植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカー
植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカーは、プライマーＡＰ ＯＨＯ２を用いて生成した増幅断片１４００ｂｐを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物では、ＤＮＡマーカーは、通常、ホモ接合体のマッピング集団を用いて開発される。これは、生殖期の周期が長い場合は実用的でない。植物の形質関連ＤＮＡマーカーの開発は、ホモ接合体の育種集団（真の（ｒｅａｌ）同質遺伝子系統−ＲＩＬ／準（ｎｅａｒ）同質遺伝子系統−ＮＩＬ）において、形質関連の生理的パラメータを中心に行われてきた。これは時間のかかるプロセスであり、ＲＩＬ及びＮＩＬの開発には多くの年月を必要とする。さらに、表現型パラメータのいずれか一つと相関があると、量的形質と直接相関し得るＤＮＡマーカーは生成されないことが多い。
【０００３】
これまでに知られている乾燥耐性マーカーの多くは、この形質と関連のある、１つ又は別の生理的パラメータと相関関係を示す。焦点となる種々の表現型は通常、生態系に特異であるため、実験植物における生殖細胞質の迅速且つ正確な評価／スクリーニングには有用でないと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカーを確立することである。
【０００５】
本発明のさらなる目的は、生態系特異の栽培用植物を実験室で正確に選択するためのＤＮＡマーカーを提案することである。
【０００６】
また、本発明のさらなる目的は、乾燥耐性用に品種改良により改良された品種を開発するためのＤＮＡマーカーを提案することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、植物における乾燥耐性形質を迅速に診断するためのＤＮＡマーカーを提案することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、改良品種の開発の際に植物の形質転換遺伝子の同定に有用なＤＮＡマーカーを提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明により、１４００ｂｐの増幅断片を含む、植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカーが提供される。
【００１０】
本発明によれば、冷凍若葉からゲノムＤＮＡを抽出すること、こうして得られたＤＮＡを検量（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）ステップにかけること、検量したＤＮＡを分析ステップにかけることを含む、乾燥耐性用ＤＮＡマーカーの開発方法が提供される。分析したＤＮＡ断片をクローニングし、そのＤＮＡ断片をシークエンスしてＤＮＡマーカーを得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
このＤＮＡマーカーを確立するために行われるプロセスは、形質特異的な、正確で迅速に評価された生化学的マーカーとの相関により開発される点で新規である。この新規で、自明ではない、独創的なプロセスを使用することにより、乾燥耐性用ＤＮＡマーカーは確立された。
【００１２】
ゲノムＤＮＡ抽出
ＤＮＡ単離には冷凍若葉２００ｍｇを用いた。ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）法をＤＮＡ抽出に使用し、平均２０μｇのＤＮＡを得た。アガロースゲル電気泳動後、基準となる規定のＤＮＡ量を用いて、エチジウムブロマイド蛍光法に基づきＤＮＡを検量した。
【００１３】
ＲＡＰＤ試験
ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析では、各クローンの若葉のＤＮＡを、ｄＮＴＰ２５μｍ、プライマー４０ｎｇ、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．３μｌを含有する、総量２５ｕｌのＰＣＲ反応混合物の鋳型に用いた。この反応は、アニーリング温度３６℃で４５サイクル行われた。ＯＰＡＢ０６、ＯＰＡＢ１８、ＯＰＡＨ１８、ＯＰＡＨ０２、ＯＰＡＢ１７、ＯＰＡＣ１９、ＯＰＡＨ１２、ＯＰＡＬ０４、ＯＰＡＡ０２、ＯＰＡＧ１３及びＯＰＡＬ０８といった１１種類のランダムデカマー（ｄｅｃａｍｅｒ，十量体）プライマーを用いて得られたＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル上で単離し、エチジウムブロマイド存在下でＵＶ光を照射して可視化した。各クローン増殖の中でランダムに選択した植物のＲＡＰＤ分析により、各クローンプロット内の植物の遺伝的均一性を確認した（データ未掲載）。本試験で使用するため、得られた、（乾燥耐性／感受性に基づき）簡単に列挙したクローンの比較分析を行った。本試験で使用するため、（乾燥耐性／感受性に基づき）簡単に列挙した１０種類のクローンの比較分析を行った。葉を、各クローンプロット内のランダムに選択した植物から採取しつつ、このＲＡＰＤ試験を繰り返した（各セット１０クローン）。ＲＡＰＤパターンの代表的なゲル画像を図１ａに示す。図１ｂは、４種類のクローン（これも図１ａに示されている）のゲノムにおける、同じプライマーによるＲＡＰＤパターンを表している。これは、野外での乾燥耐性を示すものである（図１ｂは、ＲＡＰＤバンドのスコアリングには用いなかった）。
【００１４】
ＲＡＰＤ試験に用いたプライマー、１０クローンすべてで観察されたＲＡＰＤバンドの総数、現れた単型／多型バンドの総数、及び得られた多型バンドの割合は表１に示されている。
【００１５】
ストレス関連アイソザイム活性
切断した（水ストレスを受けた）若い茶葉を抽出緩衝液で抽出し、その抽出物を非変性ゲルに流した。適正な反応混合物にゲルを浸してゲル内でイソ酵素反応を起すことにより、酵素活性を試験した後、適正な染色液にゲルを浸して酵素活性を止めた。
【００１６】
ＳＯＤ及びＡＰＸ活性
分離した葉は、ＳＯＤ（ＥＣ １．１５．１．１）についてはリン酸カリウム５０ｍＭ（ｐＨ７．８）緩衝液で、ＡＰＸ（ＥＣ １．１１．１．１１）についてはリン酸ナトリウム１００ｍＭ（ｐＨ７．８）緩衝液でホモジナイズした。電気泳動により分離した後、次に適正な染色液にゲルを浸した後、抽出物中の酵素活性を、非変性活性ゲル（ポリアクリルアミド１２％）で可視化した。
【００１７】
電気泳動により分離したＳＯＤアイソザイムは、Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）とリボフラビンとの反応で発生したＯ２により、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を還元することで可視化した。アイソザイムを表すバンドは、アイソザイム活性により除去されたＯ２欠乏のため無色のままとなり、残りのゲルは、還元ＮＢＴのため青に染まった。ネガティブ染色されたアイソザイム活性バンドの濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ）スキャン（６３２．８ｎｍ）を、図２ａに示す。
【００１８】
ＡＰＸ活性ゲル染色は、リボフラビンの代わりにＨ２Ｏ２及びアスコルビン酸を用いてＯ２を発生させているものの、同様に行った。アイソザイムバンドのネガティブ染色は、ゲル撮影装置（Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ、ファルマシア バイオテック）で記録した。ネガティブ染色されたアイソザイム活性バンドは、６３２．８ｎｍでスキャンした。濃度測定スキャンの代表図を、図２ｂに示す。
【００１９】
乾燥耐性特異的ＤＮＡマーカーを開発するための、回帰分析によるアイソザイム活性とＤＮＡフィンガープリントとの相関試験
回帰分析は、アイソザイム試験（ＳＯＤ及びＡＰＸの）及びＲＡＰＤバンドのデータを用いて行った。ＲＡＰＤマーカーと、ＳＯＤ活性及びＡＰＸ活性との関連は、重回帰分析により調べた。酵素活性、すなわち、適切なスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びＡＰＸのアイソザイムの活性（ピーク面積）を従属変数とし、さまざまなＲＡＰＤバンド（バンド有を１、バンド無を０と採点）を独立変数として扱った。回帰分析は以下のモデルに基づき行った。
Ｙ＝ａ＋ｂiｍｉ＋ｂ２ｍ２＋・・・・・ｂｊｍｊ＋・・・・・ｂｎｍｎ＋ｄ
【００２０】
Ｙは酵素的形質、ｍはＲＡＰＤマーカー、ｂは偏回帰係数、ｄは、回帰後に残るその間の受入れ剰余（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｒｅｓｉｄｕａｌ）である。ＲＡＰＤバンドと、銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤ）及びアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＡＰＸ）（バンドＩＩ）活性との関連性の程度を表２に示す。
【００２１】
このマーカーの配列は、特許取得のため提出中である。このマーカーは、品種改良／植物形質転換の試みにより改良品種を開発するため、生態系特異の栽培（ｂ）に向けた適切な遺伝子型（ａ）の選択に活用することができるであろう。
【実施例】
【００２２】
乾燥に耐性／感受性がある（野外実施（ｆｉｅｌｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）に基づく）ことが報告されている、本試験用に選択された茶のクローンは、以下の通りである。
・本試験で正確なＤＮＡマーカーの確立（野外試験のデータと相関したＲＡＰＤ及びアイソザイム試験による）に用いたダージリン茶のクローンは、以下を使用した。ＲＲ１７／１４４、Ｔ２４６、ＣＰＩ、ＴＶ２６、ＴＶ２５、Ｂ７７７、ＡＶ２、Ｋ１／１、Ｂ６８８、Ｔ７８（いずれもダージリン茶のクローン）。
・確立されたＤＮＡマーカーが、他の茶のクローン、すなわちアッサム茶のクローンの乾燥耐性と関連することの有効性評価（野外試験と相関したＲＡＰＤ試験による）に用いた茶のクローンは、以下を使用した。ＴＶ１、ＴＶ２、ＴＶ１４、ＴＶ１７、ＴＶ２０、ＴＶ３０（いずれもアッサム茶のクローン）。
【００２３】
上記に挙げた各クローンの植物の葉は、ダージリンをＧｉｎｇ Ｔｅａ Ｅｓｔａｔｅ、アッサムをＴｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＴＲＡ）より採集した。酵素試験では、（ダージリンのクローンより）切断したばかりの葉を２４時間以内に抽出に使用した。
【００２４】
茶樹（ｔｅａ ｐｌａｎｔｓ）は多年生であり、生殖周期が長い。したがって、均一の素材（すなわち、新鮮な茶葉）を迅速に入手するには、栄養繁殖された茶のクローンが茶産業用の茶樹集団となる。そのような集団では、雑種世代による連鎖研究は多大な時間を必要とする。こうした状況下では、ＤＮＡフィンガープリントパターンと、限られた遺伝子プールに属する植物の所望の表現型形質に関する正確な生化学的パラメータとの間の回帰分析で裏づけられた関連研究によるＤＮＡマーカーの開発が、１つの有用な代替法となろう。
【００２５】
細胞保護酵素、具体的にはＣｕ−Ｚｎ細胞質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＡＰＸ）は、植物の乾燥耐性と相関していることが報告されている。本試験では、ＲＡＰＤパターン及び乾燥特異的アイソザイム活性に関する回帰分析を用いて、茶樹の乾燥耐性関連ＤＮＡマーカーの確立を試みた。
【００２６】
図１ａ及び図１ｂは、このＤＮＡマーカーの確立に用いた茶のクローンにおけるＲＡＰＤパターンを示している。データ再現性は、３回の反復実験で同一のフィンガープリントパターンを観察して確認された。ＲＡＰＤ試験における再現性を示す同様のアプローチが、以前に報告されている。１０種類のクローンに関するＲＡＰＤ試験で１１種類のプライマーを使用したところ、１８０のＰＣＲバンドが明らかになり、このうち１３１バンド（すなわち、増幅断片計１８０個の６９．８７％）は多型であった（表１）。これは、ＲＡＰＤ法が茶樹の生殖細胞質におけるかなりのレベルの多型を明らかにできることを示している。
【００２７】
限られた遺伝子プールに属する植物のフィンガープリントパターンから生成した多型マーカーは、特異形質に関する独自の特徴を表すことを念頭におき、ＲＡＰＤ（ゲノム）分析と乾燥特異的アイソザイム活性との相関試験により、乾燥耐性関連分子（ＤＮＡ）マーカーの開発を試みた。このため、容易にスコア付け可能なＲＡＰＤ（優性）マーカーと、植物の乾燥耐性に関する生化学的パラメータ（すなわち、ＳＯＤ及びＡＰＸ活性）との間の試験が行われた。
【００２８】
ストレス関連の細胞保護酵素の活性は、詳細に検討が行われてきた。細胞質のＣｕ−Ｚｎ ＳＯＤ及びＡＰＸは、植物の乾燥耐性に関連していることが知られている。研究対象のクローンにおける乾燥耐性の評価に基づいたアイソザイムマーカーは、ＳＯＤ及びＡＰＸアイソザイム活性を評価することで作成される。ＳＯＤ活性ゲルの濃度測定スキャン（図２ａ）は、４つの主なピークを示している。約２９ｋＤのピーク（バンドＩＶ）は、Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤを表している。このピークは、Ｔ２４６、ＴＶ２５、Ｂ７７７、Ｋ１／１、Ｂ６８８、Ｔ７８のピークＩＶ下の面積（ピーク面積７０ｍｍ２未満）に比べて、クローンＲＲ１７／１４４、ＣＰ１、ＴＶ２６、及びＡＶ２の高い活性（ピーク面積１００ｍｍ２超）を示していることがわかった。これは、クローンＲＲ１７／１４４、ＣＰ１、ＴＶ２６、及びＡＶ２が、乾燥耐性形質を保有していることを示唆する。
【００２９】
高い乾燥耐性を有するタバコの品種は、非常に高いアスコルビン酸ペルオキシダーゼ活性を示す。ＮＢＴ染色した２つのアイソザイムバンド（これらの１つがすなわちＡＰＸＩＩ）により明らかになった、非変性のポリアクリルアミドゲル電気泳動試験による、乾燥ストレスを受けた（茶）葉のＡＰＸ活性を示した図（２ｂ）の私のデータは、分子量約２９ｋＤのモノマー及び約４０Ｋｄ（ＡＰＸバンド１）のもう１つのモノマーであることがわかった。活性ゲルの濃度測定スキャン（図２ｂ）では、２バンドは、約４０ｋＤ（ＡＰＸバンドＩ）及び約２９ｋＤ（ＡＰＸバンドＩＩ）の２つのピークで表されている。約２９ｋＤ（ＡＰＸＩＩ）のアイソザイムのピークは、特に、クローンＲＲ１７／１４４、ＣＰ１、ＴＶ２６、ＡＶ２での高い活性（ピーク面積９０ｍｍ２超）を示した。Ｔ２４６、ＴＶ２５、Ｂ７７７、Ｋ１／１、Ｂ６８８、Ｔ７８は、低い活性（ピーク面積５０ｍｍ２未満）を示した。高いＡＰＸＩＩ活性（図２ｂ）を示したクローンが、高いＣｕ−Ｚｎ ＳＯＤ活性（図２ａ）も示したことは注目されてよい。これらのクローンは、野外実施データでも乾燥耐性を示している。
【００３０】
ＲＡＰＤバンドと対象となる形質との関連性の研究が報告されている。形質関連ＤＮＡマーカーの確立で正確さを期すため、重回帰分析では極めて多様なイネのアクセッションのＲＡＰＤ分析を用いて、ＤＮＡマーカーと量的形質との関連が判断されている。本試験では、（表２）に表された回帰分析は、従属変数である特異的なアイソザイム活性のピーク面積と、独立変数であるＲＡＰＤバンド（図１ａ）のスコアとの関連を判定するために行われた。段階的回帰分析は、ＯＰＡＨ０２プライマーにより得られたＲＡＰＤバンド（１４００ｂｐ）が、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ活性（ｂ＝０．９７０）及びＡＰＸＩＩ活性（ｂ＝０．９６８）に関する極めて有意な回帰係数を有することを示した。フィッシャーの直接確率検定（Ｆ検定）により、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ及びＡＰＸＩＩと、１４００ｂｐのＲＡＰＤバンドとの関連は、９９．９％の信頼度で有意となることがわかった。乾燥耐性特異的アイソザイムの高い活性を示すクローンと関連するため、このＤＮＡバンド（マーカー）は、茶樹の乾燥耐性用の生殖細胞質スクリーニングに使用することができる。１４００ｂｐのこのバンドは、図１ａ及び１ｂで矢印を付けている。
【００３１】
１４００ｂｐのこのバンドは、現在さらに特徴が明らかになっている。
【００３２】
このＤＮＡ断片は、いくつかのアッサム茶のクローンを含む、ランダムに選択された他の茶樹において、その有効性がさらに調べられている。
【００３３】
これまでに示されたＲＡＰＤパターンの有効性試験では、同じプライマー、すなわちＡＰＯＨ０２が、いくつかのアッサム茶樹においても１４００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅したことが明らかになっている（図３ａ及び３ｂの矢印）。
【００３４】
表１：１１種類のランダムプライマー配列と、そのスコア付けされた増幅バンド及び多型バンドの数
【表１】
【００３５】
表２：Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤ、ＡＰＸＩＩと、１４００ｂｐのＲＡＰＤバンドとの関連
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】プライマーＯＰＡＨ０２を用いた、ダージリン茶樹生殖細胞質のＲＡＰＤパターン（１．５％アガロースゲル上）；ＤＮＡ断片を矢印で示した。Ｍ＝１００ｂｐ分子量マーカー。
【図２】ダージリン茶樹（クローン）における（ａ）ＳＯＤ及び（ｂ）ＡＰＸのアイソザイム活性を示す、ＮＢＴ染色された、１．２％非変性ポリアクリルアミドゲルの濃度測定スキャン。
【図３】プライマーＯＰＡＨ０２を用いた、アッサム茶樹生殖細胞質のＲＡＰＤパターン（１．５％アガロースゲル上）；ＤＮＡ断片を矢印で示した。Ｍ＝１００ｂｐ分子量マーカー。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物では、ＤＮＡマーカーは、通常、ホモ接合体のマッピング集団を用いて開発される。これは、生殖期の周期が長い場合は実用的でない。植物の形質関連ＤＮＡマーカーの開発は、ホモ接合体の育種集団（真の（ｒｅａｌ）同質遺伝子系統−ＲＩＬ／準（ｎｅａｒ）同質遺伝子系統−ＮＩＬ）において、形質関連の生理的パラメータを中心に行われてきた。これは時間のかかるプロセスであり、ＲＩＬ及びＮＩＬの開発には多くの年月を必要とする。さらに、表現型パラメータのいずれか一つと相関があると、量的形質と直接相関し得るＤＮＡマーカーは生成されないことが多い。
【０００３】
これまでに知られている乾燥耐性マーカーの多くは、この形質と関連のある、１つ又は別の生理的パラメータと相関関係を示す。焦点となる種々の表現型は通常、生態系に特異であるため、実験植物における生殖細胞質の迅速且つ正確な評価／スクリーニングには有用でないと考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカーを確立することである。
【０００５】
本発明のさらなる目的は、生態系特異の栽培用植物を実験室で正確に選択するためのＤＮＡマーカーを提案することである。
【０００６】
また、本発明のさらなる目的は、乾燥耐性用に品種改良により改良された品種を開発するためのＤＮＡマーカーを提案することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、植物における乾燥耐性形質を迅速に診断するためのＤＮＡマーカーを提案することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、改良品種の開発の際に植物の形質転換遺伝子の同定に有用なＤＮＡマーカーを提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明により、１４００ｂｐの増幅断片を含む、植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカーが提供される。
【００１０】
本発明によれば、冷凍若葉からゲノムＤＮＡを抽出すること、こうして得られたＤＮＡを検量（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）ステップにかけること、検量したＤＮＡを分析ステップにかけることを含む、乾燥耐性用ＤＮＡマーカーの開発方法が提供される。分析したＤＮＡ断片をクローニングし、そのＤＮＡ断片をシークエンスしてＤＮＡマーカーを得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
このＤＮＡマーカーを確立するために行われるプロセスは、形質特異的な、正確で迅速に評価された生化学的マーカーとの相関により開発される点で新規である。この新規で、自明ではない、独創的なプロセスを使用することにより、乾燥耐性用ＤＮＡマーカーは確立された。
【００１２】
ゲノムＤＮＡ抽出
ＤＮＡ単離には冷凍若葉２００ｍｇを用いた。ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）法をＤＮＡ抽出に使用し、平均２０μｇのＤＮＡを得た。アガロースゲル電気泳動後、基準となる規定のＤＮＡ量を用いて、エチジウムブロマイド蛍光法に基づきＤＮＡを検量した。
【００１３】
ＲＡＰＤ試験
ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析では、各クローンの若葉のＤＮＡを、ｄＮＴＰ２５μｍ、プライマー４０ｎｇ、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ０．３μｌを含有する、総量２５ｕｌのＰＣＲ反応混合物の鋳型に用いた。この反応は、アニーリング温度３６℃で４５サイクル行われた。ＯＰＡＢ０６、ＯＰＡＢ１８、ＯＰＡＨ１８、ＯＰＡＨ０２、ＯＰＡＢ１７、ＯＰＡＣ１９、ＯＰＡＨ１２、ＯＰＡＬ０４、ＯＰＡＡ０２、ＯＰＡＧ１３及びＯＰＡＬ０８といった１１種類のランダムデカマー（ｄｅｃａｍｅｒ，十量体）プライマーを用いて得られたＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル上で単離し、エチジウムブロマイド存在下でＵＶ光を照射して可視化した。各クローン増殖の中でランダムに選択した植物のＲＡＰＤ分析により、各クローンプロット内の植物の遺伝的均一性を確認した（データ未掲載）。本試験で使用するため、得られた、（乾燥耐性／感受性に基づき）簡単に列挙したクローンの比較分析を行った。本試験で使用するため、（乾燥耐性／感受性に基づき）簡単に列挙した１０種類のクローンの比較分析を行った。葉を、各クローンプロット内のランダムに選択した植物から採取しつつ、このＲＡＰＤ試験を繰り返した（各セット１０クローン）。ＲＡＰＤパターンの代表的なゲル画像を図１ａに示す。図１ｂは、４種類のクローン（これも図１ａに示されている）のゲノムにおける、同じプライマーによるＲＡＰＤパターンを表している。これは、野外での乾燥耐性を示すものである（図１ｂは、ＲＡＰＤバンドのスコアリングには用いなかった）。
【００１４】
ＲＡＰＤ試験に用いたプライマー、１０クローンすべてで観察されたＲＡＰＤバンドの総数、現れた単型／多型バンドの総数、及び得られた多型バンドの割合は表１に示されている。
【００１５】
ストレス関連アイソザイム活性
切断した（水ストレスを受けた）若い茶葉を抽出緩衝液で抽出し、その抽出物を非変性ゲルに流した。適正な反応混合物にゲルを浸してゲル内でイソ酵素反応を起すことにより、酵素活性を試験した後、適正な染色液にゲルを浸して酵素活性を止めた。
【００１６】
ＳＯＤ及びＡＰＸ活性
分離した葉は、ＳＯＤ（ＥＣ １．１５．１．１）についてはリン酸カリウム５０ｍＭ（ｐＨ７．８）緩衝液で、ＡＰＸ（ＥＣ １．１１．１．１１）についてはリン酸ナトリウム１００ｍＭ（ｐＨ７．８）緩衝液でホモジナイズした。電気泳動により分離した後、次に適正な染色液にゲルを浸した後、抽出物中の酵素活性を、非変性活性ゲル（ポリアクリルアミド１２％）で可視化した。
【００１７】
電気泳動により分離したＳＯＤアイソザイムは、Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）とリボフラビンとの反応で発生したＯ２により、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を還元することで可視化した。アイソザイムを表すバンドは、アイソザイム活性により除去されたＯ２欠乏のため無色のままとなり、残りのゲルは、還元ＮＢＴのため青に染まった。ネガティブ染色されたアイソザイム活性バンドの濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ）スキャン（６３２．８ｎｍ）を、図２ａに示す。
【００１８】
ＡＰＸ活性ゲル染色は、リボフラビンの代わりにＨ２Ｏ２及びアスコルビン酸を用いてＯ２を発生させているものの、同様に行った。アイソザイムバンドのネガティブ染色は、ゲル撮影装置（Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ、ファルマシア バイオテック）で記録した。ネガティブ染色されたアイソザイム活性バンドは、６３２．８ｎｍでスキャンした。濃度測定スキャンの代表図を、図２ｂに示す。
【００１９】
乾燥耐性特異的ＤＮＡマーカーを開発するための、回帰分析によるアイソザイム活性とＤＮＡフィンガープリントとの相関試験
回帰分析は、アイソザイム試験（ＳＯＤ及びＡＰＸの）及びＲＡＰＤバンドのデータを用いて行った。ＲＡＰＤマーカーと、ＳＯＤ活性及びＡＰＸ活性との関連は、重回帰分析により調べた。酵素活性、すなわち、適切なスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びＡＰＸのアイソザイムの活性（ピーク面積）を従属変数とし、さまざまなＲＡＰＤバンド（バンド有を１、バンド無を０と採点）を独立変数として扱った。回帰分析は以下のモデルに基づき行った。
Ｙ＝ａ＋ｂiｍｉ＋ｂ２ｍ２＋・・・・・ｂｊｍｊ＋・・・・・ｂｎｍｎ＋ｄ
【００２０】
Ｙは酵素的形質、ｍはＲＡＰＤマーカー、ｂは偏回帰係数、ｄは、回帰後に残るその間の受入れ剰余（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｒｅｓｉｄｕａｌ）である。ＲＡＰＤバンドと、銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤ）及びアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＡＰＸ）（バンドＩＩ）活性との関連性の程度を表２に示す。
【００２１】
このマーカーの配列は、特許取得のため提出中である。このマーカーは、品種改良／植物形質転換の試みにより改良品種を開発するため、生態系特異の栽培（ｂ）に向けた適切な遺伝子型（ａ）の選択に活用することができるであろう。
【実施例】
【００２２】
乾燥に耐性／感受性がある（野外実施（ｆｉｅｌｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）に基づく）ことが報告されている、本試験用に選択された茶のクローンは、以下の通りである。
・本試験で正確なＤＮＡマーカーの確立（野外試験のデータと相関したＲＡＰＤ及びアイソザイム試験による）に用いたダージリン茶のクローンは、以下を使用した。ＲＲ１７／１４４、Ｔ２４６、ＣＰＩ、ＴＶ２６、ＴＶ２５、Ｂ７７７、ＡＶ２、Ｋ１／１、Ｂ６８８、Ｔ７８（いずれもダージリン茶のクローン）。
・確立されたＤＮＡマーカーが、他の茶のクローン、すなわちアッサム茶のクローンの乾燥耐性と関連することの有効性評価（野外試験と相関したＲＡＰＤ試験による）に用いた茶のクローンは、以下を使用した。ＴＶ１、ＴＶ２、ＴＶ１４、ＴＶ１７、ＴＶ２０、ＴＶ３０（いずれもアッサム茶のクローン）。
【００２３】
上記に挙げた各クローンの植物の葉は、ダージリンをＧｉｎｇ Ｔｅａ Ｅｓｔａｔｅ、アッサムをＴｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＴＲＡ）より採集した。酵素試験では、（ダージリンのクローンより）切断したばかりの葉を２４時間以内に抽出に使用した。
【００２４】
茶樹（ｔｅａ ｐｌａｎｔｓ）は多年生であり、生殖周期が長い。したがって、均一の素材（すなわち、新鮮な茶葉）を迅速に入手するには、栄養繁殖された茶のクローンが茶産業用の茶樹集団となる。そのような集団では、雑種世代による連鎖研究は多大な時間を必要とする。こうした状況下では、ＤＮＡフィンガープリントパターンと、限られた遺伝子プールに属する植物の所望の表現型形質に関する正確な生化学的パラメータとの間の回帰分析で裏づけられた関連研究によるＤＮＡマーカーの開発が、１つの有用な代替法となろう。
【００２５】
細胞保護酵素、具体的にはＣｕ−Ｚｎ細胞質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＡＰＸ）は、植物の乾燥耐性と相関していることが報告されている。本試験では、ＲＡＰＤパターン及び乾燥特異的アイソザイム活性に関する回帰分析を用いて、茶樹の乾燥耐性関連ＤＮＡマーカーの確立を試みた。
【００２６】
図１ａ及び図１ｂは、このＤＮＡマーカーの確立に用いた茶のクローンにおけるＲＡＰＤパターンを示している。データ再現性は、３回の反復実験で同一のフィンガープリントパターンを観察して確認された。ＲＡＰＤ試験における再現性を示す同様のアプローチが、以前に報告されている。１０種類のクローンに関するＲＡＰＤ試験で１１種類のプライマーを使用したところ、１８０のＰＣＲバンドが明らかになり、このうち１３１バンド（すなわち、増幅断片計１８０個の６９．８７％）は多型であった（表１）。これは、ＲＡＰＤ法が茶樹の生殖細胞質におけるかなりのレベルの多型を明らかにできることを示している。
【００２７】
限られた遺伝子プールに属する植物のフィンガープリントパターンから生成した多型マーカーは、特異形質に関する独自の特徴を表すことを念頭におき、ＲＡＰＤ（ゲノム）分析と乾燥特異的アイソザイム活性との相関試験により、乾燥耐性関連分子（ＤＮＡ）マーカーの開発を試みた。このため、容易にスコア付け可能なＲＡＰＤ（優性）マーカーと、植物の乾燥耐性に関する生化学的パラメータ（すなわち、ＳＯＤ及びＡＰＸ活性）との間の試験が行われた。
【００２８】
ストレス関連の細胞保護酵素の活性は、詳細に検討が行われてきた。細胞質のＣｕ−Ｚｎ ＳＯＤ及びＡＰＸは、植物の乾燥耐性に関連していることが知られている。研究対象のクローンにおける乾燥耐性の評価に基づいたアイソザイムマーカーは、ＳＯＤ及びＡＰＸアイソザイム活性を評価することで作成される。ＳＯＤ活性ゲルの濃度測定スキャン（図２ａ）は、４つの主なピークを示している。約２９ｋＤのピーク（バンドＩＶ）は、Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤを表している。このピークは、Ｔ２４６、ＴＶ２５、Ｂ７７７、Ｋ１／１、Ｂ６８８、Ｔ７８のピークＩＶ下の面積（ピーク面積７０ｍｍ２未満）に比べて、クローンＲＲ１７／１４４、ＣＰ１、ＴＶ２６、及びＡＶ２の高い活性（ピーク面積１００ｍｍ２超）を示していることがわかった。これは、クローンＲＲ１７／１４４、ＣＰ１、ＴＶ２６、及びＡＶ２が、乾燥耐性形質を保有していることを示唆する。
【００２９】
高い乾燥耐性を有するタバコの品種は、非常に高いアスコルビン酸ペルオキシダーゼ活性を示す。ＮＢＴ染色した２つのアイソザイムバンド（これらの１つがすなわちＡＰＸＩＩ）により明らかになった、非変性のポリアクリルアミドゲル電気泳動試験による、乾燥ストレスを受けた（茶）葉のＡＰＸ活性を示した図（２ｂ）の私のデータは、分子量約２９ｋＤのモノマー及び約４０Ｋｄ（ＡＰＸバンド１）のもう１つのモノマーであることがわかった。活性ゲルの濃度測定スキャン（図２ｂ）では、２バンドは、約４０ｋＤ（ＡＰＸバンドＩ）及び約２９ｋＤ（ＡＰＸバンドＩＩ）の２つのピークで表されている。約２９ｋＤ（ＡＰＸＩＩ）のアイソザイムのピークは、特に、クローンＲＲ１７／１４４、ＣＰ１、ＴＶ２６、ＡＶ２での高い活性（ピーク面積９０ｍｍ２超）を示した。Ｔ２４６、ＴＶ２５、Ｂ７７７、Ｋ１／１、Ｂ６８８、Ｔ７８は、低い活性（ピーク面積５０ｍｍ２未満）を示した。高いＡＰＸＩＩ活性（図２ｂ）を示したクローンが、高いＣｕ−Ｚｎ ＳＯＤ活性（図２ａ）も示したことは注目されてよい。これらのクローンは、野外実施データでも乾燥耐性を示している。
【００３０】
ＲＡＰＤバンドと対象となる形質との関連性の研究が報告されている。形質関連ＤＮＡマーカーの確立で正確さを期すため、重回帰分析では極めて多様なイネのアクセッションのＲＡＰＤ分析を用いて、ＤＮＡマーカーと量的形質との関連が判断されている。本試験では、（表２）に表された回帰分析は、従属変数である特異的なアイソザイム活性のピーク面積と、独立変数であるＲＡＰＤバンド（図１ａ）のスコアとの関連を判定するために行われた。段階的回帰分析は、ＯＰＡＨ０２プライマーにより得られたＲＡＰＤバンド（１４００ｂｐ）が、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ活性（ｂ＝０．９７０）及びＡＰＸＩＩ活性（ｂ＝０．９６８）に関する極めて有意な回帰係数を有することを示した。フィッシャーの直接確率検定（Ｆ検定）により、Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ及びＡＰＸＩＩと、１４００ｂｐのＲＡＰＤバンドとの関連は、９９．９％の信頼度で有意となることがわかった。乾燥耐性特異的アイソザイムの高い活性を示すクローンと関連するため、このＤＮＡバンド（マーカー）は、茶樹の乾燥耐性用の生殖細胞質スクリーニングに使用することができる。１４００ｂｐのこのバンドは、図１ａ及び１ｂで矢印を付けている。
【００３１】
１４００ｂｐのこのバンドは、現在さらに特徴が明らかになっている。
【００３２】
このＤＮＡ断片は、いくつかのアッサム茶のクローンを含む、ランダムに選択された他の茶樹において、その有効性がさらに調べられている。
【００３３】
これまでに示されたＲＡＰＤパターンの有効性試験では、同じプライマー、すなわちＡＰＯＨ０２が、いくつかのアッサム茶樹においても１４００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅したことが明らかになっている（図３ａ及び３ｂの矢印）。
【００３４】
表１：１１種類のランダムプライマー配列と、そのスコア付けされた増幅バンド及び多型バンドの数
【表１】
【００３５】
表２：Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤ、ＡＰＸＩＩと、１４００ｂｐのＲＡＰＤバンドとの関連
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】プライマーＯＰＡＨ０２を用いた、ダージリン茶樹生殖細胞質のＲＡＰＤパターン（１．５％アガロースゲル上）；ＤＮＡ断片を矢印で示した。Ｍ＝１００ｂｐ分子量マーカー。
【図２】ダージリン茶樹（クローン）における（ａ）ＳＯＤ及び（ｂ）ＡＰＸのアイソザイム活性を示す、ＮＢＴ染色された、１．２％非変性ポリアクリルアミドゲルの濃度測定スキャン。
【図３】プライマーＯＰＡＨ０２を用いた、アッサム茶樹生殖細胞質のＲＡＰＤパターン（１．５％アガロースゲル上）；ＤＮＡ断片を矢印で示した。Ｍ＝１００ｂｐ分子量マーカー。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーＡＰ ＯＨＯ２を用いて生成した増幅断片１４００ｂｐを含む、植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカー。
【請求項２】
前記増幅断片が、クローンＲＲ１７／１４４、ＣＰ１、ＴＶ２６及びＡＶ２に存在する、請求項１に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項３】
以下に挙げる配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡマーカー。
茶の配列：
【化１】
【請求項４】
冷凍若葉からゲノムＤＮＡを抽出すること、
こうして得られたＤＮＡを検量ステップにかけること、
検量されたＤＮＡを分析ステップにかけること、
マーカーバンドのＤＮＡ配列を得るために、乾燥に特異的（回帰分析により同定、請求項６参照）なＤＮＡ断片をクローニングすること、
を含む、乾燥耐性に関するＤＮＡマーカーの開発方法。
【請求項５】
マーカーを同定する前記ステップが、ＯＰＡＢ０６、ＯＰＡＢ１８、ＯＰＡＨ１８、ＯＰＡＨ０２、ＯＰＡＢ１７、ＯＰＡＣ１９、ＯＰＡＨ１２、ＯＰＡＬ０４、ＯＰＡＡ０２、ＯＰＡＧ１３及びＯＰＡＬ０８などのプライマーの使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分析ステップが、乾燥ストレスを受けた切断葉におけるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＡＰＸ）の乾燥特異的アイソザイム活性と相関する（ＲＡＰＤ試験）を用いる回帰分析アプローチにより行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記分析ステップが、独立変数であるＲＡＰＤバンド（アスグノタイプ（Ａｓｇｎｏｔｙｐｅｓ）より得た）と、独立変数である植物の乾燥耐性に関する生化学的パラメータとの関連性の試験に基づく、請求項４に記載の方法。
【請求項１】
プライマーＡＰ ＯＨＯ２を用いて生成した増幅断片１４００ｂｐを含む、植物の乾燥耐性に関する新規ＤＮＡマーカー。
【請求項２】
前記増幅断片が、クローンＲＲ１７／１４４、ＣＰ１、ＴＶ２６及びＡＶ２に存在する、請求項１に記載のＤＮＡマーカー。
【請求項３】
以下に挙げる配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡマーカー。
茶の配列：
【化１】
【請求項４】
冷凍若葉からゲノムＤＮＡを抽出すること、
こうして得られたＤＮＡを検量ステップにかけること、
検量されたＤＮＡを分析ステップにかけること、
マーカーバンドのＤＮＡ配列を得るために、乾燥に特異的（回帰分析により同定、請求項６参照）なＤＮＡ断片をクローニングすること、
を含む、乾燥耐性に関するＤＮＡマーカーの開発方法。
【請求項５】
マーカーを同定する前記ステップが、ＯＰＡＢ０６、ＯＰＡＢ１８、ＯＰＡＨ１８、ＯＰＡＨ０２、ＯＰＡＢ１７、ＯＰＡＣ１９、ＯＰＡＨ１２、ＯＰＡＬ０４、ＯＰＡＡ０２、ＯＰＡＧ１３及びＯＰＡＬ０８などのプライマーの使用を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分析ステップが、乾燥ストレスを受けた切断葉におけるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（ＡＰＸ）の乾燥特異的アイソザイム活性と相関する（ＲＡＰＤ試験）を用いる回帰分析アプローチにより行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記分析ステップが、独立変数であるＲＡＰＤバンド（アスグノタイプ（Ａｓｇｎｏｔｙｐｅｓ）より得た）と、独立変数である植物の乾燥耐性に関する生化学的パラメータとの関連性の試験に基づく、請求項４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５３５３１０（Ｐ２００７−５３５３１０Ａ）
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５００３５４（Ｐ２００７−５００３５４）
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００５／００００６７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８３１１７
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０６２９０１０９）ボース インスティチュート (1)
【出願人】（５０５２２０１１４）デパートメント オブ バイオテクノロジー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＮ２００５／００００６７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８３１１７
【国際公開日】平成１７年９月９日（２００５．９．９）
【出願人】（５０６２９０１０９）ボース インスティチュート (1)
【出願人】（５０５２２０１１４）デパートメント オブ バイオテクノロジー (6)
【Ｆターム（参考）】
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