染色体広範囲遺伝子領域を欠失した生物の作出法
【課題】アフラトキシン生合成に関与する遺伝子クラスターを構成するカビの染色体上における広範囲の遺伝子領域を欠失又は置換する変異株の生産方法や、広範囲の遺伝子領域を欠失した変異株を提供すること。
【解決手段】生物の染色体上数キロベースより長く離れた二箇所の配列と、選択マーカー遺伝子配列を中央に挟むように繋げたカセットを作り、それを細胞に形質転換し、広範囲の遺伝子領域を欠失又は置換する。変異株の選択には、まず選択マーカーの性質を利用して染色体上に遺伝子が導入された生物を選択し、次に各変異株について遺伝子構造の変化を直接調べて、目的の遺伝子領域欠失変異体及び遺伝子領域置換変異体を選抜する。また、宿主由来の選択マーカー配列および遺伝子配列を用いることにより、セルフクローニングによる広範囲遺伝子領域の欠失変異体および置換変異体を作出する。
【解決手段】生物の染色体上数キロベースより長く離れた二箇所の配列と、選択マーカー遺伝子配列を中央に挟むように繋げたカセットを作り、それを細胞に形質転換し、広範囲の遺伝子領域を欠失又は置換する。変異株の選択には、まず選択マーカーの性質を利用して染色体上に遺伝子が導入された生物を選択し、次に各変異株について遺伝子構造の変化を直接調べて、目的の遺伝子領域欠失変異体及び遺伝子領域置換変異体を選抜する。また、宿主由来の選択マーカー配列および遺伝子配列を用いることにより、セルフクローニングによる広範囲遺伝子領域の欠失変異体および置換変異体を作出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体上の広範囲遺伝子領域欠失変異株やその生産方法等に関し、より詳しくは、生物の染色体上数キロベースより長く離れた２箇所の配列、例えば５ｋｂ以上、１５ｋｂ以上、３０ｋｂ以上、５０ｋｂ以上、更に１００ｋｂ以上離れた２箇所の配列を、選択マーカー遺伝子配列単独又は選択マーカーに導入を目的とする配列を繋いだ構造を中央に挟むように繋げたカセットを作り、それを細胞に形質転換し、広範囲の遺伝子領域を欠失する方法及び広範囲の遺伝子領域を他の配列と置換する方法や、これら方法により得られる広範囲遺伝子領域欠失変異株に関し、変異株の選択には、まず選択マーカーの性質を利用して染色体上に遺伝子が導入された生物を選択し、次に各変異株について遺伝子構造の変化を直接調べて、目的の遺伝子領域欠失変異体及び遺伝子領域置換変異体を選抜する方法、また、宿主由来の選択マーカー配列及び遺伝子配列を用いることにより、セルフクローニングによる広範囲遺伝子領域の欠失変異体及び置換変異体の作出に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の生命現象すべては、生物が有する遺伝子にその情報が保存され、いろいろな時期に適切に発現することによって生命現象が営まれる。近年種々の生物のゲノム研究によって、生物の染色体上の多くの領域は広範囲に蛋白質をコードせず、生命現象に関与しないと予想される、いわゆるジャンク領域であることが明らかになってきている。また、微生物や植物で見られる二次代謝は生物の生存には直接必要ではなく、二次代謝を阻害しても生物の生存可能であることは良く知られている。二次代謝に関与する遺伝子の多くは染色体上数ｋｂから数１０ｋｂに及ぶ大きな遺伝子クラスターを形成している。以上のことから、広範囲に遺伝子領域を除去しても生物の営みには少なくとも大きな影響を与えないような領域が染色体上に多く含まれると予想される。
【０００３】
カビが生産する二次代謝物質の中にはアフラトキシン等の毒性物質（カビ毒）があり、これまでに３００種以上のカビ毒が報告されている。中でもアフラトキシンは自然界で最強の発ガン性を示すとともに強力な急性毒性を示す。アフラトキシンは主としてアスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）とアスペルギルス・パラジチカス（A.parasiticus）に属する一部の菌が生産し、アフラトキシン生産菌は主として熱帯・亜熱帯地域の土壌に常在する。しかし、温帯の米国でも干ばつ等の気候変動で大規模なアフラトキシン汚染が起こることがある。我が国の本州以北の土壌ではアフラトキシン生産菌は検出されないが、さらに南の地域、例えば沖縄では汚染の報告がある。我が国は穀物の約６０％を輸入に頼っており、また穀物は世界で貿易されるため、輸入穀物のアフラトキシン汚染は厳重に検査されており、そのために使われる費用は莫大なものがある。一方、アフラトキシン生合成には１８種以上の酵素が関与しているが、これら酵素をコードする遺伝子を含めてアフラトキシン生合成に関与する２５以上の遺伝子群がカビの染色体上約７０ｋｂに及ぶ領域に大きな遺伝子クラスターを構成している。
【０００４】
ステリグマトシスチンはやはりカビ毒であるが、アフラトキシンの中間体でもあり、アフラトキシンに比べれば弱いが、やはり強力な発ガン性及び毒性を示す。アスペルギルス・ニジュランス（A.nidulans）やアスペルギルス・ベルシカラー（A.versicolor）等を含む２０種以上の多くのカビが、最終産物としてステリグマトシスチンを生産する。これらステリグマトシスチン生産カビは日本本州でも常在し、穀物のステリグマトシスチン汚染の可能性は我が国においても重要な問題である。ステリグマトシスチン生合成経路は、アフラトキシン生合成経路中ステリグマトシスチン中間体までの経路と同一である。ステリグマトシスチン生産関連遺伝子は、染色体上約６０ｋｂに及ぶ遺伝子クラスターを構成している。
【０００５】
これらのカビが有害物質を生産しないようにするには、いろいろな方法がある。例えば、種々の変異処理を行い塩基置換による変異体を得る方法もあるが、常に復帰変異が起こる可能性を念頭に置かなくてはならない。また、生産に関与するいずれかの遺伝子を破壊すれば生産を抑えることができるが、有害な中間体が蓄積する可能性があり、また、一遺伝子破壊ではわずかに活性が残ることが多い。これは、生体内の別の酵素が群特異性によって反応を触媒するためと考えられる。したがって、完全にカビ毒の生産を抑えるには、遺伝子クラスターを丸ごと除去することがもっとも確実な方法である。
【０００６】
アフラトキシンやステリグマトシスチンなど多くのカビ毒は熱に安定で、また分解も容易ではない。カビのアフラトキシン生産を効果的に防御できる方法も未だ開発されていない。しかし、近年アメリカでは、耕作土壌や収穫後の穀物にアフラトキシン非生産カビの胞子を散布して、アフラトキシン汚染を減少させる方法が開発されてきている。つまり、アフラトキシン非生産カビの胞子を大量に調製し、微生物農薬として土壌や穀物保管倉庫に過剰に添加し、環境中のアフラトキシン生産菌と感染機会を競合させるもので、有意にアフラトキシン汚染量を減少できることが報告されている。このようなアフラトキシン非生産菌の胞子はバイオコントロール剤として現在、製品として販売されている。しかし、利用されているアフラトキシン非生産カビは研究室や会社で保存されているアスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）やアフラトキシン非生産アスペルギルス・フラバスであり、実際に現場でアフラトキシン汚染を引き起こしているカビではない。そのため、気候、土壌、作物種などの環境要因に対するバイオコントロール剤の感受性は汚染現場に常在するカビとは微妙に異なると予想され、実際にバイオコントロール剤の環境への定着性は低い。そのためバイオコントロール剤は毎年、又はより頻繁に現場に散布する必要がある。そのため、安価な作物の栽培にはコストの点から利用が限られている。
【０００７】
更に、我が国を含め東アジアでは発酵食品が好まれており、発酵食品生産には麹カビが利用されている。麹カビであるアスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・ソーヤ（A.sojae）は分類学上アフラトキシン生産菌アスペルギルス・フラバスやアスペルギルス・パラジチカスと極めて近縁であり、これらは、いわゆるアフラトキシン関連物質を作らないように”家畜化された” アスペルギルス・フラバスと考えられている。これまでアフラトキシンの生産が検出された麹カビは一例もなく、麹カビの安全性については確認されている。しかし、近年の遺伝子研究技術の発展により、麹カビの半数以上がアフラトキシン遺伝子クラスター類似の広範囲遺伝子領域を有し、それ以外もかなりの領域又は少なくとも複数の類似遺伝子を含むことが明らかになっている。これらの遺伝子領域が存在しても機能していないことは明らかであるが、アフラトキシン関連遺伝子領域の存在は、消費者に対して食品の安全性をアピールする際には問題がある。また、麹の渇変原因遺伝子ｍｅｌ等の存在は、食品に色をつける可能性があり、望ましくないとされる場合がある。以上のように産業上好ましくない性質の遺伝子や有害物質関連遺伝子を除去することができれば、糸状菌の利用の可能性は大きく広がると考えられる。
【０００８】
一方、カビや細菌を利用した遺伝子組み換え技術として、従来から生物の染色体と相同な領域を選択マーカー遺伝子の両側に含む遺伝子断片を生物に導入して、２回交差の相同組換えによって数キロｂｐ程度の遺伝子領域の欠失や置換が生じた生物作出する方法は、短い遺伝子領域を改変するための一般的な方法として利用されている。生物に遺伝子導入をした場合、遺伝子断片と染色体上同一の配列を有する部位で組換えが起こる相同組換えと、遺伝子断片とは全く異なる配列に挿入される非相同組換えが起こる。生物一般に起こる現象であるが、特に真核生物では非相同組換えの率が高く、目的とする変異株の選抜を難しくしている。さらに、特定の遺伝子領域を丸ごと欠失したり、他の遺伝子又は遺伝子領域を置換したりするには、２箇所の相同領域で相同組換えが起こることが必要で、目的の変異株が得られる確率は一層低下する。したがって、従来、遺伝子改変して目的とする変異株を得るには、目的とする変異株が特徴的な表現型を示すこと、又は、変異する遺伝子の機能があらかじめ予想できていてその性質に基づいて変異株を選抜できることが、多くの場合で必要であった。加えて、遺伝子機能が不明である場合や顕著な表現系の変化がない場合には、目的の変異株の選抜は困難であり、変異株の獲得は断念される場合が多かった。
【０００９】
更に、上述したように、麹カビにおいては一つの胞子が２個以上の核を含む多核胞子の割合が高いため、胞子を培養して集落を作らせても変異を有する一つの核の性質が表現形質の変化として現れにくく、目的の変異株を選抜することは極めて困難である。特に、あらかじめ得られる変異株の形態変化や酵素活性の変化に関する情報が得られない際には、目的とする変異株の選抜は多核胞子中の核の中から目的とする変異株の核だけを分けとるか、多核胞子を培養し、継代するにしたがって分離して得られてくる変異株を選抜する必要がある。しかしながら、このような方法では、種々の形質転換株の中に極めてわずかにしか含まれないので、目的の変異株を選抜することは現実的には不可能である。
【００１０】
また、非常に多くの、例えば１００個以上の沢山の形質転換体について、遺伝子構造を全て調べるためには、形質転換体それぞれからＤＮＡを抽出する必要がある。大腸菌や酵母では直接菌体をＰＣＲ溶液に添加してＰＣＲ産物を得るいわゆるコロニーＰＣＲが可能であるが、特に、上記のようなカビや植物など強固な細胞壁を有する生物では、従来核酸の溶出は困難であり通常は乳鉢で液体窒素存在下に細胞を破砕してＤＮＡを抽出するため、一度に沢山の菌体の分析は極めて困難であった。しかし、近年、本発明者らが鋭意研究を行った結果、微量細胞破砕装置を用いて、多数の、そして少量のカビ菌体から短時間のうちに安価にＤＮＡを溶出する方法を確立した（例えば、非特許文献１参照）。
【００１１】
これまで染色体上の広範囲遺伝子領域を除去する技術として報告されてきたものは、相同組換えの頻度を高めるために染色体上の二箇所の離れた領域に組換え酵素の基質となる特殊な配列を別々に挿入し、この配列間の組換えを選択的に触媒する酵素遺伝子を細胞内で発現させて、特殊な配列間で特異的に交差を起こし、広範囲遺伝子領域を相同組換えによって欠失させるものである。これらの方法では、特殊な配列と配列に特異的な組換え酵素の利用により得られる組換え体は、ほとんどが目的とする組換え体であり、上記した変異株の選抜の問題を回避することができる。これらの方法としては、λ-red recombination system，Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステム、メガヌクレースをもちいた遺伝子置換法等がある。たとえば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ法を用いて広範囲遺伝子領域を除去する方法では、染色体上の離れた二箇所にｌｏｘＰと呼ばれる特有の配列を組み込み、別に細胞内で組換え酵素Ｃｒｅを発現することでｌｏｘＰの間の組換えを起こし、最終的に２つのｌｏｘＰで挟まれていた領域を除去する方法が知られていた。
【００１２】
また、有性世代を有さない生物の遺伝子ターゲッティングによる遺伝子破壊あるいは遺伝子置換に必要な相同組換え効率の良い菌株を提供するため、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼー等に代表されるトリコモナス科糸状菌に属し有性世代を持たない菌を用いて、Ｋｕ遺伝子破壊株及びアンチセンスＲＮＡ法等によるＫｕ遺伝子を抑制することによって相同組換え（ターゲッティング）頻度が上昇した変異株、及び、該変異株を使用する遺伝子ターゲッティング法により、遺伝子破壊株、遺伝子欠失株、遺伝子置換株、遺伝子挿入株、又は染色体改変株を作成する方法（例えば、特許文献１参照）や、真核生物細胞等の所望の細胞の相同組換え率を上昇させるために、非相同組換えに必要な因子、例えば、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０をコードする遺伝子に突然変異を導入し、又は該遺伝子を破壊することにより、機能喪失を引き起こしたとき、細胞に外来性ＤＮＡを、電気ショック法等により導入して相同組換えを行わせ、細胞の相同組換え頻度を促進させる方法（例えば、特許文献２参照）が知られているが、これらの方法では、ｋｕ破壊株を作る必要があり、さらにｋｕ破壊株における非相同組換え活性の変化が他の面でもカビに影響を与える可能性がある。
【００１３】
【特許文献１】特開２００６−１５８２６９号公報
【特許文献２】特開２００５−２３７３１６号公報
【非特許文献１】Ying Wen, Hidemi Hatabayashi, Hatsue Arai, Hiroko Kitamoto, Kimiko Yabe. Function of the cypXand moxY genes in aflatoxin biosynthesis in Aspergillus parasiticus. Applied and Environmental Micorbiology 71:3192-3198 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
染色体レベルの広範囲の遺伝子領域を欠失させる場合、例えば、染色体５キロベース以上、好ましくは１５キロベース以上、より好ましくは５０ｋｂ以上、特に好ましくは１００ｋｂ以上離れた二箇所の配列を対象としたとき、２重交差が起こる確率は極めて低く、通常１％以下である。そのため染色体レベルの広範囲遺伝子領域の改変には２回交差による相同組換株の作出は利用されてきていなかった。実際、導入遺伝子断片の一方又は両方が、非相同的に染色体に挿入されて生じる変異株の割合は高く、広範囲遺伝子領域を欠失させたり、他の遺伝子領域に置換させたりすることは極めて困難である。また、麹カビのように、１つの胞子が２個以上の核を含む多核胞子の割合が高い生物については、１つの核の変異が表現型の変化として現れないため、目的の変異株を選抜することは極めて困難であった。
【００１５】
さらに、あらかじめ得られる変異株の形態変化や酵素活性の変化に関する情報が得られない際には、目的とする変異株の選抜は、多核胞子中の核の中から目的とする変異株の核だけを分けとるか、多核胞子を培養し継代するにしたがって分離して得られてくる変異株を選抜する必要があるが、このような方法で種々の変異株からわずかに含まれる目的の変異株を選抜することは、実際には不可能である。また、目的とする変異株が特徴的な表現型、すなわち、形態や物質の生産性の変化等容易にその変化を検出できる形質を有している場合には、その形質は選抜に役立つが、狭範囲遺伝子領域の改変を行った場合でも、また広範囲遺伝子領域の改変を行った場合でさえも表現型の有意な変化が起こらないこともあるため、変異株の形質変化を予想することは通常困難であり、目的どおりの遺伝子領域改変が起こっているかを確認するためには、遺伝子構造の変化を確認する必要があった。
【００１６】
本発明の課題は、アフラトキシン生合成に関与する遺伝子クラスターを構成するカビの染色体上約７０ｋｂに及ぶ領域等の、広範囲の遺伝子領域を欠失する方法及び広範囲の遺伝子領域を他の配列と置換する方法や、広範囲の遺伝子領域を欠失した変異株の生産方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らはアフラトキシン生産菌アスペルギルス・パラジチカスのアフラトキシン遺伝子クラスターを除去する方法を確立するため、まずはＣｒｅ／ｌｏｘＰの系の利用を検討した。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを用いて遺伝子領域の欠失を行うためには、合計３つの選択マーカーが基本的に必要となる。欠失したい領域の二つの端に、ｌｏｘＰ配列を、それぞれ方向をそろえて導入する必要がある。そのためには、各ｌｏｘＰに選択マーカーが必要であり、つまり２つ選択マーカーが必要である。さらに、導入したｌｏｘＰ配列間で相同組み換えを起こすために、組み換え酵素Ｃｒｅを細胞内で発現させる必要があり、Ｃｒｅの遺伝子を細胞内に導入するための選択マーカーがもう１つ必要である。
【００１８】
アスペルギルス・パラジチカスの場合、使用できる選択マーカーの数が極めて限られており、薬剤選択マーカーとしてはピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）しか得られていない。これ以外の硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）等を選択マーカーとする場合は、ｎｉａＤ欠失株等の栄養要求性変異株を作る必要があり、栄養要求性変異株の作出も容易ではない上に、２つの栄養要求性変異を導入することで野生株とは離れた株を宿主として利用せざるをえないという問題がある。特に、アスペルギルス・パラジチカスの系に限らずアスペルギルス・フラバスグループでは極めて使える選択マーカーの数が限られているという問題が非常に大きな障害となっており、また、変異株の作製も容易ではないなど問題がある。
【００１９】
本発明者らの研究では、２つの栄養要求性が含まれるアスペルギルス・パラジチカス変異株の入手ができないという問題点があった。そこで、本発明者らは、このカビで一般的に使われている栄養要求性マーカーが硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤであることから、この遺伝子に関する変異株を入手し、ｎｉａＤとｐｔｒＡという二つの選択マーカーを用いて、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系の利用を検討することとなった。
【００２０】
まず、ｎｉａＤ選択マーカー、ｌｏｘＰ、及び、導入の標的となる遺伝子であるアフラトキシン遺伝子クラスターのｖｂｓ遺伝子の配列を含むプラスミドを構築し、ｖｂｓ遺伝子配列の内部で一箇所切断し、できた線状のプラスミドを宿主に導入して、ｖｂｓ遺伝子の部分で一回交差してベクターが導入された変異株を選抜した。この場合、ｖｂｓ遺伝子はアフラトキシンクラスター上の遺伝子で、アフラトキシン生産の途中の酵素をコードしているため、この遺伝子で交差した変異株はアフラトキシン生産性が顕著に減少するとともに、この遺伝子が関与する反応段階の直前の色素性中間体が菌糸中に蓄積する。したがって、マーカー遺伝子の選抜の後、さらに色素の蓄積を指標に目的とする変異株を絞り込んでいくことができた。こうして選抜した変異株について、次に遺伝子構造の変化をＰＣＲで確認することで、ｖｂｓ領域にｌｏｘＰ配列を含むベクターが導入された変異株を作製するのに成功した。
【００２１】
次に２つ目のｌｏｘＰを導入する必要があったが、使える選択マーカーがｐｔｒＡしかなかったため、ｐｔｒAを含む導入プラスミドにｌｏｘＰ配列とＣｒｅ酵素遺伝子発現領域との両方を組み込み、これをクラスター中のｐｋｓＡ配列に導入する計画を立てた。ベクター中には、ｎｉａＤ、ｌｏｘＰ、標的のｐｋｓＡ配列、Ｃｒｅ酵素の配列、さらにｃｒｅ遺伝子を発現するためのタカアミラーゼＡ遺伝子（ａｍｙＢ）プロモーター領域を組み込む必要があった。しかし、このような沢山の遺伝子を組み込んでいって、目的のプラスミドを得ることは、種々の組み込み方法を検討したにもかかわらず大変困難であった。この原因について時間をかけて検討したが、その原因の１つに、プラスミドサイズの問題があるという結論が得られた。つまり、このベクターは沢山の遺伝子領域を含むために大きなものとなる。一方、プラスミドは大腸菌に組み込んで増幅するが、通常研究で一般的に使われる大腸菌を用いた場合、効率よく形質転換されるプラスミドの大きさには限度があり、今回の試みではなかなか目的のサイズのプラスミドが取れなかった。つまり、形質転換できた場合でも、大腸菌を培養している間にプラスミドが分解してきているらしく最終的にプラスミドサイズが小さくなったものが優先的に増幅されることが多かった。そのため、基本ベクターを他のものに変えたり、大きなプラスミドも導入できると報告されている大腸菌の株を用いたりするなど、種々の条件を変更することで、カビの形質転換に使える量の形質転換ベクターを得ることができた。
【００２２】
得られたベクターをｐｋｓＡ遺伝子内部で一回切断後、ｌｏｘＰ配列が一つ導入されているカビに形質転換し、ｐｋｓＡ遺伝子で一回交差してベクターが丸ごと導入された形質転換体の作出を試みた。選抜には、まずピリチアミン耐性選択マーカーで選抜（ピリチアミンを含む培地で生えてくる株）した。ｐｋｓＡ遺伝子内部に導入された場合、ｐｋｓＡ遺伝子の機能が破壊される。ｐｋｓＡ遺伝子はアフラトキシン生合成経路のごく初期に関与しているため、この遺伝子が破壊されるとｖｂｓ遺伝子破壊で蓄積していた色素性アフラトキシン中間体の生産もなくなる。したがって、ピリチアミン耐性株の中から、色素の蓄積がなくなった白い菌糸を示す株を選抜した。こうして得られた株について遺伝子構造をＰＣＲで確認することで、２つ目のｌｏｘＰ配列が導入された変異株を選抜した。
【００２３】
このようにして得られた株について、ｃｒｅ酵素の発現を試みた。ｃｒｅ遺伝子の上流にタカ‐アミラーゼＡ遺伝子（ａｍｙＢ）プロモーターをつなげているが、このプロモーターはマルトースやでんぷんを培地に加えることによって誘導される。そこで、培地にこれらの炭素源を加えて変異株を継代し、遺伝子領域の欠失を検討した。しかし、目的とする広範囲領域の破壊株は得られなかった。種々のｃｒｅ遺伝子の誘導条件を検討し、ｃｒｅ遺伝子の発現誘導はＲＴ−ＰＣＲによって確認されたが、それでも目的とする株が得られなかった。ｃｒｅ遺伝子の高発現条件や、酵素活性の至適条件が得られていなかったためと予想されるが、多くの検討と試みにもかかわらず、目的とする広範囲遺伝子領域欠失株は得られず、この方向の研究を断念した。
【００２４】
以上のように、ｃｒｅ／ｌｏｘＰの系は基本的に３個の選択マーカーが必要であるため、利用できる選択マーカーの数がそれに満たない場合は、利用が大変困難である。また、広範囲遺伝子領域の破壊では、離れた、少なくとも二箇所の領域に段階的にｌｏｘＰ配列を導入する必要があり、さらに、Ｃｒｅ酵素遺伝子の導入が必要であるため、欠失させるのに必要な構造を構築するのに少なくとも３段階のステップが必要で、おのずと複雑な手法と言える。さらに、Ｃｒｅ酵素遺伝子を導入しても、Ｃｒｅ発現の至適条件を得るのは容易なことではない。本発明者らは約１年半の間、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系によるアフラトキシン遺伝子クラスターの欠失を試みたが成功には至らなかった。
【００２５】
また、特に麹カビの場合、もともとアフラトキシン及びアフラトキシン中間体の生産がないので、遺伝子を除去しても、アフラトキシン生産性の変化やアフラトキシン中間体の色の変化を指標に目的の変異株を選抜することができず、したがって、選択マーカーで選抜した変異株の中で、極めてわずかしか含まれない目的の変異株を選抜することはほとんど不可能と考えられてきた。本発明者らも含め当業者であれば、このような場合には非相同組み換えに比べて相同組み換えの頻度が顕著に上昇するようなシステムの構築を考え、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系やｋｕ株の系の開発を検討する。このようにして得られる変異株のたとえば５０％が相同組み換えによる目的の変異株であれば、数個程度の変異株について遺伝子構造を調べれば、かならず目的の変異株を見い出すことができ、調べる数が少ないので、遺伝子構造の確認もそれほど大変ではないだろうという発想が、本出願前の本発明者らも含めた当業者の研究開発の方向であった。しかし、上述したように、アスペルギルス・パラジチカスのアフラトキシン遺伝子クラスターを、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰの系を利用して除去する試みに成功しなかったことから、研究開発の方向を大きく転換することを余儀なくされた。
【００２６】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するため、研究方針を変え、１）広範囲遺伝子領域破壊のための遺伝子置換カセットの構築、及び２）目的とする変異株の選抜方法という以下に示す方法について検討を行うこととした。
１）導入遺伝子構造として、染色体上、長さが少なくとも５ｋｂ以上、１５ｋｂ以上、５０ｋｂ以上、又は１００ｋｂ以上離れた２つの領域と同一の２つの遺伝子配列を、選択マーカー又は選択マーカーと着目の遺伝子領域の配列を含んでつなげた遺伝子カセットを作製し、プロトプラスト等に形質転換する。２種の選択マーカーを利用できる場合には、ポジティブ−ネガティブセレクションが可能なように、上述のカセットの一方の外側に２つ目の選択マーカーの配列を導入する。
２）導入遺伝子断片の２つの相同遺伝子領域と染色体上の相同領域でそれぞれ相同組換えが起こった変異株を選抜するために、まず選択マーカーの性質を利用して選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより、目的の変異株を選抜する。
【００２７】
上記方法は、基本的に、選択マーカーで選抜したできるだけ多くの変異株のすべてについて、遺伝子を調べるという方法で、極めてわずかしか含まれないだろう目的の変異株を労力で選抜するという大変泥臭い方法であるが、麹カビのようにアフラトキシンを生産しないカビでも問題なく利用できる上に、カビの生存に影響しない領域、又は影響しないような培養条件が得られる領域であれば、どのような領域でも、すべて欠失、又は改変できる技術といえる。そして、染色体上、長さが少なくとも５ｋｂ以上、１５ｋｂ以上、５０ｋｂ以上、又は１００ｋｂ以上離れた広範囲遺伝子領域を簡便に除去する方法及び同広範囲領域を他の遺伝子領域に交換する方法として、ＰＣＲや遺伝子断片の結合により作られ、選択マーカーだけ、又は選択マーカーと着目の遺伝子領域の配列を含んだ内部ヌクレオチド配列に隣接する２つの相同性領域を含む挿入ベクターを、プラスミドに含まれた形又は遺伝子断片として構築し、形質転換を行った後、多くの変異株の中から、離れた２箇所の相同性領域で２回交差が起こった目的とする変異株を選抜してくる方法を見い出し、本発明を完成するに至った。
【００２８】
このように本発明では、遺伝子構造の変化を調べることによって目的とする変異株を選抜し、最終的に広範囲の遺伝子領域が目的通りに改変されていることを、種々のプライマーを用いたＰＣＲやサザーン法等で確認する。もちろん変異株の表現形の変化があれば有用な情報となるが、広範囲遺伝子領域の改変を確実にモニターするためには遺伝子構造の変化を直接調べることが有効であり、本発明によって、極めて信頼性の高い変異株選抜法が確立できたといえる。
【００２９】
すなわち本発明は、（１）糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを作製し、該広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを前記糸状菌に導入し、２回交差相同組換えが起こった変異株を、まず選択マーカーの性質を利用して一次選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより二次選抜することを特徴とする広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（２）糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域であることを特徴とする上記（１）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法に関する。
【００３０】
また本発明は、（３）染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域が、染色体上で１５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（４）染色体上で１５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域が、染色体上で５０ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域であることを特徴とする上記（３）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（５）選択マーカー遺伝子が、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）又は／及び硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（６）一次選抜で得られた変異株から単核胞子を調製し、単核胞子由来の遺伝子構造の変化を直接調べることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（７）ＰＣＲ法又はサザーン法により変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（８）糸状菌の染色体上で５ｋｂ以上の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域が、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域で置換されて欠失した広範囲遺伝子領域欠失変異株や、（９）糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター領域又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域であることを特徴とする上記（８）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株や、（１０）糸状菌の染色体上で１５ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを特徴とする上記（８）又は（９）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株や、（１１）糸状菌の染色体上で５０ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを特徴とする上記（１０）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株や、（１２）選択マーカー遺伝子が、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）又は／及び硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）であることを特徴とする上記（８）〜（１１）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株に関する。
【００３１】
さらに本発明は、（１３）アフラトキシン生産菌の遺伝子クラスターの全部又は一部が除去されたアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカスや、（１４）アスペルギルス・パラジチカス（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０）や、（１５）アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域の全部又は一部が除去されたアスペルギルス・オリゼーや、（１６）アスペルギルス・オリゼー（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１）や、（１７）上記（８）〜（１２）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株、上記（１３）若しくは（１４）記載のアスペルギルス・パラジチカス、又は、上記（１５）若しくは（１６）記載のアスペルギルス・オリゼーを含むバイオコントロール剤や、（１８）糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットと、前記広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを確認することができるプローブ又は少なくとも１対のプライマーセットとを備えた広範囲遺伝子領域欠失変異株のスクリーニングキットに関する。
【発明の効果】
【００３２】
上述の染色体改変技術（ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム、λ−ｒｅｄレコンビネーションシステム、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステム、メガヌクレースを用いた遺伝子転換）では、特殊な配列をあらかじめ挿入し、その間で相同組換えが起こるように組換え酵素を発現させて、目的とする変異株の出現頻度を上げたり、麹カビの場合には、非相同組換え活性を下げる変異をあらかじめ宿主に導入しておくことで相同組換えの割合を上昇させ、目的とする変異株の選抜が可能になっているものの、以下のような多くの問題点があった。
【００３３】
１）これらの方法では、特定の配列を導入して、さらに組換え酵素の遺伝子導入をする必要があるため、複数の選択マーカーが必要であり、それだけの数の選択マーカーが利用できる系である必要がある。選択マーカーによっては宿主にあらかじめ変異を導入することが必要となる。
２）これらの方法では、細胞内で遺伝子組み換えのための特定の酵素遺伝子を発現させる必要があるが、酵素遺伝子の発現のための至適条件を決めることが必要であり、容易ではない。また、これらの方法では特殊な酵素や遺伝子配列が必要なため、２段階以上のステップから構成される複雑な系であり操作が極めて複雑である。
３）以上のような複雑で難しい方法であるため、いずれの方法も時間がかかる。
４）さらに、得られた破壊株の染色体の中に最終的に異種遺伝子が保持されてしまうため、作製された生物は異種間の遺伝子組換え体となる。したがって組み換え体を環境中で使用することは法の規制を受け、実用の面で困難が多い。
５）麹カビで報告されているｋｕ７０破壊株による破壊法では、遺伝子領域除去のためにｋｕ７０破壊株の作製があらかじめ必要であり、さらに操作が複雑であり時間がかかる。
【００３４】
一方、本発明では、遺伝子コンストラクトの作製も容易であり、１つの選択マーカーがあれば十分であり、１回の形質転換をすれば、目的の欠失株が得られる。したがって、本発明は、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系、又はｃｒｅ／ｌｏｘＰ系と同様の原理を持つ遺伝子改変システムとは比較にならないほど、容易で短時間に目的の変異株を得ることができるシステムを提供している。
【００３５】
このように本発明によると、従来の方法と異なり、相同組換えが選択的に起こるような特別の配列や酵素の導入や非相同組換え活性の破壊は使用しないため、選択マーカーで選抜後の変異株の中で、目的とする２回交差変異株の割合は極めて少なく、表現型の変化を利用した選抜も期待できない。本発明では、遺伝子マーカーの性質で選抜された変異株それぞれからＤＮＡを調製し、ＰＣＲやサザーン分析等を用いて直接遺伝子の構造変化を調べた。すなわち、目的とする変異株が１％の確率で含まれているとすると、少なくとも１００個の変異株を、それが２００個以上また５００個であるとしても目的とする変異株を遺伝子構造の変化を調べることで選抜することになる。したがって、この方法を効率よく行うためには、生物体から簡便に遺伝子を抽出する技術が必要であり、生物体の熱処理等や細胞破砕による核酸抽出によって多数の生物体から簡便に核酸を溶出し、さらにＰＣＲやサザーン法等で分析することで、効率よくスクリーニングを行うことができる。
【００３６】
また、麹カビについては多核胞子が多い点に問題があるが、その場合にも、得られた変異株のそれぞれから核酸を調製し、遺伝子構造変化を調べることで選抜できる。例えば、ＰＣＲを用いる場合、ＰＣＲのプライマー配列として、選択マーカーの内部配列と、染色体上、導入遺伝子の相同配列より外側の配列を選ぶことにより、多核胞子であっても、胞子の中の複数の核のうち一つでも目的とする変異株の核があれば、ＰＣＲ産物が得られるように、いわゆる変異体の核のポジティブセレクションが可能になるように設計する。そして、カビの胞子サイズは含まれる核の数によって異なるため、ポジティブセレクションで得られた変異株から胞子を調製し、単核胞子しか通せないようなポアサイズの膜をもちいて胞子液をろ過し、得られた胞子を寒天培地に広げ培養することで、一つの核をもつ胞子から得られた集落（菌糸と胞子）から核酸を調製し、ＰＣＲやサザーン法で遺伝子構造を調べ、目的の変異体を選抜することができる。
【００３７】
このように本発明によると、特殊な遺伝子配列を染色体上へ導入する必要がなく、また組換え酵素の発現や、特殊な宿主も必要としない。操作は単純であり、目的の変異株の検出にも複雑な操作を必要としない。さらに、宿主由来の選択マーカー配列と遺伝子領域を本発明に利用すれば、セルフクローニングが可能であり、得られた生物の実用的利用の可能性が非常に高いといえる。
【００３８】
また、本発明を利用して、麹カビからアフラトキシン生産に関連する遺伝子領域を完全に取り除くことができ、汚染現場の菌からアフラトキシン遺伝子クラスターをまるごと除去できれば、定着率の高いバイオコントロール剤の開発が可能となり、安全な食品供給のイメージアップにも貢献することができる。さらに、アフラトキシン遺伝子クラスターに限らず、生物の生育に直接必要としないか、又は有害な領域を新たな遺伝子領域に置換できる手法を得ることは、離れた相同性領域の間に物質生産に関連する酵素遺伝子や制御遺伝子領域を繋げ、生物に新たな物質生産機能を付与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法としては、糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを作製し、該広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを前記糸状菌に導入し、２回交差相同組換えが起こった変異株を、まず選択マーカーの性質を利用して一次選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより二次選抜する方法であれば特に制限されず、上記糸状菌としては、アスペルギルス属菌、フザリウム属菌、ペニシリウム属菌、リゾップス属菌、ムコール属菌、リゾムコール属菌、アブシジア属菌、モナスカス属菌等を挙げることができる。
【００４０】
上記糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域としては、アスペルギルス属菌が産生するアフラトキシン、オクラトキシン、ステリグマトシスチンや、フザリウム属菌が産生するデオキシニバレノール、ニバレノール、ゼアラレノンや、ペニシリウム属菌が産生するルテオスカイリン、シトリニン等のマイコトキシン生産に関与する遺伝子クラスターを具体的に例示することができる。また、少なくとも生存に必須でない遺伝子としては、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ソーヤ、リゾープス・ジャバニクス、モナスカス・プルプレア等の麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域、麹の渇変原因遺伝子ｍｅｌ等の好ましくない性質に関与する遺伝子領域を好適に例示することができる。
【００４１】
上記染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域としては、好ましくは１５ｋｂ以上、より好ましくは３０ｋｂ以上、特に好ましくは５０ｋｂ以上や１００ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域を挙げることができ、より具体的には、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域としては、アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスターのｄｍｔＡとｖｂｓとの２つの遺伝子領域（６．６ｋｂ）を挙げることができ、染色体上で３０ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域としては、アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスターのｐｋｓＡとｖｂｓとの２つの遺伝子領域（４９ｋｂ）を挙げることができ、染色体上で５０ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域としては、アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスターのｎｏｒＢとｈｙｐＡとの２つの遺伝子領域（６７ｋｂ）や、アスペルギルス・オリゼー染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域のａｆｌＴとｍｏｘＹとの２つの遺伝子領域（６０ｋｂ）を挙げることができる。
【００４２】
上記選択マーカー遺伝子としては、アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・パラジチカスのピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒＡ（Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1416-1421, (2000)；特許第３１６２０４２号公報）、硝酸還元酵素をコードする遺伝子ｎｉａＤ（Mol. Gen. Genet., 218, 99-104, (1989)）、ａｒｇＢ（Enzyme Microbiol. Technol., 6, 386-389, (1984)）、ｐｙｒＧ（Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 284-289, (1983)）、ａｍｄＳ（Gene, 26, 205-221, (1983)）、ｓＣ（Gene, 84, 329-334, (1989)）を挙げることができるが、実用性の点で、ｐｔｒＡ及びｎｉａＤを好適に例示することができる。また、選択マーカー遺伝子として、アスペルギルス・ニガーのハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（Gene．1987；56（1）：117-24）、オリゴマイシン耐性遺伝子（Curr．Genet.1988 Jul；14（1）：37-42）、アスペルギルス・ニジュランスのオーレオバシジンＡ耐性遺伝子（特開平９−９８７８４号公報）、アスペルギルス・フラバスのベノミル耐性遺伝子（Appl．Environ Microbiol 1990 Dec；56（12）：3686-92）、ペニシリウム・ロックフォルテイー（P.roqueforti）のphelomycin耐性遺伝子（J. Biotccol 1996 0ct．18；51（1）：97−105 ）、ペニシリウム・アイスランジユーム（P.islandicum）のbenomyl 耐性遺伝子（curr．Genet. 1995 Nov.；28（6）580-4 ）等を挙げることができる。
【００４３】
上記広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットは、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を、λファージベクターやプラスミドベクターを利用して連結することにより調製することができる。また、ダブルジョイントＰＣＲ法（Jae-Hyuk Yu et al. Double-joint PCR: a PCR based molecular tool for gene manipulations in filamentous fungi. Fungal Genetics and Biology 41 (2004) 973-981）等を用いて、各遺伝子領域及びマーカー領域をＰＣＲで増幅後、それぞれを連結して破壊カセットをプラスミドを利用することなく直接構築する。上記選択マーカー遺伝子は、２種以上用いることもでき、この場合、ポジティブ−ネガティブセレクションが可能なように、上記カセットの一方の外側に２つ目の選択マーカーの配列を導入することが好ましい。また、選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域における所定の遺伝子領域としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を挙げることができる。
【００４４】
広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを糸状菌に導入する方法としては、ＰＥＧ−カルシウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、アグロバクテリウム法など特に制限されないが、細胞壁溶解酵素処理によってプロトプラストを作製し、ポリエチレングリコールと塩化カルシウム存在下で線状化したカセットＤＮＡを導入する方法を好適に挙げることができる。
【００４５】
広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを糸状菌に導入し、２回交差相同組換えが起こった変異株を選抜する方法としては、まず選択マーカーの性質を利用して一次選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより二次選抜する方法を挙げることができる。かかる二次選抜により、目的とする変異株を選抜し、最終的に広範囲の遺伝子領域が確実に目的通りに改変されていることを確認することが重要である。
【００４６】
例えば一次選抜において、選択マーカーとしてピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）を利用した場合、ピリチアミンを含むＣＤ（Czapex-Dox）再生培地で生育してきた株はピリチアミン耐性株であり、ピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒＡがゲノムに導入されていると考えられる。また、選択マーカーとして硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）を利用した場合、ｎｉａＤ欠失ホモ変異株を宿主として用い、硝酸を唯一の窒素源として加えた再生培地で生育してきた株は、硝酸還元酵素をコードする遺伝子ｎｉａＤがゲノムに導入されていると考えられる。なお、アフラトキシン遺伝子クラスターを欠失させた場合など、表現形の変化を利用した選抜手法を併用することもできる。
【００４７】
本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法においては、通常、２回交差相同組換えが選択的に起こるような特別の配列や酵素の導入、あるいは非相同組換え活性の破壊を行わないため、選択マーカーで選抜後の変異株の中で、目的とする２回交差変異株の割合は極めて少ない。また、表現形の変化を利用した選抜も期待できない場合も十分予想される。そこで、本発明では、遺伝子マーカーの性質で選抜された変異株それぞれからＤＮＡを調製し、ＰＣＲやサザーン分析等を用いて直接遺伝子の構造変化を調べる二次選抜を実施する。この場合、目的とする変異株が１％の確率で含まれているとすると、少なくとも１００個の変異株の遺伝子を調べて選抜する。それが２００個以上また５００個であるとしても目的とする変異株を遺伝子構造の変化を調べることで選抜することになる。このため、公知の遺伝子抽出方法を用いることもできるが、生物体から簡便に遺伝子を抽出する技術として本発明者らが開発した「生物体から核酸を溶出する方法」（特開２００３−２４０６７号公報）や、細胞破砕による核酸抽出法（非特許文献１参照）を利用して、多数の生物体から簡便にＤＮＡを溶出・調製した後、さらにＰＣＲやサザーン法等で分析することで二次選抜を行うことが好ましい。なお、上記のように、変異株の表現形の変化があれば有用な情報となるが、広範囲遺伝子領域の改変を確実にモニターするためには遺伝子構造の変化を直接調べることが有効であり、本発明によって、極めて信頼性の高い変異株選抜法を確立することができる。
【００４８】
また、麹カビの場合は多核胞子が多いという問題があるが、その場合にも、一次選抜で得られた変異株から単核胞子を調製し、単核胞子のそれぞれからＤＮＡを抽出し、単核胞子由来の遺伝子構造の変化を直接調べることで、目的とする変異株の核を含む集落の選抜を行うことが好ましい。例えばＰＣＲを用いる場合には、ＰＣＲのプライマー配列として、選択マーカーの内部配列と、染色体上、導入遺伝子の相同配列より外側の配列を選ぶことにより、目的とする変異株の核があれば、ＰＣＲ産物が得られように計画する。いわゆる変異体の核のポジティブセレクションが可能になるように設計することが好ましい。そして、カビの胞子サイズは含まれる核の数によって異なるため、ポジティブセレクションで得られた変異株から胞子を調製し、単核胞子しか通さない小さなポアサイズの膜で胞子液をろ過し、ろ液中の胞子を寒天培地に広げ培養する。このようにして１つの核をもつ胞子から得られた集落（菌糸と胞子）からＤＮＡを調製し、ＰＣＲやサザーン法で遺伝子構造を調べ、目的の変異体を選抜することができる。
【００４９】
以上のように、本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法においては、通常、特殊な遺伝子配列の染色体上への導入も必要なく、また組換え酵素の発現も必要としない上に、特殊な宿主も必要とせず、少なくとも１個の選択マーカー遺伝子があればよく、操作は単純であり、目的の変異株の検出にも複雑な操作を必要としない。さらに、宿主由来の選択マーカー配列と遺伝子領域を利用すればセルフクローニングが可能であり、得られた生物の実用的利用の可能性が高い点が、本発明が奏する極めて有利な効果であるといえる。
【００５０】
上記本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法によって得られた欠失変異株には、ゲノム中で欠失した領域に選択マーカーが通常導入されている。しかし、得られた欠失変異株から選択マーカーを除去することもできる。例えば、選択マーカーが含まれない欠失カセット（欠失した遺伝子領域の５’及び３’側の外側の２つの領域を連結した構造）を構築し、これによって欠失株を形質転換すれば、５’及び３’側の外側の２つの領域で２回交差して、選択マーカーを含まない欠失株を得ることができる。この際、選択マーカーの性質を失った株（例えばピリチアミン感受性になった株）を選抜し、さらに遺伝子構造の変化（選択マーカー領域を含まなくて、ゲノム中の離れた遺伝子領域が連結した構造を持つこと）をＰＣＲで確認することで、選択マーカー除去株を選抜できる。これによって、異種遺伝子を含まず、目的とする遺伝子領域のみが欠失した変異株を得ることができる。かかる目的とする遺伝子領域のみが欠失した変異株も本発明の生産方法の対象に含まれる。
【００５１】
次に、本発明の変異株としては、糸状菌の染色体上で５ｋｂ以上の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域が、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域で置換されて欠失した広範囲遺伝子領域欠失変異株であれば特に制限されないが、糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター領域又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域である広範囲遺伝子領域欠失変異株が好ましく、上記５ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域の欠失が、好ましくは１５ｋｂ以上、より好ましくは３０ｋｂ以上、特に好ましくは５０ｋｂ以上や１００ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域の欠失である変異株を好適に例示することができる。また、選択マーカー遺伝子としては、上述の選択マーカー遺伝子を用いることができる。本発明の変異株は、前記本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法により得ることができる。
【００５２】
本発明はまた、アフラトキシン生産菌の遺伝子クラスターの全部又は一部が除去されたアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカスに関し、かかるアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカスとして、以下の実施例に記載されている変異株、特に、アフラトキシン遺伝子クラスター領域のｎｏｒＢとｈｙｐＡとの２つの遺伝子領域間の６７ｋｂ領域の欠失変異体であるアスペルギルス・パラジチカスＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０（Aspergillus parasiticus AF-/SYS-4(norB-hypA)No.408）を具体的に例示することができる。
【００５３】
また本発明は、アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域の全部又は一部が除去されたアスペルギルス・オリゼーに関し、かかるアスペルギルス・オリゼーの変異株としては、アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域のａｆｌＴとｍｏｘＹとの２つの遺伝子領域間の６０ｋｂ領域の欠失変異体であるアスペルギルス・オリゼーＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１（Aspergillus oryzae AF-/RIB(aflT-moxY)No.80-4）を具体的に例示することができる。
【００５４】
上記本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株や、アスペルギルス・パラジチカス（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０）等のアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカスや、アスペルギルス・オリゼー（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１）等のアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域の全部又は一部が除去されたアスペルギルス属菌は、アフラトキシン生産カビと競合することから、バイオコントロール剤として有利に用いることができる。
【００５５】
本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株のスクリーニングキットとしては、糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットと、前記広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを確認することができるプローブ又は少なくとも１対のプライマーセットとを備えたものであれば特に制限されず、プライマーセットとしては、以下の実施例に具体的に例示されているプライマーセットを有利に用いることができる。
【００５６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６．６ｋｂ領域の欠失（ピリチアミン耐性選択マーカーｐｔｒＡ遺伝子利用）］
（１）ｄｍｔＡ−ｐｔｒＡ−ｖｂｓ コンストラクトを有するｐＡＦ−ＤＤ１ベクターの作製
アフラトキシン遺伝子クラスターの２つの遺伝子ｄｍｔＡとｖｂｓを選び、これらの領域を利用して６．６ｋｂ遺伝子領域の除去ベクターｐＡＦ−ＤＤ１を作製した。すなわち、遺伝子破壊用ＤＮＡ断片の作製には、２ｋｂピリチアミン耐性遺伝子断片、１．６６ｋｂ ｄｍｔＡ遺伝子断片、１．７ｋｂ ｖｂｓ遺伝子断片をＰＣＲで増幅し、ｐＵＣ１９ベクター（プロメガ）に段階的に導入して作製した。ｄｍｔＡ遺伝子領域はA. parasiticus NRRL2999（ＳＹＳ−４株）のゲノムをテンプレートとして、以下の２種のプライマーを用いて増幅した。
＜プライマー＞
配列番号１：ｄｍｔＡ−ＰｓｔＩ−Ｆ：＃３２３：AAAACTGCAGGCTCAGCGACACATCTCC
配列番号２：ｄｍｔＡ−Ｒ：＃３２４：GAGCTTACCACGCCTACC
【００５８】
ｖｂｓ遺伝子領域はＳＹＳ−４株のゲノムをテンプレートとして、以下の２種のプライマーを用いて増幅した。
＜プライマー＞
配列番号３：ｖｂｓｐｒｏ−ＫｐｎＩ−Ｆ：＃２７４：GGGTACCTGTGTAGAAATGCTGCACAG
配列番号４：ｖｂｓ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ３：＃３２１：CGGAATTCGGC ATCGATATCGGCG
【００５９】
また、選択マーカーであるピリチアミン抵抗性遺伝子ｐｔｒＡは２種のプライマーを用い、プラスミドｐＰＴＲＩ（Takara）をテンプレートとしてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ酵素 (Toyobo)を用いた。ｐＡＦ−ＤＤ１の概略図を図１に示す。
＜プライマー＞
配列番号５：ＰＴＲＩ−ＫｐｎＩ−Ｆ：＃３１１： GGGGTACCGGGCAATTGATT ACGGGATCCCA
配列番号６：ＰＴＲＩ−ＰｓｔＩ−Ｒ２：＃３２２： AAAACTGCAGTGACGATGAGCCGCTCTTGC
【００６０】
形質転換するために、得られたｐＡＦ−ＤＤ１をＢｇｌIIで切断して、１．４ｋｂ ｄｍｔＡ領域と１．５ｋｂ ｖｂｓ領域に２ｋｂ ｐｔｒＡが挟まれた直鎖状ＤＮＡ断片を作り、アフラトキシン生産株ＳＹＳ−４株の形質転換に用いた。
【００６１】
（２）形質転換
カビの形質転換には、ポリエチレングリコールを用いたプロトプラストの形質転換法を利用した。
宿主としては、アフラトキシン生産ＳＹＳ−４株を用いた。このカビをＰＤＡ(potato Dextrose Agar）培地で培養し、胞子を採集した。
【００６２】
ピリチアミン選択マーカーを用いる場合には、ＳＹＳ−４株又はＮＲ−１株の胞子約１０８ 個を１００ｍｌＣＤ（Czapex-Dox）液体培地に接種し、２８℃で１８〜２０時間静置培養を行った。こうして発芽させた後、ガラスビーズ（直径０．６ｃｍ）を培養フラスコに加え、３０℃，１３０ｒｐｍの震とう培養でさらに２４時間培養した。菌糸を採集し、０．８Ｍ ＮａＣｌ水溶液で菌糸を２〜３回洗い、洗った菌糸に１０ｍｌの新しく作ったプロトプラスト化溶液（１５ｍｇ／ｍｌ Yatalase（Takara），１０ｍｇ／ｍｌ Cellulase Onozuka R-10 （Yakult Honsha），０．８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ phosphate buffer（ｐＨ６．０），１ｍＭ ＤＴＴ）を加え、３０℃で３〜４時間ゆっくりと震とうし、細胞壁を消化してプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト溶液をミラクロス（カルビオケム社）でろ過し、ろ液を更に４℃，２５００ｇ、５分間、遠心分離して回収した。
【００６３】
プロトプラストを氷冷した溶液１（０．８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））で洗浄した後、２×１０８／ｍｌになるように溶液１に懸濁して、その量に対して０．２容量になるように溶液２ （４０％ＰＥＧ４０００，５０ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））を加え、静かに混合した。
【００６４】
形質転換は、０．１ｍｌのプロトプラスト溶液を新しい１５ｍｌチューブに移し、１５μｌ以下（３〜７μｇ）のｄｍｔＡ−ｐｔｒＡ−ｖｂｓの直鎖ＤＮＡを加え、氷上で３０分間放置した後、０．５ｍｌ溶液２を加えゆっくりと攪拌し、室温で２０分間放置した。５ｍｌ溶液１を加えて、混合した後４℃で２５００ｇの速度で５分間遠心を行った。プロトプラストを含んだ沈殿物を０．１ｍｌの溶液１に懸濁し、０．８Ｍ ＮａＣｌ及び０．１μｇ／ｌ pyrithiamine（ＰＴ）を含むＣＤ再生培地に広げ、さらに、その上に、３０℃まで冷却したＣＤ軟寒天培地を添加した後、固化させ、２８℃で４〜７日培養した。
【００６５】
（３）遺伝子領域欠失株の選抜
目的とする欠失株の選抜には（１）選択マーカーを利用した選抜と（２）ＰＣＲを利用した遺伝子構造の変化の検出、からなる２段階の方法を採用した。
１）まず、ピリチアミン（ＰＴ；pyrithiamine）を含むＣＤ再生培地で生育してきた株はピリチアミンに耐性株であり、つまりピリチアミン耐性遺伝子がゲノムに導入されていると考えられる。
２）しかし、生物に遺伝子を導入した場合、相同組換えと非相同組換えが起こり、生物によっては目的とする相同組換えの確率が極めて低いものがある。カビの場合も低いが、本発明では一箇所ではなく、選択マーカーを挟んで二箇所の配列で相同組換えが起こる必要があるため、その確率はきわめて低くなる。通常はピリチアミン耐性株の中で１〜２％以下の頻度でしか目的とする遺伝子欠失株は得られない。形態変化や生化学的代謝の変化などで指標となる顕著な変化がおこる場合は比較的選抜も容易であるが、このような顕著な変化が起こらない場合は困難である。また、ポジティブ−ネガティブセレクションを利用することも可能であるが、２種以上の選択マーカーが必要である。しかし、ポジティブ−ネガティブセレクションで選抜した場合にもすべてが目的の変異株とはならないため、最終的には遺伝子構造の変化を確認する必要がある。そこで、本発明では、欠失株を選抜する最も単純な方法として、以下のように得られた選択マーカー選抜株について、さらに遺伝子構造の変化をＰＣＲで調べることによって目的とする変異株を選抜した。
【００６６】
＜ＰＣＲ分析のための迅速ＤＮＡ抽出法＞
得られたピリチアミン耐性変異株の中で、選択マーカーを挟んで両側の配列で相同組換えが起きた目的とする変異株を選抜するため、少なくとも１００個以上のピリチアミン耐性株のそれぞれの集落から、胞子を含んだ少量の菌糸を爪楊枝等で採取し、１５０μｌ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒが入った２ｍｌ容量のチューブに入れる。さらに１５０μｌ ＴＥ−飽和フェノールを加え、同チューブにジルコニアビーズ（直径０．５ｍｍ，Ｎｉｋｋａｔｏ）を加えた。各チューブを震とう機（例えば、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ（Ｑ−ＢＩＯ １０１））にセットして、菌糸を破砕した。その後、得られた破砕液を４℃，１５，０００ｇ １５分間遠心し、ＤＮＡを含む水層（上清）を４倍に稀釈して、稀釈液を種々のプライマーを含んだＰＣＲ溶液に加えて反応させた。
【００６７】
ＰＣＲ反応は、通常０．５μｌの希釈ＤＮＡサンプルを、終量８μｌのＰＣＲ反応に用いた。８μｌのＰＣＲ反応液は、０．５μｌ稀釈ＤＮＡ抽出液、４μｌ ２×ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２．５μｌ Nuclease-free water、０．５μｌの２種の各プライマー（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）を含む。
【００６８】
ＰＣＲ反応は以下の条件で行い、ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動した。
［ＰＣＲ産物が２．５ｋｂ以下の場合］
１）９４℃ ５分
２）９４℃ ４０秒、５６℃ ４０秒、７２℃ ｎ分（ｎはターゲットフラグメントのサイズにより決定する）を１サイクルとして、３５サイクル
３）７２℃ １０分
［ＰＣＲ産物が２．５ｋｂ以上の長さの場合］
１）９４℃ ５分
２）９４℃ １分、５６℃ １分、７２℃ ｎ分を１サイクルとして、４０サイクル
３）７２℃ １０分
【００６９】
（４）遺伝子領域欠失の確認
ＰＣＲの結果を指標に目的とする形質転換体を選抜するが、カビ胞子は多核胞子を含んでいるため、選抜した変異株を安定な形質として維持するためには、菌の純化が必要である。そこで、３）までで選抜した変異株を更に単胞子分離と継代培養を３回繰り返して、変異株を純化した。その後、得られた変異株の菌体から、再度核酸を抽出し、以下の種々のプライマーを用いて、目的とした広範囲遺伝子領域破壊株であることを電気泳動にて確認した。結果を図２に示す。また、各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズを表１に示した。予想されるサイズのＰＣＲ産物の生成を電気泳動で確認した結果、ＳＹＳ−４株染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６．６ｋｂ領域の欠失が確認できた。例えば、図２の１の実験で、Ｐ７とＰ１２のプライマーをもちいてＰＣＲを行った場合、表１のＰ７／Ｐ１２から２．１４ｋｂのサイズのＰＣＲ産物が得られるはずであり、電気泳動の図２によると、１のａでは２．１４ｋｂのバンドが出ているが、１のｂ（ＳＹＳ−４株）では、予想したとおりバンドが生じないことがわかった。
【００７０】
＜プライマー＞
１．Ｐ７（配列番号７：＃４７：ｄｍｔＡ−Ｆ２）：GGTCCCTGAGCCAGGGGTATTTGTT
２．Ｐ８（配列番号８：＃２９７：ｖｂｓ−Ｒ１）：CCGCCTCAATCACGGC
３．Ｐ９（配列番号２：＃３２４：ｄｍｔＡ−Ｒ）：GAGCTTACCACGC CTACC
４．Ｐ１０（配列番号４：＃３２１：ｖｂｓ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ３） ： CGGAATTCGGCATCGATATCGGCG
５．Ｐ１１（配列番号６：＃３２２：ＰＴＲＩ−ＰｓｔＩ−Ｒ２）： AAAACTGCAGTGACGATGAGCCGCTCTTGC
６．Ｐ１２（配列番号５：＃３１１：ＰＴＲＩ−ＫｐｎＩ−Ｆ）： GGGGTACCGGGCAATTGATTACGGGATCCCA
７．Ｐ１３（配列番号９：＃３４０：ｏｍｔＡ−Ｒ１）：CCTTCCTCGCCTTTGCG
８．Ｐ１４（配列番号１０：＃３３９：ｏｍｔＡ−Ｆ１）： GGTGAGACGAAGAGCCC
９．Ｐ１５（配列番号１１：＃２６４：ｏｒｄＡ−Ｆ）：ATGATTTATAGCATAATTATTTGTGCG
１０．Ｐ１６（配列番号１２：＃２６５：ｏｒｄＡ−Ｒ）：CAAATCATCTGATTTCTGGCC
【００７１】
【表１】
【実施例２】
【００７２】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域４９ｋｂ領域の欠失（ピリチアミン耐性選択マーカーｐｔｒＡ遺伝子利用）］
（１）ｐｋｓＡ−ｐｔｒＡ−ｖｂｓ構造を有するｐＡＦ−ＤＤ２ベクターの作製
アフラトキシン遺伝子クラスターの両末端に近い遺伝子ｐｋｓＡとｖｂｓを選び、これらの領域を利用して４９ｋｂの広範囲な遺伝子領域の除去ベクターｐＡＦ−ＤＤ２を作製した。ｐＡＦ−ＤＤ２ベクターは、ｐＡＦ−ＤＤ１の１．６６ｋｂ ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩ ｄｍｔＡ配列を１．５ｋｂ ＨｉｎｄIIIＩ／ＰｓｔＩ ｐｋｓＡ ３’領域と入れ換えることにより作出した。ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩ ｐｋｓＡ ３’領域はＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、２種のプライマー（配列番号１７：ｐｋｓ−Ｆ２：＃３４１：GTGGTGCACTGCGTGTC、配列番号１８：ｐｋｓ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒ：＃３４２：CCCCAAGCTTCCATGACCC GGTCGATC）を用いて増幅し、ＨｉｎｄIIIとＰｓｔＩで切断して、ベクターに導入した。得られたベクターの概略図を図３に示す。こうしてできたｐＡＦ−ＤＤ２をＸｍａＩで切断することによって直鎖にして、最終的に得られたｐｋｓＡ−ｐｔｒＡ−ｖｂｓ断片（２ｋｂ選択マーカーｐｔｒＡが１．３ｋｂ ｐｋｓＡ ３’領域と１．６ｋｂ ｖｂｓ断片に挟まれた構造）でアフラトキシン生産菌ＳＹＳ−４株を実施例１と同様にして形質転換した。
【００７３】
欠失変異株の検出は、ピリチアミン耐性株の内、アフラトキシンを産生しなくなった６菌株について、アフラトキシン産生遺伝子が確実に欠失しているか否かをａｄｈＡとｄｍｔＡの各プライマーの組合せを用いて先ずＰＣＲと電気泳動を実施した。ＰＣＲに用いたプライマーは、ａｄｈＡについては配列番号２９、３０を、ｄｍｔＡについては配列番号４５、４６を使用した。また電気泳動の結果を図４に示す。ｄｍｔＡ遺伝子の欠失が確認された１０１株と１０３株のうち１０３株について、さらに多くの遺伝子について欠失を確認した。結果を図５に示す。使用した菌株ＳＹＳ−４株では、ａｆｌＲからｖｅｒ１までの領域が重複し、この短い重複領域では機能しないことが明らかになっているが、ＰＣＲを行った場合には該領域がテンプレートとなってＰＣＲ産物が生じてしまう。しかしながら、その他の領域ではＰＣＲ産物が産生されていないことから、遺伝子クラスターの欠失が確認された。欠失の確認は、表２に示す、前記の各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズと電気泳動の結果を比較して行った。同時にアフラトキシン遺伝子クラスターが欠失した結果としてアフラトキシン生産性が無くなることを、紫外線写真法（図６）、薄層クロマトグラフィー（図７）で確認した。
【００７４】
＜プライマー＞
１．ｎｏｒ１遺伝子領域
配列番号１３：＃４３６（ｎｏｒ１−Ｆ）： CCATA CCGGGATGGACC
配列番号１４：＃４３７（ｎｏｒ１−Ｒ）：GCCCCGATGTAGTCTCC
２．ｆａｓ２（ｈｅｘＡ）遺伝子領域
配列番号１５：＃３５１（ｈｅｘＡ−Ｆ１）：CCTCCCTCGCTACCCCA
配列番号１６：＃３５２（ｈｅｘＡ−Ｒ１）：CTCCGAGCCTACGGTGC
３．ｆａｓ１（ｈｅｘＢ）遺伝子領域：
配列番号１７：＃３５４（ｈｅｘＢ−Ｆ１）：CTGCGGGTGGAGCTGCA
配列番号１８：＃３５３（ｈｅｘＢ−Ｒ１）：CAAGCTCCAAGGGCGGC
４．ａｆｌＲ遺伝子領域
配列番号１９：＃２６２（ａｆｌＲ−Ｆ）：ATGGTTGACCATATCTCCCC
配列番号２０：＃２６３（ａｆｌＲ−Ｒ）：CATTCTCGATGCAGGTAATC
５．ａｆｌＪ遺伝子領域
配列番号２１：＃４３８（ａｆｌＪ−Ｆ）：GAACCCTGGCGAGAGAC
配列番号２２：＃４３９（ａｆｌＪ−Ｒ）：CTGAGCGACTCGCATGG
６．ａｄｈＡ遺伝子領域
配列番号２３：＃１７５（ａｄｈＡ−Ｆ）：ATGGAAGTTCTGGAACAACC
配列番号２４：＃１７６（ａｄｈＡ−Ｒ）：TTAGGTTTTAAGGCAATGGCA
７．ｅｓｔＡ遺伝子領域
配列番号２５：＃４４０（ｅｓｔＡ−Ｆ）：CCTTTTGCCGGTCCGTG
配列番号２６：＃４４１（ｅｓｔＡ−Ｒ）：GCCTTAGCTACTCCCCC
８．ｎｏｒＡ遺伝子領域
配列番号２７：＃２５４（ｎｏｒＡ−Ｆ）：ATGGTTCTCCCTACTGCTCC
配列番号２８：＃２５５（ｎｏｒＡ−Ｒ）：TCATTTTGAGGCAGAACCAAAG
９．ｖｅｒ１遺伝子領域
配列番号２９：＃２０６（ｖｅｒ１−Ｆ）：ATGTCGGATAATCACCGTTTAG
配列番号３０：＃２０７（ｖｅｒ１−Ｒ）：TTATCGAAAAGCGCCACCAT
１０．ｖｅｒＡ遺伝子領域
配列番号３１：＃４４２（ｖｅｒＡ−Ｆ）：GTTTCGACTCCCTCGGC
配列番号３２：＃４４３（ｖｅｒＡ−Ｒ）：CTCATCGTACGCTGGCG
１１．ａｖｎＡ遺伝子領域
配列番号３３：＃４４４（ａｖｎＡ−Ｆ）：CATAGTCCCTGAGGCGG
配列番号３４：＃４４５（ａｖｎＡ−Ｒ）：GGTCCGATGCTGAACGG
１２．ｖｅｒＢ遺伝子領域
配列番号３５：＃４４６（ｖｅｒＢ−Ｆ）：GGTCCACTGCTATGGCG
配列番号３６：＃４４７（ｖｅｒＢ−Ｒ）：GCGTAGGCCAGATTGCG
１３．ａｖｆＡ遺伝子領域
配列番号３７：＃４４８（ａｖｆＡ−Ｆ）：GGTCACATACGCCCTCC
配列番号３８：＃４４９（ａｖｆＡ−Ｒ）：GAGGACATCAGACACGCC
１４．ｄｍｔＡ（ｏｍｔＢ）遺伝子領域
配列番号３９：＃３２３（ｄｍｔＡ−Ｆ）：GCTCAGCGACACATCTCC
配列番号２：＃３２４（ｄｍｔＡ−Ｒ）：GAGCTTACCACGCCTACC
１５．ｏｍｔＡ遺伝子領域
配列番号１０：＃３３９（ｏｍｔＡ−Ｆ１）：GGTGAGACGAAGAGCCC
配列番号９：＃３４０（ｏｍｔＡ−Ｒ１）：CCTTCCTCGCCTTTGCG
１６．ｏｒｄＡ遺伝子領域
配列番号１１：＃２６４（ｏｒｄＡ−Ｆ）：ATGA TTTATAGCATAATTATTTGTGCG
配列番号１２：＃２６５（ｏｒｄＡ−Ｒ）：CAAATCATCTGATTTCTGGCC
【００７５】
【表２】
【実施例３】
【００７６】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域４９ｋｂ領域の欠失］
（１）A. parasiticus ＮＲ−１株のｖｂｓ遺伝子破壊株の作製
John E. Linz博士 Michigan State Universityより供与されたA. parasiticus ＮＲ−１株のｖｂｓ遺伝子に、ｐｔｒＡ遺伝子を挿入することにより遺伝子破壊を行った。
アフラトキシン遺伝子クラスターのｖｂｓ領域に導入し、ｖｂｓ遺伝子破壊株を作製するためｐＶＢＳ−ＳＤ２を構築した。ｐＶＢＳ−ＳＤ２ベクターは、１．７ｋｂのｖｂｓ遺伝子領域断片を、ＫｐｎＩサイトを有する２種のプライマー（配列番号３：＃２７４：ｖｂｓｐｒｏ−ＫｐｎＩ−Ｆ：ＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧ、配列番号５８：＃２６８：ｖｂｓｉｎ−ＫｐｎＩ−Ｒ：ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＧＣＧ）とＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲをして増幅し、ＰＣＲ産物をＫｐｎＩで処理した後、ピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒAを持つｐＰＴＲＩベクターのＫｐｎＩサイトに導入して構築した。得られたベクターの概略図を図８に示す。こうして構築したｐＶＢＳ−ＳＤ２をＢｇｌIIで切断して直鎖にして、シングルクロスでＮＲ−１株を実施例１と同様にして形質転換した。
この結果により得られるｖｂｓ遺伝子破壊株では、ｐｔｒＡを挟んで２つのｖｂｓ類似領域が本来のｖｂｓ遺伝子よりも短いために、ｖｂｓの有する活性を失っている。そのため、ｖｂｓにより触媒される反応が正常に行われず、黄色い反応中間体が蓄積する。
その後、得られた変異株の菌体から、再度核酸を抽出し、以下の種々のプライマーを用いて、目的とした広範囲遺伝子領域破壊株であることを電気泳動にて確認した。結果を図９に示す。また、各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズを表３に示した。予想されるサイズのＰＣＲ産物の生成を電気泳動で確認した結果、ＮＲ−１株染色体のｖｂｓ遺伝子領域の破壊が確認できた。
【００７７】
＜プライマー＞
配列番号１１１：P1 (#194, vbs-dis-F)：CTGCCCAAAGGTGCTCTCC
配列番号１１２：P2 (#287, vbs-3’in-R)：GCGACACCGGCGGAAGG
配列番号１１３：P3 (#273, pPTRI-R1)：TTCCCAGTCACGACGTTG
配列番号１１４：P4 (#272, pPTRI-F1)：GTGTGGAATTGTGAGCGG
配列番号３：P5(#274,vbspro-KpnI-F)：GGGTACCTGTGTAGAAATGCTGCACAG
配列番号５８：P6 (#268, vbsin-KpnI-R)：GGGGTACCGGCATCGATATCGGCG
【００７８】
【表３】
【００７９】
（２）ｐｋｓＡ−ｎｉａＤ−ｖｂｓ構造を有するｐＡＦ−ＤＤ３ベクターの作製
ｐＡＦ−ＤＤ２ベクターと同様の構造で選択マーカーだけを硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤに代えた構造ｐＡＦ−ＤＤ３を作り、本発明が種々の選択マーカーを用いても有効であることを確認した。
ｎｉａＤ選択マーカーを用いた形質転換には、硝酸還元酵素に変異を持ち、硝酸を窒素源として利用できないA. parasiticus ＮＲ−１株、及び、前記ＮＲ−１株のｖｂｓ遺伝子破壊株を宿主として用いた。
プロトプラストの調製にはＰＤＢ（ポテトデキストロースブロス）培地を用い、形質転換後、硝酸を唯一の窒素源として加えた再生培地を用いた。
ｐＡＦ−ＤＤ３の構築には、まず、１．７ｋｂ ｖｂｓ領域を２種のプライマー（配列番号４０：ｖｂｓ−ＢａｍＨＩ−Ｆ：＃３５５：CGCGGATCCTGTGTA GAAATGCTGCACAG、配列番号４１：ｖｂｓ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ４：＃３５６: CGGAATTCGACCCTTACGCTGCTC）と、アフラトキシン生産菌ＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅した。そのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ処理して、ｐＳＰ７２ベクター（Promega）の対応する部位に導入した。次に、形成したベクターに４．７ｋｂ ＳｐｈＩ／ＸｂａＩ選択マーカーｎｉａＤを導入した。選択マーカーｎｉａＤはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ酵素と２種のプライマー（配列番号４２：ｎｉａＤ−ＡｖｒＩＩ−Ｆ（ＸｂａＩサイトを内部に含む）：＃１５４：ACCCCCTAGGTCTAGAAGAGGCATTGTGTC、配列番号４３：ｎｉａＤ−ＳｐｈＩ−Ｒ：＃３２０：CCCACATGCATGCCCTATTAACGTTACTATTCGTG）と、プラスミドｐＳＬ８２をテンプレートとしてＰＣＲし増幅した。最後に、２ｋｂ ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ ｐｋｓＡ ５’領域を導入した。このｐｋｓＡ ５’領域は２種のプライマー（配列番号４４：ｐｋｓ−ＳｐｈＩ−Ｆ：＃３４３：CCCACATGCATGCATCCGTCCAGGACAGCC、配列番号４５：ｐｋｓ−ＸｈｏＩ−Ｒ：＃３４４：CCCCCGCTCGAGACGCCAAGGATGGGGTC）を用い、ＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使った。得られたベクターの概略図を図１０及び１１に示す。このようにしてできたｐＡＦ−ＤＤ３をＸｍａＩで切断し、直鎖のｐｋｓＡ−ｎｉａＤ−ｖｂｓコンストラクトを作った。このコンストラクトは１．６ｋｂ ｐｋｓＡ ５’領域と１．６ｋｂ ｖｂｓ領域に挟まれた４．７ｋｂ ｎｉａＤ選択マーカー遺伝子領域を含んでいる。この断片を、ピリチアミン耐性遺伝子を利用してｖｂｓ遺伝子が既に破壊されているｎｉａＤ欠損株A. parasiticus ＮＲ−1株（図１０）、及びｖｂｓには変異が入っていないｎｉａＤ欠損株ＮＲ−１株（John E. Linz博士 Michigan State Universityより供与された。）（図１１）に形質転換した。
【００８０】
ｖｂｓ遺伝子が既に破壊されているｎｉａＤ欠損株A. parasiticus ＮＲ−1株の形質転換体について、ｏｍｔＡ、ｆａｓ1の各遺伝子領域を対象に、実施例２で使用したプライマーを用いて同様に遺伝子欠失の確認を行った（図１２）。２３、３５、７６、１２４の各菌株が遺伝子欠失変異体であることが確認され、これらの菌株について、さらに多くの遺伝子の欠失を確認した（図１３）。実施例２と同様に、ａｆｌＲからｖｅｒ１までの領域が重複し、ＰＣＲを行った場合には該領域がテンプレートとなってＰＣＲ産物が生じてしまうが、その他の領域ではＰＣＲ産物が産生されていないことから、遺伝子クラスターの欠失が確認された。
また、ｖｂｓには変異が入っていないｎｉａＤ欠損株ＮＲ−１株の形質転換体についても同様にＰＣＲを行った結果、遺伝子クラスターの欠失が確認された。
【実施例４】
【００８１】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６７ｋｂ領域の欠失（ピリチアミン耐性選択マーカーｐｔｒＡ遺伝子利用）］
（１）ｎｏｒＢ−ｐｔｒＡ−ｈｙｐＡ の置換コンストラクトを有するｐＡＦ−ＷＤ４
アフラトキシン遺伝子クラスターの両末端に近い遺伝子ｎｏｒＢとｈｙｐＡを選び、これらの領域を利用して広範囲な遺伝子領域の除去ベクターｐＡＦ−ＤＤ４を同様な方法を用いて作製し、同様なプライマーを用いて遺伝子クラスターの欠失を確認した。
ｐＡＦ−ＷＤ４ベクターの作製では、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ３’−ｎｏｒＢ領域はＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、２種のプライマー（配列番号４６：ｎｏｒＢ−Ｌ−ＸｈｏＩ−Ｒ：＃４９８： CCCCCGCTCGAGTGGTATTGAAACAGAGCGTG、配列番号４７：ｎｏｒＢ−Ｆ１：＃５２５： ATGTCCACCTCAGCTCCC）を用いて増幅し、ｐｔｒＡ遺伝子が導入されたｐＳＰ７２ベクターに導入した。５’ｈｙｐＡ領域は、２種のプライマー（配列番号４８：ｈｙｐＡ−Ｒ−ＫｐｎＩ−Ｆ：＃４９６：CGGGGTACCCGTATCTCAGTTATGCAATGTCTC、配列番号４９：ｈｙｐＡ−Ｒ−Ｒ：＃４９７：AAGTCCAATGCCGTCAAC）を用いて増幅し、更にベクターに導入した。得られたベクターの概略図を図１４に示す。こうして得られたベクターをＸｃｍＩで切断し、３’ｎｏｒＢ−ｐｔｒＡ−５’ｈｙｐＡ断片をアフラトキシン生産菌ＳＹＳ−４株に上述したように形質転換した。ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。
【００８２】
＜プライマー＞
１．ｎｏｒＢ遺伝子領域
配列番号４７：＃５２５（ｎｏｒＢ−Ｆ１）：ATGTCCACCTCAGCTCCC
配列番号５０：＃５２６（ｎｏｒＢ−Ｒ１）：CATGGTTGAGGACGAATCG
２．ｃｙｐＡ遺伝子領域
配列番号５１：＃５００（ｎｏｒＢ−Ｒ−ＫｐｎＩ−Ｆ）：CGGGGTACCTGTGGATTCGTGAGTGTC
配列番号５２：＃５２８（ｃｙｐＡ−Ｒ）：AATCCGCCAACCCAGTC
３．ａｆｌＴ遺伝子領域
配列番号５３：＃６１０（ａｆｌＴ−Ｆ）：ATGCTAATCGACGAGGCTG
４．ｐｋｓＡ遺伝子領域
配列番号４５：＃３４４（ｐｋｓ−ＸｈｏＩ−Ｒ）：CCCCCGCTCGAGACGCCAAGGATGGGGTC
配列番号５４：＃３６０（ｐｋｓ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ）：CGGAATTCCTCAGACAAGGCGTCCG
５．ｎｏｒ１遺伝子領域
配列番号１３：＃４３６（ｎｏｒ１−Ｆ）： CCATA CCGGGATGGACC
配列番号１４：＃４３７（ｎｏｒ１−Ｒ）：GCCCCGATGTAGTCTCC
６．ｆａｓ２遺伝子領域
配列番号１５：＃３５１（ｈｅｘＡ−Ｆ１）：CCTCCCTCGCTACCCCA
配列番号１６：＃３５２（ｈｅｘＡ−Ｒ１）：CTCCGAGCCTACGGTGC
７．ｆａｓ１遺伝子領域
配列番号１７：＃３５４（ｈｅｘＢ−Ｆ１）：CTGCGGGTGGAGCTGCA
配列番号１８：＃３５３（ｈｅｘＢ−Ｒ１）：CAAGCTCCAAGGGCGGC
８．ａｆｌＲ／ａｆｌＲ２遺伝子領域
配列番号１９：＃２６２（ａｆｌＲ−Ｆ）：ATGGTTGACCATATCTCCCC
配列番号２０：＃２６３（ａｆｌＲ−Ｒ）：CATTCTCGATGCAGGTAATC
９．ａｆｌＪ／ａｆｌＪ２遺伝子領域
配列番号２１：＃４３８（ａｆｌＪ−Ｆ）：GAACCCTGGCGAGAGAC
配列番号２２：＃４３９（ａｆｌＪ−Ｒ）：CTGAGCGACTCGCATGG
１０．ａｄｈＡ／ａｄｈＡ２遺伝子領域
配列番号２３：＃１７５（ａｄｈＡ−Ｆ）：ATGGAAGTTCTGGAACAACC
配列番号２４：＃１７６（ａｄｈＡ−Ｒ）：TTAGGTTTTAAGGCAATGGCA
１１．ｅｓｔＡ／ｅｓｔＡ２遺伝子領域
配列番号２５：＃４４０（ｅｓｔＡ−Ｆ）：CCTTTTGCCGGTCCGTG
配列番号２６：＃４４１（ｅｓｔＡ−Ｒ）：GCCTTAGCTACTCCCCC
１２．ｎｏｒＡ／ｎｏｒＡ２遺伝子領域
配列番号２７：＃２５４（ｎｏｒＡ−Ｆ）：ATGGTTCTCCCTACTGCTCC
配列番号２８：＃２５５（ｎｏｒＡ−Ｒ）：TCATTTTGAGGCAGAACCAAAG
１３．ｖｅｒ−１／ｖｅｒ−１Ｂ遺伝子領域
配列番号２９：＃２０６（ｖｅｒ１−Ｆ）：ATGTCGGATAATCACCGTTTAG
配列番号３０：＃２０７（ｖｅｒ１−Ｒ）：TTATCGAAAAGCGCCACCAT
１４．ｖｅｒＡ遺伝子領域
配列番号３１：＃４４２（ｖｅｒＡ−Ｆ）：GTTTCGACTCCCTCGGC
配列番号３２：＃４４３（ｖｅｒＡ−Ｒ）：CTCATCGTACGCTGGCG
１５．ａｖｎＡ遺伝子領域
配列番号３３：＃４４４（ａｖｎＡ−Ｆ）：CATAGTCCCTGAGGCGG
配列番号３４：＃４４５（ａｖｎＡ−Ｒ）：GGTCCGATGCTGAACGG
１６．ｖｅｒＢ遺伝子領域
配列番号３５：＃４４６（ｖｅｒＢ−Ｆ）：GGTCCACTGCTATGGCG
配列番号３６：＃４４７（ｖｅｒＢ−Ｒ）：GCGTAGGCCAGATTGCG
１７．ａｖｆＡ遺伝子領域
配列番号３７：＃４４８（ａｖｆＡ−Ｆ）：GGTCACATACGCCCTCC
配列番号３８：＃４４９（ａｖｆＡ−Ｒ）：GAGGACATCAGACACGCC
１８．ｄｍｔＡ／ｄｍｔＡ２遺伝子領域
配列番号５５：＃１５３（ａｖｆＡ−Ｒ−ＮｏｔＩ）： AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGGTCCTTTTAGGTACAGC
配列番号５６：＃４７９（ａｖｆＡ−ｌｅｆｔ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ）：CCCAAGCTTGCCCTAGCTATGGTTGAG
１９．ｖｂｓ遺伝子領域
配列番号５７：＃２６７（ＶＢＳｉｎ−ＫｐｎＩ−Ｆ）：GGGGTACCGGATGGCCTGGGCAGT
配列番号５８：＃２６８（ＶＢＳｉｎ−ＫｐｎＩ−Ｒ）：GGGGTACCGGCATCGATATCGGCG
２０．ｃｙｐＸ遺伝子領域
配列番号５９：＃４３４（ｃｙｐＸ−Ｆ１）：CGCAAGATTCCTGGTCCC
配列番号６０：＃４３５（ｃｙｐＸ−Ｒ１）：CCAGCTAGGAGCAACGC
２１．ｍｏｘＹ遺伝子領域
配列番号６１：＃４３２（ｍｏｘＹ−Ｆ１）：GAAGACCGCGGAGAATGG
配列番号６２：＃４３３（ｍｏｘＹ−Ｒ１）：GGCCCAATGACACTGCC
２２．ｏｒｄＢ遺伝子領域
配列番号６３：＃４９４（ｈｙｐＡ−Ｌ−ＳａｌＩ−Ｒ）：AACGCGTCGACGGTTCTGCTTGGCTGGG
配列番号６４：＃４５５（ｍｏｘＹ−Ｒ−Ｒ）：CGCTGGAGGATGTCTCG
２３．ｈｙｐＡ遺伝子領域
配列番号５１：＃５００（ｎｏｒＢ−Ｒ−ＫｐｎＩ−Ｆ）：CGGGGTACCTGTGGATTCGTGAGTGTC
配列番号５２：＃５２８（ｃｙｐＡ−Ｒ）：AATCCGCCAACCCAGTC
２４．Ｐ１／Ｐ２遺伝子領域
配列番号６５：＃５２７（ｎｏｒＢ−Ｒ２）：CAATATTTCATCTGCTGTTTCC
配列番号６６：＃４７０（ＰＴＲＩ−Ｆ）：GCAAGAGCGGCTCATCGTCA
２５．Ｐ３／Ｐ４遺伝子領域
配列番号６７：＃４６９（ＰＴＲＩ−Ｒ）：TGGGATCCCGTAATCAATTGCCC
配列番号６８：＃５３０（ｎａｄＡ−Ｒ）：GACTGATAAGGGAGCCGC
【００８３】
遺伝子欠失の確認は、表４に示した前記の各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズと電気泳動の結果を比較して行った。表４に示した各遺伝子を対象にＰＣＲを行った結果、４０８株が、アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６７ｋｂ領域の欠失変異体であることが確認された。この４０８株は、“Aspergillus parasiticus AF-/SYS-4(norB-hypA)No.408” の表示で、平成１８（２００６）年７月２６日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受領されている。受領番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０である。
【００８４】
【表４】
【実施例５】
【００８５】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６７ｋｂ領域の欠失（ｎｉａＤ遺伝子利用）］
上記と同様な手法で３’ｎｏｒＢ−ｎｉａＤ−５’ｈｙｐＡ断片を構築し、ｎｉａＤ欠損株ＮＲ−１株に形質転換した。上記と同様にＰＣＲを行った結果、遺伝子クラスターの欠失を確認することができた。
【実施例６】
【００８６】
［アフラトキシン生産菌のアフラトキシン遺伝子クラスター欠失株のバイオコントロール剤としての機能の確認］
アフラトキシン生産菌のアフラトキシン遺伝子クラスター欠失株は、アフラトキシン生産菌のバイオコントロール剤として利用できる。実際に、アフラトキシン生産について競合することを、チップ培養法（１ｍｌのピペットマンチップの先端をシールし培養器として用いた。中に０．２５ ｍｌのＹＥＳ（２％酵母エキス、２０％蔗糖）液体培地を入れ、種々の割合で胞子を接種した。
平均３５５０コ（左側）又は３５．５コ（右側）のアフラトキシン生産株ＳＹＳ−４株の胞子と、平均１２０００コ、１２００コ、１２０コ、１２コ、１．２コ及び０コの、実施例２で得られた１０３番株の胞子を同時にチップ中の０．２５ｍｌ培地に接種し、２８℃ 、４日培養した後、培養液１０マイクロリットルをシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０，ｎｏ．５７２１；Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）にスポットし、展開溶液（クロロホルム：酢酸エチル：９０％ギ酸（６：３：１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ））を用いて展開した。アフラトキシンは紫外線（３６５ｎｍ）を照射して観察した。結果を図１５（Ａ）に示す。
ＡＦ１０３株を接種後、１日たってからＳＹＳ−４株の胞子を同様に接種し、それから４日後、培養液を同様に分析した。結果を図１５（Ｂ）に示す。その結果、ＡＦ１０３株がアフラトキシン生産に関してアフラトキシン生産カビと競合することが確認された。
【実施例７】
【００８７】
［麹カビ基準菌株ＲＩＢ４０のアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域６０ｋｂ領域の欠失］
（１）麹カビ（Aspergillus oryzae）の遺伝子についてａｆｌＴ−ｐｔｒＡ−ｍｏｘＹコンストラクトを有するｐＡＦ−ＤＤベクターの作製
１）ベクターの作製と形質転換
ｐＡＦ−ＤＤベクターは、２ｋｂ ＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ ピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒＡと１．５ｋｂ ＢｇｌII／ＫｐｎＩ ａｆｌＴホモログ遺伝子断片、１．６ｋｂ ＨｉｎｄIII／ＸｈｏＩ ｍｏｘＹホモログ遺伝子断片をｐＳＰ７２（Promega）に段階的に導入することによって作製した。麹カビのａｆｌＴホモログ領域とｍｏｘＹホモログ領域はA. oryzaeＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のように、適当な制限酵素部位を導入したプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅した。得られたベクターの概略図を図１６に示す。
【００８８】
＜プライマー＞
１．ａｆｌＴ断片のプライマー
配列番号６９：ｏｒｙｚａｅＬ−ＢｇｌＩＩ−Ｆ：＃３６８：GAAGATCTGGCGTGCTCCTCATCAC
配列番号７０：ｏｒｙｚａｅＬ−ＫｐｎＩ−Ｒ：＃３６９：GGGGTACCGTC GGGGATCGTTTCGG
２．ｍｏｘＹ断片のプライマー
配列番号７１：ｏｒｙｚａｅＲ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ：＃３７０：CCCCAAGCTTCCTGGGGTCAAGACGTC
配列番号７２：ｏｒｙｚａｅＲ−ｘｈｏＩ−Ｒ：＃３７１： CCCCCGCTCGAGCTCTACTCCGTCACCGC
３．選択マーカー（ｐｔｒＡ）断片のプライマー
配列番号５：ＰＴＲＩ−ＫｐｎＩ−Ｆ：＃３１１：GGGGTACCGGGCAATTGATTACGGGATCCCA)
配列番号６：ＰＴＲＩ−ＰｓｔＩ−Ｒ２：＃３２２：AAAACTGCAGTGACGATGAGCCGCTCTTGC
【００８９】
この場合ｐＰＴＲＩ（Takara）をテンプレートとして用いた。その後、ｐＡＦ−ＤＤをＢｓｐＨＩとＸｍａＩで処理して、１．５ｋｂ ａｆｌＴと１．５ｋｂ ｍｏｘＹ領域を２ｋｂのｐｔｒA領域を挟むように導入し、その後、カセット構造領域を直鎖ＤＮＡ断片（図１７）にして、麹カビＲＩＢ４０株を形質転換した。
【００９０】
２）麹カビにおいて変異体の選抜と特記すべき留意点
ピリチアミン耐性株を選抜した後、多数の株からＤＮＡを抽出し、ｖｂｓプライマー（配列番号７３：＃３９２（ｏｒｙｚａｅ−ｖｂｓ−Ｆ１）： CGCGGTCAGCTGCTTC、配列番号７４：＃３９３（ｏｒｙｚａｅ−ｖｂｓ−Ｒ）：GACTGTGGCTCTCGACC）を用いてＰＣＲを行い、ＲＩＢ４０野生株のＤＮＡを用いたときと比較してＰＣＲ産物のバンドの強度が顕著に減少又は欠失している株は目的の欠失株であることが予想された。しかし、麹カビの胞子は核を複数含む多核胞子が多いため、スクリーニングとしてさらに、プライマーＰ２（配列番号７５：＃１８１（ｐｔｒＡ−Ｆ１）：CCACTGTGGCCGCTACC) とプライマーＰ５（配列番号７６：＃４５８（ｏｒｙｚａｅＲ−Ｒ１）：AGTTGGGCATCTCGGGC)を用いてＰＣＲを行った。プライマーＰ２は選択マーカー遺伝子ｐｔｒＡの内部配列を有し、プライマーＰ５はカビの染色体上ｍｏｘＹホモログ領域の外側にあるため、野生株ではこれらのプライマーを用いてもバンドが出ない。それに対して、目的とする欠失株では、３ｋｂのＰＣＲ産物が得られるはずであるため、それを指標として欠失株を選抜した。
【００９１】
さらに、麹カビの胞子は多核の割合が多いため、単胞子分離によっては形質の純化が容易ではなかった。そこで、麹カビの場合は、継代を繰り返すだけでなく、単胞子分離の際に一つの核だけを有する単核胞子を選抜し、単核胞子の継代を繰り返した。胞子の大きさは含む核の数が多いほど大きいため、他の研究者によって報告されたような以下の方法を用いて小さな単核胞子を選抜した。胞子全体の直径は４〜９μｍであり、平均は約７μｍであるのに対し、単核胞子は通常４− ７μｍの直径を有し、最も多いのが約５μｍ直径である。そこで、胞子液を５μｍサイズの穴を有した限外ろ過膜でろ過して、膜を通過して回収される小さな胞子を選抜した。つまり、ＰＣＲによって目的とする変異を有すると予想される形質転換体の集落から胞子を採集し、ろ過後、胞子液を含むろ液をＧＹ寒天培地に広げ、単一胞子由来の集落についてＰＣＲを行って目的とする欠失変異株であることを確認し、さらに同様の純化を繰り返した。この純化を少なくとも３回繰り返して、すべての集落が目的とする変異体を生じることを確認して変異株を確立した。
【００９２】
３）ＰＣＲ分析によるアフラトキシン遺伝子クラスター領域の欠失の確認
得られた変異株のゲノム上アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域がすべて欠失していることは、変異株のＤＮＡと野生株ＲＩＢ４０のＤＮＡをそれぞれ調製して、以下の種々のプライマーを用いてＰＣＲにより確認した。その結果得られた欠失変異体＃８０−４株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１）について、さらに詳細な遺伝子欠失を確認した。電気泳動の結果を図１８に示す。欠失の確認は、表５に示す、前記の各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズと電気泳動の結果を比較して行った。その結果、＃８０−４株が、アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域６０ｋｂ領域の欠失変異体であることが確認された。この＃８０−４株は、“Aspergillus oryzae AF-/RIB(aflT-moxY)No.80-4” の表示で、平成１８（２００６）年７月２６日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受領されている。受領番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１である。
【００９３】
＜プライマー＞
１．ｐｋｓＡ遺伝子
配列番号７７：＃３７３（ｏｒｙｚａｅ−ｐｋｓＡ−Ｆ）： GGGGTACCCCGGACCCAGCTATACC
配列番号７８：＃３７２（ｏｒｙｚａｅ−ｐｋｓＡ−Ｒ）： GAAGATCTC CAGCATGGCATGCGTC
２．ｎｏｒ１遺伝子
配列番号７９：＃４５９（ｏｒｙｚａｅ−ｎｏｒ１−Ｆ）： GCACGGTCAAGAGAGGC
配列番号８０：＃４６０（ｏｒｙｚａｅ−ｎｏｒ１−Ｒ）： GGATAACGAAGTGCCCCG
３．ｆａｓ２ 遺伝子
配列番号８１：＃３９６（ｏｒｙｚａｅ−ｆａｓ２−Ｆ）： CGAAGTCATGGGCTCGG
配列番号８２：＃３９７（ｏｒｙｚａｅ−ｆａｓ２−Ｒ）： GGCGCACTTCAGAGTCG
４．ｆａｓ１遺伝子
配列番号８３：＃４２６（ｏｒｙｚａｅ−ｆａｓ１−Ｆ）： CATTCCCTGTCCGCTGG
配列番号８４：＃４２７（ｏｒｙｚａｅ−ｆａｓ１−Ｒ）： GGAACTACCCGCAGCTC
５．ａｆｌＲ遺伝子
配列番号８５：＃４６１（ｏｒｙｚａｅ−ａｆｌＲ−Ｆ）： CAGGTCGGAACAGGGAC
配列番号８６：＃４６２（ｏｒｙｚａｅ−ａｆｌＲ−Ｒ）： CACCTTCTTGCAGGCGC
６．ｖｅｒ１遺伝子
配列番号８７：＃４６３（ｏｒｙｚａｅ−ｖｅｒ１−Ｆ）： GCATGTCCGACAACCACC
配列番号８８：＃４６４（ｏｒｙｚａｅ−ｖｅｒ１−Ｒ）： CTGCGTCAGATGCCAGG
７．ａｖｆＡ遺伝子
配列番号８９：＃４２８（ｏｒｙｚａｅ−ａｖｆＡ−Ｆ）： CCTTCGGTGTGCGTTCC
配列番号９０：＃４２９（ｏｒｙｚａｅ−ａｖｆＡ−Ｒ）： GCAGTAGGACTCCCCAG
８．ｏｍｔＡ遺伝子
配列番号９１：＃４３０（ｏｒｙｚａｅ−ｏｍｔＡ−Ｆ）： GCGACTTCCCAGCTCTC
配列番号９２：＃４３１（ｏｒｙｚａｅ−ｏｍｔＡ−Ｒ）： CCACTCCTTGGGAGACC
９．ｏｒｄＡ遺伝子
配列番号９３：＃４２４（ｏｒｙｚａｅ−ｏｒｄＡ−Ｆ）： GGACGACCTTCGCTTCC
配列番号９４：＃４２５（ｏｒｙｚａｅ−ｏｒｄＡ−Ｒ）： CCATGGGGTCGTGGTAG
１０．ｖｂｓ遺伝子
配列番号７３：＃３９２（ｏｒｙｚａｅ−ｖｂｓ−Ｆ１）： CGCGGTCAGCTGCTTC
配列番号７４：＃３９３（ｏｒｙｚａｅ−ｖｂｓ−Ｒ）： GACTGTGGCTCTCGACC
１１．ｃｙｐＸ遺伝子
配列番号９５：＃４６７（ｏｒｙｚａｅ−ｃｙｐＸ−Ｆ）： CATGACCATGCTCTCCGG
配列番号９６：＃４６８（ｏｒｙｚａｅ−ｃｙｐＸ−Ｒ）： GGTATGCACGCCTGACG
配列番号６７（Ｐ１）：＃４６９：ｐｔｒＡ−Ｒ： TGGGATCCCGTAATCAATTGCCC.
配列番号６６（Ｐ３）：＃４７０：ｐｔｒＡ−Ｆ： GCAAGAGCGGCTCATCGTCA
配列番号９７（Ｐ４）：＃４６５：ｏｒｙｚａｅＬ−Ｆ１： GTGACCTGGCGATGGTG
配列番号７６（Ｐ５）：＃４５８：ｏｒｙｚａｅＲ−Ｒ１： AGTTGGGCATCTCGGGC
【００９４】
【表５】
【実施例８】
【００９５】
麹カビ（Aspergillus oryzae）は発酵食品産業上重要な生物である。本発明によってアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域を欠失しても産業上重要な酵素活性に影響せず、実用上問題ないことについて検討を行った。
【００９６】
［酵素活性に対する影響］
１．材料
３種類の原料を用い、以下のように培養後、それぞれの麹について酵素活性を測定した。
１）α化米の作製
９０％精白米（国産米）を十分に吸水させた後、定法に従い水切り・蒸しを行った。蒸気を軽く抜いた後、９０℃の通風乾燥機で１８時間乾燥し、α化米とした。乾燥途中に数回手入れを行って固まりをほぐし、乾燥終了後には５ミリ程度のアミで固まりを取り除いた。
２）α化麦の作製
約６５％精麦の国産大麦を１時間浸せき後、２時間水切りを行った。その後の処理はα化米と同様に実施した。
３）α化米・α化麦麹
滅菌した３００ｍｌ容三角フラスコ（メリクロン）にα化米・α化麦２０ｇを分注し９０℃２時間殺菌した。冷却後、原料１ｇあたり１×１０６個の分生子を接種し、殺菌水１０ｍｌを添加、よく攪拌した。十分に吸水したのを確認した後、再度攪拌して、培養を開始した。
培養は４２時間、恒温機を用いて３０℃で行った。培養中１８時間目、３２時間目に攪拌を行い、水分及び品温の均一化を図った。
４）醤油麹
脱脂大豆に重量に対して１３０％の水を加え、十分に攪拌した。これを３００ｍｌ容三角フラスコ（メリクロン）に１０ｇ分注し、割砕小麦６ｇを加え１ｋｇ／ｃｍ２ ２０分で蒸煮を行った。冷却後、分生子を原料重量あたり１×１０６個接種し、恒温恒湿機（タバイエスペック株式会社、ＰＲ−４ＳＰ）を用いて、製麹を行った。培養条件は、２４時間まで２８℃、以後２５℃で管理し、培養４２時間目に出麹とした。途中、２４時間目、３２時間目に麹を撹拌し、水分及び品温の均一化を図った。
【００９７】
２．分析法
（１）粗酵素液の抽出
培養した麹１０ｇに０．５％ＮａＣｌ水溶液５０ｍｌを加え、室温で３時間酵素（時々攪拌）を抽出した。次いで、東洋ろ紙Ｎｏ．５Ｃにてろ過を行い、得られた上澄液を定法に従い透析して粗酵素液とした。これを適宜希釈して酵素活性を測定した。
（２）酵素活性の測定
１）プロテア−ゼ
国税庁所定分析法注解（第４回改定国税庁所定分析法注解 注解編集委員会編（日本醸造協会，東京），ｐ．２２３（１９９３）．）に準じて，Ｈａｍｍａｒｓｔｅｉｎのミルクカゼイン（Ｍｅｒｃｋ社）２％溶液を基質として，反応温度３８℃，反応ｐＨ３．０（酸性）、６．０（中性）における活性を測定した。活性の表示は３８℃１分間にＬ−チロシン１μｇを生ずる酵素量を１単位とした。
２）酸性カルボキシペプチダーゼ
国税庁所定分析法注解（第４回改定国税庁所定分析法注解 注解編集委員会編（日本醸造協会，東京），ｐ．２２６（１９９３）．）に準じて、０．５ｍＭＣｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ溶液を基質として，反応温度３０℃，反応ｐＨ３．０における活性を測定した。３０℃６０分間にチロシン１μｇを遊離する酵素量を１単位とした。
３）α−アミラ−ゼ
国税庁所定分析法注解に（第４回改定国税庁所定分析法注解 注解編集委員会編（日本醸造協会，東京），ｐ．２１８（１９９３）．）に準じて，可溶性デンプン１％溶液を基質として反応温度４０℃，ｐＨ５．０における活性を測定した。活性は４０℃３０分間に１％可溶性デンプン１ｍｌを分解する酵素量を１単位（Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ値）とした。
４）グルコアミラーゼ
国税庁所定分析法注解に（第４回改定国税庁所定分析法注解 注解編集委員会編（日本醸造協会，東京），ｐ．２１３（１９９３）．）準じて，可溶性デンプン２％溶液を基質として反応温度４０℃，ｐＨ５．０における活性を測定した。活性は４０℃１時間に１ｍｇのグルコースを遊離する酵素量を１単位とした。
５）ホスファタ−ゼ
難波らの方法に（難波康之助・戸塚 昭・伊藤 清：醸協，７２，８９３ （１９７７）．）より準じて，１０ｍＭ p-Nitrophenyl phosphate disodium溶液を基質として反応温度３０℃，反応ｐＨ５．０における活性を測定した。活性は３０℃１時間に１μＭのp-Nitrophenolを遊離する酵素量を１単位とした。
６）ペクチン糖化力
０．５％ペクチン（リンゴ由来、Ｗａｋｏ（株）製）溶液を基質として反応温度４０℃，反応ｐＨ４．０における活性を測定した。活性は４０℃で１時間にガラクツロン酸１μｇを遊離する酵素量を１単位とした。
７）ペクチン酸糖化力
１％ポリガラクツロン酸（オレンジ由来、Ｓｉｇｍａ（株）製）溶液を基質として反応温度４０℃、反応ｐＨ４．０における活性を測定した．活性は４０℃で１時間にガラクツロン酸１μｇを遊離する酵素量を１単位とした。
８）β−グルコシダーゼ
太田らの方法（太田剛雄・下条寛和・橋本憲治・近藤洋大・佐無田隆・大場敬輝：醸協，８６，５３６ （１９９１）．）に準じて、４ｍＭ p-Nitrophenyl -β-D-glucoside溶液を基質として反応温度３７℃，反応ｐＨ５．０における活性を測定した。活性は３７℃、１分間に１μＭのp-Nitrophenolを遊離する酵素量を１単位とした。
【００９８】
３．結果
上記項目に関する分析項目について、野生型麹カビＲＩＢ４０株及び実施例７で得られた遺伝子欠損株ＲＩＢ４０（＃８０−４）を用いて検討した。結果を表６に示す。麹の酵素活性では、遺伝子欠損株において有意な差はみられなかった。
【００９９】
【表６】
【０１００】
［胞子着生量の検討］
１．種麹作製試験
９７％精白米（国産米）を十分に吸水させ、定法に従い水切り・蒸しを行った。冷却後、３００ｍｌ容三角フラスコ（メリクロン）に２０ｇ分注し１ｋｇ／ｃｍ２ １分殺菌した。
麹菌としては、野生型のＲＩＢ４０及び前記実施例欠失変異体ＲＩＢ４０（＃８０−４）を使用した。
麹菌の接種は麹菌を培養した斜面培地から数ミリを切り取り、それをフラスコに入れ、よく攪拌した。
培養は、培養２４時間まで恒温恒湿機（タバイエスペック株式会社、ＰＲ−４ＳＰ）を用いて、温度３０℃、ＲＨ９８％の条件で、以後出麹（培養は７日間）まで３０℃の恒温機で行った。培養２４時間目に麹を撹拌し、水分及び品温の均一化を図った。
培養終了後、３５℃で１８時間乾燥した麹（種麹）１００ｇを１２０メッシュの篩いにかけ、アミを通過した分生子を回収、重量を測定した。分生子数はしょうゆ試験法（しょうゆ試験法 しょうゆ試験法編集委員会編：、（日本醤油研究所、東京）、ｐ．２７５（１９８５））に従い、トーマ氏血球計を用いて測定した。
【０１０１】
２．結果
上記の方法により種麹を作製し、種麹１００ｇあたりの胞子量を測定した値を胞子収量とした。野生型ＲＩＢ４０では８．０ｇ、遺伝子欠損型ＲＩＢ４０（＃８０−４）では７．２ｇであった。
【実施例９】
【０１０２】
［フザリウム属菌の広範囲遺伝子領域の欠失］
フザリウム属の株は、畑等の土壌に多く成育し、特に麦やとうもろこしについてカビ毒を作る。これらが生産するカビ毒は、トリコテセン系カビ毒やゼアラレノンなど多くの種類がある。この中でトリコテセン系カビ毒であるデオキシニバレノールとニバレノール及びゼアラレノンは、日本、カナダ、アメリカ、フランス、イギリスなど多くの国で麦類を汚染していることがわかり、大きな問題となっている。フザリウム属菌のトリコテセン生合成の分子レベルでの概要は既に解明され、フザリウム・グラミネラム（Fusarium graminearum）の全ゲノム配列も公開された。トリコテセンの生産に関与する種々の遺伝子は遺伝子クラスターを形成していることが明らかになっている。フザリウム・グラミネラムの主要な遺伝子クラスター（Ｔｒｉ５クラスター）は、１０個のＯＲＦを含んでおり、機能が明らかになっている遺伝子もある。そこで、遺伝子クラスター領域の欠失株の作出を本発明の手法を用いて行った。その結果、３種の遺伝子、Ｔｒｉ１１， Ｔｒｉ１２，Ｔｒｉ１３を含んだ約７．５ｋｂの領域を、本発明と同じ方法を用いて欠失するのに以下のように成功した。
【０１０３】
フザリウム属カビの場合、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が選択マーカーとして利用でき、遺伝子欠失のコンストラクトとしてはこの選択マーカーを挟んでＴｒｉ１１より外側の２ｋｂの配列とＴｒｉ１３より外側の約２ｋｂの配列をつなげた構造をダブルジョイントＰＣＲ法によって作成し、これによって、フザリウム・グラミネラムを形質転換した。形質転換後、ハイグロマイシンＢを含む培地で培養し、ハイグロマイシンＢ耐性株を選抜後、耐性株のそれぞれについてＤＮＡを抽出した。そして、適当なプライマーの組み合わせを用いて目的の遺伝子領域の欠失を確認し、変異体を選抜した。最終的に得られた変異株については、遺伝子構造の変化を以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を宿主と比較することにより確認した。図１９に、フザリウム野性株とトリコテセン遺伝子領域７．５ｋｂ領域が欠失したフザリウム変異株の遺伝子構造の概略とプライマーの位置を示す。また、前記の各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズを表７に示す。予想されるサイズのＰＣＲ産物の生成を電気泳動で確認した結果、３種の遺伝子、Ｔｒｉ１１， Ｔｒｉ１２，Ｔｒｉ１３を含んだ約７．５ｋｂの領域の欠失が確認できた（図２０）。
【０１０４】
＜プライマー：Fragment 3＞
配列番号９８：＃６３９（Ｆｇ３−ＸｈｏＩ−Ｆ）：CCCTCGAGAGGGATGGTCCACAGC
配列番号９９：＃６６５（ｈｐｈ−ｎｐ−Ｒ）：TCGCGGTGAGTTCAGGC
配列番号１００：＃６４８（Ｆｇ３−Ｒ）：TGGCAAGAACAGTTTGGG
配列番号１０１：＃６９０（Ｔｒｉ１１−Ｆ）：AACTGTTCTTGCCAGCATC
配列番号１０２：＃６９１（Ｔｒｉ１１−Ｒ）：TCAACAAGTTTGCAGAGAAC
配列番号１０３：＃６９２（Ｔｒｉ１２−Ｆ）：TTCCGATTTCTTTTGGGTAC
配列番号１０４：＃６９３（Ｔｒｉ１２−Ｒ）：TCCAGTTTGAAGAACTGGC
配列番号１０５：＃６９４（Ｔｒｉ１４−Ｆ）：GCCTAAAGGCAACATCAAC
配列番号１０６：＃６９５（Ｔｒｉ１４−Ｒ）：CCGTTGTTGAGACGCAAC
配列番号１０７：＃６６６（ｈｐｈ−ｄｏｗｎ−Ｆ）：TCGTCCGAGGGCAAAGG
配列番号１０８：＃６１９（Ｆｇ２−ｓｅｑ−ｒ２）：AGTATACAGAATCTCAGGC
配列番号１０９：＃６６８（Ｔｒｉ１４−ｒｉｇｈｔ−Ｆ）：GTAAGAGCAGCAGGTTCG
配列番号１１０：＃６１９（Ｆｇ２−ｓｅｑ−ｒ２）：AGTTATCAGAATCTCAGGC
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
トリコテセン遺伝子クラスターの場合、クラスター中央の領域にカビの生育に必要な遺伝子が含まれるため、クラスター全体を欠失させた変異株は得られなかった。そこで、生育に関係しない領域について広範囲の遺伝子領域の除去を本発明の手法で行った結果、７．５ｋｂの領域が欠失した変異株が得られた。そして、この欠失株ではトリコテセン系のカビ毒であるデオキシニバレノールの生産性の顕著な減少が観察され、一方、顕著な形態変化は見られなかった。以上の結果から、フザリウム属菌においても本発明の手法が有用であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明のｐＡＦ−ＤＤ１の概略を示す図である。
【図２】本発明のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６．６ｋｂ領域の欠失株であることを確認した電気泳動結果を示す図である。
【図３】本発明のｐＡＦ−ＤＤ２ベクターの概略を示す図である。
【図４】本発明のアフラトキシン産生遺伝子欠失を確認した電気泳動結果を示す図である。ＣＫはコントロールの宿主菌株である。
【図５】本発明のアフラトキシン産生遺伝子の欠失が確認された菌株について、さらに詳細な遺伝子欠失の確認結果を示す図である。ＣＫはコントロールの宿主菌株である。
【図６】本発明のアフラトキシン生産性が産生されなくなったことを紫外線写真法により確認した結果を示す図である。３つのコロニーのうち上のコロニーは、宿主ＳＹＳ−４株、下の２つはｐｋｓ−ｖｂｓ欠失株である。アフラトキシンを産生する宿主ＳＹＳ−４株では紫外線吸収がおこるため黒い像が、欠失変異体においてはアフラトキシンが産生されないため白い像が見られる。
【図７】本発明の薄層クロマトグラフィーによるアフラトキシン生産性の比較を行った図である。１はｐｋｓ−ｖｂｓ欠失株：培養液を１０μｌスポット、２はＳＹＳ−４宿主株：培養液を５μｌスポットしたものである。カビは主に４種のアフラトキシン（上のスポットからＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２）を産生する。
【図８】本発明のｐＶＢＳ−ＳＤ２ベクターの概略を示す図である。
【図９】本発明のアフラトキシン遺伝子クラスター領域ｖｂｓ遺伝子破壊株であることを確認した電気泳動結果を示す図である。
【図１０】本発明のｐＡＦ−ＤＤ３ベクターの概略、及びｖｂｓ遺伝子が既に破壊されているｎｉａＤ欠損株における相同組換えの概略を示す図である。
【図１１】本発明のｐＡＦ−ＤＤ３ベクターの概略、及びｖｂｓ遺伝子が破壊されていないｎｉａＤ欠損株における相同組換えの概略を示す図である。
【図１２】本発明のアフラトキシン遺伝子クラスター領域４９ｋｂ領域の欠失株であることを確認した電気泳動結果を示す図である。
【図１３】本発明のアフラトキシン産生遺伝子の欠失が確認されたｎｉａＤ欠損株について、さらに詳細な遺伝子欠失の確認結果を示す図である。ＣＫはコントロールの宿主菌株である。
【図１４】本発明のｐＡＦ−ＷＤベクターの概略を示す図である。
【図１５】本発明のアフラトキシン産生株の胞子と非産生カビの胞子の割合を変えてアフラトキシンの産生を調べた結果を示す図である。（Ａ）産生カビ、非産生カビの同時接種、（Ｂ）非産生カビを接種後１日経過時点で産生カビを接種したものである。
【図１６】本発明のｐＡＦ−ＤＤベクターの概略を示す図である。
【図１７】本発明の、ｐＡＦ−ＤＤをＢｓｐＨＩとＸｍａＩで処理して、１．５ｋｂ ａｆｌＴと１．５ｋｂ ｍｏｘＹ領域が２ｋｂ ｐｔｒＡ領域を挟んだ直鎖ＤＮＡ断片の構造を示す図である。
【図１８】本発明のアフラトキシン産生遺伝子の欠失が確認された＃８０−４番菌株について、さらに詳細な遺伝子欠失の確認結果を示す図である。ＣＫはコントロールの宿主菌株である。
【図１９】本発明のトリコテセン遺伝子領域７．５ｋｂ領域が欠失したフザリウム変異株とフザリウム野性株の遺伝子構造の概略を示す図である。
【図２０】本発明のトリコテセン遺伝子領域７．５ｋｂ領域の欠失株である事を確認した電気泳動を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体上の広範囲遺伝子領域欠失変異株やその生産方法等に関し、より詳しくは、生物の染色体上数キロベースより長く離れた２箇所の配列、例えば５ｋｂ以上、１５ｋｂ以上、３０ｋｂ以上、５０ｋｂ以上、更に１００ｋｂ以上離れた２箇所の配列を、選択マーカー遺伝子配列単独又は選択マーカーに導入を目的とする配列を繋いだ構造を中央に挟むように繋げたカセットを作り、それを細胞に形質転換し、広範囲の遺伝子領域を欠失する方法及び広範囲の遺伝子領域を他の配列と置換する方法や、これら方法により得られる広範囲遺伝子領域欠失変異株に関し、変異株の選択には、まず選択マーカーの性質を利用して染色体上に遺伝子が導入された生物を選択し、次に各変異株について遺伝子構造の変化を直接調べて、目的の遺伝子領域欠失変異体及び遺伝子領域置換変異体を選抜する方法、また、宿主由来の選択マーカー配列及び遺伝子配列を用いることにより、セルフクローニングによる広範囲遺伝子領域の欠失変異体及び置換変異体の作出に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の生命現象すべては、生物が有する遺伝子にその情報が保存され、いろいろな時期に適切に発現することによって生命現象が営まれる。近年種々の生物のゲノム研究によって、生物の染色体上の多くの領域は広範囲に蛋白質をコードせず、生命現象に関与しないと予想される、いわゆるジャンク領域であることが明らかになってきている。また、微生物や植物で見られる二次代謝は生物の生存には直接必要ではなく、二次代謝を阻害しても生物の生存可能であることは良く知られている。二次代謝に関与する遺伝子の多くは染色体上数ｋｂから数１０ｋｂに及ぶ大きな遺伝子クラスターを形成している。以上のことから、広範囲に遺伝子領域を除去しても生物の営みには少なくとも大きな影響を与えないような領域が染色体上に多く含まれると予想される。
【０００３】
カビが生産する二次代謝物質の中にはアフラトキシン等の毒性物質（カビ毒）があり、これまでに３００種以上のカビ毒が報告されている。中でもアフラトキシンは自然界で最強の発ガン性を示すとともに強力な急性毒性を示す。アフラトキシンは主としてアスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）とアスペルギルス・パラジチカス（A.parasiticus）に属する一部の菌が生産し、アフラトキシン生産菌は主として熱帯・亜熱帯地域の土壌に常在する。しかし、温帯の米国でも干ばつ等の気候変動で大規模なアフラトキシン汚染が起こることがある。我が国の本州以北の土壌ではアフラトキシン生産菌は検出されないが、さらに南の地域、例えば沖縄では汚染の報告がある。我が国は穀物の約６０％を輸入に頼っており、また穀物は世界で貿易されるため、輸入穀物のアフラトキシン汚染は厳重に検査されており、そのために使われる費用は莫大なものがある。一方、アフラトキシン生合成には１８種以上の酵素が関与しているが、これら酵素をコードする遺伝子を含めてアフラトキシン生合成に関与する２５以上の遺伝子群がカビの染色体上約７０ｋｂに及ぶ領域に大きな遺伝子クラスターを構成している。
【０００４】
ステリグマトシスチンはやはりカビ毒であるが、アフラトキシンの中間体でもあり、アフラトキシンに比べれば弱いが、やはり強力な発ガン性及び毒性を示す。アスペルギルス・ニジュランス（A.nidulans）やアスペルギルス・ベルシカラー（A.versicolor）等を含む２０種以上の多くのカビが、最終産物としてステリグマトシスチンを生産する。これらステリグマトシスチン生産カビは日本本州でも常在し、穀物のステリグマトシスチン汚染の可能性は我が国においても重要な問題である。ステリグマトシスチン生合成経路は、アフラトキシン生合成経路中ステリグマトシスチン中間体までの経路と同一である。ステリグマトシスチン生産関連遺伝子は、染色体上約６０ｋｂに及ぶ遺伝子クラスターを構成している。
【０００５】
これらのカビが有害物質を生産しないようにするには、いろいろな方法がある。例えば、種々の変異処理を行い塩基置換による変異体を得る方法もあるが、常に復帰変異が起こる可能性を念頭に置かなくてはならない。また、生産に関与するいずれかの遺伝子を破壊すれば生産を抑えることができるが、有害な中間体が蓄積する可能性があり、また、一遺伝子破壊ではわずかに活性が残ることが多い。これは、生体内の別の酵素が群特異性によって反応を触媒するためと考えられる。したがって、完全にカビ毒の生産を抑えるには、遺伝子クラスターを丸ごと除去することがもっとも確実な方法である。
【０００６】
アフラトキシンやステリグマトシスチンなど多くのカビ毒は熱に安定で、また分解も容易ではない。カビのアフラトキシン生産を効果的に防御できる方法も未だ開発されていない。しかし、近年アメリカでは、耕作土壌や収穫後の穀物にアフラトキシン非生産カビの胞子を散布して、アフラトキシン汚染を減少させる方法が開発されてきている。つまり、アフラトキシン非生産カビの胞子を大量に調製し、微生物農薬として土壌や穀物保管倉庫に過剰に添加し、環境中のアフラトキシン生産菌と感染機会を競合させるもので、有意にアフラトキシン汚染量を減少できることが報告されている。このようなアフラトキシン非生産菌の胞子はバイオコントロール剤として現在、製品として販売されている。しかし、利用されているアフラトキシン非生産カビは研究室や会社で保存されているアスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）やアフラトキシン非生産アスペルギルス・フラバスであり、実際に現場でアフラトキシン汚染を引き起こしているカビではない。そのため、気候、土壌、作物種などの環境要因に対するバイオコントロール剤の感受性は汚染現場に常在するカビとは微妙に異なると予想され、実際にバイオコントロール剤の環境への定着性は低い。そのためバイオコントロール剤は毎年、又はより頻繁に現場に散布する必要がある。そのため、安価な作物の栽培にはコストの点から利用が限られている。
【０００７】
更に、我が国を含め東アジアでは発酵食品が好まれており、発酵食品生産には麹カビが利用されている。麹カビであるアスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・ソーヤ（A.sojae）は分類学上アフラトキシン生産菌アスペルギルス・フラバスやアスペルギルス・パラジチカスと極めて近縁であり、これらは、いわゆるアフラトキシン関連物質を作らないように”家畜化された” アスペルギルス・フラバスと考えられている。これまでアフラトキシンの生産が検出された麹カビは一例もなく、麹カビの安全性については確認されている。しかし、近年の遺伝子研究技術の発展により、麹カビの半数以上がアフラトキシン遺伝子クラスター類似の広範囲遺伝子領域を有し、それ以外もかなりの領域又は少なくとも複数の類似遺伝子を含むことが明らかになっている。これらの遺伝子領域が存在しても機能していないことは明らかであるが、アフラトキシン関連遺伝子領域の存在は、消費者に対して食品の安全性をアピールする際には問題がある。また、麹の渇変原因遺伝子ｍｅｌ等の存在は、食品に色をつける可能性があり、望ましくないとされる場合がある。以上のように産業上好ましくない性質の遺伝子や有害物質関連遺伝子を除去することができれば、糸状菌の利用の可能性は大きく広がると考えられる。
【０００８】
一方、カビや細菌を利用した遺伝子組み換え技術として、従来から生物の染色体と相同な領域を選択マーカー遺伝子の両側に含む遺伝子断片を生物に導入して、２回交差の相同組換えによって数キロｂｐ程度の遺伝子領域の欠失や置換が生じた生物作出する方法は、短い遺伝子領域を改変するための一般的な方法として利用されている。生物に遺伝子導入をした場合、遺伝子断片と染色体上同一の配列を有する部位で組換えが起こる相同組換えと、遺伝子断片とは全く異なる配列に挿入される非相同組換えが起こる。生物一般に起こる現象であるが、特に真核生物では非相同組換えの率が高く、目的とする変異株の選抜を難しくしている。さらに、特定の遺伝子領域を丸ごと欠失したり、他の遺伝子又は遺伝子領域を置換したりするには、２箇所の相同領域で相同組換えが起こることが必要で、目的の変異株が得られる確率は一層低下する。したがって、従来、遺伝子改変して目的とする変異株を得るには、目的とする変異株が特徴的な表現型を示すこと、又は、変異する遺伝子の機能があらかじめ予想できていてその性質に基づいて変異株を選抜できることが、多くの場合で必要であった。加えて、遺伝子機能が不明である場合や顕著な表現系の変化がない場合には、目的の変異株の選抜は困難であり、変異株の獲得は断念される場合が多かった。
【０００９】
更に、上述したように、麹カビにおいては一つの胞子が２個以上の核を含む多核胞子の割合が高いため、胞子を培養して集落を作らせても変異を有する一つの核の性質が表現形質の変化として現れにくく、目的の変異株を選抜することは極めて困難である。特に、あらかじめ得られる変異株の形態変化や酵素活性の変化に関する情報が得られない際には、目的とする変異株の選抜は多核胞子中の核の中から目的とする変異株の核だけを分けとるか、多核胞子を培養し、継代するにしたがって分離して得られてくる変異株を選抜する必要がある。しかしながら、このような方法では、種々の形質転換株の中に極めてわずかにしか含まれないので、目的の変異株を選抜することは現実的には不可能である。
【００１０】
また、非常に多くの、例えば１００個以上の沢山の形質転換体について、遺伝子構造を全て調べるためには、形質転換体それぞれからＤＮＡを抽出する必要がある。大腸菌や酵母では直接菌体をＰＣＲ溶液に添加してＰＣＲ産物を得るいわゆるコロニーＰＣＲが可能であるが、特に、上記のようなカビや植物など強固な細胞壁を有する生物では、従来核酸の溶出は困難であり通常は乳鉢で液体窒素存在下に細胞を破砕してＤＮＡを抽出するため、一度に沢山の菌体の分析は極めて困難であった。しかし、近年、本発明者らが鋭意研究を行った結果、微量細胞破砕装置を用いて、多数の、そして少量のカビ菌体から短時間のうちに安価にＤＮＡを溶出する方法を確立した（例えば、非特許文献１参照）。
【００１１】
これまで染色体上の広範囲遺伝子領域を除去する技術として報告されてきたものは、相同組換えの頻度を高めるために染色体上の二箇所の離れた領域に組換え酵素の基質となる特殊な配列を別々に挿入し、この配列間の組換えを選択的に触媒する酵素遺伝子を細胞内で発現させて、特殊な配列間で特異的に交差を起こし、広範囲遺伝子領域を相同組換えによって欠失させるものである。これらの方法では、特殊な配列と配列に特異的な組換え酵素の利用により得られる組換え体は、ほとんどが目的とする組換え体であり、上記した変異株の選抜の問題を回避することができる。これらの方法としては、λ-red recombination system，Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステム、メガヌクレースをもちいた遺伝子置換法等がある。たとえば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ法を用いて広範囲遺伝子領域を除去する方法では、染色体上の離れた二箇所にｌｏｘＰと呼ばれる特有の配列を組み込み、別に細胞内で組換え酵素Ｃｒｅを発現することでｌｏｘＰの間の組換えを起こし、最終的に２つのｌｏｘＰで挟まれていた領域を除去する方法が知られていた。
【００１２】
また、有性世代を有さない生物の遺伝子ターゲッティングによる遺伝子破壊あるいは遺伝子置換に必要な相同組換え効率の良い菌株を提供するため、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼー等に代表されるトリコモナス科糸状菌に属し有性世代を持たない菌を用いて、Ｋｕ遺伝子破壊株及びアンチセンスＲＮＡ法等によるＫｕ遺伝子を抑制することによって相同組換え（ターゲッティング）頻度が上昇した変異株、及び、該変異株を使用する遺伝子ターゲッティング法により、遺伝子破壊株、遺伝子欠失株、遺伝子置換株、遺伝子挿入株、又は染色体改変株を作成する方法（例えば、特許文献１参照）や、真核生物細胞等の所望の細胞の相同組換え率を上昇させるために、非相同組換えに必要な因子、例えば、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０をコードする遺伝子に突然変異を導入し、又は該遺伝子を破壊することにより、機能喪失を引き起こしたとき、細胞に外来性ＤＮＡを、電気ショック法等により導入して相同組換えを行わせ、細胞の相同組換え頻度を促進させる方法（例えば、特許文献２参照）が知られているが、これらの方法では、ｋｕ破壊株を作る必要があり、さらにｋｕ破壊株における非相同組換え活性の変化が他の面でもカビに影響を与える可能性がある。
【００１３】
【特許文献１】特開２００６−１５８２６９号公報
【特許文献２】特開２００５−２３７３１６号公報
【非特許文献１】Ying Wen, Hidemi Hatabayashi, Hatsue Arai, Hiroko Kitamoto, Kimiko Yabe. Function of the cypXand moxY genes in aflatoxin biosynthesis in Aspergillus parasiticus. Applied and Environmental Micorbiology 71:3192-3198 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
染色体レベルの広範囲の遺伝子領域を欠失させる場合、例えば、染色体５キロベース以上、好ましくは１５キロベース以上、より好ましくは５０ｋｂ以上、特に好ましくは１００ｋｂ以上離れた二箇所の配列を対象としたとき、２重交差が起こる確率は極めて低く、通常１％以下である。そのため染色体レベルの広範囲遺伝子領域の改変には２回交差による相同組換株の作出は利用されてきていなかった。実際、導入遺伝子断片の一方又は両方が、非相同的に染色体に挿入されて生じる変異株の割合は高く、広範囲遺伝子領域を欠失させたり、他の遺伝子領域に置換させたりすることは極めて困難である。また、麹カビのように、１つの胞子が２個以上の核を含む多核胞子の割合が高い生物については、１つの核の変異が表現型の変化として現れないため、目的の変異株を選抜することは極めて困難であった。
【００１５】
さらに、あらかじめ得られる変異株の形態変化や酵素活性の変化に関する情報が得られない際には、目的とする変異株の選抜は、多核胞子中の核の中から目的とする変異株の核だけを分けとるか、多核胞子を培養し継代するにしたがって分離して得られてくる変異株を選抜する必要があるが、このような方法で種々の変異株からわずかに含まれる目的の変異株を選抜することは、実際には不可能である。また、目的とする変異株が特徴的な表現型、すなわち、形態や物質の生産性の変化等容易にその変化を検出できる形質を有している場合には、その形質は選抜に役立つが、狭範囲遺伝子領域の改変を行った場合でも、また広範囲遺伝子領域の改変を行った場合でさえも表現型の有意な変化が起こらないこともあるため、変異株の形質変化を予想することは通常困難であり、目的どおりの遺伝子領域改変が起こっているかを確認するためには、遺伝子構造の変化を確認する必要があった。
【００１６】
本発明の課題は、アフラトキシン生合成に関与する遺伝子クラスターを構成するカビの染色体上約７０ｋｂに及ぶ領域等の、広範囲の遺伝子領域を欠失する方法及び広範囲の遺伝子領域を他の配列と置換する方法や、広範囲の遺伝子領域を欠失した変異株の生産方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らはアフラトキシン生産菌アスペルギルス・パラジチカスのアフラトキシン遺伝子クラスターを除去する方法を確立するため、まずはＣｒｅ／ｌｏｘＰの系の利用を検討した。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰを用いて遺伝子領域の欠失を行うためには、合計３つの選択マーカーが基本的に必要となる。欠失したい領域の二つの端に、ｌｏｘＰ配列を、それぞれ方向をそろえて導入する必要がある。そのためには、各ｌｏｘＰに選択マーカーが必要であり、つまり２つ選択マーカーが必要である。さらに、導入したｌｏｘＰ配列間で相同組み換えを起こすために、組み換え酵素Ｃｒｅを細胞内で発現させる必要があり、Ｃｒｅの遺伝子を細胞内に導入するための選択マーカーがもう１つ必要である。
【００１８】
アスペルギルス・パラジチカスの場合、使用できる選択マーカーの数が極めて限られており、薬剤選択マーカーとしてはピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）しか得られていない。これ以外の硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）等を選択マーカーとする場合は、ｎｉａＤ欠失株等の栄養要求性変異株を作る必要があり、栄養要求性変異株の作出も容易ではない上に、２つの栄養要求性変異を導入することで野生株とは離れた株を宿主として利用せざるをえないという問題がある。特に、アスペルギルス・パラジチカスの系に限らずアスペルギルス・フラバスグループでは極めて使える選択マーカーの数が限られているという問題が非常に大きな障害となっており、また、変異株の作製も容易ではないなど問題がある。
【００１９】
本発明者らの研究では、２つの栄養要求性が含まれるアスペルギルス・パラジチカス変異株の入手ができないという問題点があった。そこで、本発明者らは、このカビで一般的に使われている栄養要求性マーカーが硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤであることから、この遺伝子に関する変異株を入手し、ｎｉａＤとｐｔｒＡという二つの選択マーカーを用いて、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系の利用を検討することとなった。
【００２０】
まず、ｎｉａＤ選択マーカー、ｌｏｘＰ、及び、導入の標的となる遺伝子であるアフラトキシン遺伝子クラスターのｖｂｓ遺伝子の配列を含むプラスミドを構築し、ｖｂｓ遺伝子配列の内部で一箇所切断し、できた線状のプラスミドを宿主に導入して、ｖｂｓ遺伝子の部分で一回交差してベクターが導入された変異株を選抜した。この場合、ｖｂｓ遺伝子はアフラトキシンクラスター上の遺伝子で、アフラトキシン生産の途中の酵素をコードしているため、この遺伝子で交差した変異株はアフラトキシン生産性が顕著に減少するとともに、この遺伝子が関与する反応段階の直前の色素性中間体が菌糸中に蓄積する。したがって、マーカー遺伝子の選抜の後、さらに色素の蓄積を指標に目的とする変異株を絞り込んでいくことができた。こうして選抜した変異株について、次に遺伝子構造の変化をＰＣＲで確認することで、ｖｂｓ領域にｌｏｘＰ配列を含むベクターが導入された変異株を作製するのに成功した。
【００２１】
次に２つ目のｌｏｘＰを導入する必要があったが、使える選択マーカーがｐｔｒＡしかなかったため、ｐｔｒAを含む導入プラスミドにｌｏｘＰ配列とＣｒｅ酵素遺伝子発現領域との両方を組み込み、これをクラスター中のｐｋｓＡ配列に導入する計画を立てた。ベクター中には、ｎｉａＤ、ｌｏｘＰ、標的のｐｋｓＡ配列、Ｃｒｅ酵素の配列、さらにｃｒｅ遺伝子を発現するためのタカアミラーゼＡ遺伝子（ａｍｙＢ）プロモーター領域を組み込む必要があった。しかし、このような沢山の遺伝子を組み込んでいって、目的のプラスミドを得ることは、種々の組み込み方法を検討したにもかかわらず大変困難であった。この原因について時間をかけて検討したが、その原因の１つに、プラスミドサイズの問題があるという結論が得られた。つまり、このベクターは沢山の遺伝子領域を含むために大きなものとなる。一方、プラスミドは大腸菌に組み込んで増幅するが、通常研究で一般的に使われる大腸菌を用いた場合、効率よく形質転換されるプラスミドの大きさには限度があり、今回の試みではなかなか目的のサイズのプラスミドが取れなかった。つまり、形質転換できた場合でも、大腸菌を培養している間にプラスミドが分解してきているらしく最終的にプラスミドサイズが小さくなったものが優先的に増幅されることが多かった。そのため、基本ベクターを他のものに変えたり、大きなプラスミドも導入できると報告されている大腸菌の株を用いたりするなど、種々の条件を変更することで、カビの形質転換に使える量の形質転換ベクターを得ることができた。
【００２２】
得られたベクターをｐｋｓＡ遺伝子内部で一回切断後、ｌｏｘＰ配列が一つ導入されているカビに形質転換し、ｐｋｓＡ遺伝子で一回交差してベクターが丸ごと導入された形質転換体の作出を試みた。選抜には、まずピリチアミン耐性選択マーカーで選抜（ピリチアミンを含む培地で生えてくる株）した。ｐｋｓＡ遺伝子内部に導入された場合、ｐｋｓＡ遺伝子の機能が破壊される。ｐｋｓＡ遺伝子はアフラトキシン生合成経路のごく初期に関与しているため、この遺伝子が破壊されるとｖｂｓ遺伝子破壊で蓄積していた色素性アフラトキシン中間体の生産もなくなる。したがって、ピリチアミン耐性株の中から、色素の蓄積がなくなった白い菌糸を示す株を選抜した。こうして得られた株について遺伝子構造をＰＣＲで確認することで、２つ目のｌｏｘＰ配列が導入された変異株を選抜した。
【００２３】
このようにして得られた株について、ｃｒｅ酵素の発現を試みた。ｃｒｅ遺伝子の上流にタカ‐アミラーゼＡ遺伝子（ａｍｙＢ）プロモーターをつなげているが、このプロモーターはマルトースやでんぷんを培地に加えることによって誘導される。そこで、培地にこれらの炭素源を加えて変異株を継代し、遺伝子領域の欠失を検討した。しかし、目的とする広範囲領域の破壊株は得られなかった。種々のｃｒｅ遺伝子の誘導条件を検討し、ｃｒｅ遺伝子の発現誘導はＲＴ−ＰＣＲによって確認されたが、それでも目的とする株が得られなかった。ｃｒｅ遺伝子の高発現条件や、酵素活性の至適条件が得られていなかったためと予想されるが、多くの検討と試みにもかかわらず、目的とする広範囲遺伝子領域欠失株は得られず、この方向の研究を断念した。
【００２４】
以上のように、ｃｒｅ／ｌｏｘＰの系は基本的に３個の選択マーカーが必要であるため、利用できる選択マーカーの数がそれに満たない場合は、利用が大変困難である。また、広範囲遺伝子領域の破壊では、離れた、少なくとも二箇所の領域に段階的にｌｏｘＰ配列を導入する必要があり、さらに、Ｃｒｅ酵素遺伝子の導入が必要であるため、欠失させるのに必要な構造を構築するのに少なくとも３段階のステップが必要で、おのずと複雑な手法と言える。さらに、Ｃｒｅ酵素遺伝子を導入しても、Ｃｒｅ発現の至適条件を得るのは容易なことではない。本発明者らは約１年半の間、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系によるアフラトキシン遺伝子クラスターの欠失を試みたが成功には至らなかった。
【００２５】
また、特に麹カビの場合、もともとアフラトキシン及びアフラトキシン中間体の生産がないので、遺伝子を除去しても、アフラトキシン生産性の変化やアフラトキシン中間体の色の変化を指標に目的の変異株を選抜することができず、したがって、選択マーカーで選抜した変異株の中で、極めてわずかしか含まれない目的の変異株を選抜することはほとんど不可能と考えられてきた。本発明者らも含め当業者であれば、このような場合には非相同組み換えに比べて相同組み換えの頻度が顕著に上昇するようなシステムの構築を考え、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系やｋｕ株の系の開発を検討する。このようにして得られる変異株のたとえば５０％が相同組み換えによる目的の変異株であれば、数個程度の変異株について遺伝子構造を調べれば、かならず目的の変異株を見い出すことができ、調べる数が少ないので、遺伝子構造の確認もそれほど大変ではないだろうという発想が、本出願前の本発明者らも含めた当業者の研究開発の方向であった。しかし、上述したように、アスペルギルス・パラジチカスのアフラトキシン遺伝子クラスターを、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰの系を利用して除去する試みに成功しなかったことから、研究開発の方向を大きく転換することを余儀なくされた。
【００２６】
そこで本発明者らは、上記課題を解決するため、研究方針を変え、１）広範囲遺伝子領域破壊のための遺伝子置換カセットの構築、及び２）目的とする変異株の選抜方法という以下に示す方法について検討を行うこととした。
１）導入遺伝子構造として、染色体上、長さが少なくとも５ｋｂ以上、１５ｋｂ以上、５０ｋｂ以上、又は１００ｋｂ以上離れた２つの領域と同一の２つの遺伝子配列を、選択マーカー又は選択マーカーと着目の遺伝子領域の配列を含んでつなげた遺伝子カセットを作製し、プロトプラスト等に形質転換する。２種の選択マーカーを利用できる場合には、ポジティブ−ネガティブセレクションが可能なように、上述のカセットの一方の外側に２つ目の選択マーカーの配列を導入する。
２）導入遺伝子断片の２つの相同遺伝子領域と染色体上の相同領域でそれぞれ相同組換えが起こった変異株を選抜するために、まず選択マーカーの性質を利用して選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより、目的の変異株を選抜する。
【００２７】
上記方法は、基本的に、選択マーカーで選抜したできるだけ多くの変異株のすべてについて、遺伝子を調べるという方法で、極めてわずかしか含まれないだろう目的の変異株を労力で選抜するという大変泥臭い方法であるが、麹カビのようにアフラトキシンを生産しないカビでも問題なく利用できる上に、カビの生存に影響しない領域、又は影響しないような培養条件が得られる領域であれば、どのような領域でも、すべて欠失、又は改変できる技術といえる。そして、染色体上、長さが少なくとも５ｋｂ以上、１５ｋｂ以上、５０ｋｂ以上、又は１００ｋｂ以上離れた広範囲遺伝子領域を簡便に除去する方法及び同広範囲領域を他の遺伝子領域に交換する方法として、ＰＣＲや遺伝子断片の結合により作られ、選択マーカーだけ、又は選択マーカーと着目の遺伝子領域の配列を含んだ内部ヌクレオチド配列に隣接する２つの相同性領域を含む挿入ベクターを、プラスミドに含まれた形又は遺伝子断片として構築し、形質転換を行った後、多くの変異株の中から、離れた２箇所の相同性領域で２回交差が起こった目的とする変異株を選抜してくる方法を見い出し、本発明を完成するに至った。
【００２８】
このように本発明では、遺伝子構造の変化を調べることによって目的とする変異株を選抜し、最終的に広範囲の遺伝子領域が目的通りに改変されていることを、種々のプライマーを用いたＰＣＲやサザーン法等で確認する。もちろん変異株の表現形の変化があれば有用な情報となるが、広範囲遺伝子領域の改変を確実にモニターするためには遺伝子構造の変化を直接調べることが有効であり、本発明によって、極めて信頼性の高い変異株選抜法が確立できたといえる。
【００２９】
すなわち本発明は、（１）糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを作製し、該広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを前記糸状菌に導入し、２回交差相同組換えが起こった変異株を、まず選択マーカーの性質を利用して一次選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより二次選抜することを特徴とする広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（２）糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域であることを特徴とする上記（１）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法に関する。
【００３０】
また本発明は、（３）染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域が、染色体上で１５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（４）染色体上で１５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域が、染色体上で５０ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域であることを特徴とする上記（３）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（５）選択マーカー遺伝子が、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）又は／及び硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（６）一次選抜で得られた変異株から単核胞子を調製し、単核胞子由来の遺伝子構造の変化を直接調べることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（７）ＰＣＲ法又はサザーン法により変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法や、（８）糸状菌の染色体上で５ｋｂ以上の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域が、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域で置換されて欠失した広範囲遺伝子領域欠失変異株や、（９）糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター領域又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域であることを特徴とする上記（８）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株や、（１０）糸状菌の染色体上で１５ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを特徴とする上記（８）又は（９）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株や、（１１）糸状菌の染色体上で５０ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを特徴とする上記（１０）記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株や、（１２）選択マーカー遺伝子が、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）又は／及び硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）であることを特徴とする上記（８）〜（１１）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株に関する。
【００３１】
さらに本発明は、（１３）アフラトキシン生産菌の遺伝子クラスターの全部又は一部が除去されたアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカスや、（１４）アスペルギルス・パラジチカス（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０）や、（１５）アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域の全部又は一部が除去されたアスペルギルス・オリゼーや、（１６）アスペルギルス・オリゼー（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１）や、（１７）上記（８）〜（１２）のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株、上記（１３）若しくは（１４）記載のアスペルギルス・パラジチカス、又は、上記（１５）若しくは（１６）記載のアスペルギルス・オリゼーを含むバイオコントロール剤や、（１８）糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットと、前記広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを確認することができるプローブ又は少なくとも１対のプライマーセットとを備えた広範囲遺伝子領域欠失変異株のスクリーニングキットに関する。
【発明の効果】
【００３２】
上述の染色体改変技術（ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム、λ−ｒｅｄレコンビネーションシステム、Ｆｌｐ／ＦＲＴシステム、メガヌクレースを用いた遺伝子転換）では、特殊な配列をあらかじめ挿入し、その間で相同組換えが起こるように組換え酵素を発現させて、目的とする変異株の出現頻度を上げたり、麹カビの場合には、非相同組換え活性を下げる変異をあらかじめ宿主に導入しておくことで相同組換えの割合を上昇させ、目的とする変異株の選抜が可能になっているものの、以下のような多くの問題点があった。
【００３３】
１）これらの方法では、特定の配列を導入して、さらに組換え酵素の遺伝子導入をする必要があるため、複数の選択マーカーが必要であり、それだけの数の選択マーカーが利用できる系である必要がある。選択マーカーによっては宿主にあらかじめ変異を導入することが必要となる。
２）これらの方法では、細胞内で遺伝子組み換えのための特定の酵素遺伝子を発現させる必要があるが、酵素遺伝子の発現のための至適条件を決めることが必要であり、容易ではない。また、これらの方法では特殊な酵素や遺伝子配列が必要なため、２段階以上のステップから構成される複雑な系であり操作が極めて複雑である。
３）以上のような複雑で難しい方法であるため、いずれの方法も時間がかかる。
４）さらに、得られた破壊株の染色体の中に最終的に異種遺伝子が保持されてしまうため、作製された生物は異種間の遺伝子組換え体となる。したがって組み換え体を環境中で使用することは法の規制を受け、実用の面で困難が多い。
５）麹カビで報告されているｋｕ７０破壊株による破壊法では、遺伝子領域除去のためにｋｕ７０破壊株の作製があらかじめ必要であり、さらに操作が複雑であり時間がかかる。
【００３４】
一方、本発明では、遺伝子コンストラクトの作製も容易であり、１つの選択マーカーがあれば十分であり、１回の形質転換をすれば、目的の欠失株が得られる。したがって、本発明は、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系、又はｃｒｅ／ｌｏｘＰ系と同様の原理を持つ遺伝子改変システムとは比較にならないほど、容易で短時間に目的の変異株を得ることができるシステムを提供している。
【００３５】
このように本発明によると、従来の方法と異なり、相同組換えが選択的に起こるような特別の配列や酵素の導入や非相同組換え活性の破壊は使用しないため、選択マーカーで選抜後の変異株の中で、目的とする２回交差変異株の割合は極めて少なく、表現型の変化を利用した選抜も期待できない。本発明では、遺伝子マーカーの性質で選抜された変異株それぞれからＤＮＡを調製し、ＰＣＲやサザーン分析等を用いて直接遺伝子の構造変化を調べた。すなわち、目的とする変異株が１％の確率で含まれているとすると、少なくとも１００個の変異株を、それが２００個以上また５００個であるとしても目的とする変異株を遺伝子構造の変化を調べることで選抜することになる。したがって、この方法を効率よく行うためには、生物体から簡便に遺伝子を抽出する技術が必要であり、生物体の熱処理等や細胞破砕による核酸抽出によって多数の生物体から簡便に核酸を溶出し、さらにＰＣＲやサザーン法等で分析することで、効率よくスクリーニングを行うことができる。
【００３６】
また、麹カビについては多核胞子が多い点に問題があるが、その場合にも、得られた変異株のそれぞれから核酸を調製し、遺伝子構造変化を調べることで選抜できる。例えば、ＰＣＲを用いる場合、ＰＣＲのプライマー配列として、選択マーカーの内部配列と、染色体上、導入遺伝子の相同配列より外側の配列を選ぶことにより、多核胞子であっても、胞子の中の複数の核のうち一つでも目的とする変異株の核があれば、ＰＣＲ産物が得られるように、いわゆる変異体の核のポジティブセレクションが可能になるように設計する。そして、カビの胞子サイズは含まれる核の数によって異なるため、ポジティブセレクションで得られた変異株から胞子を調製し、単核胞子しか通せないようなポアサイズの膜をもちいて胞子液をろ過し、得られた胞子を寒天培地に広げ培養することで、一つの核をもつ胞子から得られた集落（菌糸と胞子）から核酸を調製し、ＰＣＲやサザーン法で遺伝子構造を調べ、目的の変異体を選抜することができる。
【００３７】
このように本発明によると、特殊な遺伝子配列を染色体上へ導入する必要がなく、また組換え酵素の発現や、特殊な宿主も必要としない。操作は単純であり、目的の変異株の検出にも複雑な操作を必要としない。さらに、宿主由来の選択マーカー配列と遺伝子領域を本発明に利用すれば、セルフクローニングが可能であり、得られた生物の実用的利用の可能性が非常に高いといえる。
【００３８】
また、本発明を利用して、麹カビからアフラトキシン生産に関連する遺伝子領域を完全に取り除くことができ、汚染現場の菌からアフラトキシン遺伝子クラスターをまるごと除去できれば、定着率の高いバイオコントロール剤の開発が可能となり、安全な食品供給のイメージアップにも貢献することができる。さらに、アフラトキシン遺伝子クラスターに限らず、生物の生育に直接必要としないか、又は有害な領域を新たな遺伝子領域に置換できる手法を得ることは、離れた相同性領域の間に物質生産に関連する酵素遺伝子や制御遺伝子領域を繋げ、生物に新たな物質生産機能を付与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法としては、糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを作製し、該広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを前記糸状菌に導入し、２回交差相同組換えが起こった変異株を、まず選択マーカーの性質を利用して一次選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより二次選抜する方法であれば特に制限されず、上記糸状菌としては、アスペルギルス属菌、フザリウム属菌、ペニシリウム属菌、リゾップス属菌、ムコール属菌、リゾムコール属菌、アブシジア属菌、モナスカス属菌等を挙げることができる。
【００４０】
上記糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域としては、アスペルギルス属菌が産生するアフラトキシン、オクラトキシン、ステリグマトシスチンや、フザリウム属菌が産生するデオキシニバレノール、ニバレノール、ゼアラレノンや、ペニシリウム属菌が産生するルテオスカイリン、シトリニン等のマイコトキシン生産に関与する遺伝子クラスターを具体的に例示することができる。また、少なくとも生存に必須でない遺伝子としては、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ソーヤ、リゾープス・ジャバニクス、モナスカス・プルプレア等の麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域、麹の渇変原因遺伝子ｍｅｌ等の好ましくない性質に関与する遺伝子領域を好適に例示することができる。
【００４１】
上記染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域としては、好ましくは１５ｋｂ以上、より好ましくは３０ｋｂ以上、特に好ましくは５０ｋｂ以上や１００ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域を挙げることができ、より具体的には、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域としては、アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスターのｄｍｔＡとｖｂｓとの２つの遺伝子領域（６．６ｋｂ）を挙げることができ、染色体上で３０ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域としては、アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスターのｐｋｓＡとｖｂｓとの２つの遺伝子領域（４９ｋｂ）を挙げることができ、染色体上で５０ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域としては、アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスターのｎｏｒＢとｈｙｐＡとの２つの遺伝子領域（６７ｋｂ）や、アスペルギルス・オリゼー染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域のａｆｌＴとｍｏｘＹとの２つの遺伝子領域（６０ｋｂ）を挙げることができる。
【００４２】
上記選択マーカー遺伝子としては、アスペルギルス・オリゼーやアスペルギルス・パラジチカスのピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒＡ（Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 1416-1421, (2000)；特許第３１６２０４２号公報）、硝酸還元酵素をコードする遺伝子ｎｉａＤ（Mol. Gen. Genet., 218, 99-104, (1989)）、ａｒｇＢ（Enzyme Microbiol. Technol., 6, 386-389, (1984)）、ｐｙｒＧ（Biochem. Biophys. Res. Commun., 112, 284-289, (1983)）、ａｍｄＳ（Gene, 26, 205-221, (1983)）、ｓＣ（Gene, 84, 329-334, (1989)）を挙げることができるが、実用性の点で、ｐｔｒＡ及びｎｉａＤを好適に例示することができる。また、選択マーカー遺伝子として、アスペルギルス・ニガーのハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（Gene．1987；56（1）：117-24）、オリゴマイシン耐性遺伝子（Curr．Genet.1988 Jul；14（1）：37-42）、アスペルギルス・ニジュランスのオーレオバシジンＡ耐性遺伝子（特開平９−９８７８４号公報）、アスペルギルス・フラバスのベノミル耐性遺伝子（Appl．Environ Microbiol 1990 Dec；56（12）：3686-92）、ペニシリウム・ロックフォルテイー（P.roqueforti）のphelomycin耐性遺伝子（J. Biotccol 1996 0ct．18；51（1）：97−105 ）、ペニシリウム・アイスランジユーム（P.islandicum）のbenomyl 耐性遺伝子（curr．Genet. 1995 Nov.；28（6）580-4 ）等を挙げることができる。
【００４３】
上記広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットは、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を、λファージベクターやプラスミドベクターを利用して連結することにより調製することができる。また、ダブルジョイントＰＣＲ法（Jae-Hyuk Yu et al. Double-joint PCR: a PCR based molecular tool for gene manipulations in filamentous fungi. Fungal Genetics and Biology 41 (2004) 973-981）等を用いて、各遺伝子領域及びマーカー領域をＰＣＲで増幅後、それぞれを連結して破壊カセットをプラスミドを利用することなく直接構築する。上記選択マーカー遺伝子は、２種以上用いることもでき、この場合、ポジティブ−ネガティブセレクションが可能なように、上記カセットの一方の外側に２つ目の選択マーカーの配列を導入することが好ましい。また、選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域における所定の遺伝子領域としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を挙げることができる。
【００４４】
広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを糸状菌に導入する方法としては、ＰＥＧ−カルシウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、アグロバクテリウム法など特に制限されないが、細胞壁溶解酵素処理によってプロトプラストを作製し、ポリエチレングリコールと塩化カルシウム存在下で線状化したカセットＤＮＡを導入する方法を好適に挙げることができる。
【００４５】
広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを糸状菌に導入し、２回交差相同組換えが起こった変異株を選抜する方法としては、まず選択マーカーの性質を利用して一次選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより二次選抜する方法を挙げることができる。かかる二次選抜により、目的とする変異株を選抜し、最終的に広範囲の遺伝子領域が確実に目的通りに改変されていることを確認することが重要である。
【００４６】
例えば一次選抜において、選択マーカーとしてピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）を利用した場合、ピリチアミンを含むＣＤ（Czapex-Dox）再生培地で生育してきた株はピリチアミン耐性株であり、ピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒＡがゲノムに導入されていると考えられる。また、選択マーカーとして硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）を利用した場合、ｎｉａＤ欠失ホモ変異株を宿主として用い、硝酸を唯一の窒素源として加えた再生培地で生育してきた株は、硝酸還元酵素をコードする遺伝子ｎｉａＤがゲノムに導入されていると考えられる。なお、アフラトキシン遺伝子クラスターを欠失させた場合など、表現形の変化を利用した選抜手法を併用することもできる。
【００４７】
本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法においては、通常、２回交差相同組換えが選択的に起こるような特別の配列や酵素の導入、あるいは非相同組換え活性の破壊を行わないため、選択マーカーで選抜後の変異株の中で、目的とする２回交差変異株の割合は極めて少ない。また、表現形の変化を利用した選抜も期待できない場合も十分予想される。そこで、本発明では、遺伝子マーカーの性質で選抜された変異株それぞれからＤＮＡを調製し、ＰＣＲやサザーン分析等を用いて直接遺伝子の構造変化を調べる二次選抜を実施する。この場合、目的とする変異株が１％の確率で含まれているとすると、少なくとも１００個の変異株の遺伝子を調べて選抜する。それが２００個以上また５００個であるとしても目的とする変異株を遺伝子構造の変化を調べることで選抜することになる。このため、公知の遺伝子抽出方法を用いることもできるが、生物体から簡便に遺伝子を抽出する技術として本発明者らが開発した「生物体から核酸を溶出する方法」（特開２００３−２４０６７号公報）や、細胞破砕による核酸抽出法（非特許文献１参照）を利用して、多数の生物体から簡便にＤＮＡを溶出・調製した後、さらにＰＣＲやサザーン法等で分析することで二次選抜を行うことが好ましい。なお、上記のように、変異株の表現形の変化があれば有用な情報となるが、広範囲遺伝子領域の改変を確実にモニターするためには遺伝子構造の変化を直接調べることが有効であり、本発明によって、極めて信頼性の高い変異株選抜法を確立することができる。
【００４８】
また、麹カビの場合は多核胞子が多いという問題があるが、その場合にも、一次選抜で得られた変異株から単核胞子を調製し、単核胞子のそれぞれからＤＮＡを抽出し、単核胞子由来の遺伝子構造の変化を直接調べることで、目的とする変異株の核を含む集落の選抜を行うことが好ましい。例えばＰＣＲを用いる場合には、ＰＣＲのプライマー配列として、選択マーカーの内部配列と、染色体上、導入遺伝子の相同配列より外側の配列を選ぶことにより、目的とする変異株の核があれば、ＰＣＲ産物が得られように計画する。いわゆる変異体の核のポジティブセレクションが可能になるように設計することが好ましい。そして、カビの胞子サイズは含まれる核の数によって異なるため、ポジティブセレクションで得られた変異株から胞子を調製し、単核胞子しか通さない小さなポアサイズの膜で胞子液をろ過し、ろ液中の胞子を寒天培地に広げ培養する。このようにして１つの核をもつ胞子から得られた集落（菌糸と胞子）からＤＮＡを調製し、ＰＣＲやサザーン法で遺伝子構造を調べ、目的の変異体を選抜することができる。
【００４９】
以上のように、本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法においては、通常、特殊な遺伝子配列の染色体上への導入も必要なく、また組換え酵素の発現も必要としない上に、特殊な宿主も必要とせず、少なくとも１個の選択マーカー遺伝子があればよく、操作は単純であり、目的の変異株の検出にも複雑な操作を必要としない。さらに、宿主由来の選択マーカー配列と遺伝子領域を利用すればセルフクローニングが可能であり、得られた生物の実用的利用の可能性が高い点が、本発明が奏する極めて有利な効果であるといえる。
【００５０】
上記本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法によって得られた欠失変異株には、ゲノム中で欠失した領域に選択マーカーが通常導入されている。しかし、得られた欠失変異株から選択マーカーを除去することもできる。例えば、選択マーカーが含まれない欠失カセット（欠失した遺伝子領域の５’及び３’側の外側の２つの領域を連結した構造）を構築し、これによって欠失株を形質転換すれば、５’及び３’側の外側の２つの領域で２回交差して、選択マーカーを含まない欠失株を得ることができる。この際、選択マーカーの性質を失った株（例えばピリチアミン感受性になった株）を選抜し、さらに遺伝子構造の変化（選択マーカー領域を含まなくて、ゲノム中の離れた遺伝子領域が連結した構造を持つこと）をＰＣＲで確認することで、選択マーカー除去株を選抜できる。これによって、異種遺伝子を含まず、目的とする遺伝子領域のみが欠失した変異株を得ることができる。かかる目的とする遺伝子領域のみが欠失した変異株も本発明の生産方法の対象に含まれる。
【００５１】
次に、本発明の変異株としては、糸状菌の染色体上で５ｋｂ以上の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域が、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域で置換されて欠失した広範囲遺伝子領域欠失変異株であれば特に制限されないが、糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター領域又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域である広範囲遺伝子領域欠失変異株が好ましく、上記５ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域の欠失が、好ましくは１５ｋｂ以上、より好ましくは３０ｋｂ以上、特に好ましくは５０ｋｂ以上や１００ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域の欠失である変異株を好適に例示することができる。また、選択マーカー遺伝子としては、上述の選択マーカー遺伝子を用いることができる。本発明の変異株は、前記本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法により得ることができる。
【００５２】
本発明はまた、アフラトキシン生産菌の遺伝子クラスターの全部又は一部が除去されたアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカスに関し、かかるアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカスとして、以下の実施例に記載されている変異株、特に、アフラトキシン遺伝子クラスター領域のｎｏｒＢとｈｙｐＡとの２つの遺伝子領域間の６７ｋｂ領域の欠失変異体であるアスペルギルス・パラジチカスＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０（Aspergillus parasiticus AF-/SYS-4(norB-hypA)No.408）を具体的に例示することができる。
【００５３】
また本発明は、アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域の全部又は一部が除去されたアスペルギルス・オリゼーに関し、かかるアスペルギルス・オリゼーの変異株としては、アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域のａｆｌＴとｍｏｘＹとの２つの遺伝子領域間の６０ｋｂ領域の欠失変異体であるアスペルギルス・オリゼーＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１（Aspergillus oryzae AF-/RIB(aflT-moxY)No.80-4）を具体的に例示することができる。
【００５４】
上記本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株や、アスペルギルス・パラジチカス（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０）等のアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカスや、アスペルギルス・オリゼー（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１）等のアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域の全部又は一部が除去されたアスペルギルス属菌は、アフラトキシン生産カビと競合することから、バイオコントロール剤として有利に用いることができる。
【００５５】
本発明の広範囲遺伝子領域欠失変異株のスクリーニングキットとしては、糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットと、前記広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを確認することができるプローブ又は少なくとも１対のプライマーセットとを備えたものであれば特に制限されず、プライマーセットとしては、以下の実施例に具体的に例示されているプライマーセットを有利に用いることができる。
【００５６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６．６ｋｂ領域の欠失（ピリチアミン耐性選択マーカーｐｔｒＡ遺伝子利用）］
（１）ｄｍｔＡ−ｐｔｒＡ−ｖｂｓ コンストラクトを有するｐＡＦ−ＤＤ１ベクターの作製
アフラトキシン遺伝子クラスターの２つの遺伝子ｄｍｔＡとｖｂｓを選び、これらの領域を利用して６．６ｋｂ遺伝子領域の除去ベクターｐＡＦ−ＤＤ１を作製した。すなわち、遺伝子破壊用ＤＮＡ断片の作製には、２ｋｂピリチアミン耐性遺伝子断片、１．６６ｋｂ ｄｍｔＡ遺伝子断片、１．７ｋｂ ｖｂｓ遺伝子断片をＰＣＲで増幅し、ｐＵＣ１９ベクター（プロメガ）に段階的に導入して作製した。ｄｍｔＡ遺伝子領域はA. parasiticus NRRL2999（ＳＹＳ−４株）のゲノムをテンプレートとして、以下の２種のプライマーを用いて増幅した。
＜プライマー＞
配列番号１：ｄｍｔＡ−ＰｓｔＩ−Ｆ：＃３２３：AAAACTGCAGGCTCAGCGACACATCTCC
配列番号２：ｄｍｔＡ−Ｒ：＃３２４：GAGCTTACCACGCCTACC
【００５８】
ｖｂｓ遺伝子領域はＳＹＳ−４株のゲノムをテンプレートとして、以下の２種のプライマーを用いて増幅した。
＜プライマー＞
配列番号３：ｖｂｓｐｒｏ−ＫｐｎＩ−Ｆ：＃２７４：GGGTACCTGTGTAGAAATGCTGCACAG
配列番号４：ｖｂｓ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ３：＃３２１：CGGAATTCGGC ATCGATATCGGCG
【００５９】
また、選択マーカーであるピリチアミン抵抗性遺伝子ｐｔｒＡは２種のプライマーを用い、プラスミドｐＰＴＲＩ（Takara）をテンプレートとしてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ酵素 (Toyobo)を用いた。ｐＡＦ−ＤＤ１の概略図を図１に示す。
＜プライマー＞
配列番号５：ＰＴＲＩ−ＫｐｎＩ−Ｆ：＃３１１： GGGGTACCGGGCAATTGATT ACGGGATCCCA
配列番号６：ＰＴＲＩ−ＰｓｔＩ−Ｒ２：＃３２２： AAAACTGCAGTGACGATGAGCCGCTCTTGC
【００６０】
形質転換するために、得られたｐＡＦ−ＤＤ１をＢｇｌIIで切断して、１．４ｋｂ ｄｍｔＡ領域と１．５ｋｂ ｖｂｓ領域に２ｋｂ ｐｔｒＡが挟まれた直鎖状ＤＮＡ断片を作り、アフラトキシン生産株ＳＹＳ−４株の形質転換に用いた。
【００６１】
（２）形質転換
カビの形質転換には、ポリエチレングリコールを用いたプロトプラストの形質転換法を利用した。
宿主としては、アフラトキシン生産ＳＹＳ−４株を用いた。このカビをＰＤＡ(potato Dextrose Agar）培地で培養し、胞子を採集した。
【００６２】
ピリチアミン選択マーカーを用いる場合には、ＳＹＳ−４株又はＮＲ−１株の胞子約１０８ 個を１００ｍｌＣＤ（Czapex-Dox）液体培地に接種し、２８℃で１８〜２０時間静置培養を行った。こうして発芽させた後、ガラスビーズ（直径０．６ｃｍ）を培養フラスコに加え、３０℃，１３０ｒｐｍの震とう培養でさらに２４時間培養した。菌糸を採集し、０．８Ｍ ＮａＣｌ水溶液で菌糸を２〜３回洗い、洗った菌糸に１０ｍｌの新しく作ったプロトプラスト化溶液（１５ｍｇ／ｍｌ Yatalase（Takara），１０ｍｇ／ｍｌ Cellulase Onozuka R-10 （Yakult Honsha），０．８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ phosphate buffer（ｐＨ６．０），１ｍＭ ＤＴＴ）を加え、３０℃で３〜４時間ゆっくりと震とうし、細胞壁を消化してプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト溶液をミラクロス（カルビオケム社）でろ過し、ろ液を更に４℃，２５００ｇ、５分間、遠心分離して回収した。
【００６３】
プロトプラストを氷冷した溶液１（０．８Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））で洗浄した後、２×１０８／ｍｌになるように溶液１に懸濁して、その量に対して０．２容量になるように溶液２ （４０％ＰＥＧ４０００，５０ｍＭ ＣａＣｌ２，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））を加え、静かに混合した。
【００６４】
形質転換は、０．１ｍｌのプロトプラスト溶液を新しい１５ｍｌチューブに移し、１５μｌ以下（３〜７μｇ）のｄｍｔＡ−ｐｔｒＡ−ｖｂｓの直鎖ＤＮＡを加え、氷上で３０分間放置した後、０．５ｍｌ溶液２を加えゆっくりと攪拌し、室温で２０分間放置した。５ｍｌ溶液１を加えて、混合した後４℃で２５００ｇの速度で５分間遠心を行った。プロトプラストを含んだ沈殿物を０．１ｍｌの溶液１に懸濁し、０．８Ｍ ＮａＣｌ及び０．１μｇ／ｌ pyrithiamine（ＰＴ）を含むＣＤ再生培地に広げ、さらに、その上に、３０℃まで冷却したＣＤ軟寒天培地を添加した後、固化させ、２８℃で４〜７日培養した。
【００６５】
（３）遺伝子領域欠失株の選抜
目的とする欠失株の選抜には（１）選択マーカーを利用した選抜と（２）ＰＣＲを利用した遺伝子構造の変化の検出、からなる２段階の方法を採用した。
１）まず、ピリチアミン（ＰＴ；pyrithiamine）を含むＣＤ再生培地で生育してきた株はピリチアミンに耐性株であり、つまりピリチアミン耐性遺伝子がゲノムに導入されていると考えられる。
２）しかし、生物に遺伝子を導入した場合、相同組換えと非相同組換えが起こり、生物によっては目的とする相同組換えの確率が極めて低いものがある。カビの場合も低いが、本発明では一箇所ではなく、選択マーカーを挟んで二箇所の配列で相同組換えが起こる必要があるため、その確率はきわめて低くなる。通常はピリチアミン耐性株の中で１〜２％以下の頻度でしか目的とする遺伝子欠失株は得られない。形態変化や生化学的代謝の変化などで指標となる顕著な変化がおこる場合は比較的選抜も容易であるが、このような顕著な変化が起こらない場合は困難である。また、ポジティブ−ネガティブセレクションを利用することも可能であるが、２種以上の選択マーカーが必要である。しかし、ポジティブ−ネガティブセレクションで選抜した場合にもすべてが目的の変異株とはならないため、最終的には遺伝子構造の変化を確認する必要がある。そこで、本発明では、欠失株を選抜する最も単純な方法として、以下のように得られた選択マーカー選抜株について、さらに遺伝子構造の変化をＰＣＲで調べることによって目的とする変異株を選抜した。
【００６６】
＜ＰＣＲ分析のための迅速ＤＮＡ抽出法＞
得られたピリチアミン耐性変異株の中で、選択マーカーを挟んで両側の配列で相同組換えが起きた目的とする変異株を選抜するため、少なくとも１００個以上のピリチアミン耐性株のそれぞれの集落から、胞子を含んだ少量の菌糸を爪楊枝等で採取し、１５０μｌ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒが入った２ｍｌ容量のチューブに入れる。さらに１５０μｌ ＴＥ−飽和フェノールを加え、同チューブにジルコニアビーズ（直径０．５ｍｍ，Ｎｉｋｋａｔｏ）を加えた。各チューブを震とう機（例えば、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ（Ｑ−ＢＩＯ １０１））にセットして、菌糸を破砕した。その後、得られた破砕液を４℃，１５，０００ｇ １５分間遠心し、ＤＮＡを含む水層（上清）を４倍に稀釈して、稀釈液を種々のプライマーを含んだＰＣＲ溶液に加えて反応させた。
【００６７】
ＰＣＲ反応は、通常０．５μｌの希釈ＤＮＡサンプルを、終量８μｌのＰＣＲ反応に用いた。８μｌのＰＣＲ反応液は、０．５μｌ稀釈ＤＮＡ抽出液、４μｌ ２×ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２．５μｌ Nuclease-free water、０．５μｌの２種の各プライマー（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）を含む。
【００６８】
ＰＣＲ反応は以下の条件で行い、ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルで電気泳動した。
［ＰＣＲ産物が２．５ｋｂ以下の場合］
１）９４℃ ５分
２）９４℃ ４０秒、５６℃ ４０秒、７２℃ ｎ分（ｎはターゲットフラグメントのサイズにより決定する）を１サイクルとして、３５サイクル
３）７２℃ １０分
［ＰＣＲ産物が２．５ｋｂ以上の長さの場合］
１）９４℃ ５分
２）９４℃ １分、５６℃ １分、７２℃ ｎ分を１サイクルとして、４０サイクル
３）７２℃ １０分
【００６９】
（４）遺伝子領域欠失の確認
ＰＣＲの結果を指標に目的とする形質転換体を選抜するが、カビ胞子は多核胞子を含んでいるため、選抜した変異株を安定な形質として維持するためには、菌の純化が必要である。そこで、３）までで選抜した変異株を更に単胞子分離と継代培養を３回繰り返して、変異株を純化した。その後、得られた変異株の菌体から、再度核酸を抽出し、以下の種々のプライマーを用いて、目的とした広範囲遺伝子領域破壊株であることを電気泳動にて確認した。結果を図２に示す。また、各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズを表１に示した。予想されるサイズのＰＣＲ産物の生成を電気泳動で確認した結果、ＳＹＳ−４株染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６．６ｋｂ領域の欠失が確認できた。例えば、図２の１の実験で、Ｐ７とＰ１２のプライマーをもちいてＰＣＲを行った場合、表１のＰ７／Ｐ１２から２．１４ｋｂのサイズのＰＣＲ産物が得られるはずであり、電気泳動の図２によると、１のａでは２．１４ｋｂのバンドが出ているが、１のｂ（ＳＹＳ−４株）では、予想したとおりバンドが生じないことがわかった。
【００７０】
＜プライマー＞
１．Ｐ７（配列番号７：＃４７：ｄｍｔＡ−Ｆ２）：GGTCCCTGAGCCAGGGGTATTTGTT
２．Ｐ８（配列番号８：＃２９７：ｖｂｓ−Ｒ１）：CCGCCTCAATCACGGC
３．Ｐ９（配列番号２：＃３２４：ｄｍｔＡ−Ｒ）：GAGCTTACCACGC CTACC
４．Ｐ１０（配列番号４：＃３２１：ｖｂｓ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ３） ： CGGAATTCGGCATCGATATCGGCG
５．Ｐ１１（配列番号６：＃３２２：ＰＴＲＩ−ＰｓｔＩ−Ｒ２）： AAAACTGCAGTGACGATGAGCCGCTCTTGC
６．Ｐ１２（配列番号５：＃３１１：ＰＴＲＩ−ＫｐｎＩ−Ｆ）： GGGGTACCGGGCAATTGATTACGGGATCCCA
７．Ｐ１３（配列番号９：＃３４０：ｏｍｔＡ−Ｒ１）：CCTTCCTCGCCTTTGCG
８．Ｐ１４（配列番号１０：＃３３９：ｏｍｔＡ−Ｆ１）： GGTGAGACGAAGAGCCC
９．Ｐ１５（配列番号１１：＃２６４：ｏｒｄＡ−Ｆ）：ATGATTTATAGCATAATTATTTGTGCG
１０．Ｐ１６（配列番号１２：＃２６５：ｏｒｄＡ−Ｒ）：CAAATCATCTGATTTCTGGCC
【００７１】
【表１】
【実施例２】
【００７２】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域４９ｋｂ領域の欠失（ピリチアミン耐性選択マーカーｐｔｒＡ遺伝子利用）］
（１）ｐｋｓＡ−ｐｔｒＡ−ｖｂｓ構造を有するｐＡＦ−ＤＤ２ベクターの作製
アフラトキシン遺伝子クラスターの両末端に近い遺伝子ｐｋｓＡとｖｂｓを選び、これらの領域を利用して４９ｋｂの広範囲な遺伝子領域の除去ベクターｐＡＦ−ＤＤ２を作製した。ｐＡＦ−ＤＤ２ベクターは、ｐＡＦ−ＤＤ１の１．６６ｋｂ ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩ ｄｍｔＡ配列を１．５ｋｂ ＨｉｎｄIIIＩ／ＰｓｔＩ ｐｋｓＡ ３’領域と入れ換えることにより作出した。ＨｉｎｄIII／ＰｓｔＩ ｐｋｓＡ ３’領域はＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、２種のプライマー（配列番号１７：ｐｋｓ−Ｆ２：＃３４１：GTGGTGCACTGCGTGTC、配列番号１８：ｐｋｓ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｒ：＃３４２：CCCCAAGCTTCCATGACCC GGTCGATC）を用いて増幅し、ＨｉｎｄIIIとＰｓｔＩで切断して、ベクターに導入した。得られたベクターの概略図を図３に示す。こうしてできたｐＡＦ−ＤＤ２をＸｍａＩで切断することによって直鎖にして、最終的に得られたｐｋｓＡ−ｐｔｒＡ−ｖｂｓ断片（２ｋｂ選択マーカーｐｔｒＡが１．３ｋｂ ｐｋｓＡ ３’領域と１．６ｋｂ ｖｂｓ断片に挟まれた構造）でアフラトキシン生産菌ＳＹＳ−４株を実施例１と同様にして形質転換した。
【００７３】
欠失変異株の検出は、ピリチアミン耐性株の内、アフラトキシンを産生しなくなった６菌株について、アフラトキシン産生遺伝子が確実に欠失しているか否かをａｄｈＡとｄｍｔＡの各プライマーの組合せを用いて先ずＰＣＲと電気泳動を実施した。ＰＣＲに用いたプライマーは、ａｄｈＡについては配列番号２９、３０を、ｄｍｔＡについては配列番号４５、４６を使用した。また電気泳動の結果を図４に示す。ｄｍｔＡ遺伝子の欠失が確認された１０１株と１０３株のうち１０３株について、さらに多くの遺伝子について欠失を確認した。結果を図５に示す。使用した菌株ＳＹＳ−４株では、ａｆｌＲからｖｅｒ１までの領域が重複し、この短い重複領域では機能しないことが明らかになっているが、ＰＣＲを行った場合には該領域がテンプレートとなってＰＣＲ産物が生じてしまう。しかしながら、その他の領域ではＰＣＲ産物が産生されていないことから、遺伝子クラスターの欠失が確認された。欠失の確認は、表２に示す、前記の各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズと電気泳動の結果を比較して行った。同時にアフラトキシン遺伝子クラスターが欠失した結果としてアフラトキシン生産性が無くなることを、紫外線写真法（図６）、薄層クロマトグラフィー（図７）で確認した。
【００７４】
＜プライマー＞
１．ｎｏｒ１遺伝子領域
配列番号１３：＃４３６（ｎｏｒ１−Ｆ）： CCATA CCGGGATGGACC
配列番号１４：＃４３７（ｎｏｒ１−Ｒ）：GCCCCGATGTAGTCTCC
２．ｆａｓ２（ｈｅｘＡ）遺伝子領域
配列番号１５：＃３５１（ｈｅｘＡ−Ｆ１）：CCTCCCTCGCTACCCCA
配列番号１６：＃３５２（ｈｅｘＡ−Ｒ１）：CTCCGAGCCTACGGTGC
３．ｆａｓ１（ｈｅｘＢ）遺伝子領域：
配列番号１７：＃３５４（ｈｅｘＢ−Ｆ１）：CTGCGGGTGGAGCTGCA
配列番号１８：＃３５３（ｈｅｘＢ−Ｒ１）：CAAGCTCCAAGGGCGGC
４．ａｆｌＲ遺伝子領域
配列番号１９：＃２６２（ａｆｌＲ−Ｆ）：ATGGTTGACCATATCTCCCC
配列番号２０：＃２６３（ａｆｌＲ−Ｒ）：CATTCTCGATGCAGGTAATC
５．ａｆｌＪ遺伝子領域
配列番号２１：＃４３８（ａｆｌＪ−Ｆ）：GAACCCTGGCGAGAGAC
配列番号２２：＃４３９（ａｆｌＪ−Ｒ）：CTGAGCGACTCGCATGG
６．ａｄｈＡ遺伝子領域
配列番号２３：＃１７５（ａｄｈＡ−Ｆ）：ATGGAAGTTCTGGAACAACC
配列番号２４：＃１７６（ａｄｈＡ−Ｒ）：TTAGGTTTTAAGGCAATGGCA
７．ｅｓｔＡ遺伝子領域
配列番号２５：＃４４０（ｅｓｔＡ−Ｆ）：CCTTTTGCCGGTCCGTG
配列番号２６：＃４４１（ｅｓｔＡ−Ｒ）：GCCTTAGCTACTCCCCC
８．ｎｏｒＡ遺伝子領域
配列番号２７：＃２５４（ｎｏｒＡ−Ｆ）：ATGGTTCTCCCTACTGCTCC
配列番号２８：＃２５５（ｎｏｒＡ−Ｒ）：TCATTTTGAGGCAGAACCAAAG
９．ｖｅｒ１遺伝子領域
配列番号２９：＃２０６（ｖｅｒ１−Ｆ）：ATGTCGGATAATCACCGTTTAG
配列番号３０：＃２０７（ｖｅｒ１−Ｒ）：TTATCGAAAAGCGCCACCAT
１０．ｖｅｒＡ遺伝子領域
配列番号３１：＃４４２（ｖｅｒＡ−Ｆ）：GTTTCGACTCCCTCGGC
配列番号３２：＃４４３（ｖｅｒＡ−Ｒ）：CTCATCGTACGCTGGCG
１１．ａｖｎＡ遺伝子領域
配列番号３３：＃４４４（ａｖｎＡ−Ｆ）：CATAGTCCCTGAGGCGG
配列番号３４：＃４４５（ａｖｎＡ−Ｒ）：GGTCCGATGCTGAACGG
１２．ｖｅｒＢ遺伝子領域
配列番号３５：＃４４６（ｖｅｒＢ−Ｆ）：GGTCCACTGCTATGGCG
配列番号３６：＃４４７（ｖｅｒＢ−Ｒ）：GCGTAGGCCAGATTGCG
１３．ａｖｆＡ遺伝子領域
配列番号３７：＃４４８（ａｖｆＡ−Ｆ）：GGTCACATACGCCCTCC
配列番号３８：＃４４９（ａｖｆＡ−Ｒ）：GAGGACATCAGACACGCC
１４．ｄｍｔＡ（ｏｍｔＢ）遺伝子領域
配列番号３９：＃３２３（ｄｍｔＡ−Ｆ）：GCTCAGCGACACATCTCC
配列番号２：＃３２４（ｄｍｔＡ−Ｒ）：GAGCTTACCACGCCTACC
１５．ｏｍｔＡ遺伝子領域
配列番号１０：＃３３９（ｏｍｔＡ−Ｆ１）：GGTGAGACGAAGAGCCC
配列番号９：＃３４０（ｏｍｔＡ−Ｒ１）：CCTTCCTCGCCTTTGCG
１６．ｏｒｄＡ遺伝子領域
配列番号１１：＃２６４（ｏｒｄＡ−Ｆ）：ATGA TTTATAGCATAATTATTTGTGCG
配列番号１２：＃２６５（ｏｒｄＡ−Ｒ）：CAAATCATCTGATTTCTGGCC
【００７５】
【表２】
【実施例３】
【００７６】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域４９ｋｂ領域の欠失］
（１）A. parasiticus ＮＲ−１株のｖｂｓ遺伝子破壊株の作製
John E. Linz博士 Michigan State Universityより供与されたA. parasiticus ＮＲ−１株のｖｂｓ遺伝子に、ｐｔｒＡ遺伝子を挿入することにより遺伝子破壊を行った。
アフラトキシン遺伝子クラスターのｖｂｓ領域に導入し、ｖｂｓ遺伝子破壊株を作製するためｐＶＢＳ−ＳＤ２を構築した。ｐＶＢＳ−ＳＤ２ベクターは、１．７ｋｂのｖｂｓ遺伝子領域断片を、ＫｐｎＩサイトを有する２種のプライマー（配列番号３：＃２７４：ｖｂｓｐｒｏ−ＫｐｎＩ−Ｆ：ＧＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧ、配列番号５８：＃２６８：ｖｂｓｉｎ−ＫｐｎＩ−Ｒ：ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＧＣＧ）とＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲをして増幅し、ＰＣＲ産物をＫｐｎＩで処理した後、ピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒAを持つｐＰＴＲＩベクターのＫｐｎＩサイトに導入して構築した。得られたベクターの概略図を図８に示す。こうして構築したｐＶＢＳ−ＳＤ２をＢｇｌIIで切断して直鎖にして、シングルクロスでＮＲ−１株を実施例１と同様にして形質転換した。
この結果により得られるｖｂｓ遺伝子破壊株では、ｐｔｒＡを挟んで２つのｖｂｓ類似領域が本来のｖｂｓ遺伝子よりも短いために、ｖｂｓの有する活性を失っている。そのため、ｖｂｓにより触媒される反応が正常に行われず、黄色い反応中間体が蓄積する。
その後、得られた変異株の菌体から、再度核酸を抽出し、以下の種々のプライマーを用いて、目的とした広範囲遺伝子領域破壊株であることを電気泳動にて確認した。結果を図９に示す。また、各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズを表３に示した。予想されるサイズのＰＣＲ産物の生成を電気泳動で確認した結果、ＮＲ−１株染色体のｖｂｓ遺伝子領域の破壊が確認できた。
【００７７】
＜プライマー＞
配列番号１１１：P1 (#194, vbs-dis-F)：CTGCCCAAAGGTGCTCTCC
配列番号１１２：P2 (#287, vbs-3’in-R)：GCGACACCGGCGGAAGG
配列番号１１３：P3 (#273, pPTRI-R1)：TTCCCAGTCACGACGTTG
配列番号１１４：P4 (#272, pPTRI-F1)：GTGTGGAATTGTGAGCGG
配列番号３：P5(#274,vbspro-KpnI-F)：GGGTACCTGTGTAGAAATGCTGCACAG
配列番号５８：P6 (#268, vbsin-KpnI-R)：GGGGTACCGGCATCGATATCGGCG
【００７８】
【表３】
【００７９】
（２）ｐｋｓＡ−ｎｉａＤ−ｖｂｓ構造を有するｐＡＦ−ＤＤ３ベクターの作製
ｐＡＦ−ＤＤ２ベクターと同様の構造で選択マーカーだけを硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤに代えた構造ｐＡＦ−ＤＤ３を作り、本発明が種々の選択マーカーを用いても有効であることを確認した。
ｎｉａＤ選択マーカーを用いた形質転換には、硝酸還元酵素に変異を持ち、硝酸を窒素源として利用できないA. parasiticus ＮＲ−１株、及び、前記ＮＲ−１株のｖｂｓ遺伝子破壊株を宿主として用いた。
プロトプラストの調製にはＰＤＢ（ポテトデキストロースブロス）培地を用い、形質転換後、硝酸を唯一の窒素源として加えた再生培地を用いた。
ｐＡＦ−ＤＤ３の構築には、まず、１．７ｋｂ ｖｂｓ領域を２種のプライマー（配列番号４０：ｖｂｓ−ＢａｍＨＩ−Ｆ：＃３５５：CGCGGATCCTGTGTA GAAATGCTGCACAG、配列番号４１：ｖｂｓ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ４：＃３５６: CGGAATTCGACCCTTACGCTGCTC）と、アフラトキシン生産菌ＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅した。そのＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ処理して、ｐＳＰ７２ベクター（Promega）の対応する部位に導入した。次に、形成したベクターに４．７ｋｂ ＳｐｈＩ／ＸｂａＩ選択マーカーｎｉａＤを導入した。選択マーカーｎｉａＤはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ酵素と２種のプライマー（配列番号４２：ｎｉａＤ−ＡｖｒＩＩ−Ｆ（ＸｂａＩサイトを内部に含む）：＃１５４：ACCCCCTAGGTCTAGAAGAGGCATTGTGTC、配列番号４３：ｎｉａＤ−ＳｐｈＩ−Ｒ：＃３２０：CCCACATGCATGCCCTATTAACGTTACTATTCGTG）と、プラスミドｐＳＬ８２をテンプレートとしてＰＣＲし増幅した。最後に、２ｋｂ ＸｈｏＩ／ＳｐｈＩ ｐｋｓＡ ５’領域を導入した。このｐｋｓＡ ５’領域は２種のプライマー（配列番号４４：ｐｋｓ−ＳｐｈＩ−Ｆ：＃３４３：CCCACATGCATGCATCCGTCCAGGACAGCC、配列番号４５：ｐｋｓ−ＸｈｏＩ−Ｒ：＃３４４：CCCCCGCTCGAGACGCCAAGGATGGGGTC）を用い、ＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使った。得られたベクターの概略図を図１０及び１１に示す。このようにしてできたｐＡＦ−ＤＤ３をＸｍａＩで切断し、直鎖のｐｋｓＡ−ｎｉａＤ−ｖｂｓコンストラクトを作った。このコンストラクトは１．６ｋｂ ｐｋｓＡ ５’領域と１．６ｋｂ ｖｂｓ領域に挟まれた４．７ｋｂ ｎｉａＤ選択マーカー遺伝子領域を含んでいる。この断片を、ピリチアミン耐性遺伝子を利用してｖｂｓ遺伝子が既に破壊されているｎｉａＤ欠損株A. parasiticus ＮＲ−1株（図１０）、及びｖｂｓには変異が入っていないｎｉａＤ欠損株ＮＲ−１株（John E. Linz博士 Michigan State Universityより供与された。）（図１１）に形質転換した。
【００８０】
ｖｂｓ遺伝子が既に破壊されているｎｉａＤ欠損株A. parasiticus ＮＲ−1株の形質転換体について、ｏｍｔＡ、ｆａｓ1の各遺伝子領域を対象に、実施例２で使用したプライマーを用いて同様に遺伝子欠失の確認を行った（図１２）。２３、３５、７６、１２４の各菌株が遺伝子欠失変異体であることが確認され、これらの菌株について、さらに多くの遺伝子の欠失を確認した（図１３）。実施例２と同様に、ａｆｌＲからｖｅｒ１までの領域が重複し、ＰＣＲを行った場合には該領域がテンプレートとなってＰＣＲ産物が生じてしまうが、その他の領域ではＰＣＲ産物が産生されていないことから、遺伝子クラスターの欠失が確認された。
また、ｖｂｓには変異が入っていないｎｉａＤ欠損株ＮＲ−１株の形質転換体についても同様にＰＣＲを行った結果、遺伝子クラスターの欠失が確認された。
【実施例４】
【００８１】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６７ｋｂ領域の欠失（ピリチアミン耐性選択マーカーｐｔｒＡ遺伝子利用）］
（１）ｎｏｒＢ−ｐｔｒＡ−ｈｙｐＡ の置換コンストラクトを有するｐＡＦ−ＷＤ４
アフラトキシン遺伝子クラスターの両末端に近い遺伝子ｎｏｒＢとｈｙｐＡを選び、これらの領域を利用して広範囲な遺伝子領域の除去ベクターｐＡＦ−ＤＤ４を同様な方法を用いて作製し、同様なプライマーを用いて遺伝子クラスターの欠失を確認した。
ｐＡＦ−ＷＤ４ベクターの作製では、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ３’−ｎｏｒＢ領域はＳＹＳ−４株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、２種のプライマー（配列番号４６：ｎｏｒＢ−Ｌ−ＸｈｏＩ−Ｒ：＃４９８： CCCCCGCTCGAGTGGTATTGAAACAGAGCGTG、配列番号４７：ｎｏｒＢ−Ｆ１：＃５２５： ATGTCCACCTCAGCTCCC）を用いて増幅し、ｐｔｒＡ遺伝子が導入されたｐＳＰ７２ベクターに導入した。５’ｈｙｐＡ領域は、２種のプライマー（配列番号４８：ｈｙｐＡ−Ｒ−ＫｐｎＩ−Ｆ：＃４９６：CGGGGTACCCGTATCTCAGTTATGCAATGTCTC、配列番号４９：ｈｙｐＡ−Ｒ−Ｒ：＃４９７：AAGTCCAATGCCGTCAAC）を用いて増幅し、更にベクターに導入した。得られたベクターの概略図を図１４に示す。こうして得られたベクターをＸｃｍＩで切断し、３’ｎｏｒＢ−ｐｔｒＡ−５’ｈｙｐＡ断片をアフラトキシン生産菌ＳＹＳ−４株に上述したように形質転換した。ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。
【００８２】
＜プライマー＞
１．ｎｏｒＢ遺伝子領域
配列番号４７：＃５２５（ｎｏｒＢ−Ｆ１）：ATGTCCACCTCAGCTCCC
配列番号５０：＃５２６（ｎｏｒＢ−Ｒ１）：CATGGTTGAGGACGAATCG
２．ｃｙｐＡ遺伝子領域
配列番号５１：＃５００（ｎｏｒＢ−Ｒ−ＫｐｎＩ−Ｆ）：CGGGGTACCTGTGGATTCGTGAGTGTC
配列番号５２：＃５２８（ｃｙｐＡ−Ｒ）：AATCCGCCAACCCAGTC
３．ａｆｌＴ遺伝子領域
配列番号５３：＃６１０（ａｆｌＴ−Ｆ）：ATGCTAATCGACGAGGCTG
４．ｐｋｓＡ遺伝子領域
配列番号４５：＃３４４（ｐｋｓ−ＸｈｏＩ−Ｒ）：CCCCCGCTCGAGACGCCAAGGATGGGGTC
配列番号５４：＃３６０（ｐｋｓ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ）：CGGAATTCCTCAGACAAGGCGTCCG
５．ｎｏｒ１遺伝子領域
配列番号１３：＃４３６（ｎｏｒ１−Ｆ）： CCATA CCGGGATGGACC
配列番号１４：＃４３７（ｎｏｒ１−Ｒ）：GCCCCGATGTAGTCTCC
６．ｆａｓ２遺伝子領域
配列番号１５：＃３５１（ｈｅｘＡ−Ｆ１）：CCTCCCTCGCTACCCCA
配列番号１６：＃３５２（ｈｅｘＡ−Ｒ１）：CTCCGAGCCTACGGTGC
７．ｆａｓ１遺伝子領域
配列番号１７：＃３５４（ｈｅｘＢ−Ｆ１）：CTGCGGGTGGAGCTGCA
配列番号１８：＃３５３（ｈｅｘＢ−Ｒ１）：CAAGCTCCAAGGGCGGC
８．ａｆｌＲ／ａｆｌＲ２遺伝子領域
配列番号１９：＃２６２（ａｆｌＲ−Ｆ）：ATGGTTGACCATATCTCCCC
配列番号２０：＃２６３（ａｆｌＲ−Ｒ）：CATTCTCGATGCAGGTAATC
９．ａｆｌＪ／ａｆｌＪ２遺伝子領域
配列番号２１：＃４３８（ａｆｌＪ−Ｆ）：GAACCCTGGCGAGAGAC
配列番号２２：＃４３９（ａｆｌＪ−Ｒ）：CTGAGCGACTCGCATGG
１０．ａｄｈＡ／ａｄｈＡ２遺伝子領域
配列番号２３：＃１７５（ａｄｈＡ−Ｆ）：ATGGAAGTTCTGGAACAACC
配列番号２４：＃１７６（ａｄｈＡ−Ｒ）：TTAGGTTTTAAGGCAATGGCA
１１．ｅｓｔＡ／ｅｓｔＡ２遺伝子領域
配列番号２５：＃４４０（ｅｓｔＡ−Ｆ）：CCTTTTGCCGGTCCGTG
配列番号２６：＃４４１（ｅｓｔＡ−Ｒ）：GCCTTAGCTACTCCCCC
１２．ｎｏｒＡ／ｎｏｒＡ２遺伝子領域
配列番号２７：＃２５４（ｎｏｒＡ−Ｆ）：ATGGTTCTCCCTACTGCTCC
配列番号２８：＃２５５（ｎｏｒＡ−Ｒ）：TCATTTTGAGGCAGAACCAAAG
１３．ｖｅｒ−１／ｖｅｒ−１Ｂ遺伝子領域
配列番号２９：＃２０６（ｖｅｒ１−Ｆ）：ATGTCGGATAATCACCGTTTAG
配列番号３０：＃２０７（ｖｅｒ１−Ｒ）：TTATCGAAAAGCGCCACCAT
１４．ｖｅｒＡ遺伝子領域
配列番号３１：＃４４２（ｖｅｒＡ−Ｆ）：GTTTCGACTCCCTCGGC
配列番号３２：＃４４３（ｖｅｒＡ−Ｒ）：CTCATCGTACGCTGGCG
１５．ａｖｎＡ遺伝子領域
配列番号３３：＃４４４（ａｖｎＡ−Ｆ）：CATAGTCCCTGAGGCGG
配列番号３４：＃４４５（ａｖｎＡ−Ｒ）：GGTCCGATGCTGAACGG
１６．ｖｅｒＢ遺伝子領域
配列番号３５：＃４４６（ｖｅｒＢ−Ｆ）：GGTCCACTGCTATGGCG
配列番号３６：＃４４７（ｖｅｒＢ−Ｒ）：GCGTAGGCCAGATTGCG
１７．ａｖｆＡ遺伝子領域
配列番号３７：＃４４８（ａｖｆＡ−Ｆ）：GGTCACATACGCCCTCC
配列番号３８：＃４４９（ａｖｆＡ−Ｒ）：GAGGACATCAGACACGCC
１８．ｄｍｔＡ／ｄｍｔＡ２遺伝子領域
配列番号５５：＃１５３（ａｖｆＡ−Ｒ−ＮｏｔＩ）： AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGGTCCTTTTAGGTACAGC
配列番号５６：＃４７９（ａｖｆＡ−ｌｅｆｔ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ）：CCCAAGCTTGCCCTAGCTATGGTTGAG
１９．ｖｂｓ遺伝子領域
配列番号５７：＃２６７（ＶＢＳｉｎ−ＫｐｎＩ−Ｆ）：GGGGTACCGGATGGCCTGGGCAGT
配列番号５８：＃２６８（ＶＢＳｉｎ−ＫｐｎＩ−Ｒ）：GGGGTACCGGCATCGATATCGGCG
２０．ｃｙｐＸ遺伝子領域
配列番号５９：＃４３４（ｃｙｐＸ−Ｆ１）：CGCAAGATTCCTGGTCCC
配列番号６０：＃４３５（ｃｙｐＸ−Ｒ１）：CCAGCTAGGAGCAACGC
２１．ｍｏｘＹ遺伝子領域
配列番号６１：＃４３２（ｍｏｘＹ−Ｆ１）：GAAGACCGCGGAGAATGG
配列番号６２：＃４３３（ｍｏｘＹ−Ｒ１）：GGCCCAATGACACTGCC
２２．ｏｒｄＢ遺伝子領域
配列番号６３：＃４９４（ｈｙｐＡ−Ｌ−ＳａｌＩ−Ｒ）：AACGCGTCGACGGTTCTGCTTGGCTGGG
配列番号６４：＃４５５（ｍｏｘＹ−Ｒ−Ｒ）：CGCTGGAGGATGTCTCG
２３．ｈｙｐＡ遺伝子領域
配列番号５１：＃５００（ｎｏｒＢ−Ｒ−ＫｐｎＩ−Ｆ）：CGGGGTACCTGTGGATTCGTGAGTGTC
配列番号５２：＃５２８（ｃｙｐＡ−Ｒ）：AATCCGCCAACCCAGTC
２４．Ｐ１／Ｐ２遺伝子領域
配列番号６５：＃５２７（ｎｏｒＢ−Ｒ２）：CAATATTTCATCTGCTGTTTCC
配列番号６６：＃４７０（ＰＴＲＩ−Ｆ）：GCAAGAGCGGCTCATCGTCA
２５．Ｐ３／Ｐ４遺伝子領域
配列番号６７：＃４６９（ＰＴＲＩ−Ｒ）：TGGGATCCCGTAATCAATTGCCC
配列番号６８：＃５３０（ｎａｄＡ−Ｒ）：GACTGATAAGGGAGCCGC
【００８３】
遺伝子欠失の確認は、表４に示した前記の各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズと電気泳動の結果を比較して行った。表４に示した各遺伝子を対象にＰＣＲを行った結果、４０８株が、アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６７ｋｂ領域の欠失変異体であることが確認された。この４０８株は、“Aspergillus parasiticus AF-/SYS-4(norB-hypA)No.408” の表示で、平成１８（２００６）年７月２６日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受領されている。受領番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０である。
【００８４】
【表４】
【実施例５】
【００８５】
［アスペルギルス・パラジチカス染色体のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６７ｋｂ領域の欠失（ｎｉａＤ遺伝子利用）］
上記と同様な手法で３’ｎｏｒＢ−ｎｉａＤ−５’ｈｙｐＡ断片を構築し、ｎｉａＤ欠損株ＮＲ−１株に形質転換した。上記と同様にＰＣＲを行った結果、遺伝子クラスターの欠失を確認することができた。
【実施例６】
【００８６】
［アフラトキシン生産菌のアフラトキシン遺伝子クラスター欠失株のバイオコントロール剤としての機能の確認］
アフラトキシン生産菌のアフラトキシン遺伝子クラスター欠失株は、アフラトキシン生産菌のバイオコントロール剤として利用できる。実際に、アフラトキシン生産について競合することを、チップ培養法（１ｍｌのピペットマンチップの先端をシールし培養器として用いた。中に０．２５ ｍｌのＹＥＳ（２％酵母エキス、２０％蔗糖）液体培地を入れ、種々の割合で胞子を接種した。
平均３５５０コ（左側）又は３５．５コ（右側）のアフラトキシン生産株ＳＹＳ−４株の胞子と、平均１２０００コ、１２００コ、１２０コ、１２コ、１．２コ及び０コの、実施例２で得られた１０３番株の胞子を同時にチップ中の０．２５ｍｌ培地に接種し、２８℃ 、４日培養した後、培養液１０マイクロリットルをシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０，ｎｏ．５７２１；Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）にスポットし、展開溶液（クロロホルム：酢酸エチル：９０％ギ酸（６：３：１ｖｏｌ／ｖｏｌ／ｖｏｌ））を用いて展開した。アフラトキシンは紫外線（３６５ｎｍ）を照射して観察した。結果を図１５（Ａ）に示す。
ＡＦ１０３株を接種後、１日たってからＳＹＳ−４株の胞子を同様に接種し、それから４日後、培養液を同様に分析した。結果を図１５（Ｂ）に示す。その結果、ＡＦ１０３株がアフラトキシン生産に関してアフラトキシン生産カビと競合することが確認された。
【実施例７】
【００８７】
［麹カビ基準菌株ＲＩＢ４０のアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域６０ｋｂ領域の欠失］
（１）麹カビ（Aspergillus oryzae）の遺伝子についてａｆｌＴ−ｐｔｒＡ−ｍｏｘＹコンストラクトを有するｐＡＦ−ＤＤベクターの作製
１）ベクターの作製と形質転換
ｐＡＦ−ＤＤベクターは、２ｋｂ ＫｐｎＩ／ＰｓｔＩ ピリチアミン耐性遺伝子ｐｔｒＡと１．５ｋｂ ＢｇｌII／ＫｐｎＩ ａｆｌＴホモログ遺伝子断片、１．６ｋｂ ＨｉｎｄIII／ＸｈｏＩ ｍｏｘＹホモログ遺伝子断片をｐＳＰ７２（Promega）に段階的に導入することによって作製した。麹カビのａｆｌＴホモログ領域とｍｏｘＹホモログ領域はA. oryzaeＲＩＢ４０株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、以下のように、適当な制限酵素部位を導入したプライマーを用いてＰＣＲを行い増幅した。得られたベクターの概略図を図１６に示す。
【００８８】
＜プライマー＞
１．ａｆｌＴ断片のプライマー
配列番号６９：ｏｒｙｚａｅＬ−ＢｇｌＩＩ−Ｆ：＃３６８：GAAGATCTGGCGTGCTCCTCATCAC
配列番号７０：ｏｒｙｚａｅＬ−ＫｐｎＩ−Ｒ：＃３６９：GGGGTACCGTC GGGGATCGTTTCGG
２．ｍｏｘＹ断片のプライマー
配列番号７１：ｏｒｙｚａｅＲ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｆ：＃３７０：CCCCAAGCTTCCTGGGGTCAAGACGTC
配列番号７２：ｏｒｙｚａｅＲ−ｘｈｏＩ−Ｒ：＃３７１： CCCCCGCTCGAGCTCTACTCCGTCACCGC
３．選択マーカー（ｐｔｒＡ）断片のプライマー
配列番号５：ＰＴＲＩ−ＫｐｎＩ−Ｆ：＃３１１：GGGGTACCGGGCAATTGATTACGGGATCCCA)
配列番号６：ＰＴＲＩ−ＰｓｔＩ−Ｒ２：＃３２２：AAAACTGCAGTGACGATGAGCCGCTCTTGC
【００８９】
この場合ｐＰＴＲＩ（Takara）をテンプレートとして用いた。その後、ｐＡＦ−ＤＤをＢｓｐＨＩとＸｍａＩで処理して、１．５ｋｂ ａｆｌＴと１．５ｋｂ ｍｏｘＹ領域を２ｋｂのｐｔｒA領域を挟むように導入し、その後、カセット構造領域を直鎖ＤＮＡ断片（図１７）にして、麹カビＲＩＢ４０株を形質転換した。
【００９０】
２）麹カビにおいて変異体の選抜と特記すべき留意点
ピリチアミン耐性株を選抜した後、多数の株からＤＮＡを抽出し、ｖｂｓプライマー（配列番号７３：＃３９２（ｏｒｙｚａｅ−ｖｂｓ−Ｆ１）： CGCGGTCAGCTGCTTC、配列番号７４：＃３９３（ｏｒｙｚａｅ−ｖｂｓ−Ｒ）：GACTGTGGCTCTCGACC）を用いてＰＣＲを行い、ＲＩＢ４０野生株のＤＮＡを用いたときと比較してＰＣＲ産物のバンドの強度が顕著に減少又は欠失している株は目的の欠失株であることが予想された。しかし、麹カビの胞子は核を複数含む多核胞子が多いため、スクリーニングとしてさらに、プライマーＰ２（配列番号７５：＃１８１（ｐｔｒＡ−Ｆ１）：CCACTGTGGCCGCTACC) とプライマーＰ５（配列番号７６：＃４５８（ｏｒｙｚａｅＲ−Ｒ１）：AGTTGGGCATCTCGGGC)を用いてＰＣＲを行った。プライマーＰ２は選択マーカー遺伝子ｐｔｒＡの内部配列を有し、プライマーＰ５はカビの染色体上ｍｏｘＹホモログ領域の外側にあるため、野生株ではこれらのプライマーを用いてもバンドが出ない。それに対して、目的とする欠失株では、３ｋｂのＰＣＲ産物が得られるはずであるため、それを指標として欠失株を選抜した。
【００９１】
さらに、麹カビの胞子は多核の割合が多いため、単胞子分離によっては形質の純化が容易ではなかった。そこで、麹カビの場合は、継代を繰り返すだけでなく、単胞子分離の際に一つの核だけを有する単核胞子を選抜し、単核胞子の継代を繰り返した。胞子の大きさは含む核の数が多いほど大きいため、他の研究者によって報告されたような以下の方法を用いて小さな単核胞子を選抜した。胞子全体の直径は４〜９μｍであり、平均は約７μｍであるのに対し、単核胞子は通常４− ７μｍの直径を有し、最も多いのが約５μｍ直径である。そこで、胞子液を５μｍサイズの穴を有した限外ろ過膜でろ過して、膜を通過して回収される小さな胞子を選抜した。つまり、ＰＣＲによって目的とする変異を有すると予想される形質転換体の集落から胞子を採集し、ろ過後、胞子液を含むろ液をＧＹ寒天培地に広げ、単一胞子由来の集落についてＰＣＲを行って目的とする欠失変異株であることを確認し、さらに同様の純化を繰り返した。この純化を少なくとも３回繰り返して、すべての集落が目的とする変異体を生じることを確認して変異株を確立した。
【００９２】
３）ＰＣＲ分析によるアフラトキシン遺伝子クラスター領域の欠失の確認
得られた変異株のゲノム上アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域がすべて欠失していることは、変異株のＤＮＡと野生株ＲＩＢ４０のＤＮＡをそれぞれ調製して、以下の種々のプライマーを用いてＰＣＲにより確認した。その結果得られた欠失変異体＃８０−４株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１）について、さらに詳細な遺伝子欠失を確認した。電気泳動の結果を図１８に示す。欠失の確認は、表５に示す、前記の各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズと電気泳動の結果を比較して行った。その結果、＃８０−４株が、アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域６０ｋｂ領域の欠失変異体であることが確認された。この＃８０−４株は、“Aspergillus oryzae AF-/RIB(aflT-moxY)No.80-4” の表示で、平成１８（２００６）年７月２６日（受領日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受領されている。受領番号は、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１である。
【００９３】
＜プライマー＞
１．ｐｋｓＡ遺伝子
配列番号７７：＃３７３（ｏｒｙｚａｅ−ｐｋｓＡ−Ｆ）： GGGGTACCCCGGACCCAGCTATACC
配列番号７８：＃３７２（ｏｒｙｚａｅ−ｐｋｓＡ−Ｒ）： GAAGATCTC CAGCATGGCATGCGTC
２．ｎｏｒ１遺伝子
配列番号７９：＃４５９（ｏｒｙｚａｅ−ｎｏｒ１−Ｆ）： GCACGGTCAAGAGAGGC
配列番号８０：＃４６０（ｏｒｙｚａｅ−ｎｏｒ１−Ｒ）： GGATAACGAAGTGCCCCG
３．ｆａｓ２ 遺伝子
配列番号８１：＃３９６（ｏｒｙｚａｅ−ｆａｓ２−Ｆ）： CGAAGTCATGGGCTCGG
配列番号８２：＃３９７（ｏｒｙｚａｅ−ｆａｓ２−Ｒ）： GGCGCACTTCAGAGTCG
４．ｆａｓ１遺伝子
配列番号８３：＃４２６（ｏｒｙｚａｅ−ｆａｓ１−Ｆ）： CATTCCCTGTCCGCTGG
配列番号８４：＃４２７（ｏｒｙｚａｅ−ｆａｓ１−Ｒ）： GGAACTACCCGCAGCTC
５．ａｆｌＲ遺伝子
配列番号８５：＃４６１（ｏｒｙｚａｅ−ａｆｌＲ−Ｆ）： CAGGTCGGAACAGGGAC
配列番号８６：＃４６２（ｏｒｙｚａｅ−ａｆｌＲ−Ｒ）： CACCTTCTTGCAGGCGC
６．ｖｅｒ１遺伝子
配列番号８７：＃４６３（ｏｒｙｚａｅ−ｖｅｒ１−Ｆ）： GCATGTCCGACAACCACC
配列番号８８：＃４６４（ｏｒｙｚａｅ−ｖｅｒ１−Ｒ）： CTGCGTCAGATGCCAGG
７．ａｖｆＡ遺伝子
配列番号８９：＃４２８（ｏｒｙｚａｅ−ａｖｆＡ−Ｆ）： CCTTCGGTGTGCGTTCC
配列番号９０：＃４２９（ｏｒｙｚａｅ−ａｖｆＡ−Ｒ）： GCAGTAGGACTCCCCAG
８．ｏｍｔＡ遺伝子
配列番号９１：＃４３０（ｏｒｙｚａｅ−ｏｍｔＡ−Ｆ）： GCGACTTCCCAGCTCTC
配列番号９２：＃４３１（ｏｒｙｚａｅ−ｏｍｔＡ−Ｒ）： CCACTCCTTGGGAGACC
９．ｏｒｄＡ遺伝子
配列番号９３：＃４２４（ｏｒｙｚａｅ−ｏｒｄＡ−Ｆ）： GGACGACCTTCGCTTCC
配列番号９４：＃４２５（ｏｒｙｚａｅ−ｏｒｄＡ−Ｒ）： CCATGGGGTCGTGGTAG
１０．ｖｂｓ遺伝子
配列番号７３：＃３９２（ｏｒｙｚａｅ−ｖｂｓ−Ｆ１）： CGCGGTCAGCTGCTTC
配列番号７４：＃３９３（ｏｒｙｚａｅ−ｖｂｓ−Ｒ）： GACTGTGGCTCTCGACC
１１．ｃｙｐＸ遺伝子
配列番号９５：＃４６７（ｏｒｙｚａｅ−ｃｙｐＸ−Ｆ）： CATGACCATGCTCTCCGG
配列番号９６：＃４６８（ｏｒｙｚａｅ−ｃｙｐＸ−Ｒ）： GGTATGCACGCCTGACG
配列番号６７（Ｐ１）：＃４６９：ｐｔｒＡ−Ｒ： TGGGATCCCGTAATCAATTGCCC.
配列番号６６（Ｐ３）：＃４７０：ｐｔｒＡ−Ｆ： GCAAGAGCGGCTCATCGTCA
配列番号９７（Ｐ４）：＃４６５：ｏｒｙｚａｅＬ−Ｆ１： GTGACCTGGCGATGGTG
配列番号７６（Ｐ５）：＃４５８：ｏｒｙｚａｅＲ−Ｒ１： AGTTGGGCATCTCGGGC
【００９４】
【表５】
【実施例８】
【００９５】
麹カビ（Aspergillus oryzae）は発酵食品産業上重要な生物である。本発明によってアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域を欠失しても産業上重要な酵素活性に影響せず、実用上問題ないことについて検討を行った。
【００９６】
［酵素活性に対する影響］
１．材料
３種類の原料を用い、以下のように培養後、それぞれの麹について酵素活性を測定した。
１）α化米の作製
９０％精白米（国産米）を十分に吸水させた後、定法に従い水切り・蒸しを行った。蒸気を軽く抜いた後、９０℃の通風乾燥機で１８時間乾燥し、α化米とした。乾燥途中に数回手入れを行って固まりをほぐし、乾燥終了後には５ミリ程度のアミで固まりを取り除いた。
２）α化麦の作製
約６５％精麦の国産大麦を１時間浸せき後、２時間水切りを行った。その後の処理はα化米と同様に実施した。
３）α化米・α化麦麹
滅菌した３００ｍｌ容三角フラスコ（メリクロン）にα化米・α化麦２０ｇを分注し９０℃２時間殺菌した。冷却後、原料１ｇあたり１×１０６個の分生子を接種し、殺菌水１０ｍｌを添加、よく攪拌した。十分に吸水したのを確認した後、再度攪拌して、培養を開始した。
培養は４２時間、恒温機を用いて３０℃で行った。培養中１８時間目、３２時間目に攪拌を行い、水分及び品温の均一化を図った。
４）醤油麹
脱脂大豆に重量に対して１３０％の水を加え、十分に攪拌した。これを３００ｍｌ容三角フラスコ（メリクロン）に１０ｇ分注し、割砕小麦６ｇを加え１ｋｇ／ｃｍ２ ２０分で蒸煮を行った。冷却後、分生子を原料重量あたり１×１０６個接種し、恒温恒湿機（タバイエスペック株式会社、ＰＲ−４ＳＰ）を用いて、製麹を行った。培養条件は、２４時間まで２８℃、以後２５℃で管理し、培養４２時間目に出麹とした。途中、２４時間目、３２時間目に麹を撹拌し、水分及び品温の均一化を図った。
【００９７】
２．分析法
（１）粗酵素液の抽出
培養した麹１０ｇに０．５％ＮａＣｌ水溶液５０ｍｌを加え、室温で３時間酵素（時々攪拌）を抽出した。次いで、東洋ろ紙Ｎｏ．５Ｃにてろ過を行い、得られた上澄液を定法に従い透析して粗酵素液とした。これを適宜希釈して酵素活性を測定した。
（２）酵素活性の測定
１）プロテア−ゼ
国税庁所定分析法注解（第４回改定国税庁所定分析法注解 注解編集委員会編（日本醸造協会，東京），ｐ．２２３（１９９３）．）に準じて，Ｈａｍｍａｒｓｔｅｉｎのミルクカゼイン（Ｍｅｒｃｋ社）２％溶液を基質として，反応温度３８℃，反応ｐＨ３．０（酸性）、６．０（中性）における活性を測定した。活性の表示は３８℃１分間にＬ−チロシン１μｇを生ずる酵素量を１単位とした。
２）酸性カルボキシペプチダーゼ
国税庁所定分析法注解（第４回改定国税庁所定分析法注解 注解編集委員会編（日本醸造協会，東京），ｐ．２２６（１９９３）．）に準じて、０．５ｍＭＣｂｚ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ溶液を基質として，反応温度３０℃，反応ｐＨ３．０における活性を測定した。３０℃６０分間にチロシン１μｇを遊離する酵素量を１単位とした。
３）α−アミラ−ゼ
国税庁所定分析法注解に（第４回改定国税庁所定分析法注解 注解編集委員会編（日本醸造協会，東京），ｐ．２１８（１９９３）．）に準じて，可溶性デンプン１％溶液を基質として反応温度４０℃，ｐＨ５．０における活性を測定した。活性は４０℃３０分間に１％可溶性デンプン１ｍｌを分解する酵素量を１単位（Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ値）とした。
４）グルコアミラーゼ
国税庁所定分析法注解に（第４回改定国税庁所定分析法注解 注解編集委員会編（日本醸造協会，東京），ｐ．２１３（１９９３）．）準じて，可溶性デンプン２％溶液を基質として反応温度４０℃，ｐＨ５．０における活性を測定した。活性は４０℃１時間に１ｍｇのグルコースを遊離する酵素量を１単位とした。
５）ホスファタ−ゼ
難波らの方法に（難波康之助・戸塚 昭・伊藤 清：醸協，７２，８９３ （１９７７）．）より準じて，１０ｍＭ p-Nitrophenyl phosphate disodium溶液を基質として反応温度３０℃，反応ｐＨ５．０における活性を測定した。活性は３０℃１時間に１μＭのp-Nitrophenolを遊離する酵素量を１単位とした。
６）ペクチン糖化力
０．５％ペクチン（リンゴ由来、Ｗａｋｏ（株）製）溶液を基質として反応温度４０℃，反応ｐＨ４．０における活性を測定した。活性は４０℃で１時間にガラクツロン酸１μｇを遊離する酵素量を１単位とした。
７）ペクチン酸糖化力
１％ポリガラクツロン酸（オレンジ由来、Ｓｉｇｍａ（株）製）溶液を基質として反応温度４０℃、反応ｐＨ４．０における活性を測定した．活性は４０℃で１時間にガラクツロン酸１μｇを遊離する酵素量を１単位とした。
８）β−グルコシダーゼ
太田らの方法（太田剛雄・下条寛和・橋本憲治・近藤洋大・佐無田隆・大場敬輝：醸協，８６，５３６ （１９９１）．）に準じて、４ｍＭ p-Nitrophenyl -β-D-glucoside溶液を基質として反応温度３７℃，反応ｐＨ５．０における活性を測定した。活性は３７℃、１分間に１μＭのp-Nitrophenolを遊離する酵素量を１単位とした。
【００９８】
３．結果
上記項目に関する分析項目について、野生型麹カビＲＩＢ４０株及び実施例７で得られた遺伝子欠損株ＲＩＢ４０（＃８０−４）を用いて検討した。結果を表６に示す。麹の酵素活性では、遺伝子欠損株において有意な差はみられなかった。
【００９９】
【表６】
【０１００】
［胞子着生量の検討］
１．種麹作製試験
９７％精白米（国産米）を十分に吸水させ、定法に従い水切り・蒸しを行った。冷却後、３００ｍｌ容三角フラスコ（メリクロン）に２０ｇ分注し１ｋｇ／ｃｍ２ １分殺菌した。
麹菌としては、野生型のＲＩＢ４０及び前記実施例欠失変異体ＲＩＢ４０（＃８０−４）を使用した。
麹菌の接種は麹菌を培養した斜面培地から数ミリを切り取り、それをフラスコに入れ、よく攪拌した。
培養は、培養２４時間まで恒温恒湿機（タバイエスペック株式会社、ＰＲ−４ＳＰ）を用いて、温度３０℃、ＲＨ９８％の条件で、以後出麹（培養は７日間）まで３０℃の恒温機で行った。培養２４時間目に麹を撹拌し、水分及び品温の均一化を図った。
培養終了後、３５℃で１８時間乾燥した麹（種麹）１００ｇを１２０メッシュの篩いにかけ、アミを通過した分生子を回収、重量を測定した。分生子数はしょうゆ試験法（しょうゆ試験法 しょうゆ試験法編集委員会編：、（日本醤油研究所、東京）、ｐ．２７５（１９８５））に従い、トーマ氏血球計を用いて測定した。
【０１０１】
２．結果
上記の方法により種麹を作製し、種麹１００ｇあたりの胞子量を測定した値を胞子収量とした。野生型ＲＩＢ４０では８．０ｇ、遺伝子欠損型ＲＩＢ４０（＃８０−４）では７．２ｇであった。
【実施例９】
【０１０２】
［フザリウム属菌の広範囲遺伝子領域の欠失］
フザリウム属の株は、畑等の土壌に多く成育し、特に麦やとうもろこしについてカビ毒を作る。これらが生産するカビ毒は、トリコテセン系カビ毒やゼアラレノンなど多くの種類がある。この中でトリコテセン系カビ毒であるデオキシニバレノールとニバレノール及びゼアラレノンは、日本、カナダ、アメリカ、フランス、イギリスなど多くの国で麦類を汚染していることがわかり、大きな問題となっている。フザリウム属菌のトリコテセン生合成の分子レベルでの概要は既に解明され、フザリウム・グラミネラム（Fusarium graminearum）の全ゲノム配列も公開された。トリコテセンの生産に関与する種々の遺伝子は遺伝子クラスターを形成していることが明らかになっている。フザリウム・グラミネラムの主要な遺伝子クラスター（Ｔｒｉ５クラスター）は、１０個のＯＲＦを含んでおり、機能が明らかになっている遺伝子もある。そこで、遺伝子クラスター領域の欠失株の作出を本発明の手法を用いて行った。その結果、３種の遺伝子、Ｔｒｉ１１， Ｔｒｉ１２，Ｔｒｉ１３を含んだ約７．５ｋｂの領域を、本発明と同じ方法を用いて欠失するのに以下のように成功した。
【０１０３】
フザリウム属カビの場合、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が選択マーカーとして利用でき、遺伝子欠失のコンストラクトとしてはこの選択マーカーを挟んでＴｒｉ１１より外側の２ｋｂの配列とＴｒｉ１３より外側の約２ｋｂの配列をつなげた構造をダブルジョイントＰＣＲ法によって作成し、これによって、フザリウム・グラミネラムを形質転換した。形質転換後、ハイグロマイシンＢを含む培地で培養し、ハイグロマイシンＢ耐性株を選抜後、耐性株のそれぞれについてＤＮＡを抽出した。そして、適当なプライマーの組み合わせを用いて目的の遺伝子領域の欠失を確認し、変異体を選抜した。最終的に得られた変異株については、遺伝子構造の変化を以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を宿主と比較することにより確認した。図１９に、フザリウム野性株とトリコテセン遺伝子領域７．５ｋｂ領域が欠失したフザリウム変異株の遺伝子構造の概略とプライマーの位置を示す。また、前記の各プライマーセットを使用してＰＣＲを行った場合に予想されるＰＣＲ産物のサイズを表７に示す。予想されるサイズのＰＣＲ産物の生成を電気泳動で確認した結果、３種の遺伝子、Ｔｒｉ１１， Ｔｒｉ１２，Ｔｒｉ１３を含んだ約７．５ｋｂの領域の欠失が確認できた（図２０）。
【０１０４】
＜プライマー：Fragment 3＞
配列番号９８：＃６３９（Ｆｇ３−ＸｈｏＩ−Ｆ）：CCCTCGAGAGGGATGGTCCACAGC
配列番号９９：＃６６５（ｈｐｈ−ｎｐ−Ｒ）：TCGCGGTGAGTTCAGGC
配列番号１００：＃６４８（Ｆｇ３−Ｒ）：TGGCAAGAACAGTTTGGG
配列番号１０１：＃６９０（Ｔｒｉ１１−Ｆ）：AACTGTTCTTGCCAGCATC
配列番号１０２：＃６９１（Ｔｒｉ１１−Ｒ）：TCAACAAGTTTGCAGAGAAC
配列番号１０３：＃６９２（Ｔｒｉ１２−Ｆ）：TTCCGATTTCTTTTGGGTAC
配列番号１０４：＃６９３（Ｔｒｉ１２−Ｒ）：TCCAGTTTGAAGAACTGGC
配列番号１０５：＃６９４（Ｔｒｉ１４−Ｆ）：GCCTAAAGGCAACATCAAC
配列番号１０６：＃６９５（Ｔｒｉ１４−Ｒ）：CCGTTGTTGAGACGCAAC
配列番号１０７：＃６６６（ｈｐｈ−ｄｏｗｎ−Ｆ）：TCGTCCGAGGGCAAAGG
配列番号１０８：＃６１９（Ｆｇ２−ｓｅｑ−ｒ２）：AGTATACAGAATCTCAGGC
配列番号１０９：＃６６８（Ｔｒｉ１４−ｒｉｇｈｔ−Ｆ）：GTAAGAGCAGCAGGTTCG
配列番号１１０：＃６１９（Ｆｇ２−ｓｅｑ−ｒ２）：AGTTATCAGAATCTCAGGC
【０１０５】
【表７】
【０１０６】
トリコテセン遺伝子クラスターの場合、クラスター中央の領域にカビの生育に必要な遺伝子が含まれるため、クラスター全体を欠失させた変異株は得られなかった。そこで、生育に関係しない領域について広範囲の遺伝子領域の除去を本発明の手法で行った結果、７．５ｋｂの領域が欠失した変異株が得られた。そして、この欠失株ではトリコテセン系のカビ毒であるデオキシニバレノールの生産性の顕著な減少が観察され、一方、顕著な形態変化は見られなかった。以上の結果から、フザリウム属菌においても本発明の手法が有用であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明のｐＡＦ−ＤＤ１の概略を示す図である。
【図２】本発明のアフラトキシン遺伝子クラスター領域６．６ｋｂ領域の欠失株であることを確認した電気泳動結果を示す図である。
【図３】本発明のｐＡＦ−ＤＤ２ベクターの概略を示す図である。
【図４】本発明のアフラトキシン産生遺伝子欠失を確認した電気泳動結果を示す図である。ＣＫはコントロールの宿主菌株である。
【図５】本発明のアフラトキシン産生遺伝子の欠失が確認された菌株について、さらに詳細な遺伝子欠失の確認結果を示す図である。ＣＫはコントロールの宿主菌株である。
【図６】本発明のアフラトキシン生産性が産生されなくなったことを紫外線写真法により確認した結果を示す図である。３つのコロニーのうち上のコロニーは、宿主ＳＹＳ−４株、下の２つはｐｋｓ−ｖｂｓ欠失株である。アフラトキシンを産生する宿主ＳＹＳ−４株では紫外線吸収がおこるため黒い像が、欠失変異体においてはアフラトキシンが産生されないため白い像が見られる。
【図７】本発明の薄層クロマトグラフィーによるアフラトキシン生産性の比較を行った図である。１はｐｋｓ−ｖｂｓ欠失株：培養液を１０μｌスポット、２はＳＹＳ−４宿主株：培養液を５μｌスポットしたものである。カビは主に４種のアフラトキシン（上のスポットからＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２）を産生する。
【図８】本発明のｐＶＢＳ−ＳＤ２ベクターの概略を示す図である。
【図９】本発明のアフラトキシン遺伝子クラスター領域ｖｂｓ遺伝子破壊株であることを確認した電気泳動結果を示す図である。
【図１０】本発明のｐＡＦ−ＤＤ３ベクターの概略、及びｖｂｓ遺伝子が既に破壊されているｎｉａＤ欠損株における相同組換えの概略を示す図である。
【図１１】本発明のｐＡＦ−ＤＤ３ベクターの概略、及びｖｂｓ遺伝子が破壊されていないｎｉａＤ欠損株における相同組換えの概略を示す図である。
【図１２】本発明のアフラトキシン遺伝子クラスター領域４９ｋｂ領域の欠失株であることを確認した電気泳動結果を示す図である。
【図１３】本発明のアフラトキシン産生遺伝子の欠失が確認されたｎｉａＤ欠損株について、さらに詳細な遺伝子欠失の確認結果を示す図である。ＣＫはコントロールの宿主菌株である。
【図１４】本発明のｐＡＦ−ＷＤベクターの概略を示す図である。
【図１５】本発明のアフラトキシン産生株の胞子と非産生カビの胞子の割合を変えてアフラトキシンの産生を調べた結果を示す図である。（Ａ）産生カビ、非産生カビの同時接種、（Ｂ）非産生カビを接種後１日経過時点で産生カビを接種したものである。
【図１６】本発明のｐＡＦ−ＤＤベクターの概略を示す図である。
【図１７】本発明の、ｐＡＦ−ＤＤをＢｓｐＨＩとＸｍａＩで処理して、１．５ｋｂ ａｆｌＴと１．５ｋｂ ｍｏｘＹ領域が２ｋｂ ｐｔｒＡ領域を挟んだ直鎖ＤＮＡ断片の構造を示す図である。
【図１８】本発明のアフラトキシン産生遺伝子の欠失が確認された＃８０−４番菌株について、さらに詳細な遺伝子欠失の確認結果を示す図である。ＣＫはコントロールの宿主菌株である。
【図１９】本発明のトリコテセン遺伝子領域７．５ｋｂ領域が欠失したフザリウム変異株とフザリウム野性株の遺伝子構造の概略を示す図である。
【図２０】本発明のトリコテセン遺伝子領域７．５ｋｂ領域の欠失株である事を確認した電気泳動を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを作製し、該広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを前記糸状菌に導入し、２回交差相同組換えが起こった変異株を、まず選択マーカーの性質を利用して一次選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより二次選抜することを特徴とする広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項２】
糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域であることを特徴とする請求項１記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項３】
染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域が、染色体上で１５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域であることを特徴とする請求項１又は２記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項４】
染色体上で１５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域が、染色体上で５０ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域であることを特徴とする請求項３記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項５】
選択マーカー遺伝子が、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）又は／及び硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項６】
一次選抜で得られた変異株から単核胞子を調製し、単核胞子由来の遺伝子構造の変化を直接調べることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項７】
ＰＣＲ法又はサザーン法により変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項８】
糸状菌の染色体上で５ｋｂ以上の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域が、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域で置換されて欠失した広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項９】
糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター領域又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域であることを特徴とする請求項８記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項１０】
糸状菌の染色体上で１５ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを特徴とする請求項８又は９記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項１１】
糸状菌の染色体上で５０ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを特徴とする請求項１０記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項１２】
選択マーカー遺伝子が、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）又は／及び硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項１３】
アフラトキシン生産菌の遺伝子クラスターの全部又は一部が除去されたアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカス。
【請求項１４】
アスペルギルス・パラジチカス（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０）。
【請求項１５】
アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域の全部又は一部が除去されたアスペルギルス・オリゼー。
【請求項１６】
アスペルギルス・オリゼー（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１）。
【請求項１７】
請求項８〜１２のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株、請求項１３若しくは１４記載のアスペルギルス・パラジチカス、又は、請求項１５若しくは１６記載のアスペルギルス・オリゼーを含むバイオコントロール剤。
【請求項１８】
糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットと、前記広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを確認することができるプローブ又は少なくとも１対のプライマーセットとを備えた広範囲遺伝子領域欠失変異株のスクリーニングキット。
【請求項１】
糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを作製し、該広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットを前記糸状菌に導入し、２回交差相同組換えが起こった変異株を、まず選択マーカーの性質を利用して一次選抜し、その後、変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることにより二次選抜することを特徴とする広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項２】
糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域であることを特徴とする請求項１記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項３】
染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域が、染色体上で１５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域であることを特徴とする請求項１又は２記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項４】
染色体上で１５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域が、染色体上で５０ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域であることを特徴とする請求項３記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項５】
選択マーカー遺伝子が、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）又は／及び硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項６】
一次選抜で得られた変異株から単核胞子を調製し、単核胞子由来の遺伝子構造の変化を直接調べることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項７】
ＰＣＲ法又はサザーン法により変異株の遺伝子構造の変化を直接調べることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株の生産方法。
【請求項８】
糸状菌の染色体上で５ｋｂ以上の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域が、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域で置換されて欠失した広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項９】
糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域が、糸状菌のアフラトキシン生産菌の遺伝子クラスター領域又は麹カビのアフラトキシン遺伝子クラスター類似領域であることを特徴とする請求項８記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項１０】
糸状菌の染色体上で１５ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを特徴とする請求項８又は９記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項１１】
糸状菌の染色体上で５０ｋｂ以上の広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを特徴とする請求項１０記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項１２】
選択マーカー遺伝子が、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）又は／及び硝酸還元酵素をコードする遺伝子（ｎｉａＤ）であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株。
【請求項１３】
アフラトキシン生産菌の遺伝子クラスターの全部又は一部が除去されたアフラトキシン非生産性アスペルギルス・パラジチカス。
【請求項１４】
アスペルギルス・パラジチカス（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７０）。
【請求項１５】
アフラトキシン遺伝子クラスター類似領域の全部又は一部が除去されたアスペルギルス・オリゼー。
【請求項１６】
アスペルギルス・オリゼー（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０９７１）。
【請求項１７】
請求項８〜１２のいずれか記載の広範囲遺伝子領域欠失変異株、請求項１３若しくは１４記載のアスペルギルス・パラジチカス、又は、請求項１５若しくは１６記載のアスペルギルス・オリゼーを含むバイオコントロール剤。
【請求項１８】
糸状菌の有害物質生産に関与する遺伝子領域又は少なくとも生存に必須でない遺伝子領域を含む広範囲標的遺伝子領域の両外側に位置し、染色体上で５ｋｂ以上離れた２つのＤＮＡ領域とそれぞれ相同組換えすることができる２つの相同ＤＮＡ領域間に、選択マーカー遺伝子、又は選択マーカー遺伝子と所定の遺伝子領域を連結した広範囲遺伝子領域欠失用遺伝子カセットと、前記広範囲標的遺伝子領域が欠失したことを確認することができるプローブ又は少なくとも１対のプライマーセットとを備えた広範囲遺伝子領域欠失変異株のスクリーニングキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００８−１２５４９３（Ｐ２００８−１２５４９３Ａ）
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１７７８７（Ｐ２００６−３１７７８７）
【出願日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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