウイルスは、吸収不良及び関節の問題を引き起こすことが周知であるため）による感染に関与し得る病原体を調べた。しかし、様々なアッセイを使用したにもかかわらず、多くの場合において、レオウイルスは検出できなかった。
【００１９】
細菌：サルモネラ、マイコプラズマ、ヘモフィルス及びパスツレラ；及びウイルス：アデノウイルス、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、産卵低下症候群（ＥＤＳ）及び鳥類インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）などの、同様の問題を引き起こすことが知られているものに対して、通常的に又は特異的に何れかでいくつかのその他の病原体も調べた。
【００２０】
今日まで、どの原因物質も、重症度にかかわらず観察された肢及び腸の問題、動物の福祉に対する問題及び結果として生じるこれらの養鶏場の経済効率低下に関連し得なかった。
【００２１】
結果的に、観察される疾患−症状に関連する物質を同定する、及び疾患の予防及び原因物質の同定をもたらす、ワクチン及び診断法を提供することが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２７０５３号
【特許文献２】国際公開第２００７／０７７４６４号
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｉ及びＧｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ他編、ＩＳＢＮ：７８１７０２５３４、１９９６年
【非特許文献２】Ｍｏｓｅｒ及びＳｃｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８、２００５年、ｐ．４−１０
【非特許文献３】Ｍ．Ｋｏｃｉ、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１８、２００５年、ｐ．１１−１６
【非特許文献４】Ｂａｘｅｎｄａｌｅ及びＭｅｂａｔｓｉｏｎ、Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３３、２００４年、ｐ．３６４−３７０
【非特許文献５】Ｋｏｃｉ及びＳｃｈｕｌｚ−Ｃｈｅｒｒｙ、Ａｖｉａｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３１、２００２年、ｐ．２１３−２２７
【非特許文献６】Ｉｍａｄａ他、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、２０００年、ｐ．８４８７−８４９３
【非特許文献７】Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ他、Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ、７ｔｈ Ｒｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＣＴＶ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００年
【非特許文献８】Ｊｉａｎｇ他、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、ｖｏｌ．９０、１９９３年、ｐ．１０５３９−１０５４３
【非特許文献９】Ｋｏｃｉ他、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、２０００年、ｐ．６１７３−６１７７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
驚くべきことに、腸及び運動器官疾患に罹患しているニワトリ及びシチメンチョウにおいて新しいウイルスが発見された。様々な齢、型及び起源の罹患鳥類の、関節及び腱の両方から、ならびに様々な内部器官から、このウイルスを単離することができた。この単離ウイルスは、同様に、健康な試験動物の感染時に疾患の同様の症状を誘導し、罹患試験動物から再単離することができ、それによりコッホの条件を満たした。
【００２５】
ウイルス及び家禽でそれが引き起こす疾患の問題、特に、関節及び腱の疾患ならびに胃腸管の疾患を検出及び治療するための、診断アッセイ及びワクチンを開発するために、この新しいウイルスを使用することができる。
【００２６】
この新規ウイルスを多くの方法で分析し、驚くべきことにアストロウイルスとして同定された。ニワトリ及びシチメンチョウにおけるその罹患率のため、これは鳥類アストロウイルスとして仮に認定される。
【００２７】
本明細書中に記載の新しいウイルスがエンベロープのないものであるという事実は、多くのその他の特性評価の中でも、クロロホルムでの２回の連続抽出を行い、その後、抽出されたウイルス試料が有胚ニワトリＳＰＦ卵において特異的な病原効果を依然として引き起こし得たという結果から得られた。
【００２８】
この新しいウイルスにおけるＲＮＡゲノムの存在は、さらなる分析に対して使用可能な核酸が、ＤＮＡ単離及び通常のＰＣＲ後ではなく、ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ後にのみ得ることができたという事実から示された。
【００２９】
驚くべきことに、最も近縁（まだ区別可能である）種は、ＡＮＶ１型のウイルスであることが分かり、従って本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスは、仮にＡＮＶ３ウイルスとして分類される、鳥類腎炎ウイルスの新規の群に相当する。
【００３０】
しかし、発明者らは、驚くべきことに、ＡＮＶ１及びその他の（アストロ）ウイルスから本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスを区別し、それ自身の新規の別個の群に属するものとして新規鳥類アストロウイルスの異なる分離株の特徴を独自に示す、多くの特性を見出した。
【００３１】
主要な特徴的性質は、ヌクレオチド配列分析により及びＰＣＲアッセイにより同定可能である特異的なヌクレオチド配列の存在に関する。
【００３２】
胚の感染時に誘発される別個の病的症状もまた観察された。特異的な免疫学的相違は、ＶＮ−又はＩＦＴ−アッセイを用いた血清型決定により検出可能であった。これら全ては、実験結果及び詳細とともに下記で述べる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、選択されたいくつかの本発明による鳥類アストロウイルスの分離株からのＯＲＦ１ａの一部分のｃＤＮＡ配列の多重アラインメントを示す。参照は分離株１９からの配列である。外側参照は、ＡＮＶ１参照ウイルスのゲノムのｃＤＮＡ配列の対応部（配列番号１）である。囲み付きの部分は、ＡＮＶ１ ＯＲＦ１ａに存在しない１２個のヌクレオチド領域を示す。
【図１−１】図１−１は、選択されたいくつかの本発明による鳥類アストロウイルスの分離株からのＯＲＦ１ａの一部分のｃＤＮＡ配列の多重アラインメントを示す。参照は分離株１９からの配列である。外側参照は、ＡＮＶ１参照ウイルスのゲノムのｃＤＮＡ配列の対応部（配列番号１）である。囲み付きの部分は、ＡＮＶ１ ＯＲＦ１ａに存在しない１２個のヌクレオチド領域を示す。
【図２】図２は、図１で列挙されるｃＤＮＡ配列のコンピュータ翻訳により作成された、推定アミノ酸配列の多重アラインメントを示す。囲み付きの部分は、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａによりコードされるタンパク質に存在しない４個のアミノ酸を示す。
【図３】図３は、図１で与えられるヌクレオチド配列アラインメントの結果の樹状図を示す。
【図４】図４は、本発明の鳥類アストロウイルスに特有である１２個のヌクレオチド領域（太字で表示）の位置に関する、プライマー配列番号３０及び３１のハイブリッド形成領域の図解である。
【図５】図５は、臭化エチジウム染色され、ＵＶ光で照射されたアガロースゲル（このゲル上でいくつかのｃＤＮＡ試料におけるプライマー配列番号３０及び３１を用いたＰＣＲアッセイ産物の電気泳動を行った。）の写真を示す。陽性ＰＣＲの予想産物であるおよそ２６０塩基対のバンドがレーン５でのみはっきりと見られた。配列番号３のプライマーを用いて、前進（ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ）ＲＴ反応を行った。 レーン１：陰性対照（ＰＣＲ反応においてｃＤＮＡなし）。 レーン２：未感染ニワトリからの肝臓ホモジェネート。 レーン３：ＡＮＶ１；１９９１のＧｅｒｍａｎ分離株、増幅１ｘＣＡＭ、４ｘ卵黄嚢、尿膜腔液を回収。 レーン４：ＣＡｓｔＶ２；番号ＣＮＣＭ Ｉ−２９３２でＣＮＣＭに寄託されたウイルス由来、尿膜腔液。 レーン５：本発明による鳥類アストロウイルスの分離株１９、尿膜腔液。 Ｍ：ＤＮＡサイズマーカーレーン：２００、４００、６００、８００、１０００ｂｐなどでのバンド。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、鳥類腎炎ウイルスのＯＲＦ１ａと比較した場合に、１２個のヌクレオチドの挿入物（この挿入物は、配列番号１のヌクレオチド番号２４８５及び２４８６に対応するヌクレオチドの間に位置する。）を含有することを特徴とする、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａゲノム領域を有する、単離新規鳥類アストロウイルスに関する。
【００３５】
好ましい「鳥類」生物は家禽であり；より好ましい鳥類生物は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル及びガチョウからなる群から選択される。最も好ましいのはニワトリである。
【００３６】
「アストロウイルス」という用語は、本発明による新しいウイルスの群の、アストロウイルス科の分類学的ファミリーに属しているものとして現在記載されている及び／又は分類されているウイルスに対する関係を示す。しかし、当業者は、新しい知見により、新しい又はその他の分類群への再分類が行われ得るので、このような分類学的分類が、時を経て変化し得ることを認識しよう。しかし、これは、本発明によるウイルスの特徴を変更せず、その分類のみが変更されるので、このような再分類生物は、本発明の範囲内に留まる。
【００３７】
特に、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスから亜種、株、分離株、遺伝子型、血清型、変異体又はサブタイプなどにさらに分類される全てのウイルスを包含する。
【００３８】
従って、本発明の場合、「アストロウイルス」とは、アストロウイルスとして分類されるウイルスの特徴的特性を有するウイルスである。このような特徴的特性は、例えば、分子生物学的、生化学的及び生物学的特性；例えば、１ａ、１ｂ及び２として同定可能なＯＲＦを含むプラスセンス１本鎖ＲＮＡゲノムを有すること；約２８−３０ｎｍのエンベロープのないビリオンであること；及び腸炎を引き起こすことに関する。
【００３９】
「ゲノム領域」という用語は、本発明による新規鳥類アストロウイルスの遺伝物質の一部を指すものとする。このような領域は、核酸からなり；本発明による新規鳥類アストロウイルスの場合、この核酸はＲＮＡである。
【００４０】
本発明による新規鳥類アストロウイルスのゲノムは、全てのその他のアストロウイルス科と同様に、ＯＲＦ１ａ、１ｂ及び２として認識可能であり、それに対応する領域を含む。
【００４１】
しかし、驚くべきことに、新規鳥類アストロウイルスが、そのＯＲＦ１ａゲノム領域において、ＡＮＶ１又は（鳥類）アストロウイルスの何らかのその他の型のＯＲＦ１ａには存在しないいくつかのヌクレオチドを有することが分かった。これらのヌクレオチドは、１２個のヌクレオチドの直線状及び連続的ストレッチの形態で存在し、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａ配列と比較した場合、この領域への挿入物に相当する。この１２個のヌクレオチド「挿入物」は、本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスの群の試験した全分離株のＯＲＦ１ａに存在した。
【００４２】
本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスの分離株のＯＲＦ１ａにおいてこの１２個のヌクレオチド挿入物が存在する場所は、Ｉｍａｄａら（２０００、Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７４、ｐ．８４８７−８４９３）により記載された、参照ＡＮＶ１株のゲノム配列に対して記載されるとおりの付番を参照することにより示される。このＡＮＶ１株のゲノム配列のｃＤＮＡ配列はまた、受入番号ＡＢ０３３９９８下でＧｅｎＢａｎｋとして知られるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈのインターネットのヌクレオチド−データベースからも利用可能であり、配列番号１として本明細書中で表される。
【００４３】
本発明による新規鳥類アストロウイルスの全分離株に対して、ＯＲＦ１ａのこの１２個のヌクレオチド挿入物は、配列番号１のヌクレオチド番号２４８５及び２４８６に対応するヌクレオチドの間にあった。
【００４４】
現在のところ、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａに存在しない本発明による新規鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａのこの１２個のヌクレオチド挿入物が、この新規鳥類アストロウイルスの挙動に影響するか否か、どのように影響するかは分かっていない。理論に縛られるものではないが、発明者らは、１２個のヌクレオチド、従って、ＯＲＦ１ａインタクトの翻訳フレームを維持する４個のトリプレットの挿入物が存在するという事実により、コードされる４個のさらなるアミノ酸がＯＲＦ１ａから発現される非構造タンパク質において組み込まれるようになるということを推測する。ウイルスの病態生物学的な挙動、例えばその毒性及びその、腸ならびに肢、関節及び腱の疾患を引き起こす能力にこれが影響する可能性は大いにある。
【００４５】
それにもかかわらず、これらの１２個のヌクレオチドが本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａゲノム領域に存在するが、ＡＮＶ１又はその他の（鳥類）アストロウイルスのＯＲＦ１ａには存在しないということから、ウイルスのこの新規群に対する陽性遺伝子マーカーがもたらされる。
【００４６】
当技術分野で周知のように、遺伝子マーカーは、生物の遺伝物質の特徴であり、ある一定のゲノム位置に存在し、これは、ある種の区別又は関係付けを行うために有用であり、技術的手段により検出可能である。この場合のように、同定しようとする群に特性が存在する場合、それは、その群に対する「陽性の」遺伝子マーカーである。
【００４７】
本発明による新規鳥類アストロウイルスの特徴である１２個のヌクレオチド挿入物のヌクレオチド配列は、本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスの全分離株に対して同一ではないが、大きさ及び位置は同一であった。この１２個のヌクレオチド挿入物のヌクレオチド配列のコンセンサスは、５’−ＴＣＹＧＧＤＭＡＲＹＹＴ−３’であり、配列番号２として本明細書中で表される。
【００４８】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、１２個のヌクレオチドの挿入物が配列番号２で与えられるような核酸配列を有することを特徴とする。
【００４９】
当業者は、配列番号２の配列がいわゆる「変性」プライマー配列であることを知っており、このことから、位置（ここで：Ｙ、Ｄ、Ｍ及びＲ）があり、ここで、多くのヌクレオチドのうち１つが存在し得ることが示される。変性塩基を示すための一般に使用されるコードはＩＵＰＡＣコードであり（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８５、ｖｏｌ．２２９、ｐ．２８１−２８６で公開）、ここで：Ｒ＝Ｇ又はＡ；Ｙ＝Ｔ又はＣ；Ｍ＝Ａ又はＣ；Ｋ＝Ｇ又はＴ；Ｓ＝Ｇ又はＣ；Ｗ＝Ａ又はＴ；Ｈ＝Ａ、Ｃ又はＴ；Ｂ＝Ｇ、Ｔ又はＣ；Ｖ＝Ｇ、Ｃ又はＡ；Ｄ＝Ｇ、Ａ又はＴ；及びＮ＝Ｇ、Ａ、Ｔ又はＣである。
【００５０】
本明細書中に記載の新規鳥類アストロウイルスに対して、この検出可能な遺伝子マーカーが存在することによって、例えばＤＮＡ配列決定又はＰＣＲを介して検出することにより、新規ウイルス及びその新規群の同定が可能となる。
【００５１】
ＤＮＡ配列決定は周知の技術であり、標準的プロトコール及び例えば高速自動配列決定のための装置は広く利用可能である。最も一般的には、このようなプロトコールは、ＰＣＲに基づく「サイクル−配列決定」と、それに続いく高解像度の電気泳動を使用する。
【００５２】
アストロウイルス科などのＲＮＡウイルスの核酸配列決定に対して、ＲＮＡ配列決定がまだ実行可能ではないので、調べようとする核酸は、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の形態である必要がある。ｃＤＮＡの調製に対して、多くの標準的プロトコール及び市販のキットが利用可能である。このようなプロトコールは、逆転写酵素を使用する。一般に、コピー作製プロセスを開始するためにプライマーが使用される。
【００５３】
ＲＴ反応のための適切なプライマーの例は、本明細書中で配列番号３として与えられるＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、５’−ＴＣＧ ＷＴＳ ＣＴＡ ＣＹＣ−３’である。発明者らは、このプライマーをプライマー１７と呼ぶ。
【００５４】
このプライマーは、多くの鳥類アストロウイルスのゲノムの遠く離れた３’領域とハイブリッド形成する（配列番号１のヌクレオチド番号６７３１に相当するヌクレオチドから始まり、逆方向に進む。）。
【００５５】
図１は、本発明による鳥類アストロウイルスの選択されたいくつかの分離株からの、ＯＲＦ１ａの一部分のｃＤＮＡ配列の多重アラインメントを示す。これらは、配列番号１で表されるようなＡＮＶ１参照ウイルスのゲノムの対応部分と並べられる。囲みのある領域で明らかに見られるように、全ての分離株は、ＡＮＶ１ ＯＲＦ１ａには存在しない１２個のヌクレオチド領域を保持する。本発明による鳥類アストロウイルスの分離株のＯＲＦ１ａ ｃＤＮＡ配列の配列番号は表１で列挙する。
【００５６】
同様に、図２は、図１で列挙されるｃＤＮＡ配列のコンピュータ翻訳により作製されるような推定アミノ酸配列の多重アラインメントを示す。囲みのある領域で明らかに見られるように、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａによりコードされるタンパク質は、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａによりコードされるタンパク質には存在しない４個のアミノ酸を含有する。本発明による鳥類アストロウイルスの分離株の翻訳ＯＲＦ１ａ配列の配列番号を表１で列挙する。
【００５７】
本発明による鳥類アストロウイルスの分離株に関して：上述のような肢及び／又は腸疾患に罹患しているニワトリ及びシチメンチョウから、長期間にわたり多数の野生分離株を回収した。これらの分離株のうち、多くを分析し、これが、本明細書中に記載のような鳥類アストロウイルスの新規群の発見に繋がった。しかし、その群で生じる天然の変異に関して新規鳥類アストロウイルスを定義するために、分析した全分離株のうち選択したもののみを本明細書中で示す。
【００５８】
表１は、本明細書中に記載の本発明による鳥類アストロウイルスの分離株の説明を与える。また、表１で、分離株のうち選択されたもの由来のＯＲＦ１ａ、１ｂ及び２からのｃＤＮＡ及び推定タンパク質配列の配列番号を列挙する。
【００５９】
【表１】
【００６０】
本発明による鳥類アストロウイルスの分離株は、１以上の器官から又は肢の関節もしくは腱からの試料を採取することによって、腸又は肢の問題がある鳥類から得ることができる。必要に応じてこの試料をホモジェナイズ処理し、例えば、適切な緩衝液、好ましくは抗生物質を含有する緩衝液と混合することができる。
【００６１】
このような分離株のウイルス力価を増幅するために、鳥類細胞株又は有胚鳥類卵などの様々な基質を使用することができる。卵を使用する場合、縣濁液を有胚鳥類卵に接種し、そこで培養することができる。漿尿膜（ＣＡＭ）において又は卵黄嚢への又は尿膜液腔へなど、様々な接種経路が可能である。好ましくは、接種の最初の数ラウンドは卵黄嚢に対して行い、以降の接種は（必要に応じて）、尿膜に行い得る。約５−７日有胚ニワトリＳＰＦ卵を使用することができる。このような技術は、全て、当業者にとって周知であり、適切な質及び齢のＳＰＦニワトリ卵は、例えばＳｐａｆａｓ（Ｒ）又はＬｏｈｍａｎｎ（Ｒ）から市販されている。
【００６２】
適切な条件下で２−７日間温置した後、胚、ＣＡＭ又は（好ましくは）尿膜腔液を回収し得る。必要に応じて、卵黄嚢又は尿膜腔液への接種により、卵での増幅のさらなるラウンドを行い得る。最後に、大量の本発明による鳥類アストロウイルスを含有する尿膜腔液を回収し得る。
【００６３】
ＯＲＦ１ａの代表的部分の両鎖のＰＣＲ配列決定のために、次のプライマーを都合よく使用することができる：
配列番号２８：５’−ＡＡＡ ＧＧＫ ＡＡＧ ＡＣＤ ＡＡＧ ＡＲＲ ＲＡＣ ＭＧ−３’及び
配列番号２９：５’−ＴＣＧ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＡＧＧ ＴＣＴ ＴＣＡ−３’。
【００６４】
発明者らは、これらの配列決定プライマーをそれぞれプライマー、Ｆ−ＩＩ及びＲ−ＩＩ−３と呼ぶ。配列番号２８は、ｎｔ２１７１に対応するヌクレオチドから始まるさらに先の部分とハイブリッド形成し（配列番号１）；配列番号２９は、配列番号１のｎｔ２６４０から始まり逆方向に進むヌクレオチドとハイブリッド形成する（表４参照）。このようにして、ＡＮＶ１に存在しない１２個のヌクレオチドを含む本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａのゲノム領域が、配列決定されるＯＲＦ１ａの部分によりカバーされる。
【００６５】
決定されたＤＮＡ配列のコンピュータ分析のために、これらは、プライマーそれ自身から、変性配列を含有しないようにトリミングされる。また、比較される配列は、代表的アラインメントを達成するために、同等な長さである必要がある。また、切り取られた配列の全長にわたりこのアラインメントが行われるべきである。これは、例えば、プライマー配列番号２８及び２９を使用する場合において、比較しようとする配列の長さが約４００−４２５ヌクレオチドであることを意味する。
【００６６】
このような操作及びアラインメントの都合の良いコンピュータプログラムは、ＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒＴＭ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ ＥｄｕｃａｔｉｏｎａｌソフトウェアＴＭによる。）であり、あるいは、多重アラインメントに対してインターネット：「ＣｌｕｓｔａｌＷ」及び翻訳に対して「Ｔｒａｎｓｌａｔｅ」を介して（両者とも、ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇでアクセス可能）又はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖの「Ｂｌａｓｔ」プログラムを介して利用可能である。好ましくは、初期設定スコアリングパラメータを使用する。
【００６７】
本発明による鳥類アストロウイルスの多くの分離株に対して、プライマー配列番号２８及び２９を用いてｃＤＮＡ配列決定を行った。結果として得られるトリミング処理済みヌクレオチド配列のうち選択されたものを、表１で表されるように、配列番号４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６におけるものとして本明細書中で与える。
【００６８】
参照として１６１３１９と付番されたニワトリからのある分離株（発明者らはこれを「分離株１９と呼ぶ。」の配列を用いて、これらの配列を互いに整列（アライン）させた。また、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能なその他のアストロウイルスからのＯＲＦ１ａの対応部分のいくつかのＤＮＡ配列を整列（アライン）させた：例えばＡＮＶ１（ＡＢ０３３９９８、配列番号１）、シチメンチョウアストロウイルス１（ＴＡｓｔＶ１）（Ｙ１５９３６）、シチメンチョウアストロウイルス２（ＡＦ２０６６６３）、ヒツジアストロウイルス（Ｙ１５９３７）、ミンクアストロウイルス（ＡＹ１７９５０９）及びヒトアストロウイルス（Ｚ２５７７１）；ハイフンの間は、個々のＧｅｎＢａｎｋ受入番号である。
【００６９】
これらのその他のアストロウイルスＯＲＦ１ａ配列のうち、ＡＮＶ１のみが、特に配列番号１からのｎｔ２２１３−２６０７の部分で、有意であった配列同一性を有した（これは、５０％を優に越えるヌクレオチド配列同一性％を意味する。）。残りのその他のアストロウイルスのうち、ＴＡｓｔＶ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｙ１５９３６）のみが、ヌクレオチド番号２４５０−２８５６の一部において検出可能な配列同一性があったが、これはあまり顕著ではなかった。これを表２で表す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
これらのヌクレオチド配列アラインメントの結果の樹状図を図３で示す。
【００７２】
従って、驚くべきことに、本発明による新規鳥類アストロウイルス群は、全てのその他のアストロウイルス、鳥類又は哺乳類とは距離を置いていることが分かった（配列番号４に対応するＯＲＦ１ａ ＤＮＡ配列の領域と比較した場合、それらは８８％以上のヌクレオチド配列同一性を有する。）。
【００７３】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一性を有する領域を含むことを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスに関する。
【００７４】
より好ましくは、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、配列番号４と少なくとも８９％のヌクレオチド配列同一性、さらにより好ましくは９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％（好ましい順に）の同一性を有する領域を含むことを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスに関する。
【００７５】
配列番号４の次に、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６で記載される部分的ＯＲＦ１ａヌクレオチド配列の何れか１つは、さらなる好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスの特徴を明らかにするために役立ち得る。
【００７６】
表２で与えられるようなＯＲＦ１ａからのヌクレオチド配列の多重アラインメントと同様に、表２のトリミング済み核酸配列、配列番号４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４及び２６からの推定アミノ酸配列のアラインメントを行うことができる。コンピュータにより翻訳された得られるアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号５、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７として与えられる。参照配列は、配列番号５、分離株１９のＯＲＦ１ａの一部の推定アミノ酸配列である。配列番号５の全長にわたり整列（アライン）させて、Ａｌｉｇｎ＋プログラムを用いてアラインメントをまた行った。結果を表３で与える。
【００７７】
【表３】
【００７８】
詳細なアミノ酸アラインメントを図２で表す。
【００７９】
このアミノ酸配列分析の結果は、表２の結果と同等の結果を示し、本発明による鳥類アストロウイルスの分離株からのアミノ酸配列は、その他の鳥類アストロウイルスと比較した場合より、それら自身の中で関連性が高い。配列番号５に対する本発明による鳥類アストロウイルスの様々な分離株のアミノ酸配列の同一性％は９３から９９％の間であり、一方、ＡＮＶ１に対する同一性は８８％とより低い。
【００８０】
従って、好ましい実施形態において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有する領域を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスに関する。
【００８１】
より好ましくは、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、配列番号５と少なくとも９４％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性（望ましい順）を有する領域を含むアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスに関する。
【００８２】
配列番号５の次に、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７で記載される部分的ＯＲＦ１ａ推定翻訳ヌクレオチド配列の何れか１つは、さらなる好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスの特徴を明らかにするために役立ち得る。
【００８３】
ヌクレオチド配列決定及びアラインメントに加えて、本発明による鳥類アストロウイルスの陽性遺伝子マーカーは、例えば腸又は運動器官疾患に罹患している鳥類からの試料において、ＡＮＶ１のＯＲＦ１ａには存在しない、本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａ領域における１２個のヌクレオチドの存在を検出するためのＰＣＲ試験を用いることにより、同定することができる。
【００８４】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスは、配列番号３０及び３１で表されるプライマーのセットを用いたＰＣＲアッセイにおいて、その鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａから、約２６０ヌクレオチドのＰＣＲ産物が生じ得ることを特徴とする。
【００８５】
使用すべきＰＣＲプライマーは、
配列番号３０：５’−ＧＴＹ ＣＴＹ ＡＣＣ ＧＡＲ ＧＡＲ ＧＡＲ ＴＡＹ Ｃ−３’
配列番号３１：５’−ＡＡＤ ＧＴＴ ＡＴＹ ＣＴＣ ＣＴＡ ＲＧＢ ＴＫＨ Ｃ−３’である。
【００８６】
発明者らは、これらのプライマーをそれぞれプライマー２９及び３０と呼ぶ。これらのプライマーは、ＡＮＶ１（配列番号１）ヌクレオチド番号２２５２以降に対応するヌクレオチドとハイブリッド形成し、ヌクレオチド番号２４９９から逆方向に進むものとハイブリッド形成する。
【００８７】
生成されたＰＣＲ産物は、約２６０ヌクレオチドのバンドとしてゲル上で見ることができる（これは、プライマーそれら自身の長さを含んでいる。）。このバンドは、出発物質が本発明による鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａ領域を含むＤＮＡを含有する場合のみ、生成されるが、これは、ただ、これらが、ＡＮＶ１ ＯＲＦ１ａには存在しない１２個のヌクレオチドを含むからである。１２個のヌクレオチド領域の位置に関する、プライマー配列番号３０及び３１の特異的結合の図解を図４で与える。
【００８８】
このようなＰＣＲアッセイにおいて、特異性及び感度は、使用される特異的ＰＣＲプライマーにより、特にプライマーの配列及び長さにより、決定される。次に、当業者にとって周知であるように、温度及び反応段階の時間などの反応及びサイクリング条件を適応させることによって、選択性及び感度の最適化を達成することができる。
【００８９】
これら及びその他の分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ、ＮＹ、２００３、ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）；Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：「ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０８７９６９６５４０）；及び「ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」：Ｊ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ及びＤ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）のような標準的教科書で詳述されている。
【００９０】
都合良く、ｃＤＮＡを生成させるために必要なＲＴ反応にプライマー配列番号３０及び３１を用いたＰＣＲ反応を組み合わせ、これに直接従い；実施例に記載のように、組み合わせアッセイをＲＴ−ＰＣＲアッセイにする。
【００９１】
記載のようなＲＴ−ＰＣＲアッセイが発明者らにより様々な試料に適用され；本発明による新規鳥類アストロウイルスの分離株の試料を用いて、陽性の結果が得られ；「陽性」ＰＣＲの結果は、適切な陽性及び陰性対照試料に関連して、電気泳動後におよそ２６０塩基対の反応産物が見られるというものである。しかし、関連する鳥類アストロウイルスＡＮＶ１及びニワトリアストロウイルス２（ＣＡｓｔＶ２）から調製されるＲＴ−ＰＣＲ試料は、一貫して配列番号３０及び３１のプライマーを用いたＰＣＲにおいて陰性であることが分かった。
【００９２】
このようなＰＣＲ試験結果の例は図５で表すが、これは、臭化エチジウム染色、ＵＶ光照射、アガロースゲル（このゲル上で、プライマー配列番号３０及び３１を用いたＰＣＲのＰＣＲ産物を流した。）の写真を示す。分離株１９の試料のみが陽性反応を示し、陰性対照と同じように、ＡＮＶ１又はＣＡｓｔＶ２を含有する試料は陰性であった。
【００９３】
驚くべきことに、本発明による鳥類アストロウイルスでの有胚鳥類卵の感染及び温置時に非常に顕著で著しい病理学的効果が観察され：疾患に冒された胚は、肢及び翼端が鮮赤色になった。これは以前に観察又は記載されたことはなかった。さらに、感染した胚は、その他のしかしそれほど特徴的ではない特性：全身的に薄赤色になり、腹部の浮腫及び肝臓の著しい腫脹を示し、暗赤／紫色の変色が見られた。
【００９４】
この特異的病理は、有胚ＳＰＦニワトリ卵の感染から約２−７日後に観察され、接種されたウイルス力価に依存して、殆ど必ず、胚の死亡を招いた。
【００９５】
比較のために、同様の試験条件を用いて、有胚卵へのＡＮＶ１の接種を同時に行った。ＡＮＶ１もまた、肝臓の腫脹を誘発したが、この場合、肝臓はさらに暗い色で、胚の全体的な色は暗赤色となった。しかし、ＡＮＶ１は、本発明による鳥類アストロウイルスの分離株に対して見られた肢及び翼端の特異的な鮮赤色を誘発しなかった。
【００９６】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスは、約５−７日有胚ニワトリＳＰＦ卵に接種し、続いて２−７日間又は必要に応じてそれより長い温置を行った際に、ニワトリ胚の翼端の赤色変化を誘発することができることを特徴とする。
【００９７】
記載のように、有胚ＳＰＦニワトリ卵及びそれらの温置のための装置が市販されている。通常、有胚ニワトリ卵の温置は、加湿雰囲気の孵化器中、約３５−３９℃で行われる。
【００９８】
接種は、例えば、ＣＡＭ、卵黄嚢又は尿膜経路など、何らかの都合の良い経路によるものであり得る。
【００９９】
当業者が認めるように、例えば接種されたウイルス量が非常に少ない（ウイルスの「取り込み」ができない）かもしくは非常に多い（変色が起こり得る前に死亡）か、又は胚の質がウイルス複製を可能とするのに十分ではないという偶発的な例において、肢及び翼端の特異的な鮮赤色の変色を見ることができない場合があり得る。一般に、この特異的な鮮赤色の変色は、約１０から約１０＾６ＥＩＤ５０／卵（ＥＩＤ５０＝卵感染性用量５０％）の間の接種時に観察され得る。
【０１００】
参照試料として使用し、寄託するために、分離株１９と命名された本発明による鳥類アストロウイルスのある特定の分離株をさらに精製し増幅させた。ニワトリ胚肝臓（ＣＥＬ）細胞での限界希釈により、この分離株を精製した。各時点で、ＣＥＬ細胞においてｃｐｅを依然として誘発する最大希釈物を継代した。次に、有胚ＳＰＦニワトリ卵の尿膜腔における３ラウンドのウイルス増幅によりこの精製ウイルスを増幅した。尿膜腔液を回収し、凍結保存した。有胚ニワトリＳＰＦ卵においてこの精製ウイルスの滴定を行い、６．１Ｌｏｇ１０ ＥＩＤ５０／ｍＬの力価を有することが分かった。この材料を標準的安定化緩衝液中で凍結乾燥させ、−２０℃で保存した。無菌であることを確認した。次に、このウイルス材料の試料をＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅの「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ」（ＣＮＣＭ）に、ＣＮＣＭ Ｉ−３８９５の寄託番号で２００８年１月２３日に寄託した。
【０１０１】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明による鳥類アストロウイルスは、番号ＣＮＣＭ Ｉ−３８９５でＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託したようなウイルスである。
【０１０２】
精製し、増幅し、寄託した試料は、「分離株１９」という名称の分離株であったが、しかし、表１に記載の本発明による鳥類アストロウイルスの分離株の何れか１つを本発明による鳥類アストロウイルスの新規群に対する参照試料として使用することができる。
【０１０３】
インビトロ培養に対して及び本発明による鳥類アストロウイルスの試験に対して、いくつかの培養系を使用することができ、例えば（鳥類）細胞株（ＣＥＬ又はニワトリ胚腎臓（ＣＥＫ）細胞のような初代細胞）が有利に使用され得る。有胚ニワトリＳＰＦ卵からのＣＥＬ又はＣＥＫ細胞培養の調製は当業者にとって周知である。
【０１０４】
特に、ＣＥＫ細胞は、ウイルス増殖を監視し、ウイルス量及び生存能を測定するために非常に適している。本発明による鳥類アストロウイルスがこれらの細胞で生じさせる細胞変性効果（ｃｐｅ）が不規則であるとしても、感染細胞は、単層から丸まり、細胞溶解へと進む球形の細胞として明確に見ることができる。
【０１０５】
従って、ウイルス試料の連続希釈及びｃｐｅを依然として引き起こす最大ウイルス希釈物のスコア化を用いて、ウイルス滴定アッセイを考案することができる。次に、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（Ｄ．Ｆｉｎｎｅｙ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ、Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ ＆ Ｃｏ．、Ｌｏｎｄｅｎ、ＩＳＢＮ０１９５２０５６７７に記載）により計算した場合の組織培養感染用量５０％（ＴＣＩ５０）／ｍＬとしてウイルス力価を表すことができる。このような技術は全て当業者にとって周知である。
【０１０６】
このようにして、様々な試験及び目的に対して、本ウイルスを組織培養フラスコ又はマイクロタイタープレートで培養することができる。一般に、ウイルス試験又は滴定での使用前に、細胞上で数回の継代を行うことにより、野外から分離されたウイルスをこのような細胞上でのインビトロ培養に最初に適応させることは有利である。
【０１０７】
あるいは、有胚卵、好ましくはニワトリＳＰＦ卵において、試験及び滴定を行うことができる。６日有胚ＳＰＦニワトリ卵の卵黄嚢への希釈率漸増ウイルス試料の接種により、例えばウイルス滴定を行うことができる。感染したか又は死亡した胚の数をスコア化した後、例えばＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（前出）を用いて、試験試料の得られた力価をＥＩＤ５０／ｍＬで表すことができる。
【０１０８】
寄託ウイルスに対して、多くの実験的試験ニワトリにおいて、実験室条件下で、孵化したニワトリ及びシチメンチョウに対して病変を引き起こすその能力を確認した。複数経路：筋肉内、経口及び眼を介して接種を行った。接種されたニワトリののうち数羽が、疾患の重篤な徴候を発現し、一方で、擬似感染ニワトリは症状がなかった。観察された症状は、死亡、全身的機能低下及び軽度から重度の下痢であった。組織病理学において、腎炎及び腸炎が観察された。肢又は関節の疾患は観察されなかったが、これらの実験に対して使用されたニワトリは幼若すぎるか（３−６週）及び／又はこのような問題が顕在化するには十分に重くはなかったので（産卵ＳＰＦニワトリ）、これらの疾患はまた予想され得なかった。
【０１０９】
さらなる特性評価：ＯＲＦ１ｂ及びＯＲＦ２のために、寄託ウイルスのうち、ゲノムのさらなる領域のヌクレオチド配列を本明細書中で与える。個々のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を配列番号５−８として本明細書中で与える（表１参照）。
【０１１０】
これらのさらなるヌクレオチド配列を決定するために使用された様々なプライマーを配列番号３２−３４として本明細書中で与え、表４で記載し；便宜上これらの表には、本明細書中に記載のその他のＰＣＲ−及び配列決定プライマーも含まれる。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
参照として寄託ウイルス試料を用いた、本発明による鳥類アストロウイルスのさらなる特性評価を行うためのさらなる方法は、血清型決定により、好ましくはＶＮ−又はＩＦＴ−アッセイを用いることにより、その免疫学的特性を決定することによるものである。
【０１１３】
全ての試験において、様々なその他の鳥類ウイルス：レオウイルス、家禽アデノウイルス（１、２、４、５及び８型）、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、鳥類エンテロウイルス（分離株１８２１／９及びＦＰ３）、産卵低下症候群及び鳥類インフルエンザウイルスに特異的な抗体により中和され得ず、この抗体と特異的に結合しなかったので、本新規鳥類アストロウイルスは、その他の鳥類ウイルスとは免疫学的に別個のものであることが証明された。これはまた、鳥類アストロウイルス、ＡＮＶ１又はＣＡｓｔＶ２に特異的な抗体に対する場合も当てはまり、一方で、これらの血清は、それらのドナーウイルス：ＡＮＶ１及びＣＡｓｔＶ２をそれぞれ、最大１：６４０又は１：１０２４０の希釈率で、効果的に中和した。
【０１１４】
しかし、寄託分離株１９ウイルスの試料は、分離株１９ウイルスを実験的に感染させたＳＰＦニワトリにおいて分離株１９に対して作製されたニワトリ抗血清により効果的及び選択的に中和された。免疫促進接種を行った後、特異的抗血清を得ることができた。このアッセイでのウイルス中和に対して使用された読み出し情報は、中和による胚の病状の阻止であった。
【０１１５】
特異的抗体のみが本発明による鳥類アストロウイルスを認識し、中和したという免疫学的実験の結果から、これらのウイルスが新規の特有なウイルス血清型に属することが明らかとなる。
【０１１６】
これは、例えばさらに好ましい実施形態において実施され得、この場合、本発明による鳥類アストロウイルスは、ウイルス中和アッセイにおいて、Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に、番号ＣＮＣＭ Ｉ−３８９５のもと寄託されたようなアストロウイルスの試料に対する抗体によって中和され得ることを特徴とする。
【０１１７】
本発明による寄託ウイルスを用いた抗体の作製に対する代替的アプローチもまた可能である。例えば、本発明による鳥類アストロウイルスである（それ由来である）ことについて調べようとするウイルス−試料は、それ自身、抗体を誘導するために使用され得、次に、本発明による鳥類アストロウイルスへの抗体の結合又はさらに中和能について抗体を同様に試験し得る。都合良く、このような抗体は、本発明による寄託ウイルスの試料において試験することができる。
【０１１８】
この目的に対して、試験ウイルス又はその断片もしくは調製物を動物に接種することができる。このような抗体の作製のために使用される動物は、原理的に、あらゆる動物であり得るが、しかし好ましくはマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ又はニワトリが使用される。例えば都合良く本発明による寄託ウイルスの試料をＣＮＣＭに注文することによって、本発明による鳥類アストロウイルスに対する結合又は中和について、このようにして作製される抗体を試験することができる。これを例えば卵、ＣＥＫ又はＣＥＬ細胞又はその他の基質で培養し、最終的に試験ウイルス試料を用いて作製された抗体と温置し得る。例えばＩＦＴ又はＶＮアッセイによって、抗体結合の検出を行うことができる。
【０１１９】
従って、これは、本発明による鳥類アストロウイルスであるか又はそれ由来であるような、生もしくは不活性化ウイルス又はそれらの断片もしくは調製物の同定及び特性評価のための方法を構成する。
【０１２０】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明は、ＶＮアッセイにおいて本発明による寄託アストロウイルスの試料を中和することができる抗体を誘導することができることを特徴とする、本発明による鳥類アストロウイルスを提供する。
【０１２１】
ＶＮアッセイを設定するためのプロトコールは当技術分野で周知であり、当業者の通常の能力の範囲内である。ＶＮアッセイに対する選択及び詳細は上記で記載されている。
【０１２２】
本発明による鳥類アストロウイルスに特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイの結果から明らかなように、本発明はまた、本発明による鳥類アストロウイルスに結合することができ、中和することができる抗体も提供する。
【０１２３】
従って、本発明のその他の態様は、ウイルス中和アッセイにおいて本発明による鳥類アストロウイルスを中和することができる抗体又はその断片である。
【０１２４】
本発明によるこのような抗体は、当業者にとって全て周知であり利用可能な様々な方法において取得及び産生され得る。例えばこの抗体は、上述のような（反復）接種によって実験動物において産生され得る。
【０１２５】
あるいは、ハイブリドーマ技術におけるように、不死化Ｂ−リンパ球細胞により抗体が産生され得る。古典的ハイブリドーマ技術に対して現在、技術が向上したことにより、例えば融合前に所望の脾臓細胞の量を向上させることによって、正の選択（パニング）とそれに続くサイトカイン混合物との培養での増殖によって、この技術はより効率的及び高生産性になった。また、古典的なポリエチレングリコール融合から電気融合に変更することによって、融合技術も向上した。
【０１２６】
さらなる代替的アプローチにおいて、分子生物学的技術の使用及び組み換え発現系での発現を通じて、抗体を得ることができる。分子生物学的技術により、治療しようとする標的種からの抗体の特徴によりよく合致させるためのこのような抗体の適応又は異なる特異性を有する２つの結合領域を有する抗体の設計が可能となる。発現系の開発によって、植物での発現など、大量発現系発現系の設定が可能となる。
【０１２７】
組み換え発現系もまた当技術分野で周知であり、例えば、細菌（例えば大腸菌（エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）など）、酵母（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））、昆虫（スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）、トリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ））、哺乳動物（例えばチャイニーズハムスター卵巣）又は植物（タバコ、ジャガイモなど）細胞を使用する。発現させようとする異種配列を有する発現コンストラクトでこれらの細胞を形質転換し得る。また、発現させようとする核酸を含む組み換え微生物を用いた複合系が知られており、ここで、微生物は、所望のタンパク質を所望の規模でインビトロで産生させるために細胞上で培養し得る。一例として、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系が挙げられる。最後に、いわゆる細胞不含発現系が、適切な組み換えＤＮＡ分子の細胞不含発現のために市販されている。
【０１２８】
「抗体又はその断片」という用語は、両方の完全な免疫グロブリン分子又はその一部が本発明による抗体の範囲内であるとみなされることを示すものとする。本発明による抗体の断片は、本発明による鳥類アストロウイルスのエピトープに依然として結合し得るタンパク質分子である。例としては、ＦＡＢ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ又はＦｄ断片（全て当技術分野で周知である。）が挙げられる。
【０１２９】
このような断片は、例えば化学的又は酵素消化により、無傷の抗体から得られ得る。あるいは、このような断片は、例えば、組み換え発現系、例えばファージディスプレイ系から得られ得る。
【０１３０】
当業者にとって周知であるように、ウイルスへの抗体又はその断片の結合は、ウイルス粒子におけるエピトープの認識を包含する。殆どの場合、これらのエピトープは、ウイルス粒子上で提示される分子の直線状又は三次元配置により形成される。結果として、これらの調製物又は断片が依然として正しい形態の正しいエピトープを含有し、提示する限り、ウイルス又はその断片の調製物は、本発明による抗体又はその断片により結合され得る。本発明による鳥類アストロウイルスの場合、免疫系に最も顕著に提示されるウイルスタンパク質は、ＯＲＦ２からコードされるキャプシドタンパク質である。
【０１３１】
当業者にとってまた当然のことながら、本発明による抗体が動物の接種を介して作製される場合、得られる動物血清はポリクローナル抗血清であり、これは、抗血清が、多岐にわたるエピトープに結合し得る抗体の混合物を含有することを意味する。実際には、これは多重結合をもたらし、よって、これらが、無傷の生ウイルス粒子において通常利用可能である全てのエピトープを保持し得ないか又は正しく提示し得ないとしても、ウイルスタンパク質の調製物又は断片の効率的な結合が可能になる。
【０１３２】
あるいは、本発明による抗体は、例えばハイブリドーマ技術により作製されるように、モノクローナル抗体であり得るか又は本発明による抗体は、Ｆａｂ断片などの抗体断片であり得る。この場合、本抗体又は断片は、それが通常は単一エピトープに特異的に結合するのみであるので、様々なエピトープを認識する能力が非常に低下している。その結果として、この特定のエピトープが存在しないか又はウイルス断片又は調製物上で提示されない場合、これは、このようなモノクローナル抗体又は抗体断片が全く結合し得ない。
【０１３３】
本発明による鳥類アストロウイルスの特性評価のために、診断のために、治療のために及び／又は品質保証目的のために、様々な方法で本発明による抗体を使用することができる。
【０１３４】
本発明は、工業規模での本発明による鳥類アストロウイルスの作製を提供する。これは、インビボ又はインビトロ系で、宿主細胞においてこのウイルスを培養することにより達成され得る。インビトロ系は、初代又は不死化細胞株を含む。初代細胞の例は、ＣＥＫ又はＣＥＬ細胞である。不死化細胞株の例はＬＭＨ細胞株である（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．４７、ｐ．４４６０−４４６４）。インビボ系の例は、有胚鳥類卵で又は接種済み鳥類での培養である。特に、細胞又は卵での培養は都合良く規模を拡大することができ；例えば細胞培養をフラスコ、ローラーボトル又はさらには発酵槽などの様々な大きさの容器で維持することができる。あらゆる規模の細胞培養技術のための技術及び装置が周知であり、市販業者から容易に入手可能である。
【０１３５】
従って、本発明は、さらなる態様において、本発明による鳥類アストロウイルスを感染させた宿主細胞を提供する。
【０１３６】
また、本発明は、適切な系における本発明による鳥類アストロウイルスの増殖及びウイルス材料を回収することを含む、本発明による鳥類アストロウイルスを産生させる方法を提供する。
【０１３７】
本発明による鳥類アストロウイルスの本明細書中に記載の特性評価は、無傷の複製可能な形態のこのような鳥類アストロウイルスを単に指すだけではない。当業者が認識するように、本発明は、多くの様々な形態のこのウイルスの調製物を提供する。これらには、例えば、本発明による鳥類アストロウイルスが不活性化されている調製物又はこのようなウイルスが、例えば抽出、溶解、消化、ホモジェナイズ処理又は超音波処理によって、１以上の方法で（生物）化学的又は物理的に断片化されている調製物が含まれる。
【０１３８】
ウイルスを不活性化するための方法は周知であり、例えば、ホルマリン、β−エタノールイミン又はβ−プロピオラクトン；また加熱及びＵＶ光、Ｘ線又は放射活性放射線での照射による不活性化など、化学的又は物理的不活性化を含む。
【０１３９】
断片化のための方法もまた、例えば抽出又はＴｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘ−１００など界面活性剤での溶解；トリプシンでの消化；凍結融解又は加圧型細胞破壊装置によるホモジェナイズ処理；又は超音波による超音波処理など、数多く知られている。
【０１４０】
このような調製物の出発材料は、精製された（生又は不活性化）本発明による鳥類アストロウイルスと、それだけでなく本発明による宿主細胞又は、本発明による宿主細胞もしくは鳥類アストロウイルスを含む細胞培養物もしくはその一部であり得る。例えばこのような細胞培養物の一部は、遠心した細胞培養物の上清又はペレットであり得る。明らかに、これらの細胞培養物又はその一部は、それら自身、記載のような抽出物、溶解物、消化物、ホモジェネート又は超音波処理物などの調製物へ変換され得る。
【０１４１】
本発明による鳥類アストロウイルスのこのような調製物は、本発明による鳥類アストロウイルスの１以上の抗原及びエピトープを含有する。
【０１４２】
従って、さらなる態様において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスから取得可能な抗原性調製物に関する。
【０１４３】
本発明による抗原性調製物は、本発明による抗体又はその一部により結合され得るか又はそれ自身、結合もしくは中和抗体又はその一部を誘発するために使用され得る。これは、下記に記載のように、ワクチン及び診断において有利に適用され得る。
【０１４４】
本発明による抗原性調製物は、例えば、本発明による鳥類アストロウイルスからのタンパク質又はこのようなタンパク質の一部である。これらのタンパク質又はその一部は、このようなウイルスからの単離により得ることができる。しかし、これらのタンパク質又はその一部は、都合良く、本発明による鳥類アストロウイルスからの核酸を用いて、組み換えＤＮＡ発現技術によっても作製され得る。例えば、配列番号４、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４又は２６の何れか１つで記載されるようなＯＲＦ１ａ領域の一部の核酸配列が使用され得；記載のように、これらのｃＤＮＡ配列は、配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一をそれらが有することに関連する。
【０１４５】
従って、本発明は、さらなる態様において、配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一性を有する領域を含むＤＮＡ分子を提供する。
【０１４６】
また、ＯＲＦ１ｂ又はＯＲＦ２の核酸は配列番号６又は８に記載のように使用され得る。
【０１４７】
このような核酸配列及びｃＤＮＡ断片は、当技術分野で周知のＤＮＡ技術を用いて、例えばさらなる操作のための組み換えＤＮＡ分子へのサブクローニングにより、クローニングされ、発現され得る。組み換えＤＮＡ分子は、細菌プラスミドなどのベクターであり得る。好ましくは、本発明による鳥類アストロウイルスからの核酸は、適切な宿主細胞又は発現系でのその発現を可能にするプロモーターなどの発現調節配列に操作可能に連結される。あるいは、本核酸、ｃＤＮＡ又は組み換えＤＮＡ分子は、細菌又はウイルスなどの生きている組み換え担体微生物に導入され得る。
【０１４８】
同様に、配列番号５、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７及びそれらの関連物に記載の推定アミノ酸配列に基づき、本発明は、さらなる態様において、配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有する領域を含むタンパク質を提供する。
【０１４９】
これらの実施形態は、下記に記載のようにワクチン及び診断の応用において非常に実用的で有利な有益性を有する。
【０１５０】
ウイルスなどの生又は不活性化微生物病原体から又はこのような微生物の断片から、ワクチンを調製することができる。このような微生物は、一般に、細胞、器官又は組織、有胚卵上で又は宿主動物において温置することによって、より小さいか又はより大きい体積で工業的に産生される。微生物を含む縣濁液を回収した後、ワクチンへとこの縣濁液を処方し、最終製品を包装する。品質、量及び無菌性に対する大規模な試験の後、このようなワクチン製品を販売開始する。
【０１５１】
ワクチン学における一般的な技術及び検討事項は当技術分野で周知であり、例えば政府規制において及び「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編、１９９７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ＩＳＢＮ：０４４４８１９６８１）及び「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ」（２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ、ＵＳＡ、ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）などのハンドブックにおいて記載されている。
【０１５２】
ワクチンは、当技術分野で、医薬的に許容可能な担体中に免疫原性化合物を含む医薬組成物を表すことが一般に知られている。免疫原性化合物は、標的の免疫系の活性化を誘導することができる、生又は不活性化微生物又はそれらのサブユニットである。
【０１５３】
驚くべきことに、本発明による鳥類アストロウイルス及び抗原性調製物、宿主細胞、抗体、核酸、タンパク質ならびにそれらの調製、培養、同定及び定量のための方法が、ワクチンにおいて又は診断目的に対して適用され得ることが分かった。このようなワクチンは、鳥類アストロウイルスによる感染から標的動物を保護するために又はこのウイルスの複製もしくはそれが引き起こす疾患の症状を軽減するために役立つ。このような診断アッセイにより、例えば動物の現地試料又はウイルス調製物におけるウイルス又はその抗原の検出が可能になる。
【０１５４】
ワクチン及び診断薬を組み合わせることで、本発明による鳥類アストロウイルスによる感染及び／又は疾患に対する同定及び防御が可能になる。
【０１５５】
本発明による鳥類アストロウイルスをニワトリに接種した、記載の動物実験により、ワクチン能が明らかになった。これにより、高特異性抗体が産生されるようになる。さらに、これらの抗体は、本発明による鳥類アストロウイルスを特異的に中和することができることが明らかになった。当技術分野で周知であるように、中和抗体の誘導は、有効で免疫防御的なワクチンの実現可能性において重要な段階である。
【０１５６】
試験動物の反復接種は、産生される抗体レベルに対する免疫促進を与えただけではなく、攻撃感染ともなり、この攻撃感染は、試験において多数の鳥により耐性が示され、克服され得た。
【０１５７】
従って、本発明による鳥類アストロウイルス又はその一部は、適切な医薬組成物中で処方され得、ワクチンとして鳥類に対して適用され得る。
【０１５８】
例えば、ワクチン接種反応の許容可能なレベルで十分な防御効果をワクチンが与えるように、ワクチンの効率及び安全性を微調整することによりこのワクチンをさらに最適化することは、当業者にとって実現可能である。これは、ワクチン用量を適応させることによって又は別の形態もしくは処方でワクチンを使用することによって又はワクチンのその他の構成物質（例えば安定化剤又はアジュバント）を適応させることによって又は異なる経路を介した適用によって、行うことができる。
【０１５９】
本発明に対するワクチンの周知の変異体は、例えば生きているか又は不活性化形態の新規鳥類アストロウイルスを使用し得；本発明による抗原性調製物及び／又はタンパク質を使用する場合、サブユニットワクチンであり得；本発明による抗体又はその断片を使用する場合、受動ワクチン（ｐａｓｓｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ）の形態であり得るか；又は本発明によるＤＮＡ分子を使用する場合、ＤＮＡワクチンの形態であり得る。
【０１６０】
従って、本発明の別の態様は、鳥類アストロウイルス、抗体又はその断片、抗原性調製物、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるものである。）と、医薬的に許容可能な担体と、を含むワクチンを提供する。
【０１６１】
同様に、本発明は、家禽用ワクチンでの使用のための化合物又は組成物に対するさらなる態様に関し、この化合物又は組成物は、鳥類アストロウイルス、抗体もしくはその断片、抗原性調製物、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるものである。）である。
【０１６２】
さらなる態様において、本発明は、家禽用ワクチンの製造のための化合物又は組成物の使用に関し、この化合物又は組成物は、鳥類アストロウイルス、抗体もしくはその断片、抗原性調製物、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるものである。）である。
【０１６３】
さらなる態様において、本発明は、家禽用ワクチンの製造のための方法に関し、この場合、化合物又は組成物は、適切な医薬担体と混合され、この化合物又は組成物は、鳥類アストロウイルス、抗体もしくはその断片、抗原性調製物、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるものである。）である。
【０１６４】
「医薬的に許容可能な担体」は、例えば、目的に適切な、滅菌水、生理食塩水又は緩衝液であり得る。より複雑な形態において、担体は、それ自身、アジュバント、さらなる抗原、サイトカインなどのその他の化合物を含み得る。
【０１６５】
本発明によるワクチンは、予防的及び治療的処置両方のために使用され得る。
【０１６６】
「ワクチン」という用語は、本発明による鳥類アストロウイルスの免疫学的に有効な量の存在及び医薬的に許容可能な担体の存在を意味する。
【０１６７】
本発明によるワクチンに対する「免疫学的に有効な量」を構成するものは、所望の効果及び鳥類アストロウイルスの特徴及び標的生物に依存する。有効量の決定は、例えばワクチン接種後又は攻撃感染後に免疫学的反応を監視することにより、例えば、非ワクチン接種動物で見られる反応と比較して、標的の疾患の臨床兆候、血清型パラメーターを監視することにより、又は病原体を再分離することにより、十分に通常の実施者の技術の範囲内である。
【０１６８】
ワクチン中で、非常に大量の、本発明による、鳥類アストロウイルス、抗原性調製物、抗体もしくはその断片、ＤＮＡ分子又はタンパク質を使用することは、免疫学的に非常に有効ではあるが、営利的な理由に対してあまり魅力的ではない。本発明によるワクチン中に含まれる本発明によるこれらの化合物又は組成物の何れかの好ましい量は、ワクチンの最終体積の０．１から９０％の間である。より好ましくは、この量は、１から５０％、１から２５％及び１から１０％の間である（好ましい順）。
【０１６９】
不活性化又はサブユニットワクチンの場合、本発明による化合物又は組成物は、ＥＬＩＳＡ単位で表され得る。有効であるＥＬＩＳＡ単位の量は、ある一定の効率を与える標準化試料のＥＬＩＳＡ単位に関連して決定される必要がある。
【０１７０】
本発明による生ワクチンの場合、鳥類アストロウイルスワクチン用量を定量する都合の良い方法であるものに依存して、ｐｆｕ（プラーク形成単位）、ｃｆｕ（コロニー形成単位）、ＴＣＩＤ５０、ＥＩＤ５０又はＥＬＤ５０（胚致死量５０％）の量を使用することができる。例えば、１から１０＾６ＥＩＤ５０／ワクチン投与量の間の範囲の鳥類アストロウイルス生ワクチン用量を有利に使用することができ；好ましくは１０から１０＾５ ＥＩＤ５０／投与量の間、より好ましくは１０＾２から１０＾４ ＥＩＤ５０／投与量の間の範囲である。
【０１７１】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスが生きている形態である、本発明によるワクチンに関する。
【０１７２】
生ワクチンは、一般に、微生物それ自身が複製するので、僅かな量の接種材料しか必要としないという有利な特性がある。また、これは、一般に、正確な免疫学的記憶のある確固たる有効な免疫反応を誘導する。
【０１７３】
当技術分野で公知のように、生ワクチンは、都合良く、弱毒化生ワクチンとして適用され得、これは、元のウイルス分離株と比較して、ワクチンウイルスの毒性又は病原性が減弱させられていることを意味する。ウイルス弱毒化のための方法は当技術分野で公知であり、例えば動物を通じるか又は細胞培養にわたる連続的継代；化学的弱毒化；又は分子生物学的技術による弱毒化が含まれる。
【０１７４】
代替的な好ましい実施形態において、本発明は、本発明による鳥類アストロウイルスが不活性化されている本発明によるワクチンに関する。
【０１７５】
ウイルス不活性化のための方法及び材料は、上記で述べられている。このような不活性化ワクチンは一般に、何らかの潜在的に病原性のある、複製する生きている鳥類アストロウイルスに宿主を曝露しないので、生ワクチンよりも安全であるという長所を有する。
【０１７６】
さらに好ましい実施形態において、本発明によるワクチンはアジュバントをさらに含む。
【０１７７】
アジュバントは、非特異的な形式で宿主の免疫反応を促進する免疫刺激性物質である。多くの様々なアジュバントが当技術分野で公知である。よく使用されるアジュバントの例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖類、いくつかのグルカン又はグリカン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（Ｒ）、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）である。これらは、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョン、ｏ／ｗエマルジョン及びｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンなどの様々なエマルジョンと組み合わせることができる。油性エマルジョンでの使用に適切な油性アジュバントは、例えば鉱物油又は代謝可能な油である。鉱物油は、例えばＢａｙｏｌ（Ｒ）、Ｍａｒｃｏｌ（Ｒ）及びＤｒａｋｅｏｌ（Ｒ）であり；代謝可能な油は、例えばピーナツ油、大豆油などの植物油又は魚油スクアレンなどの動物性の油である。あるいは、ＥＰ３８２，２７１に記載のようなビタミンＥ（トコフェロール）可溶化物が有利に使用され得る。
【０１７８】
非常に適切なｏ／ｗエマルジョンは、例えば５−５０％ｗ／ｗ水相及び９５−５０％ｗ／ｗ油性アジュバントから始まって得られ、より好ましくは２０−５０％ｗ／ｗ水相及び８０−５０％ｗ／ｗ油性アジュバントが使用される。
【０１７９】
添加されるアジュバント量は、アジュバントそれ自身の性質及び製造者により提供されるこのような量に関する情報に依存する。
【０１８０】
不活性化ワクチンと組み合わせてアジュバントを使用することが一般的な方法である一方で、いくつかの生ワクチンは、アジュバントを含むことからの利益も得られることが示されている。従って、この実施形態もまた本発明の範囲内である。
【０１８１】
さらに好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、安定化剤をさらに含む。
【０１８２】
例えば、分解から本発明によるワクチンを保護するために、品質保持期限を延長するために又は凍結乾燥効率を向上させるために、本発明によるワクチンに安定化剤を添加し得る。有用な安定化剤は、とりわけＳＰＧＡ（Ｂｏｖａｒｎｉｋら、１９５０、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．５９、ｐ．５０９）、脱脂粉乳、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストラン又はグルコース）、タンパク質（アルブミン又はカゼインなど）又はその分解産物、緩衝液（アルカリ金属リン酸塩など）及びポリアミン（スペルミンなど）である。
【０１８３】
また、チメロサール、メルチオレート又はゲンタマイシンなど、保存料も添加し得る。
【０１８４】
さらに、本ワクチンは、１以上の適切な界面活性化合物又は乳化剤、例えばＳｐａｎ（Ｒ）又はＴｗｅｅｎ（Ｒ）を含み得る。
【０１８５】
本ワクチンはまたいわゆる「ビヒクル」も含み得る。ビヒクルは、それに共有結合されずに、本発明によるポリペプチド又はタンパク質が付着する化合物である。このようなビヒクルは、とりわけ、バイオマイクロカプセル、マイクロアルギン酸塩、リポソーム及びマクロゾル（ｍａｃｒｏｓｏｌ）（全て当技術分野で公知）である。このようなビヒクルの特別な形態は、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）である。
【０１８６】
言うまでもないが、その他の安定化剤、担体、希釈剤、エマルジョンなどを本発明によるワクチンと混合することもまた本発明の範囲内である。このような添加物は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ」及び「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（両者とも前出）などの周知のハンドブックに記載されている。
【０１８７】
複数の免疫学的物質がこのようにして一度に投与され得るので（時間が短縮され、労働コストが低下し、ワクチン接種される標的動物の不快感が減少する。）、混合ワクチンとして本発明によるワクチンを処方することは非常に有効である。
【０１８８】
このような混合ワクチンは、本発明によるワクチンを、（生又は不活性化）ウイルス、細菌、寄生生物又はその一部（タンパク質、炭水化物又は抗原をコードすることが可能な核酸など）などの別の抗原性化合物と組み合わせることにより達成される。本発明によるワクチンは鳥類標的動物を対象とするので、これは、その他の家禽病原体であるか又はそれ由来であるさらなる抗原と有利に組み合わせられる。
【０１８９】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、家禽に対して病原性のある微生物から得ることができる少なくとも１つのさらなる抗原を含んでいる。
【０１９０】
多くの鳥類病原が知られているが、より関連する獣医学−経済的病原体の一部は、
ウイルス：伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、鳥類インフルエンザ、アデノウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（即ちガンボロウイルス）、ニワトリ貧血ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、家禽ポックスウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス性腸炎）、ハトポックスウイルス、マレック病、鳥類白血病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、鳥類肺炎ウイルス及びレオウイルス；
細菌：大腸菌（エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、サルモネラ種、オルニトバクテリウム・リニトラキアレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｉｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィリス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリシペロスリクス・ルシオパチエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エリシペラス種、マイコプラズマ種及びクロストリジウム種；
寄生生物：エイメリア；
真菌：例えばアスペルギルス
などである。
【０１９１】
また、例えば本発明による鳥類アストロウイルスの変異体に対してより広く有効である混合ワクチンを形成するための、２以上の本発明による鳥類アストロウイルスの本発明によるワクチンにおける組み合わせも考えられる。混合ワクチンを形成するために使用され得る鳥類アストロウイルスの例は、表１に記載の分離株である。
【０１９２】
本発明によるワクチンは、家禽への投与に適切であり、所望の適用経路及び所望の効果と合致する何らかの形態を取り得る。
【０１９３】
本発明によるワクチンの調製は、当業者とって周知の手段により行われる。好ましくは、本発明によるワクチンは、縣濁液、溶液、分散液、エマルジョンなどの注射に適切な形態で処方される。一般に、このようなワクチンは滅菌調製される。
【０１９４】
多くの投与方法（全て当技術分野で公知）が適用され得る。本発明によるワクチンは、不活性化される場合、好ましくは注射により投与され、生ワクチンである場合、好ましくは食餌、噴霧又は飲用水を介してなど、大量適用の方法により投与される。
【０１９５】
本発明によるワクチンの投与のためのプロトコールは、理想的には、その他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに組み込まれる。
【０１９６】
本発明によるワクチンに対する好ましい標的は、鳥類動物である。より好ましい標的は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル及びガチョウからなる群から選択される。最も好ましい標的はニワトリである。
【０１９７】
本発明によるワクチンを標的生物に適用するための投与スキームは、ワクチンの処方と適合する方式で及び免疫学的に有効となるような量での、単回又は複数回投与（これは同時に又は連続的に投与され得る。）であり得る。
【０１９８】
齢、体重、性別、免疫学的状況及びワクチン接種しようとする鳥類標的のその他のパラメーターは重要ではないが、健康な標的にワクチン接種すること及び飼育現場での感染を予防するためにできるだけ早急にワクチン接種することは明らかに有利である。従って、例えば、孵化した日又はさらに早く、孵化の３−４日前に；例えばニワトリに対して胚発生（ＥＤ）第１８日又はシチメンチョウに対して第２４日ＥＤで、まだ卵内にいる間に、家禽にワクチン接種することができる。
【０１９９】
安定性の又は経済的理由から、本発明によるワクチンは凍結乾燥され得る。一般に、これにより０℃以上の温度、例えば４℃で長期保存できるようになる。凍結乾燥のための手順は当業者にとって公知であり、様々な規模の凍結乾燥のための装置が市販されている。
【０２００】
従って、好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは凍結乾燥形態である。
【０２０１】
凍結乾燥ワクチン組成物を再構成するために、生理学的に許容可能な希釈剤中でこれを懸濁する。このような希釈剤は、例えば滅菌水又は生理食塩水（（リン酸緩衝）食塩水など）のような単純なものであり得るか、又は、希釈剤は、ＥＰ３８２，２７１に記載のような、トコフェロールなどの補助的化合物を既に含有し得る。より複雑な形態において、本凍結乾燥ワクチンは、例えばＥＰ１，１４０，１５２に記載のようなエマルジョン中で懸濁され得る。
【０２０２】
従って、さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明による凍結乾燥ワクチンの再構成によって得ることができるワクチン組成物に関する。
【０２０３】
ワクチンにおける本発明による化合物及び組成物の様々な使用に加えて、これらはまた、例えば動物の現地試料又はウイルス調製物において、本発明によるウイルス又はその抗原又は核酸を検出するために、診断にも有利に適用され得る。
【０２０４】
これはまた、上述のようなＩＦＴ及びＶＮアッセイによる血清型決定実験の結果によっても明らかにされ、この実験において、本発明の範囲内に包含されるウイルス（表１に記載のような分離株）とそうではないもの（中でも：ＡＮＶ１、ＣＡｓｔＶ２、レオウイルスなど）との間で差別化するために、本発明による寄託鳥類アストロウイルスに対する抗血清が適用された。同様に、記載のＰＣＲ実験によって、本発明による鳥類アストロウイルスの選択的同定能が明らかになった。
【０２０５】
当業者が認識するように、これは、本発明による抗体に適用されるだけでなく、本発明によるその他の化合物及び組成物にも適用される。このような診断アッセイは、例えば、抗原について試験するために本発明による抗体又はその断片を使用するか又はそれに対する抗体について試験するために抗原（本発明による、ウイルス、抗原性調製物又はタンパク質）を使用するか又はハイブリッド形成又はＰＣＲアッセイを設定するために核酸（ウイルスからのＲＮＡ又は本発明によるＤＮＡ分子）を使用する。
【０２０６】
従って、さらなる態様において、本発明は、鳥類アストロウイルス、抗原性調製物、抗体又はその断片、ＤＮＡ分子又はタンパク質（全て本発明によるもの）を含む診断キットに関する。
【０２０７】
「診断キット」という用語は、例えば、多くの成分及び診断テストを行うための消耗品及び説明書を含む（全て市販可能な包装形態）、市販用の包装に関する特性を指す。
【０２０８】
従って、このような診断キットは、例えば、抗体ＥＬＩＳＡに必要とされる材料を含む。このような試験において、例えば、ＥＬＩＳＡプレートのウェルは、本発明による鳥類アストロウイルス又はその調製物もしくはタンパク質に対する抗体の検出用の、抗体ＥＬＩＳＡキットを形成するために、本発明による鳥類アストロウイルスで被覆されている。試験試料との温置後、（存在するならば）この試験試料の免疫グロブリンに反応性がある標識化抗体をウェルに添加する。次に、呈色反応により、試験試料中の特異的抗体の有無が明らかになる。
【０２０９】
同様に、例えば本発明によるウイルス、抗原性調製物又はタンパク質で被覆されたマイクロタイタープレートを含む、抗原ＥＬＩＳＡキットが考案され得る。
【０２１０】
このような免疫アッセイの設計は変更され得る。例えば、この免疫アッセイは、直接結合の代わりに競合に基づき得る。さらに、このような試験はまた、装置の固体支持体の代わりに、粒子状物質又は細胞性物質も使用し得る。この試験で形成される抗体−抗原複合体の検出で使用されるのは、標識化抗体のみであり得、この標識は、例えば、酵素又は蛍光、化学発光、放射活性又は色素分子であり得る。
【０２１１】
有利に、本発明によるワクチン及び診断法は、ここで、ある一定の領域又は動物集団における本発明による鳥類アストロウイルスの根絶のためのアプローチを考案するために連携して使用され得る。
【０２１２】
ここで、次の非限定実施例を参照して、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２１３】
（実施例１）
現地試料からの鳥類アストロウイルスの単離
本発明による鳥類アストロウイルスの多くの分離株を、オランダ及びドイツの様々な農場からのニワトリ及びシチメンチョウから単離した。典型例として、試料番号１６１３１９（「分離株１９」）の単離をここで詳述する。
【０２１４】
餌消費の低下、産卵低下及び２級卵の増加を示す、オランダの農場の３６週齢の４羽の産卵雌ニワトリ由来の気管のプールから、分離株１９アストロウイルスを単離した。これらはまた、全般的に、消化不良、下痢及び運動性の問題があった。
【０２１５】
４羽のニワトリの気管のプール組織（０．５−１．０ｇ）を「ライジング液（ｒｉｓｉｎｇ −ｍｅｄｉｕｍ）」（５００ｍＬ ＨＢＳＳ［ハンクス基本塩類溶液］＋２ｍＬベンジルペニシリンナトリウム（１．０００．０００Ｉ．Ｅ／ｍＬ）＋８ｍＬストレプトマイシン（２５０ｍｇ／ｍＬ）＋０,５ｍＬファンギゾン（２．０００μｇ／ｍＬ）＋ＮａＨＣＯ３ ２ｍＬ ７．５％含有）約１０ｍＬと混合し、２分間ストマッカーを用いてホモジェナイズ処理した。２−８℃で２０００ｘｇで１５分間、縣濁液を遠心した。次に、４５０ｎｍフィルターを用いて上清をろ過した。
【０２１６】
得られた液体を４羽の８−９日有胚ニワトリＳＰＦ卵（１ｍＬ／卵）の尿膜腔、４羽の５−６日有胚ＳＰＦ卵（１ｍＬ／卵）の卵黄及び４羽の９日有胚ＳＰＦ卵（０．５ｍＬ／卵）のＣＡＭに接種し、３６．５から３８．５℃で４０から５５％湿度で温置した。この卵を毎日光に透かして調べた。接種１日以内に起こる胚の死亡は非特異的とみなした。
【０２１７】
卵黄嚢接種卵の胚は、接種後第７日で何ら異常は示さなかった。そうではあるが、卵黄液を回収し、２回目の継代に使用した。
【０２１８】
１回目の継代から回収した卵黄液４ｍＬ（１ｍＬ／卵）を「継代液（ＨＢＳＳ ９０ｍＬ＋２ｍＬベンジルペニシリンナトリウム（１．０００．０００Ｉ．Ｅ／ｍＬ）＋８ｍＬストレプトマイシン（２５０ｍｇ／ｍＬ）＋０，５ｍＬファンギゾン（２．０００μｇ／ｍＬ）＋ＮａＨＣＯ３ ２ｍＬ ７．５％含有）０．５ｍＬと混合した。この混合液から、１ｍＬ／卵を５羽の５日有胚ＳＰＦ卵の卵黄に接種し、３６．５から３８．５℃で４０から５５％湿度で温置した。これらの卵を毎日光に透かして調べた。
【０２１９】
接種後第６日目に、１個の胚が死亡し、身体の赤みが見られた。寒天ゲル沈降（ＡＧＰ）アッセイでこの卵からの尿膜腔液をレオウイルスに対して試験し；それは、レオウイルスに対して陰性であった。
【０２２０】
異常胚があったこの卵の卵黄約４から５ｍＬを回収し２回目の継代と同じようにさらなる継代に使用した。
【０２２１】
３回目の継代において、接種後第５日目に、３つの胚が死亡し、それらのうち２つで身体の赤みが見られた。プールした尿膜腔液はレオウイルス及びアデノウイルス１型に対してＡＧＰで陰性であった。
【０２２２】
さらなる継代において、胚が死亡するか又は接種後により早く症状を発現したので、分離株の力価が上昇した。６回目及び７回目の継代で、肢及び翼端の典型的な鮮赤色染色が明らかになった。
【０２２３】
一貫して、尿膜腔液は、ＩＢＤＶ、レオウイルス、アデノウイルス、ＮＤＶ、ＡＩＶ及びＩＢＶに対するＨＡ又はＡＧＰ試験で陰性であった。また、ＩＢＤＶに対するＰＣＲアッセイも陰性であった。
【０２２４】
回収したＣＡＭ及び尿膜腔液を−８０℃で凍結保存し、さらなる特徴評価のために使用した。
【０２２５】
（実施例２）
ウイルスＲＮＡ単離：
トータルウイルスＲＮＡの単離のために、製造者の説明書に従い、ＱＩＡａｍｐ（Ｒ）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡミニキット（ＱｉａＧｅｎＴＭ）を使用した。簡単に説明すると、尿膜腔液又は組織又は胚ホモジェネート（通常、５−５０％ｗ／ｖの間の量）などの１４０μＬウイルス含有液を予め調製した抽出緩衝液及び担体ＲＮＡと混合した。室温で１０分間、これを温置した。次に、純エタノール（９６−１００％）を添加し、混合し、混合物をＱＩＡａｍｐミニスピンカラム（２ｍＬ回収チューブ中）に入れた。１分間、６０００ｘｇでこれを遠心した。フロースルーを廃棄した。純エタノールを含有する洗浄緩衝液でこのカラムを洗浄した。最後に、６０μＬ溶出緩衝液でこのカラムを溶出した。一般に、ＲＮＡ単離の後、直接、ＲＴ反応を介してｃＤＮＡの産生を行った。
【０２２６】
標準的アガロース／ホルムアミドＲＮＡゲル−電気泳動によりアストロウイルスＲＮＡの存在を確認した。
【０２２７】
（実施例３）
ＲＴ反応を介したｃＤＮＡの産生
製造者の説明書に従い、Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（Ｒ）Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｅａｄｓを用いて、第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。簡単に述べると、トータルウイルスＲＮＡ単離物からの溶出ＲＮＡ２９μＬを６５℃で１０分間及び氷上で２分間、変性させた。２個のビーズを含有するチューブにこれを添加し、１０μＭプライマー１７（配列番号３）４μＬを添加し、３３μＬの最終体積とした。これを室温で１分間温置し、慎重にピペット操作することによって混合し、３７℃で１時間温置した。さらなる使用まで、ｃＤＮＡを−２０℃以下で凍結保存した。
【０２２８】
（実施例４）
ＰＣＲ反応
ＲＴ反応からのｃＤＮＡから２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを調製するために、ＰＣＲを使用した。また、本発明による鳥類アストロウイルスが試料中に存在するか否かを特異的に同定するために、診断型の検出アッセイとしてＰＣＲを使用した。
【０２２９】
ＰＣＲ反応成分は、ＨＴ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭＬｔｄ．から得た：Ｓｕｐｅｒｔａｑ（Ｒ）緩衝液（１０ｘ濃縮液）を１ｘ濃縮で使用し；Ｓｕｐｅｒｔａｑ（Ｒ）Ｐｌｕｓポリメラーゼ酵素（５Ｕ／μＬ）を１Ｕ／μＬで使用し、予混合ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）を２ｍＭで使用。ＲＮＡｓｅ不含蒸留水中でこれらを混合した。
【０２３０】
使用したプライマーは、表４で列挙されるようなものであった。プライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ（オランダ）により合成され、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中で１００μＭのプライマー保存溶液を調製し、希釈標準保存溶液は、直接使用するために１０μＭ希釈液であった。
【０２３１】
標準的ＰＣＲに対して、次の成分を使用した：２７μＬ Ａｑｕａ ｄｅｓｔ．、５μＬ １０ｘＳｕｐｅｒｔａｑ Ｐｌｕｓ緩衝液；１μＬ（＝１単位）Ｓｕｐｅｒｔａｑ Ｐｌｕｓ酵素；５μＬ ２ｍＭ ｄＮＴＰ混合液；フォワード及びリバースプライマー各５μＬ（１０μＭ）；及び最後に、ＲＴ反応混合物からのｃＤＮＡ２μＬ；５０μＬの総体積に達した。
【０２３２】
例えばプライマーＦ−ＩＩ及びＲ−ＩＩ−３（配列番号２８、２９）でＯＲＦ１ａを増幅するための又はプライマー２０及び２１（配列番号３２、３３）を用いることによりＯＲＦ１ｂを増幅するための典型的な反応条件は、
９５℃で−１分、
９４℃で３０秒間；４８℃で１分；及び７２℃で４０秒を４０サイクル
７２℃で１０分間
２０℃で保持
であった。
【０２３３】
ＮＢ：全てのＰＣＲ温度は±約１℃である。
【０２３４】
最適化中、いくつかの変更を行った：４０サイクルの代わりに４５サイクルとし、アニーリング温度に対する変更及びサイクル段階の時間に対する変更：３０秒又は１分間の長さで、４６から５３℃の間の温度を使用した。
【０２３５】
本発明による鳥類アストロウイルスの特異的検出のために、プライマー２９及び３０（配列番号３０、３１）を用いて、サイクル相に対して使用される最適条件は、５１℃で３０秒間のアニーリング温度で４５サイクルであった。その他の条件は、プライマー２０／２１反応に対するものと同じであった。
【０２３６】
サイクル配列決定反応のためのＰＣＲ反応は、基本的に異なる設定であった：９６℃で１０秒間；５０℃で５秒間；及び６０℃で２分間を２５サイクル、下記参照。
【０２３７】
（実施例５）
アガロースゲル−電気泳動によるＤＮＡ分析、精製及びサブクローニング：
産生されたＰＣＲ産物の検出及び視覚化のために、アガロースゲル−電気泳動を使用した。また、これは、切り出し及び抽出によりＰＣＲ産物を精製するために役立ち、これらの単離されたＰＣＲ産物の配列決定又はサブクローニングが可能になった。
【０２３８】
簡単に述べると、１００ｍＬアガロース溶液あたり０．５ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウム溶液約５０μＬを含有するＴＡＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中で０．８％アガロース（低電気浸透タイプ）ゲルを作製した。ＰＣＲ産物の試料を標準的試料ローディング緩衝液（グリセロール／ＳＤＳ／／ブロモフェノールブルー）と１：１０で混合した。典型的に、ＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃＴＭからのＳｍａｒｔＬａｄｄｅｒ（Ｒ）を用いたマーカーレーンが含まれた。通常は２０ｘ２０ｘ１ｃｍゲルに対して１００Ｖで１時間又は青色色素が寒天の端に到達するまで、ＴＡＥ緩衝液中に浸して電気泳動を行った。ＵＶ光により可視化した。デジタルカメラでゲルの写真を撮影した。
【０２３９】
切り出され精製されたバンドのＤＮＡの濃度を評価するために、ＤＮＡマーカーラダーの様々な量を保持するいくつかのレーンの横で試料を電気泳動する場合にも、寒天ゲル電気泳動を使用した。
【０２４０】
微量遠心又はＱＩＡｖａｃ（Ｒ）真空マニホールドの何れかを用いて、製造者の説明書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（Ｒ）ゲル抽出キット（ＱｉａＧｅｎＴＭ）を用いて、アガロースゲルから、ＰＣＲ産物の特異的バンドの精製を行った。
【０２４１】
アガロースゲルから切り出し、精製したＤＮＡバンドを、クローニング、配列決定、発現又はハイブリッド形成−検出アッセイなどのさらなる使用のために細菌プラスミドにサブクローニングした。製造者の説明書に従い、ＴＯＰＯ−ＴＡ（Ｒ）ベクター及びＴＯＰＯ−ＴＡ（Ｒ）クローニングキット（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ）を用いて、プラスミドＰＣＲ２．１にＤＮＡ断片をクローニングした。
【０２４２】
（実施例６）
ＤＮＡ配列決定
Ｂｉｇ Ｄｙｅ（Ｒ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ）及びＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ３１０自動配列決定装置を用いて、全て製造者の説明書に従い、標準的ＰＣＲサイクル配列決定により、ＤＮＡ配列決定を行った。
【０２４３】
一般的には、配列決定反応において、２０μＬの総体積まで、蒸留水中で８μＬ Ｂｉｇ Ｄｙｅ（Ｒ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ、１０μＭプライマー１μＬとともに、ＤＮＡ（精製ＰＣＲ産物又はベクター中のクローニング断片）２０から７０ｎｇを使用した。配列決定のために使用したプライマーは、通常、ｃＤＮＡからｄｓＤＮＡ産物を調製するためにＰＣＲで使用されたものと同じであった。
【０２４４】
サイクル配列決定ＰＣＲは、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、６０℃で２分間を２５サイクル行うことによるものであった。
【０２４５】
ＰＣＲ後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｒ）チューブ及び微量遠心を用いて、製造者の説明書に従い、Ｄｙｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏを除去するために、ＤｙｅＥｘ（Ｒ）スピンカラム（ＱｉａＧｅｎＴＭ）を用いて試料を精製した。４０μＬの総体積になるように、最終溶出物を蒸留水により１：２で再懸濁した。
【０２４６】
次に、Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎバージョン１．０．４及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓバージョン３ソフトウェアを用いて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒでの分析により、配列決定を行った。
【０２４７】
いくつかのプログラムを用いて配列分析を行ったが、最もよく使用したものは、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｒ）（Ｇｅｎｅ ＣｏｄｅｓＴＭ）及びＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒ（Ｒ）（Ｓｃｉ．Ｅｄ．ＳｏｆｔｗａｒｅＴＭ）であった。使用した変性ＰＣＲプライマーに基づき導入されたヌクレオチド読み取りを除去するために、最初と最後の配列を切り取った。
【０２４８】
配列番号４−２６（偶数）で本明細書中で与えられるＤＮＡ配列は、多重配列決定反応由来のコンセンサス配列である。大抵の場合、この配列はまた、フォワード及びリバース配列決定プライマーを用いて２本鎖の両方からも読み取り；配列番号８のみ、一方の鎖のみから決定した。平均重複性はヌクレオチド個あたり約４ｘであった。
【０２４９】
（実施例７）
有胚ニワトリ卵におけるアストロウイルスの滴定
２３Ｇ１”針を用いて、６日有胚ＳＰＦニワトリ卵の卵黄嚢にアストロウイルス縣濁液の連続１０倍希釈液を接種した。続いて、３７℃で７日間、孵卵器中でこの卵を温置した。
【０２５０】
この卵を毎日、光に透かして調べた。接種後２４時間以内に起こる死亡は非特異的とみなし、従って、初期に死亡した胚を含有するこのような卵を廃棄し、感染性力価の計算から除外した。
【０２５１】
接種後２から７日までに死亡した胚を本発明によるアストロウイルスでの感染に対する病変の特徴の有無について調べた（これは、死亡した胚が鮮赤色の肢及び翼端及び腫脹した暗赤色の肝臓を呈したか否かということであった。）。Ｓｐｅａｒｍａｎ及びＫａｒｂｅｒの方法に基づくコンピュータプログラムを用いて、感染性力価を計算し、ＥＬＤ５０／ｍＬで表した。
【０２５２】
（実施例８）
有胚ニワトリ卵におけるアストロウイルスの産生
９日有胚ＳＰＦニワトリ卵の卵黄嚢に２２Ｇ１ １／２”針を用いて、卵１個あたりアストロウイルス１０＾５ ＥＬＤ５０を接種した。続いて、孵卵器でこの卵を３７℃温置した。
【０２５３】
温置２４時間後に、この卵を光に透かして調べた。２４時間以内に起こった死亡は非特異的とみなし、これらの卵を除外した。
【０２５４】
温置４８時間後に、残っている全ての卵の尿膜腔液を回収した。この尿膜腔液を−６０℃以下で凍結保存した。
【０２５５】
上述のような有胚ニワトリ卵中で又は細胞での滴定により、感染性力価を明らかにした。
【０２５６】
（実施例９）
初代細胞の作製
胚から肝臓を単離することによって、１４−１６日有胚ＳＰＦニワトリ卵からＣＥＬ細胞を調製した。ＰＢＳ／フェノールレッドで肝臓を洗浄し、ＰＢＳ中にトリプシンを含有する溶液中で室温で８−１０分間温置した。１００μｍガーゼを通して上清を回収した。これを２回以上繰り返し、次に、遠心により細胞を回収し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する適切な富化培地中で再懸濁した。
【０２５７】
約１８日ＳＰＦニワトリ胚からの腎臓を用いて、同様にＣＥＫ細胞を調製した。この腎臓の外皮を穏やかに剥ぎ、洗浄し、室温で２０分間、１回トリプシン処理した。次にＣＥＫ細胞をろ過し、培地＋ＦＣＳ中で処理した。
【０２５８】
（実施例１０）
ＩＦＴアッセイ
ある一定の抗血清の異種間の特異性を調べるために、ならびにウイルス滴定のために、免疫蛍光試験（ＩＦＴ）を使用した。通常、マイクロタイタープレート中で初代細胞においてＩＦＴを行った。
【０２５９】
ＣＥＫ細胞をＩＦＴに対して使用した場合、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中で１０＾５細胞／１００μＬでこれらを播種した。この細胞を２％ＦＣＳ及び抗生物質入りの標準的な富化培地中に入れ、これを５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で温置した。翌日、細胞上にウイルスを接種した。
【０２６０】
滴定の目的で、ウイルスの連続希釈液を使用した。次に、さらに２日間プレートを温置した。次いで、上清を除去し、細胞を−７０℃の純エタノールで固定した。このプレートを使用まで−２０℃で保存し得た。滴定に対してウイルスを可視化するために、特異的抗血清でこのプレートを染色した。従って、このプレートを室温に順応させ、アルコールを捨てて、このプレートをＰＢＳで洗浄した。良好な蛍光を与えるがバックグラウンドが強すぎないことが知られている強度で抗−アストロウイルス血清の希釈液を調製した。次に、この第一の抗血清をプレートに添加し、加湿雰囲気中、３７℃で１時間温置した。次いで、ＰＢＳで３回、このプレートを洗浄した。次に、第二の抗体結合物を調製した（ヤギ抗−ニワトリＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合物（ＮｏｒｄｉｃＴＭ））。これを必要とされる希釈でプレートに添加し、３７℃で１時間再び温置した。この温置後、プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＰＢＳ：グリセロールの１：１混合物を添加した。次に、蛍光顕微鏡による読み取りまで、４℃にて暗所でプレートを保存した。陽性シグナルは、細胞層でのｃｐｅの兆候に相互に関連する、特異的蛍光の検出である。
【０２６１】
血清の特徴評価及び種の交差反応試験のために、ＣＥＫ又はＣＥＬ細胞を用いて、同様にしてマイクロタイタープレートを調製した。翌日、試験しようとする様々なウイルス、例えば本発明によるアストロウイルス分離株、またＡＮＶ１及びＣＡｓｔＶ２ならびにその他の鳥類病原体：レオウイルス、ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＦＰＶ、アデノウイルス、ＡＩＶなど、をこれらに感染させた。ウイルス量は、固定量又は希釈液（都合の良いあらゆるもの）であった。このプレートを２−３日間温置した。
【０２６２】
ある一定の抗血清の様々なウイルスへの結合能を試験するために、血清をこのプレート上で温置し、結合物と温置することによってシグナルを増強させた。結合−対−バックグラウンドシグナルの最適化のために、様々なウイルスの様々な希釈液においてＰＢＳ中の抗血清のいくつかの希釈液を試験した。
【０２６３】
（実施例１１）
アストロウイルスでのニワトリの感染
飼育現場で観察される疾患症状を再現するため及びこれらの二次感染動物から微生物を再単離するための実験設定において、ニワトリで、本発明による鳥類アストロウイルスを試験した。これは、試験される分離株を、病原性及び毒性が強い微生物及び観察される飼育現場での症状の原因となる感染因子として確立するために、コッホの条件に適合させるのに役立つ。
【０２６４】
また、続く攻撃感染に対して、生の接種材料によるワクチン接種効率を試験するために、ニワトリを繰り返し感染させた。
【０２６５】
最後に、接種されたアストロウイルスに対する特異的なポリクローナル抗血清を得るために、実験的に感染させたニワトリから総血清を分離した。
【０２６６】
この目的に対して、白色レグホン品種のＳＰＦ産卵ニワトリ及び雄雌両方を３週齢で陰圧アイソレーターに移した。無作為選択により動物を処置群に割り当て、二重の翼バンドにより個々に標識した。標準的な餌及び飲用水を自由に摂取できるようにした。
【０２６７】
免疫状態を調べるために、一定間隔で実験を通じて、また第０日にも、血液試料を採取した。次に、１５羽のニワトリに３種類の経路：１０＾５ ＥＩＤ５０／０．２ｍＬ用量及び１０＾５．４ ＥＩＤ５０／０．５ｍＬ用量で、眼内経路により及び筋肉内経路により各０．２ｍＬ、ならびに経口経路により０．５ｍＬを接種した。接種材料は、注射用水中で再懸濁した、寄託したような分離株１９アストロウイルスであった。対照及びセンチネルとして使用するために、同じアイソレーターに入れた５羽のニワトリには接種しなかった。疾患の臨床兆候又は死亡について、動物を毎日調べた。
【０２６８】
接種後（ｐ．ｉ．）第２０日に、何羽かのニワトリの採血を行い、死後組織病理試験に供した。ｐ．ｉ．第２３日に、接種材料の同様の用量を用いてその他の（既に接種済み）ニワトリに免疫促進を行った。さらに２３日後、実験を終了し、生存動物から採血し、試験した。
【０２６９】
一部のニワトリには最初に接種を行わなかったが、接種／感染ニワトリと同じアイソレーター中で飼育し、予想通り、これらのニワトリはアストロウイルスの水平伝播を通じて感染した。
【０２７０】
（実施例１１ａ）
組織病理学的結果
動物試験の組織病理学的結果は次のとおりであった：２羽のニワトリが死亡し、５羽のニワトリ（そのうち３羽が対照）が下痢を発症した。組織病理学において、数羽のニワトリが、既にｐ．ｉ．第７日から、程度の差はあれ、腎臓及び腸管に対する重度の病変を示した。腎臓では、最も顕著な兆候として、重度の間質性腎炎及び尿細管変性が見られた。胸腺及び嚢ではリンパ球溶解が見られ；膵臓では、アポトーシス及び腺房萎縮が見られ；十二指腸では絨毛が鈍化し融合していた。
【０２７１】
未接種対照ニワトリの水平感染から、アストロウイルス接種材料の毒性及び感染性が明らかになった。
【０２７２】
（実施例１１ｂ）
ＰＣＲの結果
本発明による鳥類アストロウイルスの兆候について、ＰＣＲにより、全ニワトリの腎臓試料を試験した。ホモジェナイズ処理及びＲＮＡ単離後、ＲＴ試料を調製した。配列番号３０及び３１のプライマーを用いて、ＰＣＲによりこれらを試験した。感染動物の全試料は、本発明による鳥類アストロウイルスを同定する特異的な２６０ｂｐバンドを提示したことから、試験において陽性となった。適切な陽性及び陰性対照が含まれた。
【０２７３】
これにより、死亡及び組織病理学的兆候の原因物質が本発明による鳥類アストロウイルスであったことが分かった。観察された症状、腎炎及び下痢は、飼育現場で見られたものと一致した。肢に対する問題は再現することができず；おそらく、使用した鳥がこのような問題を発現するには痩せすぎており及び／又はアイソレーターにおけるＳＰＦニワトリの状態が、飼育現場の鳥が直面する多重感染圧を十分に模していなかったからであろう。
【０２７４】
（実施例１１ｃ）
ＶＮの結果
ｐ．ｉ．第０日、第２０日及び第４６日から、３７℃で１時間、ニワトリ抗血清とともにアストロウイルス分離株１９の固定量を温置した。次に、６日有胚ＳＰＦ卵にこれらのウイルス試料を接種し、数日間温置した。卵接種後第４日に、第０日血清で処置したウイルスを接種した胚が死亡し、本発明による鳥類アストロウイルスによる感染の典型的兆候を示した。
【０２７５】
しかし、第２０日又は第４６日に採取された血清と温置したウイルスは、胚に影響を与えなかった。これにより、分離株１９ウイルスが特異的ニワトリ抗血清により効果的に中和され得ることが分かる。
【０２７６】
また、これは、本発明による鳥類アストロウイルスでの生接種において、ＶＮ能を有する有効な抗血清がニワトリにおいて誘導され得ることを証明する。
【０２７７】
（実施例１１ｄ）
ＩＦＴの結果
ニワトリポリクローナル抗血清を用いた交差反応ＩＦＴアッセイの結果から、抗−分離株１９抗血清が、本発明による鳥類アストロウイルスのウイルス分離株以外、ウイルスを何も認識しなかったことが明らかになった。
【０２７８】
同様に、ＡＮＶ１又はＣＡｓｔＶ２に特異的な抗血清は、同様にそれらが作製された特異的ウイルスのみを認識した。同様に、抗−ＡＮＶ１も抗−ＣｈＡｓｔＶ２血清も本発明による鳥類アストロウイルスのウイルス分離株に結合しなかったことは重要であった。これは、試験された最大抗体量（希釈率が最小の試料）にさえも当てはまった。
【０２７９】
また、その他の鳥類病原体、最も重要なものとしてはレオウイルス、に対する抗血清は、本発明による鳥類アストロウイルスのウイルス分離株に結合できず、本発明による鳥類アストロウイルスのウイルス分離株に対する抗血清もその他の鳥類病原体に結合できなかった。
【０２８０】
これにより、本発明による鳥類アストロウイルスがそれ自身の新規の特有な血清型であることが明らかとなり、従って、特有な分子生物学的差異が同定されたことが確認された。
【０２８１】
ＣＥＫ細胞が入ったプレートに、分離株１９アストロウイルス、第３継代、ウイルスの連続１０倍希釈物を感染させた。２日後、このプレートを固定し、様々な抗血清で染色した。
【０２８２】
−接種後第３３日からの抗分離株１９血清プール、ＰＢＳ中で１：２０
−ニワトリにおいて作製された抗ＡＮＶ１（ＳＥ−０２７／２株）、ＰＢＳ中１：２０（このＡＮＶ１はＧｅｒｍａｎ ＡＮＶ１分離株であり、特異的領域のＤＮＡ配列決定において、本明細書中で使用されるＧｅｎＢａｎｋからの参照ＡＮＶ１配列と非常に近縁であると思われる。）。
【０２８３】
−ニワトリにおいて作製された抗ＣＡｓｔＶ２（ＴＳ９Ｌ株）、ＰＢＳ中１：５００（このＣＡｓｔＶ／１は、寄託番号Ｉ−２９３２でＰａｒｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＣＮＣＭに寄託された試料由来であった。）。
【０２８４】
−陰性対照、ＰＢＳのみ。
【０２８５】
【表５】
【０２８６】
（実施例１２）
さらなるワクチン接種試験
不活性化ワクチン：
抗原用量を最適化するために、不活性化された本発明によるアストロウイルスのアジュバント付加ワクチンで、シチメンチョウ及びニワトリにワクチン接種する。
【０２８７】
記載のようにアストロウイルス分離株１９をＣＥＬ上で培養し、標準的プロトコールに従い、温度及びｐＨ調節下でβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いて不活性化する。標準的プロトコールを用いて、軽油及び適切な乳化剤からなる標準的ｗ／ｏエマルジョンへと、不活性化アストロウイルスをホモジェナイズ処理する。
【０２８８】
シチメンチョウ及びニワトリを隔離ユニットで飼育する：各群に２０羽の動物が含有されるように、それらが手に寄って来たとおりに、１２０羽の２週齢の在来シチメンチョウを６つの個別の群（群１−６）に割り当てる。３週齢で、不活性化アストロウイルス分離株１９を含有するｗ／ｏエマルジョンワクチンで、第１−４群のシチメンチョウに筋肉内経路によりワクチン接種する。同じｗ／ｏエマルジョンワクチンで、第５群のシチメンチョウに皮下経路によりワクチン接種し、第６群のシチメンチョウはワクチン接種せず、対照として使用する。
【０２８９】
同様に、各群に２０羽のニワトリが含有されるように、それらが手に寄って来たとおりに、１８０羽の１週齢ＳＰＦ産卵ニワトリを９つの個別の群（第７−１５群）に割り当てる。３週齢で、不活性化アストロ３型ウイルスを含有するｗ／ｏエマルジョンワクチンで、第７−１０群のニワトリに筋肉内経路によりワクチン接種する。同じワクチンで、第１１−１４群のニワトリに皮下経路によりワクチン接種し、第１５群のニワトリはワクチン接種せず、対照として使用する。
【０２９０】
実験開始前及びワクチン接種後第４、８及び１２週に、全てのシチメンチョウ及びニワトリから血液試料を採取する。ＣＥＬ細胞上でのＩＦＴにより、又はＶＮアッセイにより、本発明によるアストロウイルスに対して特異的な抗体の有無及びそれらの力価について血清を調べる。
【０２９１】
例えば、さらに６−１２ヶ月アイソレーター中でワクチン接種鳥類を維持することによって、適切であれば免疫試験の持続時間を含むように、このプロトコールを容易に改変することができ、次に、感染に従うアストロウイルスでの攻撃感染を適用する。
【０２９２】
生ワクチン：
本発明による生アストロウイルスの用量でニワトリにワクチン接種し、続いてアストロウイルス生ワクチンに対する適用経路を最適化するために、アストロウイルスを用いて病原体接種を行う。
【０２９３】
各群に２０羽のニワトリが含有されるように、１００羽の１日齢の市販のＭＤＡ＋（母性由来抗体陽性）種畜ニワトリを５つの個別群に割り当てる。１日齢で、点眼、散霧、エアロゾル噴霧又は飲用水を介して、尿膜腔液からの生アストロウイルス分離株１９で、第１−４群のニワトリにワクチン接種する。第５群のニワトリはワクチン接種せず、非ワクチン接種対照として使用する。ワクチン接種後第４週に、全てのニワトリに対して本発明によるアストロウイルスにより病原体接種を行う。アストロウイルス感染に特徴的な臨床兆候及び／又は死亡の発生について、病原体接種後３週間の間、全ニワトリを毎日観察する。病原体接種から２１日後、残った全ニワトリを屠殺し、組織病理学試験に供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、鳥類腎炎ウイルス１のＯＲＦと比較した場合、１２個のヌクレオチドの挿入物を含有し、該挿入物が配列番号１のヌクレオチド番号２４８５及び２４８６に対応するヌクレオチドの間に位置することを特徴とする、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａゲノム領域を有する鳥類アストロウイルス。
【請求項２】
１２個のヌクレオチドの挿入物が配列番号２で与えられるような核酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の鳥類アストロウイルス。
【請求項３】
前記鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１が、配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一性を有する領域を含むことを特徴とする、請求項１から請求項２に記載の鳥類アストロウイルス。
【請求項４】
鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａから、配列番号３０及び３１で表されるプライマーのセットを用いてＰＣＲアッセイにおいて約２６０ヌクレオチドのＰＣＲ産物が産生され得ることを特徴とする、請求項１から請求項３に記載の鳥類アストロウイルス。
【請求項５】
Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）で番号ＣＮＣＭ Ｉ−３８９５下で寄託されるようなウイルスである、請求項１から請求項４に記載の鳥類アストロウイルス。
【請求項６】
ウイルス中和アッセイにおいて請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルスを中和し得る、抗体又はその断片。
【請求項７】
請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルスから取得可能な抗原性調製物。
【請求項８】
配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一性を有する領域を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項９】
配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一を有する領域を含む、タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質と、医薬的に許容可能な担体と、を含む、ワクチン。
【請求項１１】
家禽に対して病原性のある微生物から取得可能な少なくとも１つのさらなる抗原を含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質である、家禽用ワクチンにおける使用のための化合物又は組成物。
【請求項１３】
化合物又は組成物が、請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質である、家禽用ワクチンの製造のための化合物又は組成物の使用。
【請求項１４】
化合物又は組成物が適切な医薬担体と混合され、該化合物又は組成物が、請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質である、家禽用ワクチンの製造のための方法。
【請求項１５】
請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質を含む、診断キット。
【請求項１】
鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａが、鳥類腎炎ウイルス１のＯＲＦと比較した場合、１２個のヌクレオチドの挿入物を含有し、該挿入物が配列番号１のヌクレオチド番号２４８５及び２４８６に対応するヌクレオチドの間に位置することを特徴とする、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａゲノム領域を有する鳥類アストロウイルス。
【請求項２】
１２個のヌクレオチドの挿入物が配列番号２で与えられるような核酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の鳥類アストロウイルス。
【請求項３】
前記鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１が、配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一性を有する領域を含むことを特徴とする、請求項１から請求項２に記載の鳥類アストロウイルス。
【請求項４】
鳥類アストロウイルスのＯＲＦ１ａから、配列番号３０及び３１で表されるプライマーのセットを用いてＰＣＲアッセイにおいて約２６０ヌクレオチドのＰＣＲ産物が産生され得ることを特徴とする、請求項１から請求項３に記載の鳥類アストロウイルス。
【請求項５】
Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｐａｒｉｓ、ＦｒａｎｃｅのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）で番号ＣＮＣＭ Ｉ−３８９５下で寄託されるようなウイルスである、請求項１から請求項４に記載の鳥類アストロウイルス。
【請求項６】
ウイルス中和アッセイにおいて請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルスを中和し得る、抗体又はその断片。
【請求項７】
請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルスから取得可能な抗原性調製物。
【請求項８】
配列番号４と少なくとも８８％のヌクレオチド配列同一性を有する領域を含む、ＤＮＡ分子。
【請求項９】
配列番号５と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一を有する領域を含む、タンパク質。
【請求項１０】
請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質と、医薬的に許容可能な担体と、を含む、ワクチン。
【請求項１１】
家禽に対して病原性のある微生物から取得可能な少なくとも１つのさらなる抗原を含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質である、家禽用ワクチンにおける使用のための化合物又は組成物。
【請求項１３】
化合物又は組成物が、請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質である、家禽用ワクチンの製造のための化合物又は組成物の使用。
【請求項１４】
化合物又は組成物が適切な医薬担体と混合され、該化合物又は組成物が、請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質である、家禽用ワクチンの製造のための方法。
【請求項１５】
請求項１から請求項５に記載の鳥類アストロウイルス、請求項６に記載の抗体もしくはその断片、請求項７に記載の抗原性調製物、請求項８に記載のＤＮＡ分子又は請求項９に記載のタンパク質を含む、診断キット。
【図１】
【図１−１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１−１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５２０４３０（Ｐ２０１１−５２０４３０Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０６６６９（Ｐ２０１１−５０６６６９）
【出願日】平成２１年４月２７日（２００９．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５０３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３３０５４
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２７日（２００９．４．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５０３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３３０５４
【国際公開日】平成２１年１１月５日（２００９．１１．５）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
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