核酸の濃縮精製方法および装置
電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法において、核酸（１）を含む試料に陽イオン界面活性剤（４）を加えて、該試料中の夾雑物（２）における荷電量を調節し、該試料を電解中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行う。夾雑物に対する荷電量調節は、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を、該試料に添加する非イオン界面活性剤（３）の吸着量により調節する。また、試料を、分離媒体に接触させた後に、泳動方向に対して断面積が小さくなるフィルタにより回収する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、核酸の分離方法に関する。より詳しくは、電気泳動の手法により、目的とする核酸を取出すための核酸分離方法に関する。
【背景技術】
近年、ヒトゲノムの解読が進み、さまざまな生命現象と遺伝子の関連が解明されてきている。そして、この成果により、医学・医療は病態から病因へ、治療から予防へと視野を広げている。ここにおいて、遺伝子検査技術は重要な基盤となっている。
遺伝子検査は、培養困難な病原微生物の同定検査、抗生物質加療中や感染初期の病原微生物の検出、移行抗体が疑われた際の抗原検出、病原微生物の感染源調査、親子鑑定などの個人識別、さらに白血病・固形腫瘍の遺伝子レベルの病型診断や遺伝病の確定診断など従来の臨床検査では困難であった検査を行うことができる。そして、結果を得るまでの時間が、菌の培養を用いる手法に比べて短く、培養に時間のかかる細菌の検出には威力を発揮する。さらにＤＮＡは保存条件によっては安定しているため、凍結生検材料、骨など過去の検体からも検査を行うことができる。
また、近年増加傾向にある性感染症の検査において、検査機会の拡大を図るべく、遺伝子検査が注目されている。
従来核酸の精製濃縮方法としては、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた精製方法、核酸を吸着するカラム／フィルターを用いた精製方法、磁性シリカビーズを用いた精製方法等が知られている。
さらに、平板状の電気泳動ゲルから核酸を回収する方法として、作成したゲルにおいて核酸を電気泳動し、ゲルにおいて目的とする核酸の位置に回収装置を移動し、更なる電気泳動により目的とする核酸を回収する方法が知られている（例えば、実開平５−８８２９６号公報を参照）。
この他に、平板状の電気泳動ゲルにおいて、核酸を電気泳動して目的とする核酸を分離し、目的とする核酸のバンド近傍に回収チップを挿入して核酸を回収する方法が知られている（例えば、特開平８−３２７５９５号公報を参照）。
従来核酸の精製分離方法において、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた精製方法は、劇薬を使用するため、高度の化学設備を必要とするものであり、利用する環境が限定される。そして、操作に手間がかかるとともに、高速遠心が必要となり、自動化が困難である。また、高い精製精度を得ることが困難である。
核酸を吸着するカラム／フィルターを用いた精製方法は、溶液を流しながら行うため、ごみ等の混入量の多いサンプルでは、カラム／フィルターが目詰まりを起こしやすく、精製効率が低くなる可能性がある。そして、遠心もしくは吸引操作を行う必要があるので、自動化が困難である。
さらに、磁性シリカビーズを用いた精製方法は、磁石によるビーズの回収を失敗した場合や、シリカビーズが磁性体より剥落した場合には、サンプルにシリカが混入する可能性ある。そして、高い回収率を得ることが困難である。
平板状の電気泳動ゲルから核酸を回収する従来の技術においては、平板状の電気泳動ゲルを必要とするとともに、この平板状の電気泳動ゲルにおいて一端電気泳動を行い、目的核酸の該当位置のゲルを処理する必要がある。
電気泳動に用いられるゲルは、衝撃に弱く、生成過程により、特性が大きくことなる場合がある。このため、一般に電気泳動を行った後に、紫外線により電気泳動ゲルにおける目的核酸の位置を認識した後に、目的核酸の含有量の多い部分を処理するものである。
遺伝子検査等にこの手法を利用する場合には、一回の検査にかかる時間が長くなる。また、電気泳動に用いるゲルが大きくゲルのムラによる核酸のバンドのにじみにより核酸の回収率が低下する可能性がある。さらに、ゲルが大きい場合には、電気泳動に必要となる電力が大きくなる。
【発明の開示】
上記の課題を解決すべく、様々の試験が行われ、検体中に存在する夾雑物に界面活性剤を吸着させ、核酸と異なる挙動を示させることにより、夾雑物と核酸とを分離させることが見出されたものである。
そして、陽イオン界面界面活性剤と非イオン界面活性剤で核酸以外の夾雑物を帯電させ、電界中におくことで、夾雑物を含む検体より核酸を分離精製し、核酸の濃縮もしくは濃縮しやすい状態とするものである。
図１は界面活性剤存在下における電気泳動による核酸濃縮構成を示す模式図である。検体中には、核酸１とともに夾雑物２が含まれるものである。この検体中に、界面活性剤を混合する。界面活性剤としては非イオン界面活性剤３と陽イオン界面活性剤４とを用いるものである。検体中に混合された界面活性剤は夾雑物２に吸着する。陽イオン界面活性剤４が吸着した夾雑物２は、正電荷に帯電することとなる。そして、界面活性剤の吸着した夾雑物２と、界面活性剤の吸着していない、もしくは吸着量の少ない核酸１とを電気泳動により分離することができるものである。これにより、検体から夾雑物２を容易に取り除くことができ、核酸１を濃縮できるものである。
次に、核酸濃縮の手法について説明する。この核酸濃縮の手法において、電気泳動を２回行うことにより、核酸の濃縮を確実に行うものである。第一に電気泳動においては検体中の余分なイオンを除き、第二の電気泳動においては検体中の核酸の濃縮を行うものである。まず、核酸を含む検体に非イオン界面活性剤として、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加えて混合する。非イオン界面活性剤を加えた検体を、９６℃で１０分間加熱する。そして、検体に陽イオン界面活性剤として、０．２％ＤＣＰを１００μＬ加える。なお、検体には、非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を同時に加えた後に、加熱処理を行うことも可能である。検体に界面活性剤を加えて前処理を行うため、核酸が大腸菌などの原核細胞内に存在する場合においても、細胞壁が界面活性剤により破壊されることから、大腸菌の培養液などを検体として用いることができ、検体前処理の操作を容易に行うことができるものである。このように検体の前処理を行い、１００Ｖの直流電圧を加え１０分間電気泳動を行い、検体中の余分なイオンを除去する。この後に、１２５〜１５０Ｖの直流電圧を加え、１２０分間電気泳動を行い、正極側において核酸を採取するものである。
検体の電気泳動を行う電気泳動槽の構成について説明する。まず、第一の電気泳動について説明する。図２は第一電気泳動の泳動槽構成を示す図である。電気泳動槽５内にはサンプル槽６、正極側と負極側とを分ける隔壁９が設けられている。サンプル槽６は隔壁９に貫通しており、一端が正極側に、他端が負極側に突出した構成となっている。サンプル槽６の両端は開口しており、両端の開口部はそれぞれゲル８・８により閉じられている。これにより、サンプル槽６内に電位差を発生させて核酸および界面活性剤が吸着した夾雑物の電気泳動を行うものである。検体に非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を加え、加熱処理を行った後に、検体をサンプル槽６に注入する。そして、電極間に１００Ｖの電圧を加えて、１０分間の電気泳動を行うものである。これにより、検体中に含まれる余分なイオンを除くものである。検体中に含まれる余分なイオンを除いた後に、第二に電気泳動により核酸の濃縮を行うものである。
第二電気泳動について説明する。第二の電気泳動においては、第一の電気泳動で検体を注入したサンプル槽に、核酸の回収槽を接続していたものを電気泳動槽内に配置して電気泳動を行うものである。図３は第二電気泳動の泳動槽構成を示す図である。電気泳動槽５内にはサンプル槽６、回収槽７、正極側と負極側とを分ける隔壁９が設けられている。サンプル槽６は隔壁９に挿入され、負極側に突出した構成となっている。回収槽７は隔壁９に挿入され、正極側に突出した構成となっている。サンプル槽６と回収槽７とは隔壁９配設部において接続されており、ゲル８を介して接続されている。サンプル槽６の両端は開口しており、両端の開口部はそれぞれゲル８・８により閉ざされている。そして、回収槽７の両端は開口しており、負極側はゲル８により閉じられており、正極側は限外ろ過膜１１により閉じられている。このように構成された電気泳動槽において、電極間に１２０Ｖの電圧を加え、１２０分間の電気泳動を行うものである。
このように、電気泳動槽において第二の電気泳動を行うことにより、検体中の核酸以外の余分なイオンを除いた検体を電気泳動することができ、回収槽７において核酸を効率的に回収できるものである。また、回収槽７の正極側には限外ろ過膜１１を設けており、核酸は回収槽７より排出されることなく、回収槽７内にとどまる。このため、核酸の回収効率を向上することができるものである。なお、検体の状態によっては、第一の電気泳動を行うことなく、第二の電気泳動を行うことも可能である。回収槽７に接続したサンプル槽６に前処理を行った検体を注入して電気泳動することにより、容易に核酸の濃縮を行うことができるものである。検体中に存在する余分なイオンは限外ろ過膜を透過できるので、核酸の回収に影響をあたえない。
すなわち、本発明は、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に試料を電界中におき核酸の濃縮精製を行うものである。そして、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うものである。また、核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うものである。また、核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節するものである。
そして、試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加して該試料を電気泳動して陽極側において核酸の濃縮精製を行う装置を構成するものであり、側面を絶縁体により構成した容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成して該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して電極に接続している装置を構成するものである。
さらに、上記ほかに、次のような手段を用いることもできる。核酸を含むサンプルを、分子量によって移動度の差を与える物質により構成される分離媒体に接触させ、電圧を印加することにより核酸を他の物質と分離するものである。そして、分離媒体より抜け出た核酸を、フィルターにより回収するものである。このフィルターは、目的核酸より小さい核酸等が素通りする程度のポアサイズを有するものである。
例えば、電気泳動に用いられる分離媒体の一端にバッファで満たされたサンプル供給部を設け、他端に同様にバッファで満たされた採取部を設け、サンプル供給部と採取部とに電圧を印加することにより、サンプルが電気泳動され、分離媒体中を移動する。サンプルに含まれる核酸は分子量により移動速度に差が生じ、分離媒体を抜けて採取部に溶出するまでの時間が、分子量により異なることとなる。このため、目的の核酸が採取部に溶出し終わると共に電気泳動を終了すると、目的の核酸以外の成分を減少できる。また、溶出時間に応じて採取部のバッファを入れ替えることにより目的核酸のみを採取することが出来る。そして、採取部のバッファ量により、目的核酸の濃縮を行うことが出来るものである。
このように、遠心もしくは吸引の必要がなく、容易に自動化を行うことができる。また、大容量のサンプルから一度に核酸を分離することができ、溶出時の目的核酸を含む溶液の容量を小さくすることによって、濃縮を行い、目的の核酸濃度の高いサンプルを得ることが出来る。そして、電気泳動の直後において、精製された核酸を扱いやすい状態で得ることができ、次の工程への接続を円滑に行うことが出来るものである。
さらに、他の手法に比べて、高い回収率および高い精度の目的物を得ることが可能である。そして、使用する試薬および機器において高価なものを必要とせず、ランニングコストおよび操作にかかるコストを低減することができる。すなわち、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、電気泳動により該核酸を分子量によって移動度の差を与える物質により構成される分離媒体に接触させた後に、目的核酸より小さい核酸が通り抜け、泳動方向に対して断面積が小さくなるフィルタにより回収する核酸の濃縮精製方法を用いることにより、前記試料中から核酸を分離するので、遠心もしくは吸引操作の必要がなく、簡易な装置により分離および濃縮を行うことが出来る。さらに、簡便な構成により分離を行うので、容易に自動化を行うことができる。また、大容量のサンプルを一度に精製することができ、溶出時の目的核酸を含む溶液の容量を小さくすることによって、濃縮を行い、濃度の高いサンプルを得ることが出来る。分離および濃縮操作にかかるランニングコストおよび操作にかかる時間を低減することができる。さらに、自己に存在しない外来遺伝子を同定する検査を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は界面活性剤存在下における電気泳動による核酸濃縮構成を示す模式図であり、図２は第一電気泳動の泳動槽構成を示す図であり、図３は第二電気泳動の泳動槽構成を示す図である。そして、図４は第一電気泳動槽の構成を示す図であり、図５は第二電気泳動槽の構成を示す図である。図６はサンプリングユニットの構成を示す斜視図であり、図７はサンプリングユニットの平面図であり、図８はサンプリングユニットの側面図であり、図９はサンプリングユニットの側面断面図である。
図１０は接続部の斜視図であり、図１１は接続部の側面断面図であり、図１２はろ過部の側面断面図であり、図１３は分離ユニットの組立て構成を示す図であり、図１４は回収された液のＵＶスペクトルである。
そして、図１５は核酸濃縮ユニットの構成を示す一部破断面斜視図であり、図１６は同じく平面図であり、図１７は同じく側面図である。図１８は目的核酸の濃縮過程を示す図であり、図１９は濃縮ユニットの開封工程を示す斜視図であり、図２０は濃縮ユニットの側面断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
次に、本発明の実施例について説明する。まず、電気泳動に用いる電気泳動槽の構成について説明する。図４は第一電気泳動槽の構成を示す図である。電気泳動槽２１は隔壁２４・２５により、負極側槽２２と正極側槽２３とに分けられている。隔壁２４・２５は電気泳動槽２１の中央部に配設されており、隔壁２４・２５にサンプルユニット２６が装着されている。サンプルユニット２６は一端を負極側槽２２に、他端を正極側槽２３に突出した構成となっている。サンプルユニット２６の負極側にはゲルが詰められており、側面にサンプル注入用の注入孔が開けられている。注入孔は電気泳動時には栓により閉じられるものである。そして、負極側槽２２に負極が挿入され、正極側槽２３に正極が挿入され、電気泳動槽２１に電圧がかけられるものである。
次に、電気泳動槽の他の構成例について説明する。図５は第二電気泳動槽の構成を示す図である。第二電気泳動において、電気泳動槽２１は隔壁２４・２５により、負極側槽２２と正極側槽２３とに分けられている。隔壁２４・２５は電気泳動槽２１の中央部に配設されており、隔壁２４・２５に分離ユニット３２が装着されている。分離ユニット３２は一端を負極側槽２２に、他端を正極側槽２３に突出した構成となっている。そして、負極側槽２２に負極が挿入され、正極側槽２３に正極が挿入され、電気泳動槽２１に電圧がかけられるものである。分離ユニット３２は、３つの部材を接続して構成するものであり、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４とにより構成される。サンプリングユニット２６と接続部３３との間、および接続部３３とろ過部３４との間にはＯリングが装着され接続を確保するとともに、緩衝液の流出を防止しているものである。なお、サンプリングユニット２６の負極側にはゲルが詰められており、接続部３３の正極側にもゲルが詰められている。そして、ろ過部３４には限界ろ過膜が装着されている。
このような電気泳動槽を用いて、核酸の濃縮を行うものである。まず、第一電気泳動において、溶解したサンプルを注入孔より入れ栓をする。そして、電気泳動槽２１にサンプルユニット２６を上面が少し液から出るように設置する。この後、１００Ｖの直流電圧をかけ、２０分間電気泳動を行うものである。これによりサンプル中の余分なイオンを取り除くものである。なお、緩衝液は１ｘＴＡＥ溶液、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ 氷酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡにより調製し、ｐＨ８．０とした。
そして、第一電気泳動槽２１において余分なイオンを取り除いた後に、サンプルユニット２６に接続部３３およびろ過部３４を接続するものである。各接続個所にはＯリングを装着し、液漏れを防ぐものである。接続部３３内には、１００％エタノールと１ｘＴＡＥを６：４で混合した液を入れ、サンプリングユニット２６内にはＴＥ−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を入れておくものである。
次に、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４の構成について説明する。まず、サンプリングユニット２６の構成について説明する。図６はサンプリングユニットの構成を示す斜視図であり、図７はサンプリングユニットの平面図であり、図８はサンプリングユニットの側面図であり、図９はサンプリングユニットの側面断面図である。サンプリングユニット２６は、容器にゲルを保持させて構成するものであり、ミリポア社製のマイクロコン（登録商標）ＹＭ−３マイクロコン 遠心式フィルタユニットを加工して利用するものであり、内部の限界ろ過膜をはずし、内部に直径５ｍｍの孔を開けたものである。なお、同様の効果を得られるものであれば、これに限らず用いることが出来るものである。
サンプリングユニット２６は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続しており、サンプルを注入するための注入孔４２が設けられている。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。筒体４１内にはゲル４８が配設されている。ゲル４８の厚みは数ｍｍ程度であり、筒体４１の開口部をふさぐ構成となっている。これにより、注入孔４２より供給された検体がゲル４８の内側に供給されるものである。
接続部３３の構成について説明する。図１０は接続部の斜視図であり、図１１は接続部の側面断面図である。接続部３３もサンプリングユニット２６と同様に、ミリポア社製の遠心式フィルタユニットを加工して利用するものであり、内部の限界ろ過膜をはずし、内部に直径５ｍｍの孔を開けたものである。接続部３３は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続している。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。筒体４１内には、厚み数ｍｍ程度ゲル４８を配設している。ゲル４８は、筒体４１内において、台座４３の上面に位置しており、サンプリングユニット２６との間の液体の流動を防止するものである。
ろ過部３４について説明する。図１２はろ過部の側面断面図である。ろ過部３４もミリポア社製の遠心式フィルタユニットを加工して利用するものである。ろ過部３４は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続しており、筒体４１の長さはサンプリングユニット２６や接続部３３よりも短く構成されており、約５ｍｍ短く構成されているものである。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。そして、筒体４１内において、台座４３の上面に限界ろ過膜４９が配設されている。これにより核酸の流出を防ぎ、核酸の濃縮を行うことが可能となる。
次に、核酸の濃縮操作例について説明する。検体として、大腸菌培養液を用いて、上記の第一電気泳動および第二電気泳動により核酸の濃縮を行い、回収された核酸濃度を吸光度測定により調べた。検体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α）培養液１００μＬを用いた。検体に、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００溶液１００μＬを加え、９６℃で１０分間加熱処理した。この後に０．２％ＤＰＣを１００μＬ加え、電気泳動用の試料を調製した。電気泳動用のバッファとしては０．５ｘＴＡＥを使用した。アガロースの溶解には１ｘＴＡＥを使用した。なお、１ｘＴＡＥ溶液は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ 氷酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡにより調製し、ペーハーはｐＨ８．０であった。
接続部３３を筒体４１の開口側を上方にして静置し、筒体４１の開口側より、１％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄ ａｇａｒｏｓｅ：ＴａＫａＲａから購入）をゲルの厚さが数ｍｍ程度になるように流し込み、ゲルを固めた。サンプリングユニット２６も接続部３３と同様に、筒体４１の開口側を上方にして静置し、筒体４１の開口側より、１％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄａｇａｒｏｓｅ：ＴａＫａＲａから購入）をゲルの厚さが数ｍｍ程度になるように流し込んだ。そして、ゲルが固まった後に、サンプリングユニット２６をひっくり返し、筒体４１の開口側に固まったゲルを流し込んだ。電気泳動槽はＨＵ−６（エアブラウン社製）を用い、電源はＭＰＳＵ−２００（エアブラウン社製）を用いた。
サンプリングユニット２６の注入孔４２より、調製した電気泳動用試料を入れて栓をした。電気泳動槽をパテにより正極側と負極側とに分離し正極側と負極側に０．５ｘＴＡＥを入れた。そして、パテにサンプリングユニット２６の上面が少しバッファ液から出るように設置した。この後に、直流電圧１００Ｖをかけ、２０分間第一の電気泳動を行った。
次に、第一の電気泳動を行った後のサンプリングユニット２６に接続部３３と、ろ過部３４とを接続して、分離ユニットを構成し、第二の電気泳動を行うものである。
第二電気泳動の操作例を説明する。１００％エタノールと１ｘＴＡＥとを６対４で混合した溶液を接続部３３内に入れた。ＴＥ−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）溶液をサンプリングユニット２６内に入れた。
次に、サンプリングユニット２６に接続部３３と、ろ過部３４とを接続して、分離ユニットを組み立てた。図１３は分離ユニットの組立て構成を示す図である。分離ユニットは、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４を同一方向に向けて組み立てるものであり、接続部３３とろ過部３４との間、および接続部３３とろ過部３４との間にＯリング５１をそれぞれ装着して、分離ユニットよりの液漏れを防ぐものである。
電気泳動槽をパテにより正極側と負極側とに分離し正極側と負極側に０．５ｘＴＡＥを入れた。組み立てた分離ユニットのサンプリングユニット２６側端を負極側に、ろ過部３４を正極側にしてパテに配置した。この後に、直流電圧２００Ｖをかけ、２４０分間、第二の電気泳動を行った。
次に、ろ過部３４において核酸溶液を回収して、吸光度の測定を行い、ＵＶスペクトルより回収された核酸濃度を算出した。図１４は回収された液のＵＶスペクトルである。算出された核酸濃度は、３２．３ｎｇ（６．７×１０６コピー／μＬ）であった。核酸濃度の算出は、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）に、核酸の性状固有の係数をかけ、さらに、セルの光路長（ｍｍ）をかけて、１０で割ったものである。
また、回収された核酸の純度を、ＵＶスペクトルより算出した。算出された核酸の純度は、１．９１であった。純度の算出は、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）で割ることにより、行うものである。サンプルが純度１００％のＤＮＡの場合、この値は約１．８となる。また、純度１００％のＲＮＡの場合には２．０となる。Ａ２８０の値は、被測定物に混入しているタンパク質やフェノールの量を反映し、吸光度比が１．５を大きく下回るような場合は、タンパク質などの低分子物質の混入が考えられるものである。
本発明の効果としては、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、核酸の濃縮精製を行う方法をとるので、電気泳動における核酸と夾雑物の挙動に相違をあたえ、核酸を効率的に分離できる。夾雑物と核酸との挙動における差異を荷電により調節可能であり、挙動の制御を容易に行える。遠心分離装置などを利用する必要がなく、核酸濃縮を行う機構をコンパクトに構成することができる。
また、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行う方法をとるので、陽イオン界面活性剤を用いるので、操作容易であり、作業の安全を容易に確保できる。そして、夾雑物への吸着量を増大させることにより、電気泳動における核酸と夾雑物との挙動差を大きくすることができ、核酸を効率的に分離できる。さらに、夾雑物が核酸とは反対方向に泳動されるので、夾雑物による精製の阻害を防止でき、核酸の精製を容易に行うことができる。
また、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うので、陽イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤との割合により陽イオン界面活性剤の吸着量を調節可能であり、電気泳動における夾雑物の挙動を容易に調節できるものである。核酸に非イオン界面活性剤を吸着させることにより、核酸への陽イオン界面活性剤の吸着を阻害することも可能である。
また、核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節するので、容易な操作により、夾雑物への陽イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤の吸着割合を操作することができる。さらに、夾雑物帯電量の調節を容易な操作により行うことができる。また、核酸に非イオン界面活性剤を吸着させることにより、核酸への陽イオン界面活性剤の吸着を阻害することも可能である。
また、試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、該試料を電気泳動し、陽極側において核酸の濃縮精製を行う装置を構成するので、簡便な構成により、試料中の核酸を精製することができるとともに、核酸の挙動を制御可能であるため、安全性を維持しながら、濃縮精製装置をコンパクトに構成できる。
また、電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、側面を絶縁体により構成した容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成し、該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、電極に接続している装置を構成するので、簡便な構成により、濃縮精製装置を構成可能であり、製作にかかるコストを低減するとともに、制御が容易かつ安全性の高い装置を構成することが可能である。
次に、本発明の第２の実施の形態について図を用いて説明する。
図１５は核酸濃縮ユニットの構成を示す一部破断面斜視図、図１６は同じく平面図、図１７は同じく側面図である。図１５から１７を用いて、核酸濃縮ユニットの構成について説明する。
濃縮ユニット１は、ｔ−ＤＮＡの検出装置において、目的核酸を分離、濃縮するものである。濃縮ユニット１０１は注入室１０２、分離体により構成される分離室１０８、採取室１０３により構成されている。そして、ノズル１０９により目的核酸を含むサンプルを注入室１０２に導入し、注入室１０２と採取室１０３に電圧を印加することにより、核酸を採取室１０３へと泳動する。分離室１０８を抜けた目的核酸は採取室１０３へと溶出し、採取室１０３において目的核酸を、ノズル１１０により採取することができるものである。注入室１０２に注入されるサンプルとして、血液、尿、喀痰等の生体試料や、飲食料品等を用いることが可能であり、この他にもゲノム、プラスミド等を注入することが可能である。
濃縮ユニット１０１の各部の構成について、詳しく説明する。注入室１０２は分離室１０８の一端に接続しており、採取室１０３は分離室１０８の他端に接続している。注入室には電極１０５が配設されており、採取室１０３には電極１０６および１０７が配設されている。そして、注入室１０２および採取室１０３には電気泳動用のバッファが満たされている。採取室１０３の電極１０６は、注入室１０２の電極に対向するように配設されており、採取室１０３の電極１０７は採取室１０３の底に設けられている。採取室１０３にはフィルター１０４が配設されており、採取室１０３を分離室１０８側と電極１０６側とに分けている。フィルター１０４は、目的核酸より小さいものを通過させ、目的核酸以上の大きさのものの通過を阻止するものである。フィルター１０４には、無数のポアが成形されており、目的核酸と相互作用を起こさず、目的核酸の通過を阻止するポア特性を有するフィルターを用いるものである。
フィルター１０４は、底面と一側面が開口した四角錐形状に構成されている。フィルター１０４は開口した底部を分離室１０８に向け、開口した一側面を上方に向けた構成としている。そして、開口した一側面が水平になるように構成されている。これにより、フィルター１０４の分離室１０８側の目的核酸をノズル１１０により採取することができるものである。また、目的核酸が電気泳動により電極１０６側に泳動されると、目的核酸がフィルター１０４の電極１０６側部分において濃縮される。
次に、濃縮ユニットによる目的核酸の濃縮過程について、図１８を用いて説明する。図１８は目的核酸の濃縮過程を示す図である。まず、注入室１０２にサンプルが導入されると、図１８（ａ）に示す状態となる。ここにおいて、説明を容易にするため、サンプルには目的核酸１１２と目的核酸１１２より大きい（バルキーもしくは分子量の大きい）核酸１１１と、目的核酸より小さい核酸１１２とが含まれるとする。
図１８（ａ）に示す状態において、大きい核酸１１１、目的核酸１１２、小さい核酸１１３は混ざった状態となっている。そして、電極１０５と電極１０６とに電圧を印加すると、大きい核酸１１１、目的核酸１１２、小さい核酸１１３が分離室１０８に導入され、図１８（ｂ）に示すごとく、分離室１０８内において移動速度の差が生じる。図１８に示す構成では、分離室１０８を満たす分離体としてはアガロースゲル等を用いるものであり、小さい核酸１１３が先行して移動する。
先行した小さい核酸１１３は、分離室１０８を抜けて採取室１０３に到達する。そして、小さい核酸１１３は、フィルター１０４を通過して、採取室１０３の電極１０６側に移動する。この後に、目的核酸１１２が分離室１０８を抜けて、採取室１０３に到達する。そして、図１８（ｃ）に示すごとく、フィルター１０４により、電極１０６への移動を阻止される。フィルター１０４は開口した底部を分離室１０８に向け、開口した一側面を上方に向けた構成としているので、泳動により、目的核酸１１２がフィルター１０４の電極１０６側部分に濃縮される。
この状態において、電極１０５・１０６間の印加を停止し、図１８（ｄ）に示すごとく、電極１０７・１０６間に電圧を印加する。この結果、目的核酸より小さい夾雑物は電極１０６にトラップされたままとなる。電極間の電圧印加を止めると核酸はフィルターから遊離する。目的核酸１１２をフィルターから遊離するとともに、電極１０６側の小さい夾雑物又は小さい核酸１１３の拡散も抑制し、精製度の高い状態で目的核酸１１２を濃縮することができるものである。
そして、分離室１０８を目的核酸１１２が通過する時間を算出し、注入室２へのサンプル注入から、電極１０５・１０６から電極１０７・１０６に電圧を印加するタイミングを設定することにより、自動的に目的核酸１１２の分離、濃縮を行うことができるものである。
分離室１０８は、電気泳動に用いられる各種ゲルを用いることが出来るものであり、例えば、アガロース等を用いることが出来る。また、カラム充填剤に用いられる分離媒体を利用することも可能である。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）（ファルマシア社製）等のゲルろ過用の担体等を利用することも可能である。また、電気泳動用ゲルおよりカラム充填剤を分離部８において、組み合わせて、目的核酸が最も先に流出するように調節することも可能である。
次に、濃縮ユニットの別構成について、図１９および図２０を用いて説明する。図１９は濃縮ユニットの開封工程を示す斜視図、図２０は濃縮ユニットの側面断面図である。濃縮ユニットは、検査装置等に挿入され、目的核酸の分離および濃縮を行うものである。
濃縮ユニット１１６の上面には、フィルム１１７ａ・１１７ｂが貼着されており、側面には電極１０５・１０６が露出している。そして、底面には電極７が露出している。電極１０５は注入室に、電極１０６・１０７は採取室につながっている。濃縮ユニット１１６のユニットケース１１８内には、分離体で満たされた分離室１０８の一端に注入室と他端に採取室が設けられ、注入室と採取室には電気泳動用のバッファが満たされている。そして、採取室はフィルターにより分離されている。
この状態において、濃縮ユニット１１６は密封されているとともに、外部よりの電圧印加が可能となっている。このため、濃縮ユニットの取り扱いが容易となる。そして、濃縮ユニット１１６にサンプルを注入し、目的核酸を採取する場合には、図１９に示すごとく、注入室および採取室のフィルム１１７ａ・１１７ｂを破り、サンプルを注入し、目的核酸を採取するものである。上部にフィルム１１７ａ・１１７ｂを貼着するので、フィルム１１７を破る際に、分離室１０８に大きな衝撃を与えることなく、安定した濃縮分離を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
以上のように、本発明にかかる核酸の濃縮精製方法および装置は、操作が簡便であるとともに、装置構成が簡易であるので、自動で核酸の濃縮および検査をおこなう検査装置などの用途にも適用できる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【技術分野】
本発明は、核酸の分離方法に関する。より詳しくは、電気泳動の手法により、目的とする核酸を取出すための核酸分離方法に関する。
【背景技術】
近年、ヒトゲノムの解読が進み、さまざまな生命現象と遺伝子の関連が解明されてきている。そして、この成果により、医学・医療は病態から病因へ、治療から予防へと視野を広げている。ここにおいて、遺伝子検査技術は重要な基盤となっている。
遺伝子検査は、培養困難な病原微生物の同定検査、抗生物質加療中や感染初期の病原微生物の検出、移行抗体が疑われた際の抗原検出、病原微生物の感染源調査、親子鑑定などの個人識別、さらに白血病・固形腫瘍の遺伝子レベルの病型診断や遺伝病の確定診断など従来の臨床検査では困難であった検査を行うことができる。そして、結果を得るまでの時間が、菌の培養を用いる手法に比べて短く、培養に時間のかかる細菌の検出には威力を発揮する。さらにＤＮＡは保存条件によっては安定しているため、凍結生検材料、骨など過去の検体からも検査を行うことができる。
また、近年増加傾向にある性感染症の検査において、検査機会の拡大を図るべく、遺伝子検査が注目されている。
従来核酸の精製濃縮方法としては、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた精製方法、核酸を吸着するカラム／フィルターを用いた精製方法、磁性シリカビーズを用いた精製方法等が知られている。
さらに、平板状の電気泳動ゲルから核酸を回収する方法として、作成したゲルにおいて核酸を電気泳動し、ゲルにおいて目的とする核酸の位置に回収装置を移動し、更なる電気泳動により目的とする核酸を回収する方法が知られている（例えば、実開平５−８８２９６号公報を参照）。
この他に、平板状の電気泳動ゲルにおいて、核酸を電気泳動して目的とする核酸を分離し、目的とする核酸のバンド近傍に回収チップを挿入して核酸を回収する方法が知られている（例えば、特開平８−３２７５９５号公報を参照）。
従来核酸の精製分離方法において、フェノール／クロロホルム／エタノールを用いた精製方法は、劇薬を使用するため、高度の化学設備を必要とするものであり、利用する環境が限定される。そして、操作に手間がかかるとともに、高速遠心が必要となり、自動化が困難である。また、高い精製精度を得ることが困難である。
核酸を吸着するカラム／フィルターを用いた精製方法は、溶液を流しながら行うため、ごみ等の混入量の多いサンプルでは、カラム／フィルターが目詰まりを起こしやすく、精製効率が低くなる可能性がある。そして、遠心もしくは吸引操作を行う必要があるので、自動化が困難である。
さらに、磁性シリカビーズを用いた精製方法は、磁石によるビーズの回収を失敗した場合や、シリカビーズが磁性体より剥落した場合には、サンプルにシリカが混入する可能性ある。そして、高い回収率を得ることが困難である。
平板状の電気泳動ゲルから核酸を回収する従来の技術においては、平板状の電気泳動ゲルを必要とするとともに、この平板状の電気泳動ゲルにおいて一端電気泳動を行い、目的核酸の該当位置のゲルを処理する必要がある。
電気泳動に用いられるゲルは、衝撃に弱く、生成過程により、特性が大きくことなる場合がある。このため、一般に電気泳動を行った後に、紫外線により電気泳動ゲルにおける目的核酸の位置を認識した後に、目的核酸の含有量の多い部分を処理するものである。
遺伝子検査等にこの手法を利用する場合には、一回の検査にかかる時間が長くなる。また、電気泳動に用いるゲルが大きくゲルのムラによる核酸のバンドのにじみにより核酸の回収率が低下する可能性がある。さらに、ゲルが大きい場合には、電気泳動に必要となる電力が大きくなる。
【発明の開示】
上記の課題を解決すべく、様々の試験が行われ、検体中に存在する夾雑物に界面活性剤を吸着させ、核酸と異なる挙動を示させることにより、夾雑物と核酸とを分離させることが見出されたものである。
そして、陽イオン界面界面活性剤と非イオン界面活性剤で核酸以外の夾雑物を帯電させ、電界中におくことで、夾雑物を含む検体より核酸を分離精製し、核酸の濃縮もしくは濃縮しやすい状態とするものである。
図１は界面活性剤存在下における電気泳動による核酸濃縮構成を示す模式図である。検体中には、核酸１とともに夾雑物２が含まれるものである。この検体中に、界面活性剤を混合する。界面活性剤としては非イオン界面活性剤３と陽イオン界面活性剤４とを用いるものである。検体中に混合された界面活性剤は夾雑物２に吸着する。陽イオン界面活性剤４が吸着した夾雑物２は、正電荷に帯電することとなる。そして、界面活性剤の吸着した夾雑物２と、界面活性剤の吸着していない、もしくは吸着量の少ない核酸１とを電気泳動により分離することができるものである。これにより、検体から夾雑物２を容易に取り除くことができ、核酸１を濃縮できるものである。
次に、核酸濃縮の手法について説明する。この核酸濃縮の手法において、電気泳動を２回行うことにより、核酸の濃縮を確実に行うものである。第一に電気泳動においては検体中の余分なイオンを除き、第二の電気泳動においては検体中の核酸の濃縮を行うものである。まず、核酸を含む検体に非イオン界面活性剤として、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加えて混合する。非イオン界面活性剤を加えた検体を、９６℃で１０分間加熱する。そして、検体に陽イオン界面活性剤として、０．２％ＤＣＰを１００μＬ加える。なお、検体には、非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を同時に加えた後に、加熱処理を行うことも可能である。検体に界面活性剤を加えて前処理を行うため、核酸が大腸菌などの原核細胞内に存在する場合においても、細胞壁が界面活性剤により破壊されることから、大腸菌の培養液などを検体として用いることができ、検体前処理の操作を容易に行うことができるものである。このように検体の前処理を行い、１００Ｖの直流電圧を加え１０分間電気泳動を行い、検体中の余分なイオンを除去する。この後に、１２５〜１５０Ｖの直流電圧を加え、１２０分間電気泳動を行い、正極側において核酸を採取するものである。
検体の電気泳動を行う電気泳動槽の構成について説明する。まず、第一の電気泳動について説明する。図２は第一電気泳動の泳動槽構成を示す図である。電気泳動槽５内にはサンプル槽６、正極側と負極側とを分ける隔壁９が設けられている。サンプル槽６は隔壁９に貫通しており、一端が正極側に、他端が負極側に突出した構成となっている。サンプル槽６の両端は開口しており、両端の開口部はそれぞれゲル８・８により閉じられている。これにより、サンプル槽６内に電位差を発生させて核酸および界面活性剤が吸着した夾雑物の電気泳動を行うものである。検体に非イオン界面活性剤と陽イオン界面活性剤を加え、加熱処理を行った後に、検体をサンプル槽６に注入する。そして、電極間に１００Ｖの電圧を加えて、１０分間の電気泳動を行うものである。これにより、検体中に含まれる余分なイオンを除くものである。検体中に含まれる余分なイオンを除いた後に、第二に電気泳動により核酸の濃縮を行うものである。
第二電気泳動について説明する。第二の電気泳動においては、第一の電気泳動で検体を注入したサンプル槽に、核酸の回収槽を接続していたものを電気泳動槽内に配置して電気泳動を行うものである。図３は第二電気泳動の泳動槽構成を示す図である。電気泳動槽５内にはサンプル槽６、回収槽７、正極側と負極側とを分ける隔壁９が設けられている。サンプル槽６は隔壁９に挿入され、負極側に突出した構成となっている。回収槽７は隔壁９に挿入され、正極側に突出した構成となっている。サンプル槽６と回収槽７とは隔壁９配設部において接続されており、ゲル８を介して接続されている。サンプル槽６の両端は開口しており、両端の開口部はそれぞれゲル８・８により閉ざされている。そして、回収槽７の両端は開口しており、負極側はゲル８により閉じられており、正極側は限外ろ過膜１１により閉じられている。このように構成された電気泳動槽において、電極間に１２０Ｖの電圧を加え、１２０分間の電気泳動を行うものである。
このように、電気泳動槽において第二の電気泳動を行うことにより、検体中の核酸以外の余分なイオンを除いた検体を電気泳動することができ、回収槽７において核酸を効率的に回収できるものである。また、回収槽７の正極側には限外ろ過膜１１を設けており、核酸は回収槽７より排出されることなく、回収槽７内にとどまる。このため、核酸の回収効率を向上することができるものである。なお、検体の状態によっては、第一の電気泳動を行うことなく、第二の電気泳動を行うことも可能である。回収槽７に接続したサンプル槽６に前処理を行った検体を注入して電気泳動することにより、容易に核酸の濃縮を行うことができるものである。検体中に存在する余分なイオンは限外ろ過膜を透過できるので、核酸の回収に影響をあたえない。
すなわち、本発明は、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に試料を電界中におき核酸の濃縮精製を行うものである。そして、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うものである。また、核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うものである。また、核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節するものである。
そして、試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加して該試料を電気泳動して陽極側において核酸の濃縮精製を行う装置を構成するものであり、側面を絶縁体により構成した容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成して該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して電極に接続している装置を構成するものである。
さらに、上記ほかに、次のような手段を用いることもできる。核酸を含むサンプルを、分子量によって移動度の差を与える物質により構成される分離媒体に接触させ、電圧を印加することにより核酸を他の物質と分離するものである。そして、分離媒体より抜け出た核酸を、フィルターにより回収するものである。このフィルターは、目的核酸より小さい核酸等が素通りする程度のポアサイズを有するものである。
例えば、電気泳動に用いられる分離媒体の一端にバッファで満たされたサンプル供給部を設け、他端に同様にバッファで満たされた採取部を設け、サンプル供給部と採取部とに電圧を印加することにより、サンプルが電気泳動され、分離媒体中を移動する。サンプルに含まれる核酸は分子量により移動速度に差が生じ、分離媒体を抜けて採取部に溶出するまでの時間が、分子量により異なることとなる。このため、目的の核酸が採取部に溶出し終わると共に電気泳動を終了すると、目的の核酸以外の成分を減少できる。また、溶出時間に応じて採取部のバッファを入れ替えることにより目的核酸のみを採取することが出来る。そして、採取部のバッファ量により、目的核酸の濃縮を行うことが出来るものである。
このように、遠心もしくは吸引の必要がなく、容易に自動化を行うことができる。また、大容量のサンプルから一度に核酸を分離することができ、溶出時の目的核酸を含む溶液の容量を小さくすることによって、濃縮を行い、目的の核酸濃度の高いサンプルを得ることが出来る。そして、電気泳動の直後において、精製された核酸を扱いやすい状態で得ることができ、次の工程への接続を円滑に行うことが出来るものである。
さらに、他の手法に比べて、高い回収率および高い精度の目的物を得ることが可能である。そして、使用する試薬および機器において高価なものを必要とせず、ランニングコストおよび操作にかかるコストを低減することができる。すなわち、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、電気泳動により該核酸を分子量によって移動度の差を与える物質により構成される分離媒体に接触させた後に、目的核酸より小さい核酸が通り抜け、泳動方向に対して断面積が小さくなるフィルタにより回収する核酸の濃縮精製方法を用いることにより、前記試料中から核酸を分離するので、遠心もしくは吸引操作の必要がなく、簡易な装置により分離および濃縮を行うことが出来る。さらに、簡便な構成により分離を行うので、容易に自動化を行うことができる。また、大容量のサンプルを一度に精製することができ、溶出時の目的核酸を含む溶液の容量を小さくすることによって、濃縮を行い、濃度の高いサンプルを得ることが出来る。分離および濃縮操作にかかるランニングコストおよび操作にかかる時間を低減することができる。さらに、自己に存在しない外来遺伝子を同定する検査を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
図１は界面活性剤存在下における電気泳動による核酸濃縮構成を示す模式図であり、図２は第一電気泳動の泳動槽構成を示す図であり、図３は第二電気泳動の泳動槽構成を示す図である。そして、図４は第一電気泳動槽の構成を示す図であり、図５は第二電気泳動槽の構成を示す図である。図６はサンプリングユニットの構成を示す斜視図であり、図７はサンプリングユニットの平面図であり、図８はサンプリングユニットの側面図であり、図９はサンプリングユニットの側面断面図である。
図１０は接続部の斜視図であり、図１１は接続部の側面断面図であり、図１２はろ過部の側面断面図であり、図１３は分離ユニットの組立て構成を示す図であり、図１４は回収された液のＵＶスペクトルである。
そして、図１５は核酸濃縮ユニットの構成を示す一部破断面斜視図であり、図１６は同じく平面図であり、図１７は同じく側面図である。図１８は目的核酸の濃縮過程を示す図であり、図１９は濃縮ユニットの開封工程を示す斜視図であり、図２０は濃縮ユニットの側面断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
次に、本発明の実施例について説明する。まず、電気泳動に用いる電気泳動槽の構成について説明する。図４は第一電気泳動槽の構成を示す図である。電気泳動槽２１は隔壁２４・２５により、負極側槽２２と正極側槽２３とに分けられている。隔壁２４・２５は電気泳動槽２１の中央部に配設されており、隔壁２４・２５にサンプルユニット２６が装着されている。サンプルユニット２６は一端を負極側槽２２に、他端を正極側槽２３に突出した構成となっている。サンプルユニット２６の負極側にはゲルが詰められており、側面にサンプル注入用の注入孔が開けられている。注入孔は電気泳動時には栓により閉じられるものである。そして、負極側槽２２に負極が挿入され、正極側槽２３に正極が挿入され、電気泳動槽２１に電圧がかけられるものである。
次に、電気泳動槽の他の構成例について説明する。図５は第二電気泳動槽の構成を示す図である。第二電気泳動において、電気泳動槽２１は隔壁２４・２５により、負極側槽２２と正極側槽２３とに分けられている。隔壁２４・２５は電気泳動槽２１の中央部に配設されており、隔壁２４・２５に分離ユニット３２が装着されている。分離ユニット３２は一端を負極側槽２２に、他端を正極側槽２３に突出した構成となっている。そして、負極側槽２２に負極が挿入され、正極側槽２３に正極が挿入され、電気泳動槽２１に電圧がかけられるものである。分離ユニット３２は、３つの部材を接続して構成するものであり、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４とにより構成される。サンプリングユニット２６と接続部３３との間、および接続部３３とろ過部３４との間にはＯリングが装着され接続を確保するとともに、緩衝液の流出を防止しているものである。なお、サンプリングユニット２６の負極側にはゲルが詰められており、接続部３３の正極側にもゲルが詰められている。そして、ろ過部３４には限界ろ過膜が装着されている。
このような電気泳動槽を用いて、核酸の濃縮を行うものである。まず、第一電気泳動において、溶解したサンプルを注入孔より入れ栓をする。そして、電気泳動槽２１にサンプルユニット２６を上面が少し液から出るように設置する。この後、１００Ｖの直流電圧をかけ、２０分間電気泳動を行うものである。これによりサンプル中の余分なイオンを取り除くものである。なお、緩衝液は１ｘＴＡＥ溶液、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ 氷酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡにより調製し、ｐＨ８．０とした。
そして、第一電気泳動槽２１において余分なイオンを取り除いた後に、サンプルユニット２６に接続部３３およびろ過部３４を接続するものである。各接続個所にはＯリングを装着し、液漏れを防ぐものである。接続部３３内には、１００％エタノールと１ｘＴＡＥを６：４で混合した液を入れ、サンプリングユニット２６内にはＴＥ−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を入れておくものである。
次に、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４の構成について説明する。まず、サンプリングユニット２６の構成について説明する。図６はサンプリングユニットの構成を示す斜視図であり、図７はサンプリングユニットの平面図であり、図８はサンプリングユニットの側面図であり、図９はサンプリングユニットの側面断面図である。サンプリングユニット２６は、容器にゲルを保持させて構成するものであり、ミリポア社製のマイクロコン（登録商標）ＹＭ−３マイクロコン 遠心式フィルタユニットを加工して利用するものであり、内部の限界ろ過膜をはずし、内部に直径５ｍｍの孔を開けたものである。なお、同様の効果を得られるものであれば、これに限らず用いることが出来るものである。
サンプリングユニット２６は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続しており、サンプルを注入するための注入孔４２が設けられている。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。筒体４１内にはゲル４８が配設されている。ゲル４８の厚みは数ｍｍ程度であり、筒体４１の開口部をふさぐ構成となっている。これにより、注入孔４２より供給された検体がゲル４８の内側に供給されるものである。
接続部３３の構成について説明する。図１０は接続部の斜視図であり、図１１は接続部の側面断面図である。接続部３３もサンプリングユニット２６と同様に、ミリポア社製の遠心式フィルタユニットを加工して利用するものであり、内部の限界ろ過膜をはずし、内部に直径５ｍｍの孔を開けたものである。接続部３３は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続している。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。筒体４１内には、厚み数ｍｍ程度ゲル４８を配設している。ゲル４８は、筒体４１内において、台座４３の上面に位置しており、サンプリングユニット２６との間の液体の流動を防止するものである。
ろ過部３４について説明する。図１２はろ過部の側面断面図である。ろ過部３４もミリポア社製の遠心式フィルタユニットを加工して利用するものである。ろ過部３４は筒体４１と台座４３とにより構成されている。筒体４１は台座４３に接続しており、筒体４１の長さはサンプリングユニット２６や接続部３３よりも短く構成されており、約５ｍｍ短く構成されているものである。台座４３は段付き円柱状に構成されており、台座４３には上下面に連通する孔４４が構成されている。そして、筒体４１内において、台座４３の上面に限界ろ過膜４９が配設されている。これにより核酸の流出を防ぎ、核酸の濃縮を行うことが可能となる。
次に、核酸の濃縮操作例について説明する。検体として、大腸菌培養液を用いて、上記の第一電気泳動および第二電気泳動により核酸の濃縮を行い、回収された核酸濃度を吸光度測定により調べた。検体は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α）培養液１００μＬを用いた。検体に、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００溶液１００μＬを加え、９６℃で１０分間加熱処理した。この後に０．２％ＤＰＣを１００μＬ加え、電気泳動用の試料を調製した。電気泳動用のバッファとしては０．５ｘＴＡＥを使用した。アガロースの溶解には１ｘＴＡＥを使用した。なお、１ｘＴＡＥ溶液は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ 氷酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡにより調製し、ペーハーはｐＨ８．０であった。
接続部３３を筒体４１の開口側を上方にして静置し、筒体４１の開口側より、１％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄ ａｇａｒｏｓｅ：ＴａＫａＲａから購入）をゲルの厚さが数ｍｍ程度になるように流し込み、ゲルを固めた。サンプリングユニット２６も接続部３３と同様に、筒体４１の開口側を上方にして静置し、筒体４１の開口側より、１％アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ Ｇｏｌｄａｇａｒｏｓｅ：ＴａＫａＲａから購入）をゲルの厚さが数ｍｍ程度になるように流し込んだ。そして、ゲルが固まった後に、サンプリングユニット２６をひっくり返し、筒体４１の開口側に固まったゲルを流し込んだ。電気泳動槽はＨＵ−６（エアブラウン社製）を用い、電源はＭＰＳＵ−２００（エアブラウン社製）を用いた。
サンプリングユニット２６の注入孔４２より、調製した電気泳動用試料を入れて栓をした。電気泳動槽をパテにより正極側と負極側とに分離し正極側と負極側に０．５ｘＴＡＥを入れた。そして、パテにサンプリングユニット２６の上面が少しバッファ液から出るように設置した。この後に、直流電圧１００Ｖをかけ、２０分間第一の電気泳動を行った。
次に、第一の電気泳動を行った後のサンプリングユニット２６に接続部３３と、ろ過部３４とを接続して、分離ユニットを構成し、第二の電気泳動を行うものである。
第二電気泳動の操作例を説明する。１００％エタノールと１ｘＴＡＥとを６対４で混合した溶液を接続部３３内に入れた。ＴＥ−１（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）溶液をサンプリングユニット２６内に入れた。
次に、サンプリングユニット２６に接続部３３と、ろ過部３４とを接続して、分離ユニットを組み立てた。図１３は分離ユニットの組立て構成を示す図である。分離ユニットは、サンプリングユニット２６、接続部３３、ろ過部３４を同一方向に向けて組み立てるものであり、接続部３３とろ過部３４との間、および接続部３３とろ過部３４との間にＯリング５１をそれぞれ装着して、分離ユニットよりの液漏れを防ぐものである。
電気泳動槽をパテにより正極側と負極側とに分離し正極側と負極側に０．５ｘＴＡＥを入れた。組み立てた分離ユニットのサンプリングユニット２６側端を負極側に、ろ過部３４を正極側にしてパテに配置した。この後に、直流電圧２００Ｖをかけ、２４０分間、第二の電気泳動を行った。
次に、ろ過部３４において核酸溶液を回収して、吸光度の測定を行い、ＵＶスペクトルより回収された核酸濃度を算出した。図１４は回収された液のＵＶスペクトルである。算出された核酸濃度は、３２．３ｎｇ（６．７×１０６コピー／μＬ）であった。核酸濃度の算出は、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）に、核酸の性状固有の係数をかけ、さらに、セルの光路長（ｍｍ）をかけて、１０で割ったものである。
また、回収された核酸の純度を、ＵＶスペクトルより算出した。算出された核酸の純度は、１．９１であった。純度の算出は、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）で割ることにより、行うものである。サンプルが純度１００％のＤＮＡの場合、この値は約１．８となる。また、純度１００％のＲＮＡの場合には２．０となる。Ａ２８０の値は、被測定物に混入しているタンパク質やフェノールの量を反映し、吸光度比が１．５を大きく下回るような場合は、タンパク質などの低分子物質の混入が考えられるものである。
本発明の効果としては、電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、核酸の濃縮精製を行う方法をとるので、電気泳動における核酸と夾雑物の挙動に相違をあたえ、核酸を効率的に分離できる。夾雑物と核酸との挙動における差異を荷電により調節可能であり、挙動の制御を容易に行える。遠心分離装置などを利用する必要がなく、核酸濃縮を行う機構をコンパクトに構成することができる。
また、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行う方法をとるので、陽イオン界面活性剤を用いるので、操作容易であり、作業の安全を容易に確保できる。そして、夾雑物への吸着量を増大させることにより、電気泳動における核酸と夾雑物との挙動差を大きくすることができ、核酸を効率的に分離できる。さらに、夾雑物が核酸とは反対方向に泳動されるので、夾雑物による精製の阻害を防止でき、核酸の精製を容易に行うことができる。
また、電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うので、陽イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤との割合により陽イオン界面活性剤の吸着量を調節可能であり、電気泳動における夾雑物の挙動を容易に調節できるものである。核酸に非イオン界面活性剤を吸着させることにより、核酸への陽イオン界面活性剤の吸着を阻害することも可能である。
また、核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節するので、容易な操作により、夾雑物への陽イオン界面活性剤と非イオン界面活性剤の吸着割合を操作することができる。さらに、夾雑物帯電量の調節を容易な操作により行うことができる。また、核酸に非イオン界面活性剤を吸着させることにより、核酸への陽イオン界面活性剤の吸着を阻害することも可能である。
また、試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、該試料を電気泳動し、陽極側において核酸の濃縮精製を行う装置を構成するので、簡便な構成により、試料中の核酸を精製することができるとともに、核酸の挙動を制御可能であるため、安全性を維持しながら、濃縮精製装置をコンパクトに構成できる。
また、電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、側面を絶縁体により構成した容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成し、該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、電極に接続している装置を構成するので、簡便な構成により、濃縮精製装置を構成可能であり、製作にかかるコストを低減するとともに、制御が容易かつ安全性の高い装置を構成することが可能である。
次に、本発明の第２の実施の形態について図を用いて説明する。
図１５は核酸濃縮ユニットの構成を示す一部破断面斜視図、図１６は同じく平面図、図１７は同じく側面図である。図１５から１７を用いて、核酸濃縮ユニットの構成について説明する。
濃縮ユニット１は、ｔ−ＤＮＡの検出装置において、目的核酸を分離、濃縮するものである。濃縮ユニット１０１は注入室１０２、分離体により構成される分離室１０８、採取室１０３により構成されている。そして、ノズル１０９により目的核酸を含むサンプルを注入室１０２に導入し、注入室１０２と採取室１０３に電圧を印加することにより、核酸を採取室１０３へと泳動する。分離室１０８を抜けた目的核酸は採取室１０３へと溶出し、採取室１０３において目的核酸を、ノズル１１０により採取することができるものである。注入室１０２に注入されるサンプルとして、血液、尿、喀痰等の生体試料や、飲食料品等を用いることが可能であり、この他にもゲノム、プラスミド等を注入することが可能である。
濃縮ユニット１０１の各部の構成について、詳しく説明する。注入室１０２は分離室１０８の一端に接続しており、採取室１０３は分離室１０８の他端に接続している。注入室には電極１０５が配設されており、採取室１０３には電極１０６および１０７が配設されている。そして、注入室１０２および採取室１０３には電気泳動用のバッファが満たされている。採取室１０３の電極１０６は、注入室１０２の電極に対向するように配設されており、採取室１０３の電極１０７は採取室１０３の底に設けられている。採取室１０３にはフィルター１０４が配設されており、採取室１０３を分離室１０８側と電極１０６側とに分けている。フィルター１０４は、目的核酸より小さいものを通過させ、目的核酸以上の大きさのものの通過を阻止するものである。フィルター１０４には、無数のポアが成形されており、目的核酸と相互作用を起こさず、目的核酸の通過を阻止するポア特性を有するフィルターを用いるものである。
フィルター１０４は、底面と一側面が開口した四角錐形状に構成されている。フィルター１０４は開口した底部を分離室１０８に向け、開口した一側面を上方に向けた構成としている。そして、開口した一側面が水平になるように構成されている。これにより、フィルター１０４の分離室１０８側の目的核酸をノズル１１０により採取することができるものである。また、目的核酸が電気泳動により電極１０６側に泳動されると、目的核酸がフィルター１０４の電極１０６側部分において濃縮される。
次に、濃縮ユニットによる目的核酸の濃縮過程について、図１８を用いて説明する。図１８は目的核酸の濃縮過程を示す図である。まず、注入室１０２にサンプルが導入されると、図１８（ａ）に示す状態となる。ここにおいて、説明を容易にするため、サンプルには目的核酸１１２と目的核酸１１２より大きい（バルキーもしくは分子量の大きい）核酸１１１と、目的核酸より小さい核酸１１２とが含まれるとする。
図１８（ａ）に示す状態において、大きい核酸１１１、目的核酸１１２、小さい核酸１１３は混ざった状態となっている。そして、電極１０５と電極１０６とに電圧を印加すると、大きい核酸１１１、目的核酸１１２、小さい核酸１１３が分離室１０８に導入され、図１８（ｂ）に示すごとく、分離室１０８内において移動速度の差が生じる。図１８に示す構成では、分離室１０８を満たす分離体としてはアガロースゲル等を用いるものであり、小さい核酸１１３が先行して移動する。
先行した小さい核酸１１３は、分離室１０８を抜けて採取室１０３に到達する。そして、小さい核酸１１３は、フィルター１０４を通過して、採取室１０３の電極１０６側に移動する。この後に、目的核酸１１２が分離室１０８を抜けて、採取室１０３に到達する。そして、図１８（ｃ）に示すごとく、フィルター１０４により、電極１０６への移動を阻止される。フィルター１０４は開口した底部を分離室１０８に向け、開口した一側面を上方に向けた構成としているので、泳動により、目的核酸１１２がフィルター１０４の電極１０６側部分に濃縮される。
この状態において、電極１０５・１０６間の印加を停止し、図１８（ｄ）に示すごとく、電極１０７・１０６間に電圧を印加する。この結果、目的核酸より小さい夾雑物は電極１０６にトラップされたままとなる。電極間の電圧印加を止めると核酸はフィルターから遊離する。目的核酸１１２をフィルターから遊離するとともに、電極１０６側の小さい夾雑物又は小さい核酸１１３の拡散も抑制し、精製度の高い状態で目的核酸１１２を濃縮することができるものである。
そして、分離室１０８を目的核酸１１２が通過する時間を算出し、注入室２へのサンプル注入から、電極１０５・１０６から電極１０７・１０６に電圧を印加するタイミングを設定することにより、自動的に目的核酸１１２の分離、濃縮を行うことができるものである。
分離室１０８は、電気泳動に用いられる各種ゲルを用いることが出来るものであり、例えば、アガロース等を用いることが出来る。また、カラム充填剤に用いられる分離媒体を利用することも可能である。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）（ファルマシア社製）等のゲルろ過用の担体等を利用することも可能である。また、電気泳動用ゲルおよりカラム充填剤を分離部８において、組み合わせて、目的核酸が最も先に流出するように調節することも可能である。
次に、濃縮ユニットの別構成について、図１９および図２０を用いて説明する。図１９は濃縮ユニットの開封工程を示す斜視図、図２０は濃縮ユニットの側面断面図である。濃縮ユニットは、検査装置等に挿入され、目的核酸の分離および濃縮を行うものである。
濃縮ユニット１１６の上面には、フィルム１１７ａ・１１７ｂが貼着されており、側面には電極１０５・１０６が露出している。そして、底面には電極７が露出している。電極１０５は注入室に、電極１０６・１０７は採取室につながっている。濃縮ユニット１１６のユニットケース１１８内には、分離体で満たされた分離室１０８の一端に注入室と他端に採取室が設けられ、注入室と採取室には電気泳動用のバッファが満たされている。そして、採取室はフィルターにより分離されている。
この状態において、濃縮ユニット１１６は密封されているとともに、外部よりの電圧印加が可能となっている。このため、濃縮ユニットの取り扱いが容易となる。そして、濃縮ユニット１１６にサンプルを注入し、目的核酸を採取する場合には、図１９に示すごとく、注入室および採取室のフィルム１１７ａ・１１７ｂを破り、サンプルを注入し、目的核酸を採取するものである。上部にフィルム１１７ａ・１１７ｂを貼着するので、フィルム１１７を破る際に、分離室１０８に大きな衝撃を与えることなく、安定した濃縮分離を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
以上のように、本発明にかかる核酸の濃縮精製方法および装置は、操作が簡便であるとともに、装置構成が簡易であるので、自動で核酸の濃縮および検査をおこなう検査装置などの用途にも適用できる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
【請求項２】
電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
【請求項３】
電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
【請求項４】
核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節することを特徴とする請求項３に記載の核酸の濃縮精製方法。
【請求項５】
試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、該試料を電気泳動し、陽極側において核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製装置。
【請求項６】
電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、側面を絶縁体により構成した容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成し、該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、電極に接続していることを特徴とする核酸の濃縮精製装置。
【請求項７】
電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、電気泳動により該核酸を分子量によって移動度の差を与える物質により構成される分離媒体に接触させた後に、目的核酸より小さい核酸が通り抜け、泳動方向に対して断面積が小さくなるフィルタにより回収することを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
【請求項１】
電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、荷電量の調節を行った後に、試料を電界中におき、核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
【請求項２】
電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料に陽イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
【請求項３】
電気泳動による核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中に陽イオン界面活性剤および非イオン界面活性剤を加えて、試料中夾雑物への荷電量を調節し、該試料を電界中におき、電気泳動することにより、核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
【請求項４】
核酸以外への荷電量調節を、陽イオン界面活性剤の吸着により行うとともに、陽イオン界面活性剤の吸着量を非イオン界面活性剤の添加量により調節することを特徴とする請求項３に記載の核酸の濃縮精製方法。
【請求項５】
試料に非イオン界面活性剤および陽イオン界面活性剤を添加し、該試料を電気泳動し、陽極側において核酸の濃縮精製を行うことを特徴とする核酸の濃縮精製装置。
【請求項６】
電気泳動を行う核酸の濃縮精製装置であって、側面を絶縁体により構成した容器内を、拡散を抑制する導電性の分離体により仕切り、該容器内に試料投入室および核酸回収室を構成し、該容器の端部がそれぞれバッファ槽を介して、電極に接続していることを特徴とする核酸の濃縮精製装置。
【請求項７】
電気泳動を用いた核酸の濃縮精製方法であって、核酸を含む試料中の夾雑物に対して、電気泳動により該核酸を分子量によって移動度の差を与える物質により構成される分離媒体に接触させた後に、目的核酸より小さい核酸が通り抜け、泳動方向に対して断面積が小さくなるフィルタにより回収することを特徴とする核酸の濃縮精製方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８３９８
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【発行日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５５０５７（Ｐ２００４−５５５０５７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５１３２
【国際出願日】平成１５年１１月２７日（２００３．１１．２７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【発行日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５１３２
【国際出願日】平成１５年１１月２７日（２００３．１１．２７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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