核酸配列増幅方法、核酸配列の検出方法及び核酸増幅・検出用基板
【課題】基板上における高効率な核酸増幅、高感度な核酸検出を可能な核酸検出方法及びそれに適した基板を提供すること。
【解決手段】標的核酸配列に対応するプライマーの５’末端を固定化した基板表面において，標的核酸を含む試料、核酸合成酵素，ｄＮＴＰの存在下で、前記標的核酸を鋳型とした核酸増幅反応を行い，引き続き基板上において増幅物を検出する。
【解決手段】標的核酸配列に対応するプライマーの５’末端を固定化した基板表面において，標的核酸を含む試料、核酸合成酵素，ｄＮＴＰの存在下で、前記標的核酸を鋳型とした核酸増幅反応を行い，引き続き基板上において増幅物を検出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列増幅方法、核酸配列の検出方法及び核酸増幅・検出用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸配列の検出法としては，電気泳動や固相に固定化したプローブにハイブリダイゼーションさせて検出する方法が一般的であった。しかしながら，これらの核酸検出法は感度が低く，低濃度核酸を検出する際には予め核酸増幅を行う必要があった。
【０００３】
核酸の増幅技術としては，ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が一般的である。ＰＣＲの問題点としては，その核酸合成反応が複雑な温度制御を必要とすること,数塩基違いの鋳型核酸に対して特異的な増幅が難しいこと等が指摘されている。
【０００４】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの略）法は栄研化学株式会社が開発した核酸増幅法であって,増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し,これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され,そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に,ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり,先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。解離した１本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして,固定化プライマーループ増幅法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で,伸長反応と増幅反応が同時進行するため，ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成される。ＬＡＭＰ法に関係する技術が特許文献１に開示されている。
【０００５】
従来，ＤＮＡ基板上において特定の核酸配列の有無を調べるハイブリダイゼーション法では基板上での核酸増幅の工程がないため，検出の感度が低く，微量核酸の検出には前処理としてＰＣＲによる予備増幅が不可欠であった。
【０００６】
これに対して，核酸増幅反応と核酸検出工程を同一系で行う反応が開発されている。
【０００７】
ＭＰＥＸ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＥＸｔｅｎｓｉｏｎの略）法は住友ベークライトが開発した基板上での核酸増幅法であって、親水性ポリマーからなる層，およびアミノ基と反応する官能基を表面に有する基板上に１種類のプライマーの５’末端を固定化し，標的核酸を１本鎖の状態で添加することで固定化プライマー標的核酸をアニールさせる。この固定化プライマーが標的核酸を鋳型に伸長することで，標的核酸に相補的な配列を基板上に合成する。予め，反応液にヘリカーゼを添加しておくことで再び標的核酸は１本鎖に解離し，次のプライマーにアニールするため，この反応は繰返し起きる。このように，ＭＰＥＸ法では標的核酸を鋳型にした伸長反応が順次起きることで等温条件下において核酸が増幅されるが，その増幅効率は標的核酸の初期濃度に大きく影響を受けることから，低濃度検体からの核酸検出を行うに十分な感度は得られていない。
【０００８】
その他の従来技術として、(US 7,115,400 B1) Methods of nucleic acid amplification and sequencingに示すように、固定化プライマーを用いて架橋構造を形成しながら固相で核酸増幅反応を行う方法が提案されている。この従来例は、プライマー5’末端を基板上に固定化して核酸増幅を行うが、反応温度を制御する必要がある（増幅手法がPCRと同一であるため）。また、標的核酸の検出ではなく，核酸配列の決定を目的としているので、固定化プライマーが標的核酸の相補配列ではない（検出目的でないため）といった特徴を有している。
【０００９】
さらに、（特開2005-218439）核酸検出用チップにおいては、固相核酸増幅を行い，続いて，基板上において核酸増幅反応を等温下で行って増幅産物を検出することを目的しているが、プライマーの固定化方式について具体的な増幅メカニズムの開示がない。
【００１０】
【特許文献１】国際公開００／２８０８２号パンフレット
【特許文献２】(US 7,115,400 B1) Methods of nucleic acid amplification and sequencing
【特許文献３】特開2005-218439
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は基板上における高効率な核酸増幅、高感度な核酸検出を，等温下で可能な核酸検出方法及びそれに適した基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、標的核酸配列を鋳型として、等温条件下での核酸増幅反応を可能とするプラマーセットの５’末端を固定化したことを特徴とする基板である。
【００１３】
更に、本発明は、次のような標的核酸配列の固相増幅用チップを提案する。
【００１４】
これを、図１（a）〜（ｄ）を参照して説明すると次のようになる。なお、以下の構成要素に付した符号は、本発明の理解を容易にするために便宜上、図面の引用符号を用いたが、この符号に発明が限定されるものではない。
【００１５】
すなわち、本願発明の固相増幅用チップは、基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）と、同じく前記基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）とを備える。そして、前記第１及び第２の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有する。すなわち、前記第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第１の合成鎖を生成可能な第１の配列部（Ｆ２）と、核酸合成酵素の鎖置換活性により前記鋳型核酸が前記第１の合成鎖から離れて第１の合成鎖が単鎖化すると、前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化し得る第２の配列部（Ｆ１ｃ）とを備える。
【００１６】
また、前記第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）は、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する第１の配列部（Ｂ２）と、鎖置換により前記第１の合成鎖が前記第２の合成鎖から離れて第２の合成鎖が単鎖化すると、前記第２の合成鎖の一部（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化させる第２の配列部（Ｂ１ｃ）とを備える。
【００１７】
さらに、固相増幅用チップは、以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする。
【００１８】
また、上記の複数の固定化第１プライマー及び固定化第２プライマーを有する固相増幅用チップを使用して、且つ鋳型核酸を含む試料、標的核酸配列よりも３’側にある非固定化プライマーおよび鎖置換活性を有する核酸合成酵素を用意して、等温反応の下で、以下の一連の固相核酸増幅工程が行われ核酸増幅方法を提案する。
【００１９】
すなわち、第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）の第１配列部（Ｆ２）が、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して前記標的核酸配列と相補の第１の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記鋳型核酸を前記第１の合成鎖から離して第１の合成鎖を単鎖化し、第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）の第２の配列部（Ｆ１ｃ）により前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化する工程、
第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）の第１の配列部（Ｂ２）が、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記第１の合成鎖を前記第２の合成鎖から離して第２の合成鎖を単鎖化し、第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）の第２の配列部（Ｂ１ｃ）により第２の合成鎖の一部配列（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化する工程、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーの伸長によって生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことにより標的核酸を固相増幅することを特徴とする標的核酸配列の固相増幅方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、短時間に多数種の標的核酸を増幅することができ、かつ増幅した核酸を高精度で検出することができる。また、上記増幅、検出に適した基板を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
＜基板上での固定化に関して＞
プライマーの固定化に用いるスペーサー／リンカーとしては，基板上に表面処理されている固定化試剤化合物とプライマーとの間で両者を結びつける２官能性化合物であればよい。スペーサー／リンカーとしての使用に適した化合物には，MMTr-EC Amino-Linker(SIGMA-ALDRICH)，NH2(C6) (SIGMA-ALDRICH)等が挙げられるが，特にこれらに限定されるものではない。
＜標的核酸配列に関して＞
本発明において標的核酸配列とはF2cの３’末端からB2の５’末端までの範囲の配列および前記配列と対となる相補鎖配列，B2cの３’末端からF2の５’末端までの範囲の配列のこととする。
＜ＲＮＡを標的核酸とする場合＞
標的核酸がRNAの場合には，異なる方法によって図1ｂ（4）の状態を実現することができる。すなわち，RNAを鋳型として，配列中のF2cにハイブリダイズするF2からの逆転者反応によって相補鎖（ｃＤＮＡ）合成を固定化状態で行う。続いて，非固定化プライマーF3が鋳型核酸上のF3cにハイブリダイズして相補鎖合成と鎖置換を行うことで，F2から合成された前記相補鎖配列B2cにハイブリダイズするB2の伸長反応を可能とする。この際，使用する核酸合成酵素としては逆転写活性と鎖置換活性を併せ持つBca DNAポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼを使用することが望ましいが，以降の核酸合成過程の反応条件下において，前記逆転写酵素にDNA／DNAの鎖置換活性が期待できない場合には，前述の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて用いることが望ましい。
【００２２】
以下の説明において、非固定プライマー、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、基質等を同一容器に入れて一定の昇温下で、増幅〜核酸検出を行う点を便宜上固定化プライマーループ増幅法と命名して説明するが、本発明においてはプライマーを基板に固定する点で、固定化プライマーループ増幅法とは異なることに留意すべきである。
【００２３】
本発明の最も重要なポイントは、標的核酸配列に対応する配列部を有するプライマーを基板面に固定化した状態で固定化プライマーループ増幅反応を行い，基板上において特定配列を合成する核酸の増幅法、検出法及び増幅・検出用基板にある。
【００２４】
より具体的に課題解決手段を説明すると、プライマー固定化基板を用いた固定化プライマーループ増幅反応を行い，この固定化プライマーを伸長させることによって核酸増幅する。固定化プライマーの伸長なので合成鎖は確実に基板上に固定化されることとなり，検出感度がハイブリダイゼーションの効率によらない。さらに，プライマーを複数使用することによって特定の配列のみを高感度かつ特異的に検出可能とすることを特徴とする。 本発明の好ましい実施形態を例示すると以下のようになる。
【００２５】
（１）リガンド標識したｄＮＴＰを核酸増幅反応液に添加することにより、標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として、基板上に固定化状態で増幅し、このリガンドと反応する活性物質を用いることによりこれを検出することを特徴とする核酸検出方法。 （２）リガンド又は蛍光基質を標識したｄＮＴＰを核酸増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド又は蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，この蛍光によって合成鎖を検出することを特徴とする前記核酸検出方法。
【００２６】
（３）基板上にプライマーを固定化状態で標的核酸を合成・増幅した二本鎖の核酸の検出法であって，合成鎖に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことにより発光又は発色させ、これを検出することを特徴とする核酸検出方法。
【００２７】
（４）基板上にプライマーを固定化状態で合成・増幅された標的核酸の一本鎖の検出法であって，合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションし、前記蛍光基質を発光させ、これを検出することを特徴とする核酸検出方法。
【００２８】
（５）蛍光基質を標識したｄＮＴＰを核酸増幅反応液に添加することにより標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し、この蛍光によって合成鎖を検出する前記核酸検出方法。
【００２９】
（６）放射性物質で標識したｄＮＴＰを反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，放射線を検出することを特徴とする核酸検出方法。
【００３０】
本発明において標的配列とは、増幅すべきポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポリヌクレオチドの塩基配列は、５’側から３’側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。本発明において、連続的に新たな標的塩基配列が合成されることを増幅と呼ぶ。本発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要なプライマーとして機能するポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることを言う。
【００３１】
本発明による固定化プライマーループ増幅法は、プライマーとして複数種の固定化プライマーを用いる。必要に応じ差置換合成活性により合成鎖を単鎖化するための非固定化プライマーを添加してもよい。
【００３２】
本発明の固定化プライマーループ増幅法は、基板面に固定した複数種の固定化プライマー、鎖置換合成活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、及びｄＮＴＰを用い、熱変性を必要とせずに、ほぼ等温で速やかに特異性の高い遺伝子配列の増幅反応を行うものである。本発明によれば、予めプライマーを基板にスポッティング法などにより固定して、標的核酸を増幅するので、スポット数により同時に複数の標的核酸の増幅及び／又は検出を行うことができる。
【００３３】
図１ａに示すように、標的核酸配列の５’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に、第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ、第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端から当該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に、第４の任意配列Ｂ１、第５の任意配列Ｂ２、第６の任意配列Ｂ３をそれぞれ選択する。Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の相補鎖をＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃと呼ぶ。
【００３４】
固定化プライマーＦＩＰ、ＢＩＰとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」にハイブリダイズし、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有することを特徴としたオリゴヌクレオチドであり、標的核酸配列に対応するものであり、基板表面に固定化されるものである。ここで、Ｆ２ｃより選ばれた塩基配列、およびＦ１より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配列Ｆ２及びＦ１ｃを含むプライマーで基板表面に固定されたものを固定プライマーと呼ぶ。
【００３５】
非固定化プライマーとは、『標的核酸配列の下流に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』にハイブリダイズして合成起点を与える塩基配列を有することを特徴としたオリゴヌクレオチドであり、基板表面に固定されていないものである。Ｆ３cより選ばれた塩基配列を含む非固定化のプライマーを非固定化プライマーＦ3、Ｂ３cより選ばれた塩基配列を含む非固定化のプライマーを非固定化プライマーＢ3と呼ぶ。固定化プライマー及び非固定化プライマーにおいて、Ｆは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示であり、Ｂは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示である。
【００３６】
標的塩基配列に選択的にハイブリダイズした固定化プライマーからの核酸合成反応が進行すると同時に、固定化プライマーを起点とするその下流からの核酸合成反応によって鎖置換が起こる。そのために固定化プライマーを起点とする伸長鎖が鋳型である標的塩基配列から分離し、自身の５’末端でループ構造を形成する。固定化プライマーの３’末端を起点とした伸長鎖に、もうひとつの固定化プライマーが選択的にハイブリダイズし、合成起点となり核酸合成が進行する。同時にもうひとつの非固定化プライマーを起点とする核酸合成反応によって鎖置換が起こる。その結果、自己を鋳型としながら合成起点となる３’末端を有し、両端にそれぞれループ構造を有する「ダンベル型」ヌクレオチドが形成される。
【００３７】
「ダンベル型」ヌクレオチドのループの塩基配列は、３’末端側のループの一本鎖部分に固定化プライマーが相補的にハイブリダイズし合成起点を与えるので、ループ構造を有する中間産物は連続的に固定化プライマーの鋳型として機能し、核酸合成が進行する。特に、ループ構造を複数有する中間産物は、複数の核酸合成反応が同時多発的に進行する鋳型となりながら、鎖置換反応によってまた新たなループ構造を有する中間産物を生成させる。このように等温条件下で連続的かつ大量に標的遺伝子配列の特定のヌクレオチド配列を増幅することを可能にしたのが固定化プライマーループ増幅法である。 本発明で固定化プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、3０塩基以上、好ましくは4０塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでもよい。固定化プライマーＦＩＰは、その塩基配列として標的核酸配列の３’末端配列と相補な配列よりなるオリゴヌクレオチドを３'側に、そしてそれより５’側の別の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドを５'側に持ち、その間には０から５０塩基よりなる任意のオリゴヌクレオチドを持っても良い。固定化プライマーＢＩＰの塩基配列は、固定化プライマーＦＩＰより５’側の、標的核酸配列の相補鎖の３’末端配列と相補な配列よりなるオリゴヌクレオチドを３'側に、そしてそれより５’側の別の塩基配列を５'側に持ち、その間には０から５０塩基よりなる任意の塩基配列を持ってもよい。
【００３８】
鋳型依存性核酸合成反応で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）及びＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
【００３９】
本発明の増幅法において、鋳型依存性核酸合成反応で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
＜ミスマッチ結合タンパク質＞
反応液は，ミスマッチ結合タンパク質を含んでなるものとすることができ，これにより正確な核酸増幅と検出が可能となる。
【００４０】
核酸ポリメラーゼが鋳型配列の相補配列を合成する際，合成鎖中に鋳型配列と部分的に対合できない塩基対（ミスマッチ）を誤って合成することがある。ミスマッチ結合タンパク質は，こうしたミスマッチに結合することで誤った配列の増幅を抑制することが可能である。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は，２本鎖核酸に結合することが可能であるタンパク質であればよく，好ましくはMutS（特表平9-504699号公報），MutH（特開2000-300265号公報），MutLまたは酵母に由来されるものとされ，より好ましくはMutS，MutH，MutLとされる。
【００４１】
本発明においてミスマッチとは，アデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン（Ｃ），およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組合せ，またはＧとＣの組合せ）ではないことを意味する。ミスマッチには，１つのミスマッチのみならず，複数の連続したミスマッチ，１または複数の塩基の挿入および／または欠失によるミスマッチ，ならびにそれらの組合せが含まれる。
【００４２】
ミスマッチ結合タンパク質は一本鎖核酸にも結合することがあり，このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は一本鎖核酸結合タンパク質によって阻害されることが知られている。従って，本発明においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には，一本鎖核酸結合タンパク質を併用することが望ましい。
【００４３】
以下、図面に基づいて、本発明を説明する。
【００４４】
図１ａ，図１ｂ及び図１ｃは本発明の固定化プライマーループ増幅法の概略を説明するフロー図で、まず標的核酸配列を有するオリゴヌクレオチド鎖を準備する。図１ａの上では標的核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを示しており、その標的核酸を増幅するために、図１の下に示した標的核酸と相補的なプライマーＦＩＰ，ＢＩＰを固定化プライマーとして基板表面に固定する。
【００４５】
ＤＮＡ二本鎖は、図１ａ（２）に示すように、６５℃付近において動的平衡状態となるために、ＰＣＲのように熱変性のステップを必要とせず、標的核酸に対して固定化プライマーＦＩＰがハイブリダイズする。ハイブリダイズした固定化プライマーは標的核酸を鋳型として伸長し、図１ｂ（１）に示すように、ＤＮＡ鎖（合成鎖１）を合成する。但し、ＢＩＰ伸長から反応開始の場合もある。
【００４６】
標的核酸のプライマー領域よりも下流（３’末端側）に設計された非固定化プライマーＦ３が標的核酸にハイブリダイズして伸長する。非固定化プライマーが伸長する際、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼが有する差置換活性によって、合成鎖１から標的核酸が剥ぎ取られることにより、図１ｂ（３）に示すように、合成鎖１は５’側（固定側）から単鎖化していく。
【００４７】
この際、合成鎖１は５’末端領域にＦ１ｃ，Ｆ１の相補領域を持つため、図１ｂ（４）に示すように、５’末端にループ構造を形成する。同様に、合成鎖１の３’末端に対して、ＢＩＰがアニールして伸長し、ＤＮＡ鎖（合成鎖２）がプライマー間を架橋するような形で合成され、非固定化プライマーＢ３がハイブリダイズして伸長することにより合成鎖２は５’側（固定側）から単鎖化していく。
【００４８】
合成鎖２には５’と３’末端両側に相補領域が存在すため、図１ｂ（５）に示すように、両末端にループ構造を有するダンベル型ヌクレオチドを形成する。この際、３’末端領域の相補領域から自己鎖を鋳型にした伸長反応が起こる。
【００４９】
自己鎖を鋳型とする伸長反応後、図１ｃ（６）に示すように、合成鎖２は内部配列にループ構造をとる。
【００５０】
このループ構造の単鎖部分に、図１ｃ（７）に示すように、次のＦＩＰ２がハイブリダイズして伸長することにより、あらたな核酸（合成鎖３）が合成される。なお、合成鎖２については、図１ｄ（８）に示すように、末端３’側で配列Ｂ１ｃとＢ１とが相補結合して末端３’側の配列Ｂ１で伸長し新たな核酸を生成する。合成鎖３については、図１ｄ（９）に示すように、その配列の一部Ｂ２ｃが合成鎖未生成の他の固定化プライマーＢＩＰ２の配列Ｂ２とハイブリダイズし、固定化プライマーＢＩＰ２が自己鎖を鋳型とした伸長反応と、合成鎖に形成されるループ構造に対して固定化プライマが結合・伸長することで、順次核酸が増幅される。
【００５１】
すなわち、図１（a）から（ｄ）は、次のように要約できる。
【００５２】
基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）と、同じく前記基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）とを備え、前記第１及び第２の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有し、すなわち、
前記第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第１の合成鎖を生成可能な第１の配列部（Ｆ２）と、鎖置換合成活性により前記鋳型核酸が前記第１の合成鎖から離れて第１の合成鎖が単鎖化すると、前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化し得る第２の配列部（Ｆ１ｃ）とを備え、
前記第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）は、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する第１の配列部（Ｂ２）と、鎖置換合成活性により前記第１の合成鎖が前記第２の合成鎖から離れて第２の合成鎖が単鎖化すると、前記第２の合成鎖の一部（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化させる第２の配列部（Ｂ１ｃ）とを備え、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未合成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする。
【００５３】
本発明において特定核酸配列の検出に至るまでの工程は以下の通りである。
（工程１）固定化プライマーループ増幅反応に用いる固定化プライマーのＦＩＰおよびＢＩＰを表面に固定化した基板を作製する。
（工程２）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ，非固定化プライマーを基板上に添加して等温（固定化プライマーループ増幅反応）で固定化した固定化プライマーを伸長することで核酸増幅を行う。
（工程３）ＤＮＡ増幅合成の際に，標識化したｄＮＴＰを取込ませることにより，当該標識に基づくシグナルを測定することにより合成核酸を検出する。
【００５４】
または，基板上に固定化状態で合成された二本鎖に対して，インターカレーター物質を取込むことで，これを検出してもよい。
【００５５】
本発明の最も重要なポイントは、プライマーを固定化した状態で固定化プライマーループ増幅反応を行い，基板上において特定配列を合成する核酸の増幅法およびその検出法にある。より具体的に課題解決手段を説明すると、プライマー固定化基板を用いて固定化プライマーループ増幅反応を行い，この固定化プライマーを伸長させることによって核酸増幅する。固定化プライマーの伸長なので合成鎖は確実に基板上に固定化されることとなり，検出感度がハイブリダイゼーションの効率に依存することはない。さらに，プライマーを複数使用することによって特定の配列のみを高感度かつ特異的に検出可能とすることを特徴とする。
【００５６】
本発明の１つの実施形態は、試料中の標的核酸を基板上において検出する方法にあって，固定化プライマーを用いた固定化プライマーループ増幅法によって特定核酸配列を増幅する方法である。即ち、基板表面に固定化プライマーループ増幅反応で使用する固定化プライマーＦＩＰおよびＢＩＰ固定化し，標的核酸を鋳型に当該プライマーを伸長することにより核酸を固定化状態で合成するする方法が利用できる。
【００５７】
標的核酸を含む試料と固定化プライマーループ増幅法で用いる反応液（核酸合成酵素，ｄＮＴＰ，非固定化プライマーを含む）を混合して当該基板上に添加することにより，標的核酸配列を固定化状態で合成・増幅する方法（図１，２）が採用される。この反応を利用することにより、固定化プライマーを伸長させて，基板上に固定化状態で合成・増幅された特定核酸配列を検出する核酸検出方法が提供される。
【００５８】
また、上記核酸増幅工程において，リガンド標識したｄＮＴＰを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，このリガンドと反応する活性物質を用いることでこれを検出する核酸検出方法が提供される。
【００５９】
更に、上記核酸増幅工程において，蛍光基質を標識したｄＮＴＰを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，この蛍光によって合成鎖を検出する核酸検出方法が提供される。
【００６０】
又、上記基板上に固定化状態で合成・増幅された二本鎖の核酸の検出法において，基板上の合成鎖に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことで，これを検出する核酸検出方法が提供される。
【００６１】
また、上記基板上に固定化状態で合成・増幅された一本鎖の核酸の検出法において，合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションすることで，これを検出する核酸検出方法を提供することができる。
【００６２】
以下、本発明の最良の実施形態について，図面等を参照しながら詳細に説明する。
【００６３】
＜特定核酸配列検出までの実験フロー＞
各工程における詳細説明を以下に記す。
【００６４】
（Ａ）オリゴヌクレオチド固定化基板の作製（図１，２を参照）
固定化プライマーループ増幅法では，固定化プライマーＦＩＰ，ＢＩＰおよび非固定化プライマーＦ３，Ｂ３の２組のプライマーを用いて核酸増幅が行われる。その際，基板には市販のＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製Ｓ−ＢＩＯ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を用いることができる。
【００６５】
（Ｂ）標的ＤＮＡおよび固定化プライマーループ増幅反応液を基板に添加
反応溶液には、反応溶液のｐＨを好適な範囲に調整することができる緩衝剤、酵素の触媒活性を維持することができる塩類、タンパク質や核酸が反応容器に吸着することを防いだり、酵素を保護したりする役割を果たす、非イオン性界面活性剤やウシ血清アルブミン等を添加してもよい。
【００６６】
緩衝剤としては、ｐＨを好ましくは４．０〜９．０、より好ましくは４．５〜８．５、さらに好ましくは５．０〜８．０に調整できるものであれば特に限定されない。例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、またはトリシン（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）等が挙げられる。
【００６７】
塩類としては例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＣｌ等を用いることができる。
【００６８】
非イオン性界面活性剤としては例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を用いることができる。具体的には、ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０、Ｓｈｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄの登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、ＴＷＥＥＮ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、Ｂｒｉｊ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．の登録商標）等が挙げられる。
【００６９】
ハイブリダイゼーションに好適な温度条件としては，プライマー配列から算出した融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定されるが，ハイブリダイザーション温度が高すぎると鋳型にハイブライダイズしづらくなり，逆に低いと非特異的なハイブリダイズをしてしまうといった問題を生じる。この問題を解消するために，融解温度調整剤を添加してもよい。反応液に融解温度調整剤を含有させることにより，ハイブリダイゼーション温度に影響を受けることなく，プライマーが特異的に鋳型にハイブリダイズしやすくなり，増幅反応を効率よく行うことが可能になる。核酸増幅に用いる融解温度調整剤としては，ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン），プロリン，ジメチルスルホキシド，トリメチルアミンＮ−オキシド，およびテトラアルキルアンモニウム塩，テトラエチルアンモニウムフロライド等が挙げられる。
【００７０】
これらの成分は、反応溶液を増幅反応に好適な条件に調整するために適宜選択して用いることができる。
【００７１】
実際に増幅反応を行う際、相補鎖合成の鋳型となるポリヌクレオチドを含む、または含む可能性のある溶液（以下、テンプレート溶液とする）を用いることができる。テンプレート溶液は、例えば生体試料に含まれるｍＲＮＡを検出する場合、生体試料からｍＲＮＡを抽出、精製し、テンプレート溶液として用いることができる。生体試料としては例えば、組織、喀痰、尿、生検材料、体腔液、または体腔洗浄液等が挙げられる。
【００７２】
（Ｃ）固定化プライマーループ増幅反応温度に基板を保温（６５℃付近）
固定化プライマーループ増幅反応温度６５℃付近において２本鎖ＤＮＡは動的平衡状態にあり，いずれかのプライマーがハイブリダイズしてそこから鎖置換型伸長すると，片側の鎖ははがされて１本鎖状態となる。従って，ＰＣＲに必要な熱変性を行わなくてよい。
【００７３】
固定化プライマーループ増幅法では，増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し，これらがハイブリダイズしてヘアピン状のループが形成され，そのループを起点とした鎖置換型ポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に，ループ内にハイブリダイズしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり，先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。
【００７４】
解離した１本鎖もまた，末端に相補的配列を有するため，この反応は繰り返し起きる。こうして，固定化プライマーループ増幅法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で，伸長反応と増幅反応が同時進行するため，ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成される。反応時間は，１５分以上，好ましくは６０分以上である。理論的には，反応時間を延長すれば，半永久的に核酸増幅が可能である。
【００７５】
（Ｄ）洗浄
増幅反応が終わったら、基板上の反応部を洗浄して未結合の酵素を除去する。
【００７６】
（Ｅ）活性物質の投入，反応および検出
洗浄後，活性物質を投入することにより基板上に合成・増幅した核酸を検出する。活性物質を基板上の核酸に取込む方法としては，以下の４つの方法を例示することができる。
【００７７】
（１）前記核酸配列増幅工程において，リガンド標識したｄＮＴＰを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，この基板に活性物質を投入することで基板上に増幅した核酸を検出する方法。
【００７８】
（２）前記核酸増幅工程において，蛍光基質を標識したｄＮＴＰを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，この蛍光によって合成鎖を検出する核酸検出方法。
【００７９】
（３）前記基板上に固定化状態で合成・増幅された二本鎖の核酸に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことで，これを検出する核酸検出方法。
【００８０】
（４）前記基板上に固定化状態で合成・増幅された一本鎖の核酸の検出法において，合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションすることで，これを検出する核酸検出方法。
【００８１】
上記（１）に記述した検出方式において，ビオチン化ヌクレオチド（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ，ビオチン−１１−ｄＵＴＰなど）を用いる方法がある。このうち，本発明の検出方式としてはビオチン化した核酸の検出には、ビオチンに特異的、強固に結合するタンパクのアビジン（卵白由来）、または、ストレプトアビジン（放線菌由来）を用いる。すなわち、基板上に固定化状態の合成鎖中に取込まれたビオチン化ヌクレオチドに対して，アビジンを加えるとアビジンがビオチンと結合し，これにビオチン化したアルカリホスファターゼを結合させると，ビオチンを介して酵素が結合する方式である。
【００８２】
基板を洗浄して未結合の酵素を除去した後、アルカリホスファターゼの基質である、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で反応させると、ビオチン標識プローブのハイブリダイズしたスポットに紫色の発色が見られ、発色シグナルとして検出される。発色用の酵素としては、アルカリホスファターゼ以外にも西洋ワサビのペルオキシダーゼを用いる系もある。また、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素をＤＮＡに間接的に結合させる酵素標識法、ＤＮＡのグアニン残基にフルオレン誘導体を結合させる方法もある。
【００８３】
ビオチンの代わりとして，薬用植物ジギタリスから得られる強心配糖体のジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合したｄＵＴＰ（デオキシウリジン５’−三リン酸）を用いる方法もある。この場合ＤＩＧ−ｄＵＴＰで標識されたプローブで標的の核酸とハイブリダイズさせ、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体にて免疫反応を行わせる。これをビオチンの場合と同様にＮＢＴで発色（青色）させることができる。さらに，最近ではあまり使用されないがラジオアイソトープ（ＲＩ）標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸（［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰなど）を基質として加えておき、固定化プライマー増幅の際に取り込ませ核酸内部に標識される方法もある。
【００８４】
前記（２）に記述した検出方式において使用する蛍光基質としてはＣｙ３が好ましい。
【００８５】
前記（３）に記述した検出方式において，活性物質としては，インターカレーターとしてエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ），アクリルオレンジ（ＡＯ），ＹＯＹＯ−１，ＴＯＴＯ−１，Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎなどがある。
【００８６】
前記（４）に記述した検出方式において，オリゴヌクレオチドに標識する蛍光物質としては，ＦＩＴＣ，Ｂｏｄｉｐｙ４９３，ＮＢＤ，ＴＲＩＴＩＣ，Ｔｅｘａｓ，Ｃｙ５，Ｃｙ７，ＩＲ１４４，ＦＡＭ，ＪＯＥ，ＴＡＭＲＡ，ＲＯＸなどを使用する。
【００８７】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細を説明するが，本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８８】
（実施例１）標的核酸検出基板を用いたＤＮＡ検出
実験材料
（１）標的核酸溶液（検出対象ＤＮＡをそれぞれ１０ｐＭ、１ｐＭ含む溶液：表３）
（２）反応溶液；表１及び表２に示した。
【００８９】
（３）ＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製Ｓ−ＢＩＯ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））
（４）カバーガラス（住友ベークライト製）
（５）保湿容器（日立ソフトウェアエンジニアリング製はいぶりくん（登録商標））
（６）恒温機（３０−８０℃に保温可能）
（７）検出用基質溶液（ＢＣＩＰ−ＮＢＴ，ＫＰＬ社製）
【００９０】
【表１】
【００９１】
【表２】
【００９２】
【表３】
【００９３】
試験方法
１．基板の作製
市販のＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製Ｓ−ＢＩＯ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を用いた。本基板は，親水性ポリマーからなる層，及びアミノ基と反応する官能基を表面に有するプラスチック製の基板である。横４×縦６箇所のスポット領域があり，各スポット領域で，各核酸配列の有無を評価する。
【００９４】
固定化プライマーは５’末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチド（４０ｍｅｒ）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解し，１．０μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。これらの溶液を混合しスポッタ（日立ソフトウェアエンジニアリング製Ｍａｒｋｓ−Ｉ）を用い１００クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。オリゴヌクレオチドをスポットした各基板を，８０℃で一時間加熱して，各オリゴヌクレオチドを固定化させた。
【００９５】
２．基板上核酸増幅反応
検体ＤＮＡ溶液と表１の反応溶液を混合した溶液はカバーガラスを用いてＤＮＡアレイプラスチック基板上に展開し，基板を保湿容器に密閉後，恒温機で６３℃に基板を６０分間保温する。この際のＤＮＡマイクロアレイ基板には検出対象核酸配列に特異的に増幅するプライマー（ＦＩＰ，ＢＩＰ）を固定化したものを使用する。
【００９６】
上記ＤＮＡマイクロアレイ基板上における核酸増幅反応系の手順を以下に記す（図２参照）。
【００９７】
（Ａ）固定化プライマー５’末端を固定化した基板を作製する。
【００９８】
（Ｂ）標的核酸ＤＮＡ及び固定化プライマーループ反応液を前記版に添加する。
【００９９】
（Ｃ）基板を所定温度に保持する（６５℃付近が好ましい）。
【０１００】
（Ｄ）基板を洗浄する。
【０１０１】
（Ｅ）反応系に活性物質を投入し、反応を行わせる。
【０１０２】
（Ｆ）反応の進み具合をチエックし、更に反応を継続する必要があるときは、反応系に活性物質を投入し、反応を行わせる。
【０１０３】
（Ｇ）反応が完結したら、基板を洗浄する。
【０１０４】
（Ｈ）発色、発光により又は放射線により核酸の検出を行う。
【０１０５】
３．合成核酸の検出
核酸増幅工程においてｄＮＴＰｓに対して，標識を施すことにより合成鎖を標識することで合成鎖を検出することが可能である。標識方法に関しては，詳細説明に記したように多岐にわたった方法が存在するが，実施例においてはビオチン標識化ｄＵＴＰとストレプトアビジン，ＢＣＩＰ−ＮＢＴを用いた検出法について記す。
【０１０６】
本基板上核酸増幅反応において，ビオチン標識化したｄＵＴＰを使用することで，ビオチン標識化したＤＮＡ鎖を合成する。反応後の基板を洗浄後，０．０１ｍｇ／ｍＬアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを基板上へ投入し，カバーガラスで覆い，３７℃で３０分反応させた後，洗浄を行った。
【０１０７】
ついで、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＫＰＬ））発色試薬中に基板を浸漬し，３７℃，３０分間反応させ洗浄し，青紫色のスポットを発色させた。発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製，ＰＩＸＵＳ ＭＰ４７０）でパソコンへ取り込み，画像解析ソフト（住友ベークライト製，誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。図３において、（ａ）の標的核酸濃度は、１０ｐＭ，（ｂ）は１ｐＭ，（ｃ）は０ｐＭである。図４は図３のデータを数値化したものである。
【０１０８】
（実施例２）標的核酸検出基板を用いたＲＮＡ増幅および検出
ＲＮＡを検出するためには，標的ＲＮＡを逆転写した後，核酸増幅反応を行う必要がある。その際には，表１組成のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの代わりに逆転写活性と鎖置換活性を併せ持つBca DNAポリメラーゼとＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを反応液に添加して反応すればよい。
【０１０９】
逆転写以降の核酸合成過程の反応条件下において，前記酵素にDNA／DNAの鎖置換活性が期待できない場合には，前述の鎖置換活性を有するＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ等を組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１ａ】本発明において用いられる基板上での核酸増幅法の概略を説明するフロー図で、標的核酸を鋳型としてプライマーを伸長させて合成鎖１を合成する時点までの図。
【図１ｂ】本発明において用いられる基板上での核酸増幅法の概略を説明するフロー図で、図１ａに続いて、合成鎖１を用いて合成鎖２の両末端にループ構造を形成するまでの図。
【図１ｃ】本発明において用いられる基板上での核酸増幅法の概略を説明するフロー図で、ループ構造を起点として核酸を増幅するまでの図。
【図１ｄ】合成鎖２の末端３’側で配列Ｂ１ｃとＢ１とが相補結合して末端３’側の配列Ｂ１で伸長し新たな核酸を生成する状態を示す図。
【図２】本発明の核酸検出法を示すフロー図。
【図３】標的核酸濃度に対応する発色画像を示す写真。
【図４】図３の検出結果を数値化したグラフ。
【符号の説明】
【０１１１】
ＦＩＰ１…第１の固定化プライマー、ＢＩＰ１…第２の固定化プライマー。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列増幅方法、核酸配列の検出方法及び核酸増幅・検出用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸配列の検出法としては，電気泳動や固相に固定化したプローブにハイブリダイゼーションさせて検出する方法が一般的であった。しかしながら，これらの核酸検出法は感度が低く，低濃度核酸を検出する際には予め核酸増幅を行う必要があった。
【０００３】
核酸の増幅技術としては，ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が一般的である。ＰＣＲの問題点としては，その核酸合成反応が複雑な温度制御を必要とすること,数塩基違いの鋳型核酸に対して特異的な増幅が難しいこと等が指摘されている。
【０００４】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの略）法は栄研化学株式会社が開発した核酸増幅法であって,増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し,これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され,そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に,ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり,先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。解離した１本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして,固定化プライマーループ増幅法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で,伸長反応と増幅反応が同時進行するため，ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成される。ＬＡＭＰ法に関係する技術が特許文献１に開示されている。
【０００５】
従来，ＤＮＡ基板上において特定の核酸配列の有無を調べるハイブリダイゼーション法では基板上での核酸増幅の工程がないため，検出の感度が低く，微量核酸の検出には前処理としてＰＣＲによる予備増幅が不可欠であった。
【０００６】
これに対して，核酸増幅反応と核酸検出工程を同一系で行う反応が開発されている。
【０００７】
ＭＰＥＸ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＥＸｔｅｎｓｉｏｎの略）法は住友ベークライトが開発した基板上での核酸増幅法であって、親水性ポリマーからなる層，およびアミノ基と反応する官能基を表面に有する基板上に１種類のプライマーの５’末端を固定化し，標的核酸を１本鎖の状態で添加することで固定化プライマー標的核酸をアニールさせる。この固定化プライマーが標的核酸を鋳型に伸長することで，標的核酸に相補的な配列を基板上に合成する。予め，反応液にヘリカーゼを添加しておくことで再び標的核酸は１本鎖に解離し，次のプライマーにアニールするため，この反応は繰返し起きる。このように，ＭＰＥＸ法では標的核酸を鋳型にした伸長反応が順次起きることで等温条件下において核酸が増幅されるが，その増幅効率は標的核酸の初期濃度に大きく影響を受けることから，低濃度検体からの核酸検出を行うに十分な感度は得られていない。
【０００８】
その他の従来技術として、(US 7,115,400 B1) Methods of nucleic acid amplification and sequencingに示すように、固定化プライマーを用いて架橋構造を形成しながら固相で核酸増幅反応を行う方法が提案されている。この従来例は、プライマー5’末端を基板上に固定化して核酸増幅を行うが、反応温度を制御する必要がある（増幅手法がPCRと同一であるため）。また、標的核酸の検出ではなく，核酸配列の決定を目的としているので、固定化プライマーが標的核酸の相補配列ではない（検出目的でないため）といった特徴を有している。
【０００９】
さらに、（特開2005-218439）核酸検出用チップにおいては、固相核酸増幅を行い，続いて，基板上において核酸増幅反応を等温下で行って増幅産物を検出することを目的しているが、プライマーの固定化方式について具体的な増幅メカニズムの開示がない。
【００１０】
【特許文献１】国際公開００／２８０８２号パンフレット
【特許文献２】(US 7,115,400 B1) Methods of nucleic acid amplification and sequencing
【特許文献３】特開2005-218439
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は基板上における高効率な核酸増幅、高感度な核酸検出を，等温下で可能な核酸検出方法及びそれに適した基板を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、標的核酸配列を鋳型として、等温条件下での核酸増幅反応を可能とするプラマーセットの５’末端を固定化したことを特徴とする基板である。
【００１３】
更に、本発明は、次のような標的核酸配列の固相増幅用チップを提案する。
【００１４】
これを、図１（a）〜（ｄ）を参照して説明すると次のようになる。なお、以下の構成要素に付した符号は、本発明の理解を容易にするために便宜上、図面の引用符号を用いたが、この符号に発明が限定されるものではない。
【００１５】
すなわち、本願発明の固相増幅用チップは、基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）と、同じく前記基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）とを備える。そして、前記第１及び第２の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有する。すなわち、前記第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第１の合成鎖を生成可能な第１の配列部（Ｆ２）と、核酸合成酵素の鎖置換活性により前記鋳型核酸が前記第１の合成鎖から離れて第１の合成鎖が単鎖化すると、前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化し得る第２の配列部（Ｆ１ｃ）とを備える。
【００１６】
また、前記第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）は、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する第１の配列部（Ｂ２）と、鎖置換により前記第１の合成鎖が前記第２の合成鎖から離れて第２の合成鎖が単鎖化すると、前記第２の合成鎖の一部（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化させる第２の配列部（Ｂ１ｃ）とを備える。
【００１７】
さらに、固相増幅用チップは、以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする。
【００１８】
また、上記の複数の固定化第１プライマー及び固定化第２プライマーを有する固相増幅用チップを使用して、且つ鋳型核酸を含む試料、標的核酸配列よりも３’側にある非固定化プライマーおよび鎖置換活性を有する核酸合成酵素を用意して、等温反応の下で、以下の一連の固相核酸増幅工程が行われ核酸増幅方法を提案する。
【００１９】
すなわち、第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）の第１配列部（Ｆ２）が、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して前記標的核酸配列と相補の第１の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記鋳型核酸を前記第１の合成鎖から離して第１の合成鎖を単鎖化し、第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）の第２の配列部（Ｆ１ｃ）により前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化する工程、
第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）の第１の配列部（Ｂ２）が、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記第１の合成鎖を前記第２の合成鎖から離して第２の合成鎖を単鎖化し、第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）の第２の配列部（Ｂ１ｃ）により第２の合成鎖の一部配列（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化する工程、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーの伸長によって生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことにより標的核酸を固相増幅することを特徴とする標的核酸配列の固相増幅方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、短時間に多数種の標的核酸を増幅することができ、かつ増幅した核酸を高精度で検出することができる。また、上記増幅、検出に適した基板を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
＜基板上での固定化に関して＞
プライマーの固定化に用いるスペーサー／リンカーとしては，基板上に表面処理されている固定化試剤化合物とプライマーとの間で両者を結びつける２官能性化合物であればよい。スペーサー／リンカーとしての使用に適した化合物には，MMTr-EC Amino-Linker(SIGMA-ALDRICH)，NH2(C6) (SIGMA-ALDRICH)等が挙げられるが，特にこれらに限定されるものではない。
＜標的核酸配列に関して＞
本発明において標的核酸配列とはF2cの３’末端からB2の５’末端までの範囲の配列および前記配列と対となる相補鎖配列，B2cの３’末端からF2の５’末端までの範囲の配列のこととする。
＜ＲＮＡを標的核酸とする場合＞
標的核酸がRNAの場合には，異なる方法によって図1ｂ（4）の状態を実現することができる。すなわち，RNAを鋳型として，配列中のF2cにハイブリダイズするF2からの逆転者反応によって相補鎖（ｃＤＮＡ）合成を固定化状態で行う。続いて，非固定化プライマーF3が鋳型核酸上のF3cにハイブリダイズして相補鎖合成と鎖置換を行うことで，F2から合成された前記相補鎖配列B2cにハイブリダイズするB2の伸長反応を可能とする。この際，使用する核酸合成酵素としては逆転写活性と鎖置換活性を併せ持つBca DNAポリメラーゼのようなDNAポリメラーゼを使用することが望ましいが，以降の核酸合成過程の反応条件下において，前記逆転写酵素にDNA／DNAの鎖置換活性が期待できない場合には，前述の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて用いることが望ましい。
【００２２】
以下の説明において、非固定プライマー、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、基質等を同一容器に入れて一定の昇温下で、増幅〜核酸検出を行う点を便宜上固定化プライマーループ増幅法と命名して説明するが、本発明においてはプライマーを基板に固定する点で、固定化プライマーループ増幅法とは異なることに留意すべきである。
【００２３】
本発明の最も重要なポイントは、標的核酸配列に対応する配列部を有するプライマーを基板面に固定化した状態で固定化プライマーループ増幅反応を行い，基板上において特定配列を合成する核酸の増幅法、検出法及び増幅・検出用基板にある。
【００２４】
より具体的に課題解決手段を説明すると、プライマー固定化基板を用いた固定化プライマーループ増幅反応を行い，この固定化プライマーを伸長させることによって核酸増幅する。固定化プライマーの伸長なので合成鎖は確実に基板上に固定化されることとなり，検出感度がハイブリダイゼーションの効率によらない。さらに，プライマーを複数使用することによって特定の配列のみを高感度かつ特異的に検出可能とすることを特徴とする。 本発明の好ましい実施形態を例示すると以下のようになる。
【００２５】
（１）リガンド標識したｄＮＴＰを核酸増幅反応液に添加することにより、標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として、基板上に固定化状態で増幅し、このリガンドと反応する活性物質を用いることによりこれを検出することを特徴とする核酸検出方法。 （２）リガンド又は蛍光基質を標識したｄＮＴＰを核酸増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド又は蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，この蛍光によって合成鎖を検出することを特徴とする前記核酸検出方法。
【００２６】
（３）基板上にプライマーを固定化状態で標的核酸を合成・増幅した二本鎖の核酸の検出法であって，合成鎖に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことにより発光又は発色させ、これを検出することを特徴とする核酸検出方法。
【００２７】
（４）基板上にプライマーを固定化状態で合成・増幅された標的核酸の一本鎖の検出法であって，合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションし、前記蛍光基質を発光させ、これを検出することを特徴とする核酸検出方法。
【００２８】
（５）蛍光基質を標識したｄＮＴＰを核酸増幅反応液に添加することにより標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し、この蛍光によって合成鎖を検出する前記核酸検出方法。
【００２９】
（６）放射性物質で標識したｄＮＴＰを反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，放射線を検出することを特徴とする核酸検出方法。
【００３０】
本発明において標的配列とは、増幅すべきポリヌクレオチドの塩基配列を意味する。一般にポリヌクレオチドの塩基配列は、５’側から３’側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。本発明において、連続的に新たな標的塩基配列が合成されることを増幅と呼ぶ。本発明において、相補鎖合成の起点を与えることとは、鋳型となるポリヌクレオチドに対して、相補鎖合成に必要なプライマーとして機能するポリヌクレオチドをハイブリダイズさせることを言う。
【００３１】
本発明による固定化プライマーループ増幅法は、プライマーとして複数種の固定化プライマーを用いる。必要に応じ差置換合成活性により合成鎖を単鎖化するための非固定化プライマーを添加してもよい。
【００３２】
本発明の固定化プライマーループ増幅法は、基板面に固定した複数種の固定化プライマー、鎖置換合成活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、及びｄＮＴＰを用い、熱変性を必要とせずに、ほぼ等温で速やかに特異性の高い遺伝子配列の増幅反応を行うものである。本発明によれば、予めプライマーを基板にスポッティング法などにより固定して、標的核酸を増幅するので、スポット数により同時に複数の標的核酸の増幅及び／又は検出を行うことができる。
【００３３】
図１ａに示すように、標的核酸配列の５’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に、第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ、第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端から当該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に、第４の任意配列Ｂ１、第５の任意配列Ｂ２、第６の任意配列Ｂ３をそれぞれ選択する。Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃの相補配列をそれぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の相補鎖をＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃと呼ぶ。
【００３４】
固定化プライマーＦＩＰ、ＢＩＰとは、標的塩基配列上の「ある特定のヌクレオチド配列領域」にハイブリダイズし、かつ合成起点を与える塩基配列を３’末端に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’末端に有することを特徴としたオリゴヌクレオチドであり、標的核酸配列に対応するものであり、基板表面に固定化されるものである。ここで、Ｆ２ｃより選ばれた塩基配列、およびＦ１より選ばれた塩基配列と相補的な塩基配列Ｆ２及びＦ１ｃを含むプライマーで基板表面に固定されたものを固定プライマーと呼ぶ。
【００３５】
非固定化プライマーとは、『標的核酸配列の下流に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』にハイブリダイズして合成起点を与える塩基配列を有することを特徴としたオリゴヌクレオチドであり、基板表面に固定されていないものである。Ｆ３cより選ばれた塩基配列を含む非固定化のプライマーを非固定化プライマーＦ3、Ｂ３cより選ばれた塩基配列を含む非固定化のプライマーを非固定化プライマーＢ3と呼ぶ。固定化プライマー及び非固定化プライマーにおいて、Ｆは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示であり、Ｂは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供するプライマーの表示である。
【００３６】
標的塩基配列に選択的にハイブリダイズした固定化プライマーからの核酸合成反応が進行すると同時に、固定化プライマーを起点とするその下流からの核酸合成反応によって鎖置換が起こる。そのために固定化プライマーを起点とする伸長鎖が鋳型である標的塩基配列から分離し、自身の５’末端でループ構造を形成する。固定化プライマーの３’末端を起点とした伸長鎖に、もうひとつの固定化プライマーが選択的にハイブリダイズし、合成起点となり核酸合成が進行する。同時にもうひとつの非固定化プライマーを起点とする核酸合成反応によって鎖置換が起こる。その結果、自己を鋳型としながら合成起点となる３’末端を有し、両端にそれぞれループ構造を有する「ダンベル型」ヌクレオチドが形成される。
【００３７】
「ダンベル型」ヌクレオチドのループの塩基配列は、３’末端側のループの一本鎖部分に固定化プライマーが相補的にハイブリダイズし合成起点を与えるので、ループ構造を有する中間産物は連続的に固定化プライマーの鋳型として機能し、核酸合成が進行する。特に、ループ構造を複数有する中間産物は、複数の核酸合成反応が同時多発的に進行する鋳型となりながら、鎖置換反応によってまた新たなループ構造を有する中間産物を生成させる。このように等温条件下で連続的かつ大量に標的遺伝子配列の特定のヌクレオチド配列を増幅することを可能にしたのが固定化プライマーループ増幅法である。 本発明で固定化プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの長さは、3０塩基以上、好ましくは4０塩基以上で、化学合成あるいは天然のどちらでもよい。固定化プライマーＦＩＰは、その塩基配列として標的核酸配列の３’末端配列と相補な配列よりなるオリゴヌクレオチドを３'側に、そしてそれより５’側の別の塩基配列よりなるオリゴヌクレオチドを５'側に持ち、その間には０から５０塩基よりなる任意のオリゴヌクレオチドを持っても良い。固定化プライマーＢＩＰの塩基配列は、固定化プライマーＦＩＰより５’側の、標的核酸配列の相補鎖の３’末端配列と相補な配列よりなるオリゴヌクレオチドを３'側に、そしてそれより５’側の別の塩基配列を５'側に持ち、その間には０から５０塩基よりなる任意の塩基配列を持ってもよい。
【００３８】
鋳型依存性核酸合成反応で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）及びＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
【００３９】
本発明の増幅法において、鋳型依存性核酸合成反応で使用する酵素は、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されない。このような酵素としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、その反応至適温度である６５℃付近で反応を行うのが望ましい。
＜ミスマッチ結合タンパク質＞
反応液は，ミスマッチ結合タンパク質を含んでなるものとすることができ，これにより正確な核酸増幅と検出が可能となる。
【００４０】
核酸ポリメラーゼが鋳型配列の相補配列を合成する際，合成鎖中に鋳型配列と部分的に対合できない塩基対（ミスマッチ）を誤って合成することがある。ミスマッチ結合タンパク質は，こうしたミスマッチに結合することで誤った配列の増幅を抑制することが可能である。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は，２本鎖核酸に結合することが可能であるタンパク質であればよく，好ましくはMutS（特表平9-504699号公報），MutH（特開2000-300265号公報），MutLまたは酵母に由来されるものとされ，より好ましくはMutS，MutH，MutLとされる。
【００４１】
本発明においてミスマッチとは，アデニン（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン（Ｃ），およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組合せ，またはＧとＣの組合せ）ではないことを意味する。ミスマッチには，１つのミスマッチのみならず，複数の連続したミスマッチ，１または複数の塩基の挿入および／または欠失によるミスマッチ，ならびにそれらの組合せが含まれる。
【００４２】
ミスマッチ結合タンパク質は一本鎖核酸にも結合することがあり，このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は一本鎖核酸結合タンパク質によって阻害されることが知られている。従って，本発明においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には，一本鎖核酸結合タンパク質を併用することが望ましい。
【００４３】
以下、図面に基づいて、本発明を説明する。
【００４４】
図１ａ，図１ｂ及び図１ｃは本発明の固定化プライマーループ増幅法の概略を説明するフロー図で、まず標的核酸配列を有するオリゴヌクレオチド鎖を準備する。図１ａの上では標的核酸配列を持つオリゴヌクレオチドを示しており、その標的核酸を増幅するために、図１の下に示した標的核酸と相補的なプライマーＦＩＰ，ＢＩＰを固定化プライマーとして基板表面に固定する。
【００４５】
ＤＮＡ二本鎖は、図１ａ（２）に示すように、６５℃付近において動的平衡状態となるために、ＰＣＲのように熱変性のステップを必要とせず、標的核酸に対して固定化プライマーＦＩＰがハイブリダイズする。ハイブリダイズした固定化プライマーは標的核酸を鋳型として伸長し、図１ｂ（１）に示すように、ＤＮＡ鎖（合成鎖１）を合成する。但し、ＢＩＰ伸長から反応開始の場合もある。
【００４６】
標的核酸のプライマー領域よりも下流（３’末端側）に設計された非固定化プライマーＦ３が標的核酸にハイブリダイズして伸長する。非固定化プライマーが伸長する際、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼが有する差置換活性によって、合成鎖１から標的核酸が剥ぎ取られることにより、図１ｂ（３）に示すように、合成鎖１は５’側（固定側）から単鎖化していく。
【００４７】
この際、合成鎖１は５’末端領域にＦ１ｃ，Ｆ１の相補領域を持つため、図１ｂ（４）に示すように、５’末端にループ構造を形成する。同様に、合成鎖１の３’末端に対して、ＢＩＰがアニールして伸長し、ＤＮＡ鎖（合成鎖２）がプライマー間を架橋するような形で合成され、非固定化プライマーＢ３がハイブリダイズして伸長することにより合成鎖２は５’側（固定側）から単鎖化していく。
【００４８】
合成鎖２には５’と３’末端両側に相補領域が存在すため、図１ｂ（５）に示すように、両末端にループ構造を有するダンベル型ヌクレオチドを形成する。この際、３’末端領域の相補領域から自己鎖を鋳型にした伸長反応が起こる。
【００４９】
自己鎖を鋳型とする伸長反応後、図１ｃ（６）に示すように、合成鎖２は内部配列にループ構造をとる。
【００５０】
このループ構造の単鎖部分に、図１ｃ（７）に示すように、次のＦＩＰ２がハイブリダイズして伸長することにより、あらたな核酸（合成鎖３）が合成される。なお、合成鎖２については、図１ｄ（８）に示すように、末端３’側で配列Ｂ１ｃとＢ１とが相補結合して末端３’側の配列Ｂ１で伸長し新たな核酸を生成する。合成鎖３については、図１ｄ（９）に示すように、その配列の一部Ｂ２ｃが合成鎖未生成の他の固定化プライマーＢＩＰ２の配列Ｂ２とハイブリダイズし、固定化プライマーＢＩＰ２が自己鎖を鋳型とした伸長反応と、合成鎖に形成されるループ構造に対して固定化プライマが結合・伸長することで、順次核酸が増幅される。
【００５１】
すなわち、図１（a）から（ｄ）は、次のように要約できる。
【００５２】
基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）と、同じく前記基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）とを備え、前記第１及び第２の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有し、すなわち、
前記第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第１の合成鎖を生成可能な第１の配列部（Ｆ２）と、鎖置換合成活性により前記鋳型核酸が前記第１の合成鎖から離れて第１の合成鎖が単鎖化すると、前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化し得る第２の配列部（Ｆ１ｃ）とを備え、
前記第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）は、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する第１の配列部（Ｂ２）と、鎖置換合成活性により前記第１の合成鎖が前記第２の合成鎖から離れて第２の合成鎖が単鎖化すると、前記第２の合成鎖の一部（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化させる第２の配列部（Ｂ１ｃ）とを備え、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未合成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする。
【００５３】
本発明において特定核酸配列の検出に至るまでの工程は以下の通りである。
（工程１）固定化プライマーループ増幅反応に用いる固定化プライマーのＦＩＰおよびＢＩＰを表面に固定化した基板を作製する。
（工程２）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ，非固定化プライマーを基板上に添加して等温（固定化プライマーループ増幅反応）で固定化した固定化プライマーを伸長することで核酸増幅を行う。
（工程３）ＤＮＡ増幅合成の際に，標識化したｄＮＴＰを取込ませることにより，当該標識に基づくシグナルを測定することにより合成核酸を検出する。
【００５４】
または，基板上に固定化状態で合成された二本鎖に対して，インターカレーター物質を取込むことで，これを検出してもよい。
【００５５】
本発明の最も重要なポイントは、プライマーを固定化した状態で固定化プライマーループ増幅反応を行い，基板上において特定配列を合成する核酸の増幅法およびその検出法にある。より具体的に課題解決手段を説明すると、プライマー固定化基板を用いて固定化プライマーループ増幅反応を行い，この固定化プライマーを伸長させることによって核酸増幅する。固定化プライマーの伸長なので合成鎖は確実に基板上に固定化されることとなり，検出感度がハイブリダイゼーションの効率に依存することはない。さらに，プライマーを複数使用することによって特定の配列のみを高感度かつ特異的に検出可能とすることを特徴とする。
【００５６】
本発明の１つの実施形態は、試料中の標的核酸を基板上において検出する方法にあって，固定化プライマーを用いた固定化プライマーループ増幅法によって特定核酸配列を増幅する方法である。即ち、基板表面に固定化プライマーループ増幅反応で使用する固定化プライマーＦＩＰおよびＢＩＰ固定化し，標的核酸を鋳型に当該プライマーを伸長することにより核酸を固定化状態で合成するする方法が利用できる。
【００５７】
標的核酸を含む試料と固定化プライマーループ増幅法で用いる反応液（核酸合成酵素，ｄＮＴＰ，非固定化プライマーを含む）を混合して当該基板上に添加することにより，標的核酸配列を固定化状態で合成・増幅する方法（図１，２）が採用される。この反応を利用することにより、固定化プライマーを伸長させて，基板上に固定化状態で合成・増幅された特定核酸配列を検出する核酸検出方法が提供される。
【００５８】
また、上記核酸増幅工程において，リガンド標識したｄＮＴＰを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，このリガンドと反応する活性物質を用いることでこれを検出する核酸検出方法が提供される。
【００５９】
更に、上記核酸増幅工程において，蛍光基質を標識したｄＮＴＰを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，この蛍光によって合成鎖を検出する核酸検出方法が提供される。
【００６０】
又、上記基板上に固定化状態で合成・増幅された二本鎖の核酸の検出法において，基板上の合成鎖に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことで，これを検出する核酸検出方法が提供される。
【００６１】
また、上記基板上に固定化状態で合成・増幅された一本鎖の核酸の検出法において，合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションすることで，これを検出する核酸検出方法を提供することができる。
【００６２】
以下、本発明の最良の実施形態について，図面等を参照しながら詳細に説明する。
【００６３】
＜特定核酸配列検出までの実験フロー＞
各工程における詳細説明を以下に記す。
【００６４】
（Ａ）オリゴヌクレオチド固定化基板の作製（図１，２を参照）
固定化プライマーループ増幅法では，固定化プライマーＦＩＰ，ＢＩＰおよび非固定化プライマーＦ３，Ｂ３の２組のプライマーを用いて核酸増幅が行われる。その際，基板には市販のＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製Ｓ−ＢＩＯ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を用いることができる。
【００６５】
（Ｂ）標的ＤＮＡおよび固定化プライマーループ増幅反応液を基板に添加
反応溶液には、反応溶液のｐＨを好適な範囲に調整することができる緩衝剤、酵素の触媒活性を維持することができる塩類、タンパク質や核酸が反応容器に吸着することを防いだり、酵素を保護したりする役割を果たす、非イオン性界面活性剤やウシ血清アルブミン等を添加してもよい。
【００６６】
緩衝剤としては、ｐＨを好ましくは４．０〜９．０、より好ましくは４．５〜８．５、さらに好ましくは５．０〜８．０に調整できるものであれば特に限定されない。例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、またはトリシン（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）等が挙げられる。
【００６７】
塩類としては例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＨＣｌ、ＮａＣｌ等を用いることができる。
【００６８】
非イオン性界面活性剤としては例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を用いることができる。具体的には、ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０、Ｓｈｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄの登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、ＴＷＥＥＮ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．の登録商標）、Ｂｒｉｊ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．の登録商標）等が挙げられる。
【００６９】
ハイブリダイゼーションに好適な温度条件としては，プライマー配列から算出した融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定されるが，ハイブリダイザーション温度が高すぎると鋳型にハイブライダイズしづらくなり，逆に低いと非特異的なハイブリダイズをしてしまうといった問題を生じる。この問題を解消するために，融解温度調整剤を添加してもよい。反応液に融解温度調整剤を含有させることにより，ハイブリダイゼーション温度に影響を受けることなく，プライマーが特異的に鋳型にハイブリダイズしやすくなり，増幅反応を効率よく行うことが可能になる。核酸増幅に用いる融解温度調整剤としては，ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン），プロリン，ジメチルスルホキシド，トリメチルアミンＮ−オキシド，およびテトラアルキルアンモニウム塩，テトラエチルアンモニウムフロライド等が挙げられる。
【００７０】
これらの成分は、反応溶液を増幅反応に好適な条件に調整するために適宜選択して用いることができる。
【００７１】
実際に増幅反応を行う際、相補鎖合成の鋳型となるポリヌクレオチドを含む、または含む可能性のある溶液（以下、テンプレート溶液とする）を用いることができる。テンプレート溶液は、例えば生体試料に含まれるｍＲＮＡを検出する場合、生体試料からｍＲＮＡを抽出、精製し、テンプレート溶液として用いることができる。生体試料としては例えば、組織、喀痰、尿、生検材料、体腔液、または体腔洗浄液等が挙げられる。
【００７２】
（Ｃ）固定化プライマーループ増幅反応温度に基板を保温（６５℃付近）
固定化プライマーループ増幅反応温度６５℃付近において２本鎖ＤＮＡは動的平衡状態にあり，いずれかのプライマーがハイブリダイズしてそこから鎖置換型伸長すると，片側の鎖ははがされて１本鎖状態となる。従って，ＰＣＲに必要な熱変性を行わなくてよい。
【００７３】
固定化プライマーループ増幅法では，増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し，これらがハイブリダイズしてヘアピン状のループが形成され，そのループを起点とした鎖置換型ポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に，ループ内にハイブリダイズしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり，先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。
【００７４】
解離した１本鎖もまた，末端に相補的配列を有するため，この反応は繰り返し起きる。こうして，固定化プライマーループ増幅法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で，伸長反応と増幅反応が同時進行するため，ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成される。反応時間は，１５分以上，好ましくは６０分以上である。理論的には，反応時間を延長すれば，半永久的に核酸増幅が可能である。
【００７５】
（Ｄ）洗浄
増幅反応が終わったら、基板上の反応部を洗浄して未結合の酵素を除去する。
【００７６】
（Ｅ）活性物質の投入，反応および検出
洗浄後，活性物質を投入することにより基板上に合成・増幅した核酸を検出する。活性物質を基板上の核酸に取込む方法としては，以下の４つの方法を例示することができる。
【００７７】
（１）前記核酸配列増幅工程において，リガンド標識したｄＮＴＰを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖をリガンド標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，この基板に活性物質を投入することで基板上に増幅した核酸を検出する方法。
【００７８】
（２）前記核酸増幅工程において，蛍光基質を標識したｄＮＴＰを固定化プライマーループ増幅反応液に添加することにより，標的核酸を鋳型とした合成鎖を蛍光基質標識化核酸として基板上に固定化状態で増幅し，この蛍光によって合成鎖を検出する核酸検出方法。
【００７９】
（３）前記基板上に固定化状態で合成・増幅された二本鎖の核酸に対してインターカレーションによって活性物質を取込むことで，これを検出する核酸検出方法。
【００８０】
（４）前記基板上に固定化状態で合成・増幅された一本鎖の核酸の検出法において，合成鎖に対して蛍光基質を標識化したオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイゼーションすることで，これを検出する核酸検出方法。
【００８１】
上記（１）に記述した検出方式において，ビオチン化ヌクレオチド（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ，ビオチン−１１−ｄＵＴＰなど）を用いる方法がある。このうち，本発明の検出方式としてはビオチン化した核酸の検出には、ビオチンに特異的、強固に結合するタンパクのアビジン（卵白由来）、または、ストレプトアビジン（放線菌由来）を用いる。すなわち、基板上に固定化状態の合成鎖中に取込まれたビオチン化ヌクレオチドに対して，アビジンを加えるとアビジンがビオチンと結合し，これにビオチン化したアルカリホスファターゼを結合させると，ビオチンを介して酵素が結合する方式である。
【００８２】
基板を洗浄して未結合の酵素を除去した後、アルカリホスファターゼの基質である、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で反応させると、ビオチン標識プローブのハイブリダイズしたスポットに紫色の発色が見られ、発色シグナルとして検出される。発色用の酵素としては、アルカリホスファターゼ以外にも西洋ワサビのペルオキシダーゼを用いる系もある。また、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素をＤＮＡに間接的に結合させる酵素標識法、ＤＮＡのグアニン残基にフルオレン誘導体を結合させる方法もある。
【００８３】
ビオチンの代わりとして，薬用植物ジギタリスから得られる強心配糖体のジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合したｄＵＴＰ（デオキシウリジン５’−三リン酸）を用いる方法もある。この場合ＤＩＧ−ｄＵＴＰで標識されたプローブで標的の核酸とハイブリダイズさせ、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体にて免疫反応を行わせる。これをビオチンの場合と同様にＮＢＴで発色（青色）させることができる。さらに，最近ではあまり使用されないがラジオアイソトープ（ＲＩ）標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸（［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰなど）を基質として加えておき、固定化プライマー増幅の際に取り込ませ核酸内部に標識される方法もある。
【００８４】
前記（２）に記述した検出方式において使用する蛍光基質としてはＣｙ３が好ましい。
【００８５】
前記（３）に記述した検出方式において，活性物質としては，インターカレーターとしてエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ），アクリルオレンジ（ＡＯ），ＹＯＹＯ−１，ＴＯＴＯ−１，Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎなどがある。
【００８６】
前記（４）に記述した検出方式において，オリゴヌクレオチドに標識する蛍光物質としては，ＦＩＴＣ，Ｂｏｄｉｐｙ４９３，ＮＢＤ，ＴＲＩＴＩＣ，Ｔｅｘａｓ，Ｃｙ５，Ｃｙ７，ＩＲ１４４，ＦＡＭ，ＪＯＥ，ＴＡＭＲＡ，ＲＯＸなどを使用する。
【００８７】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細を説明するが，本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８８】
（実施例１）標的核酸検出基板を用いたＤＮＡ検出
実験材料
（１）標的核酸溶液（検出対象ＤＮＡをそれぞれ１０ｐＭ、１ｐＭ含む溶液：表３）
（２）反応溶液；表１及び表２に示した。
【００８９】
（３）ＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製Ｓ−ＢＩＯ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））
（４）カバーガラス（住友ベークライト製）
（５）保湿容器（日立ソフトウェアエンジニアリング製はいぶりくん（登録商標））
（６）恒温機（３０−８０℃に保温可能）
（７）検出用基質溶液（ＢＣＩＰ−ＮＢＴ，ＫＰＬ社製）
【００９０】
【表１】
【００９１】
【表２】
【００９２】
【表３】
【００９３】
試験方法
１．基板の作製
市販のＤＮＡアレイプラスチック基板（住友ベークライト製Ｓ−ＢＩＯ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標））を用いた。本基板は，親水性ポリマーからなる層，及びアミノ基と反応する官能基を表面に有するプラスチック製の基板である。横４×縦６箇所のスポット領域があり，各スポット領域で，各核酸配列の有無を評価する。
【００９４】
固定化プライマーは５’末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチド（４０ｍｅｒ）であり，これを０．２５Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解し，１．０μＭのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。これらの溶液を混合しスポッタ（日立ソフトウェアエンジニアリング製Ｍａｒｋｓ−Ｉ）を用い１００クロスカットピンでプラスチック基板の表面上にスポットした。オリゴヌクレオチドをスポットした各基板を，８０℃で一時間加熱して，各オリゴヌクレオチドを固定化させた。
【００９５】
２．基板上核酸増幅反応
検体ＤＮＡ溶液と表１の反応溶液を混合した溶液はカバーガラスを用いてＤＮＡアレイプラスチック基板上に展開し，基板を保湿容器に密閉後，恒温機で６３℃に基板を６０分間保温する。この際のＤＮＡマイクロアレイ基板には検出対象核酸配列に特異的に増幅するプライマー（ＦＩＰ，ＢＩＰ）を固定化したものを使用する。
【００９６】
上記ＤＮＡマイクロアレイ基板上における核酸増幅反応系の手順を以下に記す（図２参照）。
【００９７】
（Ａ）固定化プライマー５’末端を固定化した基板を作製する。
【００９８】
（Ｂ）標的核酸ＤＮＡ及び固定化プライマーループ反応液を前記版に添加する。
【００９９】
（Ｃ）基板を所定温度に保持する（６５℃付近が好ましい）。
【０１００】
（Ｄ）基板を洗浄する。
【０１０１】
（Ｅ）反応系に活性物質を投入し、反応を行わせる。
【０１０２】
（Ｆ）反応の進み具合をチエックし、更に反応を継続する必要があるときは、反応系に活性物質を投入し、反応を行わせる。
【０１０３】
（Ｇ）反応が完結したら、基板を洗浄する。
【０１０４】
（Ｈ）発色、発光により又は放射線により核酸の検出を行う。
【０１０５】
３．合成核酸の検出
核酸増幅工程においてｄＮＴＰｓに対して，標識を施すことにより合成鎖を標識することで合成鎖を検出することが可能である。標識方法に関しては，詳細説明に記したように多岐にわたった方法が存在するが，実施例においてはビオチン標識化ｄＵＴＰとストレプトアビジン，ＢＣＩＰ−ＮＢＴを用いた検出法について記す。
【０１０６】
本基板上核酸増幅反応において，ビオチン標識化したｄＵＴＰを使用することで，ビオチン標識化したＤＮＡ鎖を合成する。反応後の基板を洗浄後，０．０１ｍｇ／ｍＬアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを基板上へ投入し，カバーガラスで覆い，３７℃で３０分反応させた後，洗浄を行った。
【０１０７】
ついで、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＫＰＬ））発色試薬中に基板を浸漬し，３７℃，３０分間反応させ洗浄し，青紫色のスポットを発色させた。発色画像はイメージスキャナ（キヤノン製，ＰＩＸＵＳ ＭＰ４７０）でパソコンへ取り込み，画像解析ソフト（住友ベークライト製，誰でもＤＮＡアレイ解析ソフト）で発色強度を数値化した。図３において、（ａ）の標的核酸濃度は、１０ｐＭ，（ｂ）は１ｐＭ，（ｃ）は０ｐＭである。図４は図３のデータを数値化したものである。
【０１０８】
（実施例２）標的核酸検出基板を用いたＲＮＡ増幅および検出
ＲＮＡを検出するためには，標的ＲＮＡを逆転写した後，核酸増幅反応を行う必要がある。その際には，表１組成のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの代わりに逆転写活性と鎖置換活性を併せ持つBca DNAポリメラーゼとＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを反応液に添加して反応すればよい。
【０１０９】
逆転写以降の核酸合成過程の反応条件下において，前記酵素にDNA／DNAの鎖置換活性が期待できない場合には，前述の鎖置換活性を有するＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ等を組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１ａ】本発明において用いられる基板上での核酸増幅法の概略を説明するフロー図で、標的核酸を鋳型としてプライマーを伸長させて合成鎖１を合成する時点までの図。
【図１ｂ】本発明において用いられる基板上での核酸増幅法の概略を説明するフロー図で、図１ａに続いて、合成鎖１を用いて合成鎖２の両末端にループ構造を形成するまでの図。
【図１ｃ】本発明において用いられる基板上での核酸増幅法の概略を説明するフロー図で、ループ構造を起点として核酸を増幅するまでの図。
【図１ｄ】合成鎖２の末端３’側で配列Ｂ１ｃとＢ１とが相補結合して末端３’側の配列Ｂ１で伸長し新たな核酸を生成する状態を示す図。
【図２】本発明の核酸検出法を示すフロー図。
【図３】標的核酸濃度に対応する発色画像を示す写真。
【図４】図３の検出結果を数値化したグラフ。
【符号の説明】
【０１１１】
ＦＩＰ１…第１の固定化プライマー、ＢＩＰ１…第２の固定化プライマー。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を鋳型として、等温条件下での核酸増幅反応を可能とするプラマーセットの５’末端を固定化したことを特徴とする基板。
【請求項２】
基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）と、同じく前記基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）とを備え、前記第１及び第２の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有し、すなわち、
前記第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第１の合成鎖を生成可能な第１の配列部（Ｆ２）と、核酸合成酵素の鎖置換活性により前記鋳型核酸が前記第１の合成鎖から離れて第１の合成鎖が単鎖化すると、前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化し得る第２の配列部（Ｆ１ｃ）とを備え、
前記第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）は、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する第１の配列部（Ｂ２）と、鎖置換により前記第１の合成鎖が前記第２の合成鎖から離れて第２の合成鎖が単鎖化すると、前記第２の合成鎖の一部（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化させる第２の配列部（Ｂ１ｃ）とを備え、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする標的核酸配列の固相化増幅用チップ。
【請求項３】
前記固相化増幅用チップは、前記核酸増幅により得られる合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化する試料検査用チップとして使用されることを特徴とする請求項２記載の標的核酸配列の固相増幅用チップ。
【請求項４】
請求項２記載の複数の固定化第１プライマー及び固定化第２プライマーを有する固相増幅用チップを使用して、且つ鋳型核酸を含む試料、標的核酸配列よりも３’側にある非固定化プライマーおよび鎖置換活性を有する核酸合成酵素を用意して、等温反応の下で、以下の一連の固相核酸増幅工程が行われる、すなわち、
第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）の第１配列部（Ｆ２）が、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して前記標的核酸配列と相補の第１の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記鋳型核酸を前記第１の合成鎖から離して第１の合成鎖を単鎖化し、第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）の第２の配列部（Ｆ１ｃ）により前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化する工程、
第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）の第１の配列部（Ｂ２）が、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記第１の合成鎖を前記第２の合成鎖から離して第２の合成鎖を単鎖化し、第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）の第２の配列部（Ｂ１ｃ）により第２の合成鎖の一部配列（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化する工程、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことにより標的核酸を固相増幅することを特徴とする標的核酸配列の固相増幅方法。
【請求項５】
請求項４の固相増幅方法により生成された標的核酸を鋳型とした合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化して試料検査を行うことを特徴とする試料検査方法。
【請求項６】
前記核酸増幅工程がミスマッチ結合タンパク質存在下において進行する，標的核酸配列の固相増幅方法。
【請求項１】
標的核酸配列を鋳型として、等温条件下での核酸増幅反応を可能とするプラマーセットの５’末端を固定化したことを特徴とする基板。
【請求項２】
基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）と、同じく前記基板に５’末端が共有結合により固定化された複数の第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）とを備え、前記第１及び第２の固定化プライマーは、異なる配列構造であって、等温反応の下で次の核酸増幅を行うため下記の構造を有し、すなわち、
前記第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）は、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第１の合成鎖を生成可能な第１の配列部（Ｆ２）と、核酸合成酵素の鎖置換活性により前記鋳型核酸が前記第１の合成鎖から離れて第１の合成鎖が単鎖化すると、前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化し得る第２の配列部（Ｆ１ｃ）とを備え、
前記第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）は、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する第１の配列部（Ｂ２）と、鎖置換により前記第１の合成鎖が前記第２の合成鎖から離れて第２の合成鎖が単鎖化すると、前記第２の合成鎖の一部（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化させる第２の配列部（Ｂ１ｃ）とを備え、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことが可能にしてあることを特徴とする標的核酸配列の固相化増幅用チップ。
【請求項３】
前記固相化増幅用チップは、前記核酸増幅により得られる合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化する試料検査用チップとして使用されることを特徴とする請求項２記載の標的核酸配列の固相増幅用チップ。
【請求項４】
請求項２記載の複数の固定化第１プライマー及び固定化第２プライマーを有する固相増幅用チップを使用して、且つ鋳型核酸を含む試料、標的核酸配列よりも３’側にある非固定化プライマーおよび鎖置換活性を有する核酸合成酵素を用意して、等温反応の下で、以下の一連の固相核酸増幅工程が行われる、すなわち、
第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）の第１配列部（Ｆ２）が、試料に含まれる鋳型核酸中の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｆ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して前記標的核酸配列と相補の第１の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記鋳型核酸を前記第１の合成鎖から離して第１の合成鎖を単鎖化し、第１の固定化プライマー（ＦＩＰ１）の第２の配列部（Ｆ１ｃ）により前記第１の合成鎖の一部（Ｆ１）と５’末端側で自己相補結合して第１の合成鎖をループ化する工程、
第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）の第１の配列部（Ｂ２）が、自己相補結合によりループ化された前記第１の合成鎖の標的核酸配列の３’末端の配列部（Ｂ２ｃ）にハイブリダイズして伸長反応して第２の合成鎖を生成する工程、
非固定化プライマーの伸長による鎖置換により前記第１の合成鎖を前記第２の合成鎖から離して第２の合成鎖を単鎖化し、第２の固定化プライマー（ＢＩＰ１）の第２の配列部（Ｂ１ｃ）により第２の合成鎖の一部配列（Ｂ１）と第２の固定化プライマーの５’末端側で自己相補結合して第２の合成鎖をループ化する工程、
以後、上記のようなループ化を伴って固定化プライマーで生成された合成鎖が、合成鎖未生成の他の第１の固定化プライマー（ＦＩＰ２）及び第２の固定化プライマー（ＢＩＰ２）の鋳型核酸に使用されて、この他の第１の固定化プライマー及び第２の固定化プライマーにて、上記同様の伸長反応による核酸増幅、単鎖化、自己相補結合によるループ化を順次繰り返すことにより標的核酸を固相増幅することを特徴とする標的核酸配列の固相増幅方法。
【請求項５】
請求項４の固相増幅方法により生成された標的核酸を鋳型とした合成鎖を標識化核酸として基板上に固定化して試料検査を行うことを特徴とする試料検査方法。
【請求項６】
前記核酸増幅工程がミスマッチ結合タンパク質存在下において進行する，標的核酸配列の固相増幅方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−４１９８５（Ｐ２０１０−４１９８５Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１０１２５（Ｐ２００８−２１０１２５）
【出願日】平成２０年８月１８日（２００８．８．１８）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１８日（２００８．８．１８）
【出願人】（０００００５４５２）株式会社日立プラントテクノロジー (1,767)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]