新規ＰＰＡＲｓアゴニスト
【課題】 ＰＰＡＲｓを活性化することのできる化合物を提供し、さらに当該活性化を通じた生活習慣病の改善に有用な化合物を提供することを目的とする。
【解決手段】 本発明は、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を有効成分とするペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤、ならびに前記ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤を含む生活習慣病改善剤を提供する。本発明によれば、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物は既知のＰＰＡＲｓアゴニストよりも高いＰＰＡＲｓ活性化作用を有しており、肥満や糖尿病等の生活習慣病の予防、改善、治療に利用することができる。
【解決手段】 本発明は、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を有効成分とするペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤、ならびに前記ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤を含む生活習慣病改善剤を提供する。本発明によれば、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物は既知のＰＰＡＲｓアゴニストよりも高いＰＰＡＲｓ活性化作用を有しており、肥満や糖尿病等の生活習慣病の予防、改善、治療に利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィトスフィンゴシン（Ｐｈｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）骨格を有するセラミド化合物を有効成分とするペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤、及びこれを含む生活習慣病改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病、高脂血症、高血圧症等の生活習慣病や肥満が大きな問題となっている。生活習慣病においては、遺伝因子のほか、食生活等の生活習慣が発症に寄与すると考えられている。また肥満は、消費カロリー量に対して摂取カロリー量が過剰となることが発生の原因の一つとなっている。
【０００３】
これら生活習慣病や肥満を予防、改善するには生活習慣の改善が有効と考えられているが、その他の手段として、生理系統を調節することができる、生活習慣病の発症や肥満の予防に有用な素材、特に日常的に接種できる飲食品として利用可能な素材の利用に期待が高まっている。
【０００４】
ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（Ｐｅｒｏｘｏｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）は一般にＰＰＡＲｓと表される核ホルモン受容体スーパーファミリーの一種であり、脂質及びグルコース代謝の制御に関与すると言われている。
【０００５】
これまでにＰＰＡＲｓには複数のサブタイプ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγが同定されている。これらはいずれもレチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、特徴的な１ｂｐのスペーサーを含むダイレクトリピート（ＤＲ１）を有する標的遺伝子のエンハンサー領域であるＰＰＡＲ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＰＰＲＥ）に結合することによって当該標的遺伝子の転写を制御する。また、ＰＰＡＲｓのアゴニストがリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合することが転写の活性化に必要である。
【０００６】
ＰＰＡＲｓは、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化等の種々の疾患に関与する重要なレセプターのひとつであり、ＰＰＡＲｓの活性を制御する化合物、たとえばＰＰＡＲｓを活性化するリガンド（アゴニスト）は、高脂血症や肥満の改善や予防に効果を奏するものと期待されている。
【０００７】
これまでに、脂肪酸、エイコサノイド、カルバプロスタサイクリン、非ステロイド抗炎症剤等を含む数多くの物質が、ＰＰＡＲｓの活性化に関与することが知られている。またＰＰＡＲｓは合成セラミドによっても活性化されることが報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
フィトスフィンゴシンは皮膚角質層内にある保湿・柔軟成分であるセラミドの前駆体であり、植物性セラミドの一種である。フィトスフィンゴシンは、保湿成分として主に化粧品等の成分として利用されている。
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｎ，Ｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、２００１年、第１５巻、第３２６３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＰＰＡＲｓを活性化することのできる化合物を提供し、さらに当該活性化を通じた生活習慣病の改善に有用な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、天然セラミドに類似した構造を有する合成セラミドについてＰＰＡＲｓの活性化作用を調べた結果、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物が所望の活性を有していることを見出し、下記の各本発明を完成させた。
【００１２】
（１）フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を有効成分とする、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
【００１３】
（２）フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物が下記式（１）〜（８）のいずれかで示される化合物である、（１）に記載のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
【００１４】
式（１）
【化９】
【００１５】
式（２）
【化１０】
【００１６】
式（３）
【化１１】
【００１７】
式（４）
【化１２】
【００１８】
式（５）
【化１３】
【００１９】
式（６）
【化１４】
【００２０】
式（７）
【化１５】
【００２１】
式（８）
【化１６】
【００２２】
（３）（１）又は（２）に記載のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤を含む生活習慣病改善剤。
【００２３】
（４）生活習慣病が肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症又は動脈硬化のいずれかである、（３）に記載の生活習慣病改善剤。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の脂質代謝改善剤は、既知のＰＰＡＲｓアゴニストよりも高い活性化作用を有しており、ＰＰＡＲｓを活性化することで肥満や糖尿病等の生活習慣病の予防、改善、治療に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物、特に下記式（１）〜（７）のいずれかで示されるフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を有効成分とするＰＰＡＲｓ活性化剤に関する。
【００２６】
式（１）
【化１７】
【００２７】
式（２）
【化１８】
【００２８】
式（３）
【化１９】
【００２９】
式（４）
【化２０】
【００３０】
式（５）
【化２１】
【００３１】
式（６）
【化２２】
【００３２】
式（７）
【化２３】
【００３３】
式（８）
【化２４】
【００３４】
以下、上記式（１）の化合物をＡ９、式（２）の化合物をＢ９、式（３）の化合物をＣ９、式（４）の化合物をＣ５０、式（５）の化合物をＦ６６、式（６）の化合物をＧ６６、式（７）の化合物をＨ６６、式（８）の化合物をｐｈＣｅｒと、それぞれ表すこととする。
【００３５】
式（１）〜（８）の化合物はいずれも、一般式Ｒ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ（ＮＨＲ１）−ＣＨ２ＯＨ（式中、Ｒは長鎖のアルキル基、Ｒ１は任意の置換基）で表される骨格構造を有しており、スフィンゴシン骨格中の４位と５位の二重結合部分が４位に水酸基、５位に水素がそれぞれ飽和されている。かかる構造的特徴を有する化合物は、一般にフィトスフィンゴシン（Ｐｈｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）骨格を有する化合物として理解される。
【００３６】
フィトスフィンゴシンは主に酵母細胞に存在するスフィンゴ脂質（Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）の一種で、生体の主要な細胞膜成分の一つであり、構造的機能とともに信号転移体系の信号伝達物質で、多様な生物学的機能を有する生理活性物質であるが、これまでのところ、フィトスフィンゴシン骨格を有する化合物がＰＰＡＲｓに対して活性化作用を有していることは知られていない。
【００３７】
本発明は、これらフィトスフィンゴシン骨格を有する化合物がＰＰＡＲｓを活性化するとの知見を得、これらをＰＰＡＲｓ活性化剤として、さらにはこれらを生活習慣病改善剤として使用することを提供するものである。
【００３８】
上記式（１）〜（７）の化合物はいずれも、韓国ポハン（Ｐｏｈａｎｇ）市のポハン科学技術大学（Ｐｏｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＪｅｏｎｇ−Ｊｕ Ｐａｒｋ博士により合成され、当業者に供給されている化合物ライブラリーに含まれているセラミド化合物である（Ｐａｒｋ Ｊ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００８年、第３６巻、第５号、第２２０−２２８頁）。
【００３９】
また式（８）の化合物はＡｖａｎｔｉ社（http://www.avantilipids.com/index.htm）から市販されている酵母由来の天然セラミドの一種である。
【００４０】
本発明にかかるフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物には、上記化合物ライブラリーに含まれる特定の化合物や市販されているフィトスフィンゴシンだけでなく、その他の酵母や哺乳動物、植物等から既知の方法により分離あるいは精製されるフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物、有機化学合成手法により合成されるフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物又はその誘導体等も含まれる。
【００４１】
本発明のＰＰＡＲｓ活性化剤あるいはこれを含む生活習慣病改善剤は、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を単体で、あるいは適当な賦形剤や食品あるいは医薬として許容される担体と共に使用することができる。
【００４２】
医薬は、例えばフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を薬学的に許容され得る種々の賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤等を用いて製剤化することにより製造することができる。製剤中のスフィンゴ糖脂質の含有量は、１×１０−６〜０．１質量％、好ましくは１×１０−４〜０．０１質量％程度に調節すればよい。
【００４３】
本発明のＰＰＡＲｓ活性化剤あるいはこれを含む生活習慣病改善剤の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げられる。投与剤形としては、例えば、注射剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。
【００４４】
また本発明のＰＰＡＲｓ活性化剤あるいはこれを含む生活習慣病改善剤は、飲食品、又は飼料等に配合して投与することもできる。特に、日常的に摂取可能な食品、機能性食品、栄養補助食品として、もしくはこれらに混合して用いることが好ましい。
【００４５】
飲食品は、例えばフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物に、デキストリン、デンプン等の糖類、ゼラチン、カゼイン、ホエー、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質、アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類、セルロース、グアガム、ジェランガム、アラビアガム等の多糖類、大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより製造することができる。飲食品の形態は問われず、固形物（粉末状、顆粒状等）、半固形物（ゼリー状、ペースト状等）、液状物のいずれであっても良い。
【００４６】
またフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物の摂取量は、目的とする作用効果、投与方法、期間、年齢、性別、体重等により異なるが、成人１日当たり、通常０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇの範囲から適宜選択できる。
【００４７】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定的に解釈されるものではない。
【実施例】
【００４８】
＜実施例＞
マウスのＲＸＲαの全長ｃＤＮＡをクローニングするために、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて調製したマウス肝臓由来の全ＲＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社）及びＫＯＤ ＰｌｕｓＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、下記のプライマー１とプライマー２を用いて、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で６０秒間を１サイクルとして２０サイクル行った。
【００４９】
プライマー１ ５’−catggacaccaaacatttcctgccgc−３’ （配列番号１）
プライマー２ ５’−gcctaggtggcttgatgtggtgcctc−３’（配列番号２）
【００５０】
増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製後、５ユニットのＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を用いて７０℃で３０分間インキュベートして３’Ａ−ｔａｉｌｉｎｇを行った。
【００５１】
反応生成物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に組み込んで大腸菌（ＸＬＬ１−Ｂｌｕｅ株）を形質転換させてプラスミドｐＧＥＭ−ｍＲＸＲαを作成し、クローニング断片の塩基配列を決定した。
【００５２】
このベクターを鋳型として、ＨｉｎｄIIIサイトを含む下記プライマー３とプライマー４とを用いてＰＣＲを行った。
【００５３】
プライマー３ ５’−caagcttatggacaccaaacatttcctgccgc−３’ （配列番号３）
プライマー４ ５’−caagcttctaggtggcttgatgtggtgcctc−３’（配列番号４）
【００５４】
増幅断片を精製後、上記と同様に３’Ａ−ｔａｉｌｉｎｇを行い、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ｍＲＸＲα−ＨｉｎｄIIIを得た。
【００５５】
ｐＧＥＭ−ｍＲＸＲα−ＨｉｎｄIIIを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化後、同じくＨｉｎｄIIIで消化しＣＩＰ処理したｐＣＭＸ（Ｕｍｅｓｏｎｏら、Ｃｅｌｌ、１９９１年、第６５巻、第１２５５頁）と連結して、プラスミドｐＣＭＸ−ｍＲＸＲαを作成し、再度塩基配列を決定した。
【００５６】
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）をｐＣＭＸ−ｍＲＸＲαで形質転換させた。形質転換細胞のｍＲＸＲαのタンパク質の発現をウサギ抗ＲＸＲαポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてイムノブロッティングを行ったところ、予測された分子量（５４ｋＤ）の位置に単一バンドが確認された（図１）。
【００５７】
上記形質転換されたＮｉＨ３Ｔ３細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。培養後の細胞（１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を９６穴プレートに播いてさらに３日間培養した後、リポフェクタミン２０００を用いて、１００ｎｇのＰＰＲＥｘ３−ｔｋ−Ｌｕｃ、１００ｎｇの ｐＲＬ−ＳＶ４０（コントロールベクター）、１２．５ｎｇのｐＣＭＸ−ｍＲＸＲα及び１２．５ｎｇのｐＣＭＸ、ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲα、ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲβ又はｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲγを含む反応液（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、全１５０μＬ)で形質転換させた。これらのベクターは、Ｕｍｅｓｏｎｏら（Ｃｅｌｌ、１９９１年、第６５巻、第１２５５頁）によって開発された、ＰＰＡＲｓのアゴニストを探索することのできるベクター群である。
【００５８】
レポータープラスミドであるＰＰＲＥｘ３−ｔｋ−Ｌｕｃは、アシルＣｏＡプロモーターの上流にヘルペスウイルスチミジンキナーゼ由来のＰＰＲＥを３コピーとルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）を有している。ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲα、ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲβ及びｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲγは、米国カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ研究所（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＲ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ博士から分与されたｐＣＭＸ（前記Ｕｍｅｓｏｎｏら）にマウスのＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγをコードする遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドである。また、ｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社）は形質転換効率を確認するためのコントロールプラスミドであり、ＳＶ４０プロモーターとウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子に対するエンハンサーを備えている。
【００５９】
形質転換から１８時間後、培地を１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含むフェノールレッドフリーのＤＭＥＭＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に換えた。この細胞に検体（韓国ポハン工科大学のＰａｒｋ教授の合成による６４０種の合成フィトスフィンゴシン）、既知の選択的ＰＰＡＲα選択的アゴニストであるＷＹ−１４６４３（ＷＹと表す）と、既知の選択的ＰＰＡＲβアゴニストであるＬ−１６５，０４１（ＬＤと表す）、又は既知の選択的ＰＰＡＲγアゴニストであるＣｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ（Ｃｉｇと表す）を加えて２４時間インキュベーションした。コントロールとしてＤＭＳＯ添加を用意した。
【００６０】
検体添加２４時間後, Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。各サンプルについてホタルルシフェラーゼ活性値をウミシイタケルシフェラーゼ活性値を用いて標準化し、標準偏差を計算した。統計解析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った（コントロールに対するＰ＜０．０５又は０．０１）。
【００６１】
上記のアッセイの結果、７種のセラミド化合物（前期式（１）〜（７）で示される化合物）すべてに、ルシフェラーゼ活性の上昇作用が確認された（図２〜４）。濃度５×１０−６ＭにおけるＡ９、Ｂ９、Ｃ９、Ｆ６６、Ｇ６６及びＨ６６によるＰＰＡＲα活性化の最大値はコントロールに対して優位に高かった（図２）。Ｆ６６、Ｇ６６、又はＨ６６によるＰＰＡＲαの活性化は、濃度１×１０−５〜１×１０−７ＭにおいてＷＹのそれと同程度か、又は高かった。
【００６２】
また、Ａ９、Ｂ９、Ｃ９、Ｆ６６、Ｇ６６、又はＨ６６によるＰＰＡＲβの活性化には容量依存性が認められた（図３）。Ａ９、Ｂ９、Ｃ９、Ｃ５０、Ｆ６６、Ｇ６６、又はＨ６６によるＰＰＡＲγの活性化についても容量依存性が確認され、それらの活性化はＣｉｇのそれよりも高かった（図４）。
【００６３】
さらに、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物の一種である化合物ｐｈＣｅｒについても上記と同じアッセイ系を行ったところ、ＰＰＡＲｓに対して活性化作用を示すことが確認された（図５ａ−ｃ）。
【００６４】
以上のように、式（１）〜（８）のフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物は、既知のＰＰＡＲｓアゴニストよりも高いＰＰＡＲｓ活性化作用を有していることが確認された。したがって、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物、特に式（１）〜（８）のフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物は、より優れたＰＰＡＲｓ活性化剤として利用可能であり、また種々の生活習慣病の改善剤としての利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】マウスＲＸＲαをコードするプラスミドで形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＲＸＲの発現を示す抗ウサギＲＸＲα抗体を用いたイムノブロッティング写真である。
【図２】ルシフェラーゼアッセイで選択された７種類の化合物についての、ＰＰＡＲα活性化作用の濃度依存性を示すグラフである。
【図３】ルシフェラーゼアッセイで選択された７種類の化合物についての、ＰＰＡＲβ活性化作用の濃度依存性を示すグラフである。
【図４】ルシフェラーゼアッセイで選択された７種類の化合物についての、ＰＰＡＲγ活性化作用の濃度依存性を示すグラフである。
【図５】化合物ｐｈＣｅｒ（１μＭ、１０μＭ）についての、ＰＰＡＲｓ活性化作用を示すグラフである。パネルａはＰＰＡＲαの、パネルｂはＰＰＡＲβの、パネルｃはＰＰＡＲγの活性化をそれぞれ示す。ＷＹ、ＬＤ、ＣｉｇはそれぞれのＰＰＡＲに対する選択的アゴニスト（比較対象）を、ＤＭＳＯはコントロールをそれぞれ示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィトスフィンゴシン（Ｐｈｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）骨格を有するセラミド化合物を有効成分とするペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤、及びこれを含む生活習慣病改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、糖尿病、高脂血症、高血圧症等の生活習慣病や肥満が大きな問題となっている。生活習慣病においては、遺伝因子のほか、食生活等の生活習慣が発症に寄与すると考えられている。また肥満は、消費カロリー量に対して摂取カロリー量が過剰となることが発生の原因の一つとなっている。
【０００３】
これら生活習慣病や肥満を予防、改善するには生活習慣の改善が有効と考えられているが、その他の手段として、生理系統を調節することができる、生活習慣病の発症や肥満の予防に有用な素材、特に日常的に接種できる飲食品として利用可能な素材の利用に期待が高まっている。
【０００４】
ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体（Ｐｅｒｏｘｏｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）は一般にＰＰＡＲｓと表される核ホルモン受容体スーパーファミリーの一種であり、脂質及びグルコース代謝の制御に関与すると言われている。
【０００５】
これまでにＰＰＡＲｓには複数のサブタイプ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγが同定されている。これらはいずれもレチノイドＸ受容体（ｒｅｔｉｏｉｄ Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＸＲ）とヘテロダイマーを形成し、特徴的な１ｂｐのスペーサーを含むダイレクトリピート（ＤＲ１）を有する標的遺伝子のエンハンサー領域であるＰＰＡＲ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＰＰＲＥ）に結合することによって当該標的遺伝子の転写を制御する。また、ＰＰＡＲｓのアゴニストがリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合することが転写の活性化に必要である。
【０００６】
ＰＰＡＲｓは、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化等の種々の疾患に関与する重要なレセプターのひとつであり、ＰＰＡＲｓの活性を制御する化合物、たとえばＰＰＡＲｓを活性化するリガンド（アゴニスト）は、高脂血症や肥満の改善や予防に効果を奏するものと期待されている。
【０００７】
これまでに、脂肪酸、エイコサノイド、カルバプロスタサイクリン、非ステロイド抗炎症剤等を含む数多くの物質が、ＰＰＡＲｓの活性化に関与することが知られている。またＰＰＡＲｓは合成セラミドによっても活性化されることが報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
フィトスフィンゴシンは皮膚角質層内にある保湿・柔軟成分であるセラミドの前駆体であり、植物性セラミドの一種である。フィトスフィンゴシンは、保湿成分として主に化粧品等の成分として利用されている。
【０００９】
【非特許文献１】Ｔａｎ，Ｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、２００１年、第１５巻、第３２６３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＰＰＡＲｓを活性化することのできる化合物を提供し、さらに当該活性化を通じた生活習慣病の改善に有用な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、天然セラミドに類似した構造を有する合成セラミドについてＰＰＡＲｓの活性化作用を調べた結果、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物が所望の活性を有していることを見出し、下記の各本発明を完成させた。
【００１２】
（１）フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を有効成分とする、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
【００１３】
（２）フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物が下記式（１）〜（８）のいずれかで示される化合物である、（１）に記載のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
【００１４】
式（１）
【化９】
【００１５】
式（２）
【化１０】
【００１６】
式（３）
【化１１】
【００１７】
式（４）
【化１２】
【００１８】
式（５）
【化１３】
【００１９】
式（６）
【化１４】
【００２０】
式（７）
【化１５】
【００２１】
式（８）
【化１６】
【００２２】
（３）（１）又は（２）に記載のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤を含む生活習慣病改善剤。
【００２３】
（４）生活習慣病が肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症又は動脈硬化のいずれかである、（３）に記載の生活習慣病改善剤。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の脂質代謝改善剤は、既知のＰＰＡＲｓアゴニストよりも高い活性化作用を有しており、ＰＰＡＲｓを活性化することで肥満や糖尿病等の生活習慣病の予防、改善、治療に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物、特に下記式（１）〜（７）のいずれかで示されるフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を有効成分とするＰＰＡＲｓ活性化剤に関する。
【００２６】
式（１）
【化１７】
【００２７】
式（２）
【化１８】
【００２８】
式（３）
【化１９】
【００２９】
式（４）
【化２０】
【００３０】
式（５）
【化２１】
【００３１】
式（６）
【化２２】
【００３２】
式（７）
【化２３】
【００３３】
式（８）
【化２４】
【００３４】
以下、上記式（１）の化合物をＡ９、式（２）の化合物をＢ９、式（３）の化合物をＣ９、式（４）の化合物をＣ５０、式（５）の化合物をＦ６６、式（６）の化合物をＧ６６、式（７）の化合物をＨ６６、式（８）の化合物をｐｈＣｅｒと、それぞれ表すこととする。
【００３５】
式（１）〜（８）の化合物はいずれも、一般式Ｒ−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ（ＮＨＲ１）−ＣＨ２ＯＨ（式中、Ｒは長鎖のアルキル基、Ｒ１は任意の置換基）で表される骨格構造を有しており、スフィンゴシン骨格中の４位と５位の二重結合部分が４位に水酸基、５位に水素がそれぞれ飽和されている。かかる構造的特徴を有する化合物は、一般にフィトスフィンゴシン（Ｐｈｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）骨格を有する化合物として理解される。
【００３６】
フィトスフィンゴシンは主に酵母細胞に存在するスフィンゴ脂質（Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）の一種で、生体の主要な細胞膜成分の一つであり、構造的機能とともに信号転移体系の信号伝達物質で、多様な生物学的機能を有する生理活性物質であるが、これまでのところ、フィトスフィンゴシン骨格を有する化合物がＰＰＡＲｓに対して活性化作用を有していることは知られていない。
【００３７】
本発明は、これらフィトスフィンゴシン骨格を有する化合物がＰＰＡＲｓを活性化するとの知見を得、これらをＰＰＡＲｓ活性化剤として、さらにはこれらを生活習慣病改善剤として使用することを提供するものである。
【００３８】
上記式（１）〜（７）の化合物はいずれも、韓国ポハン（Ｐｏｈａｎｇ）市のポハン科学技術大学（Ｐｏｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＪｅｏｎｇ−Ｊｕ Ｐａｒｋ博士により合成され、当業者に供給されている化合物ライブラリーに含まれているセラミド化合物である（Ｐａｒｋ Ｊ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００８年、第３６巻、第５号、第２２０−２２８頁）。
【００３９】
また式（８）の化合物はＡｖａｎｔｉ社（http://www.avantilipids.com/index.htm）から市販されている酵母由来の天然セラミドの一種である。
【００４０】
本発明にかかるフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物には、上記化合物ライブラリーに含まれる特定の化合物や市販されているフィトスフィンゴシンだけでなく、その他の酵母や哺乳動物、植物等から既知の方法により分離あるいは精製されるフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物、有機化学合成手法により合成されるフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物又はその誘導体等も含まれる。
【００４１】
本発明のＰＰＡＲｓ活性化剤あるいはこれを含む生活習慣病改善剤は、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を単体で、あるいは適当な賦形剤や食品あるいは医薬として許容される担体と共に使用することができる。
【００４２】
医薬は、例えばフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を薬学的に許容され得る種々の賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、希釈剤等を用いて製剤化することにより製造することができる。製剤中のスフィンゴ糖脂質の含有量は、１×１０−６〜０．１質量％、好ましくは１×１０−４〜０．０１質量％程度に調節すればよい。
【００４３】
本発明のＰＰＡＲｓ活性化剤あるいはこれを含む生活習慣病改善剤の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げられる。投与剤形としては、例えば、注射剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。
【００４４】
また本発明のＰＰＡＲｓ活性化剤あるいはこれを含む生活習慣病改善剤は、飲食品、又は飼料等に配合して投与することもできる。特に、日常的に摂取可能な食品、機能性食品、栄養補助食品として、もしくはこれらに混合して用いることが好ましい。
【００４５】
飲食品は、例えばフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物に、デキストリン、デンプン等の糖類、ゼラチン、カゼイン、ホエー、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質、アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類、セルロース、グアガム、ジェランガム、アラビアガム等の多糖類、大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより製造することができる。飲食品の形態は問われず、固形物（粉末状、顆粒状等）、半固形物（ゼリー状、ペースト状等）、液状物のいずれであっても良い。
【００４６】
またフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物の摂取量は、目的とする作用効果、投与方法、期間、年齢、性別、体重等により異なるが、成人１日当たり、通常０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇの範囲から適宜選択できる。
【００４７】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定的に解釈されるものではない。
【実施例】
【００４８】
＜実施例＞
マウスのＲＸＲαの全長ｃＤＮＡをクローニングするために、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて調製したマウス肝臓由来の全ＲＮＡに対して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社）及びＫＯＤ ＰｌｕｓＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、下記のプライマー１とプライマー２を用いて、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で６０秒間を１サイクルとして２０サイクル行った。
【００４９】
プライマー１ ５’−catggacaccaaacatttcctgccgc−３’ （配列番号１）
プライマー２ ５’−gcctaggtggcttgatgtggtgcctc−３’（配列番号２）
【００５０】
増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製後、５ユニットのＴａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を用いて７０℃で３０分間インキュベートして３’Ａ−ｔａｉｌｉｎｇを行った。
【００５１】
反応生成物をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に組み込んで大腸菌（ＸＬＬ１−Ｂｌｕｅ株）を形質転換させてプラスミドｐＧＥＭ−ｍＲＸＲαを作成し、クローニング断片の塩基配列を決定した。
【００５２】
このベクターを鋳型として、ＨｉｎｄIIIサイトを含む下記プライマー３とプライマー４とを用いてＰＣＲを行った。
【００５３】
プライマー３ ５’−caagcttatggacaccaaacatttcctgccgc−３’ （配列番号３）
プライマー４ ５’−caagcttctaggtggcttgatgtggtgcctc−３’（配列番号４）
【００５４】
増幅断片を精製後、上記と同様に３’Ａ−ｔａｉｌｉｎｇを行い、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングして、プラスミドｐＧＥＭ−ｍＲＸＲα−ＨｉｎｄIIIを得た。
【００５５】
ｐＧＥＭ−ｍＲＸＲα−ＨｉｎｄIIIを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化後、同じくＨｉｎｄIIIで消化しＣＩＰ処理したｐＣＭＸ（Ｕｍｅｓｏｎｏら、Ｃｅｌｌ、１９９１年、第６５巻、第１２５５頁）と連結して、プラスミドｐＣＭＸ−ｍＲＸＲαを作成し、再度塩基配列を決定した。
【００５６】
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）をｐＣＭＸ−ｍＲＸＲαで形質転換させた。形質転換細胞のｍＲＸＲαのタンパク質の発現をウサギ抗ＲＸＲαポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてイムノブロッティングを行ったところ、予測された分子量（５４ｋＤ）の位置に単一バンドが確認された（図１）。
【００５７】
上記形質転換されたＮｉＨ３Ｔ３細胞を、１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社）を用いて、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。培養後の細胞（１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を９６穴プレートに播いてさらに３日間培養した後、リポフェクタミン２０００を用いて、１００ｎｇのＰＰＲＥｘ３−ｔｋ−Ｌｕｃ、１００ｎｇの ｐＲＬ−ＳＶ４０（コントロールベクター）、１２．５ｎｇのｐＣＭＸ−ｍＲＸＲα及び１２．５ｎｇのｐＣＭＸ、ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲα、ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲβ又はｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲγを含む反応液（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、全１５０μＬ)で形質転換させた。これらのベクターは、Ｕｍｅｓｏｎｏら（Ｃｅｌｌ、１９９１年、第６５巻、第１２５５頁）によって開発された、ＰＰＡＲｓのアゴニストを探索することのできるベクター群である。
【００５８】
レポータープラスミドであるＰＰＲＥｘ３−ｔｋ−Ｌｕｃは、アシルＣｏＡプロモーターの上流にヘルペスウイルスチミジンキナーゼ由来のＰＰＲＥを３コピーとルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）を有している。ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲα、ｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲβ及びｐＣＭＸ−ｍＰＰＡＲγは、米国カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ研究所（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のＲ．Ｍ．Ｅｖａｎｓ博士から分与されたｐＣＭＸ（前記Ｕｍｅｓｏｎｏら）にマウスのＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγをコードする遺伝子を発現可能に組み込んだプラスミドである。また、ｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社）は形質転換効率を確認するためのコントロールプラスミドであり、ＳＶ４０プロモーターとウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子に対するエンハンサーを備えている。
【００５９】
形質転換から１８時間後、培地を１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含むフェノールレッドフリーのＤＭＥＭＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に換えた。この細胞に検体（韓国ポハン工科大学のＰａｒｋ教授の合成による６４０種の合成フィトスフィンゴシン）、既知の選択的ＰＰＡＲα選択的アゴニストであるＷＹ−１４６４３（ＷＹと表す）と、既知の選択的ＰＰＡＲβアゴニストであるＬ−１６５，０４１（ＬＤと表す）、又は既知の選択的ＰＰＡＲγアゴニストであるＣｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ（Ｃｉｇと表す）を加えて２４時間インキュベーションした。コントロールとしてＤＭＳＯ添加を用意した。
【００６０】
検体添加２４時間後, Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。各サンプルについてホタルルシフェラーゼ活性値をウミシイタケルシフェラーゼ活性値を用いて標準化し、標準偏差を計算した。統計解析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った（コントロールに対するＰ＜０．０５又は０．０１）。
【００６１】
上記のアッセイの結果、７種のセラミド化合物（前期式（１）〜（７）で示される化合物）すべてに、ルシフェラーゼ活性の上昇作用が確認された（図２〜４）。濃度５×１０−６ＭにおけるＡ９、Ｂ９、Ｃ９、Ｆ６６、Ｇ６６及びＨ６６によるＰＰＡＲα活性化の最大値はコントロールに対して優位に高かった（図２）。Ｆ６６、Ｇ６６、又はＨ６６によるＰＰＡＲαの活性化は、濃度１×１０−５〜１×１０−７ＭにおいてＷＹのそれと同程度か、又は高かった。
【００６２】
また、Ａ９、Ｂ９、Ｃ９、Ｆ６６、Ｇ６６、又はＨ６６によるＰＰＡＲβの活性化には容量依存性が認められた（図３）。Ａ９、Ｂ９、Ｃ９、Ｃ５０、Ｆ６６、Ｇ６６、又はＨ６６によるＰＰＡＲγの活性化についても容量依存性が確認され、それらの活性化はＣｉｇのそれよりも高かった（図４）。
【００６３】
さらに、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物の一種である化合物ｐｈＣｅｒについても上記と同じアッセイ系を行ったところ、ＰＰＡＲｓに対して活性化作用を示すことが確認された（図５ａ−ｃ）。
【００６４】
以上のように、式（１）〜（８）のフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物は、既知のＰＰＡＲｓアゴニストよりも高いＰＰＡＲｓ活性化作用を有していることが確認された。したがって、フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物、特に式（１）〜（８）のフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物は、より優れたＰＰＡＲｓ活性化剤として利用可能であり、また種々の生活習慣病の改善剤としての利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】マウスＲＸＲαをコードするプラスミドで形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＲＸＲの発現を示す抗ウサギＲＸＲα抗体を用いたイムノブロッティング写真である。
【図２】ルシフェラーゼアッセイで選択された７種類の化合物についての、ＰＰＡＲα活性化作用の濃度依存性を示すグラフである。
【図３】ルシフェラーゼアッセイで選択された７種類の化合物についての、ＰＰＡＲβ活性化作用の濃度依存性を示すグラフである。
【図４】ルシフェラーゼアッセイで選択された７種類の化合物についての、ＰＰＡＲγ活性化作用の濃度依存性を示すグラフである。
【図５】化合物ｐｈＣｅｒ（１μＭ、１０μＭ）についての、ＰＰＡＲｓ活性化作用を示すグラフである。パネルａはＰＰＡＲαの、パネルｂはＰＰＡＲβの、パネルｃはＰＰＡＲγの活性化をそれぞれ示す。ＷＹ、ＬＤ、ＣｉｇはそれぞれのＰＰＡＲに対する選択的アゴニスト（比較対象）を、ＤＭＳＯはコントロールをそれぞれ示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を有効成分とする、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
【請求項２】
フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物が下記式（１）〜（８）のいずれかで示される化合物である、請求項１に記載のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
式（１）
【化１】
式（２）
【化２】
式（３）
【化３】
式（４）
【化４】
式（５）
【化５】
式（６）
【化６】
式（７）
【化７】
式（８）
【化８】
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤を含む生活習慣病改善剤。
【請求項４】
生活習慣病が肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症又は動脈硬化のいずれかである、請求項３に記載の生活習慣病改善剤。
【請求項１】
フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物を有効成分とする、ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
【請求項２】
フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミド化合物が下記式（１）〜（８）のいずれかで示される化合物である、請求項１に記載のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤。
式（１）
【化１】
式（２）
【化２】
式（３）
【化３】
式（４）
【化４】
式（５）
【化５】
式（６）
【化６】
式（７）
【化７】
式（８）
【化８】
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体活性化剤を含む生活習慣病改善剤。
【請求項４】
生活習慣病が肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症又は動脈硬化のいずれかである、請求項３に記載の生活習慣病改善剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１３２６２２（Ｐ２０１０−１３２６２２Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１１６６５（Ｐ２００８−３１１６６５）
【出願日】平成２０年１２月６日（２００８．１２．６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）独立行政法人科学技術振興機構、地域イノベーション創出総合支援事業、重点地域研究開発プログラム育成研究の成果としての及び平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月６日（２００８．１２．６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）独立行政法人科学技術振興機構、地域イノベーション創出総合支援事業、重点地域研究開発プログラム育成研究の成果としての及び平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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