核内受容体及びその変異体、並びに細胞の再プログラミングにおけるその使用
本発明によれば、インビトロで多能性幹細胞を誘導するための方法であって、核内受容体の遺伝子又はポリペプチドと、Ｓｏｘ、クルッペル様因子又はｍｙｃファミリーからなる群から選択される１個以上の遺伝子又はポリペプチドとをインビトロで細胞に導入することを含む方法を提供する。本発明はまた、同物を生成するためのベクター及び組成物、並びに誘導された多能性幹細胞を使用して、多能性幹細胞治療を必要とする患者を治療するための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0002]本発明は、核内受容体タンパク質、及び分化した細胞を多能状態に再プログラミングする方法におけるこのようなタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0003]幹細胞治療は、疾患又は傷害を治療するために損傷を受けた組織に新たな細胞を導入する細胞療法の１種である。多能性細胞が自己再生し、様々な細胞種に分化する能力は、拒絶される危険性を伴わずに体内で罹患した組織及び損傷を受けた組織と代替することができる組織を培養する可能性を大いにもたらす。
【０００３】
[0004]幹細胞治療はいくつか存在するが、骨髄移植を注目すべき例外として、ほとんどはまだ実験段階で、及び／又は費用がかかる。医学研究者らは、癌、糖尿病、神経障害、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、認知症、並びに心障害及び筋肉損傷に加えてその他多くを治療するために、成人体細胞から得られた細胞をいつか使用することができるようになると予測している。
【０００４】
[0005]体細胞の多能性細胞への復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）とは、通常再プログラミングのことである。体細胞の核移動及び細胞融合は、分化した細胞の再プログラミングで使用される技術の例である（Ｌｅｗｉｔｚｋｙ，Ｍ．＆ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８、４６７〜７３）。再プログラミングのもう１つの方法は、４種類の転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのみをレトロウイルス導入することによってマウス線維芽細胞を再プログラミングしたときに発見された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．＆ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２６、６６３〜７６）。体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）などの転写因子を一緒に導入することによって再プログラミングし、多能状態に戻すことができる。これらの変換された細胞は、形態、遺伝子発現及びエピジェネティックマークに関して胚性幹細胞（ＥＳＣ）と多くの特性を共有し、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として知られている。ｉＰＳＣが発見されてから、様々な系列及び様々な種の細胞の再プログラミングが成功してきた（Ｆｅｎｇ，Ｂ．ら、（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４、３０１〜１２）。このような方法の効率を高めることが必要とされている。
【０００５】
[0006]草分けとなったＹａｍａｎａｋａの研究によって発見された４種類の再プログラミング因子の他に、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８などのその他の因子も再プログラミングに関与することが発見された（Ｙｕ，Ｊ．ら、（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８、１９１７〜２０）。さらに、ＥＳＣ特異的転写因子であるＵＴＦ１は、４種類のＹａｍａｎａｋａ因子及びｐ５３のノックダウンと併用するとヒト線維芽細胞の再プログラミングを増強することが示された。４種類のＹａｍａｎａｋａ転写因子のいくつかはまた、再プログラミングにおける因子と代替することが示された。例えば、Ｋｌｆ４は、Ｋｌｆ２及びＫｌｆ５に代替することができ、Ｓｏｘ２はＳｏｘ１及びＳｏｘ５に代替することができ、一方、Ｎ−ｍｙｃ及びＬ−ｍｙｃはｃ−Ｍｙｃに代替することができた。４種類の明らかにされた再プログラミング因子の中でも、Ｏｃｔ４は多能性の誘導において最も重要であることが示された（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら（２００８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６、１０１〜６）。しかし、Ｏｃｔ４はＯｃｔ１及びＯｃｔ６などの近接したファミリーのメンバーを含むその他の転写因子によって依然として代替することはできない（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍら（２００８）。今までのところ、どの転写因子も体細胞の再プログラミングにおいてＯｃｔ４とは代替できないことが示されている。
【０００６】
[0007]Ｏｃｔ−４（オクタマー−４の略語）は、ＰＯＵファミリーのホメオドメイン転写因子タンパク質である。Ｏｃｔ−４発現は、注意深く調節しなければならない。多すぎたり、少なすぎたりすると実際に細胞の分化の原因となる。Ｏｃｔ−４は、成体の生殖細胞の腫瘍形成に関係することがある。成体マウスにおけるこの因子の異所性発現は、皮膚及び腸の異形成病変の形成の原因となることが発見された。腸の異形成は、細胞分化の阻害による前駆細胞集団の増加及びβ−カテニン転写の上方制御によって生じた。
【０００７】
[0008]胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）において発現したＯｃｔ４は、ＩＣＭ並びにＥＳＣにおける細胞の多能性の維持に重要である。神経前駆細胞（ＮＰＣ）は内在性Ｓｏｘ２を高レベルで発現するが、Ｏｃｔ４のみを異所性発現することがまだ再プログラミングに必要であった。この所見は、Ｏｃｔ４が体細胞に多能性を与えるために極めて重要であることを示唆している。さらに、Ｏｃｔ４及び前述の転写因子などの数種の転写因子のみがｉＰＳＣ生成に関与することが報告されてきた。
【０００８】
[0009]核内受容体は、直接ＤＮＡに結合し、隣接する遺伝子の発現を調節する能力を有する。核内受容体はモジュラー構造をしており、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）などの特定のドメインを含有する。核内受容体は一般的に、作用機構及びリガンド不在下での細胞内分布に応じて２つの大きな部類に分類される。４８個の公知のヒト核内受容体は、タンパク質の配列相同性に基づいてサブファミリーにさらに分類された。サブファミリー５は２個の核内受容体、ステロイド産生因子１（Ｓｆ１）としても知られているＮｒ５ａ１及びＮｒ５ａ２を含む。その他の核内受容体のように、Ｎｒ５ａ２はリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有する。しかし、オーファン核内受容体では、Ｎｒ５ａ２の内在性リガンドは依然として知られていない。二量体として機能を果たすほとんどの核内受容とは異なり、Ｎｒ５ａ２は単量体の状態でＤＮＡに結合することができる（Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ｌ．ら（１９９６）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６、３８５３〜６５）。
【発明の概要】
【０００９】
[00010]本発明は、代替転写因子及び分化した細胞を多能状態に再プログラミングする方法におけるこのような因子の使用を探究する。
【００１０】
[00011]本発明者らは、核内受容体及び核内受容体のＳＵＭＯ化変異体がインビトロで多能性幹細胞を惹起できることを示す。さらに核内受容体は、インビトロにおいて多能性幹細胞の誘導においてＯｃｔ４と代替することができるだろう。
【００１１】
[00012]したがって、本発明の一態様では、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、前記転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップを含む方法を提供する。
【００１２】
[00013]本発明の別の態様では、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５若しくは配列番号８で記載されたヌクレオチド配列又はポリペプチド配列番号１０を発現する断片を含むポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５若しくは配列番号８で記載されたヌクレオチド配列又はポリペプチド配列番号１０を発現する断片に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１１で記載された配列を含む核内受容体ポリペプチド又は配列番号１０を含有するそれらの相同体、変種、誘導体若しくは断片をコードするポリヌクレオチドから選択されるサブファミリー５の核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とのポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、宿主細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を導くことができる調節配列に操作可能に結合している、発現ベクター、を提供する。
【００１３】
[00014]本発明の別の態様では、多能性幹細胞治療の必要な患者を治療するための医薬品の製造において、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、個体ドナーから細胞を単離するステップ、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップ、多能性幹細胞治療の必要な患者に多能性細胞を導入するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
[00015]本発明の別の態様では、多能性幹細胞株の作製方法であって、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、前記ポリヌクレオチドが、核内受容体を含む転写因子と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とをコードする、ステップ、多能性細胞を継代して細胞株を維持するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
[00016]本発明のその他の態様には、好ましい実施形態の説明及び図面を参考にして、当業者に明らかであるものが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｎｒ５ａ２は再プログラミング効率を高め、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と共に、ｃ−Ｍｙｃの有無に関わらず、ＭＥＦを再プログラミングすることができる。 （ａ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）によるＭＥＦ再プログラミングの増強について、１８種の核内受容体をスクリーニングした図である。図は、ＯＳＫＭ（対照）に対してＯＳＫＭと併用したそれぞれの核因子から生成したＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｂ）ＭＥＦの再プログラミングにおいて再プログラミングエンハンサー、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２がＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４と代替する能力について試験した。ＧＦＰ陽性コロニーの定量は、１４ｄｐｉで実施した。対照実験として、核内受容体因子は導入せず、ＯＫＭ、ＯＳＭ又はＳＫＭレトロウイルスのみを添加した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｃ）Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と一緒にＮｒ５ａ２でＭＥＦを再プログラミングして生成したＧＦＰ陽性コロニーの数を示した図である。対照実験として、ＳＫレトロウイルスのみをＭＥＦに導入した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｄ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４でＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入した後のｉＰＳＣコロニーの生成を示した図である。位相差画像を示す。 （ｅ）ｄのｉＰＳＣコロニーは、蛍光顕微鏡下で確認するとＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性であり、内在性Ｐｏｕ５ｆ１の反応性を示している。 （ｆ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣはアルカリホスファターゼを発現した。 （ｇ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＮａｎｏｇの発現を示した図である。 （ｈ）ｇの核は、ヘキストで対比染色した。 （ｉ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ−１の発現を示した図である。 （ｊ）ｉの細胞は、核を示すためにヘキストで染色した。スケールバーはｄ〜ｆでは２００μｍを表し、ｇ〜ｊでは５０μｍを表す。
【図２】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の全般的な発現プロファイルを示した図である。 （ａ）相関分析（４６，６４３プローブ）は、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＯＳＫＭ、Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１）及びＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）のトランスクリプトームをクラスター化するために実施した。ＯＳＫＭ ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃをＭＥＦにレトロウイルス導入することによって得られた。 （ｂ）ａの生物学的反復マイクロアレイデータから作製したヒートマップは、１０００個のＥＳＣ関連及びＭＥＦ関連遺伝子の発現プロファイルを示している。緑色はＭＥＦに対する遺伝子発現の下方制御を表し、赤色は遺伝子発現の上方制御を表す。
【図３】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のエピジェネティック状態を示した図である。 （ａ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーターメチル化分析を示した図である。重亜硫酸塩によるゲノム配列解析は、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞（Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１）におけるＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域のメチル化状態を分析するために実施した。それぞれの細胞株について、１０個のランダムクローンを配列決定し、結果を丸で示し、白丸はメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを表し、赤丸はメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを表す。 （ｂ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞における２価クロマチンマークを示した図である。ＣｈＩＰアッセイに続いて、定量的リアルタイムＰＣＲを実施して、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるトリメチル化ヒストンＨ３Ｋ４及びＨ３Ｋ２７クロマチンマークの濃縮を分析した。データは、報告されたビバレント（ｂｉｖａｌｅｎｔ）遺伝子座（Ｚｆｐｍ２、Ｓｏｘ２１、Ｐａｘ５、Ｌｂｘ１ｈ、Ｅｖｘ１及びＤｌｘ）の濃縮をｌｏｇ２で表す。データは、３回の独立した実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図４】Ｎ２ＳＫｉＰＳによって、マウスのキメラを作製することができることを示した図である。 （ａ）Ｅ１３．５ Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３キメラ胚から切除した雄生殖腺の明視野画像を示した図である。 （ｂ）ａのＧＦＰ蛍光画像である。ＧＦＰ陽性シグナルが生殖腺で認められ、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の生殖系への取り込みが示唆された。 （ｃ）Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ１１成体キメラの図である。１２９Ｓ２／ＳＶ Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦから得られたＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞をＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚にマイクロインジェクションし、被毛の色が混合したキメラを作製した。
【図５】ウイルス特異的プライマー及び遺伝子特異的プライマーでｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって確認した、スクリーニングされた核内受容体遺伝子を有するウイルス構築物の発現を示した図である。
【図６】Ｎｒ５ａ２は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと共にＭＥＦを再プログラミングすることを示した図である。 （ａ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃでＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入して得られたｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示した図である。 （ｂ）ａの蛍光画像は、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞における内在性Ｐｏｕ５ｆ１の回復を示している。 （ｃ）Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣにおけるアルカリホスファターゼの発現を示した図である。 （ｄ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＮａｎｏｇ発現を示した図である。 （ｅ）ｄの核は、ヘキストで対比染色した。 （ｆ）Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ−１の発現を示した図である。 （ｇ）ｆの細胞は、核を示すためにヘキストで染色している。 （ｈ）その他の核内受容体のＯｃｔ４と代替する能力についてスクリーニングを示した図である。ＭＥＦは、ＳＫＭウイルス及び核内受容体それぞれをコードするウイルスで同時形質導入した。ＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２は、陽性対照として使用した。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの形質導入を意味する。ＧＦＰ陽性コロニーの数は、１４ｄｐｉに計数した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｉ）１２９Ｓ２／ＳＶ Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦから得られたＮ２ＳＫＭ ＃Ａ５ ｉＰＳＣをＣ５７ＢＬ／６Ｊにマイクロインジェクションして作製した成体マウスキメラの図である。スケールバーはａ〜ｃでは２００μｍを表し、ｄ〜ｇでは５０μｍを表す。
【図７】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の核型及び遺伝子型分析を示した図である。 （ａ）Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１ ｉＰＳＣ株は正常な雄の核型を表した。 （ｂ）ＰＣＲによって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるレトロウイルス遺伝子、Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのゲノム組み込みが確認された。ＰＣＲは、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びｉＰＳＣから収集したゲノムＤＮＡでウイルス特異的プライマー及び遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。ＯＳＫＭ ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃでＭＥＦをウイルス形質導入することによって得られた。ｐ２１遺伝子の領域のＰＣＲ増幅は全試料で実施し、対照図で示している。
【図８】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、インビトロ及びインビボにおける分化アッセイにおいて、３種類の主要な胚葉の系列に分化することを示した図である。 （ａ）胚様体媒介インビトロ分化アッセイでは、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、３種類の主要な胚系統の細胞に分化することができることを示している。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞から分化した細胞は、Ｇａｔａ−４（内胚葉）、ネスチン（外胚葉）及びα−平滑筋アクチン（中胚葉）で陽性に染色した。分化マーカーは、赤色に染色され、ヘキスト色素は核を青色に対比染色した。 （ｂ）奇形腫アッセイにおいて、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、３種類の主要な胚葉の組織に分化したことを示した図である。奇形腫を切断し、マロリーテトラクローム（Ｍａｌｌｏｒｙ’ｓ Ｔｅｔｒａｃｈｒｏｍｅ）で染色し、外胚葉組織（神経外胚葉）、中胚葉組織（筋肉及び軟骨）及び内胚葉組織（腸管上皮細胞及び膵臓細胞）を明らかにした。スケールバーはａで１００μｍを表し、ｂで５０μｍを表す。
【図９】Ｎｒ５ａ１は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと共にＭＥＦを再プログラミングする。 （ａ）Ｎｒ５ａ１は、Ｏｃ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）による再プログラミングの効率を高める。図は、ＯＳＫＭ（対照）に対してＯＳＫＭと併用したＮｒ５ａ１から生成したＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｂ）ＭＥＦの再プログラミングにおいて、Ｎｒ５ａ１はＯｃｔ４と代替する。ＯＫＭ、ＯＳＭ及びＳＫＭそれぞれと併用してＮｒ５ａ１を同時形質導入することによって、Ｎｒ５ａ１がＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４と代替する能力について調べた。対照実験は、Ｎｒ５ａ１無しでＯＫＭ、ＯＳＭ又はＳＫＭレトロウイルスで実施した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｃ）Ｎｒ５ａ１、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ４によってＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入して生成したｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示した図である。 （ｄ）ｃにおけるＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性Ｎ１ＳＫＭ ｉＰＳＣコロニーの蛍光画像を示した図である。 （ｅ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞は、アルカリホスファターゼで陽性に染色した。 （ｆ）Ｎａｎｏｇは、Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞で発現した。 （ｇ）ｆのヘキスト染色は核を示している。 （ｈ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞は、ＳＳＥＡ−１で陽性に染色した。 （ｉ）ｈの細胞は、核を示すためにヘキストで染色した。 （ｊ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞株の正常な雄の核型。 （ｋ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞で実施された胚様体媒介インビトロ分化アッセイは、Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞が３種類の主要な胚系統の細胞に分化できることを示している。分化した細胞は、Ｇａｔａ４（内胚葉）、ネスチン（外胚葉）及びα−平滑筋アクチン（中胚葉）で陽性に染色した。系統マーカーは赤色に染色し、核はヘキストで青色に染色した。スケールバーはｃ〜ｅでは２００ｕｍを表し、ｆ〜ｉでは５０ｕｍを表す。
【図１０】Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１は一緒に、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃによるＭＥＦの再プログラミングを増強する。Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと共にＮｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方を導入すると、Ｎｒ５ａ２又はＮｒ５ａ１のいずれかをＳＫＭと共に形質導入するときと比較して、生成するＧＦＰ陽性コロニーの数が増加する。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみでＭＥＦを形質導入した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図１１】ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、Ｎｒ５ａ２がＭＥＦを再プログラミングするために重要であるが、Ｎｒ５ａ２のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は再プログラミング因子としての機能に重要ではない。 （ａ）Ｎｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ Ａ３６８Ｍ（ＬＢＤ変異体）及びＮｒ５ａ２ Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａ（ＤＮＡ変異体）をコードするレトロウイルスベクターのいずれかをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞から収集した細胞抽出物のウェスタン分析によって、Ｎｒ５ａ２タンパク質の発現が等しいことが示された。ＧＦＰ遺伝子を有するレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞を陰性対照として使用した。アクチンのウェスタンブロットは、添加対照として実施した。 （ｂ）Ｎｒ５ａ２変異体が再プログラミング因子としての機能を保持する能力について分析した図である。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦは、ＳＫＭウイルス及びＮｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ Ａ３６８Ｍ又はＮｒ５ａ２ Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａをコードするウイルスで形質導入した。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの感染を表す。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図１２】Ｎｒ５ａ２は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４と共に、ｃ−Ｍｙｃを含めて、又はｃ−Ｍｙｃを含めずにＭＥＦを再プログラミングする。 （Ａ）ＯＳＫＭによる再プログラミングの増強について１９種の核内受容体をスクリーニングした図である。図は、ＯＳＫＭ（対照）に対してＯＳＫＭと一緒にしたそれぞれの核受容体因子で生成したＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。 （Ｂ）Ｎｒ５ａ２又はＮｒ１ｉ２いずれかと一緒にしたＯＳＫＭによる再プログラミングの動態を示した図である。 （Ｃ）再プログラミングエンハンサー、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２のＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４を代替する能力の再プログラミングアッセイ。対照実験として、Ｎｒ５ａ２又はＮｒ１ｉ２を加えずにレトロウイルスのそれぞれの組み合わせを添加した。 （Ｄ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４によるＭＥＦの再プログラミングから生成したＧＦＰ陽性コロニーの数を示した図である。対照実験として、ＳＫレトロウイルスのみを導入した。ＡからＤのデータは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （Ｅ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４によってＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入した後のｉＰＳＣコロニーの生成。位相差画像を示す。 （Ｆ）Ｅのコロニーは、蛍光顕微鏡下で確認するとＧＦＰ陽性であり、内在性Ｐｏｕ５ｆ１の再活性化を示している。 （Ｇ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣはアルカリホスファターゼを発現する。 （Ｈ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＮａｎｏｇの発現を示した図である。 （Ｉ）Ｈの核は、ヘキストで対比染色した。 （Ｊ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ−１の発現を示した図である。 （Ｋ）Ｊの細胞は、核を示すためにヘキストで染色した。スケールバーはＥ〜Ｇでは２００μｍを表し、Ｈ〜Ｋでは５０μｍを表す。 （Ｌ）Ｅ１３．５ Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３キメラ胚から切除した雄生殖腺の明視野画像を示した図である。 （Ｍ）ＬのＧＦＰ蛍光画像である。ＧＦＰ陽性シグナルが生殖腺で認められ、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の生殖系列への組み込みが示された。 （Ｎ）Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ１１成体キメラは、Ｂ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚にマイクロインジェクションしたＦ１（１２９Ｓ２／ＳＶ×Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）ＭＥＦから得られたＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞から生じた。 （Ｏ）Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ１１成体キメラをアルビノＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊマウスと交配して生じた出生児。アグーチ及びブラックの出生児は、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の生殖系列移行の指標である。
【図１３】Ｎｒ５ａ１で媒介された再プログラミング及びＮｒ５ａ２の再プログラミング能力に対する変異の影響を示した図である。 （Ａ）Ｎｒ５ａ１は、ＯＳＫＭによる再プログラミング効率を高める。図は、対照（ＯＳＫＭ）に対してＯＳＫＭと併用したＮｒ５ａ１から生成したＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。 （Ｂ）ＭＥＦの再プログラミングにおいて、Ｎｒ５ａ１はＯｃｔ４と代替する。ＯＫＭ、ＯＳＭ又はＳＫＭそれぞれと併用してＮｒ５ａ１を同時形質導入することによって、Ｎｒ５ａ１がＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４と代替する能力について調べた。対照実験は、Ｎｒ５ａ１無しでＯＫＭ、ＯＳＭ又はＳＫＭレトロウイルスで実施した。 （Ｃ）Ｎｒ５ａ１及びＳＫＭによるＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦのレトロウイルス形質導入によって作製したｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示した図である。 （Ｄ）ＣにおけるＧＦＰ陽性Ｎ１ＳＫＭ ｉＰＳＣコロニーを示した図である。 （Ｅ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞は、アルカリホスファターゼで陽性に染色された。 （Ｆ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞におけるＮａｎｏｇ発現。 （Ｇ）Ｆのヘキスト染色は核を示している。 （Ｈ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞は、ＳＳＥＡ−１で陽性に染色した。 （Ｉ）Ｈのヘキスト染色は核を示している。 （Ｊ）Ｎ１ＳＫＭ株におけるレトロウイルス遺伝子Ｎｒ５ａ１のゲノム組み込みのＰＣＲによる確認。対照図は、ｐ２１遺伝子の領域のＰＣＲ増幅を示している。 （Ｋ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた株の正常な核型。 （Ｌ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞で実施されたＥＢ媒介インビトロ分化アッセイ。分化した細胞は、Ｇａｔａ４（内胚葉）、ネスチン（外胚葉）及びα−平滑筋アクチン（中胚葉）で陽性に染色した。系統マーカーは赤色に染色し、核はヘキストで青色に染色した。 （Ｍ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞の奇形腫アッセイ。スケールバーはＣ〜Ｅでは２００μｍ、Ｌでは１００μｍ及びＦ〜Ｉ、Ｍでは５０μｍを表す。 （Ｎ）Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｓｔａｔ３、Ｚｆｘ、Ｔｃｆｃｐ２ｌ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｎ−Ｍｙｃ及びＥｓｒｒｂのウイルス転写物発現のＰＣＲによる確認。 （Ｏ）ＳＫＭと併用したＰｏｕ５ｆ１調節領域に結合する転写因子のスクリーニング。対照は、ＳＫＭウイルスのみのＭＥＦへの形質導入を表す。ＳＫＭを有するＮｒ５ａ１及びＮｒ５ａ２は、陽性対照として使用した。 （Ｐ）Ｎｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ Ａ３６８Ｍ及びＮｒ５ａ２ Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａをコードするいずれかのレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞から収集した細胞抽出物のウェスタン分析。ＧＦＰ遺伝子を有するレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞を陰性対照として使用した。 （Ｑ）Ｎｒ５ａ２リガンド及びＤＮＡ結合変異体によるＳＫＭ再プログラミング。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦは、ＳＫＭウイルス及びＮｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ Ａ３６８Ｍ又はＮｒ５ａ２ Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａのいずれかをコードするウイルスで形質導入した。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの感染を表す。 （Ｒ）Ｎｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ ２ＫＲ及びＮｒ５ａ２ ５ＫＲをコードするいずれかのレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞から収集した細胞抽出物のウェスタン分析。いかなる遺伝子も有さないレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞を陰性対照として使用した。 （Ｓ）Ｎｒ５ａ２ ＳＵＭＯ変異体とのＯＳＫＭ再プログラミング。対照実験は、ＯＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの感染を表す。図は、対照の陽性コロニー数に対する、ＯＳＫＭウイルス及びＮｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ ２ＫＲ又はＮｒ５ａ２ ５ＫＲのいずれかをコードするウイルスをＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦに感染させて生成したＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。Ａ〜Ｂ、Ｏ、Ｑ及びＳのデータは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図１４】Ｎｒ５ａ２結合部位のゲノム全体マッピングを示した図である。 （Ａ）Ｎｒ５ａ２結合部位の過剰出現配列を調べる新規モチーフ発見アルゴリズムＭＥＭＥによって作製したＮｒ５ａ２のモチーフ。 （Ｂ）Ｎｒ５ａ２及びその他の転写因子の同時出現を示すヒートマップ。ヒートマップ中のそれぞれの四角は、２つの転写因子間の同時局在頻度を表す（赤色は同時局在の頻度が低いことを表し、黄色は同時局在の頻度が高いことを表す）。転写因子は、その他の因子との同時局在における類似性に基づいて両軸に沿って密集していた。転写因子は、Ｎｒ５ａ２と同時局在する傾向がある青い枠によって区別された。 （Ｃ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４が結合する、ＥＳＣの独自性の維持及び細胞増殖などの様々な細胞の役割において重要な遺伝子。
【図１５】Ｎａｎｏｇは、再プログラミングにおけるＮｒ５ａ２の下流標的である。 （Ａ）ＭＥＦの再プログラミング中に、Ｎｒ５ａ２はＮａｎｏｇエンハンサーと結合する。ＣｈＩＰアッセイは、ＯＳＫＭ及びＨＡ-Ｎｒ５ａ２ウイルスを同時形質導入して８日後のＭＥＦで実施した。定量的リアルタイムＰＣＲは、抗ＨＡ抗体を使用してＮａｎｏｇエンハンサーに対するＨＡ-Ｎｒ５ａ２の濃縮を分析するために実施した。示されたデータは、２連の生物試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均±標準誤差を意味する。 （Ｂ）経時的（３、７及び１１ｄｐｉ）３連の生物学的マイクロアレイデータ（平均±標準誤差）に基づいた、ＯＳＫＭ再プログラミング細胞と比較したＯＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２再プログラミング細胞におけるＮａｎｏｇの発現レベルの倍率変化。ＥＳＣ関連遺伝子、Ｇｄｆ３及びＺｉｃ３の発現レベルの倍率変化も図に含めた。 （Ｃ）感染していないＭＥＦに対してＯＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２又はＯＳＫＭで感染したＭＥＦにおける内在性Ｐｏｕ５ｆ１ ｍＲＮＡレベルの経時的倍率変化。 （Ｄ）感染していないＭＥＦに対してＯＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２又はＯＳＫＭで感染したＭＥＦにおける内在性Ｎａｎｏｇ ｍＲＮＡレベルの経時的倍率変化。Ｃ〜Ｄにおけるリアルタイム定量的ＰＣＲデータは、３連の生物学的試料の平均±標準誤差である。 （Ｅ）Ｎｒ５ａ２ ｓｈＲＮＡでノックダウンした後のＥＳＣにおけるＮｒ５ａ２ ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲによる確認。対照ＥＳＣは、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。 （Ｆ）Ｎｒ５ａ２を標的とするノックダウン構築物を導入した後のＥＳＣにおけるＮｒ５ａ２タンパク質発現のウェスタン分析。Ｎｒ５ａ２タンパク質は、Ｎｒ５ａ２に特異的な抗体で標的化した。 （Ｇ）ＯＳＫＭ再プログラミングにおけるＮｒ５ａ２のｓｈＲＮＡノックダウン。ＯＳＫＭを有するＰｏｕ５ｆ１ ＲＮＡｉは、陽性ノックダウン対照として使用し、ルシフェラーゼＲＮＡｉは陰性ノックダウン対照として使用する。Ｎａｎｏｇ又はＭｔｆ２は、ノックダウン効果を回復させる能力を調べるために導入した。 （Ｈ）Ｎｒ５ａ２及びＮａｎｏｇの両方に添加したＯＳＫＭによる再プログラミング。図は、対照に対するＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。Ｅ、Ｇ及びＨのデータは、３回の独立した実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差である。
【図１６】Ｎｒ５ａ２は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと共にＭＥＦを再プログラミングすることを示した図である。 （Ａ）ＭＥＦにおいて遺伝子導入したＰｏｕ５ｆ１高感度緑蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター構築物の模式図である。ＥＧＦＰの発現は、Ｐｏｕ５ｆ１調節領域の制御下にあり、調節領域にはＰｏｕ５ｆ１遠位エンハンサー及びＰｏｕ５ｆ１プロモーターが含まれる（Ｓｚａｂｏら、２００２）。 （Ｂ）Ｎｒ５ａ２及びＮｒ１ｉ２感染ＭＥＦのタネルアッセイ。図は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析後のタネル陽性細胞の割合を示している。ＭＥＦに、（ｐＭＸ）、Ｎｒ１ｉ２（ｐＭＸ−Ｎｒ１ｉ２）又はＮｒ５ａ２（pＭＸ-Ｎｒ５ａ２）のいずれの遺伝子もコードしないレトロウイルスを感染させた。陽性対照として、感染してないＭＥＦをタネル標識の前にＤＮアーゼ１処理した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （Ｃ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃでＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入して得られたｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示した図である。 （Ｄ）Ｃの蛍光画像は、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞における内在性Ｐｏｕ５ｆ１の回復を示している。 （Ｅ）Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣにおけるアルカリホスファターゼの発現を示した図である。 （Ｆ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＮａｎｏｇ発現を示した図である。 （Ｇ）Ｆの核は、ヘキストで対比染色した。 （Ｈ）Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ−１の発現を示した図である。 （Ｉ）Ｈの細胞は、核を示すためにヘキストで染色している。スケールバーはＣ〜Ｅでは２００μｍを表し、Ｆ〜Ｉでは５０μｍを表す。 （Ｊ）その他の核内受容体のＯｃｔ４と代替する能力についてスクリーニングを示した図である。ＭＥＦは、ＳＫＭウイルス及び核内受容体それぞれをコードするウイルスを同時形質導入した。ＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２は、陽性対照として使用した。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの形質導入を示す。ＧＦＰ陽性コロニーの数は、１４ｄｐｉで計数した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （Ｋ）Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１ ｉＰＳＣ株の核型分析。 （Ｌ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の遺伝子型分析。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるレトロウイルス遺伝子、Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのゲノム統合のＰＣＲによる確認は、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びｉＰＳＣから収集したゲノムＤＮＡに対してウイルス特異的プライマー及び遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。ＯＳＫＭ ｉＰＳＣは、ＭＥＦをＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃでウイルス形質導入することによって得られた。ｐ２１遺伝子の領域のＰＣＲ増幅は全試料について実施し、対照図で示している。 （Ｍ）Ｆ１（１２９Ｓ２／ＳＶ×Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）ＭＥＦから得られたＮ２ＳＫＭ ＃Ａ５ ｉＰＳＣをＣ５７ＢＬ／６Ｊにマイクロインジェクションして生成した成体マウスキメラの図である。
【図１７】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、インビトロ及びインビボの分化アッセイで、３種類の主要な胚葉系列に分化し、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の網羅的発現プロファイリング及びエピジェネティック状態を示した図である。 （Ａ）胚様体（ＥＢ）媒介インビトロ分化アッセイでは、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は３種類の主要な胚系統の細胞に分化することができることを示している。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞から分化した細胞は、Ｇａｔａ−４（内胚葉）、ネスチン（外胚葉）及びα−平滑筋アクチン（中胚葉）で陽性に染色した。分化マーカーは赤色で染色され、ヘキスト色素は核を青色に対比染色した。 （Ｂ）奇形腫アッセイにおいて、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、３種類の主要な胚葉の組織に分化することを示した図である。奇形腫を切断し、マロリーテトラクロームで染色することによって、外胚葉組織（神経外胚葉）、中胚葉組織（筋肉及び軟骨）及び内胚葉組織（腸管上皮細胞及び膵臓細胞）を明らかにした。スケールバーはＡでは１００μｍを表し、Ｂでは５０μｍを表す。 （Ｃ）相関分析（４６，６４３プローブ）は、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＯＳＫＭ、Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１）及びＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）のトランスクリプトームをクラスター化するために実施した。 （Ｄ）Ｃのマイクロアレイデータから作製したヒートマップは、１０００個のＥＳＣ関連及びＭＥＦ関連遺伝子の発現プロファイルを示している。遺伝子は、ＥＳＣ及びＰｏｕ５ｆ１-ＧＦＰ ＭＥＦにおける発現の倍率変化に基づいて選択し、平均発現比によって分類し、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦシグナルに平均を中心化した（ｍｅａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）。緑色はＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦに対して遺伝子発現の下方制御を表し、赤色は遺伝子発現の上方制御を表す。 （Ｅ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーターメチル化分析を示した図である。重亜硫酸塩によるゲノム配列解析は、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域のメチル化状態を分析するために実施した。それぞれの細胞株について、１０個のランダムクローンを配列決定し、結果を丸で示し、白丸はメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを表し、赤丸はメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを表す。 （Ｆ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるビバレントクロマチンマーク。ＣｈＩＰアッセイに続いて、定量的リアルタイムＰＣＲを実施して、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるトリメチル化ヒストンＨ３Ｋ４及びＨ３Ｋ２７クロマチンのマークの濃縮を分析した。データは、報告されたビバレント遺伝子座（Ｚｆｐｍ２、Ｓｏｘ２１、Ｐａｘ５、Ｌｂｘ１ｈ、Ｅｖｘ１及びＤｌｘ）の濃縮をｌｏｇ２で表す。データは、３回の独立した実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図１８】Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の共通標的遺伝子に対するＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイルを示した図である。 （Ａ）ＥＳＣの細胞溶解物を列１に添加し、内在性Ｎｒ５ａ２タンパク質をＮｒ５ａ２特異的抗体によって標的化した。列２にはＮｒ５ａ２ ３ＨＡでタグ付けした（直列型の３個のＨＡタグ）安定な細胞株の細胞溶解物を添加した。上のバンドは３ＨＡでタグ付けしたＮｒ５ａ２タンパク質を表し、下のバンドは内在性Ｎｒ５ａ２タンパク質を表す。 （Ｂ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の共通標的遺伝子に対する結合プロファイル。転写因子トリオ、Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４はＰｏｕ５ｆ１、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｔｂｘ３などの多能性のある自己再生遺伝子に結合する。これらの転写因子はまた、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃなどの細胞増殖遺伝子及びＢａｃｈ１などの酸化ストレス誘導性細胞老化に関与する遺伝子に結合する。現在及び以前のＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析（Ｃｈｅｎら、２００８）によるこれらの標的遺伝子に対する転写因子それぞれの結合プロファイルは、示したようなプロットで表される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[00017]本発明は、核内受容体、好ましくは核内受容体サブファミリー５のメンバーがインビトロで体細胞からｉＰＳＣを誘導する場合Ｏｃｔ４と代替できるという我々の発見から始まっている。さらに、オーファン核内受容体Ｎｒ５ａ２（Ｌｒｈ−１としても知られている）はまた、ＯＳＫＭと共に再プログラミングの効率を高めることができる。したがって、２個のリシン残基が変異した変異構築物（２ＫＲ）及び５個のリシン残基が変異した別の構築物（５ＫＲ）を使用して、リシン残基が変異したＮｒ５ａ２の再プログラミング能力を試験することに注目した。ウェスタン分析によって、ＷＴ及び変異体構築物が同じようなレベルのタンパク質を発現することが示された（図１３Ｒ）。際だったことに、ＯＳＫＭ再プログラミングアッセイによって、再プログラミング効率の増強がＷＴでは４倍であったのに対し、２ＫＲ変異体では少なくとも７倍になることが明らかになった（図１３Ｓ）。５ＫＲ変異体を導入したとき、再プログラミング効率はほぼ１１倍にまでさらに増大した（図１３Ｓ）。これらの結果は、ＳＵＭＯ部位の変異によってもたらされた細胞内局在の同時阻止及び転写活性の増強がＮｒ５ａ２による再プログラミングの誘導増大のきっかけとなり得ることを示唆している。核内受容体サブファミリー５によって再プログラミングされた細胞は、ＥＳＣ特異的マーカーが陽性で、３種類の系統の組織を含む奇形腫を形成してキメラを生成し得る。これらのことを考え合わせると、我々の研究は、Ｏｃｔ４に関係のない転写因子がＯｃｔ４と代替することができることを示しており、再プログラミングにおける重要な因子としての核内受容体の役割を強調している。
【００１８】
[00018]上記に基づいて、本発明は、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、前記転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップを含む方法を提供する。
【００１９】
[00019]核内受容体は、ＤＮＡに直接結合し、隣接する遺伝子の発現を調節する能力を有する。核内受容体はモジュラー構造をしており、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）などの特定のドメインを含有する。好ましい実施形態において、核内受容体は、表１に挙げた核内受容体の１つを含む。好ましくは、核内受容体は、サブファミリー５の核内受容体を含む。サブファミリー５の核内受容体は、Ｎｒ５ａ１及びＮｒ５ａ２を含む。好ましい実施形態において、核内受容体は、Ｎｒ５ａ２又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む。
【００２０】
[00020]２０個のヒトＳＯＸ遺伝子があり、全部で約３０個のＳｏｘ遺伝子が同定されている。Ｓｏｘ遺伝子は、ＤＮＡ中の小さな溝に結合する転写因子である。Ｓｏｘは、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス（ｂｏｘ）を表す。Ｓｏｘ遺伝子は、ＨＭＧ（高移動度群）ボックスと呼ばれる配列が特徴である。このＨＭＧボックスは、真菌種全体にわたって高く保存されているＤＮＡ結合ドメインである。Ｓｏｘファミリーは、１つだけの機能を有するのではなく、多くのメンバーが発生のいくつかの様々な局面を調節する能力を備えている。Ｓｏｘ遺伝子には、中枢神経系の早期発生に関与するＳＯＸ１、小脳の上皮顆粒細胞の移動状態への変化に関与するＳｏｘ２及びＳｏｘ３、胚発生の調節及び細胞の運命の決定に関与するＳｏｘ５並びに当業者には公知のその他の多くのＳｏｘ遺伝子が含まれる。好ましくは、Ｓｏｘ遺伝子は、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１及びＳｏｘ５を含む。好ましい実施形態では、Ｓｏｘ遺伝子はＳｏｘ２、Ｓｏｘ１及びＳｏｘ５の群から選択される。
【００２１】
[00021]転写因子のクルッペル様因子ファミリー（Ｋｌｆ）は、高度に保存された連結によって分離されたＣ末端に位置する３個のＣｙｓ２ Ｈｉｓ２亜鉛フィンガーが特徴である。以下のヒト遺伝子は、クルッペル様因子、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ８、ＫＬＦ９、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１１、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１３、ＫＬＦ１４、ＫＬＦ１５、ＫＬＦ１６又はＫＬＦ１７をコードする。好ましい実施形態では、クルッペル様因子は、ｋｌｆ４、ｋｌｆ２又はｋｌｆ５を含む。好ましい実施形態では、クルッペル様因子は、ｋｌｆ４、ｋｌｆ２及びｋｌｆ５の群から選択される。
【００２２】
[00022]遺伝子のＭｙｃファミリーは、転写因子を含み、転写因子は、ｂＨＬＨ/ＬＺ（基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス／ロイシンジッパー）ドメインを含有する。遺伝子のＭｙｃファミリーには、Ｎ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃ遺伝子が含まれる。好ましい実施形態では、Ｍｙｃファミリーの遺伝子はＮ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ又はＣ−Ｍｙｃを含む。好ましい実施形態では、Ｍｙｃファミリーの遺伝子はＮ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ及びＣ−Ｍｙｃの群から選択される。
【００２３】
ベクター
[00023]本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、宿主において前記ポリヌクレオチドの発現を対象とすることができる調節配列に操作可能に結合した本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００２４】
[00024]精製又は非精製形態の任意の核内受容体核酸標本を、１つ以上の開始核酸として利用することができる。
【００２５】
[00025]ＰＣＲは、単離された核内受容体配列を増幅するために使用することができるような１つのプロセスである。この技術は、例えば、ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを増幅することができ、ＤＮＡ又はＲＮＡは１本鎖又は２本鎖であってもよい。ＲＮＡを鋳型として使用する場合、鋳型をＤＮＡに逆転写するために最適な酵素及び／又は条件が使用されるだろう。さらに、それぞれの１本鎖を含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを利用してもよい。核酸の混合物も使用することができ、又は本明細書で記載した以前の増幅反応で生成した核酸も、同じ、若しくは異なるプライマーを用いて利用することができる。
【００２６】
[00026]増幅すべき特異的核酸配列は、核酸の一部であってもよく、又は特定の配列が核酸全体を構成するように、別個の核酸として最初から存在させることができる。増幅すべき配列は、純粋な形態で最初から存在している必要はなく、複雑な混合物の小画分であってもよく、例えば、全ヒトＤＮＡに含有されていてもよい。
【００２７】
[00027]本明細書で使用したＤＮＡは、身体試料、例えば、血液、組織材料、肺組織などから、当業界で公知の様々な技術によって抽出することができる。抽出した試料が精製されていなければ、増幅の前に、細胞又は試料の動物細胞膜を切断し、核酸（複数可）の鎖（複数可）を曝露し、及び／又は分離するために効果的な試薬量で処理してもよい。鎖を曝露し、分離するためのこの溶解及び核酸変性ステップによって、はるかに容易に増幅を起こさせることができるだろう。
【００２８】
[00028]デオキシリボヌクレオチド３リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰは、プライマーと別々に、又は一緒に、適切な量で合成混合物に添加し、得られた溶液を約９０度〜１００度Ｃで約１〜１０分、好ましくは１〜４分加熱する。この加熱時間の後、溶液を冷却させ、プライマーハイブリダイゼーションに利用しやすくする。冷却した混合物に、プライマー伸長反応を実施するために適切な薬剤（本明細書では「重合化用薬剤」と呼ぶ）を添加し、反応は当業界で公知の条件下で起こさせる。重合化用薬剤はまた、熱に安定ならば、その他の試薬と一緒に添加してもよい。この合成（又は増幅）反応は、室温及びそれ以上では重合化用試薬がもはや機能しない温度までで行うことができる。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを薬剤として使用する場合、温度は一般的に約４０度Ｃを上回らない。反応は室温で行うことが最も便利である。
【００２９】
[00029]プライマーは、標的ポリヌクレオチド（例えば、サブファミリー５などの核内受容体）の増幅を導く。使用するプライマーは、重合化の開始を実現するために十分な長さであり、適切な配列であるべきである。合成を促す環境条件には、ヌクレオシド３リン酸及び重合化用試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在、並びに適切な温度及びｐＨが含まれる。
【００３０】
[00030]プライマーは、増幅効率を最大にするために１本鎖であることが好ましいが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、伸長生成物を調製するために使用する前に、プライマーはまず鎖を分離するために処理してもよい。プライマーは、重合化誘導薬剤の存在下で、本発明の核内受容体の伸長生成物への合成を刺激するために十分な長さであるべきである。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液及びヌクレオチド構成を含む多くの要素に左右される。オリゴヌクレオチドプライマーは典型的に、１２〜２０以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有していてもよい。
【００３１】
[00031]プライマーは、核内受容体ゲノム遺伝子配列の各鎖と実質的に相補的であるように設計するべきである。これは、重合化用薬剤の作用を可能にする条件下で、それぞれの鎖とハイブリダイズするために、プライマーが十分相補的であるべきことを意味する。言い換えると、プライマーは、５’及び３’配列とハイブリダイズして核内受容体ゲノム遺伝子配列の増幅を可能にするために、変異に隣接した５’及び３’配列と十分相補的であるべきである。
【００３２】
[00032]本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、関与した反応ステップの数に対して指数関数的量のＣＤ１６６遺伝子配列を生成する酵素的連鎖反応であるＰＣＲ増幅プロセスで使用した。通常、１つのプライマーは、核内受容体遺伝子配列のネガティブ（−）鎖に相補的で、他方はポジティブ（＋）鎖に相補的である。変性した核酸にプライマーをアニールした後、酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片（クレノウ）及びヌクレオチドで伸長すると、標的の核内受容体遺伝子配列を含有する、新たに合成された＋及び−鎖が生じる。これらの新たに合成された配列はまた鋳型となるので、変性、プライマーアニーリング及び伸長の反復サイクルによって、プライマーによって限定された領域（すなわち、核内受容体遺伝子配列）の指数関数的生成が起こる。連鎖反応の生成物は、使用した特定のプライマーの末端に対応する終端を有する個別の核酸２本鎖である。
【００３３】
[00033]オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の適切な方法、例えば、従来のホスホトリエステル及びホスホジエステル法又はそれらの自動化実施形態を使用して調製することができる。１つのこのような自動化実施形態では、ジエチルホスホラミダイトが開始物質として使用され、当業界で知られているように合成することができる。
【００３４】
[00034]重合化用薬剤は、酵素を含めて、プライマー伸長生成物の合成を実現するために機能する任意の化合物又は系であってもよい。この目的のために適切な酵素には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、熱安定性酵素（すなわち、変性を引き起こすために十分上昇させた温度にした後でプライマー伸長を実行する酵素）、例えば、Ｔａｑポリメラーゼを含むその他の酵素が含まれる。適切な酵素は、それぞれの核内受容体遺伝子配列核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成するために適切な様式でヌクレオチドの組み合わせを促進する。一般的に、合成は、それぞれのプライマーの３’末端で開始し、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って５’方向に進行し、異なる長さの分子を生成する。
【００３５】
[00035]新たに合成された核内受容体鎖及びその相補的な核酸鎖は、前述したハイブリダイズ条件下で２本鎖分子を形成し、このハイブリッドはこのプロセスのその後のステップで使用される。
【００３６】
[00036]変性、アニーリング及び伸長生成物合成のステップは、標的の多形遺伝子配列核酸配列を必要な程度まで増幅するために必要な頻度で繰り返すことができる。生じた特定の核酸配列の量は、指数関数的に蓄積する。これはまた、当業界で公知のリアルタイムＰＣＲによって実現することができる。
【００３７】
[00037]好ましくは、核内受容体を増幅する方法は、本明細書で記載したようなＰＣＲ、又はリアルタイムＰＣＲ、及び当業者によって通常使用される通りである。増幅の代替方法も記載されたことがあり、本発明のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅された核内受容体配列が代替手段によっても同じように増幅される限り、この方法も使用することができる。このような代替増幅系には、限定はしないが、対象の短いＲＮＡ配列及びＴ７プロモーターで開始する自家持続配列複製法が含まれる。逆転写酵素がＲＮＡをｃＤＮＡに複製し、ＲＮＡを分解し、その後逆転写酵素が第２のＤＮＡ鎖を重合化する。もう１つの核酸増幅技術は、核酸配列をベースにした増幅法（ＮＡＳＢＡ）で、この増幅法は逆転写及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用し、そのサイクルスキームを標的とするために２個のプライマーを組み込む。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかで開始し、いずれかで終結することができ、６０〜９０分以内に１０８個までのコピーを増幅する。或いは、核酸は連結反応活性化転写法（ＬＡＴ）によって増幅することができる。ＬＡＴは、部分的に１本鎖で、部分的に２本鎖である１個のプライマーによって１本鎖鋳型から作動する。増幅は、ｃＤＮＡをプロモーターオリゴヌクレオチドに連結することによって開始し、数時間以内に増幅は１０８〜１０９倍になる。対象のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡに、ＭＤＶ-１と呼ばれるＲＮＡ配列を付着させることによって、ＱＢレプリカーゼ系が利用可能となる。試料と混合すると、ハイブリッドＲＮＡは標本のｍＲＮＡ中にその相補体を見出して結合し、レプリカーゼを活性化して対象のタグに沿う配列を複製する。もう１つの核酸増幅技術、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、試料中の近接した配列の存在下で、リガーゼによって共有結合し、新たな標的を形成する対象配列の２つの別々に標識された半分同士を用いることによって作動する。修復連鎖反応（ＲＣＲ）核酸増幅技術は、標的配列を幾何的に増幅するために、２個の相補的で標的特異的なオリゴヌクレオチドプローブ対、熱安定性ポリメラーゼ及びリガーゼ並びにＤＮＡヌクレオチドを使用する。２塩基のギャップがオリゴヌクレオチドプローブ対を分離し、ＲＣＲは正常なＤＮＡ修復を模倣して、このギャップを充填して接合する。鎖置換活性化法（ＳＤＡ）による核酸増幅は、標的ＤＮＡに結合する５’末端に短いオーバーハングを有する、ｈｉｎｃＩＩの認識部位を含有する短いプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼがオーバーハングに対向するプライマーの一部に、硫黄含有アデニン類似体を充填する。ＨｉｎｃＩＩが添加されるが、無修飾のＤＮＡ鎖しか切断しない。５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したＤＮＡポリメラーゼが、切れ目の部位に進入して重合化を開始し、最初のプライマー鎖を下流に向かって置換し、新規プライマーを構築し、この新規プライマーがさらなるプライマーとなる。ＳＤＡは、３７度Ｃ、２時間で１０７倍を上回る増幅を生じる。ＰＣＲ及びＬＣＲとは異なり、ＳＤＡは、機器による温度サイクルを必要としない。本発明の方法に有用なもう１つの増幅系は、ＱＢレプリカーゼ系である。本発明ではＰＣＲが好ましい増幅法であるが、これらのその他の方法も、本発明の方法で記載したように核内受容体配列を増幅するために使用することができる。
【００３８】
[00038]本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入するために複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。このようなベクターは通常、所望するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含み、宿主によって認識される複製系を含むことができ、好ましくはポリペプチドをコードする部分に操作可能に結合した転写及び翻訳開始調節配列も含む。発現ベクターには、例えば、複製開始点又は自己複製配列（ＡＲＳ）及び発現制御配列、プロモーター、エンハンサー及び必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写終止配列及びｍＲＮＡ安定化配列が含まれる。適切ならば局在化シグナルも含めることができ、天然の核内受容体タンパク質由来であっても、その他の受容体由来であっても、同種若しくは関連種の分泌ポリペプチド由来であってもよく、タンパク質が細胞膜を横断して移動するのを可能にし、従ってタンパク質の機能的形態を達成する。このようなベクターは、当業界で周知の標準的組換え技術によって調製することができる。
【００３９】
[00039]適切なプロモーター及びその他の必要なベクター配列は、宿主で機能させるために選択され、適切ならば、天然に核内受容体遺伝子に関連したものを含めることができる。細胞株及び発現ベクターの実用的な組み合わせの例は当業界では公知である。多くの有用なベクターは、当業界では公知で、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びその他などの販売会社から入手することができる。ｔｒｐ、ｌａｃなどのプロモーター及びｐｈａｇｅプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及び解糖酵素プロモーターは原核生物宿主で使用することができる。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ若しくはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、マルトース及びガラクトース利用に関連した酵素などのためのプロモーター領域が含まれる。酵母発現における使用に適したベクター及びプロモーターが知られている。適切な非天然哺乳類プロモーターには、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター又はマウスモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルス若しくはポリオーマ由来のプロモーターを含めることができる。さらに、遺伝子の複数コピーを作製することができるように、構築物は増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に結合することができる。適切なエンハンサー及びその他の発現制御配列のために。
【００４０】
[00040]このような発現ベクターは自律的に複製することができるが、当業界で周知の方法によって、宿主のゲノムに挿入することによっても複製することができる。
【００４１】
[00041]発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカー、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含有するようである。この遺伝子が存在すると、挿入物を発現する宿主のみが確実に増殖する。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質若しくはその他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに対する耐性を与える、ｂ）栄養要求性欠損を補完する、又はｃ）複合培地から利用できない必須栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えば、Ｂａｃｉｌｌｉの場合はＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に左右され、様々な宿主の適切なマーカーは当業界では周知である。
【００４２】
[00042]対象の核酸を含有するベクターはインビトロで転写され、得られたＲＮＡを周知の技術によって、例えば、注入によって宿主細胞に導入することができ、又はベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン若しくはその他の物質を使用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、感染（ベクターは感染性病原体、例えば、レトロウイルスゲノムである）及びその他の方法を含む、細胞宿主の種類に応じて変化する当業界で周知の方法によって宿主細胞に直接導入することができる。特に、前述の方法を含む当業界で公知の任意の方法によるポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、本明細書では「形質転換」と称する。以下に記載した核酸を導入した細胞とは、このような細胞の後代も含むことを意味する。
【００４３】
ポリヌクレオチド
[00043]通常核内受容体ポリペプチドをコードする、単離された核内受容体核酸分子を開示する。核酸分子は表１に挙げた機能的核内受容体ポリペプチドをコードすることができる任意の核酸を含む。好ましくは、核酸分子は、サブファミリー５の核内受容体をコードすることができる核酸、対立遺伝子変異型又は断片も含むそれらの類似体を含む。サブファミリー５の核内受容体は、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒ５ａ１又は対立遺伝子変異型のいずれか１つ、又はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び又は活性化ドメインを含む、断片を含むそれら類似体を含むことができる。具体的には、（ａ）配列番号:１、３、５、８で記載されたＤＮＡ分子又は配列番号１０などのそれらの断片をコードするＤＮＡ分子、（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズするＤＮＡ分子又はそれらのハイブリダイズできる断片、及び（ｃ）前記のＤＮＡ分子のいずれかによってコードされたアミノ酸配列の発現をコードするＤＮＡ分子からなる群から選択されるＤＮＡ分子を提供する。
【００４４】
[00044]本発明による好ましいＤＮＡ分子には、配列番号１、３、５、８で記載された配列を含むＤＮＡ分子又は配列番号１０などのそれらの断片をコードするＤＮＡ分子が含まれる。
【００４５】
[00045]ポリヌクレオチドが、天然の状態で、又は当業者に周知の方法によって操作されたときに、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ及び／又はポリペプチド又はそれらの断片を生成するために転写及び／又は翻訳され得る場合、ポリペプチドを「コードする」という。アンチセンス鎖は、このような核酸に相補的で、コードしている配列は核酸から推定することができる。
【００４６】
[00046]「単離された」又は「実質的に純粋な」核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくは混合ポリマー）とは、天然のヒト配列又はタンパク質を天然に伴うその他の細胞成分、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、その他の多くのヒトゲノム配列及びタンパク質から実質的に分離された核酸である。この用語は、天然に生じる環境から取り出された核酸配列又はタンパク質を包含し、組換え若しくはクローニングされたＤＮＡ単離物及び化学的に合成された類似体若しくは異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。
【００４７】
[00047]「核内受容体遺伝子配列」、「核内受容体遺伝子」、「核内受容体核酸」又は「核内受容体ポリヌクレオチド」はそれぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメインなどの特定のドメインを含有するポリヌクレオチドを意味する。さらに、それらは、表１に挙げたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、核酸分子は、サブファミリー５の核内受容体をコードすることができる核酸、対立遺伝子変異型又は断片を含む類似体、又はそれらの変異体を含む。サブファミリー５の核内受容体は、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒ５ａ１又は対立遺伝子変異型のいずれか１つ、又はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び又は活性化ドメインを含む、断片を含む類似体、又はそれらの変異体を含むことができる。ＳＵＭＯ化変異体は、変異したリシン残基を有するＮｒ５ａ２又はＮｒ５ａ１変異体、例えば、配列番号１又は配列番号３で記載したＮｒ５ａ２ ２ＫＲを意味することができる。
【００４８】
[00048]これらの用語は、核酸に適用する場合、核内受容体ポリペプチド、断片、例えば、タンパク質融合物、ＳＵＭＯ化変異体若しくは欠失物を含む同族変異体又は変種をコードする核酸を意味する。本発明の核酸は、天然の核内受容体をコードする遺伝子から得られた、若しくは天然の核内受容体をコードする遺伝子と実質的に類似の配列、又は天然の核内受容体をコードする遺伝子若しくはその一部と実質的に相同な配列を有する。サブファミリー５のマウスの核内受容体ポリペプチドのコーディング配列は、配列番号５及び８に示されており、アミノ酸配列は配列番号６、７及び９から１１に示されている。サブファミリー５のＳＵＭＯ化核内受容体ポリペプチドのコーディング配列は、配列番号１及び３に示されており、アミノ酸配列は配列番号２及び４に示されている。
【００４９】
[00049]核酸又はその断片は、（ヌクレオチドを適切に挿入又は欠失させて）その他の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列させたとき、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、及びより好ましくはヌクレオチド塩基の少なくとも約９５〜９８％でのヌクレオチド配列同一性を有する場合、もう１つの核酸と「実質的に相同」（又は「実質的に類似」）である。実質的に相同な断片を作動するためのコーディング配列の例は、配列番号１、３、５及び８に示されており、アミノ酸配列は配列番号２、４、６、７及び９から１１に示されている。
【００５０】
[00050]或いは、核酸又はその断片がもう１つの核酸（又はそれらの相補鎖）と選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖と、又はその相補体とハイブリダイズするときに、実質的な相同性又は（同一性）が存在する。特異性の全欠如よりも実質的により選択的なハイブリダイゼーションが起こるとき、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。通常、少なくとも約１４個のヌクレオチドの長さにわたって同一性が少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％あるとき、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。記載したように、相同性比較の長さは、より長くにわたってもよく、特定の実施形態では、しばしば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの長さである。
【００５１】
[00051]したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で挙げた配列で示された配列と好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する。ヌクレオチド相同性比較は、ポリペプチドについて以下に記載したように実施してもよい。好ましい配列比較プログラムは、以下に記載したＧＣＧウィスコンシンベストフィット（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムである。初期設定のスコアリングマトリックスは、それぞれの同一なヌクレオチドについてマッチ値が１０であり、それぞれのミスマッチについては−９である。それぞれのヌクレオチドに対して初期設定ギャップ生成ペナルティーは−５０であり、初期設定ギャップ伸張ペナルティーは−３である。
【００５２】
[00052]本発明の場合、相同な配列は、配列番号１、３、５及び８で記載されたヌクレオチド配列と少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、５００又は１０００ヌクレオチドにわたってアミノ酸レベルで少なくとも６０、７０、８０又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるヌクレオチド配列を含むと考えられる。特に、相同性は通常、タンパク質の機能に必要ではない隣接する配列よりも、必要であることが知られている近接したアミノ酸配列をコードする配列の領域に関して考えるべきである。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸１から４９９、配列番号７のアミノ酸１から５６０若しくは配列番号９のアミノ酸１から４６２をコードするポリペプチド配列である配列番号１０若しくは１１をコードするヌクレオチド配列の１個以上と５０、６０若しくは７０％を上回る相同性、より好ましくは８０、９０、９５若しくは９７％を上回る相同性を有する近接した配列を含む。好ましいポリヌクレオチドは、代わりに又はさらに、配列番号６のアミノ酸１から４９９、配列番号７のアミノ酸１から５６０、配列番号９のアミノ酸１から４６２、配列番号１０のアミノ酸１００から１８７若しくは配列番号１１のアミノ酸３１７から５６０をコードする配列番号５若しくは８の配列と８０、９０、９５若しくは９７％を上回る相同性を有する近接した配列を含んでいてもよい。好ましい核酸は、好ましくはＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメインなどの特定のドメインを含有する。
【００５３】
[00053]ヌクレオチド配列の長さは、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０、５０、１００若しくは２００ヌクレオチドである。一般的に、ポリヌクレオチドの長さが短ければ短いほど、選択的ハイブリダイゼーションを得るために必要な相同性は大きくなる。したがって、本発明のポリヌクレオチドが約３０ヌクレオチド未満からなる場合、本明細書で挙げた配列で記載された核内受容体ヌクレオチド配列と比較して、％同一性は７５％を上回ること、好ましくは９０％又は９５％を上回ることが好ましい。反対に、本発明のポリヌクレオチドが、例えば、５０若しくは１００ヌクレオチドを上回る場合、本明細書で挙げた配列で記載された核内受容体ヌクレオチド配列と比較した％同一性は低くてもよく、例えば、５０％を上回り、好ましくは６０又は７５％を上回ってもよい。
【００５４】
[00054]核酸ハイブリダイゼーションは、当業者には容易に理解されるように、塩基成分、相補鎖の長さ、ハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度又は有機溶媒などの条件によって影響を受ける。ストリンジェント温度条件は一般的に、３０度Ｃを上回る、典型的には３７度Ｃを上回る、好ましくは４５度Ｃを上回る温度を含む。ストリンジェント塩条件は、普通は１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。しかし、パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラメータの大きさよりもずっと重要である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃及び０.１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、クエン酸ナトリウム ０.０１５Ｍ、ｐＨ７．０）である。
【００５５】
[00055]本発明の「ポリヌクレオチド」成分には、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型及び混合ポリマー、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が含まれ、当業者によって容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に改変されていてもよく、又は非天然若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。このような改変には、例えば、標識、メチル化、１個以上の天然に生じるヌクレオチドの類似体による置換、電荷を有さない結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダイト、カルバマートなど）、電荷を有する結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、付属部分（例えば、ポリペプチド）、介入物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレ−ト剤、アルキル化剤、ＳＵＭＯ化部位変異体及び改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）などのヌクレオチド間の改変が含まれる。水素結合及びその他の化学的相互作用によって指定された配列に結合するポリヌクレオチドの能力を模倣した合成分子も含まれる。このような分子は当業界では公知で、例えば、ペプチド結合が分子の主鎖におけるリン酸結合と置換したものが含まれる。
【００５６】
ポリペプチド
[00056]本発明の完全長核内受容体ポリペプチドは、少なくとも８７アミノ酸を有し、動物、特に、哺乳類の核内受容体をコードしており、対立遺伝子変異型、変異体又は相同体を含む。本発明の核内受容体ポリペプチドはまた、完全長核内受容体ポリペプチドの断片及び誘導体、特に実質的に同じ、又は増強された生物活性を有する断片又は誘導体を含む。核内受容体ポリペプチドには、配列番号２、４、６、７、９、１０、１１のアミノ酸配列、又は対立遺伝子変異型、変異体又は相同体を含むものが含まれ、配列番号１０又は１１などのそれらの断片も含まれる。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１から５６０、配列番号４のアミノ酸１から５６０、配列番号６のアミノ酸１から４９９、配列番号７のアミノ酸１から５６０若しくは配列番号９のアミノ酸１から４６２、又はそれらの対立遺伝子変異型、相同体又は配列番号１０若しくは１１などの断片からなる。
【００５７】
[00057]「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマー及びその等価物を意味し、特定の長さの生成物を意味しないので、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などを意味しないか、又は排除している。定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１個以上の類似体（例えば、天然に単離されたアミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、置換された結合並びに天然及び非天然に生じる当業界に公知のその他の改変を有するポリペプチドである。
【００５８】
[00058]本発明の場合、相同な配列は、配列番号２、４、６、７、９、１０又は１１で記載されたアミノ酸配列と少なくとも２０、５０、１００、２００、３００若しくは４００アミノ酸にわたってアミノ酸レベルで少なくとも６０、７０、８０又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むものと考えられる。特に、相同性は、重要性が少ない隣接する配列、例えば、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）よりも、タンパク質の機能に必須の公知の配列、例えば、配列番号１０が一例であるＤＮＡ結合ドメイン、又は配列番号１１が一例である活性化ドメインの領域に関するものと典型的には考えられるべきである。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号２、４、６、７、９、１０若しくは１１のアミノ酸の１個以上と５０、６０又は７０％を上回る相同性、より好ましくは８０又は９０％を上回る相同性を有する近接した配列を含む。
【００５９】
[00059]その他の好ましいポリペプチドは、配列番号２、４、６、７、９、１０又は１１と４０、５０、６０又は７０％を上回る相同性有する近接した配列を含む。相同性はまた類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考えることができるが、本発明の場合、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。「実質的な相同性」又は「実質的な同一性」という用語は、ポリペプチドのことをいう場合、問題のポリペプチド又はタンパク質が天然に生じるタンパク質全体又はその一部と少なくとも約７０％の同一性、通常少なくとも約８０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０又は９５％の同一性を示すことを表す。
【００６０】
[00060]相同性比較は、目測によって、又はより通常は、容易に利用可能な配列比較プログラムによって、実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムでは、２個以上の配列の間の相同性％を算出することができる。
【００６１】
[00061]パーセント（％）相同性は、近接した配列にわたって算出することができ、すなわち、１配列をその他の配列と整列させ、１配列の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と１度に１残基ずつ直接比較する。これを「ギャップのない」アライメントと呼ぶ。典型的には、そのようなギャップのないアライメントは、比較的短い残基数（例えば、５０個未満の近接したアミノ酸）にのみ行われる。
【００６２】
[00062]これは非常に単純で一貫性のある方法であるが、例えば、1つの挿入又は欠失があると、それ以外は同一な配列対であっても、それ以降のアミノ酸残基がアライメントから閉め出される原因になるので、グローバルアライメントを行った場合、％相同性の大幅な減少が生じる可能性があることを考慮できない。したがって、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアに過度のペナルティーを課すことなく可能性のある挿入及び欠失を考慮した最適アライメントを生成するように考案されている。これは、局所相同性の最大化を試みるために配列アライメント中に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【００６３】
[00063]しかしながら、これらのより複合的な方法では、同一アミノ酸の個数が同数の場合、できるかぎり少ないギャップを有する配列アライメントが、２つの比較配列間のより高い関連性を反映して、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アライメント中に生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティー」が割り当てられる。典型的には、ギャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップ中のそれぞれの後続残基により小さいペナルティーを課する「アフィンギャップコスト（Ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ）」が使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリング系である。当然ながら、ギャップペナルティーが高ければ、より少ないギャップを有する最適化アライメントが生成されるであろう。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列比較用のこのようなソフトウェアを使用する場合、初期設定値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（下記参照）を使用する場合、アミノ酸配列に対する初期設定ギャップペナルティーは、ギャップ１つにつき−１２、各伸長につき−４である。
【００６４】
[00064]したがって、最大％相同性の計算では、最初に、ギャップペナルティーを考慮して最適アライメントを生成することが必要である。このようなアライメントを実施するのに最適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を行うことができるその他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、前述、１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０）、及び一連のＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡはいずれも、オフライン検索及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ 前述、７−５８〜７−６０頁）。しかしながら、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。
【００６５】
[00065]同一性に関して最終的な％相同性を求めることはできるが、アライメント法自体は、典型的には、絶対的な対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいてそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化類似性スコアマトリックスが広く使用される。一般に使用されるこのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、一連のＢＬＡＳＴプログラムの初期設定マトリックスである。ＧＣＧウィスコンシンプログラムでは一般的に、公開初期設定値又は供給されるのであれば、カスタムシンボル比較表のいずれかが使用される（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照されたい）。ＧＣＧパッケージでは公開初期設定値を、又は他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などの初期設定マトリックスを使用することが好ましい。
【００６６】
[00066]ソフトウェアによって最適アライメントを生成させた後、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。典型的には、ソフトウェアは配列比較の一部分としてこれを行い、数値結果を生成する。
【００６７】
[00067]核内受容体ポリペプチド相同体には、１個以上のアミノ酸が別のアミノ酸と置換されており、その置換が分化した細胞を多能性状態に再プログラミングする分子の生物学的活性を実質的に改変しないアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明による核内受容体ポリペプチドの相同性は、表１に挙げたアミノ酸のいずれかと８０％以上であることが好ましい。好ましくは、核内受容体はサブファミリー５由来で、好ましくは配列番号２、４、６、７、９、１０又は１１に記載されたアミノ酸配列に対する配列同一性のいずれか１つが８０パーセント以上の相同性を有する。本発明の範囲内の核内受容体ポリペプチド相同体の例には、配列番号２、４、６、７、９、１０又は１１のアミノ酸配列が含まれ、（ａ）１個以上のアスパラギン酸残基がグルタミン酸と置換されており、（ｂ）１個以上のイソロイシン残基がロイシンと置換されており、（ｃ）１個以上のグリシン若しくはバリン残基がアラニンと置換されており、（ｄ）１個以上のアルギニン残基がヒスチジンと置換されており、又は（ｅ）１個以上のチロシン若しくはフェニルアラニン残基がトリプトファンと置換されている。
【００６８】
[00068]好ましくは「核内受容体タンパク質」又は「核内受容体ポリペプチド」は、核内受容体遺伝子配列によってコードされるタンパク質又はポリペプチド、それらの変種又は断片を意味する。好ましくは「核内受容体タンパク質」又は「核内受容体ポリペプチド」は、表１に挙げたタンパク質又はポリペプチドを意味する。より好ましくは「核内受容体タンパク質」又は「核内受容体ポリペプチド」は、サブファミリー５のタンパク質又はポリペプチドを意味する。サブファミリー５の核内受容体には、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒ５ａ１のいずれか１つ又はその任意の変種変異体若しくは断片を含めることもできる。高又は低ストリンジェント条件下で核内受容体をコードする核酸にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされたタンパク質及び密接に関連したポリペプチド又は核内受容体タンパク質（複数可）に対する抗血清によって回収されたタンパク質も含まれる。
【００６９】
[00069]「タンパク質改変又は断片」は、1次構造配列が実質的に相同であるが、例えば、インビボ又はインビトロにおける化学的及び生化学的改変を含むか、又は通常にはないアミノ酸を組み込んだ核内受容体ポリペプチド又はその断片として、本発明によって提供される。このような改変には、当業者によって容易に理解されるように、例えば、ＳＵＭＯ化部位変異、アセチル化、カルボキシル化、ホスホリル化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば、放射性核種による標識、及び様々な酵素的改変が含まれる。ポリペプチドを標識するための様々な方法及びこのような目的のために有用な様々な置換基又は標識は、当業界では周知で、３２Ｐなどの放射性同位元素、標識したアンチリガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、蛍光色素、化学ルミネセンス剤、酵素及び標識したリガンドに対して特異的な結合対を作るメンバーとなり得るアンチリガンドが含まれる。標識の選択は必要な感受性、プライマーとの接合しやすさ、安定性要件及び利用可能な装置に左右される。ポリペプチドの標識方法は当業界では周知である。
【００７０】
[00070]ポリペプチド「断片」、「部分」又は「区域」とは、少なくとも約５個〜７個の近接したアミノ酸、しばしば少なくとも約７個〜９個の近接したアミノ酸、典型的に少なくとも約９個〜１３個の近接したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０個〜３０個以上の近接したアミノ酸のアミノ酸残基の伸長である。
【００７１】
[00071]本発明の好ましいポリペプチドは野生型完全長核転写因子と実質的に類似の機能を有する。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、野生型完全長核転写因子と実質的に類似の機能を有するポリペプチドをコードする。「実質的に類似の機能」とは、野生型核内受容体核酸又は野生型核内受容体ポリペプチドに関して、核内受容体の核酸又はポリペプチド相同体、変種、誘導体又は断片が、本明細書で記載したアッセイに従って、体細胞を再プログラミングする機能を意味する。
【００７２】
本発明の組成物
[00072]本発明によって生成したポリペプチドは、組成物の形態で再プログラミングする体細胞に投与することができる。
【００７３】
[00073]したがって、本発明はまた、治療有効量の核内受容体ポリペプチド及びＳｏｘポリペプチド、クルッペル様因子ポリペプチド又はｍｙｃファミリー由来のポリペプチドから選択される１個以上の転写因子ポリペプチドを含む医薬組成物を含む組成物に関する。本明細書では、インビトロで体細胞を再プログラミングすることができるならば、化合物は治療的に有効である。
【００７４】
[00074]注射して使用するために適切な本発明の組成物には、滅菌水性溶液（水溶性であれば）若しくは分散液及び滅菌した注射可能な溶液を即時調合するための滅菌粉末並びに又は１つ以上の担体が含まれる。或いは、注射可能な溶液は、細胞膜を通過した輸送を助けるためにリポソームに被包して送達してもよい。その代わりに又はそれに加えて、このような調製物は、細胞膜を通過する輸送を容易にするために自己集合したポア構造の構成要素を含有していてもよい。これらの調製物は製造及び保存の条件下で安定でなければならず、例えば、細菌及び真菌などの微生物の汚染／破壊作用から保護しなければならない。
【００７５】
[00075]担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。本発明の組成物中における微生物の作用の妨害は、抗菌剤及び／又は抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどを添加することによって達成される。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物を使用することによってもたらすことができる。
【００７６】
[00076]滅菌した注射可能な溶液は、必要な量の活性ポリペプチドを前記に列挙したその他の成分のいくつかと共に適切な溶媒に組み入れ、必要であればその後濾過滅菌することによって調製する。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒及び前記に列挙したものからの必要なその他の成分を含有する滅菌媒体に組み入れることによって調製する。滅菌した注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥法及び凍結乾燥法で、活性成分及びさらに所望する任意の成分の粉末を前もって滅菌濾過したそれら成分の溶液から生成する。
【００７７】
[00077]生物学的に許容される担体及び／又は希釈剤にはまた、溶媒、分散媒、抗生物質及び／又は抗菌物質、等張剤及び吸収遅延剤などのいずれか及び全てを含めることができる。このような媒質及び培養のための薬剤の使用は当業界では周知である。任意の便利な媒質又は薬剤が活性ポリペプチドに適合しない場合を除いて、組成物中において媒質又は薬剤を使用することが考えられる。
【００７８】
[00078]ポリペプチドも、前述のようなトランスフェクション高分子送達媒体及び当業者に公知のその他の方法などの当業界で公知のタンパク質送達方法によって送達することができる。
【００７９】
[00079]この組成物は、体細胞の再プログラミングにおける使用のためのものであってもよい。使用には、新たな細胞が必要とされる変性疾患を治療するための医薬品として、多能性細胞を調製するための本発明の組成物の使用が含まれる。
【００８０】
治療で使用するための多能性細胞の誘導方法
[00080]本発明の一実施形態は、多能性幹細胞治療の必要な患者を治療するための医薬品の製造において、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、個体ドナーから細胞を単離するステップ、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、前記転写因子をコードするポリヌクレオチドが、細胞を多能性細胞に誘導するために、核内受容体及び群Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ５、Ｎ−ｍｙｃ及びＬ−ｍｙｃから選択される１個以上の転写因子を含む、ステップ、多能性幹細胞治療の必要な患者に多能性細胞を導入するステップを含む方法である。
【００８１】
[00081]「治療」及び「治療する」並びにそれらの同義語は、治療的療法及び予防的又は防御的処置を意味し、その目的は変性状態を防御するか、又は鈍化させる（減少させる）ことである。このような治療を必要とする人には、脳卒中、癌、糖尿病、神経障害、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、認知症、並びに心障害及び筋肉損傷及びその他多くと既に診断された人が含まれる。
【００８２】
[00082]本明細書では、化合物の「治療有効量」は、変性状態を防御するか、又は少なくとも鈍化させる（減少させる）、特に患者の寿命を延長させることができる細胞の量である。本発明の細胞の用量及び投与は、当業者によって決定することができる。治療上使用される細胞の有効量は、例えば、治療目的、投与経路及び哺乳類の状態に左右される。したがって、治療専門家は、最適な治療効果を得るために必要な用量を調節し、投与経路を変更することが必要とされる。
【００８３】
[00083]好ましくは、本発明の多能性細胞は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、認知症又は脳卒中などの神経障害で使用される。
【００８４】
誘導多能性幹細胞株
[00084]一実施形態では、多能性幹細胞株を作製する方法は、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、群Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ５、Ｎ−ｍｙｃ及びＬ−ｍｙｃから選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップ、細胞株を維持するために多能性細胞を継代するステップを含む。
【００８５】
細胞の調製
[00085]本明細書では「細胞」とは、体内の組織、又は体液から得られた生物学的試料を意味する。細胞は、穿刺生検試料などの患者から得られた試料である「臨床試料」であることが多い。「細胞」にはまた、血液、血清などの液体から単離された細胞が含まれてもよい。細胞試料は、肺、膀胱、脳、子宮、子宮頚部、結腸、直腸、食道、口腔、頭部、筋肉、心臓、皮膚、腎臓、乳房、卵巣、首部、膵臓、前立腺、精巣、肝臓、生殖腺、胃の組織又は当業者には公知の任意のその他の臓器若しくは組織から単離して得ることができる。
【００８６】
[00086]細胞試料は身体から得られ、細胞及び細胞外物質を含む。細胞試料は、ヒト又は非ヒト動物由来であってもよい。細胞試料は、任意の臓器又は体液から得ることができる。細胞試料は、公知の方法、例えば、切除、針生検、血液抽出などを使用して得ることができる。細胞は、細胞の培養及び再プログラミングを可能にする方法で加工すべきである。したがって、対象、ドナー又は個体から得られた細胞は、理想的には洗浄してすぐに培養する。
【００８７】
細胞培養
[00087]ｉＰＳＣは、研究又は医学的処置用のインビトロで細胞を増殖させるための人工培地などの関連培養培地で、当業界で知られているように培養してもよい。細胞は、細胞の連続継代性を維持するために当業界で公知なように何世代か継代してもよい。培養培地は、細胞に栄養を与え、保持するために栄養素を含有してもよい。培養培地にはまた、細胞に所望する変化を起こさせるため、増殖因子を添加して含めてもよい。
【００８８】
好ましい実施形態の例
【００８９】
核内受容体の再プログラミング能力
[00088]再プログラミングの効率を高めることができる核内受容体を同定するため、１８種の核内受容体（表１）のスクリーニングを実施した。内在性Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰレポーターを含有するマウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）をスクリーニングで使用した。再プログラミングされたＭＥＦは、サイレンシングしたＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰレポーターの反応の結果として、ＧＦＰが発現することによって陽性に同定された。スクリーニングは、Ｏｃｔ４（Ｏ）、Ｓｏｘ２（Ｓ）、Ｋｌｆ４（Ｋ）及びｃ−Ｍｙｃ（Ｍ）ウイルスでレトロウイルスにより形質導入されたそれぞれの核内受容体について実施した。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの出現頻度は、感染させて１４日後（ｄｐｉ）に記録した。核内受容体構築物全ての転写発現も確認された（図５）。このスクリーニングによって、オーファン核内受容体Ｎｒ１ｉ２（プレグナンＸ受容体、Ｐｘｒとしても知られている）及びＮｒ５ａ２（肝臓受容体ホモログ−１、Ｌｒｈ−１としても知られている）の両方が再プログラミングの効率を（ＯＳＫＭ対照と比較して）それぞれ２．７倍及び４．０倍増強することができることを発見した（図１ａ）。
【００９０】
【表１】
【００９１】
[00089]これらの再プログラミングエンハンサーが中心的な再プログラミング因子と代替できるかどうかを次に調べようとした。ｃ−Ｍｙｃが再プログラミングに重要ではないことが以前に示されているので、ｃ−Ｍｙｃの代替能力については調べなかったが、代わりにこれら２種類の核内受容体がＯＳＫトリオのいずれかと代替する能力を調べた。注目すべきことに、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをＮｒ５ａ２及びＳＫＭウイルスで形質導入すると、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニー（播種したＭＥＦ１００，０００個当たり２３.７±３.５個）が１４ｄｐｉに認められた（図１ｂ及び図６ａ〜ｂ）。これは、外来性Ｎｒ５ａ２が再プログラミング効率を高めるだけでなく、ＭＥＦの再プログラミングにおいて外来性Ｏｃｔ４と代替することもできることを示している。Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃで再プログラミングされたこれらの細胞をＮ２ＳＫＭ ｉＰＳＣと称する。これらのコロニーは、長期間安定に継代することができ、アルカリホスファターゼ（図６ｃ）、Ｎａｎｏｇ（図６ｄ〜ｅ）及びＳＳＥＡ−１（図６ｆ〜ｇ）で陽性に染色した。
【００９２】
[00090]ｃ−Ｍｙｃが再プログラミングに必要ないならば、Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣよりも効率は低いが（播種したＭＥＦ１００，０００個当たり２.３±０.６個）Ｎｒ５ａ２及びＳＫウイルスだけで形質導入されたＰｏｕ５ｆ１−ＭＥＦからｉＰＳＣを生成することもできる（図１ｃ〜ｅ）。これらの３因子Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣと称する。Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣと同様に、Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣはアルカリホスファターゼ（図１ｆ）、Ｎａｎｏｇ（図１ｇ〜ｈ）及びＳＳＥＡ−１（図１ｉ〜ｊ）で陽性に染色した。
【００９３】
[00091]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞を細胞遺伝学的に分析すると、核型が正常であることが示された（図７ａ）。さらに、それぞれのウイルスのゲノム統合を試験し、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のゲノムＤＮＡにＯｃｔ４レトロウイルスが存在しないことを確認した（図７ｂ）。
【００９４】
Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の特徴
[00092]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のグローバル遺伝子発現プロファイルを実施して、これらのｉＰＳＣの遺伝子発現がＥＳＣと類似しているかどうかを調べた。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞株（Ｎ２ＳＫＭ及びＮ２ＳＫ）並びにＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）、ＥＳＣ及びＯＳＫＭ ｉＰＳＣ株のトランスクリプトームを特徴付けた。クラスター分析によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞はＭＥＦよりもＥＳＣ及びＯＳＫＭ ｉＰＳＣに類似していることが明らかになった（図２ａ）。さらに、発現プロファイリングによって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞では、ＥＳＣ関連遺伝子が付随して上方制御され、ＭＥＦ関連遺伝子が下方制御されることが示された（図２ｂ）。これらのことを考え合わせると、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の発現プロファイルは、ＥＳＣ及び従来のＯＳＫＭ ｉＰＳＣの両方と類似している。
【００９５】
[00093]次に、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーターのメチル化状態を調べるために、重亜硫酸塩による配列解析を実施した。プロモーターメチル化分析によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーターはほとんどがメチル化されておらず（図３ａ）、ＥＳＣのプロモーターと類似しているが、ＭＥＦのＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーター領域は高度にメチル化されていることが明らかになった。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のビバレントドメインパターンも調べた。その結果、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、６個の遺伝子（Ｚｆｐｍ２、Ｓｏｘ２１、Ｐａｘ５、Ｌｂｘ１ｈ、Ｅｖｘ１及びＤｌｘ１）に活性Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及び抑制Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３両方のクロマチン修飾を有することが示された（図３ｂ）。これらの結果は、両方のクロマチン修飾も有するＥＳＣの結果と一致しているが、どちらのクロマチンマークも解除されている分化した細胞とは異なっている。
【００９６】
[00094]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の多能性を試験するために、胚様体（ＥＢ）媒介分化アッセイ及び奇形腫形成アッセイの両方を実施した。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、インビトロで３種類の主要な胚様（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）の細胞に分化し（図８ａ）、３種類の主要な肺葉を起源とした分化組織からなる奇形腫を形成することができたので（図８ｂ）、本当に多能性があった。
【００９７】
[00095]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞を８細胞期の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ又はＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ（Ｂ６−アルビノ）胚にマイクロインジェクションすることによって、多能性のよりストリンジェントなアッセイを実施した。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞はＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦから得られたので、生殖腺では内在性Ｏｃｔ４発現が高レベルであるため、ＧＦＰ発現は生殖腺で観察するべきである。予測通り、Ｅ３.５胚は生殖腺でＧＦＰ発現を示した（図４ａ〜ｂ）。より重要なことに、生産キメラはＮ２ＳＫＭ（図６ｉ）及びＮ２ＳＫ株（図４ｃ）から作製された。
【００９８】
Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞の特徴
[00096]ステロイド産生因子１（Ｓｆ１）としても知られているＮｒ５ａ１は、Ｎｒ５ａ２と同じ核内受容体サブファミリー５に属する。したがって、Ｎｒ５ａ１が再プログラミングの効率を高め、Ｏｃｔ４と代替できるかどうかを調べることに関心を持った。Ｎｒ５ａ１は再プログラミング効率を高めるが（図９ａ）、Ｎｒ５ａ２よりは少なかった。次に、Ｎｒ５ａ１が中心的な再プログラミング因子（Ｏ、Ｓ及びＫ）のいずれかと代替できるかどうかを調べた。Ｎｒ５ａ２と同様に、Ｎｒ５ａ１はＳｏｘ２及びＫｌｆ４と代替することはできなかった。興味深いことに、Ｎｒ５ａ１及びＳＫＭウイルスで形質導入したＭＥＦは、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性ｉＰＳＣコロニーを生成した（図９ｂ〜ｄ）。これらの再プログラミングされたＭＥＦは、Ｎ１ＳＫＭ ｉＰＳＣと称する。これらのＮｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞はアルカリホスファターゼ（図９ｅ）、Ｎａｎｏｇ（図９ｆ〜ｇ）及びＳＳＥＡ−１（図９ｈ〜ｉ）を発現する。さらに、これらの核型が正常なＮ１ＳＫＭ ｉＰＳＣ（図９ｊ）は、インビトロで３種類の異なる胚葉の系列に分化することができた（図９ｋ）。Ｎｒ５ａ１による再プログラミングを独立して示すことによって、Ｎｒ５ａサブファミリーの両メンバーは本当に類似の再プログラミング特性を有することが示される。
【００９９】
[00097]次に、Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方の添加によってＯｃｔ４無しで再プログラミングの効率が高まるかどうかを調べた。したがって、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをＮｒ５ａ２、Ｎｒ５ａ１及びＳＫＭウイルスで同時形質導入した。興味深いことに、Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方をＳＫＭと共に添加すると、Ｎｒ５ａ２及びＳＫＭに対して約３倍にＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの数を増加させることができた（図１０）。この結果は、両因子を一緒に導入すると、本当に再プログラミング効率に対して相加効果を有することを示している。
【０１００】
核内受容体断片の設計
[00098]その他の核内受容体のように、Ｎｒ５ａ２はリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有する。しかし、オーファン核内受容体は、Ｎｒ５ａ２の内在性リガンドが依然として知られていない。二量体で機能を果たすほとんどの核内受容体とは異なり、Ｎｒ５ａ２は単量体の状態でＤＮＡに結合することができる。Ｏｃｔ４がない場合のＭＥＦの再プログラミングにおいて、Ｎｒ５ａ２のＬＢＤ及びＤＢＤの機能的重要性を調べた。推定リガンドの結合を阻止するために、Ｎｒ５ａ２ ＬＢＤの溝を埋めるように特定の残基を大きな残基（Ａ３６８Ｍ）に変異させた。次に、Ｎｒ５ａ２ ＤＮＡ結合活性の著しい減少を生じる、保存されたＦｔｚ−Ｆ１ドメインに２重変異（Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａ）を有するＤＢＤ変異体を作製した。したがって、ＳＫＭウイルスで形質導入したＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをまた、野生型（ＷＴ）Ｎｒ５ａ２、Ａ３６８Ｍ Ｎｒ５ａ２変異体又はＧ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａ Ｎｒ５ａ２変異体のいずれかをコードするウイルスで形質導入することによって、再プログラミングアッセイを実施した。レトロウイルスベクターが同レベルのＮｒ５ａ２タンパク質を発現することを確かめるために、ウェスタン分析を実施した（図１１ａ）。我々の結果によって、Ｎｒ５ａ２ ＬＢＤ変異体はＷＴと比較して、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの形成数を減少させないことが示された（図１１ｂ）。このことは、Ｎｒ５ａ２はリガンド結合とは独立した再プログラミング因子として機能することを示唆している。対照的に、Ｎｒ５ａ２ ＤＢＤ変異体をＳＫＭと共に導入すると、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニー数が劇的に減少した（図１１ｂ）。このことは、Ｎｒ５ａ２ ＤＢＤの完全性は、ＭＥＦにおいて再プロミングプロセスを開始するために核内受容体が標的遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域に適切に結合するために重要であることを示している。考え合わせると、ＤＢＤはＮｒ５ａ２の再プログラミング機能に必須であるが、リガンド結合はＮｒ５ａ２の再プログラミングの役割に重要ではないことが示される。
【０１０１】
[00099]Ｎｒ５ａ２又はＮｒ５ａ１による再プログラミングは、外来性Ｏｃｔ４の必要性を回避することができる転写因子の最初の報告例である。Ｎｒ５ａ２は早期マウス胚発生におけるＯｃｔ４発現の維持に関与する。Ｎｒ５ａ２は、Ｐｏｕ５ｆ１の近位エンハンサー及び近位プロモーターの領域の両方に結合することができ、マウス胚発生のエピブラスト段階においてＯｃｔ４を調節できることが示された。したがって、Ｏｃｔ４調節因子として、外来性Ｎｒ５ａ２は、ＭＥＦの再プログラミングプロセスにおいて内在性Ｏｃｔ４発現を誘導し、内在性Ｏｃｔ４と代替するのに十分であり得る。Ｎｒ５ａ１はマウスＥＳＣでは発現しないが、マウス胚性癌腫細胞においてＯｃｔ４発現を活性化し、これは、再プログラミングにおいてＯｃｔ４と代替する能力と一致する。この点について、Ｏｃｔ４発現を活性化する因子はまた、再プログラミングプロセスにおいてＯｃｔ４と代替することができると考えられる。Ｓａｌｌ４はＯｃｔ４の公知の転写調節因子である。しかし、Ｓａｌｌ４レトロウイルスをＳＫＭウイルスと共に導入しても、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーは認められなかった（データは示さず）。したがって、Ｏｃｔ４調節因子が全てｉＰＳＣの生成においてＯｃｔ４と代替できるのではないことは注目すべきことである。
【０１０２】
[000100]要約すると、我々の研究は、体細胞の再プログラミングのためにＯｃｔ４に依存しない形式（ｃｏｄｅ）を提供する。さらに、Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方が従来の４種類の因子と共に再プログラミングの効率を高めることができることも示す。要するに、再プログラミングの増強及び媒介の両方における核内受容体の予期せぬ２つの役割を明らかにした。
【０１０３】
方法
[000101]細胞培養及びトランスフェクション。ｉＰＳＣは、熱不活性化牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）１５％又はノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、Ｇｉｂｃｏ）１５％、β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）０．０５５ｍＭ、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）２ｍＭ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）０．１ｍＭ、ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）２０μｇｍｌ−１及びＬＩＦ（手製）１０００Ｕｍｌ−１を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）においてマイトマイシンＣで処理したＭＥＦフィーダーで培養し、２〜３日毎に継代した。ＭＥＦは、Ｅ１３．５胚から単離し、以前に記載したように培養した７。１０ｃｍプレート上の２９３−Ｔ細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造元の指示に従って各ＰＭＸレトロウイルスベクター２５μｇをトランスフェクトした。
【０１０４】
[000102]マウス分子遺伝学。ＭＥＦはＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰトランスジェニックマウス及びアクチン−ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ’ｓ ｌａｂ、ストック番号００４６５４及び００３５１６）から単離した。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰは、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ雄マウスと野生型１２９Ｓ２/ＳＶ雌の交配から得られたＥ１３．５胚から収集し、アクチン−ＧＦＰ ＭＥＦはアクチン−ＧＦＰマウスと野生型ＣＤ１雌マウスの交配から得られたＥ１３．５胚から収集した。８〜１２個のｉＰＳＣを、８細胞期に得たＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションした胚をＥ０．５偽妊娠雌Ｆ１（ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の卵管に移植した。キメラ胚は、Ｅ１３．５で収集し、蛍光顕微鏡で生殖腺におけるＧＦＰ発現を測定した。
【０１０５】
[000103]レトロウイルスパッケージング及び感染。Ｎｒ５ａ２及びその他の因子のｃＤＮＡ配列は、マウスＥＳＣ ｃＤＮＡ又は市販のプラスミド（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかからＰＣＲ増幅した。Ｎｒ５ａ２変異体は、適切なプライマーでＰＣＲ増幅した。増幅したコーディング配列は配列決定によって確認し、ＭＭＬＶをベースにしたｐＭＸレトロウイルスベクターにクローニングした。レトロウイルスは、既に記載したように作製した１。ｉＰＳＣ生成のために、異なる因子をコードする等量のウイルスをＦＢＳ１５％及びポリブレン６ｎｇｍｌ−１を含有するＤＭＥＭに７０％コンフルエンスでＭＥＦに導入した。１ｄｐｉに培地を新鮮なＭＥＦ培地に交換した。２ｄｐｉに、細胞をＭＥＦフィーダーに移し、前述のようにＦＢＳを含有する培養培地で６日間培養し、その後さらに５〜１５日間、前述のようにＫＳＲを含有する培養培地で培養した。
【０１０６】
[000104]ＲＮＡ抽出、逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ。前述の通りである。
【０１０７】
[000105]重亜硫酸塩ゲノム配列決定。ゲノムＤＮＡは、Ｉｍｐｒｉｎｔ（商標）ＤＮＡ修飾キット（Ｓｉｇｍａ）によって製造元の指示に従って重亜硫酸塩処理した。Ｐｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域は、ＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｍ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーで配列決定した。
【０１０８】
[000106]Ｐｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーター領域のＰＣＲ増幅で使用したプライマー配列はそれぞれ、
５’-ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡ、
５’ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣ、及び
５’−ＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴ、
５’−ＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡである。
【０１０９】
[000107]核型分析。ｉＰＳＣをコルセミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、標準低浸透圧処理によって収集し、メタノール：酢酸（３：１）で固定した。スライドは、Ｇバンド核型分析の前に空気乾燥した。
【０１１０】
[000108]遺伝子型決定。各ＰＣＲ増幅反応は、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＭＥＦ又は胚のいずれかから収集したゲノムＤＮＡ３００ｎｇで実施した。
【０１１１】
センスプライマー配列：５’−ＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣである。
【０１１２】
アンチセンスプライマー配列は、
Ｎｒ５ａ２：５’−ＧＡＣＧＣＡＡＴＡＧＣＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴＧ
Ｓｏｘ２：５’−ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴ
Ｋｌｆ４：５’−ＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧ
ｃ−Ｍｙｃ：５’−ＴＣＧＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧ
Ｏｃｔ４：５’−ＣＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＴである。
【０１１３】
[000109]ＥＢ媒介インビトロ分化。ＥＢ形成のため、ｉＰＳＣをトリプシン処理し、ペトリ皿内でＬＩＦ及びβ−メルカプトエタノールを含まないｉＰＳＣ培養培地で４〜５日培養した。ＥＢは、ゼラチンをコートしたプレートに移し、レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）１μＭを添加して５〜６日培養した。試料は４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％トリトンＸ−１００で透過処理し、８％ＦＢＳでブロックし、抗Ｇａｔａ−４（１：１００、ｓｃ−２５３１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗ネスチン（１：１００、ｓｃ−５８８１３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又は抗α−平滑筋アクチン（１：１００、ａｂ１８４６０、Ａｂｃａｍ）で染色した。次に試料は、２次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６結合抗マウス（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次いでヘキスト（１：４０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で核染色した。
【０１１４】
[000110]奇形腫アッセイ。ｉＰＳＣは、トリプシン処理によって収集し、０．９％生理食塩水中１×１０７細胞ｍｌ−１の濃度まで再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌをアベルチンで麻酔したＳＣＩＤマウスの各背側部に皮下注射した。奇形腫を３〜４週間後に切除し、重量を量り、パラフィルムに包埋する前にブアン固定液で固定した。パラフィン包埋組織を切除し、前述したようにマロリーテトラクロームで染色した２６。
【０１１５】
[000111]免疫蛍光顕微鏡及びアルカリホスファターゼ染色。ゼラチンコーティングしたカバーガラス上で培養したｉＰＳＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理し、８％ＦＢＳでブロックした。ブロック後、試料を抗Ｎａｎｏｇ（１：５０、ＲＣＡＢ０００２ＰＦ、ＣｏｓｍｏＢｉｏ）又は抗ＳＳＥＡ−１（１：２００、ＭＡＢ４３０１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色し、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８結合抗ウサギ（１：３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６結合抗マウスＩｇＭ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）それぞれで染色した。次に、核はヘキスト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色した。市販のＥＳＣ特徴付けキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用してアルカリホスファターゼ検出を実施した。
【０１１６】
[000112]ウェスタン分析。トランスフェクション４８時間後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で２９３−Ｔ細胞を可溶化した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。細胞溶解物５０μｇを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリジンジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。この膜を５％スキムミルクでブロックした。ブロック後、ブロットを抗Ｎｒ５ａ２（１：２０００、ａｂ１８２９３、Ａｂｃａｍ）又は抗アクチン（１：２０００、ｓｃ−１６１６、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）いずれかの一次抗体で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又はＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２７６８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）それぞれでインキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、シグナルはウェスタンブロッティングルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して検出した。
【０１１７】
[000113]ＣｈＩＰアッセイ。ＣｈＩＰアッセイは、以前に記載されたように実施した２７。簡単にいうと、細胞は室温で１０分間１％ホルムアルデヒドと架橋結合させ、ホルムアルデヒドはグリシン１２５ｍＭで反応停止させた。細胞溶解物は超音波処理し、クロマチン抽出物を抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（ａｂ８５８０、Ａｂｃａｍ）又は抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（０７−４４９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体で免疫沈降させた。定量ＰＣＲ分析は、以前に記載されたように実施した７。
【０１１８】
[000114]マイクロアレイ分析。マウスＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＯＳＫＭ、Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及び＃Ｂ１１）及びＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）から収集したｍＲＮＡの逆転写を実施した。各細胞株から２つの生物学的なマイクロアレイデータが繰り返し得られた。製造元の指示に従って処理したアレイ（セントリックスマウス−６発現ビーズチップ（Ｓｅｎｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ−６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ）バージョン１．１）をイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）マイクロアレイプラットホームで読み取った。個別に発現した遺伝子をマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）基準に基づいて選択した：倍率変化（（ＦＣ）＜０．６は下方制御、ＦＣ＞１．５は上方制御、ｑ値＜２％及び全試料の検出可能性は０．９５を上回る。
【０１１９】
核内受容体のスクリーニングによって、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２が再プログラミング効率を高めることができることが明らかである
【０１２０】
[000115]１９種の核内受容体（表１）の再プログラミング効率を高める能力のスクリーニングを実施した。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰレポーターを含有するＭＥＦ（図１２Ａ）（Ｆｅｎｇら、２００９ａ）を使用して、Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子の反応性に基づいて推定ｉＰＳＣコロニーを同定した。Ｏｃｔ４（Ｏ）、Ｓｏｘ２（Ｓ）、Ｋｌｆ４（Ｋ）及びｃ−Ｍｙｃ（Ｍ）レトロウイルスと共にそれぞれの核内受容体をレトロウイルスでトランスフェクトした。ＧＦＰ陽性コロニーの出現頻度は、感染させて１４日後（ｄｐｉ）に測定した。核内受容体構築物全ての転写発現が確認された（データは示さず）。このスクリーニングによって、オーファン核内受容体Ｎｒ１ｉ２（プレグナンＸ受容体、Ｐｘｒとしても知られている）及びＮｒ５ａ２（肝臓受容体ホモログ−１、Ｌｒｈ−１としても知られている）の両方が再プログラミングの効率を（ＯＳＫＭ対照と比較して）それぞれ２．７倍及び４．０倍増強することができることを発見した（図１２Ａ）。Ｎｒ５ａ２を添加するとまた、ＯＳＫＭによる再プログラミングの動態が増強され、従来の４種類の因子による再プログラミングの場合よりも３日間早くＧＦＰ発現が検出可能であった（図１２Ｂ）。細胞生存能アッセイによって、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２両方が細胞死を誘導しないことが確かめられた（図１６Ｂ）。
【０１２１】
Ｎｒ５ａ２はＭＥＦのｉＰＳＣへの再プログラミングにおいてＯｃｔ４と代替することができる
【０１２２】
[000116]次に、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２が再プログラミング効率の増強に加えて中心的再プログラミング因子と代替できるかどうかを調べた。ｃ−Ｍｙｃが再プログラミングに重要ではないことが既に示されたので（Ｎａｋａｇａｗａら、２００８；Ｗｅｒｎｉｇら、２００８）、ｃ−Ｍｙｃの代替能力については調べなかったが、代わりにこれら２種類の核内受容体がＯＳＫトリオのいずれかと代替する能力について試験した。Ｎｒ１ｉ２はＯ、Ｓ又はＫとは代替できず、Ｎｒ５ａ２はＳ又はＫと代替できなかった（図１２Ｃ）。注目すべきことに、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをＮｒ５ａ２及びＳＫＭウイルスで形質導入すると、ＧＦＰ陽性コロニー（播種したＭＥＦ１００,０００個当たり２３.７±３.５個）が１４ｄｐｉによって認められた（図１２Ｃ、図１６Ｃ及び１６Ｄ）。これは、外来性Ｎｒ５ａ２が再プログラミング効率を高めるだけでなく、内在性Ｏｃｔ４と代替することもできたことを示している。Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃで再プログラミングされたこれらの細胞をＮ２ＳＫＭ ｉＰＳＣと称する。これらのコロニーは、長期間安定に継代することができ、アルカリホスファターゼ（図１６Ｅ）、Ｎａｎｏｇ（図１６Ｆ及び１６Ｇ）及びＳＳＥＡ−１（図１６Ｈ及び１６Ｉ）で陽性に染色された。その他の１８種の核内受容体がＯｃｔ４と代替する能力についても試験した。しかし、Ｎｒ５ａ２とは異なり、いずれもＯｃｔ４とは代替できなかった（図１６Ｊ）。
【０１２３】
[000117]ｃ−Ｍｙｃが再プログラミングに重要でないならば、Ｎ２ＳＫＭの組み合わせよりも効率は低いが（播種したＭＥＦ１００，０００個当たり２.３±０.６個）、Ｎｒ５ａ２及びＳＫウイルスで形質導入されたＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦからｉＰＳＣを生成することもできた（図１２Ｄ〜１２Ｆ）。これらの３因子Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣと称する。Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣと同様に、Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣはアルカリホスファターゼ（図１２Ｇ）、Ｎａｎｏｇ（図１２Ｈ及び１２Ｉ）及びＳＳＥＡ−１（図１２Ｊ及び１２Ｋ）で陽性に染色された。
【０１２４】
[000118]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、核型が正常で（図１６Ｋ）、それぞれのウイルスのゲノムＤＮＡへのゲノム統合が確認されており、Ｏｃｔ４導入遺伝子の統合の証拠は示されなかった（図１６Ｌ）。胚様体が媒介する分化及び奇形腫形成アッセイの両方を、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の多能性を試験するために実施した。インビトロで３種類の主要な胚葉の細胞に分化し（図１７Ａ）、３種類の主要な肺葉を起源とした分化組織からなる奇形腫を形成することができたので（図１７Ｂ）、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は本当に多能性がある。
【０１２５】
[000119]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞を８細胞期の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ又はＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ（Ｂ６−アルビノ）胚にマイクロインジェクションすることによって、多能性のよりストリンジェントなアッセイを実施した。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞はＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦから得られたので、Ｅ１３．５胚は、内在性Ｏｃｔ４を高レベルで発現することによって、生殖腺においてＧＦＰ発現を示した（図１２Ｌ及び１２Ｍ）。さらに、生産キメラはＮ２ＳＫＭ（図１６Ｍ）及びＮ２ＳＫ株（図１２Ｎ）の両方から生成された。さらに重要なことに、Ｎ２ＳＫ株は生殖系列に分化可能である（図１２Ｏ、表２）。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
表の説明。あり（ｙｅｓ）はｉＰＳＣ株がアッセイで合格したことを示し、なし（ｎｏ）は生殖系列への移行が認められなかったことを示している。
【０１２８】
Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の発現及びエピジェネティックプロファイリングはＥＳＣに非常に似ている。
【０１２９】
[000120]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のグローバル遺伝子発現プロファイリングを実施し、マイクロアレイデータの階層的クラスター化によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞がＭＥＦよりもＥＳＣ及びＯＳＫＭ ｉＰＳＣとより類似していることが明らかになった（図１７Ｃ）。さらに、発現プロファイリングによって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞では、ＥＳＣ関連遺伝子が付随して上方制御され、ＭＥＦ関連遺伝子が下方制御されることが示された（図１７Ｄ）。
【０１３０】
[000121]次に、プロモーターメチル化分析によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーターはほとんどがメチル化されておらず（図１７Ｅ）、ＥＳＣと類似していることが明らかになった。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のビバレントドメインパターンも調べた。我々の結果によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、ＥＳＣと類似した活性Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及び抑制Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３両方のクロマチン修飾を有することが示された（図１７Ｆ）。
【０１３１】
近接したファミリーのメンバーＮｒ５ａ１も再プログラミング効率を高め、Ｏｃｔ４と代替することができる
【０１３２】
[000122]再プログラミングの場合、転写因子の同じファミリーの密接に関与したメンバーは互いに代替することができる（Ｆｅｎｇら、２００９ａ；Ｎａｋａｇａｗａら、２００８）。Ｎｒ５ａ１（ステロイド産生因子１、Ｓｆ１としても知られている）及びＮｒ５ａ２の両方が同じ核内受容体サブファミリーＶに属するので、Ｎｒ５ａ１が再プログラミングの効率を高め、Ｏｃｔ４と代替できるかどうかを調べることに関心を持った。Ｎｒ５ａ１は再プログラミング効率を高めるが（図１３Ａ）、Ｎｒ５ａ２よりは少なかった（図１２Ａ）。次に、Ｎｒ５ａ１が中心的な再プログラミング因子（Ｏ、Ｓ及びＫ）のいずれかと代替できるかどうかを調べた。Ｎｒ５ａ２と同様に、Ｎｒ５ａ１はＳ及びＫとは代替できないが、Ｏｃｔ４とは代替することができた（図１３Ｂ）。これらのＧＦＰ陽性ｉＰＳＣコロニー（図１３Ｃ及び１３Ｄ）をＮ１ＳＫＭ ｉＰＳＣと称する。これらのＮｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞はアルカリホスファターゼ（図１３Ｅ）、Ｎａｎｏｇ（図１３Ｆ及び１３Ｇ）及びＳＳＥＡ−１（図１３Ｈ及び１３Ｉ）を発現する。Ｎ１ＳＫＭ ｉＰＳＣにおいてウイルス性Ｎｒ５ａ１のゲノム統合を確認したが、ウイルス性Ｐｏｕ５ｆ１及びウイルス性Ｎｒ５ａ２ゲノム統合の証拠は見いだせなかった（図１３Ｊ）。これらの核型が正常なＮ１ＳＫＭ ｉＰＳＣ（図１３Ｋ）は、インビトロで３種類の異なる胚葉に分化することができ（図１３Ｌ）、３種類の異なる系列の組織を含む奇形腫を形成することができた（図１３Ｍ）。Ｎｒ５ａ１による再プログラミングを示すことによって、Ｎｒ５ａサブファミリーのいずれのメンバーも本当に類似の再プログラミング特性を有することが示される。
【０１３３】
Ｐｏｕ５ｆ１調節領域に結合するその他の転写因子は、再プログラミングにおいて外来性Ｏｃｔ４と代替することができない
【０１３４】
[000123]Ｎｒ５ａ２は、Ｐｏｕ５ｆ１の近位エンハンサー及び近位プロモーターの領域の両方に結合し、マウス胚発生のエピブラスト段階においてＰｏｕ５ｆ１を調節することが示された（Ｇｕら、２００５）。Ｎｒ５ａ２欠損胚は、エピブラストにおいてＯｃｔ４発現の欠如を示し（Ｇｕら、２００５）、Ｅ６．５とＥ７．５の間で死滅する（Ｇｕら、２００５、Ｐａｒｅら、２００４）。したがって、外来性Ｏｃｔ４との代替におけるＮｒ５ａ２の機構の一部は、Ｎｒ５ａ２が直接Ｐｏｕ５ｆ１を調節し、Ｐｏｕ５ｆ１の上流に作用するという発見によって説明することができる。
【０１３５】
[000124]Ｐｏｕ５ｆ１プロモーター又はエンハンサー領域に結合するその他の転写因子もＭＥＦの再プログラミングにおいてＯｃｔ４と代替できるか調査を続行した。したがって、Ｐｏｕ５ｆ１調節領域に結合する９種類のその他の転写因子（Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｓｔａｔ３、Ｚｆｘ、Ｔｃｆｃｐ２ｌ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｅｓｒｒｂ）を試験した（Ｃｈｅｎら、２００８）。各ウイルス転写物の発現を確認した（図１３Ｎ）。我々の結果によって、これらの転写因子はいずれもＳＫＭと組み合わせてＯｃｔ４と代替できないことが明らかになった（図１３Ｏ）。この結果は、Ｐｏｕ５ｆ１調節領域に結合する転写因子が再プログラミングにおいてＯｃｔ４と全く代替できないことを示している。したがって、Ｎｒ５ａ２及びその近接したファミリーのメンバー、Ｎｒ５ａ１はＯｃｔ４と代替する能力において特有である。
【０１３６】
Ｎｒ５ａ２のＤＮＡ結合能力は、再プログラミングにおける役割のために重要であるが、リガンド結合はあまり重要ではない
【０１３７】
[000125]その他の核内受容体のように、Ｎｒ５ａ２はリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を備えている。しかし、オーファン核内受容体では、Ｎｒ５ａ２の内在性リガンドは依然として知られていない。Ｏｃｔ４がない場合の再プログラミングにおいて、Ｎｒ５ａ２のリガンド結合及びＤＮＡ結合の機能的重要性を調べた。推定リガンドの結合を阻止するために、Ｎｒ５ａ２ ＬＢＤの溝を埋めるように特定の残基を大きな残基（Ａ３６８Ｍ）に変異させた（Ｓａｂｌｉｎら、２００３）。次に、Ｎｒ５ａ２のＤＮＡ結合活性の著しい減少を生じる、保存されたＦｔｚ−Ｆ１ドメインに２重変異（Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａ）を有するＤＮＡ結合変異体を創出した（Ｓｏｌｏｍｏｎら、２００５）。これらのレトロウイルスベクターが同レベルのＮｒ５ａ２タンパク質を発現することを確かめるために、ウェスタン分析を実施した（図１３Ｐ）。再プログラミングアッセイは、Ｎｒ５ａ２リガンド結合変異体は野生型（ＷＴ）Ｎｒ５ａ２と比較して、ＧＦＰ陽性コロニーの形成数を減少させないことを示す（図１３Ｑ）。このことは、Ｎｒ５ａ２の再プログラミング因子として機能する能力はリガンド結合とは独立していることを示唆している。対照的に、Ｎｒ５ａ２ ＤＮＡ結合変異体をＳＫＭと共に導入すると、ＧＦＰ陽性コロニー数が劇的に減少した（図１３Ｑ）。考え合わせると、ＤＮＡ結合はＮｒ５ａ２の再プログラミング機能に必須であるが、リガンド結合は重要ではないことが示される。
【０１３８】
Ｎｒ５ａ２ＳＵＭＯ化部位変異体は、再プログラミング能力の増強を示す
【０１３９】
[000126]２個のリシン残基が変異した変異構築物（２ＫＲ）及び５個のリシン残基が変異した別の構築物（５ＫＲ）を使用して、リシン残基が変異したＮｒ５ａ２の再プログラミング能力を試験した。ウェスタン分析によって、ＷＴ及び変異体構築物が同レベルのタンパク質を発現することが示された（図１３Ｒ）。注目すべきことに、ＯＳＫＭ再プログラミングアッセイによって、２ＫＲ変異体が、再プログラミング効率を、ＷＴによって実現した４倍の増強と比較して、少なくとも７倍増強することが明らかになった（図１３Ｓ）。５ＫＲ変異体を導入したとき、再プログラミング効率はほぼ１１倍までさらに高まった（図１３Ｓ）。これらの結果は、ＳＵＭＯ部位の変異によってもたらされた細胞内局在の同時阻止及び転写活性の増強がＮｒ５ａ２による再プログラミングの誘導増大のきっかけとなり得ることを示唆している。
【０１４０】
ＥＳＣにおけるＮｒ５ａ２のゲノム全体の結合分析
【０１４１】
[000127]Ｐｏｕ５ｆ１（Ｇｕら、２００５）の他に、多能性細胞においてＮｒ５ａ２の標的遺伝子は知られていない。このために、クロマチン免疫沈降配列決定（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）技術を使用することによってＥＳＣにおけるＮｒ５ａ２のゲノム全体の地図作成を実施した（表３）。ＨＡタグを付けたＮｒ５ａ２を発現する安定なＥＳＣ細胞株を作製し、ＨＡタグを付けたＮｒ５ａ２タンパク質の発現はＮｒ５ａ２特異的抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した（図１８Ａ）。Ｎｒ５ａ２結合クロマチンは、抗ＨＡタグ抗体で濃縮された。新規モチーフ発見アルゴリズムＭＥＭＥを使用し、データセットに濃縮された公知のＮｒ５ａ２モチーフを明らかにした（図１４Ａ）。より重要なことに、ペアワイズ共起分析によってＮｒ５ａ２はＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓｍａｄ１及びＥｓｒｒｂと一緒に局在する傾向があることが明らかになった（図１４Ｂ）。この結果は、Ｎｒ５ａ２を既に報告されているＮａｎｏｇ−Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２クラスターに関連付ける（Ｃｈｅｎら、２００８）。Ｎｒ５ａ２はＳｏｘ２及びＫｌｆ４と協力してＭＥＦをｉＰＳＣに再プラグラムするので、これら３種類の転写因子が同じ結合標的を共有するかどうかを調べた。興味深いことに、３種類の転写因子全てが、Ｐｏｕ５ｆ１、Ｎａｎｏｇ、Ｔｂｘ３、Ｋｌｆ２及びＫｌｆ５などのＥＳＣの独自性の維持に極めて必要な標的遺伝子に結合することを発見した（図１４Ｃ、図１８Ｂ）。
【０１４２】
ＮａｎｏｇはＮｒ５ａ２の標的である
【０１４３】
[000128]Ｎａｎｏｇは、多能性の基準状態レベルへの入り口となるので、ＥＳＣにおいて重要である（Ｓｉｌｖａら、２００９）。Ｎａｎｏｇが再プログラミング中、Ｎｒ５ａ２の標的であることを確かめるために、外来性のＨＡタグを付けたＮｒ５ａ２をＭＥＦに導入した。ＣｈＩＰ実験によって、再プログラミング中Ｎｒ５ａ２は本当にＮａｎｏｇエンハンサーに結合することが示された（図１５Ａ）。ＮａｎｏｇはＥＳＣ及びＭＥＦの両方におけるＮｒ５ａ２の標的なので（図１８Ｂ、図１５Ａ）、Ｎｒ５ａ２が関与する再プログラミングにおけるＮａｎｏｇの役割を調べた。Ｎｒ５ａ２を再プログラミングするＭＥＦに導入すると、Ｎａｎｏｇ発現が増加することを発見した（図４Ｂ）。予測通り、再プログラミング中にＮｒ５ａ２をＯＳＫＭと共に導入すると、内在性Ｐｏｕ５ｆ１はＮａｎｏｇと類似の傾向で増加する（図１５Ｃ及び１５Ｄ）。Ｎａｎｏｇは多能性状態への移行に重要なので（Ｓｉｌｖａら、２００９）、Ｎｒ５ａ２を導入することによってもたらされた再プログラミング効率の増強は、Ｎａｎｏｇによって部分的に促進され得る。
【０１４４】
[000129]次に、Ｎｒ５ａ２がＭＥＦの再プログラミングに重要かどうかを確かめたかった。ＯＳＫＭをＭＥＦに導入すると同時にＮｒ５ａ２のノックダウンを実施した。Ｎｒ５ａ２ ｓｈＲＮＡノックダウン構築物は、マウスＥＳＣにおいてＮｒ５ａ２ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を減少させることができた（図１５Ｅ及び１５Ｆ）。再プログラミング中にＮｒ５ａ２を激減させると、コロニー数の減少が生じた（図１５Ｇ）。重要なことに、外来性ＮａｎｏｇはＮｒ５ａ２のノックダウンによって生じたコロニーの減少を回復させることができた（図１５Ｇ）。Ｎａｎｏｇとは異なり、独立した因子Ｍｔｆ２は、コロニーの減少を回復させることはできなかった（図１５Ｇ）。Ｎａｎｏｇは、Ｎｒ５ａ２ノックダウンによってもたらされた再プログラミング効率の減少を回復させることはできたが、Ｎａｎｏｇは、Ｐｏｕ５ｆ１ノックダウンによる影響を回復させることはできなかった（図１５Ｇ）。興味深いことに、Ｎａｎｏｇ及びＮｒ５ａ２の両方をＯＳＫＭと共に添加すると、ＯＳＫＭと共にＮｒ５ａ２のみを添加する場合よりも多くのＧＦＰ陽性コロニーを生成することができた（図１５Ｈ）。考え合わせると、これらの結果は、ＮａｎｏｇがＭＥＦの再プログラミングにおいてＮｒ５ａ２の重要な下流標的の１つであり、再プログラミング効率の増強を媒介することを示唆している。
【０１４５】
[000130]ここでは、Ｎｒ５ａ２又はＮｒ５ａ１による再プログラミングが外来性Ｏｃｔ４の必要性を回避することができることを示す。我々のデータによって、Ｎｒ５ａ２がＳｏｘ２及びＫｌｆ４と相乗的に機能してＭＥＦの再プログラミングの成功を媒介する外来性Ｏｃｔ４と代替することが示される。Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと一緒に外来性Ｎｒ５ａ２で、ＭＥＦ以外にマウスＮＰＣを再プログラミングすることができた（データは示さず）。Ｐｏｕ５ｆ１の上流活性化因子であることに加えて（Ｇｕら、２００５）、Ｎｒ５ａ２はまた、ＥＳＣにおける基準状態の多能性の重要な媒介物であるＮａｎｏｇによって部分的に作用し（Ｓｉｌｖａら、２００９）、Ｎｒ５ａ２によるＮａｎｏｇ誘導によって多能性の獲得が促進される。最近、Ｔｇｆ−βシグナル伝達を阻害する化学物質（Ｉｃｈｉｄａら、２００９、Ｍａｈｅｒａｌｉ及びＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ、２００９）が、ＭＥＦの再プログラミングにおけるＮａｎｏｇと外来性Ｓｏｘ２の代替を誘導することが発見された（Ｉｃｈｉｄａら、２００９）。したがって、Ｎａｎｏｇは本当に再プログラミングの重要な標的である。
【０１４６】
[000131]要約すると、我々の研究は、体細胞の再プログラミングのために外来性Ｏｃｔ４に依存しない形式（ｃｏｄｅ）の一例を提供する。Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方が従来の４種類の因子と共に再プログラミングの効率を高めることができることも示す。要するに、再プログラミングの増強及び媒介の両方における核内受容体の予期せぬ２つの役割を明らかにした。
【０１４７】
細胞培養及びトランスフェクション
[000132]ｉＰＳＣは、前述のようにマイトマイシンＣ処理したＭＥＦフィーダー上で培養した（Ｆｅｎｇら、２００９ａ）。ＭＥＦは、Ｅ１３．５胚から単離し、以前に記載されたように培養した（Ｆｅｎｇら、２００９ａ）。２９３−Ｔ細胞は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造元の方法に従って、各ｐＭＸレトロウイルスベクターをトランスフェクトした。ＲＮＡｉ実験用に、ｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏベクターにクローニングしたｓｈＲＮＡ構築物をリポフェクタミンでＥＳＣにトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション１６時間後にピューロマイシン１μｇｍｌ−１で選択した。ｓｈＲＮＡ配列はＰｏｕ５ｆ１：５’−ＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡ−３’、ルシフェラーゼ：５’−ＧＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＴＡＣＡ−３’及びＮｒ５ａ２：５’ＧＣＡＡＧＴＧＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＡＡ−３’である。
【０１４８】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析
[000133]Ｎｒ５ａ２ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ（８，０２３ ４２７特有にマップされたタグ）のピーク検出（ｐｅａｋ ｃａｌｌｉｎｇ）は、ＭＡＣＳを使用してｐ値カットオフ１ｅ〜９を用いて実施し、３，３４６ピークを生成した。対照の抗ＨＡ ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーは１３，００１，２７２の特有にマップされたタグを含有した。濃縮されたモチーフは、新規モチーフ発見ツールＭＥＭＥによって、ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークの中心の２００−ｂｐ配列を使用して同定した。Ｎｒ５ａ２結合部位とその他の重要な転写因子の結合部位との重複を研究するために同時出現分析をＮｒ５ａ２ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ及び我々の以前の研究で作製したデータセットで実施した（Ｃｈｅｎら、２００８）。
【０１４９】
マイクロアレイ分析
[000134]マウスＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＯＳＫＭ、Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及び＃Ｂ１１）及びＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）から収集したｍＲＮＡの逆転写を実施した。各細胞株について、２つの生物学的な２連のマイクロアレイデータが得られた。ＯＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２及びＯＳＫＭ試料のマイクロアレイでは、生物を３連で使用した。製造元の指示に従って処理したアレイ（セントリックス（Ｓｅｎｔｒｉｘ）マウス−６発現ビーズチップ バージョン１．１）をイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）マイクロアレイプラットホームで読み取った。個別に発現した遺伝子をマイクロアレイの有意性分析基準に基づいて選択した：倍率変化（（ＦＣ）＜０．６は下方制御、ＦＣ＞１．５は上方制御、ｑ値＜０．０２及び全試料の検出可能性は０．９５超。
【０１５０】
ＧＥＯ登録コード
[000135]マイクロアレイ及びＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、ＧＥＯデータベースでそれぞれ登録番号ＧＳＥ１９０２３及びＧＳＥ１９０１９で入手できる。
【０１５１】
マウス分子遺伝学
[000136]ＭＥＦはＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰトランスジェニックマウス及びアクチン−ＧＦＰトランスジェニックマウス（ＪＡＸ研究室、ストック番号００４６５４及び００３５１６）から単離した。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰは、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ雄マウスと野生型１２９Ｓ２/ＳＶ雌の交配から得られたＥ１３．５胚から収集し、アクチン−ＧＦＰ ＭＥＦはアクチン−ＧＦＰマウスと野生型ＣＤ１雌マウスの交配から得られたＥ１３．５胚から収集した。８〜１２個のｉＰＳＣを、８細胞期で得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションした胚をＥ０．５偽妊娠雌Ｆ１（ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の卵管に移植した。キメラ胚は、Ｅ１３．５で収集し、蛍光顕微鏡で生殖腺におけるＧＦＰ発現を測定した。キメラマウスは、生殖系列関与を測定するためにアルビノＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊマウスと交配した。動物実験は全てＩＡＣＵＣ指針に従って実施した。
【０１５２】
レトロウイルス構築物、パッケージング及び感染
[000137]Ｎｒ５ａ２及びその他の因子のｃＤＮＡ配列は、マウスＥＳＣ ｃＤＮＡ又は市販のプラスミド（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかからＰＣＲ増幅した。Ｎｒ５ａ２ ＳＵＭＯ変異体（２ＫＲ：Ｋ１７３Ｒ、Ｋ２８９Ｒ及び５ＫＲ：Ｋ１７３Ｒ、Ｋ２１３Ｒ、Ｋ２８９Ｒ、Ｋ３２９Ｒ、Ｋ３８９Ｒ）のｃＤＮＡ配列は恵与された構築物（Ｙａｎｇら、２００９）から増幅した。Ｎｒ５ａ２リガンド及びＤＮＡ結合変異体は、適切なプライマーでＰＣＲ増幅した。増幅したコーディング配列は配列決定によって確認し、ＭＭＬＶをベースにしたｐＭＸレトロウイルスベクターにクローニングした。それぞれのプロモーター領域でｓｈＲＮＡノックダウンした構築物は、ｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏベクターからｐＭＸベクターに移した。レトロウイルスは、既に記載されたように作製した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６）。３Ｔ３細胞はＧＦＰ遺伝子を有するｐＭＸレトロウイルスで感染させた。４８時間感染させた後、ＧＦＰ陽性細胞の割合を定量するためにＦＡＣｓを実施した。形質導入する単位の数は、既に記載されたように計算した（Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら、２００６）。形質導入する単位の数は、感染効率（ＭＯＩ）５を実現するために必要なウイルスの量を計算するために使用した（Parkら、２００８）。ｉＰＳＣ作製のために、それぞれＭＯＩが５の異なる因子をコードするウイルスを、ＦＢＳ１５％及びポリブレン６ｎｇｍｌ−１を含有するＤＭＥＭ中で、７０％コンフルエンスでＭＥＦに導入した。１ｄｐｉで培地を新鮮なＭＥＦ培地に交換した。２ｄｐｉで、細胞をＭＥＦフィーダーに移し、ＦＢＳを含有する培養培地で６日間培養し、その後さらに５〜１５日間ＫＳＲを含有する培養培地で培養した。
【０１５３】
ＲＮＡ抽出、逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ
[000138]方法は前述の通りである（Ｆｅｎｇら、２００９）。
【０１５４】
重亜硫酸塩ゲノム配列決定
[000139]ゲノムＤＮＡは、Ｉｍｐｒｉｎｔ（商標）ＤＮＡ修飾キット（Ｓｉｇｍａ）によって製造元の指示に従って重亜硫酸塩処理した。Ｐｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域は、ＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｍ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーで配列確認した。Ｐｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーター領域のＰＣＲ増幅で使用したプライマー配列はそれぞれ、
５’−ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡ−３’、５’−ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣ−３’及び
５’−ＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴ−３’、５’−ＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡ−３’である。
【０１５５】
核型決定
[000140]ｉＰＳＣをコルセミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、標準低浸透圧処理によって収集し、メタノール：酢酸（３：１）で固定した。スライドは、Ｇバンド核型分析の前に空気乾燥した。
【０１５６】
遺伝子型決定
[000141]各ＰＣＲ増幅反応は、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＭＥＦ又は胚のいずれかから収集したゲノムＤＮＡ３００ｎｇで実施した。
センスプライマー配列：５’−ＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣ−３’。
アンチセンスプライマー配列は、
Ｎｒ５ａ２：５’−ＧＡＣＧＣＡＡＴＡＧＣＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴＧ−３’、
Ｓｏｘ２：５’−ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴ−３’、
Ｋｌｆ４：５’−ＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧ−３’
ｃ−Ｍｙｃ：５’−ＴＣＧＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧ−３’
Ｐｏｕ５ｆ１：５’−ＣＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＴ−３’である。
【０１５７】
ＥＢ媒介インビトロ分化
[000142]ＥＢ形成のため、ｉＰＳＣをトリプシン処理し、ペトリ皿でＬＩＦ及びβ−メルカプトエタノールを含まないｉＰＳＣ培養培地で４〜５日培養した。ゼラチンをコートしたプレートにＥＢを移し、レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）１μＭを添加して５〜６日培養した。試料は４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％トリトンＸ−１００で透過処理し、８％ＦＢＳでブロックし、抗Ｇａｔａ−４（１：１００、ｓｃ−２５３１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗ネスチン（１：１００、ｓｃ−５８８１３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又は抗α−平滑筋アクチン（１：１００、ａｂ１８４６０、Ａｂｃａｍ）で染色した。次に試料は、２次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６結合抗マウス（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次いでヘキスト（１：４０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で核を染色した。
【０１５８】
奇形腫アッセイ
[000143]ｉＰＳＣは、トリプシン処理によって収集し、０．９％生理食塩水に１×１０７細胞ｍｌ−１で再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌをアベルチンで麻酔したＳＣＩＤマウスの各背側部に皮下注射した。奇形腫を３〜４週間後に切除し、重量を量り、パラフィルムに包埋する前にブアン固定液で固定した。パラフィン包埋組織を切除し、既に記載されたようにマロリーテトラクロームで染色した（Ｗａｎｇ及びＬｕｆｋｉｎ、２０００）。
【０１５９】
免疫蛍光顕微鏡及びアルカリホスファターゼ染色
[000144]ゼラチンコーティングしたカバーガラス上で培養したｉＰＳＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理し、８％ＦＢＳでブロックした。ブロック後、試料を抗Ｎａｎｏｇ（１：５０、ＲＣＡＢ０００２ＰＦ、ＣｏｓｍｏＢｉｏ）又は抗ＳＳＥＡ−１（１：２００、ＭＡＢ４３０１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色し、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８結合抗ウサギ（１：３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６結合抗マウスＩｇＭ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）それぞれで染色した。次に、核はヘキスト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色した。市販のＥＳＣ特徴付けキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用して、製造元の方法にしたがってアルカリホスファターゼ検出を実施した。
【０１６０】
ウェスタン分析
[000145]プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補給したＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で細胞を可溶化した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。細胞溶解物５０μｇを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリジンジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。この膜は５％スキムミルクでブロックした。ブロックした後、ブロットを抗ＨＡ（１：２０００、ｓｃ−７３９２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗Ｎｒ５ａ２（１：２０００、ａｂ１８２９３、Ａｂｃａｍ）又は抗アクチン（１：２０００、ｓｃ−１６１６、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）１次抗体のいずれかで１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（１：５０００、１８５８４１３、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＨＲＰ結合ウサギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又はＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２７６８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）のいずれかでそれぞれインキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、シグナルはウェスタンブロッティングルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して検出した。
【０１６１】
タネルアッセイ
[000146]ＭＥＦに各ウイルスを感染させ、感染培地は２４時間後に新鮮なＭＥＦ培地と交換した。感染して７８時間後、タネルアッセイのために細胞を収集した。陽性対照のために、感染してないＭＥＦを細胞標識する前にＤＮアーゼ１（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。市販のキットを使用して、製造元（Ｒｏｃｈｅ）の方法にしたがってタネル標識を実施した。標識後、細胞はＦＡＣＳ分析を行った。
【０１６２】
ＣｈＩＰアッセイ
[000147]ＣｈＩＰアッセイは、以前に記載されたように実施した（Ｌｏｈら、２００６）。一般的に、細胞は室温で１０分間１％ホルムアルデヒドと架橋結合させ、ホルムアルデヒドはグリシン１２５ｍＭで反応停止させた。細胞溶解物を超音波処理し、クロマチン抽出物を抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（ａｂ８５８０、Ａｂｃａｍ）、抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（０７−４４９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体又は抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体で免疫沈降させた。定量ＰＣＲ分析は、以前に記載したように実施した（Ｆｅｎｇら、２００９）。
【０１６３】
[000148]当業者であれば、本明細書で記載した本発明は、具体的に記載したもの以外の変更及び改変を受けやすいことを理解するであろう。本発明には、このような変更及び改変が全て含まれる。本発明にはまた、明細書で言及した、又は指示したステップ、特徴、製剤及び化合物の全てが個々に、又は集合的に含まれ、並びに２個以上のステップ若しくは特徴の任意又は全部の組み合わせが含まれる。
【０１６４】
[000149]本文で引用したそれぞれの文書、参考文献、特許出願又は特許は、参考として全体が明らかに本明細書に組み込まれており、これは読者によって本文の一部として読まれ、考えられるべきであることを意味している。本文で引用した文書、参考文献、特許出願又は特許が本文において繰り返されていないのは、簡明にするというだけの理由である。
【０１６５】
[000150]本明細書又は本明細書で参考として組み込まれた任意の文書において述べた任意の製品のための任意の製造元の指示、記載、製品明細及び製品仕様書は、参考のために本明細書に組み込まれており、本発明の実践で使用することができる。
【０１６６】
[000151]本発明は、本明細書で記載した具体的な実施形態のいずれかによって範囲を限定されるものではない。これらの実施形態は、例示の目的だけのためのものである。機能的に等価の製品、製剤及び方法は、明らかに本明細書で記載した本発明の範囲内である。
【０１６７】
[000152]本明細書で記載した本発明は、１個以上の範囲の値（例えば、大きさ、濃度など）を含むことができる。値の範囲には、範囲内の全ての値が含まれるものと理解され、範囲を限定する値、及び範囲の境界を定める値に直接隣接した値と同じ又は実質的に同じ結果を導く、範囲に隣接した値が含まれる。
【０１６８】
[000153]本明細書全体にわたって、特に必要がなければ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載されている整数又は整数の群を含むが、その他の任意の整数又は整数の群も排除しないものと理解される。本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法でそれらのものとされる意味を有することができ、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ、並びに「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらのものと認められる意味を有し、例えば、これらは不明瞭に引用された要素は許容するが、先行技術に見出される、又は本発明の基本的な、若しくは新規の特性に影響を及ぼす要素は排除する。
【０１６９】
[000154]本明細書で使用した選択用語のその他の定義は、本発明の詳細な説明の中に見出すことができ、全体にわたって適用することができる。特に定義されていない限り、本明細書で使用したその他の科学的及び技術的用語は全て、本発明が属する業界の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０１７０】
[000155]本発明は特定の方法及び実施形態に関して記載されているが、本発明を逸脱しなければ様々な改変及び変更を行うことができることを理解されたい。
【０１７１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、いずれの内容も本明細書に参考として組み込んだ、２００９年９月３０日出願のシンガポール特許出願第２００９０６５４６−７号及び２０１０年１月９日出願の第２０１０００１４０−２号の利益及び優先権を主張する。
【技術分野】
【０００１】
[0002]本発明は、核内受容体タンパク質、及び分化した細胞を多能状態に再プログラミングする方法におけるこのようなタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0003]幹細胞治療は、疾患又は傷害を治療するために損傷を受けた組織に新たな細胞を導入する細胞療法の１種である。多能性細胞が自己再生し、様々な細胞種に分化する能力は、拒絶される危険性を伴わずに体内で罹患した組織及び損傷を受けた組織と代替することができる組織を培養する可能性を大いにもたらす。
【０００３】
[0004]幹細胞治療はいくつか存在するが、骨髄移植を注目すべき例外として、ほとんどはまだ実験段階で、及び／又は費用がかかる。医学研究者らは、癌、糖尿病、神経障害、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、認知症、並びに心障害及び筋肉損傷に加えてその他多くを治療するために、成人体細胞から得られた細胞をいつか使用することができるようになると予測している。
【０００４】
[0005]体細胞の多能性細胞への復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）とは、通常再プログラミングのことである。体細胞の核移動及び細胞融合は、分化した細胞の再プログラミングで使用される技術の例である（Ｌｅｗｉｔｚｋｙ，Ｍ．＆ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８、４６７〜７３）。再プログラミングのもう１つの方法は、４種類の転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのみをレトロウイルス導入することによってマウス線維芽細胞を再プログラミングしたときに発見された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．＆ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２６、６６３〜７６）。体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）などの転写因子を一緒に導入することによって再プログラミングし、多能状態に戻すことができる。これらの変換された細胞は、形態、遺伝子発現及びエピジェネティックマークに関して胚性幹細胞（ＥＳＣ）と多くの特性を共有し、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として知られている。ｉＰＳＣが発見されてから、様々な系列及び様々な種の細胞の再プログラミングが成功してきた（Ｆｅｎｇ，Ｂ．ら、（２００９）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４、３０１〜１２）。このような方法の効率を高めることが必要とされている。
【０００５】
[0006]草分けとなったＹａｍａｎａｋａの研究によって発見された４種類の再プログラミング因子の他に、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８などのその他の因子も再プログラミングに関与することが発見された（Ｙｕ，Ｊ．ら、（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８、１９１７〜２０）。さらに、ＥＳＣ特異的転写因子であるＵＴＦ１は、４種類のＹａｍａｎａｋａ因子及びｐ５３のノックダウンと併用するとヒト線維芽細胞の再プログラミングを増強することが示された。４種類のＹａｍａｎａｋａ転写因子のいくつかはまた、再プログラミングにおける因子と代替することが示された。例えば、Ｋｌｆ４は、Ｋｌｆ２及びＫｌｆ５に代替することができ、Ｓｏｘ２はＳｏｘ１及びＳｏｘ５に代替することができ、一方、Ｎ−ｍｙｃ及びＬ−ｍｙｃはｃ−Ｍｙｃに代替することができた。４種類の明らかにされた再プログラミング因子の中でも、Ｏｃｔ４は多能性の誘導において最も重要であることが示された（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら（２００８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６、１０１〜６）。しかし、Ｏｃｔ４はＯｃｔ１及びＯｃｔ６などの近接したファミリーのメンバーを含むその他の転写因子によって依然として代替することはできない（Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍら（２００８）。今までのところ、どの転写因子も体細胞の再プログラミングにおいてＯｃｔ４とは代替できないことが示されている。
【０００６】
[0007]Ｏｃｔ−４（オクタマー−４の略語）は、ＰＯＵファミリーのホメオドメイン転写因子タンパク質である。Ｏｃｔ−４発現は、注意深く調節しなければならない。多すぎたり、少なすぎたりすると実際に細胞の分化の原因となる。Ｏｃｔ−４は、成体の生殖細胞の腫瘍形成に関係することがある。成体マウスにおけるこの因子の異所性発現は、皮膚及び腸の異形成病変の形成の原因となることが発見された。腸の異形成は、細胞分化の阻害による前駆細胞集団の増加及びβ−カテニン転写の上方制御によって生じた。
【０００７】
[0008]胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）において発現したＯｃｔ４は、ＩＣＭ並びにＥＳＣにおける細胞の多能性の維持に重要である。神経前駆細胞（ＮＰＣ）は内在性Ｓｏｘ２を高レベルで発現するが、Ｏｃｔ４のみを異所性発現することがまだ再プログラミングに必要であった。この所見は、Ｏｃｔ４が体細胞に多能性を与えるために極めて重要であることを示唆している。さらに、Ｏｃｔ４及び前述の転写因子などの数種の転写因子のみがｉＰＳＣ生成に関与することが報告されてきた。
【０００８】
[0009]核内受容体は、直接ＤＮＡに結合し、隣接する遺伝子の発現を調節する能力を有する。核内受容体はモジュラー構造をしており、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）などの特定のドメインを含有する。核内受容体は一般的に、作用機構及びリガンド不在下での細胞内分布に応じて２つの大きな部類に分類される。４８個の公知のヒト核内受容体は、タンパク質の配列相同性に基づいてサブファミリーにさらに分類された。サブファミリー５は２個の核内受容体、ステロイド産生因子１（Ｓｆ１）としても知られているＮｒ５ａ１及びＮｒ５ａ２を含む。その他の核内受容体のように、Ｎｒ５ａ２はリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有する。しかし、オーファン核内受容体では、Ｎｒ５ａ２の内在性リガンドは依然として知られていない。二量体として機能を果たすほとんどの核内受容とは異なり、Ｎｒ５ａ２は単量体の状態でＤＮＡに結合することができる（Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ｌ．ら（１９９６）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６、３８５３〜６５）。
【発明の概要】
【０００９】
[00010]本発明は、代替転写因子及び分化した細胞を多能状態に再プログラミングする方法におけるこのような因子の使用を探究する。
【００１０】
[00011]本発明者らは、核内受容体及び核内受容体のＳＵＭＯ化変異体がインビトロで多能性幹細胞を惹起できることを示す。さらに核内受容体は、インビトロにおいて多能性幹細胞の誘導においてＯｃｔ４と代替することができるだろう。
【００１１】
[00012]したがって、本発明の一態様では、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、前記転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップを含む方法を提供する。
【００１２】
[00013]本発明の別の態様では、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５若しくは配列番号８で記載されたヌクレオチド配列又はポリペプチド配列番号１０を発現する断片を含むポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５若しくは配列番号８で記載されたヌクレオチド配列又はポリペプチド配列番号１０を発現する断片に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１１で記載された配列を含む核内受容体ポリペプチド又は配列番号１０を含有するそれらの相同体、変種、誘導体若しくは断片をコードするポリヌクレオチドから選択されるサブファミリー５の核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とのポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、宿主細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を導くことができる調節配列に操作可能に結合している、発現ベクター、を提供する。
【００１３】
[00014]本発明の別の態様では、多能性幹細胞治療の必要な患者を治療するための医薬品の製造において、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、個体ドナーから細胞を単離するステップ、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップ、多能性幹細胞治療の必要な患者に多能性細胞を導入するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
[00015]本発明の別の態様では、多能性幹細胞株の作製方法であって、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、前記ポリヌクレオチドが、核内受容体を含む転写因子と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とをコードする、ステップ、多能性細胞を継代して細胞株を維持するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
[00016]本発明のその他の態様には、好ましい実施形態の説明及び図面を参考にして、当業者に明らかであるものが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｎｒ５ａ２は再プログラミング効率を高め、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と共に、ｃ−Ｍｙｃの有無に関わらず、ＭＥＦを再プログラミングすることができる。 （ａ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）によるＭＥＦ再プログラミングの増強について、１８種の核内受容体をスクリーニングした図である。図は、ＯＳＫＭ（対照）に対してＯＳＫＭと併用したそれぞれの核因子から生成したＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｂ）ＭＥＦの再プログラミングにおいて再プログラミングエンハンサー、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２がＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４と代替する能力について試験した。ＧＦＰ陽性コロニーの定量は、１４ｄｐｉで実施した。対照実験として、核内受容体因子は導入せず、ＯＫＭ、ＯＳＭ又はＳＫＭレトロウイルスのみを添加した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｃ）Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４と一緒にＮｒ５ａ２でＭＥＦを再プログラミングして生成したＧＦＰ陽性コロニーの数を示した図である。対照実験として、ＳＫレトロウイルスのみをＭＥＦに導入した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｄ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４でＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入した後のｉＰＳＣコロニーの生成を示した図である。位相差画像を示す。 （ｅ）ｄのｉＰＳＣコロニーは、蛍光顕微鏡下で確認するとＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性であり、内在性Ｐｏｕ５ｆ１の反応性を示している。 （ｆ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣはアルカリホスファターゼを発現した。 （ｇ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＮａｎｏｇの発現を示した図である。 （ｈ）ｇの核は、ヘキストで対比染色した。 （ｉ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ−１の発現を示した図である。 （ｊ）ｉの細胞は、核を示すためにヘキストで染色した。スケールバーはｄ〜ｆでは２００μｍを表し、ｇ〜ｊでは５０μｍを表す。
【図２】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の全般的な発現プロファイルを示した図である。 （ａ）相関分析（４６，６４３プローブ）は、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＯＳＫＭ、Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１）及びＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）のトランスクリプトームをクラスター化するために実施した。ＯＳＫＭ ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃをＭＥＦにレトロウイルス導入することによって得られた。 （ｂ）ａの生物学的反復マイクロアレイデータから作製したヒートマップは、１０００個のＥＳＣ関連及びＭＥＦ関連遺伝子の発現プロファイルを示している。緑色はＭＥＦに対する遺伝子発現の下方制御を表し、赤色は遺伝子発現の上方制御を表す。
【図３】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のエピジェネティック状態を示した図である。 （ａ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーターメチル化分析を示した図である。重亜硫酸塩によるゲノム配列解析は、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞（Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１）におけるＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域のメチル化状態を分析するために実施した。それぞれの細胞株について、１０個のランダムクローンを配列決定し、結果を丸で示し、白丸はメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを表し、赤丸はメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを表す。 （ｂ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞における２価クロマチンマークを示した図である。ＣｈＩＰアッセイに続いて、定量的リアルタイムＰＣＲを実施して、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるトリメチル化ヒストンＨ３Ｋ４及びＨ３Ｋ２７クロマチンマークの濃縮を分析した。データは、報告されたビバレント（ｂｉｖａｌｅｎｔ）遺伝子座（Ｚｆｐｍ２、Ｓｏｘ２１、Ｐａｘ５、Ｌｂｘ１ｈ、Ｅｖｘ１及びＤｌｘ）の濃縮をｌｏｇ２で表す。データは、３回の独立した実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図４】Ｎ２ＳＫｉＰＳによって、マウスのキメラを作製することができることを示した図である。 （ａ）Ｅ１３．５ Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３キメラ胚から切除した雄生殖腺の明視野画像を示した図である。 （ｂ）ａのＧＦＰ蛍光画像である。ＧＦＰ陽性シグナルが生殖腺で認められ、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の生殖系への取り込みが示唆された。 （ｃ）Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ１１成体キメラの図である。１２９Ｓ２／ＳＶ Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦから得られたＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞をＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚にマイクロインジェクションし、被毛の色が混合したキメラを作製した。
【図５】ウイルス特異的プライマー及び遺伝子特異的プライマーでｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって確認した、スクリーニングされた核内受容体遺伝子を有するウイルス構築物の発現を示した図である。
【図６】Ｎｒ５ａ２は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと共にＭＥＦを再プログラミングすることを示した図である。 （ａ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃでＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入して得られたｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示した図である。 （ｂ）ａの蛍光画像は、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞における内在性Ｐｏｕ５ｆ１の回復を示している。 （ｃ）Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣにおけるアルカリホスファターゼの発現を示した図である。 （ｄ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＮａｎｏｇ発現を示した図である。 （ｅ）ｄの核は、ヘキストで対比染色した。 （ｆ）Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ−１の発現を示した図である。 （ｇ）ｆの細胞は、核を示すためにヘキストで染色している。 （ｈ）その他の核内受容体のＯｃｔ４と代替する能力についてスクリーニングを示した図である。ＭＥＦは、ＳＫＭウイルス及び核内受容体それぞれをコードするウイルスで同時形質導入した。ＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２は、陽性対照として使用した。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの形質導入を意味する。ＧＦＰ陽性コロニーの数は、１４ｄｐｉに計数した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｉ）１２９Ｓ２／ＳＶ Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦから得られたＮ２ＳＫＭ ＃Ａ５ ｉＰＳＣをＣ５７ＢＬ／６Ｊにマイクロインジェクションして作製した成体マウスキメラの図である。スケールバーはａ〜ｃでは２００μｍを表し、ｄ〜ｇでは５０μｍを表す。
【図７】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の核型及び遺伝子型分析を示した図である。 （ａ）Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１ ｉＰＳＣ株は正常な雄の核型を表した。 （ｂ）ＰＣＲによって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるレトロウイルス遺伝子、Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのゲノム組み込みが確認された。ＰＣＲは、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びｉＰＳＣから収集したゲノムＤＮＡでウイルス特異的プライマー及び遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。ＯＳＫＭ ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃでＭＥＦをウイルス形質導入することによって得られた。ｐ２１遺伝子の領域のＰＣＲ増幅は全試料で実施し、対照図で示している。
【図８】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、インビトロ及びインビボにおける分化アッセイにおいて、３種類の主要な胚葉の系列に分化することを示した図である。 （ａ）胚様体媒介インビトロ分化アッセイでは、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、３種類の主要な胚系統の細胞に分化することができることを示している。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞から分化した細胞は、Ｇａｔａ−４（内胚葉）、ネスチン（外胚葉）及びα−平滑筋アクチン（中胚葉）で陽性に染色した。分化マーカーは、赤色に染色され、ヘキスト色素は核を青色に対比染色した。 （ｂ）奇形腫アッセイにおいて、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、３種類の主要な胚葉の組織に分化したことを示した図である。奇形腫を切断し、マロリーテトラクローム（Ｍａｌｌｏｒｙ’ｓ Ｔｅｔｒａｃｈｒｏｍｅ）で染色し、外胚葉組織（神経外胚葉）、中胚葉組織（筋肉及び軟骨）及び内胚葉組織（腸管上皮細胞及び膵臓細胞）を明らかにした。スケールバーはａで１００μｍを表し、ｂで５０μｍを表す。
【図９】Ｎｒ５ａ１は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと共にＭＥＦを再プログラミングする。 （ａ）Ｎｒ５ａ１は、Ｏｃ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）による再プログラミングの効率を高める。図は、ＯＳＫＭ（対照）に対してＯＳＫＭと併用したＮｒ５ａ１から生成したＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｂ）ＭＥＦの再プログラミングにおいて、Ｎｒ５ａ１はＯｃｔ４と代替する。ＯＫＭ、ＯＳＭ及びＳＫＭそれぞれと併用してＮｒ５ａ１を同時形質導入することによって、Ｎｒ５ａ１がＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４と代替する能力について調べた。対照実験は、Ｎｒ５ａ１無しでＯＫＭ、ＯＳＭ又はＳＫＭレトロウイルスで実施した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （ｃ）Ｎｒ５ａ１、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ４によってＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入して生成したｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示した図である。 （ｄ）ｃにおけるＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性Ｎ１ＳＫＭ ｉＰＳＣコロニーの蛍光画像を示した図である。 （ｅ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞は、アルカリホスファターゼで陽性に染色した。 （ｆ）Ｎａｎｏｇは、Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞で発現した。 （ｇ）ｆのヘキスト染色は核を示している。 （ｈ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞は、ＳＳＥＡ−１で陽性に染色した。 （ｉ）ｈの細胞は、核を示すためにヘキストで染色した。 （ｊ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞株の正常な雄の核型。 （ｋ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞で実施された胚様体媒介インビトロ分化アッセイは、Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞が３種類の主要な胚系統の細胞に分化できることを示している。分化した細胞は、Ｇａｔａ４（内胚葉）、ネスチン（外胚葉）及びα−平滑筋アクチン（中胚葉）で陽性に染色した。系統マーカーは赤色に染色し、核はヘキストで青色に染色した。スケールバーはｃ〜ｅでは２００ｕｍを表し、ｆ〜ｉでは５０ｕｍを表す。
【図１０】Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１は一緒に、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃによるＭＥＦの再プログラミングを増強する。Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと共にＮｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方を導入すると、Ｎｒ５ａ２又はＮｒ５ａ１のいずれかをＳＫＭと共に形質導入するときと比較して、生成するＧＦＰ陽性コロニーの数が増加する。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみでＭＥＦを形質導入した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図１１】ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、Ｎｒ５ａ２がＭＥＦを再プログラミングするために重要であるが、Ｎｒ５ａ２のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）は再プログラミング因子としての機能に重要ではない。 （ａ）Ｎｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ Ａ３６８Ｍ（ＬＢＤ変異体）及びＮｒ５ａ２ Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａ（ＤＮＡ変異体）をコードするレトロウイルスベクターのいずれかをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞から収集した細胞抽出物のウェスタン分析によって、Ｎｒ５ａ２タンパク質の発現が等しいことが示された。ＧＦＰ遺伝子を有するレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞を陰性対照として使用した。アクチンのウェスタンブロットは、添加対照として実施した。 （ｂ）Ｎｒ５ａ２変異体が再プログラミング因子としての機能を保持する能力について分析した図である。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦは、ＳＫＭウイルス及びＮｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ Ａ３６８Ｍ又はＮｒ５ａ２ Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａをコードするウイルスで形質導入した。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの感染を表す。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図１２】Ｎｒ５ａ２は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４と共に、ｃ−Ｍｙｃを含めて、又はｃ−Ｍｙｃを含めずにＭＥＦを再プログラミングする。 （Ａ）ＯＳＫＭによる再プログラミングの増強について１９種の核内受容体をスクリーニングした図である。図は、ＯＳＫＭ（対照）に対してＯＳＫＭと一緒にしたそれぞれの核受容体因子で生成したＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。 （Ｂ）Ｎｒ５ａ２又はＮｒ１ｉ２いずれかと一緒にしたＯＳＫＭによる再プログラミングの動態を示した図である。 （Ｃ）再プログラミングエンハンサー、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２のＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４を代替する能力の再プログラミングアッセイ。対照実験として、Ｎｒ５ａ２又はＮｒ１ｉ２を加えずにレトロウイルスのそれぞれの組み合わせを添加した。 （Ｄ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４によるＭＥＦの再プログラミングから生成したＧＦＰ陽性コロニーの数を示した図である。対照実験として、ＳＫレトロウイルスのみを導入した。ＡからＤのデータは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （Ｅ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４によってＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入した後のｉＰＳＣコロニーの生成。位相差画像を示す。 （Ｆ）Ｅのコロニーは、蛍光顕微鏡下で確認するとＧＦＰ陽性であり、内在性Ｐｏｕ５ｆ１の再活性化を示している。 （Ｇ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣはアルカリホスファターゼを発現する。 （Ｈ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＮａｎｏｇの発現を示した図である。 （Ｉ）Ｈの核は、ヘキストで対比染色した。 （Ｊ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ−１の発現を示した図である。 （Ｋ）Ｊの細胞は、核を示すためにヘキストで染色した。スケールバーはＥ〜Ｇでは２００μｍを表し、Ｈ〜Ｋでは５０μｍを表す。 （Ｌ）Ｅ１３．５ Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３キメラ胚から切除した雄生殖腺の明視野画像を示した図である。 （Ｍ）ＬのＧＦＰ蛍光画像である。ＧＦＰ陽性シグナルが生殖腺で認められ、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の生殖系列への組み込みが示された。 （Ｎ）Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ１１成体キメラは、Ｂ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚にマイクロインジェクションしたＦ１（１２９Ｓ２／ＳＶ×Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）ＭＥＦから得られたＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞から生じた。 （Ｏ）Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ１１成体キメラをアルビノＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊマウスと交配して生じた出生児。アグーチ及びブラックの出生児は、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の生殖系列移行の指標である。
【図１３】Ｎｒ５ａ１で媒介された再プログラミング及びＮｒ５ａ２の再プログラミング能力に対する変異の影響を示した図である。 （Ａ）Ｎｒ５ａ１は、ＯＳＫＭによる再プログラミング効率を高める。図は、対照（ＯＳＫＭ）に対してＯＳＫＭと併用したＮｒ５ａ１から生成したＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。 （Ｂ）ＭＥＦの再プログラミングにおいて、Ｎｒ５ａ１はＯｃｔ４と代替する。ＯＫＭ、ＯＳＭ又はＳＫＭそれぞれと併用してＮｒ５ａ１を同時形質導入することによって、Ｎｒ５ａ１がＳｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＯｃｔ４と代替する能力について調べた。対照実験は、Ｎｒ５ａ１無しでＯＫＭ、ＯＳＭ又はＳＫＭレトロウイルスで実施した。 （Ｃ）Ｎｒ５ａ１及びＳＫＭによるＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦのレトロウイルス形質導入によって作製したｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示した図である。 （Ｄ）ＣにおけるＧＦＰ陽性Ｎ１ＳＫＭ ｉＰＳＣコロニーを示した図である。 （Ｅ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞は、アルカリホスファターゼで陽性に染色された。 （Ｆ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞におけるＮａｎｏｇ発現。 （Ｇ）Ｆのヘキスト染色は核を示している。 （Ｈ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞は、ＳＳＥＡ−１で陽性に染色した。 （Ｉ）Ｈのヘキスト染色は核を示している。 （Ｊ）Ｎ１ＳＫＭ株におけるレトロウイルス遺伝子Ｎｒ５ａ１のゲノム組み込みのＰＣＲによる確認。対照図は、ｐ２１遺伝子の領域のＰＣＲ増幅を示している。 （Ｋ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた株の正常な核型。 （Ｌ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞で実施されたＥＢ媒介インビトロ分化アッセイ。分化した細胞は、Ｇａｔａ４（内胚葉）、ネスチン（外胚葉）及びα−平滑筋アクチン（中胚葉）で陽性に染色した。系統マーカーは赤色に染色し、核はヘキストで青色に染色した。 （Ｍ）Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞の奇形腫アッセイ。スケールバーはＣ〜Ｅでは２００μｍ、Ｌでは１００μｍ及びＦ〜Ｉ、Ｍでは５０μｍを表す。 （Ｎ）Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｓｔａｔ３、Ｚｆｘ、Ｔｃｆｃｐ２ｌ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｎ−Ｍｙｃ及びＥｓｒｒｂのウイルス転写物発現のＰＣＲによる確認。 （Ｏ）ＳＫＭと併用したＰｏｕ５ｆ１調節領域に結合する転写因子のスクリーニング。対照は、ＳＫＭウイルスのみのＭＥＦへの形質導入を表す。ＳＫＭを有するＮｒ５ａ１及びＮｒ５ａ２は、陽性対照として使用した。 （Ｐ）Ｎｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ Ａ３６８Ｍ及びＮｒ５ａ２ Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａをコードするいずれかのレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞から収集した細胞抽出物のウェスタン分析。ＧＦＰ遺伝子を有するレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞を陰性対照として使用した。 （Ｑ）Ｎｒ５ａ２リガンド及びＤＮＡ結合変異体によるＳＫＭ再プログラミング。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦは、ＳＫＭウイルス及びＮｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ Ａ３６８Ｍ又はＮｒ５ａ２ Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａのいずれかをコードするウイルスで形質導入した。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの感染を表す。 （Ｒ）Ｎｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ ２ＫＲ及びＮｒ５ａ２ ５ＫＲをコードするいずれかのレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞から収集した細胞抽出物のウェスタン分析。いかなる遺伝子も有さないレトロウイルスベクターをトランスフェクトした２９３−Ｔ細胞を陰性対照として使用した。 （Ｓ）Ｎｒ５ａ２ ＳＵＭＯ変異体とのＯＳＫＭ再プログラミング。対照実験は、ＯＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの感染を表す。図は、対照の陽性コロニー数に対する、ＯＳＫＭウイルス及びＮｒ５ａ２ ＷＴ、Ｎｒ５ａ２ ２ＫＲ又はＮｒ５ａ２ ５ＫＲのいずれかをコードするウイルスをＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦに感染させて生成したＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。Ａ〜Ｂ、Ｏ、Ｑ及びＳのデータは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図１４】Ｎｒ５ａ２結合部位のゲノム全体マッピングを示した図である。 （Ａ）Ｎｒ５ａ２結合部位の過剰出現配列を調べる新規モチーフ発見アルゴリズムＭＥＭＥによって作製したＮｒ５ａ２のモチーフ。 （Ｂ）Ｎｒ５ａ２及びその他の転写因子の同時出現を示すヒートマップ。ヒートマップ中のそれぞれの四角は、２つの転写因子間の同時局在頻度を表す（赤色は同時局在の頻度が低いことを表し、黄色は同時局在の頻度が高いことを表す）。転写因子は、その他の因子との同時局在における類似性に基づいて両軸に沿って密集していた。転写因子は、Ｎｒ５ａ２と同時局在する傾向がある青い枠によって区別された。 （Ｃ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４が結合する、ＥＳＣの独自性の維持及び細胞増殖などの様々な細胞の役割において重要な遺伝子。
【図１５】Ｎａｎｏｇは、再プログラミングにおけるＮｒ５ａ２の下流標的である。 （Ａ）ＭＥＦの再プログラミング中に、Ｎｒ５ａ２はＮａｎｏｇエンハンサーと結合する。ＣｈＩＰアッセイは、ＯＳＫＭ及びＨＡ-Ｎｒ５ａ２ウイルスを同時形質導入して８日後のＭＥＦで実施した。定量的リアルタイムＰＣＲは、抗ＨＡ抗体を使用してＮａｎｏｇエンハンサーに対するＨＡ-Ｎｒ５ａ２の濃縮を分析するために実施した。示されたデータは、２連の生物試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均±標準誤差を意味する。 （Ｂ）経時的（３、７及び１１ｄｐｉ）３連の生物学的マイクロアレイデータ（平均±標準誤差）に基づいた、ＯＳＫＭ再プログラミング細胞と比較したＯＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２再プログラミング細胞におけるＮａｎｏｇの発現レベルの倍率変化。ＥＳＣ関連遺伝子、Ｇｄｆ３及びＺｉｃ３の発現レベルの倍率変化も図に含めた。 （Ｃ）感染していないＭＥＦに対してＯＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２又はＯＳＫＭで感染したＭＥＦにおける内在性Ｐｏｕ５ｆ１ ｍＲＮＡレベルの経時的倍率変化。 （Ｄ）感染していないＭＥＦに対してＯＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２又はＯＳＫＭで感染したＭＥＦにおける内在性Ｎａｎｏｇ ｍＲＮＡレベルの経時的倍率変化。Ｃ〜Ｄにおけるリアルタイム定量的ＰＣＲデータは、３連の生物学的試料の平均±標準誤差である。 （Ｅ）Ｎｒ５ａ２ ｓｈＲＮＡでノックダウンした後のＥＳＣにおけるＮｒ５ａ２ ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲによる確認。対照ＥＳＣは、ルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡ構築物をトランスフェクトした。 （Ｆ）Ｎｒ５ａ２を標的とするノックダウン構築物を導入した後のＥＳＣにおけるＮｒ５ａ２タンパク質発現のウェスタン分析。Ｎｒ５ａ２タンパク質は、Ｎｒ５ａ２に特異的な抗体で標的化した。 （Ｇ）ＯＳＫＭ再プログラミングにおけるＮｒ５ａ２のｓｈＲＮＡノックダウン。ＯＳＫＭを有するＰｏｕ５ｆ１ ＲＮＡｉは、陽性ノックダウン対照として使用し、ルシフェラーゼＲＮＡｉは陰性ノックダウン対照として使用する。Ｎａｎｏｇ又はＭｔｆ２は、ノックダウン効果を回復させる能力を調べるために導入した。 （Ｈ）Ｎｒ５ａ２及びＮａｎｏｇの両方に添加したＯＳＫＭによる再プログラミング。図は、対照に対するＧＦＰ陽性コロニーの数の倍率変化を表している。Ｅ、Ｇ及びＨのデータは、３回の独立した実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差である。
【図１６】Ｎｒ５ａ２は、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと共にＭＥＦを再プログラミングすることを示した図である。 （Ａ）ＭＥＦにおいて遺伝子導入したＰｏｕ５ｆ１高感度緑蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）レポーター構築物の模式図である。ＥＧＦＰの発現は、Ｐｏｕ５ｆ１調節領域の制御下にあり、調節領域にはＰｏｕ５ｆ１遠位エンハンサー及びＰｏｕ５ｆ１プロモーターが含まれる（Ｓｚａｂｏら、２００２）。 （Ｂ）Ｎｒ５ａ２及びＮｒ１ｉ２感染ＭＥＦのタネルアッセイ。図は、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析後のタネル陽性細胞の割合を示している。ＭＥＦに、（ｐＭＸ）、Ｎｒ１ｉ２（ｐＭＸ−Ｎｒ１ｉ２）又はＮｒ５ａ２（pＭＸ-Ｎｒ５ａ２）のいずれの遺伝子もコードしないレトロウイルスを感染させた。陽性対照として、感染してないＭＥＦをタネル標識の前にＤＮアーゼ１処理した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （Ｃ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃでＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをレトロウイルス形質導入して得られたｉＰＳＣコロニーの位相差画像を示した図である。 （Ｄ）Ｃの蛍光画像は、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞における内在性Ｐｏｕ５ｆ１の回復を示している。 （Ｅ）Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣにおけるアルカリホスファターゼの発現を示した図である。 （Ｆ）Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣにおけるＮａｎｏｇ発現を示した図である。 （Ｇ）Ｆの核は、ヘキストで対比染色した。 （Ｈ）Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣにおけるＳＳＥＡ−１の発現を示した図である。 （Ｉ）Ｈの細胞は、核を示すためにヘキストで染色している。スケールバーはＣ〜Ｅでは２００μｍを表し、Ｆ〜Ｉでは５０μｍを表す。 （Ｊ）その他の核内受容体のＯｃｔ４と代替する能力についてスクリーニングを示した図である。ＭＥＦは、ＳＫＭウイルス及び核内受容体それぞれをコードするウイルスを同時形質導入した。ＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２は、陽性対照として使用した。対照実験は、ＳＫＭウイルスのみによるＭＥＦの形質導入を示す。ＧＦＰ陽性コロニーの数は、１４ｄｐｉで計数した。データは、３回のレトロウイルス媒介形質導入実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。 （Ｋ）Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１ ｉＰＳＣ株の核型分析。 （Ｌ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の遺伝子型分析。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるレトロウイルス遺伝子、Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃのゲノム統合のＰＣＲによる確認は、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びｉＰＳＣから収集したゲノムＤＮＡに対してウイルス特異的プライマー及び遺伝子特異的プライマーを用いて実施した。ＯＳＫＭ ｉＰＳＣは、ＭＥＦをＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃでウイルス形質導入することによって得られた。ｐ２１遺伝子の領域のＰＣＲ増幅は全試料について実施し、対照図で示している。 （Ｍ）Ｆ１（１２９Ｓ２／ＳＶ×Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）ＭＥＦから得られたＮ２ＳＫＭ ＃Ａ５ ｉＰＳＣをＣ５７ＢＬ／６Ｊにマイクロインジェクションして生成した成体マウスキメラの図である。
【図１７】Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、インビトロ及びインビボの分化アッセイで、３種類の主要な胚葉系列に分化し、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の網羅的発現プロファイリング及びエピジェネティック状態を示した図である。 （Ａ）胚様体（ＥＢ）媒介インビトロ分化アッセイでは、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は３種類の主要な胚系統の細胞に分化することができることを示している。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞から分化した細胞は、Ｇａｔａ−４（内胚葉）、ネスチン（外胚葉）及びα−平滑筋アクチン（中胚葉）で陽性に染色した。分化マーカーは赤色で染色され、ヘキスト色素は核を青色に対比染色した。 （Ｂ）奇形腫アッセイにおいて、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、３種類の主要な胚葉の組織に分化することを示した図である。奇形腫を切断し、マロリーテトラクロームで染色することによって、外胚葉組織（神経外胚葉）、中胚葉組織（筋肉及び軟骨）及び内胚葉組織（腸管上皮細胞及び膵臓細胞）を明らかにした。スケールバーはＡでは１００μｍを表し、Ｂでは５０μｍを表す。 （Ｃ）相関分析（４６，６４３プローブ）は、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＯＳＫＭ、Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及びＮ２ＳＫ ＃Ｂ１１）及びＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）のトランスクリプトームをクラスター化するために実施した。 （Ｄ）Ｃのマイクロアレイデータから作製したヒートマップは、１０００個のＥＳＣ関連及びＭＥＦ関連遺伝子の発現プロファイルを示している。遺伝子は、ＥＳＣ及びＰｏｕ５ｆ１-ＧＦＰ ＭＥＦにおける発現の倍率変化に基づいて選択し、平均発現比によって分類し、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦシグナルに平均を中心化した（ｍｅａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）。緑色はＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦに対して遺伝子発現の下方制御を表し、赤色は遺伝子発現の上方制御を表す。 （Ｅ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーターメチル化分析を示した図である。重亜硫酸塩によるゲノム配列解析は、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域のメチル化状態を分析するために実施した。それぞれの細胞株について、１０個のランダムクローンを配列決定し、結果を丸で示し、白丸はメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを表し、赤丸はメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを表す。 （Ｆ）Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるビバレントクロマチンマーク。ＣｈＩＰアッセイに続いて、定量的リアルタイムＰＣＲを実施して、ＥＳＣ、ＭＥＦ及びＮｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるトリメチル化ヒストンＨ３Ｋ４及びＨ３Ｋ２７クロマチンのマークの濃縮を分析した。データは、報告されたビバレント遺伝子座（Ｚｆｐｍ２、Ｓｏｘ２１、Ｐａｘ５、Ｌｂｘ１ｈ、Ｅｖｘ１及びＤｌｘ）の濃縮をｌｏｇ２で表す。データは、３回の独立した実験（ｎ＝３）の平均±標準誤差を表す。
【図１８】Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の共通標的遺伝子に対するＣｈＩＰ−ｓｅｑ結合プロファイルを示した図である。 （Ａ）ＥＳＣの細胞溶解物を列１に添加し、内在性Ｎｒ５ａ２タンパク質をＮｒ５ａ２特異的抗体によって標的化した。列２にはＮｒ５ａ２ ３ＨＡでタグ付けした（直列型の３個のＨＡタグ）安定な細胞株の細胞溶解物を添加した。上のバンドは３ＨＡでタグ付けしたＮｒ５ａ２タンパク質を表し、下のバンドは内在性Ｎｒ５ａ２タンパク質を表す。 （Ｂ）Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の共通標的遺伝子に対する結合プロファイル。転写因子トリオ、Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４はＰｏｕ５ｆ１、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｔｂｘ３などの多能性のある自己再生遺伝子に結合する。これらの転写因子はまた、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃなどの細胞増殖遺伝子及びＢａｃｈ１などの酸化ストレス誘導性細胞老化に関与する遺伝子に結合する。現在及び以前のＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析（Ｃｈｅｎら、２００８）によるこれらの標的遺伝子に対する転写因子それぞれの結合プロファイルは、示したようなプロットで表される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[00017]本発明は、核内受容体、好ましくは核内受容体サブファミリー５のメンバーがインビトロで体細胞からｉＰＳＣを誘導する場合Ｏｃｔ４と代替できるという我々の発見から始まっている。さらに、オーファン核内受容体Ｎｒ５ａ２（Ｌｒｈ−１としても知られている）はまた、ＯＳＫＭと共に再プログラミングの効率を高めることができる。したがって、２個のリシン残基が変異した変異構築物（２ＫＲ）及び５個のリシン残基が変異した別の構築物（５ＫＲ）を使用して、リシン残基が変異したＮｒ５ａ２の再プログラミング能力を試験することに注目した。ウェスタン分析によって、ＷＴ及び変異体構築物が同じようなレベルのタンパク質を発現することが示された（図１３Ｒ）。際だったことに、ＯＳＫＭ再プログラミングアッセイによって、再プログラミング効率の増強がＷＴでは４倍であったのに対し、２ＫＲ変異体では少なくとも７倍になることが明らかになった（図１３Ｓ）。５ＫＲ変異体を導入したとき、再プログラミング効率はほぼ１１倍にまでさらに増大した（図１３Ｓ）。これらの結果は、ＳＵＭＯ部位の変異によってもたらされた細胞内局在の同時阻止及び転写活性の増強がＮｒ５ａ２による再プログラミングの誘導増大のきっかけとなり得ることを示唆している。核内受容体サブファミリー５によって再プログラミングされた細胞は、ＥＳＣ特異的マーカーが陽性で、３種類の系統の組織を含む奇形腫を形成してキメラを生成し得る。これらのことを考え合わせると、我々の研究は、Ｏｃｔ４に関係のない転写因子がＯｃｔ４と代替することができることを示しており、再プログラミングにおける重要な因子としての核内受容体の役割を強調している。
【００１８】
[00018]上記に基づいて、本発明は、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、前記転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップを含む方法を提供する。
【００１９】
[00019]核内受容体は、ＤＮＡに直接結合し、隣接する遺伝子の発現を調節する能力を有する。核内受容体はモジュラー構造をしており、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及びリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）などの特定のドメインを含有する。好ましい実施形態において、核内受容体は、表１に挙げた核内受容体の１つを含む。好ましくは、核内受容体は、サブファミリー５の核内受容体を含む。サブファミリー５の核内受容体は、Ｎｒ５ａ１及びＮｒ５ａ２を含む。好ましい実施形態において、核内受容体は、Ｎｒ５ａ２又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む。
【００２０】
[00020]２０個のヒトＳＯＸ遺伝子があり、全部で約３０個のＳｏｘ遺伝子が同定されている。Ｓｏｘ遺伝子は、ＤＮＡ中の小さな溝に結合する転写因子である。Ｓｏｘは、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス（ｂｏｘ）を表す。Ｓｏｘ遺伝子は、ＨＭＧ（高移動度群）ボックスと呼ばれる配列が特徴である。このＨＭＧボックスは、真菌種全体にわたって高く保存されているＤＮＡ結合ドメインである。Ｓｏｘファミリーは、１つだけの機能を有するのではなく、多くのメンバーが発生のいくつかの様々な局面を調節する能力を備えている。Ｓｏｘ遺伝子には、中枢神経系の早期発生に関与するＳＯＸ１、小脳の上皮顆粒細胞の移動状態への変化に関与するＳｏｘ２及びＳｏｘ３、胚発生の調節及び細胞の運命の決定に関与するＳｏｘ５並びに当業者には公知のその他の多くのＳｏｘ遺伝子が含まれる。好ましくは、Ｓｏｘ遺伝子は、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１及びＳｏｘ５を含む。好ましい実施形態では、Ｓｏｘ遺伝子はＳｏｘ２、Ｓｏｘ１及びＳｏｘ５の群から選択される。
【００２１】
[00021]転写因子のクルッペル様因子ファミリー（Ｋｌｆ）は、高度に保存された連結によって分離されたＣ末端に位置する３個のＣｙｓ２ Ｈｉｓ２亜鉛フィンガーが特徴である。以下のヒト遺伝子は、クルッペル様因子、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ３、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＫＬＦ６、ＫＬＦ７、ＫＬＦ８、ＫＬＦ９、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１１、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１３、ＫＬＦ１４、ＫＬＦ１５、ＫＬＦ１６又はＫＬＦ１７をコードする。好ましい実施形態では、クルッペル様因子は、ｋｌｆ４、ｋｌｆ２又はｋｌｆ５を含む。好ましい実施形態では、クルッペル様因子は、ｋｌｆ４、ｋｌｆ２及びｋｌｆ５の群から選択される。
【００２２】
[00022]遺伝子のＭｙｃファミリーは、転写因子を含み、転写因子は、ｂＨＬＨ/ＬＺ（基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス／ロイシンジッパー）ドメインを含有する。遺伝子のＭｙｃファミリーには、Ｎ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃ遺伝子が含まれる。好ましい実施形態では、Ｍｙｃファミリーの遺伝子はＮ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ又はＣ−Ｍｙｃを含む。好ましい実施形態では、Ｍｙｃファミリーの遺伝子はＮ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ及びＣ−Ｍｙｃの群から選択される。
【００２３】
ベクター
[00023]本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、宿主において前記ポリヌクレオチドの発現を対象とすることができる調節配列に操作可能に結合した本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００２４】
[00024]精製又は非精製形態の任意の核内受容体核酸標本を、１つ以上の開始核酸として利用することができる。
【００２５】
[00025]ＰＣＲは、単離された核内受容体配列を増幅するために使用することができるような１つのプロセスである。この技術は、例えば、ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを増幅することができ、ＤＮＡ又はＲＮＡは１本鎖又は２本鎖であってもよい。ＲＮＡを鋳型として使用する場合、鋳型をＤＮＡに逆転写するために最適な酵素及び／又は条件が使用されるだろう。さらに、それぞれの１本鎖を含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを利用してもよい。核酸の混合物も使用することができ、又は本明細書で記載した以前の増幅反応で生成した核酸も、同じ、若しくは異なるプライマーを用いて利用することができる。
【００２６】
[00026]増幅すべき特異的核酸配列は、核酸の一部であってもよく、又は特定の配列が核酸全体を構成するように、別個の核酸として最初から存在させることができる。増幅すべき配列は、純粋な形態で最初から存在している必要はなく、複雑な混合物の小画分であってもよく、例えば、全ヒトＤＮＡに含有されていてもよい。
【００２７】
[00027]本明細書で使用したＤＮＡは、身体試料、例えば、血液、組織材料、肺組織などから、当業界で公知の様々な技術によって抽出することができる。抽出した試料が精製されていなければ、増幅の前に、細胞又は試料の動物細胞膜を切断し、核酸（複数可）の鎖（複数可）を曝露し、及び／又は分離するために効果的な試薬量で処理してもよい。鎖を曝露し、分離するためのこの溶解及び核酸変性ステップによって、はるかに容易に増幅を起こさせることができるだろう。
【００２８】
[00028]デオキシリボヌクレオチド３リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰは、プライマーと別々に、又は一緒に、適切な量で合成混合物に添加し、得られた溶液を約９０度〜１００度Ｃで約１〜１０分、好ましくは１〜４分加熱する。この加熱時間の後、溶液を冷却させ、プライマーハイブリダイゼーションに利用しやすくする。冷却した混合物に、プライマー伸長反応を実施するために適切な薬剤（本明細書では「重合化用薬剤」と呼ぶ）を添加し、反応は当業界で公知の条件下で起こさせる。重合化用薬剤はまた、熱に安定ならば、その他の試薬と一緒に添加してもよい。この合成（又は増幅）反応は、室温及びそれ以上では重合化用試薬がもはや機能しない温度までで行うことができる。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを薬剤として使用する場合、温度は一般的に約４０度Ｃを上回らない。反応は室温で行うことが最も便利である。
【００２９】
[00029]プライマーは、標的ポリヌクレオチド（例えば、サブファミリー５などの核内受容体）の増幅を導く。使用するプライマーは、重合化の開始を実現するために十分な長さであり、適切な配列であるべきである。合成を促す環境条件には、ヌクレオシド３リン酸及び重合化用試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在、並びに適切な温度及びｐＨが含まれる。
【００３０】
[00030]プライマーは、増幅効率を最大にするために１本鎖であることが好ましいが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、伸長生成物を調製するために使用する前に、プライマーはまず鎖を分離するために処理してもよい。プライマーは、重合化誘導薬剤の存在下で、本発明の核内受容体の伸長生成物への合成を刺激するために十分な長さであるべきである。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液及びヌクレオチド構成を含む多くの要素に左右される。オリゴヌクレオチドプライマーは典型的に、１２〜２０以上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有していてもよい。
【００３１】
[00031]プライマーは、核内受容体ゲノム遺伝子配列の各鎖と実質的に相補的であるように設計するべきである。これは、重合化用薬剤の作用を可能にする条件下で、それぞれの鎖とハイブリダイズするために、プライマーが十分相補的であるべきことを意味する。言い換えると、プライマーは、５’及び３’配列とハイブリダイズして核内受容体ゲノム遺伝子配列の増幅を可能にするために、変異に隣接した５’及び３’配列と十分相補的であるべきである。
【００３２】
[00032]本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、関与した反応ステップの数に対して指数関数的量のＣＤ１６６遺伝子配列を生成する酵素的連鎖反応であるＰＣＲ増幅プロセスで使用した。通常、１つのプライマーは、核内受容体遺伝子配列のネガティブ（−）鎖に相補的で、他方はポジティブ（＋）鎖に相補的である。変性した核酸にプライマーをアニールした後、酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片（クレノウ）及びヌクレオチドで伸長すると、標的の核内受容体遺伝子配列を含有する、新たに合成された＋及び−鎖が生じる。これらの新たに合成された配列はまた鋳型となるので、変性、プライマーアニーリング及び伸長の反復サイクルによって、プライマーによって限定された領域（すなわち、核内受容体遺伝子配列）の指数関数的生成が起こる。連鎖反応の生成物は、使用した特定のプライマーの末端に対応する終端を有する個別の核酸２本鎖である。
【００３３】
[00033]オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の適切な方法、例えば、従来のホスホトリエステル及びホスホジエステル法又はそれらの自動化実施形態を使用して調製することができる。１つのこのような自動化実施形態では、ジエチルホスホラミダイトが開始物質として使用され、当業界で知られているように合成することができる。
【００３４】
[00034]重合化用薬剤は、酵素を含めて、プライマー伸長生成物の合成を実現するために機能する任意の化合物又は系であってもよい。この目的のために適切な酵素には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、熱安定性酵素（すなわち、変性を引き起こすために十分上昇させた温度にした後でプライマー伸長を実行する酵素）、例えば、Ｔａｑポリメラーゼを含むその他の酵素が含まれる。適切な酵素は、それぞれの核内受容体遺伝子配列核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物を形成するために適切な様式でヌクレオチドの組み合わせを促進する。一般的に、合成は、それぞれのプライマーの３’末端で開始し、合成が終結するまで鋳型鎖に沿って５’方向に進行し、異なる長さの分子を生成する。
【００３５】
[00035]新たに合成された核内受容体鎖及びその相補的な核酸鎖は、前述したハイブリダイズ条件下で２本鎖分子を形成し、このハイブリッドはこのプロセスのその後のステップで使用される。
【００３６】
[00036]変性、アニーリング及び伸長生成物合成のステップは、標的の多形遺伝子配列核酸配列を必要な程度まで増幅するために必要な頻度で繰り返すことができる。生じた特定の核酸配列の量は、指数関数的に蓄積する。これはまた、当業界で公知のリアルタイムＰＣＲによって実現することができる。
【００３７】
[00037]好ましくは、核内受容体を増幅する方法は、本明細書で記載したようなＰＣＲ、又はリアルタイムＰＣＲ、及び当業者によって通常使用される通りである。増幅の代替方法も記載されたことがあり、本発明のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅された核内受容体配列が代替手段によっても同じように増幅される限り、この方法も使用することができる。このような代替増幅系には、限定はしないが、対象の短いＲＮＡ配列及びＴ７プロモーターで開始する自家持続配列複製法が含まれる。逆転写酵素がＲＮＡをｃＤＮＡに複製し、ＲＮＡを分解し、その後逆転写酵素が第２のＤＮＡ鎖を重合化する。もう１つの核酸増幅技術は、核酸配列をベースにした増幅法（ＮＡＳＢＡ）で、この増幅法は逆転写及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用し、そのサイクルスキームを標的とするために２個のプライマーを組み込む。ＮＡＳＢＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかで開始し、いずれかで終結することができ、６０〜９０分以内に１０８個までのコピーを増幅する。或いは、核酸は連結反応活性化転写法（ＬＡＴ）によって増幅することができる。ＬＡＴは、部分的に１本鎖で、部分的に２本鎖である１個のプライマーによって１本鎖鋳型から作動する。増幅は、ｃＤＮＡをプロモーターオリゴヌクレオチドに連結することによって開始し、数時間以内に増幅は１０８〜１０９倍になる。対象のＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡに、ＭＤＶ-１と呼ばれるＲＮＡ配列を付着させることによって、ＱＢレプリカーゼ系が利用可能となる。試料と混合すると、ハイブリッドＲＮＡは標本のｍＲＮＡ中にその相補体を見出して結合し、レプリカーゼを活性化して対象のタグに沿う配列を複製する。もう１つの核酸増幅技術、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、試料中の近接した配列の存在下で、リガーゼによって共有結合し、新たな標的を形成する対象配列の２つの別々に標識された半分同士を用いることによって作動する。修復連鎖反応（ＲＣＲ）核酸増幅技術は、標的配列を幾何的に増幅するために、２個の相補的で標的特異的なオリゴヌクレオチドプローブ対、熱安定性ポリメラーゼ及びリガーゼ並びにＤＮＡヌクレオチドを使用する。２塩基のギャップがオリゴヌクレオチドプローブ対を分離し、ＲＣＲは正常なＤＮＡ修復を模倣して、このギャップを充填して接合する。鎖置換活性化法（ＳＤＡ）による核酸増幅は、標的ＤＮＡに結合する５’末端に短いオーバーハングを有する、ｈｉｎｃＩＩの認識部位を含有する短いプライマーを利用する。ＤＮＡポリメラーゼがオーバーハングに対向するプライマーの一部に、硫黄含有アデニン類似体を充填する。ＨｉｎｃＩＩが添加されるが、無修飾のＤＮＡ鎖しか切断しない。５’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したＤＮＡポリメラーゼが、切れ目の部位に進入して重合化を開始し、最初のプライマー鎖を下流に向かって置換し、新規プライマーを構築し、この新規プライマーがさらなるプライマーとなる。ＳＤＡは、３７度Ｃ、２時間で１０７倍を上回る増幅を生じる。ＰＣＲ及びＬＣＲとは異なり、ＳＤＡは、機器による温度サイクルを必要としない。本発明の方法に有用なもう１つの増幅系は、ＱＢレプリカーゼ系である。本発明ではＰＣＲが好ましい増幅法であるが、これらのその他の方法も、本発明の方法で記載したように核内受容体配列を増幅するために使用することができる。
【００３８】
[00038]本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入するために複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。このようなベクターは通常、所望するポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチドを含み、宿主によって認識される複製系を含むことができ、好ましくはポリペプチドをコードする部分に操作可能に結合した転写及び翻訳開始調節配列も含む。発現ベクターには、例えば、複製開始点又は自己複製配列（ＡＲＳ）及び発現制御配列、プロモーター、エンハンサー及び必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、転写終止配列及びｍＲＮＡ安定化配列が含まれる。適切ならば局在化シグナルも含めることができ、天然の核内受容体タンパク質由来であっても、その他の受容体由来であっても、同種若しくは関連種の分泌ポリペプチド由来であってもよく、タンパク質が細胞膜を横断して移動するのを可能にし、従ってタンパク質の機能的形態を達成する。このようなベクターは、当業界で周知の標準的組換え技術によって調製することができる。
【００３９】
[00039]適切なプロモーター及びその他の必要なベクター配列は、宿主で機能させるために選択され、適切ならば、天然に核内受容体遺伝子に関連したものを含めることができる。細胞株及び発現ベクターの実用的な組み合わせの例は当業界では公知である。多くの有用なベクターは、当業界では公知で、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びその他などの販売会社から入手することができる。ｔｒｐ、ｌａｃなどのプロモーター及びｐｈａｇｅプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及び解糖酵素プロモーターは原核生物宿主で使用することができる。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はその他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ若しくはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、マルトース及びガラクトース利用に関連した酵素などのためのプロモーター領域が含まれる。酵母発現における使用に適したベクター及びプロモーターが知られている。適切な非天然哺乳類プロモーターには、ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター又はマウスモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルス若しくはポリオーマ由来のプロモーターを含めることができる。さらに、遺伝子の複数コピーを作製することができるように、構築物は増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に結合することができる。適切なエンハンサー及びその他の発現制御配列のために。
【００４０】
[00040]このような発現ベクターは自律的に複製することができるが、当業界で周知の方法によって、宿主のゲノムに挿入することによっても複製することができる。
【００４１】
[00041]発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカー、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含有するようである。この遺伝子が存在すると、挿入物を発現する宿主のみが確実に増殖する。典型的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質若しくはその他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに対する耐性を与える、ｂ）栄養要求性欠損を補完する、又はｃ）複合培地から利用できない必須栄養素を供給するタンパク質をコードしており、例えば、Ｂａｃｉｌｌｉの場合はＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。適切な選択マーカーの選択は、宿主細胞に左右され、様々な宿主の適切なマーカーは当業界では周知である。
【００４２】
[00042]対象の核酸を含有するベクターはインビトロで転写され、得られたＲＮＡを周知の技術によって、例えば、注入によって宿主細胞に導入することができ、又はベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン若しくはその他の物質を使用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、感染（ベクターは感染性病原体、例えば、レトロウイルスゲノムである）及びその他の方法を含む、細胞宿主の種類に応じて変化する当業界で周知の方法によって宿主細胞に直接導入することができる。特に、前述の方法を含む当業界で公知の任意の方法によるポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、本明細書では「形質転換」と称する。以下に記載した核酸を導入した細胞とは、このような細胞の後代も含むことを意味する。
【００４３】
ポリヌクレオチド
[00043]通常核内受容体ポリペプチドをコードする、単離された核内受容体核酸分子を開示する。核酸分子は表１に挙げた機能的核内受容体ポリペプチドをコードすることができる任意の核酸を含む。好ましくは、核酸分子は、サブファミリー５の核内受容体をコードすることができる核酸、対立遺伝子変異型又は断片も含むそれらの類似体を含む。サブファミリー５の核内受容体は、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒ５ａ１又は対立遺伝子変異型のいずれか１つ、又はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び又は活性化ドメインを含む、断片を含むそれら類似体を含むことができる。具体的には、（ａ）配列番号:１、３、５、８で記載されたＤＮＡ分子又は配列番号１０などのそれらの断片をコードするＤＮＡ分子、（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ分子とハイブリダイズするＤＮＡ分子又はそれらのハイブリダイズできる断片、及び（ｃ）前記のＤＮＡ分子のいずれかによってコードされたアミノ酸配列の発現をコードするＤＮＡ分子からなる群から選択されるＤＮＡ分子を提供する。
【００４４】
[00044]本発明による好ましいＤＮＡ分子には、配列番号１、３、５、８で記載された配列を含むＤＮＡ分子又は配列番号１０などのそれらの断片をコードするＤＮＡ分子が含まれる。
【００４５】
[00045]ポリヌクレオチドが、天然の状態で、又は当業者に周知の方法によって操作されたときに、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ及び／又はポリペプチド又はそれらの断片を生成するために転写及び／又は翻訳され得る場合、ポリペプチドを「コードする」という。アンチセンス鎖は、このような核酸に相補的で、コードしている配列は核酸から推定することができる。
【００４６】
[00046]「単離された」又は「実質的に純粋な」核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくは混合ポリマー）とは、天然のヒト配列又はタンパク質を天然に伴うその他の細胞成分、例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、その他の多くのヒトゲノム配列及びタンパク質から実質的に分離された核酸である。この用語は、天然に生じる環境から取り出された核酸配列又はタンパク質を包含し、組換え若しくはクローニングされたＤＮＡ単離物及び化学的に合成された類似体若しくは異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。
【００４７】
[00047]「核内受容体遺伝子配列」、「核内受容体遺伝子」、「核内受容体核酸」又は「核内受容体ポリヌクレオチド」はそれぞれ、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメインなどの特定のドメインを含有するポリヌクレオチドを意味する。さらに、それらは、表１に挙げたタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、核酸分子は、サブファミリー５の核内受容体をコードすることができる核酸、対立遺伝子変異型又は断片を含む類似体、又はそれらの変異体を含む。サブファミリー５の核内受容体は、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒ５ａ１又は対立遺伝子変異型のいずれか１つ、又はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び又は活性化ドメインを含む、断片を含む類似体、又はそれらの変異体を含むことができる。ＳＵＭＯ化変異体は、変異したリシン残基を有するＮｒ５ａ２又はＮｒ５ａ１変異体、例えば、配列番号１又は配列番号３で記載したＮｒ５ａ２ ２ＫＲを意味することができる。
【００４８】
[00048]これらの用語は、核酸に適用する場合、核内受容体ポリペプチド、断片、例えば、タンパク質融合物、ＳＵＭＯ化変異体若しくは欠失物を含む同族変異体又は変種をコードする核酸を意味する。本発明の核酸は、天然の核内受容体をコードする遺伝子から得られた、若しくは天然の核内受容体をコードする遺伝子と実質的に類似の配列、又は天然の核内受容体をコードする遺伝子若しくはその一部と実質的に相同な配列を有する。サブファミリー５のマウスの核内受容体ポリペプチドのコーディング配列は、配列番号５及び８に示されており、アミノ酸配列は配列番号６、７及び９から１１に示されている。サブファミリー５のＳＵＭＯ化核内受容体ポリペプチドのコーディング配列は、配列番号１及び３に示されており、アミノ酸配列は配列番号２及び４に示されている。
【００４９】
[00049]核酸又はその断片は、（ヌクレオチドを適切に挿入又は欠失させて）その他の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列させたとき、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常少なくとも約７０％、より通常少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、及びより好ましくはヌクレオチド塩基の少なくとも約９５〜９８％でのヌクレオチド配列同一性を有する場合、もう１つの核酸と「実質的に相同」（又は「実質的に類似」）である。実質的に相同な断片を作動するためのコーディング配列の例は、配列番号１、３、５及び８に示されており、アミノ酸配列は配列番号２、４、６、７及び９から１１に示されている。
【００５０】
[00050]或いは、核酸又はその断片がもう１つの核酸（又はそれらの相補鎖）と選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖と、又はその相補体とハイブリダイズするときに、実質的な相同性又は（同一性）が存在する。特異性の全欠如よりも実質的により選択的なハイブリダイゼーションが起こるとき、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。通常、少なくとも約１４個のヌクレオチドの長さにわたって同一性が少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％あるとき、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。記載したように、相同性比較の長さは、より長くにわたってもよく、特定の実施形態では、しばしば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常は少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの長さである。
【００５１】
[00051]したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で挙げた配列で示された配列と好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性を有する。ヌクレオチド相同性比較は、ポリペプチドについて以下に記載したように実施してもよい。好ましい配列比較プログラムは、以下に記載したＧＣＧウィスコンシンベストフィット（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムである。初期設定のスコアリングマトリックスは、それぞれの同一なヌクレオチドについてマッチ値が１０であり、それぞれのミスマッチについては−９である。それぞれのヌクレオチドに対して初期設定ギャップ生成ペナルティーは−５０であり、初期設定ギャップ伸張ペナルティーは−３である。
【００５２】
[00052]本発明の場合、相同な配列は、配列番号１、３、５及び８で記載されたヌクレオチド配列と少なくとも２０、５０、１００、２００、３００、５００又は１０００ヌクレオチドにわたってアミノ酸レベルで少なくとも６０、７０、８０又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるヌクレオチド配列を含むと考えられる。特に、相同性は通常、タンパク質の機能に必要ではない隣接する配列よりも、必要であることが知られている近接したアミノ酸配列をコードする配列の領域に関して考えるべきである。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸１から４９９、配列番号７のアミノ酸１から５６０若しくは配列番号９のアミノ酸１から４６２をコードするポリペプチド配列である配列番号１０若しくは１１をコードするヌクレオチド配列の１個以上と５０、６０若しくは７０％を上回る相同性、より好ましくは８０、９０、９５若しくは９７％を上回る相同性を有する近接した配列を含む。好ましいポリヌクレオチドは、代わりに又はさらに、配列番号６のアミノ酸１から４９９、配列番号７のアミノ酸１から５６０、配列番号９のアミノ酸１から４６２、配列番号１０のアミノ酸１００から１８７若しくは配列番号１１のアミノ酸３１７から５６０をコードする配列番号５若しくは８の配列と８０、９０、９５若しくは９７％を上回る相同性を有する近接した配列を含んでいてもよい。好ましい核酸は、好ましくはＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び活性化ドメインなどの特定のドメインを含有する。
【００５３】
[00053]ヌクレオチド配列の長さは、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０、３０、４０、５０、１００若しくは２００ヌクレオチドである。一般的に、ポリヌクレオチドの長さが短ければ短いほど、選択的ハイブリダイゼーションを得るために必要な相同性は大きくなる。したがって、本発明のポリヌクレオチドが約３０ヌクレオチド未満からなる場合、本明細書で挙げた配列で記載された核内受容体ヌクレオチド配列と比較して、％同一性は７５％を上回ること、好ましくは９０％又は９５％を上回ることが好ましい。反対に、本発明のポリヌクレオチドが、例えば、５０若しくは１００ヌクレオチドを上回る場合、本明細書で挙げた配列で記載された核内受容体ヌクレオチド配列と比較した％同一性は低くてもよく、例えば、５０％を上回り、好ましくは６０又は７５％を上回ってもよい。
【００５４】
[00054]核酸ハイブリダイゼーションは、当業者には容易に理解されるように、塩基成分、相補鎖の長さ、ハイブリダイズする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度、温度又は有機溶媒などの条件によって影響を受ける。ストリンジェント温度条件は一般的に、３０度Ｃを上回る、典型的には３７度Ｃを上回る、好ましくは４５度Ｃを上回る温度を含む。ストリンジェント塩条件は、普通は１０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。しかし、パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラメータの大きさよりもずっと重要である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃及び０.１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、クエン酸ナトリウム ０.０１５Ｍ、ｐＨ７．０）である。
【００５５】
[00055]本発明の「ポリヌクレオチド」成分には、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型及び混合ポリマー、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が含まれ、当業者によって容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に改変されていてもよく、又は非天然若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。このような改変には、例えば、標識、メチル化、１個以上の天然に生じるヌクレオチドの類似体による置換、電荷を有さない結合（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダイト、カルバマートなど）、電荷を有する結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、付属部分（例えば、ポリペプチド）、介入物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレ−ト剤、アルキル化剤、ＳＵＭＯ化部位変異体及び改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）などのヌクレオチド間の改変が含まれる。水素結合及びその他の化学的相互作用によって指定された配列に結合するポリヌクレオチドの能力を模倣した合成分子も含まれる。このような分子は当業界では公知で、例えば、ペプチド結合が分子の主鎖におけるリン酸結合と置換したものが含まれる。
【００５６】
ポリペプチド
[00056]本発明の完全長核内受容体ポリペプチドは、少なくとも８７アミノ酸を有し、動物、特に、哺乳類の核内受容体をコードしており、対立遺伝子変異型、変異体又は相同体を含む。本発明の核内受容体ポリペプチドはまた、完全長核内受容体ポリペプチドの断片及び誘導体、特に実質的に同じ、又は増強された生物活性を有する断片又は誘導体を含む。核内受容体ポリペプチドには、配列番号２、４、６、７、９、１０、１１のアミノ酸配列、又は対立遺伝子変異型、変異体又は相同体を含むものが含まれ、配列番号１０又は１１などのそれらの断片も含まれる。特に好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１から５６０、配列番号４のアミノ酸１から５６０、配列番号６のアミノ酸１から４９９、配列番号７のアミノ酸１から５６０若しくは配列番号９のアミノ酸１から４６２、又はそれらの対立遺伝子変異型、相同体又は配列番号１０若しくは１１などの断片からなる。
【００５７】
[00057]「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマー及びその等価物を意味し、特定の長さの生成物を意味しないので、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの改変、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化などを意味しないか、又は排除している。定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１個以上の類似体（例えば、天然に単離されたアミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、置換された結合並びに天然及び非天然に生じる当業界に公知のその他の改変を有するポリペプチドである。
【００５８】
[00058]本発明の場合、相同な配列は、配列番号２、４、６、７、９、１０又は１１で記載されたアミノ酸配列と少なくとも２０、５０、１００、２００、３００若しくは４００アミノ酸にわたってアミノ酸レベルで少なくとも６０、７０、８０又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるアミノ酸配列を含むものと考えられる。特に、相同性は、重要性が少ない隣接する配列、例えば、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）よりも、タンパク質の機能に必須の公知の配列、例えば、配列番号１０が一例であるＤＮＡ結合ドメイン、又は配列番号１１が一例である活性化ドメインの領域に関するものと典型的には考えられるべきである。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号２、４、６、７、９、１０若しくは１１のアミノ酸の１個以上と５０、６０又は７０％を上回る相同性、より好ましくは８０又は９０％を上回る相同性を有する近接した配列を含む。
【００５９】
[00059]その他の好ましいポリペプチドは、配列番号２、４、６、７、９、１０又は１１と４０、５０、６０又は７０％を上回る相同性有する近接した配列を含む。相同性はまた類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関して考えることができるが、本発明の場合、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。「実質的な相同性」又は「実質的な同一性」という用語は、ポリペプチドのことをいう場合、問題のポリペプチド又はタンパク質が天然に生じるタンパク質全体又はその一部と少なくとも約７０％の同一性、通常少なくとも約８０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０又は９５％の同一性を示すことを表す。
【００６０】
[00060]相同性比較は、目測によって、又はより通常は、容易に利用可能な配列比較プログラムによって、実施することができる。これらの市販のコンピュータプログラムでは、２個以上の配列の間の相同性％を算出することができる。
【００６１】
[00061]パーセント（％）相同性は、近接した配列にわたって算出することができ、すなわち、１配列をその他の配列と整列させ、１配列の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と１度に１残基ずつ直接比較する。これを「ギャップのない」アライメントと呼ぶ。典型的には、そのようなギャップのないアライメントは、比較的短い残基数（例えば、５０個未満の近接したアミノ酸）にのみ行われる。
【００６２】
[00062]これは非常に単純で一貫性のある方法であるが、例えば、1つの挿入又は欠失があると、それ以外は同一な配列対であっても、それ以降のアミノ酸残基がアライメントから閉め出される原因になるので、グローバルアライメントを行った場合、％相同性の大幅な減少が生じる可能性があることを考慮できない。したがって、ほとんどの配列比較法は、全相同性スコアに過度のペナルティーを課すことなく可能性のある挿入及び欠失を考慮した最適アライメントを生成するように考案されている。これは、局所相同性の最大化を試みるために配列アライメント中に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【００６３】
[00063]しかしながら、これらのより複合的な方法では、同一アミノ酸の個数が同数の場合、できるかぎり少ないギャップを有する配列アライメントが、２つの比較配列間のより高い関連性を反映して、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するように、アライメント中に生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティー」が割り当てられる。典型的には、ギャップの存在に比較的高いコストを課し、ギャップ中のそれぞれの後続残基により小さいペナルティーを課する「アフィンギャップコスト（Ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ）」が使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリング系である。当然ながら、ギャップペナルティーが高ければ、より少ないギャップを有する最適化アライメントが生成されるであろう。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列比較用のこのようなソフトウェアを使用する場合、初期設定値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（下記参照）を使用する場合、アミノ酸配列に対する初期設定ギャップペナルティーは、ギャップ１つにつき−１２、各伸長につき−４である。
【００６４】
[00064]したがって、最大％相同性の計算では、最初に、ギャップペナルティーを考慮して最適アライメントを生成することが必要である。このようなアライメントを実施するのに最適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧウィスコンシンベストフィットパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を行うことができるその他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、前述、１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０）、及び一連のＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡはいずれも、オフライン検索及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ 前述、７−５８〜７−６０頁）。しかしながら、ＧＣＧベストフィットプログラムを使用することが好ましい。
【００６５】
[00065]同一性に関して最終的な％相同性を求めることはできるが、アライメント法自体は、典型的には、絶対的な対比較に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性又は進化距離に基づいてそれぞれのペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化類似性スコアマトリックスが広く使用される。一般に使用されるこのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、一連のＢＬＡＳＴプログラムの初期設定マトリックスである。ＧＣＧウィスコンシンプログラムでは一般的に、公開初期設定値又は供給されるのであれば、カスタムシンボル比較表のいずれかが使用される（さらに詳しくはユーザーマニュアルを参照されたい）。ＧＣＧパッケージでは公開初期設定値を、又は他のソフトウェアの場合にはＢＬＯＳＵＭ６２などの初期設定マトリックスを使用することが好ましい。
【００６６】
[00066]ソフトウェアによって最適アライメントを生成させた後、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。典型的には、ソフトウェアは配列比較の一部分としてこれを行い、数値結果を生成する。
【００６７】
[00067]核内受容体ポリペプチド相同体には、１個以上のアミノ酸が別のアミノ酸と置換されており、その置換が分化した細胞を多能性状態に再プログラミングする分子の生物学的活性を実質的に改変しないアミノ酸配列を有するものが含まれる。本発明による核内受容体ポリペプチドの相同性は、表１に挙げたアミノ酸のいずれかと８０％以上であることが好ましい。好ましくは、核内受容体はサブファミリー５由来で、好ましくは配列番号２、４、６、７、９、１０又は１１に記載されたアミノ酸配列に対する配列同一性のいずれか１つが８０パーセント以上の相同性を有する。本発明の範囲内の核内受容体ポリペプチド相同体の例には、配列番号２、４、６、７、９、１０又は１１のアミノ酸配列が含まれ、（ａ）１個以上のアスパラギン酸残基がグルタミン酸と置換されており、（ｂ）１個以上のイソロイシン残基がロイシンと置換されており、（ｃ）１個以上のグリシン若しくはバリン残基がアラニンと置換されており、（ｄ）１個以上のアルギニン残基がヒスチジンと置換されており、又は（ｅ）１個以上のチロシン若しくはフェニルアラニン残基がトリプトファンと置換されている。
【００６８】
[00068]好ましくは「核内受容体タンパク質」又は「核内受容体ポリペプチド」は、核内受容体遺伝子配列によってコードされるタンパク質又はポリペプチド、それらの変種又は断片を意味する。好ましくは「核内受容体タンパク質」又は「核内受容体ポリペプチド」は、表１に挙げたタンパク質又はポリペプチドを意味する。より好ましくは「核内受容体タンパク質」又は「核内受容体ポリペプチド」は、サブファミリー５のタンパク質又はポリペプチドを意味する。サブファミリー５の核内受容体には、Ｎｒ５ａ２、Ｎｒ５ａ１のいずれか１つ又はその任意の変種変異体若しくは断片を含めることもできる。高又は低ストリンジェント条件下で核内受容体をコードする核酸にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされたタンパク質及び密接に関連したポリペプチド又は核内受容体タンパク質（複数可）に対する抗血清によって回収されたタンパク質も含まれる。
【００６９】
[00069]「タンパク質改変又は断片」は、1次構造配列が実質的に相同であるが、例えば、インビボ又はインビトロにおける化学的及び生化学的改変を含むか、又は通常にはないアミノ酸を組み込んだ核内受容体ポリペプチド又はその断片として、本発明によって提供される。このような改変には、当業者によって容易に理解されるように、例えば、ＳＵＭＯ化部位変異、アセチル化、カルボキシル化、ホスホリル化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば、放射性核種による標識、及び様々な酵素的改変が含まれる。ポリペプチドを標識するための様々な方法及びこのような目的のために有用な様々な置換基又は標識は、当業界では周知で、３２Ｐなどの放射性同位元素、標識したアンチリガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、蛍光色素、化学ルミネセンス剤、酵素及び標識したリガンドに対して特異的な結合対を作るメンバーとなり得るアンチリガンドが含まれる。標識の選択は必要な感受性、プライマーとの接合しやすさ、安定性要件及び利用可能な装置に左右される。ポリペプチドの標識方法は当業界では周知である。
【００７０】
[00070]ポリペプチド「断片」、「部分」又は「区域」とは、少なくとも約５個〜７個の近接したアミノ酸、しばしば少なくとも約７個〜９個の近接したアミノ酸、典型的に少なくとも約９個〜１３個の近接したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０個〜３０個以上の近接したアミノ酸のアミノ酸残基の伸長である。
【００７１】
[00071]本発明の好ましいポリペプチドは野生型完全長核転写因子と実質的に類似の機能を有する。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、野生型完全長核転写因子と実質的に類似の機能を有するポリペプチドをコードする。「実質的に類似の機能」とは、野生型核内受容体核酸又は野生型核内受容体ポリペプチドに関して、核内受容体の核酸又はポリペプチド相同体、変種、誘導体又は断片が、本明細書で記載したアッセイに従って、体細胞を再プログラミングする機能を意味する。
【００７２】
本発明の組成物
[00072]本発明によって生成したポリペプチドは、組成物の形態で再プログラミングする体細胞に投与することができる。
【００７３】
[00073]したがって、本発明はまた、治療有効量の核内受容体ポリペプチド及びＳｏｘポリペプチド、クルッペル様因子ポリペプチド又はｍｙｃファミリー由来のポリペプチドから選択される１個以上の転写因子ポリペプチドを含む医薬組成物を含む組成物に関する。本明細書では、インビトロで体細胞を再プログラミングすることができるならば、化合物は治療的に有効である。
【００７４】
[00074]注射して使用するために適切な本発明の組成物には、滅菌水性溶液（水溶性であれば）若しくは分散液及び滅菌した注射可能な溶液を即時調合するための滅菌粉末並びに又は１つ以上の担体が含まれる。或いは、注射可能な溶液は、細胞膜を通過した輸送を助けるためにリポソームに被包して送達してもよい。その代わりに又はそれに加えて、このような調製物は、細胞膜を通過する輸送を容易にするために自己集合したポア構造の構成要素を含有していてもよい。これらの調製物は製造及び保存の条件下で安定でなければならず、例えば、細菌及び真菌などの微生物の汚染／破壊作用から保護しなければならない。
【００７５】
[00075]担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。本発明の組成物中における微生物の作用の妨害は、抗菌剤及び／又は抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどを添加することによって達成される。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物を使用することによってもたらすことができる。
【００７６】
[00076]滅菌した注射可能な溶液は、必要な量の活性ポリペプチドを前記に列挙したその他の成分のいくつかと共に適切な溶媒に組み入れ、必要であればその後濾過滅菌することによって調製する。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒及び前記に列挙したものからの必要なその他の成分を含有する滅菌媒体に組み入れることによって調製する。滅菌した注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥法及び凍結乾燥法で、活性成分及びさらに所望する任意の成分の粉末を前もって滅菌濾過したそれら成分の溶液から生成する。
【００７７】
[00077]生物学的に許容される担体及び／又は希釈剤にはまた、溶媒、分散媒、抗生物質及び／又は抗菌物質、等張剤及び吸収遅延剤などのいずれか及び全てを含めることができる。このような媒質及び培養のための薬剤の使用は当業界では周知である。任意の便利な媒質又は薬剤が活性ポリペプチドに適合しない場合を除いて、組成物中において媒質又は薬剤を使用することが考えられる。
【００７８】
[00078]ポリペプチドも、前述のようなトランスフェクション高分子送達媒体及び当業者に公知のその他の方法などの当業界で公知のタンパク質送達方法によって送達することができる。
【００７９】
[00079]この組成物は、体細胞の再プログラミングにおける使用のためのものであってもよい。使用には、新たな細胞が必要とされる変性疾患を治療するための医薬品として、多能性細胞を調製するための本発明の組成物の使用が含まれる。
【００８０】
治療で使用するための多能性細胞の誘導方法
[00080]本発明の一実施形態は、多能性幹細胞治療の必要な患者を治療するための医薬品の製造において、インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、個体ドナーから細胞を単離するステップ、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、前記転写因子をコードするポリヌクレオチドが、細胞を多能性細胞に誘導するために、核内受容体及び群Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ５、Ｎ−ｍｙｃ及びＬ−ｍｙｃから選択される１個以上の転写因子を含む、ステップ、多能性幹細胞治療の必要な患者に多能性細胞を導入するステップを含む方法である。
【００８１】
[00081]「治療」及び「治療する」並びにそれらの同義語は、治療的療法及び予防的又は防御的処置を意味し、その目的は変性状態を防御するか、又は鈍化させる（減少させる）ことである。このような治療を必要とする人には、脳卒中、癌、糖尿病、神経障害、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、認知症、並びに心障害及び筋肉損傷及びその他多くと既に診断された人が含まれる。
【００８２】
[00082]本明細書では、化合物の「治療有効量」は、変性状態を防御するか、又は少なくとも鈍化させる（減少させる）、特に患者の寿命を延長させることができる細胞の量である。本発明の細胞の用量及び投与は、当業者によって決定することができる。治療上使用される細胞の有効量は、例えば、治療目的、投与経路及び哺乳類の状態に左右される。したがって、治療専門家は、最適な治療効果を得るために必要な用量を調節し、投与経路を変更することが必要とされる。
【００８３】
[00083]好ましくは、本発明の多能性細胞は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー、認知症又は脳卒中などの神経障害で使用される。
【００８４】
誘導多能性幹細胞株
[00084]一実施形態では、多能性幹細胞株を作製する方法は、インビトロで細胞を培養するステップ、培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、群Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ５、Ｎ−ｍｙｃ及びＬ−ｍｙｃから選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップ、細胞株を維持するために多能性細胞を継代するステップを含む。
【００８５】
細胞の調製
[00085]本明細書では「細胞」とは、体内の組織、又は体液から得られた生物学的試料を意味する。細胞は、穿刺生検試料などの患者から得られた試料である「臨床試料」であることが多い。「細胞」にはまた、血液、血清などの液体から単離された細胞が含まれてもよい。細胞試料は、肺、膀胱、脳、子宮、子宮頚部、結腸、直腸、食道、口腔、頭部、筋肉、心臓、皮膚、腎臓、乳房、卵巣、首部、膵臓、前立腺、精巣、肝臓、生殖腺、胃の組織又は当業者には公知の任意のその他の臓器若しくは組織から単離して得ることができる。
【００８６】
[00086]細胞試料は身体から得られ、細胞及び細胞外物質を含む。細胞試料は、ヒト又は非ヒト動物由来であってもよい。細胞試料は、任意の臓器又は体液から得ることができる。細胞試料は、公知の方法、例えば、切除、針生検、血液抽出などを使用して得ることができる。細胞は、細胞の培養及び再プログラミングを可能にする方法で加工すべきである。したがって、対象、ドナー又は個体から得られた細胞は、理想的には洗浄してすぐに培養する。
【００８７】
細胞培養
[00087]ｉＰＳＣは、研究又は医学的処置用のインビトロで細胞を増殖させるための人工培地などの関連培養培地で、当業界で知られているように培養してもよい。細胞は、細胞の連続継代性を維持するために当業界で公知なように何世代か継代してもよい。培養培地は、細胞に栄養を与え、保持するために栄養素を含有してもよい。培養培地にはまた、細胞に所望する変化を起こさせるため、増殖因子を添加して含めてもよい。
【００８８】
好ましい実施形態の例
【００８９】
核内受容体の再プログラミング能力
[00088]再プログラミングの効率を高めることができる核内受容体を同定するため、１８種の核内受容体（表１）のスクリーニングを実施した。内在性Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰレポーターを含有するマウスの胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）をスクリーニングで使用した。再プログラミングされたＭＥＦは、サイレンシングしたＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰレポーターの反応の結果として、ＧＦＰが発現することによって陽性に同定された。スクリーニングは、Ｏｃｔ４（Ｏ）、Ｓｏｘ２（Ｓ）、Ｋｌｆ４（Ｋ）及びｃ−Ｍｙｃ（Ｍ）ウイルスでレトロウイルスにより形質導入されたそれぞれの核内受容体について実施した。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの出現頻度は、感染させて１４日後（ｄｐｉ）に記録した。核内受容体構築物全ての転写発現も確認された（図５）。このスクリーニングによって、オーファン核内受容体Ｎｒ１ｉ２（プレグナンＸ受容体、Ｐｘｒとしても知られている）及びＮｒ５ａ２（肝臓受容体ホモログ−１、Ｌｒｈ−１としても知られている）の両方が再プログラミングの効率を（ＯＳＫＭ対照と比較して）それぞれ２．７倍及び４．０倍増強することができることを発見した（図１ａ）。
【００９０】
【表１】
【００９１】
[00089]これらの再プログラミングエンハンサーが中心的な再プログラミング因子と代替できるかどうかを次に調べようとした。ｃ−Ｍｙｃが再プログラミングに重要ではないことが以前に示されているので、ｃ−Ｍｙｃの代替能力については調べなかったが、代わりにこれら２種類の核内受容体がＯＳＫトリオのいずれかと代替する能力を調べた。注目すべきことに、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをＮｒ５ａ２及びＳＫＭウイルスで形質導入すると、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニー（播種したＭＥＦ１００，０００個当たり２３.７±３.５個）が１４ｄｐｉに認められた（図１ｂ及び図６ａ〜ｂ）。これは、外来性Ｎｒ５ａ２が再プログラミング効率を高めるだけでなく、ＭＥＦの再プログラミングにおいて外来性Ｏｃｔ４と代替することもできることを示している。Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃで再プログラミングされたこれらの細胞をＮ２ＳＫＭ ｉＰＳＣと称する。これらのコロニーは、長期間安定に継代することができ、アルカリホスファターゼ（図６ｃ）、Ｎａｎｏｇ（図６ｄ〜ｅ）及びＳＳＥＡ−１（図６ｆ〜ｇ）で陽性に染色した。
【００９２】
[00090]ｃ−Ｍｙｃが再プログラミングに必要ないならば、Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣよりも効率は低いが（播種したＭＥＦ１００，０００個当たり２.３±０.６個）Ｎｒ５ａ２及びＳＫウイルスだけで形質導入されたＰｏｕ５ｆ１−ＭＥＦからｉＰＳＣを生成することもできる（図１ｃ〜ｅ）。これらの３因子Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣと称する。Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣと同様に、Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣはアルカリホスファターゼ（図１ｆ）、Ｎａｎｏｇ（図１ｇ〜ｈ）及びＳＳＥＡ−１（図１ｉ〜ｊ）で陽性に染色した。
【００９３】
[00091]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞を細胞遺伝学的に分析すると、核型が正常であることが示された（図７ａ）。さらに、それぞれのウイルスのゲノム統合を試験し、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のゲノムＤＮＡにＯｃｔ４レトロウイルスが存在しないことを確認した（図７ｂ）。
【００９４】
Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の特徴
[00092]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のグローバル遺伝子発現プロファイルを実施して、これらのｉＰＳＣの遺伝子発現がＥＳＣと類似しているかどうかを調べた。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞株（Ｎ２ＳＫＭ及びＮ２ＳＫ）並びにＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）、ＥＳＣ及びＯＳＫＭ ｉＰＳＣ株のトランスクリプトームを特徴付けた。クラスター分析によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞はＭＥＦよりもＥＳＣ及びＯＳＫＭ ｉＰＳＣに類似していることが明らかになった（図２ａ）。さらに、発現プロファイリングによって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞では、ＥＳＣ関連遺伝子が付随して上方制御され、ＭＥＦ関連遺伝子が下方制御されることが示された（図２ｂ）。これらのことを考え合わせると、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の発現プロファイルは、ＥＳＣ及び従来のＯＳＫＭ ｉＰＳＣの両方と類似している。
【００９５】
[00093]次に、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞におけるＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーターのメチル化状態を調べるために、重亜硫酸塩による配列解析を実施した。プロモーターメチル化分析によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーターはほとんどがメチル化されておらず（図３ａ）、ＥＳＣのプロモーターと類似しているが、ＭＥＦのＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーター領域は高度にメチル化されていることが明らかになった。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のビバレントドメインパターンも調べた。その結果、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、６個の遺伝子（Ｚｆｐｍ２、Ｓｏｘ２１、Ｐａｘ５、Ｌｂｘ１ｈ、Ｅｖｘ１及びＤｌｘ１）に活性Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及び抑制Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３両方のクロマチン修飾を有することが示された（図３ｂ）。これらの結果は、両方のクロマチン修飾も有するＥＳＣの結果と一致しているが、どちらのクロマチンマークも解除されている分化した細胞とは異なっている。
【００９６】
[00094]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の多能性を試験するために、胚様体（ＥＢ）媒介分化アッセイ及び奇形腫形成アッセイの両方を実施した。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、インビトロで３種類の主要な胚様（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）の細胞に分化し（図８ａ）、３種類の主要な肺葉を起源とした分化組織からなる奇形腫を形成することができたので（図８ｂ）、本当に多能性があった。
【００９７】
[00095]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞を８細胞期の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ又はＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ（Ｂ６−アルビノ）胚にマイクロインジェクションすることによって、多能性のよりストリンジェントなアッセイを実施した。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞はＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦから得られたので、生殖腺では内在性Ｏｃｔ４発現が高レベルであるため、ＧＦＰ発現は生殖腺で観察するべきである。予測通り、Ｅ３.５胚は生殖腺でＧＦＰ発現を示した（図４ａ〜ｂ）。より重要なことに、生産キメラはＮ２ＳＫＭ（図６ｉ）及びＮ２ＳＫ株（図４ｃ）から作製された。
【００９８】
Ｎｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞の特徴
[00096]ステロイド産生因子１（Ｓｆ１）としても知られているＮｒ５ａ１は、Ｎｒ５ａ２と同じ核内受容体サブファミリー５に属する。したがって、Ｎｒ５ａ１が再プログラミングの効率を高め、Ｏｃｔ４と代替できるかどうかを調べることに関心を持った。Ｎｒ５ａ１は再プログラミング効率を高めるが（図９ａ）、Ｎｒ５ａ２よりは少なかった。次に、Ｎｒ５ａ１が中心的な再プログラミング因子（Ｏ、Ｓ及びＫ）のいずれかと代替できるかどうかを調べた。Ｎｒ５ａ２と同様に、Ｎｒ５ａ１はＳｏｘ２及びＫｌｆ４と代替することはできなかった。興味深いことに、Ｎｒ５ａ１及びＳＫＭウイルスで形質導入したＭＥＦは、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性ｉＰＳＣコロニーを生成した（図９ｂ〜ｄ）。これらの再プログラミングされたＭＥＦは、Ｎ１ＳＫＭ ｉＰＳＣと称する。これらのＮｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞はアルカリホスファターゼ（図９ｅ）、Ｎａｎｏｇ（図９ｆ〜ｇ）及びＳＳＥＡ−１（図９ｈ〜ｉ）を発現する。さらに、これらの核型が正常なＮ１ＳＫＭ ｉＰＳＣ（図９ｊ）は、インビトロで３種類の異なる胚葉の系列に分化することができた（図９ｋ）。Ｎｒ５ａ１による再プログラミングを独立して示すことによって、Ｎｒ５ａサブファミリーの両メンバーは本当に類似の再プログラミング特性を有することが示される。
【００９９】
[00097]次に、Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方の添加によってＯｃｔ４無しで再プログラミングの効率が高まるかどうかを調べた。したがって、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをＮｒ５ａ２、Ｎｒ５ａ１及びＳＫＭウイルスで同時形質導入した。興味深いことに、Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方をＳＫＭと共に添加すると、Ｎｒ５ａ２及びＳＫＭに対して約３倍にＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの数を増加させることができた（図１０）。この結果は、両因子を一緒に導入すると、本当に再プログラミング効率に対して相加効果を有することを示している。
【０１００】
核内受容体断片の設計
[00098]その他の核内受容体のように、Ｎｒ５ａ２はリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有する。しかし、オーファン核内受容体は、Ｎｒ５ａ２の内在性リガンドが依然として知られていない。二量体で機能を果たすほとんどの核内受容体とは異なり、Ｎｒ５ａ２は単量体の状態でＤＮＡに結合することができる。Ｏｃｔ４がない場合のＭＥＦの再プログラミングにおいて、Ｎｒ５ａ２のＬＢＤ及びＤＢＤの機能的重要性を調べた。推定リガンドの結合を阻止するために、Ｎｒ５ａ２ ＬＢＤの溝を埋めるように特定の残基を大きな残基（Ａ３６８Ｍ）に変異させた。次に、Ｎｒ５ａ２ ＤＮＡ結合活性の著しい減少を生じる、保存されたＦｔｚ−Ｆ１ドメインに２重変異（Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａ）を有するＤＢＤ変異体を作製した。したがって、ＳＫＭウイルスで形質導入したＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをまた、野生型（ＷＴ）Ｎｒ５ａ２、Ａ３６８Ｍ Ｎｒ５ａ２変異体又はＧ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａ Ｎｒ５ａ２変異体のいずれかをコードするウイルスで形質導入することによって、再プログラミングアッセイを実施した。レトロウイルスベクターが同レベルのＮｒ５ａ２タンパク質を発現することを確かめるために、ウェスタン分析を実施した（図１１ａ）。我々の結果によって、Ｎｒ５ａ２ ＬＢＤ変異体はＷＴと比較して、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーの形成数を減少させないことが示された（図１１ｂ）。このことは、Ｎｒ５ａ２はリガンド結合とは独立した再プログラミング因子として機能することを示唆している。対照的に、Ｎｒ５ａ２ ＤＢＤ変異体をＳＫＭと共に導入すると、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニー数が劇的に減少した（図１１ｂ）。このことは、Ｎｒ５ａ２ ＤＢＤの完全性は、ＭＥＦにおいて再プロミングプロセスを開始するために核内受容体が標的遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域に適切に結合するために重要であることを示している。考え合わせると、ＤＢＤはＮｒ５ａ２の再プログラミング機能に必須であるが、リガンド結合はＮｒ５ａ２の再プログラミングの役割に重要ではないことが示される。
【０１０１】
[00099]Ｎｒ５ａ２又はＮｒ５ａ１による再プログラミングは、外来性Ｏｃｔ４の必要性を回避することができる転写因子の最初の報告例である。Ｎｒ５ａ２は早期マウス胚発生におけるＯｃｔ４発現の維持に関与する。Ｎｒ５ａ２は、Ｐｏｕ５ｆ１の近位エンハンサー及び近位プロモーターの領域の両方に結合することができ、マウス胚発生のエピブラスト段階においてＯｃｔ４を調節できることが示された。したがって、Ｏｃｔ４調節因子として、外来性Ｎｒ５ａ２は、ＭＥＦの再プログラミングプロセスにおいて内在性Ｏｃｔ４発現を誘導し、内在性Ｏｃｔ４と代替するのに十分であり得る。Ｎｒ５ａ１はマウスＥＳＣでは発現しないが、マウス胚性癌腫細胞においてＯｃｔ４発現を活性化し、これは、再プログラミングにおいてＯｃｔ４と代替する能力と一致する。この点について、Ｏｃｔ４発現を活性化する因子はまた、再プログラミングプロセスにおいてＯｃｔ４と代替することができると考えられる。Ｓａｌｌ４はＯｃｔ４の公知の転写調節因子である。しかし、Ｓａｌｌ４レトロウイルスをＳＫＭウイルスと共に導入しても、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ陽性コロニーは認められなかった（データは示さず）。したがって、Ｏｃｔ４調節因子が全てｉＰＳＣの生成においてＯｃｔ４と代替できるのではないことは注目すべきことである。
【０１０２】
[000100]要約すると、我々の研究は、体細胞の再プログラミングのためにＯｃｔ４に依存しない形式（ｃｏｄｅ）を提供する。さらに、Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方が従来の４種類の因子と共に再プログラミングの効率を高めることができることも示す。要するに、再プログラミングの増強及び媒介の両方における核内受容体の予期せぬ２つの役割を明らかにした。
【０１０３】
方法
[000101]細胞培養及びトランスフェクション。ｉＰＳＣは、熱不活性化牛胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）１５％又はノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、Ｇｉｂｃｏ）１５％、β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）０．０５５ｍＭ、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）２ｍＭ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）０．１ｍＭ、ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）２０μｇｍｌ−１及びＬＩＦ（手製）１０００Ｕｍｌ−１を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）においてマイトマイシンＣで処理したＭＥＦフィーダーで培養し、２〜３日毎に継代した。ＭＥＦは、Ｅ１３．５胚から単離し、以前に記載したように培養した７。１０ｃｍプレート上の２９３−Ｔ細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造元の指示に従って各ＰＭＸレトロウイルスベクター２５μｇをトランスフェクトした。
【０１０４】
[000102]マウス分子遺伝学。ＭＥＦはＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰトランスジェニックマウス及びアクチン−ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ’ｓ ｌａｂ、ストック番号００４６５４及び００３５１６）から単離した。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰは、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ雄マウスと野生型１２９Ｓ２/ＳＶ雌の交配から得られたＥ１３．５胚から収集し、アクチン−ＧＦＰ ＭＥＦはアクチン−ＧＦＰマウスと野生型ＣＤ１雌マウスの交配から得られたＥ１３．５胚から収集した。８〜１２個のｉＰＳＣを、８細胞期に得たＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションした胚をＥ０．５偽妊娠雌Ｆ１（ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の卵管に移植した。キメラ胚は、Ｅ１３．５で収集し、蛍光顕微鏡で生殖腺におけるＧＦＰ発現を測定した。
【０１０５】
[000103]レトロウイルスパッケージング及び感染。Ｎｒ５ａ２及びその他の因子のｃＤＮＡ配列は、マウスＥＳＣ ｃＤＮＡ又は市販のプラスミド（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかからＰＣＲ増幅した。Ｎｒ５ａ２変異体は、適切なプライマーでＰＣＲ増幅した。増幅したコーディング配列は配列決定によって確認し、ＭＭＬＶをベースにしたｐＭＸレトロウイルスベクターにクローニングした。レトロウイルスは、既に記載したように作製した１。ｉＰＳＣ生成のために、異なる因子をコードする等量のウイルスをＦＢＳ１５％及びポリブレン６ｎｇｍｌ−１を含有するＤＭＥＭに７０％コンフルエンスでＭＥＦに導入した。１ｄｐｉに培地を新鮮なＭＥＦ培地に交換した。２ｄｐｉに、細胞をＭＥＦフィーダーに移し、前述のようにＦＢＳを含有する培養培地で６日間培養し、その後さらに５〜１５日間、前述のようにＫＳＲを含有する培養培地で培養した。
【０１０６】
[000104]ＲＮＡ抽出、逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ。前述の通りである。
【０１０７】
[000105]重亜硫酸塩ゲノム配列決定。ゲノムＤＮＡは、Ｉｍｐｒｉｎｔ（商標）ＤＮＡ修飾キット（Ｓｉｇｍａ）によって製造元の指示に従って重亜硫酸塩処理した。Ｐｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域は、ＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｍ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーで配列決定した。
【０１０８】
[000106]Ｐｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーター領域のＰＣＲ増幅で使用したプライマー配列はそれぞれ、
５’-ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡ、
５’ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣ、及び
５’−ＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴ、
５’−ＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡである。
【０１０９】
[000107]核型分析。ｉＰＳＣをコルセミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、標準低浸透圧処理によって収集し、メタノール：酢酸（３：１）で固定した。スライドは、Ｇバンド核型分析の前に空気乾燥した。
【０１１０】
[000108]遺伝子型決定。各ＰＣＲ増幅反応は、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＭＥＦ又は胚のいずれかから収集したゲノムＤＮＡ３００ｎｇで実施した。
【０１１１】
センスプライマー配列：５’−ＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣである。
【０１１２】
アンチセンスプライマー配列は、
Ｎｒ５ａ２：５’−ＧＡＣＧＣＡＡＴＡＧＣＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴＧ
Ｓｏｘ２：５’−ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴ
Ｋｌｆ４：５’−ＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧ
ｃ−Ｍｙｃ：５’−ＴＣＧＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧ
Ｏｃｔ４：５’−ＣＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＴである。
【０１１３】
[000109]ＥＢ媒介インビトロ分化。ＥＢ形成のため、ｉＰＳＣをトリプシン処理し、ペトリ皿内でＬＩＦ及びβ−メルカプトエタノールを含まないｉＰＳＣ培養培地で４〜５日培養した。ＥＢは、ゼラチンをコートしたプレートに移し、レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）１μＭを添加して５〜６日培養した。試料は４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％トリトンＸ−１００で透過処理し、８％ＦＢＳでブロックし、抗Ｇａｔａ−４（１：１００、ｓｃ−２５３１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗ネスチン（１：１００、ｓｃ−５８８１３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又は抗α−平滑筋アクチン（１：１００、ａｂ１８４６０、Ａｂｃａｍ）で染色した。次に試料は、２次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６結合抗マウス（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次いでヘキスト（１：４０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で核染色した。
【０１１４】
[000110]奇形腫アッセイ。ｉＰＳＣは、トリプシン処理によって収集し、０．９％生理食塩水中１×１０７細胞ｍｌ−１の濃度まで再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌをアベルチンで麻酔したＳＣＩＤマウスの各背側部に皮下注射した。奇形腫を３〜４週間後に切除し、重量を量り、パラフィルムに包埋する前にブアン固定液で固定した。パラフィン包埋組織を切除し、前述したようにマロリーテトラクロームで染色した２６。
【０１１５】
[000111]免疫蛍光顕微鏡及びアルカリホスファターゼ染色。ゼラチンコーティングしたカバーガラス上で培養したｉＰＳＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理し、８％ＦＢＳでブロックした。ブロック後、試料を抗Ｎａｎｏｇ（１：５０、ＲＣＡＢ０００２ＰＦ、ＣｏｓｍｏＢｉｏ）又は抗ＳＳＥＡ−１（１：２００、ＭＡＢ４３０１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色し、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８結合抗ウサギ（１：３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６結合抗マウスＩｇＭ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）それぞれで染色した。次に、核はヘキスト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色した。市販のＥＳＣ特徴付けキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用してアルカリホスファターゼ検出を実施した。
【０１１６】
[000112]ウェスタン分析。トランスフェクション４８時間後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で２９３−Ｔ細胞を可溶化した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。細胞溶解物５０μｇを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリジンジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。この膜を５％スキムミルクでブロックした。ブロック後、ブロットを抗Ｎｒ５ａ２（１：２０００、ａｂ１８２９３、Ａｂｃａｍ）又は抗アクチン（１：２０００、ｓｃ−１６１６、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）いずれかの一次抗体で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又はＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２７６８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）それぞれでインキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、シグナルはウェスタンブロッティングルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して検出した。
【０１１７】
[000113]ＣｈＩＰアッセイ。ＣｈＩＰアッセイは、以前に記載されたように実施した２７。簡単にいうと、細胞は室温で１０分間１％ホルムアルデヒドと架橋結合させ、ホルムアルデヒドはグリシン１２５ｍＭで反応停止させた。細胞溶解物は超音波処理し、クロマチン抽出物を抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（ａｂ８５８０、Ａｂｃａｍ）又は抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（０７−４４９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体で免疫沈降させた。定量ＰＣＲ分析は、以前に記載されたように実施した７。
【０１１８】
[000114]マイクロアレイ分析。マウスＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＯＳＫＭ、Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及び＃Ｂ１１）及びＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）から収集したｍＲＮＡの逆転写を実施した。各細胞株から２つの生物学的なマイクロアレイデータが繰り返し得られた。製造元の指示に従って処理したアレイ（セントリックスマウス−６発現ビーズチップ（Ｓｅｎｔｒｉｘ Ｍｏｕｓｅ−６ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐ）バージョン１．１）をイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）マイクロアレイプラットホームで読み取った。個別に発現した遺伝子をマイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）基準に基づいて選択した：倍率変化（（ＦＣ）＜０．６は下方制御、ＦＣ＞１．５は上方制御、ｑ値＜２％及び全試料の検出可能性は０．９５を上回る。
【０１１９】
核内受容体のスクリーニングによって、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２が再プログラミング効率を高めることができることが明らかである
【０１２０】
[000115]１９種の核内受容体（表１）の再プログラミング効率を高める能力のスクリーニングを実施した。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰレポーターを含有するＭＥＦ（図１２Ａ）（Ｆｅｎｇら、２００９ａ）を使用して、Ｐｏｕ５ｆ１遺伝子の反応性に基づいて推定ｉＰＳＣコロニーを同定した。Ｏｃｔ４（Ｏ）、Ｓｏｘ２（Ｓ）、Ｋｌｆ４（Ｋ）及びｃ−Ｍｙｃ（Ｍ）レトロウイルスと共にそれぞれの核内受容体をレトロウイルスでトランスフェクトした。ＧＦＰ陽性コロニーの出現頻度は、感染させて１４日後（ｄｐｉ）に測定した。核内受容体構築物全ての転写発現が確認された（データは示さず）。このスクリーニングによって、オーファン核内受容体Ｎｒ１ｉ２（プレグナンＸ受容体、Ｐｘｒとしても知られている）及びＮｒ５ａ２（肝臓受容体ホモログ−１、Ｌｒｈ−１としても知られている）の両方が再プログラミングの効率を（ＯＳＫＭ対照と比較して）それぞれ２．７倍及び４．０倍増強することができることを発見した（図１２Ａ）。Ｎｒ５ａ２を添加するとまた、ＯＳＫＭによる再プログラミングの動態が増強され、従来の４種類の因子による再プログラミングの場合よりも３日間早くＧＦＰ発現が検出可能であった（図１２Ｂ）。細胞生存能アッセイによって、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２両方が細胞死を誘導しないことが確かめられた（図１６Ｂ）。
【０１２１】
Ｎｒ５ａ２はＭＥＦのｉＰＳＣへの再プログラミングにおいてＯｃｔ４と代替することができる
【０１２２】
[000116]次に、Ｎｒ１ｉ２及びＮｒ５ａ２が再プログラミング効率の増強に加えて中心的再プログラミング因子と代替できるかどうかを調べた。ｃ−Ｍｙｃが再プログラミングに重要ではないことが既に示されたので（Ｎａｋａｇａｗａら、２００８；Ｗｅｒｎｉｇら、２００８）、ｃ−Ｍｙｃの代替能力については調べなかったが、代わりにこれら２種類の核内受容体がＯＳＫトリオのいずれかと代替する能力について試験した。Ｎｒ１ｉ２はＯ、Ｓ又はＫとは代替できず、Ｎｒ５ａ２はＳ又はＫと代替できなかった（図１２Ｃ）。注目すべきことに、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦをＮｒ５ａ２及びＳＫＭウイルスで形質導入すると、ＧＦＰ陽性コロニー（播種したＭＥＦ１００,０００個当たり２３.７±３.５個）が１４ｄｐｉによって認められた（図１２Ｃ、図１６Ｃ及び１６Ｄ）。これは、外来性Ｎｒ５ａ２が再プログラミング効率を高めるだけでなく、内在性Ｏｃｔ４と代替することもできたことを示している。Ｎｒ５ａ２、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃで再プログラミングされたこれらの細胞をＮ２ＳＫＭ ｉＰＳＣと称する。これらのコロニーは、長期間安定に継代することができ、アルカリホスファターゼ（図１６Ｅ）、Ｎａｎｏｇ（図１６Ｆ及び１６Ｇ）及びＳＳＥＡ−１（図１６Ｈ及び１６Ｉ）で陽性に染色された。その他の１８種の核内受容体がＯｃｔ４と代替する能力についても試験した。しかし、Ｎｒ５ａ２とは異なり、いずれもＯｃｔ４とは代替できなかった（図１６Ｊ）。
【０１２３】
[000117]ｃ−Ｍｙｃが再プログラミングに重要でないならば、Ｎ２ＳＫＭの組み合わせよりも効率は低いが（播種したＭＥＦ１００，０００個当たり２.３±０.６個）、Ｎｒ５ａ２及びＳＫウイルスで形質導入されたＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦからｉＰＳＣを生成することもできた（図１２Ｄ〜１２Ｆ）。これらの３因子Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣと称する。Ｎ２ＳＫＭ ｉＰＳＣと同様に、Ｎ２ＳＫ ｉＰＳＣはアルカリホスファターゼ（図１２Ｇ）、Ｎａｎｏｇ（図１２Ｈ及び１２Ｉ）及びＳＳＥＡ−１（図１２Ｊ及び１２Ｋ）で陽性に染色された。
【０１２４】
[000118]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、核型が正常で（図１６Ｋ）、それぞれのウイルスのゲノムＤＮＡへのゲノム統合が確認されており、Ｏｃｔ４導入遺伝子の統合の証拠は示されなかった（図１６Ｌ）。胚様体が媒介する分化及び奇形腫形成アッセイの両方を、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の多能性を試験するために実施した。インビトロで３種類の主要な胚葉の細胞に分化し（図１７Ａ）、３種類の主要な肺葉を起源とした分化組織からなる奇形腫を形成することができたので（図１７Ｂ）、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は本当に多能性がある。
【０１２５】
[000119]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞を８細胞期の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ又はＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ（Ｂ６−アルビノ）胚にマイクロインジェクションすることによって、多能性のよりストリンジェントなアッセイを実施した。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞はＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ ＭＥＦから得られたので、Ｅ１３．５胚は、内在性Ｏｃｔ４を高レベルで発現することによって、生殖腺においてＧＦＰ発現を示した（図１２Ｌ及び１２Ｍ）。さらに、生産キメラはＮ２ＳＫＭ（図１６Ｍ）及びＮ２ＳＫ株（図１２Ｎ）の両方から生成された。さらに重要なことに、Ｎ２ＳＫ株は生殖系列に分化可能である（図１２Ｏ、表２）。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
表の説明。あり（ｙｅｓ）はｉＰＳＣ株がアッセイで合格したことを示し、なし（ｎｏ）は生殖系列への移行が認められなかったことを示している。
【０１２８】
Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞の発現及びエピジェネティックプロファイリングはＥＳＣに非常に似ている。
【０１２９】
[000120]Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のグローバル遺伝子発現プロファイリングを実施し、マイクロアレイデータの階層的クラスター化によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞がＭＥＦよりもＥＳＣ及びＯＳＫＭ ｉＰＳＣとより類似していることが明らかになった（図１７Ｃ）。さらに、発現プロファイリングによって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞では、ＥＳＣ関連遺伝子が付随して上方制御され、ＭＥＦ関連遺伝子が下方制御されることが示された（図１７Ｄ）。
【０１３０】
[000121]次に、プロモーターメチル化分析によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のＰｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーターはほとんどがメチル化されておらず（図１７Ｅ）、ＥＳＣと類似していることが明らかになった。Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞のビバレントドメインパターンも調べた。我々の結果によって、Ｎｒ５ａ２で再プログラミングされた細胞は、ＥＳＣと類似した活性Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及び抑制Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３両方のクロマチン修飾を有することが示された（図１７Ｆ）。
【０１３１】
近接したファミリーのメンバーＮｒ５ａ１も再プログラミング効率を高め、Ｏｃｔ４と代替することができる
【０１３２】
[000122]再プログラミングの場合、転写因子の同じファミリーの密接に関与したメンバーは互いに代替することができる（Ｆｅｎｇら、２００９ａ；Ｎａｋａｇａｗａら、２００８）。Ｎｒ５ａ１（ステロイド産生因子１、Ｓｆ１としても知られている）及びＮｒ５ａ２の両方が同じ核内受容体サブファミリーＶに属するので、Ｎｒ５ａ１が再プログラミングの効率を高め、Ｏｃｔ４と代替できるかどうかを調べることに関心を持った。Ｎｒ５ａ１は再プログラミング効率を高めるが（図１３Ａ）、Ｎｒ５ａ２よりは少なかった（図１２Ａ）。次に、Ｎｒ５ａ１が中心的な再プログラミング因子（Ｏ、Ｓ及びＫ）のいずれかと代替できるかどうかを調べた。Ｎｒ５ａ２と同様に、Ｎｒ５ａ１はＳ及びＫとは代替できないが、Ｏｃｔ４とは代替することができた（図１３Ｂ）。これらのＧＦＰ陽性ｉＰＳＣコロニー（図１３Ｃ及び１３Ｄ）をＮ１ＳＫＭ ｉＰＳＣと称する。これらのＮｒ５ａ１で再プログラミングされた細胞はアルカリホスファターゼ（図１３Ｅ）、Ｎａｎｏｇ（図１３Ｆ及び１３Ｇ）及びＳＳＥＡ−１（図１３Ｈ及び１３Ｉ）を発現する。Ｎ１ＳＫＭ ｉＰＳＣにおいてウイルス性Ｎｒ５ａ１のゲノム統合を確認したが、ウイルス性Ｐｏｕ５ｆ１及びウイルス性Ｎｒ５ａ２ゲノム統合の証拠は見いだせなかった（図１３Ｊ）。これらの核型が正常なＮ１ＳＫＭ ｉＰＳＣ（図１３Ｋ）は、インビトロで３種類の異なる胚葉に分化することができ（図１３Ｌ）、３種類の異なる系列の組織を含む奇形腫を形成することができた（図１３Ｍ）。Ｎｒ５ａ１による再プログラミングを示すことによって、Ｎｒ５ａサブファミリーのいずれのメンバーも本当に類似の再プログラミング特性を有することが示される。
【０１３３】
Ｐｏｕ５ｆ１調節領域に結合するその他の転写因子は、再プログラミングにおいて外来性Ｏｃｔ４と代替することができない
【０１３４】
[000123]Ｎｒ５ａ２は、Ｐｏｕ５ｆ１の近位エンハンサー及び近位プロモーターの領域の両方に結合し、マウス胚発生のエピブラスト段階においてＰｏｕ５ｆ１を調節することが示された（Ｇｕら、２００５）。Ｎｒ５ａ２欠損胚は、エピブラストにおいてＯｃｔ４発現の欠如を示し（Ｇｕら、２００５）、Ｅ６．５とＥ７．５の間で死滅する（Ｇｕら、２００５、Ｐａｒｅら、２００４）。したがって、外来性Ｏｃｔ４との代替におけるＮｒ５ａ２の機構の一部は、Ｎｒ５ａ２が直接Ｐｏｕ５ｆ１を調節し、Ｐｏｕ５ｆ１の上流に作用するという発見によって説明することができる。
【０１３５】
[000124]Ｐｏｕ５ｆ１プロモーター又はエンハンサー領域に結合するその他の転写因子もＭＥＦの再プログラミングにおいてＯｃｔ４と代替できるか調査を続行した。したがって、Ｐｏｕ５ｆ１調節領域に結合する９種類のその他の転写因子（Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｓｔａｔ３、Ｚｆｘ、Ｔｃｆｃｐ２ｌ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｅｓｒｒｂ）を試験した（Ｃｈｅｎら、２００８）。各ウイルス転写物の発現を確認した（図１３Ｎ）。我々の結果によって、これらの転写因子はいずれもＳＫＭと組み合わせてＯｃｔ４と代替できないことが明らかになった（図１３Ｏ）。この結果は、Ｐｏｕ５ｆ１調節領域に結合する転写因子が再プログラミングにおいてＯｃｔ４と全く代替できないことを示している。したがって、Ｎｒ５ａ２及びその近接したファミリーのメンバー、Ｎｒ５ａ１はＯｃｔ４と代替する能力において特有である。
【０１３６】
Ｎｒ５ａ２のＤＮＡ結合能力は、再プログラミングにおける役割のために重要であるが、リガンド結合はあまり重要ではない
【０１３７】
[000125]その他の核内受容体のように、Ｎｒ５ａ２はリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）及びＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を備えている。しかし、オーファン核内受容体では、Ｎｒ５ａ２の内在性リガンドは依然として知られていない。Ｏｃｔ４がない場合の再プログラミングにおいて、Ｎｒ５ａ２のリガンド結合及びＤＮＡ結合の機能的重要性を調べた。推定リガンドの結合を阻止するために、Ｎｒ５ａ２ ＬＢＤの溝を埋めるように特定の残基を大きな残基（Ａ３６８Ｍ）に変異させた（Ｓａｂｌｉｎら、２００３）。次に、Ｎｒ５ａ２のＤＮＡ結合活性の著しい減少を生じる、保存されたＦｔｚ−Ｆ１ドメインに２重変異（Ｇ１９０Ｖ、Ｐ１９１Ａ）を有するＤＮＡ結合変異体を創出した（Ｓｏｌｏｍｏｎら、２００５）。これらのレトロウイルスベクターが同レベルのＮｒ５ａ２タンパク質を発現することを確かめるために、ウェスタン分析を実施した（図１３Ｐ）。再プログラミングアッセイは、Ｎｒ５ａ２リガンド結合変異体は野生型（ＷＴ）Ｎｒ５ａ２と比較して、ＧＦＰ陽性コロニーの形成数を減少させないことを示す（図１３Ｑ）。このことは、Ｎｒ５ａ２の再プログラミング因子として機能する能力はリガンド結合とは独立していることを示唆している。対照的に、Ｎｒ５ａ２ ＤＮＡ結合変異体をＳＫＭと共に導入すると、ＧＦＰ陽性コロニー数が劇的に減少した（図１３Ｑ）。考え合わせると、ＤＮＡ結合はＮｒ５ａ２の再プログラミング機能に必須であるが、リガンド結合は重要ではないことが示される。
【０１３８】
Ｎｒ５ａ２ＳＵＭＯ化部位変異体は、再プログラミング能力の増強を示す
【０１３９】
[000126]２個のリシン残基が変異した変異構築物（２ＫＲ）及び５個のリシン残基が変異した別の構築物（５ＫＲ）を使用して、リシン残基が変異したＮｒ５ａ２の再プログラミング能力を試験した。ウェスタン分析によって、ＷＴ及び変異体構築物が同レベルのタンパク質を発現することが示された（図１３Ｒ）。注目すべきことに、ＯＳＫＭ再プログラミングアッセイによって、２ＫＲ変異体が、再プログラミング効率を、ＷＴによって実現した４倍の増強と比較して、少なくとも７倍増強することが明らかになった（図１３Ｓ）。５ＫＲ変異体を導入したとき、再プログラミング効率はほぼ１１倍までさらに高まった（図１３Ｓ）。これらの結果は、ＳＵＭＯ部位の変異によってもたらされた細胞内局在の同時阻止及び転写活性の増強がＮｒ５ａ２による再プログラミングの誘導増大のきっかけとなり得ることを示唆している。
【０１４０】
ＥＳＣにおけるＮｒ５ａ２のゲノム全体の結合分析
【０１４１】
[000127]Ｐｏｕ５ｆ１（Ｇｕら、２００５）の他に、多能性細胞においてＮｒ５ａ２の標的遺伝子は知られていない。このために、クロマチン免疫沈降配列決定（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）技術を使用することによってＥＳＣにおけるＮｒ５ａ２のゲノム全体の地図作成を実施した（表３）。ＨＡタグを付けたＮｒ５ａ２を発現する安定なＥＳＣ細胞株を作製し、ＨＡタグを付けたＮｒ５ａ２タンパク質の発現はＮｒ５ａ２特異的抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した（図１８Ａ）。Ｎｒ５ａ２結合クロマチンは、抗ＨＡタグ抗体で濃縮された。新規モチーフ発見アルゴリズムＭＥＭＥを使用し、データセットに濃縮された公知のＮｒ５ａ２モチーフを明らかにした（図１４Ａ）。より重要なことに、ペアワイズ共起分析によってＮｒ５ａ２はＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｓｍａｄ１及びＥｓｒｒｂと一緒に局在する傾向があることが明らかになった（図１４Ｂ）。この結果は、Ｎｒ５ａ２を既に報告されているＮａｎｏｇ−Ｏｃｔ４−Ｓｏｘ２クラスターに関連付ける（Ｃｈｅｎら、２００８）。Ｎｒ５ａ２はＳｏｘ２及びＫｌｆ４と協力してＭＥＦをｉＰＳＣに再プラグラムするので、これら３種類の転写因子が同じ結合標的を共有するかどうかを調べた。興味深いことに、３種類の転写因子全てが、Ｐｏｕ５ｆ１、Ｎａｎｏｇ、Ｔｂｘ３、Ｋｌｆ２及びＫｌｆ５などのＥＳＣの独自性の維持に極めて必要な標的遺伝子に結合することを発見した（図１４Ｃ、図１８Ｂ）。
【０１４２】
ＮａｎｏｇはＮｒ５ａ２の標的である
【０１４３】
[000128]Ｎａｎｏｇは、多能性の基準状態レベルへの入り口となるので、ＥＳＣにおいて重要である（Ｓｉｌｖａら、２００９）。Ｎａｎｏｇが再プログラミング中、Ｎｒ５ａ２の標的であることを確かめるために、外来性のＨＡタグを付けたＮｒ５ａ２をＭＥＦに導入した。ＣｈＩＰ実験によって、再プログラミング中Ｎｒ５ａ２は本当にＮａｎｏｇエンハンサーに結合することが示された（図１５Ａ）。ＮａｎｏｇはＥＳＣ及びＭＥＦの両方におけるＮｒ５ａ２の標的なので（図１８Ｂ、図１５Ａ）、Ｎｒ５ａ２が関与する再プログラミングにおけるＮａｎｏｇの役割を調べた。Ｎｒ５ａ２を再プログラミングするＭＥＦに導入すると、Ｎａｎｏｇ発現が増加することを発見した（図４Ｂ）。予測通り、再プログラミング中にＮｒ５ａ２をＯＳＫＭと共に導入すると、内在性Ｐｏｕ５ｆ１はＮａｎｏｇと類似の傾向で増加する（図１５Ｃ及び１５Ｄ）。Ｎａｎｏｇは多能性状態への移行に重要なので（Ｓｉｌｖａら、２００９）、Ｎｒ５ａ２を導入することによってもたらされた再プログラミング効率の増強は、Ｎａｎｏｇによって部分的に促進され得る。
【０１４４】
[000129]次に、Ｎｒ５ａ２がＭＥＦの再プログラミングに重要かどうかを確かめたかった。ＯＳＫＭをＭＥＦに導入すると同時にＮｒ５ａ２のノックダウンを実施した。Ｎｒ５ａ２ ｓｈＲＮＡノックダウン構築物は、マウスＥＳＣにおいてＮｒ５ａ２ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を減少させることができた（図１５Ｅ及び１５Ｆ）。再プログラミング中にＮｒ５ａ２を激減させると、コロニー数の減少が生じた（図１５Ｇ）。重要なことに、外来性ＮａｎｏｇはＮｒ５ａ２のノックダウンによって生じたコロニーの減少を回復させることができた（図１５Ｇ）。Ｎａｎｏｇとは異なり、独立した因子Ｍｔｆ２は、コロニーの減少を回復させることはできなかった（図１５Ｇ）。Ｎａｎｏｇは、Ｎｒ５ａ２ノックダウンによってもたらされた再プログラミング効率の減少を回復させることはできたが、Ｎａｎｏｇは、Ｐｏｕ５ｆ１ノックダウンによる影響を回復させることはできなかった（図１５Ｇ）。興味深いことに、Ｎａｎｏｇ及びＮｒ５ａ２の両方をＯＳＫＭと共に添加すると、ＯＳＫＭと共にＮｒ５ａ２のみを添加する場合よりも多くのＧＦＰ陽性コロニーを生成することができた（図１５Ｈ）。考え合わせると、これらの結果は、ＮａｎｏｇがＭＥＦの再プログラミングにおいてＮｒ５ａ２の重要な下流標的の１つであり、再プログラミング効率の増強を媒介することを示唆している。
【０１４５】
[000130]ここでは、Ｎｒ５ａ２又はＮｒ５ａ１による再プログラミングが外来性Ｏｃｔ４の必要性を回避することができることを示す。我々のデータによって、Ｎｒ５ａ２がＳｏｘ２及びＫｌｆ４と相乗的に機能してＭＥＦの再プログラミングの成功を媒介する外来性Ｏｃｔ４と代替することが示される。Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃと一緒に外来性Ｎｒ５ａ２で、ＭＥＦ以外にマウスＮＰＣを再プログラミングすることができた（データは示さず）。Ｐｏｕ５ｆ１の上流活性化因子であることに加えて（Ｇｕら、２００５）、Ｎｒ５ａ２はまた、ＥＳＣにおける基準状態の多能性の重要な媒介物であるＮａｎｏｇによって部分的に作用し（Ｓｉｌｖａら、２００９）、Ｎｒ５ａ２によるＮａｎｏｇ誘導によって多能性の獲得が促進される。最近、Ｔｇｆ−βシグナル伝達を阻害する化学物質（Ｉｃｈｉｄａら、２００９、Ｍａｈｅｒａｌｉ及びＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ、２００９）が、ＭＥＦの再プログラミングにおけるＮａｎｏｇと外来性Ｓｏｘ２の代替を誘導することが発見された（Ｉｃｈｉｄａら、２００９）。したがって、Ｎａｎｏｇは本当に再プログラミングの重要な標的である。
【０１４６】
[000131]要約すると、我々の研究は、体細胞の再プログラミングのために外来性Ｏｃｔ４に依存しない形式（ｃｏｄｅ）の一例を提供する。Ｎｒ５ａ２及びＮｒ５ａ１の両方が従来の４種類の因子と共に再プログラミングの効率を高めることができることも示す。要するに、再プログラミングの増強及び媒介の両方における核内受容体の予期せぬ２つの役割を明らかにした。
【０１４７】
細胞培養及びトランスフェクション
[000132]ｉＰＳＣは、前述のようにマイトマイシンＣ処理したＭＥＦフィーダー上で培養した（Ｆｅｎｇら、２００９ａ）。ＭＥＦは、Ｅ１３．５胚から単離し、以前に記載されたように培養した（Ｆｅｎｇら、２００９ａ）。２９３−Ｔ細胞は、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造元の方法に従って、各ｐＭＸレトロウイルスベクターをトランスフェクトした。ＲＮＡｉ実験用に、ｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏベクターにクローニングしたｓｈＲＮＡ構築物をリポフェクタミンでＥＳＣにトランスフェクトした。細胞は、トランスフェクション１６時間後にピューロマイシン１μｇｍｌ−１で選択した。ｓｈＲＮＡ配列はＰｏｕ５ｆ１：５’−ＧＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡ−３’、ルシフェラーゼ：５’−ＧＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＡＧＴＡＣＡ−３’及びＮｒ５ａ２：５’ＧＣＡＡＧＴＧＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＡＡ−３’である。
【０１４８】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑ分析
[000133]Ｎｒ５ａ２ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ（８，０２３ ４２７特有にマップされたタグ）のピーク検出（ｐｅａｋ ｃａｌｌｉｎｇ）は、ＭＡＣＳを使用してｐ値カットオフ１ｅ〜９を用いて実施し、３，３４６ピークを生成した。対照の抗ＨＡ ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーは１３，００１，２７２の特有にマップされたタグを含有した。濃縮されたモチーフは、新規モチーフ発見ツールＭＥＭＥによって、ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークの中心の２００−ｂｐ配列を使用して同定した。Ｎｒ５ａ２結合部位とその他の重要な転写因子の結合部位との重複を研究するために同時出現分析をＮｒ５ａ２ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ及び我々の以前の研究で作製したデータセットで実施した（Ｃｈｅｎら、２００８）。
【０１４９】
マイクロアレイ分析
[000134]マウスＥＳＣ、ｉＰＳＣ（ＯＳＫＭ、Ｎ２ＳＫＭ ＃Ａ５、Ｎ２ＳＫ ＃Ｂ３及び＃Ｂ１１）及びＭＥＦ（アクチン−ＧＦＰ及びＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ）から収集したｍＲＮＡの逆転写を実施した。各細胞株について、２つの生物学的な２連のマイクロアレイデータが得られた。ＯＳＫＭ＋Ｎｒ５ａ２及びＯＳＫＭ試料のマイクロアレイでは、生物を３連で使用した。製造元の指示に従って処理したアレイ（セントリックス（Ｓｅｎｔｒｉｘ）マウス−６発現ビーズチップ バージョン１．１）をイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）マイクロアレイプラットホームで読み取った。個別に発現した遺伝子をマイクロアレイの有意性分析基準に基づいて選択した：倍率変化（（ＦＣ）＜０．６は下方制御、ＦＣ＞１．５は上方制御、ｑ値＜０．０２及び全試料の検出可能性は０．９５超。
【０１５０】
ＧＥＯ登録コード
[000135]マイクロアレイ及びＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、ＧＥＯデータベースでそれぞれ登録番号ＧＳＥ１９０２３及びＧＳＥ１９０１９で入手できる。
【０１５１】
マウス分子遺伝学
[000136]ＭＥＦはＰｏｕ５ｆ１−ＧＦＰトランスジェニックマウス及びアクチン−ＧＦＰトランスジェニックマウス（ＪＡＸ研究室、ストック番号００４６５４及び００３５１６）から単離した。Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰは、Ｐｏｕ５ｆ１−ＧＦＰ雄マウスと野生型１２９Ｓ２/ＳＶ雌の交配から得られたＥ１３．５胚から収集し、アクチン−ＧＦＰ ＭＥＦはアクチン−ＧＦＰマウスと野生型ＣＤ１雌マウスの交配から得られたＥ１３．５胚から収集した。８〜１２個のｉＰＳＣを、８細胞期で得られたＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ胚にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションした胚をＥ０．５偽妊娠雌Ｆ１（ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）の卵管に移植した。キメラ胚は、Ｅ１３．５で収集し、蛍光顕微鏡で生殖腺におけるＧＦＰ発現を測定した。キメラマウスは、生殖系列関与を測定するためにアルビノＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊマウスと交配した。動物実験は全てＩＡＣＵＣ指針に従って実施した。
【０１５２】
レトロウイルス構築物、パッケージング及び感染
[000137]Ｎｒ５ａ２及びその他の因子のｃＤＮＡ配列は、マウスＥＳＣ ｃＤＮＡ又は市販のプラスミド（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかからＰＣＲ増幅した。Ｎｒ５ａ２ ＳＵＭＯ変異体（２ＫＲ：Ｋ１７３Ｒ、Ｋ２８９Ｒ及び５ＫＲ：Ｋ１７３Ｒ、Ｋ２１３Ｒ、Ｋ２８９Ｒ、Ｋ３２９Ｒ、Ｋ３８９Ｒ）のｃＤＮＡ配列は恵与された構築物（Ｙａｎｇら、２００９）から増幅した。Ｎｒ５ａ２リガンド及びＤＮＡ結合変異体は、適切なプライマーでＰＣＲ増幅した。増幅したコーディング配列は配列決定によって確認し、ＭＭＬＶをベースにしたｐＭＸレトロウイルスベクターにクローニングした。それぞれのプロモーター領域でｓｈＲＮＡノックダウンした構築物は、ｐＳＵＰＥＲ．ｐｕｒｏベクターからｐＭＸベクターに移した。レトロウイルスは、既に記載されたように作製した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６）。３Ｔ３細胞はＧＦＰ遺伝子を有するｐＭＸレトロウイルスで感染させた。４８時間感染させた後、ＧＦＰ陽性細胞の割合を定量するためにＦＡＣｓを実施した。形質導入する単位の数は、既に記載されたように計算した（Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら、２００６）。形質導入する単位の数は、感染効率（ＭＯＩ）５を実現するために必要なウイルスの量を計算するために使用した（Parkら、２００８）。ｉＰＳＣ作製のために、それぞれＭＯＩが５の異なる因子をコードするウイルスを、ＦＢＳ１５％及びポリブレン６ｎｇｍｌ−１を含有するＤＭＥＭ中で、７０％コンフルエンスでＭＥＦに導入した。１ｄｐｉで培地を新鮮なＭＥＦ培地に交換した。２ｄｐｉで、細胞をＭＥＦフィーダーに移し、ＦＢＳを含有する培養培地で６日間培養し、その後さらに５〜１５日間ＫＳＲを含有する培養培地で培養した。
【０１５３】
ＲＮＡ抽出、逆転写及び定量的リアルタイムＰＣＲ
[000138]方法は前述の通りである（Ｆｅｎｇら、２００９）。
【０１５４】
重亜硫酸塩ゲノム配列決定
[000139]ゲノムＤＮＡは、Ｉｍｐｒｉｎｔ（商標）ＤＮＡ修飾キット（Ｓｉｇｍａ）によって製造元の指示に従って重亜硫酸塩処理した。Ｐｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域は、ＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｍ１３フォワード及びＭ１３リバースプライマーで配列確認した。Ｐｏｕ５ｆ１及びＮａｎｏｇプロモーター領域のＰＣＲ増幅で使用したプライマー配列はそれぞれ、
５’−ＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＧＧＴＴＴＡＴＴＴＡ−３’、５’−ＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣ−３’及び
５’−ＧＡＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＧＧＧＡＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴ−３’、５’−ＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡ−３’である。
【０１５５】
核型決定
[000140]ｉＰＳＣをコルセミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、標準低浸透圧処理によって収集し、メタノール：酢酸（３：１）で固定した。スライドは、Ｇバンド核型分析の前に空気乾燥した。
【０１５６】
遺伝子型決定
[000141]各ＰＣＲ増幅反応は、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＭＥＦ又は胚のいずれかから収集したゲノムＤＮＡ３００ｎｇで実施した。
センスプライマー配列：５’−ＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣ−３’。
アンチセンスプライマー配列は、
Ｎｒ５ａ２：５’−ＧＡＣＧＣＡＡＴＡＧＣＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＴＧ−３’、
Ｓｏｘ２：５’−ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴ−３’、
Ｋｌｆ４：５’−ＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＴＣＧＣＣＡＧＧ−３’
ｃ−Ｍｙｃ：５’−ＴＣＧＴＣＧＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＧＧＧＣＴＧ−３’
Ｐｏｕ５ｆ１：５’−ＣＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＧＡＴ−３’である。
【０１５７】
ＥＢ媒介インビトロ分化
[000142]ＥＢ形成のため、ｉＰＳＣをトリプシン処理し、ペトリ皿でＬＩＦ及びβ−メルカプトエタノールを含まないｉＰＳＣ培養培地で４〜５日培養した。ゼラチンをコートしたプレートにＥＢを移し、レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）１μＭを添加して５〜６日培養した。試料は４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％トリトンＸ−１００で透過処理し、８％ＦＢＳでブロックし、抗Ｇａｔａ−４（１：１００、ｓｃ−２５３１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗ネスチン（１：１００、ｓｃ−５８８１３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又は抗α−平滑筋アクチン（１：１００、ａｂ１８４６０、Ａｂｃａｍ）で染色した。次に試料は、２次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６結合抗マウス（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次いでヘキスト（１：４０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で核を染色した。
【０１５８】
奇形腫アッセイ
[000143]ｉＰＳＣは、トリプシン処理によって収集し、０．９％生理食塩水に１×１０７細胞ｍｌ−１で再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌをアベルチンで麻酔したＳＣＩＤマウスの各背側部に皮下注射した。奇形腫を３〜４週間後に切除し、重量を量り、パラフィルムに包埋する前にブアン固定液で固定した。パラフィン包埋組織を切除し、既に記載されたようにマロリーテトラクロームで染色した（Ｗａｎｇ及びＬｕｆｋｉｎ、２０００）。
【０１５９】
免疫蛍光顕微鏡及びアルカリホスファターゼ染色
[000144]ゼラチンコーティングしたカバーガラス上で培養したｉＰＳＣを４％パラホルムアルデヒドで固定し、１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理し、８％ＦＢＳでブロックした。ブロック後、試料を抗Ｎａｎｏｇ（１：５０、ＲＣＡＢ０００２ＰＦ、ＣｏｓｍｏＢｉｏ）又は抗ＳＳＥＡ−１（１：２００、ＭＡＢ４３０１、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で染色し、その後Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８結合抗ウサギ（１：３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６結合抗マウスＩｇＭ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）それぞれで染色した。次に、核はヘキスト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色した。市販のＥＳＣ特徴付けキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用して、製造元の方法にしたがってアルカリホスファターゼ検出を実施した。
【０１６０】
ウェスタン分析
[000145]プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補給したＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で細胞を可溶化した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。細胞溶解物５０μｇを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ポリビニリジンジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。この膜は５％スキムミルクでブロックした。ブロックした後、ブロットを抗ＨＡ（１：２０００、ｓｃ−７３９２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、抗Ｎｒ５ａ２（１：２０００、ａｂ１８２９３、Ａｂｃａｍ）又は抗アクチン（１：２０００、ｓｃ−１６１６、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）１次抗体のいずれかで１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（１：５０００、１８５８４１３、Ｐｉｅｒｃｅ）、ＨＲＰ結合ウサギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２００４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又はＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ（１：５０００、ｓｃ−２７６８、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）のいずれかでそれぞれインキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、シグナルはウェスタンブロッティングルミノール試薬（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して検出した。
【０１６１】
タネルアッセイ
[000146]ＭＥＦに各ウイルスを感染させ、感染培地は２４時間後に新鮮なＭＥＦ培地と交換した。感染して７８時間後、タネルアッセイのために細胞を収集した。陽性対照のために、感染してないＭＥＦを細胞標識する前にＤＮアーゼ１（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。市販のキットを使用して、製造元（Ｒｏｃｈｅ）の方法にしたがってタネル標識を実施した。標識後、細胞はＦＡＣＳ分析を行った。
【０１６２】
ＣｈＩＰアッセイ
[000147]ＣｈＩＰアッセイは、以前に記載されたように実施した（Ｌｏｈら、２００６）。一般的に、細胞は室温で１０分間１％ホルムアルデヒドと架橋結合させ、ホルムアルデヒドはグリシン１２５ｍＭで反応停止させた。細胞溶解物を超音波処理し、クロマチン抽出物を抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（ａｂ８５８０、Ａｂｃａｍ）、抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（０７−４４９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体又は抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体で免疫沈降させた。定量ＰＣＲ分析は、以前に記載したように実施した（Ｆｅｎｇら、２００９）。
【０１６３】
[000148]当業者であれば、本明細書で記載した本発明は、具体的に記載したもの以外の変更及び改変を受けやすいことを理解するであろう。本発明には、このような変更及び改変が全て含まれる。本発明にはまた、明細書で言及した、又は指示したステップ、特徴、製剤及び化合物の全てが個々に、又は集合的に含まれ、並びに２個以上のステップ若しくは特徴の任意又は全部の組み合わせが含まれる。
【０１６４】
[000149]本文で引用したそれぞれの文書、参考文献、特許出願又は特許は、参考として全体が明らかに本明細書に組み込まれており、これは読者によって本文の一部として読まれ、考えられるべきであることを意味している。本文で引用した文書、参考文献、特許出願又は特許が本文において繰り返されていないのは、簡明にするというだけの理由である。
【０１６５】
[000150]本明細書又は本明細書で参考として組み込まれた任意の文書において述べた任意の製品のための任意の製造元の指示、記載、製品明細及び製品仕様書は、参考のために本明細書に組み込まれており、本発明の実践で使用することができる。
【０１６６】
[000151]本発明は、本明細書で記載した具体的な実施形態のいずれかによって範囲を限定されるものではない。これらの実施形態は、例示の目的だけのためのものである。機能的に等価の製品、製剤及び方法は、明らかに本明細書で記載した本発明の範囲内である。
【０１６７】
[000152]本明細書で記載した本発明は、１個以上の範囲の値（例えば、大きさ、濃度など）を含むことができる。値の範囲には、範囲内の全ての値が含まれるものと理解され、範囲を限定する値、及び範囲の境界を定める値に直接隣接した値と同じ又は実質的に同じ結果を導く、範囲に隣接した値が含まれる。
【０１６８】
[000153]本明細書全体にわたって、特に必要がなければ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載されている整数又は整数の群を含むが、その他の任意の整数又は整数の群も排除しないものと理解される。本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法でそれらのものとされる意味を有することができ、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ、並びに「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらのものと認められる意味を有し、例えば、これらは不明瞭に引用された要素は許容するが、先行技術に見出される、又は本発明の基本的な、若しくは新規の特性に影響を及ぼす要素は排除する。
【０１６９】
[000154]本明細書で使用した選択用語のその他の定義は、本発明の詳細な説明の中に見出すことができ、全体にわたって適用することができる。特に定義されていない限り、本明細書で使用したその他の科学的及び技術的用語は全て、本発明が属する業界の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【０１７０】
[000155]本発明は特定の方法及び実施形態に関して記載されているが、本発明を逸脱しなければ様々な改変及び変更を行うことができることを理解されたい。
【０１７１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、いずれの内容も本明細書に参考として組み込んだ、２００９年９月３０日出願のシンガポール特許出願第２００９０６５４６−７号及び２０１０年１月９日出願の第２０１０００１４０−２号の利益及び優先権を主張する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、
ａ）インビトロで細胞を培養するステップ、
ｂ）培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップ
を含む方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、表１に挙げた核内受容体の１つをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー５の核内受容体又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
サブファミリー５の核内受容体が配列番号１０を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号８を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１から選択されるポリペプチドをコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞内でポリヌクレオチドの発現を導くことができる調節配列に操作可能に結合した、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子、又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、表１に挙げた核内受容体の１つをコードする、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー５の核内受容体又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
サブファミリー５の核内受容体が配列番号１０を含む、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号８を含む、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１から選択されるポリペプチドをコードする、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
変性疾患の治療において使用するための、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のベクターによって培養液中の細胞に導入される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
多能性幹細胞治療の必要な患者を治療するために多能性幹細胞を誘導する方法であって、
ａ）個体ドナーから細胞を単離するステップ、
ｂ）インビトロで細胞を培養するステップ、
ｃ）培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップ、
ｄ）多能性幹細胞治療の必要な患者に多能性細胞を誘導するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが、表１に挙げた核内受容体の１つをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー５の核内受容体をコードするポリヌクレオチド又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む、請求項1５に記載の方法。
【請求項１８】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号１０を発現するポリヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号８のポリヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
変性疾患の治療のための医薬品を調製するための、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２２】
多能性幹細胞株の作製方法であって、
ａ）インビトロで細胞を培養するステップ、
ｂ）培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、ポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む転写因子をコードする、ステップ、
ｃ）多能性細胞を継代して細胞株を維持するステップ
を含む方法。
【請求項２３】
核内受容体ポリペプチドと、Ｓｏｘポリペプチド、クルッペル様因子ポリペプチド又はｍｙｃファミリーのポリペプチドから選択される１個以上の転写因子ポリペプチドとを含む、体細胞を再プログラミングするための組成物。
【請求項２４】
核内受容体ポリペプチドが、表１に挙げた核内受容体の１つである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
核内受容体ポリペプチドが、サブファミリー５の核内受容体又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
サブファミリー５の核内受容体ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項１】
インビトロで多能性幹細胞を誘導する方法であって、
ａ）インビトロで細胞を培養するステップ、
ｂ）培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップ
を含む方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチドが、表１に挙げた核内受容体の１つをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー５の核内受容体又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
サブファミリー５の核内受容体が配列番号１０を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号８を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１から選択されるポリペプチドをコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
宿主細胞内でポリヌクレオチドの発現を導くことができる調節配列に操作可能に結合した、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子、又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、表１に挙げた核内受容体の１つをコードする、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー５の核内受容体又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
サブファミリー５の核内受容体が配列番号１０を含む、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号８を含む、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１から選択されるポリペプチドをコードする、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
変性疾患の治療において使用するための、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のベクターによって培養液中の細胞に導入される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
多能性幹細胞治療の必要な患者を治療するために多能性幹細胞を誘導する方法であって、
ａ）個体ドナーから細胞を単離するステップ、
ｂ）インビトロで細胞を培養するステップ、
ｃ）培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、転写因子をコードするポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む、ステップ、
ｄ）多能性幹細胞治療の必要な患者に多能性細胞を誘導するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが、表１に挙げた核内受容体の１つをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核内受容体をコードするポリヌクレオチドが、サブファミリー５の核内受容体をコードするポリヌクレオチド又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む、請求項1５に記載の方法。
【請求項１８】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号１０を発現するポリヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号８のポリヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
サブファミリー５の核内受容体が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
変性疾患の治療のための医薬品を調製するための、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のベクターの使用。
【請求項２２】
多能性幹細胞株の作製方法であって、
ａ）インビトロで細胞を培養するステップ、
ｂ）培養液中の細胞に転写因子をコードするポリヌクレオチドを導入するステップであり、細胞を多能性細胞に誘導するために、ポリヌクレオチドが、核内受容体と、Ｓｏｘ遺伝子、クルッペル様因子遺伝子又はｍｙｃファミリーの遺伝子から選択される１個以上の転写因子とを含む転写因子をコードする、ステップ、
ｃ）多能性細胞を継代して細胞株を維持するステップ
を含む方法。
【請求項２３】
核内受容体ポリペプチドと、Ｓｏｘポリペプチド、クルッペル様因子ポリペプチド又はｍｙｃファミリーのポリペプチドから選択される１個以上の転写因子ポリペプチドとを含む、体細胞を再プログラミングするための組成物。
【請求項２４】
核内受容体ポリペプチドが、表１に挙げた核内受容体の１つである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
核内受容体ポリペプチドが、サブファミリー５の核内受容体又はそのＳＵＭＯ化変異体を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
サブファミリー５の核内受容体ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１３−５０６４１７（Ｐ２０１３−５０６４１７Ａ）
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３２０５３（Ｐ２０１２−５３２０５３）
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４０８８７
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２０１０／０００３７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４０８８７
【国際公開日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
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