核酸定量法、及び核酸定量装置
【課題】低分子の核酸にも適用可能であって、簡便かつ安全に定量することが可能な核酸の定量法、及び核酸の定量装置を提供する。
【解決手段】本発明に係る核酸の定量法は、蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する工程（ａ）と、生物の体内に分布した、若しくは細胞に取り込まれた標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出して精製する工程（ｂ）と、工程（ｂ）により得た精製物の蛍光強度を測定する工程（ｃ）と、工程（ｃ）の測定値に対し、工程（ｂ）中の標識核酸の損失量を考慮して、標識核酸の定量を行う工程（ｄ）とを備える。
【解決手段】本発明に係る核酸の定量法は、蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する工程（ａ）と、生物の体内に分布した、若しくは細胞に取り込まれた標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出して精製する工程（ｂ）と、工程（ｂ）により得た精製物の蛍光強度を測定する工程（ｃ）と、工程（ｃ）の測定値に対し、工程（ｂ）中の標識核酸の損失量を考慮して、標識核酸の定量を行う工程（ｄ）とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の定量法、及び核酸定量装置に関する。より詳しくは、生体内に分布した核酸、若しくは細胞に取り込まれた核酸の定量法、及び核酸定量装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）は、２００６年度のノーベル賞受賞テーマであるｓｉＲＮＡの機能の解明以降、疾患の原因遺伝子を破壊する新規核酸医薬として大きな期待を集め、世界中で広範に研究開発が進められている。ｓｉＲＮＡの新規核酸医薬の実現には、ｓｉＲＮＡの生体内、若しくは細胞内における動態を解明する技術が重要となる。
【０００３】
実験動物等の生体内に分布したｓｉＲＮＡの定性的な検出方法として、蛍光顕微鏡を用いる方法が知られている。また、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入したときの細胞内導入率を求める方法として、蛍光標識したｓｉＲＮＡをフローサイトメトリーによる解析する方法が知られている（非特許文献１）。さらに、生体内に分布したｓｉＲＮＡを定量する方法として、アイソトープを用いて放射能強度を測定する方法が提案されている（非特許文献２〜４）。なお、核酸の定量法としては、特許文献１や２などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１９６９９７号公報
【特許文献２】特開２００６−２０１０６２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】関根光雄、多比良和誠編者、「ＲＮＡｉ法とアンチセンス法」、初版、株式会社講談社、２００５年６月２０日、ｐ．１０４−１０６
【非特許文献２】Derek W. Bartlett 他５名、ＰＮＡＳ、２００７年９月２５日、第１０４巻、第３９号、ｐ．１５５４９−１５５５４
【非特許文献３】Merkel OM． 他４名、Bioconjug Chem.、２００９年１月、２０（１）、ｐ．１７４−１８２
【非特許文献４】Liu N 他４名、Nucl Med Biol.、２００７年５月、３４（４）、ｐ．３９９−４０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記非特許文献１に記載のフローサイトメトリーによる測定法は、個々の細胞の蛍光強度を測定することが可能である。しかしながら、個々の細胞の蛍光強度からｓｉＲＮＡ量を割り出すことはできなかった。また、フローサイトメトリーによる測定法は、個々の細胞に分散させることができない臓器などにおいて適用することができないという問題点があった。
【０００７】
上記非特許文献２〜４に記載のｓｉＲＮＡの定量方法は、アイソトープ実験設備を備えている施設に限定されるという問題があった。さらに、放射性同位体を用いるため、簡便、かつ安全な方法とは言えなかった。
【０００８】
なお、上記においては、ｓｉＲＮＡにおける問題点について述べたが、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ等をはじめとする核酸全般においても同様の問題が生じ得る。
【０００９】
さらに、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）などの核酸増幅法を必須とする上記特許文献１や２の方法を、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのような低分子の核酸に適用することは技術上困難であった。
【００１０】
本発明は、上記背景に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、低分子の核酸にも適用可能であって、簡便かつ安全に定量することが可能な核酸の定量法、及び核酸の定量装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る核酸の定量法は、蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する工程（ａ）と、前記生物の体内に分布した、若しくは前記細胞に取り込まれた前記標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出して精製する工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）により得た精製物の蛍光強度を測定する工程（ｃ）と、前記工程（ｃ）の測定値に対し、前記工程（ｂ）中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う工程（ｄ）とを備えるものである。
【００１２】
本発明に係る核酸の定量法によれば、蛍光強度を測定することにより定量を行っているので、簡便かつ安全に定量を行うことができる。また、抽出、精製工程によって標識核酸が損失することは必発であるが、この損失量を考慮して補正しているので、定量精度を高めることができる。
【００１３】
本発明に係る核酸の定量装置は、蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与して生物の体内に分布した、若しくは細胞の培養液に添加して取り込まれた前記標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に取り出したものを抽出して精製するサンプル調製手段と、前記サンプル調製手段により得た精製物の蛍光強度を測定する測定手段と、前記測定手段により得た測定値に対し、前記サンプル調製手段中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う手段とを備えるものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、低分子の核酸にも適用可能であって、簡便かつ安全に定量することが可能な核酸の定量法、及び核酸の定量装置を提供することができるという優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施形態に係る核酸の定量法のフローチャート図。
【図２】（ａ）〜（ｅ）実施例に係る製造工程説明図。
【図３】実施例に係る標識核酸の標準曲線をプロットした図。
【図４】実施例に係る各臓器中のｓｉＲＮＡ量をプロットした図。
【図５】実施例に係る各臓器中のｓｉＲＮＡの重量比をプロットした図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を適用した実施形態の一例について図１のフローチャート図を用いつつ説明する。
【００１７】
＜工程（ａ）＞ 蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する。ここで、「核酸」とは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）等の低分子のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ等をはじめとするＲＮＡ、ＤＮＡ全般を云う。また、ＰＮＡ（Peptide Nucleic acid）など核酸類似体であってもよい。核酸は、天然由来のものであっても、合成されたものであってもよい。本発明の定量法を適用する核酸の分子量は問わないが、本発明は、従来、放射性同位体等を用いずに安全に定量することが難しかった低分子量（例えば、塩基が１０以上、１００以下程度）の核酸を定量するのに特に有用である。また、前述したとおり、新規核酸医薬として期待されているｓｉＲＮＡに特に好適に適用できる。
【００１８】
蛍光色素は、特定の波長で励起され、蛍光を発光する色素であり、本発明の趣旨を逸脱しないものであれば特に限定されるものではないが、一例として以下のものを挙げることができる。すなわち、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０）、ＢＯＤＩＰＹＲ（登録商標）色素（Ｂｉｏｄｉｐｙ ＦＬ、Ｂｉｏｄｉｐｙ ５３０／５５０、Ｂｉｏｄｉｐｙ ＴＲ、Ｂｉｏｄｉｐｙ ＴＭＲ）、ローダミン系色素（Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡなど）、フルオレセイン系色素（フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｙａｋｉｍａ ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。
【００１９】
蛍光標識の核酸への結合部位については、特に限定されず、核酸を標識することのできる結合部位は全て用いることができる。一例として、核酸の３'末端、５'末端を挙げることができる。
【００２０】
標識核酸は、生体内、生体外のいずれにおいても使用することができる。生体内で使用する場合の投与経路は、特に限定されない。一例を挙げれば、静脈内、実質臓器内（例えば、脳、目、甲状腺、乳腺、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、卵巣、精巣等）、管腔臓器の管腔内（例えば、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、大腸、胆嚢、尿管、膀胱内等）、脳脊髄腔内、胸腔内、腹腔内、筋肉内、関節内、皮下、皮内等である。
【００２１】
核酸を投与する生物種は、動物、植物、カビ、酵母等の微生物等、特に限定されることはないが、動物由来であることが好ましく、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット等の哺乳動物であることがより好ましい。また、核酸を取り込む細胞の種類は、特に限定されないが、一例として、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等を挙げることができる。
【００２２】
標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する際には、標識核酸の他、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、本発明者らが先に提案した磁性ナノ粒子（特願２００７−１９８１０４号公報）、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー等の核酸運搬用のデリバリーシステムを用いることができる。無論、標識核酸単独で生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加してもよい。また、公知の核酸の投与法を制限なく適用することができる。
【００２３】
＜工程（ｂ）＞ 生物の体内に分布した、若しくは細胞に取り込まれた標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出する。ここでは、生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加した標識核酸と、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸とを総称してトータル核酸と称する。核酸のうちのＲＮＡを対象とする場合には、トータルＲＮＡを抽出する。生物の体内に分布したトータル核酸の抽出は、生物の一部、若しくは全部を用いて抽出することが可能である。例えば、肝臓、肺、脾臓等の各種臓器、全血、血清、生体組織等から核酸を抽出することができる。細胞に取り込まれたトータル核酸の抽出には、培養液中の細胞の一部、若しくは全部を用いて抽出することが可能である。
【００２４】
核酸を含有する試料からトータル核酸を得る方法としては、公知の方法を制限なく使用することができる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出法により、核酸を含有する試料からトータル核酸を得ることができる。この方法は、フェノール・クロロホルムを用いてタンパク質、脂質などの水難溶性の検体成分を変性、溶解または沈殿させる一方、核酸を水相に溶解するという溶解度の違いを利用するものである。その他、チオシアン酸グアニジン等のカオトロピック塩、硫酸アンモニウム等のアンチカオトロピック塩等を用いる方法もある。
【００２５】
次いで、抽出物を精製する。核酸を精製する方法であれば、特に限定されないが、一例として、アルコール沈澱、限外濾過、電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、イオン交換、選択吸着、アフィニティー結合を利用したクロマトグラフィー、磁性粒子などを組み合わせたアフィニティー結合等を挙げることができる。これらは、単独、若しくは併用することができる。より好ましくは、ゲル濾過と遠心分離を利用したスピンカラムクロマトグラフィーである。
【００２６】
カラムクロマトグラフィーにおいては、核酸を固相担体表面に吸着させる工程、並びに、固相担体を洗浄し、核酸を溶離する工程を備える。固相担体の表面は、例えば、合成高分子、無機物質、ガラスよりなる群から選択されるものを好適に適用することができる。より具体的には、シリカ粒子、シリカ粉末、シリカ繊維（グラスファイバー）、シリカメンブレン、シリカクロス、一体型多孔質シリカなどのシリカ担体、セラミック粒子、セラミック粉末、セラミック繊維、セラミックメンブレン、セラミッククロス、一体型多孔質セラミックなどのセラミック担体のいずれか、若しくはこれらを混成したもの、若しくはこれらを混合したもの等を好適に適用することができる。抽出する核酸を効率よく精製できるものであることが好ましく、１０〜１８塩基以上の全ての長さの核酸を精製可能なものを使用することがより好ましい。例えば、標識核酸がｓｉＲＮＡであり、トータルＲＮＡを精製する場合には、１０〜１８塩基以上の全ての長さのＲＮＡを精製可能な固相担体表面を使用することが好ましい。
【００２７】
核酸の精製は、抽出試料の全量、若しくはその一部に対して実施する。抽出試料の一部に対して実施した場合には、測定に用いたサンプルの量とその測定値に基づいて、全量を算出すればよい。操作時間の短縮化、操作工程の簡便化を図る観点からは、抽出試料の一部に対して実施することが好ましい。
【００２８】
＜工程（ｃ）＞ 工程（ｂ）により得た精製物の蛍光強度を測定する。具体的には、標識核酸の定量は、蛍光色素固有の励起波長光を測定サンプルに照射し、サンプルからの蛍光強度を測定する。測定装置は、微量の発光を検知可能であって、本発明の目的を達成し得るものであれば限定されないが、蛍光測定装置、蛍光プレートリーダー等が好適な例として挙げられる。
【００２９】
＜工程（ｄ）＞ 工程（ｃ）の測定値に対し、工程（ｂ）中の標識核酸の損失量を考慮して、標識核酸の定量を行う。損失量の好適な計算方法として、以下の方法を挙げることができる。
【００３０】
損失量の第１の導出方法としては、以下の方法を挙げることができる。すなわち、標識核酸の既知量のサンプルを複数用意して希釈系列を作成する。次いで、当該サンプルに対して工程（ｂ）の抽出前に蛍光強度を工程（ｃ）と同様にして測定する。その後、工程（ｂ）の抽出、精製工程を実施した後に工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定する。抽出前、及び精製後の蛍光強度の関係より希釈系列の標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて工程（ｂ）の損失量を導出する。
【００３１】
標識核酸の工程（ｃ）の蛍光強度、及び前述の標準曲線により、工程（ｂ）により損失した量を含めた標識核酸の量を求めることができる。
【００３２】
損失量の第２の導出方法としては、抽出工程による損失量を無視して、精製工程による損失量のみを考慮して補正を行う方法を挙げることができる。精製方法によっては、抽出工程による損失量に比して精製工程の損失量が相当大きい場合もあり得る。このような場合に特に有効な方法である。この場合、希釈系列のサンプルを、精製工程前、精製工程後のそれぞれの蛍光強度を測定して標準曲線を作成すればよい。
【００３３】
損失量の第３の導出方法としては、上記第１の導出方法に対して、抽出前の蛍光強度の測定を省略して標準曲線を作成する方法を挙げることができる。具体的には、標識核酸の既知量のサンプルを複数用意して希釈系列を作成し、工程（ｂ）の抽出・精製の全工程を実施した後に、工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定する。そして、抽出前に加えた核酸量と、抽出精製後の蛍光強度との関係より、希釈系列の損失量を加味した標準曲線を作成する。当該方法によれば、損失量を加味した標準曲線により、一段階で、工程（ｂ）により損失した量を含めた標識核酸の量を求めることができる。
【００３４】
損失量の第４の導出方法としては、以下の方法を挙げることができる。すなわち、標識核酸に対して、結合している蛍光色素のみが異なる対比用標識核酸を用意する。そして、工程（ｂ）の抽出を実施する前のサンプルに、対比用標識核酸を所定量加える。次いで、工程（ｂ）の抽出を実施する前と、精製を実施した後それぞれにおいて、対比用標識核酸の蛍光強度を工程（ｃ）と同様に測定する。その後、工程（ｂ）における対比用標識核酸の損失量を求め、当該損失量から標識核酸の損失量を導出する。
【００３５】
対比用標識核酸に結合する蛍光色素は、標識核酸に結合している蛍光色素と蛍光測定により区別し得るものであれば特に限定されないが、互いの発光波長が重ならないものを用いることが好ましい。標識核酸の工程（ｃ）の蛍光強度、及び前述の対比用標識核酸の損失した量より、工程（ｂ）により得た精製物中の標識核酸の量を求めることができる。
【００３６】
損失量の第５の導出方法としては、第４の導出方法のように抽出工程前に対比用標識核酸を加えずに、抽出工程後に対比用標識核酸を加え、精製工程前後の損失量を上記第４の導出方法と同様にして求めてもよい。精製方法によっては、抽出工程による損失量に比して精製工程の損失量が相当大きい場合もあり得る。このような場合に特に有効な方法である。この場合、希釈系列のサンプルを、精製工程前、精製工程後のそれぞれの蛍光強度を測定して標準曲線を作成すればよい。なお、損失量の導出方法としては、上記例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、種々の方法を採用することができる。
【００３７】
上述した損失量の第１の導出方法〜第５の損失方法等において、サンプルの一部に対して抽出、精製工程を行った場合には、得られた標識核酸の量から生体試料中の標識核酸の含有量を決定する。
【００３８】
なお、トータル核酸の濃度を求め、トータル核酸中の標識核酸の比率を求めることもできる。トータル核酸の濃度は、公知の方法により制限なく求めることができる。例えば、サンプル中のトータルＲＮＡの濃度は、分光光度計を用いて２６０ｎｍの波長における吸光度Ａ（２６０）を測定し、以下の式（１）より求めることができる。
［トータルＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）］
＝Ａ（２６０）×４０×１０／光路長（ｍｍ）・・・式（１）
但し、トータルＲＮＡの定量は、公知の方法を制限なく使用することができる。なお、二本鎖ＤＮＡ濃度を求める場合には、上記式（１）の定数４０を５０に、一本差ＤＮＡの場合には、定数４０を３３に変更することにより求めることができる。
【００３９】
次に、本実施形態に係る核酸の定量装置について説明する。本実施形態に係る核酸の定量装置は、サンプル調整手段と、測定手段と、定量手段とを備える。サンプル調整手段は、蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与して生物の体内に分布した、若しくは細胞の培養液に添加して取り込まれた標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に取り出したものを抽出して精製する手段である。測定手段は、サンプル調製手段により得たサンプルの蛍光強度を測定する手段である。また、定量手段は、測定手段により得た測定値に対し、サンプル調製手段中の標識核酸の損失量を考慮して、標識核酸の定量を行う手段である。
【００４０】
サンプル調整手段としては、前述した抽出方法、精製方法を実現する装置を用いることができる。測定手段としては、前述した蛍光測定装置、蛍光プレートリーダー等の微量の発光を検知可能であって、本発明の目的を達成し得る装置を用いることができる。定量手段としては、定量したい全量と測定サンプルの量を入力する手段と、前述の工程（ｂ）中の損失量を計算するための標準曲線を記憶する手段と、当該標準曲線に基づいて、標識核酸の損失量を導出して、前述の測定手段により求めた蛍光強度から測定サンプルの標識核酸量を算出する手段と、得られた標識核酸量から目的物の標識核酸の量を求める手段とを備える。
【００４１】
標準曲線に対する情報がない場合には、標準曲線を記憶する手段の前に、既知量の標識核酸の希釈系列を複数作成したものに対し、工程（ｂ）の抽出及び精製を実施する前後それぞれにおいて、若しくは、精製を実施する前後それぞれにおいて、蛍光強度を測定して、精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成する手段を有するようにしてもよい。サンプル調整手段、測定手段、定量手段の全てを接続して全工程を自動化した自動分析装置を用いることにより、より容易かつ迅速に、高精度に標識核酸の定量を行うことができる。
【００４２】
なお、標識核酸の損失量の導出方法は、例えば、前述の第１の方法〜第５の方法を好適に適用することができる。
【００４３】
ところで、核酸の一種であるｓｉＲＮＡは、通常、１９〜２３塩基対からなる短い２本鎖ＲＮＡで、哺乳動物細胞内において遺伝子配列特異的に遺伝子発現を抑制する機能をもつ。すなわち、ｓｉＲＮＡを用いて狙った遺伝子の発現を特異的に制御可能である。しかしながら、ｓｉＲＮＡは不安定、かつ高価であるため、目的部位にｓｉＲＮＡを効率良く送達する技術の開発が望まれていた。
【００４４】
ｓｉＲＮＡは、低分子量であることに起因して、特許文献１や２の定量方法をそのまま適用することは困難であった。本実施形態によれば、ｓｉＲＮＡを生体内に投与した後の、ｓｉＲＮＡの生体内分布、若しくは、細胞の培養液に添加した後のｓｉＲＮＡの細胞への取り込み状態を簡便、かつ精密に定量することができる。また、ｓｉＲＮＡの精製工程におけるｓｉＲＮＡの回収損失は必発であるが、この損失量を考慮することにより、よりｓｉＲＮＡの定量精度を高めることが可能となった。しかも、非特許文献２〜４のように、アイソトープ等の特殊設備を使用せず、放射性同位体も使用しないので、安全かつ簡便に定量することができる。従って、ｓｉＲＮＡの動態の解明に大きく貢献することが期待できる。また、ｓｉＲＮＡの新規核酸医薬の実現に向け、患部への送達法の開発等に大きく貢献することが期待できる。無論、ｓｉＲＮＡの他、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ等をはじめとする各種ＤＮＡ、ＲＮＡにおいて同様の効果を提供することができる。
【００４５】
なお、上記実施形態は一例であって、本発明の趣旨に合致する限り、他の実施形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
［実施例］
【００４６】
以下、本発明のより具体的な実施例について、図２の工程説明図を用いつつ詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、以下の実施例に限定されないことは言うまでもない。?
【００４７】
（実施例１）
＜標準曲線の作成実験＞
（工程１−１）ｓｉＲＮＡ(キアゲン社）を投与していないマウスを屠殺後、肝臓を摘出し、その重量を測定した。測定後、トータルＲＮＡ抽出用のフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＱＩＡｚｏｌ組織溶解液（キアゲン社製）を、肝臓１００ｍｇあたり７ｍＬ加えた。そして、その重量を測定後、ホモジナイザーを用いて物理的に破砕して懸濁液を作製した。
【００４８】
（工程１−２）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８により標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（以降、単に「標識ｓｉＲＮＡ」とも称する）の原液をＲＮＡ分解酵素フリーの純水で希釈した。そして、それぞれ１．５ｍＬ容のマイクロチューブ１（エッペンドルフ製）内で、０ｎｇ（純水のみ）、０．４ｎｇ、１．２ｎｇ、３．６ｎｇ、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇの標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの希釈系列を作製した。
【００４９】
（工程１−３）工程１−２で作製した希釈系列それぞれに対し、工程１−１で作製した懸濁液を０．７ｍＬずつ入れ、攪拌した。その後さらに、クロロホルム０．３ｍＬをマイクロチューブ１に添加することにより調製したサンプル１０を激しく攪拌した。その後、５分間室温に放置した（図２（ａ）参照）。引き続き、冷却遠心機（不図示）にて摂氏４℃・１２０００Ｇにて遠心分離を行った。遠心分離後のサンプル１０の最上層１１にはトータルＲＮＡが、中間層１２には変性タンパクが、最下層１３にはＤＮＡが含まれていることを確認した（図２（ｂ）参照）。
【００５０】
（工程１−４）工程１−３の処理を行ったサンプル１０の最上層１１を採取し、トータルＲＮＡの吸光度を測定した。そして、得られた吸光度より以下の式（２）を用いて、最上層１１のトータルＲＮＡ濃度を計算した。具体的には、工程１−３で得たサンプル１０の最上層１１を静かに数μＬ取り出し、適度に希釈した（希釈率：１／［ａ］）。その後、分光光度計を用いて２６０ｎｍの波長における吸光度Ａ（２６０）を測定した。そして、この値を式（１）に代入することにより、トータルＲＮＡ濃度を求めた。
［トータルＲＮＡ濃度（μｇ/mＬ）］
＝Ａ（２６０）×４０×１０／光路長（mm）×［ａ］・・・式（２）
【００５１】
（工程１−５）新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブ２に、工程１−２で調製した０．４ｎｇ、１．２ｎｇ、３．６ｎｇ、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇの標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの希釈系列を加えたサンプルを用意した。次いで、工程１−３により得られた最上層１１を静かに０．３ｍＬ採取して、前述の各マイクロチューブ２内に入れた。その後、さらに各マイクロチューブ２内にエタノール０．４５ｍＬを添加することにより各希釈系列の混合液２０を得た（図２（ｃ）参照）。
【００５２】
（工程１−６）ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラム（以下、「カラム」とも称する）３（キアゲン社製）を２ｍＬ容のマイクロチューブ４にセットした後、カラム３内に混合液２０の全容を入れた。次いで、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラム３にｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを吸着させた。各希釈系列のサンプルに対して同様の操作を行った。
【００５３】
（工程１−７）ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの吸着したカラム３をマイクロチューブ４から外し、マイクロチューブ４内に排出された廃液とともにマイクロチューブ４を廃棄し、カラム３に新しい２ｍＬ容のマイクロチューブ（不図示）をセットした。
【００５４】
（工程１−８）カラム３に、チオシアン酸グアニジンを含有するプレ洗浄液ＲＷＴ緩衝液（キアゲン社製）０．７ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラム３をプレ洗浄した（１回目洗浄）。
【００５５】
（工程１−９）工程１−８で洗浄したカラム３をマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、カラム３に新しい２ｍＬ容のマイクロチューブ（不図示）をセットした。
【００５６】
（工程１−１０）カラム３に、洗浄液ＲＰＥ緩衝液（キアゲン社製）０．５ｍＬを加え、室温下、８０００Ｇにて２分間遠心分離することにより、カラム３を洗浄した（２回目洗浄）。
【００５７】
（工程１−１１）工程１−１０で洗浄したカラム３をマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、カラム３に新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブ５をセットした。
【００５８】
（工程１−１２）カラム３に６０μＬのＲＮＡ分解酵素フリーの純水を入れ、室温下、８０００Ｇにて１分間遠心分離することにより、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの吸着したカラム３から、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡ溶液３０をマイクロチューブ５内に溶出させた（図２（ｅ）参照）。
【００５９】
（工程１−１３）工程１−１２で得られた各溶出液５０μＬを蛍光測定用の９６穴黒色プレート（ＮＵＮＣ社製）に入れた。そして、蛍光マイクロプレートリーダー（モデル１４２０マルチラベルカウンター、パーキンエルマー社製）を用いて、励起波長４９５ｎｍ、蛍光検出波長５１８ｎｍで蛍光強度を測定し、その値を記録した。
【００６０】
（工程１−１４）工程１−１３で記録したそれぞれの希釈系列の蛍光強度と、それぞれの希釈系列５０μＬの標識ｓｉＲＮＡの含有量、すなわち、４００ｐｇ、１．２ｎｇ、３．６ｎｇ、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇとの間の関係式を導くために、グラフ上にプロットすることにより標準曲線を作成した。図３に、得られた標準曲線を示す。横軸は、標識ｓｉＲＮＡの初期調製量であり、縦軸は、精製工程後（工程１−１２後）の蛍光強度を示す。図３の結果より、標識ｓｉＲＮＡの初期含有量が４００ｐｇ〜１μｇのときに、縦軸の蛍光強度との間に、直線性を認めることを確認した。また、ＲＮＡ抽出・カラム精製前の標識ｓｉＲＮＡ量と、最終的にカラムから溶出された当該ｓｉＲＮＡ溶出液の示す蛍光強度との間に、例えば、以下の式（３）の相関関数があるという知見を得た。
[抽出・カラム精製前の標識ｓｉＲＮＡ量]
=Ｄ×（［ｓｉＲＮＡ溶出液の示す蛍光強度］＾Ｅ）・・・式（３）
なお、Ｄ、Ｅはグラフソフト（Delta Graph ver.5）を用いて算出した。
【００６１】
＜マウスモデルの各臓器に分布したｓｉＲＮＡの抽出実験＞
（工程ａ−１）陽性荷電ポリマーＰｏｌｙＭａｇ(OZ Biosciences社, フランス)（８．３μＬ）と、陰性荷電をもつ蛍光標識核酸であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８によって標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（標識ｓｉＲＮＡ）を室温（２０℃）で混合し、５分間放置した。静電結合により得られたＰｏｌｙＭａｇ／標識ｓｉＲＮＡ複合体の全量を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に投与した。
【００６２】
（工程ｂ−１）投与無、投与０．５時間、１．５時間、３時間、４．５時間、６時間、９時間、１３．５時間、１８時間後に、それぞれ動物を屠殺し、各臓器を摘出した。そして、各臓器の重量を測定した（重量Ａ（ｍｇ））。その後、トータルＲＮＡ抽出用のフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＱＩＡｚｏｌ組織溶解液（キアゲン社製）を臓器２５ｍｇあたり０．７ｍＬ加えた重量を測定後（重量Ｂ（ｍｇ））、ホモジナイザーを用いて物理的に破砕して懸濁液を作製した。
【００６３】
（工程ｂ−２）１．５ｍＬ容のマイクロチューブ内に入れた当該懸濁液０．７ｍＬの重量を測定（重量Ｃ（ｍｇ））した。次いで、ＲＮＡ分解酵素フリーの純水を５０μＬ添加し、攪拌した。さらにクロロホルム０．１４ｍＬをチューブ内に添加することにより調製したサンプルを激しく攪拌した。その後、５分間室温に放置した。引き続き、冷却遠心機にて摂氏４℃・１２０００Ｇにて遠心分離を行った。遠心分離後、静かに最上層を０．３ｍＬ採取し、これを新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れた。
【００６４】
（工程ｂ−３）工程１−４と同様に、分光光度計を用い、２６０ｎｍの波長における吸光度Ａ（２６０）を測定することにより、全てのサンプルの最上層のトータルＲＮＡ濃度を計算した。
【００６５】
（工程ｂ−４）工程ｂ−３で求めたサンプルの最上層のトータルＲＮＡ濃度を、工程１−４で求めた陰性コントロールの最上層のトータルＲＮＡ濃度と同一にするため、工程ｂ−２で得られた最上層０．３ｍＬに、適量のＲＮＡ分解酵素フリーの純水を加え（希釈率：１／［ｂ］）、良く攪拌した。
【００６６】
（工程ｂ−５）工程ｂ−４で得られたサンプルのうち、０．３ｍＬを新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れ、さらに、エタノール０．４５ｍＬを添加した。
【００６７】
（工程ｂ−６）得られた混合液全容を、２ｍＬ容のマイクロチューブにセットしたカラム（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラム）内に入れ、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラムにｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを吸着させた。
【００６８】
（工程ｂ−７）ｓｉＲＮＡの吸着したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい２ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００６９】
（工程ｂ−８）当該カラムに、プレ洗浄液ＲＷＴ緩衝液０．７ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラムをプレ洗浄した（１回目洗浄）。
【００７０】
（工程ｂ−９）工程ｂ−８で洗浄したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい２ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００７１】
（工程ｂ−１０）当該カラムに、洗浄液ＲＰＥ緩衝液０．５ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて２分間遠心分離することにより、カラムを洗浄した（２回目洗浄）。
【００７２】
（工程ｂ−１１）工程ｂ−１０で洗浄したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００７３】
（工程ｂ−１２）当該カラムに６０μＬのＲＮＡ分解酵素フリーの純水を入れ、室温・８０００Ｇにて１分間遠心分離することにより、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの吸着したカラムから、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを溶出した。
【００７４】
（工程ｃ−１）工程ｂ−１２で得られた各溶出液５０μＬを９６穴黒色プレートに入れ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１８ｎｍで蛍光強度を測定し記録した。
【００７５】
＜各臓器に分布したｓｉＲＮＡ重量の計算＞
（工程ｄ−１）各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量は、下記の式（４）により算出される。ここで、Ｃ（ｍｇ）は、工程ｂ−２による破砕及び懸濁処理後の０．７ｍＬのサンプル重量を示す。また、Ｂ（ｍｇ）は、当該破砕及び懸濁処理前の各臓器重量Ａ（ｍｇ）と、各臓器に加えた組織溶解液の重量との和である。本実施例においては、臓器２５ｍｇあたりに組織溶解を０．７ｍＬ加えているので、以下の式（５）により求めることができる。さらに、１／［ｂ］は、工程ｂ−４の工程でサンプルの希釈率を示す。
［各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量］
＝［抽出・カラム精製前の標識ｓｉＲＮＡ量］×［Ｂ（ｍｇ）／Ｃ（ｍｇ）］×［ｂ］
・・・式（４）
Ｂ（ｍｇ）＝Ａ（ｍｇ）＋Ａ（ｍｇ）／２５（ｍｇ）×０．７×［組織溶解液の比重］
・・・式（５）
【００７６】
＜各臓器に分布した単位重量あたりのｓｉＲＮＡ重量比の計算＞
工程ｂ−１において、各臓器の重量はＡ（ｍｇ）であったので、各臓器に分布した臓器単位重量（例えば、臓器１ｍｇ）あたりのｓｉＲＮＡ重量比は、下記の式（６）により算出される。
［各臓器に分布した臓器単位重量あたりのｓｉＲＮＡ重量比］
＝［各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量］／Ａ（ｍｇ）・・・式（６）
【００７７】
各溶出液の蛍光強度、及び標準曲線から各溶出液に含まれる蛍光標識ｓｉＲＮＡの量を導出した。図４に、各臓器におけるｓｉＲＮＡ量の分布を経時的にプロットした図を示す。より具体的には、ＰｏｌｙＭａｇ（８．３μＬ）／標識ｓｉＲＮＡ複合体を、静脈内投与後、当該ｓｉＲＮＡのマウスの各臓器での集積量（生体内分布）を、図３で示した相関関数より損失量を考慮して求めた結果を示す。図中の（ａ）は０．５時間、（ｂ）は１．５時間、（ｃ）は３時間、（ｄ）は４．５時間、（ｅ）は６時間、（ｆ）は９時間、（ｇ）は１３．５時間、（ｈ）は１８時間経過後（ｓｉＲＮＡ投与後）を示す
【００７８】
また、図５に、各臓器におけるｓｉＲＮＡの重量比の分布を経時的にプロットした図を示す。具体的には、図４で求めた数値を、対応する各臓器の重量で除すことにより計算した。
【００７９】
（実施例２）
＜標準曲線（内部標準用）の作成実験＞
（工程２−１）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７によって標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（以降、「対比用標識ｓｉＲＮＡ」とも称する）の原液をＲＮＡ分解酵素フリーの純水で希釈した。そして、それぞれ１．５ｍＬ容のマイクロチューブ（エッペンドルフ製）内で、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇの対比用標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの希釈系列を作製した。なお、対比用標識ｓｉＲＮＡとは、前述したとおり、標識する蛍光色素の種類のみが標識核酸と異なるものであって、結合されている核酸は同一（遺伝子配列は同一）のものを云う。
【００８０】
（工程２−２）工程２−１で得られた各溶出液５０μＬを蛍光測定用の９６穴黒色プレートに入れ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長５９５ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍで蛍光強度を測定し記録した。
【００８１】
（工程２−３）工程２−２で記録したそれぞれの希釈系列の蛍光強度と、それぞれの希釈系列５０μＬの対比用標識ｓｉＲＮＡの含有量との間の関係式を導くために、グラフ上にプロットすることにより標準曲線を作成した。そして、当該含有量における直線性を確認した。対比用標識ｓｉＲＮＡ量と、当該ｓｉＲＮＡ溶液の示す蛍光強度との間に、例えば、以下の式（７）の相関関数があるという知見を得た。
［対比用標識ｓｉＲＮＡ量］
＝Ｆ×（［対比用標識ｓｉＲＮＡ溶液の示す蛍光強度］＾Ｇ） ・・・式（７）
なお、Ｆ、Ｇは前記のグラフソフトを用いて算出した。
【００８２】
＜標準曲線（未知のサンプル用）の作成実験＞
（工程３−１）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８によって標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（以降、「標識ｓｉＲＮＡ」とも称する）の原液をＲＮＡ分解酵素フリーの純水で希釈した。そして、それぞれ１．５ｍＬ容のマイクロチューブ（エッペンドルフ製）内で、０ｎｇ（純水のみ）、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇの標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの希釈系列を作製した。
【００８３】
（工程３−２）工程３−１で得られた各溶出液５０μＬを蛍光測定用の９６穴黒色プレートに入れ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１
８ｎｍで蛍光強度を測定し記録した。
【００８４】
（工程３−３）工程３−２で記録したそれぞれの希釈系列の蛍光強度と、それぞれの希釈系列５０μＬの標識ｓｉＲＮＡの含有量との間の関係式を導くために、グラフ上にプロットすることにより標準曲線を作成した。そして、当該含有量における直線性を確認した。標識ｓｉＲＮＡ量と、当該ｓｉＲＮＡ溶液の示す蛍光強度との間に、例えば、以下の式（８）の相関関数があることを確認した。
［標識ｓｉＲＮＡ量］＝Ｈ×（［標識ｓｉＲＮＡ溶液の示す蛍光強度］＾Ｉ）
・・・式（８）
なお、Ｈ、Ｉは前記のグラフソフトを用いて算出した。
【００８５】
＜マウスモデルの各臓器に分布したｓｉＲＮＡの抽出実験＞
（工程２ａ−１）陽性荷電ポリマーＰｏｌｙＭａｇ（８．３μＬ）と、陰性荷電をもつ標識ｓｉＲＮＡを室温で混合し、５分間放置した。静電結合により得られたＰｏｌｙＭａｇ／標識ｓｉＲＮＡ複合体の全量を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に投与した。
【００８６】
（工程２ｂ−１）投与０．５時間後に、動物を屠殺し、肝臓を摘出した。そして、肝臓の重量を測定した（重量Ａ'（ｍｇ））。その後、ＱＩＡｚｏｌ組織溶解液を肝臓２５ｍｇあたり０．７ｍＬ加えた重量を測定後（重量Ｂ'（ｍｇ））、ホモジナイザーを用いて物理的に破砕して懸濁液を作製した。
【００８７】
（工程２ｂ−２）１．５ｍＬ容のマイクロチューブ内に入れた当該懸濁液０．７ｍＬの重量を測定（重量Ｃ'（ｍｇ））した。次いで、ＲＮＡ分解酵素フリーの純水で希釈した、既知量として、例えば、２９１．６ｎｇの対比用標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの溶液を添加して攪拌した。さらに、クロロホルム０．１４ｍＬをチューブ内に添加後、激しく攪拌し、５分間室温に放置した。引き続き、冷却遠心機にて摂氏４℃・１２０００Ｇにて遠心分離を行った。遠心分離後、静かに最上層を０．３ｍＬ採取し、これを新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れた。
【００８８】
（工程２ｂ−３）工程２ｂ−２で得られたサンプルのうち、０．３ｍＬを新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れ、さらに、エタノール０．４５ｍＬを添加した。
【００８９】
（工程２ｂ−４）得られた混合液全容を、２ｍＬ容のマイクロチューブにセットしたスピンカラム内に入れ、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、当該カラムにｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを吸着させた。
【００９０】
（工程２ｂ−５）ｓｉＲＮＡの吸着した当該カラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい２ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００９１】
（工程２ｂ−６）当該カラムに、プレ洗浄液ＲＷＴ緩衝液０．７ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラムをプレ洗浄した（１回目洗浄）。
【００９２】
（工程２ｂ−７）工程２ｂ−６で洗浄したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該ｍｉＲＮｅａｓｙカラムに新しい２ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００９３】
（工程２ｂ−８）当該カラムに、洗浄液ＲＰＥ緩衝液０．５ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて２分間遠心分離することにより、カラムを洗浄した（２回目洗浄）。
【００９４】
（工程２ｂ−９）工程２ｂ−８の工程で洗浄したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００９５】
（工程２ｂ−１０）当該カラムに６０μＬのＲＮＡ分解酵素フリーの純水を入れ、室温・８０００Ｇにて１分間遠心分離することにより、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの吸着したカラムから、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを溶出した。
【００９６】
（工程２ｃ−１）工程２ｂ−１０で得られた各溶出液５０μＬを９６穴黒色プレートに入れ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、１サンプルに対し、励起波長５９５ｎｍ／蛍光波長６７０ｎｍ及び励起波長４９５ｎｍ／蛍光波長５１８ｎｍの２種類の蛍光強度を測定し記録した。
【００９７】
（工程２ｄ−１）工程２ｃ−１で記録した励起波長５９５ｎｍ／蛍光波長６７０ｎｍの蛍光強度を工程２−３で求めた式（７）に入れ、カラムから溶出された対比用標識核酸（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７によって標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）量：Ｄ'（ｎｇ）を求めた。
【００９８】
また、工程３−３で加えた対比用標識核酸量は、例えば２９１．６ｎｇであったため、サンプル処理前に存在するｓｉＲＮＡ総量は、一連のサンプル処理により一部損失していることが以下の式（９）より求められた。
［最終的なｓｉＲＮＡ回収率：Ｅ'］＝Ｄ'（ｎｇ）／２９１．６（ｎｇ）・・式（９）
実験では、回収率は２３．２％と計算された。
【００９９】
＜臓器に分布したｓｉＲＮＡ重量の計算＞
工程３−３による破砕及び懸濁処理後の０．７ｍＬのサンプル重量はＣ'（ｍ
ｇ）、工程３−２による各臓器重量と、各臓器に加えた組織溶解液の重量の和はＢ'
（ｍｇ）である。Ｂ'（ｍｇ）は、臓器２５ｍｇあたりに組織溶解液を０．７ｍＬ加えているので、上記式（５）と同様にして求めることができる。さらに、工程３−３で算出した式（８）、及び工程２ｄ−１で求めた上記式（９）より、臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量は下記の式（１０）により算出される。
［各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量］
＝［抽出・精製前の標識ｓｉＲＮＡ量］×［Ｂ'(mg)／Ｃ'(mg)］／Ｅ'
・・・式（１０）
実験では、当該ｓｉＲＮＡ量は２１８３ｎｇと計算された。
【０１００】
＜臓器に分布した単位重量あたりのｓｉＲＮＡ重量比の計算＞
工程３−２において、各臓器の重量はＡ'（ｍｇ）であったので、各臓器に分布した臓器単位重量（例えば、臓器１ｍｇ）あたりのｓｉＲＮＡ重量比は、下記の式（１１）により算出される。
［各臓器に分布した臓器単位重量あたりのｓｉＲＮＡ重量比］
＝［各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量］／Ａ'（ｍｇ）・・・式（１１）
実験では、当該ｓｉＲＮＡ量は１．９８０×０−６と計算された。
実施例２により求めた式（９）、式（１０）、式（１１）により得た実験値は、実施例１と概ね近似した数値であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明によれば、生体内に分布した核酸、若しくは細胞に取り込まれた核酸の簡便な精密定量法を提供することができる。核酸のうち、特に、低分子量である核酸の定量も簡便かつ安全に行うことができるので、新規核酸医薬として期待されているｓｉＲＮＡにおける最重要課題である患部への運搬法を開発する上で非常に有用な手段となる。そのため、ｓｉＲＮＡの各種送達法の開発、及び様々な疾患治療に対応する新規ｓｉＲＮＡの開発に利用可能である。
【符号の説明】
【０１０２】
１、２、４、５ マイクロチューブ
３ カラム
１０ サンプル
１１ 最上層
１２ 中間層
１３ 下層
２０ サンプル
３０ トータルＲＮＡ溶液
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の定量法、及び核酸定量装置に関する。より詳しくは、生体内に分布した核酸、若しくは細胞に取り込まれた核酸の定量法、及び核酸定量装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（small interfering ＲＮＡ）は、２００６年度のノーベル賞受賞テーマであるｓｉＲＮＡの機能の解明以降、疾患の原因遺伝子を破壊する新規核酸医薬として大きな期待を集め、世界中で広範に研究開発が進められている。ｓｉＲＮＡの新規核酸医薬の実現には、ｓｉＲＮＡの生体内、若しくは細胞内における動態を解明する技術が重要となる。
【０００３】
実験動物等の生体内に分布したｓｉＲＮＡの定性的な検出方法として、蛍光顕微鏡を用いる方法が知られている。また、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入したときの細胞内導入率を求める方法として、蛍光標識したｓｉＲＮＡをフローサイトメトリーによる解析する方法が知られている（非特許文献１）。さらに、生体内に分布したｓｉＲＮＡを定量する方法として、アイソトープを用いて放射能強度を測定する方法が提案されている（非特許文献２〜４）。なお、核酸の定量法としては、特許文献１や２などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１９６９９７号公報
【特許文献２】特開２００６−２０１０６２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】関根光雄、多比良和誠編者、「ＲＮＡｉ法とアンチセンス法」、初版、株式会社講談社、２００５年６月２０日、ｐ．１０４−１０６
【非特許文献２】Derek W. Bartlett 他５名、ＰＮＡＳ、２００７年９月２５日、第１０４巻、第３９号、ｐ．１５５４９−１５５５４
【非特許文献３】Merkel OM． 他４名、Bioconjug Chem.、２００９年１月、２０（１）、ｐ．１７４−１８２
【非特許文献４】Liu N 他４名、Nucl Med Biol.、２００７年５月、３４（４）、ｐ．３９９−４０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記非特許文献１に記載のフローサイトメトリーによる測定法は、個々の細胞の蛍光強度を測定することが可能である。しかしながら、個々の細胞の蛍光強度からｓｉＲＮＡ量を割り出すことはできなかった。また、フローサイトメトリーによる測定法は、個々の細胞に分散させることができない臓器などにおいて適用することができないという問題点があった。
【０００７】
上記非特許文献２〜４に記載のｓｉＲＮＡの定量方法は、アイソトープ実験設備を備えている施設に限定されるという問題があった。さらに、放射性同位体を用いるため、簡便、かつ安全な方法とは言えなかった。
【０００８】
なお、上記においては、ｓｉＲＮＡにおける問題点について述べたが、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ等をはじめとする核酸全般においても同様の問題が生じ得る。
【０００９】
さらに、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）などの核酸増幅法を必須とする上記特許文献１や２の方法を、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのような低分子の核酸に適用することは技術上困難であった。
【００１０】
本発明は、上記背景に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、低分子の核酸にも適用可能であって、簡便かつ安全に定量することが可能な核酸の定量法、及び核酸の定量装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る核酸の定量法は、蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する工程（ａ）と、前記生物の体内に分布した、若しくは前記細胞に取り込まれた前記標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出して精製する工程（ｂ）と、前記工程（ｂ）により得た精製物の蛍光強度を測定する工程（ｃ）と、前記工程（ｃ）の測定値に対し、前記工程（ｂ）中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う工程（ｄ）とを備えるものである。
【００１２】
本発明に係る核酸の定量法によれば、蛍光強度を測定することにより定量を行っているので、簡便かつ安全に定量を行うことができる。また、抽出、精製工程によって標識核酸が損失することは必発であるが、この損失量を考慮して補正しているので、定量精度を高めることができる。
【００１３】
本発明に係る核酸の定量装置は、蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与して生物の体内に分布した、若しくは細胞の培養液に添加して取り込まれた前記標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に取り出したものを抽出して精製するサンプル調製手段と、前記サンプル調製手段により得た精製物の蛍光強度を測定する測定手段と、前記測定手段により得た測定値に対し、前記サンプル調製手段中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う手段とを備えるものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、低分子の核酸にも適用可能であって、簡便かつ安全に定量することが可能な核酸の定量法、及び核酸の定量装置を提供することができるという優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施形態に係る核酸の定量法のフローチャート図。
【図２】（ａ）〜（ｅ）実施例に係る製造工程説明図。
【図３】実施例に係る標識核酸の標準曲線をプロットした図。
【図４】実施例に係る各臓器中のｓｉＲＮＡ量をプロットした図。
【図５】実施例に係る各臓器中のｓｉＲＮＡの重量比をプロットした図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を適用した実施形態の一例について図１のフローチャート図を用いつつ説明する。
【００１７】
＜工程（ａ）＞ 蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する。ここで、「核酸」とは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）等の低分子のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ等をはじめとするＲＮＡ、ＤＮＡ全般を云う。また、ＰＮＡ（Peptide Nucleic acid）など核酸類似体であってもよい。核酸は、天然由来のものであっても、合成されたものであってもよい。本発明の定量法を適用する核酸の分子量は問わないが、本発明は、従来、放射性同位体等を用いずに安全に定量することが難しかった低分子量（例えば、塩基が１０以上、１００以下程度）の核酸を定量するのに特に有用である。また、前述したとおり、新規核酸医薬として期待されているｓｉＲＮＡに特に好適に適用できる。
【００１８】
蛍光色素は、特定の波長で励起され、蛍光を発光する色素であり、本発明の趣旨を逸脱しないものであれば特に限定されるものではないが、一例として以下のものを挙げることができる。すなわち、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７５０）、ＢＯＤＩＰＹＲ（登録商標）色素（Ｂｉｏｄｉｐｙ ＦＬ、Ｂｉｏｄｉｐｙ ５３０／５５０、Ｂｉｏｄｉｐｙ ＴＲ、Ｂｉｏｄｉｐｙ ＴＭＲ）、ローダミン系色素（Ｒ６Ｇ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡなど）、フルオレセイン系色素（フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、Ｙａｋｉｍａ ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。
【００１９】
蛍光標識の核酸への結合部位については、特に限定されず、核酸を標識することのできる結合部位は全て用いることができる。一例として、核酸の３'末端、５'末端を挙げることができる。
【００２０】
標識核酸は、生体内、生体外のいずれにおいても使用することができる。生体内で使用する場合の投与経路は、特に限定されない。一例を挙げれば、静脈内、実質臓器内（例えば、脳、目、甲状腺、乳腺、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、副腎、卵巣、精巣等）、管腔臓器の管腔内（例えば、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、大腸、胆嚢、尿管、膀胱内等）、脳脊髄腔内、胸腔内、腹腔内、筋肉内、関節内、皮下、皮内等である。
【００２１】
核酸を投与する生物種は、動物、植物、カビ、酵母等の微生物等、特に限定されることはないが、動物由来であることが好ましく、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット等の哺乳動物であることがより好ましい。また、核酸を取り込む細胞の種類は、特に限定されないが、一例として、体細胞、生殖細胞、幹細胞又はこれらの培養細胞等を挙げることができる。
【００２２】
標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する際には、標識核酸の他、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、本発明者らが先に提案した磁性ナノ粒子（特願２００７−１９８１０４号公報）、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー等の核酸運搬用のデリバリーシステムを用いることができる。無論、標識核酸単独で生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加してもよい。また、公知の核酸の投与法を制限なく適用することができる。
【００２３】
＜工程（ｂ）＞ 生物の体内に分布した、若しくは細胞に取り込まれた標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出する。ここでは、生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加した標識核酸と、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸とを総称してトータル核酸と称する。核酸のうちのＲＮＡを対象とする場合には、トータルＲＮＡを抽出する。生物の体内に分布したトータル核酸の抽出は、生物の一部、若しくは全部を用いて抽出することが可能である。例えば、肝臓、肺、脾臓等の各種臓器、全血、血清、生体組織等から核酸を抽出することができる。細胞に取り込まれたトータル核酸の抽出には、培養液中の細胞の一部、若しくは全部を用いて抽出することが可能である。
【００２４】
核酸を含有する試料からトータル核酸を得る方法としては、公知の方法を制限なく使用することができる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出法により、核酸を含有する試料からトータル核酸を得ることができる。この方法は、フェノール・クロロホルムを用いてタンパク質、脂質などの水難溶性の検体成分を変性、溶解または沈殿させる一方、核酸を水相に溶解するという溶解度の違いを利用するものである。その他、チオシアン酸グアニジン等のカオトロピック塩、硫酸アンモニウム等のアンチカオトロピック塩等を用いる方法もある。
【００２５】
次いで、抽出物を精製する。核酸を精製する方法であれば、特に限定されないが、一例として、アルコール沈澱、限外濾過、電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、イオン交換、選択吸着、アフィニティー結合を利用したクロマトグラフィー、磁性粒子などを組み合わせたアフィニティー結合等を挙げることができる。これらは、単独、若しくは併用することができる。より好ましくは、ゲル濾過と遠心分離を利用したスピンカラムクロマトグラフィーである。
【００２６】
カラムクロマトグラフィーにおいては、核酸を固相担体表面に吸着させる工程、並びに、固相担体を洗浄し、核酸を溶離する工程を備える。固相担体の表面は、例えば、合成高分子、無機物質、ガラスよりなる群から選択されるものを好適に適用することができる。より具体的には、シリカ粒子、シリカ粉末、シリカ繊維（グラスファイバー）、シリカメンブレン、シリカクロス、一体型多孔質シリカなどのシリカ担体、セラミック粒子、セラミック粉末、セラミック繊維、セラミックメンブレン、セラミッククロス、一体型多孔質セラミックなどのセラミック担体のいずれか、若しくはこれらを混成したもの、若しくはこれらを混合したもの等を好適に適用することができる。抽出する核酸を効率よく精製できるものであることが好ましく、１０〜１８塩基以上の全ての長さの核酸を精製可能なものを使用することがより好ましい。例えば、標識核酸がｓｉＲＮＡであり、トータルＲＮＡを精製する場合には、１０〜１８塩基以上の全ての長さのＲＮＡを精製可能な固相担体表面を使用することが好ましい。
【００２７】
核酸の精製は、抽出試料の全量、若しくはその一部に対して実施する。抽出試料の一部に対して実施した場合には、測定に用いたサンプルの量とその測定値に基づいて、全量を算出すればよい。操作時間の短縮化、操作工程の簡便化を図る観点からは、抽出試料の一部に対して実施することが好ましい。
【００２８】
＜工程（ｃ）＞ 工程（ｂ）により得た精製物の蛍光強度を測定する。具体的には、標識核酸の定量は、蛍光色素固有の励起波長光を測定サンプルに照射し、サンプルからの蛍光強度を測定する。測定装置は、微量の発光を検知可能であって、本発明の目的を達成し得るものであれば限定されないが、蛍光測定装置、蛍光プレートリーダー等が好適な例として挙げられる。
【００２９】
＜工程（ｄ）＞ 工程（ｃ）の測定値に対し、工程（ｂ）中の標識核酸の損失量を考慮して、標識核酸の定量を行う。損失量の好適な計算方法として、以下の方法を挙げることができる。
【００３０】
損失量の第１の導出方法としては、以下の方法を挙げることができる。すなわち、標識核酸の既知量のサンプルを複数用意して希釈系列を作成する。次いで、当該サンプルに対して工程（ｂ）の抽出前に蛍光強度を工程（ｃ）と同様にして測定する。その後、工程（ｂ）の抽出、精製工程を実施した後に工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定する。抽出前、及び精製後の蛍光強度の関係より希釈系列の標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて工程（ｂ）の損失量を導出する。
【００３１】
標識核酸の工程（ｃ）の蛍光強度、及び前述の標準曲線により、工程（ｂ）により損失した量を含めた標識核酸の量を求めることができる。
【００３２】
損失量の第２の導出方法としては、抽出工程による損失量を無視して、精製工程による損失量のみを考慮して補正を行う方法を挙げることができる。精製方法によっては、抽出工程による損失量に比して精製工程の損失量が相当大きい場合もあり得る。このような場合に特に有効な方法である。この場合、希釈系列のサンプルを、精製工程前、精製工程後のそれぞれの蛍光強度を測定して標準曲線を作成すればよい。
【００３３】
損失量の第３の導出方法としては、上記第１の導出方法に対して、抽出前の蛍光強度の測定を省略して標準曲線を作成する方法を挙げることができる。具体的には、標識核酸の既知量のサンプルを複数用意して希釈系列を作成し、工程（ｂ）の抽出・精製の全工程を実施した後に、工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定する。そして、抽出前に加えた核酸量と、抽出精製後の蛍光強度との関係より、希釈系列の損失量を加味した標準曲線を作成する。当該方法によれば、損失量を加味した標準曲線により、一段階で、工程（ｂ）により損失した量を含めた標識核酸の量を求めることができる。
【００３４】
損失量の第４の導出方法としては、以下の方法を挙げることができる。すなわち、標識核酸に対して、結合している蛍光色素のみが異なる対比用標識核酸を用意する。そして、工程（ｂ）の抽出を実施する前のサンプルに、対比用標識核酸を所定量加える。次いで、工程（ｂ）の抽出を実施する前と、精製を実施した後それぞれにおいて、対比用標識核酸の蛍光強度を工程（ｃ）と同様に測定する。その後、工程（ｂ）における対比用標識核酸の損失量を求め、当該損失量から標識核酸の損失量を導出する。
【００３５】
対比用標識核酸に結合する蛍光色素は、標識核酸に結合している蛍光色素と蛍光測定により区別し得るものであれば特に限定されないが、互いの発光波長が重ならないものを用いることが好ましい。標識核酸の工程（ｃ）の蛍光強度、及び前述の対比用標識核酸の損失した量より、工程（ｂ）により得た精製物中の標識核酸の量を求めることができる。
【００３６】
損失量の第５の導出方法としては、第４の導出方法のように抽出工程前に対比用標識核酸を加えずに、抽出工程後に対比用標識核酸を加え、精製工程前後の損失量を上記第４の導出方法と同様にして求めてもよい。精製方法によっては、抽出工程による損失量に比して精製工程の損失量が相当大きい場合もあり得る。このような場合に特に有効な方法である。この場合、希釈系列のサンプルを、精製工程前、精製工程後のそれぞれの蛍光強度を測定して標準曲線を作成すればよい。なお、損失量の導出方法としては、上記例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、種々の方法を採用することができる。
【００３７】
上述した損失量の第１の導出方法〜第５の損失方法等において、サンプルの一部に対して抽出、精製工程を行った場合には、得られた標識核酸の量から生体試料中の標識核酸の含有量を決定する。
【００３８】
なお、トータル核酸の濃度を求め、トータル核酸中の標識核酸の比率を求めることもできる。トータル核酸の濃度は、公知の方法により制限なく求めることができる。例えば、サンプル中のトータルＲＮＡの濃度は、分光光度計を用いて２６０ｎｍの波長における吸光度Ａ（２６０）を測定し、以下の式（１）より求めることができる。
［トータルＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）］
＝Ａ（２６０）×４０×１０／光路長（ｍｍ）・・・式（１）
但し、トータルＲＮＡの定量は、公知の方法を制限なく使用することができる。なお、二本鎖ＤＮＡ濃度を求める場合には、上記式（１）の定数４０を５０に、一本差ＤＮＡの場合には、定数４０を３３に変更することにより求めることができる。
【００３９】
次に、本実施形態に係る核酸の定量装置について説明する。本実施形態に係る核酸の定量装置は、サンプル調整手段と、測定手段と、定量手段とを備える。サンプル調整手段は、蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与して生物の体内に分布した、若しくは細胞の培養液に添加して取り込まれた標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に取り出したものを抽出して精製する手段である。測定手段は、サンプル調製手段により得たサンプルの蛍光強度を測定する手段である。また、定量手段は、測定手段により得た測定値に対し、サンプル調製手段中の標識核酸の損失量を考慮して、標識核酸の定量を行う手段である。
【００４０】
サンプル調整手段としては、前述した抽出方法、精製方法を実現する装置を用いることができる。測定手段としては、前述した蛍光測定装置、蛍光プレートリーダー等の微量の発光を検知可能であって、本発明の目的を達成し得る装置を用いることができる。定量手段としては、定量したい全量と測定サンプルの量を入力する手段と、前述の工程（ｂ）中の損失量を計算するための標準曲線を記憶する手段と、当該標準曲線に基づいて、標識核酸の損失量を導出して、前述の測定手段により求めた蛍光強度から測定サンプルの標識核酸量を算出する手段と、得られた標識核酸量から目的物の標識核酸の量を求める手段とを備える。
【００４１】
標準曲線に対する情報がない場合には、標準曲線を記憶する手段の前に、既知量の標識核酸の希釈系列を複数作成したものに対し、工程（ｂ）の抽出及び精製を実施する前後それぞれにおいて、若しくは、精製を実施する前後それぞれにおいて、蛍光強度を測定して、精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成する手段を有するようにしてもよい。サンプル調整手段、測定手段、定量手段の全てを接続して全工程を自動化した自動分析装置を用いることにより、より容易かつ迅速に、高精度に標識核酸の定量を行うことができる。
【００４２】
なお、標識核酸の損失量の導出方法は、例えば、前述の第１の方法〜第５の方法を好適に適用することができる。
【００４３】
ところで、核酸の一種であるｓｉＲＮＡは、通常、１９〜２３塩基対からなる短い２本鎖ＲＮＡで、哺乳動物細胞内において遺伝子配列特異的に遺伝子発現を抑制する機能をもつ。すなわち、ｓｉＲＮＡを用いて狙った遺伝子の発現を特異的に制御可能である。しかしながら、ｓｉＲＮＡは不安定、かつ高価であるため、目的部位にｓｉＲＮＡを効率良く送達する技術の開発が望まれていた。
【００４４】
ｓｉＲＮＡは、低分子量であることに起因して、特許文献１や２の定量方法をそのまま適用することは困難であった。本実施形態によれば、ｓｉＲＮＡを生体内に投与した後の、ｓｉＲＮＡの生体内分布、若しくは、細胞の培養液に添加した後のｓｉＲＮＡの細胞への取り込み状態を簡便、かつ精密に定量することができる。また、ｓｉＲＮＡの精製工程におけるｓｉＲＮＡの回収損失は必発であるが、この損失量を考慮することにより、よりｓｉＲＮＡの定量精度を高めることが可能となった。しかも、非特許文献２〜４のように、アイソトープ等の特殊設備を使用せず、放射性同位体も使用しないので、安全かつ簡便に定量することができる。従って、ｓｉＲＮＡの動態の解明に大きく貢献することが期待できる。また、ｓｉＲＮＡの新規核酸医薬の実現に向け、患部への送達法の開発等に大きく貢献することが期待できる。無論、ｓｉＲＮＡの他、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ等をはじめとする各種ＤＮＡ、ＲＮＡにおいて同様の効果を提供することができる。
【００４５】
なお、上記実施形態は一例であって、本発明の趣旨に合致する限り、他の実施形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
［実施例］
【００４６】
以下、本発明のより具体的な実施例について、図２の工程説明図を用いつつ詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、以下の実施例に限定されないことは言うまでもない。?
【００４７】
（実施例１）
＜標準曲線の作成実験＞
（工程１−１）ｓｉＲＮＡ(キアゲン社）を投与していないマウスを屠殺後、肝臓を摘出し、その重量を測定した。測定後、トータルＲＮＡ抽出用のフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＱＩＡｚｏｌ組織溶解液（キアゲン社製）を、肝臓１００ｍｇあたり７ｍＬ加えた。そして、その重量を測定後、ホモジナイザーを用いて物理的に破砕して懸濁液を作製した。
【００４８】
（工程１−２）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８により標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（以降、単に「標識ｓｉＲＮＡ」とも称する）の原液をＲＮＡ分解酵素フリーの純水で希釈した。そして、それぞれ１．５ｍＬ容のマイクロチューブ１（エッペンドルフ製）内で、０ｎｇ（純水のみ）、０．４ｎｇ、１．２ｎｇ、３．６ｎｇ、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇの標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの希釈系列を作製した。
【００４９】
（工程１−３）工程１−２で作製した希釈系列それぞれに対し、工程１−１で作製した懸濁液を０．７ｍＬずつ入れ、攪拌した。その後さらに、クロロホルム０．３ｍＬをマイクロチューブ１に添加することにより調製したサンプル１０を激しく攪拌した。その後、５分間室温に放置した（図２（ａ）参照）。引き続き、冷却遠心機（不図示）にて摂氏４℃・１２０００Ｇにて遠心分離を行った。遠心分離後のサンプル１０の最上層１１にはトータルＲＮＡが、中間層１２には変性タンパクが、最下層１３にはＤＮＡが含まれていることを確認した（図２（ｂ）参照）。
【００５０】
（工程１−４）工程１−３の処理を行ったサンプル１０の最上層１１を採取し、トータルＲＮＡの吸光度を測定した。そして、得られた吸光度より以下の式（２）を用いて、最上層１１のトータルＲＮＡ濃度を計算した。具体的には、工程１−３で得たサンプル１０の最上層１１を静かに数μＬ取り出し、適度に希釈した（希釈率：１／［ａ］）。その後、分光光度計を用いて２６０ｎｍの波長における吸光度Ａ（２６０）を測定した。そして、この値を式（１）に代入することにより、トータルＲＮＡ濃度を求めた。
［トータルＲＮＡ濃度（μｇ/mＬ）］
＝Ａ（２６０）×４０×１０／光路長（mm）×［ａ］・・・式（２）
【００５１】
（工程１−５）新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブ２に、工程１−２で調製した０．４ｎｇ、１．２ｎｇ、３．６ｎｇ、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇの標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの希釈系列を加えたサンプルを用意した。次いで、工程１−３により得られた最上層１１を静かに０．３ｍＬ採取して、前述の各マイクロチューブ２内に入れた。その後、さらに各マイクロチューブ２内にエタノール０．４５ｍＬを添加することにより各希釈系列の混合液２０を得た（図２（ｃ）参照）。
【００５２】
（工程１−６）ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラム（以下、「カラム」とも称する）３（キアゲン社製）を２ｍＬ容のマイクロチューブ４にセットした後、カラム３内に混合液２０の全容を入れた。次いで、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラム３にｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを吸着させた。各希釈系列のサンプルに対して同様の操作を行った。
【００５３】
（工程１−７）ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの吸着したカラム３をマイクロチューブ４から外し、マイクロチューブ４内に排出された廃液とともにマイクロチューブ４を廃棄し、カラム３に新しい２ｍＬ容のマイクロチューブ（不図示）をセットした。
【００５４】
（工程１−８）カラム３に、チオシアン酸グアニジンを含有するプレ洗浄液ＲＷＴ緩衝液（キアゲン社製）０．７ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラム３をプレ洗浄した（１回目洗浄）。
【００５５】
（工程１−９）工程１−８で洗浄したカラム３をマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、カラム３に新しい２ｍＬ容のマイクロチューブ（不図示）をセットした。
【００５６】
（工程１−１０）カラム３に、洗浄液ＲＰＥ緩衝液（キアゲン社製）０．５ｍＬを加え、室温下、８０００Ｇにて２分間遠心分離することにより、カラム３を洗浄した（２回目洗浄）。
【００５７】
（工程１−１１）工程１−１０で洗浄したカラム３をマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、カラム３に新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブ５をセットした。
【００５８】
（工程１−１２）カラム３に６０μＬのＲＮＡ分解酵素フリーの純水を入れ、室温下、８０００Ｇにて１分間遠心分離することにより、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの吸着したカラム３から、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡ溶液３０をマイクロチューブ５内に溶出させた（図２（ｅ）参照）。
【００５９】
（工程１−１３）工程１−１２で得られた各溶出液５０μＬを蛍光測定用の９６穴黒色プレート（ＮＵＮＣ社製）に入れた。そして、蛍光マイクロプレートリーダー（モデル１４２０マルチラベルカウンター、パーキンエルマー社製）を用いて、励起波長４９５ｎｍ、蛍光検出波長５１８ｎｍで蛍光強度を測定し、その値を記録した。
【００６０】
（工程１−１４）工程１−１３で記録したそれぞれの希釈系列の蛍光強度と、それぞれの希釈系列５０μＬの標識ｓｉＲＮＡの含有量、すなわち、４００ｐｇ、１．２ｎｇ、３．６ｎｇ、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇとの間の関係式を導くために、グラフ上にプロットすることにより標準曲線を作成した。図３に、得られた標準曲線を示す。横軸は、標識ｓｉＲＮＡの初期調製量であり、縦軸は、精製工程後（工程１−１２後）の蛍光強度を示す。図３の結果より、標識ｓｉＲＮＡの初期含有量が４００ｐｇ〜１μｇのときに、縦軸の蛍光強度との間に、直線性を認めることを確認した。また、ＲＮＡ抽出・カラム精製前の標識ｓｉＲＮＡ量と、最終的にカラムから溶出された当該ｓｉＲＮＡ溶出液の示す蛍光強度との間に、例えば、以下の式（３）の相関関数があるという知見を得た。
[抽出・カラム精製前の標識ｓｉＲＮＡ量]
=Ｄ×（［ｓｉＲＮＡ溶出液の示す蛍光強度］＾Ｅ）・・・式（３）
なお、Ｄ、Ｅはグラフソフト（Delta Graph ver.5）を用いて算出した。
【００６１】
＜マウスモデルの各臓器に分布したｓｉＲＮＡの抽出実験＞
（工程ａ−１）陽性荷電ポリマーＰｏｌｙＭａｇ(OZ Biosciences社, フランス)（８．３μＬ）と、陰性荷電をもつ蛍光標識核酸であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８によって標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（標識ｓｉＲＮＡ）を室温（２０℃）で混合し、５分間放置した。静電結合により得られたＰｏｌｙＭａｇ／標識ｓｉＲＮＡ複合体の全量を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に投与した。
【００６２】
（工程ｂ−１）投与無、投与０．５時間、１．５時間、３時間、４．５時間、６時間、９時間、１３．５時間、１８時間後に、それぞれ動物を屠殺し、各臓器を摘出した。そして、各臓器の重量を測定した（重量Ａ（ｍｇ））。その後、トータルＲＮＡ抽出用のフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含有するＱＩＡｚｏｌ組織溶解液（キアゲン社製）を臓器２５ｍｇあたり０．７ｍＬ加えた重量を測定後（重量Ｂ（ｍｇ））、ホモジナイザーを用いて物理的に破砕して懸濁液を作製した。
【００６３】
（工程ｂ−２）１．５ｍＬ容のマイクロチューブ内に入れた当該懸濁液０．７ｍＬの重量を測定（重量Ｃ（ｍｇ））した。次いで、ＲＮＡ分解酵素フリーの純水を５０μＬ添加し、攪拌した。さらにクロロホルム０．１４ｍＬをチューブ内に添加することにより調製したサンプルを激しく攪拌した。その後、５分間室温に放置した。引き続き、冷却遠心機にて摂氏４℃・１２０００Ｇにて遠心分離を行った。遠心分離後、静かに最上層を０．３ｍＬ採取し、これを新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れた。
【００６４】
（工程ｂ−３）工程１−４と同様に、分光光度計を用い、２６０ｎｍの波長における吸光度Ａ（２６０）を測定することにより、全てのサンプルの最上層のトータルＲＮＡ濃度を計算した。
【００６５】
（工程ｂ−４）工程ｂ−３で求めたサンプルの最上層のトータルＲＮＡ濃度を、工程１−４で求めた陰性コントロールの最上層のトータルＲＮＡ濃度と同一にするため、工程ｂ−２で得られた最上層０．３ｍＬに、適量のＲＮＡ分解酵素フリーの純水を加え（希釈率：１／［ｂ］）、良く攪拌した。
【００６６】
（工程ｂ−５）工程ｂ−４で得られたサンプルのうち、０．３ｍＬを新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れ、さらに、エタノール０．４５ｍＬを添加した。
【００６７】
（工程ｂ−６）得られた混合液全容を、２ｍＬ容のマイクロチューブにセットしたカラム（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラム）内に入れ、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラムにｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを吸着させた。
【００６８】
（工程ｂ−７）ｓｉＲＮＡの吸着したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい２ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００６９】
（工程ｂ−８）当該カラムに、プレ洗浄液ＲＷＴ緩衝液０．７ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラムをプレ洗浄した（１回目洗浄）。
【００７０】
（工程ｂ−９）工程ｂ−８で洗浄したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい２ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００７１】
（工程ｂ−１０）当該カラムに、洗浄液ＲＰＥ緩衝液０．５ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて２分間遠心分離することにより、カラムを洗浄した（２回目洗浄）。
【００７２】
（工程ｂ−１１）工程ｂ−１０で洗浄したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００７３】
（工程ｂ−１２）当該カラムに６０μＬのＲＮＡ分解酵素フリーの純水を入れ、室温・８０００Ｇにて１分間遠心分離することにより、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの吸着したカラムから、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを溶出した。
【００７４】
（工程ｃ−１）工程ｂ−１２で得られた各溶出液５０μＬを９６穴黒色プレートに入れ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１８ｎｍで蛍光強度を測定し記録した。
【００７５】
＜各臓器に分布したｓｉＲＮＡ重量の計算＞
（工程ｄ−１）各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量は、下記の式（４）により算出される。ここで、Ｃ（ｍｇ）は、工程ｂ−２による破砕及び懸濁処理後の０．７ｍＬのサンプル重量を示す。また、Ｂ（ｍｇ）は、当該破砕及び懸濁処理前の各臓器重量Ａ（ｍｇ）と、各臓器に加えた組織溶解液の重量との和である。本実施例においては、臓器２５ｍｇあたりに組織溶解を０．７ｍＬ加えているので、以下の式（５）により求めることができる。さらに、１／［ｂ］は、工程ｂ−４の工程でサンプルの希釈率を示す。
［各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量］
＝［抽出・カラム精製前の標識ｓｉＲＮＡ量］×［Ｂ（ｍｇ）／Ｃ（ｍｇ）］×［ｂ］
・・・式（４）
Ｂ（ｍｇ）＝Ａ（ｍｇ）＋Ａ（ｍｇ）／２５（ｍｇ）×０．７×［組織溶解液の比重］
・・・式（５）
【００７６】
＜各臓器に分布した単位重量あたりのｓｉＲＮＡ重量比の計算＞
工程ｂ−１において、各臓器の重量はＡ（ｍｇ）であったので、各臓器に分布した臓器単位重量（例えば、臓器１ｍｇ）あたりのｓｉＲＮＡ重量比は、下記の式（６）により算出される。
［各臓器に分布した臓器単位重量あたりのｓｉＲＮＡ重量比］
＝［各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量］／Ａ（ｍｇ）・・・式（６）
【００７７】
各溶出液の蛍光強度、及び標準曲線から各溶出液に含まれる蛍光標識ｓｉＲＮＡの量を導出した。図４に、各臓器におけるｓｉＲＮＡ量の分布を経時的にプロットした図を示す。より具体的には、ＰｏｌｙＭａｇ（８．３μＬ）／標識ｓｉＲＮＡ複合体を、静脈内投与後、当該ｓｉＲＮＡのマウスの各臓器での集積量（生体内分布）を、図３で示した相関関数より損失量を考慮して求めた結果を示す。図中の（ａ）は０．５時間、（ｂ）は１．５時間、（ｃ）は３時間、（ｄ）は４．５時間、（ｅ）は６時間、（ｆ）は９時間、（ｇ）は１３．５時間、（ｈ）は１８時間経過後（ｓｉＲＮＡ投与後）を示す
【００７８】
また、図５に、各臓器におけるｓｉＲＮＡの重量比の分布を経時的にプロットした図を示す。具体的には、図４で求めた数値を、対応する各臓器の重量で除すことにより計算した。
【００７９】
（実施例２）
＜標準曲線（内部標準用）の作成実験＞
（工程２−１）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７によって標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（以降、「対比用標識ｓｉＲＮＡ」とも称する）の原液をＲＮＡ分解酵素フリーの純水で希釈した。そして、それぞれ１．５ｍＬ容のマイクロチューブ（エッペンドルフ製）内で、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇの対比用標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの希釈系列を作製した。なお、対比用標識ｓｉＲＮＡとは、前述したとおり、標識する蛍光色素の種類のみが標識核酸と異なるものであって、結合されている核酸は同一（遺伝子配列は同一）のものを云う。
【００８０】
（工程２−２）工程２−１で得られた各溶出液５０μＬを蛍光測定用の９６穴黒色プレートに入れ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長５９５ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍで蛍光強度を測定し記録した。
【００８１】
（工程２−３）工程２−２で記録したそれぞれの希釈系列の蛍光強度と、それぞれの希釈系列５０μＬの対比用標識ｓｉＲＮＡの含有量との間の関係式を導くために、グラフ上にプロットすることにより標準曲線を作成した。そして、当該含有量における直線性を確認した。対比用標識ｓｉＲＮＡ量と、当該ｓｉＲＮＡ溶液の示す蛍光強度との間に、例えば、以下の式（７）の相関関数があるという知見を得た。
［対比用標識ｓｉＲＮＡ量］
＝Ｆ×（［対比用標識ｓｉＲＮＡ溶液の示す蛍光強度］＾Ｇ） ・・・式（７）
なお、Ｆ、Ｇは前記のグラフソフトを用いて算出した。
【００８２】
＜標準曲線（未知のサンプル用）の作成実験＞
（工程３−１）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）４８８によって標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（以降、「標識ｓｉＲＮＡ」とも称する）の原液をＲＮＡ分解酵素フリーの純水で希釈した。そして、それぞれ１．５ｍＬ容のマイクロチューブ（エッペンドルフ製）内で、０ｎｇ（純水のみ）、１０．８ｎｇ、３２．４ｎｇ、９７．２ｎｇ、２９１．６ｎｇ、８７４．８ｎｇの標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの希釈系列を作製した。
【００８３】
（工程３−２）工程３−１で得られた各溶出液５０μＬを蛍光測定用の９６穴黒色プレートに入れ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１
８ｎｍで蛍光強度を測定し記録した。
【００８４】
（工程３−３）工程３−２で記録したそれぞれの希釈系列の蛍光強度と、それぞれの希釈系列５０μＬの標識ｓｉＲＮＡの含有量との間の関係式を導くために、グラフ上にプロットすることにより標準曲線を作成した。そして、当該含有量における直線性を確認した。標識ｓｉＲＮＡ量と、当該ｓｉＲＮＡ溶液の示す蛍光強度との間に、例えば、以下の式（８）の相関関数があることを確認した。
［標識ｓｉＲＮＡ量］＝Ｈ×（［標識ｓｉＲＮＡ溶液の示す蛍光強度］＾Ｉ）
・・・式（８）
なお、Ｈ、Ｉは前記のグラフソフトを用いて算出した。
【００８５】
＜マウスモデルの各臓器に分布したｓｉＲＮＡの抽出実験＞
（工程２ａ−１）陽性荷電ポリマーＰｏｌｙＭａｇ（８．３μＬ）と、陰性荷電をもつ標識ｓｉＲＮＡを室温で混合し、５分間放置した。静電結合により得られたＰｏｌｙＭａｇ／標識ｓｉＲＮＡ複合体の全量を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に投与した。
【００８６】
（工程２ｂ−１）投与０．５時間後に、動物を屠殺し、肝臓を摘出した。そして、肝臓の重量を測定した（重量Ａ'（ｍｇ））。その後、ＱＩＡｚｏｌ組織溶解液を肝臓２５ｍｇあたり０．７ｍＬ加えた重量を測定後（重量Ｂ'（ｍｇ））、ホモジナイザーを用いて物理的に破砕して懸濁液を作製した。
【００８７】
（工程２ｂ−２）１．５ｍＬ容のマイクロチューブ内に入れた当該懸濁液０．７ｍＬの重量を測定（重量Ｃ'（ｍｇ））した。次いで、ＲＮＡ分解酵素フリーの純水で希釈した、既知量として、例えば、２９１．６ｎｇの対比用標識ｓｉＲＮＡを含む５０μＬの溶液を添加して攪拌した。さらに、クロロホルム０．１４ｍＬをチューブ内に添加後、激しく攪拌し、５分間室温に放置した。引き続き、冷却遠心機にて摂氏４℃・１２０００Ｇにて遠心分離を行った。遠心分離後、静かに最上層を０．３ｍＬ採取し、これを新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れた。
【００８８】
（工程２ｂ−３）工程２ｂ−２で得られたサンプルのうち、０．３ｍＬを新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブに入れ、さらに、エタノール０．４５ｍＬを添加した。
【００８９】
（工程２ｂ−４）得られた混合液全容を、２ｍＬ容のマイクロチューブにセットしたスピンカラム内に入れ、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、当該カラムにｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを吸着させた。
【００９０】
（工程２ｂ−５）ｓｉＲＮＡの吸着した当該カラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい２ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００９１】
（工程２ｂ−６）当該カラムに、プレ洗浄液ＲＷＴ緩衝液０．７ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて１５秒間遠心分離することにより、カラムをプレ洗浄した（１回目洗浄）。
【００９２】
（工程２ｂ−７）工程２ｂ−６で洗浄したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該ｍｉＲＮｅａｓｙカラムに新しい２ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００９３】
（工程２ｂ−８）当該カラムに、洗浄液ＲＰＥ緩衝液０．５ｍＬを加え、室温・８０００Ｇにて２分間遠心分離することにより、カラムを洗浄した（２回目洗浄）。
【００９４】
（工程２ｂ−９）工程２ｂ−８の工程で洗浄したカラムをマイクロチューブから外し、マイクロチューブ内に排出された廃液とともに当該マイクロチューブを廃棄し、当該カラムに新しい１．５ｍＬ容のマイクロチューブをセットした。
【００９５】
（工程２ｂ−１０）当該カラムに６０μＬのＲＮＡ分解酵素フリーの純水を入れ、室温・８０００Ｇにて１分間遠心分離することにより、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡの吸着したカラムから、ｓｉＲＮＡを含むトータルＲＮＡを溶出した。
【００９６】
（工程２ｃ−１）工程２ｂ−１０で得られた各溶出液５０μＬを９６穴黒色プレートに入れ、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、１サンプルに対し、励起波長５９５ｎｍ／蛍光波長６７０ｎｍ及び励起波長４９５ｎｍ／蛍光波長５１８ｎｍの２種類の蛍光強度を測定し記録した。
【００９７】
（工程２ｄ−１）工程２ｃ−１で記録した励起波長５９５ｎｍ／蛍光波長６７０ｎｍの蛍光強度を工程２−３で求めた式（７）に入れ、カラムから溶出された対比用標識核酸（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｏ（登録商標）６４７によって標識されたｓｉＲＮＡＡｌｌ Ｓｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）量：Ｄ'（ｎｇ）を求めた。
【００９８】
また、工程３−３で加えた対比用標識核酸量は、例えば２９１．６ｎｇであったため、サンプル処理前に存在するｓｉＲＮＡ総量は、一連のサンプル処理により一部損失していることが以下の式（９）より求められた。
［最終的なｓｉＲＮＡ回収率：Ｅ'］＝Ｄ'（ｎｇ）／２９１．６（ｎｇ）・・式（９）
実験では、回収率は２３．２％と計算された。
【００９９】
＜臓器に分布したｓｉＲＮＡ重量の計算＞
工程３−３による破砕及び懸濁処理後の０．７ｍＬのサンプル重量はＣ'（ｍ
ｇ）、工程３−２による各臓器重量と、各臓器に加えた組織溶解液の重量の和はＢ'
（ｍｇ）である。Ｂ'（ｍｇ）は、臓器２５ｍｇあたりに組織溶解液を０．７ｍＬ加えているので、上記式（５）と同様にして求めることができる。さらに、工程３−３で算出した式（８）、及び工程２ｄ−１で求めた上記式（９）より、臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量は下記の式（１０）により算出される。
［各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量］
＝［抽出・精製前の標識ｓｉＲＮＡ量］×［Ｂ'(mg)／Ｃ'(mg)］／Ｅ'
・・・式（１０）
実験では、当該ｓｉＲＮＡ量は２１８３ｎｇと計算された。
【０１００】
＜臓器に分布した単位重量あたりのｓｉＲＮＡ重量比の計算＞
工程３−２において、各臓器の重量はＡ'（ｍｇ）であったので、各臓器に分布した臓器単位重量（例えば、臓器１ｍｇ）あたりのｓｉＲＮＡ重量比は、下記の式（１１）により算出される。
［各臓器に分布した臓器単位重量あたりのｓｉＲＮＡ重量比］
＝［各臓器に集積（分布）した標識ｓｉＲＮＡ量］／Ａ'（ｍｇ）・・・式（１１）
実験では、当該ｓｉＲＮＡ量は１．９８０×０−６と計算された。
実施例２により求めた式（９）、式（１０）、式（１１）により得た実験値は、実施例１と概ね近似した数値であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明によれば、生体内に分布した核酸、若しくは細胞に取り込まれた核酸の簡便な精密定量法を提供することができる。核酸のうち、特に、低分子量である核酸の定量も簡便かつ安全に行うことができるので、新規核酸医薬として期待されているｓｉＲＮＡにおける最重要課題である患部への運搬法を開発する上で非常に有用な手段となる。そのため、ｓｉＲＮＡの各種送達法の開発、及び様々な疾患治療に対応する新規ｓｉＲＮＡの開発に利用可能である。
【符号の説明】
【０１０２】
１、２、４、５ マイクロチューブ
３ カラム
１０ サンプル
１１ 最上層
１２ 中間層
１３ 下層
２０ サンプル
３０ トータルＲＮＡ溶液
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する工程（ａ）と、
前記生物の体内に分布した、若しくは前記細胞に取り込まれた前記標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出して精製する工程（ｂ）と、
前記工程（ｂ）により得た精製物の蛍光強度を測定する工程（ｃ）と、
前記工程（ｃ）の測定値に対し、前記工程（ｂ）中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う工程（ｄ）と
を備える核酸の定量法。
【請求項２】
前記核酸は、塩基が１０以上、１００以下の低分子の核酸であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の定量法。
【請求項３】
前記核酸は、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸の定量法。
【請求項４】
前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該各サンプルに対して前記工程（ｂ）の抽出前、及び精製後それぞれにおいて、前記工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定して前記抽出及び精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項５】
前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該各サンプルに対して前記工程（ｂ）の前記抽出及び精製後において、前記工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定し、前記抽出及び精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項６】
前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該サンプルに対して前記工程（ｂ）の精製を実施する前後それぞれにおいて、前記工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定して前記精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項７】
前記損失量は、
前記標識核酸に対して、結合している蛍光色素のみが異なる既知量の対比用標識核酸の希釈系列のサンプルを複数用意し、
前記工程（ｂ）の抽出前に前記サンプルを所定量加え、
前記抽出を実施する前と、前記精製を実施した後それぞれにおいて、前記対比用標識核酸の蛍光強度を前記工程（ｃ）と同様に測定して、当該対比用標識核酸の前記抽出及び精製によるロス量を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項８】
前記損失量は、
前記標識核酸に対して、結合している蛍光色素のみが異なる既知量の対比用標識核酸の希釈系列のサンプルを複数用意し、
前記工程（ｂ）の精製前に前記サンプルを所定量加え、
前記精製を実施する前後それぞれにおいて、前記対比用標識核酸の蛍光強度を前記工程（ｃ）と同様に測定して、当該対比用標識核酸の前記精製によるロス量を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項９】
蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与して生物の体内に分布した、若しくは細胞の培養液に添加して取り込まれた前記標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に取り出したものを抽出して精製するサンプル調製手段と、
前記サンプル調製手段により得た精製物の蛍光強度を測定する測定手段と、
前記測定手段により得た測定値に対し、前記サンプル調製手段中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う手段と
を備える核酸の定量装置。
【請求項１】
蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与、若しくは細胞の培養液に添加する工程（ａ）と、
前記生物の体内に分布した、若しくは前記細胞に取り込まれた前記標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に抽出して精製する工程（ｂ）と、
前記工程（ｂ）により得た精製物の蛍光強度を測定する工程（ｃ）と、
前記工程（ｃ）の測定値に対し、前記工程（ｂ）中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う工程（ｄ）と
を備える核酸の定量法。
【請求項２】
前記核酸は、塩基が１０以上、１００以下の低分子の核酸であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の定量法。
【請求項３】
前記核酸は、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸の定量法。
【請求項４】
前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該各サンプルに対して前記工程（ｂ）の抽出前、及び精製後それぞれにおいて、前記工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定して前記抽出及び精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項５】
前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該各サンプルに対して前記工程（ｂ）の前記抽出及び精製後において、前記工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定し、前記抽出及び精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項６】
前記損失量は、
前記標識核酸の既知量の希釈系列のサンプルを複数用意し、当該サンプルに対して前記工程（ｂ）の精製を実施する前後それぞれにおいて、前記工程（ｃ）と同様に蛍光強度を測定して前記精製によるロス分を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項７】
前記損失量は、
前記標識核酸に対して、結合している蛍光色素のみが異なる既知量の対比用標識核酸の希釈系列のサンプルを複数用意し、
前記工程（ｂ）の抽出前に前記サンプルを所定量加え、
前記抽出を実施する前と、前記精製を実施した後それぞれにおいて、前記対比用標識核酸の蛍光強度を前記工程（ｃ）と同様に測定して、当該対比用標識核酸の前記抽出及び精製によるロス量を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項８】
前記損失量は、
前記標識核酸に対して、結合している蛍光色素のみが異なる既知量の対比用標識核酸の希釈系列のサンプルを複数用意し、
前記工程（ｂ）の精製前に前記サンプルを所定量加え、
前記精製を実施する前後それぞれにおいて、前記対比用標識核酸の蛍光強度を前記工程（ｃ）と同様に測定して、当該対比用標識核酸の前記精製によるロス量を考慮した標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて導出することを特徴とする１〜３のいずれか１項に記載の核酸の定量法。
【請求項９】
蛍光色素を予め結合させた標識核酸を生物に投与して生物の体内に分布した、若しくは細胞の培養液に添加して取り込まれた前記標識核酸を、生物由来の核酸、若しくは細胞由来の核酸と同時に取り出したものを抽出して精製するサンプル調製手段と、
前記サンプル調製手段により得た精製物の蛍光強度を測定する測定手段と、
前記測定手段により得た測定値に対し、前記サンプル調製手段中の前記標識核酸の損失量を考慮して、前記標識核酸の定量を行う手段と
を備える核酸の定量装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２２７００３（Ｐ２０１０−２２７００３Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７７９１３（Ｐ２００９−７７９１３）
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（５０１０８３６４３）学校法人慈恵大学 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２７日（２００９．３．２７）
【出願人】（５０１０８３６４３）学校法人慈恵大学 (20)
【Ｆターム（参考）】
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