標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法、プローブセット、及び核酸の識別方法
【課題】ＰＣＲ法とハイブリダイゼーション法を組み合わせた標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法の提供。
【解決手段】ＰＣＲにより増幅された核酸を鋳型とし、（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足するプローブを用いて一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成し、光を照射し、連結されたプローブを検出する標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法；（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、上流側プローブは上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、下流側プローブは下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブである。（ＩＩ）上流側プローブ及び下流側プローブは３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されている。（ＩＩＩ）上流側プローブの５’末端及び／又は下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されている。
【解決手段】ＰＣＲにより増幅された核酸を鋳型とし、（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足するプローブを用いて一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成し、光を照射し、連結されたプローブを検出する標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法；（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、上流側プローブは上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、下流側プローブは下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブである。（ＩＩ）上流側プローブ及び下流側プローブは３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されている。（ＩＩＩ）上流側プローブの５’末端及び／又は下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）と光応答性塩基による光連結反応とを組み合せた標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法、該検出方法に好適なプローブセット、及び該検出方法を用いた核酸の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞や微生物等の生物の遺伝子や、特定のヌクレオチド配列を有する核酸を検出し解析する技術の開発が盛んに行われている。例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等の遺伝子多型の解析等を行う場合には、解析対象である核酸サンプルは通常微量であるため、核酸サンプル中の核酸を増幅しつつ、ヌクレオチド配列を解析することが一般的である。
【０００３】
汎用されている核酸増幅方法として、ＰＣＲ法がある。ＰＣＲ法は、核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、解析の目的である標的ヌクレオチド配列を挟んだ２種類のプライマーを起点として、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡポリメラーゼ反応を繰り返すことにより、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を増幅する方法である。ＰＣＲ法は基本的に、（i）二本鎖核酸を一本鎖化する変性工程、（ii）鋳型となる一本鎖核酸とプライマーをハイブリダイズさせるアニーリング工程、及び（iii）ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマーを起点としてヌクレオチド鎖を伸長させる伸長工程の３つの工程を１サイクルとし、該サイクルを２５〜３０回繰り返すことにより特定の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を増幅していく方法である。
【０００４】
また、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出には、ＰＣＲ法の他にも、例えば、該標的ヌクレオチド配列を有する核酸と特異的にハイブリダイズすることができる人工合成したヌクレオチド鎖からなるプローブを用いて、ハイブリダイゼーションの有無により、核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するハイブリダイゼーション法が汎用されている。ハイブリダイゼーション法による標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法として、例えば、（１）エクサイプレックス蛍光又はエキシマー蛍光を用いたハイブリダイゼーションに基づく標的ヌクレオチド配列を有する核酸の識別法等がある（例えば、特許文献１参照）。該方法では、まず、標的ヌクレオチド配列部分と完全に相補的なヌクレオチド配列を有する２種類以上からなる非放射性のヌクレオチドプローブを用意する。各プローブの５’又は３’末端には、各プローブが該標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズした際に、プローブが隣接し、エキシマー等を形成できる適当な空間的配置をとれるよう発色基分子を標識する。これにより、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とプローブとが完全に相補的となり、ハイブリダイズした場合にのみエキシマー蛍光等が誘起され、極めて高い認識性を有することができる。該方法においては、各プローブに標識する分子は、極めて広い種類の分子から選択することができ、また、検出感度においてもバックグラウンドノイズを著しく減少させることが可能である。
【０００５】
その他、ＰＣＲによる核酸増幅とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法として、例えば、（２）ＰＣＲとＬＤＲ（ｌｉｇａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、リガーゼ検出法）とを組み合わせたＰＣＲ−ＬＤＲ法がある（例えば、特許文献１参照。）。該（２）方法は、ＰＣＲにより増幅した核酸を鋳型として、該鋳型に隣り合ってハイブリダイズする２種類のヌクレオチドプローブを、リガーゼを用いて連結し、連結反応の有無を検出することにより、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を識別し検出する方法である。
【特許文献１】特許第３９９２０７９号公報
【特許文献２】特表２０００−５１１０６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記（１）の方法は、プローブを用いて、解析対象である標的ヌクレオチド配列を直接解析する方法であり、ＳＮＰ等の、標的ヌクレオチド配列とそれ以外の非標的ヌクレオチド配列が１ヌクレオチド程度しか異ならない場合であっても、精度よく標的ヌクレオチド配列を検出することができる。しかしながら、ハイブリダイゼーション法のみによる方法では、標的ヌクレオチド配列の検出感度は必ずしも十分ではないという問題がある。また、標的ヌクレオチド配列の識別には、通常、ハイブリダイゼーション条件を厳密に制御するシステムが必要であり、高度な温度制御と巧みなプローブの配列設計が要求されるため、特に多種類の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を同時に高精度に識別検出することは極めて困難であった。
【０００７】
一方、上記（２）の方法は、ＰＣＲとＬＤＲを組み合わせており、標的ヌクレオチド配列の検出感度は良好であるが、ＰＣＲとＬＤＲを同一の反応系で実行した場合には、リガーゼにより連結されるべきプローブが、ＰＣＲのプライマーとして消費されてしまう結果、プローブ本来の機能を果たせなくなるばかりか、標的ヌクレオチド配列を有する核酸領域のＰＣＲによる増幅効率の減少にもつながる。また、プローブにＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するように修飾を施した場合には、該修飾によりリガーゼの活性も阻害されてしまうため、好ましくない。このため、該方法により標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出を効率的に実行するためには、第一反応をＰＣＲ、第二反応をＬＤＲとする２段階反応とし、ＰＣＲ後には、ＬＤＲ反応においてＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制するために、ＰＣＲ後の反応溶液に対して、失活処理、希釈処理、又は反応溶液置換等を行った後に、第二反応であるＬＤＲを行うことが必要である。このように、２段階反応とすることにより、操作が煩雑になり、装置やシステムの簡素化にも限界が生じるという問題がある。
【０００８】
また、酵素は、溶液組成、濃度、温度の影響を受け易く、通常、ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとリガーゼでは、最適な反応条件が異なる。このため、ＰＣＲとＬＤＲを同一反応系にて実行させるためには、どちらかの酵素にとって不十分な反応条件にて実行させるか、もしくは両酵素にとって妥協的な条件にて反応を実行させることとなり、反応の効率や精度の向上においても限界があるという問題もある。
【０００９】
本発明は、ＰＣＲ法とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法であって、ＰＣＲ後にＤＮＡポリメラーゼ活性の抑制処理を要さず、簡便に、かつ感度及び精度良く標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出し得る方法、該方法に好適に用いられるプローブセット、及び該検出方法を用いた核酸の識別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＰＣＲ−ＬＤＲ法において、ＰＣＲにより増幅した核酸を鋳型として、該鋳型に隣り合ってハイブリダイズする２種類のプローブを連結させる方法として、ＬＤＲに代えて、光連結（Ｐｈｏｔｏｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を用いることにより、ＰＣＲの反応系と同一の反応系においてプローブ同士を連結させることができること、及び、該プローブの３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド鎖の伸長を阻害するように修飾することにより、該プローブが、ＰＣＲのプライマーとして消費されることを効果的に抑制し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
（１）本発明は、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、（ａ）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより、１種又は２種以上の二本鎖核酸を増幅する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、（ｃ）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）により形成された複合体に光を照射する工程と、（ｆ）前記工程（ｅ）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ）前記工程（ｆ）の後に、前記工程（ｅ）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ）前記工程（ｇ）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、を有することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供する。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
（２）本発明は、前記工程（ａ）におけるＰＣＲが、多段階ＰＣＲであることを特徴とする、前記（１）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（３）本発明は、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（４）本発明は、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、６〜１００分子連結したものであることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（５）本発明は、前記光応答性物質は、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（６）本発明は、前記光応答性物質は、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル基、フェニルトリアゾールビニル基、メトキシフェニルトリアゾールビニル基、シアノフェニルトリアゾールビニル基、及びナフチルトリアゾールビニル基からなる群より選択される１以上を有することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（７）本発明は、前記工程（ｅ）において照射される光が、紫外光であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（８）本発明は、前記工程（ｅ）において照射される光が、３２０〜４００ｎｍの波長の光の照射であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（９）本発明は、前記上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１０）本発明は、前記上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１１）本発明は、前記工程（ｅ）において、前記複合体を形成するプローブのＴｍ値以下の温度において光を照射することを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１２）本発明は、前記工程（ｅ）において、前記複合体を形成するプローブのＴｍ値−５℃以上Ｔｍ値以下の温度において光を照射することを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１３）本発明は、前記上流側プローブの３’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１４）本発明は、前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１５）本発明は、前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１６）本発明は、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基が、ホスホロチオエート化されていることを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１７）本発明は、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブが、標識分子により標識されていることを特徴とする前記（１）〜（１６）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１８）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とが、異なる種類の発色基分子であり、前記工程（ｇ）における連結されたプローブの検出が、前記上流側プローブを標識する標識分子と前記下流側プローブを標識する標識分子のうち、いずれか一方をドナー分子とし、他方をアクセプター分子とする蛍光共鳴エネルギー転移による、蛍光の発光又は消光の検出であることを特徴とする前記（１７）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１９）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子であり、
前記工程（ｇ）における連結されたプローブの検出が、前記発色基分子の消光の検出であることを特徴とする前記（１７）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２０）本発明は、前記ドナー分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）４８８又はＡＴＴＯ ４８８であり、前記アクセプター分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることを特徴とする前記（１８）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２１）本発明は、前記発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、前記発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることを特徴とする前記（２１）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２２）本発明は、前記標識分子が、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることを特徴とする前記（１７）〜（２１）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２３）本発明は、前記上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、前記下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることを特徴とする前記（１７）〜（２１）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２４）本発明は、前記ＰＣＲに用いられるプライマーが、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする前記（１）〜（２３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２５）本発明は、前記ＰＣＲに用いられるプライマーが、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、１０〜１００分子連結したものであることを特徴とする前記（１）〜（２３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２６）本発明は、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に熱エネルギーを加えることにより行うことを特徴とする前記（１）〜（２５）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２７）本発明は、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸を８０〜１０５℃に加熱することにより行うことを特徴とする前記（１）〜（２５）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２８）本発明は、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド、及び尿素からなる群より選択される１以上の化学物質を添加することにより行うことを特徴とする前記（１）〜（２５）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２９）本発明は、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に、標的ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を添加することにより行うことを特徴とする前記（１）〜（２５）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（３０）本発明は、前記工程（ｆ）において、前記複合体を３７〜１０５℃に加熱することにより、一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させることを特徴とする前記（１）〜（２９）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（３１）本発明は、１又は２以上の、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するためのプローブのセットであって、標的ヌクレオチド配列の種類ごとに下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを有することを特徴とするプローブセットを提供するものである。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
（３２）本発明は、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする前記（３１）記載のプローブセットを提供するものである。
（３３）本発明は、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、６〜１００分子連結したものであることを特徴とする前記（３１）記載のプローブセットを提供するものである。
（３４）本発明は、前記光応答性物質は、光反応官能基として、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有することを特徴とする前記（３１）〜（３３）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３５）本発明は、前記光応答性物質は、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル基、フェニルトリアゾールビニル基、メトキシフェニルトリアゾールビニル基、シアノフェニルトリアゾールビニル基、及びナフチルトリアゾールビニル基からなる群より選択される１以上を有することを特徴とする前記（３１）〜（３３）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３６）本発明は、前記上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることを特徴とする前記（３１）〜（３５）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３７）本発明は、前記上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする前記（３１）〜（３５）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３８）本発明は、前記上流側プローブの３’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることを特徴とする前記（３１）〜（３７）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３９）本発明は、前記上流側プローブの５’末端又は前記下流側プローブの５’末端が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることを特徴とする前記（３１）〜（３８）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４０）本発明は、前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする前記（３１）〜（３８）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４１）本発明は、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基が、ホスホロチオエート化されていることを特徴とする前記（３１）〜（３８）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４２）本発明は、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブが、標識分子により標識されていることを特徴とする前記（３１）〜（４１）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４３）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とが、異なる種類の発色基分子であることを特徴とする前記（４２）記載のプローブセットを提供するものである。
（４４）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子であることを特徴とする前記（４２）記載のプローブセットを提供するものである。
（４５）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と前記下流側プローブを標識する標識分子のいずれか一方がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）４８８又はＡＴＴＯ ４８８であり、他方がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることを特徴とする前記（４３）記載のプローブセットを提供するものである。
（４６）本発明は、前記発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、前記発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることを特徴とする前記（４４）記載のプローブセットを提供するものである。
（４７）本発明は、前記標識分子が、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることを特徴とする前記（４２）〜（４６）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４８）本発明は、前記上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、前記下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることを特徴とする前記（４２）〜（４６）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４９）本発明は、標的ヌクレオチド配列に、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失からなるミスマッチ部位を有する非標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とを識別する方法であって、（ａ”）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、二本鎖核酸を増幅する工程と、（ｂ”）前記工程（ａ”）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、（ｃ”）下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ”）前記工程（ｂ”）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ”）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（ｅ”）前記工程（ｄ”）により形成された複合体に光を照射する工程と、（ｆ”）前記工程（ｅ”）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ”）前記工程（ｆ”）の後に、前記工程（ｅ”）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ”）前記工程（ｇ”）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記非標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていると判断する工程と、を有することを特徴とする、核酸の識別方法を提供するものである。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
（５０）本発明は、前記ミスマッチ部位が、前記上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から１０分子以内又は前記下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から１０分子以内にあることを特徴とする前記（４９）記載の核酸の識別方法を提供するものである。
（５１）本発明は、前記ミスマッチ部位は、１又は２箇所以上の、１のヌクレオチド又は２以上の連続したヌクレオチドが、置換、挿入、又は欠失していることを特徴とする前記（４９）又は（５０）記載の核酸の識別方法を提供するものである。
（５２）本発明は、前記標的ヌクレオチド配列が遺伝子多型のうちの一多型に相同的なヌクレオチド配列であり、前記非標的ヌクレオチド配列が前記遺伝子多型の他の一多型に相同的なヌクレオチド配列であり、前記ミスマッチ部位が前記遺伝子多型の多型部位であり、前記工程（ｈ”）が、（ｈ”２）前記工程（ｇ”）において検出された連結されたプローブ量に基づき、前記核酸サンプル中の核酸が、前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、及び前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルと前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのヘテロ接合体のいずれであるかを識別する工程、であることを特徴とする前記（４９）〜（５１）のいずれか記載の核酸の識別方法を提供するものである。
（５３）本発明は、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、（ａ’）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、非対称ＰＣＲ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより、１種又は２種以上の一本鎖核酸を増幅する工程と、（ｃ’）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ’）前記工程（ａ’）において得られた一本鎖核酸、前記上流側プローブ、及び前記下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（ｅ’）前記工程（ｄ’）により形成された複合体に光を照射する工程と、（ｆ’）前記工程（ｅ’）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ’）前記工程（ｆ’）の後に、前記工程（ｅ’）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ’）前記工程（ｇ’）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、を有することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（５４）本発明は、前記工程（ａ’）が、（ａ’１）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１段階又は多段階のＰＣＲを行い、核酸を増幅する工程と、（ａ’２）前記工程（ａ’１）において増幅された核酸を鋳型とし、非対称ＰＣＲを行うことにより、、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上の核酸を増幅する工程と、を有する工程であることを特徴とする前記（５３）記載の核酸の検出方法を提供するものである。
（５５）本発明は、前記工程（ａ’）が、（ａ’３）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、ＰＣＲと非対称ＰＣＲを同時に行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上の核酸を増幅する工程、であることを特徴とする前記（５３）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（５６）本発明は、前記工程（ａ’）が、（ａ’４）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得る３種類のプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上のループ状構造を有する核酸を増幅する工程
であり、前記３種類のプライマーが、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の５’側末端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の３’側末端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーと、３’末端側に前記フォワードプライマーよりも３’側であって、標的ヌクレオチド配列よりも５’側にある領域と相同的なヌクレオチド配列を有するループ形成用プライマーとであり、前記ループ形成用プライマーの５’末端には、当該プライマーを起点としてＰＣＲにより伸長されるヌクレオチド配列領域のうち、標的ヌクレオチド配列よりも３’末端側であり、かつ前記リバースプライマーと相補的なヌクレオチド配列よりも５’末端側にあるヌクレオチド配列領域と、ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が付加されていることを特徴とする前記（５４）記載の核酸の検出方法を提供するものである。
（５７）本発明は、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、（１）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（２）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを準備する工程と、（３）前記核酸サンプル、前記工程（１）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブ、前記工程（２）において準備したプライマー、並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有する反応溶液を調製する工程と、（４）前記工程（３）において調製した反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、（５）前記工程（４）において得られた一本鎖核酸を鋳型として、前記プライマー用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程と、（６）前記工程（５）の後、反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、（７）前記工程（６）において得られた一本鎖核酸に対して、反応溶液中の上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（８）前記工程（７）により形成された複合体に光を照射する工程と、（９）前記工程（８）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（１０）前記工程（９）の後に、前記工程（８）において連結されたプローブを検出する工程と、（１１）前記工程（１０）の後、前記工程（４）〜（１０）を繰り返す工程と、を有し、前記工程（１０）及び（１１）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法及び核酸の識別方法は、ＰＣＲ法とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法であるため、より高精度かつ高感度に標的ヌクレオチド配列を識別し検出することができる。また、ＬＤＲに代えて、光連結反応を用いていることにより、従来のＰＣＲ−ＬＤＲ法とは異なり、一つの反応系でＰＣＲとプローブ連結反応を同時に進行させることも可能となり、ヌクレオチド配列の識別や検出の精度のみならず、反応効率の向上にも資する。さらに、反応系を簡素化することが可能となるため、本発明を実施するシステムや装置において、装置の小型化、装備の単純化、しいては製品のコストダウン等の多種のメリットを生みだすことができる。さらに、反応の開始・停止は光照射の有無で制御できるため、任意のタイミングで連結反応を誘導することができ、反応条件をより厳密に制御することが可能となる。
また、本発明のプローブセットを用いることにより、従来法よりも簡便かつ高精度に、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を識別し検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、核酸とは、ＤＮＡ又はＲＮＡであれば特に限定されるものではなく、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００１４】
本発明において核酸サンプルとは、核酸を含有するサンプルであれば、特に限定されるものではないが、動物、植物、微生物、培養細胞等から核酸を抽出したサンプルであることが好ましい。なお、動物等からの核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。
【００１５】
本発明において標的ヌクレオチド配列は、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法等により検出が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法や核酸の識別方法においては、標的ヌクレオチド配列として、遺伝子上に存在する特定の領域のヌクレオチド配列であることが好ましく、遺伝子多型を含む領域のヌクレオチド配列であることがより好ましい。本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法や核酸の識別方法は、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の識別・検出能が高く、相同性の高いヌクレオチド配列同士を高精度に識別し得るためである。
【００１６】
ここで、遺伝子多型とは、ある生物種の集団内において、個体ごとに遺伝子のヌクレオチド配列が異なるものを意味する。遺伝子多型としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト多型等がある。本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法や核酸の識別方法において、標的ヌクレオチド配列が含む遺伝子多型として、ＳＮＰであることが好ましい。
【００１７】
その他、本発明における標的ヌクレオチド配列としては、遺伝子多型のように先天的な多型のみならず、後天的な遺伝子変異等を含む領域のヌクレオチド配列であってもよい。後天的な遺伝子変異として、紫外線等の物理的刺激や発がん性物質等による化学的刺激により誘発される体細胞変異等が挙げられる。後述するように、本発明においては、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出を、連結されたプローブ量を測定することにより検出するため、定量的な解析が可能となり得るため、体細胞変異等を定量的に解析する場合にも用いることができる。
【００１８】
本発明においてヌクレオチドアナログとは、非天然のヌクレオチドであり、天然のヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ）と同様の機能を有するものをいう。すなわち、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合により鎖を形成することができ、かつ、ヌクレオチドアナログを用いて形成されたプライマーやプローブは、ヌクレオチドのみを用いて形成されたプライマーやプローブと同様に、ＰＣＲやハイブリダイゼーションに用いることができる。このようなヌクレオチドアナログとして、例えば、ＰＮＡ（ポリアミドヌクレオチド誘導体）、ＬＮＡ（ＢＮＡ）、ＥＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体等がある。ここで、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡのリン酸と５炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。また、ＬＮＡ（ＢＮＡ）は、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している２つの環状構造を持つ化合物である。
【００１９】
本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法（以下、本発明の検出方法ということがある。）は、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、（ａ）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、１種又は２種以上の二本鎖核酸を増幅する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、（ｃ）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）により形成された複合体に光を照射する工程と、（ｆ）前記工程（ｅ）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ）前記工程（ｆ）の後に、前記工程（ｅ）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ）前記工程（ｇ）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、を有することを特徴とする。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【００２０】
本発明の検出方法は、主に、工程（ａ）〜（ｂ）のＰＣＲによる増幅段階と、工程（ｃ）〜（ｈ）の光連結反応を用いたハイブリダイゼーションによる検出段階の２段階に分けられる。以下、工程ごとに説明する。
【００２１】
まず、工程（ａ）において、核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、１種又は２種以上の二本鎖核酸を増幅する。核酸サンプルに含まれている全核酸のうち、標的ヌクレオチド配列を含むことが期待される領域のみを増幅することにより、核酸サンプルとして、標的ヌクレオチドを有する核酸が微量にしか存在していない遺伝子サンプル等を用いた場合であっても、高感度に標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出することができる。ここで、鋳型とする核酸サンプル中の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもあってよく、一本鎖でもあっても二本鎖であってもよい。なお、核酸サンプル中の核酸がＲＮＡである場合には、逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型とすることができる。
【００２２】
工程（ａ）において用いられるプライマーは、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（増幅用ヌクレオチド配列）をＰＣＲにより増幅し得るプライマーであり、増幅用ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーである。例えば、増幅用ヌクレオチド配列の上流端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、増幅用ヌクレオチド配列の下流端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとからなる２種類のプライマーであってもよい。なお、ＰＣＲにおいて用いられる該２種類のプライマーの各濃度は、ＰＣＲ産物として二本鎖核酸を得ることができる濃度比であれば特に限定されるものではないが、等濃度で用いることが好ましい。
【００２３】
増幅用ヌクレオチド配列、すなわち、ＰＣＲにより増幅される領域は、少なくとも１の標的ヌクレオチド配列を含む領域であればよく、２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域を一のＰＣＲにより増幅してもよい。つまり、ＰＣＲにより得られる二本鎖核酸は、１の標的ヌクレオチド配列を含む核酸であってもよく、２以上の標的ヌクレオチド配列を含む核酸であってもよい。
【００２４】
また、工程（ａ）においてＰＣＲにより得られる二本鎖核酸は、１種類であってもよく、複数種類であってもよい。ここで、ＰＣＲにより得られる二本鎖核酸が複数種類であるとは、ＰＣＲにより増幅される領域が、核酸サンプル中の核酸の１の領域ではなく、２以上の領域であることを意味する。例えば、工程（ａ）におけるＰＣＲをマルチプレックスＰＣＲとすることにより、複数種類の二本鎖核酸（ＰＣＲ産物）を得ることができる。また、二本鎖核酸の種類ごとに別個独立にＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を混合してもよい。
【００２５】
このように、２以上の標的ヌクレオチド配列を含むと期待し得る核酸領域をまとめて増幅することにより、２以上の標的ヌクレオチド配列の検出、すなわち多重解析における作業工程を減少させることができる。
【００２６】
工程（ａ）におけるＰＣＲは、多段階ＰＣＲであってもよい。ここで、多段階ＰＣＲとは、前段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ溶液に、前段階目のＰＣＲとは異なるプライマーを添加して、後段階目のＰＣＲを行うことを意味する。後段階目のＰＣＲは、前段階目のＰＣＲ産物を鋳型として用いるものであってもよく、核酸サンプル中に元々含まれていた核酸を鋳型として用いるものであってもよい。工程（ａ）におけるＰＣＲ増幅を複数回繰り返すことにより、後のハイブリダイゼーションによる検出段階において、より高い検出シグナルを得ることができる。
【００２７】
次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る。一本鎖化することにより、工程（ａ）において増幅した標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を有する核酸を、後の工程のハイブリダイゼーションにおける鋳型として用いることができるようになる。
【００２８】
工程（ｂ）において、二本鎖核酸を一本鎖化する方法は、特に限定されるものではなく、公知の手法で行うことができる。例えば、二本鎖核酸に熱エネルギーを加えることや、塩基同士の水素結合を弱めるような化学物質を添加すること等により、二本鎖核酸を一本鎖化することができる。具体的には、例えば、ＰＣＲ後のＰＣＲ溶液を、８０〜１０５℃に加熱することや、該ＰＣＲ溶液に、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド、及び尿素等を添加することにより、ＰＣＲ溶液中の二本鎖核酸を一本鎖化することができる。その他、該ＰＣＲ溶液に、一本鎖化させたい領域のヌクレオチ配列、すなわち標的ヌクレオチド配列と相同的な配列を有する一本鎖核酸を添加することによっても、一本鎖化することができる。
【００２９】
二本鎖核酸を一本鎖化するために添加される一本鎖核酸は、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログがリン酸ジエステル結合することにより形成されたものであることが好ましい。特に、ヌクレオチドアナログとして、ＬＮＡ（ＢＮＡ）、ＥＮＡ、ＰＮＡ等のＴｍ値が比較的高いヌクレオチドアナログを構成分子として形成された一本鎖核酸であることが好ましい。
【００３０】
本発明の検出方法においては、工程（ｂ）における一本鎖化は、熱エネルギーを加える方法であることが好ましく、ＰＣＲ後のＰＣＲ溶液を、８０〜１０５℃に加熱することがより好ましく、９５〜１００℃に加熱することがさらに好ましく、９５℃に加熱することが特に好ましい。ＰＣＲ溶液の組成を変更する必要がないため、後の工程に対する影響を抑えることができるためである。
【００３１】
工程（ａ）におけるＰＣＲを、非対称ＰＣＲとすることにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を増幅させることができる。具体的には、核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、非対称ＰＣＲを行うことにより、１種又は２種以上の一本鎖核酸を増幅する。このようにして得られた一本鎖核酸は、一本鎖化することなく、後の工程のハイブリダイゼーションにおける鋳型として用いることができる。
【００３２】
本発明において、非対称ＰＣＲとは、前記二本鎖核酸を得る場合とは異なり、ＰＣＲに用いられる増幅用ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーのうち、１種類のプライマーのみを用いて行うＰＣＲや、１種類のプライマーを他方のプライマーよりも高濃度に用いて行うＰＣＲを意味する。鋳型である二本鎖核酸を構成する二本の鎖が非対称的に増幅される結果、より高濃度に添加したプライマーを起点として伸長される鎖が、一本鎖核酸の状態で得ることができる。ここで、１種類のプライマーのみを用いてＰＣＲを行った場合には、一本鎖核酸は増幅されるものの、指数関数的な増幅は行われないが、プライマーの量比を変えてＰＣＲを行った場合には、通常のＰＣＲのように二本鎖核酸が指数関数的に増幅しつつ、一本鎖核酸も増幅される。
【００３３】
その他、一部分に一本鎖のループ構造を有するＰＣＲ産物を得る方法を用いることにより、標的ヌクレオチド配列領域を一本鎖核酸として得ることができる（例えば、特開２００５−１０２５０２号公報参照。）。具体的には、３種類のプライマー、すなわち、通常のＰＣＲに用いられる前述のフォワードプライマーとリバースプライマーの２種類のプライマーに加えて、５’末端には、当該プライマーを起点としてＰＣＲにより伸長されるヌクレオチド配列領域のうち、標的ヌクレオチド配列よりも３’末端側であり、かつ前記リバースプライマーと相補的なヌクレオチド配列よりも５’末端側にあるヌクレオチド配列領域と、ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が付加されており、３’末端側に前記フォワードプライマーよりも３’側であって、標的ヌクレオチド配列よりも５’側にある領域と相同的なヌクレオチド配列を有するループ形成用プライマーとを用いてＰＣＲを行うことにより、一本鎖のループ構造部分に標的ヌクレオチド配列領域を有するＰＣＲ産物を得ることができる。該方法により得られたＰＣＲ産物も、非対称ＰＣＲ産物と同様に、一本鎖化することなく、後の工程のハイブリダイゼーションにおける鋳型として用いることができる。
【００３４】
なお、ＰＣＲ産物として二本鎖核酸を得るＰＣＲと、一本鎖核酸を得るＰＣＲとを組み合わせて行ってもよい。例えば、１段階のＰＣＲ又は多段階ＰＣＲを行った後に、非対称ＰＣＲを行ってもよい。
【００３５】
また、工程（ａ）におけるＰＣＲは、ＰＣＲと非対称ＰＣＲを同時に行うものであってもよい。例えば、第一段階目のＰＣＲを通常のＰＣＲとし、第二段階目のＰＣＲを非対称ＰＣＲとして、第二段階目の非対称ＰＣＲにより目的の増幅ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を増幅させるＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行う場合に、第一段階目のＰＣＲを行うためのプライマーと、第二段階目の非対称ＰＣＲを行うためのプライマーとを、予め反応溶液中に入れておくことにより、第一段階目のＰＣＲと第二段階目の非対称ＰＣＲを同時に行うことができる。
なお、ＰＣＲや非対称ＰＣＲを同時に行うとは、同一の反応溶液中で、同一の反応サイクル（変性工程、アニール工程、伸長工程）で反応を行うことを意味する。
【００３６】
ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは、標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の配列情報、ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼの種類等を考慮して、常法により設計し合成することができる。
【００３７】
本発明においては、ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーのＴｍ値が、上流側プローブや下流側プローブのＴｍ値よりも高くなるように設計することが好ましい。プローブのＴｍ値よりもプライマーのＴｍ値を高くすることにより、プローブの存在下でプライマーを用いてＰＣＲを行う場合にも、ＰＣＲに対するプローブの影響を抑えることができる。
【００３８】
ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものである。プライマーの長さは、プライマーのＴｍ値、増幅ヌクレオチド配列の種類等を考慮して適宜決定することができるが、１０〜１００分子連結したものであることが好ましい。
【００３９】
本発明の検出方法においては、ＰＣＲは、通常用いられる試薬を通常用いられる量で用いて、通常使用されるプロトコールに基づき、常法により行うことができる。なお、ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼは、通常ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されるものではないが、耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。ＰＣＲの変性工程では、通常９０℃以上の高温処理が行われるためである。
【００４０】
また、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることもできる。通常のＰＣＲと同様に、ＰＣＲの精度を向上させることができるためである。但し、上流側プローブや下流側プローブの５’末端が、後述するように５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていない場合等、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により上流側プローブ等が損なわれるおそれがある場合には、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
【００４１】
その他、例えば、標的ヌクレオチド配列中に、遺伝子多型部位等の特に高精度に識別して検出したい標的ヌクレオチドが存在する場合であって、上流側プローブや下流側プローブ中の該標的ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチドが、各プローブの３’末端領域に存在する場合には、該プローブの３’末端を後述するように３’→５’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾しておくことが好ましく、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていない場合には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、各プローブ中の該標的ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチドが、削られてしまうおそれがあるためである。
【００４２】
また、本発明の検出方法においては、工程（ｃ）として、標的ヌクレオチド配列ごとに、上記の３要件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する。なお、工程（ｃ）は、工程（ｄ）の前であればいつ行ってもよく、工程（ａ）及び（ｂ）とは独立して行うことができる。例えば、工程（ａ）の前に予め工程（ｃ）を行ってもよい。
【００４３】
上流側プローブ及び下流側プローブは、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものである。ここで、修飾体としては、例えば、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、修飾ＰＮＡ、修飾ＬＮＡ（ＢＮＡ）、修飾ＥＮＡ等がある。ここで、ヌクレオチドやヌクレオチドアナログの修飾に用いられる物質は、本発明の効果を損なわない限り、特に限定されるものではなく、ヌクレオチド等の修飾に通常用いられる物質を用いることができる。修飾ヌクレオチドや修飾ヌクレオチドアナログとして、例えば、アミノ基、カルボキシビニル基、リン酸基、メチル基等の官能基により修飾されたヌクレオチド等、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等、ホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等、蛍光物質等の後述する標識分子により修飾されたヌクレオチド等がある。
【００４４】
上流側プローブ及び下流側プローブの長さは、特に限定されるものではなく、標的ヌクレオチド配列の長さや種類、Ｔｍ値等を考慮して適宜決定することができる。本発明における上流側プローブ又は下流側プローブとしては、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体（以下、ヌクレオチド等ということがある。）が、６〜１００分子連結したものであることが好ましい。特に、プローブのＴｍ値が、核酸増幅工段階であるＰＣＲにおいて用いられるプライマーのＴｍ値よりも低くなるように、長さを調整することが好ましい。
【００４５】
標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割した場合に、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであることを要する（要件（Ｉ））。なお、本発明においては、上流とは、ヌクレオチド配列やプローブ、プライマー等の５’側を意味し、下流とは、３’側を意味する。
【００４６】
図１は、標的ヌクレオチド配列１、上流側プローブ２、及び下流側プローブ３の関係を模式的に示した図である。上流側プローブ２は、標的ヌクレオチド配列１の上流側標的ヌクレオチド配列１ａにハイブリダイズし得るプローブであり、下流側プローブ３は、下流側標的ヌクレオチド配列１ｂにハイブリダイズし得るプローブである。つまり、標的ヌクレオチド配列１を有する核酸を鋳型とし、各プローブがハイブリダイズした場合には、上流側プローブ２の５’末端と、下流側プローブ３の３’末端が隣接することになる。
【００４７】
また、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されているプローブであることを要する（要件（ＩＩ））。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応は、ヌクレオチドの５’側から３’側へと進行するため、各プローブの３’末端をＰＣＲ阻害物質により修飾することにより、ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在する場合であっても、各プローブはプライマーとして消費され難い。このため、ＤＮＡポリメラーゼの失活処理をすることなく、ＰＣＲ溶液をそのまま工程（ｄ）以降の処理に用いることができる。
【００４８】
ここで、各プローブにおいて、３’末端とは、各プローブの３’末端を構成するヌクレオチド等を、５’末端とは、各プローブの５’末端を構成するヌクレオチド等を、それぞれ意味する。
【００４９】
各プローブの３’末端を修飾するＰＣＲ阻害物質は、該物質により修飾された３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼ活性による伸長反応の起点となることができない物質であれば、特に限定されるものではなく、ＤＮＡポリメラーゼ活性阻害作用を有する公知の物質を適宜用いることができる。本発明においては、特に、上流側プローブの３’末端や下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることが好ましい。
【００５０】
さらに、前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていることを要する（要件（ＩＩＩ））。図１に示すように、ハイブリダイズした場合には、上流側プローブと下流側プローブは、上流側プローブの５’末端と下流側プローブの３’末端において隣接するため、少なくともいずれか一方のプローブ末端が光応答性物質により修飾されていることにより、光連結反応により両プローブを連結させることができる。なお、上流側プローブの５’末端と下流側プローブの３’末端の両末端が光応答性物質により修飾されていてもよい。なお、本発明においては、下流側プローブの３’末端ではなく、上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることが好ましい。
【００５１】
本発明において、光応答性物質とは、光エネルギーにより分子構造が変化し、隣接する分子を互いに連結し得る光反応官能基を有する物質を意味する。上流側プローブの５’末端や下流側プローブの３’末端を修飾する光応答性物質は、このような光反応官能基を有する物質であれば、特に限定されるものではないが、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有する物質であることが好ましい。例えば、光照射により、光応答性物質に存在する共役二重結合部位が開裂することにより、隣接する分子、具体的には隣接するプローブの末端の共役二重結合部位の開裂を促される。これらの開裂された共役二重結部位同士により環状結合が形成される結果、隣接するプローブ同士が連結される。
【００５２】
本発明における上流側プローブの５’末端や下流側プローブの３’末端を修飾する光応答性物質としては、紫外光、好ましくは３２０〜４００ｎｍ、より好ましくは３６５ｎｍ付近の光に応答し得る物質であることが好ましい。このような波長の光の照射によって開裂する共役二重結合部位を有する物質としては、例えば、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル（ＢＴＶ）基、フェニルトリアゾールビニル（ＰＴＶ）基、メトキシフェニルトリアゾールビニル（ＭＰＴＶ）基、シアノフェニルトリアゾールビニル（ＣＰＴＶ）基、及びナフチルトリアゾールビニル（ＮＰＴＶ基）等を有する物質等がある。特に、上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド等であることが好ましい。具体的には、カルボキシビニルデオキシアデノシン、カルボキシビニルデオキシシチジン、カルボキシビニルデオキシグアノシン、カルボキシビニルデオキシウリジン等がある。
【００５３】
上流側プローブの５’末端や下流側プローブの５’末端は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることが好ましい。各プローブの５’末端が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることにより、工程（ａ）におけるＰＣＲにおいて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いた場合であっても、工程（ｄ）以降の工程における該活性の影響を効果的に抑制することができる。各プローブの５’末端のヌクレオチド等と５’末端から２番目のヌクレオチド等との間に位置するリン酸が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることがより好ましい。
【００５４】
このような５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質による修飾として、本発明においては、特に、上流側プローブの５’末端や下流側プローブの５’末端がメチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等や、ホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等であることが好ましい。ここで、プローブの５’末端が２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等であるとは、各プローブの５’末端のヌクレオチド等の炭糖の２位がメチル化（２−Ｏ−メチル化）されていることを意味する。また、プローブの５’末端がホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等であるとは、各プローブの５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド等を連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基がホスホロチオエート化されていることを意味する。
【００５５】
その他、上流側プローブの３’末端や下流側プローブの３’末端は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていてもよい。本発明において、各プローブの３’末端の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されたヌクレオチドとしては、２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等や、ホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。ここで、プローブの３’末端が２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等であるとは、各プローブの３’末端のヌクレオチド等の炭糖の２位がメチル化（２−Ｏ−メチル化）されていることを意味する。また、プローブの３’末端がホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等であるとは、各プローブの３’末端と３’末端から２番目のヌクレオチド等を連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基がホスホロチオエート化されていることを意味する。
【００５６】
標的ヌクレオチド配列が２以上ある場合には、標的ヌクレオチド配列ごとに上流側プローブと下流側プローブを準備する。ここで、標的ヌクレオチド配列は、互いに別個独立のものであってもよく、互いに重複するものであってもよい。また、遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖の一方にのみ複数の標的ヌクレオチド配列を有していてもよく、センス鎖とアンチセンス鎖の両方に標的ヌクレオチド配列を有するものであってもよい。
【００５７】
２以上の標的ヌクレオチド配列が互いに重複する場合には、例えば、図２に示すように、１のプローブが、ある標的ヌクレオチド配列に対する上流側プローブであると同時に、別の標的ヌクレオチド配列に対する下流側プローブであってもよい。図２においては、プローブ５ａは、標的ヌクレオチド配列４ａに対する下流側プローブであり、プローブ５ｂは、標的ヌクレオチド配列４ａに対する上流側プローブであると同時に、標的ヌクレオチド配列４ｂに対する下流側プローブである。プローブ５ｃは、標的ヌクレオチド配列４ｂに対する上流側プローブであると同時に、標的ヌクレオチド配列４ｃに対する下流側プローブである。プローブ５ｄは、標的ヌクレオチド配列４ｃに対する上流側プローブであると同時に、標的ヌクレオチド配列４ｄに対する下流側プローブである。プローブ５ｅは、標的ヌクレオチド配列４ｄに対する上流側プローブである。各プローブの３’末端をＰＣＲ阻害物質６により修飾し、各上流側プローブ（プローブ５ｂ〜５ｅ）の５’末端を光応答性物質７により修飾することにより、上記要件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足することができる。
【００５８】
ヌクレオチド配列は、基本的に、ＡＴＧＣの４種のヌクレオチドの組み合わせからなるものにすぎないため、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するためには、該標的ヌクレオチド配列を、該標的ヌクレオチド配列と相同性が高い該標的ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列から高精度に識別して検出する必要がある。一般的には、標的ヌクレオチド配列が有しており、かつ該標的ヌクレオチド配列と相同性が高い他のヌクレオチド配列にはない特徴的な１又は２以上のヌクレオチド（以下、標的ヌクレオチドということがある。）を指標として、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を他のヌクレオチド配列を有する核酸から識別して検出することができる。
【００５９】
ここで、標的ヌクレオチドを含む領域のヌクレオチド配列情報が公知である場合には、標的ヌクレオチド配列は、任意に設定することができる。例えば、図３のように、遺伝子のある領域に、２つの標的ヌクレオチド９が存在していた場合に、図３（ａ）のように、２つの標的ヌクレオチドが含まれる比較的長い領域を標的ヌクレオチド配列１０Ａ＋Ｂとしてもよく、図３（ｂ）のように、標的ヌクレオチドごとに別個独立した標的ヌクレオチド配列１０Ａと標的ヌクレオチド配列１０Ｂとしてもよく、図３（ｃ）のように、２つの標的ヌクレオチド配列が互いに重複するように設定してもよい。どのように標的ヌクレオチド配列を設定するかは、標的ヌクレオチド配列に依存して決定される上流側プローブや下流側プローブのＴｍ値や、標的ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチドが各プローブ中のどこに配置されることになるか等を考慮して、適宜決定することができる。なお、標的ヌクレオチド９にハイブリダイズするヌクレオチドが、後述する塩基識別可能領域内となるように各プローブを設計することが好ましく、このように各プローブの設計を可能とするように標的ヌクレオチド配列を設定することが好ましい。
【００６０】
例えば、図３（ｃ）のように２の標的ヌクレオチド配列１０３’ と１０５’を決定した場合には、図４に示すように、標的ヌクレオチド配列１０３’の下流側プローブであるプローブ１１ａ、標的ヌクレオチド配列１０３’の上流側プローブでありかつ標的ヌクレオチド配列１０５’の下流側プローブであるプローブ１１ｂ、標的ヌクレオチド配列１０５’の上流側プローブであるプローブ１１ｃを設計することができる。この場合、プローブ１１ａとプローブ１１ｂとプローブ１１ｃの３つのプローブの連結体が検出された場合には、核酸サンプル中に、標的ヌクレオチド配列１０３’と標的ヌクレオチド配列１０５’の両方を有する核酸が存在することが分かる。一方、いずれのプローブ連結体も検出されない場合には、核酸サンプル中に、標的ヌクレオチド配列１０３’を有する核酸と標的ヌクレオチド配列１０５’を有する核酸のいずれも存在していないことが分かる。その他、例えば、プローブ１１ａとプローブ１１ｂのプローブ連結体と、プローブ１１ｂとプローブ１１ｃのプローブ連結体は検出されたものの、プローブ１１ａとプローブ１１ｂとプローブ１１ｃの３つのプローブの連結体が検出されなかった場合には、核酸サンプル中の核酸においては、標的ヌクレオチド配列１０３’と標的ヌクレオチド配列１０５’が重複していないことが分かる。つまり、本発明の検出方法を応用することにより、染色体転座等の遺伝子変異の有無を検出し得ることが期待できる。
【００６１】
次に、工程（ｄ）として、工程（ｂ）において得られた一本鎖核酸、又は非対象ＰＣＲ等により得られた一本鎖核酸に対して、工程（ｃ）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体（以下、一本鎖核酸−プローブ複合体ということがある。）を形成する。具体的には、一本鎖化処理後又はＰＣＲ後の反応溶液に、上流側プローブ及び下流側プローブを添加し、混合することにより、該反応溶液中の一本鎖核酸の標的ヌクレオチド配列領域に、各プローブをハイブリダイズさせ、一本鎖核酸−プローブ複合体を形成することができる。既に述べたように、各プローブはＤＮＡポリメラーゼ活性の影響を受けないよう修飾されているため、一本鎖化処理後又はＰＣＲ後の反応溶液は、失活処理等を行うことなく用いることができる。
【００６２】
本発明の検出方法においては、工程（ｄ）は、一本鎖化処理後又はＰＣＲ後の反応溶液に、上流側プローブ及び下流側プローブを添加してもよく、ＰＣＲ前の反応溶液に予め上流側プローブ及び下流側プローブを添加しておいてもよい。ＰＣＲ前の反応溶液に予め上流側プローブ及び下流側プローブを添加しておくことにより、一本鎖化処理後又はＰＣＲ後に速やかに一本鎖核酸−プローブ複合体を形成することができ、また、操作工程を少なくすることができる。
【００６３】
さらに、工程（ｅ）として、工程（ｄ）により形成された一本鎖核酸−プローブ複合体に光を照射した後、工程（ｆ）として、該一本鎖核酸−プローブ複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる。一本鎖核酸が標的ヌクレオチド配列を有する場合には、該標的ヌクレオチド配列に対応する上流側プローブと下流側プローブが互いに隣接してハイブリダイズして一本鎖核酸−プローブ複合体が形成されている。このため、光を照射することにより、光連結反応が誘導される結果、隣接するプローブ同士が連結される。
【００６４】
工程（ｅ）において照射される光の波長は、各プローブに修飾されている光応答性物質の種類に応じて適宜決定することができる。より十分な光エネルギーを与えることができるため、照射される光は、紫外光であることが好ましく、３２０〜４００ｎｍの波長の光であることがより好ましく、３６５ｎｍ付近の波長の光であることがさらに好ましい。
【００６５】
光連結反応の反応効率は、連結反応に必要とされる波長域の光の照度と照射時間との積に相関する。このため、工程（ｅ）において照射される光の照度や照射時間を調整することにより、光連結反応効率を良好に維持することができる。また、光によって誘導される反応であるため、光を照射するタイミングを調整することにより、連結反応を任意のタイミングで実施することができる。さらに、光連結反応は、従来の酵素を用いた連結法に比べ、温度による影響を受け難い。このため、例えば０〜８０℃といった幅広い温度域で反応を行うことができる。また、反応溶液が所望の反応温度に達した時点で、単に光を照射することにより光連結反応を行うことができるため、従来の酵素法に比べて非常に厳密な反応温度制御も可能である。
【００６６】
特に、工程（ｅ）においては、光を照射する温度を適宜調整することにより、上流側プローブや下流側プローブの、標的ヌクレオチド配列に対する特異性を高めることができ、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出精度を向上させることができる。本発明の検出方法においては、一本鎖核酸−プローブ複合体に、該一本鎖核酸−プローブ複合体を形成するプローブのＴｍ値以下の温度において光を照射することが好ましい。より好ましくは、（Ｔｍ値−２０℃）以上Ｔｍ値以下の温度であり、さらに好ましくは（Ｔｍ値−１０℃）以上Ｔｍ値以下の温度であり、さらに好ましくは（Ｔｍ値−５℃）以上Ｔｍ値以下の温度である。
【００６７】
なお、「一本鎖核酸−プローブ複合体を形成するプローブのＴｍ値」とは、該一本鎖核酸−プローブ複合体を形成する複数のプローブのＴｍ値の中で、最も低いＴｍ値を意味する。例えば、一の一本鎖核酸中に一の標的ヌクレオチド配列領域のみが存在している場合には、一本鎖核酸−プローブ複合体は、該一本鎖核酸と、１の上流側プローブと１の下流側プローブとから形成される。したがって、この場合には、「一本鎖核酸−プローブ複合体を形成するプローブのＴｍ値」とは、該上流側プローブのＴｍ値と該下流側プローブのＴｍ値のうちいずれか低い方である。また、図２や図４に示すように標的ヌクレオチド配列が重複している場合等、複数の標的ヌクレオチド配列に対する上流側プローブと下流側プローブとが互いに連結する場合には、これらの複数のプローブのＴｍ値のうち、最も低いＴｍ値が「一本鎖核酸−プローブ複合体を形成するプローブのＴｍ値」となる。
【００６８】
このように、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出精度が、光連結反応時の温度に影響を受ける理由は明らかではないが、各プローブのハイブリダイゼーション効率が温度に影響を受けるためではないかと推察される。例えば、光を照射する温度が、各プローブのＴｍ値よりも高い場合には、各プローブと標的ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下するため、光連結反応効率も低下してプローブ連結体が形成されず、核酸サンプルが標的ヌクレオチド配列を有する核酸を含んでいた場合であっても、該核酸サンプル中には標的ヌクレオチド配列を有する核酸は含まれていないと判断される恐れが高い。一方で、光を照射する温度が、各プローブのＴｍ値よりもはるかに低い場合には、各プローブのヌクレオチド配列識別能が低下し、標的ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列に対してもハイブリダイズしやすくなるため、核酸サンプルが標的ヌクレオチド配列を有する核酸を含んでいない場合であっても、該核酸サンプル中には標的ヌクレオチド配列を有する核酸は含まれていると判断される恐れが高い。
【００６９】
工程（ｆ）において、該一本鎖核酸−プローブ複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる方法は、特に限定されるものではなく、二本鎖核酸を一本鎖化する方法において挙げられた方法と同様の方法により行うことができる。特に、該一本鎖核酸−プローブ複合体を３７〜１０５℃に加熱することが好ましく、６０〜９５℃に加熱することがより好ましい。
【００７０】
その後、工程（ｇ）として、工程（ｅ）において連結されたプローブ（プローブ連結体）を検出し、工程（ｈ）として、プローブ連結体が検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、プローブ連結体が検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断することにより、核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出することができる。
【００７１】
工程（ｇ）におけるプローブ連結体の検出方法は、特に限定されるものではなく、ＰＣＲ産物等の核酸を検出する場合に通常行われる方法を用いて行うことができる。また、プローブ連結体の検出を容易にするために、工程（ｃ）において準備した各プローブは、予め適当な標識分子によって標識されていることが好ましい。このような標識分子は、一本鎖核酸−プローブ複合体の形成を阻害しない限り、特に限定されるものではなく、ヌクレオチド等を標識する場合に通常用いられる分子を使用することができる。
【００７２】
例えば、未連結の各プローブよりもプローブ連結体のほうが、分子量が大きいことを利用して、電気泳動法、カラムクロマトグラフィー法等により、各プローブを標識した標識分子を指標として、プローブ連結体を検出することができる。
【００７３】
各プローブは、一の標識分子により標識されていてもよく、同一種類の複数の標識分子により標識されていてもよく、複数種類の標識分子により標識されていてもよい。また、上流側プローブと下流側プローブは同一種類の標識分子により標識されていてもよく、異なる種類の標識分子により標識されていてもよい。その他、上流側プローブと下流側プローブのいずれか一方のみに標識分子を標識し、他方は非標識のプローブとしてもよい。例えば、複数の標的ヌクレオチド配列を検出する多重解析を行う場合には、一の標的ヌクレオチド配列対応する上流側プローブと下流側プローブを同一種類の標識分子により標識し、かつ標的ヌクレオチド配列の種類ごとに異なる種類の標識分子を用いて標識することにより、多重解析を容易に行うこともできる。
【００７４】
本発明においては、上流側プローブと下流側プローブを標識し得る標識分子としては、通常核酸の標識に用いられ得る分子であれば、特に限定されるものではない。このような標識分子として、例えば、発色基分子、発色抑制分子、蛍光分子、色素、燐光発光性分子、放射活性物質、化学発光性分子、酵素、抗原、重金属、ユーロピウム錯体、磁性分子、及び電気化学的検出分子等がある。ここで、発色基分子とは、少なくとも１の発色基を含み、他の発色基分子又は発色抑制分子と、空間的に適切な位置にて接近することにより、蛍光を発光又は消光することができる分子を意味する。また、発色抑制分子とは、空間的に適切な位置に配置されている他の発色基分子の発色を抑制することができる分子を意味する。なお、各標識分子のプローブへの標識は、一般的な有機合成方法等を用いることにより行うことができる。
【００７５】
未連結のプローブとプローブ連結体を区別して検出する方法として、大きさによる区別以外に、上流側プローブを標識する標識分子と下流側プローブを標識する標識分子との相互反応を検出する方法がある。このように、標識分子の相互反応を利用する場合には、上流側プローブを標識する標識分子と下流側プローブを標識する標識分子の空間的な距離が適当であることが必要である。このため、標識分子は、上流側プローブや下流側プローブにおいて、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることが好ましく、５’末端又は３’末端から６分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることがより好ましい。また、上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることが好ましく、１２以下であることがより好ましい。
【００７６】
このような標識分子の相互反応を利用する検出方法として、例えば、上流側プローブと下流側プローブを同一種類の発色基分子により標識することにより、上流側プローブと下流側プローブを連結させた場合に、上流側プローブを標識する発色基分子と下流側プローブを標識する発色基分子とによってエクサイプレックス又はエキシマーが形成される結果、発光されるエクサイプレックス蛍光又はエキシマー蛍光を検出することにより、上流側プローブと下流側プローブのプローブ連結体を検出することが可能となる（例えば、特許文献１参照。）。エクサイプレックス又はエキシマーは、各発色基分子が空間的に近接することにより形成されるため、一本鎖核酸に正しくハイブリダイズし、光照射により連結されたプローブのみを検出することができる。このため、未連結のプローブが過剰に共存する場合であっても、発色基分子単量体自体に由来する蛍光に干渉されることなく、プローブ連結体を検出することができる。
【００７７】
上流側プローブと下流側プローブを標識する発色基分子としては、上記定義を充足するものであれば特に限定されるものではないが、エクサイプレックス又はエキシマーを形成しやすい分子であることが好ましい。このような発色基分子としては、例えば、ピレン、ナフタレン、アントラセン、ペリレン、スチルベン、ベンゼン、トルエン、フェニルアントラセン、ジフェニルアントラセン、ベンツピレン、ベンツアントラセン、テトラセン、フェナントレン、ペンタセン、トリフェニレン、及びクリセン等の、芳香族性の発色基を含む分子であることが好ましく、ピレン骨格を有する発色基を含む分子であることがより好ましい。
【００７８】
また、上流側プローブと下流側プローブを異なる種類の発色基分子により標識することにより、上流側プローブを標識する標識分子と下流側プローブを標識する標識分子のうち、いずれか一方をドナー分子とし、他方をアクセプター分子とする蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を起こすことができ、この際に生じる蛍光の発光又は消光を検出することによっても、上流側プローブと下流側プローブのプローブ連結体を検出することができる。ＦＲＥＴも、エクサイプレックス又はエキシマーの形成と同様に、ドナー分子とアクセプター分子とが空間的に近接することにより起こるため、光照射により連結されたプローブのみを検出することが可能となる。
【００７９】
ドナー分子やアクセプター分子として機能し得る発色基分子は、ＦＲＥＴ法を行う場合に通常用いられている発色基分子を適宜使用することができる。本発明の検出方法においては、ドナー分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン社製）又はＡＴＴＯ ４８８（ＡＴＴＯ-ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）であり、前記アクセプター分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン社製）又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることが好ましい。
【００８０】
例えば、図４に示すように、標的ヌクレオチド配列及び各プローブを設計した場合に、プローブ１１ａに低波長で励起する発色基分子を標識し、プローブ１１ｂに中波長で励起する発色基分子を標識し、プローブ１１ｃに高波長で励起する発色基分子を標識しておく。これらのプローブを用いて鋳型となる一本鎖核酸にハイブリダイズさせ、光連結反応を行った場合に、核酸サンプル中に標的ヌクレオチド配列１０Ａと標的ヌクレオチド配列１０Ｂの両方を有する、図４に示す核酸が存在していた場合には、プローブ１１ａとプローブ１１ｂとプローブ１１ｃの３つのプローブの連結体が形成されるため、低波長の励起光を照射すると、各プローブの標識に用いた３種類の発色基分子が連鎖的にＦＲＥTを起こす結果、プローブ１１ｃを標識した高波長で励起する発色基分子の発光が検出される。
【００８１】
その他、上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子とすることにより、上流側プローブと下流側プローブを連結させた場合に、ＦＲＥＴとは異なる熱エネルギー放出により発色基分子の発光を消光させることができる。したがって、発色基分子の発光の変化を測定し、生じた消光を検出することにより、上流側プローブと下流側プローブのプローブ連結体を検出することが可能となる。この発色基分子の消光も、エクサイプレックス又はエキシマーの形成と同様に、発色基分子と発色抑制分子とが空間的に近接することにより起こるため、光照射により連結されたプローブのみを検出することが可能となる。
【００８２】
該検出方法では、２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する場合であって、各２以上の標的ヌクレオチド配列の上流側プローブに発色基分子を、各下流側プローブに発色抑制分子を、それぞれ標識する場合に、各発色基分子と各発色抑制分子は標的ヌクレオチド配列ごとに異なる種類としてもよいが、発色基分子は、標的ヌクレオチド配列ごとに異なる種類とし、発色抑制分子は、使用する全ての発色基分子の発色波長をカバーし得る１の種類の発色抑制分子を共通して使用することもできる。例えば、標的ヌクレオチド配列Ａの上流側プローブに発色基分子Ａを標識し、標的ヌクレオチド配列Ｂの上流側プローブに発色基分子Ｂを標識し、標的ヌクレオチド配列Ａと標的ヌクレオチド配列Ｂの双方の下流側プローブに、発色基分子Ａと発色基分子Ｂの両方の発色波長を抑制し得る同一の発色抑制分子Ｃを標識し、これらのプローブを一の反応溶液中に混在させることにより、各発色分子の発色波長をそれぞれ検出して、反応溶液中の標的ヌクレオチド配列Ａを有する核酸の有無と、標的ヌクレオチド配列Ｂを有する核酸の有無を、一の反応溶液中で解析することができる。
【００８３】
発色基分子の消光の検出により連結されたプローブを検出する場合に用いられる発色基分子や発色抑制分子としては、近接させた場合に熱エネルギーの放出が生じる組み合わせの分子であれば特に限定されるものではないが、発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ ４８８（ＡＴＴＯ-ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン社製）、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることが好ましい。
【００８４】
その他、本発明の検出方法においては、上記のように、全ての核酸増幅段階が終了した後に光連結反応による検出段階を行ってもよく、核酸増幅段階と検出段階を交互に行ってもよい。つまり、ＰＣＲは、変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程の３つの工程を１サイクルとし、該サイクルを繰り返すことにより標的ヌクレオチド配列を有する核酸を増幅していくが、このＰＣＲのサイクルごとに、光連結反応を行い、プローブ連結体を検出してもよい。このように、１サイクルを終了する度に検出反応を行い、増幅された標的ヌクレオチド配列を有する核酸を経時的に検出することにより、リアルタイムＰＣＲのように、半定量的な検出が可能となる。
【００８５】
また、核酸増幅段階と検出段階を交互に行う場合において、核酸増幅段階におけるＰＣＲは、変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程の３つの工程からなるサイクルを繰り返すものであれば、特に限定されるものではなく、通常のＰＣＲであってもよく、非対称ＰＣＲであってもよく、一本鎖のループ構造部分に標的ヌクレオチド配列領域を有するＰＣＲ産物を得ることができるＰＣＲであってもよい。
【００８６】
具体的には、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、下記の工程（１）〜（１１）を有し、工程（１０）及び（１１）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法であってもよい。
（１）標的ヌクレオチド配列ごとに、上記要件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（２）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを準備する工程と、
（３）前記核酸サンプル、前記工程（１）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブ、前記工程（２）において準備したプライマー、並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有する反応溶液を調製する工程と、
（４）前記工程（３）において調製した反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、
（５）前記工程（４）において得られた一本鎖核酸を鋳型として、前記プライマー用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程と、
（６）前記工程（５）の後、反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、
（７）前記工程（６）において得られた一本鎖核酸に対して、反応溶液中の上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（８）前記工程（７）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（９）前記工程（８）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（１０）前記工程（９）の後に、前記工程（８）において連結されたプローブを検出する工程と、
（１１）前記工程（１０）の後、前記工程（４）〜（１０）を繰り返す工程。
【００８７】
工程（１）は、前記工程（ｂ）と同様である。
また、工程（２）において準備されるプライマーは、前記工程（ａ）においてＰＣＲに用いるプライマーと同様である。
そして、工程（３）において、核酸サンプルと、前工程において準備した上流側プローブ、下流側プローブ、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有する反応溶液を調製する。ここで調製される反応溶液は、前記工程（ａ）においてＰＣＲを行う反応溶液に、上流側プローブと下流側プローブとを添加したものであり、ＤＮＡポリメラーゼのみならず、ヌクレオチド、塩類等のＰＣＲのために必要な試薬を適量含むものである。該反応溶液に添加される、工程（２）において準備された１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーは、通常のＰＣＲと同様に増幅ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーであってもよく、このうちの１種類のみであってもよく、前記工程（ａ’４）において用いられるような３種類のプライマーであってもよい。
【００８８】
次に、工程（４）として、工程（３）において調製した反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させ、工程（５）として、変性により得られた一本鎖核酸を鋳型として、前記プライマー用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う。この工程（４）が、ＰＣＲの１サイクルにおける変性工程に相当し、工程（５）が、アニール工程及び伸長工程に相当する。
【００８９】
その後、工程（６）として、反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる。該工程は、前記工程（ｂ）に相当する工程であり、変性方法は、工程（ｂ）と同様に行うことができる。また、工程（３）〜（４）におけるＰＣＲが非対称ＰＣＲ等であって、増幅された標的ヌクレオチド配列を有する核酸が一本鎖核酸である場合には、省略することができる。
【００９０】
さらに工程（７）〜（１０）により、ＰＣＲにより増幅された一本鎖核酸を鋳型として、上流側プローブと下流側プローブをハイブリダイズさせた後、光連結反応を行い、得られたプローブ連結体を検出する。具体的には、工程（７）は前記工程（ｄ）と、工程（８）は前記工程（ｅ）と、工程（９）は前記工程（ｆ）と、工程（１０）は前記工程（ｇ）と、それぞれ同様に行うことができる。
【００９１】
なお、このようにＰＣＲの各サイクル終了時に光連結反応を行い、得られたプローブ連結体を検出する方法は、リアルタイムＰＣＲに通常用いられている装置に、光連結反応に適した波長の光を照射し得る装置を組み込んだ装置を用いることにより、簡便に実施することができる。
【００９２】
本発明の検出方法を利用することにより、標的ヌクレオチド配列に、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失からなるミスマッチ部位を有する非標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とを識別することができる。具体的には、本発明の核酸の識別方法は、標的ヌクレオチド配列に、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失からなるミスマッチ部位を有する非標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とを識別する方法であって、（ａ”）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、二本鎖核酸を増幅する工程と、（ｂ”）前記工程（ａ”）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、（ｃ”）上記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ”）前記工程（ｂ”）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ”）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸−プローブ複合体を形成する工程と、（ｅ”）前記工程（ｄ”）により形成された一本鎖核酸−プローブ複合体に光を照射する工程と、（ｆ”）前記工程（ｅ”）の後に、前記一本鎖核酸−プローブ複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ”）前記工程（ｆ”）の後に、前記工程（ｅ”）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ”）前記工程（ｇ”）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記非標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていると判断する工程と、を有することを特徴とする。
【００９３】
本発明の核酸の識別方法において、工程（ａ”）〜（ｇ”）は、本発明の検出方法の工程（ａ）〜（ｇ）と同様である。特に工程（ａ”）におけるＰＣＲは、本発明の検出方法の工程（ａ）と同様に非対象ＰＣＲであってもよい。工程（ａ”）におけるＰＣＲを非対称ＰＣＲとする場合には、工程（ｂ）と同様に工程（ｂ”）は省略してもよい。
【００９４】
本発明の核酸の識別方法において、標的ヌクレオチド配列と非標的ヌクレオチド配列との相違部位であるミスマッチ部位は、１又は２以上のヌクレオチドが置換、挿入、又は欠失されている部位である。例えば、１又は２箇所以上の、１のヌクレオチド又は２以上の連続したヌクレオチドが置換、挿入、又は欠失されている部位であってよい。つまり、２以上のヌクレオチドが置換等している場合には、ミスマッチ部位は、一箇所であってもよく、複数箇所にあってもよい。具体的には、一箇所の２以上の連続するヌクレオチドが置換等されていてもよく、１又は２以上の連続するヌクレオチドが置換等されている箇所が複数存在していてもよい。
【００９５】
標的ヌクレオチド配列において、ミスマッチ部位は、上流側プローブと下流側プローブの連結部位の近隣に存在していることが好ましい。なお、本発明においては、上流側プローブと下流側プローブの連結部位の近隣１０分子を、「塩基識別可能領域」という。ミスマッチ部位は塩基識別可能領域にあることが好ましい。該領域にあることにより、たった一塩基のみ相違する標的ヌクレオチド配列同士をより高精度に識別することができるためである。本発明の核酸の識別方法においては、ミスマッチ部位が塩基識別可能領域にあること、すなわち、ミスマッチ部位が、上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から１０分子以内又は下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から１０分子以内にあることが好ましい。ミスマッチ部位は、特に、上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から３分子以内又は下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から３分子以内にあることがより好ましい。
【００９６】
なお、標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割する際に、ミスマッチ部位が該上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から１０分子以内、又は該下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から１０分子以内となるように、標的ヌクレオチド配列を２分割することにより、ミスマッチ部位が上流側プローブや下流側プローブの塩基識別可能領域に有るようにすることができる。また、解析対象である核酸のヌクレオチド配列が予め開示されている場合には、標的ヌクレオチド配列は任意に決定することができるため、ミスマッチ部位が標的ヌクレオチド配列の５’末端領域や３’末端領域に偏りすぎないように、予め標的ヌクレオチド配列を決定しておくことも好ましい。
【００９７】
図５は本発明の核酸の識別方法の一態様を模式的に示した図である。標的ヌクレオチド配列と非標的ヌクレオチド配列は、ミスマッチ部位（図中の「変異部位」に相当）以外は相同的なヌクレオチド配列を有しており、相同性が高い。このため、上流側プローブと下流側プローブは、非標的ヌクレオチド配列に対しても、ミスマッチ部位以外の領域でハイブリダイズし得る場合が多い。この場合であっても、ミスマッチ部位が連結部位近隣、特に塩基識別可能領域に有る場合には、連結部位近隣において、少なくともいずれか一方のプローブが一本鎖核酸と完全にハイブリダイズしていないため、図５に示すように、上流側プローブと下流側プローブが光連結反応による連結のために十分なほど近接することができず、プローブ連結体の形成が阻害される。この結果、連結されたプローブが検出された場合には、核酸サンプル中に標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、核酸サンプル中に非標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていると判断することができ、核酸サンプル中の核酸が、標的ヌクレオチド配列を有する核酸であるか、又は非標的ヌクレオチド配列を有する核酸であるかを識別することができる。
【００９８】
本発明の核酸の識別方法は、特に遺伝子多型のタイピングに好適に用いることができる。工程（ｇ”）において検出された連結されたプローブ量は、核酸サンプル中に存在していた標的ヌクレオチド配列を有する核酸の量と相関するため、連結されたプローブ量から、核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、非標的ヌクレオチド配列を有する核酸との相対的な量比を算出し得るためである。
【００９９】
具体的には、ミスマッチ部位が遺伝子多型の多型部位とし、標的ヌクレオチド配列が遺伝子多型のうちの一多型に相同的なヌクレオチド配列とし、非標的ヌクレオチド配列が該遺伝子多型の他の一多型に相同的なヌクレオチド配列として、工程（ａ”）〜（ｇ”）を行った後、工程（ｇ”）において検出されたプローブ連結体量に基づき、前記核酸サンプル中の核酸が、前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、及び前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルと前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのヘテロ接合体のいずれであるかを識別することができる。
【０１００】
例えば、Ａ／ＧタイプのＳＮＰをタイピングする場合において、Ａアレルに相同的なヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とし、Ｇアレルに相同的なヌクレオチド配列を非標的ヌクレオチド配列として、本発明の核酸の識別方法を用いて検出対象である核酸サンプルのタイピングを行った場合に、検出されたプローブ連結体量が、Ａアレルのホモ接合体を核酸サンプルとして用いた場合のプローブ連結体量とほぼ同程度であれば、検出対象核酸サンプルはＡアレルのホモ接合体であり、Ｇアレルのホモ接合体を核酸サンプルとして用いた場合のプローブ連結体量とほぼ同程度であれば、検出対象核酸サンプルはＧアレルのホモ接合体であり、Ａアレルのホモ接合体を核酸サンプルとして用いた場合のプローブ連結体量とＧアレルのホモ接合体を核酸サンプルとして用いた場合のプローブ連結体量との中間的な量であれば、ＡアレルとＧアレルのヘテロ接合体であるとタイピングすることができる。
【０１０１】
その他、本発明の検出方法を利用することにより、配列情報が未知のヌクレオチド配列を決定することもできる。例えば、配列情報が不明であるヌクレオチド配列領域において、該領域のヌクレオチド配列として推定されるヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とし、該標的ヌクレオチド配列を有する核酸が検出された場合には、該領域のヌクレオチド配列が、該標的ヌクレオチド配列と同一の配列であると決定することができる。
【０１０２】
本発明のプローブセットは、本発明の検出方法や、本発明の核酸の識別方法において用いることができる上流側プローブと下流側プローブをセットとしたものである。標的ヌクレオチド配列が２以上ある場合には、一の標的ヌクレオチド配列に対する上流側プローブと下流側プローブのみを一のプローブセットとしてもよく、全ての標的ヌクレオチド配列に対する上流側プローブと下流側プローブを一のプローブセットとしてもよい。
【実施例】
【０１０３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
［参考例１］各種蛍光色素の紫外線耐性の検討
本発明における上流側プローブ又は下流側プローブの標識（修飾）に用いられる蛍光色素の紫外線耐性について検討した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に、表１に示した各種蛍光色素修飾プローブを、終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬに、また、１０×ＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製）を終濃度１×（説明書に記載の標準濃度）になるように添加し、純水でメスアップして全量４０μＬのサンプルを調製した。なお、表１中、「ｐ」は３’ 末端ヌクレオチドのリン酸基修飾を、「ｃｖ−Ｕ」は５−カルボキシビニル-デオキシウリジンを、「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８」、「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４」、「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８」、「ＡＴＴＯ ５５０」、「ＡＴＴＯ ５６５」、「ＡＴＴＯ ４６５」、「ＡＴＴＯ ４８８」、「Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５」、「Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８」、「ＴＡＭＲＡ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）」、「ＲＯＸ」は各種蛍光色素の種類と修飾部位を、それぞれ示す。例えば、「ｗＬ１４−Ａｌｅ５６８」は、配列番号３のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端から１０番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８で修飾されているプローブである。また、「ｗＬ２５−Ａｌｅ５９４」は、配列番号５のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端から２１番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４で修飾されているプローブであり、「ｍＬ２５−Ａｌｅ５９４」は、配列番号６のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端から２１番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４で修飾されているプローブである。また、「Ｒ１２−Ａｌｅ４８８」は、配列番号７のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端ヌクレオチドが５−カルボキシビニル-デオキシウリジンであり、さらに５’末端から６番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で修飾されているプローブである。「Ｒ２１−Ａｔ４８８」は、配列番号８のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端ヌクレオチドが５−カルボキシビニル-デオキシウリジンであり、さらに５’末端から６番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で修飾されているプローブである。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
チューブに透明キャップを装着した後、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線（強度：約９００ｍＷ／ｃｍ２）を室温下にて、０分、３０分間、６０分間照射し、その際の蛍光強度劣化との関係を調べた。蛍光強度測定は、リアルタイムＰＣＲ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて計測した。その際、下流側プローブ（長波長励起のＡｃｃｅｐｔｏｒ色素）は、励起光４６５ｎｍ、蛍光５８０〜６１０ｎｍのフィルタを、また、上流側プローブ（低波長励起のＤｏｎｏｒ色素）は励起光４６５ｎｍ、蛍光５２０〜５５０ｎｍのフィルタを、それぞれ用いて計測した。
【０１０７】
各種蛍光色素修飾プローブの紫外線照射後における蛍光強度変化を図６〜図１６に示す。
この結果、ｗＬ１４−Ａｌｅ ５９４、ｗＬ１４−Ｈｉｌ ５５５、ｗＬ１４−Ｒｏｘの３種については、紫外線照射によっても蛍光強度に大きな変化は見られなかった。
一方で、Ｒ１２−Ａｌｅ ４８８、Ｒ１２−Ａｔｏ ４８８、ｗＬ１４−Ａｔｏ ５５０の３種については、照射時間が長くなるほど蛍光強度に若干の減少が認められた。
また、ｗＬ１４−Ａｔｏ ５６５、ｗＬ１４−ＴＡＭＲＡの２種については、照射時間が長くなるほど見かけ上、蛍光強度が増加する傾向を示し、Ｒ１２−Ａｔｏ ４６５、Ｒ１２−Ｈｉｌ ４８８、ｗＬ１４−Ａｌｅ ５６８の３種については、照射時間が長くなるについて、蛍光強度は激減する結果となった。
以上のことから、上流側プローブとしては、Ｒ１２−Ａｌｅ ４８８、Ｒ１２−Ａｔｏ ４８８の２種、また、下流側プローブとしては、ｗＬ１４−Ａｌｅ ５９４、ｗＬ１４−Ｈｉｌ ５５５、ｗＬ１４−Ｒｏｘ、ｗＬ１４−Ａｔｏ ５５０の４種が紫外線に対して比較的強い耐性を有することが明らかとなった。
【０１０８】
［参考例２］各種蛍光色素修飾プローブにおけるＦＲＥＴ効果
表１に示した各種蛍光色素修飾プローブのうち、低波長励起色素と長波長励起色素とを組み合わせ、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９、配列番号１０）とハイブリダイゼーションさせた際のＦＲＥＴ効果における蛍光強度比較を行った。
具体的には、表１に記載の各種蛍光修飾プローブの上流側プローブと下流側プローブを、それぞれ終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬ、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）を終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬ、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるように添加し、純水でメスアップして全量４０μＬのサンプルを調製した。また、ネガティブコントロールとしては、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）を添加しないサンプルを調製した。
蛍光強度測定にはリアルタイムＰＣＲ７３００を使用し、サンプルを２０．０℃から８０．３℃まで昇温させる間の蛍光強度を計測した。その際、励起光は４６５ｎｍ、蛍光は５８０〜６１０ｎｍのフィルタにて測光した。
鋳型存在下におけるＦＥＲＴ光と、鋳型非存在下におけるＦＲＥＴ光（ネガティブコントロール）の蛍光強度比を算出した。図１７〜２３は、算出された各種蛍光色素の強度比を重ねてプロットした図である。
この結果、表１記載の蛍光修飾プローブのうち、下流側プローブのｗＬ１４−Ｈｉｌ ５５５及びｗＬ１４−ＴＡＭＲＡを除いた全ての色素の組み合わせにおいて、顕著なＦＲＥＴが認められた。中でも本検出器では、上流側プローブのＲ１２−Ａｌｅ４８８及びＲ１２−４６５が高いＦＲＥＴ効果を引き出すことが分かった。
【０１０９】
［参考例３］各種蛍光色素修飾プローブの光連結反応後のＦＲＥＴ効果
表１に示した各種蛍光色素修飾プローブのうち、低波長励起色素と長波長励起色素とを組み合わせ、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）とをハイブリダイゼーションさせ、さらに光連結反応を行った際のＦＲＥＴ強度について比較した。
具体的には、２００μＬチューブに、表１に記載の上流側プローブ及び下流側プローブの各種組み合わせた蛍光修飾プローブをそれぞれ終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬ、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）を終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬ、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるように添加し、純水でメスアップして全量４０μＬのサンプルを調製した。また、ネガティブコントロールには、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）を添加しないサンプルとして調製した。なお、Ｒ１２−Ａｔｏ ４６５及びＲ１２−Ｈｉｌ ４８８は、紫外線耐性が低かったことから（参考例１の結果）、本実験では用いなかった。
上記調製サンプルの入った容器に透明キャップを装着し、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線（強度：約９００ｍＷ／ｃｍ２）を０℃下にて、１０分間照射し、プローブ間の光連結反応を試みた。
ＦＲＥＴ強度測定にはリアルタイムＰＣＲ７３００を使用し、励起光は４６５ｎｍ、蛍光は５８０〜６１０ｎｍのフィルタを用いて、サンプルを２０．１℃から７７．３℃まで昇温させた際の蛍光を計測した。
鋳型存在下における各種蛍光色素修飾プローブの光連結反応後のＦＥＲＴ光と、鋳型非存在下におけるＦＲＥＴ光（ネガティブコントロール）の蛍光強度比を算出した。図２４〜３０は、算出された各種蛍光色素の強度比を重ねてプロットした図である。
連結反応後の上・下流側プローブの連結体のＴｍ値（５５℃付近）よりも高い温度領域（各図２４〜３０の点線枠内）でのＦＲＥＴは、単に上流側プローブと下流側プローブの隣接により生じたＦＲＥＴではなく、連結されたプローブのみによるＦＲＥＴである。点線枠内のＦＲＥＴ強度比の結果より、ｗＬ１４−Ｈｉｌ ５５５とｗＬ１４−ＴＡＭＲＡを除く蛍光修飾プローブでは、光連結反応による顕著なＦＲＥＴ効果が認められた。また、この結果から、プローブに修飾されている蛍光色素の位置が、光連結反応を阻害する位置ではないことが分かると同時に、光連結反応が蛍光色素のＦＲＥＴ反応を阻害しないことも確認できた。さらに、上流側プローブの３’末端にリン酸基が修飾されてもプローブ間の光連結反応が起こることが明らかとなった。なお、通常の酵素（リガーゼ）反応では連結反応は阻害される。
【０１１０】
［参考例４］光連結反応の最適反応温度の検討１
光連結反応におけるヌクレオチド識別特異性と温度との関係について検討した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブの中に、表１記載の下流側プローブｗＬ１４−ＴＡＭＲＡ又はｍＬ１４−ＴＡＭＲＡを終濃度が各５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の上流側プローブＲ１２を終濃度が各５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１の鋳型ＤＮＡであるｗＴ３９又はｍＴ３９（配列番号１１）を終濃度が５ｐｍｏｌ／μＬになるよう加え、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう試薬を添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。サンプルは、ｗＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（フルマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（フルマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）、ｗＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）の４通りの組合せとなるように調製した。マイクロチューブに透明キャップを装着した後、各サンプルをそれぞれ０℃、１０℃、１８℃、２６℃、３１℃、３７℃、４８℃、６０℃となるようサーマルサイクラーにて温調制御し、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線を約９００ｍＷ／ｃｍ２の強度で１０分間照射した。
上記の条件で紫外線照射したサンプルについて下記条件にてＨＰＬＣ分析を行った。各反応温度におけるプローブ連結体量の測定結果を図３１に示す。
溶離液［Ａ］：１００ｍＭ 酢酸トリエチルアミン水溶液
溶離液［Ｂ］：５０％ １００ｍＭ酢酸トリエチルアミン水溶液 / ５０％アセトニトリル
グラジエント[Ｂ]： ０ｍｉｎ，１０％→２２ｍｉｎ，４５．５％
インジェクション： ２０μＬ
検出波長： ２５４ｎｍ
流速： １ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度： ６０℃
カラム / 充填材：ChemcoPak Chemcobond 5-ODS-H (Lot# G7A62)
【０１１１】
この結果、光連結反応温度が高温になるに従って、光連結反応の効率低下が認められた。また、４８℃以上では光連結反応産物の生成を認めることはできなかった。一方、０℃下における光連結反応では、シングルヌクレオチドミスマッチ配列であっても比較的高い光連結反応産物が認められたが、反応温度が高くなるにつれて、その非特異的な連結反応産物は減少する傾向にあり、３７℃下での光連結反応が最も高い精度（高いＳ／Ｎ比）にてヌクレオチドミスマッチを識別できていることが分かった。
【０１１２】
［参考例５］光連結反応の最適反応温度の検討２
下流側プローブとしてｗＬ２５−ＴＡＭＲＡ又はｍＬ２５−ＴＡＭＲＡを、上流側プローブとしてＲ２１を、鋳型ＤＮＡとしてｗＴ５０（配列番号１２）又はｍＴ５０（配列番号１３）をそれぞれ用いた以外は、参考例４と同様にして、各反応温度におけるプローブ連結体量を測定した。測定結果を図３２に示す。
この結果、参考例４と同様に、光連結反応温度が高温になるに従って、光連結反応の効率低下が認められた。また、０℃下における光連結反応では、シングルヌクレオチドミスマッチ配列であっても比較的高い光連結反応産物が認められたが、反応温度が高くなるにつれて、その非特異的な連結反応産物は減少する傾向にあり、６０℃下での光連結反応が最も高い精度（高いＳ／Ｎ比）にてヌクレオチドミスマッチを識別できていることが分かった。
本実験結果を参考例４の結果と比較すると、ヌクレオチドミスマッチを高精度に識別できる至適反応温度は、プローブが長鎖となる本実験では高くなっていた（３７℃→４８℃）。以上より、光連結反応によるヌクレオチド配列の識別特異性は、プローブの長さに依存する、すなわち、プローブのＴｍ値にも深く関与していることが示唆された。
【０１１３】
［参考例６］オリゴＤＮＡとプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値の測定１
参考例４で用いたオリゴＤＮＡと標識分子のみが異なるプローブを用いて、オリゴＤＮＡとプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値を測定した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブの中に、表１記載の下流側プローブｗＬ１４−Ａｌｅ５９４又はｍＬ１４−Ａｌｅ５９４を終濃度が各０．５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の上流側プローブＲ１２−Ａｔｏ４８８を終濃度が各０．５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の鋳型ＤＮＡであるｗＴ３９又はｍＴ３９を終濃度が各０．５ｐｍｏｌ／μＬになるよう加え、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう試薬を添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。サンプルは、ｗＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（フルマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（フルマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）、ｗＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）の４通りの組合せとなるように調製した。また、ネガティブコントロールとしては、鋳型ＤＮＡを添加しないサンプルを調製した。
蛍光強度測定にはリアルタイムＰＣＲ７３００を使用し、サンプルを１５．０℃から９１．９℃まで昇温させる間の蛍光強度を計測した。その際、励起光は４６５ｎｍ、蛍光は５８０〜６１０ｎｍのフィルタにて測光した。
図３３は、上記実験より得られた融解曲線である。この結果、本実験で使用したプローブの上記４通りの組合せにおけるＴｍ値は、３４〜３７℃の範囲であることが示された。
【０１１４】
［参考例７］オリゴＤＮＡとプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値の測定２
参考例５で用いたオリゴＤＮＡと標識分子のみが異なるプローブを用いて、オリゴＤＮＡとプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値を測定した。
下流側プローブとしてｗＬ２５−Ａｌｅ５９４又はｍＬ２５−Ａｌｅ５９４を、上流側プローブとしてＲ２１−Ａｔｏ４８８を、鋳型ＤＮＡとしてｗＴ５０又はｍＴ５０をそれぞれ用いた以外は、参考例６と同様にして、Ｔｍ値の測定を行った。
図３４は、上記実験より得られた融解曲線である。この結果、本実験で使用したプローブの上記４通りの組合せにおけるＴｍ値は、５５〜５８℃の範囲であることが示された。
【０１１５】
参考例４及び５において得られた各プローブのヌクレオチド配列の識別特異性と光連結反応温度との関係に関する結果と、参考例６及び７において得られた各プローブのＴｍ値の結果から、光連結反応温度を、鋳型となる一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値−５℃以上Ｔｍ値以下の範囲にすることにより、各プローブのヌクレオチド配列の識別能（各プローブのヌクレオチド配列に対する特異性）が向上し、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を、高精度に検出し得ることが明らかである。
【０１１６】
［参考例８］オリゴＤＮＡを鋳型とした光連結反応のヌクレオチド識別特異性評価
光連結反応におけるヌクレオチド識別特異性と定量性について検討した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブの中に、表１記載の下流側プローブｗＬ１４又はｍＬ１４を終濃度が各０.５ｐｍｏｌ／μＬになるように、また、表１記載の上流側プローブＲ１２を終濃度が各０.５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の鋳型ＤＮＡｗＴ３９又はｍＴ３９を終濃度が０.５ｐｍｏｌ／μＬ、あるいはｗＴ３９とｍＴ３９を混合し、それぞれの終濃度が０.２５ｐｍｏｌ／μＬになるよう加え、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう試薬を添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。サンプルは、ｗＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（マッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（マッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）、ｗＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｗＴ３９とｍＴ３９（ハーフマッチ）、ｗＬ１４とＲ１２とｗＴ３９とｍＴ３９（ハーフマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２（ネガティブコントロール）、ｗＬ１４とＲ１２（ネガティブコントロール）の全８通りの組合せとなるように調製した。マイクロチューブに透明キャップを装着した後、反応温度が３７℃となるようサーマルサイクラーにて温調制御し、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線を約９００ｍＷ／ｃｍ２の強度で１０分間照射した。
ＦＲＥＴ強度測定にはリアルタイムＰＣＲ７３００を使用し、励起光は４６５ｎｍ、蛍光は６１０ｎｍのフィルタを用いて、サンプルを２１．２℃から９２．５℃まで昇温させた際の蛍光を計測した。図３３〜４０は、Ａｃｃｅｐｔｏｒ色素のＦＲＥＴ値をＤｏｎｏｒ色素のＦＲＥＴ値で除した値を重ねてプロットした図である。
図３３から図４０において、光連結反応したプローブのＴｍ値（５５℃付近）よりも高い温度領域での蛍光強度比を比較すると、ターゲットが含まれないネガティブコントロールの蛍光強度比に対して、ミスマッチ、ハーフマッチ、マッチの順に蛍光強度比は高くなることが分かった。このことから、光連結反応がターゲットのヌクレオチド配列を識別検出できていることが明らかとなった。また同時に、ハーフマッチがミスマッチとマッチのほぼ中間値となる蛍光強度比を示していることから、本光連結反応は、定量性も有していることが示唆される。よって、検出対象である核酸が、野生型アレルホモ体、変異型アレルと野生型アレルのへテロ体、野生型アレルのホモ体のいずれのタイプを呈する場合であっても、本発明の方法を用いることにより、容易にその多型を識別できることが明らかである。
【０１１７】
［実施例１］
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のヒトＳＮＰ（Ａ／Ｃ）の、３タイプ（ＡＡ、ＡＣ、ＣＣ）のゲノムＤＮＡをそれぞれＰＣＲ増幅し、合成された二本鎖核酸を鋳型として、上流側及び下流側プローブを用いて光連結反応を行い、遺伝子型を識別した。方法の詳細を以下に示す。
増幅ヌクレオチド配列領域内に３種類の多型をそれぞれ持つヒトゲノムＤＮＡ（ＡＡ：ワイルド、ＡＣ：ミュータントへテロ、ＣＣ：ミュータントホモ）を鋳型として、表１記載のＦ２４プライマーとＲ２２プライマーを用いて、ＰＣＲ反応にて増幅ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸を増幅した。ＰＣＲ反応には、ホットスタート式Ｔａｑポリメラーゼを５ｕｎｉｔ、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。ＰＣＲ温調サイクルは、９５℃３分間を１サイクル、次に９５℃３０秒間−５８℃３０秒間−７２℃３０秒間を４０サイクル、その後７２℃５分間とした。次に、得られたＰＣＲ産物から１８μＬを分取し、表１記載の下流側プローブｗＬ２５−Ａｌｅ ５９４（ワイルド検出用）又はｍＬ２５−Ａｌｅ ５９４（ミュータント検出用）と、表１記載の上流側プローブＲ２１−Ａｔｏ４８８を各々０．５ｐｍｏｌ／μＬになるように加え、全量を２０μＬとする光連結反応準備溶液を調製した。また、ネガティブコントロール溶液は、ＰＣＲ産物の代わりに水で置き換えたものを準備した。
サンプルをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３５０Ｓ専用キャピラリに装填し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３５０Ｓにて、９５℃１分、次いで、２０℃／ｓｅｃの速度で４０℃まで温度降下し、ＰＣＲ産物である二本鎖核酸と各種プローブセットとのハイブリダイゼーション反応を促した。その後直ちに、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３５０Ｓからキャピラリを取り出し、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、キャピラリの外側から内部のサンプル溶液に向けて、室温下で３６５ｎｍの紫外線を１０分間照射した。
上記のサンプル溶液（キャピラリ）を再び、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３５０Ｓにセットし、９５℃にてサンプル溶液のＦＲＥＴ解析を行った。Ｆ２（６４０ｎｍ）、Ｆ１（５３０ｎｍ）のフィルタで測定した蛍光強度値の比、Ｆ２／Ｆ１の値を算出した。図４１及び図４２は、各種プローブセットにおいて検出されたＦＲＥＴ強度比から、ネガティブコントロールのＦＲＥＴ強度比を差し引いた値と、各種ゲノムＤＮＡのタイプとの関係について示した図である。
図４１、図４２はともに、検出用である下流側プローブとゲノムＤＮＡのタイプが一致する場合（マッチ）には、ＦＲＥＴ強度比が高くなり、一致しない場合（ミスマッチ）には、そのＦＲＥＴ強度比は小さくなり、半分のみ一致するヘテロ接合体である場合（ハーフマッチ）では、タイプが一致する場合と一致しない場合の中間のＦＲＥＴ強度比を示した。これらの結果から、本発明の核酸識別方法により、ＳＮＰ等の遺伝子多型をタイピングし得ることが明らかである。
【０１１８】
現在、臨床分野や研究分野においては、遺伝子検査の安定性、コストダウン、簡素化党が求められているが、従来法では、検査反応に酵素を用いるということで、保存性や安定性の面で問題解決に限界があり、それに伴い、コストダウンや検査反応の簡素改良も困難となっている。本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法及び核酸の識別方法は、光連結反応を用いることにより、酵素を用いずに変異を識別することが可能となるため、安定性及びコスト面での改善、また、反応系の簡素化も容易となり、今後産業価値の高い技術として広く活用されることが期待できる。
【０１１９】
［参考例９］紫外線照射に伴うＢＨＱ２のクエンチング能力減衰評価
ＢＨＱ２の紫外線耐性、すなわち、ＢＨＱ２のクエンチング能力に対する紫外線照射の影響を、経時的に紫外線を照射したＢＨＱ２による、蛍光色素の消光度合いについて解析し、評価した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブの中に、表１記載の下流側プローブｗＬ２５−Ａｌｅ４８８又はｗＬ２５−Ａｌｅ５９４を終濃度が各１ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の上流側プローブＲ２３−ＢＨＱ２を終濃度が１ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１の鋳型ＤＮＡであるｗＴ５０を終濃度が１ｐｍｏｌ／μＬになるよう加え、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう試薬を添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。なお、ポジティブコントロールとして、Ｒ２３−ＢＨＱ２に代えて純水を添加した反応溶液を調製した。
これらのチューブに透明キャップを装着した後、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線（強度：約９００ｍＷ／ｃｍ２）を室温下にて、０分、３０分間、６０分間照射し、各下流側プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定した。なお、蛍光強度測定は、リアルタイムＰＣＲ７３００を用いて行った。
図４５及び図４６は、各種蛍光色素修飾プローブの紫外線照射後における蛍光強度変化を示した図である。また、図中、「ＰＣ」は、紫外線照射０分のポジティブコントロールを示している。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
表２は、測定された蛍光強度に基づき、ＢＨＱ２のクエンチング能力を評価した表である。表中の「ＰＣ」は図４５及び４６と同様である。具体的には、紫外線照射０分間のサンプルにおけるＢＨＱ２のクエンチング能力を１００％とし、紫外線照射０分のポジティブコントロールにおけるＢＨＱ２のクエンチング能力を０％とし、紫外線照射３０分間と６０分間の各サンプルにおけるＢＨＱ２のクエンチング能力を算定した。
表２の結果から、いずれの蛍光色素であっても、紫外線照射３０分間では、ＢＨＱ２のクエンチング能力はおよそ１３％程度の減衰しか認められなかった。したがって、これらの結果から、少なくとも３０分間程度の紫外線照射による光連結反応であれば、ＢＨＱ２のクエンチング能力を活かした蛍光検出によるプローブ連結体の検出が可能であることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】標的ヌクレオチド配列１、上流側プローブ２、及び下流側プローブ３の関係を模式的に示した図である。
【図２】複数の標的ヌクレオチド配列と、上流側プローブ及び下流側プローブの関係を模式的に示した図である。
【図３】標的ヌクレオチド８及び標的ヌクレオチド配列９の関係を模式的に例示した図である。
【図４】標的ヌクレオチド８、標的ヌクレオチド配列９、プローブ１０の関係を模式的に例示した図である。
【図５】本発明の核酸の識別方法の一態様を模式的に示した図である。
【図６】参考例１におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８の蛍光強度変化を示した図である。
【図７】参考例１におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４の蛍光強度変化を示した図である。
【図８】参考例１におけるＡＴＴＯ ５５０の蛍光強度変化を示した図である。
【図９】参考例１におけるＡＴＴＯ ５６５の蛍光強度変化を示した図である。
【図１０】参考例１におけるＨｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５の蛍光強度変化を示した図である。
【図１１】参考例１におけるＴＡＭＲＡの蛍光強度変化を示した図である。
【図１２】参考例１におけるＲＯＸ--の蛍光強度変化を示した図である。
【図１３】参考例１におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光強度変化を示した図である。
【図１４】参考例１におけるＡＴＴＯ ４６５の蛍光強度変化を示した図である。
【図１５】参考例１におけるＡＴＴＯ ４８８の蛍光強度変化を示した図である。
【図１６】参考例１におけるＨｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光強度変化を示した図である。
【図１７】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図１８】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図１９】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＡＴＴＯ ５５０とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２０】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＡＴＴＯ ５６５とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２１】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２２】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＴＡＭＲＡとのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２３】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＲＯＸとのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２４】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２５】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２６】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＡＴＴＯ ５５０とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２７】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＡＴＴＯ ５６５とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２８】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２９】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＴＡＭＲＡとのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図３０】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＲＯＸとのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図３１】参考例４におけるヌクレオチド識別特異性と光連結反応温度との関係を示した図である。
【図３２】参考例５におけるヌクレオチド識別特異性と光連結反応温度との関係を示した図である。
【図３３】参考例６における光連結プローブの融解曲線解析の結果を示した図である。
【図３４】参考例７における光連結プローブの融解曲線解析の結果を示した図である。
【図３５】参考例８におけるＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ５９４のＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図３６】参考例８におけるＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ５９４のＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図３７】参考例８におけるＡＴＴＯ ４８８とＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ５９４のＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図３８】参考例８におけるＡＴＴＯ ４８８とＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ５９４のＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図３９】参考例８におけるＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＲＯＸのＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図４０】参考例８におけるＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＲＯＸのＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図４１】参考例８におけるＡＴＴＯ ４８８とＲＯＸのＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図４２】参考例８におけるＡＴＴＯ ４８８とＲＯＸのＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図４３】実施例１におけるＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるＣＹＰ２Ｃ９の変異解析結果を示した図である。
【図４４】実施例１におけるＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるＣＹＰ２Ｃ９の変異解析結果を示した図である。
【図４５】参考例９におけるＡＴＴＯ ４８８の蛍光強度変化を示した図である。
【図４６】参考例９におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４の蛍光強度変化を示した図である。
【符号の説明】
【０１２３】
１…標的ヌクレオチド配列、１ａ…標的ヌクレオチド配列１の上流側標的ヌクレオチド配列、１ｂ…標的ヌクレオチド配列１の下流側標的ヌクレオチド配列、２…上流側プローブ、３…下流側プローブ、４ａ〜４ｄ…標的ヌクレオチド配列、５ａ〜５ｅ…プローブ、６…ＰＣＲ阻害物質、７…光応答性物質、８…標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、９…標的ヌクレオチド、１０…標的ヌクレオチド配列、１１ａ〜１１ｃ…プローブ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）と光応答性塩基による光連結反応とを組み合せた標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法、該検出方法に好適なプローブセット、及び該検出方法を用いた核酸の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞や微生物等の生物の遺伝子や、特定のヌクレオチド配列を有する核酸を検出し解析する技術の開発が盛んに行われている。例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等の遺伝子多型の解析等を行う場合には、解析対象である核酸サンプルは通常微量であるため、核酸サンプル中の核酸を増幅しつつ、ヌクレオチド配列を解析することが一般的である。
【０００３】
汎用されている核酸増幅方法として、ＰＣＲ法がある。ＰＣＲ法は、核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、解析の目的である標的ヌクレオチド配列を挟んだ２種類のプライマーを起点として、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡポリメラーゼ反応を繰り返すことにより、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を増幅する方法である。ＰＣＲ法は基本的に、（i）二本鎖核酸を一本鎖化する変性工程、（ii）鋳型となる一本鎖核酸とプライマーをハイブリダイズさせるアニーリング工程、及び（iii）ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマーを起点としてヌクレオチド鎖を伸長させる伸長工程の３つの工程を１サイクルとし、該サイクルを２５〜３０回繰り返すことにより特定の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を増幅していく方法である。
【０００４】
また、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出には、ＰＣＲ法の他にも、例えば、該標的ヌクレオチド配列を有する核酸と特異的にハイブリダイズすることができる人工合成したヌクレオチド鎖からなるプローブを用いて、ハイブリダイゼーションの有無により、核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するハイブリダイゼーション法が汎用されている。ハイブリダイゼーション法による標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法として、例えば、（１）エクサイプレックス蛍光又はエキシマー蛍光を用いたハイブリダイゼーションに基づく標的ヌクレオチド配列を有する核酸の識別法等がある（例えば、特許文献１参照）。該方法では、まず、標的ヌクレオチド配列部分と完全に相補的なヌクレオチド配列を有する２種類以上からなる非放射性のヌクレオチドプローブを用意する。各プローブの５’又は３’末端には、各プローブが該標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズした際に、プローブが隣接し、エキシマー等を形成できる適当な空間的配置をとれるよう発色基分子を標識する。これにより、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とプローブとが完全に相補的となり、ハイブリダイズした場合にのみエキシマー蛍光等が誘起され、極めて高い認識性を有することができる。該方法においては、各プローブに標識する分子は、極めて広い種類の分子から選択することができ、また、検出感度においてもバックグラウンドノイズを著しく減少させることが可能である。
【０００５】
その他、ＰＣＲによる核酸増幅とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法として、例えば、（２）ＰＣＲとＬＤＲ（ｌｉｇａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、リガーゼ検出法）とを組み合わせたＰＣＲ−ＬＤＲ法がある（例えば、特許文献１参照。）。該（２）方法は、ＰＣＲにより増幅した核酸を鋳型として、該鋳型に隣り合ってハイブリダイズする２種類のヌクレオチドプローブを、リガーゼを用いて連結し、連結反応の有無を検出することにより、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を識別し検出する方法である。
【特許文献１】特許第３９９２０７９号公報
【特許文献２】特表２０００−５１１０６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記（１）の方法は、プローブを用いて、解析対象である標的ヌクレオチド配列を直接解析する方法であり、ＳＮＰ等の、標的ヌクレオチド配列とそれ以外の非標的ヌクレオチド配列が１ヌクレオチド程度しか異ならない場合であっても、精度よく標的ヌクレオチド配列を検出することができる。しかしながら、ハイブリダイゼーション法のみによる方法では、標的ヌクレオチド配列の検出感度は必ずしも十分ではないという問題がある。また、標的ヌクレオチド配列の識別には、通常、ハイブリダイゼーション条件を厳密に制御するシステムが必要であり、高度な温度制御と巧みなプローブの配列設計が要求されるため、特に多種類の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を同時に高精度に識別検出することは極めて困難であった。
【０００７】
一方、上記（２）の方法は、ＰＣＲとＬＤＲを組み合わせており、標的ヌクレオチド配列の検出感度は良好であるが、ＰＣＲとＬＤＲを同一の反応系で実行した場合には、リガーゼにより連結されるべきプローブが、ＰＣＲのプライマーとして消費されてしまう結果、プローブ本来の機能を果たせなくなるばかりか、標的ヌクレオチド配列を有する核酸領域のＰＣＲによる増幅効率の減少にもつながる。また、プローブにＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害するように修飾を施した場合には、該修飾によりリガーゼの活性も阻害されてしまうため、好ましくない。このため、該方法により標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出を効率的に実行するためには、第一反応をＰＣＲ、第二反応をＬＤＲとする２段階反応とし、ＰＣＲ後には、ＬＤＲ反応においてＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制するために、ＰＣＲ後の反応溶液に対して、失活処理、希釈処理、又は反応溶液置換等を行った後に、第二反応であるＬＤＲを行うことが必要である。このように、２段階反応とすることにより、操作が煩雑になり、装置やシステムの簡素化にも限界が生じるという問題がある。
【０００８】
また、酵素は、溶液組成、濃度、温度の影響を受け易く、通常、ＰＣＲに用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとリガーゼでは、最適な反応条件が異なる。このため、ＰＣＲとＬＤＲを同一反応系にて実行させるためには、どちらかの酵素にとって不十分な反応条件にて実行させるか、もしくは両酵素にとって妥協的な条件にて反応を実行させることとなり、反応の効率や精度の向上においても限界があるという問題もある。
【０００９】
本発明は、ＰＣＲ法とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法であって、ＰＣＲ後にＤＮＡポリメラーゼ活性の抑制処理を要さず、簡便に、かつ感度及び精度良く標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出し得る方法、該方法に好適に用いられるプローブセット、及び該検出方法を用いた核酸の識別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＰＣＲ−ＬＤＲ法において、ＰＣＲにより増幅した核酸を鋳型として、該鋳型に隣り合ってハイブリダイズする２種類のプローブを連結させる方法として、ＬＤＲに代えて、光連結（Ｐｈｏｔｏｎ ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を用いることにより、ＰＣＲの反応系と同一の反応系においてプローブ同士を連結させることができること、及び、該プローブの３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド鎖の伸長を阻害するように修飾することにより、該プローブが、ＰＣＲのプライマーとして消費されることを効果的に抑制し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
（１）本発明は、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、（ａ）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより、１種又は２種以上の二本鎖核酸を増幅する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、（ｃ）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）により形成された複合体に光を照射する工程と、（ｆ）前記工程（ｅ）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ）前記工程（ｆ）の後に、前記工程（ｅ）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ）前記工程（ｇ）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、を有することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供する。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
（２）本発明は、前記工程（ａ）におけるＰＣＲが、多段階ＰＣＲであることを特徴とする、前記（１）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（３）本発明は、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（４）本発明は、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、６〜１００分子連結したものであることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（５）本発明は、前記光応答性物質は、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（６）本発明は、前記光応答性物質は、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル基、フェニルトリアゾールビニル基、メトキシフェニルトリアゾールビニル基、シアノフェニルトリアゾールビニル基、及びナフチルトリアゾールビニル基からなる群より選択される１以上を有することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（７）本発明は、前記工程（ｅ）において照射される光が、紫外光であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（８）本発明は、前記工程（ｅ）において照射される光が、３２０〜４００ｎｍの波長の光の照射であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（９）本発明は、前記上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１０）本発明は、前記上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１１）本発明は、前記工程（ｅ）において、前記複合体を形成するプローブのＴｍ値以下の温度において光を照射することを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１２）本発明は、前記工程（ｅ）において、前記複合体を形成するプローブのＴｍ値−５℃以上Ｔｍ値以下の温度において光を照射することを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１３）本発明は、前記上流側プローブの３’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１４）本発明は、前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１５）本発明は、前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１６）本発明は、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基が、ホスホロチオエート化されていることを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１７）本発明は、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブが、標識分子により標識されていることを特徴とする前記（１）〜（１６）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１８）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とが、異なる種類の発色基分子であり、前記工程（ｇ）における連結されたプローブの検出が、前記上流側プローブを標識する標識分子と前記下流側プローブを標識する標識分子のうち、いずれか一方をドナー分子とし、他方をアクセプター分子とする蛍光共鳴エネルギー転移による、蛍光の発光又は消光の検出であることを特徴とする前記（１７）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（１９）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子であり、
前記工程（ｇ）における連結されたプローブの検出が、前記発色基分子の消光の検出であることを特徴とする前記（１７）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２０）本発明は、前記ドナー分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）４８８又はＡＴＴＯ ４８８であり、前記アクセプター分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることを特徴とする前記（１８）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２１）本発明は、前記発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、前記発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることを特徴とする前記（２１）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２２）本発明は、前記標識分子が、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることを特徴とする前記（１７）〜（２１）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２３）本発明は、前記上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、前記下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることを特徴とする前記（１７）〜（２１）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２４）本発明は、前記ＰＣＲに用いられるプライマーが、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする前記（１）〜（２３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２５）本発明は、前記ＰＣＲに用いられるプライマーが、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、１０〜１００分子連結したものであることを特徴とする前記（１）〜（２３）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２６）本発明は、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に熱エネルギーを加えることにより行うことを特徴とする前記（１）〜（２５）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２７）本発明は、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸を８０〜１０５℃に加熱することにより行うことを特徴とする前記（１）〜（２５）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２８）本発明は、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド、及び尿素からなる群より選択される１以上の化学物質を添加することにより行うことを特徴とする前記（１）〜（２５）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（２９）本発明は、前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に、標的ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を添加することにより行うことを特徴とする前記（１）〜（２５）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（３０）本発明は、前記工程（ｆ）において、前記複合体を３７〜１０５℃に加熱することにより、一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させることを特徴とする前記（１）〜（２９）のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（３１）本発明は、１又は２以上の、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するためのプローブのセットであって、標的ヌクレオチド配列の種類ごとに下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを有することを特徴とするプローブセットを提供するものである。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
（３２）本発明は、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする前記（３１）記載のプローブセットを提供するものである。
（３３）本発明は、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、６〜１００分子連結したものであることを特徴とする前記（３１）記載のプローブセットを提供するものである。
（３４）本発明は、前記光応答性物質は、光反応官能基として、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有することを特徴とする前記（３１）〜（３３）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３５）本発明は、前記光応答性物質は、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル基、フェニルトリアゾールビニル基、メトキシフェニルトリアゾールビニル基、シアノフェニルトリアゾールビニル基、及びナフチルトリアゾールビニル基からなる群より選択される１以上を有することを特徴とする前記（３１）〜（３３）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３６）本発明は、前記上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることを特徴とする前記（３１）〜（３５）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３７）本発明は、前記上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする前記（３１）〜（３５）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３８）本発明は、前記上流側プローブの３’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることを特徴とする前記（３１）〜（３７）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（３９）本発明は、前記上流側プローブの５’末端又は前記下流側プローブの５’末端が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることを特徴とする前記（３１）〜（３８）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４０）本発明は、前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする前記（３１）〜（３８）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４１）本発明は、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基が、ホスホロチオエート化されていることを特徴とする前記（３１）〜（３８）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４２）本発明は、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブが、標識分子により標識されていることを特徴とする前記（３１）〜（４１）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４３）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とが、異なる種類の発色基分子であることを特徴とする前記（４２）記載のプローブセットを提供するものである。
（４４）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子であることを特徴とする前記（４２）記載のプローブセットを提供するものである。
（４５）本発明は、前記上流側プローブを標識する標識分子と前記下流側プローブを標識する標識分子のいずれか一方がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）４８８又はＡＴＴＯ ４８８であり、他方がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることを特徴とする前記（４３）記載のプローブセットを提供するものである。
（４６）本発明は、前記発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、前記発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることを特徴とする前記（４４）記載のプローブセットを提供するものである。
（４７）本発明は、前記標識分子が、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることを特徴とする前記（４２）〜（４６）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４８）本発明は、前記上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、前記下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることを特徴とする前記（４２）〜（４６）のいずれか記載のプローブセットを提供するものである。
（４９）本発明は、標的ヌクレオチド配列に、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失からなるミスマッチ部位を有する非標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とを識別する方法であって、（ａ”）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、二本鎖核酸を増幅する工程と、（ｂ”）前記工程（ａ”）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、（ｃ”）下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ”）前記工程（ｂ”）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ”）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（ｅ”）前記工程（ｄ”）により形成された複合体に光を照射する工程と、（ｆ”）前記工程（ｅ”）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ”）前記工程（ｆ”）の後に、前記工程（ｅ”）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ”）前記工程（ｇ”）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記非標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていると判断する工程と、を有することを特徴とする、核酸の識別方法を提供するものである。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
（５０）本発明は、前記ミスマッチ部位が、前記上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から１０分子以内又は前記下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から１０分子以内にあることを特徴とする前記（４９）記載の核酸の識別方法を提供するものである。
（５１）本発明は、前記ミスマッチ部位は、１又は２箇所以上の、１のヌクレオチド又は２以上の連続したヌクレオチドが、置換、挿入、又は欠失していることを特徴とする前記（４９）又は（５０）記載の核酸の識別方法を提供するものである。
（５２）本発明は、前記標的ヌクレオチド配列が遺伝子多型のうちの一多型に相同的なヌクレオチド配列であり、前記非標的ヌクレオチド配列が前記遺伝子多型の他の一多型に相同的なヌクレオチド配列であり、前記ミスマッチ部位が前記遺伝子多型の多型部位であり、前記工程（ｈ”）が、（ｈ”２）前記工程（ｇ”）において検出された連結されたプローブ量に基づき、前記核酸サンプル中の核酸が、前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、及び前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルと前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのヘテロ接合体のいずれであるかを識別する工程、であることを特徴とする前記（４９）〜（５１）のいずれか記載の核酸の識別方法を提供するものである。
（５３）本発明は、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、（ａ’）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、非対称ＰＣＲ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより、１種又は２種以上の一本鎖核酸を増幅する工程と、（ｃ’）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ’）前記工程（ａ’）において得られた一本鎖核酸、前記上流側プローブ、及び前記下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（ｅ’）前記工程（ｄ’）により形成された複合体に光を照射する工程と、（ｆ’）前記工程（ｅ’）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ’）前記工程（ｆ’）の後に、前記工程（ｅ’）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ’）前記工程（ｇ’）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、を有することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（５４）本発明は、前記工程（ａ’）が、（ａ’１）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１段階又は多段階のＰＣＲを行い、核酸を増幅する工程と、（ａ’２）前記工程（ａ’１）において増幅された核酸を鋳型とし、非対称ＰＣＲを行うことにより、、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上の核酸を増幅する工程と、を有する工程であることを特徴とする前記（５３）記載の核酸の検出方法を提供するものである。
（５５）本発明は、前記工程（ａ’）が、（ａ’３）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、ＰＣＲと非対称ＰＣＲを同時に行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上の核酸を増幅する工程、であることを特徴とする前記（５３）記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（５６）本発明は、前記工程（ａ’）が、（ａ’４）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得る３種類のプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上のループ状構造を有する核酸を増幅する工程
であり、前記３種類のプライマーが、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の５’側末端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の３’側末端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーと、３’末端側に前記フォワードプライマーよりも３’側であって、標的ヌクレオチド配列よりも５’側にある領域と相同的なヌクレオチド配列を有するループ形成用プライマーとであり、前記ループ形成用プライマーの５’末端には、当該プライマーを起点としてＰＣＲにより伸長されるヌクレオチド配列領域のうち、標的ヌクレオチド配列よりも３’末端側であり、かつ前記リバースプライマーと相補的なヌクレオチド配列よりも５’末端側にあるヌクレオチド配列領域と、ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が付加されていることを特徴とする前記（５４）記載の核酸の検出方法を提供するものである。
（５７）本発明は、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、（１）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（２）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを準備する工程と、（３）前記核酸サンプル、前記工程（１）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブ、前記工程（２）において準備したプライマー、並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有する反応溶液を調製する工程と、（４）前記工程（３）において調製した反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、（５）前記工程（４）において得られた一本鎖核酸を鋳型として、前記プライマー用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程と、（６）前記工程（５）の後、反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、（７）前記工程（６）において得られた一本鎖核酸に対して、反応溶液中の上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（８）前記工程（７）により形成された複合体に光を照射する工程と、（９）前記工程（８）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（１０）前記工程（９）の後に、前記工程（８）において連結されたプローブを検出する工程と、（１１）前記工程（１０）の後、前記工程（４）〜（１０）を繰り返す工程と、を有し、前記工程（１０）及び（１１）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法を提供するものである。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法及び核酸の識別方法は、ＰＣＲ法とハイブリダイゼーション法を組み合わせた方法であるため、より高精度かつ高感度に標的ヌクレオチド配列を識別し検出することができる。また、ＬＤＲに代えて、光連結反応を用いていることにより、従来のＰＣＲ−ＬＤＲ法とは異なり、一つの反応系でＰＣＲとプローブ連結反応を同時に進行させることも可能となり、ヌクレオチド配列の識別や検出の精度のみならず、反応効率の向上にも資する。さらに、反応系を簡素化することが可能となるため、本発明を実施するシステムや装置において、装置の小型化、装備の単純化、しいては製品のコストダウン等の多種のメリットを生みだすことができる。さらに、反応の開始・停止は光照射の有無で制御できるため、任意のタイミングで連結反応を誘導することができ、反応条件をより厳密に制御することが可能となる。
また、本発明のプローブセットを用いることにより、従来法よりも簡便かつ高精度に、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を識別し検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、核酸とは、ＤＮＡ又はＲＮＡであれば特に限定されるものではなく、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００１４】
本発明において核酸サンプルとは、核酸を含有するサンプルであれば、特に限定されるものではないが、動物、植物、微生物、培養細胞等から核酸を抽出したサンプルであることが好ましい。なお、動物等からの核酸の抽出は、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法により行うことができる。
【００１５】
本発明において標的ヌクレオチド配列は、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法等により検出が可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法や核酸の識別方法においては、標的ヌクレオチド配列として、遺伝子上に存在する特定の領域のヌクレオチド配列であることが好ましく、遺伝子多型を含む領域のヌクレオチド配列であることがより好ましい。本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法や核酸の識別方法は、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の識別・検出能が高く、相同性の高いヌクレオチド配列同士を高精度に識別し得るためである。
【００１６】
ここで、遺伝子多型とは、ある生物種の集団内において、個体ごとに遺伝子のヌクレオチド配列が異なるものを意味する。遺伝子多型としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト多型等がある。本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法や核酸の識別方法において、標的ヌクレオチド配列が含む遺伝子多型として、ＳＮＰであることが好ましい。
【００１７】
その他、本発明における標的ヌクレオチド配列としては、遺伝子多型のように先天的な多型のみならず、後天的な遺伝子変異等を含む領域のヌクレオチド配列であってもよい。後天的な遺伝子変異として、紫外線等の物理的刺激や発がん性物質等による化学的刺激により誘発される体細胞変異等が挙げられる。後述するように、本発明においては、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出を、連結されたプローブ量を測定することにより検出するため、定量的な解析が可能となり得るため、体細胞変異等を定量的に解析する場合にも用いることができる。
【００１８】
本発明においてヌクレオチドアナログとは、非天然のヌクレオチドであり、天然のヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）やリボヌクレオチド（ＲＮＡ）と同様の機能を有するものをいう。すなわち、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合により鎖を形成することができ、かつ、ヌクレオチドアナログを用いて形成されたプライマーやプローブは、ヌクレオチドのみを用いて形成されたプライマーやプローブと同様に、ＰＣＲやハイブリダイゼーションに用いることができる。このようなヌクレオチドアナログとして、例えば、ＰＮＡ（ポリアミドヌクレオチド誘導体）、ＬＮＡ（ＢＮＡ）、ＥＮＡ（２‘−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、及びこれらの複合体等がある。ここで、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡのリン酸と５炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。また、ＬＮＡ（ＢＮＡ）は、リボヌクレオシドの２’部位の酸素原子と４’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している２つの環状構造を持つ化合物である。
【００１９】
本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法（以下、本発明の検出方法ということがある。）は、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、（ａ）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、１種又は２種以上の二本鎖核酸を増幅する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、（ｃ）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、（ｅ）前記工程（ｄ）により形成された複合体に光を照射する工程と、（ｆ）前記工程（ｅ）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ）前記工程（ｆ）の後に、前記工程（ｅ）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ）前記工程（ｇ）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、を有することを特徴とする。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【００２０】
本発明の検出方法は、主に、工程（ａ）〜（ｂ）のＰＣＲによる増幅段階と、工程（ｃ）〜（ｈ）の光連結反応を用いたハイブリダイゼーションによる検出段階の２段階に分けられる。以下、工程ごとに説明する。
【００２１】
まず、工程（ａ）において、核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、１種又は２種以上の二本鎖核酸を増幅する。核酸サンプルに含まれている全核酸のうち、標的ヌクレオチド配列を含むことが期待される領域のみを増幅することにより、核酸サンプルとして、標的ヌクレオチドを有する核酸が微量にしか存在していない遺伝子サンプル等を用いた場合であっても、高感度に標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出することができる。ここで、鋳型とする核酸サンプル中の核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもあってよく、一本鎖でもあっても二本鎖であってもよい。なお、核酸サンプル中の核酸がＲＮＡである場合には、逆転写反応により得られたｃＤＮＡを鋳型とすることができる。
【００２２】
工程（ａ）において用いられるプライマーは、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列（増幅用ヌクレオチド配列）をＰＣＲにより増幅し得るプライマーであり、増幅用ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーである。例えば、増幅用ヌクレオチド配列の上流端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、増幅用ヌクレオチド配列の下流端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーとからなる２種類のプライマーであってもよい。なお、ＰＣＲにおいて用いられる該２種類のプライマーの各濃度は、ＰＣＲ産物として二本鎖核酸を得ることができる濃度比であれば特に限定されるものではないが、等濃度で用いることが好ましい。
【００２３】
増幅用ヌクレオチド配列、すなわち、ＰＣＲにより増幅される領域は、少なくとも１の標的ヌクレオチド配列を含む領域であればよく、２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域を一のＰＣＲにより増幅してもよい。つまり、ＰＣＲにより得られる二本鎖核酸は、１の標的ヌクレオチド配列を含む核酸であってもよく、２以上の標的ヌクレオチド配列を含む核酸であってもよい。
【００２４】
また、工程（ａ）においてＰＣＲにより得られる二本鎖核酸は、１種類であってもよく、複数種類であってもよい。ここで、ＰＣＲにより得られる二本鎖核酸が複数種類であるとは、ＰＣＲにより増幅される領域が、核酸サンプル中の核酸の１の領域ではなく、２以上の領域であることを意味する。例えば、工程（ａ）におけるＰＣＲをマルチプレックスＰＣＲとすることにより、複数種類の二本鎖核酸（ＰＣＲ産物）を得ることができる。また、二本鎖核酸の種類ごとに別個独立にＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を混合してもよい。
【００２５】
このように、２以上の標的ヌクレオチド配列を含むと期待し得る核酸領域をまとめて増幅することにより、２以上の標的ヌクレオチド配列の検出、すなわち多重解析における作業工程を減少させることができる。
【００２６】
工程（ａ）におけるＰＣＲは、多段階ＰＣＲであってもよい。ここで、多段階ＰＣＲとは、前段階目のＰＣＲ後のＰＣＲ溶液に、前段階目のＰＣＲとは異なるプライマーを添加して、後段階目のＰＣＲを行うことを意味する。後段階目のＰＣＲは、前段階目のＰＣＲ産物を鋳型として用いるものであってもよく、核酸サンプル中に元々含まれていた核酸を鋳型として用いるものであってもよい。工程（ａ）におけるＰＣＲ増幅を複数回繰り返すことにより、後のハイブリダイゼーションによる検出段階において、より高い検出シグナルを得ることができる。
【００２７】
次に、工程（ｂ）として、工程（ａ）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る。一本鎖化することにより、工程（ａ）において増幅した標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を有する核酸を、後の工程のハイブリダイゼーションにおける鋳型として用いることができるようになる。
【００２８】
工程（ｂ）において、二本鎖核酸を一本鎖化する方法は、特に限定されるものではなく、公知の手法で行うことができる。例えば、二本鎖核酸に熱エネルギーを加えることや、塩基同士の水素結合を弱めるような化学物質を添加すること等により、二本鎖核酸を一本鎖化することができる。具体的には、例えば、ＰＣＲ後のＰＣＲ溶液を、８０〜１０５℃に加熱することや、該ＰＣＲ溶液に、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド、及び尿素等を添加することにより、ＰＣＲ溶液中の二本鎖核酸を一本鎖化することができる。その他、該ＰＣＲ溶液に、一本鎖化させたい領域のヌクレオチ配列、すなわち標的ヌクレオチド配列と相同的な配列を有する一本鎖核酸を添加することによっても、一本鎖化することができる。
【００２９】
二本鎖核酸を一本鎖化するために添加される一本鎖核酸は、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログがリン酸ジエステル結合することにより形成されたものであることが好ましい。特に、ヌクレオチドアナログとして、ＬＮＡ（ＢＮＡ）、ＥＮＡ、ＰＮＡ等のＴｍ値が比較的高いヌクレオチドアナログを構成分子として形成された一本鎖核酸であることが好ましい。
【００３０】
本発明の検出方法においては、工程（ｂ）における一本鎖化は、熱エネルギーを加える方法であることが好ましく、ＰＣＲ後のＰＣＲ溶液を、８０〜１０５℃に加熱することがより好ましく、９５〜１００℃に加熱することがさらに好ましく、９５℃に加熱することが特に好ましい。ＰＣＲ溶液の組成を変更する必要がないため、後の工程に対する影響を抑えることができるためである。
【００３１】
工程（ａ）におけるＰＣＲを、非対称ＰＣＲとすることにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を増幅させることができる。具体的には、核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、非対称ＰＣＲを行うことにより、１種又は２種以上の一本鎖核酸を増幅する。このようにして得られた一本鎖核酸は、一本鎖化することなく、後の工程のハイブリダイゼーションにおける鋳型として用いることができる。
【００３２】
本発明において、非対称ＰＣＲとは、前記二本鎖核酸を得る場合とは異なり、ＰＣＲに用いられる増幅用ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーのうち、１種類のプライマーのみを用いて行うＰＣＲや、１種類のプライマーを他方のプライマーよりも高濃度に用いて行うＰＣＲを意味する。鋳型である二本鎖核酸を構成する二本の鎖が非対称的に増幅される結果、より高濃度に添加したプライマーを起点として伸長される鎖が、一本鎖核酸の状態で得ることができる。ここで、１種類のプライマーのみを用いてＰＣＲを行った場合には、一本鎖核酸は増幅されるものの、指数関数的な増幅は行われないが、プライマーの量比を変えてＰＣＲを行った場合には、通常のＰＣＲのように二本鎖核酸が指数関数的に増幅しつつ、一本鎖核酸も増幅される。
【００３３】
その他、一部分に一本鎖のループ構造を有するＰＣＲ産物を得る方法を用いることにより、標的ヌクレオチド配列領域を一本鎖核酸として得ることができる（例えば、特開２００５−１０２５０２号公報参照。）。具体的には、３種類のプライマー、すなわち、通常のＰＣＲに用いられる前述のフォワードプライマーとリバースプライマーの２種類のプライマーに加えて、５’末端には、当該プライマーを起点としてＰＣＲにより伸長されるヌクレオチド配列領域のうち、標的ヌクレオチド配列よりも３’末端側であり、かつ前記リバースプライマーと相補的なヌクレオチド配列よりも５’末端側にあるヌクレオチド配列領域と、ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が付加されており、３’末端側に前記フォワードプライマーよりも３’側であって、標的ヌクレオチド配列よりも５’側にある領域と相同的なヌクレオチド配列を有するループ形成用プライマーとを用いてＰＣＲを行うことにより、一本鎖のループ構造部分に標的ヌクレオチド配列領域を有するＰＣＲ産物を得ることができる。該方法により得られたＰＣＲ産物も、非対称ＰＣＲ産物と同様に、一本鎖化することなく、後の工程のハイブリダイゼーションにおける鋳型として用いることができる。
【００３４】
なお、ＰＣＲ産物として二本鎖核酸を得るＰＣＲと、一本鎖核酸を得るＰＣＲとを組み合わせて行ってもよい。例えば、１段階のＰＣＲ又は多段階ＰＣＲを行った後に、非対称ＰＣＲを行ってもよい。
【００３５】
また、工程（ａ）におけるＰＣＲは、ＰＣＲと非対称ＰＣＲを同時に行うものであってもよい。例えば、第一段階目のＰＣＲを通常のＰＣＲとし、第二段階目のＰＣＲを非対称ＰＣＲとして、第二段階目の非対称ＰＣＲにより目的の増幅ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を増幅させるＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行う場合に、第一段階目のＰＣＲを行うためのプライマーと、第二段階目の非対称ＰＣＲを行うためのプライマーとを、予め反応溶液中に入れておくことにより、第一段階目のＰＣＲと第二段階目の非対称ＰＣＲを同時に行うことができる。
なお、ＰＣＲや非対称ＰＣＲを同時に行うとは、同一の反応溶液中で、同一の反応サイクル（変性工程、アニール工程、伸長工程）で反応を行うことを意味する。
【００３６】
ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは、標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の配列情報、ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼの種類等を考慮して、常法により設計し合成することができる。
【００３７】
本発明においては、ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーのＴｍ値が、上流側プローブや下流側プローブのＴｍ値よりも高くなるように設計することが好ましい。プローブのＴｍ値よりもプライマーのＴｍ値を高くすることにより、プローブの存在下でプライマーを用いてＰＣＲを行う場合にも、ＰＣＲに対するプローブの影響を抑えることができる。
【００３８】
ＰＣＲに用いられるこれらのプライマーは、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものである。プライマーの長さは、プライマーのＴｍ値、増幅ヌクレオチド配列の種類等を考慮して適宜決定することができるが、１０〜１００分子連結したものであることが好ましい。
【００３９】
本発明の検出方法においては、ＰＣＲは、通常用いられる試薬を通常用いられる量で用いて、通常使用されるプロトコールに基づき、常法により行うことができる。なお、ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼは、通常ＰＣＲにおいて用いられるＤＮＡポリメラーゼであれば特に限定されるものではないが、耐熱性ポリメラーゼであることが好ましい。ＰＣＲの変性工程では、通常９０℃以上の高温処理が行われるためである。
【００４０】
また、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いることもできる。通常のＰＣＲと同様に、ＰＣＲの精度を向上させることができるためである。但し、上流側プローブや下流側プローブの５’末端が、後述するように５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていない場合等、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により上流側プローブ等が損なわれるおそれがある場合には、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。
【００４１】
その他、例えば、標的ヌクレオチド配列中に、遺伝子多型部位等の特に高精度に識別して検出したい標的ヌクレオチドが存在する場合であって、上流側プローブや下流側プローブ中の該標的ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチドが、各プローブの３’末端領域に存在する場合には、該プローブの３’末端を後述するように３’→５’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾しておくことが好ましく、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていない場合には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、各プローブ中の該標的ヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチドが、削られてしまうおそれがあるためである。
【００４２】
また、本発明の検出方法においては、工程（ｃ）として、標的ヌクレオチド配列ごとに、上記の３要件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する。なお、工程（ｃ）は、工程（ｄ）の前であればいつ行ってもよく、工程（ａ）及び（ｂ）とは独立して行うことができる。例えば、工程（ａ）の前に予め工程（ｃ）を行ってもよい。
【００４３】
上流側プローブ及び下流側プローブは、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものである。ここで、修飾体としては、例えば、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、修飾ＰＮＡ、修飾ＬＮＡ（ＢＮＡ）、修飾ＥＮＡ等がある。ここで、ヌクレオチドやヌクレオチドアナログの修飾に用いられる物質は、本発明の効果を損なわない限り、特に限定されるものではなく、ヌクレオチド等の修飾に通常用いられる物質を用いることができる。修飾ヌクレオチドや修飾ヌクレオチドアナログとして、例えば、アミノ基、カルボキシビニル基、リン酸基、メチル基等の官能基により修飾されたヌクレオチド等、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等、ホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等、蛍光物質等の後述する標識分子により修飾されたヌクレオチド等がある。
【００４４】
上流側プローブ及び下流側プローブの長さは、特に限定されるものではなく、標的ヌクレオチド配列の長さや種類、Ｔｍ値等を考慮して適宜決定することができる。本発明における上流側プローブ又は下流側プローブとしては、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体（以下、ヌクレオチド等ということがある。）が、６〜１００分子連結したものであることが好ましい。特に、プローブのＴｍ値が、核酸増幅工段階であるＰＣＲにおいて用いられるプライマーのＴｍ値よりも低くなるように、長さを調整することが好ましい。
【００４５】
標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割した場合に、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであることを要する（要件（Ｉ））。なお、本発明においては、上流とは、ヌクレオチド配列やプローブ、プライマー等の５’側を意味し、下流とは、３’側を意味する。
【００４６】
図１は、標的ヌクレオチド配列１、上流側プローブ２、及び下流側プローブ３の関係を模式的に示した図である。上流側プローブ２は、標的ヌクレオチド配列１の上流側標的ヌクレオチド配列１ａにハイブリダイズし得るプローブであり、下流側プローブ３は、下流側標的ヌクレオチド配列１ｂにハイブリダイズし得るプローブである。つまり、標的ヌクレオチド配列１を有する核酸を鋳型とし、各プローブがハイブリダイズした場合には、上流側プローブ２の５’末端と、下流側プローブ３の３’末端が隣接することになる。
【００４７】
また、前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されているプローブであることを要する（要件（ＩＩ））。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応は、ヌクレオチドの５’側から３’側へと進行するため、各プローブの３’末端をＰＣＲ阻害物質により修飾することにより、ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在する場合であっても、各プローブはプライマーとして消費され難い。このため、ＤＮＡポリメラーゼの失活処理をすることなく、ＰＣＲ溶液をそのまま工程（ｄ）以降の処理に用いることができる。
【００４８】
ここで、各プローブにおいて、３’末端とは、各プローブの３’末端を構成するヌクレオチド等を、５’末端とは、各プローブの５’末端を構成するヌクレオチド等を、それぞれ意味する。
【００４９】
各プローブの３’末端を修飾するＰＣＲ阻害物質は、該物質により修飾された３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼ活性による伸長反応の起点となることができない物質であれば、特に限定されるものではなく、ＤＮＡポリメラーゼ活性阻害作用を有する公知の物質を適宜用いることができる。本発明においては、特に、上流側プローブの３’末端や下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることが好ましい。
【００５０】
さらに、前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていることを要する（要件（ＩＩＩ））。図１に示すように、ハイブリダイズした場合には、上流側プローブと下流側プローブは、上流側プローブの５’末端と下流側プローブの３’末端において隣接するため、少なくともいずれか一方のプローブ末端が光応答性物質により修飾されていることにより、光連結反応により両プローブを連結させることができる。なお、上流側プローブの５’末端と下流側プローブの３’末端の両末端が光応答性物質により修飾されていてもよい。なお、本発明においては、下流側プローブの３’末端ではなく、上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることが好ましい。
【００５１】
本発明において、光応答性物質とは、光エネルギーにより分子構造が変化し、隣接する分子を互いに連結し得る光反応官能基を有する物質を意味する。上流側プローブの５’末端や下流側プローブの３’末端を修飾する光応答性物質は、このような光反応官能基を有する物質であれば、特に限定されるものではないが、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有する物質であることが好ましい。例えば、光照射により、光応答性物質に存在する共役二重結合部位が開裂することにより、隣接する分子、具体的には隣接するプローブの末端の共役二重結合部位の開裂を促される。これらの開裂された共役二重結部位同士により環状結合が形成される結果、隣接するプローブ同士が連結される。
【００５２】
本発明における上流側プローブの５’末端や下流側プローブの３’末端を修飾する光応答性物質としては、紫外光、好ましくは３２０〜４００ｎｍ、より好ましくは３６５ｎｍ付近の光に応答し得る物質であることが好ましい。このような波長の光の照射によって開裂する共役二重結合部位を有する物質としては、例えば、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル（ＢＴＶ）基、フェニルトリアゾールビニル（ＰＴＶ）基、メトキシフェニルトリアゾールビニル（ＭＰＴＶ）基、シアノフェニルトリアゾールビニル（ＣＰＴＶ）基、及びナフチルトリアゾールビニル（ＮＰＴＶ基）等を有する物質等がある。特に、上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド等であることが好ましい。具体的には、カルボキシビニルデオキシアデノシン、カルボキシビニルデオキシシチジン、カルボキシビニルデオキシグアノシン、カルボキシビニルデオキシウリジン等がある。
【００５３】
上流側プローブの５’末端や下流側プローブの５’末端は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることが好ましい。各プローブの５’末端が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることにより、工程（ａ）におけるＰＣＲにおいて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いた場合であっても、工程（ｄ）以降の工程における該活性の影響を効果的に抑制することができる。各プローブの５’末端のヌクレオチド等と５’末端から２番目のヌクレオチド等との間に位置するリン酸が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることがより好ましい。
【００５４】
このような５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質による修飾として、本発明においては、特に、上流側プローブの５’末端や下流側プローブの５’末端がメチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等や、ホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等であることが好ましい。ここで、プローブの５’末端が２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等であるとは、各プローブの５’末端のヌクレオチド等の炭糖の２位がメチル化（２−Ｏ−メチル化）されていることを意味する。また、プローブの５’末端がホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等であるとは、各プローブの５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド等を連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基がホスホロチオエート化されていることを意味する。
【００５５】
その他、上流側プローブの３’末端や下流側プローブの３’末端は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていてもよい。本発明において、各プローブの３’末端の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されたヌクレオチドとしては、２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等や、ホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。ここで、プローブの３’末端が２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド等であるとは、各プローブの３’末端のヌクレオチド等の炭糖の２位がメチル化（２−Ｏ−メチル化）されていることを意味する。また、プローブの３’末端がホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等であるとは、各プローブの３’末端と３’末端から２番目のヌクレオチド等を連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基がホスホロチオエート化されていることを意味する。
【００５６】
標的ヌクレオチド配列が２以上ある場合には、標的ヌクレオチド配列ごとに上流側プローブと下流側プローブを準備する。ここで、標的ヌクレオチド配列は、互いに別個独立のものであってもよく、互いに重複するものであってもよい。また、遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖の一方にのみ複数の標的ヌクレオチド配列を有していてもよく、センス鎖とアンチセンス鎖の両方に標的ヌクレオチド配列を有するものであってもよい。
【００５７】
２以上の標的ヌクレオチド配列が互いに重複する場合には、例えば、図２に示すように、１のプローブが、ある標的ヌクレオチド配列に対する上流側プローブであると同時に、別の標的ヌクレオチド配列に対する下流側プローブであってもよい。図２においては、プローブ５ａは、標的ヌクレオチド配列４ａに対する下流側プローブであり、プローブ５ｂは、標的ヌクレオチド配列４ａに対する上流側プローブであると同時に、標的ヌクレオチド配列４ｂに対する下流側プローブである。プローブ５ｃは、標的ヌクレオチド配列４ｂに対する上流側プローブであると同時に、標的ヌクレオチド配列４ｃに対する下流側プローブである。プローブ５ｄは、標的ヌクレオチド配列４ｃに対する上流側プローブであると同時に、標的ヌクレオチド配列４ｄに対する下流側プローブである。プローブ５ｅは、標的ヌクレオチド配列４ｄに対する上流側プローブである。各プローブの３’末端をＰＣＲ阻害物質６により修飾し、各上流側プローブ（プローブ５ｂ〜５ｅ）の５’末端を光応答性物質７により修飾することにより、上記要件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足することができる。
【００５８】
ヌクレオチド配列は、基本的に、ＡＴＧＣの４種のヌクレオチドの組み合わせからなるものにすぎないため、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するためには、該標的ヌクレオチド配列を、該標的ヌクレオチド配列と相同性が高い該標的ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列から高精度に識別して検出する必要がある。一般的には、標的ヌクレオチド配列が有しており、かつ該標的ヌクレオチド配列と相同性が高い他のヌクレオチド配列にはない特徴的な１又は２以上のヌクレオチド（以下、標的ヌクレオチドということがある。）を指標として、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を他のヌクレオチド配列を有する核酸から識別して検出することができる。
【００５９】
ここで、標的ヌクレオチドを含む領域のヌクレオチド配列情報が公知である場合には、標的ヌクレオチド配列は、任意に設定することができる。例えば、図３のように、遺伝子のある領域に、２つの標的ヌクレオチド９が存在していた場合に、図３（ａ）のように、２つの標的ヌクレオチドが含まれる比較的長い領域を標的ヌクレオチド配列１０Ａ＋Ｂとしてもよく、図３（ｂ）のように、標的ヌクレオチドごとに別個独立した標的ヌクレオチド配列１０Ａと標的ヌクレオチド配列１０Ｂとしてもよく、図３（ｃ）のように、２つの標的ヌクレオチド配列が互いに重複するように設定してもよい。どのように標的ヌクレオチド配列を設定するかは、標的ヌクレオチド配列に依存して決定される上流側プローブや下流側プローブのＴｍ値や、標的ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチドが各プローブ中のどこに配置されることになるか等を考慮して、適宜決定することができる。なお、標的ヌクレオチド９にハイブリダイズするヌクレオチドが、後述する塩基識別可能領域内となるように各プローブを設計することが好ましく、このように各プローブの設計を可能とするように標的ヌクレオチド配列を設定することが好ましい。
【００６０】
例えば、図３（ｃ）のように２の標的ヌクレオチド配列１０３’ と１０５’を決定した場合には、図４に示すように、標的ヌクレオチド配列１０３’の下流側プローブであるプローブ１１ａ、標的ヌクレオチド配列１０３’の上流側プローブでありかつ標的ヌクレオチド配列１０５’の下流側プローブであるプローブ１１ｂ、標的ヌクレオチド配列１０５’の上流側プローブであるプローブ１１ｃを設計することができる。この場合、プローブ１１ａとプローブ１１ｂとプローブ１１ｃの３つのプローブの連結体が検出された場合には、核酸サンプル中に、標的ヌクレオチド配列１０３’と標的ヌクレオチド配列１０５’の両方を有する核酸が存在することが分かる。一方、いずれのプローブ連結体も検出されない場合には、核酸サンプル中に、標的ヌクレオチド配列１０３’を有する核酸と標的ヌクレオチド配列１０５’を有する核酸のいずれも存在していないことが分かる。その他、例えば、プローブ１１ａとプローブ１１ｂのプローブ連結体と、プローブ１１ｂとプローブ１１ｃのプローブ連結体は検出されたものの、プローブ１１ａとプローブ１１ｂとプローブ１１ｃの３つのプローブの連結体が検出されなかった場合には、核酸サンプル中の核酸においては、標的ヌクレオチド配列１０３’と標的ヌクレオチド配列１０５’が重複していないことが分かる。つまり、本発明の検出方法を応用することにより、染色体転座等の遺伝子変異の有無を検出し得ることが期待できる。
【００６１】
次に、工程（ｄ）として、工程（ｂ）において得られた一本鎖核酸、又は非対象ＰＣＲ等により得られた一本鎖核酸に対して、工程（ｃ）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体（以下、一本鎖核酸−プローブ複合体ということがある。）を形成する。具体的には、一本鎖化処理後又はＰＣＲ後の反応溶液に、上流側プローブ及び下流側プローブを添加し、混合することにより、該反応溶液中の一本鎖核酸の標的ヌクレオチド配列領域に、各プローブをハイブリダイズさせ、一本鎖核酸−プローブ複合体を形成することができる。既に述べたように、各プローブはＤＮＡポリメラーゼ活性の影響を受けないよう修飾されているため、一本鎖化処理後又はＰＣＲ後の反応溶液は、失活処理等を行うことなく用いることができる。
【００６２】
本発明の検出方法においては、工程（ｄ）は、一本鎖化処理後又はＰＣＲ後の反応溶液に、上流側プローブ及び下流側プローブを添加してもよく、ＰＣＲ前の反応溶液に予め上流側プローブ及び下流側プローブを添加しておいてもよい。ＰＣＲ前の反応溶液に予め上流側プローブ及び下流側プローブを添加しておくことにより、一本鎖化処理後又はＰＣＲ後に速やかに一本鎖核酸−プローブ複合体を形成することができ、また、操作工程を少なくすることができる。
【００６３】
さらに、工程（ｅ）として、工程（ｄ）により形成された一本鎖核酸−プローブ複合体に光を照射した後、工程（ｆ）として、該一本鎖核酸−プローブ複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる。一本鎖核酸が標的ヌクレオチド配列を有する場合には、該標的ヌクレオチド配列に対応する上流側プローブと下流側プローブが互いに隣接してハイブリダイズして一本鎖核酸−プローブ複合体が形成されている。このため、光を照射することにより、光連結反応が誘導される結果、隣接するプローブ同士が連結される。
【００６４】
工程（ｅ）において照射される光の波長は、各プローブに修飾されている光応答性物質の種類に応じて適宜決定することができる。より十分な光エネルギーを与えることができるため、照射される光は、紫外光であることが好ましく、３２０〜４００ｎｍの波長の光であることがより好ましく、３６５ｎｍ付近の波長の光であることがさらに好ましい。
【００６５】
光連結反応の反応効率は、連結反応に必要とされる波長域の光の照度と照射時間との積に相関する。このため、工程（ｅ）において照射される光の照度や照射時間を調整することにより、光連結反応効率を良好に維持することができる。また、光によって誘導される反応であるため、光を照射するタイミングを調整することにより、連結反応を任意のタイミングで実施することができる。さらに、光連結反応は、従来の酵素を用いた連結法に比べ、温度による影響を受け難い。このため、例えば０〜８０℃といった幅広い温度域で反応を行うことができる。また、反応溶液が所望の反応温度に達した時点で、単に光を照射することにより光連結反応を行うことができるため、従来の酵素法に比べて非常に厳密な反応温度制御も可能である。
【００６６】
特に、工程（ｅ）においては、光を照射する温度を適宜調整することにより、上流側プローブや下流側プローブの、標的ヌクレオチド配列に対する特異性を高めることができ、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出精度を向上させることができる。本発明の検出方法においては、一本鎖核酸−プローブ複合体に、該一本鎖核酸−プローブ複合体を形成するプローブのＴｍ値以下の温度において光を照射することが好ましい。より好ましくは、（Ｔｍ値−２０℃）以上Ｔｍ値以下の温度であり、さらに好ましくは（Ｔｍ値−１０℃）以上Ｔｍ値以下の温度であり、さらに好ましくは（Ｔｍ値−５℃）以上Ｔｍ値以下の温度である。
【００６７】
なお、「一本鎖核酸−プローブ複合体を形成するプローブのＴｍ値」とは、該一本鎖核酸−プローブ複合体を形成する複数のプローブのＴｍ値の中で、最も低いＴｍ値を意味する。例えば、一の一本鎖核酸中に一の標的ヌクレオチド配列領域のみが存在している場合には、一本鎖核酸−プローブ複合体は、該一本鎖核酸と、１の上流側プローブと１の下流側プローブとから形成される。したがって、この場合には、「一本鎖核酸−プローブ複合体を形成するプローブのＴｍ値」とは、該上流側プローブのＴｍ値と該下流側プローブのＴｍ値のうちいずれか低い方である。また、図２や図４に示すように標的ヌクレオチド配列が重複している場合等、複数の標的ヌクレオチド配列に対する上流側プローブと下流側プローブとが互いに連結する場合には、これらの複数のプローブのＴｍ値のうち、最も低いＴｍ値が「一本鎖核酸−プローブ複合体を形成するプローブのＴｍ値」となる。
【００６８】
このように、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出精度が、光連結反応時の温度に影響を受ける理由は明らかではないが、各プローブのハイブリダイゼーション効率が温度に影響を受けるためではないかと推察される。例えば、光を照射する温度が、各プローブのＴｍ値よりも高い場合には、各プローブと標的ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション効率が低下するため、光連結反応効率も低下してプローブ連結体が形成されず、核酸サンプルが標的ヌクレオチド配列を有する核酸を含んでいた場合であっても、該核酸サンプル中には標的ヌクレオチド配列を有する核酸は含まれていないと判断される恐れが高い。一方で、光を照射する温度が、各プローブのＴｍ値よりもはるかに低い場合には、各プローブのヌクレオチド配列識別能が低下し、標的ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列に対してもハイブリダイズしやすくなるため、核酸サンプルが標的ヌクレオチド配列を有する核酸を含んでいない場合であっても、該核酸サンプル中には標的ヌクレオチド配列を有する核酸は含まれていると判断される恐れが高い。
【００６９】
工程（ｆ）において、該一本鎖核酸−プローブ複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる方法は、特に限定されるものではなく、二本鎖核酸を一本鎖化する方法において挙げられた方法と同様の方法により行うことができる。特に、該一本鎖核酸−プローブ複合体を３７〜１０５℃に加熱することが好ましく、６０〜９５℃に加熱することがより好ましい。
【００７０】
その後、工程（ｇ）として、工程（ｅ）において連結されたプローブ（プローブ連結体）を検出し、工程（ｈ）として、プローブ連結体が検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、プローブ連結体が検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断することにより、核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出することができる。
【００７１】
工程（ｇ）におけるプローブ連結体の検出方法は、特に限定されるものではなく、ＰＣＲ産物等の核酸を検出する場合に通常行われる方法を用いて行うことができる。また、プローブ連結体の検出を容易にするために、工程（ｃ）において準備した各プローブは、予め適当な標識分子によって標識されていることが好ましい。このような標識分子は、一本鎖核酸−プローブ複合体の形成を阻害しない限り、特に限定されるものではなく、ヌクレオチド等を標識する場合に通常用いられる分子を使用することができる。
【００７２】
例えば、未連結の各プローブよりもプローブ連結体のほうが、分子量が大きいことを利用して、電気泳動法、カラムクロマトグラフィー法等により、各プローブを標識した標識分子を指標として、プローブ連結体を検出することができる。
【００７３】
各プローブは、一の標識分子により標識されていてもよく、同一種類の複数の標識分子により標識されていてもよく、複数種類の標識分子により標識されていてもよい。また、上流側プローブと下流側プローブは同一種類の標識分子により標識されていてもよく、異なる種類の標識分子により標識されていてもよい。その他、上流側プローブと下流側プローブのいずれか一方のみに標識分子を標識し、他方は非標識のプローブとしてもよい。例えば、複数の標的ヌクレオチド配列を検出する多重解析を行う場合には、一の標的ヌクレオチド配列対応する上流側プローブと下流側プローブを同一種類の標識分子により標識し、かつ標的ヌクレオチド配列の種類ごとに異なる種類の標識分子を用いて標識することにより、多重解析を容易に行うこともできる。
【００７４】
本発明においては、上流側プローブと下流側プローブを標識し得る標識分子としては、通常核酸の標識に用いられ得る分子であれば、特に限定されるものではない。このような標識分子として、例えば、発色基分子、発色抑制分子、蛍光分子、色素、燐光発光性分子、放射活性物質、化学発光性分子、酵素、抗原、重金属、ユーロピウム錯体、磁性分子、及び電気化学的検出分子等がある。ここで、発色基分子とは、少なくとも１の発色基を含み、他の発色基分子又は発色抑制分子と、空間的に適切な位置にて接近することにより、蛍光を発光又は消光することができる分子を意味する。また、発色抑制分子とは、空間的に適切な位置に配置されている他の発色基分子の発色を抑制することができる分子を意味する。なお、各標識分子のプローブへの標識は、一般的な有機合成方法等を用いることにより行うことができる。
【００７５】
未連結のプローブとプローブ連結体を区別して検出する方法として、大きさによる区別以外に、上流側プローブを標識する標識分子と下流側プローブを標識する標識分子との相互反応を検出する方法がある。このように、標識分子の相互反応を利用する場合には、上流側プローブを標識する標識分子と下流側プローブを標識する標識分子の空間的な距離が適当であることが必要である。このため、標識分子は、上流側プローブや下流側プローブにおいて、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることが好ましく、５’末端又は３’末端から６分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることがより好ましい。また、上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることが好ましく、１２以下であることがより好ましい。
【００７６】
このような標識分子の相互反応を利用する検出方法として、例えば、上流側プローブと下流側プローブを同一種類の発色基分子により標識することにより、上流側プローブと下流側プローブを連結させた場合に、上流側プローブを標識する発色基分子と下流側プローブを標識する発色基分子とによってエクサイプレックス又はエキシマーが形成される結果、発光されるエクサイプレックス蛍光又はエキシマー蛍光を検出することにより、上流側プローブと下流側プローブのプローブ連結体を検出することが可能となる（例えば、特許文献１参照。）。エクサイプレックス又はエキシマーは、各発色基分子が空間的に近接することにより形成されるため、一本鎖核酸に正しくハイブリダイズし、光照射により連結されたプローブのみを検出することができる。このため、未連結のプローブが過剰に共存する場合であっても、発色基分子単量体自体に由来する蛍光に干渉されることなく、プローブ連結体を検出することができる。
【００７７】
上流側プローブと下流側プローブを標識する発色基分子としては、上記定義を充足するものであれば特に限定されるものではないが、エクサイプレックス又はエキシマーを形成しやすい分子であることが好ましい。このような発色基分子としては、例えば、ピレン、ナフタレン、アントラセン、ペリレン、スチルベン、ベンゼン、トルエン、フェニルアントラセン、ジフェニルアントラセン、ベンツピレン、ベンツアントラセン、テトラセン、フェナントレン、ペンタセン、トリフェニレン、及びクリセン等の、芳香族性の発色基を含む分子であることが好ましく、ピレン骨格を有する発色基を含む分子であることがより好ましい。
【００７８】
また、上流側プローブと下流側プローブを異なる種類の発色基分子により標識することにより、上流側プローブを標識する標識分子と下流側プローブを標識する標識分子のうち、いずれか一方をドナー分子とし、他方をアクセプター分子とする蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）を起こすことができ、この際に生じる蛍光の発光又は消光を検出することによっても、上流側プローブと下流側プローブのプローブ連結体を検出することができる。ＦＲＥＴも、エクサイプレックス又はエキシマーの形成と同様に、ドナー分子とアクセプター分子とが空間的に近接することにより起こるため、光照射により連結されたプローブのみを検出することが可能となる。
【００７９】
ドナー分子やアクセプター分子として機能し得る発色基分子は、ＦＲＥＴ法を行う場合に通常用いられている発色基分子を適宜使用することができる。本発明の検出方法においては、ドナー分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン社製）又はＡＴＴＯ ４８８（ＡＴＴＯ-ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）であり、前記アクセプター分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン社製）又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることが好ましい。
【００８０】
例えば、図４に示すように、標的ヌクレオチド配列及び各プローブを設計した場合に、プローブ１１ａに低波長で励起する発色基分子を標識し、プローブ１１ｂに中波長で励起する発色基分子を標識し、プローブ１１ｃに高波長で励起する発色基分子を標識しておく。これらのプローブを用いて鋳型となる一本鎖核酸にハイブリダイズさせ、光連結反応を行った場合に、核酸サンプル中に標的ヌクレオチド配列１０Ａと標的ヌクレオチド配列１０Ｂの両方を有する、図４に示す核酸が存在していた場合には、プローブ１１ａとプローブ１１ｂとプローブ１１ｃの３つのプローブの連結体が形成されるため、低波長の励起光を照射すると、各プローブの標識に用いた３種類の発色基分子が連鎖的にＦＲＥTを起こす結果、プローブ１１ｃを標識した高波長で励起する発色基分子の発光が検出される。
【００８１】
その他、上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子とすることにより、上流側プローブと下流側プローブを連結させた場合に、ＦＲＥＴとは異なる熱エネルギー放出により発色基分子の発光を消光させることができる。したがって、発色基分子の発光の変化を測定し、生じた消光を検出することにより、上流側プローブと下流側プローブのプローブ連結体を検出することが可能となる。この発色基分子の消光も、エクサイプレックス又はエキシマーの形成と同様に、発色基分子と発色抑制分子とが空間的に近接することにより起こるため、光照射により連結されたプローブのみを検出することが可能となる。
【００８２】
該検出方法では、２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する場合であって、各２以上の標的ヌクレオチド配列の上流側プローブに発色基分子を、各下流側プローブに発色抑制分子を、それぞれ標識する場合に、各発色基分子と各発色抑制分子は標的ヌクレオチド配列ごとに異なる種類としてもよいが、発色基分子は、標的ヌクレオチド配列ごとに異なる種類とし、発色抑制分子は、使用する全ての発色基分子の発色波長をカバーし得る１の種類の発色抑制分子を共通して使用することもできる。例えば、標的ヌクレオチド配列Ａの上流側プローブに発色基分子Ａを標識し、標的ヌクレオチド配列Ｂの上流側プローブに発色基分子Ｂを標識し、標的ヌクレオチド配列Ａと標的ヌクレオチド配列Ｂの双方の下流側プローブに、発色基分子Ａと発色基分子Ｂの両方の発色波長を抑制し得る同一の発色抑制分子Ｃを標識し、これらのプローブを一の反応溶液中に混在させることにより、各発色分子の発色波長をそれぞれ検出して、反応溶液中の標的ヌクレオチド配列Ａを有する核酸の有無と、標的ヌクレオチド配列Ｂを有する核酸の有無を、一の反応溶液中で解析することができる。
【００８３】
発色基分子の消光の検出により連結されたプローブを検出する場合に用いられる発色基分子や発色抑制分子としては、近接させた場合に熱エネルギーの放出が生じる組み合わせの分子であれば特に限定されるものではないが、発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ ４８８（ＡＴＴＯ-ＴＥＣ ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン社製）、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることが好ましい。
【００８４】
その他、本発明の検出方法においては、上記のように、全ての核酸増幅段階が終了した後に光連結反応による検出段階を行ってもよく、核酸増幅段階と検出段階を交互に行ってもよい。つまり、ＰＣＲは、変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程の３つの工程を１サイクルとし、該サイクルを繰り返すことにより標的ヌクレオチド配列を有する核酸を増幅していくが、このＰＣＲのサイクルごとに、光連結反応を行い、プローブ連結体を検出してもよい。このように、１サイクルを終了する度に検出反応を行い、増幅された標的ヌクレオチド配列を有する核酸を経時的に検出することにより、リアルタイムＰＣＲのように、半定量的な検出が可能となる。
【００８５】
また、核酸増幅段階と検出段階を交互に行う場合において、核酸増幅段階におけるＰＣＲは、変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程の３つの工程からなるサイクルを繰り返すものであれば、特に限定されるものではなく、通常のＰＣＲであってもよく、非対称ＰＣＲであってもよく、一本鎖のループ構造部分に標的ヌクレオチド配列領域を有するＰＣＲ産物を得ることができるＰＣＲであってもよい。
【００８６】
具体的には、核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、下記の工程（１）〜（１１）を有し、工程（１０）及び（１１）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法であってもよい。
（１）標的ヌクレオチド配列ごとに、上記要件（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（２）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを準備する工程と、
（３）前記核酸サンプル、前記工程（１）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブ、前記工程（２）において準備したプライマー、並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有する反応溶液を調製する工程と、
（４）前記工程（３）において調製した反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、
（５）前記工程（４）において得られた一本鎖核酸を鋳型として、前記プライマー用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程と、
（６）前記工程（５）の後、反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、
（７）前記工程（６）において得られた一本鎖核酸に対して、反応溶液中の上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（８）前記工程（７）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（９）前記工程（８）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（１０）前記工程（９）の後に、前記工程（８）において連結されたプローブを検出する工程と、
（１１）前記工程（１０）の後、前記工程（４）〜（１０）を繰り返す工程。
【００８７】
工程（１）は、前記工程（ｂ）と同様である。
また、工程（２）において準備されるプライマーは、前記工程（ａ）においてＰＣＲに用いるプライマーと同様である。
そして、工程（３）において、核酸サンプルと、前工程において準備した上流側プローブ、下流側プローブ、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有する反応溶液を調製する。ここで調製される反応溶液は、前記工程（ａ）においてＰＣＲを行う反応溶液に、上流側プローブと下流側プローブとを添加したものであり、ＤＮＡポリメラーゼのみならず、ヌクレオチド、塩類等のＰＣＲのために必要な試薬を適量含むものである。該反応溶液に添加される、工程（２）において準備された１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーは、通常のＰＣＲと同様に増幅ヌクレオチド配列を挟む２種類のプライマーであってもよく、このうちの１種類のみであってもよく、前記工程（ａ’４）において用いられるような３種類のプライマーであってもよい。
【００８８】
次に、工程（４）として、工程（３）において調製した反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させ、工程（５）として、変性により得られた一本鎖核酸を鋳型として、前記プライマー用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う。この工程（４）が、ＰＣＲの１サイクルにおける変性工程に相当し、工程（５）が、アニール工程及び伸長工程に相当する。
【００８９】
その後、工程（６）として、反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる。該工程は、前記工程（ｂ）に相当する工程であり、変性方法は、工程（ｂ）と同様に行うことができる。また、工程（３）〜（４）におけるＰＣＲが非対称ＰＣＲ等であって、増幅された標的ヌクレオチド配列を有する核酸が一本鎖核酸である場合には、省略することができる。
【００９０】
さらに工程（７）〜（１０）により、ＰＣＲにより増幅された一本鎖核酸を鋳型として、上流側プローブと下流側プローブをハイブリダイズさせた後、光連結反応を行い、得られたプローブ連結体を検出する。具体的には、工程（７）は前記工程（ｄ）と、工程（８）は前記工程（ｅ）と、工程（９）は前記工程（ｆ）と、工程（１０）は前記工程（ｇ）と、それぞれ同様に行うことができる。
【００９１】
なお、このようにＰＣＲの各サイクル終了時に光連結反応を行い、得られたプローブ連結体を検出する方法は、リアルタイムＰＣＲに通常用いられている装置に、光連結反応に適した波長の光を照射し得る装置を組み込んだ装置を用いることにより、簡便に実施することができる。
【００９２】
本発明の検出方法を利用することにより、標的ヌクレオチド配列に、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失からなるミスマッチ部位を有する非標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とを識別することができる。具体的には、本発明の核酸の識別方法は、標的ヌクレオチド配列に、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失からなるミスマッチ部位を有する非標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とを識別する方法であって、（ａ”）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、二本鎖核酸を増幅する工程と、（ｂ”）前記工程（ａ”）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、（ｃ”）上記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、（ｄ”）前記工程（ｂ”）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ”）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸−プローブ複合体を形成する工程と、（ｅ”）前記工程（ｄ”）により形成された一本鎖核酸−プローブ複合体に光を照射する工程と、（ｆ”）前記工程（ｅ”）の後に、前記一本鎖核酸−プローブ複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、（ｇ”）前記工程（ｆ”）の後に、前記工程（ｅ”）において連結されたプローブを検出する工程と、（ｈ”）前記工程（ｇ”）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記非標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていると判断する工程と、を有することを特徴とする。
【００９３】
本発明の核酸の識別方法において、工程（ａ”）〜（ｇ”）は、本発明の検出方法の工程（ａ）〜（ｇ）と同様である。特に工程（ａ”）におけるＰＣＲは、本発明の検出方法の工程（ａ）と同様に非対象ＰＣＲであってもよい。工程（ａ”）におけるＰＣＲを非対称ＰＣＲとする場合には、工程（ｂ）と同様に工程（ｂ”）は省略してもよい。
【００９４】
本発明の核酸の識別方法において、標的ヌクレオチド配列と非標的ヌクレオチド配列との相違部位であるミスマッチ部位は、１又は２以上のヌクレオチドが置換、挿入、又は欠失されている部位である。例えば、１又は２箇所以上の、１のヌクレオチド又は２以上の連続したヌクレオチドが置換、挿入、又は欠失されている部位であってよい。つまり、２以上のヌクレオチドが置換等している場合には、ミスマッチ部位は、一箇所であってもよく、複数箇所にあってもよい。具体的には、一箇所の２以上の連続するヌクレオチドが置換等されていてもよく、１又は２以上の連続するヌクレオチドが置換等されている箇所が複数存在していてもよい。
【００９５】
標的ヌクレオチド配列において、ミスマッチ部位は、上流側プローブと下流側プローブの連結部位の近隣に存在していることが好ましい。なお、本発明においては、上流側プローブと下流側プローブの連結部位の近隣１０分子を、「塩基識別可能領域」という。ミスマッチ部位は塩基識別可能領域にあることが好ましい。該領域にあることにより、たった一塩基のみ相違する標的ヌクレオチド配列同士をより高精度に識別することができるためである。本発明の核酸の識別方法においては、ミスマッチ部位が塩基識別可能領域にあること、すなわち、ミスマッチ部位が、上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から１０分子以内又は下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から１０分子以内にあることが好ましい。ミスマッチ部位は、特に、上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から３分子以内又は下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から３分子以内にあることがより好ましい。
【００９６】
なお、標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割する際に、ミスマッチ部位が該上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から１０分子以内、又は該下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から１０分子以内となるように、標的ヌクレオチド配列を２分割することにより、ミスマッチ部位が上流側プローブや下流側プローブの塩基識別可能領域に有るようにすることができる。また、解析対象である核酸のヌクレオチド配列が予め開示されている場合には、標的ヌクレオチド配列は任意に決定することができるため、ミスマッチ部位が標的ヌクレオチド配列の５’末端領域や３’末端領域に偏りすぎないように、予め標的ヌクレオチド配列を決定しておくことも好ましい。
【００９７】
図５は本発明の核酸の識別方法の一態様を模式的に示した図である。標的ヌクレオチド配列と非標的ヌクレオチド配列は、ミスマッチ部位（図中の「変異部位」に相当）以外は相同的なヌクレオチド配列を有しており、相同性が高い。このため、上流側プローブと下流側プローブは、非標的ヌクレオチド配列に対しても、ミスマッチ部位以外の領域でハイブリダイズし得る場合が多い。この場合であっても、ミスマッチ部位が連結部位近隣、特に塩基識別可能領域に有る場合には、連結部位近隣において、少なくともいずれか一方のプローブが一本鎖核酸と完全にハイブリダイズしていないため、図５に示すように、上流側プローブと下流側プローブが光連結反応による連結のために十分なほど近接することができず、プローブ連結体の形成が阻害される。この結果、連結されたプローブが検出された場合には、核酸サンプル中に標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、核酸サンプル中に非標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていると判断することができ、核酸サンプル中の核酸が、標的ヌクレオチド配列を有する核酸であるか、又は非標的ヌクレオチド配列を有する核酸であるかを識別することができる。
【００９８】
本発明の核酸の識別方法は、特に遺伝子多型のタイピングに好適に用いることができる。工程（ｇ”）において検出された連結されたプローブ量は、核酸サンプル中に存在していた標的ヌクレオチド配列を有する核酸の量と相関するため、連結されたプローブ量から、核酸サンプル中の標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、非標的ヌクレオチド配列を有する核酸との相対的な量比を算出し得るためである。
【００９９】
具体的には、ミスマッチ部位が遺伝子多型の多型部位とし、標的ヌクレオチド配列が遺伝子多型のうちの一多型に相同的なヌクレオチド配列とし、非標的ヌクレオチド配列が該遺伝子多型の他の一多型に相同的なヌクレオチド配列として、工程（ａ”）〜（ｇ”）を行った後、工程（ｇ”）において検出されたプローブ連結体量に基づき、前記核酸サンプル中の核酸が、前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、及び前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルと前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのヘテロ接合体のいずれであるかを識別することができる。
【０１００】
例えば、Ａ／ＧタイプのＳＮＰをタイピングする場合において、Ａアレルに相同的なヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とし、Ｇアレルに相同的なヌクレオチド配列を非標的ヌクレオチド配列として、本発明の核酸の識別方法を用いて検出対象である核酸サンプルのタイピングを行った場合に、検出されたプローブ連結体量が、Ａアレルのホモ接合体を核酸サンプルとして用いた場合のプローブ連結体量とほぼ同程度であれば、検出対象核酸サンプルはＡアレルのホモ接合体であり、Ｇアレルのホモ接合体を核酸サンプルとして用いた場合のプローブ連結体量とほぼ同程度であれば、検出対象核酸サンプルはＧアレルのホモ接合体であり、Ａアレルのホモ接合体を核酸サンプルとして用いた場合のプローブ連結体量とＧアレルのホモ接合体を核酸サンプルとして用いた場合のプローブ連結体量との中間的な量であれば、ＡアレルとＧアレルのヘテロ接合体であるとタイピングすることができる。
【０１０１】
その他、本発明の検出方法を利用することにより、配列情報が未知のヌクレオチド配列を決定することもできる。例えば、配列情報が不明であるヌクレオチド配列領域において、該領域のヌクレオチド配列として推定されるヌクレオチド配列を標的ヌクレオチド配列とし、該標的ヌクレオチド配列を有する核酸が検出された場合には、該領域のヌクレオチド配列が、該標的ヌクレオチド配列と同一の配列であると決定することができる。
【０１０２】
本発明のプローブセットは、本発明の検出方法や、本発明の核酸の識別方法において用いることができる上流側プローブと下流側プローブをセットとしたものである。標的ヌクレオチド配列が２以上ある場合には、一の標的ヌクレオチド配列に対する上流側プローブと下流側プローブのみを一のプローブセットとしてもよく、全ての標的ヌクレオチド配列に対する上流側プローブと下流側プローブを一のプローブセットとしてもよい。
【実施例】
【０１０３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１０４】
［参考例１］各種蛍光色素の紫外線耐性の検討
本発明における上流側プローブ又は下流側プローブの標識（修飾）に用いられる蛍光色素の紫外線耐性について検討した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に、表１に示した各種蛍光色素修飾プローブを、終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬに、また、１０×ＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製）を終濃度１×（説明書に記載の標準濃度）になるように添加し、純水でメスアップして全量４０μＬのサンプルを調製した。なお、表１中、「ｐ」は３’ 末端ヌクレオチドのリン酸基修飾を、「ｃｖ−Ｕ」は５−カルボキシビニル-デオキシウリジンを、「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８」、「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４」、「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８」、「ＡＴＴＯ ５５０」、「ＡＴＴＯ ５６５」、「ＡＴＴＯ ４６５」、「ＡＴＴＯ ４８８」、「Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５」、「Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８」、「ＴＡＭＲＡ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）」、「ＲＯＸ」は各種蛍光色素の種類と修飾部位を、それぞれ示す。例えば、「ｗＬ１４−Ａｌｅ５６８」は、配列番号３のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端から１０番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８で修飾されているプローブである。また、「ｗＬ２５−Ａｌｅ５９４」は、配列番号５のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端から２１番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４で修飾されているプローブであり、「ｍＬ２５−Ａｌｅ５９４」は、配列番号６のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端から２１番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４で修飾されているプローブである。また、「Ｒ１２−Ａｌｅ４８８」は、配列番号７のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端ヌクレオチドが５−カルボキシビニル-デオキシウリジンであり、さらに５’末端から６番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で修飾されているプローブである。「Ｒ２１−Ａｔ４８８」は、配列番号８のヌクレオチド配列を有するプローブであって、３’末端がリン酸基で修飾されており、５’末端ヌクレオチドが５−カルボキシビニル-デオキシウリジンであり、さらに５’末端から６番目のヌクレオチドがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で修飾されているプローブである。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
チューブに透明キャップを装着した後、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線（強度：約９００ｍＷ／ｃｍ２）を室温下にて、０分、３０分間、６０分間照射し、その際の蛍光強度劣化との関係を調べた。蛍光強度測定は、リアルタイムＰＣＲ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて計測した。その際、下流側プローブ（長波長励起のＡｃｃｅｐｔｏｒ色素）は、励起光４６５ｎｍ、蛍光５８０〜６１０ｎｍのフィルタを、また、上流側プローブ（低波長励起のＤｏｎｏｒ色素）は励起光４６５ｎｍ、蛍光５２０〜５５０ｎｍのフィルタを、それぞれ用いて計測した。
【０１０７】
各種蛍光色素修飾プローブの紫外線照射後における蛍光強度変化を図６〜図１６に示す。
この結果、ｗＬ１４−Ａｌｅ ５９４、ｗＬ１４−Ｈｉｌ ５５５、ｗＬ１４−Ｒｏｘの３種については、紫外線照射によっても蛍光強度に大きな変化は見られなかった。
一方で、Ｒ１２−Ａｌｅ ４８８、Ｒ１２−Ａｔｏ ４８８、ｗＬ１４−Ａｔｏ ５５０の３種については、照射時間が長くなるほど蛍光強度に若干の減少が認められた。
また、ｗＬ１４−Ａｔｏ ５６５、ｗＬ１４−ＴＡＭＲＡの２種については、照射時間が長くなるほど見かけ上、蛍光強度が増加する傾向を示し、Ｒ１２−Ａｔｏ ４６５、Ｒ１２−Ｈｉｌ ４８８、ｗＬ１４−Ａｌｅ ５６８の３種については、照射時間が長くなるについて、蛍光強度は激減する結果となった。
以上のことから、上流側プローブとしては、Ｒ１２−Ａｌｅ ４８８、Ｒ１２−Ａｔｏ ４８８の２種、また、下流側プローブとしては、ｗＬ１４−Ａｌｅ ５９４、ｗＬ１４−Ｈｉｌ ５５５、ｗＬ１４−Ｒｏｘ、ｗＬ１４−Ａｔｏ ５５０の４種が紫外線に対して比較的強い耐性を有することが明らかとなった。
【０１０８】
［参考例２］各種蛍光色素修飾プローブにおけるＦＲＥＴ効果
表１に示した各種蛍光色素修飾プローブのうち、低波長励起色素と長波長励起色素とを組み合わせ、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９、配列番号１０）とハイブリダイゼーションさせた際のＦＲＥＴ効果における蛍光強度比較を行った。
具体的には、表１に記載の各種蛍光修飾プローブの上流側プローブと下流側プローブを、それぞれ終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬ、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）を終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬ、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるように添加し、純水でメスアップして全量４０μＬのサンプルを調製した。また、ネガティブコントロールとしては、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）を添加しないサンプルを調製した。
蛍光強度測定にはリアルタイムＰＣＲ７３００を使用し、サンプルを２０．０℃から８０．３℃まで昇温させる間の蛍光強度を計測した。その際、励起光は４６５ｎｍ、蛍光は５８０〜６１０ｎｍのフィルタにて測光した。
鋳型存在下におけるＦＥＲＴ光と、鋳型非存在下におけるＦＲＥＴ光（ネガティブコントロール）の蛍光強度比を算出した。図１７〜２３は、算出された各種蛍光色素の強度比を重ねてプロットした図である。
この結果、表１記載の蛍光修飾プローブのうち、下流側プローブのｗＬ１４−Ｈｉｌ ５５５及びｗＬ１４−ＴＡＭＲＡを除いた全ての色素の組み合わせにおいて、顕著なＦＲＥＴが認められた。中でも本検出器では、上流側プローブのＲ１２−Ａｌｅ４８８及びＲ１２−４６５が高いＦＲＥＴ効果を引き出すことが分かった。
【０１０９】
［参考例３］各種蛍光色素修飾プローブの光連結反応後のＦＲＥＴ効果
表１に示した各種蛍光色素修飾プローブのうち、低波長励起色素と長波長励起色素とを組み合わせ、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）とをハイブリダイゼーションさせ、さらに光連結反応を行った際のＦＲＥＴ強度について比較した。
具体的には、２００μＬチューブに、表１に記載の上流側プローブ及び下流側プローブの各種組み合わせた蛍光修飾プローブをそれぞれ終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬ、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）を終濃度１．０ｐｍｏｌ／μＬ、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるように添加し、純水でメスアップして全量４０μＬのサンプルを調製した。また、ネガティブコントロールには、鋳型ＤＮＡ（ｗＴ３９）を添加しないサンプルとして調製した。なお、Ｒ１２−Ａｔｏ ４６５及びＲ１２−Ｈｉｌ ４８８は、紫外線耐性が低かったことから（参考例１の結果）、本実験では用いなかった。
上記調製サンプルの入った容器に透明キャップを装着し、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線（強度：約９００ｍＷ／ｃｍ２）を０℃下にて、１０分間照射し、プローブ間の光連結反応を試みた。
ＦＲＥＴ強度測定にはリアルタイムＰＣＲ７３００を使用し、励起光は４６５ｎｍ、蛍光は５８０〜６１０ｎｍのフィルタを用いて、サンプルを２０．１℃から７７．３℃まで昇温させた際の蛍光を計測した。
鋳型存在下における各種蛍光色素修飾プローブの光連結反応後のＦＥＲＴ光と、鋳型非存在下におけるＦＲＥＴ光（ネガティブコントロール）の蛍光強度比を算出した。図２４〜３０は、算出された各種蛍光色素の強度比を重ねてプロットした図である。
連結反応後の上・下流側プローブの連結体のＴｍ値（５５℃付近）よりも高い温度領域（各図２４〜３０の点線枠内）でのＦＲＥＴは、単に上流側プローブと下流側プローブの隣接により生じたＦＲＥＴではなく、連結されたプローブのみによるＦＲＥＴである。点線枠内のＦＲＥＴ強度比の結果より、ｗＬ１４−Ｈｉｌ ５５５とｗＬ１４−ＴＡＭＲＡを除く蛍光修飾プローブでは、光連結反応による顕著なＦＲＥＴ効果が認められた。また、この結果から、プローブに修飾されている蛍光色素の位置が、光連結反応を阻害する位置ではないことが分かると同時に、光連結反応が蛍光色素のＦＲＥＴ反応を阻害しないことも確認できた。さらに、上流側プローブの３’末端にリン酸基が修飾されてもプローブ間の光連結反応が起こることが明らかとなった。なお、通常の酵素（リガーゼ）反応では連結反応は阻害される。
【０１１０】
［参考例４］光連結反応の最適反応温度の検討１
光連結反応におけるヌクレオチド識別特異性と温度との関係について検討した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブの中に、表１記載の下流側プローブｗＬ１４−ＴＡＭＲＡ又はｍＬ１４−ＴＡＭＲＡを終濃度が各５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の上流側プローブＲ１２を終濃度が各５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１の鋳型ＤＮＡであるｗＴ３９又はｍＴ３９（配列番号１１）を終濃度が５ｐｍｏｌ／μＬになるよう加え、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう試薬を添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。サンプルは、ｗＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（フルマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（フルマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）、ｗＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）の４通りの組合せとなるように調製した。マイクロチューブに透明キャップを装着した後、各サンプルをそれぞれ０℃、１０℃、１８℃、２６℃、３１℃、３７℃、４８℃、６０℃となるようサーマルサイクラーにて温調制御し、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線を約９００ｍＷ／ｃｍ２の強度で１０分間照射した。
上記の条件で紫外線照射したサンプルについて下記条件にてＨＰＬＣ分析を行った。各反応温度におけるプローブ連結体量の測定結果を図３１に示す。
溶離液［Ａ］：１００ｍＭ 酢酸トリエチルアミン水溶液
溶離液［Ｂ］：５０％ １００ｍＭ酢酸トリエチルアミン水溶液 / ５０％アセトニトリル
グラジエント[Ｂ]： ０ｍｉｎ，１０％→２２ｍｉｎ，４５．５％
インジェクション： ２０μＬ
検出波長： ２５４ｎｍ
流速： １ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度： ６０℃
カラム / 充填材：ChemcoPak Chemcobond 5-ODS-H (Lot# G7A62)
【０１１１】
この結果、光連結反応温度が高温になるに従って、光連結反応の効率低下が認められた。また、４８℃以上では光連結反応産物の生成を認めることはできなかった。一方、０℃下における光連結反応では、シングルヌクレオチドミスマッチ配列であっても比較的高い光連結反応産物が認められたが、反応温度が高くなるにつれて、その非特異的な連結反応産物は減少する傾向にあり、３７℃下での光連結反応が最も高い精度（高いＳ／Ｎ比）にてヌクレオチドミスマッチを識別できていることが分かった。
【０１１２】
［参考例５］光連結反応の最適反応温度の検討２
下流側プローブとしてｗＬ２５−ＴＡＭＲＡ又はｍＬ２５−ＴＡＭＲＡを、上流側プローブとしてＲ２１を、鋳型ＤＮＡとしてｗＴ５０（配列番号１２）又はｍＴ５０（配列番号１３）をそれぞれ用いた以外は、参考例４と同様にして、各反応温度におけるプローブ連結体量を測定した。測定結果を図３２に示す。
この結果、参考例４と同様に、光連結反応温度が高温になるに従って、光連結反応の効率低下が認められた。また、０℃下における光連結反応では、シングルヌクレオチドミスマッチ配列であっても比較的高い光連結反応産物が認められたが、反応温度が高くなるにつれて、その非特異的な連結反応産物は減少する傾向にあり、６０℃下での光連結反応が最も高い精度（高いＳ／Ｎ比）にてヌクレオチドミスマッチを識別できていることが分かった。
本実験結果を参考例４の結果と比較すると、ヌクレオチドミスマッチを高精度に識別できる至適反応温度は、プローブが長鎖となる本実験では高くなっていた（３７℃→４８℃）。以上より、光連結反応によるヌクレオチド配列の識別特異性は、プローブの長さに依存する、すなわち、プローブのＴｍ値にも深く関与していることが示唆された。
【０１１３】
［参考例６］オリゴＤＮＡとプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値の測定１
参考例４で用いたオリゴＤＮＡと標識分子のみが異なるプローブを用いて、オリゴＤＮＡとプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値を測定した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブの中に、表１記載の下流側プローブｗＬ１４−Ａｌｅ５９４又はｍＬ１４−Ａｌｅ５９４を終濃度が各０．５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の上流側プローブＲ１２−Ａｔｏ４８８を終濃度が各０．５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の鋳型ＤＮＡであるｗＴ３９又はｍＴ３９を終濃度が各０．５ｐｍｏｌ／μＬになるよう加え、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう試薬を添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。サンプルは、ｗＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（フルマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（フルマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）、ｗＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）の４通りの組合せとなるように調製した。また、ネガティブコントロールとしては、鋳型ＤＮＡを添加しないサンプルを調製した。
蛍光強度測定にはリアルタイムＰＣＲ７３００を使用し、サンプルを１５．０℃から９１．９℃まで昇温させる間の蛍光強度を計測した。その際、励起光は４６５ｎｍ、蛍光は５８０〜６１０ｎｍのフィルタにて測光した。
図３３は、上記実験より得られた融解曲線である。この結果、本実験で使用したプローブの上記４通りの組合せにおけるＴｍ値は、３４〜３７℃の範囲であることが示された。
【０１１４】
［参考例７］オリゴＤＮＡとプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値の測定２
参考例５で用いたオリゴＤＮＡと標識分子のみが異なるプローブを用いて、オリゴＤＮＡとプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値を測定した。
下流側プローブとしてｗＬ２５−Ａｌｅ５９４又はｍＬ２５−Ａｌｅ５９４を、上流側プローブとしてＲ２１−Ａｔｏ４８８を、鋳型ＤＮＡとしてｗＴ５０又はｍＴ５０をそれぞれ用いた以外は、参考例６と同様にして、Ｔｍ値の測定を行った。
図３４は、上記実験より得られた融解曲線である。この結果、本実験で使用したプローブの上記４通りの組合せにおけるＴｍ値は、５５〜５８℃の範囲であることが示された。
【０１１５】
参考例４及び５において得られた各プローブのヌクレオチド配列の識別特異性と光連結反応温度との関係に関する結果と、参考例６及び７において得られた各プローブのＴｍ値の結果から、光連結反応温度を、鋳型となる一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成するプローブのＴｍ値−５℃以上Ｔｍ値以下の範囲にすることにより、各プローブのヌクレオチド配列の識別能（各プローブのヌクレオチド配列に対する特異性）が向上し、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を、高精度に検出し得ることが明らかである。
【０１１６】
［参考例８］オリゴＤＮＡを鋳型とした光連結反応のヌクレオチド識別特異性評価
光連結反応におけるヌクレオチド識別特異性と定量性について検討した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブの中に、表１記載の下流側プローブｗＬ１４又はｍＬ１４を終濃度が各０.５ｐｍｏｌ／μＬになるように、また、表１記載の上流側プローブＲ１２を終濃度が各０.５ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の鋳型ＤＮＡｗＴ３９又はｍＴ３９を終濃度が０.５ｐｍｏｌ／μＬ、あるいはｗＴ３９とｍＴ３９を混合し、それぞれの終濃度が０.２５ｐｍｏｌ／μＬになるよう加え、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう試薬を添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。サンプルは、ｗＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（マッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（マッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｗＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）、ｗＬ１４とＲ１２とｍＴ３９（シングルヌクレオチドミスマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２とｗＴ３９とｍＴ３９（ハーフマッチ）、ｗＬ１４とＲ１２とｗＴ３９とｍＴ３９（ハーフマッチ）、ｍＬ１４とＲ１２（ネガティブコントロール）、ｗＬ１４とＲ１２（ネガティブコントロール）の全８通りの組合せとなるように調製した。マイクロチューブに透明キャップを装着した後、反応温度が３７℃となるようサーマルサイクラーにて温調制御し、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線を約９００ｍＷ／ｃｍ２の強度で１０分間照射した。
ＦＲＥＴ強度測定にはリアルタイムＰＣＲ７３００を使用し、励起光は４６５ｎｍ、蛍光は６１０ｎｍのフィルタを用いて、サンプルを２１．２℃から９２．５℃まで昇温させた際の蛍光を計測した。図３３〜４０は、Ａｃｃｅｐｔｏｒ色素のＦＲＥＴ値をＤｏｎｏｒ色素のＦＲＥＴ値で除した値を重ねてプロットした図である。
図３３から図４０において、光連結反応したプローブのＴｍ値（５５℃付近）よりも高い温度領域での蛍光強度比を比較すると、ターゲットが含まれないネガティブコントロールの蛍光強度比に対して、ミスマッチ、ハーフマッチ、マッチの順に蛍光強度比は高くなることが分かった。このことから、光連結反応がターゲットのヌクレオチド配列を識別検出できていることが明らかとなった。また同時に、ハーフマッチがミスマッチとマッチのほぼ中間値となる蛍光強度比を示していることから、本光連結反応は、定量性も有していることが示唆される。よって、検出対象である核酸が、野生型アレルホモ体、変異型アレルと野生型アレルのへテロ体、野生型アレルのホモ体のいずれのタイプを呈する場合であっても、本発明の方法を用いることにより、容易にその多型を識別できることが明らかである。
【０１１７】
［実施例１］
ＣＹＰ２Ｃ９遺伝子のヒトＳＮＰ（Ａ／Ｃ）の、３タイプ（ＡＡ、ＡＣ、ＣＣ）のゲノムＤＮＡをそれぞれＰＣＲ増幅し、合成された二本鎖核酸を鋳型として、上流側及び下流側プローブを用いて光連結反応を行い、遺伝子型を識別した。方法の詳細を以下に示す。
増幅ヌクレオチド配列領域内に３種類の多型をそれぞれ持つヒトゲノムＤＮＡ（ＡＡ：ワイルド、ＡＣ：ミュータントへテロ、ＣＣ：ミュータントホモ）を鋳型として、表１記載のＦ２４プライマーとＲ２２プライマーを用いて、ＰＣＲ反応にて増幅ヌクレオチド配列を有する二本鎖核酸を増幅した。ＰＣＲ反応には、ホットスタート式Ｔａｑポリメラーゼを５ｕｎｉｔ、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。ＰＣＲ温調サイクルは、９５℃３分間を１サイクル、次に９５℃３０秒間−５８℃３０秒間−７２℃３０秒間を４０サイクル、その後７２℃５分間とした。次に、得られたＰＣＲ産物から１８μＬを分取し、表１記載の下流側プローブｗＬ２５−Ａｌｅ ５９４（ワイルド検出用）又はｍＬ２５−Ａｌｅ ５９４（ミュータント検出用）と、表１記載の上流側プローブＲ２１−Ａｔｏ４８８を各々０．５ｐｍｏｌ／μＬになるように加え、全量を２０μＬとする光連結反応準備溶液を調製した。また、ネガティブコントロール溶液は、ＰＣＲ産物の代わりに水で置き換えたものを準備した。
サンプルをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３５０Ｓ専用キャピラリに装填し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３５０Ｓにて、９５℃１分、次いで、２０℃／ｓｅｃの速度で４０℃まで温度降下し、ＰＣＲ産物である二本鎖核酸と各種プローブセットとのハイブリダイゼーション反応を促した。その後直ちに、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３５０Ｓからキャピラリを取り出し、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、キャピラリの外側から内部のサンプル溶液に向けて、室温下で３６５ｎｍの紫外線を１０分間照射した。
上記のサンプル溶液（キャピラリ）を再び、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−３５０Ｓにセットし、９５℃にてサンプル溶液のＦＲＥＴ解析を行った。Ｆ２（６４０ｎｍ）、Ｆ１（５３０ｎｍ）のフィルタで測定した蛍光強度値の比、Ｆ２／Ｆ１の値を算出した。図４１及び図４２は、各種プローブセットにおいて検出されたＦＲＥＴ強度比から、ネガティブコントロールのＦＲＥＴ強度比を差し引いた値と、各種ゲノムＤＮＡのタイプとの関係について示した図である。
図４１、図４２はともに、検出用である下流側プローブとゲノムＤＮＡのタイプが一致する場合（マッチ）には、ＦＲＥＴ強度比が高くなり、一致しない場合（ミスマッチ）には、そのＦＲＥＴ強度比は小さくなり、半分のみ一致するヘテロ接合体である場合（ハーフマッチ）では、タイプが一致する場合と一致しない場合の中間のＦＲＥＴ強度比を示した。これらの結果から、本発明の核酸識別方法により、ＳＮＰ等の遺伝子多型をタイピングし得ることが明らかである。
【０１１８】
現在、臨床分野や研究分野においては、遺伝子検査の安定性、コストダウン、簡素化党が求められているが、従来法では、検査反応に酵素を用いるということで、保存性や安定性の面で問題解決に限界があり、それに伴い、コストダウンや検査反応の簡素改良も困難となっている。本発明の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法及び核酸の識別方法は、光連結反応を用いることにより、酵素を用いずに変異を識別することが可能となるため、安定性及びコスト面での改善、また、反応系の簡素化も容易となり、今後産業価値の高い技術として広く活用されることが期待できる。
【０１１９】
［参考例９］紫外線照射に伴うＢＨＱ２のクエンチング能力減衰評価
ＢＨＱ２の紫外線耐性、すなわち、ＢＨＱ２のクエンチング能力に対する紫外線照射の影響を、経時的に紫外線を照射したＢＨＱ２による、蛍光色素の消光度合いについて解析し、評価した。
具体的には、２００μＬのマイクロチューブの中に、表１記載の下流側プローブｗＬ２５−Ａｌｅ４８８又はｗＬ２５−Ａｌｅ５９４を終濃度が各１ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１記載の上流側プローブＲ２３−ＢＨＱ２を終濃度が１ｐｍｏｌ／μＬになるように、表１の鋳型ＤＮＡであるｗＴ５０を終濃度が１ｐｍｏｌ／μＬになるよう加え、１０×ＰＣＲバッファーを１×の濃度として、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ ｅａｃｈ）を終濃度０．２５ｍＭとなるよう試薬を添加して、反応溶液の全量が４０μＬとなるよう純水でメスアップした。なお、ポジティブコントロールとして、Ｒ２３−ＢＨＱ２に代えて純水を添加した反応溶液を調製した。
これらのチューブに透明キャップを装着した後、紫外線照射器（オムロン社製、ＵＶ−ＬＥＤ）及び紫外線照射コントローラ（オムロン社製、ＺＵＶ−Ｈ３０Ｍ）を使用して、透明キャップを通して、３６５ｎｍの紫外線（強度：約９００ｍＷ／ｃｍ２）を室温下にて、０分、３０分間、６０分間照射し、各下流側プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定した。なお、蛍光強度測定は、リアルタイムＰＣＲ７３００を用いて行った。
図４５及び図４６は、各種蛍光色素修飾プローブの紫外線照射後における蛍光強度変化を示した図である。また、図中、「ＰＣ」は、紫外線照射０分のポジティブコントロールを示している。
【０１２０】
【表２】
【０１２１】
表２は、測定された蛍光強度に基づき、ＢＨＱ２のクエンチング能力を評価した表である。表中の「ＰＣ」は図４５及び４６と同様である。具体的には、紫外線照射０分間のサンプルにおけるＢＨＱ２のクエンチング能力を１００％とし、紫外線照射０分のポジティブコントロールにおけるＢＨＱ２のクエンチング能力を０％とし、紫外線照射３０分間と６０分間の各サンプルにおけるＢＨＱ２のクエンチング能力を算定した。
表２の結果から、いずれの蛍光色素であっても、紫外線照射３０分間では、ＢＨＱ２のクエンチング能力はおよそ１３％程度の減衰しか認められなかった。したがって、これらの結果から、少なくとも３０分間程度の紫外線照射による光連結反応であれば、ＢＨＱ２のクエンチング能力を活かした蛍光検出によるプローブ連結体の検出が可能であることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】標的ヌクレオチド配列１、上流側プローブ２、及び下流側プローブ３の関係を模式的に示した図である。
【図２】複数の標的ヌクレオチド配列と、上流側プローブ及び下流側プローブの関係を模式的に示した図である。
【図３】標的ヌクレオチド８及び標的ヌクレオチド配列９の関係を模式的に例示した図である。
【図４】標的ヌクレオチド８、標的ヌクレオチド配列９、プローブ１０の関係を模式的に例示した図である。
【図５】本発明の核酸の識別方法の一態様を模式的に示した図である。
【図６】参考例１におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８の蛍光強度変化を示した図である。
【図７】参考例１におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４の蛍光強度変化を示した図である。
【図８】参考例１におけるＡＴＴＯ ５５０の蛍光強度変化を示した図である。
【図９】参考例１におけるＡＴＴＯ ５６５の蛍光強度変化を示した図である。
【図１０】参考例１におけるＨｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５の蛍光強度変化を示した図である。
【図１１】参考例１におけるＴＡＭＲＡの蛍光強度変化を示した図である。
【図１２】参考例１におけるＲＯＸ--の蛍光強度変化を示した図である。
【図１３】参考例１におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光強度変化を示した図である。
【図１４】参考例１におけるＡＴＴＯ ４６５の蛍光強度変化を示した図である。
【図１５】参考例１におけるＡＴＴＯ ４８８の蛍光強度変化を示した図である。
【図１６】参考例１におけるＨｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８の蛍光強度変化を示した図である。
【図１７】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図１８】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図１９】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＡＴＴＯ ５５０とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２０】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＡＴＴＯ ５６５とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２１】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２２】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＴＡＭＲＡとのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２３】参考例２におけるＤｏｎｏｒ色素３種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＲＯＸとのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２４】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２５】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２６】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＡＴＴＯ ５５０とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２７】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＡＴＴＯ ５６５とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２８】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素Ｈｉｌｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ５５５とのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図２９】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＴＡＭＲＡとのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図３０】参考例３におけるＤｏｎｏｒ色素２種それぞれとＡｃｃｅｐｔｏｒ色素ＲＯＸとのＦＲＥＴ強度比相対比較を示した図である。
【図３１】参考例４におけるヌクレオチド識別特異性と光連結反応温度との関係を示した図である。
【図３２】参考例５におけるヌクレオチド識別特異性と光連結反応温度との関係を示した図である。
【図３３】参考例６における光連結プローブの融解曲線解析の結果を示した図である。
【図３４】参考例７における光連結プローブの融解曲線解析の結果を示した図である。
【図３５】参考例８におけるＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ５９４のＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図３６】参考例８におけるＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ５９４のＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図３７】参考例８におけるＡＴＴＯ ４８８とＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ５９４のＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図３８】参考例８におけるＡＴＴＯ ４８８とＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ５９４のＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図３９】参考例８におけるＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＲＯＸのＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図４０】参考例８におけるＡＬＥＸＡ Ｆｌｕｏｒ ４８８とＲＯＸのＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図４１】参考例８におけるＡＴＴＯ ４８８とＲＯＸのＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図４２】参考例８におけるＡＴＴＯ ４８８とＲＯＸのＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるヌクレオチド配列の識別及び定量結果を示した図である。
【図４３】実施例１におけるＦＲＥＴプローブ（Ｗｔ）を用いた光連結反応によるＣＹＰ２Ｃ９の変異解析結果を示した図である。
【図４４】実施例１におけるＦＲＥＴプローブ（Ｍｔ）を用いた光連結反応によるＣＹＰ２Ｃ９の変異解析結果を示した図である。
【図４５】参考例９におけるＡＴＴＯ ４８８の蛍光強度変化を示した図である。
【図４６】参考例９におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４の蛍光強度変化を示した図である。
【符号の説明】
【０１２３】
１…標的ヌクレオチド配列、１ａ…標的ヌクレオチド配列１の上流側標的ヌクレオチド配列、１ｂ…標的ヌクレオチド配列１の下流側標的ヌクレオチド配列、２…上流側プローブ、３…下流側プローブ、４ａ〜４ｄ…標的ヌクレオチド配列、５ａ〜５ｅ…プローブ、６…ＰＣＲ阻害物質、７…光応答性物質、８…標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、９…標的ヌクレオチド、１０…標的ヌクレオチド配列、１１ａ〜１１ｃ…プローブ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、
（ａ）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより、１種又は２種以上の二本鎖核酸を増幅する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、
（ｃ）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（ｇ）前記工程（ｆ）の後に、前記工程（ｅ）において連結されたプローブを検出する工程と、
（ｈ）前記工程（ｇ）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、
を有することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項２】
前記工程（ａ）におけるＰＣＲが、多段階ＰＣＲであることを特徴とする、請求項１記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項３】
前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする請求項１又は２記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項４】
前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、６〜１００分子連結したものであることを特徴とする請求項１又は２記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項５】
前記光応答性物質は、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項６】
前記光応答性物質は、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル基、フェニルトリアゾールビニル基、メトキシフェニルトリアゾールビニル基、シアノフェニルトリアゾールビニル基、及びナフチルトリアゾールビニル基からなる群より選択される１以上を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項７】
前記工程（ｅ）において照射される光が、紫外光であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項８】
前記工程（ｅ）において照射される光が、３２０〜４００ｎｍの波長の光の照射であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項９】
前記上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記工程（ｅ）において、前記複合体を形成するプローブのＴｍ値以下の温度において光を照射することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記工程（ｅ）において、前記複合体を形成するプローブのＴｍ値−５℃以上Ｔｍ値以下の温度において光を照射することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記上流側プローブの３’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１５】
前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１６】
前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基が、ホスホロチオエート化されていることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１７】
前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブが、標識分子により標識されていることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１８】
前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とが、異なる種類の発色基分子であり、
前記工程（ｇ）における連結されたプローブの検出が、前記上流側プローブを標識する標識分子と前記下流側プローブを標識する標識分子のうち、いずれか一方をドナー分子とし、他方をアクセプター分子とする蛍光共鳴エネルギー転移による、蛍光の発光又は消光の検出であることを特徴とする請求項１７記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１９】
前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子であり、
前記工程（ｇ）における連結されたプローブの検出が、前記発色基分子の消光の検出であることを特徴とする請求項１７記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２０】
前記ドナー分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）４８８又はＡＴＴＯ ４８８であり、前記アクセプター分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることを特徴とする請求項１８記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２１】
前記発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、前記発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることを特徴とする請求項１９記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２２】
前記標識分子が、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることを特徴とする請求項１７〜２１のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２３】
前記上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、前記下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることを特徴とする請求項１７〜２１のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２４】
前記ＰＣＲに用いられるプライマーが、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２５】
前記ＰＣＲに用いられるプライマーが、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、１０〜１００分子連結したものであることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２６】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に熱エネルギーを加えることにより行うことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２７】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸を８０〜１０５℃に加熱することにより行うことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２８】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド、及び尿素からなる群より選択される１以上の化学物質を添加することにより行うことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２９】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に、標的ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を添加することにより行うことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項３０】
前記工程（ｆ）において、前記複合体を３７〜１０５℃に加熱することにより、一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させることを特徴とする請求項１〜２９のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項３１】
１又は２以上の、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するためのプローブのセットであって、
標的ヌクレオチド配列の種類ごとに下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを有することを特徴とするプローブセット。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項３２】
前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする請求項３１記載のプローブセット。
【請求項３３】
前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、６〜１００分子連結したものであることを特徴とする請求項３１記載のプローブセット。
【請求項３４】
前記光応答性物質は、光反応官能基として、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有することを特徴とする請求項３１〜３３のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３５】
前記光応答性物質は、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル基、フェニルトリアゾールビニル基、メトキシフェニルトリアゾールビニル基、シアノフェニルトリアゾールビニル基、及びナフチルトリアゾールビニル基からなる群より選択される１以上を有することを特徴とする請求項３１〜３３のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３６】
前記上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることを特徴とする請求項３１〜３５のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３７】
前記上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする請求項３１〜３５のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３８】
前記上流側プローブの３’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることを特徴とする請求項３１〜３７のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３９】
前記上流側プローブの５’末端又は前記下流側プローブの５’末端が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることを特徴とする請求項３１〜３８のいずれか記載のプローブセット。
【請求項４０】
前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする請求項３１〜３８のいずれか記載のプローブセット。
【請求項４１】
前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基が、ホスホロチオエート化されていることを特徴とする請求項３１〜３８のいずれか記載のプローブセット。
【請求項４２】
前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブが、標識分子により標識されていることを特徴とする請求項３１〜４１のいずれか記載のプローブセット。
【請求項４３】
前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とが、異なる種類の発色基分子であることを特徴とする請求項４２記載のプローブセット。
【請求項４４】
前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子であることを特徴とする請求項４２記載のプローブセット。
【請求項４５】
前記上流側プローブを標識する標識分子と前記下流側プローブを標識する標識分子のいずれか一方がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）４８８又はＡＴＴＯ ４８８であり、他方がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることを特徴とする請求項４３記載のプローブセット。
【請求項４６】
前記発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、前記発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることを特徴とする請求項４４記載のプローブセット。
【請求項４７】
前記標識分子が、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることを特徴とする請求項４２〜４６のいずれか記載プローブセット。
【請求項４８】
前記上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、前記下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることを特徴とする請求項４２〜４６のいずれか記載プローブセット。
【請求項４９】
標的ヌクレオチド配列に、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失からなるミスマッチ部位を有する非標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とを識別する方法であって、
（ａ”）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、二本鎖核酸を増幅する工程と、
（ｂ”）前記工程（ａ”）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、
（ｃ”）下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（ｄ”）前記工程（ｂ”）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ”）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（ｅ”）前記工程（ｄ”）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（ｆ”）前記工程（ｅ”）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（ｇ”）前記工程（ｆ”）の後に、前記工程（ｅ”）において連結されたプローブを検出する工程と、
（ｈ”）前記工程（ｇ”）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記非標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていると判断する工程と、
を有することを特徴とする、核酸の識別方法。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項５０】
前記ミスマッチ部位が、前記上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から１０分子以内又は前記下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から１０分子以内にあることを特徴とする請求項４９記載の核酸の識別方法。
【請求項５１】
前記ミスマッチ部位は、１又は２箇所以上の、１のヌクレオチド又は２以上の連続したヌクレオチドが、置換、挿入、又は欠失していることを特徴とする請求項４９又は５０記載の核酸の識別方法。
【請求項５２】
前記標的ヌクレオチド配列が遺伝子多型のうちの一多型に相同的なヌクレオチド配列であり、前記非標的ヌクレオチド配列が前記遺伝子多型の他の一多型に相同的なヌクレオチド配列であり、前記ミスマッチ部位が前記遺伝子多型の多型部位であり、前記工程（ｈ”）が、
（ｈ”２）前記工程（ｇ”）において検出された連結されたプローブ量に基づき、前記核酸サンプル中の核酸が、前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、及び前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルと前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのヘテロ接合体のいずれであるかを識別する工程、
であることを特徴とする請求項４９〜５１のいずれか記載の核酸の識別方法。
【請求項５３】
核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、
（ａ’）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、非対称ＰＣＲ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより、１種又は２種以上の一本鎖核酸を増幅する工程と、
（ｃ’）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（ｄ’）前記工程（ａ’）において得られた一本鎖核酸、前記上流側プローブ、及び前記下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（ｅ’）前記工程（ｄ’）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（ｆ’）前記工程（ｅ’）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（ｇ’）前記工程（ｆ’）の後に、前記工程（ｅ’）において連結されたプローブを検出する工程と、
（ｈ’）前記工程（ｇ’）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、
を有することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項５４】
前記工程（ａ’）が、
（ａ’１）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１段階又は多段階のＰＣＲを行い、核酸を増幅する工程と、
（ａ’２）前記工程（ａ’１）において増幅された核酸を鋳型とし、非対称ＰＣＲを行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上の核酸を増幅する工程と、
を有する工程であることを特徴とする請求項５３記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項５５】
前記工程（ａ’）が、
（ａ’３）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、ＰＣＲと非対称ＰＣＲを同時に行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上の核酸を増幅する工程、
であることを特徴とする請求項５３記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項５６】
前記工程（ａ’）が、
（ａ’４）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得る３種類のプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上のループ状構造を有する核酸を増幅する工程、
であり、
前記３種類のプライマーが、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の５’側末端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の３’側末端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーと、３’末端側に前記フォワードプライマーよりも３’側であって、標的ヌクレオチド配列よりも５’側にある領域と相同的なヌクレオチド配列を有するループ形成用プライマーとであり、
前記ループ形成用プライマーの５’末端には、当該プライマーを起点としてＰＣＲにより伸長されるヌクレオチド配列領域のうち、標的ヌクレオチド配列よりも３’末端側であり、かつ前記リバースプライマーと相補的なヌクレオチド配列よりも５’末端側にあるヌクレオチド配列領域と、ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が付加されていることを特徴とする請求項５３記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項５７】
核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、
（１）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（２）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを準備する工程と、
（３）前記核酸サンプル、前記工程（１）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブ、前記工程（２）において準備したプライマー、並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有する反応溶液を調製する工程と、
（４）前記工程（３）において調製した反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、
（５）前記工程（４）において得られた一本鎖核酸を鋳型として、前記プライマー用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程と、
（６）前記工程（５）の後、反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、
（７）前記工程（６）において得られた一本鎖核酸に対して、反応溶液中の上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（８）前記工程（７）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（９）前記工程（８）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（１０）前記工程（９）の後に、前記工程（８）において連結されたプローブを検出する工程と、
（１１）前記工程（１０）の後、前記工程（４）〜（１０）を繰り返す工程と、
を有し、
前記工程（１０）及び（１１）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項１】
核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、
（ａ）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより、１種又は２種以上の二本鎖核酸を増幅する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、
（ｃ）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（ｄ）前記工程（ｂ）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（ｅ）前記工程（ｄ）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（ｆ）前記工程（ｅ）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（ｇ）前記工程（ｆ）の後に、前記工程（ｅ）において連結されたプローブを検出する工程と、
（ｈ）前記工程（ｇ）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、
を有することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項２】
前記工程（ａ）におけるＰＣＲが、多段階ＰＣＲであることを特徴とする、請求項１記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項３】
前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする請求項１又は２記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項４】
前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、６〜１００分子連結したものであることを特徴とする請求項１又は２記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項５】
前記光応答性物質は、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項６】
前記光応答性物質は、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル基、フェニルトリアゾールビニル基、メトキシフェニルトリアゾールビニル基、シアノフェニルトリアゾールビニル基、及びナフチルトリアゾールビニル基からなる群より選択される１以上を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項７】
前記工程（ｅ）において照射される光が、紫外光であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項８】
前記工程（ｅ）において照射される光が、３２０〜４００ｎｍの波長の光の照射であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項９】
前記上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記工程（ｅ）において、前記複合体を形成するプローブのＴｍ値以下の温度において光を照射することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記工程（ｅ）において、前記複合体を形成するプローブのＴｍ値−５℃以上Ｔｍ値以下の温度において光を照射することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記上流側プローブの３’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１５】
前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１６】
前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基が、ホスホロチオエート化されていることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１７】
前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブが、標識分子により標識されていることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１８】
前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とが、異なる種類の発色基分子であり、
前記工程（ｇ）における連結されたプローブの検出が、前記上流側プローブを標識する標識分子と前記下流側プローブを標識する標識分子のうち、いずれか一方をドナー分子とし、他方をアクセプター分子とする蛍光共鳴エネルギー転移による、蛍光の発光又は消光の検出であることを特徴とする請求項１７記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項１９】
前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子であり、
前記工程（ｇ）における連結されたプローブの検出が、前記発色基分子の消光の検出であることを特徴とする請求項１７記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２０】
前記ドナー分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）４８８又はＡＴＴＯ ４８８であり、前記アクセプター分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることを特徴とする請求項１８記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２１】
前記発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、前記発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることを特徴とする請求項１９記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２２】
前記標識分子が、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることを特徴とする請求項１７〜２１のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２３】
前記上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、前記下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることを特徴とする請求項１７〜２１のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２４】
前記ＰＣＲに用いられるプライマーが、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２５】
前記ＰＣＲに用いられるプライマーが、ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログからなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、１０〜１００分子連結したものであることを特徴とする請求項１〜２３のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２６】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に熱エネルギーを加えることにより行うことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２７】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸を８０〜１０５℃に加熱することにより行うことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２８】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒド、及び尿素からなる群より選択される１以上の化学物質を添加することにより行うことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項２９】
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）において得られた二本鎖核酸の一本鎖化を、前記二本鎖核酸に、標的ヌクレオチド配列を有する一本鎖核酸を添加することにより行うことを特徴とする請求項１〜２５のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項３０】
前記工程（ｆ）において、前記複合体を３７〜１０５℃に加熱することにより、一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させることを特徴とする請求項１〜２９のいずれか記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項３１】
１又は２以上の、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出するためのプローブのセットであって、
標的ヌクレオチド配列の種類ごとに下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを有することを特徴とするプローブセット。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項３２】
前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により連結したものであることを特徴とする請求項３１記載のプローブセット。
【請求項３３】
前記上流側プローブ及び前記下流側プローブが、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、及びこれらの修飾体からなる群より選択される１以上がリン酸ジエステル結合により、６〜１００分子連結したものであることを特徴とする請求項３１記載のプローブセット。
【請求項３４】
前記光応答性物質は、光反応官能基として、光照射によって開裂する共役二重結合部位を有することを特徴とする請求項３１〜３３のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３５】
前記光応答性物質は、カルボキシビニル基、ビニル基、ベンジルトリアゾールビニル基、フェニルトリアゾールビニル基、メトキシフェニルトリアゾールビニル基、シアノフェニルトリアゾールビニル基、及びナフチルトリアゾールビニル基からなる群より選択される１以上を有することを特徴とする請求項３１〜３３のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３６】
前記上流側プローブの５’末端が光応答性物質により修飾されていることを特徴とする請求項３１〜３５のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３７】
前記上流側プローブの５’末端が、カルボキシビニル基により修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする請求項３１〜３５のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３８】
前記上流側プローブの３’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が、アミノ基により修飾されたヌクレオチド、リン酸基により修飾されたヌクレオチド、及びダイデオキシヌクレオチドからなる群より選択される１であることを特徴とする請求項３１〜３７のいずれか記載のプローブセット。
【請求項３９】
前記上流側プローブの５’末端又は前記下流側プローブの５’末端が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害物質により修飾されていることを特徴とする請求項３１〜３８のいずれか記載のプローブセット。
【請求項４０】
前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの５’末端が、メチル基により２−Ｏ−メチル化修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログであることを特徴とする請求項３１〜３８のいずれか記載のプローブセット。
【請求項４１】
前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端と５’末端から２番目のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを連結するリン酸ジエステル結合中のリン酸基が、ホスホロチオエート化されていることを特徴とする請求項３１〜３８のいずれか記載のプローブセット。
【請求項４２】
前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブが、標識分子により標識されていることを特徴とする請求項３１〜４１のいずれか記載のプローブセット。
【請求項４３】
前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とが、異なる種類の発色基分子であることを特徴とする請求項４２記載のプローブセット。
【請求項４４】
前記上流側プローブを標識する標識分子と、前記下流側プローブを標識する標識分子とのうち、いずれか一方が発色基分子、他方が発色抑制分子であることを特徴とする請求項４２記載のプローブセット。
【請求項４５】
前記上流側プローブを標識する標識分子と前記下流側プローブを標識する標識分子のいずれか一方がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）４８８又はＡＴＴＯ ４８８であり、他方がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４又はＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）であることを特徴とする請求項４３記載のプローブセット。
【請求項４６】
前記発色基分子がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＡＴＴＯ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１であり、前記発色抑制分子がＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２であることを特徴とする請求項４４記載のプローブセット。
【請求項４７】
前記標識分子が、前記上流側プローブ及び／又は前記下流側プローブの、５’末端又は３’末端から１９分子以内のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログに標識されていることを特徴とする請求項４２〜４６のいずれか記載プローブセット。
【請求項４８】
前記上流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから５’末端までの分子数と、前記下流側プローブにおける標識分子により標識されているヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから３’末端までの分子数との和が２０以下であることを特徴とする請求項４２〜４６のいずれか記載プローブセット。
【請求項４９】
標的ヌクレオチド配列に、１又は２以上のヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失からなるミスマッチ部位を有する非標的ヌクレオチド配列を有する核酸と、標的ヌクレオチド配列を有する核酸とを識別する方法であって、
（ａ”）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、二本鎖核酸を増幅する工程と、
（ｂ”）前記工程（ａ”）において得られた二本鎖核酸を一本鎖化し、一本鎖核酸を得る工程と、
（ｃ”）下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（ｄ”）前記工程（ｂ”）において得られた一本鎖核酸に対して、前記工程（ｃ”）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（ｅ”）前記工程（ｄ”）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（ｆ”）前記工程（ｅ”）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（ｇ”）前記工程（ｆ”）の後に、前記工程（ｅ”）において連結されたプローブを検出する工程と、
（ｈ”）前記工程（ｇ”）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記非標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていると判断する工程と、
を有することを特徴とする、核酸の識別方法。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項５０】
前記ミスマッチ部位が、前記上流側標的ヌクレオチド配列の３’末端から１０分子以内又は前記下流側標的ヌクレオチド配列の５’末端から１０分子以内にあることを特徴とする請求項４９記載の核酸の識別方法。
【請求項５１】
前記ミスマッチ部位は、１又は２箇所以上の、１のヌクレオチド又は２以上の連続したヌクレオチドが、置換、挿入、又は欠失していることを特徴とする請求項４９又は５０記載の核酸の識別方法。
【請求項５２】
前記標的ヌクレオチド配列が遺伝子多型のうちの一多型に相同的なヌクレオチド配列であり、前記非標的ヌクレオチド配列が前記遺伝子多型の他の一多型に相同的なヌクレオチド配列であり、前記ミスマッチ部位が前記遺伝子多型の多型部位であり、前記工程（ｈ”）が、
（ｈ”２）前記工程（ｇ”）において検出された連結されたプローブ量に基づき、前記核酸サンプル中の核酸が、前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのホモ接合体、及び前記標的ヌクレオチド配列を有するアレルと前記非標的ヌクレオチド配列を有するアレルのヘテロ接合体のいずれであるかを識別する工程、
であることを特徴とする請求項４９〜５１のいずれか記載の核酸の識別方法。
【請求項５３】
核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、
（ａ’）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを用いて、非対称ＰＣＲ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより、１種又は２種以上の一本鎖核酸を増幅する工程と、
（ｃ’）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（ｄ’）前記工程（ａ’）において得られた一本鎖核酸、前記上流側プローブ、及び前記下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（ｅ’）前記工程（ｄ’）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（ｆ’）前記工程（ｅ’）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（ｇ’）前記工程（ｆ’）の後に、前記工程（ｅ’）において連結されたプローブを検出する工程と、
（ｈ’）前記工程（ｇ’）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断する工程と、
を有することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【請求項５４】
前記工程（ａ’）が、
（ａ’１）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１段階又は多段階のＰＣＲを行い、核酸を増幅する工程と、
（ａ’２）前記工程（ａ’１）において増幅された核酸を鋳型とし、非対称ＰＣＲを行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上の核酸を増幅する工程と、
を有する工程であることを特徴とする請求項５３記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項５５】
前記工程（ａ’）が、
（ａ’３）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、ＰＣＲと非対称ＰＣＲを同時に行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上の核酸を増幅する工程、
であることを特徴とする請求項５３記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項５６】
前記工程（ａ’）が、
（ａ’４）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得る３種類のプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含む領域が一本鎖核酸である１種又は２種以上のループ状構造を有する核酸を増幅する工程、
であり、
前記３種類のプライマーが、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の５’側末端領域と相同的なヌクレオチド配列を有するフォワードプライマーと、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の３’側末端領域と相補的なヌクレオチド配列を有するリバースプライマーと、３’末端側に前記フォワードプライマーよりも３’側であって、標的ヌクレオチド配列よりも５’側にある領域と相同的なヌクレオチド配列を有するループ形成用プライマーとであり、
前記ループ形成用プライマーの５’末端には、当該プライマーを起点としてＰＣＲにより伸長されるヌクレオチド配列領域のうち、標的ヌクレオチド配列よりも３’末端側であり、かつ前記リバースプライマーと相補的なヌクレオチド配列よりも５’末端側にあるヌクレオチド配列領域と、ハイブリダイズし得るヌクレオチド配列が付加されていることを特徴とする請求項５３記載の標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
【請求項５７】
核酸サンプル中の１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を有する核酸を検出する方法であって、
（１）標的ヌクレオチド配列ごとに、下記の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を充足する上流側プローブ及び下流側プローブを準備する工程と、
（２）核酸サンプル中の核酸を鋳型とし、１又は２以上の標的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を増幅し得るプライマーを準備する工程と、
（３）前記核酸サンプル、前記工程（１）において準備した上流側プローブ及び下流側プローブ、前記工程（２）において準備したプライマー、並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを有する反応溶液を調製する工程と、
（４）前記工程（３）において調製した反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、
（５）前記工程（４）において得られた一本鎖核酸を鋳型として、前記プライマー用いて、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を行う工程と、
（６）前記工程（５）の後、反応溶液中の二本鎖核酸を、一本鎖核酸に変性させる工程と、
（７）前記工程（６）において得られた一本鎖核酸に対して、反応溶液中の上流側プローブ及び下流側プローブをハイブリダイズさせることにより、一本鎖核酸とプローブとの複合体を形成する工程と、
（８）前記工程（７）により形成された複合体に光を照射する工程と、
（９）前記工程（８）の後に、前記複合体中の一本鎖核酸を、前記上流側プローブ、前記下流側プローブ、及びこれらが連結されたプローブから解離させる工程と、
（１０）前記工程（９）の後に、前記工程（８）において連結されたプローブを検出する工程と、
（１１）前記工程（１０）の後、前記工程（４）〜（１０）を繰り返す工程と、
を有し、
前記工程（１０）及び（１１）において、連結されたプローブが検出された場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されており、連結されたプローブが検出されなかった場合には、前記核酸サンプル中に前記標的ヌクレオチド配列を有する核酸が含有されていないと判断することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列を有する核酸の検出方法。
（Ｉ）標的ヌクレオチド配列を上流側標的ヌクレオチド配列と下流側標的ヌクレオチド配列に２分割し、前記上流側プローブは、前記上流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであり、前記下流側プローブは、前記下流側標的ヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリダイズし得るプローブであること。
（ＩＩ）前記上流側プローブ及び前記下流側プローブは、３’末端がＰＣＲ阻害物質により修飾されていること。
（ＩＩＩ）前記上流側プローブの５’末端及び／又は前記下流側プローブの３’末端が光応答性物質により修飾されていること。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【公開番号】特開２００９−２１３４４５（Ｐ２００９−２１３４４５Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６３２４７（Ｐ２００８−６３２４７）
【出願日】平成２０年３月１２日（２００８．３．１２）
【出願人】（０００００３１９３）凸版印刷株式会社 (10,630)
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１２日（２００８．３．１２）
【出願人】（０００００３１９３）凸版印刷株式会社 (10,630)
【出願人】（３０４０２４４３０）国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 (169)
【Ｆターム（参考）】
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