核酸プローブアレイに対する非特異的な結合を減少させるための方法
【課題】調製スケールでのオリゴヌクレオチドアレイまたは単一の化合物の固相合成における適用を見出す方法および支持体の提供。
【解決手段】固体支持体の表面において複数のポリヌクレオチドプローブに対する標的分子の非特異的結合を減少させるための方法であって、方法は、以下の工程：ａ）保護基を有する表面を有する支持体を提供する工程；ｂ）支持体からすべてはないがいくつかの保護基を除去する工程であって、保護基は、表面の既知の位置において除去される、工程；ｃ）既知の位置において複数の異なるポリヌクレオチドプローブを形成させる工程であって、ポリヌクレオチドプローブは、末端保護基を有する、工程；ｄ）プローブにおける末端保護基もしくは支持体における除去されていない保護基のいずれかまたはその両方を、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程であって、標的分子の非特異的結合が減少する、工程を包含する、方法。
【解決手段】固体支持体の表面において複数のポリヌクレオチドプローブに対する標的分子の非特異的結合を減少させるための方法であって、方法は、以下の工程：ａ）保護基を有する表面を有する支持体を提供する工程；ｂ）支持体からすべてはないがいくつかの保護基を除去する工程であって、保護基は、表面の既知の位置において除去される、工程；ｃ）既知の位置において複数の異なるポリヌクレオチドプローブを形成させる工程であって、ポリヌクレオチドプローブは、末端保護基を有する、工程；ｄ）プローブにおける末端保護基もしくは支持体における除去されていない保護基のいずれかまたはその両方を、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程であって、標的分子の非特異的結合が減少する、工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、固相ポリマー合成の分野に関する。より詳細には、本発明は、調製スケールでのオリゴヌクレオチドアレイまたは単一の化合物の固相合成における適用を見出す方法および支持体を提供する。このオリゴヌクレオチドアレイは、例えば、結合アフィニティーの決定のためのスクリーニング研究および診断的適用において使用され得る。本発明の表面修飾は、結合アフィニティーおよび診断的適用における標的分子のアレイへの非特異的結合を減少する。
【０００２】
生物学的ポリマー（例えば、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド）の合成は、最も初期の溶液合成の段階から、単一のポリマーの固相合成へ、より最近の、単一の固体支持体またはチップ上の多くの種々のオリゴヌクレオチド配列を有するライブラリーの調製まで、劇的な様式で発展してきた。
【０００３】
オリゴヌクレオチド、ペプチド、および他のポリマー配列の大きなアレイを形成する改善された方法が、短い期間の間に考案されてきた。特に注目すべきものとして、Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願番号
ＷＯ ９０／１５０７０もまた参照のこと）、およびＦｏｄｏｒら、ＰＣＴ公開番号 ＷＯ９２／１００９２（本明細書中にすべて参考として援用される）は、例えば、光指向性合成技術を使用して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および他のポリマー配列の巨大なアレイを形成する方法を開示する。Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７７（１９９１）もまた参照のこと（すべての目的のために本明細書中で参考として援用される）。これらの手順はまた、現在、ＶＬＳＩＰＳTM手順といわれる。
【０００４】
上記で引用したＦｏｄｏｒらのＰＣＴ出願において、ＶＬＳＩＰＳTM手順を管理するためのコンピューター制御システムを使用することについて見事な方法が記載されている。このアプローチを使用して、ポリマーの１つの異種アレイが、多くの反応部位の同時カップリングを通して、異なる異種アレイに転換される。Ｗｉｎｋｌｅｒらへの米国特許第５，３８４，２６１号および同第５，６７７，１９５号を参照のこと。これらの開示は、すべての目的のために本明細書中で援用される。
【０００５】
上記で言及された米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ
９０／１５０７０および９２／１００９２において記載されるように、ＶＬＳＩＰＳTM技術の開発は、コンビナトリアル合成およびコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングの分野にある先駆的な技術であると考えられている。より最近では、１９９３年６月２５日に出願された米国特許出願番号第０８／０８２，９３７号は、標的核酸の部分配列もしくは完全配列を提供するため、および特定のオリゴヌクレオチド配列を含む核酸の存在を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドプローブのアレイを作製する方法を記載する。
【０００６】
化学合成およびバイオアッセイの両方におけるＶＬＳＩＰＳTM基材の実行を最適化するための表面特性の制御は、合成開始のための部位密度、表面の湿潤性、および開始部位を表面に結合させる結合基の長さのようなパラメーターを含むことが認識されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によって以下が提供される：
（１）固体支持体の表面において複数のポリヌクレオチドプローブに対する標的分子の非特異的結合を減少させるための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）保護基を有する表面を有する支持体を提供する工程；
ｂ）該支持体からすべてはないがいくつかの該保護基を除去する工程であって、該保護基は、該表面の既知の位置において除去される、工程；
ｃ）該既知の位置において複数の異なるポリヌクレオチドプローブを形成させる工程であって、該ポリヌクレオチドプローブは、末端保護基を有する、工程；
ｄ）該プローブにおける末端保護基もしくは該支持体における除去されていない保護基のいずれかまたはその両方を、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程であって、これにより、該標的分子の非特異的結合が減少する、工程
を包含する、方法。
（２）項目１に記載の方法であって、前記固体支持体が、重合化したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、官能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ポリマー、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ガリウムヒ素、金属酸化物フィルムおよびそれらの組合せを含む、方法。
（３）項目１に記載の方法であって、前記複数のプローブを産生する工程ａ）が以下：
１）前記既知の位置の各々に対して、独立に選択された、光分解性保護基を有するリンカーモノマーを付着させる工程；
２）光指向性方法を用いて該付着したリンカーモノマーの各々に対して光分解性保護基を有する独立に選択されたヌクレオチドモノマーを、付着させて、光分解性の末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程；および
３）工程２）を１〜１２０回反復して、続きのヌクレオチドモノマーを工程２）において生成された該プローブの各々に対して付着させて，光分解性の末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（４）項目１に記載の方法であって、前記複数のプローブを産生する工程ａ）が以下：
１）前記既知の位置の各々に対して、独立して選択された、化学的に除去可能な保護基を有するリンカーモノマーを付着させる工程；
２）該付着されたリンカーモノマーの各々における該化学的に除去可能な保護基の各々を光分解性保護基へと置き換える工程；
３）光指向性方法を用いて、化学的に除去可能な保護基を有する独立して選択されたヌクレオチドモノマーを該付着したリンカーモノマーの各々へと付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程；
４）該プローブの各々における該化学的に除去可能な保護基の各々を光分解性保護基に置き換える工程；および
５）工程３）および４）を１〜１２０回反復して，工程３）において生成した該プローブの各々に対して続きのヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する該複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（５）項目１に記載の方法であって、前記複数のプローブを産生する工程ａ）が以下：
１）前記既知領域の各々に対して、独立して選択された、化学的に除去可能な保護基を有するリンカーモノマーを付着させる工程；
２）該既知の位置の内部および外部に活性化層を形成させる工程であって、該活性化層が、以下：
ｉ）光活性化因子、ここで該光活性化因子は、照射される場合、触媒を生成する光活性化因子、および
ｉｉ）自己触媒因子、ここで該自己触媒因子は、該自己触媒因子が該触媒によって活性化される場合、該化学的に除去可能な保護基を除去する生成物を生成する自己触媒因子、
を含む、工程；
３）該既知の位置と重複する該活性化層の部分を照射して、該リンカーモノマーにおける該化学的に除去可能な保護基を除去する工程；
４）該付着したリンカーモノマーの各々に対して、化学的に除去可能な保護基を有する独立して選択されたヌクレオチドモノマーを付着して、化学的に除去可能な末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程；
５）該既知の位置に重複する該活性化層の部分を照射して、該プローブにおいて該化学的に除去可能な保護基を除去する工程；
６）工程４）および５）を１〜１２０回反復して、工程４）において生成された該プローブの各々に対して続きのヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する該複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（６）項目１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｂ）が以下：
１）前記プローブにおける末端保護基もしくは前記支持体における除去されていない保護基のいずれかまたは両方を、アクチベーターに曝露して、該保護基を除去し、活性化部位を生成する工程；および
２）該活性化部位を、該プローブまたは該支持体、またはその両方に対して負に荷電したホスフェート残基を共有結合する化合物と反応させる工程、
を包含する、方法。
（７）項目６に記載の方法であって、前記保護基が、光分解性保護基であり、そして前記アクチベーターがイオンビーム、電子ビーム、ガンマ線、ｘ線、紫外線照射、光、赤外線照射、マイクロ波、電流、電波、およびそれらの組合せからなる群より選択される、方法。
（８）項目６に記載の方法であって、前記保護基が化学的に除去可能な保護基であり、そして前記アクチベーターが、酸、塩基、酸化剤および還元剤からなる群より選択される、方法。
（９）項目６に記載の方法であって、前記活性化部位と化合物とを反応させる工程２）が、以下：
以下の式Ｉ
【化１】
および式ＩＩ
【化２】
からなる群より選択される化合物と該活性化部位の各々とを反応させる工程を含み、ここで、
ＤＭＴは、ジメトキシトリチル保護基であり；
各Ｘは塩基除去可能な保護基であり；そして
ｉＰｒ2Ｎは、ジイソプロピルアミノ保護基である、
方法。
（１０）項目１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｂ）が、以下：
１）前記プローブにおける末端保護基もしくは前記支持体における除去されていない保護基またはその両方をアクチベーターに曝露して、該保護基を除去して、活性化部位を生成する工程；
２）該活性化部位を、負に荷電したホスフェート単位および保護基を有するモノマーと反応させる工程であって、それにより該モノマーが該プローブもしくは該支持体またはその両方と共有結合する、工程；ならびに
３）工程１）および２）を１〜２０回反復して、該複数のプローブまたは該支持体のｉ）の各々の少なくとも１つにおける負に荷電したホスフェート単位のポリアニオン鎖を生成する工程、
を包含する、方法。
（１１）項目１０に記載の方法であって、前記工程２）が、以下の式ＩＩＩ
【化３】
のモノマーと反応させる工程であって、ここで、
Ｒ1は、ヌクレオシド部分、デオキシリボース部分、Ｃ1-8アルキレン、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−からなる群より選択され、ここで、ｍは１〜８の整数であり；
Ｒ2は、ジメトキシトリチル保護基およびＭｅＮＰＯＣ保護基からなる群より選択される保護基であり；
Ｘは、塩基除去可能な保護基であり；そして
ｉＰｒ2Ｎがジイソプロピルアミノ保護基である、
工程を包含する、方法。
（１２）項目１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｂ）が、以下：
前記プローブにおける末端保護基および前記支持体における除去されていない保護基の両方を置き換える工程、
を包含する、方法。
（１３）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対する標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下の工程：
ａ）複数の既知の位置に対してポリアニオン鎖を付着させる工程；
ｂ）該既知の位置の各々にて該ポリアニオン鎖の各々において該複数の異なる核酸プローブを形成させる工程であって、これにより、該標的分子の非特異的な結合が減少する、工程、
を包含する、方法。
（１４）項目１３に記載の方法であって、前記ポリアニオン鎖が保護基を有する、方法。
（１５）項目１４に記載の方法であって、前記固体支持体が、重合化したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、官能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ポリマー、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ガリウムヒ素、金属酸化物フィルムおよびそれらの組合せを含む、方法。
（１６）項目１４に記載の方法であって、前記ポリアニオン鎖を付着させる工程ａ）が、以下：
前記既知の位置の各々における該ポリアニオン鎖を形成させる工程であって、ここで、該ポリアニオン鎖を形成させる工程が、以下、
１）該既知の位置の各々にモノマーを付着させる工程であって、該モノマーは、負に荷電したホスフェート単位および保護基を有し、それにより、該モノマーは、該既知の位置の各々に共有結合している、工程；
２）該モノマーの各々を、アクチベーターに曝露して、該モノマーの各々から該保護基を除去して、活性化部位を生成する工程；
３）該活性化部位と、負に荷電したホスフェート単位および保護基を有する該モノマーとを反応させて、第二のモノマーを付加する工程；ならびに
４）工程２）および３）を０〜２０回反復して、該既知の位置の各々における保護基を有するポリアニオン鎖を生成する工程、を包含する、工程、
を包含する、方法。
（１７）項目１６に記載の方法であって、前記工程１）および３）が、以下の式ＩＩＩ：
【化４】
のモノマーであって、ここで、
Ｒ1は、ヌクレオシド部分、デオキシリボース部分、Ｃ1-8アルキレン、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−からなる群より選択され、ここで、ｍは１〜８の整数であり；
Ｒ2は、ジメトキシトリチル保護基およびＭｅＮＰＯＣ保護基からなる群より選択され；
Ｘは、塩基除去可能な保護基であり；そして
ｉＰｒ2Ｎがジイソプロピルアミノ保護基である、
モノマーを使用する工程を含む、
方法。
（１８）項目１６に記載の方法であって、前記保護基は、光分解性保護基であり、そして前記工程２）は、イオンビーム、電子ビーム、ガンマ線、ｘ線、紫外線照射、光、赤外線照射、マイクロ波、電流、電波、およびそれらの組合せからなる群より選択されるアクチベーターを使用する工程を包含する、方法。
（１９）項目１６に記載の方法であって、前記保護基が、化学的に除去可能な保護基であり、そして前記工程２）が、酸、塩基、酸化剤および還元剤からなる群より選択されるアクチベーターを使用する工程を包含する、方法。
（２０）項目１４に記載の方法であって、前記ポリアニオン鎖を付着させる工程ａ）が、さらに、前記既知の位置の外側の基材に対して、保護基を有するポリアニオン鎖を付着させる工程を包含する、方法。
（２１）項目１４に記載の方法であって、前記保護基が、光分解性の保護基を含み、そして前記複数のプローブを形成させる工程ｂ）が、以下：
１）光指向性方法を用いて、該既知の位置の各々にて該ポリアニオン鎖の各々に対して光分解性の末端保護基を有する独立に選択されたヌクレオチドモノマーを付着させる工程；および
２）工程１）を１〜１２０回反復して、続きのヌクレオチドモノマーを工程１）において付着された該ヌクレオチドモノマーの各々に対して付着させて，複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（２２）項目１４に記載の方法であって、前記保護基が化学的に除去可能な保護基を含み、そして前記複数のプローブを形成させる工程ｂ）が、以下：
１）前記既知の位置の各々にて、前記付着したポリアニオン鎖の各々における該化学的に除去可能な保護基の各々を、光分解性保護基に置き換える工程；
２）光指向性方法を用いて、該付着したポリアニオン鎖の各々に対して、化学的に除去可能な保護基を有する独立して選択されるヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な保護基を有する、複数の付着したヌクレオチドモノマーを生成する工程、
３）該ヌクレオチドモノマーの各々における該化学的に除去可能な保護基の各々を、光分解性保護基と置き換える工程；
４）光指向性方法を用いて、該付着されたヌクレオチドモノマーの各々に対して、独立に選択された化学的に除去可能な保護基を有するヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程；
５）工程３）および４）を１〜１２０回反復して、工程３）において生成した該プローブの各々に対して続きのヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する該複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（２３）項目１４に記載の方法であって、前記保護基が化学的に除去可能な保護基であって、そして前記複数のプローブを生成する工程ａ）が、以下：
１）前記既知の位置の内部および外側に活性化層を形成させる工程であって、該活性化層は、以下を含む：
ｉ）光活性化因子、ここで該光活性化因子は、照射される場合、触媒を生成する、および
ｉｉ）自己触媒因子、ここで該自己触媒因子は、該自己触媒因子が該触媒によって活性化される場合、該化学的に除去可能な保護基を除去する生成物を生成する；
２）該既知の位置と重複する該活性化層の部分を照射して、該ポリアニオン鎖における該化学的に除去可能な保護基を除去する工程；
３）該既知の位置の各々にて該付着したポリアニオン鎖の各々に対して、独立して選択されたヌクレオチドモノマーを付着して、化学的に除去可能な末端保護基を有する複数のヌクレオチドモノマーを生成する工程；
４）該既知の位置に重複する該活性化層の部分を照射して、該ヌクレオチドモノマーの各々において該化学的に除去可能な保護基を除去する工程；
５）工程３）および４）を１〜１２０回反復して、工程３）において付着された該ヌクレオチドの各々に対して続きのヌクレオチドモノマーを付着させて、該複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（２４）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対して標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）該支持体における支持体の外側の既知の位置に対してポリアニオン鎖を付着させる工程；
（ｂ）該既知の位置の各々にて該複数のプローブを形成させ、それにより該標的分子の非特異的な結合が減少する工程、
を包含する、方法。
（２５）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対して標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下：
ａ）保護基を有する表面を有する支持体を提供する工程；
ｂ）該支持体からすべてはないがいくつかの該保護基を除去する工程であって、該保護基は、既知の位置において除去される、工程；
ｃ）該既知の位置において保護基を有するポリアニオン鎖を形成させる工程；
ｄ）該ポリアニオン鎖において該複数のプローブを形成させる工程であって、該複数のプローブの各々は、末端保護基を有する、工程；および
ｅ）該プローブにおける末端保護基もしくは該支持体における除去されていない保護基のいずれかまたはその両方を除去する工程、
を包含する、方法。
（２６）項目２５に記載の方法であって、前記プローブにおける前記末端保護基および前記支持体における前記除去されていない保護基の両方が、除去されている、方法。
（２７）項目２５に記載の方法であって、前記ポリアニオン鎖を付着させる工程ａ）が、さらに、前記既知の位置の外側の基材に対して保護基を有するポリアニオン鎖を付着させる工程を包含する、方法。
（２８）項目２７に記載の方法であって、前記除去する工程ｃ）が、以下：
ｉ）工程ｂ）において生成される前記複数のプローブの各々における前記保護基、および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記支持体に付着した前記複数のポリアニオン鎖の各々における該保護基、
の両方を除去する工程、
を包含する、方法。
（２９）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対する標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下：
ａ）支持体における既知の位置の外側に保護基を有するポリアニオン鎖を形成させる工程；
ｂ）該支持体の該表面の該既知の位置に複数の核酸プローブを形成させる工程であって、該複数のプローブの各々は、末端保護基を有する、工程；および
ｃ）該プローブにおいてもしくは該既知の位置の外側の該基材のいずれかまたはその両方から該保護基を除去する工程であって、これにより、該標的分子の非特異的な結合が減少する、工程、
を包含する、方法。
（３０）項目２９に記載の方法であって、前記除去する工程ｃ）が、該プローブ、および該既知の位置の外側の該基材から、両方の該保護基を除去する工程を包含する、方法。
（３１）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対する標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下、
ａ）既知の位置の外側に保護基を有する基材の該表面上に該既知の位置にてポリアニオン鎖を形成させる工程；
ｂ）該ポリアニオン鎖において該既知の位置の各々にて複数の核酸プローブを形成させる工程であって、該複数のプローブの各々が末端保護基を有する、工程；ならびに
ｃ）以下：
ｉ）該複数のプローブの各々における該保護基；および
ｉｉ）該既知の位置の外側の該保護基、
の少なくとも１つを、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程であって、それによって該標的分子の非特異的な結合が減少する、工程
を包含する、方法。
（３２）項目３１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
１）以下：
ｉ）前記複数のプローブの各々；および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材における前記保護基の各々、
の少なくとも１つを、アクチベーターに曝露して、該保護基を除去して、活性化部位を生成する工程；および
２）負に荷電したホスフェート残基を、該複数のプローブもしくは該既知の位置の外側の該基材のいずれかまたはその両方に共有結合する化合物と該活性化部位を反応させる工程、
を包含する、方法。
（３３）項目３１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
１）以下：
ｉ）前記複数のプローブの各々；および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材における前記保護基、
の少なくとも１つを、アクチベーターに曝露して、該保護基を除去して、活性化部位を生成する工程；
２）該活性化部位を、負に荷電したホスフェート単位および保護基を有するモノマーと反応させる工程であって、それにより該モノマーが：ｉ）前記複数のプローブの各々；およびｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材の少なくとも１つと共有結合する、工程；ならびに
３）工程１）および２）を１〜２０回反復して：ｉ）前記複数のプローブの各々；およびｉｉ）前記複数の既知の位置の各々の少なくとも１つにおける負に荷電したホスフェート単位のポリアニオン鎖を生成する工程、
を包含する、方法。
（３４）項目３１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
ｉ）工程ｂ）において生成した前記複数のプローブの各々における前記保護基、および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材における前記保護基、
の両方を、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程、
を包含する、方法。
（３５）項目３１に記載の方法であって、前記工程ａ）が、さらに、
前記既知の位置の外側の前記基材の前記表面においてポリアニオン鎖を形成させる工程、
を包含する、方法。
（３６）項目３５に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
ｉ）工程ｂ）において生成した前記複数のプローブの各々における前記保護基、および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材の前記表面における前記保護基の
両方を置き換える工程、
を包含する、方法。
（３７）固体支持体の表面における複数のプローブに対する標的分子の非特異的な結合を減少させる方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）前記基材の前記表面上の既知の位置の外側に保護基を有するポリアニオン鎖を形成させる工程；
ｂ）該既知の位置にて該複数のプローブを形成させる工程であって、該複数のプローブの各々が末端保護基を有する、工程；ならびに
ｃ）以下：
ｉ）工程ｂ）において生成された該複数のプローブの各々における該保護基；および
ｉｉ）該既知の位置の外側の該ポリアニオン鎖における該保護基、
の少なくとも１つを、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程であって、それによって該標的分子の非特異的な結合が減少する、工程
を包含する、方法。
（３８）項目３７に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
ｉ）工程ｂ）において生成した前記複数のプローブの各々における前記保護基、および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材の前記表面に付着した前記複数のポリアニオン鎖の各々における前記保護基、
の両方を、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程、
を包含する、方法。
（３９）複数の核酸プローブに対するハイブリダイゼーションについて標的分子をスクリーニングするための方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）既知の位置において核酸プローブを有する表面を有する固体支持体を提供する工程であって、該支持体は、該既知の位置の外側もしくは該既知の位置の内部のいずれかまたはその両方にてさらにポリアニオン鎖を有し、該プローブは、該ポリアニオン鎖が該既知の位置に存在する場合に該ポリアニオン鎖を通じて該支持体に付着している、工程；
ｂ）該プローブを有する該支持体と、標的分子とを接触させる工程；および
ｃ）該複数のプローブに対する該標的分子のハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、該ポリアニオン鎖が、該複数のプローブに対する該標的分子の非特異的な結合を減少させる、工程、
を包含する、方法。
（４０）項目３９に記載の方法であって、前記支持体が、前記既知の位置の内部およびその外側に前記ポリアニオンを有し、そして前記プローブは、該既知の位置の内部の該ポリアニオンに付着している、方法。
（発明の要旨）
本発明は、標的分子または複数の標的分子の、オリゴヌクレオチドのアレイへの非特異的結合を減少させるための種々の方法を提供する。
【０００８】
第１の局面として、本発明は、標的分子または検出／シグナル生成分子の、固体支持体の表面の複数のオリゴヌクレオチドへの非特異的結合を減少させるための方法を提供し、ここでこの表面は、複数の指定領域および複数の保護領域を有する。各々の複数の保護領域は、その上に保護基を有する。この方法は以下の工程を含む：ａ）各々の指定領域で複数のオリゴヌクレオチドを生成する工程であって、ここで各々の複数のオリゴヌクレオチドは、末端保護基を有する、工程；およびｂ）各々の複数の保護領域上で保護基を除去する工程。標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、保護基の除去の結果として減少する。別の実施態様において、本発明の方法は、複数のオリゴヌクレオチドおよび保護領域の両方からの保護基の除去を含む。この保護基は、感光性の保護基、または化学的に除去可能な保護基、あるいはそれらの組み合わせであり得る。
【０００９】
第２の局面として、本発明は、標的分子または検出／シグナル生成分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための別の方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）各々の指定領域で複数のオリゴヌクレオチドを生成する工程であって、ここで各々の複数のオリゴヌクレオチドは、末端保護基を有する、工程；ならびにｂ）少なくとも１つの：ｉ）工程ａ）中で生成された各々の複数のオリゴヌクレオチド上の保護基、およびｉｉ）各々の複数の保護領域上の保護基を、負に荷電したリン酸残基で置換する工程。標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、保護基を、負に荷電したリン酸残基に置換することによって減少する。本発明はさらに、オリゴヌクレオチド上および保護領域上の両方の保護基を置換する工程を包含する。保護基を置換する負に荷電したリン酸残基は、負に荷電したリン酸残基に共有結合する化合物との反応、または負に荷電したリン酸残基のポリアニオン鎖を結合させることによって提供され得る。
【００１０】
第３の局面として、本発明は、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための、なお別の方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）固体支持体上の表面の各々の指定領域に、保護基を有するポリアニオン鎖を結合させる工程、およびｂ）各々の指定領域のポリアニオン鎖上に、末端保護基を有する複数のオリゴヌクレオチドを形成する工程。オリゴヌクレオチドアレイへの標的分子の非特異的結合は、固体支持体の表面の指定領域上のポリアニオン鎖の存在によって減少する。このポリアニオン鎖は、指定領域上でポリアニオン鎖を形成すること、またはあらかじめ形成したポリアニオン鎖を指定領域に結合することによって、指定領域に結合され得る。１つの実施態様において、保護基を有するポリアニオン鎖はまた、固体支持体の保護領域に結合される。
【００１１】
第４の実施態様において、本発明は、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）保護基を有するポリアニオン鎖を各々の保護領域に結合させる工程；およびｂ）各々の指定領域において末端保護基を有する複数のオリゴヌクレオチドを形成する工程。標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、固体支持体の表面の保護領域上のポリアニオン鎖の存在によって減少する。このポリアニオン鎖は、保護領域上でポリアニオン鎖を形成すること、またはあらかじめ形成したポリアニオン鎖を保護領域に結合することによって、保護領域に結合され得る。
【００１２】
第５の実施態様において、本発明は、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：ａ）保護基を有するポリアニオン鎖を、各々の指定領域に結合させる工程；ｂ）各々の指定領域のポリアニオン鎖上で、末端保護基を有する複数のオリゴヌクレオチドを形成する工程、ならびにｃ）少なくとも１つの：ｉ）工程ｂ）で生成された各々の複数のオリゴヌクレオチド上の保護基、およびｉｉ）各々の複数の保護領域上の保護基、を除去する工程。標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、指定領域上のポリアニオン鎖、ならびに固体支持体の表面のオリゴヌクレオチドまたは保護領域のいずれかまたは両方からの保護基の除去の組み合わせによって減少する。別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、保護領域に結合され、そして標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、保護領域上のポリアニオン鎖、ならびに固体支持体の表面のオリゴヌクレオチドまたは保護領域に結合したポリアニオン鎖のいずれかかまたは両方からの保護基の除去の組み合わせ、によって減少する。別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、指定領域および保護領域の両方に結合し、そしてオリゴヌクレオチドアレイへの標的分子の非特異的結合は、ポリアニオン鎖、ならびに、固体支持体の表面の保護領域に結合したオリゴヌクレオチドまたはポリアニオン鎖のいずれかまたは両方からの保護基の除去の組み合わせにより減少する。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）保護基を有するポリアニオン鎖を、各々の指定領域に結合させる工程；ｂ）各々の指定領域で、ポリアニオン鎖上に末端保護基を有する複数のオリゴヌクレオチドを形成する工程；ならびにｃ）少なくとも１つの、または両方の：ｉ）工程ｂ）中で生成された各々の複数のオリゴヌクレオチド上の保護基、およびｉｉ）各々の複数の保護領域上の保護基を、負に荷電したリン酸残基で置換する工程。標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、指定領域上のポリアニオン鎖、および、固体支持体の表面のオリゴヌクレオチド上または保護領域上のいずれかまたは両方での保護基の置換の組み合わせによって減少する。別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、保護領域に結合され、そして標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、保護領域上のポリアニオン鎖、および、固体支持体の表面の保護領域に結合したオリゴヌクレオチド上またはポリアニオン鎖上のいずれかまたは両方の保護基の置換の組み合わせによって減少する。別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、指定領域および保護領域の両方に結合され、そして標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、ポリアニオン鎖、および、固体支持体の表面の保護領域に結合されたオリゴヌクレオチド鎖上のもしくはポリアニオン鎖上のいずれかまたは両方での保護基の置換の組み合わせによって減少する。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は固相合成のための固体支持体を提供する。この固体支持体は、複数の指定領域および複数の保護領域ならびに少なくとも１つのｉ）各々の指定領域、およびｉｉ）各々の保護領域、に結合した保護基を有するポリアニオン鎖を有する表面を含む。
【００１５】
なお別の実施態様において、本発明は、複数のオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションのための標的分子をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）複数の指定領域および複数の保護領域、ならびに少なくとも１つのｉ）各々の指定領域、およびｉｉ）各々の保護領域に結合した保護基を有するポリアニオン鎖を有する表面を含む固体支持体を提供する工程；ｂ）標的分子を複数のオリゴヌクレオチドに接触させる工程；ならびにｃ）複数のオリゴヌクレオチドに対する標的分子のハイブリダイゼーションを検出する工程。このオリゴヌクレオチドは、ポリアニオン鎖が各々の指定領域と結合する場合に、ポリアニオン鎖に結合される。標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、指定領域および保護領域の１つまたは両方におけるポリアニオン鎖の存在によって減少する。
【００１６】
前述の方法は、その上、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための種々の方法と組み合わされ得る。前述の方法の任意の適切な組み合わせが、本発明に従って利用され得る。
【００１７】
本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の好ましい実施態様の説明および本発明の実施例の説明においてさらに記載される。
【００１８】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、一般的には、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための方法に関する。このような方法には、オリゴヌクレオチドが提供される基剤表面に対する表面修飾、ならびにオリゴヌクレオチドに対する修飾およびこれらの技術の組み合わせが含まれる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＥＤＡ」はエチレンジアミンを意味し；「ＡｃＯＨ」は酢酸を意味し；「ＡＬＬＯＣ」はアリルオキシカルボニルを意味し；「ＢＯＰ」はベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味し；「ＣＡＰ」はε−アミノカプロン酸を意味し；「ＤＩＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンを意味し；「ＤＩＧＬＹ」はグリシルグリシンを意味し；「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し；「ＤＭＴ」はジメトシトリチルを意味し；「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを意味し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを意味し；「ＦＭＯＣ」はフルオレニルメトキシカルボニルを意味し；「ＭｅＮＰＯＣ」はαメチルニトロ−ピペロニルオキシカルボニルを意味し；「ＭＰ」は融点を意味し；「ＮＶＯＣ」はニトロベラトリル（ｖｅｒａｔｒｙｌ）オキシカルボニルを意味し；「ＯＢｔ」はヒドロキシベンゾトリアゾールラジカルを意味し；「ＰＢＳ」はリン酸緩衝化生理食塩水を意味し；「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を意味し；「１５−ＡＴＯＭ−ＰＥＧ」はＨ2Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯ−（ＣＨ2）3−ＣＯ2Ｈを意味し；そして「ＴＲＩＧＬＹ」はグリシルグリシルグリシンを意味する。
【００２０】
以下の用語は、それらが本明細書中で使用される場合、以下の一般的な意味を有することが意図される：
化学用語：本明細書中で使用される場合、用語「アルキル」は、飽和炭化水素ラジカルをいう。これは、直鎖または分枝鎖（例えば、エチル、イソプロピル、ｔ−アミル、または２，５−ジメチルヘキシル）であり得る。「アルキル」または「アルキレン」が結合基またはスペーサーをいうために使用される場合、これは、共有結合のために２つの利用可能な原子価を有する基（例えば、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−、および、−ＣＨ2（ＣＨ2ＣＨ2）2ＣＨ2−）であるととられる。置換基として好ましいアルキル基は、１〜１０炭素原子を含むアルキル基であり、特に好ましいのは、１〜６炭素原子を含むアルキル基である。結合基として好ましいアルキル基はまたはアルキレン基は、１〜２０炭素原子を含むアルキル基はまたはアルキレン基であり、特に好ましいのは、３〜６炭素原子を含むアルキル基はまたはアルキレン基である。用語「ポリエチレングリコール」は、エチレングリコールの反復単位を有するそれらの分子（例えば、ヘキサエチレングリコール（ＨＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）5−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ））をいうために用いられる。用語「ポリエチレングリコール」が、結合基およびスペーサー基をいうために使用される場合、他のポリエーテルまたはポリオール（すなわち、ポリプロピレングリコール、またはエチレングリコールとプロピレングリコールとの混合物）が同様に使用され得ることが当業者に理解される。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「保護基」は、感光性の保護基および化学的に除去可能な保護基をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「感光性保護基」は、化学反応が別の反応部位で行われる間、分子中の１つの反応性部位を遮断するように設計され、そして光照射のような放射に曝露することによって除去可能な任意の基をいう。本明細書中で利用されるその用語の意味内での感光性の保護基の特定の例には、ジメトキシベンゾイン、２−ニトベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、α−メチル−２−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）、２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）、α−メチル−２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）、２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＤＮＢＯＣ）、α−メチル−２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＭｅＤＮＢＯＣ）、２−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）、２−メチル−２−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＥＯＣ）、１−ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＭＯＣ）、９−アントラセニルメチルオキシカルボニル（ＡＮＭＯＣ）、３’−メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）、３’，５’−ジメトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）、７−ニトロインドリニルオキシカルボニル（ＮＩＯＣ）、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルオシキカルボニル（ＢＮＩＯＣ）、５，７−ジニトロインドリニルオキシカルボニル（ＤＮＩＯＣ）、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、および上記の任意のものの非カルボネートベンジリック形態（例えば、ＮＶ、ＭｅＮＶなど）のような基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「化学的に除去可能な保護基」は、化学反応が別の反応部位で行われている間に、分子中の１つの反応部位を遮断するように設計され、そして化学薬剤への曝露、すなわち、放射への曝露以外の手段によって除去され得る任意の基をいう。例えば、化学的に除去可能な保護基の１つの型は、塩基への曝露によって除去可能である（すなわち、「塩基除去可能な保護基」）。特定の塩基除去可能な保護基の例として、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、２−シアノエチル（ＣＥ）、Ｎ−トリフルオロアセチルアミノエチル（ＴＦ）、２−（４−ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）、および２−（４−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。化学的に除去可能な保護基の別の型は、求核試薬への曝露によって除去可能である（すなわち、「求核試薬除去可能保護基」）。求核除去可能な保護基の特定の例には、レブリニル（Ｌｅｖ）およびアリールオキシカルボニル（ＡＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。他の化学的除去可能な保護基は、酸に対する曝露によって除去される（すなわち、「酸除去可能保護基」）。特定の酸除去可能な保護基には、トリフェニルメチル（Ｔｒまたはトリチル）、４−メトキシトリフェニルメチル（ＭＭＴまたはモノメトキシトリチル）、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴまたはジメトキシトリチル）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢＯＣ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル（ＤＤｚ）、２−（トリメチルシリル）エチル（ＴＭＳＥ）、および２−（トリメチルシリル）エチルオキシカルボニル（ＴＭＳＥＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。別の型の化学的除去可能な保護基は、還元剤への曝露によって除去可能である（すなわち、「還元剤除去可能な保護基」）。還元剤除去可能な保護基の特定の例には、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）および２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル（ＴＲＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。化学的に除去可能な保護基のさらなる例には、アリル（Ａｌｌ）およびアリルオキシカルボニル（ＡｌｌＯＣ）保護基が含まれる。化学的に除去可能な保護基の他の例は、当業者に公知である。
【００２４】
モノマー：モノマーは、２つ以上のモノマー単位から構成されるポリマーまたは化合物を形成するように互いに結合されたか、または互いに結合され得る低分子のセットのメンバーである。本発明は、固相合成において有用である組成物および方法に関して本明細書に記載される。多くの適用において、固相方法は、オリゴヌクレオチドのような生物学的ポリマーの調製のために使用される。これらの生物学的ポリマーのための、モノマーのセットには、例えば、ヌクレオチドのセットおよびペントースおよびヘキソースのセットが含まれるが、これらに限定されない。生物学的ポリマー内のモノマーの特定の順序は、ポリマーの「配列」として本明細書中で言及される。本明細書中で使用される場合、モノマーは、ポリマーの合成のための基本のセットの任意のメンバーをいう。モノマーの異なる基本セットは、ポリマーの合成における連続的な工程で使用され得る。さらに、セットの各々は、合成後に修飾される保護されたメンバーを含み得る。本発明は、ヌクレオチドのようなモノマーの配列を含有する分子の調製に関して主に本明細書中に記載されるが、他のポリマーの調製に容易に適用され得る。このようなポリマーには、例えば、核酸の直線状および環状の両方のポリマー、ポリサッカライド、リン脂質、およびα、β、またはωアミノ酸のいずれかを有するペプチド、公知の薬物が任意の上記のものに共有結合したヘテロポリマー、ポリヌクレオチド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド（ｐｏｌｙａｒｙｌｅｎｅ ｓｕｌｆｉｄｅ）、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、または本開示を検討すると明らかになる他のポリマーが含まれる。このようなポリマーは、異なるモノマー配列を有するポリマーが、基質の異なる指定された領域で形成された場合、「多様」である。ポリマーの環状化およびポリマー反転の方法は、本明細書中に参考として全ての目的で援用される「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」と題された同時係属中の出願である米国特許第５，５５０，２１５号に開示されている。
【００２５】
固体支持体：本明細書で使用される場合、用語「固体支持体」または「基材」は、剛性の、または半剛性の表面を有する部材のことをいう。多くの実施態様において、支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるが、いくつかの実施態様では、例えば、ウェル、盛り上がった領域、エッチングした溝、などで、異なるポリマーについての合成領域を物理的に分離していることが所望であり得る。いくつかの実施態様では、支持体自体は、合成領域の全部かまたは一部を形成するウェル、溝、フロースルー領域、などを備える。他の実施態様に従って、小ビーズが、その表面に提供され得、そしてそこで合成された化合物が、合成の完了に伴って放出され得る。
【００２６】
チャンネルブロック：その表面上に、複数の溝またはくぼんだ領域を有する部材。溝またはくぼんだ領域は、縞、円、曲がりくねった路、などを含むが、これらに限定されない種々の幾何学的なコンフィギュレーションを取り得る。チャンネルブロックは、エッチングシリコンブロック、成型ポリマーまたは加圧ポリマー（ｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ）などを含む種々の様式で調製され得る。
【００２７】
異なるプローブを、支持体の表面の異なる既知の位置に合成するか、または付着させる。既知の位置は、任意の都合の良い形状（例えば、環状、長方形、楕円形、楔型など）を有し得る。いくつかの実施態様において、各異なるポリマー配列が合成される領域は、約１ｃｍ2より小さく、より好ましくは、１ｍｍ2よりも小さく、そしてなおより好ましくは、０．５ｍｍ2よりも小さい。最も好ましい実施態様では、その領域は、約１０，０００μｍ2よりも小さいか、またはより好ましくは、１００μｍ2よりも小さい面積を有する。これらの領域内で、そこで合成されたポリマーは、好ましくは、実質的に純粋な形態（例えば、優勢な種）で合成される。さらに、そのポリマーの複数のコピーは、代表的には、任意の公知の位置内で合成される。コピー数は、数千から数百万であり得る。
【００２８】
保護領域：保護領域は、オリゴヌクレオチドポリマーの形成について使用されない固体支持体の表面上の局在した領域である。従って、保護領域は、オリゴヌクレオチドが合成されることを意図されない、そして保護基を結合させた固体支持体の表面上の全ての領域として規定される。保護領域は、任意の従来の形状（例えば、環状、長方形、楕円形、楔形、など）を有し得る。いくつかの実施態様において、保護領域は、約１ｃｍ2よりも小さく、より好ましくは、１ｍｍ2よりも小さく、そしてなおより好ましくは、０．５ｍｍ2よりも小さい。最も好ましい実施態様では、保護領域は、約１０，０００μｍ2よりも小さい面積、またはより好ましくは、１００μｍ2よりも小さい面積を有する。
【００２９】
標的分子：本明細書で使用される用語「標的分子」は、アレイ上の複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより有利に検出および／または同定される１つの分子または複数の分子をいう。代表的には、標的分子は、種々の分子を含有する混合物（例えば、生物学的サンプル）中に含有される。本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、生物または生物の成分（例えば、細胞）から得られるサンプルをいう。サンプルは、任意の生物学的組織または体液であり得る。頻繁には、そのサンプルは、患者由来のサンプルである「臨床的サンプル」である。このようなサンプルには、疸、血液、血液細胞（例えば、白血球）、組織または細針生検サンプル、尿、腹膜液、および胸膜液、またはこれら由来の細胞を含むが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織学的目的のために取り出された凍結切片のような組織の切片を含み得る。本発明は、生物学的サンプル中の標的分子についてのアッセイにおいて特定の有用性を見出す。
【００３０】
核酸プローブ（ときどきオリゴヌクレオチドプローブといわれる）は、任意の長さであり得、そして任意の手段によって産生され得る。プローブには、６〜３０または１０〜２５塩基の範囲の長さを有するものもある。プローブには、１０００塩基以上の長さを有するものもある。プローブは、代表的には、一本鎖であり、そしてＤＮＡまたはＲＮＡあるいはＰＮＡのようなそれらのアナログであり得る。プローブは、予め合成されて、支持体にインタクトに結合されるか、またはインサイチュで支持体上で成分を連続的に付加することによって合成され得る。
【００３１】
（１．標的分子を含有するサンプルをアッセイする一般的な方法）
固体支持体上での多様な化学化合物の合成のための方法の出現により、このような化学ライブラリーのための多数の研究および診断的適用が発生した。これらの研究および診断適用の多くは、サンプルを、ペプチドおよびオリゴペプチドのような多数の生物学的ポリマー、または段階的な様式でビルディングブロックから合成された他の低リガンド分子が複数付着した固体支持体またはチップと接触させて、１つ以上の付着したポリマーまたは低リガンド分子と特異的に結合する任意の種を同定する。
【００３２】
例えば、１９９３年６月２５日に出願された特許出願第０８／０８２，９３７号は、標的核酸の完全配列を提供するために、および特定のオリゴヌクレオチド配列を含有する核酸の存在を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドプローブのアレイを作製するための方法を記載する。「Ｓｕｒｆａｃｅ Ｂｏｕｎｄ Ｕｎｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ」と題された米国特許第５，５５６，７５２号は、ｐ５３タンパク質および多くの癌状態に寄与する遺伝子と関連するもののようなタンパク質／ＤＮＡ結合相互作用を含む診断適用に使用され得る単一分子の二本鎖オリゴヌクレオチドのアレイを作製する方法を記載する。二本鎖オリゴヌクレオチドのアレイはまた、特定の結合親和性を有する新たな薬物をスクリーングするために使用され得る。
【００３３】
本発明の方法および組成物は、１つ以上の標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少するために有用である。これらの方法は、配列が公知である１つ以上の選択された標的分子に対して相補性を示すプローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを利用する。代表的には、これらのアレイは、米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９２／１００９２およびＷＯ９５／１１９９５（これらの各々が本明細書中に参考として援用される）に記載されるような固体支持体上の高密度のアレイ（「チップ上のＤＮＡ」）に固定される。一般的に、１つ以上の標的分子を含有するサンプルは、アレイ上の複数のオリゴヌクレオチドに対してアッセイまたはスクリーニングされ、サンプル中の標的分子を検出および／または同定し得る。この方法は、複数のオリゴヌクレオチドプローブをその上に有する固体支持体を提供する工程、複数の標的分子をオリゴヌクレオチドアレイと接触させる工程、およびその複数のオリゴヌクレオチドへのその標的分子のハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する。ハイブリダイゼーションおよびアッセイ技術は、１９９７年２月２日に出願された同時係属中の米国特許第０８／７９７，８１２号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。発現分析技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１０３６５（その全体が参考として援用される）に記載される。
【００３４】
種々のストラテジーが、チップ上にオリゴヌクレオチドアレイを整列しそしてディスプレイし、それにより、標的核酸に関して導き得るハイブリダイゼーションパターンおよび配列情報を最大化するために利用可能である。例示的なディスプレイおよび整列化ストラテジー（基本的なタイリングストラテジーを含む）は、本明細書に参考として援用されるＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１２３０５号、および１９９７年２月２日に出願された米国特許出願第０８／７９７，８１２号［１８５４７−０１８５５０］に記載される。１つ以上の標的分子をオリゴヌクレオチドアレイに曝露して、その標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションを決定する技術は、当該分野で公知である。
【００３５】
オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的な結合は、標的分子ではない分子がアレイにハイブリダイズするようである場合に生じる。非特異的結合の結果として、サンプル中の標的分子の定性的および／または定量的測定における精度の減少が生じる。非特異的結合は、多くの要因から生じ得る。非特異的結合は、サンプル内のタンパク質成分（例えば、フルオレセイン−ストレプトアビジンまたはフィコエリトリン−ストレプトアビジン）のオリゴヌクレオチドアレイへの結合から生じるようである。他の場合には、ＲＮＡフラグメント化またはＴｄＴ標識に使用される緩衝液中に存在する不溶性のマグネシウム、コバルト、または他の塩の沈殿した粒子の接着によって引き起こされるようである明るい「斑点」が生じる。両方の種類の非特異的結合は、ＥＤＡ中の最終基質脱保護の前に光分解していない反応していない保護基（例えば、ＭｅＮＰＯＣ保護基）を有するアレイまたはチップの領域において最も重度である。オリゴヌクレオチドプローブが合成されているチップ上の領域は、一般に、最も低い強度の蛍光非特異的結合を示す。光分解されていない表面のリンカー部位は、ＥＤＡと反応して、遊離の末端ヒドロキシ基の混合物ならびにアミノエチルカルバモイル残基を生成することが公知である。後者は、そのように処理された表面領域に正味の正電荷を与える。これは、負であるアレイのプローブ含有領域と対照をなす。本発明のいかなる特定の理論に縛られることを望まないが、これらの領域での正味の正電荷は、非特異的結合へ寄与すると考えられる。
【００３６】
（ＩＩＩ．固体支持体）
固体支持体は、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらの任意の組み合わせであり得、粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、管状材料、球体、容器、毛管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドなどとして、存在する。固体支持体は、好ましくは平坦であるが、代替の表面外形を取り得る。例えば、固体支持体は、隆起したまたは陥没した領域を含み得、ここで、合成が起こる。いくつかの実施態様において、固体支持体は適切な光吸収特性を提供するように選択される。例えば、支持体は、重合したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、機能化したガラス、溶融シリカ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＮ4、アルミナまたは二酸化ケイ素のような金属酸化物フィルム、修飾したシリコンあるいは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデン二フッ化物、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはそれらの組み合わせのような種々のゲルまたはポリマーのいずれか１つであり得る。他の適切な固体支持体材料は、当業者にとって容易に明らかである。好ましくは、固体支持体の表面は、反応性基を含み、この反応性基は、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシ、チオールなどであり得る。より好ましくは、この表面は、光学的に透明であり、そして、シリカ表面上に見出されるような表面Ｓｉ−ＯＨ官能性を有する。
【００３７】
固体支持体の表面は、本質的に２つの領域、すなわち、複数の指定された領域（本明細書中で公知の領域とも呼ばれる）、および複数の保護領域に、分割される。プローブは、複数の指定された領域の各々において付着されるかもしくは合成されるか、付着されたかもしくは合成されたか、または今後付着されるかもしくは合成される。プローブは、任意のメカニズムによって付着され得るか、または合成され得る。例えば、比較的長いプローブが支持体にそのまま付着され得る。あるいは、プローブは、成分の段階的取り込みによって支持体上に合成され得る。表面の保護領域は、固体支持体の表面上の指定された領域から区別される。表面上の複数の保護領域の各々は、オリゴヌクレオチドが結合も合成もされておらず、そしてそこに除去可能な保護基を付着させた領域である。各保護領域の保護基は、好ましくは、標準の感光性または化学的に除去可能な保護基であり、これらの保護基は、市販され、そして放射または化学的条件に対する曝露によって除去可能であることが公知である。このような保護基の例として、ＦＭＯＣ、ＤＭＴ、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＰＯＣ、ＢＯＣ、ＡＬＬＯＣ、ｔ−ブチルエステルおよびｔ−ブチルエーテルが挙げられる。現在、保護領域のための好ましい保護基は、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＶＯＣまたはＭｅＮＰＯＣ基のような感光性保護基である。
【００３８】
本発明の１実施態様に従って、固体支持体の表面は、その表面上でのオリゴヌクレオチドの合成の前に、固体支持体の表面上の指定された領域の各々におけるリンカーモノマーの付着によって誘導体化され得る。リンカーモノマーを用いた誘導体化は、本発明の方法を実施するのに必須ではない。特に、ポリアニオン鎖が固体支持体の表面の指定された領域に付着される実施態様において、基板は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの合成の前にリンカーモノマーを用いて誘導体化されない。
【００３９】
固体支持体の表面がリンカーモノマーを用いて誘導体化される実施態様において、各オリゴヌクレオチドが、上記の一般的技術の適用によってリンカーモノマー上に合成される。このリンカーモノマーは、固体支持体を、一方の末端上に基板付着基を有し、遠位末端（表面から離れている）上に反応性部位を有する誘導体化試薬と反応させることによってこの固体支持体の表面に付着され、反応性部位の均一な分布を有する支持体表面を提供する。次いで、この誘導体化した表面をリンカー分子と接触させられる。このリンカー分子の各々は、誘導体化表面上の反応性部位と共有結合し得る反応性基を有する。リンカー分子は、さらに、保護基で保護される官能基を有する。接触は、固体支持体の表面へリンカー分子を結合するのに十分な時間をかけて行われる。
【００４０】
誘導体化試薬は、例えば、（ポリ）トリフルオロクロロエチレン表面を有する固体支持体を使用する炭素−炭素結合を介して、またはより好ましくは、シロキサン結合（例えば、固体支持体としてガラスまたはシリコン酸化物を使用する）によって、固体支持体に付着され得る。支持体の表面とのシロキサン結合は、トリクロロシリル基またはトリアルコキシシリル基を有する誘導体化試薬の反応を介する１実施態様において形成される。
【００４１】
使用される特定の誘導体化試薬は、特定のレセプター、タンパク質または薬物への、付着したオリゴヌクレオチドの提示を改良するために、その親水性／疎水性特性に基づいて選択され得る。上記のように、固体支持体への結合の前に、誘導体化試薬は、一方の末端に基板付着基を有し、そして他方の末端に反応性部位を有する。この反応性部位は、リンカーモノマー、ヌクレオチドモノマー、または負に荷電したホスフェートモノマーへの付着に対して適切である基である。例えば、シリカ表面への付着に対して適切な基として、トリクロロシリル官能基およびトリアルコキシシリル官能基が挙げられる。リンカーモノマー、ヌクレオチドモノマーまたは負に荷電したホスフェートモノマーへの付着に対して適切である基として、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボン酸、エステル、アミド、エポキシド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。さらに、合成の際の使用において、本明細書中で使用される誘導体化試薬は、典型的に、誘導体化試薬の遠位末端または終結末端（固体支持体の反対側）上の反応性部位に付着した保護基を有する。好ましい誘導体化試薬として、アミノアルキルトリアルコキシシラン、アミノアルキルトリクロロシラン、ヒドロキシアルキルトリアルコキシ−シラン、ヒドロキシアルキルトリクロロシラン、カルボキシアルキルトリアルコキシシラン、ポリエチレングリコール、トリエトキシシラン、エポキシアルキルトリアルコキシシラン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４２】
リンカーモノマーが各々の指定された領域において使用される実施態様において、誘導体化した表面は、リンカーモノマーと接触される。このリンカーモノマーは、固体支持体の誘導体化した表面上の反応性部位と反応性がある１つの中心を有する。さらに、リンカーモノマーは、保護基で保護され、そして、後に合成開始部位として役立ち得る官能基を有する。
【００４３】
本発明で使用されるリンカーモノマーは、好ましくは、そこで合成される任意のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに曝される標的分子と自由に相互作用するのを可能にするのに十分な距離であり得る。リンカーモノマーは、それらのレセプターに対するリガンドの十分な曝露を提供するために、３〜５０原子長であるべきである。典型的には、リンカーモノマーは、アルキレン（（−ＣＨ2）n−）、アリールアセチレン、２〜１４個のモノマーユニットを含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、ジオール、二酸、アミノ酸、ペプチド、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施態様において、リンカーモノマーはポリヌクレオチドであり得る。使用される特定の連結分子は、その親水性／疎水性特性に基づいて選択され得、特定のレセプター、タンパク質または薬物への、そこで合成されるポリマーの提示を改良する。上記のように、誘導体化した表面への結合の前に、リンカーモノマーは、それぞれの末端に適切な官能基、すなわち、誘導体化表面上の反応性部位への付着に適切な一方の基、およびおよび合成開始部位として適切な他方の基を有する。例えば、誘導体化した表面への結合に適切な基として、アミノ、ヒドロキシ、チオール、カルボン酸、エステル、アミド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。さらに、オリゴヌクレオチドアレイまたはライブラリの合成の際の後の使用のために、本明細書中で使用されるリンカーモノマーは、典型的に、リンカーモノマーの遠位末端または終結末端（固体支持体と反対側）上の官能基に結合される保護基を有する。
【００４４】
リンカーモノマーは、表面の正味の疎水性または親水性の性質に寄与する。例えば、リンカーモノマーが−（ＣＨ2）n−のような炭化水素鎖を含む場合、湿潤性を軽減する効果がある。ポリオキシエチレン（−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−）鎖、またはポリアミド（−（ＣＨ2ＣＯＮＨ）n−）鎖を含むリンカーモノマーは、その表面をより親水性にし、これによって湿潤性が向上する傾向がある。１つの好ましい実施態様において、リンカーモノマーは、保護基を有するポリエチレングリコール分子を含む。リンカーモノマー上の保護基は、好ましくは、市販されそして典型的な化学的条件下で除去可能であることが公知である基を含む、標準の感光性または化学的に除去可能な保護基である。このような保護基の例として、ＦＭＯＣ、ＤＭＴ、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＰＯＣ、ＢＯＣ、ＡＬＬＯＣ、ｔ−ブチルエステル、およびｔ−ブチルエーテルが挙げられる。現在、リンカーモノマーに対して好ましい保護基は、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＶＯＣ、ＭｅＮＰＯＣ、またはＤＭＴ基のような感光性基、あるいは化学的に除去可能な基である。
【００４５】
ＩＶ．一般的固相合成技術
オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体上の指定された領域にて合成され得、光指向性方法、フローチャネルおよびスポット法、ピンに基づく方法およびビーズに基づく方法を含む種々の従来の技術のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドアレイを製造する。固相合成のこれらの方法は、例えば、米国特許第５，６２４，７１１号および同第５，６７７，１９５号に詳細に記載され、これらの開示は、本明細書中において、全体を通して、参考として援用される。これらの技術の幾つかは、本明細書中以下で簡潔に記載される。
【００４６】
「光指向性」方法（ＶＬＳＩＰＳTM法として公知である方法の系統内の１技術である）は、米国特許第５，１４３，８５４号に記載され、これは以前に参考として援用された。’８５４特許で議論される光指向性方法は、基板または固体支持体の指定された領域を活性化する工程、および次いでこの表面を予め選択されたモノマー溶液と接触させる工程を包含する。この指定された領域は、典型的にはマスクを通して示される（たいてい、一体化した回路作製に使用されるフォトリソグラフィー技術の様式で）光源を用いて活性化され得る。表面の他の領域は不活性のままである。なぜなら、それらは、照明からのマスクによって遮蔽され、従って化学的に保護されたままであるからである。この様式で、光パターンは、基板のどの領域が所定のモノマーを反応するかを規定する。種々の組の、予め規定された、指定された領域を活性化する工程、および種々のモノマー溶液を基板と接触させる工程とを繰り返すことによって、ポリマーの様々なアレイが基板上に製造される。当然のことながら、この基板から未反応モノマー溶液を洗浄する工程のような他の工程は、必要に応じて使用され得る。
【００４７】
単一の基板上でのライブラリー合成に適用され得るさらなる方法は、米国特許第５，３８４，２６１号および同第５，６７７，１９５号に記載され、これらは、全ての目的のために、本明細書中において参考として援用される。これらの出願に開示される方法では、試薬は、（１）予め規定された領域上に規定されたチャネル内で流動する工程または（２）予め規定された領域上で「スポット」する工程のいずれかによって支持体に送達される。しかし、他のアプローチ、ならびにスポットする工程および流動する工程、またはフォトレジストの使用が使用され得る。それぞれの例において、モノマー溶液が種々の反応部位に送達される場合、表面のある活性化された領域は、他の領域から機械的に分離される。
【００４８】
本発明の化合物およびライブラリーに適用される典型的な「フローチャネル」法は、概して、以下のように記載され得る。様々なポリマーシーケンスは、適切な試薬が流動するかまたは適切な試薬が設置される支持体の表面上にフローチャネルを形成する工程によって、基板または固体支持体の指定された領域にて合成される。例えば、モノマー「Ａ」が選択された領域の第１グループ内の基板に結合されると想定。必要ならば、選択された領域の全てまたは一部内の基板の表面の全てまたは一部が、例えば、全てまたは幾つかのチャネルを通して適切な試薬を流動する工程、または基板全体を適切な試薬で洗浄する工程によって結合のために活性化される。支持体の表面上のチャネルブロックの設置後、モノマーＡを有する試薬が全てまたは幾つかのチャネルを通して流入するかまたはそのチャネル内に設置される。これらのチャネルは第１の指定された領域との流体接触を提供し、このことによって、第１の指定された領域内で、直接的にまたは間接的に（スペーサーを介して）表面上にモノマーＡを結合する。
【００４９】
その後、モノマーＢが第２の指定された領域にカップリングされ、それらの幾つかが第１の指定された領域に含まれ得る。この第２の指定された領域は、支持体の表面上でのチャネルブロックの転換、回転、または置換を介して；選択したバルブの開閉を介して；または一層の化学物質またはフォトレジストの累積を介して第２フローチャネルと流体接触する。必要ならば、少なくとも第２の領域を活性化するための工程が実施される。その後、モノマーＢは第２フローチャネルを介して流入されるかまたは第２フローチャネル内に設置され、第２の指定された位置にてモノマーＢを結合する。この特定の例において、プロセシングのこの段階で支持体に結合した得られたシーケンスは、例えば、Ａ、Ｂ、およびＡＢである、このプロセスは、支持体の表面上の既知の位置において所望の長さのシーケンスの莫大なアレイを形成するために繰り返される。
【００５０】
基板が活性化された後、モノマーＡは、幾つかのチャネルを通して流入され得、モノマーＢは、他のチャネルを通して流入され得、モノマーＣは、さらに他のチャネルなどを通して流入され得る。この様式において、多くのまたは全ての反応領域がモノマーと反応され、後に、チャネルブロックが移動されなければならないか、または基板が洗浄されおよび／または再活性化されなければならない。多くのまたは全ての有効な反応領域を同時に使用することによって、洗浄する工程および活性化工程の数が最小化され得る。
【００５１】
当業者は、チャネルを形成する、または別に支持体の表面の一部を保護する代替の方法が存在することを理解し得る。例えば、いくつかの実施態様に従って、親水性または疎水性コーティングのような保護コーティング（溶媒の性質に依存する）が、基板の保護されるべき部分にわたって利用され、時に、このコーティングは他の領域で反応物溶液によって湿潤を容易にする材料と組み合わされる。この様式では、流入する溶液はそれらの指定された流路の外側を通過することをさらに防がれる。
【００５２】
本発明の化合物およびライブラリを調製する「スポットティング」法は、フローチャネル法とほぼ同じ様式で実行され得る。例えば、モノマーＡが、適切に活性された反応領域の第１グループに送達され得、そしてカップリングされ得る。その後、モノマーＢは、活性化された反応領域の第２グループに送達され得、そして第２グループと反応され得る。上記のフローチャネル実施態様と異なり、指定された領域内で、それらの比較的少量を（流入するよりむしろ）直接堆積する工程によって反応物が送達される。当然のことながら、いくつかの工程において、支持体の表面全体が溶液で噴霧され得るか、または他の方法でコーティングされ得る。好ましい実施態様において、ディスペンサーが領域間を移動し、各工程において必要な量のモノマーのみ堆積する。典型的なディスペンサーとして、表面にモノマー溶液を送達するためのマイクロピペットおよび表面に対するマイクロピペットの位置を制御するためのロボットシステム、またはインクジェットプリンタが挙げられる。他の実施態様において、ディスペンサーは、一連のチューブ、マニホルド、一列に並んだピペットなどを備え、その結果、種々の試薬が同時に反応領域に送達され得る。
【００５３】
本発明の化合物およびライブラリの調製の有用な別の方法として、「ピンに基づく合成」が挙げられる。この方法は米国特許第５，２８８，５１４号で詳細に記載され、これは本明細書中にて以前に参考として援用された。この方法は、複数のピンまたは他の伸長物を有する基板を利用する。ピンは、トレイ中の個々の試薬容器にそれぞれ同時に挿入される。共通の実施態様において、一列に並んだ９６ピン／容器が利用される。
【００５４】
各トレイは、個々のピン上の特定の化学反応でカップリングするための特定の試薬で充填される。従って、このトレイは、しばしば、異なる試薬を含む。本明細書中で開示される化学は、比較的同様の組の反応条件が各反応を実施するために利用され得るように確立されているため、複数の化学カップリング工程を同時に行うことが可能となる。このプロセスの第１工程において、本発明は、化学カップリング工程が行われる基板の使用を提供する。基板は、必要に応じて、活性部位を有するスペーサーと共に提供される。オリゴヌクレオチドの特定の場合において、例えば、スペーサーは、合成に関連した有機環境および結合研究と関連した水性環境において使用され得る広範な分子から選択され得る。適切なスペーサーの例は、例えばメトキシ基およびエトキシ基と置換されたポリエチレングリコール、ジカルボン酸、ポリアミンおよびアルキレンである。さらに、スペーサーは、遠位末端に活性部位を有する。この活性部位は必要に応じて始めに保護基によって保護される。有用である広範な種々の化学的に除去可能な保護基の中には、ＦＭＯＣ、ＢＯＣ、ｔ−ブチルエステル、ｔ−ブチルエーテルなどがある。種々の例示的な保護基は、例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載され、これは本明細書中において参考として援用される。いくつかの実施態様において、スペーサーは、例えば酸または塩基に対する曝露によって開裂可能な機能を提供し得る。
【００５５】
固体支持体におけるポリマーおよび小リガンド分子の合成に有用ななお別の方法は、「ビーズに基づく合成」である。ビーズに基づく合成のための一般的なアプローチは、米国特許第５，５４１，０６１号に記載され、この開示は、本明細書中に参考として援用される。
【００５６】
ビーズ上のオリゴヌクレオチドのような分子の合成のために、大量のビーズが、容器中の適切なキャリア（例えば、水）中に懸濁される。このビーズは、活性部位を有する任意のスペーサー分子と共に提供される。活性部位は、任意の保護基によって保護される。
【００５７】
合成の第一工程では、ビーズを、複数の容器に、カップリングさせるために分割する。この簡単な説明のため、容器の数を３つに限定し、モノマーをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦと記す。次いで、保護基を取り除き、そして合成されるべき分子の第一部分を、３つの容器の各々に添加する（すなわち、Ａを容器１に添加し、Ｂを容器２に添加し、そしてＣを容器３に添加する）。
【００５８】
その後、種々のビーズを、過剰の試薬で適当に洗い流し、そして１つの容器中に再混合する。再度、最初に利用される多数のビーズによって、同様に、多数のビーズが、容器中に無作為に分散され、その各々は、その表面上に、合成されるべきモノマーの特定の第一部分を有することが認識される。
【００５９】
その後、種々のビーズを再度、３つの容器の別の群において、カップリングさせるために分割する。第一の容器中のビーズを脱保護し、そして第二のモノマー（Ｄ）に曝露し、一方、第二および第三の容器中のビーズを分子部分ＥおよびＦのそれぞれにカップリングさせる。従って、分子ＡＤ、ＢＤ、および、ＣＤが、第一の容器中に存在するが、一方、ＡＥ、ＢＥ、およびＣＥが、第二の容器中に存在し、そして分子ＡＦ、ＢＦ、およびＣＦが第三の容器中に存在する。しかし、各ビーズは、その表面上に、単一のタイプの分子のみを有する。従って、第一の部分Ａ、Ｂ、Ｃと第二の部分Ｄ、Ｅ、Ｆとから形成される可能な分子の全てが、形成されている。
【００６０】
次いで、ビーズを１つの容器中に組み入れ、そしてポリマー分子の合成を完了するために、さらなる工程を行う。好ましい実施態様では、ビーズは、特定の二本鎖オリゴヌクレオチドに独特の認識タグまたは各ビーズ上に存在するプローブでタグ化される。合成ライブラリーにおける使用のための認識タグの完全な記載は、欧州特許公開第０６０４５５２号（１９９２年９月１６日出願）に提供される。
【００６１】
固体支持体上のポリマー合成のための一般的な光指向性方法は、固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための、現在、１つの好ましい方法である。この一般的な技術における変法もまた、米国特許第５，６２４，７１１号（その全体が、本明細書中において参考として既に援用されている）において記載される。簡潔には、オリゴマー合成のためのこの技術は、保護基が、指定された領域の各々に位置するように感光性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）保護基を付着させた、指定された領域を有する固体支持体を構成することを包含する。上述の一般方法の節で記載のフォトリソグラフィー技術を用いて、感光性保護基は、１つの指定された領域から除去され得、そして化学的に除去可能な保護基を有するヌクレオチドモノマーが、モノマーカップリングのためのホスホルアミダイト化学を使用して付着される。本発明のこの特定の実施態様は、モノマーカップリングのためにホスホルアミダイト化学の使用を例示するが、モノマーはまた、Ｈ−ホスホネート法または当業者に公知の他のカップリング方法を用いて、増大中のオリゴマーに付加され得る。
【００６２】
標準的な化学的に除去可能な保護基には、市販の基、および代表的な化学条件（例えば、酸、塩基、酸化剤、還元剤もしくは他の化学薬剤への曝露）下で除去可能であることが公知である基が含まれる。このような保護基の例としては、ＦＭＯＣ、ＤＭＴ，ＢＯＣ，ｔ−ブチルエステルおよびｔ−ブチルエーテルが挙げられる。このような保護されたヌクレオチドモノマーの付着後、保護基は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ，１９９１（本明細書中に参考として以前に援用された）に記載される条件下で除去される。化学的に除去可能な保護基で以前に保護された反応性官能基は、次いで、例えば、以下の式の誘導体を用いて、感光性保護基で再保護される：
Ｒ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｘ
ここで、Ｒは、感光性部分（例えば、ｏ−ニトロベンジル、（２−ニトロベラトリルオキシカルボニル、α−メチル−２−ニトロベラトリルオキシカルボニル、２−ニトロピペロニルオキシカルボニル、α−メチル−２−ニトロピペロニルオキシカルボニル、２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル、α−メチル−２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル、２−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−メチル２−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、１−ピレニルメチルオキシカルボニル、９−アントラセニルメチルオキシカルボニル、３’−メトキシベンゾイニルオキシカルボニル、３’，５’−ジメトキシベンゾイニルオキシカルボニル、７−ニトロインドリニルオキシカルボニル、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルオキシカルボニル、５，７−ジニトロインドリニルオキシカルボニル、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニルを含む）であり、そしてＸは、適切な脱離基（例えば、Ｃｌ、Ｆ、ペンタフルオロフェノキシ、ｐ−ニトロフェノキシ、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、アダマンタンカルボキシ、またはテトラゾリル）である。好ましくは、誘導体は、ＭｅＮＰＯＣ、ＭｅＮＶＯＣ、またはＮＶＯＣ基の適切に活性化された誘導体である。適切に活性化された誘導体の例は、ＭｅＮＰＯＣの混合された無水誘導体（例えば、ＭｅＮＰＯＣ塩化物とトリエチルアンモニウムピバロエート（ｐｉｖａｌｏａｔｅ）との反応により調製されたＭｅＮＰＯＣピバロエート）またはＭｅＮＰＯＣのカーボネート（例えば、ＭｅＮＰＯＣ塩化物とペンタフルオロフェノールとの反応により産生されたカーボネート）のような試薬を含む。
【００６３】
このような試薬を用いる表面官能基の再保護は、代表的には、非求核塩基を含む有機溶媒（例えば、２，６−ルチジン、ピリジン、トリエチルアミン、またはジイソプロピルエチルアミン）中で実施される。いくつかの実施態様では、求核触媒（例えば、Ｍ−メチルイミダゾール、ヒドロキシベンゾトリアゾール、または４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン）もまた、再保護工程の速度および効率のさらなる増大を提供するように含まれる。
【００６４】
感光性保護基を付加した後、ＶＬＳＩＰＳサイクルは、フォトリソグラフィック脱保護、続いてさらなるヌクレオチドモノマーのカップリング、保護基置換などを用いて、所望のオリゴマーが完成するまで継続され得る。好ましくは、このサイクルは、１〜１２０回繰り返される。
【００６５】
例示される感光性脱保護基（ＭｅＮＰＯＣ）は、ＮＶＯＣのような別の感光性保護基、または従来公知の他の感光性保護基で置換され得る。一旦、化学的に除去可能な保護基が除去されると、感光性保護基が、混合された保護基の無水物を用いて添加され得る。本方法は、従来のＶＬＳＩＰＳ合成を超える特定の利点を提供する。例えば、化学的に除去可能な保護基を有する多数のモノマーは市販されている。
【００６６】
リンカーモノマーが、指定された領域に付着された実施態様では、オリゴヌクレオチド合成のための前述の方法が等しく適用可能である。例えば、ヌクレオチドモノマーを反応させ、それによりリンカーモノマーに付着される。これは、各リンカーモノマー中の化学的に除去可能な保護基を感光性保護基で置換すること、および以前のヌクレオチドモノマーへの各ヌクレオチドモノマーの付着のために上述した光指向性方法を用いることによって感光性保護基の位置でヌクレオチドモノマーを付着させることによる。上述のように、各ヌクレオチドモノマーは、化学的に除去可能な保護基を有する。これは、感光性保護基での置換および光指向性方法を用いる反応によって、別のヌクレオチドモノマーの付着を可能にする。ヌクレオチドモノマー上のいかなる残存する官能基も、キャップまたは保護される。
【００６７】
一般的な光指向性技術についての別の変法は、１９９７年１１月１３日に出願された同時係属出願第０８／９６９，２２７号に記載の方法を包含し、その記載事項は、あらゆる目的のために、その全体が、参考として援用される。簡潔には、この方法は、表面でのオリゴヌクレオチドの製造のために、化学的に除去可能な保護基（例えば、上記の保護基）を有するヌクレオチドモノマーを用いる。本方法に従って、放射シグナルは、例えば、光活性化剤（これは、光活性化触媒（ＰＡＣ）である）を含む触媒系によって検出される。光活性化剤は、自己触媒剤（または「増強剤」）を活性化し、これは、後続の化学反応において、光子の有効量子収量を増大させる。このような後続の反応は、パターン化されたアレイの合成における化学的に除去可能な保護基の除去を包含する。
【００６８】
特定の実施態様では、光酸生成因子（ｐｈｏｔｏａｃｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）（すなわち、光活性化酸触媒（ＰＡＡＣ））が照射される。光酸生成因子から生じた得られた酸は、自己触媒剤を活性化し、酸触媒反応を受け、それ自体、付着された分子またはオリゴマーから酸不安定保護基を除去する酸を生成させる。
【００６９】
本方法の１つの実施態様によれば、化学的に除去可能な保護基を有するモノマーが基材の表面に提供される。モノマーは、リンカーモノマー、ヌクレオチドモノマー、または負に荷電したリン酸単位および保護基を有するモノマーであり得る。光活性化剤および自己触媒剤を含む活性化層（または「触媒系」）もまた、表面に提供される。基材の表面上の選択された領域のセットは、周知のリソグラフ方法（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｌ．Ｆ．、Ｗｉｌｌｓｏｎ、Ｃ．Ｇ．、およびＢｏｗｄｅｎ、Ｍ．Ｊ．、ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＯ ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２１２−２３２頁、１９９４（これは、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）において議論される）を用いて放射に曝露される。
【００７０】
領域選択照射により活性化された光活性化剤は、自己触媒剤の反応を開始させるように作用する。自己触媒剤は、第一の選択された領域中で基材に付着された分子またはオリゴマーから保護基を除去する少なくとも１つの生成物を生成する。好ましくは、自己触媒剤は、触媒様式で保護基を除去し得る。次いで、基材は、洗浄されるか、またはそうでなければ、付加される次のモノマーと接触させられ、次いで以前に付加されたモノマーの曝露された官能基と反応する。
【００７１】
その後、選択された領域の第二のセットが、放射に曝露される。照射開始反応は、選択された領域の第二のセット中の分子上の保護基を除去する。この基材は、次いで、添加される次のモノマーと接触させられる。このモノマーは、曝露された官能基との反応のために化学的に除去可能な保護基を有する。このプロセスは、所望の長さおよび所望の化学配列のポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）が得られるまで、モノマーを選択的に適用することを繰り返される。次いで、保護基は、必要に応じて除去され、配列は、その後、必要に応じてキャップされる。側鎖保護基はまた、存在する場合、必要に応じて除去される。
【００７２】
本方法の他の実施態様では、化学的に除去可能な保護基は、塩基、酸化剤、または還元剤への曝露によって除去される。各実施態様において、光活性化剤および自己触媒剤は、所定の保護基の除去のための適切な化学試薬が生成され、そしてそれにより保護基が除去されるようなものである。塩基、酸化剤、または還元剤の生成は、フォトレジストの分野で従来公知である光活性化剤を使用し、そして酸触媒を生成する例において上記で提供した指針を適用して達成され得る。
【００７３】
基材上でオリゴヌクレオチドポリマーを生成する、一般的な光指向性方法に対するなお別の改善は、Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｂｒｏｃｋらに発行された米国特許第５，６５８，７３４号に記載される。この開示内容は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。この方法もまた、表面でのオリゴヌクレオチドの生成のために、化学的に除去可能な保護基を有するヌクレオチドモノマーを用いる。簡潔には、本方法は、基材に付着される基盤分子（例えば、化学的に除去可能な保護基を有する第一のヌクレオチドモノマー、または化学的に除去可能な保護基を有するリンカーモノマー、または化学的に除去可能な保護基を有するポリアニオン鎖）の層上に展開可能なポリマーの層をコーティングすることを包含する。基盤分子は、リンカーモノマーまたはポリアニオン鎖を介して基材に付着され得る。この方法において使用するための適切なポリマーとしては、可溶性ポリイミドおよびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）が挙げられる。展開可能なポリマーは、適切なコーティング溶媒（例えば、アニソール、水（ＰＶＡに対して）、Ｎ−メチルピロリドン、またはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）中に溶解される。
【００７４】
展開可能なポリマーは、周知技術（例えば、スピンもしくはスプレーコーティング、またはドクターブレード処理）を用いて基盤分子の層上にコーティングされ得る。好ましくは、次いで、ポリマー層が加熱されて、キャスティング溶媒を除去する。
【００７５】
その後、ポリマー性放射感受性レジストが、展開可能なポリマー層の適用に類似の様式で、展開可能なポリマー層上にコーティングされる。好ましいレジストは、架橋ネガティブトーンレジスト（ｃｌｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｏｎｅ ｒｅｓｉｓｔ）であり、これは、リソグラフパターンをレジストから展開可能なポリマーを介して転写させるために利用される有機溶媒に対して抵抗性である。適切なレジストとしては、架橋エポキシレジスト、環状化ゴムレジスト（例えば、ＫＴＦＲ）、ポリビニルシンナメート（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｉｎｎａｍａｔｅ）レジスト（例えば、ＫＰＲ）、およびＷ．ＤｅＦｏｒｅｓｔ、ＰＨＯＴＯＲＥＳＩＳＴ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７５およびＷ．Ｍｏｒｅａｕ、ＳＥＭＩＣＯＮＤＵＣＴＯＲ ＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８８に記載のレジストが挙げられる。
【００７６】
適用後、レジスト層の選択領域は、放射に曝露され、そしてレジスト中の潜在画像は、適切な現像溶媒（これらの多くは、フォトレジストリソグラフィーの分野において公知である）を用いて現像される。放射曝露の画像は、適切な溶媒の使用によって、レジスト層および展開可能なポリマー層を介して下層の基盤分子層に現像される。このように下層の基盤分子層の剥き出しにされた部分が、次いで、処理されて、曝露された分子から化学的に除去可能な保護基を除去し、そしてそれにより、曝露された基盤分子を活性化させる。好ましくは、曝露された基盤分子は、各分子から保護基を開裂するために、溶液で処理される。適切な開裂溶液の例としては、強酸、およびアンモニア、アミン、もしくは他の強塩基の溶液、ならびに酸化剤および還元剤が挙げられる。
【００７７】
曝露された基盤分子上の化学的に除去可能な保護基の除去後、レジスト層の残りの部分および展開可能なポリマー層が除去される。続いて、次のモノマーが適用され、これは、曝露された、保護されない、基盤分子に結合する。基盤分子への第二のモノマーの付加により生成されたオリゴマーは、次いで、プロセスの次の反復のための基盤となる。これらの工程は、所望の数のモノマー単位が接続されてポリマーを提供するまで、繰り返される。
【００７８】
前出の方法の各々は、固体支持体の表面上でのオリゴヌクレオチドの生成のために当業者によって用いられ得る一般的な技術を例示する。当業者に明らかであるように、モノマー上で種々のタイプの保護基を利用することもまた可能である。例えば、連結モノマーは、感光性保護基を利用し得るが、一方、ヌクレオチドモノマーは、化学的に除去可能な保護基を利用する。保護領域上の保護基は、化学的に除去可能な保護基であり得、一方、リンカーおよびヌクレオチドモノマー上の保護基は感光性保護基である。前出の方法のいずれにおいても、全ての保護基が同一でなければならないということは必要ない。前出の技術のいずれかが、必要とされるような異なる活性化因子の組み合わせにより、異なるタイプの保護基を除去するために用いられ得る。前出の方法のこのような類似の組み合わせは、当業者の範囲内である。
【００７９】
（ＶＩ．表面修飾）
１つの実施態様においてオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための本発明の方法は、固体支持体の表面修飾を包含する。オリゴヌクレオチドアレイへの標的分子の非特異的結合を減少させるために、表面修飾のいくつかの方法が利用され得る。
【００８０】
（保護領域からの保護基の除去）
本発明の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、固体支持体の表面上の保護領域で保護基を除去することにより減少される。表面の保護領域上の保護基は、複数の保護領域の各々から保護基を除去するために、保護領域の各々を適切な活性化因子に曝露することにより除去され得る。オリゴヌクレオチド合成に使用するための上記に列挙された活性化因子は、保護領域からの保護基の除去のために用いられ得る。
【００８１】
いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、複数の保護領域の各々からの保護基の除去が、固体支持体の表面上の極性の変化のために、オリゴヌクレオチドアレイへの標的分子の非特異的結合を減少させると考えられる。この変化は、これらの保護基の除去によって引き起こされる。より詳細には、保護基の除去は、非特異的結合における寄与因子であると考えられる、これらの保護基が有する正電荷を除去する。この正電荷の除去は、それにより、非特異的結合への１つの寄与因子を除去する。
【００８２】
（保護領域上の保護基の置換）
本発明の別の実施態様において、固体支持体の表面は、保護領域上の保護基を、負に荷電したリン酸残基で置換することにより改変される。この表面の保護領域上の保護基は、有利には、複数の保護領域をアクチベータに曝して活性化部位を生成すること、およびこの活性化部位を、負に荷電したリン酸残基を複数の保護領域の各々に共有結合する化合物と反応することにより、負に荷電したリン酸残基で置換され得る。採用されるアクチベータは、オリゴヌクレオチド合成および保護基の除去において使用するために、上記に記載の任意の適切なアクチベータであり得る。活性化部位と反応する化合物は、以下の式Ｉおよび式ＩＩからなる基から選択される：
【００８３】
【化５】
【００８４】
【化６】
ここで、ＤＭＴはジメトキシトリチル保護基、Ｘは塩基で除去可能な保護基（例えば２−シアノエチル）、およびｉＰｒ2Ｎはジイソプロピルアミノ保護基である。
【００８５】
有利なことに、式ＩまたはＩＩの化合物は市販されている。式ＩまたはＩＩの範囲内の適切な化合物の例は、Ｘが２−シアノエチルである規定された化合物を含むがこれに限定されない。これらの化合物は、表面の保護領域上の保護基を置換する方法における使用に好適である。これら化合物の活性化部位との反応は、固体支持体の表面上の活性化部位を、溶液相中で、式ＩまたはＩＩの化合物の上記保護領域への共有結合が起こるに十分な時間、このような化合物に接触することにより実施され得る。この方法における使用に適切な試薬は、無水アセトニトリル中の０．４５Ｍテトラゾールを含むがこれに限定されない。好ましくは、式ＩまたはＩＩの化合物は、約０．５分〜約１５分の期間の間活性化部位と反応させる。採用される技法は、オリゴヌクレオチド合成について上記に記載の技法と同じかまたは類似である。
【００８６】
本発明の１つの実施態様では、基板の表面は、基板の表面上の指定領域および保護領域の１つまたは両方で、シチジンの単層を提供するように改変される。
【００８７】
別の実施態様では、この表面の保護領域上の保護基は、ポリアニオン鎖の付着により置換され得る。この固体支持体の表面上の保護領域および指定領域のいずれかまたは両方へのポリアニオン鎖の付着のための方法を、以下に記載する。
【００８８】
（ポリアニオン鎖の付着）
本発明の別の方法によれば、固体支持体の表面は、ポリアニオン鎖で誘導体化される。このポリアニオン鎖は、この表面の指定領域（オリゴヌクレオチドが付着する場所）で、リンカーモノマーの代わりに付着され得る。この実施態様では、指定領域の各々でリンカーモノマーを提供するよりむしろ、ポリアニオン鎖が代わりに提供され、そしてオリゴヌクレオチドが、付着するか、またはこの表面の指定領域でポリアニオン鎖の各々上で合成される。別の実施態様では、このポリアニオン鎖は、この固体支持体の表面上の保護領域の各々でのみ付着する。この実施態様では、この表面の指定領域は、好ましくは、上記のようなそれに付着したリンカーモノマーを有する。なお第３の実施態様では、ポリアニオン鎖は、ｉ）指定領域の各々およびｉｉ）保護領域の各々の両方に付着され得る。このポリアニオン鎖の、この固体支持体の表面上の指定領域および保護領域のいずれかまたは両方への付着は、ハイブリダイゼーションアッセイの間に標的分子のオリゴヌクレオチドプローブへの非特異的結合を低減する効果を有する。本発明の方法の１つの好適な実施態様では、ｉ）指定領域およびｉｉ）保護領域の少なくとも１つが、それに付着したポリアニオン鎖を有し、その結果この固体支持体の表面が指定領域および保護領域の１つまたは両方でポリアニオン鎖を含むように改変される。
【００８９】
ポリアニオン鎖は、この表面上の所望の領域（単数または複数）に、所望の領域（単数または複数）でポリアニオン鎖を合成もしくは形成することか、または所望の領域（単数または複数）で予備形成されたポリアニオン鎖を付着することのいずれかにより付着され得る。この固体支持体の表面は、ポリアニオン鎖の付着のために、リンカーモノマーの付着のために上記で論議した様式で、誘導体化試薬を利用することにより調製され得る。第１の実施態様では、このポリアニオン鎖は、所望の領域（単数または複数）で、負に荷電したリン酸単位および所望の領域（単数または複数）（すなわち、ｉ）表面上の指定領域の各々またはｉｉ）表面上の保護領域の各々の少なくとも１つまたは両方）に対する保護基を有するモノマーを付着することにより形成され、その結果、このモノマーは、所望の領域（単数または複数）に共有結合する。その後、このモノマーは、アクチベータに曝され、保護基を除去し、それによって第１のモノマーにモノマーの単位を付加するさらなるモノマーと反応し得る活性化部位を生成し、それによってポリマー鎖を構築する。このモノマーをアクチベータに曝して活性化部位を生成する工程およびさらなるモノマーと反応する工程を、０〜２０回繰り返し、所望の領域（単数または複数）でポリアニオン鎖を生成する。
【００９０】
ポリアニオン鎖を構築するために利用されるモノマーは、有利には、負に荷電したリン酸単位および感光性または化学的に除去可能な保護基を有し、そして選択された特定の固体支持体の表面に付着し得る、任意の市販のモノマーを含む。例えば、所望の領域（単数または複数）でポリアニオン鎖を形成するための適切なモノマーは以下の式ＩＩＩで示されるモノマーである：
【００９１】
【化７】
ここでＲ1は、ヌクレオシド成分、デオキシリボース成分、Ｃ1-8アルキレン、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ここでｍは１〜８の整数である）からなる群から選択され；Ｒ2は、ジメトキシトリチル保護基およびＭｅＮＰＯＣ保護基からなる群から選択され；Ｘは、塩基で除去可能な保護基（例えば、２−シアノエチル）；そしてｉＰｒ2Ｎは、ジイソプロピルアミノ保護基である。上記式ＩＩＩの範囲内の好適なモノマーの特定の例は、Ｘが２−シアノエチル、Ｒ1がＣ3または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3−、そしてＲ2がＤＭＴまたはＭｅＮＰＯＣである規定されたポリマーを含むがこれに限定されない。
【００９２】
リンカーおよびヌクレオチドモノマーとともに利用される保護基の場合のように、ポリアニオン鎖を生成するために用いられるモノマーに対して利用される保護基は、化学的に除去され得るかまたは感光性の保護基であり得る。従って、感光性保護基を除去するために利用されるアクチベータは、電子ビーム、γ線、ｘ線、紫外線照射、光、赤外線照射、マイクロ波、電流、電波、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。化学的に除去可能な保護基を除去するために利用されるアクチベータは、酸、塩基、酸化剤、および還元剤からなる群から選択される。１つの好適な実施態様では、この保護基は、感光性保護基であり、そしてモノマーをアクチベータに曝す工程は、光をモノマーの各々に適用し、感光性保護基を除去し、そしてさらなるモノマーとの反応のために活性化部位を生成することを含む。あるいは、予備形成されたポリアニオン鎖を、複数の保護領域の各々で化学的に除去可能な保護基を感光性保護基で置換すること、および保護領域の各々にポリアニオン鎖を付着する光指向性方法を用いることか、またはオリゴヌクレオチド合成のための上記に記載のその他の一般的な技法のいずれかを用いることにより、この保護領域の各々に付着し得る。
【００９３】
予備形成されたポリアニオン鎖が、表面の所望の領域（単数または複数）に付着する実施態様では、この方法は、所望の領域（単数または複数）の各々に、負に荷電したリン酸単位のポリマーのポリアニオン鎖を付着することを含む。所望の領域に付着され得る１つのポリアニオン鎖は、以下の式ＩＩＩ−Ａのポリアニオンである：
【００９４】
【化８】
ここでＲ1は、ヌクレオシド成分、デオキシリボース成分、Ｃ1-8アルキレン、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ここでｍは１〜８の整数であり、そしてｎは０〜１８の整数である）からなる群から選択される。所望の領域に付着され得るポリアニオン鎖のその他の例は、ポリカルボキシセルロース、ポリカルボキシデキストラン、ポリビニルリン酸，ポリビニルホスホン酸、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、およびポリアクリル酸を含むがこれらに限定されない。
【００９５】
適切な予備形成されたポリアニオン鎖は、有利には、市販されるか、または当業者に公知の技法を用いて生産され得る。
【００９６】
予備形成されたポリアニオン鎖の複数の指定領域の各々への付着は、表面の指定領域へのリンカーモノマーの付着のための上記と同じ技法を用いて達成され得る。予備形成されたポリアニオン鎖の複数の保護領域の各々への付着は、保護領域の各々で、化学的に除去可能な保護基をアクチベータに曝し、活性化部位を提供すること、およびこの活性化部位を、予備形成されたポリアニオン鎖と反応させ、ポリアニオン鎖を保護領域の各々に共有結合することにより達成され得る。あるいは、予備形成されたポリアニオン鎖は、複数の保護領域各々で、化学的に除去可能な保護基を、感光性保護基で置換すること、およびこのポリアニオン鎖を保護領域の各々に付着する光指向性方法を用いることにより保護領域の各々に付着され得る。
【００９７】
形成または付着したポリアニオン鎖は、鎖の遠位端（すなわち、固体支持体の表面の反対の末端）に保護基を含む。ポリアニオン鎖が、表面の指定領域に付着する実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブが、上記に記載の光指向性技法を用いてポリアニオン鎖の遠位端に付着する。詳細には、このオリゴヌクレオチドは、ポリアニオン鎖の各々上の保護基をアクチベータに曝し保護基を除去することによりポリアニオン鎖上で合成され得、そして活性化部位を提供する。次いでこの活性化部位を、第１のヌクレオチドモノマーと反応させ得、この第１のヌクレオチドモノマーのポリアニオン鎖鎖への共有結合を提供する。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドを、ポリアニオン鎖の各々の遠位端で化学的に除去可能な保護基の各々を、感光性保護基で置換すること、および第１のヌクレオチドモノマーを、光指向性方法を用いてポリアニオン鎖の遠位端に付着することによるか、またはオリゴヌクレオチド合成のための上記のその他の一般的技法のいずれかを用いてポリアニオン鎖上で合成する。このように、第１のヌクレオチドモノマーを、複数の指定領域の各々でポリアニオン鎖に付着する。さらなるヌクレオチドモノマー単位を、オリゴヌクレオチド合成のための上記の一般的技法を用いてこの第１のヌクレオチドモノマーに付加する。
【００９８】
当業者に明らかなように、２つ以上の先に記載の表面改変方法は、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を低減するために組み合わせられ得る。例えば、基板の表面は、保護領域上の保護基の除去、および指定領域へのポリアニオン鎖の付着により改変され得る。別の例として、基板の表面は、保護領域上の保護基の置換および指定領域へのポリアニオン鎖の付着により改変され得る。なお別の例として、領域の一部分を別に処理し得、その結果、例えば、保護基は保護領域の一部分から除去され、その一方、ポリアニオン鎖は、保護領域の別の一部分で付着される。これらの技法の組み合わせの多くのバリエーションは、これらの例に基づけば、当業者の範囲内にあり、そしてこれらの組み合わせは、それ故本発明により意図される。
【００９９】
（ＶＩＩ．オリゴヌクレオチド改変）
オリゴヌクレオチドアレイに対する標的分子の非特異的結合を低減するための他の方法は、固体支持体の表面上の複数の指定領域の各々に付着したオリゴヌクレオチドを改変することを含む。オリゴヌクレオチド改変は、オリゴヌクレオチドの遠位端または終点端（すなわち、オリゴヌクレオチドが付着される表面の反対の末端。）で保護基を除去するか、または保護基を、負に荷電したリン酸残基またはポリアニオン鎖のいずれかで置換する形態であり得る。
【０１００】
（オリゴヌクレオチドからの保護基の除去）
上記の方法に従って生成されたオリゴヌクレオチドは、その遠位端に保護基を有する。オリゴヌクレオチド（ポリマー）を形成するために付加される各ヌクレオチドモノマーは、オリゴヌクレオチドを構築するプロセスにおいて次の引き続くモノマーの付着を可能にする保護基を有する。従って、付加される最後のモノマーは、その上に保護基を有する。この保護基は、オリゴヌクレオチドの遠位端における保護基である。
【０１０１】
保護基は、表面上のオリゴヌクレオチドの各々をアクチベータに曝し、複数のオリゴヌクレオチドの各々から保護基を除去することによりオリゴヌクレオチドから除去され得る。オリゴヌクレオチド合成における使用のために上記に列挙されたアクチベータは、オリゴヌクレオチドの遠位端からの保護基の除去のために採用され得る。オリゴヌクレオチドからの保護基の除去は、上記に既に記載の理由のために非特異的結合を低減すると考えられる。
【０１０２】
（オリゴヌクレオチド上の保護基の置換）
オリゴヌクレオチドから保護基を単に除去するための代替として、オリゴヌクレオチド上の保護基を、負に荷電したリン酸残基と置換し得る。１つの実施態様に従って、オリゴヌクレオチド上の保護基を、複数のオリゴヌクレオチドをアクチベーターに曝露し、活性化部位を生成し、そしてその活性化部位を、負に荷電したリン酸残基を複数の各オリゴヌクレオチドに共有的に結合する化合物と反応させることにより、負に荷電したリン酸残基と置換し得る。使用されるアクチベーターは、オリゴヌクレオチド合成および保護基の除去における使用のために本明細書中上記に記載される、任意の適切なアクチベーターであり得る。活性化部位と反応される化合物は、式Ｉ：
【０１０３】
【化９】
および、式ＩＩ：
【０１０４】
【化１０】
からなる群より選択される。ここで、ＤＭＴは、ジメトキシトリチル保護基であり、Ｘは、塩基を除去可能な保護基であり、そしてｉＰｒ2Ｎは、ジイソプロピルアミノ保護基である。式ＩおよびＩＩの適切な化合物の例は、上記に提供される。
【０１０５】
活性化部位とこれらの化合物との反応を、オリゴヌクレオチドに対して式ＩまたはＩＩの化合物の共有的結合をもたらすために十分な時間、溶液相中でこのような化合物に対して、オリゴヌクレオチド上の活性化部位を接触させることによって実行し得る。使用される技術は、上記のオリゴヌクレオチド合成について記載される技術と同じであるか、または類似である。
【０１０６】
（ポリアニオン鎖の付着）
別の実施態様において、オリゴヌクレオチド上の保護基を、ポリアニオン鎖の付着によって置換する。
【０１０７】
固体支持体の表面へのポリアニオン鎖の付着について上記に記載される実施態様のように、ポリアニオン鎖を、複数の各オリゴヌクレオチド上にポリアニオン鎖を合成または形成するか、あるいは予め形成されたポリアニオン鎖を各オリゴヌクレオチドに付着することによって、オリゴヌクレオチドに付着し得る。第１の実施態様において、ポリアニオン鎖を、各オリゴヌクレオチドに対して、負に荷電したリン酸単位、および保護基を有するモノマーに付着することによってオリゴヌクレオチド上に形成し、その結果モノマーを、各オリゴヌクレオチドに共有結合させる。その後、このモノマーをアクチベーターに曝露して保護基を除去し、それによって、第１のモノマーにモノマー単位を付加するためにさらなるモノマーと反応し得る活性化部位を生成し、それによって、ポリマー鎖を構築する。モノマーを、生成した活性化部位に対するアクチベーターに曝露し、そしてさらなるモノマーと反応させる工程は、オリゴヌクレオチド上にポリアニオン鎖を生成させるために、０〜２０回繰り返される。使用されるモノマー、アクチベーターおよび方法は、固体支持体の表面上でのオリゴヌクレオチドの形成について、上記で記載される通りである。
【０１０８】
予め形成されたポリアニオン鎖をオリゴヌクレオチドに付着する、この実施態様において、この方法は、所望の領域の各々に、負に荷電したリン酸単位の重合体のポリアニオン鎖（例えば、上記に記載されるポリアニオン鎖）を付着する工程を含む。複数の各オリゴヌクレオチドへの予め形成されたポリアニオン鎖の付着は、保護領域において、固体支持体の表面への予め形成されたポリマーの付着のために、上記のようなポリマーおよび技術を使用して達成され得る。形成または付着されるポリアニオン鎖は、この鎖の遠位末端（すなわち、固体支持体の表面の反対側の末端）において保護基を含む。
【０１０９】
（ＶＩＩＩ．組み合わせ技術）
上記の任意の表面修飾技術またはオリゴヌクレオチド修飾技術の利用は、標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるが、上記の技術はまた、非特異的結合をさらに減少させるために組み合わせられ得る。
【０１１０】
本発明の１つの実施態様において、保護領域上の保護基およびオリゴヌクレオチド上の保護基は、両方とも除去される。
【０１１１】
別の実施態様において、保護領域上の保護基およびオリゴヌクレオチド上の保護基は、両方とも置換される。これらの保護基は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物と反応することによるか、あるいはポリアニオン鎖の付着により、置換され得る。式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応によって表面の保護領域上の保護基を置換すること、ならびポリアニオン鎖の付着によってオリゴヌクレオチド上の保護基を置換することおよびその逆もまた可能である。従って、一貫した様式において、保護領域上およびオリゴヌクレオチド上の保護基を置換する必要はない。
【０１１２】
さらに別の実施態様において、置換技術および除去技術が組み合わせられる。例えば、基材の保護領域上の保護基は除去され得るが、一方オリゴヌクレオチド上の保護基は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物のいずれかとの反応によるか、あるいはポリアニオン鎖の付着により、置換される。同様に、保護領域上の保護基は置換され得るが、一方オリゴヌクレオチド上の保護基は、除去される。
【０１１３】
保護基を除去または置換するいずれかの技術はまた、固体支持体の表面にポリアニオン鎖を付着する方法と組み合わせて使用され得る。すでに上記で記されるように、本発明の１つの実施態様は、以下のいずれかまたは両方にポリアニオン鎖を付着することを含む：ｉ）各指定領域およびｉｉ）固体支持体の表面上の各保護領域。本発明の１つの実施態様において、ポリアニオン鎖は、複数の各保護領域に付着され、そして保護領域に付着されるポリアニオン鎖上の保護基、またはオリゴヌクレオチド上の保護基のいずれか、あるいは両方が、除去される。従って、この実施態様は、各保護領域へのポリアニオン鎖の付着、およびこれらのポリアニオン鎖上の保護基の除去を想定する。この実施態様はまた、各保護領域へのポリアニオン鎖の付着、およびオリゴヌクレオチド上の保護基の除去を想定する。この実施態様内のさらに別の特定の実施例は、アレイであり、ここで、ポリアニオン鎖は各保護領域に付着され、そして保護基はポリアニオン鎖およびオリゴヌクレオチドの両方から除去される。
【０１１４】
本発明の別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、複数の各保護領域に付着され、そしてポリアニオン鎖上の保護基、またはオリゴヌクレオチド上の保護基のいずれか、あるいは両方が、置換される。ポリアニオン鎖および／またはオリゴヌクレオチド上の保護基の置換は、式ＩもしくはＩＩの化合物との反応によってもよいし、またはポリアニオン鎖の付着によってもよく、あるいはこれらの技術の組み合わせによってもよい。ポリアニオン鎖の付着は、上記で詳細に記載されるように、ポリアニオン鎖の形成または予め形成されたポリアニオン鎖の付着によるものであり得る。従って、この実施態様は、保護領域へのポリアニオン鎖の付着、および複数の各オリゴヌクレオチド上のポリアニオン鎖の付着を想定する。この実施態様はまた、保護領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を想定する。この実施態様は、保護領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による保護領域でのポリアニオン鎖上の保護基の置換を想像する。この実施態様のさらに別の特定の実施例は、保護領域へのポリアニオン鎖の付着、および式ＩまたはＩＩの化合物との反応によるポリアニオン鎖上の保護基の置換、ならびにまた、（鎖の形成または予め形成された鎖の付着のいずれかによる）ポリアニオン鎖の付着によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を含む。保護領域においてすでに付着されたポリアニオン鎖へポリアニオン鎖を付着することは必要ではないが、本発明のこの実施態様はまた、考慮される。本発明のこの実施態様によって考慮される多くの可能な修飾されたオリゴヌクレオチドアレイの他の特定の例は、先の詳細な説明および特定の実施例に基づいて、当業者に容易に明らかである。
【０１１５】
本発明の別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、複数の各指定領域で付着され、次いで、オリゴヌクレオチドは、ポリアニオン鎖上で合成される。関連する実施態様において、ポリアニオン鎖は、指定領域において付着され、そして保護基は、保護領域または（指定領域においてポリアニオン鎖に付着された）オリゴヌクレオチドのいずれか、あるいは両方から除去される。従って、この実施態様は、各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および保護領域上の保護基の除去を想定する。この実施態様はまた、各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、およびオリゴヌクレオチド上の保護基の除去を想定する。この実施態様内のさらに別の特定の例は、アレイであり、ここで、ポリアニオン鎖は各指定領域に付着され、そして保護基は保護領域およびオリゴヌクレオチドの両方から除去される。
【０１１６】
別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、指定領域において付着され、そして保護領域上の保護基、または（指定領域でポリアニオン鎖に付着される）オリゴヌクレオチド上の保護基のいずれか、あるいは両方が、置換される。保護領域およびオリゴヌクレオチド上のいずれかまたは両方の保護基の置換は、式ＩもしくはＩＩの化合物との反応、またはポリアニオン鎖の付着、あるいはこれらの技術の組み合わせによるものであり得る。ポリアニオン鎖の付着は、上記で詳細に記載されるように、ポリアニオン鎖の形成または予め形成されたポリアニオン鎖の付着によるものであり得る。従って、この実施態様は、指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および次いで指定領域においてポリアニオン鎖に付着されるオリゴヌクレオチド上の第２のポリアニオン鎖の付着を想定する。この実施態様はまた、指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による保護領域上の保護基の置換を想定する。この実施態様はまた、指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を想定する。この実施態様のさらに別の特定の例は、指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による保護領域上の保護基の置換、ならびにまた（鎖の形成または予め形成された鎖の付着のいずれかによる）第２のポリアニオン鎖の付着によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を含む。本発明のこの実施態様によって考慮される多くの可能な修飾されたオリゴヌクレオチドアレイの他の特定の例は、先の詳細な説明および特定の実施例に基づいて、当業者に容易に明らかである。
【０１１７】
本発明の別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、ｉ）複数の各指定領域、およびｉｉ）複数の各保護領域、の両方において付着される。従って、この実施態様において、固体支持体の表面全体は、ポリアニオン鎖によってコーティングされる。次いで、オリゴヌクレオチドは、ポリアニオン鎖上で合成されて、各指定領域において付着される。関連する実施態様において、ポリアニオン鎖は、保護領域および指定領域の両方において付着され、ならびに保護領域のポリアニオン鎖上の保護基、または（指定領域でポリアニオン鎖に付着される）オリゴヌクレオチド上の保護基のいずれか、あるいは両方が、除去される。従って、この実施態様は、各保護領域、および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびに保護領域に付着されるポリアニオン鎖上の保護基の除去を想定する。この実施態様はまた、各保護領域、および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびオリゴヌクレオチド上の保護基の除去を想定する。この実施態様内のさらに別の特定の例は、アレイであり、ここで、ポリアニオン鎖は、各保護領域、および各指定領域に付着され、そして保護基は、保護領域およびオリゴヌクレオチド上の両方のポリアニオン鎖から除去される。
【０１１８】
別の実施態様において，ポリアニオン鎖は、各保護領域上および各指定領域の両方で付着され、そして保護領域のポリアニオン鎖上、または（指定領域でポリアニオン鎖に付着される）オリゴヌクレオチド上のいずれかの保護基、あるいは両方が、置換される。保護領域およびオリゴヌクレオチドにおけるポリアニオン鎖上の保護基のいずれかまたは両方の置換は、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物との反応、またはポリアニオン鎖の付着、あるいはこれらの技術の組み合わせによるものであり得る。ポリアニオン鎖の付着は、上記で詳細に記載されるように、ポリアニオン鎖の形成または予め形成されたポリアニオン鎖の付着によるものであり得る。従って、この実施態様は、各保護領域および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および各オリゴヌクレオチド上の第２のポリアニオン鎖の付着を想定する。この実施態様はまた、各保護領域および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびに式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による保護領域でのポリアニオン鎖上の保護基の置換を想定する。この実施態様はまた、各保護領域および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびに式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を想定する。この実施態様のさらに別の特定の例は、各保護領域および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびに式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による、保護領域におけるポリアニオン鎖上の保護基の置換、ならびにまた（鎖の形成または予め形成された鎖の付着のいずれかによる）第２のポリアニオン鎖の付着によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を含む。本発明のこの実施態様によって考慮される多くの可能な修飾されたオリゴヌクレオチドアレイの他の特定の例は、先の詳細な説明および特定の実施例に基づいて、当業者に容易に明らかである。
【０１１９】
当業者に既に明らかであるべきであるように、保護領域上の保護基をポリアニオン鎖で置換する工程を含む表面改変と、この支持体を誘導体化する手段としてそれらの表面へのポリアニオン鎖の付着との間の差異は、各技術の時期である。詳細には、ポリアニオン鎖を付着させることによる固体支持体の表面の誘導体化技術は、各々の指定された領域上でオリゴヌクレオチドを合成する前に実施される。保護領域上の保護基をポリアニオン鎖で置換する技術は、各々の指定された領域上でのオリゴヌクレオチドの合成後に実施される。この違いは、これらの技術を明快にするため、および本発明の方法を実施する際に用いられ得る技術の多くの可能な組み合わせをより明確に記載するために有用である。しかし、当業者に明らかなように、最終的な結果は、同じである。すなわち、固体支持体の表面上の各々の保護領域に付着したポリアニオン鎖である。
【０１２０】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提供され、そして本発明を限定するとは解釈されないべきである。本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ定義される。
【０１２１】
以下の実施例では、基材表面を改変して、ＤＮＡプローブアレイの合成の完了時および最終的な脱保護時に単一または複数の負の荷電を付与した。次いで、実験を行って、サンプル中のタンパク質および他の成分の表面非特異的結合ＮＳＢに起因した蛍光バックグラウンドレベルの減少を測定した。観察されたバックグラウンドは、２つの型のものであり得る：サンプル混合物中のタンパク質および他の可溶性成分のＮＳＢに起因する「分散」バックグラウンド；およびサンプル中の不溶性粒子成分（すなわち、金属水酸化物の微細な沈澱物（例えば、サンプル調製手順において用いられる種々の緩衝液の組合せから生じ得る））のＮＳＢに起因する「鏡」バックグラウンド。
【０１２２】
（基材調製）オリゴヌクレオチド合成のためのガラスウェハ（５”×５”×０．０２７”）を、各工程の間では、脱イオン水を用いて直ちにかつ徹底的にリンスしながら、Ｎａｎｏｓｔｒｉｐ（Ｃｙａｎｔｅｋ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）／１５分間、１０％ＮａＯＨ水溶液／７０℃／３分間、次いで１％ＨＣｌ水溶液／１分間中に連続的に浸漬することにより清浄にした。次いで、このウェハを、３５℃にて窒素流の下で５分間スピン乾燥した。次いで、スライドを、穏やかに攪拌したＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．）の溶液（９５：５のエタノール−水中で１％容量／容量）中で１５分間シラン処理し（ｓｉｌａｎａｔｅｄ）、２−プロパノールで徹底的にリンスし、次いで脱イオン水で徹底的にリンスし、そして最終的に９０〜１１０℃にて５分間スピン乾燥した。
【０１２３】
（アレイ合成）アレイ合成を、マスクアラインメントおよびＵＶ曝露システムからなり、そしてフローセルが試薬送達システムに連結されている特製のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘシンセサイザーで行った。この基材を、フローセルに対してねじで締め付け、そしてホスホルアミダイト添加を、標準的な自動化オリゴヌクレオチド合成プロトコル、特に、このフローセルの特定の容量および混和の必要条件に従う液体試薬および加圧アルゴンの送達のためのプログラムに従って実施した。
【実施例】
【０１２４】
（実施例１）
本実施例では、蛍光タンパク質結合体フィコエリトリン−ストレプトアビジン（「ＳＡＰＥ」）の非特異的表面結合に対する表面改変の効果を調べた。
【０１２５】
標準的な、非改変「コントロール」アレイを、まず、標準的なカップリングプロトコルを用いて、ヘキサエチルオキシリンカー（「ＨＥＸ」）をＯ−ＭｅＮＰＯＣ−（ヘキサエチルオキシ）−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｐｅａｓｅら，１９９４；ＭｃＧａｌｌら，１９９７）、ホスホルアミダイトとして添加することにより調製した。次いで、この基材を、チェッカーボードパターンで表面の交互の四角領域を照射するマスクを通してＵＶ光に曝露し、そして２０マー配列の第１のＭｅＮＰＯＣ塩基（Ｇ）を、光不安定性５’−Ｏ−ＭｅＮＰＯＣ−（Ｎ２−ｐ−イソプロピルフェノキシアセチル）−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトとして添加した（Ｐｅａｓｅら，１９９４；ＭｃＧａｌｌら，１９９７）。光不安定性５’−Ｏ−ＭｅＮＰＯＣ−ヌクレオシドホスホルアミダイトを用いる、曝露と結合との交互のサイクルを用いて、基材上のチェッカーボードパターンにおける２０マーオリゴヌクレオチド配列の合成を完了させた：
「コントロール」アレイ：
バックグラウンド：［基材］−ＯＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6-McNPOC（非光分解性）
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6］−ＯＰＯ2(-)Ｏ−（3'ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ5'）。
【０１２６】
表面改変を有する「Ｃ３試験」アレイを、以下の通りに調製した：最初に、モノマービルディングブロック３−（ジメトキシトリチルオキシ）プロピル（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（「Ｃ３スペーサー」，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用い、標準的結合／ＴＣＡ脱保護プロトコルを用いて、「Ｃ３スペーサー」の短いオリゴマー（０、１、５）を基材に添加した。このことには、必要に応じて、標準的結合／ＴＣＡ脱保護プロトコルをまた用いて、（ＤＭＴ−ヘキサエチルオキシ）ホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）として添加したヘキサエチルオキシリンカー（「ＨＥＸ」）の添加を続けた。次いで、２０マーの試験配列の最初の塩基（Ｇ）を、光不安定性５’−Ｏ−ＭｅＮＰＯＣ−（Ｎ２−ｐ−イソプロピルフェノキシアセチル）−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｐｅａｓｅら，１９９４；ＭｃＧａｌｌら，１９９７）として結合させた。次いで、この基材を、チェッカーボードパターンで表面の交互の領域を照射するマスクを通して曝露し、そして次に２０マー配列におけるＭｅｎＰＯＣ−塩基を添加した。曝露と結合との交互のサイクルを用いて、基材上のチェッカーボードパターンにおける２０マーオリゴヌクレオチド配列の合成を完了させた：
試験アレイ：
バックグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］m（ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6）nＯＰＯ2(-)Ｏ3'−（Ｇ）5'OH
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］m（ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6）nＯＰＯ2(-)Ｏ3'−（ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ）5'。
【０１２７】
（アレイハイブリダイゼーション）：次いで、このコントロールおよび試験アレイを、相補的な５’−ビオチン化標的オリゴヌクレオチド（5'ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣ3'）の溶液とハイブリダイゼーションさせ、次いで結合したオリゴヌクレオチド標的を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘハイブリダイゼーションステーションで以下の標準的なＧｅｎｅＣｈｉｐTMプロトコルを用い、フィコエリトリン−ストレプトアビジン結合体（「ＳＡＰＥ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）の溶液を用いて「染色」した：
（ＨＹＢＷＡＳＨ Ａ条件）：
オリゴの濃度＝５×ＳＳＰＥ／０．０５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中１００ｐＭ
サンプルバイアル中のオリゴの容量＝６５０ ｍｌ
洗浄緩衝液＝６×ＳＳＰＥ／０．００５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
Ｈｙｂ温度＝５０℃
Ｈｙｂ時間＝１８００秒間
洗浄温度＝５０℃
洗浄サイクル数＝４
１サイクルあたりの排水および充填の数＝４
保持温度＝２０℃
（染色条件）：
ＳＡＰＥ＝６×ＳＳＰＥ／０．００５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で１：５００希釈
洗浄バイアルにおけるＳＡＰＥの容量＝２００ｍｌ
染色温度＝ＲＴ
Ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅのスピード＝６０ｒｐｍ
持続時間＝５分間
（ＷＡＳＨＡ条件）：
洗浄温度＝２２℃
洗浄サイクル数＝１０
１サイクルあたりの排水および充填の数＝２
保持温度＝２０℃
（アレイ走査）：表面蛍光レベルを、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＧｅｎｅＡｒｒａｙTM共焦点蛍光スキャナーで獲得した画像から抽出した：
（走査条件）：
走査温度＝２０℃
画素サイズ＝３０ｍ
フィルター＝５６０ｎｍ。
【０１２８】
代表的な画像を、図１に示し、そしてこのデータを、以下の表１にまとめる。測定された「フォアグラウンド」蛍光強度は、オリゴヌクレオチドプローブ配列を含むチェッカーボードアレイ（「＋」）の四角内のシグナル強度に対応し、そして「バックグラウンド」蛍光を、プローブ配列を含まないチェッカーボードアレイ（「−」）の四角内で決定した。コントロールアレイと比較して、アレイ合成の前の少なくとも１つの「Ｃ３」を用いる基材の改変が、バックグラウンド蛍光強度において６倍の減少を生じたことが理解され得る。
【０１２９】
【表１】
（実施例２）
本実施例は、分散および鏡の両方のＮＳＢに対する表面改変の効果を調べることを目的とする。後者は、代表的にはＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを用いて分析される、より複雑なサンプルにおいて頻繁に観察される。
【０１３０】
「コントロール」アレイを、実施例１におけるコントロールアレイについて記載されたのと正確に同じに調製した：
バックグラウンド：［基材］−ＯＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6-O-MeNPOC（非光分解性）
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6］−ＯＰＯ2(-)Ｏ−（3'ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ5'）。
【０１３１】
「光分解についてのコントロール」アレイを、オリゴヌクレオチド合成後に、アレイ全体を、ＨＥＸ改変基材の非合成（「−」）領域から残りのＭｅＮＰＯＣ光不安定性基を取り出すように光に曝露したこと以外は、コントロールと同じ方法で調製した：
バックグラウンド：［基材］−ＯＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6-OH（光分解性）
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6］−ＯＰＯ2(-)Ｏ−（3'ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ5'OH。
【０１３２】
（Ｃ３）n（ＨＥＸ）表面改変を有する「Ｃ３試験」アレイを、実施例１において「Ｃ３試験」アレイについて記載された方法に従って調製した：
バックグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］m（ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6）−ＯＰＯ2(-)Ｏ3'−（Ｇ）5'OH
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］m（ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6）−ＯＰＯ2(-)Ｏ3'−（ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ）5'OH。
【０１３３】
ハイブリダイゼーション：アレイを、１００ｐＭの最終濃度でＧｅｎｅＣｈｉｐ試験サンプル中にスパイクされた相補的な５’−ビオチン化標的オリゴヌクレオチド（5'ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣ3'）の溶液とハイブリダイズさせた。このＧｅｎｅＣｈｉｐ試験サンプルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｐ４５０アッセイキットパッケージの挿入物とともに提供されるプロトコルに従って調製した。これを、ＤＮＡｓｅ−Ｉを用いて断片化し、そして末端トランスフェラーゼの存在下でビオチン−ジデオキシＡＴＰを用いて標識した、精製されていない多重ＰＣＲ反応物から本質的に調製する。いくつかの場合、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をまた、サンプル中に含めて、それがＮＳＢにおいてさらなる減少を提供するその能力を調べた。ハイブリダイゼーション、ＳＡＰＥ染色、洗浄、および走査を、上記の実施例１に記載される通りに実施した。
【０１３４】
代表的な画像を、図２および図３に示し、そしてこのデータを、以下の表２にまとめる。図２は、表２のエントリー１におけるデータに対応する。図３は、表２のエントリー３におけるデータに対応する。測定した「フォアグラウンド」蛍光強度は、オリゴヌクレオチドプローブ配列を含むチェッカーボードアレイ（「＋」）の四角内の配列内のシグナル強度に対応し、そして「バックグラウンド」蛍光をプローブ配列を含まないチェッカーボードアレイ（「−」）の配列内の四角内で決定した。多数の結論が、このデータから得られ得る。第１に、ＨＥＸ改変基材（Ｃ３改変なし）を有するコントロールアレイの場合、非プローブ含有領域からのＭｅＮＰＯＣ保護基の最終的な光分解性除去は、これらの領域における分散ＮＳＢレベルの有意な減少を生じた（エントリー１およびエントリー２）。光分解はまた、非光分解コントロールアレイについて観察されたやや厳しい鏡バックグラウンドを減少させたが、これを排除しなかった。ＨＥＸ添加およびオリゴヌクレオチド合成の前の、「Ｃ３」オリゴマー（長さ５〜２０）を有する基材の改変は、バックグラウンド蛍光強度における実質的減少をもたらし、そして鏡バックグラウンドの大部分を完全に排除した。サンプル中にＢＳＡを含むことは、最低の分散バックグラウンドレベルを提供するようであった。
【０１３５】
【表２】
前述は、本発明の例示であり、そして本発明を限定するとは解釈されない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物は、特許請求の範囲の中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、本発明のプロセスによって得られたイメージである。
【図２】図２はコントロールアレイであり、ここで基材はハイブリダイゼーションの前に光分解されていない。
【図３】図３はアレイであり、ここで基材は、鏡面の非特異的結合を減少させるために、ハイブリダイゼーションの前に本発明の方法に従って修飾される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、固相ポリマー合成の分野に関する。より詳細には、本発明は、調製スケールでのオリゴヌクレオチドアレイまたは単一の化合物の固相合成における適用を見出す方法および支持体を提供する。このオリゴヌクレオチドアレイは、例えば、結合アフィニティーの決定のためのスクリーニング研究および診断的適用において使用され得る。本発明の表面修飾は、結合アフィニティーおよび診断的適用における標的分子のアレイへの非特異的結合を減少する。
【０００２】
生物学的ポリマー（例えば、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド）の合成は、最も初期の溶液合成の段階から、単一のポリマーの固相合成へ、より最近の、単一の固体支持体またはチップ上の多くの種々のオリゴヌクレオチド配列を有するライブラリーの調製まで、劇的な様式で発展してきた。
【０００３】
オリゴヌクレオチド、ペプチド、および他のポリマー配列の大きなアレイを形成する改善された方法が、短い期間の間に考案されてきた。特に注目すべきものとして、Ｐｉｒｒｕｎｇら、米国特許第５，１４３，８５４号（ＰＣＴ出願番号
ＷＯ ９０／１５０７０もまた参照のこと）、およびＦｏｄｏｒら、ＰＣＴ公開番号 ＷＯ９２／１００９２（本明細書中にすべて参考として援用される）は、例えば、光指向性合成技術を使用して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および他のポリマー配列の巨大なアレイを形成する方法を開示する。Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７７（１９９１）もまた参照のこと（すべての目的のために本明細書中で参考として援用される）。これらの手順はまた、現在、ＶＬＳＩＰＳTM手順といわれる。
【０００４】
上記で引用したＦｏｄｏｒらのＰＣＴ出願において、ＶＬＳＩＰＳTM手順を管理するためのコンピューター制御システムを使用することについて見事な方法が記載されている。このアプローチを使用して、ポリマーの１つの異種アレイが、多くの反応部位の同時カップリングを通して、異なる異種アレイに転換される。Ｗｉｎｋｌｅｒらへの米国特許第５，３８４，２６１号および同第５，６７７，１９５号を参照のこと。これらの開示は、すべての目的のために本明細書中で援用される。
【０００５】
上記で言及された米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ
９０／１５０７０および９２／１００９２において記載されるように、ＶＬＳＩＰＳTM技術の開発は、コンビナトリアル合成およびコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングの分野にある先駆的な技術であると考えられている。より最近では、１９９３年６月２５日に出願された米国特許出願番号第０８／０８２，９３７号は、標的核酸の部分配列もしくは完全配列を提供するため、および特定のオリゴヌクレオチド配列を含む核酸の存在を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドプローブのアレイを作製する方法を記載する。
【０００６】
化学合成およびバイオアッセイの両方におけるＶＬＳＩＰＳTM基材の実行を最適化するための表面特性の制御は、合成開始のための部位密度、表面の湿潤性、および開始部位を表面に結合させる結合基の長さのようなパラメーターを含むことが認識されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によって以下が提供される：
（１）固体支持体の表面において複数のポリヌクレオチドプローブに対する標的分子の非特異的結合を減少させるための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）保護基を有する表面を有する支持体を提供する工程；
ｂ）該支持体からすべてはないがいくつかの該保護基を除去する工程であって、該保護基は、該表面の既知の位置において除去される、工程；
ｃ）該既知の位置において複数の異なるポリヌクレオチドプローブを形成させる工程であって、該ポリヌクレオチドプローブは、末端保護基を有する、工程；
ｄ）該プローブにおける末端保護基もしくは該支持体における除去されていない保護基のいずれかまたはその両方を、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程であって、これにより、該標的分子の非特異的結合が減少する、工程
を包含する、方法。
（２）項目１に記載の方法であって、前記固体支持体が、重合化したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、官能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ポリマー、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ガリウムヒ素、金属酸化物フィルムおよびそれらの組合せを含む、方法。
（３）項目１に記載の方法であって、前記複数のプローブを産生する工程ａ）が以下：
１）前記既知の位置の各々に対して、独立に選択された、光分解性保護基を有するリンカーモノマーを付着させる工程；
２）光指向性方法を用いて該付着したリンカーモノマーの各々に対して光分解性保護基を有する独立に選択されたヌクレオチドモノマーを、付着させて、光分解性の末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程；および
３）工程２）を１〜１２０回反復して、続きのヌクレオチドモノマーを工程２）において生成された該プローブの各々に対して付着させて，光分解性の末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（４）項目１に記載の方法であって、前記複数のプローブを産生する工程ａ）が以下：
１）前記既知の位置の各々に対して、独立して選択された、化学的に除去可能な保護基を有するリンカーモノマーを付着させる工程；
２）該付着されたリンカーモノマーの各々における該化学的に除去可能な保護基の各々を光分解性保護基へと置き換える工程；
３）光指向性方法を用いて、化学的に除去可能な保護基を有する独立して選択されたヌクレオチドモノマーを該付着したリンカーモノマーの各々へと付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程；
４）該プローブの各々における該化学的に除去可能な保護基の各々を光分解性保護基に置き換える工程；および
５）工程３）および４）を１〜１２０回反復して，工程３）において生成した該プローブの各々に対して続きのヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する該複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（５）項目１に記載の方法であって、前記複数のプローブを産生する工程ａ）が以下：
１）前記既知領域の各々に対して、独立して選択された、化学的に除去可能な保護基を有するリンカーモノマーを付着させる工程；
２）該既知の位置の内部および外部に活性化層を形成させる工程であって、該活性化層が、以下：
ｉ）光活性化因子、ここで該光活性化因子は、照射される場合、触媒を生成する光活性化因子、および
ｉｉ）自己触媒因子、ここで該自己触媒因子は、該自己触媒因子が該触媒によって活性化される場合、該化学的に除去可能な保護基を除去する生成物を生成する自己触媒因子、
を含む、工程；
３）該既知の位置と重複する該活性化層の部分を照射して、該リンカーモノマーにおける該化学的に除去可能な保護基を除去する工程；
４）該付着したリンカーモノマーの各々に対して、化学的に除去可能な保護基を有する独立して選択されたヌクレオチドモノマーを付着して、化学的に除去可能な末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程；
５）該既知の位置に重複する該活性化層の部分を照射して、該プローブにおいて該化学的に除去可能な保護基を除去する工程；
６）工程４）および５）を１〜１２０回反復して、工程４）において生成された該プローブの各々に対して続きのヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する該複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（６）項目１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｂ）が以下：
１）前記プローブにおける末端保護基もしくは前記支持体における除去されていない保護基のいずれかまたは両方を、アクチベーターに曝露して、該保護基を除去し、活性化部位を生成する工程；および
２）該活性化部位を、該プローブまたは該支持体、またはその両方に対して負に荷電したホスフェート残基を共有結合する化合物と反応させる工程、
を包含する、方法。
（７）項目６に記載の方法であって、前記保護基が、光分解性保護基であり、そして前記アクチベーターがイオンビーム、電子ビーム、ガンマ線、ｘ線、紫外線照射、光、赤外線照射、マイクロ波、電流、電波、およびそれらの組合せからなる群より選択される、方法。
（８）項目６に記載の方法であって、前記保護基が化学的に除去可能な保護基であり、そして前記アクチベーターが、酸、塩基、酸化剤および還元剤からなる群より選択される、方法。
（９）項目６に記載の方法であって、前記活性化部位と化合物とを反応させる工程２）が、以下：
以下の式Ｉ
【化１】
および式ＩＩ
【化２】
からなる群より選択される化合物と該活性化部位の各々とを反応させる工程を含み、ここで、
ＤＭＴは、ジメトキシトリチル保護基であり；
各Ｘは塩基除去可能な保護基であり；そして
ｉＰｒ2Ｎは、ジイソプロピルアミノ保護基である、
方法。
（１０）項目１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｂ）が、以下：
１）前記プローブにおける末端保護基もしくは前記支持体における除去されていない保護基またはその両方をアクチベーターに曝露して、該保護基を除去して、活性化部位を生成する工程；
２）該活性化部位を、負に荷電したホスフェート単位および保護基を有するモノマーと反応させる工程であって、それにより該モノマーが該プローブもしくは該支持体またはその両方と共有結合する、工程；ならびに
３）工程１）および２）を１〜２０回反復して、該複数のプローブまたは該支持体のｉ）の各々の少なくとも１つにおける負に荷電したホスフェート単位のポリアニオン鎖を生成する工程、
を包含する、方法。
（１１）項目１０に記載の方法であって、前記工程２）が、以下の式ＩＩＩ
【化３】
のモノマーと反応させる工程であって、ここで、
Ｒ1は、ヌクレオシド部分、デオキシリボース部分、Ｃ1-8アルキレン、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−からなる群より選択され、ここで、ｍは１〜８の整数であり；
Ｒ2は、ジメトキシトリチル保護基およびＭｅＮＰＯＣ保護基からなる群より選択される保護基であり；
Ｘは、塩基除去可能な保護基であり；そして
ｉＰｒ2Ｎがジイソプロピルアミノ保護基である、
工程を包含する、方法。
（１２）項目１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｂ）が、以下：
前記プローブにおける末端保護基および前記支持体における除去されていない保護基の両方を置き換える工程、
を包含する、方法。
（１３）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対する標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下の工程：
ａ）複数の既知の位置に対してポリアニオン鎖を付着させる工程；
ｂ）該既知の位置の各々にて該ポリアニオン鎖の各々において該複数の異なる核酸プローブを形成させる工程であって、これにより、該標的分子の非特異的な結合が減少する、工程、
を包含する、方法。
（１４）項目１３に記載の方法であって、前記ポリアニオン鎖が保護基を有する、方法。
（１５）項目１４に記載の方法であって、前記固体支持体が、重合化したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、官能化ガラス、ゲルマニウム、シリコン、ポリマー、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ガリウムヒ素、金属酸化物フィルムおよびそれらの組合せを含む、方法。
（１６）項目１４に記載の方法であって、前記ポリアニオン鎖を付着させる工程ａ）が、以下：
前記既知の位置の各々における該ポリアニオン鎖を形成させる工程であって、ここで、該ポリアニオン鎖を形成させる工程が、以下、
１）該既知の位置の各々にモノマーを付着させる工程であって、該モノマーは、負に荷電したホスフェート単位および保護基を有し、それにより、該モノマーは、該既知の位置の各々に共有結合している、工程；
２）該モノマーの各々を、アクチベーターに曝露して、該モノマーの各々から該保護基を除去して、活性化部位を生成する工程；
３）該活性化部位と、負に荷電したホスフェート単位および保護基を有する該モノマーとを反応させて、第二のモノマーを付加する工程；ならびに
４）工程２）および３）を０〜２０回反復して、該既知の位置の各々における保護基を有するポリアニオン鎖を生成する工程、を包含する、工程、
を包含する、方法。
（１７）項目１６に記載の方法であって、前記工程１）および３）が、以下の式ＩＩＩ：
【化４】
のモノマーであって、ここで、
Ｒ1は、ヌクレオシド部分、デオキシリボース部分、Ｃ1-8アルキレン、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−からなる群より選択され、ここで、ｍは１〜８の整数であり；
Ｒ2は、ジメトキシトリチル保護基およびＭｅＮＰＯＣ保護基からなる群より選択され；
Ｘは、塩基除去可能な保護基であり；そして
ｉＰｒ2Ｎがジイソプロピルアミノ保護基である、
モノマーを使用する工程を含む、
方法。
（１８）項目１６に記載の方法であって、前記保護基は、光分解性保護基であり、そして前記工程２）は、イオンビーム、電子ビーム、ガンマ線、ｘ線、紫外線照射、光、赤外線照射、マイクロ波、電流、電波、およびそれらの組合せからなる群より選択されるアクチベーターを使用する工程を包含する、方法。
（１９）項目１６に記載の方法であって、前記保護基が、化学的に除去可能な保護基であり、そして前記工程２）が、酸、塩基、酸化剤および還元剤からなる群より選択されるアクチベーターを使用する工程を包含する、方法。
（２０）項目１４に記載の方法であって、前記ポリアニオン鎖を付着させる工程ａ）が、さらに、前記既知の位置の外側の基材に対して、保護基を有するポリアニオン鎖を付着させる工程を包含する、方法。
（２１）項目１４に記載の方法であって、前記保護基が、光分解性の保護基を含み、そして前記複数のプローブを形成させる工程ｂ）が、以下：
１）光指向性方法を用いて、該既知の位置の各々にて該ポリアニオン鎖の各々に対して光分解性の末端保護基を有する独立に選択されたヌクレオチドモノマーを付着させる工程；および
２）工程１）を１〜１２０回反復して、続きのヌクレオチドモノマーを工程１）において付着された該ヌクレオチドモノマーの各々に対して付着させて，複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（２２）項目１４に記載の方法であって、前記保護基が化学的に除去可能な保護基を含み、そして前記複数のプローブを形成させる工程ｂ）が、以下：
１）前記既知の位置の各々にて、前記付着したポリアニオン鎖の各々における該化学的に除去可能な保護基の各々を、光分解性保護基に置き換える工程；
２）光指向性方法を用いて、該付着したポリアニオン鎖の各々に対して、化学的に除去可能な保護基を有する独立して選択されるヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な保護基を有する、複数の付着したヌクレオチドモノマーを生成する工程、
３）該ヌクレオチドモノマーの各々における該化学的に除去可能な保護基の各々を、光分解性保護基と置き換える工程；
４）光指向性方法を用いて、該付着されたヌクレオチドモノマーの各々に対して、独立に選択された化学的に除去可能な保護基を有するヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する複数のプローブを生成する工程；
５）工程３）および４）を１〜１２０回反復して、工程３）において生成した該プローブの各々に対して続きのヌクレオチドモノマーを付着させて、化学的に除去可能な末端保護基を有する該複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（２３）項目１４に記載の方法であって、前記保護基が化学的に除去可能な保護基であって、そして前記複数のプローブを生成する工程ａ）が、以下：
１）前記既知の位置の内部および外側に活性化層を形成させる工程であって、該活性化層は、以下を含む：
ｉ）光活性化因子、ここで該光活性化因子は、照射される場合、触媒を生成する、および
ｉｉ）自己触媒因子、ここで該自己触媒因子は、該自己触媒因子が該触媒によって活性化される場合、該化学的に除去可能な保護基を除去する生成物を生成する；
２）該既知の位置と重複する該活性化層の部分を照射して、該ポリアニオン鎖における該化学的に除去可能な保護基を除去する工程；
３）該既知の位置の各々にて該付着したポリアニオン鎖の各々に対して、独立して選択されたヌクレオチドモノマーを付着して、化学的に除去可能な末端保護基を有する複数のヌクレオチドモノマーを生成する工程；
４）該既知の位置に重複する該活性化層の部分を照射して、該ヌクレオチドモノマーの各々において該化学的に除去可能な保護基を除去する工程；
５）工程３）および４）を１〜１２０回反復して、工程３）において付着された該ヌクレオチドの各々に対して続きのヌクレオチドモノマーを付着させて、該複数のプローブを生成する工程、
を包含する、方法。
（２４）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対して標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下の工程：
（ａ）該支持体における支持体の外側の既知の位置に対してポリアニオン鎖を付着させる工程；
（ｂ）該既知の位置の各々にて該複数のプローブを形成させ、それにより該標的分子の非特異的な結合が減少する工程、
を包含する、方法。
（２５）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対して標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下：
ａ）保護基を有する表面を有する支持体を提供する工程；
ｂ）該支持体からすべてはないがいくつかの該保護基を除去する工程であって、該保護基は、既知の位置において除去される、工程；
ｃ）該既知の位置において保護基を有するポリアニオン鎖を形成させる工程；
ｄ）該ポリアニオン鎖において該複数のプローブを形成させる工程であって、該複数のプローブの各々は、末端保護基を有する、工程；および
ｅ）該プローブにおける末端保護基もしくは該支持体における除去されていない保護基のいずれかまたはその両方を除去する工程、
を包含する、方法。
（２６）項目２５に記載の方法であって、前記プローブにおける前記末端保護基および前記支持体における前記除去されていない保護基の両方が、除去されている、方法。
（２７）項目２５に記載の方法であって、前記ポリアニオン鎖を付着させる工程ａ）が、さらに、前記既知の位置の外側の基材に対して保護基を有するポリアニオン鎖を付着させる工程を包含する、方法。
（２８）項目２７に記載の方法であって、前記除去する工程ｃ）が、以下：
ｉ）工程ｂ）において生成される前記複数のプローブの各々における前記保護基、および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記支持体に付着した前記複数のポリアニオン鎖の各々における該保護基、
の両方を除去する工程、
を包含する、方法。
（２９）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対する標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下：
ａ）支持体における既知の位置の外側に保護基を有するポリアニオン鎖を形成させる工程；
ｂ）該支持体の該表面の該既知の位置に複数の核酸プローブを形成させる工程であって、該複数のプローブの各々は、末端保護基を有する、工程；および
ｃ）該プローブにおいてもしくは該既知の位置の外側の該基材のいずれかまたはその両方から該保護基を除去する工程であって、これにより、該標的分子の非特異的な結合が減少する、工程、
を包含する、方法。
（３０）項目２９に記載の方法であって、前記除去する工程ｃ）が、該プローブ、および該既知の位置の外側の該基材から、両方の該保護基を除去する工程を包含する、方法。
（３１）固体支持体の表面における複数の核酸プローブに対する標的分子の非特異的な結合を減少させるための方法であって、以下、
ａ）既知の位置の外側に保護基を有する基材の該表面上に該既知の位置にてポリアニオン鎖を形成させる工程；
ｂ）該ポリアニオン鎖において該既知の位置の各々にて複数の核酸プローブを形成させる工程であって、該複数のプローブの各々が末端保護基を有する、工程；ならびに
ｃ）以下：
ｉ）該複数のプローブの各々における該保護基；および
ｉｉ）該既知の位置の外側の該保護基、
の少なくとも１つを、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程であって、それによって該標的分子の非特異的な結合が減少する、工程
を包含する、方法。
（３２）項目３１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
１）以下：
ｉ）前記複数のプローブの各々；および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材における前記保護基の各々、
の少なくとも１つを、アクチベーターに曝露して、該保護基を除去して、活性化部位を生成する工程；および
２）負に荷電したホスフェート残基を、該複数のプローブもしくは該既知の位置の外側の該基材のいずれかまたはその両方に共有結合する化合物と該活性化部位を反応させる工程、
を包含する、方法。
（３３）項目３１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
１）以下：
ｉ）前記複数のプローブの各々；および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材における前記保護基、
の少なくとも１つを、アクチベーターに曝露して、該保護基を除去して、活性化部位を生成する工程；
２）該活性化部位を、負に荷電したホスフェート単位および保護基を有するモノマーと反応させる工程であって、それにより該モノマーが：ｉ）前記複数のプローブの各々；およびｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材の少なくとも１つと共有結合する、工程；ならびに
３）工程１）および２）を１〜２０回反復して：ｉ）前記複数のプローブの各々；およびｉｉ）前記複数の既知の位置の各々の少なくとも１つにおける負に荷電したホスフェート単位のポリアニオン鎖を生成する工程、
を包含する、方法。
（３４）項目３１に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
ｉ）工程ｂ）において生成した前記複数のプローブの各々における前記保護基、および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材における前記保護基、
の両方を、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程、
を包含する、方法。
（３５）項目３１に記載の方法であって、前記工程ａ）が、さらに、
前記既知の位置の外側の前記基材の前記表面においてポリアニオン鎖を形成させる工程、
を包含する、方法。
（３６）項目３５に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
ｉ）工程ｂ）において生成した前記複数のプローブの各々における前記保護基、および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材の前記表面における前記保護基の
両方を置き換える工程、
を包含する、方法。
（３７）固体支持体の表面における複数のプローブに対する標的分子の非特異的な結合を減少させる方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）前記基材の前記表面上の既知の位置の外側に保護基を有するポリアニオン鎖を形成させる工程；
ｂ）該既知の位置にて該複数のプローブを形成させる工程であって、該複数のプローブの各々が末端保護基を有する、工程；ならびに
ｃ）以下：
ｉ）工程ｂ）において生成された該複数のプローブの各々における該保護基；および
ｉｉ）該既知の位置の外側の該ポリアニオン鎖における該保護基、
の少なくとも１つを、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程であって、それによって該標的分子の非特異的な結合が減少する、工程
を包含する、方法。
（３８）項目３７に記載の方法であって、前記置き換える工程ｃ）が、以下：
ｉ）工程ｂ）において生成した前記複数のプローブの各々における前記保護基、および
ｉｉ）前記既知の位置の外側の前記基材の前記表面に付着した前記複数のポリアニオン鎖の各々における前記保護基、
の両方を、負に荷電したホスフェート残基に置き換える工程、
を包含する、方法。
（３９）複数の核酸プローブに対するハイブリダイゼーションについて標的分子をスクリーニングするための方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）既知の位置において核酸プローブを有する表面を有する固体支持体を提供する工程であって、該支持体は、該既知の位置の外側もしくは該既知の位置の内部のいずれかまたはその両方にてさらにポリアニオン鎖を有し、該プローブは、該ポリアニオン鎖が該既知の位置に存在する場合に該ポリアニオン鎖を通じて該支持体に付着している、工程；
ｂ）該プローブを有する該支持体と、標的分子とを接触させる工程；および
ｃ）該複数のプローブに対する該標的分子のハイブリダイゼーションを検出する工程であって、ここで、該ポリアニオン鎖が、該複数のプローブに対する該標的分子の非特異的な結合を減少させる、工程、
を包含する、方法。
（４０）項目３９に記載の方法であって、前記支持体が、前記既知の位置の内部およびその外側に前記ポリアニオンを有し、そして前記プローブは、該既知の位置の内部の該ポリアニオンに付着している、方法。
（発明の要旨）
本発明は、標的分子または複数の標的分子の、オリゴヌクレオチドのアレイへの非特異的結合を減少させるための種々の方法を提供する。
【０００８】
第１の局面として、本発明は、標的分子または検出／シグナル生成分子の、固体支持体の表面の複数のオリゴヌクレオチドへの非特異的結合を減少させるための方法を提供し、ここでこの表面は、複数の指定領域および複数の保護領域を有する。各々の複数の保護領域は、その上に保護基を有する。この方法は以下の工程を含む：ａ）各々の指定領域で複数のオリゴヌクレオチドを生成する工程であって、ここで各々の複数のオリゴヌクレオチドは、末端保護基を有する、工程；およびｂ）各々の複数の保護領域上で保護基を除去する工程。標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、保護基の除去の結果として減少する。別の実施態様において、本発明の方法は、複数のオリゴヌクレオチドおよび保護領域の両方からの保護基の除去を含む。この保護基は、感光性の保護基、または化学的に除去可能な保護基、あるいはそれらの組み合わせであり得る。
【０００９】
第２の局面として、本発明は、標的分子または検出／シグナル生成分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための別の方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）各々の指定領域で複数のオリゴヌクレオチドを生成する工程であって、ここで各々の複数のオリゴヌクレオチドは、末端保護基を有する、工程；ならびにｂ）少なくとも１つの：ｉ）工程ａ）中で生成された各々の複数のオリゴヌクレオチド上の保護基、およびｉｉ）各々の複数の保護領域上の保護基を、負に荷電したリン酸残基で置換する工程。標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、保護基を、負に荷電したリン酸残基に置換することによって減少する。本発明はさらに、オリゴヌクレオチド上および保護領域上の両方の保護基を置換する工程を包含する。保護基を置換する負に荷電したリン酸残基は、負に荷電したリン酸残基に共有結合する化合物との反応、または負に荷電したリン酸残基のポリアニオン鎖を結合させることによって提供され得る。
【００１０】
第３の局面として、本発明は、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための、なお別の方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）固体支持体上の表面の各々の指定領域に、保護基を有するポリアニオン鎖を結合させる工程、およびｂ）各々の指定領域のポリアニオン鎖上に、末端保護基を有する複数のオリゴヌクレオチドを形成する工程。オリゴヌクレオチドアレイへの標的分子の非特異的結合は、固体支持体の表面の指定領域上のポリアニオン鎖の存在によって減少する。このポリアニオン鎖は、指定領域上でポリアニオン鎖を形成すること、またはあらかじめ形成したポリアニオン鎖を指定領域に結合することによって、指定領域に結合され得る。１つの実施態様において、保護基を有するポリアニオン鎖はまた、固体支持体の保護領域に結合される。
【００１１】
第４の実施態様において、本発明は、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：ａ）保護基を有するポリアニオン鎖を各々の保護領域に結合させる工程；およびｂ）各々の指定領域において末端保護基を有する複数のオリゴヌクレオチドを形成する工程。標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、固体支持体の表面の保護領域上のポリアニオン鎖の存在によって減少する。このポリアニオン鎖は、保護領域上でポリアニオン鎖を形成すること、またはあらかじめ形成したポリアニオン鎖を保護領域に結合することによって、保護領域に結合され得る。
【００１２】
第５の実施態様において、本発明は、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための方法を提供する。この方法は、以下の工程を含む：ａ）保護基を有するポリアニオン鎖を、各々の指定領域に結合させる工程；ｂ）各々の指定領域のポリアニオン鎖上で、末端保護基を有する複数のオリゴヌクレオチドを形成する工程、ならびにｃ）少なくとも１つの：ｉ）工程ｂ）で生成された各々の複数のオリゴヌクレオチド上の保護基、およびｉｉ）各々の複数の保護領域上の保護基、を除去する工程。標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、指定領域上のポリアニオン鎖、ならびに固体支持体の表面のオリゴヌクレオチドまたは保護領域のいずれかまたは両方からの保護基の除去の組み合わせによって減少する。別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、保護領域に結合され、そして標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、保護領域上のポリアニオン鎖、ならびに固体支持体の表面のオリゴヌクレオチドまたは保護領域に結合したポリアニオン鎖のいずれかかまたは両方からの保護基の除去の組み合わせ、によって減少する。別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、指定領域および保護領域の両方に結合し、そしてオリゴヌクレオチドアレイへの標的分子の非特異的結合は、ポリアニオン鎖、ならびに、固体支持体の表面の保護領域に結合したオリゴヌクレオチドまたはポリアニオン鎖のいずれかまたは両方からの保護基の除去の組み合わせにより減少する。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）保護基を有するポリアニオン鎖を、各々の指定領域に結合させる工程；ｂ）各々の指定領域で、ポリアニオン鎖上に末端保護基を有する複数のオリゴヌクレオチドを形成する工程；ならびにｃ）少なくとも１つの、または両方の：ｉ）工程ｂ）中で生成された各々の複数のオリゴヌクレオチド上の保護基、およびｉｉ）各々の複数の保護領域上の保護基を、負に荷電したリン酸残基で置換する工程。標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、指定領域上のポリアニオン鎖、および、固体支持体の表面のオリゴヌクレオチド上または保護領域上のいずれかまたは両方での保護基の置換の組み合わせによって減少する。別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、保護領域に結合され、そして標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、保護領域上のポリアニオン鎖、および、固体支持体の表面の保護領域に結合したオリゴヌクレオチド上またはポリアニオン鎖上のいずれかまたは両方の保護基の置換の組み合わせによって減少する。別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、指定領域および保護領域の両方に結合され、そして標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、ポリアニオン鎖、および、固体支持体の表面の保護領域に結合されたオリゴヌクレオチド鎖上のもしくはポリアニオン鎖上のいずれかまたは両方での保護基の置換の組み合わせによって減少する。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は固相合成のための固体支持体を提供する。この固体支持体は、複数の指定領域および複数の保護領域ならびに少なくとも１つのｉ）各々の指定領域、およびｉｉ）各々の保護領域、に結合した保護基を有するポリアニオン鎖を有する表面を含む。
【００１５】
なお別の実施態様において、本発明は、複数のオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションのための標的分子をスクリーニングするための方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）複数の指定領域および複数の保護領域、ならびに少なくとも１つのｉ）各々の指定領域、およびｉｉ）各々の保護領域に結合した保護基を有するポリアニオン鎖を有する表面を含む固体支持体を提供する工程；ｂ）標的分子を複数のオリゴヌクレオチドに接触させる工程；ならびにｃ）複数のオリゴヌクレオチドに対する標的分子のハイブリダイゼーションを検出する工程。このオリゴヌクレオチドは、ポリアニオン鎖が各々の指定領域と結合する場合に、ポリアニオン鎖に結合される。標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、指定領域および保護領域の１つまたは両方におけるポリアニオン鎖の存在によって減少する。
【００１６】
前述の方法は、その上、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための種々の方法と組み合わされ得る。前述の方法の任意の適切な組み合わせが、本発明に従って利用され得る。
【００１７】
本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の好ましい実施態様の説明および本発明の実施例の説明においてさらに記載される。
【００１８】
（好ましい実施態様の説明）
本発明は、一般的には、標的分子の、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための方法に関する。このような方法には、オリゴヌクレオチドが提供される基剤表面に対する表面修飾、ならびにオリゴヌクレオチドに対する修飾およびこれらの技術の組み合わせが含まれる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「ＥＤＡ」はエチレンジアミンを意味し；「ＡｃＯＨ」は酢酸を意味し；「ＡＬＬＯＣ」はアリルオキシカルボニルを意味し；「ＢＯＰ」はベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートを意味し；「ＣＡＰ」はε−アミノカプロン酸を意味し；「ＤＩＥＡ」はジイソプロピルエチルアミンを意味し；「ＤＩＧＬＹ」はグリシルグリシンを意味し；「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し；「ＤＭＴ」はジメトシトリチルを意味し；「ＤＴＴ」はジチオスレイトールを意味し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを意味し；「ＦＭＯＣ」はフルオレニルメトキシカルボニルを意味し；「ＭｅＮＰＯＣ」はαメチルニトロ−ピペロニルオキシカルボニルを意味し；「ＭＰ」は融点を意味し；「ＮＶＯＣ」はニトロベラトリル（ｖｅｒａｔｒｙｌ）オキシカルボニルを意味し；「ＯＢｔ」はヒドロキシベンゾトリアゾールラジカルを意味し；「ＰＢＳ」はリン酸緩衝化生理食塩水を意味し；「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を意味し；「１５−ＡＴＯＭ−ＰＥＧ」はＨ2Ｎ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣＯ−（ＣＨ2）3−ＣＯ2Ｈを意味し；そして「ＴＲＩＧＬＹ」はグリシルグリシルグリシンを意味する。
【００２０】
以下の用語は、それらが本明細書中で使用される場合、以下の一般的な意味を有することが意図される：
化学用語：本明細書中で使用される場合、用語「アルキル」は、飽和炭化水素ラジカルをいう。これは、直鎖または分枝鎖（例えば、エチル、イソプロピル、ｔ−アミル、または２，５−ジメチルヘキシル）であり得る。「アルキル」または「アルキレン」が結合基またはスペーサーをいうために使用される場合、これは、共有結合のために２つの利用可能な原子価を有する基（例えば、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−、および、−ＣＨ2（ＣＨ2ＣＨ2）2ＣＨ2−）であるととられる。置換基として好ましいアルキル基は、１〜１０炭素原子を含むアルキル基であり、特に好ましいのは、１〜６炭素原子を含むアルキル基である。結合基として好ましいアルキル基はまたはアルキレン基は、１〜２０炭素原子を含むアルキル基はまたはアルキレン基であり、特に好ましいのは、３〜６炭素原子を含むアルキル基はまたはアルキレン基である。用語「ポリエチレングリコール」は、エチレングリコールの反復単位を有するそれらの分子（例えば、ヘキサエチレングリコール（ＨＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）5−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ））をいうために用いられる。用語「ポリエチレングリコール」が、結合基およびスペーサー基をいうために使用される場合、他のポリエーテルまたはポリオール（すなわち、ポリプロピレングリコール、またはエチレングリコールとプロピレングリコールとの混合物）が同様に使用され得ることが当業者に理解される。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「保護基」は、感光性の保護基および化学的に除去可能な保護基をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される用語「感光性保護基」は、化学反応が別の反応部位で行われる間、分子中の１つの反応性部位を遮断するように設計され、そして光照射のような放射に曝露することによって除去可能な任意の基をいう。本明細書中で利用されるその用語の意味内での感光性の保護基の特定の例には、ジメトキシベンゾイン、２−ニトベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、α−メチル−２−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）、２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）、α−メチル−２−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）、２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＤＮＢＯＣ）、α−メチル−２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル（ＭｅＤＮＢＯＣ）、２−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）、２−メチル−２−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＥＯＣ）、１−ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＭＯＣ）、９−アントラセニルメチルオキシカルボニル（ＡＮＭＯＣ）、３’−メトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＭＢＯＣ）、３’，５’−ジメトキシベンゾイニルオキシカルボニル（ＤＭＢＯＣ）、７−ニトロインドリニルオキシカルボニル（ＮＩＯＣ）、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルオシキカルボニル（ＢＮＩＯＣ）、５，７−ジニトロインドリニルオキシカルボニル（ＤＮＩＯＣ）、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、および上記の任意のものの非カルボネートベンジリック形態（例えば、ＮＶ、ＭｅＮＶなど）のような基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「化学的に除去可能な保護基」は、化学反応が別の反応部位で行われている間に、分子中の１つの反応部位を遮断するように設計され、そして化学薬剤への曝露、すなわち、放射への曝露以外の手段によって除去され得る任意の基をいう。例えば、化学的に除去可能な保護基の１つの型は、塩基への曝露によって除去可能である（すなわち、「塩基除去可能な保護基」）。特定の塩基除去可能な保護基の例として、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、２−シアノエチル（ＣＥ）、Ｎ−トリフルオロアセチルアミノエチル（ＴＦ）、２−（４−ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）、および２−（４−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル（ＮＰＥＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。化学的に除去可能な保護基の別の型は、求核試薬への曝露によって除去可能である（すなわち、「求核試薬除去可能保護基」）。求核除去可能な保護基の特定の例には、レブリニル（Ｌｅｖ）およびアリールオキシカルボニル（ＡＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。他の化学的除去可能な保護基は、酸に対する曝露によって除去される（すなわち、「酸除去可能保護基」）。特定の酸除去可能な保護基には、トリフェニルメチル（Ｔｒまたはトリチル）、４−メトキシトリフェニルメチル（ＭＭＴまたはモノメトキシトリチル）、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴまたはジメトキシトリチル）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ｔＢＯＣ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル（ＤＤｚ）、２−（トリメチルシリル）エチル（ＴＭＳＥ）、および２−（トリメチルシリル）エチルオキシカルボニル（ＴＭＳＥＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。別の型の化学的除去可能な保護基は、還元剤への曝露によって除去可能である（すなわち、「還元剤除去可能な保護基」）。還元剤除去可能な保護基の特定の例には、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニル（ＡＱＭＯＣ）および２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル（ＴＲＯＣ）が含まれるが、これらに限定されない。化学的に除去可能な保護基のさらなる例には、アリル（Ａｌｌ）およびアリルオキシカルボニル（ＡｌｌＯＣ）保護基が含まれる。化学的に除去可能な保護基の他の例は、当業者に公知である。
【００２４】
モノマー：モノマーは、２つ以上のモノマー単位から構成されるポリマーまたは化合物を形成するように互いに結合されたか、または互いに結合され得る低分子のセットのメンバーである。本発明は、固相合成において有用である組成物および方法に関して本明細書に記載される。多くの適用において、固相方法は、オリゴヌクレオチドのような生物学的ポリマーの調製のために使用される。これらの生物学的ポリマーのための、モノマーのセットには、例えば、ヌクレオチドのセットおよびペントースおよびヘキソースのセットが含まれるが、これらに限定されない。生物学的ポリマー内のモノマーの特定の順序は、ポリマーの「配列」として本明細書中で言及される。本明細書中で使用される場合、モノマーは、ポリマーの合成のための基本のセットの任意のメンバーをいう。モノマーの異なる基本セットは、ポリマーの合成における連続的な工程で使用され得る。さらに、セットの各々は、合成後に修飾される保護されたメンバーを含み得る。本発明は、ヌクレオチドのようなモノマーの配列を含有する分子の調製に関して主に本明細書中に記載されるが、他のポリマーの調製に容易に適用され得る。このようなポリマーには、例えば、核酸の直線状および環状の両方のポリマー、ポリサッカライド、リン脂質、およびα、β、またはωアミノ酸のいずれかを有するペプチド、公知の薬物が任意の上記のものに共有結合したヘテロポリマー、ポリヌクレオチド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド（ｐｏｌｙａｒｙｌｅｎｅ ｓｕｌｆｉｄｅ）、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、または本開示を検討すると明らかになる他のポリマーが含まれる。このようなポリマーは、異なるモノマー配列を有するポリマーが、基質の異なる指定された領域で形成された場合、「多様」である。ポリマーの環状化およびポリマー反転の方法は、本明細書中に参考として全ての目的で援用される「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｎ Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」と題された同時係属中の出願である米国特許第５，５５０，２１５号に開示されている。
【００２５】
固体支持体：本明細書で使用される場合、用語「固体支持体」または「基材」は、剛性の、または半剛性の表面を有する部材のことをいう。多くの実施態様において、支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるが、いくつかの実施態様では、例えば、ウェル、盛り上がった領域、エッチングした溝、などで、異なるポリマーについての合成領域を物理的に分離していることが所望であり得る。いくつかの実施態様では、支持体自体は、合成領域の全部かまたは一部を形成するウェル、溝、フロースルー領域、などを備える。他の実施態様に従って、小ビーズが、その表面に提供され得、そしてそこで合成された化合物が、合成の完了に伴って放出され得る。
【００２６】
チャンネルブロック：その表面上に、複数の溝またはくぼんだ領域を有する部材。溝またはくぼんだ領域は、縞、円、曲がりくねった路、などを含むが、これらに限定されない種々の幾何学的なコンフィギュレーションを取り得る。チャンネルブロックは、エッチングシリコンブロック、成型ポリマーまたは加圧ポリマー（ｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ）などを含む種々の様式で調製され得る。
【００２７】
異なるプローブを、支持体の表面の異なる既知の位置に合成するか、または付着させる。既知の位置は、任意の都合の良い形状（例えば、環状、長方形、楕円形、楔型など）を有し得る。いくつかの実施態様において、各異なるポリマー配列が合成される領域は、約１ｃｍ2より小さく、より好ましくは、１ｍｍ2よりも小さく、そしてなおより好ましくは、０．５ｍｍ2よりも小さい。最も好ましい実施態様では、その領域は、約１０，０００μｍ2よりも小さいか、またはより好ましくは、１００μｍ2よりも小さい面積を有する。これらの領域内で、そこで合成されたポリマーは、好ましくは、実質的に純粋な形態（例えば、優勢な種）で合成される。さらに、そのポリマーの複数のコピーは、代表的には、任意の公知の位置内で合成される。コピー数は、数千から数百万であり得る。
【００２８】
保護領域：保護領域は、オリゴヌクレオチドポリマーの形成について使用されない固体支持体の表面上の局在した領域である。従って、保護領域は、オリゴヌクレオチドが合成されることを意図されない、そして保護基を結合させた固体支持体の表面上の全ての領域として規定される。保護領域は、任意の従来の形状（例えば、環状、長方形、楕円形、楔形、など）を有し得る。いくつかの実施態様において、保護領域は、約１ｃｍ2よりも小さく、より好ましくは、１ｍｍ2よりも小さく、そしてなおより好ましくは、０．５ｍｍ2よりも小さい。最も好ましい実施態様では、保護領域は、約１０，０００μｍ2よりも小さい面積、またはより好ましくは、１００μｍ2よりも小さい面積を有する。
【００２９】
標的分子：本明細書で使用される用語「標的分子」は、アレイ上の複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それにより有利に検出および／または同定される１つの分子または複数の分子をいう。代表的には、標的分子は、種々の分子を含有する混合物（例えば、生物学的サンプル）中に含有される。本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、生物または生物の成分（例えば、細胞）から得られるサンプルをいう。サンプルは、任意の生物学的組織または体液であり得る。頻繁には、そのサンプルは、患者由来のサンプルである「臨床的サンプル」である。このようなサンプルには、疸、血液、血液細胞（例えば、白血球）、組織または細針生検サンプル、尿、腹膜液、および胸膜液、またはこれら由来の細胞を含むが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織学的目的のために取り出された凍結切片のような組織の切片を含み得る。本発明は、生物学的サンプル中の標的分子についてのアッセイにおいて特定の有用性を見出す。
【００３０】
核酸プローブ（ときどきオリゴヌクレオチドプローブといわれる）は、任意の長さであり得、そして任意の手段によって産生され得る。プローブには、６〜３０または１０〜２５塩基の範囲の長さを有するものもある。プローブには、１０００塩基以上の長さを有するものもある。プローブは、代表的には、一本鎖であり、そしてＤＮＡまたはＲＮＡあるいはＰＮＡのようなそれらのアナログであり得る。プローブは、予め合成されて、支持体にインタクトに結合されるか、またはインサイチュで支持体上で成分を連続的に付加することによって合成され得る。
【００３１】
（１．標的分子を含有するサンプルをアッセイする一般的な方法）
固体支持体上での多様な化学化合物の合成のための方法の出現により、このような化学ライブラリーのための多数の研究および診断的適用が発生した。これらの研究および診断適用の多くは、サンプルを、ペプチドおよびオリゴペプチドのような多数の生物学的ポリマー、または段階的な様式でビルディングブロックから合成された他の低リガンド分子が複数付着した固体支持体またはチップと接触させて、１つ以上の付着したポリマーまたは低リガンド分子と特異的に結合する任意の種を同定する。
【００３２】
例えば、１９９３年６月２５日に出願された特許出願第０８／０８２，９３７号は、標的核酸の完全配列を提供するために、および特定のオリゴヌクレオチド配列を含有する核酸の存在を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドプローブのアレイを作製するための方法を記載する。「Ｓｕｒｆａｃｅ Ｂｏｕｎｄ Ｕｎｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ」と題された米国特許第５，５５６，７５２号は、ｐ５３タンパク質および多くの癌状態に寄与する遺伝子と関連するもののようなタンパク質／ＤＮＡ結合相互作用を含む診断適用に使用され得る単一分子の二本鎖オリゴヌクレオチドのアレイを作製する方法を記載する。二本鎖オリゴヌクレオチドのアレイはまた、特定の結合親和性を有する新たな薬物をスクリーングするために使用され得る。
【００３３】
本発明の方法および組成物は、１つ以上の標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少するために有用である。これらの方法は、配列が公知である１つ以上の選択された標的分子に対して相補性を示すプローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを利用する。代表的には、これらのアレイは、米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９２／１００９２およびＷＯ９５／１１９９５（これらの各々が本明細書中に参考として援用される）に記載されるような固体支持体上の高密度のアレイ（「チップ上のＤＮＡ」）に固定される。一般的に、１つ以上の標的分子を含有するサンプルは、アレイ上の複数のオリゴヌクレオチドに対してアッセイまたはスクリーニングされ、サンプル中の標的分子を検出および／または同定し得る。この方法は、複数のオリゴヌクレオチドプローブをその上に有する固体支持体を提供する工程、複数の標的分子をオリゴヌクレオチドアレイと接触させる工程、およびその複数のオリゴヌクレオチドへのその標的分子のハイブリダイゼーションを検出する工程を包含する。ハイブリダイゼーションおよびアッセイ技術は、１９９７年２月２日に出願された同時係属中の米国特許第０８／７９７，８１２号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載される。発現分析技術は、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１０３６５（その全体が参考として援用される）に記載される。
【００３４】
種々のストラテジーが、チップ上にオリゴヌクレオチドアレイを整列しそしてディスプレイし、それにより、標的核酸に関して導き得るハイブリダイゼーションパターンおよび配列情報を最大化するために利用可能である。例示的なディスプレイおよび整列化ストラテジー（基本的なタイリングストラテジーを含む）は、本明細書に参考として援用されるＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１２３０５号、および１９９７年２月２日に出願された米国特許出願第０８／７９７，８１２号［１８５４７−０１８５５０］に記載される。１つ以上の標的分子をオリゴヌクレオチドアレイに曝露して、その標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションを決定する技術は、当該分野で公知である。
【００３５】
オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的な結合は、標的分子ではない分子がアレイにハイブリダイズするようである場合に生じる。非特異的結合の結果として、サンプル中の標的分子の定性的および／または定量的測定における精度の減少が生じる。非特異的結合は、多くの要因から生じ得る。非特異的結合は、サンプル内のタンパク質成分（例えば、フルオレセイン−ストレプトアビジンまたはフィコエリトリン−ストレプトアビジン）のオリゴヌクレオチドアレイへの結合から生じるようである。他の場合には、ＲＮＡフラグメント化またはＴｄＴ標識に使用される緩衝液中に存在する不溶性のマグネシウム、コバルト、または他の塩の沈殿した粒子の接着によって引き起こされるようである明るい「斑点」が生じる。両方の種類の非特異的結合は、ＥＤＡ中の最終基質脱保護の前に光分解していない反応していない保護基（例えば、ＭｅＮＰＯＣ保護基）を有するアレイまたはチップの領域において最も重度である。オリゴヌクレオチドプローブが合成されているチップ上の領域は、一般に、最も低い強度の蛍光非特異的結合を示す。光分解されていない表面のリンカー部位は、ＥＤＡと反応して、遊離の末端ヒドロキシ基の混合物ならびにアミノエチルカルバモイル残基を生成することが公知である。後者は、そのように処理された表面領域に正味の正電荷を与える。これは、負であるアレイのプローブ含有領域と対照をなす。本発明のいかなる特定の理論に縛られることを望まないが、これらの領域での正味の正電荷は、非特異的結合へ寄与すると考えられる。
【００３６】
（ＩＩＩ．固体支持体）
固体支持体は、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらの任意の組み合わせであり得、粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、管状材料、球体、容器、毛管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドなどとして、存在する。固体支持体は、好ましくは平坦であるが、代替の表面外形を取り得る。例えば、固体支持体は、隆起したまたは陥没した領域を含み得、ここで、合成が起こる。いくつかの実施態様において、固体支持体は適切な光吸収特性を提供するように選択される。例えば、支持体は、重合したＬａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、機能化したガラス、溶融シリカ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＮ4、アルミナまたは二酸化ケイ素のような金属酸化物フィルム、修飾したシリコンあるいは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデン二フッ化物、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはそれらの組み合わせのような種々のゲルまたはポリマーのいずれか１つであり得る。他の適切な固体支持体材料は、当業者にとって容易に明らかである。好ましくは、固体支持体の表面は、反応性基を含み、この反応性基は、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシ、チオールなどであり得る。より好ましくは、この表面は、光学的に透明であり、そして、シリカ表面上に見出されるような表面Ｓｉ−ＯＨ官能性を有する。
【００３７】
固体支持体の表面は、本質的に２つの領域、すなわち、複数の指定された領域（本明細書中で公知の領域とも呼ばれる）、および複数の保護領域に、分割される。プローブは、複数の指定された領域の各々において付着されるかもしくは合成されるか、付着されたかもしくは合成されたか、または今後付着されるかもしくは合成される。プローブは、任意のメカニズムによって付着され得るか、または合成され得る。例えば、比較的長いプローブが支持体にそのまま付着され得る。あるいは、プローブは、成分の段階的取り込みによって支持体上に合成され得る。表面の保護領域は、固体支持体の表面上の指定された領域から区別される。表面上の複数の保護領域の各々は、オリゴヌクレオチドが結合も合成もされておらず、そしてそこに除去可能な保護基を付着させた領域である。各保護領域の保護基は、好ましくは、標準の感光性または化学的に除去可能な保護基であり、これらの保護基は、市販され、そして放射または化学的条件に対する曝露によって除去可能であることが公知である。このような保護基の例として、ＦＭＯＣ、ＤＭＴ、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＰＯＣ、ＢＯＣ、ＡＬＬＯＣ、ｔ−ブチルエステルおよびｔ−ブチルエーテルが挙げられる。現在、保護領域のための好ましい保護基は、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＶＯＣまたはＭｅＮＰＯＣ基のような感光性保護基である。
【００３８】
本発明の１実施態様に従って、固体支持体の表面は、その表面上でのオリゴヌクレオチドの合成の前に、固体支持体の表面上の指定された領域の各々におけるリンカーモノマーの付着によって誘導体化され得る。リンカーモノマーを用いた誘導体化は、本発明の方法を実施するのに必須ではない。特に、ポリアニオン鎖が固体支持体の表面の指定された領域に付着される実施態様において、基板は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの合成の前にリンカーモノマーを用いて誘導体化されない。
【００３９】
固体支持体の表面がリンカーモノマーを用いて誘導体化される実施態様において、各オリゴヌクレオチドが、上記の一般的技術の適用によってリンカーモノマー上に合成される。このリンカーモノマーは、固体支持体を、一方の末端上に基板付着基を有し、遠位末端（表面から離れている）上に反応性部位を有する誘導体化試薬と反応させることによってこの固体支持体の表面に付着され、反応性部位の均一な分布を有する支持体表面を提供する。次いで、この誘導体化した表面をリンカー分子と接触させられる。このリンカー分子の各々は、誘導体化表面上の反応性部位と共有結合し得る反応性基を有する。リンカー分子は、さらに、保護基で保護される官能基を有する。接触は、固体支持体の表面へリンカー分子を結合するのに十分な時間をかけて行われる。
【００４０】
誘導体化試薬は、例えば、（ポリ）トリフルオロクロロエチレン表面を有する固体支持体を使用する炭素−炭素結合を介して、またはより好ましくは、シロキサン結合（例えば、固体支持体としてガラスまたはシリコン酸化物を使用する）によって、固体支持体に付着され得る。支持体の表面とのシロキサン結合は、トリクロロシリル基またはトリアルコキシシリル基を有する誘導体化試薬の反応を介する１実施態様において形成される。
【００４１】
使用される特定の誘導体化試薬は、特定のレセプター、タンパク質または薬物への、付着したオリゴヌクレオチドの提示を改良するために、その親水性／疎水性特性に基づいて選択され得る。上記のように、固体支持体への結合の前に、誘導体化試薬は、一方の末端に基板付着基を有し、そして他方の末端に反応性部位を有する。この反応性部位は、リンカーモノマー、ヌクレオチドモノマー、または負に荷電したホスフェートモノマーへの付着に対して適切である基である。例えば、シリカ表面への付着に対して適切な基として、トリクロロシリル官能基およびトリアルコキシシリル官能基が挙げられる。リンカーモノマー、ヌクレオチドモノマーまたは負に荷電したホスフェートモノマーへの付着に対して適切である基として、アミン、ヒドロキシル、チオール、カルボン酸、エステル、アミド、エポキシド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。さらに、合成の際の使用において、本明細書中で使用される誘導体化試薬は、典型的に、誘導体化試薬の遠位末端または終結末端（固体支持体の反対側）上の反応性部位に付着した保護基を有する。好ましい誘導体化試薬として、アミノアルキルトリアルコキシシラン、アミノアルキルトリクロロシラン、ヒドロキシアルキルトリアルコキシ−シラン、ヒドロキシアルキルトリクロロシラン、カルボキシアルキルトリアルコキシシラン、ポリエチレングリコール、トリエトキシシラン、エポキシアルキルトリアルコキシシラン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４２】
リンカーモノマーが各々の指定された領域において使用される実施態様において、誘導体化した表面は、リンカーモノマーと接触される。このリンカーモノマーは、固体支持体の誘導体化した表面上の反応性部位と反応性がある１つの中心を有する。さらに、リンカーモノマーは、保護基で保護され、そして、後に合成開始部位として役立ち得る官能基を有する。
【００４３】
本発明で使用されるリンカーモノマーは、好ましくは、そこで合成される任意のオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに曝される標的分子と自由に相互作用するのを可能にするのに十分な距離であり得る。リンカーモノマーは、それらのレセプターに対するリガンドの十分な曝露を提供するために、３〜５０原子長であるべきである。典型的には、リンカーモノマーは、アルキレン（（−ＣＨ2）n−）、アリールアセチレン、２〜１４個のモノマーユニットを含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、ジオール、二酸、アミノ酸、ペプチド、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施態様において、リンカーモノマーはポリヌクレオチドであり得る。使用される特定の連結分子は、その親水性／疎水性特性に基づいて選択され得、特定のレセプター、タンパク質または薬物への、そこで合成されるポリマーの提示を改良する。上記のように、誘導体化した表面への結合の前に、リンカーモノマーは、それぞれの末端に適切な官能基、すなわち、誘導体化表面上の反応性部位への付着に適切な一方の基、およびおよび合成開始部位として適切な他方の基を有する。例えば、誘導体化した表面への結合に適切な基として、アミノ、ヒドロキシ、チオール、カルボン酸、エステル、アミド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。さらに、オリゴヌクレオチドアレイまたはライブラリの合成の際の後の使用のために、本明細書中で使用されるリンカーモノマーは、典型的に、リンカーモノマーの遠位末端または終結末端（固体支持体と反対側）上の官能基に結合される保護基を有する。
【００４４】
リンカーモノマーは、表面の正味の疎水性または親水性の性質に寄与する。例えば、リンカーモノマーが−（ＣＨ2）n−のような炭化水素鎖を含む場合、湿潤性を軽減する効果がある。ポリオキシエチレン（−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−）鎖、またはポリアミド（−（ＣＨ2ＣＯＮＨ）n−）鎖を含むリンカーモノマーは、その表面をより親水性にし、これによって湿潤性が向上する傾向がある。１つの好ましい実施態様において、リンカーモノマーは、保護基を有するポリエチレングリコール分子を含む。リンカーモノマー上の保護基は、好ましくは、市販されそして典型的な化学的条件下で除去可能であることが公知である基を含む、標準の感光性または化学的に除去可能な保護基である。このような保護基の例として、ＦＭＯＣ、ＤＭＴ、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＰＯＣ、ＢＯＣ、ＡＬＬＯＣ、ｔ−ブチルエステル、およびｔ−ブチルエーテルが挙げられる。現在、リンカーモノマーに対して好ましい保護基は、ＮＶＯＣ、ＭｅＮＶＯＣ、ＭｅＮＰＯＣ、またはＤＭＴ基のような感光性基、あるいは化学的に除去可能な基である。
【００４５】
ＩＶ．一般的固相合成技術
オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体上の指定された領域にて合成され得、光指向性方法、フローチャネルおよびスポット法、ピンに基づく方法およびビーズに基づく方法を含む種々の従来の技術のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドアレイを製造する。固相合成のこれらの方法は、例えば、米国特許第５，６２４，７１１号および同第５，６７７，１９５号に詳細に記載され、これらの開示は、本明細書中において、全体を通して、参考として援用される。これらの技術の幾つかは、本明細書中以下で簡潔に記載される。
【００４６】
「光指向性」方法（ＶＬＳＩＰＳTM法として公知である方法の系統内の１技術である）は、米国特許第５，１４３，８５４号に記載され、これは以前に参考として援用された。’８５４特許で議論される光指向性方法は、基板または固体支持体の指定された領域を活性化する工程、および次いでこの表面を予め選択されたモノマー溶液と接触させる工程を包含する。この指定された領域は、典型的にはマスクを通して示される（たいてい、一体化した回路作製に使用されるフォトリソグラフィー技術の様式で）光源を用いて活性化され得る。表面の他の領域は不活性のままである。なぜなら、それらは、照明からのマスクによって遮蔽され、従って化学的に保護されたままであるからである。この様式で、光パターンは、基板のどの領域が所定のモノマーを反応するかを規定する。種々の組の、予め規定された、指定された領域を活性化する工程、および種々のモノマー溶液を基板と接触させる工程とを繰り返すことによって、ポリマーの様々なアレイが基板上に製造される。当然のことながら、この基板から未反応モノマー溶液を洗浄する工程のような他の工程は、必要に応じて使用され得る。
【００４７】
単一の基板上でのライブラリー合成に適用され得るさらなる方法は、米国特許第５，３８４，２６１号および同第５，６７７，１９５号に記載され、これらは、全ての目的のために、本明細書中において参考として援用される。これらの出願に開示される方法では、試薬は、（１）予め規定された領域上に規定されたチャネル内で流動する工程または（２）予め規定された領域上で「スポット」する工程のいずれかによって支持体に送達される。しかし、他のアプローチ、ならびにスポットする工程および流動する工程、またはフォトレジストの使用が使用され得る。それぞれの例において、モノマー溶液が種々の反応部位に送達される場合、表面のある活性化された領域は、他の領域から機械的に分離される。
【００４８】
本発明の化合物およびライブラリーに適用される典型的な「フローチャネル」法は、概して、以下のように記載され得る。様々なポリマーシーケンスは、適切な試薬が流動するかまたは適切な試薬が設置される支持体の表面上にフローチャネルを形成する工程によって、基板または固体支持体の指定された領域にて合成される。例えば、モノマー「Ａ」が選択された領域の第１グループ内の基板に結合されると想定。必要ならば、選択された領域の全てまたは一部内の基板の表面の全てまたは一部が、例えば、全てまたは幾つかのチャネルを通して適切な試薬を流動する工程、または基板全体を適切な試薬で洗浄する工程によって結合のために活性化される。支持体の表面上のチャネルブロックの設置後、モノマーＡを有する試薬が全てまたは幾つかのチャネルを通して流入するかまたはそのチャネル内に設置される。これらのチャネルは第１の指定された領域との流体接触を提供し、このことによって、第１の指定された領域内で、直接的にまたは間接的に（スペーサーを介して）表面上にモノマーＡを結合する。
【００４９】
その後、モノマーＢが第２の指定された領域にカップリングされ、それらの幾つかが第１の指定された領域に含まれ得る。この第２の指定された領域は、支持体の表面上でのチャネルブロックの転換、回転、または置換を介して；選択したバルブの開閉を介して；または一層の化学物質またはフォトレジストの累積を介して第２フローチャネルと流体接触する。必要ならば、少なくとも第２の領域を活性化するための工程が実施される。その後、モノマーＢは第２フローチャネルを介して流入されるかまたは第２フローチャネル内に設置され、第２の指定された位置にてモノマーＢを結合する。この特定の例において、プロセシングのこの段階で支持体に結合した得られたシーケンスは、例えば、Ａ、Ｂ、およびＡＢである、このプロセスは、支持体の表面上の既知の位置において所望の長さのシーケンスの莫大なアレイを形成するために繰り返される。
【００５０】
基板が活性化された後、モノマーＡは、幾つかのチャネルを通して流入され得、モノマーＢは、他のチャネルを通して流入され得、モノマーＣは、さらに他のチャネルなどを通して流入され得る。この様式において、多くのまたは全ての反応領域がモノマーと反応され、後に、チャネルブロックが移動されなければならないか、または基板が洗浄されおよび／または再活性化されなければならない。多くのまたは全ての有効な反応領域を同時に使用することによって、洗浄する工程および活性化工程の数が最小化され得る。
【００５１】
当業者は、チャネルを形成する、または別に支持体の表面の一部を保護する代替の方法が存在することを理解し得る。例えば、いくつかの実施態様に従って、親水性または疎水性コーティングのような保護コーティング（溶媒の性質に依存する）が、基板の保護されるべき部分にわたって利用され、時に、このコーティングは他の領域で反応物溶液によって湿潤を容易にする材料と組み合わされる。この様式では、流入する溶液はそれらの指定された流路の外側を通過することをさらに防がれる。
【００５２】
本発明の化合物およびライブラリを調製する「スポットティング」法は、フローチャネル法とほぼ同じ様式で実行され得る。例えば、モノマーＡが、適切に活性された反応領域の第１グループに送達され得、そしてカップリングされ得る。その後、モノマーＢは、活性化された反応領域の第２グループに送達され得、そして第２グループと反応され得る。上記のフローチャネル実施態様と異なり、指定された領域内で、それらの比較的少量を（流入するよりむしろ）直接堆積する工程によって反応物が送達される。当然のことながら、いくつかの工程において、支持体の表面全体が溶液で噴霧され得るか、または他の方法でコーティングされ得る。好ましい実施態様において、ディスペンサーが領域間を移動し、各工程において必要な量のモノマーのみ堆積する。典型的なディスペンサーとして、表面にモノマー溶液を送達するためのマイクロピペットおよび表面に対するマイクロピペットの位置を制御するためのロボットシステム、またはインクジェットプリンタが挙げられる。他の実施態様において、ディスペンサーは、一連のチューブ、マニホルド、一列に並んだピペットなどを備え、その結果、種々の試薬が同時に反応領域に送達され得る。
【００５３】
本発明の化合物およびライブラリの調製の有用な別の方法として、「ピンに基づく合成」が挙げられる。この方法は米国特許第５，２８８，５１４号で詳細に記載され、これは本明細書中にて以前に参考として援用された。この方法は、複数のピンまたは他の伸長物を有する基板を利用する。ピンは、トレイ中の個々の試薬容器にそれぞれ同時に挿入される。共通の実施態様において、一列に並んだ９６ピン／容器が利用される。
【００５４】
各トレイは、個々のピン上の特定の化学反応でカップリングするための特定の試薬で充填される。従って、このトレイは、しばしば、異なる試薬を含む。本明細書中で開示される化学は、比較的同様の組の反応条件が各反応を実施するために利用され得るように確立されているため、複数の化学カップリング工程を同時に行うことが可能となる。このプロセスの第１工程において、本発明は、化学カップリング工程が行われる基板の使用を提供する。基板は、必要に応じて、活性部位を有するスペーサーと共に提供される。オリゴヌクレオチドの特定の場合において、例えば、スペーサーは、合成に関連した有機環境および結合研究と関連した水性環境において使用され得る広範な分子から選択され得る。適切なスペーサーの例は、例えばメトキシ基およびエトキシ基と置換されたポリエチレングリコール、ジカルボン酸、ポリアミンおよびアルキレンである。さらに、スペーサーは、遠位末端に活性部位を有する。この活性部位は必要に応じて始めに保護基によって保護される。有用である広範な種々の化学的に除去可能な保護基の中には、ＦＭＯＣ、ＢＯＣ、ｔ−ブチルエステル、ｔ−ブチルエーテルなどがある。種々の例示的な保護基は、例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載され、これは本明細書中において参考として援用される。いくつかの実施態様において、スペーサーは、例えば酸または塩基に対する曝露によって開裂可能な機能を提供し得る。
【００５５】
固体支持体におけるポリマーおよび小リガンド分子の合成に有用ななお別の方法は、「ビーズに基づく合成」である。ビーズに基づく合成のための一般的なアプローチは、米国特許第５，５４１，０６１号に記載され、この開示は、本明細書中に参考として援用される。
【００５６】
ビーズ上のオリゴヌクレオチドのような分子の合成のために、大量のビーズが、容器中の適切なキャリア（例えば、水）中に懸濁される。このビーズは、活性部位を有する任意のスペーサー分子と共に提供される。活性部位は、任意の保護基によって保護される。
【００５７】
合成の第一工程では、ビーズを、複数の容器に、カップリングさせるために分割する。この簡単な説明のため、容器の数を３つに限定し、モノマーをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦと記す。次いで、保護基を取り除き、そして合成されるべき分子の第一部分を、３つの容器の各々に添加する（すなわち、Ａを容器１に添加し、Ｂを容器２に添加し、そしてＣを容器３に添加する）。
【００５８】
その後、種々のビーズを、過剰の試薬で適当に洗い流し、そして１つの容器中に再混合する。再度、最初に利用される多数のビーズによって、同様に、多数のビーズが、容器中に無作為に分散され、その各々は、その表面上に、合成されるべきモノマーの特定の第一部分を有することが認識される。
【００５９】
その後、種々のビーズを再度、３つの容器の別の群において、カップリングさせるために分割する。第一の容器中のビーズを脱保護し、そして第二のモノマー（Ｄ）に曝露し、一方、第二および第三の容器中のビーズを分子部分ＥおよびＦのそれぞれにカップリングさせる。従って、分子ＡＤ、ＢＤ、および、ＣＤが、第一の容器中に存在するが、一方、ＡＥ、ＢＥ、およびＣＥが、第二の容器中に存在し、そして分子ＡＦ、ＢＦ、およびＣＦが第三の容器中に存在する。しかし、各ビーズは、その表面上に、単一のタイプの分子のみを有する。従って、第一の部分Ａ、Ｂ、Ｃと第二の部分Ｄ、Ｅ、Ｆとから形成される可能な分子の全てが、形成されている。
【００６０】
次いで、ビーズを１つの容器中に組み入れ、そしてポリマー分子の合成を完了するために、さらなる工程を行う。好ましい実施態様では、ビーズは、特定の二本鎖オリゴヌクレオチドに独特の認識タグまたは各ビーズ上に存在するプローブでタグ化される。合成ライブラリーにおける使用のための認識タグの完全な記載は、欧州特許公開第０６０４５５２号（１９９２年９月１６日出願）に提供される。
【００６１】
固体支持体上のポリマー合成のための一般的な光指向性方法は、固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための、現在、１つの好ましい方法である。この一般的な技術における変法もまた、米国特許第５，６２４，７１１号（その全体が、本明細書中において参考として既に援用されている）において記載される。簡潔には、オリゴマー合成のためのこの技術は、保護基が、指定された領域の各々に位置するように感光性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）保護基を付着させた、指定された領域を有する固体支持体を構成することを包含する。上述の一般方法の節で記載のフォトリソグラフィー技術を用いて、感光性保護基は、１つの指定された領域から除去され得、そして化学的に除去可能な保護基を有するヌクレオチドモノマーが、モノマーカップリングのためのホスホルアミダイト化学を使用して付着される。本発明のこの特定の実施態様は、モノマーカップリングのためにホスホルアミダイト化学の使用を例示するが、モノマーはまた、Ｈ−ホスホネート法または当業者に公知の他のカップリング方法を用いて、増大中のオリゴマーに付加され得る。
【００６２】
標準的な化学的に除去可能な保護基には、市販の基、および代表的な化学条件（例えば、酸、塩基、酸化剤、還元剤もしくは他の化学薬剤への曝露）下で除去可能であることが公知である基が含まれる。このような保護基の例としては、ＦＭＯＣ、ＤＭＴ，ＢＯＣ，ｔ−ブチルエステルおよびｔ−ブチルエーテルが挙げられる。このような保護されたヌクレオチドモノマーの付着後、保護基は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ，１９９１（本明細書中に参考として以前に援用された）に記載される条件下で除去される。化学的に除去可能な保護基で以前に保護された反応性官能基は、次いで、例えば、以下の式の誘導体を用いて、感光性保護基で再保護される：
Ｒ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｘ
ここで、Ｒは、感光性部分（例えば、ｏ−ニトロベンジル、（２−ニトロベラトリルオキシカルボニル、α−メチル−２−ニトロベラトリルオキシカルボニル、２−ニトロピペロニルオキシカルボニル、α−メチル−２−ニトロピペロニルオキシカルボニル、２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル、α−メチル−２，６−ジニトロベンジルオキシカルボニル、２−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、２−メチル２−（２−ニトロフェニル）エチルオキシカルボニル、１−ピレニルメチルオキシカルボニル、９−アントラセニルメチルオキシカルボニル、３’−メトキシベンゾイニルオキシカルボニル、３’，５’−ジメトキシベンゾイニルオキシカルボニル、７−ニトロインドリニルオキシカルボニル、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルオキシカルボニル、５，７−ジニトロインドリニルオキシカルボニル、２−アントラキノニルメチルオキシカルボニルを含む）であり、そしてＸは、適切な脱離基（例えば、Ｃｌ、Ｆ、ペンタフルオロフェノキシ、ｐ−ニトロフェノキシ、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、アダマンタンカルボキシ、またはテトラゾリル）である。好ましくは、誘導体は、ＭｅＮＰＯＣ、ＭｅＮＶＯＣ、またはＮＶＯＣ基の適切に活性化された誘導体である。適切に活性化された誘導体の例は、ＭｅＮＰＯＣの混合された無水誘導体（例えば、ＭｅＮＰＯＣ塩化物とトリエチルアンモニウムピバロエート（ｐｉｖａｌｏａｔｅ）との反応により調製されたＭｅＮＰＯＣピバロエート）またはＭｅＮＰＯＣのカーボネート（例えば、ＭｅＮＰＯＣ塩化物とペンタフルオロフェノールとの反応により産生されたカーボネート）のような試薬を含む。
【００６３】
このような試薬を用いる表面官能基の再保護は、代表的には、非求核塩基を含む有機溶媒（例えば、２，６−ルチジン、ピリジン、トリエチルアミン、またはジイソプロピルエチルアミン）中で実施される。いくつかの実施態様では、求核触媒（例えば、Ｍ−メチルイミダゾール、ヒドロキシベンゾトリアゾール、または４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン）もまた、再保護工程の速度および効率のさらなる増大を提供するように含まれる。
【００６４】
感光性保護基を付加した後、ＶＬＳＩＰＳサイクルは、フォトリソグラフィック脱保護、続いてさらなるヌクレオチドモノマーのカップリング、保護基置換などを用いて、所望のオリゴマーが完成するまで継続され得る。好ましくは、このサイクルは、１〜１２０回繰り返される。
【００６５】
例示される感光性脱保護基（ＭｅＮＰＯＣ）は、ＮＶＯＣのような別の感光性保護基、または従来公知の他の感光性保護基で置換され得る。一旦、化学的に除去可能な保護基が除去されると、感光性保護基が、混合された保護基の無水物を用いて添加され得る。本方法は、従来のＶＬＳＩＰＳ合成を超える特定の利点を提供する。例えば、化学的に除去可能な保護基を有する多数のモノマーは市販されている。
【００６６】
リンカーモノマーが、指定された領域に付着された実施態様では、オリゴヌクレオチド合成のための前述の方法が等しく適用可能である。例えば、ヌクレオチドモノマーを反応させ、それによりリンカーモノマーに付着される。これは、各リンカーモノマー中の化学的に除去可能な保護基を感光性保護基で置換すること、および以前のヌクレオチドモノマーへの各ヌクレオチドモノマーの付着のために上述した光指向性方法を用いることによって感光性保護基の位置でヌクレオチドモノマーを付着させることによる。上述のように、各ヌクレオチドモノマーは、化学的に除去可能な保護基を有する。これは、感光性保護基での置換および光指向性方法を用いる反応によって、別のヌクレオチドモノマーの付着を可能にする。ヌクレオチドモノマー上のいかなる残存する官能基も、キャップまたは保護される。
【００６７】
一般的な光指向性技術についての別の変法は、１９９７年１１月１３日に出願された同時係属出願第０８／９６９，２２７号に記載の方法を包含し、その記載事項は、あらゆる目的のために、その全体が、参考として援用される。簡潔には、この方法は、表面でのオリゴヌクレオチドの製造のために、化学的に除去可能な保護基（例えば、上記の保護基）を有するヌクレオチドモノマーを用いる。本方法に従って、放射シグナルは、例えば、光活性化剤（これは、光活性化触媒（ＰＡＣ）である）を含む触媒系によって検出される。光活性化剤は、自己触媒剤（または「増強剤」）を活性化し、これは、後続の化学反応において、光子の有効量子収量を増大させる。このような後続の反応は、パターン化されたアレイの合成における化学的に除去可能な保護基の除去を包含する。
【００６８】
特定の実施態様では、光酸生成因子（ｐｈｏｔｏａｃｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）（すなわち、光活性化酸触媒（ＰＡＡＣ））が照射される。光酸生成因子から生じた得られた酸は、自己触媒剤を活性化し、酸触媒反応を受け、それ自体、付着された分子またはオリゴマーから酸不安定保護基を除去する酸を生成させる。
【００６９】
本方法の１つの実施態様によれば、化学的に除去可能な保護基を有するモノマーが基材の表面に提供される。モノマーは、リンカーモノマー、ヌクレオチドモノマー、または負に荷電したリン酸単位および保護基を有するモノマーであり得る。光活性化剤および自己触媒剤を含む活性化層（または「触媒系」）もまた、表面に提供される。基材の表面上の選択された領域のセットは、周知のリソグラフ方法（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｌ．Ｆ．、Ｗｉｌｌｓｏｎ、Ｃ．Ｇ．、およびＢｏｗｄｅｎ、Ｍ．Ｊ．、ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＯ ＭＩＣＲＯＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、２１２−２３２頁、１９９４（これは、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）において議論される）を用いて放射に曝露される。
【００７０】
領域選択照射により活性化された光活性化剤は、自己触媒剤の反応を開始させるように作用する。自己触媒剤は、第一の選択された領域中で基材に付着された分子またはオリゴマーから保護基を除去する少なくとも１つの生成物を生成する。好ましくは、自己触媒剤は、触媒様式で保護基を除去し得る。次いで、基材は、洗浄されるか、またはそうでなければ、付加される次のモノマーと接触させられ、次いで以前に付加されたモノマーの曝露された官能基と反応する。
【００７１】
その後、選択された領域の第二のセットが、放射に曝露される。照射開始反応は、選択された領域の第二のセット中の分子上の保護基を除去する。この基材は、次いで、添加される次のモノマーと接触させられる。このモノマーは、曝露された官能基との反応のために化学的に除去可能な保護基を有する。このプロセスは、所望の長さおよび所望の化学配列のポリマー（例えば、オリゴヌクレオチド）が得られるまで、モノマーを選択的に適用することを繰り返される。次いで、保護基は、必要に応じて除去され、配列は、その後、必要に応じてキャップされる。側鎖保護基はまた、存在する場合、必要に応じて除去される。
【００７２】
本方法の他の実施態様では、化学的に除去可能な保護基は、塩基、酸化剤、または還元剤への曝露によって除去される。各実施態様において、光活性化剤および自己触媒剤は、所定の保護基の除去のための適切な化学試薬が生成され、そしてそれにより保護基が除去されるようなものである。塩基、酸化剤、または還元剤の生成は、フォトレジストの分野で従来公知である光活性化剤を使用し、そして酸触媒を生成する例において上記で提供した指針を適用して達成され得る。
【００７３】
基材上でオリゴヌクレオチドポリマーを生成する、一般的な光指向性方法に対するなお別の改善は、Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｂｒｏｃｋらに発行された米国特許第５，６５８，７３４号に記載される。この開示内容は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。この方法もまた、表面でのオリゴヌクレオチドの生成のために、化学的に除去可能な保護基を有するヌクレオチドモノマーを用いる。簡潔には、本方法は、基材に付着される基盤分子（例えば、化学的に除去可能な保護基を有する第一のヌクレオチドモノマー、または化学的に除去可能な保護基を有するリンカーモノマー、または化学的に除去可能な保護基を有するポリアニオン鎖）の層上に展開可能なポリマーの層をコーティングすることを包含する。基盤分子は、リンカーモノマーまたはポリアニオン鎖を介して基材に付着され得る。この方法において使用するための適切なポリマーとしては、可溶性ポリイミドおよびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）が挙げられる。展開可能なポリマーは、適切なコーティング溶媒（例えば、アニソール、水（ＰＶＡに対して）、Ｎ−メチルピロリドン、またはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）中に溶解される。
【００７４】
展開可能なポリマーは、周知技術（例えば、スピンもしくはスプレーコーティング、またはドクターブレード処理）を用いて基盤分子の層上にコーティングされ得る。好ましくは、次いで、ポリマー層が加熱されて、キャスティング溶媒を除去する。
【００７５】
その後、ポリマー性放射感受性レジストが、展開可能なポリマー層の適用に類似の様式で、展開可能なポリマー層上にコーティングされる。好ましいレジストは、架橋ネガティブトーンレジスト（ｃｌｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｏｎｅ ｒｅｓｉｓｔ）であり、これは、リソグラフパターンをレジストから展開可能なポリマーを介して転写させるために利用される有機溶媒に対して抵抗性である。適切なレジストとしては、架橋エポキシレジスト、環状化ゴムレジスト（例えば、ＫＴＦＲ）、ポリビニルシンナメート（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｉｎｎａｍａｔｅ）レジスト（例えば、ＫＰＲ）、およびＷ．ＤｅＦｏｒｅｓｔ、ＰＨＯＴＯＲＥＳＩＳＴ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７５およびＷ．Ｍｏｒｅａｕ、ＳＥＭＩＣＯＮＤＵＣＴＯＲ ＬＩＴＨＯＧＲＡＰＨＹ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８８に記載のレジストが挙げられる。
【００７６】
適用後、レジスト層の選択領域は、放射に曝露され、そしてレジスト中の潜在画像は、適切な現像溶媒（これらの多くは、フォトレジストリソグラフィーの分野において公知である）を用いて現像される。放射曝露の画像は、適切な溶媒の使用によって、レジスト層および展開可能なポリマー層を介して下層の基盤分子層に現像される。このように下層の基盤分子層の剥き出しにされた部分が、次いで、処理されて、曝露された分子から化学的に除去可能な保護基を除去し、そしてそれにより、曝露された基盤分子を活性化させる。好ましくは、曝露された基盤分子は、各分子から保護基を開裂するために、溶液で処理される。適切な開裂溶液の例としては、強酸、およびアンモニア、アミン、もしくは他の強塩基の溶液、ならびに酸化剤および還元剤が挙げられる。
【００７７】
曝露された基盤分子上の化学的に除去可能な保護基の除去後、レジスト層の残りの部分および展開可能なポリマー層が除去される。続いて、次のモノマーが適用され、これは、曝露された、保護されない、基盤分子に結合する。基盤分子への第二のモノマーの付加により生成されたオリゴマーは、次いで、プロセスの次の反復のための基盤となる。これらの工程は、所望の数のモノマー単位が接続されてポリマーを提供するまで、繰り返される。
【００７８】
前出の方法の各々は、固体支持体の表面上でのオリゴヌクレオチドの生成のために当業者によって用いられ得る一般的な技術を例示する。当業者に明らかであるように、モノマー上で種々のタイプの保護基を利用することもまた可能である。例えば、連結モノマーは、感光性保護基を利用し得るが、一方、ヌクレオチドモノマーは、化学的に除去可能な保護基を利用する。保護領域上の保護基は、化学的に除去可能な保護基であり得、一方、リンカーおよびヌクレオチドモノマー上の保護基は感光性保護基である。前出の方法のいずれにおいても、全ての保護基が同一でなければならないということは必要ない。前出の技術のいずれかが、必要とされるような異なる活性化因子の組み合わせにより、異なるタイプの保護基を除去するために用いられ得る。前出の方法のこのような類似の組み合わせは、当業者の範囲内である。
【００７９】
（ＶＩ．表面修飾）
１つの実施態様においてオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるための本発明の方法は、固体支持体の表面修飾を包含する。オリゴヌクレオチドアレイへの標的分子の非特異的結合を減少させるために、表面修飾のいくつかの方法が利用され得る。
【００８０】
（保護領域からの保護基の除去）
本発明の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合は、固体支持体の表面上の保護領域で保護基を除去することにより減少される。表面の保護領域上の保護基は、複数の保護領域の各々から保護基を除去するために、保護領域の各々を適切な活性化因子に曝露することにより除去され得る。オリゴヌクレオチド合成に使用するための上記に列挙された活性化因子は、保護領域からの保護基の除去のために用いられ得る。
【００８１】
いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、複数の保護領域の各々からの保護基の除去が、固体支持体の表面上の極性の変化のために、オリゴヌクレオチドアレイへの標的分子の非特異的結合を減少させると考えられる。この変化は、これらの保護基の除去によって引き起こされる。より詳細には、保護基の除去は、非特異的結合における寄与因子であると考えられる、これらの保護基が有する正電荷を除去する。この正電荷の除去は、それにより、非特異的結合への１つの寄与因子を除去する。
【００８２】
（保護領域上の保護基の置換）
本発明の別の実施態様において、固体支持体の表面は、保護領域上の保護基を、負に荷電したリン酸残基で置換することにより改変される。この表面の保護領域上の保護基は、有利には、複数の保護領域をアクチベータに曝して活性化部位を生成すること、およびこの活性化部位を、負に荷電したリン酸残基を複数の保護領域の各々に共有結合する化合物と反応することにより、負に荷電したリン酸残基で置換され得る。採用されるアクチベータは、オリゴヌクレオチド合成および保護基の除去において使用するために、上記に記載の任意の適切なアクチベータであり得る。活性化部位と反応する化合物は、以下の式Ｉおよび式ＩＩからなる基から選択される：
【００８３】
【化５】
【００８４】
【化６】
ここで、ＤＭＴはジメトキシトリチル保護基、Ｘは塩基で除去可能な保護基（例えば２−シアノエチル）、およびｉＰｒ2Ｎはジイソプロピルアミノ保護基である。
【００８５】
有利なことに、式ＩまたはＩＩの化合物は市販されている。式ＩまたはＩＩの範囲内の適切な化合物の例は、Ｘが２−シアノエチルである規定された化合物を含むがこれに限定されない。これらの化合物は、表面の保護領域上の保護基を置換する方法における使用に好適である。これら化合物の活性化部位との反応は、固体支持体の表面上の活性化部位を、溶液相中で、式ＩまたはＩＩの化合物の上記保護領域への共有結合が起こるに十分な時間、このような化合物に接触することにより実施され得る。この方法における使用に適切な試薬は、無水アセトニトリル中の０．４５Ｍテトラゾールを含むがこれに限定されない。好ましくは、式ＩまたはＩＩの化合物は、約０．５分〜約１５分の期間の間活性化部位と反応させる。採用される技法は、オリゴヌクレオチド合成について上記に記載の技法と同じかまたは類似である。
【００８６】
本発明の１つの実施態様では、基板の表面は、基板の表面上の指定領域および保護領域の１つまたは両方で、シチジンの単層を提供するように改変される。
【００８７】
別の実施態様では、この表面の保護領域上の保護基は、ポリアニオン鎖の付着により置換され得る。この固体支持体の表面上の保護領域および指定領域のいずれかまたは両方へのポリアニオン鎖の付着のための方法を、以下に記載する。
【００８８】
（ポリアニオン鎖の付着）
本発明の別の方法によれば、固体支持体の表面は、ポリアニオン鎖で誘導体化される。このポリアニオン鎖は、この表面の指定領域（オリゴヌクレオチドが付着する場所）で、リンカーモノマーの代わりに付着され得る。この実施態様では、指定領域の各々でリンカーモノマーを提供するよりむしろ、ポリアニオン鎖が代わりに提供され、そしてオリゴヌクレオチドが、付着するか、またはこの表面の指定領域でポリアニオン鎖の各々上で合成される。別の実施態様では、このポリアニオン鎖は、この固体支持体の表面上の保護領域の各々でのみ付着する。この実施態様では、この表面の指定領域は、好ましくは、上記のようなそれに付着したリンカーモノマーを有する。なお第３の実施態様では、ポリアニオン鎖は、ｉ）指定領域の各々およびｉｉ）保護領域の各々の両方に付着され得る。このポリアニオン鎖の、この固体支持体の表面上の指定領域および保護領域のいずれかまたは両方への付着は、ハイブリダイゼーションアッセイの間に標的分子のオリゴヌクレオチドプローブへの非特異的結合を低減する効果を有する。本発明の方法の１つの好適な実施態様では、ｉ）指定領域およびｉｉ）保護領域の少なくとも１つが、それに付着したポリアニオン鎖を有し、その結果この固体支持体の表面が指定領域および保護領域の１つまたは両方でポリアニオン鎖を含むように改変される。
【００８９】
ポリアニオン鎖は、この表面上の所望の領域（単数または複数）に、所望の領域（単数または複数）でポリアニオン鎖を合成もしくは形成することか、または所望の領域（単数または複数）で予備形成されたポリアニオン鎖を付着することのいずれかにより付着され得る。この固体支持体の表面は、ポリアニオン鎖の付着のために、リンカーモノマーの付着のために上記で論議した様式で、誘導体化試薬を利用することにより調製され得る。第１の実施態様では、このポリアニオン鎖は、所望の領域（単数または複数）で、負に荷電したリン酸単位および所望の領域（単数または複数）（すなわち、ｉ）表面上の指定領域の各々またはｉｉ）表面上の保護領域の各々の少なくとも１つまたは両方）に対する保護基を有するモノマーを付着することにより形成され、その結果、このモノマーは、所望の領域（単数または複数）に共有結合する。その後、このモノマーは、アクチベータに曝され、保護基を除去し、それによって第１のモノマーにモノマーの単位を付加するさらなるモノマーと反応し得る活性化部位を生成し、それによってポリマー鎖を構築する。このモノマーをアクチベータに曝して活性化部位を生成する工程およびさらなるモノマーと反応する工程を、０〜２０回繰り返し、所望の領域（単数または複数）でポリアニオン鎖を生成する。
【００９０】
ポリアニオン鎖を構築するために利用されるモノマーは、有利には、負に荷電したリン酸単位および感光性または化学的に除去可能な保護基を有し、そして選択された特定の固体支持体の表面に付着し得る、任意の市販のモノマーを含む。例えば、所望の領域（単数または複数）でポリアニオン鎖を形成するための適切なモノマーは以下の式ＩＩＩで示されるモノマーである：
【００９１】
【化７】
ここでＲ1は、ヌクレオシド成分、デオキシリボース成分、Ｃ1-8アルキレン、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ここでｍは１〜８の整数である）からなる群から選択され；Ｒ2は、ジメトキシトリチル保護基およびＭｅＮＰＯＣ保護基からなる群から選択され；Ｘは、塩基で除去可能な保護基（例えば、２−シアノエチル）；そしてｉＰｒ2Ｎは、ジイソプロピルアミノ保護基である。上記式ＩＩＩの範囲内の好適なモノマーの特定の例は、Ｘが２−シアノエチル、Ｒ1がＣ3または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）3−、そしてＲ2がＤＭＴまたはＭｅＮＰＯＣである規定されたポリマーを含むがこれに限定されない。
【００９２】
リンカーおよびヌクレオチドモノマーとともに利用される保護基の場合のように、ポリアニオン鎖を生成するために用いられるモノマーに対して利用される保護基は、化学的に除去され得るかまたは感光性の保護基であり得る。従って、感光性保護基を除去するために利用されるアクチベータは、電子ビーム、γ線、ｘ線、紫外線照射、光、赤外線照射、マイクロ波、電流、電波、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。化学的に除去可能な保護基を除去するために利用されるアクチベータは、酸、塩基、酸化剤、および還元剤からなる群から選択される。１つの好適な実施態様では、この保護基は、感光性保護基であり、そしてモノマーをアクチベータに曝す工程は、光をモノマーの各々に適用し、感光性保護基を除去し、そしてさらなるモノマーとの反応のために活性化部位を生成することを含む。あるいは、予備形成されたポリアニオン鎖を、複数の保護領域の各々で化学的に除去可能な保護基を感光性保護基で置換すること、および保護領域の各々にポリアニオン鎖を付着する光指向性方法を用いることか、またはオリゴヌクレオチド合成のための上記に記載のその他の一般的な技法のいずれかを用いることにより、この保護領域の各々に付着し得る。
【００９３】
予備形成されたポリアニオン鎖が、表面の所望の領域（単数または複数）に付着する実施態様では、この方法は、所望の領域（単数または複数）の各々に、負に荷電したリン酸単位のポリマーのポリアニオン鎖を付着することを含む。所望の領域に付着され得る１つのポリアニオン鎖は、以下の式ＩＩＩ−Ａのポリアニオンである：
【００９４】
【化８】
ここでＲ1は、ヌクレオシド成分、デオキシリボース成分、Ｃ1-8アルキレン、および−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）m−（ここでｍは１〜８の整数であり、そしてｎは０〜１８の整数である）からなる群から選択される。所望の領域に付着され得るポリアニオン鎖のその他の例は、ポリカルボキシセルロース、ポリカルボキシデキストラン、ポリビニルリン酸，ポリビニルホスホン酸、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、およびポリアクリル酸を含むがこれらに限定されない。
【００９５】
適切な予備形成されたポリアニオン鎖は、有利には、市販されるか、または当業者に公知の技法を用いて生産され得る。
【００９６】
予備形成されたポリアニオン鎖の複数の指定領域の各々への付着は、表面の指定領域へのリンカーモノマーの付着のための上記と同じ技法を用いて達成され得る。予備形成されたポリアニオン鎖の複数の保護領域の各々への付着は、保護領域の各々で、化学的に除去可能な保護基をアクチベータに曝し、活性化部位を提供すること、およびこの活性化部位を、予備形成されたポリアニオン鎖と反応させ、ポリアニオン鎖を保護領域の各々に共有結合することにより達成され得る。あるいは、予備形成されたポリアニオン鎖は、複数の保護領域各々で、化学的に除去可能な保護基を、感光性保護基で置換すること、およびこのポリアニオン鎖を保護領域の各々に付着する光指向性方法を用いることにより保護領域の各々に付着され得る。
【００９７】
形成または付着したポリアニオン鎖は、鎖の遠位端（すなわち、固体支持体の表面の反対の末端）に保護基を含む。ポリアニオン鎖が、表面の指定領域に付着する実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブが、上記に記載の光指向性技法を用いてポリアニオン鎖の遠位端に付着する。詳細には、このオリゴヌクレオチドは、ポリアニオン鎖の各々上の保護基をアクチベータに曝し保護基を除去することによりポリアニオン鎖上で合成され得、そして活性化部位を提供する。次いでこの活性化部位を、第１のヌクレオチドモノマーと反応させ得、この第１のヌクレオチドモノマーのポリアニオン鎖鎖への共有結合を提供する。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドを、ポリアニオン鎖の各々の遠位端で化学的に除去可能な保護基の各々を、感光性保護基で置換すること、および第１のヌクレオチドモノマーを、光指向性方法を用いてポリアニオン鎖の遠位端に付着することによるか、またはオリゴヌクレオチド合成のための上記のその他の一般的技法のいずれかを用いてポリアニオン鎖上で合成する。このように、第１のヌクレオチドモノマーを、複数の指定領域の各々でポリアニオン鎖に付着する。さらなるヌクレオチドモノマー単位を、オリゴヌクレオチド合成のための上記の一般的技法を用いてこの第１のヌクレオチドモノマーに付加する。
【００９８】
当業者に明らかなように、２つ以上の先に記載の表面改変方法は、オリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を低減するために組み合わせられ得る。例えば、基板の表面は、保護領域上の保護基の除去、および指定領域へのポリアニオン鎖の付着により改変され得る。別の例として、基板の表面は、保護領域上の保護基の置換および指定領域へのポリアニオン鎖の付着により改変され得る。なお別の例として、領域の一部分を別に処理し得、その結果、例えば、保護基は保護領域の一部分から除去され、その一方、ポリアニオン鎖は、保護領域の別の一部分で付着される。これらの技法の組み合わせの多くのバリエーションは、これらの例に基づけば、当業者の範囲内にあり、そしてこれらの組み合わせは、それ故本発明により意図される。
【００９９】
（ＶＩＩ．オリゴヌクレオチド改変）
オリゴヌクレオチドアレイに対する標的分子の非特異的結合を低減するための他の方法は、固体支持体の表面上の複数の指定領域の各々に付着したオリゴヌクレオチドを改変することを含む。オリゴヌクレオチド改変は、オリゴヌクレオチドの遠位端または終点端（すなわち、オリゴヌクレオチドが付着される表面の反対の末端。）で保護基を除去するか、または保護基を、負に荷電したリン酸残基またはポリアニオン鎖のいずれかで置換する形態であり得る。
【０１００】
（オリゴヌクレオチドからの保護基の除去）
上記の方法に従って生成されたオリゴヌクレオチドは、その遠位端に保護基を有する。オリゴヌクレオチド（ポリマー）を形成するために付加される各ヌクレオチドモノマーは、オリゴヌクレオチドを構築するプロセスにおいて次の引き続くモノマーの付着を可能にする保護基を有する。従って、付加される最後のモノマーは、その上に保護基を有する。この保護基は、オリゴヌクレオチドの遠位端における保護基である。
【０１０１】
保護基は、表面上のオリゴヌクレオチドの各々をアクチベータに曝し、複数のオリゴヌクレオチドの各々から保護基を除去することによりオリゴヌクレオチドから除去され得る。オリゴヌクレオチド合成における使用のために上記に列挙されたアクチベータは、オリゴヌクレオチドの遠位端からの保護基の除去のために採用され得る。オリゴヌクレオチドからの保護基の除去は、上記に既に記載の理由のために非特異的結合を低減すると考えられる。
【０１０２】
（オリゴヌクレオチド上の保護基の置換）
オリゴヌクレオチドから保護基を単に除去するための代替として、オリゴヌクレオチド上の保護基を、負に荷電したリン酸残基と置換し得る。１つの実施態様に従って、オリゴヌクレオチド上の保護基を、複数のオリゴヌクレオチドをアクチベーターに曝露し、活性化部位を生成し、そしてその活性化部位を、負に荷電したリン酸残基を複数の各オリゴヌクレオチドに共有的に結合する化合物と反応させることにより、負に荷電したリン酸残基と置換し得る。使用されるアクチベーターは、オリゴヌクレオチド合成および保護基の除去における使用のために本明細書中上記に記載される、任意の適切なアクチベーターであり得る。活性化部位と反応される化合物は、式Ｉ：
【０１０３】
【化９】
および、式ＩＩ：
【０１０４】
【化１０】
からなる群より選択される。ここで、ＤＭＴは、ジメトキシトリチル保護基であり、Ｘは、塩基を除去可能な保護基であり、そしてｉＰｒ2Ｎは、ジイソプロピルアミノ保護基である。式ＩおよびＩＩの適切な化合物の例は、上記に提供される。
【０１０５】
活性化部位とこれらの化合物との反応を、オリゴヌクレオチドに対して式ＩまたはＩＩの化合物の共有的結合をもたらすために十分な時間、溶液相中でこのような化合物に対して、オリゴヌクレオチド上の活性化部位を接触させることによって実行し得る。使用される技術は、上記のオリゴヌクレオチド合成について記載される技術と同じであるか、または類似である。
【０１０６】
（ポリアニオン鎖の付着）
別の実施態様において、オリゴヌクレオチド上の保護基を、ポリアニオン鎖の付着によって置換する。
【０１０７】
固体支持体の表面へのポリアニオン鎖の付着について上記に記載される実施態様のように、ポリアニオン鎖を、複数の各オリゴヌクレオチド上にポリアニオン鎖を合成または形成するか、あるいは予め形成されたポリアニオン鎖を各オリゴヌクレオチドに付着することによって、オリゴヌクレオチドに付着し得る。第１の実施態様において、ポリアニオン鎖を、各オリゴヌクレオチドに対して、負に荷電したリン酸単位、および保護基を有するモノマーに付着することによってオリゴヌクレオチド上に形成し、その結果モノマーを、各オリゴヌクレオチドに共有結合させる。その後、このモノマーをアクチベーターに曝露して保護基を除去し、それによって、第１のモノマーにモノマー単位を付加するためにさらなるモノマーと反応し得る活性化部位を生成し、それによって、ポリマー鎖を構築する。モノマーを、生成した活性化部位に対するアクチベーターに曝露し、そしてさらなるモノマーと反応させる工程は、オリゴヌクレオチド上にポリアニオン鎖を生成させるために、０〜２０回繰り返される。使用されるモノマー、アクチベーターおよび方法は、固体支持体の表面上でのオリゴヌクレオチドの形成について、上記で記載される通りである。
【０１０８】
予め形成されたポリアニオン鎖をオリゴヌクレオチドに付着する、この実施態様において、この方法は、所望の領域の各々に、負に荷電したリン酸単位の重合体のポリアニオン鎖（例えば、上記に記載されるポリアニオン鎖）を付着する工程を含む。複数の各オリゴヌクレオチドへの予め形成されたポリアニオン鎖の付着は、保護領域において、固体支持体の表面への予め形成されたポリマーの付着のために、上記のようなポリマーおよび技術を使用して達成され得る。形成または付着されるポリアニオン鎖は、この鎖の遠位末端（すなわち、固体支持体の表面の反対側の末端）において保護基を含む。
【０１０９】
（ＶＩＩＩ．組み合わせ技術）
上記の任意の表面修飾技術またはオリゴヌクレオチド修飾技術の利用は、標的分子のオリゴヌクレオチドアレイへの非特異的結合を減少させるが、上記の技術はまた、非特異的結合をさらに減少させるために組み合わせられ得る。
【０１１０】
本発明の１つの実施態様において、保護領域上の保護基およびオリゴヌクレオチド上の保護基は、両方とも除去される。
【０１１１】
別の実施態様において、保護領域上の保護基およびオリゴヌクレオチド上の保護基は、両方とも置換される。これらの保護基は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物と反応することによるか、あるいはポリアニオン鎖の付着により、置換され得る。式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応によって表面の保護領域上の保護基を置換すること、ならびポリアニオン鎖の付着によってオリゴヌクレオチド上の保護基を置換することおよびその逆もまた可能である。従って、一貫した様式において、保護領域上およびオリゴヌクレオチド上の保護基を置換する必要はない。
【０１１２】
さらに別の実施態様において、置換技術および除去技術が組み合わせられる。例えば、基材の保護領域上の保護基は除去され得るが、一方オリゴヌクレオチド上の保護基は、式Ｉまたは式ＩＩの化合物のいずれかとの反応によるか、あるいはポリアニオン鎖の付着により、置換される。同様に、保護領域上の保護基は置換され得るが、一方オリゴヌクレオチド上の保護基は、除去される。
【０１１３】
保護基を除去または置換するいずれかの技術はまた、固体支持体の表面にポリアニオン鎖を付着する方法と組み合わせて使用され得る。すでに上記で記されるように、本発明の１つの実施態様は、以下のいずれかまたは両方にポリアニオン鎖を付着することを含む：ｉ）各指定領域およびｉｉ）固体支持体の表面上の各保護領域。本発明の１つの実施態様において、ポリアニオン鎖は、複数の各保護領域に付着され、そして保護領域に付着されるポリアニオン鎖上の保護基、またはオリゴヌクレオチド上の保護基のいずれか、あるいは両方が、除去される。従って、この実施態様は、各保護領域へのポリアニオン鎖の付着、およびこれらのポリアニオン鎖上の保護基の除去を想定する。この実施態様はまた、各保護領域へのポリアニオン鎖の付着、およびオリゴヌクレオチド上の保護基の除去を想定する。この実施態様内のさらに別の特定の実施例は、アレイであり、ここで、ポリアニオン鎖は各保護領域に付着され、そして保護基はポリアニオン鎖およびオリゴヌクレオチドの両方から除去される。
【０１１４】
本発明の別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、複数の各保護領域に付着され、そしてポリアニオン鎖上の保護基、またはオリゴヌクレオチド上の保護基のいずれか、あるいは両方が、置換される。ポリアニオン鎖および／またはオリゴヌクレオチド上の保護基の置換は、式ＩもしくはＩＩの化合物との反応によってもよいし、またはポリアニオン鎖の付着によってもよく、あるいはこれらの技術の組み合わせによってもよい。ポリアニオン鎖の付着は、上記で詳細に記載されるように、ポリアニオン鎖の形成または予め形成されたポリアニオン鎖の付着によるものであり得る。従って、この実施態様は、保護領域へのポリアニオン鎖の付着、および複数の各オリゴヌクレオチド上のポリアニオン鎖の付着を想定する。この実施態様はまた、保護領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を想定する。この実施態様は、保護領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による保護領域でのポリアニオン鎖上の保護基の置換を想像する。この実施態様のさらに別の特定の実施例は、保護領域へのポリアニオン鎖の付着、および式ＩまたはＩＩの化合物との反応によるポリアニオン鎖上の保護基の置換、ならびにまた、（鎖の形成または予め形成された鎖の付着のいずれかによる）ポリアニオン鎖の付着によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を含む。保護領域においてすでに付着されたポリアニオン鎖へポリアニオン鎖を付着することは必要ではないが、本発明のこの実施態様はまた、考慮される。本発明のこの実施態様によって考慮される多くの可能な修飾されたオリゴヌクレオチドアレイの他の特定の例は、先の詳細な説明および特定の実施例に基づいて、当業者に容易に明らかである。
【０１１５】
本発明の別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、複数の各指定領域で付着され、次いで、オリゴヌクレオチドは、ポリアニオン鎖上で合成される。関連する実施態様において、ポリアニオン鎖は、指定領域において付着され、そして保護基は、保護領域または（指定領域においてポリアニオン鎖に付着された）オリゴヌクレオチドのいずれか、あるいは両方から除去される。従って、この実施態様は、各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および保護領域上の保護基の除去を想定する。この実施態様はまた、各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、およびオリゴヌクレオチド上の保護基の除去を想定する。この実施態様内のさらに別の特定の例は、アレイであり、ここで、ポリアニオン鎖は各指定領域に付着され、そして保護基は保護領域およびオリゴヌクレオチドの両方から除去される。
【０１１６】
別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、指定領域において付着され、そして保護領域上の保護基、または（指定領域でポリアニオン鎖に付着される）オリゴヌクレオチド上の保護基のいずれか、あるいは両方が、置換される。保護領域およびオリゴヌクレオチド上のいずれかまたは両方の保護基の置換は、式ＩもしくはＩＩの化合物との反応、またはポリアニオン鎖の付着、あるいはこれらの技術の組み合わせによるものであり得る。ポリアニオン鎖の付着は、上記で詳細に記載されるように、ポリアニオン鎖の形成または予め形成されたポリアニオン鎖の付着によるものであり得る。従って、この実施態様は、指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および次いで指定領域においてポリアニオン鎖に付着されるオリゴヌクレオチド上の第２のポリアニオン鎖の付着を想定する。この実施態様はまた、指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による保護領域上の保護基の置換を想定する。この実施態様はまた、指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を想定する。この実施態様のさらに別の特定の例は、指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による保護領域上の保護基の置換、ならびにまた（鎖の形成または予め形成された鎖の付着のいずれかによる）第２のポリアニオン鎖の付着によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を含む。本発明のこの実施態様によって考慮される多くの可能な修飾されたオリゴヌクレオチドアレイの他の特定の例は、先の詳細な説明および特定の実施例に基づいて、当業者に容易に明らかである。
【０１１７】
本発明の別の実施態様において、ポリアニオン鎖は、ｉ）複数の各指定領域、およびｉｉ）複数の各保護領域、の両方において付着される。従って、この実施態様において、固体支持体の表面全体は、ポリアニオン鎖によってコーティングされる。次いで、オリゴヌクレオチドは、ポリアニオン鎖上で合成されて、各指定領域において付着される。関連する実施態様において、ポリアニオン鎖は、保護領域および指定領域の両方において付着され、ならびに保護領域のポリアニオン鎖上の保護基、または（指定領域でポリアニオン鎖に付着される）オリゴヌクレオチド上の保護基のいずれか、あるいは両方が、除去される。従って、この実施態様は、各保護領域、および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびに保護領域に付着されるポリアニオン鎖上の保護基の除去を想定する。この実施態様はまた、各保護領域、および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびオリゴヌクレオチド上の保護基の除去を想定する。この実施態様内のさらに別の特定の例は、アレイであり、ここで、ポリアニオン鎖は、各保護領域、および各指定領域に付着され、そして保護基は、保護領域およびオリゴヌクレオチド上の両方のポリアニオン鎖から除去される。
【０１１８】
別の実施態様において，ポリアニオン鎖は、各保護領域上および各指定領域の両方で付着され、そして保護領域のポリアニオン鎖上、または（指定領域でポリアニオン鎖に付着される）オリゴヌクレオチド上のいずれかの保護基、あるいは両方が、置換される。保護領域およびオリゴヌクレオチドにおけるポリアニオン鎖上の保護基のいずれかまたは両方の置換は、式Ｉもしくは式ＩＩの化合物との反応、またはポリアニオン鎖の付着、あるいはこれらの技術の組み合わせによるものであり得る。ポリアニオン鎖の付着は、上記で詳細に記載されるように、ポリアニオン鎖の形成または予め形成されたポリアニオン鎖の付着によるものであり得る。従って、この実施態様は、各保護領域および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、および各オリゴヌクレオチド上の第２のポリアニオン鎖の付着を想定する。この実施態様はまた、各保護領域および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびに式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による保護領域でのポリアニオン鎖上の保護基の置換を想定する。この実施態様はまた、各保護領域および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびに式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を想定する。この実施態様のさらに別の特定の例は、各保護領域および各指定領域へのポリアニオン鎖の付着、ならびに式Ｉまたは式ＩＩの化合物との反応による、保護領域におけるポリアニオン鎖上の保護基の置換、ならびにまた（鎖の形成または予め形成された鎖の付着のいずれかによる）第２のポリアニオン鎖の付着によるオリゴヌクレオチド上の保護基の置換を含む。本発明のこの実施態様によって考慮される多くの可能な修飾されたオリゴヌクレオチドアレイの他の特定の例は、先の詳細な説明および特定の実施例に基づいて、当業者に容易に明らかである。
【０１１９】
当業者に既に明らかであるべきであるように、保護領域上の保護基をポリアニオン鎖で置換する工程を含む表面改変と、この支持体を誘導体化する手段としてそれらの表面へのポリアニオン鎖の付着との間の差異は、各技術の時期である。詳細には、ポリアニオン鎖を付着させることによる固体支持体の表面の誘導体化技術は、各々の指定された領域上でオリゴヌクレオチドを合成する前に実施される。保護領域上の保護基をポリアニオン鎖で置換する技術は、各々の指定された領域上でのオリゴヌクレオチドの合成後に実施される。この違いは、これらの技術を明快にするため、および本発明の方法を実施する際に用いられ得る技術の多くの可能な組み合わせをより明確に記載するために有用である。しかし、当業者に明らかなように、最終的な結果は、同じである。すなわち、固体支持体の表面上の各々の保護領域に付着したポリアニオン鎖である。
【０１２０】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提供され、そして本発明を限定するとは解釈されないべきである。本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ定義される。
【０１２１】
以下の実施例では、基材表面を改変して、ＤＮＡプローブアレイの合成の完了時および最終的な脱保護時に単一または複数の負の荷電を付与した。次いで、実験を行って、サンプル中のタンパク質および他の成分の表面非特異的結合ＮＳＢに起因した蛍光バックグラウンドレベルの減少を測定した。観察されたバックグラウンドは、２つの型のものであり得る：サンプル混合物中のタンパク質および他の可溶性成分のＮＳＢに起因する「分散」バックグラウンド；およびサンプル中の不溶性粒子成分（すなわち、金属水酸化物の微細な沈澱物（例えば、サンプル調製手順において用いられる種々の緩衝液の組合せから生じ得る））のＮＳＢに起因する「鏡」バックグラウンド。
【０１２２】
（基材調製）オリゴヌクレオチド合成のためのガラスウェハ（５”×５”×０．０２７”）を、各工程の間では、脱イオン水を用いて直ちにかつ徹底的にリンスしながら、Ｎａｎｏｓｔｒｉｐ（Ｃｙａｎｔｅｋ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）／１５分間、１０％ＮａＯＨ水溶液／７０℃／３分間、次いで１％ＨＣｌ水溶液／１分間中に連続的に浸漬することにより清浄にした。次いで、このウェハを、３５℃にて窒素流の下で５分間スピン乾燥した。次いで、スライドを、穏やかに攪拌したＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ，Ｉｎｃ．）の溶液（９５：５のエタノール−水中で１％容量／容量）中で１５分間シラン処理し（ｓｉｌａｎａｔｅｄ）、２−プロパノールで徹底的にリンスし、次いで脱イオン水で徹底的にリンスし、そして最終的に９０〜１１０℃にて５分間スピン乾燥した。
【０１２３】
（アレイ合成）アレイ合成を、マスクアラインメントおよびＵＶ曝露システムからなり、そしてフローセルが試薬送達システムに連結されている特製のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘシンセサイザーで行った。この基材を、フローセルに対してねじで締め付け、そしてホスホルアミダイト添加を、標準的な自動化オリゴヌクレオチド合成プロトコル、特に、このフローセルの特定の容量および混和の必要条件に従う液体試薬および加圧アルゴンの送達のためのプログラムに従って実施した。
【実施例】
【０１２４】
（実施例１）
本実施例では、蛍光タンパク質結合体フィコエリトリン−ストレプトアビジン（「ＳＡＰＥ」）の非特異的表面結合に対する表面改変の効果を調べた。
【０１２５】
標準的な、非改変「コントロール」アレイを、まず、標準的なカップリングプロトコルを用いて、ヘキサエチルオキシリンカー（「ＨＥＸ」）をＯ−ＭｅＮＰＯＣ−（ヘキサエチルオキシ）−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｐｅａｓｅら，１９９４；ＭｃＧａｌｌら，１９９７）、ホスホルアミダイトとして添加することにより調製した。次いで、この基材を、チェッカーボードパターンで表面の交互の四角領域を照射するマスクを通してＵＶ光に曝露し、そして２０マー配列の第１のＭｅＮＰＯＣ塩基（Ｇ）を、光不安定性５’−Ｏ−ＭｅＮＰＯＣ−（Ｎ２−ｐ−イソプロピルフェノキシアセチル）−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトとして添加した（Ｐｅａｓｅら，１９９４；ＭｃＧａｌｌら，１９９７）。光不安定性５’−Ｏ−ＭｅＮＰＯＣ−ヌクレオシドホスホルアミダイトを用いる、曝露と結合との交互のサイクルを用いて、基材上のチェッカーボードパターンにおける２０マーオリゴヌクレオチド配列の合成を完了させた：
「コントロール」アレイ：
バックグラウンド：［基材］−ＯＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6-McNPOC（非光分解性）
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6］−ＯＰＯ2(-)Ｏ−（3'ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ5'）。
【０１２６】
表面改変を有する「Ｃ３試験」アレイを、以下の通りに調製した：最初に、モノマービルディングブロック３−（ジメトキシトリチルオキシ）プロピル（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（「Ｃ３スペーサー」，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を用い、標準的結合／ＴＣＡ脱保護プロトコルを用いて、「Ｃ３スペーサー」の短いオリゴマー（０、１、５）を基材に添加した。このことには、必要に応じて、標準的結合／ＴＣＡ脱保護プロトコルをまた用いて、（ＤＭＴ−ヘキサエチルオキシ）ホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）として添加したヘキサエチルオキシリンカー（「ＨＥＸ」）の添加を続けた。次いで、２０マーの試験配列の最初の塩基（Ｇ）を、光不安定性５’−Ｏ−ＭｅＮＰＯＣ−（Ｎ２−ｐ−イソプロピルフェノキシアセチル）−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（Ｐｅａｓｅら，１９９４；ＭｃＧａｌｌら，１９９７）として結合させた。次いで、この基材を、チェッカーボードパターンで表面の交互の領域を照射するマスクを通して曝露し、そして次に２０マー配列におけるＭｅｎＰＯＣ−塩基を添加した。曝露と結合との交互のサイクルを用いて、基材上のチェッカーボードパターンにおける２０マーオリゴヌクレオチド配列の合成を完了させた：
試験アレイ：
バックグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］m（ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6）nＯＰＯ2(-)Ｏ3'−（Ｇ）5'OH
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］m（ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6）nＯＰＯ2(-)Ｏ3'−（ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ）5'。
【０１２７】
（アレイハイブリダイゼーション）：次いで、このコントロールおよび試験アレイを、相補的な５’−ビオチン化標的オリゴヌクレオチド（5'ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣ3'）の溶液とハイブリダイゼーションさせ、次いで結合したオリゴヌクレオチド標的を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘハイブリダイゼーションステーションで以下の標準的なＧｅｎｅＣｈｉｐTMプロトコルを用い、フィコエリトリン−ストレプトアビジン結合体（「ＳＡＰＥ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）の溶液を用いて「染色」した：
（ＨＹＢＷＡＳＨ Ａ条件）：
オリゴの濃度＝５×ＳＳＰＥ／０．０５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中１００ｐＭ
サンプルバイアル中のオリゴの容量＝６５０ ｍｌ
洗浄緩衝液＝６×ＳＳＰＥ／０．００５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
Ｈｙｂ温度＝５０℃
Ｈｙｂ時間＝１８００秒間
洗浄温度＝５０℃
洗浄サイクル数＝４
１サイクルあたりの排水および充填の数＝４
保持温度＝２０℃
（染色条件）：
ＳＡＰＥ＝６×ＳＳＰＥ／０．００５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で１：５００希釈
洗浄バイアルにおけるＳＡＰＥの容量＝２００ｍｌ
染色温度＝ＲＴ
Ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅのスピード＝６０ｒｐｍ
持続時間＝５分間
（ＷＡＳＨＡ条件）：
洗浄温度＝２２℃
洗浄サイクル数＝１０
１サイクルあたりの排水および充填の数＝２
保持温度＝２０℃
（アレイ走査）：表面蛍光レベルを、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＧｅｎｅＡｒｒａｙTM共焦点蛍光スキャナーで獲得した画像から抽出した：
（走査条件）：
走査温度＝２０℃
画素サイズ＝３０ｍ
フィルター＝５６０ｎｍ。
【０１２８】
代表的な画像を、図１に示し、そしてこのデータを、以下の表１にまとめる。測定された「フォアグラウンド」蛍光強度は、オリゴヌクレオチドプローブ配列を含むチェッカーボードアレイ（「＋」）の四角内のシグナル強度に対応し、そして「バックグラウンド」蛍光を、プローブ配列を含まないチェッカーボードアレイ（「−」）の四角内で決定した。コントロールアレイと比較して、アレイ合成の前の少なくとも１つの「Ｃ３」を用いる基材の改変が、バックグラウンド蛍光強度において６倍の減少を生じたことが理解され得る。
【０１２９】
【表１】
（実施例２）
本実施例は、分散および鏡の両方のＮＳＢに対する表面改変の効果を調べることを目的とする。後者は、代表的にはＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを用いて分析される、より複雑なサンプルにおいて頻繁に観察される。
【０１３０】
「コントロール」アレイを、実施例１におけるコントロールアレイについて記載されたのと正確に同じに調製した：
バックグラウンド：［基材］−ＯＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6-O-MeNPOC（非光分解性）
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6］−ＯＰＯ2(-)Ｏ−（3'ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ5'）。
【０１３１】
「光分解についてのコントロール」アレイを、オリゴヌクレオチド合成後に、アレイ全体を、ＨＥＸ改変基材の非合成（「−」）領域から残りのＭｅＮＰＯＣ光不安定性基を取り出すように光に曝露したこと以外は、コントロールと同じ方法で調製した：
バックグラウンド：［基材］−ＯＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6-OH（光分解性）
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6］−ＯＰＯ2(-)Ｏ−（3'ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ5'OH。
【０１３２】
（Ｃ３）n（ＨＥＸ）表面改変を有する「Ｃ３試験」アレイを、実施例１において「Ｃ３試験」アレイについて記載された方法に従って調製した：
バックグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］m（ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6）−ＯＰＯ2(-)Ｏ3'−（Ｇ）5'OH
フォアグラウンド：［基材］−Ｏ［ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］m（ＰＯ2(-)Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）6）−ＯＰＯ2(-)Ｏ3'−（ＧＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＡＡＣＴＧ）5'OH。
【０１３３】
ハイブリダイゼーション：アレイを、１００ｐＭの最終濃度でＧｅｎｅＣｈｉｐ試験サンプル中にスパイクされた相補的な５’−ビオチン化標的オリゴヌクレオチド（5'ＣＴＧＡＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＡＣ3'）の溶液とハイブリダイズさせた。このＧｅｎｅＣｈｉｐ試験サンプルを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｐ４５０アッセイキットパッケージの挿入物とともに提供されるプロトコルに従って調製した。これを、ＤＮＡｓｅ−Ｉを用いて断片化し、そして末端トランスフェラーゼの存在下でビオチン−ジデオキシＡＴＰを用いて標識した、精製されていない多重ＰＣＲ反応物から本質的に調製する。いくつかの場合、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をまた、サンプル中に含めて、それがＮＳＢにおいてさらなる減少を提供するその能力を調べた。ハイブリダイゼーション、ＳＡＰＥ染色、洗浄、および走査を、上記の実施例１に記載される通りに実施した。
【０１３４】
代表的な画像を、図２および図３に示し、そしてこのデータを、以下の表２にまとめる。図２は、表２のエントリー１におけるデータに対応する。図３は、表２のエントリー３におけるデータに対応する。測定した「フォアグラウンド」蛍光強度は、オリゴヌクレオチドプローブ配列を含むチェッカーボードアレイ（「＋」）の四角内の配列内のシグナル強度に対応し、そして「バックグラウンド」蛍光をプローブ配列を含まないチェッカーボードアレイ（「−」）の配列内の四角内で決定した。多数の結論が、このデータから得られ得る。第１に、ＨＥＸ改変基材（Ｃ３改変なし）を有するコントロールアレイの場合、非プローブ含有領域からのＭｅＮＰＯＣ保護基の最終的な光分解性除去は、これらの領域における分散ＮＳＢレベルの有意な減少を生じた（エントリー１およびエントリー２）。光分解はまた、非光分解コントロールアレイについて観察されたやや厳しい鏡バックグラウンドを減少させたが、これを排除しなかった。ＨＥＸ添加およびオリゴヌクレオチド合成の前の、「Ｃ３」オリゴマー（長さ５〜２０）を有する基材の改変は、バックグラウンド蛍光強度における実質的減少をもたらし、そして鏡バックグラウンドの大部分を完全に排除した。サンプル中にＢＳＡを含むことは、最低の分散バックグラウンドレベルを提供するようであった。
【０１３５】
【表２】
前述は、本発明の例示であり、そして本発明を限定するとは解釈されない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物は、特許請求の範囲の中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】図１は、本発明のプロセスによって得られたイメージである。
【図２】図２はコントロールアレイであり、ここで基材はハイブリダイゼーションの前に光分解されていない。
【図３】図３はアレイであり、ここで基材は、鏡面の非特異的結合を減少させるために、ハイブリダイゼーションの前に本発明の方法に従って修飾される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実施例に記載の方法。
【請求項１】
実施例に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２２７０１７（Ｐ２００６−２２７０１７Ａ）
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−８１７９３（Ｐ２００６−８１７９３）
【出願日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【分割の表示】特願２０００−５４４８３７（Ｐ２０００−５４４８３７）の分割
【原出願日】平成１１年４月２０日（１９９９．４．２０）
【出願人】（３９９１２５７５７）アフィメトリックス インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【分割の表示】特願２０００−５４４８３７（Ｐ２０００−５４４８３７）の分割
【原出願日】平成１１年４月２０日（１９９９．４．２０）
【出願人】（３９９１２５７５７）アフィメトリックス インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
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