核酸検出用キット
【課題】簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる核酸検出用キットを提供する。
【解決手段】下記式（１）等で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含む核酸検出用キットである。
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【解決手段】下記式（１）等で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含む核酸検出用キットである。
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
何らかの標識が施されたＲＮＡプローブなどの核酸プローブを用い、細胞レベルにおけるＤＮＡやＲＮＡの発現パターンを検出、可視化することによって、生命現象に関する数多くの疑問点を解明することが可能となる。細胞レベルでの遺伝子発現パターンを可視化するこのような手法をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＩＳＨ）と言うが、この際に使用されるプローブの標識法は大別して、「放射性同位体標識法」、「蛍光抗体標識法」、「酵素抗体標識法」に分類される。歴史的には、放射性同位体を取り込ませた核酸プローブが先に確立したが、近年その取り扱いが制限されてきたこともあって、放射性同位体元素を用いない蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法が注目されている。
【０００３】
これらの手法は、核酸プローブ作製時に抗原やビオチンでラベル化しておき、それらを標的核酸にハイブリダイズした後、酵素もしくは蛍光物質によって標識された抗体やアビジンを用いて免疫染色法により検出するといった手法である。感度という観点から見ると、酵素反応によるシグナル増幅効果が得られる酵素抗体標識法が優れており、現在最も広く使用されている。
【０００４】
酵素抗体標識法を利用した核酸プローブとしては、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの抗体認識部位で修飾したヌクレオチド誘導体を複数個ランダムに導入した抗原マルチラベル化核酸プローブが知られている。この抗原マルチラベル化核酸プローブと標的核酸とのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの後、抗体認識部位を認識する酵素標識化抗体との抗原−抗体反応を行い、酵素アルカリホスファターゼとのハイブリッドによる発色反応を利用して検出を行う。しかしながら、酵素標識された抗体が非常に高価であること、抗原−抗体反応に伴う操作の煩雑化や非特異吸着などによるバックグラウンドの増加など、幾つかの問題を有している。
【０００５】
一方、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有するペプチドまたはタンパク質へ、アニオン性であり、かつＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する外来分子を部位特異的に連結する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−５４６５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる核酸検出用キットである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含む核酸検出用キットである。
【化１】
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化２】
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化３】
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化４】
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【０００９】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記式（１）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が、下記式（５）で示される化合物であることが好ましい。
【化５】
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であり、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【００１０】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることが好ましい。
【００１１】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基は、ＦＹＰＬＱＭＲ、ＹＰＬＱＭＲ、ＰＬＱＭＲ、ＦＹＰＬＱＭＧ、ＹＰＬＱＭＧ、ＹＰＬＱＭ、ＰＬＱＭＧ、ＦＹＰＬＱＧ、ＹＰＬＱＧまたはＰＬＱＧのアミノ酸配列中に存在することが好ましい。
【００１２】
また、前記核酸検出用キットにおいて、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を含むことが好ましい。
【００１３】
また、前記核酸検出用キットにおいて、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含むことが好ましい。
【００１４】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記リシン（Ｌｙｓ）残基が、ＭＴＧに認識されるアミノ酸配列中に存在することが好ましい。
【００１５】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることが好ましい。
【００１６】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることが好ましい。
【００１７】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つ、前記Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる核酸検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態に係る核酸検出用キットにおける酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸の構造の一例（Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ）を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る核酸検出用キットにおける酵素マルチラベル化核酸プローブの調製方法を示す概略図である。
【図３】本発明の実施形態に係る核酸検出用キットにおける標的核酸の検出方法の一例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施形態に係る核酸検出用キットにおける酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸の一例であるＺ−ＱＧ−ＵＴＰの合成方法の一例を示す図である。
【図５】本発明の実施例１において、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表１のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例１において合成したＺ−ＱＧ−ＵＴＰのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例１において合成したＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例１において、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表２のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例１において、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの逆相ＨＰＬＣ（表２のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図１０】（ａ）本発明の実施例１における核酸検出用キットを用いたドットブロットの結果を示す図である。（ｂ）本発明の比較例１におけるドットブロットの結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例２における核酸検出用キットを用いたドットブロットの結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例３における核酸検出用キットによるマルチラベル化核酸プローブの精製品および未精製品を用いたドットブロットの結果を示す図である。
【図１３】本発明の実施例４において、Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表６のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図１４】本発明の実施例４において、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの逆相ＨＰＬＣ（表６のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図１５】本発明の実施例４において合成したＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１６】本発明の実施例４において合成したＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰを用いてＤＮＡを調製した際のアガロースゲル電気泳動装置にて電気泳動を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
本発明の実施の形態に係る核酸検出用キットは、下記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含む。式（１），（２），（３）または（４）において、Ａ、Ａ１またはＡ２は、リシン（Ｌｙｓ）残基またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基以外のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【化６】
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化７】
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化８】
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化９】
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００２２】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を含んでもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含んでもよい。さらに、本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸においてＢが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つを含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含んでもよい。
【００２３】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含む酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸含有溶液を含むものであってもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むトランスグルタミナーゼ含有溶液を含んでもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含む標識化合物含有溶液を含んでもよい。さらに、本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸においてＢが水素原子の場合には、ｄＡＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＡＴＰ含有溶液、ｄＣＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＣＴＰ含有溶液、ｄＧＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＧＴＰ含有溶液、ｄＴＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＴＴＰ含有溶液のうち少なくとも１つを含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＡＴＰ含有溶液、ＣＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＣＴＰ含有溶液、ＧＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＧＴＰ含有溶液、ＵＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＵＴＰ含有溶液のうち少なくとも１つを含んでもよい。
【００２４】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸と、Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つと、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むヌクレオシド三リン酸含有溶液を含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つと、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むヌクレオシド三リン酸含有溶液を含むものであってもよい。
【００２５】
本発明者らは、核酸プローブに複数の酵素を共有結合的に導入する手法として、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）などのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が有する部位特異的なタンパク質修飾能に着目した。ＴＧａｓｅはアシル転移反応を触媒する酵素であり、例えば、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、Ｌｙｓ残基（Ｋ）のε−アミノ基や各種一級アミンとの共有結合を触媒する酵素である。このＴＧａｓｅを用いて、複数の標識酵素などの標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブの創製を行うことができる。
【００２６】
具体的には、例えば、図１に示す、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）に、ＴＧａｓｅが認識するＧｌｎ（ＭＴＧ認識Ｇｌｎ）を有するＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体であるＺ−ＱＧ−ＵＴＰを、図２に示すように、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所導入されたＺ−ＱＧ ＲＮＡを調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させることによって、ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる。
【００２７】
このマルチラベル化核酸プローブは、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、直ちに検出反応を行うことができるため、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。
【００２８】
なお、図２において、核酸プローブにおけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが複数箇所導入された核酸プローブを調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製してもよい。
【００２９】
また、図３に示すように、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡなどの核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させてもよい。ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）となり、このように導入した標識部分の検出反応を行うことにより、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。
【００３０】
なお、図３において、核酸プローブにおけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を合成し、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが複数箇所導入された核酸プローブを調製する。その後、核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させてもよい。
【００３１】
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いて、ＱＧ基を導入した核酸とＮ末端にＫ残基等を有する酵素を、ＭＴＧを用いて結合させることにより、容易に酵素標識核酸を得ることができる。また、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方に標識することができる。酵素標識した核酸プローブは、フィルターハイブリダイゼーションやＩＳＨなどの核酸検出アッセイに用いることができる。
【００３２】
＜酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸＞
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれる酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する上記式（１），（２），（３）または（４）で示されるヌクレオシド三リン酸である。上記式（１），（２），（３）または（４）で示されるヌクレオシド三リン酸は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）誘導体、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）誘導体、グアノシン三リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴＰ）誘導体、シチジン三リン酸（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＣＴＰ）誘導体、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）誘導体、デオキシアデノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＡＴＰ）誘導体、デオキシグアノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＧＴＰ）誘導体、デオキシシチジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＣＴＰ）誘導体である。本実施形態に係る酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸において、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンは、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
【００３３】
これらの酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはそれらの各種誘導体から得ることができる。
【００３４】
また、これらの酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ウリジン、ウリジンの一リン酸（ＵＭＰ）および二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン、アデノシンの一リン酸（ＡＭＰ）および二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン、グアノシンの一リン酸（ＧＭＰ）および二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン、シチジンの一リン酸（ＣＭＰ）および二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンの一リン酸（ｄＵＭＰ）および二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシアデノシン、デオキシアデノシンの一リン酸（ｄＡＭＰ）および二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン、デオキシグアノシンの一リン酸（ｄＧＭＰ）および二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンの一リン酸（ｄＣＭＰ）および二リン酸（ｄＣＤＰ）ならびにそれらの各種誘導体から得てもよい。
【００３５】
例えば、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのリン酸化酵素などによるリン酸化（例えば、生物工学会誌，８５（９），ｐ３９７−３９９（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７（６），ｐ．７３２−７３８（１９９９）など参照）や、プロトンスポンジ存在下でのオキシ塩化リンなどによるリン酸化（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（３６），ｐ．４５２５−４５２８（１９８８）など参照）などによって、それらの三リン酸体を得ることができる。
【００３６】
上記式（１）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、下記式（５）で示される、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有するＴＧａｓｅ基質修飾ヌクレオチド三リン酸であることが好ましい。
【化１０】
【００３７】
式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基などの炭素数２〜４８のアルケニレン基などが挙げられる。これらのうち、Ｘ，Ｙは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基、炭素数１〜４８のアルコキシ基であることが好ましく、Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であることがより好ましい。Ｘ，Ｙはさらにエテニレン基、オキシアルキレン基、例えば−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ｎは繰り返し数でありｎ＝２，４，８，１２，２４）基などで置換されていてもよい。
【００３８】
Ｚで表される置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などの炭素数１〜４８のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基などの炭素数１〜４８のアルコキシ基、フェニル基、ナフチル基などの炭素数６〜４８のアリール基、フェニルオキシ基などの炭素数６〜４８のアリールオキシ基、ベンジル基などの炭素数７〜４８のアリールアルキル基、ベンジルオキシ基などの炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基などが挙げられる。これらのうち、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることが好ましく、Ｚはベンジルオキシ基であることがより好ましい。Ｚはさらにジニトロフェニル基、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル基などで置換されていてもよい。また、上述したＹで表される置換との組み合わせで、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。
【００３９】
Ｘを適宜選択することにより、Ｚ−ＱＧとＵＴＰとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、酵素などのアクセスを向上することができる。また、Ｙ，Ｚを適宜選択することにより、基質ペプチド配列を最適化し、例えば酵素などの親和性を向上することができる。
【００４０】
微生物由来ＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）を用いる場合、ＭＴＧが認識可能なＧｌｎ残基は、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）として存在することが好ましい。Ｚ−ＱＧは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などよりも分子サイズが小さいため好ましい。式（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸において、Ｂがヒドロキシル基、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基であるヌクレオチド誘導体が、ＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰである。Ｂが水素原子、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基であるヌクレオチド誘導体が、ｄＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰである。また、酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸中には、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基または第一級アミンが共存しないようなものを選択することが好ましい。共存する場合には、ＴＧａｓｅにより、自己架橋する可能性があり、目的のマルチラベル化核酸プローブの収率に好ましくない影響を与える場合があるからである。
【００４１】
また、微生物由来ＴＧａｓｅの良基質として、ＬＬＱＧ（配列番号：１）、ＬＡＱＧ（配列番号：２）、ＬＧＱＧ（配列番号：３）、ＰＬＡＱＳＨ（配列番号：４）、ＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号：５）、もしくはＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＬＧＱＧＧＧ（配列番号：７）、ＧＦＧＱＧＧＧ（配列番号：８）、ＧＶＧＱＧＧＧ（配列番号：９）、もしくはＧＧＬＱＧＧＧ（配列番号：１０）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｌｉｖｅｒ由来のＴＧａｓｅの良基質として、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルフェニルアラニン（Ｚ−ＱＦ）、またはＥＡＱＱＩＶＭ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＧＧＱＬＧＧ（配列番号：１２）、ＧＧＧＱＶＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＱＲＧＧ（配列番号：１４）、ＧＱＱＱＬＧ（配列番号：１５）、ＰＮＰＱＬＰＦ（配列番号：１６）もしくはＰＫＰＱＱＦＭ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、用いるＴＧａｓｅの種類に応じ、このようなペプチドとして存在してもよい。
【００４２】
また、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、ＦＹＰＬＱＭＲ（配列番号：２７）、ＹＰＬＱＭＲ（配列番号：２８）、ＰＬＱＭＲ（配列番号：２９）、ＦＹＰＬＱＭＧ（配列番号：３０）、ＹＰＬＱＭＧ（配列番号：３１）、ＹＰＬＱＭ（配列番号：３２）、ＰＬＱＭＧ（配列番号：３３）、ＦＹＰＬＱＧ（配列番号：３４）、ＹＰＬＱＧ（配列番号：３５）またはＰＬＱＧ（配列番号：３６）のアミノ酸配列からなるペプチドとして存在してもよい。これにより、ＴＧａｓｅによる架橋反応の反応性が高くなる。
【００４３】
なお、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドは、Ｎ末端アミノ基がＴＧａｓｅの基質になりうるため、自己架橋による副産物が生じうる。したがって、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドについては、Ｎ末端アミノ基の水素を適切な基で置換することによりＴＧａｓｅの基質とはならないように保護して、所望の連結を行うことができるようにするとよい。なお、本明細書において「Ｎ末端保護」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。そして、Ｎ末端保護の手段により、反応性が異なることが知られている。詳細には、ほ乳類由来ＴＧａｓｅに関して、ＧＱＱＱＬＧのＮ末端アセチル化による保護（すなわち、Ａｃ−ＧＱＱＱＬＧ）、またＮ末端アミノ酸をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）にする（すなわち、ＤＯＰＡ−ＧＱＱＱＬＧ）と反応性が向上することが知られている。このような保護の例を、本実施形態においても利用することができる。
【００４４】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの調製方法を図４に示す。これは、本実施形態に係る酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸の調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。
【００４５】
まず、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておく（ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ）。そして、アミノアリルＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するＵＴＰと、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧとを縮合することにより、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを得ることができる。
【００４６】
また、Ｃ末端のカルボキシル基を活性エステル化する上述の方法に加えて、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するペプチドをＵＴＰに導入する方法として、アミノ基と反応性の高い官能基をペプチドに導入する方法がある。例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドを調製できれば、これをアミノ化ＵＴＰと反応させることにより、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するＵＴＰを調製することができる。ただし、これらの反応性官能基は、基質ペプチドにおいてＴＧａｓｅ認識に影響がない部分に導入する必要がある。したがって、上述のように、Ｇｌｎ残基とは離れたＣ末端のカルボキシル基を活性化する方法は、この目的において最も優れたものの一つである。
【００４７】
また、例えば、ＰＬＱＭＲのアミノ酸配列からなるペプチドをｄＵＴＰに導入したＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰは、例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておき、アミノアリルｄＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するｄＵＴＰと縮合することによって、得ることができる。
【００４８】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等の精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）などにより行うことができる。また、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等の同定は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲなどにより行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。
【００４９】
＜ＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸＞
本実施形態に係る核酸検出キットを用いて調製することができるＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸は、構成単位として、上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されているＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
【００５０】
核酸には、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸の配列および長さには特に制限はない。長さに関しては、例えば少なくとも２０ｍｅｒ程度であればよい。
【００５１】
例えば、本実施形態に係る核酸検出キットに含まれるＺ−ＱＧ−ＵＴＰを基質として、ＲＮＡポリメラーゼ活性のある酵素を用いて複数のＺ−ＱＧ−ＵＴＰを取り込ませて、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入され、所望の配列を有するＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡ（図２）を調製することができる。
【００５２】
＜マルチラベル化核酸プローブ＞
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位である酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸のグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有し標識部分を含む標識化合物を結合して構成することができる。マルチラベル化核酸プローブは、例えば、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入された核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡに、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などを結合させることによって、ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる（図２）。
【００５３】
ＲＮＡと標識酵素などの標識部分との比率ｎは、２以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができるが、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、標的核酸とのハイブリダイゼーションの効率が低下する場合がある。
【００５４】
また、例えば、以下の方法により、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のマルチラベル化核酸プローブを調製することができる。
（１）ＴＧａｓｅの由来を変える。
（２）ＴＧａｓｅの基質特異性を変える。
【００５５】
（１）の方法では、例えば、用いるＴＧａｓｅの種類に応じて、異なる基質ペプチドで修飾されたＵＴＰなどを調製すればよい。
【００５６】
（２）の方法では、例えば、ＴＧａｓｅに、タンパク質工学的にアミノ酸変異を導入して基質特異性を変えればよい。例えば、ＭＴＧを大腸菌で調製し（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋ． Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ Ｃ． Ｈｅｒｔｅｌ ａｎｄ Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４０，Ｉｓｓｕｅ ６，２ Ｍａｙ ２００７，ｐ．１５４３−１５５０，”Ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”参照）、さらに変異体ライブラリーを作って耐熱性の向上したＭＴＧを取得することができる（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋ． Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ Ｃ． Ｈｅｒｔｅｌ ａｎｄ Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １３６，Ｉｓｓｕｅｓ ３−４，１０ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８，ｐ．１５６−１６２，”Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｈｅａｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔｓ”参照）。
【００５７】
本明細書において、「ＴＧａｓｅにより結合する」というときは、特別な場合を除き、得られる連結部は、Ｌｙｓ残基とＧｌｎ残基とが、ε（γ−グルタミル）リシン結合を形成することにより構成されている。
【００５８】
本実施形態においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基は、第一級アミンであってもよい。本明細書では、Ｌｙｓ残基を例に説明するが、その説明は、特別な場合を除き、第一級アミンにも当てはまる。
【００５９】
リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物としては、特に制限はない。
【００６０】
標識部分としては、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、熱的に検出可能な標識（例えば、温度応答性高分子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）などが挙げられ、検出感度、取り扱い性などの点から、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つが好ましい。
【００６１】
蛍光色素としては、選択された波長の紫外光、可視光などの放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体などが挙げられる。
【００６２】
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。
【００６３】
ＴＧａｓｅに対し、Ｌｙｓ残基（または第一級アミン）供与体となる基質は、Ｇｌｎ残基供与体となる基質に比較して構造的な制約が少ないと考えられる。したがって、修飾しようとする標識酵素が、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を元来有している場合もあり、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むタグを酵素に付加する場合もある。
【００６４】
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基（Ｋ）は、ＭＫＨＫＧＳ（配列番号：１８）、ＭＲＨＫＧＳ（配列番号：２４）、ＭＲＲＫＧＳ（配列番号：２５）、ＭＨＲＫＧＳ（配列番号：２６）のアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドによるタグ化は、標識酵素を、タンパク質の所望の部位、例えばＣ末端またはＮ末端に連結する目的で用いることができる。ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含む他のペプチドまたはそのアミノ酸配列の例としては、改変型Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＲＦＥＲＡＨＭＤＳＧＳ（配列番号：１９））、ＭＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号：２０）、Ｎ末端グリシン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＧＧＧ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＧＧＧＧＧ（配列番号：２１））、Ｎ末端ＭＫＨＫＧＳと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号：２２）などが挙げられる。
【００６５】
Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加した標識酵素は、遺伝子工学的な手法を用いて、組換えタンパク質として調製することができる。Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅの基質ペプチドタグが導入された当該組換えタンパク質の精製は、それぞれＮ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し（ＴＧａｓｅの反応性の低下を回避するために、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端に精製用ペプチドタグを入れるようにデザインするとよい。）、ゲル濾過クロマトグラフィなどにより行うことができ、またアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認するか、Ｎ末端に導入された基質ペプチドについてはＮ末端分析により直接同定することができる。タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで行うことができる。
【００６６】
標識酵素としては、発色反応、化学発光などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ならびにＰ４５０およびそれらの変異体などが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。
【００６７】
酵素マルチラベル化核酸プローブと標的核酸の間でより厳密に塩基配列特異的な二本鎖形成を行うためには、比較的高温（例えば、７０℃以上）の条件下で行うことがあるため、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。そこで、標的酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）が好ましい。
【００６８】
超好熱菌由来の酵素は、一般的に有機溶媒や熱に対して高い安定性を示すことが知られているため好ましく（例えば、Ｈ．Ａｔｏｍｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，ｐ．１６６−１７３（２００５）参照）、さらに、大腸菌を宿主とした大量調製が比較的容易に行うことができる点においても好ましい。大腸菌を宿主として耐熱性酵素を調製する場合、細胞破砕液を高温処理（例えば、８０℃で３０分温置）することで、大腸菌由来の共雑タンパク質のほとんどを沈殿させ、粗精製を容易に行うことができる。
【００６９】
超好熱菌は一般の生物がほとんど生育できない極限環境で生育することができる微生物であるため、超好熱菌由来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有している。さらに、熱に対する耐性だけでなく、一般的に、変性剤、有機溶媒、ｐＨなどに対する耐性も常温菌由来酵素に比べて極めて高いことから、ＰｆｕＡＰを使用することによって、酵素の失活を伴わない厳密な二本鎖形成を達成することができると考えられる。
【００７０】
本実施形態に係る酵素マルチラベル化核酸プローブの好ましい態様の一つは、ＰｆｕＡＰとＺ−ＱＧ ＲＮＡとの複合体またはＰｆｕＡＰとＺ−ＱＧ ＤＮＡとの複合体である。このような複合体は、安定な酵素であるＰｆｕＡＰと、安定な分子であるＲＮＡまたはＤＮＡが、アミド結合という安定な共有結合で連結されているため、複合体全体としても安定性であるというメリットがある。
【００７１】
また、酵素マルチラベル化核酸プローブにおいて、酵素が有機溶媒や熱に対して安定な酵素であってもよい。このような安定性の高い酵素は、自然界からのスクリーニング（例えば、化学と工業，ｖｏｌ．６１（Ｎｏ．６），ｐ．５７１−５７５（２００８）、内山拓，宮崎健太郎，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．５），ｐ．２３４−２３９（２００８）、道久則之，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．１２），ｐ．６６７−６７０（２００８））や、タンパク質工学的手法により安定性を高める技術（例えば、荻野博康，ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．１６−２３（２００８）、宮崎健太郎，ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．５２−５８（２００８））により得ることができる。これらの手法により、常温菌由来の酵素であっても、有機溶媒耐性や耐熱性を有する酵素へと変換することができる。
【００７２】
蛍光色素部分を導入した、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識化合物は、例えば、カルボキシル基にジアミンを導入する方法で調製することができる（例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １,Ｓｅｃｔｉｏｎ ４．３，ｐ．１００−１０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．を参照）。
【００７３】
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）としては、種々のものを用いることができる。現在、ＴＧａｓｅとして、哺乳類（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。本実施形態において用いることのできるＴＧａｓｅの好ましい例は、安定性、ハンドリングの容易さ、バルク生産が可能などの点から微生物由来微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）である。
【００７４】
本実施形態においてＭＴＧを用いた場合、予想されているＭＴＧの触媒反応から、Ｌｙｓ残基を有する標識酵素などの標識部分を含む標識化合物とＺ−ＱＧ ＲＮＡとの連結反応は、ＭＴＧ活性中心であるシステイン（Ｃｙｓ）残基の、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡのＧｌｎへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こる標識化合物のＬｙｓによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるＭＴＧの脱離、の２段階で進行すると予想される。
【００７５】
本実施形態の核酸検出用キットにおいては、ＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有するＺ−ＱＧ ＲＮＡに対する、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識化合物のモル濃度比は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。なお、本明細書で単に「濃度比」というときは、特別な場合を除き、モル濃度による比を指す。例えば、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡに対するＮＫ１４−ＰｆｕＡＰのモル濃度比は、[ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ]／[Ｚ−ＱＧ ＲＮＡ]と表すこともできる。
【００７６】
［ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの調製］
ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰとは、ＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳの配列を有するアミノ酸１４残基からなる付加配列を遺伝子工学的にＰｆｕＡＰのＮ末端に、精製用タグをＣ末端に導入したものである。ＰｆｕＡＰの発現ベクターは香川大学櫻庭春彦教授より委譲頂いた。ＰＣＲによりＰｆｕＡＰをコードする領域を増幅する際、それぞれのタグが導入されるようにタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００７７】
また、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの大腸菌での発現量の向上のため、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて塩基配列が改変されたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの発現ベクター（アクセッション番号：ＡＢ４７９３８３、配列番号：２３）を用いてもよい。この発現ベクターは、Codon Devices社（http://www.codondevices.com）に受託合成して得た。ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰをコードする遺伝子領域の両端に適切な制限酵素サイトを導入しておき、これらを利用することでタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、得られたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ発現ベクターにより大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００７８】
ＴＧａｓｅとしてＭＴＧを用いて連結反応を行う場合には、上述のようにモル濃度比が適切な範囲となるようにすることに加えて、ｐＨ５．０〜８．０、温度４〜５０℃（例えば、室温（例えば、１８℃〜２２℃））の条件で行うことが好ましい。このようにすれば、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内に、充分に高い反応率が達成可能である。
【００７９】
このような高い反応率が達成できる方法により得られたマルチラベル化核酸プローブ溶液には、未反応の核酸プローブ（例えば、遊離のＺ−ＱＧ ＲＮＡ）がほとんど存在せず、以下で詳述する、標的核酸の検出にそのまま用いたとしても、マルチラベル化核酸プローブと未反応分子との競合が実質的に生じないか、生じたとしても目的とする検出の結果には実質的な影響を与えないほど少ないと考えられる。したがって、マルチラベル化核酸プローブ溶液を精製することなく、直接検出へと利用できるメリットがある。
【００８０】
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いた酵素マルチラベル化核酸プローブの形成方法は、従来法に比較して、以下の特徴およびメリットを有する。
・対象となる標識酵素は、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する酵素、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を導入することができるあらゆる酵素を包含する。また、インテインのような大きなタンパク質性タグを必要としない。
・酵素の修飾部位は、Ｃ末端に限定されない。ＴＧａｓｅ活性なＬｙｓ残基またはＧｌｎ残基が存在するか、そのようなＬｙｓ残基またはＧｌｎ残基を有するタグを導入することができる部位であれば、修飾可能である。
・Ｃ末端、Ｎ末端に加え、ｌｏｏｐ領域のようなタンパク質構造中の揺らぎの大きな部位も修飾対象となりうる。
・結合する核酸の塩基配列および長さには、特に制限がない。
【００８１】
＜標的核酸の検出方法＞
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いた標的核酸の検出方法は、構成単位として例えば上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを調製し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、酵素部分などの標識部分により検出する工程を含む。
【００８２】
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、標的核酸の定性、定量、識別、染色、局在化の調査などの目的で用いることができる。
【００８３】
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。酵素部分などの標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。
【００８４】
検出対象が（ｉ）の場合、標的核酸は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡまたはゲノム断片ＤＮＡなどであり、（ｉｉ）の場合、標的核酸は、細胞または個体組織中に含まれる核酸（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）などである。本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸検出用キットを用いて得たマルチラベル化核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（酵素など）を配置しているため、検出感度の向上が可能になる。
【００８５】
この方法においては、標的核酸に、マルチラベル化核酸プローブを供し、標的核酸とマルチラベル化核酸プローブの標的核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせるが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。
【００８６】
本実施形態に係る標的核酸の検出方法において、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のマルチラベル化核酸プローブを準備して、同時に複数の標的核酸を検出してもよい。
【００８７】
また、本実施形態において、標的核酸の検出方法は、
（ａ）基材表面に固定化された核酸、
（ｂ）固定化された固定化核酸の全部または一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、および標的核酸に特異的に結合可能な配列（標的核酸特異的配列）を有するアプタマ核酸、
（ｃ）構成単位として上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、及び／又は核酸部分がアプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブ、
を調製し、
（Ａ）固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化し、
（Ｂ）固定化された固定化アプタマ核酸に、標的核酸を含む標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的核酸とアプタマ核酸の標的核酸分子特異的配列を有する部分とを結合させ、かつ上記マルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせることにより、タンパク質を固定化し、
（Ｃ）固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出する工程を含む。
【００８８】
この方法における基材表面への核酸の固定化のためには、従来技術、例えばＤＮＡマイクロアレイなどを調製する際に用いられる技術を適用することができる。「基材」は、ガラス、シリコンなどのプラスチック製の、チップ、ビーズ、ウェル、プレートなどの形態とすることができ、核酸は、従来技術を用いて、基材表面に非共有結合（静電結合）的に、または共有結合で固定することができる。あらかじめ調製した核酸を基材に固定化してもよく、基材上で直接核酸を合成してもよい。簡便には、アビジンなどで被覆された市販のプレートを用い、ビオチン化した所望のＤＮＡを固定することができる。
【００８９】
この方法ではさらに、固定化核酸の全部または一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、および標的分子を含まれる標的核酸に特異性的に結合可能な配列（標的核酸特異的配列）を有する核酸（アプタマ核酸）が用いられる。標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。標的核酸特異的配列を有する部分は、従来技術、例えばＳＥＬＥＸ（試験管内人工進化法）工程を用いることにより産生することができ、また標的分子に対して非常に高い標的親和性及び特異性を有するものとすることができる。標的核酸特異的配列を有する部分は、修飾ヌクレオチドで構成されていてもよい。
【００９０】
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、アプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものとする。酵素部分などの標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。
【００９１】
この方法においては、固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化するが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。
【００９２】
また、この方法においては、次いで固定化アプタマ核酸に、標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的分子とアプタマ核酸の標的核酸特異的配列を有する部分とを結合させ、さらにマルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせる。試料は、細胞もしくは組織抽出液、体液などでありうる。
【００９３】
さらにこの方法においては、固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出することができる。
【００９４】
アプタマ核酸においては、固定化核酸相補的配列を有する部分と、標的核酸特異的配列を有する部分とは、重複してもよく、連続してもよく、また適当なスペーサを介して両者が存在するように設計することができる。標的核酸特異的配列を有する部分（アプタマ領域）が分子認識のためにある立体構造をとることを考慮すると、該部分は、固定化核酸相補的配列を有する部分とは少なくとも重複しないようにするのがよい。
【００９５】
アプタマ核酸は、固定化核酸相補的配列および標的核酸特異的配列以外に、所望の場合にはマルチラベル化核酸プローブと適切にハイブリダイズするための配列をさらに含んでいてもよい。マルチラベル化核酸プローブの核酸部分は、アプタマ核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するが、この特異的配列の全部または一部に相補的な配列からなる領域が長い（標的核酸特異的配列と重複が多い）と、かえってアプタマ核酸とはハイブリダイズできない場合が生じうる。また短い（重複が少ない）と、標的分子が存在し、アプタマ核酸と結合している場合にも、マルチラベル化核酸プローブとアプタマ核酸とがハイブリダイズしてしまう場合が生じうる。当業者であれば、このようなことを考慮して、固定化核酸、アプタマ核酸、マルチラベル化核酸プローブの核酸部分を、適宜設計することができる。
【００９６】
また、本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものである、構成単位として、例えば上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンと、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有し標識部分を含む標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基とを反応させて、容易に検出可能な性質を有する複数の標識部分を導入し、結合している核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む（図３参照）。
【００９７】
この方法においては、上記核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。また、標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。
【００９８】
本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（標識部分）を配置することにより、検出感度の向上が可能になる。
【００９９】
例えば、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入された核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡに、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した酵素、蛍光色素などの標識化合物を結合させる。
【０１００】
本実施形態に係る核酸検出用キットの構成の一例は、例えば、下記（１）〜（３）の各セットを含むものである。
（１）ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液、ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液、ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液、ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセット（Ｚ−ＱＧ デオキシリボヌクレオチドセット）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭである。ｄＴＴＰとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰとは適切な比率（例えば、モル比で６：４）で混合されていてもよい。
（２）ＡＴＰと溶媒とを含むＡＴＰ含有溶液、ＣＴＰと溶媒とを含むＣＴＰ含有溶液、ＧＴＰと溶媒とを含むＧＴＰ含有溶液、ＵＴＰと溶媒とを含むＵＴＰ含有溶液、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセット（Ｚ−ＱＧ リボヌクレオチドセット）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭである。ＵＴＰとＺ−ＱＧ−ＵＴＰとは適切な比率（例えば、モル比で６：４）で混合されていてもよい。
（３）標識部分としてＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ等の超好熱菌由来の標識酵素等を含む標識化合物と溶媒とを含む標識化合物含有溶液、ＭＴＧと溶媒とを含むＭＴＧ含有溶液、反応バッファ、コントロール用ＤＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＤＮＡ）、コントロール用ＲＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＲＮＡ）の標識セット。
【０１０１】
本実施形態に係る核酸検出用キットの構成の他の例は、例えば、下記（１）〜（３）の各セットを含むものである。
（１）ｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリング混合物セット（Ｚ−ＱＧ デオキシリボヌクレオチドミックス）。各成分の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭであり、ＰＣＲに用いやすい２ｍＭまたは汎用性が高い１００ｍＭである。
（２）ＡＴＰとＣＴＰとＧＴＰとＵＴＰとＺ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリング混合物セット（Ｚ−ＱＧ リボヌクレオチドミックス）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭであり、ＲＮＡ合成に用いやすい２０ｍＭである。
（３）標識部分としてＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ等の超好熱菌由来の標識酵素等を含む標識化合物とＭＴＧと反応バッファと溶媒とを含む標識化合物／ＭＴＧ含有溶液、コントロール用ＤＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＤＮＡ）、コントロール用ＲＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＲＮＡ）の標識セット。ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰおよびＭＴＧは、反応に適した終濃度の例えば２倍の濃度とし、Ｚ−ＱＧ核酸と例えばモル比で１：１で混合することにより反応させる。
【０１０２】
溶媒としては、例えば、水や、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられる。これらのうち、安定性等の点から水が好ましい。また、水としては、蒸留水、イオン交換水等の純水、超純水等が用いられる。
【０１０３】
本実施形態に係る核酸検出用キットにおける各溶液のｐＨは、例えば、ｐＨ４〜１０の範囲であり、ｐＨ５〜８の範囲が好ましい。ｐＨがこの範囲外の場合は、ＭＴＧによるラベル化効率が低下する場合がある。
【０１０４】
ｐＨ調整剤としては、アルカリ性から酸性の溶液または緩衝溶液等が挙げられる。ｐＨ調整用の溶液または緩衝溶液としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、リン酸、ホウ酸水溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、コハク酸緩衝液、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボン酸緩衝液、モノフタル酸カリウム緩衝液、２−（Ｎ−モルノホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、イミダゾール緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、マロン酸緩衝液、乳酸緩衝液、Ｎ−メチルジエタノールアミン、ヒスチジン緩衝液、ピリジン酢酸緩衝液、酢酸トリエタノールアミン緩衝液、３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（ＭＯＰＳバッファ：３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｕｆｆｅｒ）等が挙げられ、これらを単独または混合物として用いることができる。これらのうち、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液が好ましい。
【０１０５】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、検出感度を向上させるために、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）等の２価の陽イオンを含んでもよく、２価の陽イオンと溶媒とを含む陽イオン含有溶液を含んでもよい。これらのうち、系内で凝集や沈殿が生じにくい等の点からマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）が好ましい。２価の陽イオンは、ＴＧａｓｅによるラベル化反応のときに添加してもよいし、酵素の発色反応等のときに添加してもよい。
【０１０６】
本実施形態に係る核酸検出用キットにおいて、検出感度を向上させるために、核酸プローブと標識化合物との比率が１：２（モル比）以上となるようにすることが好ましい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットにおいて、検出感度を向上させるために、ラベル化反応のときの標識化合物と２価の陽イオンとの比率（モル比）は、１：１〜１：３００の範囲であることが好ましい。また、酵素の発色反応のときの発色液中のマグネシウムイオン等の２価の陽イオンの濃度が、５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲になるようにすることが好ましい。
【０１０７】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、その他に例えば、反応で残存したＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等を除去するカラム、試薬等を含むＺ−ＱＧ精製セット；反応で残存した標識化合物等を除去してマルチラベル化核酸プローブを精製するためのカラム、試薬等を含む標識化合物精製セット；標識核酸に適したブロッキング剤を含む標識核酸用ブロッキング剤セット；標識核酸に適したハイブリダイゼーション溶液を含む標識核酸用ハイブリダイゼーション溶液セット等を含んでもよい。
【０１０８】
マルチラベル化核酸プローブを精製するカラムとしては、ゲルろ過クロマトグラフィ方式のものが好ましい。これによりバックグラウンドが低減される。核酸の精製方法として一般的な手法としては、例えば、フェノール抽出によるタンパク質の除去、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿等のアルコール沈殿、電気泳動後にゲルを切り出してシリカカラム等を用いて精製、限外ろ過膜による精製等が挙げられる。しかし、フェノール抽出やアルコール沈殿はマルチラベル化核酸プローブがタンパク質との複合体を形成しているために困難であり、ＭＴＧ反応液等の中の核酸濃度がｎｇ／ｍＬオーダーと低い場合にはアルコールを用いても沈殿しにくく、シリカ樹脂や限外ろ過膜を用いてもマルチラベル化核酸プローブの回収が困難である。
【０１０９】
ゲルろ過方式の精製において、直鎖状核酸がゲルを素通りし、球状タンパク質がゲル中へ保持されるような条件がよい。すなわち、ゲルろ過方式のカラムとしては、ゲルの孔サイズが直鎖状核酸より小さく、球状タンパク質より大きいこと（例えば、１０−５００．２／ｎｍ程度）が好ましい。また、標識化合物除去のために十分なカラム容量であること（例えば、０．２００−１ｍＬ）が好ましい。カラム容量が小さすぎると、保持できなかった標識化合物が溶出してくる場合があり、カラム容量が大きいときには反応液が希釈されてしまう場合がある。
【０１１０】
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれるＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセットは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ等を用いたＰＣＲ時に、ｄＮＴＰの代わりに用いてＰＣＲ産物にＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸プローブを調製するのに用いられる。また、例えば、Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅにより核酸プローブの３’端を伸長させさる際に、ｄＮＴＰの代わりに用いてＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸プローブを調製するのに用いられる。その他、例えば、核酸修飾酵素などにより通常のｄＮＴＰの代わりに用いてＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸を調製するのに用いられる。
【０１１１】
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれるＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセットは、例えば、ＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロ転写反応を行う際に、ＮＴＰの代わりに用いて、Ｚ−ＱＧ−ＮＴＰが取込まれたＲＮＡを合成するのに用いられる。
【０１１２】
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれる標識セットは、例えば、Ｚ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセット、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセットを用いて調製したＺ−ＱＧ標識核酸に、標識化合物を結合させる際に用いられる。また、Ｚ−ＱＧ標識核酸に標識化合物を結合させることにより、任意の配列を持った核酸を検出するマルチラベル化核酸プローブとして用いることができる。
【実施例】
【０１１３】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１４】
（実施例１）
＜Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成・精製＞
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成スキームは、図４に示す通りである。まず１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は２７．０℃）でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中で２０時間反応させることにより、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した（この段階で５００μＬずつに分注し、−８０℃で保存）。その後、２５ｍＭのＮＨＳ化Ｚ−ＱＧと５ｍＭの５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）とを、１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）とＤＭＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝１／１）０．３２ｍＬ中において２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルを超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製）（高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって精製を行った。ＨＰＬＣの測定条件は表１の通りとした。生成物の同定は、レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置であるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（島津製作所製 ＡＸＩＭＡ（登録商標）−ＣＦＲ Ｐｌｕｓ）によって行った。なお、サンプル調製手順は、まず、試料１μＬをＭＡＬＤＩ用試料プレートの上に滴下し、次にその上から、マトリックス溶液；２，５−ジヒドロキ安息香酸（ＤＨＢ）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液（超純水）を滴下し、その後、風乾して、得られた試料プレートをＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ装置のイオン源内に導入して計測した。
【０１１５】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを合成した後、表１に示す条件で逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図５に示す。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
そこで、保持時間１８．８分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った（図６参照）。その結果、８５６．８９のピークが確認され、理論分子量の８５７．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成が示された。
【０１１８】
＜Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成・精製＞
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中にて、１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は１８〜２２℃程度）で２０時間反応させることによって、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した。一方、５０ｍＭ ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液（Ａｍｂｉｏｎ製）１６μＬと２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）４０μＬ、滅菌水１６μＬとを混合し、１０ｍＭ ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ溶液を８０μＬ調製した。この溶液に対して、上記で調製したＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ溶液を８０μＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。反応終了後、サンプルを超純水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表２に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ）によって行った。結果を図７に示す。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図８に示す。ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合（図９参照）と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１９．１分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、図７に示すように、８４１．４６のピークが確認され、理論分子量の８４２．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成が示された。
【０１２１】
＜ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの調製＞
遺伝子工学的手法により、Ｎ末端にＭＴＧが認識するＫを含んだペプチドタグ（ＭＫＨＫ（ＧＧＧＳ）２ＧＳ）を導入したＮＫ１４−ＰｆｕＡＰを調製した。
【０１２２】
＜各溶液の調製＞
表３（下記（１）），表４（下記（２）），表５（下記（３））に示す組成で、以下の溶液を調製した。
（１）ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液
ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液
ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液
ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液
（２）ＡＴＰと溶媒とを含むＡＴＰ含有溶液
ＣＴＰと溶媒とを含むＣＴＰ含有溶液
ＧＴＰと溶媒とを含むＧＴＰ含有溶液
ＵＴＰと溶媒とを含むＵＴＰ含有溶液
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液
（３）ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰと溶媒とを含むＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ含有溶液
ＭＴＧと溶媒とを含むＭＴＧ含有溶液
反応バッファ
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
＜マルチラベル化核酸プローブの調製＞
まず、マウス由来のＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）をコードする遺伝子中の約３００ｂｐをＰＣＲ増幅するプライマを設計した。次に、ＰＣＲ反応液の全ｄＴＴＰのうちの４０％をＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰに置き換えて反応液を調製してＰＣＲを行うことによって、Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡを得た。Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡに９５℃、５分間の熱変性を施し、Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡ ２５ｎｇ／μＬ、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ ０．２ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＧ ５．０Ｕｎｉｔ／ｍＬの条件で、３７℃で３時間反応を行い、Ｚ−ＱＧ ４０％マルチラベル化核酸プローブを調製した。
【０１２７】
＜メンブランの作製＞
Ｎｙｂｏｎｄ Ｎ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のプロトコールに準じてメンブランを作製した。アプライ前にＤＮＡを９５℃、５分で熱変性した。メンブランを８０℃で２時間ベーキングした。
【０１２８】
＜プレハイブリダイゼーション＞
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随するハイブリダイゼーションバッファを用いて、プレハイブリダイゼーション（５５℃、１時間）を行った。
【０１２９】
＜ハイブリダイゼーション＞
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随するハイブリダイゼーションバッファを用いて、ハイブリダイゼーション（５５℃、Ｏ／Ｎ、プローブ濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を行った。Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒＩでメンブランを洗浄（５５℃、１０分間×２回）した。Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒＩＩでメンブランを洗浄（室温、５分間×２回）した。
【０１３０】
＜検出＞
発光基質をメンブラン上に１ｍＬ滴下し、ハイブリバックにくるんでインキュベート（室温、５分間）した。化学発光装置（化学発光装置（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋)）にセットし、１時間露光した。発光基質として、Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ（商標） Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）添付の発光基質を用いた。結果を図１０（ａ）に示す。
【０１３１】
（比較例１）
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（商標、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随する試薬にて調製したプローブを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。結果を図１０（ｂ）に示す。
【０１３２】
（実施例２）
ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの濃度を変え、検出を行った。結果を図１１に示す。
【０１３３】
Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡ濃度 １０ｎｇ／ｕＬ、ＰｆｕＡＰ濃度 ４ｍｇ／ｍＬ以上（モル比でＺ−ＱＧ：ＰｆｕＡＰ＝１：３０以上）でラベル化したプローブにて、発色法にて０．１ｐｇの検出感度を達成した。
【０１３４】
（実施例３）
実施例１と同様にしてＺ−ＱＧ ４０％マルチラベル化核酸プローブを調製し、反応液を以下の手順で精製し、未精製のもの、１回精製したものについて、実施例１と同様にしてハイブリダイゼーション、検出を行った。結果を図１２に示す。
【０１３５】
＜精製の手順＞
ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、２７−５１４０−０１）の下を折り、フタを開けて、カラムに添付されている２ｍＬチューブにセットして７３５×ｇで１分間遠心処理した。カラムを新しい１．５ｍＬチューブにセットし、ＭＴＧ反応液１００μＬをゲル上部に置いて７３５×ｇで４分間遠心処理した。溶出したマルチラベル化核酸プローブ溶液を４℃で保存した。核酸の溶出量はおよそ５０％、未反応のタンパク質の溶出量はおよそ１０％未満であった。
【０１３６】
＜核酸濃度の定量＞
１×ＴＥバッファ（ｐＨ８．０）にて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（タカラバイオ社製、Ｆ０５２３）を１０，０００倍に希釈した。ＰＣＲまたはＲｕｎ−ｏｆｆ転写反応により得られた核酸を精製し、０，１，３，１０ｎｇ／μＬの水溶液を１０μＬずつ調製した。この核酸を熱変性後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ溶液９９０μＬに添加して蛍光強度を測定し（励起波長／蛍光波長：４８０ｎｍ／５２０ｎｍ）、検量線を作成した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ溶液９９０μＬにプローブ精製溶液を１０μＬ添加し、蛍光を測定して検量線から濃度を算出した。タンパク質濃度はＢＣＡ法により定量した。
【０１３７】
図１２からわかるように、マルチラベル化核酸プローブをゲルろ過方式のカラムで精製することにより、バックグラウンドが低減された。
【０１３８】
（実施例４）
＜Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰの合成＞
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５０μＬ中にて、５０ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、５０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、２５ｍＭ Ａｃ−ＰＬＱＭＲを、４℃で１６時間反応させることによって、ＮＨＳ化ＰＬＱＭＲ（２５ｍＭ）を調製した。一方、２０ｍＭ ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）の溶液１００μＬに対して、上記で調製したＮＨＳ化ＰＬＱＭＲ溶液を１００μＬ添加し、２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルを超純水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表６に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ）によって行った。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図１３に示す。ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合（図１４参照）と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１０．９分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、図１５に示すように、１１９３．２６のピークが確認され、理論分子量と良く一致した結果が得られたため、Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰの合成が示された。
【０１４１】
＜各溶液の調製＞
表７に示す組成で、以下の溶液を調製した。
ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液
ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液
ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液
ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液
Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰ含有溶液
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
＜マルチラベル化核酸プローブの調製＞
まず、マウス由来のＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）をコードする遺伝子中の約３００ｂｐをＰＣＲ増幅するプライマを設計した。次に、ＰＣＲ反応液の全ｄＴＴＰのうちの８０％をＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰに置き換えて反応液を調製してＰＣＲ（表８参照、９４℃×２ｍｉｎ＋（９４℃×２０ｓｅｃ，５４℃×２０ｓｅｃ，７２℃×３０ｓｅｃ）×４０サイクル）を行うことによって、Ａｃ−ＰＬＱＭＲ ８０％ＤＮＡを得た。結果を図１６に示す。
【０１４４】
【表８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
何らかの標識が施されたＲＮＡプローブなどの核酸プローブを用い、細胞レベルにおけるＤＮＡやＲＮＡの発現パターンを検出、可視化することによって、生命現象に関する数多くの疑問点を解明することが可能となる。細胞レベルでの遺伝子発現パターンを可視化するこのような手法をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＩＳＨ）と言うが、この際に使用されるプローブの標識法は大別して、「放射性同位体標識法」、「蛍光抗体標識法」、「酵素抗体標識法」に分類される。歴史的には、放射性同位体を取り込ませた核酸プローブが先に確立したが、近年その取り扱いが制限されてきたこともあって、放射性同位体元素を用いない蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法が注目されている。
【０００３】
これらの手法は、核酸プローブ作製時に抗原やビオチンでラベル化しておき、それらを標的核酸にハイブリダイズした後、酵素もしくは蛍光物質によって標識された抗体やアビジンを用いて免疫染色法により検出するといった手法である。感度という観点から見ると、酵素反応によるシグナル増幅効果が得られる酵素抗体標識法が優れており、現在最も広く使用されている。
【０００４】
酵素抗体標識法を利用した核酸プローブとしては、例えば、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの抗体認識部位で修飾したヌクレオチド誘導体を複数個ランダムに導入した抗原マルチラベル化核酸プローブが知られている。この抗原マルチラベル化核酸プローブと標的核酸とのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの後、抗体認識部位を認識する酵素標識化抗体との抗原−抗体反応を行い、酵素アルカリホスファターゼとのハイブリッドによる発色反応を利用して検出を行う。しかしながら、酵素標識された抗体が非常に高価であること、抗原−抗体反応に伴う操作の煩雑化や非特異吸着などによるバックグラウンドの増加など、幾つかの問題を有している。
【０００５】
一方、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有するペプチドまたはタンパク質へ、アニオン性であり、かつＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する外来分子を部位特異的に連結する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−５４６５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる核酸検出用キットである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含む核酸検出用キットである。
【化１】
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化２】
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化３】
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化４】
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【０００９】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記式（１）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が、下記式（５）で示される化合物であることが好ましい。
【化５】
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であり、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【００１０】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることが好ましい。
【００１１】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基は、ＦＹＰＬＱＭＲ、ＹＰＬＱＭＲ、ＰＬＱＭＲ、ＦＹＰＬＱＭＧ、ＹＰＬＱＭＧ、ＹＰＬＱＭ、ＰＬＱＭＧ、ＦＹＰＬＱＧ、ＹＰＬＱＧまたはＰＬＱＧのアミノ酸配列中に存在することが好ましい。
【００１２】
また、前記核酸検出用キットにおいて、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を含むことが好ましい。
【００１３】
また、前記核酸検出用キットにおいて、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含むことが好ましい。
【００１４】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記リシン（Ｌｙｓ）残基が、ＭＴＧに認識されるアミノ酸配列中に存在することが好ましい。
【００１５】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることが好ましい。
【００１６】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることが好ましい。
【００１７】
また、前記核酸検出用キットにおいて、前記Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つ、前記Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明では、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる核酸検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態に係る核酸検出用キットにおける酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸の構造の一例（Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ）を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る核酸検出用キットにおける酵素マルチラベル化核酸プローブの調製方法を示す概略図である。
【図３】本発明の実施形態に係る核酸検出用キットにおける標的核酸の検出方法の一例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施形態に係る核酸検出用キットにおける酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸の一例であるＺ−ＱＧ−ＵＴＰの合成方法の一例を示す図である。
【図５】本発明の実施例１において、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表１のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例１において合成したＺ−ＱＧ−ＵＴＰのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例１において合成したＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例１において、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表２のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例１において、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの逆相ＨＰＬＣ（表２のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図１０】（ａ）本発明の実施例１における核酸検出用キットを用いたドットブロットの結果を示す図である。（ｂ）本発明の比較例１におけるドットブロットの結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例２における核酸検出用キットを用いたドットブロットの結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例３における核酸検出用キットによるマルチラベル化核酸プローブの精製品および未精製品を用いたドットブロットの結果を示す図である。
【図１３】本発明の実施例４において、Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣ（表６のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図１４】本発明の実施例４において、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの逆相ＨＰＬＣ（表６のＨＰＬＣ測定条件）を行った際の結果を示す図である。
【図１５】本発明の実施例４において合成したＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰのＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１６】本発明の実施例４において合成したＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰを用いてＤＮＡを調製した際のアガロースゲル電気泳動装置にて電気泳動を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
本発明の実施の形態に係る核酸検出用キットは、下記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含む。式（１），（２），（３）または（４）において、Ａ、Ａ１またはＡ２は、リシン（Ｌｙｓ）残基またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基以外のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【化６】
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化７】
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化８】
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化９】
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００２２】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を含んでもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含んでもよい。さらに、本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸においてＢが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つを含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含んでもよい。
【００２３】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含む酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸含有溶液を含むものであってもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むトランスグルタミナーゼ含有溶液を含んでもよい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットは、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物と、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含む標識化合物含有溶液を含んでもよい。さらに、本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸においてＢが水素原子の場合には、ｄＡＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＡＴＰ含有溶液、ｄＣＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＣＴＰ含有溶液、ｄＧＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＧＴＰ含有溶液、ｄＴＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むｄＴＴＰ含有溶液のうち少なくとも１つを含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＡＴＰ含有溶液、ＣＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＣＴＰ含有溶液、ＧＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＧＴＰ含有溶液、ＵＴＰと溶媒と必要に応じてｐＨ調整剤とを含むＵＴＰ含有溶液のうち少なくとも１つを含んでもよい。
【００２４】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、上記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸と、Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つと、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むヌクレオシド三リン酸含有溶液を含んでもよく、Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つと、溶媒と、必要に応じてｐＨ調整剤とを含むヌクレオシド三リン酸含有溶液を含むものであってもよい。
【００２５】
本発明者らは、核酸プローブに複数の酵素を共有結合的に導入する手法として、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）などのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が有する部位特異的なタンパク質修飾能に着目した。ＴＧａｓｅはアシル転移反応を触媒する酵素であり、例えば、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、Ｌｙｓ残基（Ｋ）のε−アミノ基や各種一級アミンとの共有結合を触媒する酵素である。このＴＧａｓｅを用いて、複数の標識酵素などの標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブの創製を行うことができる。
【００２６】
具体的には、例えば、図１に示す、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）に、ＴＧａｓｅが認識するＧｌｎ（ＭＴＧ認識Ｇｌｎ）を有するＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体であるＺ−ＱＧ−ＵＴＰを、図２に示すように、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所導入されたＺ−ＱＧ ＲＮＡを調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させることによって、ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる。
【００２７】
このマルチラベル化核酸プローブは、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、直ちに検出反応を行うことができるため、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。
【００２８】
なお、図２において、核酸プローブにおけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが複数箇所導入された核酸プローブを調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製してもよい。
【００２９】
また、図３に示すように、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡなどの核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させてもよい。ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）となり、このように導入した標識部分の検出反応を行うことにより、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。
【００３０】
なお、図３において、核酸プローブにおけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を合成し、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが複数箇所導入された核酸プローブを調製する。その後、核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させてもよい。
【００３１】
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いて、ＱＧ基を導入した核酸とＮ末端にＫ残基等を有する酵素を、ＭＴＧを用いて結合させることにより、容易に酵素標識核酸を得ることができる。また、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方に標識することができる。酵素標識した核酸プローブは、フィルターハイブリダイゼーションやＩＳＨなどの核酸検出アッセイに用いることができる。
【００３２】
＜酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸＞
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれる酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する上記式（１），（２），（３）または（４）で示されるヌクレオシド三リン酸である。上記式（１），（２），（３）または（４）で示されるヌクレオシド三リン酸は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）誘導体、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）誘導体、グアノシン三リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴＰ）誘導体、シチジン三リン酸（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＣＴＰ）誘導体、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）誘導体、デオキシアデノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＡＴＰ）誘導体、デオキシグアノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＧＴＰ）誘導体、デオキシシチジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＣＴＰ）誘導体である。本実施形態に係る酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸において、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンは、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
【００３３】
これらの酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはそれらの各種誘導体から得ることができる。
【００３４】
また、これらの酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、ウリジン、ウリジンの一リン酸（ＵＭＰ）および二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン、アデノシンの一リン酸（ＡＭＰ）および二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン、グアノシンの一リン酸（ＧＭＰ）および二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン、シチジンの一リン酸（ＣＭＰ）および二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンの一リン酸（ｄＵＭＰ）および二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシアデノシン、デオキシアデノシンの一リン酸（ｄＡＭＰ）および二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン、デオキシグアノシンの一リン酸（ｄＧＭＰ）および二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンの一リン酸（ｄＣＭＰ）および二リン酸（ｄＣＤＰ）ならびにそれらの各種誘導体から得てもよい。
【００３５】
例えば、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのリン酸化酵素などによるリン酸化（例えば、生物工学会誌，８５（９），ｐ３９７−３９９（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７（６），ｐ．７３２−７３８（１９９９）など参照）や、プロトンスポンジ存在下でのオキシ塩化リンなどによるリン酸化（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（３６），ｐ．４５２５−４５２８（１９８８）など参照）などによって、それらの三リン酸体を得ることができる。
【００３６】
上記式（１）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸は、下記式（５）で示される、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有するＴＧａｓｅ基質修飾ヌクレオチド三リン酸であることが好ましい。
【化１０】
【００３７】
式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基などの炭素数２〜４８のアルケニレン基などが挙げられる。これらのうち、Ｘ，Ｙは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基、炭素数１〜４８のアルコキシ基であることが好ましく、Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であることがより好ましい。Ｘ，Ｙはさらにエテニレン基、オキシアルキレン基、例えば−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ｎは繰り返し数でありｎ＝２，４，８，１２，２４）基などで置換されていてもよい。
【００３８】
Ｚで表される置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などの炭素数１〜４８のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基などの炭素数１〜４８のアルコキシ基、フェニル基、ナフチル基などの炭素数６〜４８のアリール基、フェニルオキシ基などの炭素数６〜４８のアリールオキシ基、ベンジル基などの炭素数７〜４８のアリールアルキル基、ベンジルオキシ基などの炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基などが挙げられる。これらのうち、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることが好ましく、Ｚはベンジルオキシ基であることがより好ましい。Ｚはさらにジニトロフェニル基、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル基などで置換されていてもよい。また、上述したＹで表される置換との組み合わせで、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。
【００３９】
Ｘを適宜選択することにより、Ｚ−ＱＧとＵＴＰとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、酵素などのアクセスを向上することができる。また、Ｙ，Ｚを適宜選択することにより、基質ペプチド配列を最適化し、例えば酵素などの親和性を向上することができる。
【００４０】
微生物由来ＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）を用いる場合、ＭＴＧが認識可能なＧｌｎ残基は、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）として存在することが好ましい。Ｚ−ＱＧは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などよりも分子サイズが小さいため好ましい。式（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸において、Ｂがヒドロキシル基、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基であるヌクレオチド誘導体が、ＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰである。Ｂが水素原子、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基であるヌクレオチド誘導体が、ｄＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰである。また、酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸中には、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基または第一級アミンが共存しないようなものを選択することが好ましい。共存する場合には、ＴＧａｓｅにより、自己架橋する可能性があり、目的のマルチラベル化核酸プローブの収率に好ましくない影響を与える場合があるからである。
【００４１】
また、微生物由来ＴＧａｓｅの良基質として、ＬＬＱＧ（配列番号：１）、ＬＡＱＧ（配列番号：２）、ＬＧＱＧ（配列番号：３）、ＰＬＡＱＳＨ（配列番号：４）、ＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号：５）、もしくはＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＬＧＱＧＧＧ（配列番号：７）、ＧＦＧＱＧＧＧ（配列番号：８）、ＧＶＧＱＧＧＧ（配列番号：９）、もしくはＧＧＬＱＧＧＧ（配列番号：１０）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｌｉｖｅｒ由来のＴＧａｓｅの良基質として、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルフェニルアラニン（Ｚ−ＱＦ）、またはＥＡＱＱＩＶＭ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＧＧＱＬＧＧ（配列番号：１２）、ＧＧＧＱＶＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＱＲＧＧ（配列番号：１４）、ＧＱＱＱＬＧ（配列番号：１５）、ＰＮＰＱＬＰＦ（配列番号：１６）もしくはＰＫＰＱＱＦＭ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、用いるＴＧａｓｅの種類に応じ、このようなペプチドとして存在してもよい。
【００４２】
また、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、ＦＹＰＬＱＭＲ（配列番号：２７）、ＹＰＬＱＭＲ（配列番号：２８）、ＰＬＱＭＲ（配列番号：２９）、ＦＹＰＬＱＭＧ（配列番号：３０）、ＹＰＬＱＭＧ（配列番号：３１）、ＹＰＬＱＭ（配列番号：３２）、ＰＬＱＭＧ（配列番号：３３）、ＦＹＰＬＱＧ（配列番号：３４）、ＹＰＬＱＧ（配列番号：３５）またはＰＬＱＧ（配列番号：３６）のアミノ酸配列からなるペプチドとして存在してもよい。これにより、ＴＧａｓｅによる架橋反応の反応性が高くなる。
【００４３】
なお、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドは、Ｎ末端アミノ基がＴＧａｓｅの基質になりうるため、自己架橋による副産物が生じうる。したがって、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドについては、Ｎ末端アミノ基の水素を適切な基で置換することによりＴＧａｓｅの基質とはならないように保護して、所望の連結を行うことができるようにするとよい。なお、本明細書において「Ｎ末端保護」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。そして、Ｎ末端保護の手段により、反応性が異なることが知られている。詳細には、ほ乳類由来ＴＧａｓｅに関して、ＧＱＱＱＬＧのＮ末端アセチル化による保護（すなわち、Ａｃ−ＧＱＱＱＬＧ）、またＮ末端アミノ酸をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）にする（すなわち、ＤＯＰＡ−ＧＱＱＱＬＧ）と反応性が向上することが知られている。このような保護の例を、本実施形態においても利用することができる。
【００４４】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの調製方法を図４に示す。これは、本実施形態に係る酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸の調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。
【００４５】
まず、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておく（ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ）。そして、アミノアリルＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するＵＴＰと、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧとを縮合することにより、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを得ることができる。
【００４６】
また、Ｃ末端のカルボキシル基を活性エステル化する上述の方法に加えて、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するペプチドをＵＴＰに導入する方法として、アミノ基と反応性の高い官能基をペプチドに導入する方法がある。例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドを調製できれば、これをアミノ化ＵＴＰと反応させることにより、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するＵＴＰを調製することができる。ただし、これらの反応性官能基は、基質ペプチドにおいてＴＧａｓｅ認識に影響がない部分に導入する必要がある。したがって、上述のように、Ｇｌｎ残基とは離れたＣ末端のカルボキシル基を活性化する方法は、この目的において最も優れたものの一つである。
【００４７】
また、例えば、ＰＬＱＭＲのアミノ酸配列からなるペプチドをｄＵＴＰに導入したＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰは、例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておき、アミノアリルｄＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するｄＵＴＰと縮合することによって、得ることができる。
【００４８】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等の精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）などにより行うことができる。また、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等の同定は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲなどにより行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。
【００４９】
＜ＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸＞
本実施形態に係る核酸検出キットを用いて調製することができるＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸は、構成単位として、上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されているＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
【００５０】
核酸には、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸の配列および長さには特に制限はない。長さに関しては、例えば少なくとも２０ｍｅｒ程度であればよい。
【００５１】
例えば、本実施形態に係る核酸検出キットに含まれるＺ−ＱＧ−ＵＴＰを基質として、ＲＮＡポリメラーゼ活性のある酵素を用いて複数のＺ−ＱＧ−ＵＴＰを取り込ませて、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入され、所望の配列を有するＴＧａｓｅ基質マルチラベル化核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡ（図２）を調製することができる。
【００５２】
＜マルチラベル化核酸プローブ＞
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位である酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸のグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有し標識部分を含む標識化合物を結合して構成することができる。マルチラベル化核酸プローブは、例えば、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入された核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡに、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などを結合させることによって、ＲＮＡと標識酵素などの標識部分が１：ｎであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる（図２）。
【００５３】
ＲＮＡと標識酵素などの標識部分との比率ｎは、２以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができるが、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、標的核酸とのハイブリダイゼーションの効率が低下する場合がある。
【００５４】
また、例えば、以下の方法により、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のマルチラベル化核酸プローブを調製することができる。
（１）ＴＧａｓｅの由来を変える。
（２）ＴＧａｓｅの基質特異性を変える。
【００５５】
（１）の方法では、例えば、用いるＴＧａｓｅの種類に応じて、異なる基質ペプチドで修飾されたＵＴＰなどを調製すればよい。
【００５６】
（２）の方法では、例えば、ＴＧａｓｅに、タンパク質工学的にアミノ酸変異を導入して基質特異性を変えればよい。例えば、ＭＴＧを大腸菌で調製し（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋ． Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ Ｃ． Ｈｅｒｔｅｌ ａｎｄ Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４０，Ｉｓｓｕｅ ６，２ Ｍａｙ ２００７，ｐ．１５４３−１５５０，”Ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”参照）、さらに変異体ライブラリーを作って耐熱性の向上したＭＴＧを取得することができる（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｋ． Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ Ｃ． Ｈｅｒｔｅｌ ａｎｄ Ｍａｒｋｕｓ Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １３６，Ｉｓｓｕｅｓ ３−４，１０ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８，ｐ．１５６−１６２，”Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｈｅａｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔｓ”参照）。
【００５７】
本明細書において、「ＴＧａｓｅにより結合する」というときは、特別な場合を除き、得られる連結部は、Ｌｙｓ残基とＧｌｎ残基とが、ε（γ−グルタミル）リシン結合を形成することにより構成されている。
【００５８】
本実施形態においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基は、第一級アミンであってもよい。本明細書では、Ｌｙｓ残基を例に説明するが、その説明は、特別な場合を除き、第一級アミンにも当てはまる。
【００５９】
リシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有し標識部分を含む標識化合物としては、特に制限はない。
【００６０】
標識部分としては、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、熱的に検出可能な標識（例えば、温度応答性高分子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）などが挙げられ、検出感度、取り扱い性などの点から、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つが好ましい。
【００６１】
蛍光色素としては、選択された波長の紫外光、可視光などの放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体などが挙げられる。
【００６２】
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。
【００６３】
ＴＧａｓｅに対し、Ｌｙｓ残基（または第一級アミン）供与体となる基質は、Ｇｌｎ残基供与体となる基質に比較して構造的な制約が少ないと考えられる。したがって、修飾しようとする標識酵素が、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を元来有している場合もあり、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むタグを酵素に付加する場合もある。
【００６４】
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基（Ｋ）は、ＭＫＨＫＧＳ（配列番号：１８）、ＭＲＨＫＧＳ（配列番号：２４）、ＭＲＲＫＧＳ（配列番号：２５）、ＭＨＲＫＧＳ（配列番号：２６）のアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドによるタグ化は、標識酵素を、タンパク質の所望の部位、例えばＣ末端またはＮ末端に連結する目的で用いることができる。ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含む他のペプチドまたはそのアミノ酸配列の例としては、改変型Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＲＦＥＲＡＨＭＤＳＧＳ（配列番号：１９））、ＭＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号：２０）、Ｎ末端グリシン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＧＧＧ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ＧＧＧＧＧ（配列番号：２１））、Ｎ末端ＭＫＨＫＧＳと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号：２２）などが挙げられる。
【００６５】
Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加した標識酵素は、遺伝子工学的な手法を用いて、組換えタンパク質として調製することができる。Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅの基質ペプチドタグが導入された当該組換えタンパク質の精製は、それぞれＮ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し（ＴＧａｓｅの反応性の低下を回避するために、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端に精製用ペプチドタグを入れるようにデザインするとよい。）、ゲル濾過クロマトグラフィなどにより行うことができ、またアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認するか、Ｎ末端に導入された基質ペプチドについてはＮ末端分析により直接同定することができる。タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで行うことができる。
【００６６】
標識酵素としては、発色反応、化学発光などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ならびにＰ４５０およびそれらの変異体などが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。
【００６７】
酵素マルチラベル化核酸プローブと標的核酸の間でより厳密に塩基配列特異的な二本鎖形成を行うためには、比較的高温（例えば、７０℃以上）の条件下で行うことがあるため、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。そこで、標的酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）が好ましい。
【００６８】
超好熱菌由来の酵素は、一般的に有機溶媒や熱に対して高い安定性を示すことが知られているため好ましく（例えば、Ｈ．Ａｔｏｍｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，ｐ．１６６−１７３（２００５）参照）、さらに、大腸菌を宿主とした大量調製が比較的容易に行うことができる点においても好ましい。大腸菌を宿主として耐熱性酵素を調製する場合、細胞破砕液を高温処理（例えば、８０℃で３０分温置）することで、大腸菌由来の共雑タンパク質のほとんどを沈殿させ、粗精製を容易に行うことができる。
【００６９】
超好熱菌は一般の生物がほとんど生育できない極限環境で生育することができる微生物であるため、超好熱菌由来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有している。さらに、熱に対する耐性だけでなく、一般的に、変性剤、有機溶媒、ｐＨなどに対する耐性も常温菌由来酵素に比べて極めて高いことから、ＰｆｕＡＰを使用することによって、酵素の失活を伴わない厳密な二本鎖形成を達成することができると考えられる。
【００７０】
本実施形態に係る酵素マルチラベル化核酸プローブの好ましい態様の一つは、ＰｆｕＡＰとＺ−ＱＧ ＲＮＡとの複合体またはＰｆｕＡＰとＺ−ＱＧ ＤＮＡとの複合体である。このような複合体は、安定な酵素であるＰｆｕＡＰと、安定な分子であるＲＮＡまたはＤＮＡが、アミド結合という安定な共有結合で連結されているため、複合体全体としても安定性であるというメリットがある。
【００７１】
また、酵素マルチラベル化核酸プローブにおいて、酵素が有機溶媒や熱に対して安定な酵素であってもよい。このような安定性の高い酵素は、自然界からのスクリーニング（例えば、化学と工業，ｖｏｌ．６１（Ｎｏ．６），ｐ．５７１−５７５（２００８）、内山拓，宮崎健太郎，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．５），ｐ．２３４−２３９（２００８）、道久則之，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．１２），ｐ．６６７−６７０（２００８））や、タンパク質工学的手法により安定性を高める技術（例えば、荻野博康，ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．１６−２３（２００８）、宮崎健太郎，ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．５２−５８（２００８））により得ることができる。これらの手法により、常温菌由来の酵素であっても、有機溶媒耐性や耐熱性を有する酵素へと変換することができる。
【００７２】
蛍光色素部分を導入した、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識化合物は、例えば、カルボキシル基にジアミンを導入する方法で調製することができる（例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ １,Ｓｅｃｔｉｏｎ ４．３，ｐ．１００−１０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．を参照）。
【００７３】
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）としては、種々のものを用いることができる。現在、ＴＧａｓｅとして、哺乳類（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。本実施形態において用いることのできるＴＧａｓｅの好ましい例は、安定性、ハンドリングの容易さ、バルク生産が可能などの点から微生物由来微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）である。
【００７４】
本実施形態においてＭＴＧを用いた場合、予想されているＭＴＧの触媒反応から、Ｌｙｓ残基を有する標識酵素などの標識部分を含む標識化合物とＺ−ＱＧ ＲＮＡとの連結反応は、ＭＴＧ活性中心であるシステイン（Ｃｙｓ）残基の、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡのＧｌｎへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こる標識化合物のＬｙｓによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるＭＴＧの脱離、の２段階で進行すると予想される。
【００７５】
本実施形態の核酸検出用キットにおいては、ＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有するＺ−ＱＧ ＲＮＡに対する、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識化合物のモル濃度比は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。なお、本明細書で単に「濃度比」というときは、特別な場合を除き、モル濃度による比を指す。例えば、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡに対するＮＫ１４−ＰｆｕＡＰのモル濃度比は、[ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ]／[Ｚ−ＱＧ ＲＮＡ]と表すこともできる。
【００７６】
［ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの調製］
ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰとは、ＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳの配列を有するアミノ酸１４残基からなる付加配列を遺伝子工学的にＰｆｕＡＰのＮ末端に、精製用タグをＣ末端に導入したものである。ＰｆｕＡＰの発現ベクターは香川大学櫻庭春彦教授より委譲頂いた。ＰＣＲによりＰｆｕＡＰをコードする領域を増幅する際、それぞれのタグが導入されるようにタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００７７】
また、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの大腸菌での発現量の向上のため、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて塩基配列が改変されたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの発現ベクター（アクセッション番号：ＡＢ４７９３８３、配列番号：２３）を用いてもよい。この発現ベクターは、Codon Devices社（http://www.codondevices.com）に受託合成して得た。ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰをコードする遺伝子領域の両端に適切な制限酵素サイトを導入しておき、これらを利用することでタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、得られたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ発現ベクターにより大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００７８】
ＴＧａｓｅとしてＭＴＧを用いて連結反応を行う場合には、上述のようにモル濃度比が適切な範囲となるようにすることに加えて、ｐＨ５．０〜８．０、温度４〜５０℃（例えば、室温（例えば、１８℃〜２２℃））の条件で行うことが好ましい。このようにすれば、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内に、充分に高い反応率が達成可能である。
【００７９】
このような高い反応率が達成できる方法により得られたマルチラベル化核酸プローブ溶液には、未反応の核酸プローブ（例えば、遊離のＺ−ＱＧ ＲＮＡ）がほとんど存在せず、以下で詳述する、標的核酸の検出にそのまま用いたとしても、マルチラベル化核酸プローブと未反応分子との競合が実質的に生じないか、生じたとしても目的とする検出の結果には実質的な影響を与えないほど少ないと考えられる。したがって、マルチラベル化核酸プローブ溶液を精製することなく、直接検出へと利用できるメリットがある。
【００８０】
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いた酵素マルチラベル化核酸プローブの形成方法は、従来法に比較して、以下の特徴およびメリットを有する。
・対象となる標識酵素は、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する酵素、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を導入することができるあらゆる酵素を包含する。また、インテインのような大きなタンパク質性タグを必要としない。
・酵素の修飾部位は、Ｃ末端に限定されない。ＴＧａｓｅ活性なＬｙｓ残基またはＧｌｎ残基が存在するか、そのようなＬｙｓ残基またはＧｌｎ残基を有するタグを導入することができる部位であれば、修飾可能である。
・Ｃ末端、Ｎ末端に加え、ｌｏｏｐ領域のようなタンパク質構造中の揺らぎの大きな部位も修飾対象となりうる。
・結合する核酸の塩基配列および長さには、特に制限がない。
【００８１】
＜標的核酸の検出方法＞
本実施形態に係る核酸検出用キットを用いた標的核酸の検出方法は、構成単位として例えば上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを調製し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、酵素部分などの標識部分により検出する工程を含む。
【００８２】
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、標的核酸の定性、定量、識別、染色、局在化の調査などの目的で用いることができる。
【００８３】
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。酵素部分などの標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。
【００８４】
検出対象が（ｉ）の場合、標的核酸は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡまたはゲノム断片ＤＮＡなどであり、（ｉｉ）の場合、標的核酸は、細胞または個体組織中に含まれる核酸（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）などである。本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸検出用キットを用いて得たマルチラベル化核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（酵素など）を配置しているため、検出感度の向上が可能になる。
【００８５】
この方法においては、標的核酸に、マルチラベル化核酸プローブを供し、標的核酸とマルチラベル化核酸プローブの標的核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせるが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。
【００８６】
本実施形態に係る標的核酸の検出方法において、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のマルチラベル化核酸プローブを準備して、同時に複数の標的核酸を検出してもよい。
【００８７】
また、本実施形態において、標的核酸の検出方法は、
（ａ）基材表面に固定化された核酸、
（ｂ）固定化された固定化核酸の全部または一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、および標的核酸に特異的に結合可能な配列（標的核酸特異的配列）を有するアプタマ核酸、
（ｃ）構成単位として上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンのうち少なくとも２つに、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する標識酵素などの標識化合物が結合されて構成されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、及び／又は核酸部分がアプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブ、
を調製し、
（Ａ）固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化し、
（Ｂ）固定化された固定化アプタマ核酸に、標的核酸を含む標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的核酸とアプタマ核酸の標的核酸分子特異的配列を有する部分とを結合させ、かつ上記マルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせることにより、タンパク質を固定化し、
（Ｃ）固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出する工程を含む。
【００８８】
この方法における基材表面への核酸の固定化のためには、従来技術、例えばＤＮＡマイクロアレイなどを調製する際に用いられる技術を適用することができる。「基材」は、ガラス、シリコンなどのプラスチック製の、チップ、ビーズ、ウェル、プレートなどの形態とすることができ、核酸は、従来技術を用いて、基材表面に非共有結合（静電結合）的に、または共有結合で固定することができる。あらかじめ調製した核酸を基材に固定化してもよく、基材上で直接核酸を合成してもよい。簡便には、アビジンなどで被覆された市販のプレートを用い、ビオチン化した所望のＤＮＡを固定することができる。
【００８９】
この方法ではさらに、固定化核酸の全部または一部に相補的な配列（固定化核酸相補的配列）、および標的分子を含まれる標的核酸に特異性的に結合可能な配列（標的核酸特異的配列）を有する核酸（アプタマ核酸）が用いられる。標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。標的核酸特異的配列を有する部分は、従来技術、例えばＳＥＬＥＸ（試験管内人工進化法）工程を用いることにより産生することができ、また標的分子に対して非常に高い標的親和性及び特異性を有するものとすることができる。標的核酸特異的配列を有する部分は、修飾ヌクレオチドで構成されていてもよい。
【００９０】
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、アプタマ核酸の標的核酸特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものとする。酵素部分などの標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。
【００９１】
この方法においては、固定化核酸に、アプタマ核酸を供し、固定化核酸とアプタマ核酸の固定化核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせることにより、アプタマ核酸を固定化するが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。
【００９２】
また、この方法においては、次いで固定化アプタマ核酸に、標的分子を含む可能性のある試料を供し、標的分子が存在する場合には標的分子とアプタマ核酸の標的核酸特異的配列を有する部分とを結合させ、さらにマルチラベル化核酸プローブを供し、標的分子が存在しない場合にはマルチラベル化核酸プローブの核酸部分とアプタマ核酸とをハイブリダイズさせる。試料は、細胞もしくは組織抽出液、体液などでありうる。
【００９３】
さらにこの方法においては、固定化された酵素部分の有無またはその量を酵素の性質に基づいて検出することにより、試料中の標的分子を検出することができる。
【００９４】
アプタマ核酸においては、固定化核酸相補的配列を有する部分と、標的核酸特異的配列を有する部分とは、重複してもよく、連続してもよく、また適当なスペーサを介して両者が存在するように設計することができる。標的核酸特異的配列を有する部分（アプタマ領域）が分子認識のためにある立体構造をとることを考慮すると、該部分は、固定化核酸相補的配列を有する部分とは少なくとも重複しないようにするのがよい。
【００９５】
アプタマ核酸は、固定化核酸相補的配列および標的核酸特異的配列以外に、所望の場合にはマルチラベル化核酸プローブと適切にハイブリダイズするための配列をさらに含んでいてもよい。マルチラベル化核酸プローブの核酸部分は、アプタマ核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するが、この特異的配列の全部または一部に相補的な配列からなる領域が長い（標的核酸特異的配列と重複が多い）と、かえってアプタマ核酸とはハイブリダイズできない場合が生じうる。また短い（重複が少ない）と、標的分子が存在し、アプタマ核酸と結合している場合にも、マルチラベル化核酸プローブとアプタマ核酸とがハイブリダイズしてしまう場合が生じうる。当業者であれば、このようなことを考慮して、固定化核酸、アプタマ核酸、マルチラベル化核酸プローブの核酸部分を、適宜設計することができる。
【００９６】
また、本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものである、構成単位として、例えば上記式（１）〜（５）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が複数個導入されている核酸である核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、核酸プローブにおけるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンと、リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有し標識部分を含む標識化合物のリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基とを反応させて、容易に検出可能な性質を有する複数の標識部分を導入し、結合している核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む（図３参照）。
【００９７】
この方法においては、上記核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。また、標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。
【００９８】
本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（標識部分）を配置することにより、検出感度の向上が可能になる。
【００９９】
例えば、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが複数箇所に導入された核酸プローブＺ−ＱＧ ＲＮＡに、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した酵素、蛍光色素などの標識化合物を結合させる。
【０１００】
本実施形態に係る核酸検出用キットの構成の一例は、例えば、下記（１）〜（３）の各セットを含むものである。
（１）ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液、ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液、ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液、ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセット（Ｚ−ＱＧ デオキシリボヌクレオチドセット）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭである。ｄＴＴＰとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰとは適切な比率（例えば、モル比で６：４）で混合されていてもよい。
（２）ＡＴＰと溶媒とを含むＡＴＰ含有溶液、ＣＴＰと溶媒とを含むＣＴＰ含有溶液、ＧＴＰと溶媒とを含むＧＴＰ含有溶液、ＵＴＰと溶媒とを含むＵＴＰ含有溶液、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセット（Ｚ−ＱＧ リボヌクレオチドセット）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭである。ＵＴＰとＺ−ＱＧ−ＵＴＰとは適切な比率（例えば、モル比で６：４）で混合されていてもよい。
（３）標識部分としてＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ等の超好熱菌由来の標識酵素等を含む標識化合物と溶媒とを含む標識化合物含有溶液、ＭＴＧと溶媒とを含むＭＴＧ含有溶液、反応バッファ、コントロール用ＤＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＤＮＡ）、コントロール用ＲＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＲＮＡ）の標識セット。
【０１０１】
本実施形態に係る核酸検出用キットの構成の他の例は、例えば、下記（１）〜（３）の各セットを含むものである。
（１）ｄＡＴＰとｄＣＴＰとｄＧＴＰとｄＴＴＰとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリング混合物セット（Ｚ−ＱＧ デオキシリボヌクレオチドミックス）。各成分の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭであり、ＰＣＲに用いやすい２ｍＭまたは汎用性が高い１００ｍＭである。
（２）ＡＴＰとＣＴＰとＧＴＰとＵＴＰとＺ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液のＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリング混合物セット（Ｚ−ＱＧ リボヌクレオチドミックス）。各溶液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜１００ｍＭであり、ＲＮＡ合成に用いやすい２０ｍＭである。
（３）標識部分としてＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ等の超好熱菌由来の標識酵素等を含む標識化合物とＭＴＧと反応バッファと溶媒とを含む標識化合物／ＭＴＧ含有溶液、コントロール用ＤＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＤＮＡ）、コントロール用ＲＮＡ（Ｚ−ＱＧ標識済ＲＮＡ）の標識セット。ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰおよびＭＴＧは、反応に適した終濃度の例えば２倍の濃度とし、Ｚ−ＱＧ核酸と例えばモル比で１：１で混合することにより反応させる。
【０１０２】
溶媒としては、例えば、水や、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられる。これらのうち、安定性等の点から水が好ましい。また、水としては、蒸留水、イオン交換水等の純水、超純水等が用いられる。
【０１０３】
本実施形態に係る核酸検出用キットにおける各溶液のｐＨは、例えば、ｐＨ４〜１０の範囲であり、ｐＨ５〜８の範囲が好ましい。ｐＨがこの範囲外の場合は、ＭＴＧによるラベル化効率が低下する場合がある。
【０１０４】
ｐＨ調整剤としては、アルカリ性から酸性の溶液または緩衝溶液等が挙げられる。ｐＨ調整用の溶液または緩衝溶液としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、リン酸、ホウ酸水溶液、酢酸ナトリウム緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、コハク酸緩衝液、２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボン酸緩衝液、モノフタル酸カリウム緩衝液、２−（Ｎ−モルノホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、イミダゾール緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、マロン酸緩衝液、乳酸緩衝液、Ｎ−メチルジエタノールアミン、ヒスチジン緩衝液、ピリジン酢酸緩衝液、酢酸トリエタノールアミン緩衝液、３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝液（ＭＯＰＳバッファ：３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｕｆｆｅｒ）等が挙げられ、これらを単独または混合物として用いることができる。これらのうち、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液が好ましい。
【０１０５】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、検出感度を向上させるために、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）等の２価の陽イオンを含んでもよく、２価の陽イオンと溶媒とを含む陽イオン含有溶液を含んでもよい。これらのうち、系内で凝集や沈殿が生じにくい等の点からマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）が好ましい。２価の陽イオンは、ＴＧａｓｅによるラベル化反応のときに添加してもよいし、酵素の発色反応等のときに添加してもよい。
【０１０６】
本実施形態に係る核酸検出用キットにおいて、検出感度を向上させるために、核酸プローブと標識化合物との比率が１：２（モル比）以上となるようにすることが好ましい。また、本実施形態に係る核酸検出用キットにおいて、検出感度を向上させるために、ラベル化反応のときの標識化合物と２価の陽イオンとの比率（モル比）は、１：１〜１：３００の範囲であることが好ましい。また、酵素の発色反応のときの発色液中のマグネシウムイオン等の２価の陽イオンの濃度が、５０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲になるようにすることが好ましい。
【０１０７】
本実施形態に係る核酸検出用キットは、その他に例えば、反応で残存したＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰ等を除去するカラム、試薬等を含むＺ−ＱＧ精製セット；反応で残存した標識化合物等を除去してマルチラベル化核酸プローブを精製するためのカラム、試薬等を含む標識化合物精製セット；標識核酸に適したブロッキング剤を含む標識核酸用ブロッキング剤セット；標識核酸に適したハイブリダイゼーション溶液を含む標識核酸用ハイブリダイゼーション溶液セット等を含んでもよい。
【０１０８】
マルチラベル化核酸プローブを精製するカラムとしては、ゲルろ過クロマトグラフィ方式のものが好ましい。これによりバックグラウンドが低減される。核酸の精製方法として一般的な手法としては、例えば、フェノール抽出によるタンパク質の除去、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿等のアルコール沈殿、電気泳動後にゲルを切り出してシリカカラム等を用いて精製、限外ろ過膜による精製等が挙げられる。しかし、フェノール抽出やアルコール沈殿はマルチラベル化核酸プローブがタンパク質との複合体を形成しているために困難であり、ＭＴＧ反応液等の中の核酸濃度がｎｇ／ｍＬオーダーと低い場合にはアルコールを用いても沈殿しにくく、シリカ樹脂や限外ろ過膜を用いてもマルチラベル化核酸プローブの回収が困難である。
【０１０９】
ゲルろ過方式の精製において、直鎖状核酸がゲルを素通りし、球状タンパク質がゲル中へ保持されるような条件がよい。すなわち、ゲルろ過方式のカラムとしては、ゲルの孔サイズが直鎖状核酸より小さく、球状タンパク質より大きいこと（例えば、１０−５００．２／ｎｍ程度）が好ましい。また、標識化合物除去のために十分なカラム容量であること（例えば、０．２００−１ｍＬ）が好ましい。カラム容量が小さすぎると、保持できなかった標識化合物が溶出してくる場合があり、カラム容量が大きいときには反応液が希釈されてしまう場合がある。
【０１１０】
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれるＺ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセットは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ等を用いたＰＣＲ時に、ｄＮＴＰの代わりに用いてＰＣＲ産物にＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸プローブを調製するのに用いられる。また、例えば、Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅにより核酸プローブの３’端を伸長させさる際に、ｄＮＴＰの代わりに用いてＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸プローブを調製するのに用いられる。その他、例えば、核酸修飾酵素などにより通常のｄＮＴＰの代わりに用いてＺ−ＱＧ−ｄＮＴＰを取込ませることにより、Ｚ−ＱＧ核酸を調製するのに用いられる。
【０１１１】
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれるＺ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセットは、例えば、ＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロ転写反応を行う際に、ＮＴＰの代わりに用いて、Ｚ−ＱＧ−ＮＴＰが取込まれたＲＮＡを合成するのに用いられる。
【０１１２】
本実施形態に係る核酸検出用キットに含まれる標識セットは、例えば、Ｚ−ＱＧ ＤＮＡラベリングセット、Ｚ−ＱＧ ＲＮＡラベリングセットを用いて調製したＺ−ＱＧ標識核酸に、標識化合物を結合させる際に用いられる。また、Ｚ−ＱＧ標識核酸に標識化合物を結合させることにより、任意の配列を持った核酸を検出するマルチラベル化核酸プローブとして用いることができる。
【実施例】
【０１１３】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１４】
（実施例１）
＜Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成・精製＞
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成スキームは、図４に示す通りである。まず１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は２７．０℃）でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中で２０時間反応させることにより、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した（この段階で５００μＬずつに分注し、−８０℃で保存）。その後、２５ｍＭのＮＨＳ化Ｚ−ＱＧと５ｍＭの５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）とを、１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）とＤＭＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝１／１）０．３２ｍＬ中において２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルを超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製）（高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって精製を行った。ＨＰＬＣの測定条件は表１の通りとした。生成物の同定は、レーザーイオン化飛行時間型質量分析装置であるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（島津製作所製 ＡＸＩＭＡ（登録商標）−ＣＦＲ Ｐｌｕｓ）によって行った。なお、サンプル調製手順は、まず、試料１μＬをＭＡＬＤＩ用試料プレートの上に滴下し、次にその上から、マトリックス溶液；２，５−ジヒドロキ安息香酸（ＤＨＢ）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液（超純水）を滴下し、その後、風乾して、得られた試料プレートをＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ装置のイオン源内に導入して計測した。
【０１１５】
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰを合成した後、表１に示す条件で逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図５に示す。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
そこで、保持時間１８．８分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った（図６参照）。その結果、８５６．８９のピークが確認され、理論分子量の８５７．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰの合成が示された。
【０１１８】
＜Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成・精製＞
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中にて、１００ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は１８〜２２℃程度）で２０時間反応させることによって、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した。一方、５０ｍＭ ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液（Ａｍｂｉｏｎ製）１６μＬと２００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）４０μＬ、滅菌水１６μＬとを混合し、１０ｍＭ ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ溶液を８０μＬ調製した。この溶液に対して、上記で調製したＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ溶液を８０μＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。反応終了後、サンプルを超純水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表２に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ）によって行った。結果を図７に示す。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図８に示す。ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合（図９参照）と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１９．１分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、図７に示すように、８４１．４６のピークが確認され、理論分子量の８４２．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成が示された。
【０１２１】
＜ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの調製＞
遺伝子工学的手法により、Ｎ末端にＭＴＧが認識するＫを含んだペプチドタグ（ＭＫＨＫ（ＧＧＧＳ）２ＧＳ）を導入したＮＫ１４−ＰｆｕＡＰを調製した。
【０１２２】
＜各溶液の調製＞
表３（下記（１）），表４（下記（２）），表５（下記（３））に示す組成で、以下の溶液を調製した。
（１）ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液
ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液
ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液
ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ含有溶液
（２）ＡＴＰと溶媒とを含むＡＴＰ含有溶液
ＣＴＰと溶媒とを含むＣＴＰ含有溶液
ＧＴＰと溶媒とを含むＧＴＰ含有溶液
ＵＴＰと溶媒とを含むＵＴＰ含有溶液
Ｚ−ＱＧ−ＵＴＰと溶媒とを含むＺ−ＱＧ−ＵＴＰ含有溶液
（３）ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰと溶媒とを含むＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ含有溶液
ＭＴＧと溶媒とを含むＭＴＧ含有溶液
反応バッファ
【０１２３】
【表３】
【０１２４】
【表４】
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
＜マルチラベル化核酸プローブの調製＞
まず、マウス由来のＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）をコードする遺伝子中の約３００ｂｐをＰＣＲ増幅するプライマを設計した。次に、ＰＣＲ反応液の全ｄＴＴＰのうちの４０％をＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰに置き換えて反応液を調製してＰＣＲを行うことによって、Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡを得た。Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡに９５℃、５分間の熱変性を施し、Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡ ２５ｎｇ／μＬ、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ ０．２ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＧ ５．０Ｕｎｉｔ／ｍＬの条件で、３７℃で３時間反応を行い、Ｚ−ＱＧ ４０％マルチラベル化核酸プローブを調製した。
【０１２７】
＜メンブランの作製＞
Ｎｙｂｏｎｄ Ｎ＋（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のプロトコールに準じてメンブランを作製した。アプライ前にＤＮＡを９５℃、５分で熱変性した。メンブランを８０℃で２時間ベーキングした。
【０１２８】
＜プレハイブリダイゼーション＞
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随するハイブリダイゼーションバッファを用いて、プレハイブリダイゼーション（５５℃、１時間）を行った。
【０１２９】
＜ハイブリダイゼーション＞
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随するハイブリダイゼーションバッファを用いて、ハイブリダイゼーション（５５℃、Ｏ／Ｎ、プローブ濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を行った。Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒＩでメンブランを洗浄（５５℃、１０分間×２回）した。Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒＩＩでメンブランを洗浄（室温、５分間×２回）した。
【０１３０】
＜検出＞
発光基質をメンブラン上に１ｍＬ滴下し、ハイブリバックにくるんでインキュベート（室温、５分間）した。化学発光装置（化学発光装置（ＢＩＯ ＲＡＤ社製、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋)）にセットし、１時間露光した。発光基質として、Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ（商標） Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）添付の発光基質を用いた。結果を図１０（ａ）に示す。
【０１３１】
（比較例１）
ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ（商標、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のキットに付随する試薬にて調製したプローブを用いた以外は、実施例１と同様にして評価した。結果を図１０（ｂ）に示す。
【０１３２】
（実施例２）
ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの濃度を変え、検出を行った。結果を図１１に示す。
【０１３３】
Ｚ−ＱＧ ４０％ＤＮＡ濃度 １０ｎｇ／ｕＬ、ＰｆｕＡＰ濃度 ４ｍｇ／ｍＬ以上（モル比でＺ−ＱＧ：ＰｆｕＡＰ＝１：３０以上）でラベル化したプローブにて、発色法にて０．１ｐｇの検出感度を達成した。
【０１３４】
（実施例３）
実施例１と同様にしてＺ−ＱＧ ４０％マルチラベル化核酸プローブを調製し、反応液を以下の手順で精製し、未精製のもの、１回精製したものについて、実施例１と同様にしてハイブリダイゼーション、検出を行った。結果を図１２に示す。
【０１３５】
＜精製の手順＞
ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ−４００ ＨＲ Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、２７−５１４０−０１）の下を折り、フタを開けて、カラムに添付されている２ｍＬチューブにセットして７３５×ｇで１分間遠心処理した。カラムを新しい１．５ｍＬチューブにセットし、ＭＴＧ反応液１００μＬをゲル上部に置いて７３５×ｇで４分間遠心処理した。溶出したマルチラベル化核酸プローブ溶液を４℃で保存した。核酸の溶出量はおよそ５０％、未反応のタンパク質の溶出量はおよそ１０％未満であった。
【０１３６】
＜核酸濃度の定量＞
１×ＴＥバッファ（ｐＨ８．０）にて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（タカラバイオ社製、Ｆ０５２３）を１０，０００倍に希釈した。ＰＣＲまたはＲｕｎ−ｏｆｆ転写反応により得られた核酸を精製し、０，１，３，１０ｎｇ／μＬの水溶液を１０μＬずつ調製した。この核酸を熱変性後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ溶液９９０μＬに添加して蛍光強度を測定し（励起波長／蛍光波長：４８０ｎｍ／５２０ｎｍ）、検量線を作成した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ溶液９９０μＬにプローブ精製溶液を１０μＬ添加し、蛍光を測定して検量線から濃度を算出した。タンパク質濃度はＢＣＡ法により定量した。
【０１３７】
図１２からわかるように、マルチラベル化核酸プローブをゲルろ過方式のカラムで精製することにより、バックグラウンドが低減された。
【０１３８】
（実施例４）
＜Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰの合成＞
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５０μＬ中にて、５０ｍＭ Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、５０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、２５ｍＭ Ａｃ−ＰＬＱＭＲを、４℃で１６時間反応させることによって、ＮＨＳ化ＰＬＱＭＲ（２５ｍＭ）を調製した。一方、２０ｍＭ ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）の溶液１００μＬに対して、上記で調製したＮＨＳ化ＰＬＱＭＲ溶液を１００μＬ添加し、２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルを超純水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表６に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ）によって行った。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】
Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図１３に示す。ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合（図１４参照）と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１０．９分のピークを回収してＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。その結果、図１５に示すように、１１９３．２６のピークが確認され、理論分子量と良く一致した結果が得られたため、Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰの合成が示された。
【０１４１】
＜各溶液の調製＞
表７に示す組成で、以下の溶液を調製した。
ｄＡＴＰと溶媒とを含むｄＡＴＰ含有溶液
ｄＣＴＰと溶媒とを含むｄＣＴＰ含有溶液
ｄＧＴＰと溶媒とを含むｄＧＴＰ含有溶液
ｄＴＴＰと溶媒とを含むｄＴＴＰ含有溶液
Ａｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰと溶媒とを含むＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰ含有溶液
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
＜マルチラベル化核酸プローブの調製＞
まず、マウス由来のＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）をコードする遺伝子中の約３００ｂｐをＰＣＲ増幅するプライマを設計した。次に、ＰＣＲ反応液の全ｄＴＴＰのうちの８０％をＡｃ−ＰＬＱＭＲ−ｄＵＴＰに置き換えて反応液を調製してＰＣＲ（表８参照、９４℃×２ｍｉｎ＋（９４℃×２０ｓｅｃ，５４℃×２０ｓｅｃ，７２℃×３０ｓｅｃ）×４０サイクル）を行うことによって、Ａｃ−ＰＬＱＭＲ ８０％ＤＮＡを得た。結果を図１６に示す。
【０１４４】
【表８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【化１】
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化２】
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化３】
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化４】
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項２】
請求項１に記載の核酸検出用キットであって、
前記式（１）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が、下記式（５）で示される化合物であることを特徴とする核酸検出用キット。
【化５】
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であり、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項３】
請求項２に記載の核酸検出用キットであって、
前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸検出用キットであって、
前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基は、ＦＹＰＬＱＭＲ、ＹＰＬＱＭＲ、ＰＬＱＭＲ、ＦＹＰＬＱＭＧ、ＹＰＬＱＭＧ、ＹＰＬＱＭ、ＰＬＱＭＧ、ＦＹＰＬＱＧ、ＹＰＬＱＧまたはＰＬＱＧのアミノ酸配列中に存在することを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸検出用キットであって、
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載の核酸検出用キットであって、
リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸検出用キットであって、
前記リシン（Ｌｙｓ）残基が、ＭＴＧに認識されるアミノ酸配列中に存在することを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項８】
請求項６または７に記載の核酸検出用キットであって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸検出用キットであって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸検出用キットであって、
前記Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つ、前記Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項１】
下記式（１），（２），（３）または（４）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【化１】
（式（１）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化２】
（式（２）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化３】
（式（３）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【化４】
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンを有する、直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基のうち少なくとも１つを含む置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項２】
請求項１に記載の核酸検出用キットであって、
前記式（１）で示される酵素基質修飾ヌクレオシド三リン酸が、下記式（５）で示される化合物であることを特徴とする核酸検出用キット。
【化５】
（式（５）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であり、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。）
【請求項３】
請求項２に記載の核酸検出用キットであって、
前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸検出用キットであって、
前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基は、ＦＹＰＬＱＭＲ、ＹＰＬＱＭＲ、ＰＬＱＭＲ、ＦＹＰＬＱＭＧ、ＹＰＬＱＭＧ、ＹＰＬＱＭ、ＰＬＱＭＧ、ＦＹＰＬＱＧ、ＹＰＬＱＧまたはＰＬＱＧのアミノ酸配列中に存在することを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸検出用キットであって、
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載の核酸検出用キットであって、
リシン（Ｌｙｓ）残基もしくは第一級アミンまたはグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な化合物、熱的に検出可能な化合物および電気的に検出可能な化合物のうち少なくとも１つである標識部分を含む標識化合物を含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸検出用キットであって、
前記リシン（Ｌｙｓ）残基が、ＭＴＧに認識されるアミノ酸配列中に存在することを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項８】
請求項６または７に記載の核酸検出用キットであって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸検出用キットであって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とする核酸検出用キット。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸検出用キットであって、
前記Ｂが水素原子の場合には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうち少なくとも１つ、前記Ｂがヒドロキシル基の場合には、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰのうち少なくとも１つを含むことを特徴とする核酸検出用キット。
【図１】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１１−１６９８７８（Ｐ２０１１−１６９８７８Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−４９６３１（Ｐ２０１０−４９６３１）
【出願日】平成２２年３月５日（２０１０．３．５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（独立行政法人科学技術振興機構 地域イノベーション創出総合支援事業、重点地域研究開発推進プログラム（育成研究）、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【出願人】（３９００２９７９１）日立アロカメディカル株式会社 (899)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月５日（２０１０．３．５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（独立行政法人科学技術振興機構 地域イノベーション創出総合支援事業、重点地域研究開発推進プログラム（育成研究）、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（３０４０２０２９２）国立大学法人徳島大学 (307)
【出願人】（３９００２９７９１）日立アロカメディカル株式会社 (899)
【Ｆターム（参考）】
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