核酸検出
【課題】生物学的または環境サンプル中の核酸の検出のための方法を提供する。
【解決手段】プローブが蛍光標識されていてもよい、プライマーまたはプローブとして使用するための単離ＤＮＡ配列。目的とする核酸の増幅、ｃＤＮＡへの変換、その後増幅された核酸がリアル・タイムＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)技術によってさらなる増幅のためのテンプレートとして使用される方法。この方法の使用におけるプライマーおよび診断用試験キット。
【解決手段】プローブが蛍光標識されていてもよい、プライマーまたはプローブとして使用するための単離ＤＮＡ配列。目的とする核酸の増幅、ｃＤＮＡへの変換、その後増幅された核酸がリアル・タイムＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)技術によってさらなる増幅のためのテンプレートとして使用される方法。この方法の使用におけるプライマーおよび診断用試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生物学的または環境サンプルから核酸を検出するための方法に関する。本発明は、核酸を検出するための診断用試験キット、ならびに該検出方法で使用するためのプライマーおよびプローブにも関する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
重症急性呼吸器症候群(ＳＡＲＳ)は、ヒトの典型的な肺炎の新規に同定された形態である(Drosten et al., "Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome" The New England Journal of Medicine, (2003) 348:1967-1976, ２００３年５月１５日発行)。それは、ＳＡＲＳコロナウイルスまたはUrbani株ＳＡＲＳ関連コロナウイルスと知られるコロナウイルスの新規株に起因する。そのウイルスは、エアロゾル状態によって効率よく蔓延し、対人接触感染がいわれてきた。疑わしいかまたはその可能性があるＳＡＲＳの診断は、「重症急性呼吸器症候群(ＳＡＲＳ)のサーベイランスについての症例の定義」で特定された次のＷＨＯ診断基準によってなされる(World Health Organization,２００３年４月３０日改定)。しかし、ＳＡＲＳの陽性診断は、新規コロナウイルスに対する抗体の存在の証明、または患者サンプル中のコロナウイルス核酸の存在の証明のいずれかによる病因物質の同定なしには為し得ない。疾患進行により、不可逆的肺損傷を導き、確認されたＳＡＲＳ感染患者の５-１０％の死亡率が報告されている。疾患の重症度を制限し、疾患の蔓延を制御するために、出来るだけ早く感染患者を同定することが、迅速な処置を開始するために重要である。
【０００３】
ウイルス感染を同定するために最も一般的に使用されている方法は、標準的な血清学的方法による患者の血清サンプル中の抗体の同定であって、この方法は、アガー・ゲル免疫拡散法(ＡＧＩＤ)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を包含するが、これに限定するものではない。正確で高感度の検出を可能にするに十分な濃度で抗体が産生され得るには、感染後７〜２１日かかるため、これらの方法は限定的である。
【０００４】
イン・ビトロで感染し得る細胞内でウイルスを培養することは、ウイルスを検出するための十分に確立された方法でもある。しかし、ＳＡＲＳに関連するコロナウイルスは、新規実在物であり、至適成長条件は説明されていない。さらに、アッセイ産物が完全な感染ウイルスであるので、ウイルスの成長に関して、高レベルのバイオセキュリティーが必要とされる。従って、高度な技術スタッフ、装置および施設が要求されるため、通例の診断的使用についてこの技術の適用性が制限される。さらに、ウイルスの成長は、あまりに遅いため、迅速な処置を開始するために十分な時間内に検出することができない。
【０００５】
ウイルス遺伝的材料の増幅および検出を基にした分子的方法は、多くの病原性ウイルスについて以前から説明されてきており、ＳＡＲＳコロナウイルスの検出に適用し得る。核酸増幅方法は、一般的に、迅速で特異性が高く、高感度である。
【０００６】
様々なタイプの核酸増幅プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の後のアガロースゲル電気泳動、ネスティッド ＰＣＲ、リアル・タイムTaqman（登録商標）ＰＣＲ、分子ビーコンＰＣＲ、核酸配列を基にした増幅(ＮＡＳＢＡ)、等温およびキメラプライマーにより開始される核酸増幅(ＩＣＡＮ)などを含めて、説明されてきた。
【０００７】
ＰＣＲの後のゲル電気泳動(従来のＰＣＲとして知られている)は、１９８５年に初めて記載された標準的な技術である。それ以来、その技術は通例的な実験方法となってきた。しかし、それは、比較的遅く、手間のかかる技術である。さらに、最近の開発技術と比較すると、従来のＰＣＲは感受性が低い。
【０００８】
ゲル電気泳動に続くネスティッド（Nested）ＰＣＲは、従来のＰＣＲの感度を増加させる技術である。ネスティッドＰＣＲは、特定対のＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー(外側のプライマー)を用いる特異的な遺伝子配列の第一の増幅を包含する。この増幅産物は、第二ラウンドの増幅のためのテンプレートとして使用され、そこでは別のプライマー対(内側プライマー)は、第一増幅産物内の領域から選択される。このように、第二の増幅産物は、第一の増幅産物よりも短い。この方法は、それが別の増幅ステップを包含するので、非常に骨のおれる作業である。そのため、この方法は汚染されやすい。
【０００９】
ＮＡＳＢＡは、Compton J. "Nucleic acid sequence-based amplification" (1991) Nature 350:91-92; Heim AI et al "Highly sensitive detection of gene expression of an intronless gene: amplification of mRNA, but not genomic DNA by nucleic acid sequence based amplification(NASBA)"(1998) Nucleic Acids Research 26(9):2250-2251; および Deiman B et al "Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification"(2002)Molecular Biotechnology 20:163-179に記載されている。
【００１０】
リアル・タイムＰＣＲ(全体を通してＲＴ−ＰＣＲという)といわれる高度に自動化された方法は、高特異性かつ使用し易い技術であると証明されてきたが、ネスティッドＰＣＲよりも感度が低くなることもあり得る。ＲＴ−ＰＣＲは、１つの末端では蛍光吸収成分によって標識され、もう一つの末端では蛍光放出成分によって標識された追加のＤＮＡオリゴヌクレオチド分子の使用を包含し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー間の標的遺伝子の領域とハイブリダイズする。標識分子は蛍光遺伝子プローブとして知られる。増幅プロセスは継続すると、前進性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって蛍光遺伝子プローブの置換および分解により蛍光シグナルが増加する。リアル・タイムＰＣＲは、Desjardin LE et al "Comparison of the ABI 7700 system (TaqMan) and competitive PCR for quantification of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis." (1998) J Clin Microbiol. 36(7):1964-8 および Wang T et al "mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection" (1999) Anal Biochem. 269(1):198-201に記載されている。
【００１１】
Yangらの"Clinical detection of polymerase gene of SARS-associated coronovirus" Academic J First Med (2003) 23(5): 424-427（2003年5月8日発行）は、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的プライマーを用いる逆転写酵素ＰＣＲの使用に関する。先に開示したDrostenらは、ＳＡＲＳコロナウイルスの検出のためにネスティッドＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲの独立した使用に関する。
【００１２】
従来のＰＣＲ、ネスティッドＰＲおよびＲＴ−ＰＣＲ単独では、広い範囲の患者サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための十分な精度または感度ではないともいえる。ＰＣＲによる陰性の結果は、増幅プロトコールで使用されたプライマーおよびプローブの不感受性、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染の欠如、別の感染性物質により生じた観察される疾患、偽陰性ＰＣＲ結果、またウイルスまたはその遺伝物質が存在しないか、現在の方法を用いては検出不能レベルであった時点で回収されたその試験標本、などを包含する多くのファクターがウイルス核酸検出に影響するので、必ずしも、患者がＳＡＲＳに罹っていないということを意味しない。従って、高感度、高特異性およびスピードを合わせもつ増幅技術により、ＳＡＲＳコロナウイルスの核酸の特異的部分を検出することによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶについてスクリーニングするために十分に感度がある方法を設計し、ＳＡＲＳの診断を改善することが重要である。
【００１３】
この発明が、ＳＡＲＳコロナウイルスだけの検出に限定されないで、広く核酸検出について適用し得ることは理解される。すなわち、この発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスを包含する病原体およびウイルスの多様なタイプの検出に適用し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
この発明の目的は、感染の初期段階にあるヒトを同定できるような、ＳＡＲＳコロナウイルスを包含する核酸を検出するための高感度な方法を提供することである。
【００１５】
また、この発明の目的は、核酸を検出するために、使用し易い診断用キットを設計することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の要約
一般的に、本発明は、様々な生物学的または環境サンプルから、例えばコロナウイルス核酸を抽出および検出するための方法を提供し、その方法は、次のステップ、
（Ａ）ＳＡＲＳコロナウイルスを含有すると疑われるサンプルを回収すること、
（Ｂ）回収したサンプルからリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出すること、
（Ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡ増幅技術を用いて、特異的な標的配列を増幅すること、そして
（Ｄ）ＤＮＡ増幅技術および適当な伝達系、例えば、Taqman（登録商標）プローブまたは分子ビーコンなどを包含する蛍光遺伝子プローブを用いて、標的増幅核酸産物を検出すること、
を含む。
【００１７】
さらに、本発明は、標的分子を複製するための核酸複製剤、ここで標的分子はＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列に相補的な少なくとも一部分を含有する核酸配列である;および複製された標的分子を増幅し、増幅中に複製産物を検出するための核酸複製剤および核酸検出剤、を包含するＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキットを提供する。これらの剤は、複製産物を増幅し得るプライマー対および増幅産物に相補的である蛍光遺伝子プローブを包含する。
【００１８】
本発明の第一態様に従って、配列番号１〜２７のいずれかに記載の単離ＤＮＡ配列が提供される。
【００１９】
第二態様に従って、ＤＮＡ増幅の際にプライマーまたは蛍光標識プローブとして使用するための配列番号１〜２７のいずれかに記載のものを含む単離ＤＮＡ配列が提供される。プライマーまたはプローブは、配列番号１〜２７のいずれかを含み得る。
【００２０】
本発明の第三態様に従って、核酸単離に続くＤＮＡ増幅によって、その後のリアル・タイム ＰＣＲのステップを含む核酸検出方法が提供される。好ましくは、ＤＮＡ増幅はＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたは他の適当な核酸増幅技術を含む。
最も好ましくは、該方法は下記ステップ：
ｉ）生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ｉｉ）核酸を増幅すること、所望によりＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたは他の核酸増幅技術を使用すること、そして
ｉｉｉ）リアル・タイムＰＣＲを用いて、ステップ(ｉｉ)で産生した核酸を増幅および検出すること、
を含む。
【００２１】
より好ましくは、ステップ(ｉｉ)は、ＰＣＲを用いて核酸を増幅することを含む。ステップ(ｉｉ)は、前増幅ステップとしても知られる。この増幅ステップは、ＤＮＡ増幅およびＰＣＲによる検出を含み得る。あるいは、ＮＡＳＢを用いてもよい。ステップ(ｉｉ)の別の適当な核酸増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に続くアガロースゲル電気泳動、ネスティドＰＣＲ、リアル・タイム Taqman（登録商標）ＰＣＲ、分子ビーコンＰＣＲ、等温でキメラプライマーにより開始される核酸増幅(ＩＣＡＮ)から選択され得る。
【００２２】
本発明の方法は、この新規の核酸増幅技術の組合せによって達成される。前増幅ステップに続くリアル・タイムＰＣＲのこの組合せは、核酸を検出するための高感度な方法を有利に提供する。これは、ウイルスまたは他の病原体により感染した初期段階にあるヒトを容易に同定することを可能にする。
【００２３】
さらに、本発明の別の態様は、核酸を検出する方法における使用のための配列番号１〜２７を含む単離ＤＮＡ配列に関し、核酸の検出方法における使用のための組成物の製造において、次のステップ：
ｉ）生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ｉｉ）核酸を増幅すること、所望により、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そして
ｉｉｉ）リアル・タイムＰＣＲを用いて、ステップ(ｉｉ)から核酸を増幅および検出すること、
を含む配列番号１〜２７を含む単離ＤＮＡ配列の使用に関する。
【００２４】
ステップ（ｉｉ)は、前増幅ステップとして知られる。前増幅は、ＰＣＲまたはＮＡＳＢＡによって実施され得る。この前増幅ステップのために使用されるプライマーは、どの方法を用いるかによって異なる。
【００２５】
検出されるべき核酸は、ＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡまたはｃＤＮＡから誘導されるのが好ましい。
【００２６】
本発明は、一般的に、生物学的または環境サンプルにおけるＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための診断用試験キットに関し、下記のステップ：
(ｉ）サンプル由来のＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡを単離するための単離用剤、
(ｉｉ）標的分子がＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列に相補的な核酸配列を包含する、標的分子を複製するための核酸複製剤、および
(ｉｉｉ）標的分子を検出するための核酸検出剤、ここで核酸検出剤が検出分子を包含する、
を含む。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１〜２７と一致する２以上の単離ＤＮＡ配列を含むＳＡＲＳ診断用試験キットに関する。
【００２８】
好ましくは、ＳＡＲＳ診断用試験キットは、配列番号１、２、３、４または５、および６、７、８、９または１０のいずれか一つに一致する前増幅プライマーを含む。プライマー対のうち１つのプライマーは、配列番号１、２、３、４または５から選択され、もう一つのプライマーは配列番号６、７、８、９または１０から選択される。配列番号１〜５は、ＰＣＲのフォワードプライマーに対応し、配列番号６〜１０は、ＰＣＲリバースプライマーと一致する。一方、前増幅プライマーは、配列番号２６および２７と一致する。配列番号１、２、３、４または５、および６、７、８、９または１０は前増幅ＰＣＲにおいて使用され得るし、配列番号２６および２７は、前増幅ＮＡＳＢＡにおいて使用され得る。
【００２９】
さらに、ＳＡＲＳ診断用試験キットは、配列番号１１、１２、１３、１４または１５、および１６、１７、１８、１９または２０のいずれか一つと一致するリアル・タイムＰＣＲプライマーも含む。ＲＴ−ＰＣＲプライマー対の１つのプライマーは、配列番号１１、１２、１３、１４または１５から選択され、もう一つのプライマーは、配列番号１６、１７、１８、１９または２０から選択される。さらに、ＳＡＲＳ診断用試験キットは、配列番号２１、２２、２３、２４または２５のいずれか一つと一致するリアル・タイムＰＣＲプローブを包含してもよい。これらのプライマーおよびプローブは、リアル・タイムＰＣＲで使用される。配列番号１１〜１５は、リアル・タイムＰＣＲフォワードプライマーと一致し、配列番号１６〜２０は、リアル・タイムＰＣＲリバースプライマーと一致する。配列番号２０〜２５は、リアル・タイムＰＣＲプローブと一致する。
【００３０】
前増幅ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＴにおいて使用されたプライマーは、必要であれば、互換的に使用され得る。
【００３１】
一方、診断用試験キットは、次のプライマー対；ａ）配列番号１、２または３、および６、７または８；ｂ）配列番号１１、１２または１３、および１６、１７または１８、および配列番号２１、２２または２３、から選択されるプローブを含む。
【００３２】
好ましい実施態様として、診断用試験キットは、下記プライマー対ＡおよびＢ；およびＣおよびＤ；およびプローブＥを含む：
Ａ）配列番号１、２、３、４または５のいずれかから選択されたプライマー、
Ｂ）配列番号６、７、８、９または１０のいずれかから選択されたプライマー、
Ｃ）配列番号１１、１２、１３、１４または１５のいずれかから選択されたプライマー、
Ｄ）配列番号１６、１７、１８、１９または２０のいずれかから選択されたプライマー、および
Ｅ）配列番号２０〜２５のいずれかから選択されたプローブ。
この診断用試験キットは、前増幅ステップがＰＣＲを包含する場合に使用され得る。さらに、プライマー対ＡおよびＢ；またはＣおよびＤは、従来のＰＣＲおよび/またはＲＴ−ＰＣＲのいずれかを互換的に使用され得る。
【００３３】
別の好ましい実施態様として、診断用試験キットは、下記プライマー対Ａ；およびＣおよびＤ；およびプローブＥを含む：
Ａ）配列番号２６または２７から選択されたプライマー、
Ｃ）配列番号１１、１２、１３、１４または１５から選択されたプライマー、
Ｄ）配列番号１６、１７、１８、１９または２０から選択されたプライマー、
Ｅ）配列番号２０〜２５のいずれかから選択されたプローブ。
この診断用試験キットは、前増幅ステップがＮＡＳＢＡを包含する場合に使用され得る。 配列番号２６および２７は、ＳＡＲＳ ＮＡＳＢＡ Ｔ７プライマーおよびＳＡＲＳ ＮＡＳＢＡ 電気化学発光(ＥＣＬ)プライマーに各々一致する。
本発明は、図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、この発明の好ましい実施態様のＳＡＲＳコロナウイルスの検出の全方法に関するフロー・チャートを示す。
【図２】図２は、ＳＡＲＳコロナウイルスの単離方法およびこの発明の好ましい実施態様による相補的なＤＮＡ(ｃＤＮＡ)へのその変換を示す。
【図３】図３は、本発明の好ましい実施態様のプローブＥによって影響される検出および定量化による、２つのＤＮＡ分子、プライマーＡおよびＢによるＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡ分子の一部分の増幅、および２つのＤＮＡ分子、プライマーＣおよびＤによるさらなる増幅のためのテンプレートとしての増幅産物の連続使用を示す。
【図４−１】図４は、配列番号１〜２７と一致する核酸配列を示す。
【図４−２】図４は、配列番号１〜２７と一致する核酸配列を示す。
【図５】図５から８は、増強され、かつ標準的なリアル・タイム増幅の比較を示す。各サンプルについて、△Ｒｎ(レポーター染料放出と停止染料放出の定量の比）が、サイクル数に関して表示される。蛍光強度は、インプット標的ＤＮＡの量と直接関連する。蛍光の検出レベルに達するようなサイクルが少なければ少ないほど、開始コピー数は多い。図５は、増強されたリアル・タイムＰＣＲを用いて分析された臨床サンプルを示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ 陽性サンプルは、矢印で示したとおり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ 陰性サンプルとは明らかに異なっている。
【図６】図５から８は、増強され、かつ標準的なリアル・タイム増幅の比較を示す。各サンプルについて、△Ｒｎ(レポーター染料放出と停止染料放出の定量の比）が、サイクル数に関して表示される。蛍光強度は、インプット標的ＤＮＡの量と直接関連する。蛍光の検出レベルに達するようなサイクルが少なければ少ないほど、開始コピー数は多い。図６は、標準的なリアル・タイムＰＣＲを用いるパネルＡに示した同一の臨床サンプルを示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、陽性および陰性サンプルは、容易に区別されない。
【図７】図５から８は、増強され、かつ標準的なリアル・タイム増幅の比較を示す。各サンプルについて、△Ｒｎ(レポーター染料放出と停止染料放出の定量の比）が、サイクル数に関して表示される。蛍光強度は、インプット標的ＤＮＡの量と直接関連する。蛍光の検出レベルに達するようなサイクルが少なければ少ないほど、開始コピー数は多い。図７は、増強されたリアル・タイムＰＣＲを用いるＳＡＲＳ−ＣｏＶ (２ x １０２.５ ＴＣＩＤ５０/ml [上限トレース]から２ x １０−１０.５ ＴＣＩＤ５０/ml)の連続１０倍希釈を示す。低いトレースは、リバース転写陰性コントロールおよびTaqMan(登録商標) 陰性コントロールを示す。
【図８】図５から８は、増強され、かつ標準的なリアル・タイム増幅の比較を示す。各サンプルについて、△Ｒｎ(レポーター染料放出と停止染料放出の定量の比）が、サイクル数に関して表示される。蛍光強度は、インプット標的ＤＮＡの量と直接関連する。蛍光の検出レベルに達するようなサイクルが少なければ少ないほど、開始コピー数は多い。図８は、標準的なリアル・タイムＰＣＲを用いるＳＡＲＳ−ＣｏＶ (２ x １０２.５ ＴＣＩＤ５０/ml [上限トレース] から２ x １０−１０.５ ＴＣＩＤ５０/ml)の連続１０倍希釈を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
急速に、核酸増幅は、患者組織における感染生物体の存在を直接示すことによって多くの疾患の診断を確認するための標準的な臨床検査方法となってきた。該方法は、それらの特異性および感度により、迅速に感染を確認でき、抗ウイルス治療の効果をモニターされるようになったので、ＳＡＲＳの発生中に不可欠なものとなった。ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する宿主抗体の存在を証明することによるＳＡＲＳ診断アッセイは、ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光などを用いて開発されてきた。しかし、そのような試験は、核酸方法の感度を欠くことが多く、抗体が検出レベルに達するまでに７−２１日を要するので、新たに感染した患者を検出できない。
【００３６】
本発明は、核酸、例えば、生物的および環境サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡまたはｃＤＮＡ、を検出するための高感度な方法を提供する。かかる生物サンプルは、血液、痰、血清、血漿、鼻喉頭上部スワブ、口腔咽頭スワブ、尿、便、その他体液、および環境サンプル、例えば、水、汚水、廃棄物などを包含する。
【００３７】
核酸検出のための本発明の方法は、前増幅ステップ後のリアル・タイムＰＣＲを包含する。Lauら " A real-time PCR for SARS-corona virus incorporating target gene pre-amplification " Biochemical and Biophysical Research Communication (2003) 312:1290-1296の内容目録を、出典明示により本明細書の一部とする。ＰＣＲおよびリアル・タイムＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)は、当業者には既知の技術である。蛍光定量化を用いるリアル・タイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＤＮＡの検出について迅速で高感度かつ高特異的な方法であり、ＳＡＲＳコロナウイルス核酸の検出に適用され得る。この技術単独についての結果は、３時間程度で得ることができる。ＲＴ−ＰＣＲは、蛍光性の定量を用い得るが、蛍光定量のみに限定しない。ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、好ましくは片方では蛍光吸収成分により標識し、そしてもう片方で蛍光放出成分により標識された別のＤＮＡオリゴヌクレオチド分子(本明細書中に示されるように、プローブとして)の使用を包含する。さらなるＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー間の目的とする核酸の領域とハイブリダイズする。そのため、シグナル発生物は、適当な検出器で検出でき、定量化できる光子を放出するように刺激され得る蛍光遺伝子分子、分子ビーコンまたは他の分子であり得る。
【００３８】
増幅の開始ラウンドの産物が、その後の増幅のためのテンプレートとして使用されるネスティッドＰＣＲ方法は、多くの標的遺伝子の検出の適合度および感度を増加させるとよく知られている。かかる前増幅方法は、従来のＰＣＲ技術以上にそれらの一般に秀でた感度のために、様々なリアル・タイムＰＣＲの適用には不必要であると考えられている。しかしながら、目的の標的遺伝子が少なく、および/または他の汚染物質がバックグラウンド中に存在する状況では、驚くべき事に、本発明による前増幅が、検出限界を改善するのに有利であることがわかった。
【００３９】
本発明の方法、すなわち前増幅後のリアル・タイムＰＣＲは、"増強されたリアル・タイムＰＣＲ（Enhanced Real-time PCR）"として本明細書中に示す。前増幅は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたは他の核酸増幅技術によっておこり得る。このＥＲＴ技術の１つの利点は、驚くべきことに、検出限界は、通常のTaqMan(登録商標)リアル・タイム・ＰＣＲの１００倍以上であるＴＣＩＤ５０(２×１０-１１.５)までであり、従来のＰＣＲの１０８倍以上であることが見出された。さらなる利点は、この増強されたリアル・タイムＰＣＲ検出についてのターンアラウンド時間が、約５.５時間要することである。全体の検出方法の時間をさらに短縮し、試験の感度を増加させるために、前増幅のためにＮＡＳＢＡ技術とリアル・タイムＰＣＲとを組み合わせる方法が使用され得る。前増幅ステップがＮＡＳＢＡを含有する場合に、有利なことには、ターンアラウンド時間が４時間の範囲内であることがわかった。すなわち、この組合せられた前増幅/ＲＴ−ＰＣＲ技術についての検出限界および時間に関する利点は、双方予想外のことであり、また有利なものであった。
【００４０】
ＥＲＴは、陽性と陰性サンプルとを明確な手法で識別することを可能にし得る。これは、いかなる誤診断または解釈も許容してはならない臨床診断において特に重要である。
【００４１】
同一サンプルを標準的なリアル・タイムＰＣＲによって分析する時に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性および陰性増幅曲線が、別のものと近接して重複する傾向がある場合に(図６)、陽性および陰性シグナル間の判別はより不明瞭である。そのため、リアル・タイムＰＣＲの結果を解釈する際に、経験が浅い臨床医は、ＥＲＴにより得られた増強された結果を用いて、陽性と陰性シグナルとの違いを容易に区別することが可能である。これは、従来のリアル・タイムＰＣＲを超える本発明の非常に重要な利点である。
【００４２】
増強されたリアル・タイムＰＣＲの増強された感度により、単なる臨床診断以上に多くの分野への適用を可能とする。媒介物および汚水がＳＡＲＳ発生と関連すると考えられるなら、核酸検出方法を環境サンプルに適用するにふさわしいことは明らかである。共有面積の表面(エレベーター、待合所など)をＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸のエビデンスについて試験することは、疾患の伝搬をモニターする機会および洗浄/滅菌方法の効力をモニターする機会を提供する。
【００４３】
ＳＡＲＳの徴候および症状は、特に高リスク患者、例えば発熱しない老人では非常に変化し易いので、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を決定するための高感度な方法は、医療環境におけるウイルスの伝搬を制限するのに非常に有用である。早期検出は、地域発生を含めて、より迅速に実行されるべき緊急プランを可能にし、社会的関心そして潜在的な経済効果を制限して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの国際的蔓延を防止することを可能にする。
この発明の好ましい実施態様は、図を参考にして説明される。表１は、図１〜３に使用される符号の説明を示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
生物サンプル、例えば鼻咽頭スワブ（anoropharyngeal swab）中のＳＡＲＳコロナウイルス濃度は、ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡの存在の検出を生物サンプルに対して直接実施できないような非常に低い濃度かもしれない。検出目的のための十分な量まで、ウイルスＲＮＡ分子の数を増加させるために、適当な増幅技術が必要とされる。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)は、ＤＮＡ増幅についての特別な用途をもった柔軟な技術であると知られている。ＲＮＡのＤＮＡへの変換は、ＰＣＲプロセスを、ＲＮＡゲノムを有する病原体、例えばＳＡＲＳコロナウイルスをカバーするよう拡張することを可能にする。次いで、増幅されたＤＮＡ分子は、適当な技術のいずれによって検出してもよい
【００４６】
ＳＡＲＳコロナウイルスは、リボ核酸の１本鎖の形態(ＲＮＡ１０)でその遺伝物質を含有する。該ウイルスＲＮＡは、その再生に必要な遺伝子を含有し、その主な遺伝子の１つはポリメラーゼとよばれている。この遺伝子は、分子の５’末端から数えて、約２８００個のヌクレオチド長である。
【００４７】
図１は、検出キットによってＳＡＲＳコロナウイルスの検出のための全体的な方法を示す。図１に示したように、ＲＮＡの１本鎖形態である標的ＳＡＲＳコロナウイルスのウイルス核酸分子は、最初に生物サンプルから抽出される。不都合のない生物サンプル型は、血液、血清/血漿、末梢血液単核細胞/末梢血液リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ)、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚創傷スワブ、髄液、頸管塗抹、膿サンプル、食品基盤（food matrices）および脳、脾臓および肝臓を含む身体様々な部分からの組織を包含し得る。列挙されていない他のサンプルを用いてもよい。単離用剤は、この発明の検出キットの核酸抽出方法を達成する。
【００４８】
標的ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡ分子（１０）が生物サンプルから抽出された後に、サンプル中のＲＮＡ分子の量は検出されるべき十分な量では存在しないかもしれない。そのため、ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡ分子の一部が、適当な増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)またはＮＡＳＢＡまたはＲＴ−ＰＣＲによって、標的核酸分子に複製される。次いで、標的核酸分子は、適当な方法によって検出されうる。ＲＴ−ＰＣＲに先立って、前増幅ステップを使用することは、驚くべきことに、従来のＰＣＲ技術単独によって提供される以上に、より高い検出レベル、改善された感度およびより短い時間を含めて、ある範囲の価値を提供する。
【００４９】
次いで単離および増幅方法の詳細を説明する。
核酸単離:
ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡ分子（１０）は、適当な単離用剤を生物サンプルに適用することによって生物サンプルから単離され得る。好ましくは、溶菌剤が、単離用剤の前に用いられ得る。溶菌剤、例えば溶菌緩衝液は、タンパク質および脂質を溶解すること、そしてこれらの材料がより簡単にサンプルから除去され得るように生物サンプル中のタンパク質を変性させることに関与する。さらに、溶菌剤は、長期貯蔵目的のために、ＲＮＡ分子を安定化するために緩衝液として働き得る。図２に示したとおり、ＲＮＡ分子は、室温で４８時間まで、溶菌緩衝液中で安定であり得るし、−７０℃で無期限に貯蔵され得る。そのように行う利点は、かかるプロセスを行うのに適当でない試料採取場所で、分析を行う必要がないことである。
【００５０】
適当な溶菌緩衝液の例は、５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩およびＴｒｉｓ／ＨＣｌを包含し得る。かかる溶菌緩衝液は、当業者にはよく知られている。タンパク質および脂質の溶解、タンパク質の変性、ＲＮＡ分子の安定化という目的をなお達成し得る様々な組成物を有する溶菌剤は、この発明の検出キットにおいて利用され得る。
【００５１】
溶菌剤を生物サンプルに適用した後の次のステップは、単離用剤の使用によるサンプル由来の核酸分子の単離である。図２は、検出キットにおける全体的な単離方法を説明するものである。溶菌剤を生物サンプルに適用した後、核酸と共に他の望ましくない成分は、溶液形態にある。次いで、この溶液を、核酸に対して高親和性を有する小さなクロマトグラフィーカラム（１２）に供する。非核酸成分を、洗浄によりカラムから除去し得る。次いで、核酸を、適当な溶離剤を用いてカラムから特異的に溶出し得る。ここで説明した核酸精製方法は、当業者には既知である。
【００５２】
サンプル中に含まれる核酸が単離された後に、必要であれば、その後ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡ分子が、その後、逆転写酵素の使用により相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)(１６)コピーへと変換されるように、増幅剤が核酸の混合物(１４)に用いられてもよい。この方法は、当業者には既知である。ｃＤＮＡへの変換は、ある特定の状況にのみ必要とされる。すなわち、ＲＮＡまたはｃＤＮＡが、前増幅に使用される方法によって、次のステップに対するテンプレートとなり得る。
【００５３】
前増幅ステップ：
ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの一部が、いわゆる前増幅ステップにおいて、例えば、ＰＣＲ技術またはＮＡＳＢＡまたはその他の適当な核酸増幅技術によって検出目的のために複製される。増幅中に、ｃＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡの両方が合成される。
【００５４】
ＮＡＳＢＡ(核酸配列を基にした増幅)は、核酸の増幅のための連続的な、等温の、酵素を基にした方法である。該技術は、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ-Ｈ、ＲＮＡポリメラーゼおよび２つの特異的に設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いる。ＮＡＳＢＡは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する必要がないので、ＲＮＡに対して直接機能し得る。配列番号２６および２７は、ＮＡＳＢＡ前増幅ステップにおいてプライマーとして使用され得る。
【００５５】
一方、従来のＰＣＲまたはその他の核酸増幅技術もまた、この前増幅ステップにおいて使用され得る。配列番号１〜１０は、前増幅ＰＣＲステップにおいてプライマーとして使用され得る。一方、配列番号１１〜２０は、この前増幅ＰＣＲステップについてはプライマーとして使用され得る。ＰＣＲのために、ＳＡＲＳ ＲＮＡは、まずｃＤＮＡに変換され、次いでこれを前増幅ＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。
【００５６】
ＰＣＲによる前増幅ステップ：
図３に示したように、増幅プロセスは、９５℃に加熱することによって１本鎖形態となっている標的ＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡ(１６）に対してプライマーＡ（１８）およびＢ（２０）をアニーリングして開始される。該プライマーＡおよびＢは、それらが標的ｃＤＮＡ分子に結合し得るように設計される。結合の正確な位置は、試験したウイルスの株に依存する。結合部位は、特定の期間の後に変化し得る。プライマーＡおよびＢの重要な技術的特徴は、それらが各々ＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡの一部に結合し得るままであることである。
【００５７】
従って、プライマーＡおよびＢは、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡに対してＤＮＡ配列相補性をコードする結合配列を包含する。この発明の目的のために、プライマーＡがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡに結合するための適当な領域は、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子ヌクレオチド１８３１９から１８３３８の間の領域であり、それは結合機能について最小数のヌクレオチドを含有することが見出された。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９,GenBank Accession number AY278491である。従って、プライマーＡの結合配列は、好ましくは、図４で配列番号１に記載されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８３１９から１８３３８の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含する。配列番号１は、５’−３’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。結果として、ウイルス遺伝子に関して結合の方向は、"バック"から"フロント"である。
【００５８】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８３６３から１８３８２(配列番号２、図４)、またはヌクレオチド１８４０４から１８３８６(配列番号３、図４)は、プライマーＡにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号４または５が、プライマーＡにおいて結合目的のために使用され得る。
【００５９】
この発明の目的のために、プライマーＢをＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡに結合するために適当な領域が、結合機能について最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１５７から１８１７９の間の領域であることが見出された。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９,GenBank Accession number AY278491である。従って、プライマーＢの結合配列は、好ましくは、図４において配列番号６に記載のＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１５７から１８１７９の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含する。配列番号６が、５’−３’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。
【００６０】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１２５から１８１４４(配列番号７、図４)またはヌクレオチド１８１０３から１８１２２(配列番号８、図４)が、プライマーＢにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号９または１０は、プライマーＢにおいて結合目的のために使用され得る。
【００６１】
プライマーＡおよびＢがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡに結合した後に、プライマーＡおよびＢが、プライマーＡおよびＢの３’末端で適当なヌクレオチドの存在下で、適当なポリメラーゼ、例えばTaqＤＮＡポリメラーゼの作用を介して伸張される。こうして、一部のＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡに相補的である下記配列(ａ)ＤＮＡ配列を包含する伸張されたプライマーＡ(２２)およびＢ(２４)が、産生される。
【００６２】
適当な増幅プログラムの適用によって、ＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ産物(２６)の過剰量に変換され得る。適当な増幅プログラムは下記である：
【表２】
【００６３】
ＮＡＳＢＡによる前増幅：
一方、前増幅は、核酸の増幅のために連続した、等温の、酵素を基にした方法であるＮＡＳＢＡ(核酸配列を基にした増幅)によって生じさせ得る。該技術は、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ-Ｈ、ＲＮＡポリメラーゼおよび２つの特別に設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いる。増幅中、ｃＤＮＡおよび１本鎖ＲＮＡの両方が合成される。そうして、TaqManリアル・タイムＰＣＲは、ＮＡＳＢＡ産物中のｃＤＮＡの存在と共に行われうる。ＲＮＡは、ＮＡＳＢＡについてのテンプレートとして作用できる、そのため、この状況ではＳＡＲＳ ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する必要はない。
【００６４】
ＮＡＳＢＡを実行するための適当なプライマーは、ＳＡＲＳ ＮＡＳＢＡＴ７プライマーおよびＳＡＲＳ ＮＡＳＢＡ ＥＣＬプライマー各々に対応する配列番号２６および２７を包含する。これらのＮＡＳＢＡプライマーは、前増幅ステップでＰＣＲプライマー配列番号１〜１０の代わりに使用され得る。
【００６５】
リアル・タイムＰＣＲ：
検出方法の感度を高めるために、前増幅ステップ、すなわちＰＣＲ反応またはＮＡＳＢＡの産物は、別の増幅方法、すなわちＲＴ−ＰＣＲ 方法において使用される。必要なら、プライマー配列番号１〜１０を代わりに使用してもよいが、配列番号１１〜２０は、ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのプライマーとして使用され得る。配列番号２１〜２５は、ＲＴ−ＰＣＲにおけるプローブとして使用される。
【００６６】
検出目的を達成するために、前増幅ステップ、例えばＰＣＲまたはＮＡＳＢＡの増幅された２本鎖ＤＮＡ産物（２６）は、ＲＴ−ＰＣＲを利用するさらなる増幅方法、好ましくは、TaqMan(登録商標)定量化リアル・タイムＰＣＲに対するテンプレートとして使用され得る。別の増幅のためのテンプレートとして使用され得る前に、複製されたＤＮＡは、後続の増幅方法の効率を最高にするために、適当な液体で最初に希釈しなければならない。複製したＤＮＡ分子のための適当な希釈剤は、ヌクレアーゼ不含水または緩衝液を包含する。ＲＴ−ＰＣＲ方法のための適当な増幅プログラムは下記である：
【表３】
【００６７】
増幅の程度は、適当な装置、例えばＡＢＩ Prism ７７００遺伝子検出システム(Applied Biosystems) において、自動的にモニターされ得る。
【００６８】
ＲＴ−ＰＣＲによる増幅には、２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー(プライマーＣ(２８)およびプライマーＤ(３０)および蛍光遺伝子プローブ(Ｅ、３２)が必要である。
【００６９】
この発明の目的のために、プライマーＣがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡ増幅産物に結合するための適切な領域は、結合機能について最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２６４から１８２４５の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９,GenBank Accession number AY278491である。従って、プライマーＣの結合配列は、好ましくは、図４の配列番号１１に記載されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２６４から１８２４５の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含する。配列番号１１は、５’−３’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。結果として、ウイルス遺伝子に関して結合の方向は、"バック"から"フロント"である。
【００７０】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２９５から１８３１４(配列番号１２、図４)、またはヌクレオチド１８３２２から１８３０４ (配列番号１３、図４)は、プライマーＣにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号１４または１５が、プライマーＣにおいて結合目的のために使用され得る。
【００７１】
この発明の目的のために、プライマーＤがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡ増幅産物に結合するための適当な領域は、結合機能のための最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１９３から１８２１１の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９，GenBank Accession number AY278491である。従って、プライマーＤの結合配列は、図４で配列番号１６に記載されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１９３から１８２１１の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含するのが好ましい。配列番号１６は、５’−３’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。
【００７２】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２１９から１８３３６ (配列番号１７、図４)、またはヌクレオチド１８２０５から１８２２０ (配列番号１８、図４)は、プライマーＤにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号１９または２０が、プライマーＤにおいて結合目的のために使用され得る。
【００７３】
この発明の目的のために、プライマーＥがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡ増幅産物に結合するための適当な領域は、結合機能のための最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２１７から１８２３４の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９，GenBank Accession number AY278491である。従って、プローブＥの結合配列は、図４で配列番号２１に記載されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２１７から１８２３４の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含するのが好ましい。
【００７４】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２４１から１８２６０ (配列番号２２、図４)、またはヌクレオチド１８２２８から１８２４６ (配列番号２３、図４)は、プローブＥにおいて結合目的のために使用される。あるいは、配列番号２４または２５が、プローブＥにおいて結合目的のために使用され得る。
【００７５】
プライマーＣおよびＤが、２本鎖産物(３４)を形成するために、適当な酵素、例えばTaqＤＮＡポリメラーゼおよび追加のヌクレオチドの作用を介して、３’末端から伸張される。増幅中に、プローブＥは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ作用により置換され、減成される。これは、増幅の程度、すなわち増幅産物の濃度に相関し得る蛍光シグナルの増加を生じる。このように、ＲＴ−ＰＣＲ増幅方法の産物は、下記ＤＮＡ配列を各々含有する大量の標的ＤＮＡ分子である：
(ａ）元々のＳＡＲＳコロナウイルスの一部分に相補的なＤＮＡ配列。
【００７６】
TaqMan(登録商標)リアル・タイム プローブの配列は、増幅されたＤＮＡ産物のどのような領域にも相補的であり、その末端がプライマーＣおよびＤによって定義され得る。しかし、これは増幅反応の発生を防止するため、該プローブ配列はプライマーＣおよびＤのものと重複し得ない。
【００７７】
増強されたリアル・タイムＰＣＲ
前増幅およびリアル・タイムＰＣＲ技術を組み合わせたこの技術は、"増強されたリアル・タイムＰＣＲ"(ＥＲＴ)として示される。図３は、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲの組合せによって、ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡの増幅のための概略図を示す。
【００７８】
この新規アッセイの目立った態様は、ＲＴ−ＰＣＲの第二回目のラウンドのテンプレートとして、前増幅ステップ、例えば従来のＰＣＲまたはＮＡＳＢＡの開始ラウンドいずれかの増幅産物の使用である。この組合せ技術は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ検出の感度を増加させる。所望により、同一プライマーは、従来のＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ段階による開始前増幅のために使用され得る。この追加の前増幅ステップは、臨床サンプル中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの検出の感度を改善する。
【００７９】
表２は、列挙したプライマー配列が、CUHK AG03 AY 345988 GenBank配列を基にしたＳＡＲＳ配列にどのように対応するかを示す。
【表４】
配列番号４、９、１４、１９、２４は、ＳＡＲＳヌクレオカプシドタンパク質(ＮＰ)遺伝子から得られる、配列番号５、１０、１５、２０および２５は、ＳＡＲＳポリメラーゼ（Ｐｏｌ）遺伝子から得られる。
【００８０】
さらに、本発明は、生物学的または環境サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスの検出するためのキット製造において、第一および第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子の使用に関し、ここで、該ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ分子は単離用剤によって生物学的または環境サンプルから単離される；標的分子は、第一および第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子を包含する核酸複製剤によって複製され、該標的分子は、ＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列に相補的な核酸配列と検出分子に結合するための核酸配列を包含し、該標的分子は核酸検出剤によって検出され、該核酸検出剤は検出分子を包含する。
【００８１】
ＲＮＡまたは他の核酸であり得るが、好ましくは、標的分子はｃＤＮＡ分子である。第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子は、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子が酵素およびＤＮＡヌクレオチドの存在下で伸張し、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子がＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のｃＤＮＡ配列と結合する場合にＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列に対して相補的なＤＮＡ配列を包含しているＤＮＡ配列を生成するように、ＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列と結合するためのＤＮＡ配列を含んでいる。
【００８２】
より好ましくは、第一のＤＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４または５に記載のＤＮＡ配列対の一つ、配列番号６、７、８、９または１０に記載のＤＮＡ配列対のいずれか一つをコードし得る。一方、第一のＤＮＡ配列は、配列番号２６および２７に記載のＤＮＡ配列対をコードし得る。
【００８３】
さらに、核酸複製剤は、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を包含するＤＮＡに結合する場合、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を生成するために、酵素およびＤＮＡヌクレオチドの存在下で伸張するように、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を包含する第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子を包含し得る。より好ましくは、ＤＮＡ配列は、配列番号１１、１２、１３、１４または１５に記載のＤＮＡ配列対のいずれか一つを、配列番号１６、１７、１８、１９または２０に記載のＤＮＡ配列対のいずれか一つと組み合わせて、コードする。複製されたＤＮＡ産物は、さらに増幅する前に希釈され得る。
【００８４】
検出分子は、標的分子に結合するための、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列;およびシグナル発生物を包含し得る。
【００８５】
シグナル発生物は、適当な検出器において検出および定量し得る光子を放出するように刺激し得る次のうちの一つを含みうる：蛍光遺伝子分子、分子ビーコン、その他の分子。好ましくは、検出分子のＤＮＡ配列は、配列番号２０から２５に記載のＤＮＡ配列対のいずれか一つをコードする。
【００８６】
本発明は、下記の非限定的な実施例で説明される。本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更および修飾が下記実施例および方法に適用され得ることに注目すべきである。
【実施例】
【００８７】
実施例
下記実施例で使用した成分および遺伝子プロトコールを、下記に説明する：
サンプル
核酸を単離するために使用したサンプルは、ＳＡＲＳ患者から得たもので、中国の北京にある病院から提供された。
ボックスＡ(核酸単離）
Qiagen RNeasy（登録商標）Mini Kit 核酸単離キット
ボックスＢ(核酸増幅)
Mastermix (0.5 ml)(Eurogentecから購入)
dUTP (0.2 mM dATP、dCTP、dGTP および 0.4 mM dUTP)を有するdNTPs、HotStart TaqＤＮＡポリメラーゼ、ＭgＣl２、ウラシル-Ｎ-グリコシラーゼ(ＵＮＧ)含有物および不動対照（Passive Reference）。
【００８８】
ＳＡＲＳプライマー(２０μｌ)
ＳＡＲＳに関連のあるコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子領域に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド、かつ配列番号１〜２０および２６および２７の包含物。
【００８９】
ＳＡＲＳプローブ(１０μｌ)
ＳＡＲＳと関連があるコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子の領域に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、蛍光放出標識と蛍光消光分子の両方で標識され、配列番号２１〜２５を包含するものである。
０.２ mMの各ＳＡＲＳプライマー＋０.２４ mM TaqMan ＳＡＲＳプローブを、ユニバーサル・マスターミックスに添加した。
【００９０】
ＳＡＲＳ陽性コントロール(１０ μｌ)
ＳＡＲＳに関連するコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子の一部分を含有する、高精製度かつ非感染プラスミド。
【００９１】
試薬調整のためのプロトコール
ボックスＡ(核酸単離)
要求されているように、RNeasy Mini-カラム(サンプルあたり１つ)の十分な数を調製した。ＲＬＴ緩衝液(サンプルあたり0.4 ml)、RW1 緩衝液 (サンプルあたり0.7 ml)およびＲＰＥ緩衝液(サンプルあたり0.5 ml)(全てはRNeasy キットにおいて提供される)を要求されているように調製し、室温にゆっくりと温めた。７０％のエタノール(サンプルあたり0.4 ml)およびヌクレアーゼ不含水(サンプルあたり５０μ)を、要求されているように、調製し、室温までゆっくりと温めた。
【００９２】
ボックスＢ(核酸増幅)
Mastermix、ＳＡＲＳプライマー、ＳＡＲＳプローブ、精製した核酸テンプレート(サンプル)およびヌクレアーゼ不含水を、要求されているように、調製し、室温までゆっくりと温めた。
【００９３】
核酸抽出プロトコール(Qiagen RNeasy（登録商標）Mini Kit)
１．サンプル（0.4 ml）およびＲＬＴ緩衝液（0.4 ml）を一緒に混合した。
２．７０％エタノール（0.4 ml）をチューブに添加した。
３．溶液混合物（0.6 ml）を、RNeasy カラムに添加した。該チューブをゆっくりと締めて、１５秒、約10,000xgで遠心分離した。洗液（flow-through）を、回収チューブ（2 ml）に取った。ステップ３を繰り返した。
４．ＲＷ１緩衝液（0.7 ml）をRNeasyカラムに添加した。チューブをゆっくりと締め、１５秒間、約10,000xgで遠心分離し、カラムを洗浄した。洗液（flow-through）を廃棄した。
５．ＲＰＥ緩衝液（0.5 ml）を、RNeasyカラムに添加し、１５秒、約10,000xgで遠心分離した。洗液を廃棄した。ステップ５を繰り返した。
６．該カラムを、さらに２分、約10,000xgで遠心分離した。
７．RNeasyカラムを、新規の1.5 ml回収チューブに移した。ＲＮase不含水(50μl)を、シリカゲル膜上に直接ピペットで移し、３分間室温でインキュベートした。
８．ＲＮＡを、１分、約10,000xgで遠心分離に供し、溶出した。
９．核酸、ＲＮＡを得た。
【００９４】
配列決定プロトコール
アンプリコンが、目的の標的配列決定反応と一致することを確認するために増幅反応の産物を配列決定した。配列決定反応は、製品説明書に従って市販購入し得る配列決定キット(Applied Biosystems)を用いて行った。ＤＮＡ配列を、373A sequencer system (Applied Biosystems)を用いて配列決定反応を解析することによって得た。ＤＮＡ配列を、the National Center for Bioethechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)から利用できるＢＬＡＳＴ配列比較ツールを用いて分析した。
【００９５】
実施例１：
前増幅のためのＰＣＲを用いる増強強化リアル・タイムＰＣＲ
ＰＣＲ前増幅:
全容量（２５μl）において、下記成分を混合した：ヌクレアーゼ不含水、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Platinum TaqＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１xＰＣＲ緩衝液、プライマー(１０μＭ)およびｃＤＮＡテンプレート(約１００ng)。ＰＣＲ増幅を、下記の温度プロファイルを用いてMasterCycler (Eppendorf)で行った：
【表５】
【００９６】
リアル・タイムＰＣＲ
ＰＣＲ前増幅の第一のラウンドの後、一部分の産物を、ＲＴ−ＰＣＲを利用するさらなる増幅のためのテンプレートとして使用した。
ＰＣＲ成分を、表３で記載した割合で混合した。
表３
【表６】
【００９７】
ＲＴ−ＰＣＲ装置(ABI 7700)を、表４の増幅プロファイルを用いてプログラムした。
【表７】
【００９８】
ＰＣＲ前増幅に続くＲＴ−ＰＣＲを用いるＳＡＲＳコロナウイルス検出の結果を、表５および６に示した。該結果を、Perkin Elmer ABI 310 Genetic Analyzerおよび上記した一般的なプロトコールを用いるＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００９９】
ＳＡＲＳ患者から得られた核酸サンプルに対する種々の増幅方法の比較
表５および６に示した結果を、様々な患者サンプルから単離された核酸を増幅することを試みることによって得た。サンプルは、ＳＡＲＳ患者から得られ、中国の上海の病院から提供された。各サンプルを、３つの異なる方法によって試験した：
ｉ）アガロースゲル電気泳動を用いる従来のＰＣＲ
ｉｉ）リアル・タイム TaqMan(登録商標)ＰＣＲ、および
ｉｉｉ）新規に説明した方法、前増幅ステップを用いる増強されたＲＴ−ＰＣＲ。
【０１００】
従来のＰＣＲを、ＰＣＲ前増幅と同じプロトコールを用いて実施した。リアル・タイム TaqMan(登録商標)ＰＣＲを、ＥＲＴ方法と同じプロトコールを用いて実施した。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
感度試験の結果
コロナウイルスＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへ転写した。該ｃＤＮＡを連続希釈し、表６に記載の３つの方法によって試験した。
【表９】
【０１０３】
実施例２
前増幅についてＰＣＲを用いる増幅されたリアル・タイムＰＣＲ
臨床サンプルを、疑わしいか、もしくは潜在的ＳＡＲＳ症例として診断された１２０人の患者から回収し、実施例１のプロトコールを用いて、従来のＰＣＲの後のアガロースゲル電気泳動、従来のTaqMan(登録商標)リアル・タイムＰＣＲおよび本発明の増強されたTaqMan(登録商標)リアル・タイムＰＣＲアッセイによって分析した。
【０１０４】
ＥＲＴを用いて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリメラーゼ遺伝子の約１９０bp 領域を、従来のＰＣＲによりｃＤＮＡから増幅させた。アンプリコンを配列決定し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの予測領域と一致することを確認した。続いて、このＰＣＲ産物を、ＲＴ−ＰＣＲ プライマーを用いる増強されたリアル・タイムＰＣＲプロトコールのためのテンプレートとして使用した。このプロトコールについて、標準的なリアル・タイム 方法による２１/１２０(１８.３％)、および様々な従来のＰＣＲ方法による１０.６％のみの平均と比較して、２８/１２０(２３.３％)患者サンプルをＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性と同定した。適当な陰性、陽性およびＰＣＲ阻害コントロールを、増幅方法の各段階で用いた。
【０１０５】
臨床サンプルについて標準的および増強されたリアル・タイムＰＣＲデータの選択を示した(図５から８)。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ陰性サンプルの間の明確な判別は、明らかである(図５、矢印で示した)。陽性および陰性シグナルの間の判別は、同一サンプルを標準的なリアル・タイムＰＣＲによって分析し、そこでＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性および陰性増幅曲線が、お互いに密接に重なる傾向がある場合には、一層不明瞭である（図７）。ＥＲＴによって得られた増強された結果を用いて、陽性および陰性シグナル間を容易に区別するようにリアル・タイムＰＣＲの結果を判断することは、さらに容易である。増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法は、従来のリアル・タイムＰＣＲ方法と比較して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ 陽性サンプルのためのサイクル時間(Ｃｔ)値の低下を導く。Ｃｔ値＜３５.０は、そうでないものからのＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を含有するサンプル間を明白に区別するための適当なカット・オフ値である。
【０１０６】
分析感度
各増幅方法の検出限界を、香港の患者から得たＳＡＲＳ−ＣｏＶ(２x１０２．５ ＴＣＩＤ５０/ml)の培養サンプルから抽出した全核酸を連続希釈することによって測定した。従来のＰＣＲ、標準的なリアル・タイムＰＣＲおよび増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法の検出限界は、各々２x １０-５.５ ＴＣＩＤ５０/ml、２x１０-１０.５ ＴＣＩＤ５０/ml (図１Ｄ)および２x１０-１２.５ＴＣＩＤ５０/ml(図１Ｃ)に相当する。このように、増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法は、標準的なリアル・タイムＰＣＲよりも少なくとも１０２倍以上の高い感度であり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの分子検出のために現在使用されている従来のいずれのＰＣＲ技術よりも１０７倍以上感度が高い。ウイルス培養によるＳＡＲＳ−ＣｏＶの検出は、増強されたリアル・タイムＰＣＲによって検出された３/２８(１０.７％)の症例のみがウイルス培養によるＳＡＲＳ−ＣｏＶに対して陽性であった場合、感度が最も低い方法といえる。
【０１０７】
増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法は、いくつかの症例において、その他のいかなるアッセイによっても確認されなかったＳＡＲＳ−ＣｏＶ 陽性サンプルを検出することが、わかった。このように、診断の精度を改善するどのような新規の検出方法も、臨床医に利用し得る一揃いの診断ツールへの価値ある追加である。従来のＰＣＲおよびリアル・タイムＰＣＲ単独では、少数のＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性の症例を同定しただけであった。結果を、ウイルス培養によって３/２８症例で確認した。増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法の限界は、標準的なリアル・タイムＰＣＲアッセイよりも１０２倍以上高く、従来のＰＣＲ方法よりも１０７倍以上高い。アッセイの増強された感度が、将来ＳＡＲＳ発生中の疾患の蔓延を制御する助けとなり得る。
【０１０８】
実施例３：前増幅についてＮＡＳＢＡを用いる増強されたリアル・タイムＰＣＲ
(ｉ）ＮＡＳＢＡ反応
【表１０】
【０１０９】
【表１１】
反応混合物を、６５℃で５分間インキュベートし、次いで４１℃で５分間冷却した。次いで、５μｌの酵素混合物(１酵素範囲について、全量５５μｌ)を反応混合物に添加した。短時間の混合後、４１℃に冷却し、５分インキュベートした。該反応混合物を、短時間回転させ、次いで１.５時間、４１℃でインキュベーションに供した。
【０１１０】
(ｉｉ) TaqMan リアル・タイムＰＣＲ
ＮＡＳＢＡ前増幅の第一回目のラウンド後に、次のようにＲＴ−ＰＣＲを利用したさらなる増幅のためのＮＡＳＢＡ産物をテンプレートとして使用した:
【表１２】
【表１３】
【０１１１】
ＮＡＳＢＡ増強されたリアル・タイムＰＣＲの結果:
コロナウイルスＮＡＳＢＡ産物は、表７、８および９に示したとおり、TaqManリアル・タイムＰＣＲによって、上手く増幅され、検出されることがわかった。
【表１４】
【０１１２】
【表１５】
【０１１３】
【表１６】
【０１１４】
ＮＡＳＢＡ-TaqMan ＰＣＲの反応条件は最適化されていることを見出した。ＮＡＳＢＡ-TaqMan および通常のＮＡＳＢＡの感度は類似しており、おおよそＴＣＩＤ５０ ２×１０-５.５である。表７(ＮＡＳＢＡ ＥＣＬ 結果)から、その試験は、ＴＣＩＤ ５０ x １０−８の低いレベルまで検出され得るし、ＮＡＳＢＡ Taqman ＰＣＲ (ＥＲＴ)と同じレベルであることがわかった。しかしながら、ＮＡＳＢＡ ＥＣＬの読取りは、他の陽性シグナルとは非常に異なる７４０７である(通常、１００万カウント)。そのため、実際の状況では、この結果を、陽性と簡単に判断できない。しかし、ＮＡＳＢＡリアル・タイム ＰＣＲ (ＥＲＴ)については、Ｃｔは７.１６であり、他の陽性シグナルと類似している。従って、我々のＮＡＳＢＡリアル・タイム ＰＣＲ(ＥＲＴ)は、従来のＮＡＳＢＡ方法よりも有利である。
【０１１５】
上記実施例に示したように、その検出キットが、種々の試験場所において従来的に使用され得ることが認識され得る。さらに、検出キットは、既存方法よりも使用するのに比較的容易であり、より短時間で検出結果を提供することができ、該検出結果は、所望であれば３時間以内で利用し得る。ＤＮＡを基にした検出システムであるので、特異性および感度は増強され、実施例に記載の検出キットがＳＡＲＳコロナウイルスに特異的である、またウイルスが検出のための標的分子へ複製されるので、サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスの濃度はもはや重要ではない。
【０１１６】
この発明の好ましい実施態様が前段に記載されているが、この発明の修飾および別の形式が可能であり、請求項に記載のとおり、かかる修飾および形式が、依然この発明の範囲内であることは当業者には明白に理解されるであろう。さらに、この発明の実施態様は、実施例または図によってのみ、制限的に説明されるものではない。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生物学的または環境サンプルから核酸を検出するための方法に関する。本発明は、核酸を検出するための診断用試験キット、ならびに該検出方法で使用するためのプライマーおよびプローブにも関する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
重症急性呼吸器症候群(ＳＡＲＳ)は、ヒトの典型的な肺炎の新規に同定された形態である(Drosten et al., "Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome" The New England Journal of Medicine, (2003) 348:1967-1976, ２００３年５月１５日発行)。それは、ＳＡＲＳコロナウイルスまたはUrbani株ＳＡＲＳ関連コロナウイルスと知られるコロナウイルスの新規株に起因する。そのウイルスは、エアロゾル状態によって効率よく蔓延し、対人接触感染がいわれてきた。疑わしいかまたはその可能性があるＳＡＲＳの診断は、「重症急性呼吸器症候群(ＳＡＲＳ)のサーベイランスについての症例の定義」で特定された次のＷＨＯ診断基準によってなされる(World Health Organization,２００３年４月３０日改定)。しかし、ＳＡＲＳの陽性診断は、新規コロナウイルスに対する抗体の存在の証明、または患者サンプル中のコロナウイルス核酸の存在の証明のいずれかによる病因物質の同定なしには為し得ない。疾患進行により、不可逆的肺損傷を導き、確認されたＳＡＲＳ感染患者の５-１０％の死亡率が報告されている。疾患の重症度を制限し、疾患の蔓延を制御するために、出来るだけ早く感染患者を同定することが、迅速な処置を開始するために重要である。
【０００３】
ウイルス感染を同定するために最も一般的に使用されている方法は、標準的な血清学的方法による患者の血清サンプル中の抗体の同定であって、この方法は、アガー・ゲル免疫拡散法(ＡＧＩＤ)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を包含するが、これに限定するものではない。正確で高感度の検出を可能にするに十分な濃度で抗体が産生され得るには、感染後７〜２１日かかるため、これらの方法は限定的である。
【０００４】
イン・ビトロで感染し得る細胞内でウイルスを培養することは、ウイルスを検出するための十分に確立された方法でもある。しかし、ＳＡＲＳに関連するコロナウイルスは、新規実在物であり、至適成長条件は説明されていない。さらに、アッセイ産物が完全な感染ウイルスであるので、ウイルスの成長に関して、高レベルのバイオセキュリティーが必要とされる。従って、高度な技術スタッフ、装置および施設が要求されるため、通例の診断的使用についてこの技術の適用性が制限される。さらに、ウイルスの成長は、あまりに遅いため、迅速な処置を開始するために十分な時間内に検出することができない。
【０００５】
ウイルス遺伝的材料の増幅および検出を基にした分子的方法は、多くの病原性ウイルスについて以前から説明されてきており、ＳＡＲＳコロナウイルスの検出に適用し得る。核酸増幅方法は、一般的に、迅速で特異性が高く、高感度である。
【０００６】
様々なタイプの核酸増幅プロセスは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)の後のアガロースゲル電気泳動、ネスティッド ＰＣＲ、リアル・タイムTaqman（登録商標）ＰＣＲ、分子ビーコンＰＣＲ、核酸配列を基にした増幅(ＮＡＳＢＡ)、等温およびキメラプライマーにより開始される核酸増幅(ＩＣＡＮ)などを含めて、説明されてきた。
【０００７】
ＰＣＲの後のゲル電気泳動(従来のＰＣＲとして知られている)は、１９８５年に初めて記載された標準的な技術である。それ以来、その技術は通例的な実験方法となってきた。しかし、それは、比較的遅く、手間のかかる技術である。さらに、最近の開発技術と比較すると、従来のＰＣＲは感受性が低い。
【０００８】
ゲル電気泳動に続くネスティッド（Nested）ＰＣＲは、従来のＰＣＲの感度を増加させる技術である。ネスティッドＰＣＲは、特定対のＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー(外側のプライマー)を用いる特異的な遺伝子配列の第一の増幅を包含する。この増幅産物は、第二ラウンドの増幅のためのテンプレートとして使用され、そこでは別のプライマー対(内側プライマー)は、第一増幅産物内の領域から選択される。このように、第二の増幅産物は、第一の増幅産物よりも短い。この方法は、それが別の増幅ステップを包含するので、非常に骨のおれる作業である。そのため、この方法は汚染されやすい。
【０００９】
ＮＡＳＢＡは、Compton J. "Nucleic acid sequence-based amplification" (1991) Nature 350:91-92; Heim AI et al "Highly sensitive detection of gene expression of an intronless gene: amplification of mRNA, but not genomic DNA by nucleic acid sequence based amplification(NASBA)"(1998) Nucleic Acids Research 26(9):2250-2251; および Deiman B et al "Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification"(2002)Molecular Biotechnology 20:163-179に記載されている。
【００１０】
リアル・タイムＰＣＲ(全体を通してＲＴ−ＰＣＲという)といわれる高度に自動化された方法は、高特異性かつ使用し易い技術であると証明されてきたが、ネスティッドＰＣＲよりも感度が低くなることもあり得る。ＲＴ−ＰＣＲは、１つの末端では蛍光吸収成分によって標識され、もう一つの末端では蛍光放出成分によって標識された追加のＤＮＡオリゴヌクレオチド分子の使用を包含し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー間の標的遺伝子の領域とハイブリダイズする。標識分子は蛍光遺伝子プローブとして知られる。増幅プロセスは継続すると、前進性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって蛍光遺伝子プローブの置換および分解により蛍光シグナルが増加する。リアル・タイムＰＣＲは、Desjardin LE et al "Comparison of the ABI 7700 system (TaqMan) and competitive PCR for quantification of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis." (1998) J Clin Microbiol. 36(7):1964-8 および Wang T et al "mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection" (1999) Anal Biochem. 269(1):198-201に記載されている。
【００１１】
Yangらの"Clinical detection of polymerase gene of SARS-associated coronovirus" Academic J First Med (2003) 23(5): 424-427（2003年5月8日発行）は、ＳＡＲＳコロナウイルス特異的プライマーを用いる逆転写酵素ＰＣＲの使用に関する。先に開示したDrostenらは、ＳＡＲＳコロナウイルスの検出のためにネスティッドＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲの独立した使用に関する。
【００１２】
従来のＰＣＲ、ネスティッドＰＲおよびＲＴ−ＰＣＲ単独では、広い範囲の患者サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための十分な精度または感度ではないともいえる。ＰＣＲによる陰性の結果は、増幅プロトコールで使用されたプライマーおよびプローブの不感受性、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染の欠如、別の感染性物質により生じた観察される疾患、偽陰性ＰＣＲ結果、またウイルスまたはその遺伝物質が存在しないか、現在の方法を用いては検出不能レベルであった時点で回収されたその試験標本、などを包含する多くのファクターがウイルス核酸検出に影響するので、必ずしも、患者がＳＡＲＳに罹っていないということを意味しない。従って、高感度、高特異性およびスピードを合わせもつ増幅技術により、ＳＡＲＳコロナウイルスの核酸の特異的部分を検出することによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶについてスクリーニングするために十分に感度がある方法を設計し、ＳＡＲＳの診断を改善することが重要である。
【００１３】
この発明が、ＳＡＲＳコロナウイルスだけの検出に限定されないで、広く核酸検出について適用し得ることは理解される。すなわち、この発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスを包含する病原体およびウイルスの多様なタイプの検出に適用し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
この発明の目的は、感染の初期段階にあるヒトを同定できるような、ＳＡＲＳコロナウイルスを包含する核酸を検出するための高感度な方法を提供することである。
【００１５】
また、この発明の目的は、核酸を検出するために、使用し易い診断用キットを設計することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の要約
一般的に、本発明は、様々な生物学的または環境サンプルから、例えばコロナウイルス核酸を抽出および検出するための方法を提供し、その方法は、次のステップ、
（Ａ）ＳＡＲＳコロナウイルスを含有すると疑われるサンプルを回収すること、
（Ｂ）回収したサンプルからリボ核酸（ＲＮＡ）を抽出すること、
（Ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡ増幅技術を用いて、特異的な標的配列を増幅すること、そして
（Ｄ）ＤＮＡ増幅技術および適当な伝達系、例えば、Taqman（登録商標）プローブまたは分子ビーコンなどを包含する蛍光遺伝子プローブを用いて、標的増幅核酸産物を検出すること、
を含む。
【００１７】
さらに、本発明は、標的分子を複製するための核酸複製剤、ここで標的分子はＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列に相補的な少なくとも一部分を含有する核酸配列である;および複製された標的分子を増幅し、増幅中に複製産物を検出するための核酸複製剤および核酸検出剤、を包含するＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキットを提供する。これらの剤は、複製産物を増幅し得るプライマー対および増幅産物に相補的である蛍光遺伝子プローブを包含する。
【００１８】
本発明の第一態様に従って、配列番号１〜２７のいずれかに記載の単離ＤＮＡ配列が提供される。
【００１９】
第二態様に従って、ＤＮＡ増幅の際にプライマーまたは蛍光標識プローブとして使用するための配列番号１〜２７のいずれかに記載のものを含む単離ＤＮＡ配列が提供される。プライマーまたはプローブは、配列番号１〜２７のいずれかを含み得る。
【００２０】
本発明の第三態様に従って、核酸単離に続くＤＮＡ増幅によって、その後のリアル・タイム ＰＣＲのステップを含む核酸検出方法が提供される。好ましくは、ＤＮＡ増幅はＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたは他の適当な核酸増幅技術を含む。
最も好ましくは、該方法は下記ステップ：
ｉ）生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ｉｉ）核酸を増幅すること、所望によりＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたは他の核酸増幅技術を使用すること、そして
ｉｉｉ）リアル・タイムＰＣＲを用いて、ステップ(ｉｉ)で産生した核酸を増幅および検出すること、
を含む。
【００２１】
より好ましくは、ステップ(ｉｉ)は、ＰＣＲを用いて核酸を増幅することを含む。ステップ(ｉｉ)は、前増幅ステップとしても知られる。この増幅ステップは、ＤＮＡ増幅およびＰＣＲによる検出を含み得る。あるいは、ＮＡＳＢを用いてもよい。ステップ(ｉｉ)の別の適当な核酸増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)に続くアガロースゲル電気泳動、ネスティドＰＣＲ、リアル・タイム Taqman（登録商標）ＰＣＲ、分子ビーコンＰＣＲ、等温でキメラプライマーにより開始される核酸増幅(ＩＣＡＮ)から選択され得る。
【００２２】
本発明の方法は、この新規の核酸増幅技術の組合せによって達成される。前増幅ステップに続くリアル・タイムＰＣＲのこの組合せは、核酸を検出するための高感度な方法を有利に提供する。これは、ウイルスまたは他の病原体により感染した初期段階にあるヒトを容易に同定することを可能にする。
【００２３】
さらに、本発明の別の態様は、核酸を検出する方法における使用のための配列番号１〜２７を含む単離ＤＮＡ配列に関し、核酸の検出方法における使用のための組成物の製造において、次のステップ：
ｉ）生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ｉｉ）核酸を増幅すること、所望により、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そして
ｉｉｉ）リアル・タイムＰＣＲを用いて、ステップ(ｉｉ)から核酸を増幅および検出すること、
を含む配列番号１〜２７を含む単離ＤＮＡ配列の使用に関する。
【００２４】
ステップ（ｉｉ)は、前増幅ステップとして知られる。前増幅は、ＰＣＲまたはＮＡＳＢＡによって実施され得る。この前増幅ステップのために使用されるプライマーは、どの方法を用いるかによって異なる。
【００２５】
検出されるべき核酸は、ＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡまたはｃＤＮＡから誘導されるのが好ましい。
【００２６】
本発明は、一般的に、生物学的または環境サンプルにおけるＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための診断用試験キットに関し、下記のステップ：
(ｉ）サンプル由来のＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡを単離するための単離用剤、
(ｉｉ）標的分子がＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列に相補的な核酸配列を包含する、標的分子を複製するための核酸複製剤、および
(ｉｉｉ）標的分子を検出するための核酸検出剤、ここで核酸検出剤が検出分子を包含する、
を含む。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１〜２７と一致する２以上の単離ＤＮＡ配列を含むＳＡＲＳ診断用試験キットに関する。
【００２８】
好ましくは、ＳＡＲＳ診断用試験キットは、配列番号１、２、３、４または５、および６、７、８、９または１０のいずれか一つに一致する前増幅プライマーを含む。プライマー対のうち１つのプライマーは、配列番号１、２、３、４または５から選択され、もう一つのプライマーは配列番号６、７、８、９または１０から選択される。配列番号１〜５は、ＰＣＲのフォワードプライマーに対応し、配列番号６〜１０は、ＰＣＲリバースプライマーと一致する。一方、前増幅プライマーは、配列番号２６および２７と一致する。配列番号１、２、３、４または５、および６、７、８、９または１０は前増幅ＰＣＲにおいて使用され得るし、配列番号２６および２７は、前増幅ＮＡＳＢＡにおいて使用され得る。
【００２９】
さらに、ＳＡＲＳ診断用試験キットは、配列番号１１、１２、１３、１４または１５、および１６、１７、１８、１９または２０のいずれか一つと一致するリアル・タイムＰＣＲプライマーも含む。ＲＴ−ＰＣＲプライマー対の１つのプライマーは、配列番号１１、１２、１３、１４または１５から選択され、もう一つのプライマーは、配列番号１６、１７、１８、１９または２０から選択される。さらに、ＳＡＲＳ診断用試験キットは、配列番号２１、２２、２３、２４または２５のいずれか一つと一致するリアル・タイムＰＣＲプローブを包含してもよい。これらのプライマーおよびプローブは、リアル・タイムＰＣＲで使用される。配列番号１１〜１５は、リアル・タイムＰＣＲフォワードプライマーと一致し、配列番号１６〜２０は、リアル・タイムＰＣＲリバースプライマーと一致する。配列番号２０〜２５は、リアル・タイムＰＣＲプローブと一致する。
【００３０】
前増幅ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＴにおいて使用されたプライマーは、必要であれば、互換的に使用され得る。
【００３１】
一方、診断用試験キットは、次のプライマー対；ａ）配列番号１、２または３、および６、７または８；ｂ）配列番号１１、１２または１３、および１６、１７または１８、および配列番号２１、２２または２３、から選択されるプローブを含む。
【００３２】
好ましい実施態様として、診断用試験キットは、下記プライマー対ＡおよびＢ；およびＣおよびＤ；およびプローブＥを含む：
Ａ）配列番号１、２、３、４または５のいずれかから選択されたプライマー、
Ｂ）配列番号６、７、８、９または１０のいずれかから選択されたプライマー、
Ｃ）配列番号１１、１２、１３、１４または１５のいずれかから選択されたプライマー、
Ｄ）配列番号１６、１７、１８、１９または２０のいずれかから選択されたプライマー、および
Ｅ）配列番号２０〜２５のいずれかから選択されたプローブ。
この診断用試験キットは、前増幅ステップがＰＣＲを包含する場合に使用され得る。さらに、プライマー対ＡおよびＢ；またはＣおよびＤは、従来のＰＣＲおよび/またはＲＴ−ＰＣＲのいずれかを互換的に使用され得る。
【００３３】
別の好ましい実施態様として、診断用試験キットは、下記プライマー対Ａ；およびＣおよびＤ；およびプローブＥを含む：
Ａ）配列番号２６または２７から選択されたプライマー、
Ｃ）配列番号１１、１２、１３、１４または１５から選択されたプライマー、
Ｄ）配列番号１６、１７、１８、１９または２０から選択されたプライマー、
Ｅ）配列番号２０〜２５のいずれかから選択されたプローブ。
この診断用試験キットは、前増幅ステップがＮＡＳＢＡを包含する場合に使用され得る。 配列番号２６および２７は、ＳＡＲＳ ＮＡＳＢＡ Ｔ７プライマーおよびＳＡＲＳ ＮＡＳＢＡ 電気化学発光(ＥＣＬ)プライマーに各々一致する。
本発明は、図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、この発明の好ましい実施態様のＳＡＲＳコロナウイルスの検出の全方法に関するフロー・チャートを示す。
【図２】図２は、ＳＡＲＳコロナウイルスの単離方法およびこの発明の好ましい実施態様による相補的なＤＮＡ(ｃＤＮＡ)へのその変換を示す。
【図３】図３は、本発明の好ましい実施態様のプローブＥによって影響される検出および定量化による、２つのＤＮＡ分子、プライマーＡおよびＢによるＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡ分子の一部分の増幅、および２つのＤＮＡ分子、プライマーＣおよびＤによるさらなる増幅のためのテンプレートとしての増幅産物の連続使用を示す。
【図４−１】図４は、配列番号１〜２７と一致する核酸配列を示す。
【図４−２】図４は、配列番号１〜２７と一致する核酸配列を示す。
【図５】図５から８は、増強され、かつ標準的なリアル・タイム増幅の比較を示す。各サンプルについて、△Ｒｎ(レポーター染料放出と停止染料放出の定量の比）が、サイクル数に関して表示される。蛍光強度は、インプット標的ＤＮＡの量と直接関連する。蛍光の検出レベルに達するようなサイクルが少なければ少ないほど、開始コピー数は多い。図５は、増強されたリアル・タイムＰＣＲを用いて分析された臨床サンプルを示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ 陽性サンプルは、矢印で示したとおり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ 陰性サンプルとは明らかに異なっている。
【図６】図５から８は、増強され、かつ標準的なリアル・タイム増幅の比較を示す。各サンプルについて、△Ｒｎ(レポーター染料放出と停止染料放出の定量の比）が、サイクル数に関して表示される。蛍光強度は、インプット標的ＤＮＡの量と直接関連する。蛍光の検出レベルに達するようなサイクルが少なければ少ないほど、開始コピー数は多い。図６は、標準的なリアル・タイムＰＣＲを用いるパネルＡに示した同一の臨床サンプルを示す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、陽性および陰性サンプルは、容易に区別されない。
【図７】図５から８は、増強され、かつ標準的なリアル・タイム増幅の比較を示す。各サンプルについて、△Ｒｎ(レポーター染料放出と停止染料放出の定量の比）が、サイクル数に関して表示される。蛍光強度は、インプット標的ＤＮＡの量と直接関連する。蛍光の検出レベルに達するようなサイクルが少なければ少ないほど、開始コピー数は多い。図７は、増強されたリアル・タイムＰＣＲを用いるＳＡＲＳ−ＣｏＶ (２ x １０２.５ ＴＣＩＤ５０/ml [上限トレース]から２ x １０−１０.５ ＴＣＩＤ５０/ml)の連続１０倍希釈を示す。低いトレースは、リバース転写陰性コントロールおよびTaqMan(登録商標) 陰性コントロールを示す。
【図８】図５から８は、増強され、かつ標準的なリアル・タイム増幅の比較を示す。各サンプルについて、△Ｒｎ(レポーター染料放出と停止染料放出の定量の比）が、サイクル数に関して表示される。蛍光強度は、インプット標的ＤＮＡの量と直接関連する。蛍光の検出レベルに達するようなサイクルが少なければ少ないほど、開始コピー数は多い。図８は、標準的なリアル・タイムＰＣＲを用いるＳＡＲＳ−ＣｏＶ (２ x １０２.５ ＴＣＩＤ５０/ml [上限トレース] から２ x １０−１０.５ ＴＣＩＤ５０/ml)の連続１０倍希釈を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
急速に、核酸増幅は、患者組織における感染生物体の存在を直接示すことによって多くの疾患の診断を確認するための標準的な臨床検査方法となってきた。該方法は、それらの特異性および感度により、迅速に感染を確認でき、抗ウイルス治療の効果をモニターされるようになったので、ＳＡＲＳの発生中に不可欠なものとなった。ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する宿主抗体の存在を証明することによるＳＡＲＳ診断アッセイは、ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光などを用いて開発されてきた。しかし、そのような試験は、核酸方法の感度を欠くことが多く、抗体が検出レベルに達するまでに７−２１日を要するので、新たに感染した患者を検出できない。
【００３６】
本発明は、核酸、例えば、生物的および環境サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡまたはｃＤＮＡ、を検出するための高感度な方法を提供する。かかる生物サンプルは、血液、痰、血清、血漿、鼻喉頭上部スワブ、口腔咽頭スワブ、尿、便、その他体液、および環境サンプル、例えば、水、汚水、廃棄物などを包含する。
【００３７】
核酸検出のための本発明の方法は、前増幅ステップ後のリアル・タイムＰＣＲを包含する。Lauら " A real-time PCR for SARS-corona virus incorporating target gene pre-amplification " Biochemical and Biophysical Research Communication (2003) 312:1290-1296の内容目録を、出典明示により本明細書の一部とする。ＰＣＲおよびリアル・タイムＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)は、当業者には既知の技術である。蛍光定量化を用いるリアル・タイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＤＮＡの検出について迅速で高感度かつ高特異的な方法であり、ＳＡＲＳコロナウイルス核酸の検出に適用され得る。この技術単独についての結果は、３時間程度で得ることができる。ＲＴ−ＰＣＲは、蛍光性の定量を用い得るが、蛍光定量のみに限定しない。ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、好ましくは片方では蛍光吸収成分により標識し、そしてもう片方で蛍光放出成分により標識された別のＤＮＡオリゴヌクレオチド分子(本明細書中に示されるように、プローブとして)の使用を包含する。さらなるＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー間の目的とする核酸の領域とハイブリダイズする。そのため、シグナル発生物は、適当な検出器で検出でき、定量化できる光子を放出するように刺激され得る蛍光遺伝子分子、分子ビーコンまたは他の分子であり得る。
【００３８】
増幅の開始ラウンドの産物が、その後の増幅のためのテンプレートとして使用されるネスティッドＰＣＲ方法は、多くの標的遺伝子の検出の適合度および感度を増加させるとよく知られている。かかる前増幅方法は、従来のＰＣＲ技術以上にそれらの一般に秀でた感度のために、様々なリアル・タイムＰＣＲの適用には不必要であると考えられている。しかしながら、目的の標的遺伝子が少なく、および/または他の汚染物質がバックグラウンド中に存在する状況では、驚くべき事に、本発明による前増幅が、検出限界を改善するのに有利であることがわかった。
【００３９】
本発明の方法、すなわち前増幅後のリアル・タイムＰＣＲは、"増強されたリアル・タイムＰＣＲ（Enhanced Real-time PCR）"として本明細書中に示す。前増幅は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたは他の核酸増幅技術によっておこり得る。このＥＲＴ技術の１つの利点は、驚くべきことに、検出限界は、通常のTaqMan(登録商標)リアル・タイム・ＰＣＲの１００倍以上であるＴＣＩＤ５０(２×１０-１１.５)までであり、従来のＰＣＲの１０８倍以上であることが見出された。さらなる利点は、この増強されたリアル・タイムＰＣＲ検出についてのターンアラウンド時間が、約５.５時間要することである。全体の検出方法の時間をさらに短縮し、試験の感度を増加させるために、前増幅のためにＮＡＳＢＡ技術とリアル・タイムＰＣＲとを組み合わせる方法が使用され得る。前増幅ステップがＮＡＳＢＡを含有する場合に、有利なことには、ターンアラウンド時間が４時間の範囲内であることがわかった。すなわち、この組合せられた前増幅/ＲＴ−ＰＣＲ技術についての検出限界および時間に関する利点は、双方予想外のことであり、また有利なものであった。
【００４０】
ＥＲＴは、陽性と陰性サンプルとを明確な手法で識別することを可能にし得る。これは、いかなる誤診断または解釈も許容してはならない臨床診断において特に重要である。
【００４１】
同一サンプルを標準的なリアル・タイムＰＣＲによって分析する時に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性および陰性増幅曲線が、別のものと近接して重複する傾向がある場合に(図６)、陽性および陰性シグナル間の判別はより不明瞭である。そのため、リアル・タイムＰＣＲの結果を解釈する際に、経験が浅い臨床医は、ＥＲＴにより得られた増強された結果を用いて、陽性と陰性シグナルとの違いを容易に区別することが可能である。これは、従来のリアル・タイムＰＣＲを超える本発明の非常に重要な利点である。
【００４２】
増強されたリアル・タイムＰＣＲの増強された感度により、単なる臨床診断以上に多くの分野への適用を可能とする。媒介物および汚水がＳＡＲＳ発生と関連すると考えられるなら、核酸検出方法を環境サンプルに適用するにふさわしいことは明らかである。共有面積の表面(エレベーター、待合所など)をＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸のエビデンスについて試験することは、疾患の伝搬をモニターする機会および洗浄/滅菌方法の効力をモニターする機会を提供する。
【００４３】
ＳＡＲＳの徴候および症状は、特に高リスク患者、例えば発熱しない老人では非常に変化し易いので、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を決定するための高感度な方法は、医療環境におけるウイルスの伝搬を制限するのに非常に有用である。早期検出は、地域発生を含めて、より迅速に実行されるべき緊急プランを可能にし、社会的関心そして潜在的な経済効果を制限して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの国際的蔓延を防止することを可能にする。
この発明の好ましい実施態様は、図を参考にして説明される。表１は、図１〜３に使用される符号の説明を示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】
生物サンプル、例えば鼻咽頭スワブ（anoropharyngeal swab）中のＳＡＲＳコロナウイルス濃度は、ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡの存在の検出を生物サンプルに対して直接実施できないような非常に低い濃度かもしれない。検出目的のための十分な量まで、ウイルスＲＮＡ分子の数を増加させるために、適当な増幅技術が必要とされる。ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)は、ＤＮＡ増幅についての特別な用途をもった柔軟な技術であると知られている。ＲＮＡのＤＮＡへの変換は、ＰＣＲプロセスを、ＲＮＡゲノムを有する病原体、例えばＳＡＲＳコロナウイルスをカバーするよう拡張することを可能にする。次いで、増幅されたＤＮＡ分子は、適当な技術のいずれによって検出してもよい
【００４６】
ＳＡＲＳコロナウイルスは、リボ核酸の１本鎖の形態(ＲＮＡ１０)でその遺伝物質を含有する。該ウイルスＲＮＡは、その再生に必要な遺伝子を含有し、その主な遺伝子の１つはポリメラーゼとよばれている。この遺伝子は、分子の５’末端から数えて、約２８００個のヌクレオチド長である。
【００４７】
図１は、検出キットによってＳＡＲＳコロナウイルスの検出のための全体的な方法を示す。図１に示したように、ＲＮＡの１本鎖形態である標的ＳＡＲＳコロナウイルスのウイルス核酸分子は、最初に生物サンプルから抽出される。不都合のない生物サンプル型は、血液、血清/血漿、末梢血液単核細胞/末梢血液リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ)、痰、尿、糞便、咽頭スワブ、皮膚創傷スワブ、髄液、頸管塗抹、膿サンプル、食品基盤（food matrices）および脳、脾臓および肝臓を含む身体様々な部分からの組織を包含し得る。列挙されていない他のサンプルを用いてもよい。単離用剤は、この発明の検出キットの核酸抽出方法を達成する。
【００４８】
標的ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡ分子（１０）が生物サンプルから抽出された後に、サンプル中のＲＮＡ分子の量は検出されるべき十分な量では存在しないかもしれない。そのため、ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡ分子の一部が、適当な増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)またはＮＡＳＢＡまたはＲＴ−ＰＣＲによって、標的核酸分子に複製される。次いで、標的核酸分子は、適当な方法によって検出されうる。ＲＴ−ＰＣＲに先立って、前増幅ステップを使用することは、驚くべきことに、従来のＰＣＲ技術単独によって提供される以上に、より高い検出レベル、改善された感度およびより短い時間を含めて、ある範囲の価値を提供する。
【００４９】
次いで単離および増幅方法の詳細を説明する。
核酸単離:
ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡ分子（１０）は、適当な単離用剤を生物サンプルに適用することによって生物サンプルから単離され得る。好ましくは、溶菌剤が、単離用剤の前に用いられ得る。溶菌剤、例えば溶菌緩衝液は、タンパク質および脂質を溶解すること、そしてこれらの材料がより簡単にサンプルから除去され得るように生物サンプル中のタンパク質を変性させることに関与する。さらに、溶菌剤は、長期貯蔵目的のために、ＲＮＡ分子を安定化するために緩衝液として働き得る。図２に示したとおり、ＲＮＡ分子は、室温で４８時間まで、溶菌緩衝液中で安定であり得るし、−７０℃で無期限に貯蔵され得る。そのように行う利点は、かかるプロセスを行うのに適当でない試料採取場所で、分析を行う必要がないことである。
【００５０】
適当な溶菌緩衝液の例は、５Ｍのグアニジンチオシアン酸塩およびＴｒｉｓ／ＨＣｌを包含し得る。かかる溶菌緩衝液は、当業者にはよく知られている。タンパク質および脂質の溶解、タンパク質の変性、ＲＮＡ分子の安定化という目的をなお達成し得る様々な組成物を有する溶菌剤は、この発明の検出キットにおいて利用され得る。
【００５１】
溶菌剤を生物サンプルに適用した後の次のステップは、単離用剤の使用によるサンプル由来の核酸分子の単離である。図２は、検出キットにおける全体的な単離方法を説明するものである。溶菌剤を生物サンプルに適用した後、核酸と共に他の望ましくない成分は、溶液形態にある。次いで、この溶液を、核酸に対して高親和性を有する小さなクロマトグラフィーカラム（１２）に供する。非核酸成分を、洗浄によりカラムから除去し得る。次いで、核酸を、適当な溶離剤を用いてカラムから特異的に溶出し得る。ここで説明した核酸精製方法は、当業者には既知である。
【００５２】
サンプル中に含まれる核酸が単離された後に、必要であれば、その後ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡ分子が、その後、逆転写酵素の使用により相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)(１６)コピーへと変換されるように、増幅剤が核酸の混合物(１４)に用いられてもよい。この方法は、当業者には既知である。ｃＤＮＡへの変換は、ある特定の状況にのみ必要とされる。すなわち、ＲＮＡまたはｃＤＮＡが、前増幅に使用される方法によって、次のステップに対するテンプレートとなり得る。
【００５３】
前増幅ステップ：
ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの一部が、いわゆる前増幅ステップにおいて、例えば、ＰＣＲ技術またはＮＡＳＢＡまたはその他の適当な核酸増幅技術によって検出目的のために複製される。増幅中に、ｃＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡの両方が合成される。
【００５４】
ＮＡＳＢＡ(核酸配列を基にした増幅)は、核酸の増幅のための連続的な、等温の、酵素を基にした方法である。該技術は、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ-Ｈ、ＲＮＡポリメラーゼおよび２つの特異的に設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いる。ＮＡＳＢＡは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する必要がないので、ＲＮＡに対して直接機能し得る。配列番号２６および２７は、ＮＡＳＢＡ前増幅ステップにおいてプライマーとして使用され得る。
【００５５】
一方、従来のＰＣＲまたはその他の核酸増幅技術もまた、この前増幅ステップにおいて使用され得る。配列番号１〜１０は、前増幅ＰＣＲステップにおいてプライマーとして使用され得る。一方、配列番号１１〜２０は、この前増幅ＰＣＲステップについてはプライマーとして使用され得る。ＰＣＲのために、ＳＡＲＳ ＲＮＡは、まずｃＤＮＡに変換され、次いでこれを前増幅ＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。
【００５６】
ＰＣＲによる前増幅ステップ：
図３に示したように、増幅プロセスは、９５℃に加熱することによって１本鎖形態となっている標的ＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡ(１６）に対してプライマーＡ（１８）およびＢ（２０）をアニーリングして開始される。該プライマーＡおよびＢは、それらが標的ｃＤＮＡ分子に結合し得るように設計される。結合の正確な位置は、試験したウイルスの株に依存する。結合部位は、特定の期間の後に変化し得る。プライマーＡおよびＢの重要な技術的特徴は、それらが各々ＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡの一部に結合し得るままであることである。
【００５７】
従って、プライマーＡおよびＢは、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡに対してＤＮＡ配列相補性をコードする結合配列を包含する。この発明の目的のために、プライマーＡがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡに結合するための適当な領域は、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子ヌクレオチド１８３１９から１８３３８の間の領域であり、それは結合機能について最小数のヌクレオチドを含有することが見出された。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９,GenBank Accession number AY278491である。従って、プライマーＡの結合配列は、好ましくは、図４で配列番号１に記載されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８３１９から１８３３８の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含する。配列番号１は、５’−３’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。結果として、ウイルス遺伝子に関して結合の方向は、"バック"から"フロント"である。
【００５８】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８３６３から１８３８２(配列番号２、図４)、またはヌクレオチド１８４０４から１８３８６(配列番号３、図４)は、プライマーＡにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号４または５が、プライマーＡにおいて結合目的のために使用され得る。
【００５９】
この発明の目的のために、プライマーＢをＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡに結合するために適当な領域が、結合機能について最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１５７から１８１７９の間の領域であることが見出された。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９,GenBank Accession number AY278491である。従って、プライマーＢの結合配列は、好ましくは、図４において配列番号６に記載のＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１５７から１８１７９の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含する。配列番号６が、５’−３’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。
【００６０】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１２５から１８１４４(配列番号７、図４)またはヌクレオチド１８１０３から１８１２２(配列番号８、図４)が、プライマーＢにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号９または１０は、プライマーＢにおいて結合目的のために使用され得る。
【００６１】
プライマーＡおよびＢがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡに結合した後に、プライマーＡおよびＢが、プライマーＡおよびＢの３’末端で適当なヌクレオチドの存在下で、適当なポリメラーゼ、例えばTaqＤＮＡポリメラーゼの作用を介して伸張される。こうして、一部のＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡに相補的である下記配列(ａ)ＤＮＡ配列を包含する伸張されたプライマーＡ(２２)およびＢ(２４)が、産生される。
【００６２】
適当な増幅プログラムの適用によって、ＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ産物(２６)の過剰量に変換され得る。適当な増幅プログラムは下記である：
【表２】
【００６３】
ＮＡＳＢＡによる前増幅：
一方、前増幅は、核酸の増幅のために連続した、等温の、酵素を基にした方法であるＮＡＳＢＡ(核酸配列を基にした増幅)によって生じさせ得る。該技術は、逆転写酵素、リボヌクレアーゼ-Ｈ、ＲＮＡポリメラーゼおよび２つの特別に設計されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用いる。増幅中、ｃＤＮＡおよび１本鎖ＲＮＡの両方が合成される。そうして、TaqManリアル・タイムＰＣＲは、ＮＡＳＢＡ産物中のｃＤＮＡの存在と共に行われうる。ＲＮＡは、ＮＡＳＢＡについてのテンプレートとして作用できる、そのため、この状況ではＳＡＲＳ ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する必要はない。
【００６４】
ＮＡＳＢＡを実行するための適当なプライマーは、ＳＡＲＳ ＮＡＳＢＡＴ７プライマーおよびＳＡＲＳ ＮＡＳＢＡ ＥＣＬプライマー各々に対応する配列番号２６および２７を包含する。これらのＮＡＳＢＡプライマーは、前増幅ステップでＰＣＲプライマー配列番号１〜１０の代わりに使用され得る。
【００６５】
リアル・タイムＰＣＲ：
検出方法の感度を高めるために、前増幅ステップ、すなわちＰＣＲ反応またはＮＡＳＢＡの産物は、別の増幅方法、すなわちＲＴ−ＰＣＲ 方法において使用される。必要なら、プライマー配列番号１〜１０を代わりに使用してもよいが、配列番号１１〜２０は、ＲＴ−ＰＣＲを実施するためのプライマーとして使用され得る。配列番号２１〜２５は、ＲＴ−ＰＣＲにおけるプローブとして使用される。
【００６６】
検出目的を達成するために、前増幅ステップ、例えばＰＣＲまたはＮＡＳＢＡの増幅された２本鎖ＤＮＡ産物（２６）は、ＲＴ−ＰＣＲを利用するさらなる増幅方法、好ましくは、TaqMan(登録商標)定量化リアル・タイムＰＣＲに対するテンプレートとして使用され得る。別の増幅のためのテンプレートとして使用され得る前に、複製されたＤＮＡは、後続の増幅方法の効率を最高にするために、適当な液体で最初に希釈しなければならない。複製したＤＮＡ分子のための適当な希釈剤は、ヌクレアーゼ不含水または緩衝液を包含する。ＲＴ−ＰＣＲ方法のための適当な増幅プログラムは下記である：
【表３】
【００６７】
増幅の程度は、適当な装置、例えばＡＢＩ Prism ７７００遺伝子検出システム(Applied Biosystems) において、自動的にモニターされ得る。
【００６８】
ＲＴ−ＰＣＲによる増幅には、２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマー(プライマーＣ(２８)およびプライマーＤ(３０)および蛍光遺伝子プローブ(Ｅ、３２)が必要である。
【００６９】
この発明の目的のために、プライマーＣがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡ増幅産物に結合するための適切な領域は、結合機能について最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２６４から１８２４５の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９,GenBank Accession number AY278491である。従って、プライマーＣの結合配列は、好ましくは、図４の配列番号１１に記載されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２６４から１８２４５の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含する。配列番号１１は、５’−３’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。結果として、ウイルス遺伝子に関して結合の方向は、"バック"から"フロント"である。
【００７０】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２９５から１８３１４(配列番号１２、図４)、またはヌクレオチド１８３２２から１８３０４ (配列番号１３、図４)は、プライマーＣにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号１４または１５が、プライマーＣにおいて結合目的のために使用され得る。
【００７１】
この発明の目的のために、プライマーＤがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡ増幅産物に結合するための適当な領域は、結合機能のための最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１９３から１８２１１の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９，GenBank Accession number AY278491である。従って、プライマーＤの結合配列は、図４で配列番号１６に記載されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８１９３から１８２１１の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含するのが好ましい。配列番号１６は、５’−３’方向で形式的に記載されていることに注意すべきである。
【００７２】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２１９から１８３３６ (配列番号１７、図４)、またはヌクレオチド１８２０５から１８２２０ (配列番号１８、図４)は、プライマーＤにおいて結合目的のために使用され得る。あるいは、配列番号１９または２０が、プライマーＤにおいて結合目的のために使用され得る。
【００７３】
この発明の目的のために、プライマーＥがＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスｃＤＮＡ増幅産物に結合するための適当な領域は、結合機能のための最小数のヌクレオチドを含有することが見出されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２１７から１８２３４の間の領域であることがわかった。これらの試験で使用したタイプの生物体は、ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９，GenBank Accession number AY278491である。従って、プローブＥの結合配列は、図４で配列番号２１に記載されたＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２１７から１８２３４の間の領域に相補的であるＤＮＡ配列を包含するのが好ましい。
【００７４】
あるいは、ＳＡＲＳコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８２４１から１８２６０ (配列番号２２、図４)、またはヌクレオチド１８２２８から１８２４６ (配列番号２３、図４)は、プローブＥにおいて結合目的のために使用される。あるいは、配列番号２４または２５が、プローブＥにおいて結合目的のために使用され得る。
【００７５】
プライマーＣおよびＤが、２本鎖産物(３４)を形成するために、適当な酵素、例えばTaqＤＮＡポリメラーゼおよび追加のヌクレオチドの作用を介して、３’末端から伸張される。増幅中に、プローブＥは、ＤＮＡポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ作用により置換され、減成される。これは、増幅の程度、すなわち増幅産物の濃度に相関し得る蛍光シグナルの増加を生じる。このように、ＲＴ−ＰＣＲ増幅方法の産物は、下記ＤＮＡ配列を各々含有する大量の標的ＤＮＡ分子である：
(ａ）元々のＳＡＲＳコロナウイルスの一部分に相補的なＤＮＡ配列。
【００７６】
TaqMan(登録商標)リアル・タイム プローブの配列は、増幅されたＤＮＡ産物のどのような領域にも相補的であり、その末端がプライマーＣおよびＤによって定義され得る。しかし、これは増幅反応の発生を防止するため、該プローブ配列はプライマーＣおよびＤのものと重複し得ない。
【００７７】
増強されたリアル・タイムＰＣＲ
前増幅およびリアル・タイムＰＣＲ技術を組み合わせたこの技術は、"増強されたリアル・タイムＰＣＲ"(ＥＲＴ)として示される。図３は、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲの組合せによって、ＳＡＲＳコロナウイルス・ウイルスＲＮＡの増幅のための概略図を示す。
【００７８】
この新規アッセイの目立った態様は、ＲＴ−ＰＣＲの第二回目のラウンドのテンプレートとして、前増幅ステップ、例えば従来のＰＣＲまたはＮＡＳＢＡの開始ラウンドいずれかの増幅産物の使用である。この組合せ技術は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ検出の感度を増加させる。所望により、同一プライマーは、従来のＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ段階による開始前増幅のために使用され得る。この追加の前増幅ステップは、臨床サンプル中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの検出の感度を改善する。
【００７９】
表２は、列挙したプライマー配列が、CUHK AG03 AY 345988 GenBank配列を基にしたＳＡＲＳ配列にどのように対応するかを示す。
【表４】
配列番号４、９、１４、１９、２４は、ＳＡＲＳヌクレオカプシドタンパク質(ＮＰ)遺伝子から得られる、配列番号５、１０、１５、２０および２５は、ＳＡＲＳポリメラーゼ（Ｐｏｌ）遺伝子から得られる。
【００８０】
さらに、本発明は、生物学的または環境サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスの検出するためのキット製造において、第一および第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子の使用に関し、ここで、該ＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ分子は単離用剤によって生物学的または環境サンプルから単離される；標的分子は、第一および第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子を包含する核酸複製剤によって複製され、該標的分子は、ＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列に相補的な核酸配列と検出分子に結合するための核酸配列を包含し、該標的分子は核酸検出剤によって検出され、該核酸検出剤は検出分子を包含する。
【００８１】
ＲＮＡまたは他の核酸であり得るが、好ましくは、標的分子はｃＤＮＡ分子である。第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子は、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子が酵素およびＤＮＡヌクレオチドの存在下で伸張し、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子がＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のｃＤＮＡ配列と結合する場合にＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列に対して相補的なＤＮＡ配列を包含しているＤＮＡ配列を生成するように、ＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列と結合するためのＤＮＡ配列を含んでいる。
【００８２】
より好ましくは、第一のＤＮＡ配列は、配列番号１、２、３、４または５に記載のＤＮＡ配列対の一つ、配列番号６、７、８、９または１０に記載のＤＮＡ配列対のいずれか一つをコードし得る。一方、第一のＤＮＡ配列は、配列番号２６および２７に記載のＤＮＡ配列対をコードし得る。
【００８３】
さらに、核酸複製剤は、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を包含するＤＮＡに結合する場合、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を生成するために、酵素およびＤＮＡヌクレオチドの存在下で伸張するように、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を包含する第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子を包含し得る。より好ましくは、ＤＮＡ配列は、配列番号１１、１２、１３、１４または１５に記載のＤＮＡ配列対のいずれか一つを、配列番号１６、１７、１８、１９または２０に記載のＤＮＡ配列対のいずれか一つと組み合わせて、コードする。複製されたＤＮＡ産物は、さらに増幅する前に希釈され得る。
【００８４】
検出分子は、標的分子に結合するための、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列;およびシグナル発生物を包含し得る。
【００８５】
シグナル発生物は、適当な検出器において検出および定量し得る光子を放出するように刺激し得る次のうちの一つを含みうる：蛍光遺伝子分子、分子ビーコン、その他の分子。好ましくは、検出分子のＤＮＡ配列は、配列番号２０から２５に記載のＤＮＡ配列対のいずれか一つをコードする。
【００８６】
本発明は、下記の非限定的な実施例で説明される。本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更および修飾が下記実施例および方法に適用され得ることに注目すべきである。
【実施例】
【００８７】
実施例
下記実施例で使用した成分および遺伝子プロトコールを、下記に説明する：
サンプル
核酸を単離するために使用したサンプルは、ＳＡＲＳ患者から得たもので、中国の北京にある病院から提供された。
ボックスＡ(核酸単離）
Qiagen RNeasy（登録商標）Mini Kit 核酸単離キット
ボックスＢ(核酸増幅)
Mastermix (0.5 ml)(Eurogentecから購入)
dUTP (0.2 mM dATP、dCTP、dGTP および 0.4 mM dUTP)を有するdNTPs、HotStart TaqＤＮＡポリメラーゼ、ＭgＣl２、ウラシル-Ｎ-グリコシラーゼ(ＵＮＧ)含有物および不動対照（Passive Reference）。
【００８８】
ＳＡＲＳプライマー(２０μｌ)
ＳＡＲＳに関連のあるコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子領域に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド、かつ配列番号１〜２０および２６および２７の包含物。
【００８９】
ＳＡＲＳプローブ(１０μｌ)
ＳＡＲＳと関連があるコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子の領域に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、蛍光放出標識と蛍光消光分子の両方で標識され、配列番号２１〜２５を包含するものである。
０.２ mMの各ＳＡＲＳプライマー＋０.２４ mM TaqMan ＳＡＲＳプローブを、ユニバーサル・マスターミックスに添加した。
【００９０】
ＳＡＲＳ陽性コントロール(１０ μｌ)
ＳＡＲＳに関連するコロナウイルスのポリメラーゼ遺伝子の一部分を含有する、高精製度かつ非感染プラスミド。
【００９１】
試薬調整のためのプロトコール
ボックスＡ(核酸単離)
要求されているように、RNeasy Mini-カラム(サンプルあたり１つ)の十分な数を調製した。ＲＬＴ緩衝液(サンプルあたり0.4 ml)、RW1 緩衝液 (サンプルあたり0.7 ml)およびＲＰＥ緩衝液(サンプルあたり0.5 ml)(全てはRNeasy キットにおいて提供される)を要求されているように調製し、室温にゆっくりと温めた。７０％のエタノール(サンプルあたり0.4 ml)およびヌクレアーゼ不含水(サンプルあたり５０μ)を、要求されているように、調製し、室温までゆっくりと温めた。
【００９２】
ボックスＢ(核酸増幅)
Mastermix、ＳＡＲＳプライマー、ＳＡＲＳプローブ、精製した核酸テンプレート(サンプル)およびヌクレアーゼ不含水を、要求されているように、調製し、室温までゆっくりと温めた。
【００９３】
核酸抽出プロトコール(Qiagen RNeasy（登録商標）Mini Kit)
１．サンプル（0.4 ml）およびＲＬＴ緩衝液（0.4 ml）を一緒に混合した。
２．７０％エタノール（0.4 ml）をチューブに添加した。
３．溶液混合物（0.6 ml）を、RNeasy カラムに添加した。該チューブをゆっくりと締めて、１５秒、約10,000xgで遠心分離した。洗液（flow-through）を、回収チューブ（2 ml）に取った。ステップ３を繰り返した。
４．ＲＷ１緩衝液（0.7 ml）をRNeasyカラムに添加した。チューブをゆっくりと締め、１５秒間、約10,000xgで遠心分離し、カラムを洗浄した。洗液（flow-through）を廃棄した。
５．ＲＰＥ緩衝液（0.5 ml）を、RNeasyカラムに添加し、１５秒、約10,000xgで遠心分離した。洗液を廃棄した。ステップ５を繰り返した。
６．該カラムを、さらに２分、約10,000xgで遠心分離した。
７．RNeasyカラムを、新規の1.5 ml回収チューブに移した。ＲＮase不含水(50μl)を、シリカゲル膜上に直接ピペットで移し、３分間室温でインキュベートした。
８．ＲＮＡを、１分、約10,000xgで遠心分離に供し、溶出した。
９．核酸、ＲＮＡを得た。
【００９４】
配列決定プロトコール
アンプリコンが、目的の標的配列決定反応と一致することを確認するために増幅反応の産物を配列決定した。配列決定反応は、製品説明書に従って市販購入し得る配列決定キット(Applied Biosystems)を用いて行った。ＤＮＡ配列を、373A sequencer system (Applied Biosystems)を用いて配列決定反応を解析することによって得た。ＤＮＡ配列を、the National Center for Bioethechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)から利用できるＢＬＡＳＴ配列比較ツールを用いて分析した。
【００９５】
実施例１：
前増幅のためのＰＣＲを用いる増強強化リアル・タイムＰＣＲ
ＰＣＲ前増幅:
全容量（２５μl）において、下記成分を混合した：ヌクレアーゼ不含水、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１Ｕ Platinum TaqＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen)、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１xＰＣＲ緩衝液、プライマー(１０μＭ)およびｃＤＮＡテンプレート(約１００ng)。ＰＣＲ増幅を、下記の温度プロファイルを用いてMasterCycler (Eppendorf)で行った：
【表５】
【００９６】
リアル・タイムＰＣＲ
ＰＣＲ前増幅の第一のラウンドの後、一部分の産物を、ＲＴ−ＰＣＲを利用するさらなる増幅のためのテンプレートとして使用した。
ＰＣＲ成分を、表３で記載した割合で混合した。
表３
【表６】
【００９７】
ＲＴ−ＰＣＲ装置(ABI 7700)を、表４の増幅プロファイルを用いてプログラムした。
【表７】
【００９８】
ＰＣＲ前増幅に続くＲＴ−ＰＣＲを用いるＳＡＲＳコロナウイルス検出の結果を、表５および６に示した。該結果を、Perkin Elmer ABI 310 Genetic Analyzerおよび上記した一般的なプロトコールを用いるＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００９９】
ＳＡＲＳ患者から得られた核酸サンプルに対する種々の増幅方法の比較
表５および６に示した結果を、様々な患者サンプルから単離された核酸を増幅することを試みることによって得た。サンプルは、ＳＡＲＳ患者から得られ、中国の上海の病院から提供された。各サンプルを、３つの異なる方法によって試験した：
ｉ）アガロースゲル電気泳動を用いる従来のＰＣＲ
ｉｉ）リアル・タイム TaqMan(登録商標)ＰＣＲ、および
ｉｉｉ）新規に説明した方法、前増幅ステップを用いる増強されたＲＴ−ＰＣＲ。
【０１００】
従来のＰＣＲを、ＰＣＲ前増幅と同じプロトコールを用いて実施した。リアル・タイム TaqMan(登録商標)ＰＣＲを、ＥＲＴ方法と同じプロトコールを用いて実施した。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】
感度試験の結果
コロナウイルスＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへ転写した。該ｃＤＮＡを連続希釈し、表６に記載の３つの方法によって試験した。
【表９】
【０１０３】
実施例２
前増幅についてＰＣＲを用いる増幅されたリアル・タイムＰＣＲ
臨床サンプルを、疑わしいか、もしくは潜在的ＳＡＲＳ症例として診断された１２０人の患者から回収し、実施例１のプロトコールを用いて、従来のＰＣＲの後のアガロースゲル電気泳動、従来のTaqMan(登録商標)リアル・タイムＰＣＲおよび本発明の増強されたTaqMan(登録商標)リアル・タイムＰＣＲアッセイによって分析した。
【０１０４】
ＥＲＴを用いて、ＳＡＲＳ−ＣｏＶポリメラーゼ遺伝子の約１９０bp 領域を、従来のＰＣＲによりｃＤＮＡから増幅させた。アンプリコンを配列決定し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの予測領域と一致することを確認した。続いて、このＰＣＲ産物を、ＲＴ−ＰＣＲ プライマーを用いる増強されたリアル・タイムＰＣＲプロトコールのためのテンプレートとして使用した。このプロトコールについて、標準的なリアル・タイム 方法による２１/１２０(１８.３％)、および様々な従来のＰＣＲ方法による１０.６％のみの平均と比較して、２８/１２０(２３.３％)患者サンプルをＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性と同定した。適当な陰性、陽性およびＰＣＲ阻害コントロールを、増幅方法の各段階で用いた。
【０１０５】
臨床サンプルについて標準的および増強されたリアル・タイムＰＣＲデータの選択を示した(図５から８)。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ陰性サンプルの間の明確な判別は、明らかである(図５、矢印で示した)。陽性および陰性シグナルの間の判別は、同一サンプルを標準的なリアル・タイムＰＣＲによって分析し、そこでＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性および陰性増幅曲線が、お互いに密接に重なる傾向がある場合には、一層不明瞭である（図７）。ＥＲＴによって得られた増強された結果を用いて、陽性および陰性シグナル間を容易に区別するようにリアル・タイムＰＣＲの結果を判断することは、さらに容易である。増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法は、従来のリアル・タイムＰＣＲ方法と比較して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ 陽性サンプルのためのサイクル時間(Ｃｔ)値の低下を導く。Ｃｔ値＜３５.０は、そうでないものからのＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を含有するサンプル間を明白に区別するための適当なカット・オフ値である。
【０１０６】
分析感度
各増幅方法の検出限界を、香港の患者から得たＳＡＲＳ−ＣｏＶ(２x１０２．５ ＴＣＩＤ５０/ml)の培養サンプルから抽出した全核酸を連続希釈することによって測定した。従来のＰＣＲ、標準的なリアル・タイムＰＣＲおよび増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法の検出限界は、各々２x １０-５.５ ＴＣＩＤ５０/ml、２x１０-１０.５ ＴＣＩＤ５０/ml (図１Ｄ)および２x１０-１２.５ＴＣＩＤ５０/ml(図１Ｃ)に相当する。このように、増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法は、標準的なリアル・タイムＰＣＲよりも少なくとも１０２倍以上の高い感度であり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの分子検出のために現在使用されている従来のいずれのＰＣＲ技術よりも１０７倍以上感度が高い。ウイルス培養によるＳＡＲＳ−ＣｏＶの検出は、増強されたリアル・タイムＰＣＲによって検出された３/２８(１０.７％)の症例のみがウイルス培養によるＳＡＲＳ−ＣｏＶに対して陽性であった場合、感度が最も低い方法といえる。
【０１０７】
増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法は、いくつかの症例において、その他のいかなるアッセイによっても確認されなかったＳＡＲＳ−ＣｏＶ 陽性サンプルを検出することが、わかった。このように、診断の精度を改善するどのような新規の検出方法も、臨床医に利用し得る一揃いの診断ツールへの価値ある追加である。従来のＰＣＲおよびリアル・タイムＰＣＲ単独では、少数のＳＡＲＳ−ＣｏＶ陽性の症例を同定しただけであった。結果を、ウイルス培養によって３/２８症例で確認した。増強されたリアル・タイムＰＣＲ方法の限界は、標準的なリアル・タイムＰＣＲアッセイよりも１０２倍以上高く、従来のＰＣＲ方法よりも１０７倍以上高い。アッセイの増強された感度が、将来ＳＡＲＳ発生中の疾患の蔓延を制御する助けとなり得る。
【０１０８】
実施例３：前増幅についてＮＡＳＢＡを用いる増強されたリアル・タイムＰＣＲ
(ｉ）ＮＡＳＢＡ反応
【表１０】
【０１０９】
【表１１】
反応混合物を、６５℃で５分間インキュベートし、次いで４１℃で５分間冷却した。次いで、５μｌの酵素混合物(１酵素範囲について、全量５５μｌ)を反応混合物に添加した。短時間の混合後、４１℃に冷却し、５分インキュベートした。該反応混合物を、短時間回転させ、次いで１.５時間、４１℃でインキュベーションに供した。
【０１１０】
(ｉｉ) TaqMan リアル・タイムＰＣＲ
ＮＡＳＢＡ前増幅の第一回目のラウンド後に、次のようにＲＴ−ＰＣＲを利用したさらなる増幅のためのＮＡＳＢＡ産物をテンプレートとして使用した:
【表１２】
【表１３】
【０１１１】
ＮＡＳＢＡ増強されたリアル・タイムＰＣＲの結果:
コロナウイルスＮＡＳＢＡ産物は、表７、８および９に示したとおり、TaqManリアル・タイムＰＣＲによって、上手く増幅され、検出されることがわかった。
【表１４】
【０１１２】
【表１５】
【０１１３】
【表１６】
【０１１４】
ＮＡＳＢＡ-TaqMan ＰＣＲの反応条件は最適化されていることを見出した。ＮＡＳＢＡ-TaqMan および通常のＮＡＳＢＡの感度は類似しており、おおよそＴＣＩＤ５０ ２×１０-５.５である。表７(ＮＡＳＢＡ ＥＣＬ 結果)から、その試験は、ＴＣＩＤ ５０ x １０−８の低いレベルまで検出され得るし、ＮＡＳＢＡ Taqman ＰＣＲ (ＥＲＴ)と同じレベルであることがわかった。しかしながら、ＮＡＳＢＡ ＥＣＬの読取りは、他の陽性シグナルとは非常に異なる７４０７である(通常、１００万カウント)。そのため、実際の状況では、この結果を、陽性と簡単に判断できない。しかし、ＮＡＳＢＡリアル・タイム ＰＣＲ (ＥＲＴ)については、Ｃｔは７.１６であり、他の陽性シグナルと類似している。従って、我々のＮＡＳＢＡリアル・タイム ＰＣＲ(ＥＲＴ)は、従来のＮＡＳＢＡ方法よりも有利である。
【０１１５】
上記実施例に示したように、その検出キットが、種々の試験場所において従来的に使用され得ることが認識され得る。さらに、検出キットは、既存方法よりも使用するのに比較的容易であり、より短時間で検出結果を提供することができ、該検出結果は、所望であれば３時間以内で利用し得る。ＤＮＡを基にした検出システムであるので、特異性および感度は増強され、実施例に記載の検出キットがＳＡＲＳコロナウイルスに特異的である、またウイルスが検出のための標的分子へ複製されるので、サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスの濃度はもはや重要ではない。
【０１１６】
この発明の好ましい実施態様が前段に記載されているが、この発明の修飾および別の形式が可能であり、請求項に記載のとおり、かかる修飾および形式が、依然この発明の範囲内であることは当業者には明白に理解されるであろう。さらに、この発明の実施態様は、実施例または図によってのみ、制限的に説明されるものではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２７のいずれかを含む、単離ＤＮＡ配列。
【請求項２】
配列番号１〜２７のいずれかからなる、請求項１記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項３】
ＤＮＡ増幅において使用するための請求項１または２に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項４】
プローブが蛍光標識されていてもよい、プライマーまたはプローブとして使用するための請求項３記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項５】
核酸単離に続いて核酸増幅、続いてリアル・タイムＰＣＲのステップを含む、核酸検出のための方法。
【請求項６】
核酸増幅が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはその他の核酸増幅技術を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
リアル・タイムＰＣＲが蛍光標識プローブを使用する、請求項５または６のいずれかに記載の核酸検出のための方法。
【請求項８】
検出されるべき核酸がＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
核酸がＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
下記ステップ：
ｉ）生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ｉｉ)核酸を増幅すること、所望によりＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そして
ｉｉｉ）リアル・タイムＰＣＲを用いて、ステップ(ｉｉ)で産生される核酸を増幅および検出すること、
を含む、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
得られた核酸がＲＮＡである場合、ステップ（ｉ）後のさらなるステップがあり、該ステップは逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
プライマーおよび/またはプローブが、ステップ(ｉｉ)および(ｉｉｉ)で使用される、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
プライマーおよび/またはプローブが、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡに結合する、ＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡを検出するための、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
使用されるプライマーおよびプローブが、配列番号１〜２７を含む単離ＤＮＡ配列に一致する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ステップ(ｉｉｉ)で使用されるプライマーがプローブと重複しない、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(ｉｉ)で使用されるプライマー対が、配列番号１、２、３、４または５；および６、７、８、９または１０のいずれかに一致する、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ステップ(ｉｉ)で使用されたプライマー対が、配列番号２６および２７のいずれかと一致する、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
ステップ(ｉｉｉ)で使用したプライマー対が、配列番号１１、１２、１３、１４または１５；および１６、１７、１８、１９または２０のいずれかに一致する、請求項１４または１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ステップ(ｉｉｉ)で使用されたプローブが、配列番号２１、２２、２３、２４または２５のいずれかに一致する、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
核酸を検出する方法において使用するための請求項１記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項２１】
核酸がＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項２０に記載した使用のための単離ＤＮＡ配列。
【請求項２２】
下記ステップ：
ｉ）生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ｉｉ）核酸を増幅すること、所望によりＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そして
ｉｉｉ)リアル・タイムＰＣＲを用いて、ステップ(ｉｉ)から核酸を増幅および検出すること、
を含む、核酸の検出方法において使用するための組成物の製造における、請求項１記載の単離ＤＮＡ配列の使用。
【請求項２３】
核酸がＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
核酸がＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡである、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
ウイルスがＳＡＲＳコロナウイルスであり、該プライマーが配列番号１〜２７からなり、ウイルス感染を検出するための診断用試験キットの製造におけるＳＡＲＳコロナウイルスに特異的なプライマーの使用。
【請求項２６】
配列番号１〜２７に一致する２以上の単離ＤＮＡ配列を含む、ＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項２７】
配列番号１、２、３、４または５、および６、７、８、９または１０のいずれかに一致しているプライマーを含む、請求項２６記載のＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項２８】
配列番号２６および２７のいずれかに一致するプライマーを含む、請求項２６記載のＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項２９】
配列番号１１、１２、１３、１４または１５、および１６、１７、１８、１９または２０のいずれかに一致するプライマーを含む、請求項２６〜２８のいずれかに記載のＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項３０】
配列番号２１、２２、２３、２４または２５のいずれかに一致するプローブを含む、請求項２９記載のＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項３１】
生物学的または環境サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための診断用試験キットであって、
(ｉ）サンプルからＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡを単離するための単離用剤、
(ｉｉ）標的分子を複製するための核酸複製剤であって、標的分子はＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列に相補的な核酸配列を包含する、そして
(ｉｉｉ）標的分子を検出するための核酸検出剤であって、該核酸検出剤が検出分子を包含する、
を含む、キット。
【請求項３２】
標的分子がｃＤＮＡ分子である、請求項３１記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３３】
請求項３１または３２記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキットであって、この中の、
該核酸複製剤は、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子を包含しており、
このＤＮＡ分子は、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子が酵素およびＤＮＡヌクレオチドの存在下で伸張し、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子がＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のｃＤＮＡ配列と結合する場合にＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のｃＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を包含しているＤＮＡ配列を生成するように、ＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列と結合するためのＤＮＡ配列を含んでいる、
キット。
【請求項３４】
第一のＤＮＡ配列が、配列番号６、７、８、９または１０、あるいは配列番号２６および２７に記載のＤＮＡ配列のいずれか一つと結合し、配列番号１、２、３、４または５のＤＮＡ配列のいずれか一つをコードする、請求項３１〜３３のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３５】
請求項３１〜３３のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキットであって、この中の、
該核酸複製剤は、第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子を包含しており、
このＤＮＡ分子は、第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子が酵素およびＤＮＡ配列の存在下で伸張し、第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子が少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのｃＤＮＡ配列と結合する場合に第一回目の増幅中に生成された少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのｃＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を包含しているＤＮＡ配列を生成するように、第一回目の増幅によって産生されたＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＤＮＡ配列に結合するためのＤＮＡ配列を含んでいる、
キット。
【請求項３６】
第二のＤＮＡ配列が、配列番号１１、１２、１３、１４または１５に記載のＤＮＡ配列のいずれか一つを、配列番号１６、１７、１８、１９または２０に記載のＤＮＡ配列のいずれか一つと一緒にコードしている、請求項３２または３３のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３７】
複製されたＤＮＡ産物が、さらなる増幅の前にまず希釈される、請求項３１〜３６のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３８】
検出分子が、標的分子に結合するためにＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列に相補的な少なくとも一部分をコードしているＤＮＡ配列；およびシグナル生成器を包含する、請求項３１〜３７のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３９】
第一のＤＮＡ分子のＤＮＡ配列が第二のＤＮＡ分子と重複しない、請求項３８記載のキット。
【請求項４０】
シグナル発生物が、
適当な検出器において検出され、定量され得る光子を放出するように刺激され得る、蛍光遺伝子分子、分子ビーコンまたはその他の分子、
のいずれか１つを含む、請求項３８または３９に記載のキット。
【請求項４１】
検出分子が、配列番号２１〜２５のＤＮＡ配列のいずれか１つをコードする、請求項３８〜４０のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項１】
配列番号１〜２７のいずれかを含む、単離ＤＮＡ配列。
【請求項２】
配列番号１〜２７のいずれかからなる、請求項１記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項３】
ＤＮＡ増幅において使用するための請求項１または２に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項４】
プローブが蛍光標識されていてもよい、プライマーまたはプローブとして使用するための請求項３記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項５】
核酸単離に続いて核酸増幅、続いてリアル・タイムＰＣＲのステップを含む、核酸検出のための方法。
【請求項６】
核酸増幅が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはその他の核酸増幅技術を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
リアル・タイムＰＣＲが蛍光標識プローブを使用する、請求項５または６のいずれかに記載の核酸検出のための方法。
【請求項８】
検出されるべき核酸がＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
核酸がＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
下記ステップ：
ｉ）生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ｉｉ)核酸を増幅すること、所望によりＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そして
ｉｉｉ）リアル・タイムＰＣＲを用いて、ステップ(ｉｉ)で産生される核酸を増幅および検出すること、
を含む、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
得られた核酸がＲＮＡである場合、ステップ（ｉ）後のさらなるステップがあり、該ステップは逆転写酵素を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換することを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
プライマーおよび/またはプローブが、ステップ(ｉｉ)および(ｉｉｉ)で使用される、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
プライマーおよび/またはプローブが、少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡに結合する、ＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡを検出するための、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
使用されるプライマーおよびプローブが、配列番号１〜２７を含む単離ＤＮＡ配列に一致する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ステップ(ｉｉｉ)で使用されるプライマーがプローブと重複しない、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ステップ(ｉｉ)で使用されるプライマー対が、配列番号１、２、３、４または５；および６、７、８、９または１０のいずれかに一致する、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ステップ(ｉｉ)で使用されたプライマー対が、配列番号２６および２７のいずれかと一致する、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
ステップ(ｉｉｉ)で使用したプライマー対が、配列番号１１、１２、１３、１４または１５；および１６、１７、１８、１９または２０のいずれかに一致する、請求項１４または１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ステップ(ｉｉｉ)で使用されたプローブが、配列番号２１、２２、２３、２４または２５のいずれかに一致する、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
核酸を検出する方法において使用するための請求項１記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項２１】
核酸がＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項２０に記載した使用のための単離ＤＮＡ配列。
【請求項２２】
下記ステップ：
ｉ）生物学的または環境サンプルから核酸を抽出すること、
ｉｉ）核酸を増幅すること、所望によりＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはその他の核酸増幅技術を用いること、そして
ｉｉｉ)リアル・タイムＰＣＲを用いて、ステップ(ｉｉ)から核酸を増幅および検出すること、
を含む、核酸の検出方法において使用するための組成物の製造における、請求項１記載の単離ＤＮＡ配列の使用。
【請求項２３】
核酸がＤＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
核酸がＳＡＲＳコロナウイルスｃＤＮＡである、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
ウイルスがＳＡＲＳコロナウイルスであり、該プライマーが配列番号１〜２７からなり、ウイルス感染を検出するための診断用試験キットの製造におけるＳＡＲＳコロナウイルスに特異的なプライマーの使用。
【請求項２６】
配列番号１〜２７に一致する２以上の単離ＤＮＡ配列を含む、ＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項２７】
配列番号１、２、３、４または５、および６、７、８、９または１０のいずれかに一致しているプライマーを含む、請求項２６記載のＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項２８】
配列番号２６および２７のいずれかに一致するプライマーを含む、請求項２６記載のＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項２９】
配列番号１１、１２、１３、１４または１５、および１６、１７、１８、１９または２０のいずれかに一致するプライマーを含む、請求項２６〜２８のいずれかに記載のＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項３０】
配列番号２１、２２、２３、２４または２５のいずれかに一致するプローブを含む、請求項２９記載のＳＡＲＳ診断用試験キット。
【請求項３１】
生物学的または環境サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための診断用試験キットであって、
(ｉ）サンプルからＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡを単離するための単離用剤、
(ｉｉ）標的分子を複製するための核酸複製剤であって、標的分子はＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列に相補的な核酸配列を包含する、そして
(ｉｉｉ）標的分子を検出するための核酸検出剤であって、該核酸検出剤が検出分子を包含する、
を含む、キット。
【請求項３２】
標的分子がｃＤＮＡ分子である、請求項３１記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３３】
請求項３１または３２記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキットであって、この中の、
該核酸複製剤は、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子を包含しており、
このＤＮＡ分子は、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子が酵素およびＤＮＡヌクレオチドの存在下で伸張し、第一の精製かつ単離されたＤＮＡ分子がＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のｃＤＮＡ配列と結合する場合にＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のｃＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を包含しているＤＮＡ配列を生成するように、ＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＲＮＡ配列と結合するためのＤＮＡ配列を含んでいる、
キット。
【請求項３４】
第一のＤＮＡ配列が、配列番号６、７、８、９または１０、あるいは配列番号２６および２７に記載のＤＮＡ配列のいずれか一つと結合し、配列番号１、２、３、４または５のＤＮＡ配列のいずれか一つをコードする、請求項３１〜３３のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３５】
請求項３１〜３３のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキットであって、この中の、
該核酸複製剤は、第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子を包含しており、
このＤＮＡ分子は、第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子が酵素およびＤＮＡ配列の存在下で伸張し、第二の精製かつ単離されたＤＮＡ分子が少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのｃＤＮＡ配列と結合する場合に第一回目の増幅中に生成された少なくとも一部分のＳＡＲＳコロナウイルスのｃＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列を包含しているＤＮＡ配列を生成するように、第一回目の増幅によって産生されたＳＡＲＳコロナウイルスの少なくとも一部分のＤＮＡ配列に結合するためのＤＮＡ配列を含んでいる、
キット。
【請求項３６】
第二のＤＮＡ配列が、配列番号１１、１２、１３、１４または１５に記載のＤＮＡ配列のいずれか一つを、配列番号１６、１７、１８、１９または２０に記載のＤＮＡ配列のいずれか一つと一緒にコードしている、請求項３２または３３のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３７】
複製されたＤＮＡ産物が、さらなる増幅の前にまず希釈される、請求項３１〜３６のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３８】
検出分子が、標的分子に結合するためにＳＡＲＳコロナウイルスのＲＮＡ配列に相補的な少なくとも一部分をコードしているＤＮＡ配列；およびシグナル生成器を包含する、請求項３１〜３７のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【請求項３９】
第一のＤＮＡ分子のＤＮＡ配列が第二のＤＮＡ分子と重複しない、請求項３８記載のキット。
【請求項４０】
シグナル発生物が、
適当な検出器において検出され、定量され得る光子を放出するように刺激され得る、蛍光遺伝子分子、分子ビーコンまたはその他の分子、
のいずれか１つを含む、請求項３８または３９に記載のキット。
【請求項４１】
検出分子が、配列番号２１〜２５のＤＮＡ配列のいずれか１つをコードする、請求項３８〜４０のいずれかに記載のＳＡＲＳコロナウイルスを検出するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−８０８８４（Ｐ２０１２−８０８８４Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３５６４５（Ｐ２０１１−２３５６４５）
【出願日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【分割の表示】特願２００６−５０４２１４（Ｐ２００６−５０４２１４）の分割
【原出願日】平成１６年４月３０日（２００４．４．３０）
【出願人】（５０５０５４９８８）ハイ・カン・ライフ・コーポレイション・リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＩ ＫＡＮＧ ＬＩＦＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【分割の表示】特願２００６−５０４２１４（Ｐ２００６−５０４２１４）の分割
【原出願日】平成１６年４月３０日（２００４．４．３０）
【出願人】（５０５０５４９８８）ハイ・カン・ライフ・コーポレイション・リミテッド (5)
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＩ ＫＡＮＧ ＬＩＦＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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