標的物質の定量方法
【課題】複数種類の生物種の生体関連物質が含まれている２以上の試料中の標的物質量を定量する場合において、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し、試料間の標的物質量の比をより正確に求めることができる標的物質の定量方法の提供。
【解決手段】２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、を有することを特徴とする、標的物質の定量方法。
【解決手段】２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、を有することを特徴とする、標的物質の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種類の生物種の生体関連物質が含まれている２以上の試料中の標的物質量を定量する場合において、試料間の標的物質量の比をより正確に求めることができる標的物質の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析は、近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、医療、学術研究、産業等の多くの分野において広く応用されている。遺伝子解析は、通常、試料中に、解析対象である標的遺伝子と相同的な塩基配列を有する核酸が存在するか否かを検出することにより行われるが、臨床検査における検体等のように、検体が微量である場合や試料中の核酸濃度が非常に低い場合には、解析対象となる標的塩基配列を有する核酸を増幅して解析を行うことが多い。このような核酸の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。例えば、遺伝病、疾病感受性、癌等の診断において、異常細胞特異的なｍＲＮＡ等の標的核酸をＰＣＲ増幅して検出する方法が、広く用いられている。
【０００３】
特に、近年、糞便、唾液や血液等の体液、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等の生体試料中に含まれる核酸を回収し、各試料間の核酸の特徴を比較することによって、癌や、細菌（原核生物）・ウィルス・寄生虫等による感染症等の疾患を診断することが行われている。例えば、薬剤に対する応答反応として、チミジル酸シンターゼのｍＲＮＡの発現量が増大することを利用して、癌細胞における薬剤耐性の獲得の有無を調べるために、患者から採取した癌細胞に抗癌剤を投与した後、定量的ＰＣＲを行うことによりチミジル酸シンターゼのｍＲＮＡの発現量を測定し、抗癌剤投与前後における該発現量を相対的に比較する方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、口腔癌患者と健常人の唾液からそれぞれＲＮＡを回収し、その中のｍＲＮＡの発現プロファイルを、マイクロアレイを用いて比較することにより、口腔癌の早期発見を行う試みがなされている。その他、感染症の発見・診断を行うために、糞便等の生体試料からＲＮＡウィルスを定量的に検出し、感染症が疑われる患者のものと健常人のものとを比較することも行われている。
【０００４】
このような生体試料には、核酸、タンパク質、脂質、ビタミン類等の低分子化合物等の多種多様な生体関連物質が含まれている。このため、生体試料を用いた核酸解析においては、予め、該生体試料から核酸を回収する場合が多い。一方で、多くの生体試料には、該生体試料が採取された対象である動物以外にも、細菌やウィルスといった様々な生物及び該生物由来の生体関連物質も含まれている。このため、例えば、ヒトから採取された生体試料から、生物種ごとに分離することなく核酸を回収した場合には、ヒト由来の核酸と、細菌やウィルスのようなヒト以外の生物種由来の核酸とが混合された状態で回収される。特に、糞便や唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等には細菌が多く存在するため、これらの生体試料から回収された核酸には、圧倒的に細菌由来の成分が多く含まれており、ヒト由来の生体関連物質は非常に少量である場合が多い。
【０００５】
核酸解析においては、他の解析・検出方法と同様に、解析対象である試料中の標的核酸の濃度（存在量）が非常に重要である。このため、ヒト由来の標的核酸が等量含まれている２の試料のうち、一方の試料には細菌由来の核酸が比較的少量含まれており、他方の試料中には非常に大量に含まれている場合には、前者の試料からは標的核酸を検出することができ、後者の試料からは検出することができない、という問題が生じてしまう。また、細菌を多く含む試料中には、細菌由来の分解酵素等も大量に存在する。このため、試料中の核酸がこれらの分解酵素の影響を受けて損なわれやすく、試料間のバラツキが大きくなりやすいという問題もある。特に、ヒト等の動物から剥離された上皮細胞や該上皮細胞由来の生体関連物質は、細菌や細菌の分解酵素等から身を守る術に乏しく、より影響を受けやすい。
【０００６】
このため、大量の細菌を含む糞便等の試料のように、複数の生物種が存在し、互いに影響を及ぼしている試料では、初期試料の量、すなわち、解析に用いる試料の重量や容量を規定し、該試料の単位あたりの標的物質を測定した場合であっても、試料の採取や保管状況、解析までに要する時間、解析作業等によって影響され、試料ごとの結果のバラツキが非常に大きくなることが懸念される。特に、標的物質が分解されやすい核酸、特にＲＮＡである場合には、試料中の分解されていないＲＮＡ分子のコピー数を揃えて解析しなければ、試料間のバラツキを抑えることは困難である。しかしながら、核酸の定量は、通常は核酸の吸光度値を元に推測されており、また吸光度値は分解の度合いを示すものではないため、単に吸光度値に基づき核酸量を規定したとしても、分解されていないＲＮＡ分子のコピー数を揃えることは困難である。
【０００７】
試料中の標的物質を定量する場合に、試料ごとの結果のバラツキを抑えるために、例えば、既知濃度の物質を内部標準品として添加して測定を行うことがある。これにより、添加した内部標準品の測定値から、標的物質量を算出することができるため、測定操作による影響を排除し得るばかりではなく、標的物質の絶対量を得ることができる。しかしながら、該方法は、比較的均質な試料であって安定性の高い標的物質を定量する場合には有効であるものの、試料の採取や保管状況等による影響を排除することはできず、細菌を多く含む試料を用いた場合に信頼に足る定量結果を得ることは困難である。
【０００８】
試料間の標的物質量を比較する場合に、試料の初期品質の相違や試料の調製方法等による影響を排除し、より信頼性の高い定量結果を得るために、全ての試料にほぼ同量含まれていることが期待できる標的物質以外の物質を標準物質とし、該標準物質により測定値をノーマライズする、すなわち、該標準物質の測定値に基づき標的物質の測定値を補正することがある。標的物質が核酸であり、試料間の標的核酸量を比較する方法として、例えば、（１）標的核酸がある特定の遺伝子由来のｍＲＮＡであり、複数の試料間の標的核酸量を比較する場合に、各試料中のＲＮＡ量を、ハウスキーピング遺伝子由来のｍＲＮＡ量によりノーマライズさせて解析する方法が開示されている（例えば、非特許文献２参照。）。ハウスキーピング遺伝子は、個々の生理状態とは無関係に全ての細胞で構成的に発現しており、そのｍＲＮＡは全ての細胞にほぼ同じ量で存在すると考えられる。例えば、癌組織から得られたＲＮＡと正常組織から得られたＲＮＡの間で、標的ＲＮＡの発現量の差を見る場合、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ、ｒＲＮＡ等のヒト遺伝子由来のＲＮＡを標準ＲＮＡとすると、各試料中の総ＲＮＡ量に対する標準ＲＮＡ量の比はほぼ一致すると考えられるため、癌組織から検出された標準ＲＮＡの総量と、正常組織から検出された標準ＲＮＡの総量から、各試料中の総ＲＮＡ量の比を推定し、該推定に基づき検出された標的ＲＮＡ量を補正することにより、より確からしい定量結果を得ることができる。その他、（２）ノーマライズに複数の標準物質を用いる方法等も開示されている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００９】
上記（１）及び（２）の方法では、ヒトの特定の遺伝子由来の核酸を標的物質として定量する場合に、測定値をノーマライズするために、ハウスキーピング遺伝子等のヒト由来の核酸を標準物質として用いている。このように、標準物質として標的物質と同じ生物種・同じ分子種の生体関連物質を用いることにより、試料の採取や保管状況、調製方法等による影響を効果的に排除し得ると考えられる。
【非特許文献１】Kashani-Sabet, et al.、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８８年、第４８巻、第５７７５〜５７７８ページ。
【非特許文献２】Bustin、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２０００年、第２５巻、第１６９〜１９３ページ。
【非特許文献３】Vandesompele, et al.、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第３巻、第７号、ｒｅｓｅａｒｃｈ００３４．１〜１１。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
各組織からそれぞれ採取された試料間の比較等、比較的類似した試料間での比較に用いられる場合には、上記（１）及び（２）の方法によっても、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し得ることが期待できる。しかしながら、試料中に元々少数しか存在していない生物種由来の標的物質を定量する場合には、標準物質を標的物質と同じ生物種の生体関連物質とした場合には、標準物質自体が検出されない場合が多いという問題がある。この場合には、そもそも標準物質として機能することはできず、例え標的物質が検出されていたとしても補正することができず、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることはできない。
【００１１】
例えば、ヒト口腔細胞において、癌化により特定の遺伝子（標的遺伝子）の発現量が亢進されるという知見に基づき、標的遺伝子の発現量が一定値以上である場合に陽性（癌）と判断する場合であって、標準遺伝子としてヒトハウスキーピング遺伝子を用いた場合には、唾液から直接核酸を抽出し、唾液中に含まれている標的遺伝子由来核酸量を測定したとしても、同時に測定した標準遺伝子由来核酸が検出されないことによって、標的遺伝子由来核酸量の検出結果の信頼性や定量性に問題が生じ、癌の診断ができないおそれがある。
【００１２】
本発明は、複数種類の生物種の生体関連物質が含まれている２以上の試料中の標的物質量を定量する場合において、標的物質が比較的少量存在する生物種の生体関連物質である場合であっても、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し、試料間の標的物質量の比をより正確に求めることができる標的物質の定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質である場合であっても、標準物質として、標的物質と同一生物種由来の生体関連物質ではなく、細菌等の該試料中に大量に存在する標的物質とは異なる生物種の生体関連物質を用いることにより、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し得るため、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明は、２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、を有することを特徴とする標的物質の定量方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の標的物質の定量方法により、大量の細菌が存在する試料に含まれている細菌以外の生物種の生体関連物質を標的物質として定量する場合のように、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質であっても、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。標的物質と同一生物種の生体関連物質ではなく、異なる生物種由来の生体関連物質を標準物質とすることにより、標準物質が検出されない等の標準物質が機能できない事態の発生を防止しつつ、試料の採取から保存、試料からの生体関連物質の抽出等の一連の工程の影響を加味し、ノーマライズすることができる。このため、本発明の標的物質の定量方法は、糞便試料中の哺乳細胞由来の核酸を定量する場合等、標的物質が、共存する生物種に比べて圧倒的に少量しか試料中に存在していない生物種の生体関連物質であり、試料中に検出限界ギリギリの量しか含まれていない場合に、特に有効である。従来は、試料中に検出限界量程度しか含まれていない標的物質の量を試料間で比較する場合には、該生体試料から生物種ごとに分離して生体関連物質を回収する等の、標的物質を濃縮する工程が必要とされたが、本発明の標的物質の定量方法を用いることにより、信頼性の高い各試料の標的物質量比を、より簡便に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の標的物質の定量方法は、２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、を有することを特徴とする。以下、より詳細に説明する。
【００１７】
本発明において試料とは、生物種の異なる２以上の生体関連物質を含むものである。生物から採取された試料（生体試料）であってもよく、培養細胞等から調製された試料であってもよい。本発明の標的物質の定量方法の対象となる試料としては、臨床検体等の生体試料であることが好ましい。生体試料が採取される生物は、特に限定されるものではないが、真核生物であることが好ましく、動物であることがより好ましく、哺乳類であることがさらに好ましく、ヒトであることが特に好ましい。該生体試料として、例えば、糞便、唾液や血液等の体液、喀痰、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等がある。特に、該生体試料を採取された生物以外の種類の生物の生体関連物質、例えば原核生物やウィルス等の微生物の生体関連物質を含む生体試料であることが好ましく、真正細菌等の原核生物の生体関連物質をより多く含む生体試料であることが特に好ましい。このような細菌等を多く含む生体試料として、例えば、糞便、唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等がある。
【００１８】
本発明において生体関連物質とは、生体に関連する物質であり、具体的には、核酸、タンパク質、ビタミン類やホルモン類等の低分子化合物、糖類、脂質類等である。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。タンパク質は、アミノ酸のみからなるタンパク質であってもよく、糖タンパク質やリポタンパク質等のアミノ酸以外の物質を含むものであってもよい。
【００１９】
本発明において標的物質とは、試料中に含まれている量を定量する対象である。本発明における標的物質としては、各試料に比較的少量含まれている生物種の生体関連物質であることが好ましい。このような生体関連物質は、試料中に大量に存在する生体関連物質よりも、試料の初期品質の相違や試料の調製方法等による影響を受けやすいため、本発明の標的物質の定量方法により好適である。特に、本発明における標的物質としては、試料に比較的少量含まれている生物種の、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸であることが好ましい。
【００２０】
本発明において標準物質とは、各試料中の標的物質量の測定値を補正するための標準とする物質であり、試料中に含まれている標的物質とは異なる生物種の生体関連物質である。標準物質は、各試料に比較的大量に含まれている生物種の生体関連物質であることが好ましい。各試料に一定の割合以上含まれている生物種の生体関連物質であれば、試料の採取等の条件による初期試料の品質のバラツキを抑えられること、及び、各試料にほぼ確実に検出限界量以上含まれていること等が、期待できるためである。すなわち、各試料には、前記標的物質よりも、前記標準物質が多く含まれていることが好ましい。
【００２１】
標準物質と標的物質とは、生物種が異なっていればよく、同種類の生体関連物質であってもよく、異なる種類の生体関連物質であってもよい。例えば、標的物質がＲＮＡである場合に、標準物質はＲＮＡであってもよく、ＤＮＡであってもよく、タンパク質であってもよい。
【００２２】
生物種ごとに区別した解析が比較的容易であること、解析手法が汎用されていること等から、本発明における標準物質としては、核酸であることが好ましい。このような標準物質として、例えば、各試料に比較的大量に含まれている生物種のｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、リボゾーム関連タンパク質やＲＮＡポリメラーゼ、ハウスキーピング遺伝子等のｍＲＮＡやＤＮＡ等がある。標的物質の種類や量に応じて、適当な発現量を有する遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として用いることにより、より適正にノーマライズし得ることが期待できる。このため、標準物質としては、低発現の遺伝子から高発現の遺伝子まで、様々な発現量を有する遺伝子のｍＲＮＡを揃えておくことが好ましい。
【００２３】
標準物質として用いる生体関連物質は、一種類であってもよく、複数種類であってもよい。例えば、一遺伝子のｍＲＮＡやＤＮＡを用いてもよく、複数種類の遺伝子のｍＲＮＡやＤＮＡを用いてもよい。より具体的には、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを用いてもよく、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡとＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のｍＲＮＡとを組み合わせて用いてもよい。複数種類の生体関連物質を標準物質として用いる場合には、用いる複数種類の生体関連物質が、互いに生物種の異なるホモログ遺伝子であることがより好ましい。例えば、複数種類の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを標準物質として用いることができる。
【００２４】
また、標準物質として複数種類の生体関連物質を用いる場合、複数種類の生体関連物質を一括で定量した結果を補正に用いてもよく、それぞれの生体関連物質の定量結果の平均を補正に用いてもよい。より具体的には、複数種類の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの総量を標準物質量としてもよく、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ量の平均値を標準物質量としてもよい。
【００２５】
本発明の標的物質の定量方法は、まず、工程（ａ）として、各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める。各試料中の標準物質量の比は、例えば、一の試料中の標準物質量を１．０とした場合の、他の試料中の標準物質量の比をそれぞれ算出することにより求めることができる。このようにして得られた各試料中の標準物質量の比を、本願明細書においては、補正係数という。
【００２６】
各試料中の標準物質量は、該標準物質と同一種類の生体関連物質の定量に通常用いられている方法により定量することができる。このような定量方法として、例えば、定量的核酸増幅法、ハイブリダイゼーション法、免疫凝集法、ＥＬＩＳＡ法、吸光度測定法等がある。定量対象である標準物質が核酸である場合には、試料中に微量に存在する核酸を容易に検出し定量することが可能であるため、定量的核酸増幅法を用いて測定することが好ましい。該定量的核酸増幅法として、例えば、リアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法等がある。また、特異的な検出が比較的簡便に行えることから、プローブ等を用いたハイブリダイゼーション法を用いることも好ましい。このような方法として、例えば、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法等があり、なかでもＴａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法を用いることが好ましい。標準物質がＲＮＡである場合には、逆転写反応により得られたｃＤＮＡに対して定量的ＰＣＲを行うことができる。
【００２７】
また、標準物質として、複数種類の細菌のそれぞれの１６Ｓ ｒＲＮＡ量の総和を標準物質量とする場合には、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡごとに特異的なプライマーを用いて、個別にＰＣＲを行い、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量をそれぞれ定量した後に総和量を算出してもよく、マルチプレックスＰＣＲを行うことにより、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量をまとめて定量してもよい。その他、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡに共通するプライマーを用いて、一のＰＣＲを行うことにより、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを同時に増幅してまとめて定量してもよい。
【００２８】
次に工程（ｂ）として、各試料中の標的物質量を測定する。各試料中の標的物質量は、標準物質量の測定法において挙げられた方法を用いて測定することができる。
【００２９】
その後、工程（ｃ）として、工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する。具体的には、工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で算出した補正係数で除する。該補正係数を用いて補正することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られる。
【００３０】
図１は、本発明の標的物質の定量方法の対象となる試料の一態様の模式図である。（ａ）と（ｂ）は、それぞれヒトの同一の糞便から等重量ずつ異なる部位から採取した試料の模式図である。図中、○は細菌の核酸、△はヒト大腸剥離細胞の核酸、●は食物残渣や分解された核酸等のデブリスを表している。試料（ａ）には、細菌の核酸が２０、ヒトの核酸が２、デブリスが０、それぞれ存在しており、試料（ｂ）には、細菌の核酸が５、ヒトの核酸が１、デブリスが多数、それぞれ存在している。従来法通りに、ヒトの核酸量を、重量当たりの量を定量した場合には、試料（ｂ）には試料（ａ）の１／２倍量のヒトの核酸が存在しているという結果となる。一方で、細菌のｒＲＮＡ遺伝子を標準物質として定量した場合には、試料（ａ）中の細菌の核酸量を１．０とした場合の試料（ｂ）の補正係数は０．２５であり、該補正係数を用いて補正すると、試料（ｂ）中のヒトの核酸量は４となり、試料（ｂ）には試料（ａ）の２倍量のヒトの核酸が存在しているという結果が得られる。このように、本発明の標的物質の定量方法を用いることにより、試料の採取から解析までの一連の操作の影響による試料間のバラツキを防止して、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。
【００３１】
糞便中に含まれているヒト等の真核生物の細胞や生体関連物質として、主に、大腸剥離細胞等の消化管上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。このような糞便中に含まれているヒト細胞やヒトの生体関連物質等を検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、大腸癌や炎症性大腸疾患等の診断を行うことが試みられている。また、糞便中のウィルスやウィルスの生体関連物質等を検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、感染症等の診断も試みられている。その他、糞便中に含まれている真核生物として寄生虫等があり、これらを同様に検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、寄生虫の有無の判定をすることも可能である。一方で、糞便は、その半分以上は細菌から構成されていると言われるほど大量の細菌を含んでおり、真核生物やウィルスの細胞や生体関連物質等はごく少量しか含まれてはいない。そこで、糞便を試料とし、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて標的物質である真核生物やウィルスの生体関連物質を定量することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。特に、標的物質がヒトの生体関連物質であり、標準物質が真正細菌の生体関連物質であることがより好ましい。
【００３２】
例えば、糞便中に多く存在する、大腸菌、大腸菌群、腸球菌、乳酸菌等の腸内細菌の全種類又はその大部分が共通して有する遺伝子（ホモログ遺伝子）又はその一部を標準物質とすることにより、糞便中の大多数の細菌の核酸を、全体的にノーマライズすることが可能である。また、特定の一種類又は数種類の細菌の遺伝子を標準物質として、ノーマライズしてもよい。その他、試料からＤＮＡとＲＮＡを一括で回収し、そのうちの一部で、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の標的ＲＮＡの定量検出を行い、残りの一部に存在するＤＮＡを標準物質としてノーマライズすることもできる。ＤＮＡを標準物質として用いる場合、遺伝子のコピー数は数個から数十個になるため、標的物質が低発現のｍＲＮＡである場合等のノーマライズに好適に用いることができる。
【００３３】
唾液や口腔粘膜に含まれているヒト等の真核生物の細胞や生体関連物質として、主に、口腔内の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。また、喀痰に含まれている真核生物の細胞等として、主に、口腔や気管内の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等があり、子宮粘膜に含まれている真核生物の細胞等として、主に、子宮内膜の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。これらの生体試料中の真核細胞等を検出・定量することにより、各組織の癌や炎症等の疾患の診断をすることができる。また、口腔や気管、子宮は生体外部と直接接する組織であり、これらの生体試料中にウィルスが含まれているか否かにより、ウィルス感染の有無を診断することもできる。一方で、これらの生体試料中には、通常、糞便と同様に細菌が大量に存在している。このため、唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等を試料とし、これらの試料中の標的物質である真核生物やウィルスの生体関連物質の量を、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて定量することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。標準物質として用いる原核生物の生体関連物質は、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡやハウスキーピング遺伝子等であることが好ましい。その他、標準物質として、原核生物以外の真核生物を用いてもよい。
【００３４】
本発明の定量方法は、糞便等の原核生物を多く含む生体試料中の癌等の疾患マーカーを定量する場合に、特に有効である。標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いてノーマライズすることにより、健常者由来の試料と患者由来の試料のそれぞれに含まれている疾患マーカー（標的物質）量の比をより正確に求めることができるため、疾患の診断の信頼性を向上し得ることが期待できる。特に、標的物質を癌マーカーとし、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて癌マーカーを定量することが好ましい。癌診断においては、他の疾患にも増して高い正確性が要求されるが、本発明の定量方法により定量された癌マーカー量に基づき診断することにより、癌診断の精度（特異度）を改善し得ることが期待できる。なお、癌マーカーとは、癌検出の指標となり得る生体関連物質であれば特に限定されるものではなく、公知の癌マーカーを用いることができる。
【００３５】
このように、試料中の標的物質量を、標的物質とは異なる生物種の生体関連物質を標準物質として補正するという考え方は、標的物質が核酸以外の生体関連物質である場合、例えば、タンパク質が標的物質である場合にも何ら変わりはない。したがって、本発明の定量方法は、タンパク質の発現解析等にも応用することができる。例えば、糞便中の癌細胞由来のタンパク質を検出する場合、糞便中の細菌のリボゾームタンパク質を標準物質とし、ＣＥＡやＣＡ１９−９、ＣＤ４４等の定量を行うことができる。なお、タンパク質の検出や定量は、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、糞便中の癌細胞由来のタンパク質の検出は、国際公開第１９９６／００８５１４号パンフレット等で開示されているヒト結腸癌腫関連抗原に対するモノクローナル抗体を用いて検出することもできる。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、培養細胞であるＭＫＮ４５細胞は、常法により培養した。
【００３７】
［実施例１］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一試料を小分けし、糞便試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。具体的には、配列番号１の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と、配列番号２の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１を用いて定量的ＰＣＲを行った。
まず、健常人の糞便を、採便後速やかに５ｍＬチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。糞便は一人由来のものを１０個分に分取した。その後、グアニジン塩とフェノールを添加し、ホモジナイザーを用いてホモジナイズした後、クロロホルムとエタノールを用いて全ＲＮＡを抽出した。該ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数（ｍＲＮＡ量）を定量した。具体的には、抽出したＲＮＡの一部をリバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μＬ、和光純薬）とランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。さらに、１μＬの該ｃＤＮＡ溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と、１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１をそれぞれ最終濃度が９００ｎｍｏｌとなるように添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの熱サイクルは、９５℃１０分間の変性サイクルの後、９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間を４５サイクルの条件で行った。定量は、濃度既知のスタンダードプラスミドによる希釈系列を鋳型として得られた蛍光強度の結果に基づいて行った。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料１−１〜１０は、同一の糞便から等量採取した試料であるにもかかわらず、１ｇの糞便中のｒＲＮＡ量は、最大で２．３倍の開きが見られた。
【００４０】
＜標的物質の定量と補正＞
１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１に代えて、配列番号３の塩基配列を有するヒトＧＡＰＤＨ用フォワードプライマーと配列番号４の塩基配列を有するヒトＧＡＰＤＨ用リバースプライマーを用いた以外は、全て細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の算出と同様にして、ヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表１記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
表２の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表１記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表２左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは１．２０〜２．９０×１０３であったのに対し、補正後のバラツキは１．１８〜１．３２×１０３と最大で１．１２倍の開きであり、より各試料間のバラツキが少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
【００４３】
［実施例２］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
健常人５名の糞便試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。具体的には、配列番号５の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー２と、配列番号６の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー２、及び、５’末端が６−ＦＡＭ、３’末端がＴＡＭＲＡでそれぞれ標識された１６Ｓ ｒＲＮＡ用ＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲによる定量的ＰＣＲを行った。
まず、健常人の糞便を、採便後速やかに５ｍＬチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。糞便は５名からそれぞれ分取した。その後、実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、１μＬの各ｃＤＮＡ溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー２と、１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー２をそれぞれ最終濃度が２００ｎＭとなるように、また、１６Ｓ ｒＲＮＡ用ＴａｑＭａｎプローブを最終濃度が１００ｎＭとなるように、それぞれ添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。調製したＰＣＲ溶液を用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲを行い、各ＰＣＲ溶液の６−ＦＡＭの蛍光強度を解析することにより、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例１の試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料２−１〜５の約１ｇの糞便中のｒＲＮＡ量は、最大で３．９倍の開きが見られた。
【００４６】
＜標的物質の定量と補正＞
実施例１と同様にして、試料２−１〜５の各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表３記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
【００４７】
【表４】
【００４８】
表４の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表３記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表４左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは１．９０〜８．５０×１０３であったのに対し、補正後のバラツキは０．９１〜１．７６×１０３と最大で１．９倍の開きであり、同一被験者由来の試料間の比較である実施例１の結果に比べるとバラツキは大きかったが、補正をすることにより、より各試料間のバラツキは少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
【００４９】
［実施例３］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、採取後一定期間経過した唾液中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一試料を小分けし、採取後の時間経過の異なる唾液試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。
まず、健常人の唾液を、採取後速やかに５ｍＬチューブに約１ｍＬずつ分取した。唾液は一人由来のものを３個分（試料３−１〜３）に分取した。それぞれの唾液試料に、ｃｏｘ−２遺伝子を高発現しているヒト胃癌由来細胞株ＭＫＮ４５細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ添加して混合し、試料３−１は直ちに、試料３−２は室温で３時間静置した後、試料３−３は室温で８時間静置した後、それぞれＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、全ＲＮＡを抽出した。その後、該ＲＮＡの一部を用いて実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、リアルタイムＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
【００５０】
【表５】
【００５１】
表５の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（唾液約１ｍＬ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例３の試料３−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料３−１〜３の約１ｍＬの唾液中のｒＲＮＡ量は、最大で２．３倍の開きが見られた。なお、同一の唾液から等量採取した試料であるにもかかわらず、試料３−３に含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数が、試料３−１や３−２よりも顕著に少なかったのは、採取後室温で静置されている間に核酸の分解が進行したためと考えられる。
【００５２】
＜標的物質の定量と補正＞
実施例１と同様にして、試料３−１〜３の各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表５記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
【００５３】
【表６】
【００５４】
表６の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（唾液約１ｍＬ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表５記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表６左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは２．３０〜５．１０×１０６であったのに対し、補正後のバラツキは５．１０〜５．５１×１０６と最大で１．０５倍の開きであり、より各試料間のバラツキは少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料中の細菌による分解の影響等が抑えられ、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
【００５５】
［実施例４］
大腸癌患者由来の糞便中には、ｃｏｘ−２遺伝子のｍＲＮＡ等が、健常者由来の糞便中よりも多く存在していることが報告されている。これは、大腸癌患者において、ｃｏｘ−２遺伝子が高発現するためと考えられている。そこで、健常人の糞便に対し、ｃｏｘ−２遺伝子を高発現しているヒト胃癌由来細胞株ＭＫＮ４５細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ添加して混合させたものを、擬似大腸癌患者糞便とし、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、擬似大腸癌患者糞便中に含まれているヒトｃｏｘ−２遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
健常人由来の糞便を、１０ｍＬチューブに約１ｇずつ３本、０．２５ｇずつ３本に分取し、１ｇのものには、ＭＫＮ４５細胞を１×１０、１×１０２、１×１０３ｃｅｌｌｓずつ、０．２５ｇのものには、２、２×１０、２×１０２ｃｅｌｌｓずつ、それぞれ添加して混合した後、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。その後、実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、リアルタイムＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
【００５６】
【表７】
【００５７】
表７の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例１の試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。
【００５８】
＜標的物質の定量と補正＞
１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１に代えて、配列番号８の塩基配列を有するヒトｃｏｘ−２用フォワードプライマーと配列番号９の塩基配列を有するヒトｃｏｘ−２用リバースプライマーを用いた以外は、実施例１における細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の算出と同様にして、ヒトｃｏｘ−２のコピー数を算出した。一試料あたりのヒトｃｏｘ−２のコピー数が１×１０６以上である場合に、大腸癌陽性と判定した。また、得られたヒトｃｏｘ−２のコピー数を、表７記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトｃｏｘ−２のコピー数を算出し、各試料が大腸癌陽性か陰性かの判定を行った。
【００５９】
【表８】
【００６０】
表８の左から２列目はリアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数を、左から３列目はリアルタイムＰＣＲの結果得られたコピー数に基づいて大腸癌の判定を行った結果を、左から４列目は表７記載の補正係数を、左から５列目は補正後のヒトｃｏｘ−２のコピー数（左から２列目記載のコピー数を左から４列目記載の補正係数で除したもの）を、左から５列目は補正後のコピー数に基づいて大腸癌の判定を行った結果を、それぞれ示したものである。
補正前の各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数に基づいて大腸癌の判定を行ったところ、試料４−５は陰性と判定されたが、補正後の各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数に基づいて行うと、試料４−５は陽性と判定することができた。
【００６１】
［実施例５］
大腸菌のｇｕｓ ＡのゲノムＤＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。大腸菌ｇｕｓ ＡのゲノムＤＮＡ量は、配列番号１０の塩基配列を有するｇｕｓ Ａ用フォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列を有するｇｕｓ Ａ用リバースプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行うことにより定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一健常人由来の便を、５ｍＬチューブに３ｇ採取し、ＭＫＮ４５細胞を３×１０２ｃｅｌｌｓ添加して混合したものから、０．５ｇと１ｇをそれぞれ５ｍＬチューブに分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。その後、ＤＮＡとＲＮＡを同時に抽出する方法で核酸を回収した。具体的には、各試料をグアニジンチオシアネートの存在下でホモジナイザーを用いてホモジナイズした後、１ｍＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｐＨ８．０）を添加してｖｏｒｔｅｘを用いて攪拌した。その後、４℃で１６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離処理をし、得られた水層を分取後、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、４℃で１６，０００×ｇ、５分間の遠心分離処理をし、得られた水層をさらに分取した。その後、得られた水層に０．６倍量のイソプロパノールと１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を添加して攪拌した後、４℃で１６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離処理をすることにより、全核酸を含むペレットを得た。該ペレットに対して５００μＬの７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールでリンスし、風乾後、５０μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）に溶解させることにより、約５０μＬの全核酸溶液を得た。
【００６２】
５μＬの該全核酸溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ｇｕｓ Ａ用フォワードプライマーと、ｇｕｓ Ａ用リバースプライマーをそれぞれ最終濃度が９００ｎｍｏｌとなるように添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、実施例１と同様にしてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ解析を行い、大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡ量を測定した。
【００６３】
【表９】
【００６４】
表９の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数を、右欄は、試料５−１中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。
【００６５】
＜標的物質の定量と補正＞
５μＬの該全核酸溶液をリバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μＬ、和光純薬）とランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。さらに、１μＬの該ｃＤＮＡ溶液を鋳型とした以外は全て実施例１と同様にして、ヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表９記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
表１０の左欄はリアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表９記載の補正係数を、右欄は補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）を、それぞれ示したものである。補正を行うことにより、初期便量の差を補正し、等量のＧＡＰＤＨを検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の標的物質の定量方法により、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質であっても、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができるため、本発明の標的物質の定量方法は、医療診断のための臨床検査の分野において特に有用であり、遺伝学、分子生物学、生化学等の分野でも利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の標的物質の定量方法の対象となる試料の一態様の模式図である。図１（ａ）と１（ｂ）は、それぞれヒトの同一の糞便から等重量ずつ異なる部位から採取した試料である。図中、○は細菌の核酸、△はヒト大腸剥離細胞の核酸、●は食物残渣や分解された核酸等のデブリスを表している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種類の生物種の生体関連物質が含まれている２以上の試料中の標的物質量を定量する場合において、試料間の標的物質量の比をより正確に求めることができる標的物質の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子解析は、近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、医療、学術研究、産業等の多くの分野において広く応用されている。遺伝子解析は、通常、試料中に、解析対象である標的遺伝子と相同的な塩基配列を有する核酸が存在するか否かを検出することにより行われるが、臨床検査における検体等のように、検体が微量である場合や試料中の核酸濃度が非常に低い場合には、解析対象となる標的塩基配列を有する核酸を増幅して解析を行うことが多い。このような核酸の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。例えば、遺伝病、疾病感受性、癌等の診断において、異常細胞特異的なｍＲＮＡ等の標的核酸をＰＣＲ増幅して検出する方法が、広く用いられている。
【０００３】
特に、近年、糞便、唾液や血液等の体液、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等の生体試料中に含まれる核酸を回収し、各試料間の核酸の特徴を比較することによって、癌や、細菌（原核生物）・ウィルス・寄生虫等による感染症等の疾患を診断することが行われている。例えば、薬剤に対する応答反応として、チミジル酸シンターゼのｍＲＮＡの発現量が増大することを利用して、癌細胞における薬剤耐性の獲得の有無を調べるために、患者から採取した癌細胞に抗癌剤を投与した後、定量的ＰＣＲを行うことによりチミジル酸シンターゼのｍＲＮＡの発現量を測定し、抗癌剤投与前後における該発現量を相対的に比較する方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、口腔癌患者と健常人の唾液からそれぞれＲＮＡを回収し、その中のｍＲＮＡの発現プロファイルを、マイクロアレイを用いて比較することにより、口腔癌の早期発見を行う試みがなされている。その他、感染症の発見・診断を行うために、糞便等の生体試料からＲＮＡウィルスを定量的に検出し、感染症が疑われる患者のものと健常人のものとを比較することも行われている。
【０００４】
このような生体試料には、核酸、タンパク質、脂質、ビタミン類等の低分子化合物等の多種多様な生体関連物質が含まれている。このため、生体試料を用いた核酸解析においては、予め、該生体試料から核酸を回収する場合が多い。一方で、多くの生体試料には、該生体試料が採取された対象である動物以外にも、細菌やウィルスといった様々な生物及び該生物由来の生体関連物質も含まれている。このため、例えば、ヒトから採取された生体試料から、生物種ごとに分離することなく核酸を回収した場合には、ヒト由来の核酸と、細菌やウィルスのようなヒト以外の生物種由来の核酸とが混合された状態で回収される。特に、糞便や唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等には細菌が多く存在するため、これらの生体試料から回収された核酸には、圧倒的に細菌由来の成分が多く含まれており、ヒト由来の生体関連物質は非常に少量である場合が多い。
【０００５】
核酸解析においては、他の解析・検出方法と同様に、解析対象である試料中の標的核酸の濃度（存在量）が非常に重要である。このため、ヒト由来の標的核酸が等量含まれている２の試料のうち、一方の試料には細菌由来の核酸が比較的少量含まれており、他方の試料中には非常に大量に含まれている場合には、前者の試料からは標的核酸を検出することができ、後者の試料からは検出することができない、という問題が生じてしまう。また、細菌を多く含む試料中には、細菌由来の分解酵素等も大量に存在する。このため、試料中の核酸がこれらの分解酵素の影響を受けて損なわれやすく、試料間のバラツキが大きくなりやすいという問題もある。特に、ヒト等の動物から剥離された上皮細胞や該上皮細胞由来の生体関連物質は、細菌や細菌の分解酵素等から身を守る術に乏しく、より影響を受けやすい。
【０００６】
このため、大量の細菌を含む糞便等の試料のように、複数の生物種が存在し、互いに影響を及ぼしている試料では、初期試料の量、すなわち、解析に用いる試料の重量や容量を規定し、該試料の単位あたりの標的物質を測定した場合であっても、試料の採取や保管状況、解析までに要する時間、解析作業等によって影響され、試料ごとの結果のバラツキが非常に大きくなることが懸念される。特に、標的物質が分解されやすい核酸、特にＲＮＡである場合には、試料中の分解されていないＲＮＡ分子のコピー数を揃えて解析しなければ、試料間のバラツキを抑えることは困難である。しかしながら、核酸の定量は、通常は核酸の吸光度値を元に推測されており、また吸光度値は分解の度合いを示すものではないため、単に吸光度値に基づき核酸量を規定したとしても、分解されていないＲＮＡ分子のコピー数を揃えることは困難である。
【０００７】
試料中の標的物質を定量する場合に、試料ごとの結果のバラツキを抑えるために、例えば、既知濃度の物質を内部標準品として添加して測定を行うことがある。これにより、添加した内部標準品の測定値から、標的物質量を算出することができるため、測定操作による影響を排除し得るばかりではなく、標的物質の絶対量を得ることができる。しかしながら、該方法は、比較的均質な試料であって安定性の高い標的物質を定量する場合には有効であるものの、試料の採取や保管状況等による影響を排除することはできず、細菌を多く含む試料を用いた場合に信頼に足る定量結果を得ることは困難である。
【０００８】
試料間の標的物質量を比較する場合に、試料の初期品質の相違や試料の調製方法等による影響を排除し、より信頼性の高い定量結果を得るために、全ての試料にほぼ同量含まれていることが期待できる標的物質以外の物質を標準物質とし、該標準物質により測定値をノーマライズする、すなわち、該標準物質の測定値に基づき標的物質の測定値を補正することがある。標的物質が核酸であり、試料間の標的核酸量を比較する方法として、例えば、（１）標的核酸がある特定の遺伝子由来のｍＲＮＡであり、複数の試料間の標的核酸量を比較する場合に、各試料中のＲＮＡ量を、ハウスキーピング遺伝子由来のｍＲＮＡ量によりノーマライズさせて解析する方法が開示されている（例えば、非特許文献２参照。）。ハウスキーピング遺伝子は、個々の生理状態とは無関係に全ての細胞で構成的に発現しており、そのｍＲＮＡは全ての細胞にほぼ同じ量で存在すると考えられる。例えば、癌組織から得られたＲＮＡと正常組織から得られたＲＮＡの間で、標的ＲＮＡの発現量の差を見る場合、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ、ｒＲＮＡ等のヒト遺伝子由来のＲＮＡを標準ＲＮＡとすると、各試料中の総ＲＮＡ量に対する標準ＲＮＡ量の比はほぼ一致すると考えられるため、癌組織から検出された標準ＲＮＡの総量と、正常組織から検出された標準ＲＮＡの総量から、各試料中の総ＲＮＡ量の比を推定し、該推定に基づき検出された標的ＲＮＡ量を補正することにより、より確からしい定量結果を得ることができる。その他、（２）ノーマライズに複数の標準物質を用いる方法等も開示されている（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００９】
上記（１）及び（２）の方法では、ヒトの特定の遺伝子由来の核酸を標的物質として定量する場合に、測定値をノーマライズするために、ハウスキーピング遺伝子等のヒト由来の核酸を標準物質として用いている。このように、標準物質として標的物質と同じ生物種・同じ分子種の生体関連物質を用いることにより、試料の採取や保管状況、調製方法等による影響を効果的に排除し得ると考えられる。
【非特許文献１】Kashani-Sabet, et al.、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８８年、第４８巻、第５７７５〜５７７８ページ。
【非特許文献２】Bustin、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、２０００年、第２５巻、第１６９〜１９３ページ。
【非特許文献３】Vandesompele, et al.、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第３巻、第７号、ｒｅｓｅａｒｃｈ００３４．１〜１１。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
各組織からそれぞれ採取された試料間の比較等、比較的類似した試料間での比較に用いられる場合には、上記（１）及び（２）の方法によっても、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し得ることが期待できる。しかしながら、試料中に元々少数しか存在していない生物種由来の標的物質を定量する場合には、標準物質を標的物質と同じ生物種の生体関連物質とした場合には、標準物質自体が検出されない場合が多いという問題がある。この場合には、そもそも標準物質として機能することはできず、例え標的物質が検出されていたとしても補正することができず、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることはできない。
【００１１】
例えば、ヒト口腔細胞において、癌化により特定の遺伝子（標的遺伝子）の発現量が亢進されるという知見に基づき、標的遺伝子の発現量が一定値以上である場合に陽性（癌）と判断する場合であって、標準遺伝子としてヒトハウスキーピング遺伝子を用いた場合には、唾液から直接核酸を抽出し、唾液中に含まれている標的遺伝子由来核酸量を測定したとしても、同時に測定した標準遺伝子由来核酸が検出されないことによって、標的遺伝子由来核酸量の検出結果の信頼性や定量性に問題が生じ、癌の診断ができないおそれがある。
【００１２】
本発明は、複数種類の生物種の生体関連物質が含まれている２以上の試料中の標的物質量を定量する場合において、標的物質が比較的少量存在する生物種の生体関連物質である場合であっても、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し、試料間の標的物質量の比をより正確に求めることができる標的物質の定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質である場合であっても、標準物質として、標的物質と同一生物種由来の生体関連物質ではなく、細菌等の該試料中に大量に存在する標的物質とは異なる生物種の生体関連物質を用いることにより、試料の初期品質の相違や解析操作等の影響による測定結果のバラツキを適正に補正し得るため、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明は、２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、を有することを特徴とする標的物質の定量方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の標的物質の定量方法により、大量の細菌が存在する試料に含まれている細菌以外の生物種の生体関連物質を標的物質として定量する場合のように、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質であっても、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。標的物質と同一生物種の生体関連物質ではなく、異なる生物種由来の生体関連物質を標準物質とすることにより、標準物質が検出されない等の標準物質が機能できない事態の発生を防止しつつ、試料の採取から保存、試料からの生体関連物質の抽出等の一連の工程の影響を加味し、ノーマライズすることができる。このため、本発明の標的物質の定量方法は、糞便試料中の哺乳細胞由来の核酸を定量する場合等、標的物質が、共存する生物種に比べて圧倒的に少量しか試料中に存在していない生物種の生体関連物質であり、試料中に検出限界ギリギリの量しか含まれていない場合に、特に有効である。従来は、試料中に検出限界量程度しか含まれていない標的物質の量を試料間で比較する場合には、該生体試料から生物種ごとに分離して生体関連物質を回収する等の、標的物質を濃縮する工程が必要とされたが、本発明の標的物質の定量方法を用いることにより、信頼性の高い各試料の標的物質量比を、より簡便に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の標的物質の定量方法は、２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、を有することを特徴とする。以下、より詳細に説明する。
【００１７】
本発明において試料とは、生物種の異なる２以上の生体関連物質を含むものである。生物から採取された試料（生体試料）であってもよく、培養細胞等から調製された試料であってもよい。本発明の標的物質の定量方法の対象となる試料としては、臨床検体等の生体試料であることが好ましい。生体試料が採取される生物は、特に限定されるものではないが、真核生物であることが好ましく、動物であることがより好ましく、哺乳類であることがさらに好ましく、ヒトであることが特に好ましい。該生体試料として、例えば、糞便、唾液や血液等の体液、喀痰、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等がある。特に、該生体試料を採取された生物以外の種類の生物の生体関連物質、例えば原核生物やウィルス等の微生物の生体関連物質を含む生体試料であることが好ましく、真正細菌等の原核生物の生体関連物質をより多く含む生体試料であることが特に好ましい。このような細菌等を多く含む生体試料として、例えば、糞便、唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等がある。
【００１８】
本発明において生体関連物質とは、生体に関連する物質であり、具体的には、核酸、タンパク質、ビタミン類やホルモン類等の低分子化合物、糖類、脂質類等である。核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。タンパク質は、アミノ酸のみからなるタンパク質であってもよく、糖タンパク質やリポタンパク質等のアミノ酸以外の物質を含むものであってもよい。
【００１９】
本発明において標的物質とは、試料中に含まれている量を定量する対象である。本発明における標的物質としては、各試料に比較的少量含まれている生物種の生体関連物質であることが好ましい。このような生体関連物質は、試料中に大量に存在する生体関連物質よりも、試料の初期品質の相違や試料の調製方法等による影響を受けやすいため、本発明の標的物質の定量方法により好適である。特に、本発明における標的物質としては、試料に比較的少量含まれている生物種の、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸であることが好ましい。
【００２０】
本発明において標準物質とは、各試料中の標的物質量の測定値を補正するための標準とする物質であり、試料中に含まれている標的物質とは異なる生物種の生体関連物質である。標準物質は、各試料に比較的大量に含まれている生物種の生体関連物質であることが好ましい。各試料に一定の割合以上含まれている生物種の生体関連物質であれば、試料の採取等の条件による初期試料の品質のバラツキを抑えられること、及び、各試料にほぼ確実に検出限界量以上含まれていること等が、期待できるためである。すなわち、各試料には、前記標的物質よりも、前記標準物質が多く含まれていることが好ましい。
【００２１】
標準物質と標的物質とは、生物種が異なっていればよく、同種類の生体関連物質であってもよく、異なる種類の生体関連物質であってもよい。例えば、標的物質がＲＮＡである場合に、標準物質はＲＮＡであってもよく、ＤＮＡであってもよく、タンパク質であってもよい。
【００２２】
生物種ごとに区別した解析が比較的容易であること、解析手法が汎用されていること等から、本発明における標準物質としては、核酸であることが好ましい。このような標準物質として、例えば、各試料に比較的大量に含まれている生物種のｒＲＮＡ、ｒＤＮＡ、リボゾーム関連タンパク質やＲＮＡポリメラーゼ、ハウスキーピング遺伝子等のｍＲＮＡやＤＮＡ等がある。標的物質の種類や量に応じて、適当な発現量を有する遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として用いることにより、より適正にノーマライズし得ることが期待できる。このため、標準物質としては、低発現の遺伝子から高発現の遺伝子まで、様々な発現量を有する遺伝子のｍＲＮＡを揃えておくことが好ましい。
【００２３】
標準物質として用いる生体関連物質は、一種類であってもよく、複数種類であってもよい。例えば、一遺伝子のｍＲＮＡやＤＮＡを用いてもよく、複数種類の遺伝子のｍＲＮＡやＤＮＡを用いてもよい。より具体的には、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを用いてもよく、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡとＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のｍＲＮＡとを組み合わせて用いてもよい。複数種類の生体関連物質を標準物質として用いる場合には、用いる複数種類の生体関連物質が、互いに生物種の異なるホモログ遺伝子であることがより好ましい。例えば、複数種類の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを標準物質として用いることができる。
【００２４】
また、標準物質として複数種類の生体関連物質を用いる場合、複数種類の生体関連物質を一括で定量した結果を補正に用いてもよく、それぞれの生体関連物質の定量結果の平均を補正に用いてもよい。より具体的には、複数種類の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの総量を標準物質量としてもよく、ある特定の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ量の平均値を標準物質量としてもよい。
【００２５】
本発明の標的物質の定量方法は、まず、工程（ａ）として、各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める。各試料中の標準物質量の比は、例えば、一の試料中の標準物質量を１．０とした場合の、他の試料中の標準物質量の比をそれぞれ算出することにより求めることができる。このようにして得られた各試料中の標準物質量の比を、本願明細書においては、補正係数という。
【００２６】
各試料中の標準物質量は、該標準物質と同一種類の生体関連物質の定量に通常用いられている方法により定量することができる。このような定量方法として、例えば、定量的核酸増幅法、ハイブリダイゼーション法、免疫凝集法、ＥＬＩＳＡ法、吸光度測定法等がある。定量対象である標準物質が核酸である場合には、試料中に微量に存在する核酸を容易に検出し定量することが可能であるため、定量的核酸増幅法を用いて測定することが好ましい。該定量的核酸増幅法として、例えば、リアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法等がある。また、特異的な検出が比較的簡便に行えることから、プローブ等を用いたハイブリダイゼーション法を用いることも好ましい。このような方法として、例えば、Ｔａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法等があり、なかでもＴａｑ Ｍａｎ ＰＣＲ法を用いることが好ましい。標準物質がＲＮＡである場合には、逆転写反応により得られたｃＤＮＡに対して定量的ＰＣＲを行うことができる。
【００２７】
また、標準物質として、複数種類の細菌のそれぞれの１６Ｓ ｒＲＮＡ量の総和を標準物質量とする場合には、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡごとに特異的なプライマーを用いて、個別にＰＣＲを行い、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量をそれぞれ定量した後に総和量を算出してもよく、マルチプレックスＰＣＲを行うことにより、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ量をまとめて定量してもよい。その他、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡに共通するプライマーを用いて、一のＰＣＲを行うことにより、各細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡを同時に増幅してまとめて定量してもよい。
【００２８】
次に工程（ｂ）として、各試料中の標的物質量を測定する。各試料中の標的物質量は、標準物質量の測定法において挙げられた方法を用いて測定することができる。
【００２９】
その後、工程（ｃ）として、工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する。具体的には、工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で算出した補正係数で除する。該補正係数を用いて補正することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られる。
【００３０】
図１は、本発明の標的物質の定量方法の対象となる試料の一態様の模式図である。（ａ）と（ｂ）は、それぞれヒトの同一の糞便から等重量ずつ異なる部位から採取した試料の模式図である。図中、○は細菌の核酸、△はヒト大腸剥離細胞の核酸、●は食物残渣や分解された核酸等のデブリスを表している。試料（ａ）には、細菌の核酸が２０、ヒトの核酸が２、デブリスが０、それぞれ存在しており、試料（ｂ）には、細菌の核酸が５、ヒトの核酸が１、デブリスが多数、それぞれ存在している。従来法通りに、ヒトの核酸量を、重量当たりの量を定量した場合には、試料（ｂ）には試料（ａ）の１／２倍量のヒトの核酸が存在しているという結果となる。一方で、細菌のｒＲＮＡ遺伝子を標準物質として定量した場合には、試料（ａ）中の細菌の核酸量を１．０とした場合の試料（ｂ）の補正係数は０．２５であり、該補正係数を用いて補正すると、試料（ｂ）中のヒトの核酸量は４となり、試料（ｂ）には試料（ａ）の２倍量のヒトの核酸が存在しているという結果が得られる。このように、本発明の標的物質の定量方法を用いることにより、試料の採取から解析までの一連の操作の影響による試料間のバラツキを防止して、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。
【００３１】
糞便中に含まれているヒト等の真核生物の細胞や生体関連物質として、主に、大腸剥離細胞等の消化管上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。このような糞便中に含まれているヒト細胞やヒトの生体関連物質等を検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、大腸癌や炎症性大腸疾患等の診断を行うことが試みられている。また、糞便中のウィルスやウィルスの生体関連物質等を検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、感染症等の診断も試みられている。その他、糞便中に含まれている真核生物として寄生虫等があり、これらを同様に検出・定量し、健常者由来の試料と比較等することにより、寄生虫の有無の判定をすることも可能である。一方で、糞便は、その半分以上は細菌から構成されていると言われるほど大量の細菌を含んでおり、真核生物やウィルスの細胞や生体関連物質等はごく少量しか含まれてはいない。そこで、糞便を試料とし、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて標的物質である真核生物やウィルスの生体関連物質を定量することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。特に、標的物質がヒトの生体関連物質であり、標準物質が真正細菌の生体関連物質であることがより好ましい。
【００３２】
例えば、糞便中に多く存在する、大腸菌、大腸菌群、腸球菌、乳酸菌等の腸内細菌の全種類又はその大部分が共通して有する遺伝子（ホモログ遺伝子）又はその一部を標準物質とすることにより、糞便中の大多数の細菌の核酸を、全体的にノーマライズすることが可能である。また、特定の一種類又は数種類の細菌の遺伝子を標準物質として、ノーマライズしてもよい。その他、試料からＤＮＡとＲＮＡを一括で回収し、そのうちの一部で、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の標的ＲＮＡの定量検出を行い、残りの一部に存在するＤＮＡを標準物質としてノーマライズすることもできる。ＤＮＡを標準物質として用いる場合、遺伝子のコピー数は数個から数十個になるため、標的物質が低発現のｍＲＮＡである場合等のノーマライズに好適に用いることができる。
【００３３】
唾液や口腔粘膜に含まれているヒト等の真核生物の細胞や生体関連物質として、主に、口腔内の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。また、喀痰に含まれている真核生物の細胞等として、主に、口腔や気管内の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等があり、子宮粘膜に含まれている真核生物の細胞等として、主に、子宮内膜の上皮細胞からの剥離細胞及びこれらの細胞の生体関連物質等がある。これらの生体試料中の真核細胞等を検出・定量することにより、各組織の癌や炎症等の疾患の診断をすることができる。また、口腔や気管、子宮は生体外部と直接接する組織であり、これらの生体試料中にウィルスが含まれているか否かにより、ウィルス感染の有無を診断することもできる。一方で、これらの生体試料中には、通常、糞便と同様に細菌が大量に存在している。このため、唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等を試料とし、これらの試料中の標的物質である真核生物やウィルスの生体関連物質の量を、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて定量することにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができる。標準物質として用いる原核生物の生体関連物質は、真正細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡやハウスキーピング遺伝子等であることが好ましい。その他、標準物質として、原核生物以外の真核生物を用いてもよい。
【００３４】
本発明の定量方法は、糞便等の原核生物を多く含む生体試料中の癌等の疾患マーカーを定量する場合に、特に有効である。標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いてノーマライズすることにより、健常者由来の試料と患者由来の試料のそれぞれに含まれている疾患マーカー（標的物質）量の比をより正確に求めることができるため、疾患の診断の信頼性を向上し得ることが期待できる。特に、標的物質を癌マーカーとし、標準物質を原核生物の生体関連物質として、本発明の定量方法を用いて癌マーカーを定量することが好ましい。癌診断においては、他の疾患にも増して高い正確性が要求されるが、本発明の定量方法により定量された癌マーカー量に基づき診断することにより、癌診断の精度（特異度）を改善し得ることが期待できる。なお、癌マーカーとは、癌検出の指標となり得る生体関連物質であれば特に限定されるものではなく、公知の癌マーカーを用いることができる。
【００３５】
このように、試料中の標的物質量を、標的物質とは異なる生物種の生体関連物質を標準物質として補正するという考え方は、標的物質が核酸以外の生体関連物質である場合、例えば、タンパク質が標的物質である場合にも何ら変わりはない。したがって、本発明の定量方法は、タンパク質の発現解析等にも応用することができる。例えば、糞便中の癌細胞由来のタンパク質を検出する場合、糞便中の細菌のリボゾームタンパク質を標準物質とし、ＣＥＡやＣＡ１９−９、ＣＤ４４等の定量を行うことができる。なお、タンパク質の検出や定量は、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、糞便中の癌細胞由来のタンパク質の検出は、国際公開第１９９６／００８５１４号パンフレット等で開示されているヒト結腸癌腫関連抗原に対するモノクローナル抗体を用いて検出することもできる。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、培養細胞であるＭＫＮ４５細胞は、常法により培養した。
【００３７】
［実施例１］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一試料を小分けし、糞便試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。具体的には、配列番号１の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と、配列番号２の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１を用いて定量的ＰＣＲを行った。
まず、健常人の糞便を、採便後速やかに５ｍＬチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。糞便は一人由来のものを１０個分に分取した。その後、グアニジン塩とフェノールを添加し、ホモジナイザーを用いてホモジナイズした後、クロロホルムとエタノールを用いて全ＲＮＡを抽出した。該ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数（ｍＲＮＡ量）を定量した。具体的には、抽出したＲＮＡの一部をリバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μＬ、和光純薬）とランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。さらに、１μＬの該ｃＤＮＡ溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と、１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１をそれぞれ最終濃度が９００ｎｍｏｌとなるように添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲの熱サイクルは、９５℃１０分間の変性サイクルの後、９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間を４５サイクルの条件で行った。定量は、濃度既知のスタンダードプラスミドによる希釈系列を鋳型として得られた蛍光強度の結果に基づいて行った。
【００３８】
【表１】
【００３９】
表１の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料１−１〜１０は、同一の糞便から等量採取した試料であるにもかかわらず、１ｇの糞便中のｒＲＮＡ量は、最大で２．３倍の開きが見られた。
【００４０】
＜標的物質の定量と補正＞
１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１に代えて、配列番号３の塩基配列を有するヒトＧＡＰＤＨ用フォワードプライマーと配列番号４の塩基配列を有するヒトＧＡＰＤＨ用リバースプライマーを用いた以外は、全て細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の算出と同様にして、ヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表１記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
表２の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表１記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表２左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは１．２０〜２．９０×１０３であったのに対し、補正後のバラツキは１．１８〜１．３２×１０３と最大で１．１２倍の開きであり、より各試料間のバラツキが少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
【００４３】
［実施例２］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
健常人５名の糞便試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。具体的には、配列番号５の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー２と、配列番号６の塩基配列を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー２、及び、５’末端が６−ＦＡＭ、３’末端がＴＡＭＲＡでそれぞれ標識された１６Ｓ ｒＲＮＡ用ＴａｑＭａｎプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲによる定量的ＰＣＲを行った。
まず、健常人の糞便を、採便後速やかに５ｍＬチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。糞便は５名からそれぞれ分取した。その後、実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、１μＬの各ｃＤＮＡ溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー２と、１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー２をそれぞれ最終濃度が２００ｎＭとなるように、また、１６Ｓ ｒＲＮＡ用ＴａｑＭａｎプローブを最終濃度が１００ｎＭとなるように、それぞれ添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。調製したＰＣＲ溶液を用いて、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲを行い、各ＰＣＲ溶液の６−ＦＡＭの蛍光強度を解析することにより、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
【００４４】
【表３】
【００４５】
表３の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例１の試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料２−１〜５の約１ｇの糞便中のｒＲＮＡ量は、最大で３．９倍の開きが見られた。
【００４６】
＜標的物質の定量と補正＞
実施例１と同様にして、試料２−１〜５の各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表３記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
【００４７】
【表４】
【００４８】
表４の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（糞便約１ｇ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表３記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表４左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは１．９０〜８．５０×１０３であったのに対し、補正後のバラツキは０．９１〜１．７６×１０３と最大で１．９倍の開きであり、同一被験者由来の試料間の比較である実施例１の結果に比べるとバラツキは大きかったが、補正をすることにより、より各試料間のバラツキは少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
【００４９】
［実施例３］
細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、採取後一定期間経過した唾液中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一試料を小分けし、採取後の時間経過の異なる唾液試料中の細菌由来核酸を、様々な細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に共通する塩基配列を有するプライマーを用いた定量的ＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を測定した。
まず、健常人の唾液を、採取後速やかに５ｍＬチューブに約１ｍＬずつ分取した。唾液は一人由来のものを３個分（試料３−１〜３）に分取した。それぞれの唾液試料に、ｃｏｘ−２遺伝子を高発現しているヒト胃癌由来細胞株ＭＫＮ４５細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ添加して混合し、試料３−１は直ちに、試料３−２は室温で３時間静置した後、試料３−３は室温で８時間静置した後、それぞれＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、全ＲＮＡを抽出した。その後、該ＲＮＡの一部を用いて実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、リアルタイムＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
【００５０】
【表５】
【００５１】
表５の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（唾液約１ｍＬ中）の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例３の試料３−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。試料３−１〜３の約１ｍＬの唾液中のｒＲＮＡ量は、最大で２．３倍の開きが見られた。なお、同一の唾液から等量採取した試料であるにもかかわらず、試料３−３に含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数が、試料３−１や３−２よりも顕著に少なかったのは、採取後室温で静置されている間に核酸の分解が進行したためと考えられる。
【００５２】
＜標的物質の定量と補正＞
実施例１と同様にして、試料３−１〜３の各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表５記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
【００５３】
【表６】
【００５４】
表６の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中（唾液約１ｍＬ中）のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表５記載の補正係数を、右欄は、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）をそれぞれ示したものである。補正前の各試料中のヒトＧＡＰＤＨ量（表６左欄記載のＧＡＰＤＨのコピー数）のバラツキは２．３０〜５．１０×１０６であったのに対し、補正後のバラツキは５．１０〜５．５１×１０６と最大で１．０５倍の開きであり、より各試料間のバラツキは少なくなった。
これらの結果から、本発明の定量方法を用いることにより、試料中の細菌による分解の影響等が抑えられ、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果が得られることが明らかである。
【００５５】
［実施例４］
大腸癌患者由来の糞便中には、ｃｏｘ−２遺伝子のｍＲＮＡ等が、健常者由来の糞便中よりも多く存在していることが報告されている。これは、大腸癌患者において、ｃｏｘ−２遺伝子が高発現するためと考えられている。そこで、健常人の糞便に対し、ｃｏｘ−２遺伝子を高発現しているヒト胃癌由来細胞株ＭＫＮ４５細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ添加して混合させたものを、擬似大腸癌患者糞便とし、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡを標準物質として、擬似大腸癌患者糞便中に含まれているヒトｃｏｘ−２遺伝子のｍＲＮＡを定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
健常人由来の糞便を、１０ｍＬチューブに約１ｇずつ３本、０．２５ｇずつ３本に分取し、１ｇのものには、ＭＫＮ４５細胞を１×１０、１×１０２、１×１０３ｃｅｌｌｓずつ、０．２５ｇのものには、２、２×１０、２×１０２ｃｅｌｌｓずつ、それぞれ添加して混合した後、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。その後、実施例１と同様にｃＤＮＡ溶液を調製した後、リアルタイムＰＣＲを行い、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を算出した。
【００５６】
【表７】
【００５７】
表７の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を、右欄は、実施例１の試料１−１中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。
【００５８】
＜標的物質の定量と補正＞
１６Ｓ ｒＲＮＡ用フォワードプライマー１と１６Ｓ ｒＲＮＡ用リバースプライマー１に代えて、配列番号８の塩基配列を有するヒトｃｏｘ−２用フォワードプライマーと配列番号９の塩基配列を有するヒトｃｏｘ−２用リバースプライマーを用いた以外は、実施例１における細菌１６Ｓ ｒＲＮＡのコピー数の算出と同様にして、ヒトｃｏｘ−２のコピー数を算出した。一試料あたりのヒトｃｏｘ−２のコピー数が１×１０６以上である場合に、大腸癌陽性と判定した。また、得られたヒトｃｏｘ−２のコピー数を、表７記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトｃｏｘ−２のコピー数を算出し、各試料が大腸癌陽性か陰性かの判定を行った。
【００５９】
【表８】
【００６０】
表８の左から２列目はリアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数を、左から３列目はリアルタイムＰＣＲの結果得られたコピー数に基づいて大腸癌の判定を行った結果を、左から４列目は表７記載の補正係数を、左から５列目は補正後のヒトｃｏｘ−２のコピー数（左から２列目記載のコピー数を左から４列目記載の補正係数で除したもの）を、左から５列目は補正後のコピー数に基づいて大腸癌の判定を行った結果を、それぞれ示したものである。
補正前の各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数に基づいて大腸癌の判定を行ったところ、試料４−５は陰性と判定されたが、補正後の各試料中のヒトｃｏｘ−２のコピー数に基づいて行うと、試料４−５は陽性と判定することができた。
【００６１】
［実施例５］
大腸菌のｇｕｓ ＡのゲノムＤＮＡを標準物質として、糞便中に含まれているヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。大腸菌ｇｕｓ ＡのゲノムＤＮＡ量は、配列番号１０の塩基配列を有するｇｕｓ Ａ用フォワードプライマーと、配列番号１１の塩基配列を有するｇｕｓ Ａ用リバースプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行うことにより定量した。
＜標準物質の定量と補正係数の算出＞
同一健常人由来の便を、５ｍＬチューブに３ｇ採取し、ＭＫＮ４５細胞を３×１０２ｃｅｌｌｓ添加して混合したものから、０．５ｇと１ｇをそれぞれ５ｍＬチューブに分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。その後、ＤＮＡとＲＮＡを同時に抽出する方法で核酸を回収した。具体的には、各試料をグアニジンチオシアネートの存在下でホモジナイザーを用いてホモジナイズした後、１ｍＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｐＨ８．０）を添加してｖｏｒｔｅｘを用いて攪拌した。その後、４℃で１６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離処理をし、得られた水層を分取後、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、４℃で１６，０００×ｇ、５分間の遠心分離処理をし、得られた水層をさらに分取した。その後、得られた水層に０．６倍量のイソプロパノールと１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を添加して攪拌した後、４℃で１６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離処理をすることにより、全核酸を含むペレットを得た。該ペレットに対して５００μＬの７０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールでリンスし、風乾後、５０μＬのＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）に溶解させることにより、約５０μＬの全核酸溶液を得た。
【００６２】
５μＬの該全核酸溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ (Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ｇｕｓ Ａ用フォワードプライマーと、ｇｕｓ Ａ用リバースプライマーをそれぞれ最終濃度が９００ｎｍｏｌとなるように添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、実施例１と同様にしてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ解析を行い、大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡ量を測定した。
【００６３】
【表９】
【００６４】
表９の左欄は、リアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数を、右欄は、試料５−１中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数を１．０として算出した各試料中の大腸菌ｇｕｓ ＡゲノムＤＮＡのコピー数の比（補正係数）をそれぞれ示したものである。
【００６５】
＜標的物質の定量と補正＞
５μＬの該全核酸溶液をリバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μＬ、和光純薬）とランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。さらに、１μＬの該ｃＤＮＡ溶液を鋳型とした以外は全て実施例１と同様にして、ヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。得られたヒトＧＡＰＤＨのコピー数を、表９記載の補正係数で除することにより、補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数を算出した。
【００６６】
【表１０】
【００６７】
表１０の左欄はリアルタイムＰＣＲの結果得られた各試料中のヒトＧＡＰＤＨのコピー数、中欄は表９記載の補正係数を、右欄は補正後のヒトＧＡＰＤＨのコピー数（左欄記載のコピー数を中欄記載の補正係数で除したもの）を、それぞれ示したものである。補正を行うことにより、初期便量の差を補正し、等量のＧＡＰＤＨを検出することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の標的物質の定量方法により、標的物質が試料中に比較的少量存在する生物種の生体関連物質であっても、試料間の標的物質量比をより正確に反映した信頼性の高い定量結果を得ることができるため、本発明の標的物質の定量方法は、医療診断のための臨床検査の分野において特に有用であり、遺伝学、分子生物学、生化学等の分野でも利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の標的物質の定量方法の対象となる試料の一態様の模式図である。図１（ａ）と１（ｂ）は、それぞれヒトの同一の糞便から等重量ずつ異なる部位から採取した試料である。図中、○は細菌の核酸、△はヒト大腸剥離細胞の核酸、●は食物残渣や分解された核酸等のデブリスを表している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、
各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、
前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、
（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、
（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、
を有することを特徴とする、標的物質の定量方法。
【請求項２】
各試料には、前記標的物質よりも前記標準物質が多く含まれていることを特徴とする、請求項１記載の標的物質の定量方法。
【請求項３】
前記試料が、糞便、唾液、喀痰、口腔粘膜、及び子宮粘膜からなる群より選択される試料であることを特徴とする、請求項１又は２記載の標的物質の定量方法。
【請求項４】
前記標的物質が核酸であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項５】
前記標準物質が核酸であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項６】
前記標準物質として、複数種類の生体関連物質を用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項７】
前記複数種類の生体関連物質が、互いに生物種の異なるホモログ遺伝子であることを特徴とする、請求項６記載の標的物質の定量方法。
【請求項８】
前記試料が糞便であり、前記標的物質が真核生物の生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項９】
前記真核生物がヒトであり、前記原核生物が真正細菌であることを特徴とする、請求項８記載の標的物質の定量方法。
【請求項１０】
前記試料が糞便であり、前記標的物質がウィルスの生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１１】
前記試料が唾液であり、前記標的物質が真核生物の生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１２】
前記試料が唾液であり、前記標的物質がウィルスの生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１３】
前記試料が粘膜であり、前記標的物質が真核生物の生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１４】
前記試料が粘膜であり、前記標的物質がウィルスの生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１５】
前記標的物質が癌マーカーであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）における前記標準物質量の測定と、前記工程（ｂ）における前記標的物質量の測定とが、定量的核酸増幅法を用いた測定であることを特徴とする、請求項５〜１５のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１７】
前記定量的核酸増幅法が、定量的ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であることを特徴とする、請求項１６記載の標的物質の定量方法。
【請求項１８】
前記工程（ａ）における前記標準物質量の測定と、前記工程（ｂ）における前記標的物質量の測定とが、ハイブリダイゼーション法を用いた測定であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか記載の標的物質の定量方法を用いて定量した結果に基づき、癌を診断する方法。
【請求項１】
２以上の試料に含まれる標的物質をそれぞれ定量する方法であって、
各試料には、標的物質とは異なる標準物質が含まれており、
前記標準物質は、前記標的物質とは異なる生物種の生体関連物質であり、
（ａ）各試料中の標準物質量を測定し、各試料中の標準物質量の比を求める工程と、
（ｂ）各試料中の標的物質量を測定する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた各試料中の標的物質量を、工程（ａ）で得られた各試料中の標準物質量の比を用いて補正する工程と、
を有することを特徴とする、標的物質の定量方法。
【請求項２】
各試料には、前記標的物質よりも前記標準物質が多く含まれていることを特徴とする、請求項１記載の標的物質の定量方法。
【請求項３】
前記試料が、糞便、唾液、喀痰、口腔粘膜、及び子宮粘膜からなる群より選択される試料であることを特徴とする、請求項１又は２記載の標的物質の定量方法。
【請求項４】
前記標的物質が核酸であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項５】
前記標準物質が核酸であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項６】
前記標準物質として、複数種類の生体関連物質を用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項７】
前記複数種類の生体関連物質が、互いに生物種の異なるホモログ遺伝子であることを特徴とする、請求項６記載の標的物質の定量方法。
【請求項８】
前記試料が糞便であり、前記標的物質が真核生物の生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項９】
前記真核生物がヒトであり、前記原核生物が真正細菌であることを特徴とする、請求項８記載の標的物質の定量方法。
【請求項１０】
前記試料が糞便であり、前記標的物質がウィルスの生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１１】
前記試料が唾液であり、前記標的物質が真核生物の生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１２】
前記試料が唾液であり、前記標的物質がウィルスの生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１３】
前記試料が粘膜であり、前記標的物質が真核生物の生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１４】
前記試料が粘膜であり、前記標的物質がウィルスの生体関連物質であり、前記標準物質が原核生物の生体関連物質であることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１５】
前記標的物質が癌マーカーであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）における前記標準物質量の測定と、前記工程（ｂ）における前記標的物質量の測定とが、定量的核酸増幅法を用いた測定であることを特徴とする、請求項５〜１５のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１７】
前記定量的核酸増幅法が、定量的ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）であることを特徴とする、請求項１６記載の標的物質の定量方法。
【請求項１８】
前記工程（ａ）における前記標準物質量の測定と、前記工程（ｂ）における前記標的物質量の測定とが、ハイブリダイゼーション法を用いた測定であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか記載の標的物質の定量方法。
【請求項１９】
請求項１５〜１８のいずれか記載の標的物質の定量方法を用いて定量した結果に基づき、癌を診断する方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１６５４０１（Ｐ２００９−１６５４０１Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６７６１（Ｐ２００８−６７６１）
【出願日】平成２０年１月１６日（２００８．１．１６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１６日（２００８．１．１６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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