未分化細胞の心筋分化活性検出用マーカー、核酸分子、プライマーペア、キット、心筋分化抑制剤、未分化細胞の心筋分化活性検出方法、心筋分化活性を有する細胞の単離方法、未分化細胞の心筋分化活性のモニタリング方法、および未分化細胞の心筋分化の抑制方法
【課題】細胞の心筋分化活性の的確かつ簡易な検出に有用なマーカーに関する。また、本発明は、核酸分子、プライマーペア、キット、心筋分化抑制剤、未分化細胞の心筋分化活性検出方法、心筋分化活性を有する細胞の単離方法、未分化細胞の心筋分化活性のモニタリング方法、および未分化細胞の心筋分化の抑制方法を提供する。
【解決手段】細胞の心筋分化活性と相関を示す、CMP（cardiomyogenesis predictor)遺伝子またはその遺伝子産物からなるマーカー。未分化細胞の心筋分化活性を検出するための遺伝子マーカーであって、特定の配列のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【解決手段】細胞の心筋分化活性と相関を示す、CMP（cardiomyogenesis predictor)遺伝子またはその遺伝子産物からなるマーカー。未分化細胞の心筋分化活性を検出するための遺伝子マーカーであって、特定の配列のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２００６―１０９８５８号（出願日：２００６年４月１２日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、細胞の心筋分化活性の的確かつ簡易な検出に有用なマーカーに関する。また、本発明は、核酸分子、プライマーペア、キット、心筋分化抑制剤、未分化細胞の心筋分化活性検出方法、心筋分化活性を有する細胞の単離方法、未分化細胞の心筋分化活性のモニタリング方法、および未分化細胞の心筋分化の抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
心筋細胞は、出生前においては自律拍動をしながらも活発に分裂増殖している。しかしながら、心筋細胞は出生と同時に速やかにその分裂能を喪失し、肝細胞等とは異なり二度と分裂能を獲得することはないのが通常である。
【０００４】
近年、成熟した心筋組織中にも心筋細胞前駆細胞が含まれることが明らかとされた。しかしながら、心筋細胞前駆細胞の数は非常に僅かであり、心筋細胞に障害が生じた際にそれを補完して心機能を完全に回復するには十分ではない。したがって、虚血性心疾患や心筋症等により心筋に負荷や壊死が生じた場合には、心筋細胞は細胞分裂でなく主に細胞肥大という形で適応する。心筋細胞肥大は初期においては負荷に対する生理的適応現象とされるが、共存する心線維芽細胞の増生、間質の線維化と相まって心臓自体の拡張機能の低下、さらには収縮機能の低下へと結びつき、心不全を呈するようになる。
【０００５】
虚血性心疾患や心筋症等による心不全の治療は、心収縮力の増強、血管拡張薬による圧負荷・容量負荷の軽減、利尿薬による体液量の減少等の対症療法を中心として行われている。さらに、重症心不全に対する根本的な治療法としては心臓移植が挙げられる。しかしながら、心臓移植は、臓器提供者の不足、脳死判定の難しさ、拒絶反応、医療費等の多くの問題を有している。そこで、適切な心疾患治療のため、失われた心筋を再獲得する方法の開発が求められている。
【０００６】
心筋を再獲得する一つの方法としては、心筋細胞の分裂増殖能の再獲得させる方法が挙げられる。この方法の実施のためには、出生後、心筋細胞が分裂能を喪失する機序を究明することが求められる。そして、かかる機序を明らかとし、遺伝子治療等によって心筋細胞に分裂能を再獲得させることが期待される(非特許文献１)。
【０００７】
また、心筋を再獲得する他の方法としては、心筋細胞以外の細胞を心筋細胞に変換する、分化誘導法が挙げられる。Murryらは、骨格筋分化のマスターキー遺伝子であるMyoDを、in vitroにて心臓に導入することにより、非心筋細胞(線維芽細胞)を骨格筋細胞に変換しうることを報告している(非特許文献２) 。また、心筋細胞において、Nkx2.5、GATA4、MEF2C等の様々な心筋細胞特異的な転写因子がクローニングされている。しかしながら、これらの遺伝子を単独または複数にて他の細胞に遺伝子導入することにより、心筋細胞が作製されたという報告はない。したがって、心筋分化機序の詳細の解明、さらには心疾患治療において、細胞の心筋分化の制御に利用可能な遺伝子が依然として必要とされるといえる。
【０００８】
また、心疾患の他の治療方法としては、心筋細胞移植が挙げられる。近年、幹細胞もしくは心筋前駆細胞を心筋障害部位に移植して心筋細胞へと分化させる方法、または幹細胞もしくは心筋前駆細胞をin vitroで心筋細胞へと分化させた後に心筋障害部位に移植する方法が、再生医学の観点から注目されている。この方法は患者本人由来の細胞を移植するため、拒絶の心配がない。
【０００９】
しかしながら、心筋細胞移植においては、移植した細胞が移植部位に適した表現形を獲得せず、目的外の種類の細胞等に分化した場合、不整脈や心不全を生ずる危険性がある。したがって、心筋細胞移植治療の安全性向上のためには、細胞の心筋細胞への分化のしやすさ、すなわち「心筋分化活性」を適切に予測することが不可欠である。
【００１０】
細胞の心筋分化活性の指標となるマーカーの探索が国内外で盛んに行われている（非特許文献３）。心筋分化活性の指標となるマーカーは、心筋分化能の比較的高い未分化細胞の分離する技術、さらには特異的かつ効率的な心筋細胞分化誘導技術への応用が期待される。しかしながら、未分化段階において用いうる、細胞の心筋分化活性の指標となるマーカーは依然として存在していない。従前の研究では、未分化細胞に対して心筋分化誘導刺激を施した後、分化過程の初期に発現が変動する遺伝子を探索する手法が取られている。このため、得られたマーカーは「既に開始してしまった心筋細胞分化の初期過程」のマーカーではあっても、分化誘導前の「未分化細胞が有する心筋細胞への分化活性」についてのマーカーではない。心疾患の適切な治療のためには、未分化細胞の品質評価および心筋分化能の高い未分化細胞の分離が必要とされる。したがって、未分化段階において、細胞の心筋分化活性の検出に用いうるマーカーが依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tamamori et al., Critical role of cyclin D1 nuclear import in cardiomyocyte proliferation, Circ Res. 2003, Jan 10, 92(1), e12-9
【非特許文献２】Murryet al., Muscle differentiation during repair of myocardial necrosis in rats via gene transfer with MyoD, J Clin Invest., 1996, Nov 15, 98(10), 2209-17
【非特許文献３】Peng et al., Microarray analysis of global changes in gene expression during cardiac myocyte differentiation, Physiol Genomics., 2002, 9(3), 145-55、日高京子等、「ES細胞で発現する心筋分化関連遺伝子の探索・解析システムの構築」、「再生医療」、2005、4(Suppl)、88、秋丸裕司等、「ES細胞の心筋分化を制御するシグナルの解析」、「再生医療」、2005、4(Suppl)、89
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、今般、未分化段階において、細胞における複数の特定遺伝子（以下、「ＣＭＰ（cardiomyogenesis predictor)遺伝子」という。）の発現量が、細胞の心筋分化活性と有意な相関を示すとの知見を得た。さらに、本発明者らは、ＣＭＰ遺伝子およびその遺伝子産物を、マーカーとして用いることにより、細胞の心筋分化活性を的確に検出することができるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１３】
したがって、本発明は、未分化細胞の心筋分化活性を検出するためのマーカーの提供をその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そして、本発明による未分化細胞の心筋分化活性を検出するための遺伝子マーカーは、下記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントからなるものである：
（ａ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ（ａ）に記載のポリヌクレオチドと機能的に同等なものである、ポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、上記マーカーを用いることにより、未分化段階において、細胞の心筋分化活性を的確に検出することが可能となる。よって、本発明によるマーカーは、未分化細胞の品質評価および心筋分化能の高い未分化細胞の単離において有利に利用することができる。また、本発明による遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドの発現を制御することにより、細胞の心筋分化を制御することが可能となる。よって、本発明における上記ポリヌクレオチドは、心筋分化機序の詳細の解明や心筋細胞の製造において有利に利用することができる。よって、かかる本発明が提供されることは、心疾患の治療において意義があるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における収縮ノジュール数の時間経過を示す図である。 また、図１Ｂは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における収縮ノジュールサイズの時間経過を示す図である。
【図２】図２Ａは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、MLC2a遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｂは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、MLC2v遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｃは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、αMHC遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｄは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、βMHC遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｅは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、Nkx2.5遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｆは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、GATA４遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｇは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、MEF2C遺伝子の発現の時間経過を示す図である。
【図３】図３Ａは、心筋細胞分化を誘導した細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における心筋細胞マーカー遺伝子のｍRNA発現データを主成分分析した際のスクリープロットを示す図である。また、図３Ｂは、心筋細胞分化を誘導した細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における心筋細胞マーカー遺伝子のｍRNA発現データを主成分分析した際の変量プロットを示す図である。
【図４】図４Ａは、心筋分化を誘導した細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における心筋細胞マーカー遺伝子のmRNA発現量データを主成分分析した際の第１主成分得点の時間経過を示す図である。また、図４Ｂは、心筋分化を誘導した細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における心筋細胞マーカー遺伝子のmRNA発現量データを主成分分析した際の第２主成分得点の時間経過を示す図である。
【図５】図５Ａは、RNAi処理によるG52細胞のCMP2遺伝子の発現量の変化を示す図である。また、図５Ｂは、RNAi処理よるG52細胞のCMP13遺伝子の発現量の変化を示す図である。
【図６】図６は、CMP2またはCMP13遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図７】図７ＡおよびＢは、RNAi処理によるG52細胞のCMP1〜24遺伝子の発現量の変化を示す図である。
【図８−１】図８Ａ〜Ｃは、CMP1〜3遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−２】図８Ｄ〜Ｆは、CMP4〜6遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−３】図８Ｇ〜Ｉは、CMP7〜9遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−４】図８Ｊ〜Ｌは、CMP10〜13遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−５】図８Ｍ〜Ｏは、CMP14〜16遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−６】図８Ｐ〜Ｒは、CMP17〜20遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−７】図８Ｓ〜Ｕは、CMP21〜24遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
遺伝子マーカー
本発明による遺伝子マーカーは、以下にＣＭＰ１〜２４として記載されるＣＭＰ遺伝子を含んでなる。かかる遺伝子マーカーの細胞における発現量を測定することにより、細胞の心筋分化活性を簡易に検出することが可能となる。
【００１８】
ＣＭＰ遺伝子の配列情報の詳細は、公知のデータベースにおいて取得することができ、例えば、ＣＭＰ１はアメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_027547に相当し、ＣＭＰ２は同アクセッション番号 NM_178737に相当し、ＣＭＰ３は同アクセッション番号 NM_144888に相当し、ＣＭＰ４は同アクセッション番号 NM_182991に相当し、ＣＭＰ５は同アクセッション番号 NM_029537に相当し、ＣＭＰ６は同アクセッション番号 NM_009982に相当し、ＣＭＰ７は同アクセッション番号 NM_010169に相当し、ＣＭＰ８は同アクセッション番号 NM_011348に相当し、ＣＭＰ９は同アクセッション番号 NM_030700に相当し、ＣＭＰ１０は同アクセッション番号 NM_025582に相当し、ＣＭＰ１１は同アクセッション番号 NM_133362に相当し、ＣＭＰ１２は同アクセッション番号 NM_025422に相当し、ＣＭＰ１３は同アクセッション番号 NM_021457に相当し、ＣＭＰ１４は同アクセッション番号 NM_130895に相当し、ＣＭＰ１５は同アクセッション番号 NM_010331に相当し、ＣＭＰ１６は同アクセッション番号 NM_018763に相当し、ＣＭＰ１７は同アクセッション番号 AK036481に相当し、ＣＭＰ１８は同アクセッション番号 XM_619720に相当し、ＣＭＰ２０は同アクセッション番号 NM_010363に相当し、ＣＭＰ２１は同アクセッション番号 AK003902に相当し、ＣＭＰ２２は同アクセッション番号 NM_031998に相当し、ＣＭＰ２３は同アクセッション番号 NM_010447に相当し、ＣＭＰ２４は同アクセッション番号 NM_009627に相当し、ＣＭＰ１９は国際塩基配列データベース（the International Nucleotide Sequence Databases：INSD）におけるアクセッション番号BB119527に相当する。
【００１９】
また、上記ＣＭＰ遺伝子の具体的なヌクレオチド配列としては、以下の配列が挙げられる。すなわち、ＣＭＰ１は配列番号１で表されるものであり、ＣＭＰ２は配列番号３で表されるものであり、ＣＭＰ３は配列番号５で表されるものであり、ＣＭＰ４は配列番号７で表されるものであり、ＣＭＰ５は配列番号９で表されるものであり、ＣＭＰ６は配列番号１１で表されるものであり、ＣＭＰ７は配列番号１３で表されるものであり、ＣＭＰ８は配列番号１５で表されるものであり、ＣＭＰ９は配列番号１７で表されるものであり、ＣＭＰ１０は配列番号１９で表されるものであり、ＣＭＰ１１は配列番号２１で表されるものであり、ＣＭＰ１２は配列番号２３で表されるものであり、ＣＭＰ１３は配列番号２５で表されるものであり、ＣＭＰ１４は配列番号２７で表されるものであり、ＣＭＰ１５は配列番号２９で表されるものであり、ＣＭＰ１６は配列番号３１で表されるものであり、ＣＭＰ１７は配列番号３３で表されるものであり、ＣＭＰ１８は配列番号３４で表されるものであり、ＣＭＰ１９は配列番号３６で表されるものであり、ＣＭＰ２０は配列番号３７で表されるものであり、ＣＭＰ２１は配列番号３９で表されるものであり、ＣＭＰ２２は配列番号４１で表されるものであり、ＣＭＰ２３は配列番号４３で表されるものであり、ＣＭＰ２４は配列番号４５で表されるものである。したがって、本発明の一つの態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２０】
また、ＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ1〜6、ＣＭＰ8〜10、ＣＭＰ13、ＣＭＰ18、ＣＭＰ20およびＣＭＰ24は、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とするものである。したがって、本発明の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２５、配列番号３４、配列番号３７または配列番号４５で表されるヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とするものである。
【００２１】
また、ＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ7、ＣＭＰ12、ＣＭＰ16、ＣＭＰ17、ＣＭＰ21およびＣＭＰ23は、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少することを特徴とするものである。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３９または配列番号４３で表されるヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少することを特徴とするものである。
【００２２】
また、本発明による遺伝子マーカーは、ＣＭＰ１〜２４と、機能的に同等なポリヌクレオチドも包含する。ここで、「機能的に同等」とは、ＣＭＰ遺伝子と同等に、細胞の心筋分化活性と相関を示すことを好ましくは意味する。さらに、本発明による上記ポリヌクレチオドは、心筋分化制御に利用しうるものである。したがって、かかるポリヌクレチオドと機能的に同等なポリヌクレチオドは、より好ましくは、ＣＭＰ遺伝子と同等な細胞の心筋分化制御活性を有するものである。上記ポリヌクレオチドとＣＭＰ遺伝子との機能的同等性は、例えば、後述する本発明による核酸分子またはプライマーを用い、ポリヌクレオチドの発現量を測定し、該発現量と、拍動を生ずる細胞の数や大きさとの相関を公知の統計手法により決定し、ＣＭＰ遺伝子のそれと比較することにより簡易に決定することができる。
【００２３】
また、本発明による遺伝子マーカーは、心筋分化活性の指標となる限り、ＣＭＰ遺伝子と配列相同性を有するものであってもよい。そして、本発明の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、ＣＭＰ遺伝子をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＣＭＰ遺伝子と機能的に同等なポリヌクレオチドからなる。また、かかる配列相同性は、より好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上である。
【００２４】
本発明において、上記ヌクレオチド配列やアミノ酸配列の相同性は、公知の手法によって決定されるものであり、かかる手法としては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３−５８７７（１９９３）〕等が挙げられる。また、このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されており〔Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）〕、本発明においても利用することができる。さらに、他の好ましい手法としては、遺伝情報処理ソフトウェア ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）を用いる手法が挙げられる。ＧＥＮＥＴＹＸを用いる場合には、ＢＬＡＳＴによる解析のほかにＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法によるホモロジー解析を行うことができ、本発明における相同性決定において有利に利用することができる。
【００２５】
また、本発明による遺伝子マーカーの一部は、ＣＭＰ遺伝子のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列からなる。すなわち、ＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ１〜１６、１８、２０〜２４は、ポリペプチドをコードするものである。具体的には、ＣＭＰ遺伝子において、配列番号１（ＣＭＰ１：特に、第６４〜１８６３ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３（ＣＭＰ２：特に、第２３０〜２６４４ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号５（ＣＭＰ３：特に、第２７７〜１７８８ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号７（ＣＭＰ４：特に、第４２〜１０５５ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号９（ＣＭＰ５：特に、第９９〜７７９ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１１（ＣＭＰ６：特に、第７０〜１４５８ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１３（ＣＭＰ７：特に、第６０〜１３５２ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１５（ＣＭＰ８：特に、第６１０〜２９４３ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１６で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１７（ＣＭＰ９：特に、第７７〜１９２７ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１９（ＣＭＰ１０：特に、第４０〜６４５ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２１（ＣＭＰ１１：特に、第２３４〜７６７ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２３（ＣＭＰ１２：特に、第３０１〜９６０ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２４で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２５（ＣＭＰ１３：特に、第３９２〜２３２０ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２６で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２７（ＣＭＰ１４：特に、第３９６〜２５０１ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２８で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２９（ＣＭＰ１５：特に、第９７〜１９６２ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号３０で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３１（ＣＭＰ１６：特に、第４７０〜１９２１ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号３２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３４（ＣＭＰ１８：特に、第９２〜１７７４ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号３５で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３７（ＣＭＰ２０：特に、第１１３〜７６３ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３９（ＣＭＰ２１：特に、第２２１〜４５７ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４０で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号４１（ＣＭＰ２２：特に、第１４〜１１３５ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号４３（ＣＭＰ２３：特に、第２５〜９８７ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４４で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号４５（ＣＭＰ２４：特に、第１７６〜７３０ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列をコードするものである。
【００２６】
したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものである。
【００２７】
また、上述の通り、蛋白質コード領域を有するＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ１〜６、ＣＭＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８、ＣＭＰ２０およびＣＭＰ２４は、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加する。したがって、本発明の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３５、配列番号３８または配列番号４６で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とするものである。
【００２８】
また、蛋白質コード領域を有するＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ２１およびＣＭＰ２３は、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少する。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０または配列番号４４で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少することを特徴とするものである。
【００２９】
また、本発明による遺伝子マーカーは、上記アミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、かつ上記アミノ酸配列と機能的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドを含んでなる。ここで、上記「１個または数個」は、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜２個である。
【００３０】
さらに、本発明の別の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、上記アミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ上記アミノ酸配列と機能的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドを含んでなる。さらに、上記遺伝子マーカーにおける相同性は、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。
【００３１】
また、上記遺伝子マーカーは、心筋分化活性の指標としうる限り、ＣＭＰ遺伝子または該遺伝子と機能的に同等なポリヌクレオチドのフラグメントであってもよい。したがって、本発明の別の態様によれば、遺伝子マーカーは、ＣＭＰ遺伝子または該遺伝子と機能的に同等なポリヌクレオチドの部分配列からなる。かかるポリヌクレオチドの有するヌクレオチド残基数は、心筋分化活性の指標としうる限り限定されないが、例えば、１００ヌクレオチド残基以上である。
【００３２】
上述の遺伝子マーカーは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。より具体的には、上記遺伝子マーカーは、ゲノム中に存在するＤＮＡであってもよく、その転写産物であるｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡであってもよい。また、上記ｍＲＮＡを直接遺伝子マーカーとして用いてもよく、本発明にはかかる態様も包含される。したがって、本発明の別の態様によれば、遺伝子マーカーは、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等な遺伝子をコードする上記ヌクレオチド配列において、チミン残基をウラシル残基に置換した、リボヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含んでなる。
【００３３】
また、上記遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００３４】
ポリペプチドマーカー
また、本発明によれば、ＣＭＰ遺伝子の発現産物を細胞の心筋分化活性の検出用マーカーとして利用することができる。そして、かかるマーカーとしては、上記ＣＭＰ遺伝子１〜１６、１８、２０〜２４にコードされるポリペプチドからなるマーカーが挙げられる。したがって、本発明の別の態様によれば、細胞の心筋分化活性を検出するためのポリペプチドマーカーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含んでなる。
【００３５】
また、蛋白質コード領域を有するＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ１〜６、ＣＭＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８、ＣＭＰ２０およびＣＭＰ２４のコードするポリペプチドは細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加しうる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、上記ポリペプチドマーカーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３５、配列番号３８または配列番号４６で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とするものである。
【００３６】
また、蛋白質コード領域を有するＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ２１およびＣＭＰ２３のコードするポリペプチドは、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少しうる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、上記ポリペプチドマーカーは、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０または配列番号４４で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少することを特徴とするものである。
【００３７】
さらに、ＣＭＰ遺伝子と機能的に同等な遺伝子にコードされるポリペプチドもまた、細胞の心筋分化活性の指標とすることができる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、上記ポリペプチドマーカーは、上記アミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ遺伝子にコードされるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを含んでなる。
【００３８】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、ポリペプチドマーカーは、上記アミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ遺伝子にコードされるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを含んでなる。
【００３９】
また、本発明によるポリペプチドマーカーは、心筋分化活性の指標としうる限り、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの全配列を有する必要はなく、その部分配列であってもよい。よって、本発明によるポリペプチドマーカーは、上述のポリペプチドのフラグメントを包含する。そして、かかるフラグメントの有するアミノ酸残基は、例えば、１３個以上とされる。
【００４０】
細胞
上記遺伝子マーカーおよびポリペプチドマーカーは、いずれも未分化段階において、細胞の心筋分化活性の指標として用いることができる。したがって、本発明における細胞は、未分化細胞である。また、本発明における細胞は、好ましくは哺乳動物由来細胞であり、より好ましくはヒト、マウスまたはサル由来細胞である。
【００４１】
核酸分子／プローブ
また、本発明による遺伝子マーカーを指標として細胞の心筋分化活性を検出するために、本発明による遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドまたはこれと相補的なポリヌクレオチドを標的として、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズうる核酸分子を用いることができる。ここで、相補的とは、２つのヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下において、対合しうるものであることを意味し、例えば、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）との関係、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との関係をいう。
【００４２】
また、本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で遺伝子マーカーにハイブリダイズし、遺伝子マーカー以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度等に依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を遺伝子マーカーに特異的にハイブリダイズさせることができる。また、本発明による遺伝子マーカーにハイブリダイズする核酸分子は、特異的なハイブリダイズが可能であれば、その遺伝子マーカーに対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、その遺伝子マーカーに相補的なヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００４３】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい態様によれば、核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００４４】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。本発明による核酸分子は上述の通り、遺伝子マーカーを標的とするが、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができる。
【００４５】
本発明による核酸分子は、上記遺伝子マーカーの検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、該核酸プローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
【００４６】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１８ヌクレオチド以上とすることが好ましく、また、３０ヌクレオチド以下、より好ましくは２４ヌクレオチド以下とすることが好ましい。
【００４７】
さらに、本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、該核酸分子を適宜標識することが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）が挙げられる。
【００４８】
また、本発明による核酸分子は、本発明による遺伝子マーカーの検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１８〜３０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは１８〜２４ヌクレオチドとする。
【００４９】
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。したがって、本発明によれば、上記遺伝子マーカーを検出するためのプライマーペアであって、本発明による遺伝子マーカーの全部または一部を増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００５０】
また、本発明の好ましい態様によれば、上記遺伝子マーカーの検出方法としては、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（Livak KJ. Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)）においては、本発明による遺伝子マーカーに特異的にハイブリダイズするプローブであって、蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、細胞由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用プライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、蛍光標識物質、クエンチャーおよびこれらの組み合わせは当業者に公知のものを用いることができるが、例えば、蛍光標識物質としては、例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ等であり、クエンチャーとしては、ＭＧＢ、ＴＡＭＲＡ等である。このようなＰＣＲ反応においては、まず、本発明による遺伝子マーカーにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。したがって、この方法によれば、上記遺伝子マーカーの発現量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、遺伝子マーカーの発現量が容易に決定される。
【００５１】
また、細胞の心筋分化活性を検出するために、以上のような、上記核酸分子および／またはプライマーペアを必要な試薬とともにまとめて、キットとすることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、上記核酸分子および／またはプライマーペアを少なくとも含んでなる、キットが提供される。
【００５２】
心筋分化制御剤
また、本発明におけるＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドは、細胞におけるその発現を制御することにより、細胞の心筋分化を抑制または誘導するのに利用することができる。とりわけ、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現するｍＲＮＡを標的とした場合、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）により細胞の心筋分化を抑制または誘導することが可能となる。
【００５３】
ＣＭＰ遺伝子のうち、CMP1〜6、CMP8〜10、CMP13、CMP18、CMP20およびCMP24の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と正の相関を示し、これら遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制した場合、細胞の心筋分化を抑制することができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、CMP1〜6、CMP8〜10、CMP13、CMP18、CMP20またはCMP24からなるポリヌクレオチドまたはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分として含んでなる、細胞の心筋分化抑制剤であって、二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が上記ポリヌクレオチドと細胞内で特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる、心筋分化抑制剤が提供される。
【００５４】
また、ＣＭＰ遺伝子のうち、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21およびCMP23の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と負の相関を示し、これら遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制した場合、細胞の心筋分化を誘導することができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21およびCMP23からなるポリヌクレオチドまたはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分として含んでなる、細胞の心筋分化誘導剤であって、二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が上記ポリヌクレオチドと細胞内で特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる、心筋分化誘導剤が提供される。
【００５５】
上記ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ分子が同じ配列を含む標的のＲＮＡを分解することにより、その発現を抑制する現象をいう。ここで、上記二本鎖ＲＮＡ分子とは、二本の一本鎖ＲＮＡ分子が、全体にわたってまたは部分的にハイブリダイズして得られるＲＮＡ分子をいう。さらに、上記二本鎖ＲＮＡ分子において、標的配列と相同な配列を有するヌクレオチド鎖をセンス鎖といい、標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖をアンチセンス鎖という。また、「特異的にハイブリダイズする」とは、上記アンチセンス鎖が、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現抑制を行う細胞において、ＣＭＰ遺伝子、これと機能的に同等なポリヌクレオチドおよびこれらの転写産物以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。かかるアンチセンス鎖は、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチド中の標的配列に対応する配列を含むものとされるが、標的配列に完全に相補的な配列を有する必要はなく、標的配列に特異的にハイブリダイズする限り、相補的でないヌクレオチドを含んでいてもよい。しかしながら、心筋分化抑制剤におけるアンチセンス鎖は好ましくは、標的配列に相補的な配列からなるものとされる。
【００５６】
上記二本鎖ＲＮＡ分子は、異なるストランドで構成されてもよく、１つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられてもよい。また、上記二本鎖ＲＮＡ分子における一本鎖ＲＮＡ分子の鎖長は、適切なＲＮＡｉ効果を得ることを勘案すれば、少なくとも１９残基以上、好ましくは１９〜２７残基を有するものである。また、センス鎖とアンチセンス鎖は、同一鎖長であってもよいが、それぞれの鎖の３’側に２塩基程度のオーバーハングを持たせることにより、遺伝子の発現抑制作用を増強することもできる。
【００５７】
上記二本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの標的配列と相同なセンス鎖およびそのアンチセンス鎖を、オリゴヌクレオチド合成機等を用いる公知の手法により合成し、それぞれをアニーリングすることにより、作成することができる。なお、上述の様な標的配列、二本鎖ＲＮＡ分子の長さや構造等については、当業者であれば、公知の手法を用いて様々な改変を試みることができ、最も遺伝子発現抑制作用の強い二本鎖ＲＮＡ分子を至適化することが可能である。
【００５８】
また、細胞の心筋分化制御の別の方法としては、細胞におけるＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現を、アンチセンス、リボザイム等を用いて抑制する手法が挙げられるが、本発明にはかかる態様も包含される。
【００５９】
また、上述の通り、ＣＭＰ１〜６、ＣＮＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８、ＣＭＰ２０およびＣＭＰ２４の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と正の相関を示す。したがって、本発明の別の態様によれば、ＣＭＰ１〜６、ＣＮＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８、ＣＭＰ２０およびＣＭＰ２４またはこれらと機能的に同等なポリヌクレオチドを機能しうる形で含んでなる、心筋分化誘導剤が提供される。また、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ１７、ＣＭＰ２１およびＣＭＰ２３の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と負の相関を示す。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ１７、ＣＭＰ２１およびＣＭＰ２３またはこれらと機能的に同等なポリヌクレオチドを機能しうる形で含んでなる、心筋分化抑制剤が提供される。
【００６０】
上記心筋分化制御剤、すなわち、心筋分化誘導剤または抑制剤としては、例えば、上記ポリヌクレオチドが機能しうる形で挿入された、ベクター等が挙げられる。ここで「機能しうる形で含んでなる」とは、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等）の制御下に、上記ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を可能にする様式で、そのベクター中に上記ポリヌクレオチドが挿入されていることを意味する。
【００６１】
上記ベクターは、当技術分野で周知となっている標準的方法により構築することができ、例えば、Sambrook, J.らの「Molecular Cloning: a laboratory manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（1989）に記載に従って構築することができる。
【００６２】
細胞の心筋分化活性の検出方法
本発明による遺伝子マーカーは、上述の通り、細胞の心筋分化活性の指標として用いられる。したがって、本発明の別の態様によれば、細胞の心筋分化活性を検出する方法であって、上記ポリペプチドマーカーまたは遺伝子マーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、細胞における上記発現量が、上記細胞の心筋分化活性のレベルと相関する、方法が提供される。
【００６３】
また、上述の通り、CMP1〜6、CMP8〜10、CMP13、CMP18、CMP20およびCMP24の発現量は細胞の心筋分化活性が増加と正の相関を示し、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21およびCMP23の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と負の相関を示す。これら性質は、細胞の心筋分化活性を正確に検出する上で有利である。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、CMP1〜6、CMP8〜10、CMP13、CMP18、CMP20もしくはCMP24、これと機能的に同等なポリヌクレオチド、またはこれらの遺伝子産物からなるマーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、該発現量が、心筋分化活性を有しない対照細胞における、前記マーカーの発現量を参照して予め設定された閾値よりも高い場合、前記細胞が心筋分化活性を有するものとする方法が提供される。また、本発明の別の好ましい態様によれば、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21もしくはCMP23、これと機能的に同等なポリヌクレオチド、またはこれらの遺伝子産物からなるマーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、該発現量が、心筋分化活性を有しない対照細胞における、前記マーカーの発現量を参照して予め設定された閾値よりも低い場合、前記細胞が心筋分化活性を有するものとする方法が提供される。
【００６４】
上記マーカーの発現量の測定は、例えば、細胞由来の生物学的試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物の発現量を解析、定量することにより行うことができる。核酸増幅法およびこれによるマーカーの検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００６５】
また、上記対照細胞におけるマーカーの発現量の閾値は、上述の手法により予め測定されたマーカーの定量値を参照して公知の統計手法により設定することができる。上記発現量の具体的な設定手法としては、例えば、（対照細胞におけるマーカーの発現量の平均値±標準偏差）またはＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic)分析等が挙げられる。
【００６６】
また、上記検出方法は、心筋分化活性を有する細胞の効率的かつ簡易な単離に利用することができる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、心筋分化活性を有する細胞を単離する方法であって、上記検出方法により、心筋分化活性を有する細胞を検出し、該細胞を単離することを含んでなる方法が提供される。かかる方法により単離された細胞は、心筋症や虚血性心疾患をはじめとする難治性心疾患の治療用の移植用細胞として有利に利用することができる。
【００６７】
上記方法において、単離工程は、当業者にとって公知の培養条件下において適切に行われる。また、上記細胞を単離する方法としては、例えば、上記マーカーに対する抗体を用いるフローサイトメトリーによる細胞を単離する方法(FACS)、あるいは抗体を担持させた磁気ビーズを用いて、特定の細胞を磁石で捕集・単離する方法(MACS)等が挙げられる。
【００６８】
また、本発明によるマーカーの細胞における発現量を経時的に測定することにより、細胞の心筋への分化状態をモニタリングすることができる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、細胞の心筋分化活性をモニタリングする方法であって、ＣＭＰ１〜６、ＣＭＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８ＣＭＰ２０もしくはＣＭＰ２４、これらと機能的に同等なポリヌクレオチド、またはこれらの遺伝子産物からなるマーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、該発現量が経時的に増加した場合、細胞の心筋分化活性が増加したものとする方法が提供される。また、本発明の別の好ましい態様によれば、細胞の心筋分化活性をモニタリングする方法であって、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ１７、ＣＭＰ２１もしくはＣＭＰ２３、これらと機能的に同等なポリヌクレオチド、またはこれらの遺伝子産物からなるマーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、該発現量が経時的に減少した場合、前記細胞の心筋分化活性が増加したものとする方法が提供される。
【００６９】
細胞の心筋分化制御方法
また、本発明による心筋制御剤を細胞に導入することにより、細胞の心筋分化を誘導しまたは抑制することができる。したがって、本発明の別の態様によれば、細胞の心筋分化を誘導する方法であって、本発明による心筋分化誘導剤を細胞に導入することを含んでなる方法が提供される。また、本発明の別の態様によれば、細胞の心筋分化を抑制する方法であって、本発明による心筋分化抑制剤を細胞に導入することを含んでなる方法が提供される。
【００７０】
上記心筋分化制御剤の導入方法としては、トランスフェクションまたは形質転換方法として当該技術分野において公知の方法を用いることが可能であり、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム試薬を用いる方法、カチオン性脂質を用いたリポフェクション法およびウィルスベクターを用いたトランスフェクション等が挙げられる。なお、かかる心筋分化の制御方法にあっては、本発明による遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドの遺伝子産物を細胞に直接導入してもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７２】
なお、実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００７３】
実施例１：細胞の分化効率評価
細胞の取得
マウス由来の胎児性癌細胞P19細胞（ＡＴＣＣ番号：CRL-1825）はAmerican Type Culture Collection (ATCC)から供与を受けた。また、そのサブラインであるCL6細胞（ＲＣＢ番号：RCB1539）は理研バイオリソースセンター（RIKEN Cell Bank）から供与を受けた。また、CL6細胞に、Neomycin耐性遺伝子を有するベクターであるpcDNA3.1(+) (Invitrogen)と、マウスαMHCプロモーター、EGFP遺伝子(Clontech社製)およびヒト成長ホルモンポリＡシグナルを5’方向から順にマルチクローニングサイトに含有するp Bluescript II SK(+)（Stratagene社製)とをLipofectamine2000 (Invitrogen)を導入し、Geneticine (G418, Sigma)によりスクリーニングした。その結果、Neomycin耐性遺伝子を含むCL6細胞サブラインCL6G26 (以下、「G26」という)、CL6G36 (以下、「G36」という)、CL6G45 (以下、「G45」という)、CL6G52 (以下、「G52」という)を得た。
上記細胞を用いて、以下の実験を行った。
【００７４】
培養
未分化な上記各種細胞の増殖には、基本培地として非働化(56℃、30分熱処理することにより補体成分を不活化)したウシ胎児血清(FCS, fetal calf serum)10％、2mM L-グルタミン(SIGMA)、ペニシリンG（100unit/mL）および硫酸ストレプトマイシン(100unit/mL)を含有したMEM培地(Minimum Essential Medium, SIGMA)を用い、直径100mmの細胞培養ディッシュ(Falcon)上で、5％CO2存在下37℃にて、細胞がコンフルエントにならないように留意して培養した。
【００７５】
分化誘導処理
次に、上記未分化な細胞をディッシュ面積に対し６０〜７０％程度まで培養増殖させ、心筋細胞への分化誘導を行った。分化誘導処理としてはまず基本培地を除去し、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水(phosphate-buffered saline, FBS, SIGMA)5mLを用いて2回洗浄した。次に、トリプシン-EDTA(Gibco)１ｍＬで細胞全体を軽くぬらした後、直ちにトリプシン-EDTAを吸引し5％CO2存在下37℃で3分間、さらに室温で5分弱インキュベートし、反応停止のために分化培地(1% DMSOを含むMEMα培地)10mLに懸濁した。細胞懸濁液を細胞培養容器(Falcon)に分注し、分化誘導処理した細胞を得た。さらに、得られた細胞を6ウェル細胞培養用マルチウェルプレート(Costar)に1×105cells/wellの密度で蒔いた。これを5％CO2存在下37℃分化培地中で培養し、培地は2日おきに交換した。
【００７６】
収縮ノジュールの比較
上記各種細胞について、2日ごとに収縮ノジュール（beating nodule）の出現日（収縮開始日）、大きさおよび数をCKX41またはCKX31培養顕微鏡(OLYMPUS)にて観察し、分化効率を評価した。評価に際し、収縮ノジュール数が、0.016個/cm2以上(プレート１枚につき１つ以上の収縮がある時)を「少ない」、0.098個/cm2以上(ウェル１つにつき１つ以上の収縮がある時)を「中程度」、157個/cm2以上(顕微鏡の視野１面（ｘ２００）につき１つ以上の収縮がある時)を「多い」と定義した。さらに、収縮ノジュール数について、収縮が「ない」ものに0、「少ない」ものに1、「中程度」のものに2、「多い」ものに3のスコアを与えた。また、収縮ノジュールサイズは、6.36×10-5cm2以上の大きさのもの(顕微鏡の視野の面積(×200)の約1/100以上の大きさの点状に収縮しているもの)を「小さい」、3.18×10-3cm2以上の大きさのもの(顕微鏡の視野の面積(×200)の約1/2以上の大きさのシート状に収縮しているもの)を「大きい」と定義した。さらに、収縮ノジュールの大きさについて、収縮が「ない」ものに0、「小さい」ものに1、「大きい」ものに2のスコアを与えた。
【００７７】
収縮ノジュールの数を指標とした結果は、図１Ａに示される通りであり、収縮ノジュールの大きさを指標とした結果は、図１Ｂに示される通りであった。図１ＡおよびＢにおいて、横軸は心筋分化誘導後の日数を示す。図１ＡおよびＢの結果から、細胞株によって、収縮の開始日や収縮ノジュールの数・大きさに差異があることが確認された。特に、P19細胞については、分化誘導後、6日目にコンフルエントな状態となり、16日目にはプレートの各ウェルに対して1つ以上の小さな収縮が観察され、その収縮は少なくとも20日目までは継続することが観察された。この結果、P19細胞は、CL6細胞よりも比較的長期にわたって接着条件下、DMSO存在下で培養することにより、CL6細胞と同様に胚様体の形成を行わなくても心筋細胞へと分化することが確認された。
【００７８】
実施例２：心筋細胞マーカー遺伝子の発現確認と主成分分析
心筋細胞マーカー遺伝子の発現比較
６種類の細胞株、P19細胞、CL6細胞およびNeomycin耐性遺伝子を含むCL6細胞サブラインのG26、G36、G45およびG52について、実施例１と同様の手法により、心筋分化誘導処理および培養を行った。各細胞株は、8日目、12日目、16日目および20日目にSV Total RNA Isolation system (Promega)により回収し、Total RNAの抽出を行った。また、ポジティブコントロールとして9週齢の雄のC3H/He系マウスより心室筋を単離し、Sepazol (Nacalai Tesque)によりTotal RNAを抽出した。Total RNAを抽出した後、RNA中の既存の心筋細胞マーカー遺伝子の発現を定量的RT-PCRにより測定した。心筋細胞マーカー遺伝子としては、心筋線維遺伝子としてMLC2a（ミオシン軽鎖2a）、MLC2v(ミオシン軽鎖2v)、αMHC(αミオシン重鎖)およびβMHC(βミオシン重鎖)を選択し、心筋分化関連転写因子としてNkx2.5、GATA４およびMEF2Cを選択した。また、各遺伝子の発現量を正規化するために18S rRNAの発現量の測定を併せて行った。また、上記定量的RT-PCRにおいては、以下の表１に記載のプライマーおよびTaqManプローブ、TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagent (Applied Biosystems)ならびにABI Prism 7000 Sequence Detection Systemを用いた。なお、上記Taqmanプローブにおいて、５’末端の蛍光標識物質としてはＦＡＭを用い、３’末端のクエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡを用いた。
【００７９】
【表１】
【００８０】
結果は、図２Ａ〜図２Ｇに示される通りであった。図２Ａ〜図２Ｇにおいて、縦軸はmRNA/18S rRNAの値を成体マウス心筋と比較した場合の相対値を示す。また、mRNA/18S rRNAの値は平均値(n=6)である。
【００８１】
図２Ａ〜図２Ｇに示される通り、細胞株によって、心筋細胞マーカー遺伝子の発現に相違が確認され、心筋への分化状態に相違があることが定量的に確認された。
【００８２】
主成分分析
上記心筋細胞マーカー遺伝子の発現を心筋細胞分化と関連付けて解釈する際、個々の心筋細胞マーカー遺伝子の発現にどの程度の重み付けをした上で解釈してよいかは明らかではない。そこで、細胞株 P1、CL6、G26、G36、G45およびG52について得られた上記心筋細胞マーカー遺伝子のｍRNA発現データに基づき、主成分分析を行った。また、主成分分析は、統計ソフトウェアSYSTAT(SYSTAT Software)を用いて行った。なお、心筋細胞マーカー遺伝子のｍRNA発現量は、サンプルの平均値および標準偏差に基づき標準化した。
【００８３】
主成分分析の結果、図３Ａに示されるスクリープロットが得られ、寄与率65％の第1主成分と寄与率15％の第2主成分とを採用した。ここで、二つの主成分の累積寄与率は、８０％以上であった。
【００８４】
また、上記二つの主成分に関する変量プロットは、図３Ｂに示される通りであった。第1主成分については、全ての変量の係数値が正を示したことから心筋分化の指標であると解釈した。また、上記第2主成分については、発生の比較的初期に機能する心筋細胞マーカー遺伝子の係数が負を示し、発生の比較的後期に機能する心筋細胞マーカー遺伝子の係数が正を示したことから、成熟段階の指標であると解釈した。
【００８５】
また、二つの主成分に関し、各細胞株の主成分得点の経時的変化は、図４Ａおよび図４Ｂに示される通りであった。細胞株の種類によって、心筋細胞への分化状態の相違があることが、確認された。なお、図４Ａにおいて、縦軸は、第１主成分得点と示す。また、図４Ｂにおいて、縦軸は、第２主成分得点を示す。
【００８６】
実施例３：心筋細胞分化検出用マーカーの同定
Sequence Tagの取得
6種類の細胞株、P19、CL6、G26、G36、G45およびG52について、分化誘導前に、細胞がコンフルエントにならないように注意しながらRNeasy Midi(QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。次に、得られたRNAをRNeasy Mini(QIAGEN)を用い、2回クリーンアップした。GeneChip(Affymetrix)により遺伝子発現を網羅的に解析するために、Affymetrix社のマニュアルに従い各RNAサンプルからcDNAを合成し、次いでcDNAをもとにしてビオチン化cRNA断片を合成した。次に、GeneChip Hybridizatioin Ovenを用いてビオチン化cRNA断片をGeneChipにハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしたcRNAをGeneChip Fluidics Stationを用いてストレプトアビジン-フィコエリスリンで染色することにより可視化し、GeneChip Scanner 3000でスキャンした。得られた蛍光データはGCOSソフトウェア(Affymetrix)を用いて解析した。ここで、GeneChipは、MOE430A（Sequence Tag数22,626）およびMOE430B（Sequence Tag数22,511）を用いた。抽出された遺伝子からシグナルの高い方から2％および低い方から2％を除き、残りのSequence Tagの平均値がデフォルトで500になるように補正した。これに次に示すフィルターをかけて、各細胞株の心筋細胞分化と相関のある遺伝子を抽出した。
【００８７】
フィルター１
GCOSで解析された各Sequence TagのシグナルはAbsolute Analysis（発現の有無を判定する解析）の結果「発現があるもの:P (Present)」、「発現があるかわからないもの:M (Marginal)」あるいは「発現がないもの:A (Absent)」として判定がなされる。細胞株各群の5例の半数以上（つまり3例以上）でPと判定されたSequence Tagについては、当該細胞株においてそのSequence Tagの塩基配列を含む遺伝子が発現していると判定した。逆に各群の5例のうちＰ判定されたものが2例以下の場合は当該細胞株においてそのSequence Tagの塩基配列を含む遺伝子の発現はないと判定した。細胞株のうち少なくとも1株以上において発現が見られるSequence Tagは次のフィルターをかけ、全ての細胞株で発現が見られないSequence Tagは棄却した。
【００８８】
フィルター２
分散分析(ANOVA)で細胞株間の遺伝子発現の平均値の比較を行い、有意水準5％の条件で帰無仮説が棄却できたもの、すなわち6細胞株の中で発現量が有意に異なる細胞株が少なくとも１つは存在する結果が得られたSequence Tagは次のフィルターをかけ、全ての細胞株で有意な差が現れなかったSequence Tagは棄却した。
【００８９】
フィルター３
細胞株間の遺伝子発現の差の平均値が50％以上のあるもの、すなわち6細胞株の最低の平均値と最高の平均値の差が2.5倍以上出るSequence Tagは次のフィルターをかけ、差が2.5倍より小さいものは棄却した。
【００９０】
フィルター４
P19、CL6、G26、G36、G45およびG52の6種類について、GeneChipで得られた分化誘導前の上記Sequence Tagの発現シグナルと、自動拍動能出現までの日数、自動拍動する細胞ノジュール数のスコア、定量的RT-PCRによって得られた心筋遺伝子発現データの第1主成分得点、または第2主成分得点との間でスピアマンの順位相関係数を算出し、有意水準5％の条件で有意差を検定し、有意な相関の認められたSequence Tagを抽出した。
【００９１】
上記Sequence Tag抽出の結果、第1主成分と相関があるSequence Tagは109個、第2主成分と相関があるSequence Tagは342個、自動拍動能出現までの日数と相関があるSequence Tagは122個、収縮ノジュール数と相関があるSequence Tagは274個抽出された。これらSequence Tagのうち、心筋分化の指標である第1主成分、自動拍動能出現までの日数および収縮ノジュール数の３要素と有意な相関のあるSequence Tagは計24個であった。これら24個のSequence Tagに対応する遺伝子を、CMP1〜24 と命名した。また、CMP1〜24 のうち、第1主成分（心筋細胞分化の指標）、第2主成分（心筋細胞成熟の指標）、自動拍動能出現までの日数および収縮ノジュール数の4要素と有意な相関のある遺伝子は9個であった。
【００９２】
SOSUIシステムによる機能予測
また、上記２４個のCMP遺伝子がコードするアミノ酸配列について、SOSUIシステム(名古屋大学・美宅成樹研究室)によって機能予測解析を行った。解析の結果、12個の遺伝子が膜結合性蛋白質であり、10個の遺伝子が可溶性蛋白質と判定された。
【００９３】
上記統計解析およびSOSUIシステムによる機能解析の結果は表２に示される通りである。なお、表２において、rsはスピアマンの順位相関係数、pはスピアマンの順位相関係数のp-値を示す。また、＊によって示される遺伝子（CMP1〜6、8、11および12）は、第1主成分、第2主成分、自動拍動能出現までの日数および収縮ノジュール数の4要素と有意な相関の認められたものである。
【００９４】
【表２】
【００９５】
実施例４：ＲＮＡｉによる心筋細胞分化の制御１
CMP遺伝子の発現を制御することにより、心筋分化効率の制御が可能かどうかを検討する目的で、CMP2およびCMP13をＲＮＡｉの標的として設定した。そして、表３に記載のヌクレオチド配列を有するStealthRNAi (Invitrogen)をリポフェクション法によってG52細胞へ導入した。また、コントロール（ＮＣ）としてはStealthRNAi Negative Control Medium GC Duplex (Invitrogen)を用いた。
【００９６】
【表３】
【００９７】
siRNAを細胞への導入した後、ＣＭＰ２およびＣＭＰ１３の発現量は、以下に記載のＰＣＲ用プライマーおよびTaqmanプローブを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。この際、定量的ＲＴ−ＰＣＲにおける内部標準としては、１８ＳｒＲＮＡを使用した。なお、Taqmanプローブにおいて、５’末端の蛍光標識物質としてはＦＡＭを用い、３’末端のクエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡを用いた。なお、この実験の具体的手法は、以下の実施例５と同様であった。
ＣＭＰ２遺伝子
フォワード プライマー：5’-CCATCCTGAATCCTAGATACCATCTC-3’（配列番号７２）
リバース プライマー：5’-TAGTGGCAACCATGCTGAGTGT-3’（配列番号７３）
Ｔａｑｍａｎプローブ：5’-CCGATGGACGTGAGGACAGTAATCTGGA-3’（配列番号７４）
ＣＭＰ１３遺伝子
フォワード プライマー：5’-CGCCTCTCTTCGTTTATCTGTTC-3’（配列番号７５）
リバース プライマー：5’-TCTCTGTCTTGGTGCCGTCAT-3’（配列番号７６）
Ｔａｑｍａｎプローブ：5’-ACTTCTTTCCTGCTGGCCGGTTTCGT-3’（配列番号７７）
結果は、図５ＡおよびＢに示される通りであった。StealthRNAiにより、CMP2およびCMP13の発現が７割程度抑制された。さらに、図６に示される通り、CMP２およびCMP13の発現が抑制された条件下では細胞の心筋分化が抑制された。特に、CMP２の発現が抑制された条件下では細胞の心筋分化がほぼ完全に抑制されていた。
【００９８】
実施例５：ＲＮＡｉによる心筋細胞分化の制御２
ＲＮＡｉ
CL6細胞サブラインのうち、G52細胞を分化誘導処理せず、24well細胞培養用マルチウェルプレート (Falcon) に1×104 cells / wellとなるように播種した。これを37℃、5%CO2で一晩培養した。ウェル中の各細胞は、抗生物質不含の基本培地 500μLで2回洗浄し、各wellに同培地400μLを加えた。
次に、Stealth RNAi (Invitrogen) またはsiRNA (QIAGEN) を用いて得られた、以下の表４〜５に記載されるヌクレオチド配列を有するsiRNAを、Lipofectamine 2000 (Invitrogen) を用いてウェル中の各細胞に導入し、CMP１〜２４をノックダウンした。
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
具体的には、まず、1ウェル当たりのsiRNAが40pmolとなるように、蛍光オリゴとしてBLOCK-iT (Invitrogen)（最終濃度10 pmol/well）を含む、OPTI-MEMＩ Reduced Serum Medium (Gibco) でsiRNAを希釈し、siRNA溶液を得た。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）であるStealth RNAi Negative Control Duplexes (Invitrogen) についても同様に希釈した。その後、Lipofectamine 2000 が1.5μL/wellとなるように、OPTI-MEMＩ Reduced Serum Mediumで希釈し、室温で5分インキュベートし、Lipofectamine 2000溶液を得た。次に、siRNA溶液またはネガティブコントロール溶液 50μLとLipofectamine 2000溶液 50μLとを混和し、複合体を形成させるために室温で20分間インキュベートした。この複合体を100μLずつ各wellに加えて緩やかに振盪しながら混合し、5%CO2条件下37℃で48時間インキュベートした。
【０１０２】
siRNAを細胞への導入した後、ＣＭＰ１〜２４の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。具体的には、まず、各細胞からRNesay Mini (QIAGEN)またはBioRobot M48 Workstation (QIAGEN)を用いて、Total RNAを抽出した。このTotal RNAを、2ng/μLに希釈し、測定用サンプルとした。検量線用サンプルとしては、未分化なCL6G52を直径100ｍｍの細胞培養ディッシュ (Falcon)でコンフルエントにならないように培養し、この細胞からBioRobot M48 Workstation (QIAGEN)を用いて抽出したTotal RNAを用いた。20ng /μl、6ng /μl、2ng/μl、0.6ng/μl、0.2ng/μl、0.06ng/μlに希釈し、検量線の作成に用いた。
また、各遺伝子の発現量を補正するために、内部標準として18S rRNAを測定した。18S rRNA測定にあっては、各測定用サンプルを0.02ng/μLに希釈し、検量線用サンプルを0.2ng /μl、0.06ng /μl、0.02ng/μl、0.006g/μl、0.002ng/μl、0.0006ng/μlに希釈した。
【０１０３】
上記サンプルを用い、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) により定量的RT-PCRを行った。なお、CMP1〜２４についての定量的RT-PCRは、TaqMan Master MixおよびTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems)を用いて行った。また、CMP19については、検出感度を考慮し、RQuantiTect Probe RT-PCR Kit (QIAGEN) を用いた測定を再度行った。得られた結果は、18S rRNAの発現値により補正し、各サンプルの補正値をネガティブコントロール（ＮＣ）の補正値と比較することで、各遺伝子の発現量の変動を解析した。
【０１０４】
なお、上記定量的RT-PCRで用いたＰＣＲ用プライマーおよびTaqmanプローブは、表６および表７に示される通りである。Taqmanプローブにおいて、５’末端の蛍光標識物質としてはＦＡＭを用い、３’末端のクエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡを用いた。
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
【表７】
【０１０７】
結果は、図７ＡおよびＢに示される通りであった。細胞にRNAiを施した後、ＣＭＰ１〜１０、ＣＭＰ１２〜１８、ＣＭＰ２０〜２１およびＣＭＰ２３〜２４の発現量は、コントロール（ＮＣ）と比較して有意に低下した（Student’t-test、ｐ＜０．０５）。
【０１０８】
収縮ノジュール数の測定
上記siRNAの導入後、培養ウェル中の収縮ノジュール数の変化を観察したところ、結果は図８Ａ〜Ｕに示される通りであった。
【０１０９】
CMP１〜６、CMP９、CMP１０、CMP１３、CMP１８、CMP２４のそれぞれについてRNAiを施した細胞では、コントロール（ＮＣ）と比較して収縮ノジュール数は有意に低かった（反復測定二元配置分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）、ｐ＜０．０５）。一方、CMP７、CMP１２、CMP１６、CMP１７、CMP２１、CMP２３では、コントロール（ＮＣ）と比較して収縮ノジュール数は有意に高かった（反復測定二元配置分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）、ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
心筋細胞マーカー遺伝子の発現量の測定
siRNAiの上記細胞への導入後、既存の心筋細胞マーカー遺伝子（心筋線維遺伝子であるαMHC、βMHC 、MLC2aおよびMLC2v）の発現量を定量的RT-PCRにより測定し、ＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ１〜１０、ＣＭＰ１２〜１３、ＣＭＰ１６〜１８、ＣＭＰ２０〜２１およびＣＭＰ２３〜２４の発現量と比較した。定量的RT-PCRは、表１に記載のプライマーおよびTaqManプローブを用い、実施例２と同様の手法により行った。
【０１１１】
RNAiによってＣＭＰ遺伝子をノックダウンした後、既存の心筋細胞マーカー遺伝子（αMHC、βMHC 、MLC2a、MLC2v）の発現量の変化は、表８に示される通りであった。さらに、表８には、ＣＭＰ遺伝子をノックダウンした後の収縮ノジュール数の変化を併記した。
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
: RNAiにより有意にノックダウンされたことを示す (p < 0.05 vs. ＮＣ)。
↓: ノックダウン後に有意に減少したことを示す (p < 0.05 vs.ＮＣ)。
↑: ノックダウン後に有意に増加した (p < 0.05 vs. ＮＣ)。
NS: 有意差なし。
【０１１４】
表８に示される通り、CMP1〜6、CMP8、CMP9、CMP10、CMP13、CMP18、CMP20、CMP24のRNAiによるノックダウンにより、いずれかの心筋細胞マーカー遺伝子（αMHC、βMHC 、MLC2aまたはMLC2v）の発現が抑制されるか、あるいは収縮ノジュール数が減少し、心筋細胞分化が抑制さることが確認された。また、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21、CMP23のRNAiによるノックダウンにより、いずれかの心筋細胞マーカー遺伝子（αMHC、βMHC 、MLC2aまたはMLC2v）の発現が促進されるか、あるいは収縮ノジュール数が増加し、心筋細胞分化が誘導されることが確認された。特に、CMP23については、収縮ノジュール数が増加し、心筋細胞マーカー遺伝子のαMHC、βMHC、MLC2vは有意な増加が認められる一方、MLC2aは有意な減少が認められた。心房筋を特徴付けるMLC2aが減少し、心室筋を特徴付けるMLC2vが増加したことから、CMP23は細胞の心室筋への特異的な誘導に用いうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
未分化細胞の心筋分化活性の検出に有益である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号４７，４８，５０，５１，５３，５４，５６，５７，５９，６０，６２，６３，６５，６６，７２，７３，７５，７６，１２３，１２４，１２６，１２７，１２９，１３０，１３２，１３３，１３５，１３６，１３８，１３９，１４１，１４２，１４４，１４５，１４７，１４８，１５０，１５１，１５４，１５６，１５７，１５９，１６０，１６２，１６３，１６５，１６６，１６８，１６９，１７１，１７２，１７４，１７５，１７７，１７８，１８０，１８１，１８３，１８４，１８６，１８７：プライマー
配列番号４９，５２，５５，５８，６１，６４，６７，７４，７７，１２２，１２５，１２８，１３１，１３４，１３７，１４０，１４３，１４６，１４９，１５２，１５５，１５８，１６１，１６４，１６７，１７０，１７３，１７６，１７９，１８２，１８５：Taqmanプローブ
配列番号６８，６９，７０，７１，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８，１１９，１２０，１２１：siRNAの一方のストランド
【関連出願】
【０００１】
本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２００６―１０９８５８号（出願日：２００６年４月１２日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、細胞の心筋分化活性の的確かつ簡易な検出に有用なマーカーに関する。また、本発明は、核酸分子、プライマーペア、キット、心筋分化抑制剤、未分化細胞の心筋分化活性検出方法、心筋分化活性を有する細胞の単離方法、未分化細胞の心筋分化活性のモニタリング方法、および未分化細胞の心筋分化の抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
心筋細胞は、出生前においては自律拍動をしながらも活発に分裂増殖している。しかしながら、心筋細胞は出生と同時に速やかにその分裂能を喪失し、肝細胞等とは異なり二度と分裂能を獲得することはないのが通常である。
【０００４】
近年、成熟した心筋組織中にも心筋細胞前駆細胞が含まれることが明らかとされた。しかしながら、心筋細胞前駆細胞の数は非常に僅かであり、心筋細胞に障害が生じた際にそれを補完して心機能を完全に回復するには十分ではない。したがって、虚血性心疾患や心筋症等により心筋に負荷や壊死が生じた場合には、心筋細胞は細胞分裂でなく主に細胞肥大という形で適応する。心筋細胞肥大は初期においては負荷に対する生理的適応現象とされるが、共存する心線維芽細胞の増生、間質の線維化と相まって心臓自体の拡張機能の低下、さらには収縮機能の低下へと結びつき、心不全を呈するようになる。
【０００５】
虚血性心疾患や心筋症等による心不全の治療は、心収縮力の増強、血管拡張薬による圧負荷・容量負荷の軽減、利尿薬による体液量の減少等の対症療法を中心として行われている。さらに、重症心不全に対する根本的な治療法としては心臓移植が挙げられる。しかしながら、心臓移植は、臓器提供者の不足、脳死判定の難しさ、拒絶反応、医療費等の多くの問題を有している。そこで、適切な心疾患治療のため、失われた心筋を再獲得する方法の開発が求められている。
【０００６】
心筋を再獲得する一つの方法としては、心筋細胞の分裂増殖能の再獲得させる方法が挙げられる。この方法の実施のためには、出生後、心筋細胞が分裂能を喪失する機序を究明することが求められる。そして、かかる機序を明らかとし、遺伝子治療等によって心筋細胞に分裂能を再獲得させることが期待される(非特許文献１)。
【０００７】
また、心筋を再獲得する他の方法としては、心筋細胞以外の細胞を心筋細胞に変換する、分化誘導法が挙げられる。Murryらは、骨格筋分化のマスターキー遺伝子であるMyoDを、in vitroにて心臓に導入することにより、非心筋細胞(線維芽細胞)を骨格筋細胞に変換しうることを報告している(非特許文献２) 。また、心筋細胞において、Nkx2.5、GATA4、MEF2C等の様々な心筋細胞特異的な転写因子がクローニングされている。しかしながら、これらの遺伝子を単独または複数にて他の細胞に遺伝子導入することにより、心筋細胞が作製されたという報告はない。したがって、心筋分化機序の詳細の解明、さらには心疾患治療において、細胞の心筋分化の制御に利用可能な遺伝子が依然として必要とされるといえる。
【０００８】
また、心疾患の他の治療方法としては、心筋細胞移植が挙げられる。近年、幹細胞もしくは心筋前駆細胞を心筋障害部位に移植して心筋細胞へと分化させる方法、または幹細胞もしくは心筋前駆細胞をin vitroで心筋細胞へと分化させた後に心筋障害部位に移植する方法が、再生医学の観点から注目されている。この方法は患者本人由来の細胞を移植するため、拒絶の心配がない。
【０００９】
しかしながら、心筋細胞移植においては、移植した細胞が移植部位に適した表現形を獲得せず、目的外の種類の細胞等に分化した場合、不整脈や心不全を生ずる危険性がある。したがって、心筋細胞移植治療の安全性向上のためには、細胞の心筋細胞への分化のしやすさ、すなわち「心筋分化活性」を適切に予測することが不可欠である。
【００１０】
細胞の心筋分化活性の指標となるマーカーの探索が国内外で盛んに行われている（非特許文献３）。心筋分化活性の指標となるマーカーは、心筋分化能の比較的高い未分化細胞の分離する技術、さらには特異的かつ効率的な心筋細胞分化誘導技術への応用が期待される。しかしながら、未分化段階において用いうる、細胞の心筋分化活性の指標となるマーカーは依然として存在していない。従前の研究では、未分化細胞に対して心筋分化誘導刺激を施した後、分化過程の初期に発現が変動する遺伝子を探索する手法が取られている。このため、得られたマーカーは「既に開始してしまった心筋細胞分化の初期過程」のマーカーではあっても、分化誘導前の「未分化細胞が有する心筋細胞への分化活性」についてのマーカーではない。心疾患の適切な治療のためには、未分化細胞の品質評価および心筋分化能の高い未分化細胞の分離が必要とされる。したがって、未分化段階において、細胞の心筋分化活性の検出に用いうるマーカーが依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tamamori et al., Critical role of cyclin D1 nuclear import in cardiomyocyte proliferation, Circ Res. 2003, Jan 10, 92(1), e12-9
【非特許文献２】Murryet al., Muscle differentiation during repair of myocardial necrosis in rats via gene transfer with MyoD, J Clin Invest., 1996, Nov 15, 98(10), 2209-17
【非特許文献３】Peng et al., Microarray analysis of global changes in gene expression during cardiac myocyte differentiation, Physiol Genomics., 2002, 9(3), 145-55、日高京子等、「ES細胞で発現する心筋分化関連遺伝子の探索・解析システムの構築」、「再生医療」、2005、4(Suppl)、88、秋丸裕司等、「ES細胞の心筋分化を制御するシグナルの解析」、「再生医療」、2005、4(Suppl)、89
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは、今般、未分化段階において、細胞における複数の特定遺伝子（以下、「ＣＭＰ（cardiomyogenesis predictor)遺伝子」という。）の発現量が、細胞の心筋分化活性と有意な相関を示すとの知見を得た。さらに、本発明者らは、ＣＭＰ遺伝子およびその遺伝子産物を、マーカーとして用いることにより、細胞の心筋分化活性を的確に検出することができるとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１３】
したがって、本発明は、未分化細胞の心筋分化活性を検出するためのマーカーの提供をその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そして、本発明による未分化細胞の心筋分化活性を検出するための遺伝子マーカーは、下記の（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントからなるものである：
（ａ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ（ａ）に記載のポリヌクレオチドと機能的に同等なものである、ポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、上記マーカーを用いることにより、未分化段階において、細胞の心筋分化活性を的確に検出することが可能となる。よって、本発明によるマーカーは、未分化細胞の品質評価および心筋分化能の高い未分化細胞の単離において有利に利用することができる。また、本発明による遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドの発現を制御することにより、細胞の心筋分化を制御することが可能となる。よって、本発明における上記ポリヌクレオチドは、心筋分化機序の詳細の解明や心筋細胞の製造において有利に利用することができる。よって、かかる本発明が提供されることは、心疾患の治療において意義があるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における収縮ノジュール数の時間経過を示す図である。 また、図１Ｂは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における収縮ノジュールサイズの時間経過を示す図である。
【図２】図２Ａは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、MLC2a遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｂは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、MLC2v遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｃは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、αMHC遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｄは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、βMHC遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｅは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、Nkx2.5遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｆは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、GATA４遺伝子の発現の時間経過を示す図である。図２Ｇは、細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における、MEF2C遺伝子の発現の時間経過を示す図である。
【図３】図３Ａは、心筋細胞分化を誘導した細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における心筋細胞マーカー遺伝子のｍRNA発現データを主成分分析した際のスクリープロットを示す図である。また、図３Ｂは、心筋細胞分化を誘導した細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における心筋細胞マーカー遺伝子のｍRNA発現データを主成分分析した際の変量プロットを示す図である。
【図４】図４Ａは、心筋分化を誘導した細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における心筋細胞マーカー遺伝子のmRNA発現量データを主成分分析した際の第１主成分得点の時間経過を示す図である。また、図４Ｂは、心筋分化を誘導した細胞株（P19、CL6、G26、G36、G45およびG52）における心筋細胞マーカー遺伝子のmRNA発現量データを主成分分析した際の第２主成分得点の時間経過を示す図である。
【図５】図５Ａは、RNAi処理によるG52細胞のCMP2遺伝子の発現量の変化を示す図である。また、図５Ｂは、RNAi処理よるG52細胞のCMP13遺伝子の発現量の変化を示す図である。
【図６】図６は、CMP2またはCMP13遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図７】図７ＡおよびＢは、RNAi処理によるG52細胞のCMP1〜24遺伝子の発現量の変化を示す図である。
【図８−１】図８Ａ〜Ｃは、CMP1〜3遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−２】図８Ｄ〜Ｆは、CMP4〜6遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−３】図８Ｇ〜Ｉは、CMP7〜9遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−４】図８Ｊ〜Ｌは、CMP10〜13遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−５】図８Ｍ〜Ｏは、CMP14〜16遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−６】図８Ｐ〜Ｒは、CMP17〜20遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【図８−７】図８Ｓ〜Ｕは、CMP21〜24遺伝子の発現をRNAiで抑制した際のG52細胞の心筋分化活性の時間経過を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
遺伝子マーカー
本発明による遺伝子マーカーは、以下にＣＭＰ１〜２４として記載されるＣＭＰ遺伝子を含んでなる。かかる遺伝子マーカーの細胞における発現量を測定することにより、細胞の心筋分化活性を簡易に検出することが可能となる。
【００１８】
ＣＭＰ遺伝子の配列情報の詳細は、公知のデータベースにおいて取得することができ、例えば、ＣＭＰ１はアメリカ合衆国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のRefSeqデータベースにおけるアクセッション番号NM_027547に相当し、ＣＭＰ２は同アクセッション番号 NM_178737に相当し、ＣＭＰ３は同アクセッション番号 NM_144888に相当し、ＣＭＰ４は同アクセッション番号 NM_182991に相当し、ＣＭＰ５は同アクセッション番号 NM_029537に相当し、ＣＭＰ６は同アクセッション番号 NM_009982に相当し、ＣＭＰ７は同アクセッション番号 NM_010169に相当し、ＣＭＰ８は同アクセッション番号 NM_011348に相当し、ＣＭＰ９は同アクセッション番号 NM_030700に相当し、ＣＭＰ１０は同アクセッション番号 NM_025582に相当し、ＣＭＰ１１は同アクセッション番号 NM_133362に相当し、ＣＭＰ１２は同アクセッション番号 NM_025422に相当し、ＣＭＰ１３は同アクセッション番号 NM_021457に相当し、ＣＭＰ１４は同アクセッション番号 NM_130895に相当し、ＣＭＰ１５は同アクセッション番号 NM_010331に相当し、ＣＭＰ１６は同アクセッション番号 NM_018763に相当し、ＣＭＰ１７は同アクセッション番号 AK036481に相当し、ＣＭＰ１８は同アクセッション番号 XM_619720に相当し、ＣＭＰ２０は同アクセッション番号 NM_010363に相当し、ＣＭＰ２１は同アクセッション番号 AK003902に相当し、ＣＭＰ２２は同アクセッション番号 NM_031998に相当し、ＣＭＰ２３は同アクセッション番号 NM_010447に相当し、ＣＭＰ２４は同アクセッション番号 NM_009627に相当し、ＣＭＰ１９は国際塩基配列データベース（the International Nucleotide Sequence Databases：INSD）におけるアクセッション番号BB119527に相当する。
【００１９】
また、上記ＣＭＰ遺伝子の具体的なヌクレオチド配列としては、以下の配列が挙げられる。すなわち、ＣＭＰ１は配列番号１で表されるものであり、ＣＭＰ２は配列番号３で表されるものであり、ＣＭＰ３は配列番号５で表されるものであり、ＣＭＰ４は配列番号７で表されるものであり、ＣＭＰ５は配列番号９で表されるものであり、ＣＭＰ６は配列番号１１で表されるものであり、ＣＭＰ７は配列番号１３で表されるものであり、ＣＭＰ８は配列番号１５で表されるものであり、ＣＭＰ９は配列番号１７で表されるものであり、ＣＭＰ１０は配列番号１９で表されるものであり、ＣＭＰ１１は配列番号２１で表されるものであり、ＣＭＰ１２は配列番号２３で表されるものであり、ＣＭＰ１３は配列番号２５で表されるものであり、ＣＭＰ１４は配列番号２７で表されるものであり、ＣＭＰ１５は配列番号２９で表されるものであり、ＣＭＰ１６は配列番号３１で表されるものであり、ＣＭＰ１７は配列番号３３で表されるものであり、ＣＭＰ１８は配列番号３４で表されるものであり、ＣＭＰ１９は配列番号３６で表されるものであり、ＣＭＰ２０は配列番号３７で表されるものであり、ＣＭＰ２１は配列番号３９で表されるものであり、ＣＭＰ２２は配列番号４１で表されるものであり、ＣＭＰ２３は配列番号４３で表されるものであり、ＣＭＰ２４は配列番号４５で表されるものである。したがって、本発明の一つの態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、または配列番号４５で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。
【００２０】
また、ＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ1〜6、ＣＭＰ8〜10、ＣＭＰ13、ＣＭＰ18、ＣＭＰ20およびＣＭＰ24は、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とするものである。したがって、本発明の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２５、配列番号３４、配列番号３７または配列番号４５で表されるヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とするものである。
【００２１】
また、ＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ7、ＣＭＰ12、ＣＭＰ16、ＣＭＰ17、ＣＭＰ21およびＣＭＰ23は、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少することを特徴とするものである。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３９または配列番号４３で表されるヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少することを特徴とするものである。
【００２２】
また、本発明による遺伝子マーカーは、ＣＭＰ１〜２４と、機能的に同等なポリヌクレオチドも包含する。ここで、「機能的に同等」とは、ＣＭＰ遺伝子と同等に、細胞の心筋分化活性と相関を示すことを好ましくは意味する。さらに、本発明による上記ポリヌクレチオドは、心筋分化制御に利用しうるものである。したがって、かかるポリヌクレチオドと機能的に同等なポリヌクレチオドは、より好ましくは、ＣＭＰ遺伝子と同等な細胞の心筋分化制御活性を有するものである。上記ポリヌクレオチドとＣＭＰ遺伝子との機能的同等性は、例えば、後述する本発明による核酸分子またはプライマーを用い、ポリヌクレオチドの発現量を測定し、該発現量と、拍動を生ずる細胞の数や大きさとの相関を公知の統計手法により決定し、ＣＭＰ遺伝子のそれと比較することにより簡易に決定することができる。
【００２３】
また、本発明による遺伝子マーカーは、心筋分化活性の指標となる限り、ＣＭＰ遺伝子と配列相同性を有するものであってもよい。そして、本発明の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、ＣＭＰ遺伝子をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＣＭＰ遺伝子と機能的に同等なポリヌクレオチドからなる。また、かかる配列相同性は、より好ましくは７５％以上であり、さらに好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは８５％以上である。
【００２４】
本発明において、上記ヌクレオチド配列やアミノ酸配列の相同性は、公知の手法によって決定されるものであり、かかる手法としては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３−５８７７（１９９３）〕等が挙げられる。また、このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されており〔Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）〕、本発明においても利用することができる。さらに、他の好ましい手法としては、遺伝情報処理ソフトウェア ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）を用いる手法が挙げられる。ＧＥＮＥＴＹＸを用いる場合には、ＢＬＡＳＴによる解析のほかにＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法によるホモロジー解析を行うことができ、本発明における相同性決定において有利に利用することができる。
【００２５】
また、本発明による遺伝子マーカーの一部は、ＣＭＰ遺伝子のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列からなる。すなわち、ＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ１〜１６、１８、２０〜２４は、ポリペプチドをコードするものである。具体的には、ＣＭＰ遺伝子において、配列番号１（ＣＭＰ１：特に、第６４〜１８６３ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３（ＣＭＰ２：特に、第２３０〜２６４４ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号５（ＣＭＰ３：特に、第２７７〜１７８８ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号７（ＣＭＰ４：特に、第４２〜１０５５ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号９（ＣＭＰ５：特に、第９９〜７７９ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１１（ＣＭＰ６：特に、第７０〜１４５８ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１３（ＣＭＰ７：特に、第６０〜１３５２ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１５（ＣＭＰ８：特に、第６１０〜２９４３ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１６で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１７（ＣＭＰ９：特に、第７７〜１９２７ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号１９（ＣＭＰ１０：特に、第４０〜６４５ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２１（ＣＭＰ１１：特に、第２３４〜７６７ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２３（ＣＭＰ１２：特に、第３０１〜９６０ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２４で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２５（ＣＭＰ１３：特に、第３９２〜２３２０ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２６で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２７（ＣＭＰ１４：特に、第３９６〜２５０１ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号２８で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号２９（ＣＭＰ１５：特に、第９７〜１９６２ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号３０で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３１（ＣＭＰ１６：特に、第４７０〜１９２１ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号３２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３４（ＣＭＰ１８：特に、第９２〜１７７４ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号３５で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３７（ＣＭＰ２０：特に、第１１３〜７６３ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号３８で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号３９（ＣＭＰ２１：特に、第２２１〜４５７ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４０で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号４１（ＣＭＰ２２：特に、第１４〜１１３５ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４２で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号４３（ＣＭＰ２３：特に、第２５〜９８７ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４４で表されるアミノ酸配列をコードするものであり、配列番号４５（ＣＭＰ２４：特に、第１７６〜７３０ヌクレオチドで表されるヌクレオチド配列）は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列をコードするものである。
【００２６】
したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものである。
【００２７】
また、上述の通り、蛋白質コード領域を有するＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ１〜６、ＣＭＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８、ＣＭＰ２０およびＣＭＰ２４は、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加する。したがって、本発明の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３５、配列番号３８または配列番号４６で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とするものである。
【００２８】
また、蛋白質コード領域を有するＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ２１およびＣＭＰ２３は、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少する。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０または配列番号４４で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少することを特徴とするものである。
【００２９】
また、本発明による遺伝子マーカーは、上記アミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であって、かつ上記アミノ酸配列と機能的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドを含んでなる。ここで、上記「１個または数個」は、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは１〜２個である。
【００３０】
さらに、本発明の別の好ましい態様によれば、遺伝子マーカーは、上記アミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ上記アミノ酸配列と機能的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドを含んでなる。さらに、上記遺伝子マーカーにおける相同性は、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。
【００３１】
また、上記遺伝子マーカーは、心筋分化活性の指標としうる限り、ＣＭＰ遺伝子または該遺伝子と機能的に同等なポリヌクレオチドのフラグメントであってもよい。したがって、本発明の別の態様によれば、遺伝子マーカーは、ＣＭＰ遺伝子または該遺伝子と機能的に同等なポリヌクレオチドの部分配列からなる。かかるポリヌクレオチドの有するヌクレオチド残基数は、心筋分化活性の指標としうる限り限定されないが、例えば、１００ヌクレオチド残基以上である。
【００３２】
上述の遺伝子マーカーは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。より具体的には、上記遺伝子マーカーは、ゲノム中に存在するＤＮＡであってもよく、その転写産物であるｍＲＮＡに対して生成させたｃＤＮＡであってもよい。また、上記ｍＲＮＡを直接遺伝子マーカーとして用いてもよく、本発明にはかかる態様も包含される。したがって、本発明の別の態様によれば、遺伝子マーカーは、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等な遺伝子をコードする上記ヌクレオチド配列において、チミン残基をウラシル残基に置換した、リボヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含んでなる。
【００３３】
また、上記遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００３４】
ポリペプチドマーカー
また、本発明によれば、ＣＭＰ遺伝子の発現産物を細胞の心筋分化活性の検出用マーカーとして利用することができる。そして、かかるマーカーとしては、上記ＣＭＰ遺伝子１〜１６、１８、２０〜２４にコードされるポリペプチドからなるマーカーが挙げられる。したがって、本発明の別の態様によれば、細胞の心筋分化活性を検出するためのポリペプチドマーカーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４または配列番号４６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含んでなる。
【００３５】
また、蛋白質コード領域を有するＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ１〜６、ＣＭＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８、ＣＭＰ２０およびＣＭＰ２４のコードするポリペプチドは細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加しうる。したがって、本発明の好ましい態様によれば、上記ポリペプチドマーカーは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３５、配列番号３８または配列番号４６で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とするものである。
【００３６】
また、蛋白質コード領域を有するＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ２１およびＣＭＰ２３のコードするポリペプチドは、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少しうる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、上記ポリペプチドマーカーは、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０または配列番号４４で表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるものであり、細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が減少することを特徴とするものである。
【００３７】
さらに、ＣＭＰ遺伝子と機能的に同等な遺伝子にコードされるポリペプチドもまた、細胞の心筋分化活性の指標とすることができる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、上記ポリペプチドマーカーは、上記アミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ遺伝子にコードされるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを含んでなる。
【００３８】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、ポリペプチドマーカーは、上記アミノ酸配列と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＣＭＰ遺伝子にコードされるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを含んでなる。
【００３９】
また、本発明によるポリペプチドマーカーは、心筋分化活性の指標としうる限り、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの全配列を有する必要はなく、その部分配列であってもよい。よって、本発明によるポリペプチドマーカーは、上述のポリペプチドのフラグメントを包含する。そして、かかるフラグメントの有するアミノ酸残基は、例えば、１３個以上とされる。
【００４０】
細胞
上記遺伝子マーカーおよびポリペプチドマーカーは、いずれも未分化段階において、細胞の心筋分化活性の指標として用いることができる。したがって、本発明における細胞は、未分化細胞である。また、本発明における細胞は、好ましくは哺乳動物由来細胞であり、より好ましくはヒト、マウスまたはサル由来細胞である。
【００４１】
核酸分子／プローブ
また、本発明による遺伝子マーカーを指標として細胞の心筋分化活性を検出するために、本発明による遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドまたはこれと相補的なポリヌクレオチドを標的として、該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズうる核酸分子を用いることができる。ここで、相補的とは、２つのヌクレオチドがハイブリダイゼーション条件下において、対合しうるものであることを意味し、例えば、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）との関係、シトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との関係をいう。
【００４２】
また、本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子が通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で遺伝子マーカーにハイブリダイズし、遺伝子マーカー以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度等に依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を遺伝子マーカーに特異的にハイブリダイズさせることができる。また、本発明による遺伝子マーカーにハイブリダイズする核酸分子は、特異的なハイブリダイズが可能であれば、その遺伝子マーカーに対して完全に相補的である必要はないが、好ましくは、その遺伝子マーカーに相補的なヌクレオチド分子の全部または一部の配列を含んでなるものとする。
【００４３】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい態様によれば、核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００４４】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。本発明による核酸分子は上述の通り、遺伝子マーカーを標的とするが、検出の標的をゲノムとする場合には、本発明による核酸分子は、エクソンにハイブリダイズする部分だけでなく、イントロンにハイブリダイズする部分をも含むことができる。
【００４５】
本発明による核酸分子は、上記遺伝子マーカーの検出において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、該核酸プローブは、市販のオリゴヌクレオチド合成機等を用いて合成オリゴヌクレオチドとして作製してもよいし、あるいは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製してもよい。
【００４６】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１８ヌクレオチド以上とすることが好ましく、また、３０ヌクレオチド以下、より好ましくは２４ヌクレオチド以下とすることが好ましい。
【００４７】
さらに、本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、該核酸分子を適宜標識することが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）が挙げられる。
【００４８】
また、本発明による核酸分子は、本発明による遺伝子マーカーの検出において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１８〜３０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは１８〜２４ヌクレオチドとする。
【００４９】
核酸増幅法は、通常、プライマーのペアを用いて実施される。したがって、本発明によれば、上記遺伝子マーカーを検出するためのプライマーペアであって、本発明による遺伝子マーカーの全部または一部を増幅しうるプライマーペアが提供される。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００５０】
また、本発明の好ましい態様によれば、上記遺伝子マーカーの検出方法としては、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（Livak KJ. Genet. Anal. vol.14, pp143-149, (1999)）においては、本発明による遺伝子マーカーに特異的にハイブリダイズするプローブであって、蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付され、さらに３’末端がリン酸化されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、細胞由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用プライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができる。また、蛍光標識物質、クエンチャーおよびこれらの組み合わせは当業者に公知のものを用いることができるが、例えば、蛍光標識物質としては、例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ等であり、クエンチャーとしては、ＭＧＢ、ＴＡＭＲＡ等である。このようなＰＣＲ反応においては、まず、本発明による遺伝子マーカーにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。したがって、この方法によれば、上記遺伝子マーカーの発現量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、遺伝子マーカーの発現量が容易に決定される。
【００５１】
また、細胞の心筋分化活性を検出するために、以上のような、上記核酸分子および／またはプライマーペアを必要な試薬とともにまとめて、キットとすることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、上記核酸分子および／またはプライマーペアを少なくとも含んでなる、キットが提供される。
【００５２】
心筋分化制御剤
また、本発明におけるＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドは、細胞におけるその発現を制御することにより、細胞の心筋分化を抑制または誘導するのに利用することができる。とりわけ、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現するｍＲＮＡを標的とした場合、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）により細胞の心筋分化を抑制または誘導することが可能となる。
【００５３】
ＣＭＰ遺伝子のうち、CMP1〜6、CMP8〜10、CMP13、CMP18、CMP20およびCMP24の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と正の相関を示し、これら遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制した場合、細胞の心筋分化を抑制することができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、CMP1〜6、CMP8〜10、CMP13、CMP18、CMP20またはCMP24からなるポリヌクレオチドまたはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分として含んでなる、細胞の心筋分化抑制剤であって、二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が上記ポリヌクレオチドと細胞内で特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる、心筋分化抑制剤が提供される。
【００５４】
また、ＣＭＰ遺伝子のうち、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21およびCMP23の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と負の相関を示し、これら遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制した場合、細胞の心筋分化を誘導することができる。したがって、本発明の一つの態様によれば、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21およびCMP23からなるポリヌクレオチドまたはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分として含んでなる、細胞の心筋分化誘導剤であって、二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が上記ポリヌクレオチドと細胞内で特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなる、心筋分化誘導剤が提供される。
【００５５】
上記ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ分子が同じ配列を含む標的のＲＮＡを分解することにより、その発現を抑制する現象をいう。ここで、上記二本鎖ＲＮＡ分子とは、二本の一本鎖ＲＮＡ分子が、全体にわたってまたは部分的にハイブリダイズして得られるＲＮＡ分子をいう。さらに、上記二本鎖ＲＮＡ分子において、標的配列と相同な配列を有するヌクレオチド鎖をセンス鎖といい、標的配列と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖をアンチセンス鎖という。また、「特異的にハイブリダイズする」とは、上記アンチセンス鎖が、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現抑制を行う細胞において、ＣＭＰ遺伝子、これと機能的に同等なポリヌクレオチドおよびこれらの転写産物以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。かかるアンチセンス鎖は、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチド中の標的配列に対応する配列を含むものとされるが、標的配列に完全に相補的な配列を有する必要はなく、標的配列に特異的にハイブリダイズする限り、相補的でないヌクレオチドを含んでいてもよい。しかしながら、心筋分化抑制剤におけるアンチセンス鎖は好ましくは、標的配列に相補的な配列からなるものとされる。
【００５６】
上記二本鎖ＲＮＡ分子は、異なるストランドで構成されてもよく、１つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられてもよい。また、上記二本鎖ＲＮＡ分子における一本鎖ＲＮＡ分子の鎖長は、適切なＲＮＡｉ効果を得ることを勘案すれば、少なくとも１９残基以上、好ましくは１９〜２７残基を有するものである。また、センス鎖とアンチセンス鎖は、同一鎖長であってもよいが、それぞれの鎖の３’側に２塩基程度のオーバーハングを持たせることにより、遺伝子の発現抑制作用を増強することもできる。
【００５７】
上記二本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、ＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの標的配列と相同なセンス鎖およびそのアンチセンス鎖を、オリゴヌクレオチド合成機等を用いる公知の手法により合成し、それぞれをアニーリングすることにより、作成することができる。なお、上述の様な標的配列、二本鎖ＲＮＡ分子の長さや構造等については、当業者であれば、公知の手法を用いて様々な改変を試みることができ、最も遺伝子発現抑制作用の強い二本鎖ＲＮＡ分子を至適化することが可能である。
【００５８】
また、細胞の心筋分化制御の別の方法としては、細胞におけるＣＭＰ遺伝子またはこれと機能的に同等なポリヌクレオチドの発現を、アンチセンス、リボザイム等を用いて抑制する手法が挙げられるが、本発明にはかかる態様も包含される。
【００５９】
また、上述の通り、ＣＭＰ１〜６、ＣＮＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８、ＣＭＰ２０およびＣＭＰ２４の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と正の相関を示す。したがって、本発明の別の態様によれば、ＣＭＰ１〜６、ＣＮＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８、ＣＭＰ２０およびＣＭＰ２４またはこれらと機能的に同等なポリヌクレオチドを機能しうる形で含んでなる、心筋分化誘導剤が提供される。また、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ１７、ＣＭＰ２１およびＣＭＰ２３の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と負の相関を示す。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ１７、ＣＭＰ２１およびＣＭＰ２３またはこれらと機能的に同等なポリヌクレオチドを機能しうる形で含んでなる、心筋分化抑制剤が提供される。
【００６０】
上記心筋分化制御剤、すなわち、心筋分化誘導剤または抑制剤としては、例えば、上記ポリヌクレオチドが機能しうる形で挿入された、ベクター等が挙げられる。ここで「機能しうる形で含んでなる」とは、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等）の制御下に、上記ポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の発現を可能にする様式で、そのベクター中に上記ポリヌクレオチドが挿入されていることを意味する。
【００６１】
上記ベクターは、当技術分野で周知となっている標準的方法により構築することができ、例えば、Sambrook, J.らの「Molecular Cloning: a laboratory manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York（1989）に記載に従って構築することができる。
【００６２】
細胞の心筋分化活性の検出方法
本発明による遺伝子マーカーは、上述の通り、細胞の心筋分化活性の指標として用いられる。したがって、本発明の別の態様によれば、細胞の心筋分化活性を検出する方法であって、上記ポリペプチドマーカーまたは遺伝子マーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、細胞における上記発現量が、上記細胞の心筋分化活性のレベルと相関する、方法が提供される。
【００６３】
また、上述の通り、CMP1〜6、CMP8〜10、CMP13、CMP18、CMP20およびCMP24の発現量は細胞の心筋分化活性が増加と正の相関を示し、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21およびCMP23の発現量は、細胞の心筋分化活性が増加と負の相関を示す。これら性質は、細胞の心筋分化活性を正確に検出する上で有利である。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、CMP1〜6、CMP8〜10、CMP13、CMP18、CMP20もしくはCMP24、これと機能的に同等なポリヌクレオチド、またはこれらの遺伝子産物からなるマーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、該発現量が、心筋分化活性を有しない対照細胞における、前記マーカーの発現量を参照して予め設定された閾値よりも高い場合、前記細胞が心筋分化活性を有するものとする方法が提供される。また、本発明の別の好ましい態様によれば、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21もしくはCMP23、これと機能的に同等なポリヌクレオチド、またはこれらの遺伝子産物からなるマーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、該発現量が、心筋分化活性を有しない対照細胞における、前記マーカーの発現量を参照して予め設定された閾値よりも低い場合、前記細胞が心筋分化活性を有するものとする方法が提供される。
【００６４】
上記マーカーの発現量の測定は、例えば、細胞由来の生物学的試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物の発現量を解析、定量することにより行うことができる。核酸増幅法およびこれによるマーカーの検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【００６５】
また、上記対照細胞におけるマーカーの発現量の閾値は、上述の手法により予め測定されたマーカーの定量値を参照して公知の統計手法により設定することができる。上記発現量の具体的な設定手法としては、例えば、（対照細胞におけるマーカーの発現量の平均値±標準偏差）またはＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic)分析等が挙げられる。
【００６６】
また、上記検出方法は、心筋分化活性を有する細胞の効率的かつ簡易な単離に利用することができる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、心筋分化活性を有する細胞を単離する方法であって、上記検出方法により、心筋分化活性を有する細胞を検出し、該細胞を単離することを含んでなる方法が提供される。かかる方法により単離された細胞は、心筋症や虚血性心疾患をはじめとする難治性心疾患の治療用の移植用細胞として有利に利用することができる。
【００６７】
上記方法において、単離工程は、当業者にとって公知の培養条件下において適切に行われる。また、上記細胞を単離する方法としては、例えば、上記マーカーに対する抗体を用いるフローサイトメトリーによる細胞を単離する方法(FACS)、あるいは抗体を担持させた磁気ビーズを用いて、特定の細胞を磁石で捕集・単離する方法(MACS)等が挙げられる。
【００６８】
また、本発明によるマーカーの細胞における発現量を経時的に測定することにより、細胞の心筋への分化状態をモニタリングすることができる。したがって、本発明の別の好ましい態様によれば、細胞の心筋分化活性をモニタリングする方法であって、ＣＭＰ１〜６、ＣＭＰ８〜１０、ＣＭＰ１３、ＣＭＰ１８ＣＭＰ２０もしくはＣＭＰ２４、これらと機能的に同等なポリヌクレオチド、またはこれらの遺伝子産物からなるマーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、該発現量が経時的に増加した場合、細胞の心筋分化活性が増加したものとする方法が提供される。また、本発明の別の好ましい態様によれば、細胞の心筋分化活性をモニタリングする方法であって、ＣＭＰ７、ＣＭＰ１２、ＣＭＰ１６、ＣＭＰ１７、ＣＭＰ２１もしくはＣＭＰ２３、これらと機能的に同等なポリヌクレオチド、またはこれらの遺伝子産物からなるマーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、該発現量が経時的に減少した場合、前記細胞の心筋分化活性が増加したものとする方法が提供される。
【００６９】
細胞の心筋分化制御方法
また、本発明による心筋制御剤を細胞に導入することにより、細胞の心筋分化を誘導しまたは抑制することができる。したがって、本発明の別の態様によれば、細胞の心筋分化を誘導する方法であって、本発明による心筋分化誘導剤を細胞に導入することを含んでなる方法が提供される。また、本発明の別の態様によれば、細胞の心筋分化を抑制する方法であって、本発明による心筋分化抑制剤を細胞に導入することを含んでなる方法が提供される。
【００７０】
上記心筋分化制御剤の導入方法としては、トランスフェクションまたは形質転換方法として当該技術分野において公知の方法を用いることが可能であり、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リポソーム試薬を用いる方法、カチオン性脂質を用いたリポフェクション法およびウィルスベクターを用いたトランスフェクション等が挙げられる。なお、かかる心筋分化の制御方法にあっては、本発明による遺伝子マーカーを構成するポリヌクレオチドの遺伝子産物を細胞に直接導入してもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７２】
なお、実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００７３】
実施例１：細胞の分化効率評価
細胞の取得
マウス由来の胎児性癌細胞P19細胞（ＡＴＣＣ番号：CRL-1825）はAmerican Type Culture Collection (ATCC)から供与を受けた。また、そのサブラインであるCL6細胞（ＲＣＢ番号：RCB1539）は理研バイオリソースセンター（RIKEN Cell Bank）から供与を受けた。また、CL6細胞に、Neomycin耐性遺伝子を有するベクターであるpcDNA3.1(+) (Invitrogen)と、マウスαMHCプロモーター、EGFP遺伝子(Clontech社製)およびヒト成長ホルモンポリＡシグナルを5’方向から順にマルチクローニングサイトに含有するp Bluescript II SK(+)（Stratagene社製)とをLipofectamine2000 (Invitrogen)を導入し、Geneticine (G418, Sigma)によりスクリーニングした。その結果、Neomycin耐性遺伝子を含むCL6細胞サブラインCL6G26 (以下、「G26」という)、CL6G36 (以下、「G36」という)、CL6G45 (以下、「G45」という)、CL6G52 (以下、「G52」という)を得た。
上記細胞を用いて、以下の実験を行った。
【００７４】
培養
未分化な上記各種細胞の増殖には、基本培地として非働化(56℃、30分熱処理することにより補体成分を不活化)したウシ胎児血清(FCS, fetal calf serum)10％、2mM L-グルタミン(SIGMA)、ペニシリンG（100unit/mL）および硫酸ストレプトマイシン(100unit/mL)を含有したMEM培地(Minimum Essential Medium, SIGMA)を用い、直径100mmの細胞培養ディッシュ(Falcon)上で、5％CO2存在下37℃にて、細胞がコンフルエントにならないように留意して培養した。
【００７５】
分化誘導処理
次に、上記未分化な細胞をディッシュ面積に対し６０〜７０％程度まで培養増殖させ、心筋細胞への分化誘導を行った。分化誘導処理としてはまず基本培地を除去し、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水(phosphate-buffered saline, FBS, SIGMA)5mLを用いて2回洗浄した。次に、トリプシン-EDTA(Gibco)１ｍＬで細胞全体を軽くぬらした後、直ちにトリプシン-EDTAを吸引し5％CO2存在下37℃で3分間、さらに室温で5分弱インキュベートし、反応停止のために分化培地(1% DMSOを含むMEMα培地)10mLに懸濁した。細胞懸濁液を細胞培養容器(Falcon)に分注し、分化誘導処理した細胞を得た。さらに、得られた細胞を6ウェル細胞培養用マルチウェルプレート(Costar)に1×105cells/wellの密度で蒔いた。これを5％CO2存在下37℃分化培地中で培養し、培地は2日おきに交換した。
【００７６】
収縮ノジュールの比較
上記各種細胞について、2日ごとに収縮ノジュール（beating nodule）の出現日（収縮開始日）、大きさおよび数をCKX41またはCKX31培養顕微鏡(OLYMPUS)にて観察し、分化効率を評価した。評価に際し、収縮ノジュール数が、0.016個/cm2以上(プレート１枚につき１つ以上の収縮がある時)を「少ない」、0.098個/cm2以上(ウェル１つにつき１つ以上の収縮がある時)を「中程度」、157個/cm2以上(顕微鏡の視野１面（ｘ２００）につき１つ以上の収縮がある時)を「多い」と定義した。さらに、収縮ノジュール数について、収縮が「ない」ものに0、「少ない」ものに1、「中程度」のものに2、「多い」ものに3のスコアを与えた。また、収縮ノジュールサイズは、6.36×10-5cm2以上の大きさのもの(顕微鏡の視野の面積(×200)の約1/100以上の大きさの点状に収縮しているもの)を「小さい」、3.18×10-3cm2以上の大きさのもの(顕微鏡の視野の面積(×200)の約1/2以上の大きさのシート状に収縮しているもの)を「大きい」と定義した。さらに、収縮ノジュールの大きさについて、収縮が「ない」ものに0、「小さい」ものに1、「大きい」ものに2のスコアを与えた。
【００７７】
収縮ノジュールの数を指標とした結果は、図１Ａに示される通りであり、収縮ノジュールの大きさを指標とした結果は、図１Ｂに示される通りであった。図１ＡおよびＢにおいて、横軸は心筋分化誘導後の日数を示す。図１ＡおよびＢの結果から、細胞株によって、収縮の開始日や収縮ノジュールの数・大きさに差異があることが確認された。特に、P19細胞については、分化誘導後、6日目にコンフルエントな状態となり、16日目にはプレートの各ウェルに対して1つ以上の小さな収縮が観察され、その収縮は少なくとも20日目までは継続することが観察された。この結果、P19細胞は、CL6細胞よりも比較的長期にわたって接着条件下、DMSO存在下で培養することにより、CL6細胞と同様に胚様体の形成を行わなくても心筋細胞へと分化することが確認された。
【００７８】
実施例２：心筋細胞マーカー遺伝子の発現確認と主成分分析
心筋細胞マーカー遺伝子の発現比較
６種類の細胞株、P19細胞、CL6細胞およびNeomycin耐性遺伝子を含むCL6細胞サブラインのG26、G36、G45およびG52について、実施例１と同様の手法により、心筋分化誘導処理および培養を行った。各細胞株は、8日目、12日目、16日目および20日目にSV Total RNA Isolation system (Promega)により回収し、Total RNAの抽出を行った。また、ポジティブコントロールとして9週齢の雄のC3H/He系マウスより心室筋を単離し、Sepazol (Nacalai Tesque)によりTotal RNAを抽出した。Total RNAを抽出した後、RNA中の既存の心筋細胞マーカー遺伝子の発現を定量的RT-PCRにより測定した。心筋細胞マーカー遺伝子としては、心筋線維遺伝子としてMLC2a（ミオシン軽鎖2a）、MLC2v(ミオシン軽鎖2v)、αMHC(αミオシン重鎖)およびβMHC(βミオシン重鎖)を選択し、心筋分化関連転写因子としてNkx2.5、GATA４およびMEF2Cを選択した。また、各遺伝子の発現量を正規化するために18S rRNAの発現量の測定を併せて行った。また、上記定量的RT-PCRにおいては、以下の表１に記載のプライマーおよびTaqManプローブ、TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagent (Applied Biosystems)ならびにABI Prism 7000 Sequence Detection Systemを用いた。なお、上記Taqmanプローブにおいて、５’末端の蛍光標識物質としてはＦＡＭを用い、３’末端のクエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡを用いた。
【００７９】
【表１】
【００８０】
結果は、図２Ａ〜図２Ｇに示される通りであった。図２Ａ〜図２Ｇにおいて、縦軸はmRNA/18S rRNAの値を成体マウス心筋と比較した場合の相対値を示す。また、mRNA/18S rRNAの値は平均値(n=6)である。
【００８１】
図２Ａ〜図２Ｇに示される通り、細胞株によって、心筋細胞マーカー遺伝子の発現に相違が確認され、心筋への分化状態に相違があることが定量的に確認された。
【００８２】
主成分分析
上記心筋細胞マーカー遺伝子の発現を心筋細胞分化と関連付けて解釈する際、個々の心筋細胞マーカー遺伝子の発現にどの程度の重み付けをした上で解釈してよいかは明らかではない。そこで、細胞株 P1、CL6、G26、G36、G45およびG52について得られた上記心筋細胞マーカー遺伝子のｍRNA発現データに基づき、主成分分析を行った。また、主成分分析は、統計ソフトウェアSYSTAT(SYSTAT Software)を用いて行った。なお、心筋細胞マーカー遺伝子のｍRNA発現量は、サンプルの平均値および標準偏差に基づき標準化した。
【００８３】
主成分分析の結果、図３Ａに示されるスクリープロットが得られ、寄与率65％の第1主成分と寄与率15％の第2主成分とを採用した。ここで、二つの主成分の累積寄与率は、８０％以上であった。
【００８４】
また、上記二つの主成分に関する変量プロットは、図３Ｂに示される通りであった。第1主成分については、全ての変量の係数値が正を示したことから心筋分化の指標であると解釈した。また、上記第2主成分については、発生の比較的初期に機能する心筋細胞マーカー遺伝子の係数が負を示し、発生の比較的後期に機能する心筋細胞マーカー遺伝子の係数が正を示したことから、成熟段階の指標であると解釈した。
【００８５】
また、二つの主成分に関し、各細胞株の主成分得点の経時的変化は、図４Ａおよび図４Ｂに示される通りであった。細胞株の種類によって、心筋細胞への分化状態の相違があることが、確認された。なお、図４Ａにおいて、縦軸は、第１主成分得点と示す。また、図４Ｂにおいて、縦軸は、第２主成分得点を示す。
【００８６】
実施例３：心筋細胞分化検出用マーカーの同定
Sequence Tagの取得
6種類の細胞株、P19、CL6、G26、G36、G45およびG52について、分化誘導前に、細胞がコンフルエントにならないように注意しながらRNeasy Midi(QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。次に、得られたRNAをRNeasy Mini(QIAGEN)を用い、2回クリーンアップした。GeneChip(Affymetrix)により遺伝子発現を網羅的に解析するために、Affymetrix社のマニュアルに従い各RNAサンプルからcDNAを合成し、次いでcDNAをもとにしてビオチン化cRNA断片を合成した。次に、GeneChip Hybridizatioin Ovenを用いてビオチン化cRNA断片をGeneChipにハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイズしたcRNAをGeneChip Fluidics Stationを用いてストレプトアビジン-フィコエリスリンで染色することにより可視化し、GeneChip Scanner 3000でスキャンした。得られた蛍光データはGCOSソフトウェア(Affymetrix)を用いて解析した。ここで、GeneChipは、MOE430A（Sequence Tag数22,626）およびMOE430B（Sequence Tag数22,511）を用いた。抽出された遺伝子からシグナルの高い方から2％および低い方から2％を除き、残りのSequence Tagの平均値がデフォルトで500になるように補正した。これに次に示すフィルターをかけて、各細胞株の心筋細胞分化と相関のある遺伝子を抽出した。
【００８７】
フィルター１
GCOSで解析された各Sequence TagのシグナルはAbsolute Analysis（発現の有無を判定する解析）の結果「発現があるもの:P (Present)」、「発現があるかわからないもの:M (Marginal)」あるいは「発現がないもの:A (Absent)」として判定がなされる。細胞株各群の5例の半数以上（つまり3例以上）でPと判定されたSequence Tagについては、当該細胞株においてそのSequence Tagの塩基配列を含む遺伝子が発現していると判定した。逆に各群の5例のうちＰ判定されたものが2例以下の場合は当該細胞株においてそのSequence Tagの塩基配列を含む遺伝子の発現はないと判定した。細胞株のうち少なくとも1株以上において発現が見られるSequence Tagは次のフィルターをかけ、全ての細胞株で発現が見られないSequence Tagは棄却した。
【００８８】
フィルター２
分散分析(ANOVA)で細胞株間の遺伝子発現の平均値の比較を行い、有意水準5％の条件で帰無仮説が棄却できたもの、すなわち6細胞株の中で発現量が有意に異なる細胞株が少なくとも１つは存在する結果が得られたSequence Tagは次のフィルターをかけ、全ての細胞株で有意な差が現れなかったSequence Tagは棄却した。
【００８９】
フィルター３
細胞株間の遺伝子発現の差の平均値が50％以上のあるもの、すなわち6細胞株の最低の平均値と最高の平均値の差が2.5倍以上出るSequence Tagは次のフィルターをかけ、差が2.5倍より小さいものは棄却した。
【００９０】
フィルター４
P19、CL6、G26、G36、G45およびG52の6種類について、GeneChipで得られた分化誘導前の上記Sequence Tagの発現シグナルと、自動拍動能出現までの日数、自動拍動する細胞ノジュール数のスコア、定量的RT-PCRによって得られた心筋遺伝子発現データの第1主成分得点、または第2主成分得点との間でスピアマンの順位相関係数を算出し、有意水準5％の条件で有意差を検定し、有意な相関の認められたSequence Tagを抽出した。
【００９１】
上記Sequence Tag抽出の結果、第1主成分と相関があるSequence Tagは109個、第2主成分と相関があるSequence Tagは342個、自動拍動能出現までの日数と相関があるSequence Tagは122個、収縮ノジュール数と相関があるSequence Tagは274個抽出された。これらSequence Tagのうち、心筋分化の指標である第1主成分、自動拍動能出現までの日数および収縮ノジュール数の３要素と有意な相関のあるSequence Tagは計24個であった。これら24個のSequence Tagに対応する遺伝子を、CMP1〜24 と命名した。また、CMP1〜24 のうち、第1主成分（心筋細胞分化の指標）、第2主成分（心筋細胞成熟の指標）、自動拍動能出現までの日数および収縮ノジュール数の4要素と有意な相関のある遺伝子は9個であった。
【００９２】
SOSUIシステムによる機能予測
また、上記２４個のCMP遺伝子がコードするアミノ酸配列について、SOSUIシステム(名古屋大学・美宅成樹研究室)によって機能予測解析を行った。解析の結果、12個の遺伝子が膜結合性蛋白質であり、10個の遺伝子が可溶性蛋白質と判定された。
【００９３】
上記統計解析およびSOSUIシステムによる機能解析の結果は表２に示される通りである。なお、表２において、rsはスピアマンの順位相関係数、pはスピアマンの順位相関係数のp-値を示す。また、＊によって示される遺伝子（CMP1〜6、8、11および12）は、第1主成分、第2主成分、自動拍動能出現までの日数および収縮ノジュール数の4要素と有意な相関の認められたものである。
【００９４】
【表２】
【００９５】
実施例４：ＲＮＡｉによる心筋細胞分化の制御１
CMP遺伝子の発現を制御することにより、心筋分化効率の制御が可能かどうかを検討する目的で、CMP2およびCMP13をＲＮＡｉの標的として設定した。そして、表３に記載のヌクレオチド配列を有するStealthRNAi (Invitrogen)をリポフェクション法によってG52細胞へ導入した。また、コントロール（ＮＣ）としてはStealthRNAi Negative Control Medium GC Duplex (Invitrogen)を用いた。
【００９６】
【表３】
【００９７】
siRNAを細胞への導入した後、ＣＭＰ２およびＣＭＰ１３の発現量は、以下に記載のＰＣＲ用プライマーおよびTaqmanプローブを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。この際、定量的ＲＴ−ＰＣＲにおける内部標準としては、１８ＳｒＲＮＡを使用した。なお、Taqmanプローブにおいて、５’末端の蛍光標識物質としてはＦＡＭを用い、３’末端のクエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡを用いた。なお、この実験の具体的手法は、以下の実施例５と同様であった。
ＣＭＰ２遺伝子
フォワード プライマー：5’-CCATCCTGAATCCTAGATACCATCTC-3’（配列番号７２）
リバース プライマー：5’-TAGTGGCAACCATGCTGAGTGT-3’（配列番号７３）
Ｔａｑｍａｎプローブ：5’-CCGATGGACGTGAGGACAGTAATCTGGA-3’（配列番号７４）
ＣＭＰ１３遺伝子
フォワード プライマー：5’-CGCCTCTCTTCGTTTATCTGTTC-3’（配列番号７５）
リバース プライマー：5’-TCTCTGTCTTGGTGCCGTCAT-3’（配列番号７６）
Ｔａｑｍａｎプローブ：5’-ACTTCTTTCCTGCTGGCCGGTTTCGT-3’（配列番号７７）
結果は、図５ＡおよびＢに示される通りであった。StealthRNAiにより、CMP2およびCMP13の発現が７割程度抑制された。さらに、図６に示される通り、CMP２およびCMP13の発現が抑制された条件下では細胞の心筋分化が抑制された。特に、CMP２の発現が抑制された条件下では細胞の心筋分化がほぼ完全に抑制されていた。
【００９８】
実施例５：ＲＮＡｉによる心筋細胞分化の制御２
ＲＮＡｉ
CL6細胞サブラインのうち、G52細胞を分化誘導処理せず、24well細胞培養用マルチウェルプレート (Falcon) に1×104 cells / wellとなるように播種した。これを37℃、5%CO2で一晩培養した。ウェル中の各細胞は、抗生物質不含の基本培地 500μLで2回洗浄し、各wellに同培地400μLを加えた。
次に、Stealth RNAi (Invitrogen) またはsiRNA (QIAGEN) を用いて得られた、以下の表４〜５に記載されるヌクレオチド配列を有するsiRNAを、Lipofectamine 2000 (Invitrogen) を用いてウェル中の各細胞に導入し、CMP１〜２４をノックダウンした。
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
具体的には、まず、1ウェル当たりのsiRNAが40pmolとなるように、蛍光オリゴとしてBLOCK-iT (Invitrogen)（最終濃度10 pmol/well）を含む、OPTI-MEMＩ Reduced Serum Medium (Gibco) でsiRNAを希釈し、siRNA溶液を得た。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）であるStealth RNAi Negative Control Duplexes (Invitrogen) についても同様に希釈した。その後、Lipofectamine 2000 が1.5μL/wellとなるように、OPTI-MEMＩ Reduced Serum Mediumで希釈し、室温で5分インキュベートし、Lipofectamine 2000溶液を得た。次に、siRNA溶液またはネガティブコントロール溶液 50μLとLipofectamine 2000溶液 50μLとを混和し、複合体を形成させるために室温で20分間インキュベートした。この複合体を100μLずつ各wellに加えて緩やかに振盪しながら混合し、5%CO2条件下37℃で48時間インキュベートした。
【０１０２】
siRNAを細胞への導入した後、ＣＭＰ１〜２４の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。具体的には、まず、各細胞からRNesay Mini (QIAGEN)またはBioRobot M48 Workstation (QIAGEN)を用いて、Total RNAを抽出した。このTotal RNAを、2ng/μLに希釈し、測定用サンプルとした。検量線用サンプルとしては、未分化なCL6G52を直径100ｍｍの細胞培養ディッシュ (Falcon)でコンフルエントにならないように培養し、この細胞からBioRobot M48 Workstation (QIAGEN)を用いて抽出したTotal RNAを用いた。20ng /μl、6ng /μl、2ng/μl、0.6ng/μl、0.2ng/μl、0.06ng/μlに希釈し、検量線の作成に用いた。
また、各遺伝子の発現量を補正するために、内部標準として18S rRNAを測定した。18S rRNA測定にあっては、各測定用サンプルを0.02ng/μLに希釈し、検量線用サンプルを0.2ng /μl、0.06ng /μl、0.02ng/μl、0.006g/μl、0.002ng/μl、0.0006ng/μlに希釈した。
【０１０３】
上記サンプルを用い、ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) により定量的RT-PCRを行った。なお、CMP1〜２４についての定量的RT-PCRは、TaqMan Master MixおよびTaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents (Applied Biosystems)を用いて行った。また、CMP19については、検出感度を考慮し、RQuantiTect Probe RT-PCR Kit (QIAGEN) を用いた測定を再度行った。得られた結果は、18S rRNAの発現値により補正し、各サンプルの補正値をネガティブコントロール（ＮＣ）の補正値と比較することで、各遺伝子の発現量の変動を解析した。
【０１０４】
なお、上記定量的RT-PCRで用いたＰＣＲ用プライマーおよびTaqmanプローブは、表６および表７に示される通りである。Taqmanプローブにおいて、５’末端の蛍光標識物質としてはＦＡＭを用い、３’末端のクエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡを用いた。
【０１０５】
【表６】
【０１０６】
【表７】
【０１０７】
結果は、図７ＡおよびＢに示される通りであった。細胞にRNAiを施した後、ＣＭＰ１〜１０、ＣＭＰ１２〜１８、ＣＭＰ２０〜２１およびＣＭＰ２３〜２４の発現量は、コントロール（ＮＣ）と比較して有意に低下した（Student’t-test、ｐ＜０．０５）。
【０１０８】
収縮ノジュール数の測定
上記siRNAの導入後、培養ウェル中の収縮ノジュール数の変化を観察したところ、結果は図８Ａ〜Ｕに示される通りであった。
【０１０９】
CMP１〜６、CMP９、CMP１０、CMP１３、CMP１８、CMP２４のそれぞれについてRNAiを施した細胞では、コントロール（ＮＣ）と比較して収縮ノジュール数は有意に低かった（反復測定二元配置分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）、ｐ＜０．０５）。一方、CMP７、CMP１２、CMP１６、CMP１７、CMP２１、CMP２３では、コントロール（ＮＣ）と比較して収縮ノジュール数は有意に高かった（反復測定二元配置分散分析（two-way repeated-measures ANOVA）、ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
心筋細胞マーカー遺伝子の発現量の測定
siRNAiの上記細胞への導入後、既存の心筋細胞マーカー遺伝子（心筋線維遺伝子であるαMHC、βMHC 、MLC2aおよびMLC2v）の発現量を定量的RT-PCRにより測定し、ＣＭＰ遺伝子のうち、ＣＭＰ１〜１０、ＣＭＰ１２〜１３、ＣＭＰ１６〜１８、ＣＭＰ２０〜２１およびＣＭＰ２３〜２４の発現量と比較した。定量的RT-PCRは、表１に記載のプライマーおよびTaqManプローブを用い、実施例２と同様の手法により行った。
【０１１１】
RNAiによってＣＭＰ遺伝子をノックダウンした後、既存の心筋細胞マーカー遺伝子（αMHC、βMHC 、MLC2a、MLC2v）の発現量の変化は、表８に示される通りであった。さらに、表８には、ＣＭＰ遺伝子をノックダウンした後の収縮ノジュール数の変化を併記した。
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
: RNAiにより有意にノックダウンされたことを示す (p < 0.05 vs. ＮＣ)。
↓: ノックダウン後に有意に減少したことを示す (p < 0.05 vs.ＮＣ)。
↑: ノックダウン後に有意に増加した (p < 0.05 vs. ＮＣ)。
NS: 有意差なし。
【０１１４】
表８に示される通り、CMP1〜6、CMP8、CMP9、CMP10、CMP13、CMP18、CMP20、CMP24のRNAiによるノックダウンにより、いずれかの心筋細胞マーカー遺伝子（αMHC、βMHC 、MLC2aまたはMLC2v）の発現が抑制されるか、あるいは収縮ノジュール数が減少し、心筋細胞分化が抑制さることが確認された。また、CMP7、CMP12、CMP16、CMP17、CMP21、CMP23のRNAiによるノックダウンにより、いずれかの心筋細胞マーカー遺伝子（αMHC、βMHC 、MLC2aまたはMLC2v）の発現が促進されるか、あるいは収縮ノジュール数が増加し、心筋細胞分化が誘導されることが確認された。特に、CMP23については、収縮ノジュール数が増加し、心筋細胞マーカー遺伝子のαMHC、βMHC、MLC2vは有意な増加が認められる一方、MLC2aは有意な減少が認められた。心房筋を特徴付けるMLC2aが減少し、心室筋を特徴付けるMLC2vが増加したことから、CMP23は細胞の心室筋への特異的な誘導に用いうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
未分化細胞の心筋分化活性の検出に有益である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号４７，４８，５０，５１，５３，５４，５６，５７，５９，６０，６２，６３，６５，６６，７２，７３，７５，７６，１２３，１２４，１２６，１２７，１２９，１３０，１３２，１３３，１３５，１３６，１３８，１３９，１４１，１４２，１４４，１４５，１４７，１４８，１５０，１５１，１５４，１５６，１５７，１５９，１６０，１６２，１６３，１６５，１６６，１６８，１６９，１７１，１７２，１７４，１７５，１７７，１７８，１８０，１８１，１８３，１８４，１８６，１８７：プライマー
配列番号４９，５２，５５，５８，６１，６４，６７，７４，７７，１２２，１２５，１２８，１３１，１３４，１３７，１４０，１４３，１４６，１４９，１５２，１５５，１５８，１６１，１６４，１６７，１７０，１７３，１７６，１７９，１８２，１８５：Taqmanプローブ
配列番号６８，６９，７０，７１，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０１，１０２，１０３，１０４，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１１，１１２，１１３，１１４，１１５，１１６，１１７，１１８，１１９，１２０，１２１：siRNAの一方のストランド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化細胞の心筋分化活性を検出するための遺伝子マーカーであって、下記の（ａ）、または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントからなる、遺伝子マーカー：
（ａ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ（ａ）に記載のポリヌクレオチドと機能的に同等なものである、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子マーカー。
【請求項３】
前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドが、前記（ａ）に記載のヌクレオチド配列と７５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ（ａ）に記載のポリヌクレオチドと機能的に同等なものである、請求項１に記載の遺伝子マーカー。
【請求項４】
未分化細胞の心筋分化活性を検出するための核酸分子であって、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはこれと相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである、核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載のヌクレオチド配列の全部または一部からなるものである、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの全部または一部を核酸増幅法により増幅しうる、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項７】
未分化細胞の心筋分化活性を検出するためのプライマーペアであって、請求項１に記載のポリヌクレオチドの全部または一部を核酸増幅法により増幅しうる、プライマーペア。
【請求項８】
未分化細胞の心筋分化活性を検出するためのキットであって、請求項４に記載の核酸分子および／または請求項７に記載のプライマーペアを少なくとも含んでなる、キット。
【請求項９】
請求項２に記載のポリヌクレオチドの発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分として含んでなる、未分化細胞の心筋分化抑制剤であって、前記二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が前記ポリヌクレオチドと未分化細胞内で特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなるものである、心筋分化抑制剤。
【請求項１０】
前記アンチセンス鎖が、請求項２に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるものである、請求項９に記載の心筋分化抑制剤。
【請求項１１】
未分化細胞の心筋分化活性を検出する方法であって、
請求項１に記載の遺伝子マーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、
前記発現量が、前記未分化細胞の心筋分化活性のレベルと相関する、方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の遺伝子マーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、
前記発現量が、心筋分化活性を有しない対照細胞における、前記マーカーの発現量を参照して予め設定された閾値よりも高い場合、前記細胞が心筋分化活性を有するものとする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定が、請求項４に記載の核酸分子および／または請求項７に記載のプライマーペアを用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
心筋分化活性を有する細胞を単離する方法であって、請求項１２に記載の方法により、心筋分化活性を有する細胞を検出し、該細胞を単離することを含んでなる、方法。
【請求項１５】
未分化細胞の心筋分化活性をモニタリングする方法であって、
請求項２に記載の遺伝子マーカーの未分化細胞における発現量を測定することを含んでなり、
前記発現量が経時的に増加した場合、前記未分化細胞の心筋分化活性が増加したものとする、方法。
【請求項１６】
前記測定が、請求項４に記載の核酸分子および／または請求項７に記載のプライマーペアを用いて行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
未分化細胞の心筋分化を抑制する方法であって、請求項９に記載の心筋分化抑制剤を細胞に導入することを含んでなる、方法。
【請求項１】
未分化細胞の心筋分化活性を検出するための遺伝子マーカーであって、下記の（ａ）、または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントからなる、遺伝子マーカー：
（ａ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）（ａ）に記載のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ（ａ）に記載のポリヌクレオチドと機能的に同等なものである、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
細胞の心筋分化活性が増加する場合、細胞における発現量が増加することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子マーカー。
【請求項３】
前記（ｂ）に記載のポリヌクレオチドが、前記（ａ）に記載のヌクレオチド配列と７５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ（ａ）に記載のポリヌクレオチドと機能的に同等なものである、請求項１に記載の遺伝子マーカー。
【請求項４】
未分化細胞の心筋分化活性を検出するための核酸分子であって、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはこれと相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである、核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載のヌクレオチド配列の全部または一部からなるものである、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの全部または一部を核酸増幅法により増幅しうる、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項７】
未分化細胞の心筋分化活性を検出するためのプライマーペアであって、請求項１に記載のポリヌクレオチドの全部または一部を核酸増幅法により増幅しうる、プライマーペア。
【請求項８】
未分化細胞の心筋分化活性を検出するためのキットであって、請求項４に記載の核酸分子および／または請求項７に記載のプライマーペアを少なくとも含んでなる、キット。
【請求項９】
請求項２に記載のポリヌクレオチドの発現をＲＮＡｉにより抑制しうる二本鎖ＲＮＡ分子を有効成分として含んでなる、未分化細胞の心筋分化抑制剤であって、前記二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が前記ポリヌクレオチドと未分化細胞内で特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなるものである、心筋分化抑制剤。
【請求項１０】
前記アンチセンス鎖が、請求項２に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるものである、請求項９に記載の心筋分化抑制剤。
【請求項１１】
未分化細胞の心筋分化活性を検出する方法であって、
請求項１に記載の遺伝子マーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、
前記発現量が、前記未分化細胞の心筋分化活性のレベルと相関する、方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の遺伝子マーカーの細胞における発現量を測定することを含んでなり、
前記発現量が、心筋分化活性を有しない対照細胞における、前記マーカーの発現量を参照して予め設定された閾値よりも高い場合、前記細胞が心筋分化活性を有するものとする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定が、請求項４に記載の核酸分子および／または請求項７に記載のプライマーペアを用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
心筋分化活性を有する細胞を単離する方法であって、請求項１２に記載の方法により、心筋分化活性を有する細胞を検出し、該細胞を単離することを含んでなる、方法。
【請求項１５】
未分化細胞の心筋分化活性をモニタリングする方法であって、
請求項２に記載の遺伝子マーカーの未分化細胞における発現量を測定することを含んでなり、
前記発現量が経時的に増加した場合、前記未分化細胞の心筋分化活性が増加したものとする、方法。
【請求項１６】
前記測定が、請求項４に記載の核酸分子および／または請求項７に記載のプライマーペアを用いて行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
未分化細胞の心筋分化を抑制する方法であって、請求項９に記載の心筋分化抑制剤を細胞に導入することを含んでなる、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図８−４】
【図８−５】
【図８−６】
【図８−７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図８−３】
【図８−４】
【図８−５】
【図８−６】
【図８−７】
【公開番号】特開２０１３−３１４４８（Ｐ２０１３−３１４４８Ａ）
【公開日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２０９７５９（Ｐ２０１２−２０９７５９）
【出願日】平成２４年９月２４日（２０１２．９．２４）
【分割の表示】特願２００８−５１０９９２（Ｐ２００８−５１０９９２）の分割
【原出願日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年９月２４日（２０１２．９．２４）
【分割の表示】特願２００８−５１０９９２（Ｐ２００８−５１０９９２）の分割
【原出願日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]