樹状細胞
本発明は、腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び少なくとも一つの腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片を取り込んだ樹状細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の誘導及び調節の両方において重要な役割を果たす、骨髄由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ヒトＤＣのインビトロでの生成及び操作は、癌に対する免疫系を刺激するために特に有効であり得、腫瘍との戦いにおいて新規の強力なツールであると記載された。実際、異なる種類の癌、例えば、限定されないが、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、頭頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、腎腫瘍、肝細胞癌及び悪性黒色腫を患っている患者において、宿主の免疫系が癌形成を効果的に攻撃する能力の無いことは、ＤＣ機能の低下と完全に相関することが示された。これらの変化は、主に血液中、浸潤性癌の細胞中、及びリンパ節（ＬＮ）中において主に検出された。さらに、大部分の化学療法は、ＤＣ機能を著しく害し、一方で患者のＴ細胞が効果的な免疫応答を引き起こす能力は、健常人において観察されるものと同程度であることが実証されている。この観察は、癌患者の免疫系によって提示された腫瘍形成への開放が、大部分において、ＤＣにおける機能的な欠陥の存在、例えば、未成熟な表現型の維持、及び／又は、ＩＬ−１２分泌とＩＬ−１０分泌との間の不正確なバランスによるものであることを示唆している。したがって、ＩＬ−１０の血清レベルが、癌を患う患者において、健常な同一年齢かつ同一性別の対照においてよりも著しく高いことが示された。ＩＬ−１０は、ＤＣ機能の幾つかの態様、例えば、共刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の発現、及びＩＬ−１２を合成する能力に対して、著しい阻害効果を有することが示されている。重要なことに、ＩＬ−１０で処理されたＤＣは、寛容原性となる。さらに、徐々に腫瘍が増殖している患者において、ＤＣは未成熟であり、かつスイッチがオフの状態であることが報告された。ＤＣの抗腫瘍効果は、それらの活性レベル及び成熟レベルに依存するため、細胞障害性応答を促進する腫瘍特異的Ｔ細胞の誘導の失敗は、ＩＬ−１０とＩＬ−１２との間の誤ったバランス、及び期待されたＴ細胞の活性化を引き起こすために必要とされる成熟マーカーの不在に基づく。実際には、ＩＬ−１０の免疫抑制機能は、ＩＬ−１２の同時産生によって調節され得る。例えば、単球由来の成熟ＤＣは通常、ＣＤ４０Ｌを用いて刺激したとき、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０の両方を分泌することが明らかとされている。この場合において、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０の連動した分泌は、ＩＬ−１２単体の分泌で観察されるもの以上に、癌に対してより効果的な免疫応答を誘導する。ＩＬ−１２産生の軽−高レベルの存在下において、ＩＬ−１０分泌は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+Ｔ細胞）の活性化を促進し、したがって免疫系の適応力（ａｄａｐｔｉｖｅ ａｒｍ）を引き起こす。
【０００３】
現在の免疫治療法の主な目的の一つは、癌に対する宿主の免疫系を効果的に活性化することである。それらの中で、インビトロにおいて培養かつ修飾された、ＤＣ及びＴ細胞の使用は、最も一般的な方法である。多くの小規模なインビトロにおける試験、動物モデル、及び臨床試験が、特に、ＣＤ８+Ｔ細胞によって媒介される強い細胞障害性応答を引き起こすことに関して部分的な成功を示したが、それらは全て、強力な適応応答の確立を示すことができず、そして当該治療が終了して数年後においてでさえ、任意の腫瘍の再発と戦うことができなかった。
【０００４】
ワクチン用にＤＣを使用する最も一般的な手法は、多くの自己の成熟したミエロイドＤＣ（ＭＤＣ）をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）において調製し、それらに癌特異的抗原（単数又は複数）を取り込み（ｌｏａｄ）、そしてそれらを対象へと注射して戻すことである。単球から成熟ＤＣへの分化転換率が低いため、成熟ＤＣの大規模産生に対応するＤＣ前駆体量を得ることが重要である。この目的は通常、（１）ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を有する、又はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１３を有する、白血球分離／水簸由来の単球と、ＤＣとを区別することによって、あるいは（２）密度勾配遠心分離法によって、又は免疫磁性ビーズの使用に基づく市販の閉鎖系を用いて、白血球分離産物から直接的に単離することによって、代替的に達成される。
【０００５】
単球から分化転換された後、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）は取り込みがなされ、そしてインビトロにおいて成熟がなされるべきである。取り込み（ｌｏａｄｉｎｇ）ステップは、幾つかの方法に従って、単一の天然又は修飾タンパク質抗原、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、腫瘍溶解物などとして行われ得るが、成熟化は通常、以下のカクテルの一つの添加によって行われる：（ａ）ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＰＧＥ２；（ｂ）ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ；（ｃ）Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＦＮ−γ。当技術分野において、ＰＧＥ２を含むカクテルを用いて成熟したＤＣはＣＣＲ７をなお発現し、そしてＴｈ１及びＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導するが、ＬＰＳ／Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＦＮ−γを用いて成熟されたＤＣとは対照的に、それらは検出可能に生物活性ＩＬ−１２ｐ７０を分泌することができない。
【０００６】
Ｚｈｏｕ Ｙ．他（Ｊ．Ｉｍｍｕ．Ｔｈｅｒａ．２５（２００２）：２８９−３０３）において、樹状細胞に腫瘍抗原を取り込むための方法が記載されている。この刊行物の著者は、当該取り込みがペプチド若しくはタンパク質、又は代替的に前記ペプチド及びタンパク質をコードする核酸分子を用いて起こり得ると報告している。
【０００７】
Ｏｎａｉｔｉｓ Ｍ．他（Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１１（２００２）：６４５−６６０）において、樹状細胞に抗原を取り込むための幾つかの方法が開示されている。
【０００８】
Ｏｓａｄａ Ｔ．他（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（２００６）：３７７−４１３）の総説において、樹状細胞に基づく免疫療法が記載されている。これらの方法において使用される樹状細胞は、腫瘍関連抗原を取り込み得る。
【０００９】
Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ Ｈ−Ｇ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８４（２００６）：２９０−２９４）において、ワクチン接種の目的のために、ペプチド又はＲＮＡ分子のいずれかを取り込んだ樹状細胞の利点が記載されている。
【００１０】
国際公開第２００６／０２０８８９号において、樹状細胞への、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡ分子又はその断片の取り込みが開示されている。
【００１１】
Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋｉ Ｍ．Ｊ．他（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５５（２００６）：１４９１−１５０３）において、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）をコードするＤＮＡを取り込んだ樹状細胞を産生するための方法が開示されている。かかる細胞は、前記樹状細胞中においてサバイビンを発現することができる。
【００１２】
Ｏｔｔｏ Ｋ．他（Ｖａｃｃｉｎｅ ２３ （２００５）：８８４−８８９）において、腫瘍の予防接種のための、サバイビンのエピトープを取り込んだ樹状細胞の有用性が調べられた。
【００１３】
Ｈｓｕ Ａ．Ｋ．Ｗ．他（Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１２（２００６）：８５５−８６７）において、サバイビンをコードするｍＲＮＡ分子を取り込んだ樹状細胞が開示されている。
【００１４】
Ｍｏｒｓｅ Ｍ．Ａ．他（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１９９８）：２９６５−２９６８）において、樹状細胞への、腫瘍関連抗原であるＣＥＡに由来するペプチド又はそれをコードするＲＮＡの取り込みが開示されている。
【００１５】
同様にＮａｉｒ Ｓ．Ｋ．他（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８２（１９９９）：１２１−１２４）において、腫瘍関連抗原であるＣＥＡを取り込んだ樹状細胞が開示されている。
【００１６】
Ｆｕｅｓｓｅｌ Ｓ．他（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６６（２００６）：８１１−８２１）において、ＰＳＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、サバイビン、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）及び一過性受容体電位ｐ８（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐ８）を取り込んだ樹状細胞を８人の患者へ投与する臨床試験が開示されている。
【００１７】
これらの全ての文献は、タンパク質抗原（単数若しくは複数）又はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ抗原（単数又は複数）のいずれかに基づく取り込み方法を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
向上した免疫学的特性を示す樹状細胞を提供することが、本発明の目的である。
【００１９】
これらのＤＣは、（ａ）ｉＤＣと比較して、少なくとも８０％減少した食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｎｇ）の能力；（ｂ）刺激（例えば、限定されないが、ＣＣＬ１９及び／又はＣＤ４０Ｌ）に応答して遊走する能力；（ｃ）成熟した表現型、すなわち、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲの高い表面発現；（ｄ）ＩＬ１０分泌を伴うか又は伴わない、軽〜高レベルのＩＬ−１２分泌；（ｅ）ＣＤ４０Ｌを用いた刺激に基づく、取り込んだ抗原（単数又は複数）の表面発現、を好ましくは示すはずである。
【００２０】
ＣＤ８+Ｔ細胞（細胞障害性）による短期間免疫応答、及びＣＤ４+Ｔ細胞（適応性）による長期間免疫応答の両方の活性化かつ確立が、これらのＤＣによって達成されるさらなる目的である。
【００２１】
本発明は、腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び少なくとも一つの腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片を取り込んだ樹状細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣ中の、サバイビン及びＰＳＡの発現を示す。
【図２】図２は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣの表現型を示す。
【図３】図３は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣによるＩＬ−１０及びＩＬ−１２の分泌を示す。
【図４】図４は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣと共にインキュベーションしたときにおけるＴ細胞の増加誘導を示す。
【図５】図５は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣにより示される、自発的な及び（ＣＣＬ１９によって）誘導された細胞遊走を示す。
【図６】図６は、実施例に記載した通りに培養された、未成熟、半成熟の、取り込みしていないＤＣ／ｍＲＮＡを取り込んだＤＣ、及びサバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣにより示される、自発的な及び（ＣＣＬ１９によって）誘導された食作用を示す。
【図７】図７は、二重取り込みしたＤＣと共にインキュベーションした時における、細胞障害性Ｔ細胞及びＴ−ｍｅｍの刺激を示す。一方で、Ｔ−ｒｅｇの数が、二重取り込みしたＤＣを用いたインキュベーション時において強く下方制御された。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
少なくとも一つの核酸分子によってコードされた抗原は、内因性タンパク質へと翻訳され、したがってＤＣによって処理され、そしてＭＨＣ−Ｉと複合化してそれらの細胞膜上において曝される。このようにして、ＭＨＣ−ＩがＣＤ８+のみに抗原を曝すという事実のために、それは細胞障害性応答を誘発する。一方、ＤＣへと取り込まれたタンパク質抗原は、前記ＤＣによって外来性のタンパク質抗原として処理され、そしてＭＨＣ-ＩＩと複合化されてそれらの細胞膜上に曝されるであろう。このようにして、ＭＨＣ−ＩＩがＣＤ４+のみに抗原を曝すという事実のために、それは適応性応答（ａｄａｐｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発する。したがって、少なくとも一つの核酸分子及び腫瘍抗原タンパク質の二重の取り込みは、以下を保証する：（ａ）ＭＨＣ−Ｉを通じて曝された抗原の認識に基づく、細胞障害性Ｔ細胞、ＮＫ、及びＮＫＴを通じた細胞障害性を活性化することによる免疫系の短期間応答；（ｂ）ＭＨＣ−ＩＩを通じて曝された抗原の認識に基づく、ＣＤ４+依存性持続的ＣＤ８+活性化による、細胞障害性応答の安定性；（ｃ）ＭＨＣ−ＩＩを通じて曝された抗原の認識に基づく、メモリーＴ細胞及びＢ細胞のカスケード活性化による、抗体媒介性メモリー応答の活性化。
【００２４】
簡潔に言えば、二重取り込み法は、（ａ）最初の効果的な腫瘍除去に必要とされる、短期間での細胞障害性応答を活性化し；（ｂ）ヘルパーＴ細胞を活性化することによって、一般的に遷移するものであり、したがって高度に効率的ではない細胞障害性応答期間を拡張し；（ｃ）長期間必要であるが、細胞障害性とは異なり、治療の終了から数年後でさえ腫瘍に対して免疫系を活性化する適応免疫応答の活性を促進し、そしてその確立を維持する。
【００２５】
本発明のＤＣは、好ましくは（ａ）万能性腫瘍関連抗原（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｕｍｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ）（又はｕＴＡＡ、そしてそれは、２個超、好ましくは５個超、より好ましくは１０個超、さらにより好ましくは２０個超、特に３０個超の異なるタイプの腫瘍中に存在する）を取り込み、及び／又は、（ｂ）タイプ特異的（ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）腫瘍抗原（ＴＡＡ；単一の腫瘍タイプ、及び／又は単一の腫瘍ファミリータイプの特性）を取り込む。例えば、本方法は、２つの最も一般的なｕＴＡＡ：サバイビン及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ＴＥＲＴ）との併用での使用に適用され得る。実際、これら２つの抗原の発現は腫瘍細胞において限定されており、一方で健常細胞／組織において全く発現していないか、又はごく少量のレベルで発現している。実際、サバイビンはアポトーシス（プログラム細胞死）から細胞を救出し、そしてＴＥＲＴは細胞の不死化を促進し、これら２つの特徴は健常細胞よりも制限が解除されているのが典型的である。したがって、サバイビンは、ほとんど胚及び胎児発達の間においてのみ発現されるが、最終的に分化した正常な成人組織において検出不能となり、一方でそれは、腫瘍細胞株及び幾つかのヒト癌細胞において、３４〜１００％の頻度で再発現する。同様にＴＥＲＴタンパク質は、そのＲＮＡサブユニットからではないのだが、腫瘍形成の非常に早期の段階においてさえ、ほとんど腫瘍細胞においてのみ発現されている。予後因子として、サバイビン及びＴＥＲＴの発現は、癌、例えば乳癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、肺癌及び食道癌における芳しくない臨床転帰と非常に関連がある。サバイビン及びＴＥＲＴは、正常組織と比較して腫瘍組織において優先的に発現されているため、正常な分化細胞における副作用は起こり得ない。実際、サバイビンペプチド又はＴＥＲＴ ｍＲＮＡ若しくはペプチドを取り込んだＤＣで処理された患者は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されるような、サバイビン又はＴＥＲＴに対する優れた免疫反応性の誘導にもかかわらず、ワクチン接種部位における局所的反応以外で、免疫療法と関連する任意の有害事象へと発展しないことが、最近の研究において実証された。さらに、腫瘍応答時における、サバイビン及びＴＥＲＴに対する強い免疫応答は、ワクチン接種後における腫瘍退縮を強調する。
【００２６】
代替的に、本発明のＤＣは、特定の腫瘍を処置及び／又は予防するために使用され得る。例えば乳癌の場合において、ＤＣは、Ｈｅｒ２−タンパク質及びＭｕｃ−１ ｍＲＮＡを取り込んでもよい。
【００２７】
ＤＣに取り込まれるべき抗原の別の可能な組み合わせは、前立腺癌の場合において、ＰＳＡタンパク質及びサバイビン−ｍＲＮＡである。
【００２８】
最終的に、ＤＣに核酸分子の混合物及びタンパク質抗原の混合物を同時に取り込ませることが可能である。
【００２９】
特定の腫瘍細胞によって特異的に発現される腫瘍関連抗原は、当業者に既知である。したがって当業者は、別個のタイプの癌を患う個人、又は癌となるリスクを有する個人を治療するために、または予防的にワクチン接種するために使用され得る、取り込みを行う樹状細胞を製造するために必要とされる抗原を選択し得る。
【００３０】
したがって、本発明のＤＣは、２つの異なるタイプの分子：核酸分子（単数又は複数）及びタンパク質分子（単数又は複数）を取り込む。
【００３１】
免疫増強性ＤＣを製造する場合において、核酸、特にｍＲＮＡのトランスフェクションは、他の抗原取り込み技術よりも優れていることを比較試験は示唆している。さらに、ＤＣへの、例えばｍＲＮＡの取り込みは単純かつ効果的である。微少量の腫瘍組織から核酸分子を増幅する能力は、各々の癌患者へのＤＣワクチン接種の使用を拡張する。
【００３２】
ＤＣへの、核酸をコードする限定された腫瘍抗原の取り込みは、単純であり、再生産性があり、そして有効である。配列が既知である、遺伝子産物に対応する核酸分子は、好適なプライマー及びポリメラーゼ連鎖反応、ｍＲＮＡの場合においては、転写反応と連動された逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、インビトロにおいて速やかに生成され得る。インビトロにおいて製造される非細胞由来産物の臨床的使用のための核酸の製造は、費用効果があるように、そして定められた方法で行われ、したがって規制認可行程を合理化かつ簡素化する。これは、試験研究における利用可能性を限定し、そしてそれらの臨床的評価を制限する、ウィルスベクターの使用の複雑性及び制限と対比される。さらに、特にＲＮＡ手法は、この種の治療において遭遇する一般的な問題：大部分の場合において、癌患者に対する有効かつ持続的な免疫プロトコルのために必要とされる抗原の量を発生させるために十分な腫瘍組織を得ることが可能ではないという事実、に対する実用的な解決を提供する。実際、当該ＲＮＡ手法によって、微少量の腫瘍組織由来の対象の抗原の、単純かつ直接的なＰＣＲ型増幅が可能であり、そしてそれは実質上、無尽蔵の抗原を提供する。未成熟ヒト単球由来ＤＣの、抗原ｍＲＮＡとの、培地のみ中におけるインキュベーションは、抗原特異的ＣＴＬ応答を刺激するために、ＤＣを感作するために十分であり、脂質の存在中においてトランスフェクトされたＤＣに関連するものほど優れていないとしても、同程度のものであることが示された。
【００３３】
本明細書において使用される用語「腫瘍関連抗原タンパク質」は、タンパク性構造、例えばポリペプチド、タンパク質及びペプチドを含むか、又はからなる、腫瘍関連抗原のことである。本発明の腫瘍関連抗原タンパク質の断片は、少なくとも１０個の、好ましくは少なくとも２０個の、より好ましくは少なくとも３０個の、さらにより好ましくは少なくとも５０個の、前記腫瘍関連抗原の連続したアミノ酸残基を有する。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態に従って、少なくとも一つの核酸分子によってコードされた腫瘍関連抗原又はその断片は、（ａ）ｕＴＡＡの群、例えば、限定されないが、サバイビン及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、並びに／又は、（ｂ）腫瘍特異的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、限定されないが、ＰＳＡ、ｍｕｃ−１などから選択される。特定の好ましい実施形態において、少なくとも一つの核酸分子によってコードされる腫瘍関連抗原又はその断片は、サバイビン及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の樹状細胞は、当技術分野において既知である、取り込みされた樹状細胞を超える幾つかの利点を有する：（ａ）たとえ原発腫瘍が、続発性の転移とは異なる（ｕ）ＴＡＡ発現パターンを示すとしても、及び／又は、腫瘍の進行によって、一つ以上の腫瘍病巣における（ｕ）ＴＡＡ発現パターンの変化を伴うとき、より多くの抗原の同時使用によって、標的範囲を増加させることが可能である；（ｂ）場合によりＴＡＡとの併用によるｕＴＡＡの使用は、実質的に任意の腫瘍への治療の適用性を拡張する；（ｃ）発現が腫瘍細胞にほぼ完全に制限され、一方で治療の有効性を増大させる、ｕＴＡＡの使用は、任意の（深刻な）副作用の増大を著しく減少させる；（ｄ）核酸分子によってコードされる少なくとも１つの（ｕ）ＴＡＡ、及び少なくとも一つのタンパク質ｕＴＡＡの使用は、短期間の遷移性細胞障害性応答、及び長期間の安定性適応応答の両方の確立を誘発し、そして維持する。
【００３６】
特に、核酸（例えばＲＮＡ）及びタンパク質取り込みの同時使用は、外因性タンパク質抗原の処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及び存在（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を通じた、ＭＨＣ−ＩＩの活性化のみによって誘発され得るＴ−ｒｅｇの応答を引き起こす危険性を回避し、一方で、２つの異なる応答を引き起こす：（ａ）ＭＨＣ−Ｉ分子と結合した抗原を認識する、ＣＤ８+Ｔ細胞によって媒介される、細胞障害性の、早期及び短期間応答。これらの細胞は、それらの表面上にＤＣ提示抗原を保持する他の細胞を直接攻撃する。この種の応答は、厳密に制御され、そして一般的に非常に強いＭＨＣ／抗原活性化シグナル、及び／又は「ヘルパーＴ」細胞によって提供される追加の活性化シグナルを必要とする；（ｂ）マクロファージ、ＣＴＬ及び抗体を産生するＢ細胞の活性を刺激するＣＤ４+Ｔ細胞（Ｔｈ）によって媒介される、メモリー性の、安定かつ長期間応答。実際、ヘルパーＴ細胞は、先天性及び適応性の両方の免疫応答を制御し、そしてどのタイプの免疫応答を身体が産生するかを決定することを助ける。長期間活性メモリーは、Ｂ及びＴ細胞の特異的な活性化によってのみ獲得され、かかる活性化を誘発する抗原が非常に免疫原性であることを必要とする。核酸分子によってコードされる少なくとも一つの（ｕ）ＴＡＡ、及び少なくとも一つの（ｕ）ＴＡＡタンパク質抗原を取り込んだ本発明のＤＣは、（ａ）大部分が食作用の能力を失っている。この特徴は、取り込まれた抗原に対する独占的なＴ細胞の特異的活性化を保証するために重要である；（ｂ）刺激要因、例えばＣＣＬ１９及び／又はＣＤ４０Ｌに対する応答で遊走する能力を保持している。この特徴によって、ＤＣは注入部位からリンパ節、及び／又は高濃度のＴ細胞が存在する場所へと遊走することができる；（ｃ）成熟した表現型、すなわち、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲの高い表面発現を示す。適切な数のＴ細胞を減少させ、及び活性化するために重要である；（ｄ）軽〜高レベルのＩＬ−１２、及び軽〜無のＩＬ−１０を分泌する。この特徴は、ＤＣが細胞障害性応答を維持し（ＩＬ−１２）、そしてヘルパーＴ細胞の活性化を潜在的に増加させる（ＩＬ−１０）ことを保証する；（ｅ）ＣＤ４０Ｌを用いた刺激に基づいて、取り込まれた抗原（単数又は複数）の表面発現を示す。この特徴は、Ｔ細胞のＤＣ刺激の特異性を決定するために重要である；（ｆ）凍結／解凍サイクルの後に採取及び再培養する場合、小円形細胞から伸長する幾つかの指状のものの接着及び存在によって、及び細胞集団の存在によって特徴付けられる、典型的な樹状形態を示す。この特徴は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてのＤＣ機能の特質を構成する；（ｇ）それらの活性表現型及び／又は機能を失わせることなく、−８０℃〜−１８０℃で貯蔵され得る。
【００３７】
さらに、本発明はまた、異なる固形癌及び血液癌を患う患者の治療における、異なるタンパク質腫瘍抗原又はその断片との併用での、ＴＥＲＴ及び／又はサバイビンｍＲＮＡを取り込んだ、成熟ＤＣの使用に関し、好ましくは、遊走できるが食作用の無い前記成熟ＤＣの使用に関する。
【００３８】
本発明、特にその好ましい実施形態は、先行技術を超える多くの利点、例えば、患者のＰＢＭＮＣ由来の純粋な単球の多量の単離、末梢血単球（ｐＭｏｓ）から成熟ＤＣへの、４０〜８０％の形質転換率、ＧＭＰ及びｒｅ−ｖｉｖｏにおける使用準拠プロトコル、ＧＭＰ準拠実験室における標準的な製造、無血清プロセスの可能性、任意のタイプの固形及び液体腫瘍に実質的に適用可能な治療、表現型的及び機能的に成熟した、大量のＤＣの利用可能性、数年間貯蔵され得る、すぐに使用可能な製造物、非常に増大された細胞障害性応答、非常に増大された適応性応答、Ｔ−ｒｅｇ応答の阻害、最少の細胞操作を用いた技術、腫瘍組織／細胞の不要性、タンパク質形態で投与された抗原との併用の結果としての、ＭＨＣ−ＩＩの同時活性化と一緒になった、ｍＲＮＡ取り込みの結果としての、ＭＨＣ−Ｉを用いて腫瘍抗原を曝す可能性、万能に発現される抗原、及び癌特異的抗原の組み合わせ、凍結／解凍サイクルの後の高い細胞生存率、及び凍結／解凍サイクルの後における細胞の機能及び表現型の完全な保存を提供する。
【００３９】
本明細書において使用される用語「断片」は、少なくとも一つの野生型タンパク質のエピトープを保持する、万能性又はタイプ特異的腫瘍関連抗原の一部又は一続き（ｓｔｒｅｃｈ）のことである。結果的に、樹状細胞に組み込まれるために使用された、万能性又はタイプ特異的腫瘍関連抗原の「断片」は、少なくとも一つのＴ細胞受容体と結合し、そしてそれは、かかる万能性又はタイプ特異的腫瘍関連抗原を発現する細胞に対して非常に特異的な免疫応答を促進する。当該「断片」は、同様に、その免疫活性を増加させるために、インビトロで修飾かつ合成された、万能性又はタイプ特異的腫瘍関連抗原の一部又は一続きのことである。
【００４０】
用語「断片」は、ＲＮＡ及びタンパク質抗原の両方のことである。
【００４１】
同様に、「タンパク質腫瘍抗原」の定義は、単離された、又は化学的に／組み換えにより製造された、タンパク質及びペプチドの全体及び一部に加えて、腫瘍滲出物及び溶解物を含む。本発明にしたがって、アミノ酸修飾（欠失、置換、挿入）を含む腫瘍関連抗原及びその断片は、本明細書において使用されるように、腫瘍関連抗原及びその断片の定義に含まれる。これは、これらの修飾分子がなお、野生型腫瘍関連抗原又はその断片と類似の又は同一の機能を示すという条件下においてである。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態に従って、核酸分子はリボ核酸、好ましくはｍＲＮＡである。
【００４３】
ｍＲＮＡ及び腫瘍特異的タンパク質／ペプチドを同時に取り込んだＤＣは、ほぼ完全に食作用の能力を失っているが、刺激因子への応答おける遊走能力を保持し；軽度のＩＬ−１０分泌を伴うか、又は伴わずに、高いＩＬ−１２産生を示し；Ｔ細胞の細胞障害性応答を向上させ；ｍＲＮＡによってコードされた抗原が、ＤＣによって内因性タンパク質として処理されるため、したがってＭＨＣ−Ｉと複合化され；外因性タンパク質がＭＨＣ−ＩＩと共に複合化されたＤＣによって処理されるという事実のために、ＭＨＣ−ＩＩを通じたＴ−ｍｅｍ応答を誘導し；Ｔ−ｒｅｇを活性化しない。
【００４４】
ＤＣは、ｍＲＮＡをコードした抗原を、以下の理由で取り込む：
・ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣは、インビトロにおけるＣＴＬ応答を刺激するときにおいて、ペプチドパルス（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ）ＤＣと同等、又はより強力である（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０（４）：１０２８−３４）；
・ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣは、最も効果的なＡＰＣであり、インビトロにおいてＣＤ８+応答を刺激することができる（Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ．ａｎｄ Ｊ．Ｖｉｅｗｅｇ（２００４）．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９：２５１−６３）；
・ｍＲＮＡトランスフェクションは、非常に有効であるため、それはＤＣ変異工程を誘導し及び貢献することができる（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５（８）：４７１０−７ ａｎｄ Ｈｅｉｓｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０９（３）：４０９−１７）；
・ｍＲＮＡは、ＣＴＬ応答として測定されるように、受動的トランスフェクションを経由して、非常に効率的にＤＣに組み込まれ得る（Ｎａｉｒ，Ｓ．Ｋ．（１９９８）．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５（１１）：１４４５−６）。
【００４５】
ｍＲＮＡ及び核酸分子を取り込む方法は、他の取り込み技術に対して幾つかの利点を示すが、この手法はまた、少なくとも１つの弱点がある：それは、ＣＤ８+細胞の活性化を通じて強力なＣＴＬ応答を引き起こすが、たとえかかる応答が腫瘍に対する効率的な免疫応答の確立に重要であることが示されているとしても、それは効果的なＣＤ４+応答を誘導することができない。実際、ＣＤ４+細胞は、ＣＤ８+ＣＴＬの拡張及び持続のために重要な機能を提供し；腫瘍部位における免疫系の固有の力を刺激し、そして局所的な血管新生を阻害する。最適な抗腫瘍免疫応答は、したがって、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞が引き起こす免疫応答の両方の同時の活性化を必要とする。
【００４６】
この目的を達成するために、ｍＲＮＡ取り込み手法に加えて、第二の取り込みステップ：受動的インキュベーションによるタンパク質抗原の取り込み、が導入された。ｍＲＮＡインキュベーションによって刺激されたＤＣは、例えば、短いペプチドを食作用により取り込む（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）能力の増大を示す。したがって、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の免疫応答力を誘導するための二重取り込み（ｄｏｕｂｌｅ−ｌｏａｄｉｎｇ）法の使用が有利であることが判明した。この方法は、それが、ＣＤ８+の活性化による短期間応答、及びＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を通じた長期に渡るメモリー応答を同時に誘導することができるため、ＤＣをベースとした癌免疫治療の大きな改善を構成する。
【００４７】
この二重取り込み法は、当技術分野において既知の他の方法に対して、幾つかの利点を有する：
・免疫系の細胞障害性及びメモリー力の両方の特異的活性化；
・Ｔ−ｒｅｇ応答の不在；
・刺激因子の感受性及び力の両方において結果的に生じる利益を有する、個々の免疫系の力の活性化を目的とする異なる抗原の使用；
・固形腫瘍及び血液腫瘍の任意のタイプに実質的に利用可能な治療；
・万能性及びタイプ特異的腫瘍抗原の組み合わせ；
・ＧＭＰ及びｒｅ−ｖｉｖｏ使用における全準拠性；
・数年間貯蔵可能である使用準備済みの製造物；
・最少の細胞操作；
・腫瘍組織／細胞の不要性；
・核酸分子（単数又は複数）によってコードされた（ｕ）ＴＡＡ（単数又は複数）及び（ｕ）ＴＡＡ（単数又は複数）タンパク質抗原（単数又は複数）のそれぞれを取り込む時における、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ複合体の同時活性化；
・凍結／解凍サイクルの後における、細胞の高い生存率；
・凍結／解凍サイクルの後における、細胞の機能及び表現型の高い保存；
・当該方法の多用途性。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施形態に従って、核酸分子は、完全長野生型ｍＲＮＡ、当該野生型ｍＲＮＡの断片、完全長インビトロ修飾ｍＲＮＡ、当該インビトロ修飾ｍＲＮＡの断片、２つ以上の完全長、断片、野生型、又は修飾型のｍＲＮＡの混合物をさらに含む。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態に従って、タンパク質抗原は、完全長野生型ｍＲＮＡ；当該野生型ｍＲＮＡの断片；完全長インビトロ修飾ｍＲＮＡ；当該インビトロ修飾ｍＲＮＡの断片、２つ以上の完全長、断片、野生型、又は修飾型のｍＲＮＡの混合物；異種抗原と結合した、完全長抗原又は抗原断片、例えば、限定されないが、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）；単離された又は化学的／組み換えによって産生された腫瘍溶解物及びペプチドを含む。用語、タンパク質抗原は、抗原、タンパク質、ペプチド及び溶解物の混合物を同様に含む。
【００５０】
本発明の樹状細胞の製造は、任意の種類の腫瘍関連抗原を取り込んでなされ得る。しかし、当該腫瘍関連抗原は、好ましくは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン（ＭＵＣ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＢＲＣＡ及びｒａｓからなる群から選択される特異的腫瘍関連抗原、並びに／或いはサバイビン及びＴＥＲＴからなる群から選択される万能性腫瘍関連抗原である。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態に従って、樹状細胞は、ヒト又は動物由来である。
【００５２】
本発明の樹状細胞は、好ましくは、ヒト個人の末梢血からの自己ＤＣの拡張に基づく。末梢血単核細胞（ＰＢＭ−ＮＣ）を、白血球分離を通じて回収し、その後、選択されたＤＣ前駆体を構成する単球（Ｍｏ）画分を増大させるために、水簸又は勾配遠心分離（すなわち、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離）を行う。個人からＭｏを得るために、この方法は、したがって、中間ステップ、例えば、一方でＧＭＰに準拠しない、及び他方で汚染源となり得るビーズの使用を通じた濃縮の必要性無しに、速やかに培養され得る、高純度かつ大量のＤＣ前駆体を保証する。Ｍｏをその後、ＧＭＰ準拠実験室において、ＧＭＰのみならず無血清かつｒｅ−ｖｉｖｏ順応した培養培地を用いてＤＣへと分化させる。
【００５３】
ＤＣは、好ましくは、それらがまだ未成熟であるときに核酸分子（単数又は複数）を取り込み、成熟され、そしてその後タンパク質抗原（単数又は複数）を取り込む。代替的に、ＤＣは、それらがまだ未成熟のときに、核酸分子（単数又は複数）を第一に取り込み、そしてその後タンパク質抗原（単数又は複数）を取り込み得、そしてその後成熟される。さらに、ＤＣは、核酸分子（単数又は複数）を第一に取り込み、その後成熟され、そして同時にタンパク質抗原（単数又は複数）を取り込み得る。最終的に、核酸分子（単数又は複数）が最初であり、タンパク質抗原（単数又は複数）がその後であるという取り込みの順番は、逆にされ得る。使用される方法に従って、取り込んだＤＣによってなされる免疫応答を調節することが可能である。
【００５４】
ＤＣは、現在利用可能である標準的なカクテルの一つを添加することによって成熟され得るが、好ましくはＲｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＦＮ−γの使用によってなされ得る。
【００５５】
成熟したＤＣは、それらの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％が二重に取り込んでいる場合にのみ、好ましくは患者へと注射される。
【００５６】
本発明の別の態様は、腫瘍関連抗原をコードする少なくとも一つの核酸分子、又はその断片、及び腫瘍関連抗原であるタンパク質分子、又はその断片を取り込んだ樹状細胞の製造方法に関し、好ましくは、本発明に従って、以下のステップ：
・樹状細胞を提供し；
・上記の通り、前記細胞に腫瘍関連抗原をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び腫瘍関連抗原であるタンパク質分子、又はその断片を取り込み；そして場合により
・前記ＤＣを成熟させること
を含む、前記製造方法に関する。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態に従って、樹状細胞源は、それらの自己前駆体、すなわちＰＢＭＮＣ由来単球からなる。当該単球は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で５〜６日かけて、未成熟ＤＣへと分化変換される。
【００５８】
樹状細胞は、代わりに、直接的に全血から単離され得る。樹状細胞の直接的な単離、及び単球の樹状細胞への分化転換の手順は、当技術分野において既知である。本発明の手順は、４０〜８０％の初期ＭｏがＤＣとなることを保証するが、普及している手順は約１０〜２０％保証する。
【００５９】
ＤＣは、共刺激分子のレベルを増大させるために、及び強力かつ持続的な腫瘍特異的Ｔ細胞の細胞障害性応答を引き起こすために、最終的にインビトロで成熟される。本発明の成熟化カクテルは完全にＧＭＰに準拠したものであり、そして現在普及して行われている方法と比較して、軽度のＩＬ−１０分泌を伴わない又は伴う、長期のＩＬ−１２産生を保証する。さらに、これらのＤＣは、ＣＤ４０Ｌを用いた刺激で、高レベルのＩＬ−１２及び低量のＩＬ−１０を産生することができ、そして凍結／解凍サイクルにおいて、ＤＭＳＯ１０％中、又はグリセロール１０％中において１年間の冷凍保存（−１５０℃）された後でさえ、生存可能で、表現型において、形態学的に、そして機能的に活性であり続ける。本明細書において記載された方法がＧＭＰ準拠最終生産物の製造のために使用される時、その放出は、生存率、表現型的、形態学的、及び機能的活性、冷凍保存及び冷凍／解凍サイクルにおける安定性、患者へ適用されなければならないＤＣの純度及び滅菌度を完全に決定するために設計された、厳密な最終生産物調節（Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＥＰＣ）の成功する通過への条件である。最終生産物は、好ましくはグリセロール（１０％）又はＤＭＳＯ（１０％）中で、すなわち、その質を長期間保存することによって当該生産物をすぐに使用可能とするものであり、ＧＭＰに準拠しており、そして使用された濃度において副作用を引き起こさない凍結培地中で保存される。これらの冷凍培地は同様に、当該製造物の長期に渡る活性（ＩＬ−１２分泌、Ｔ細胞刺激及び遊走）を供与する。二重取り込みされたＤＣは、ほぼ完全にそれらの食作用を行う能力を失っているが、刺激因子及び非常に低い温度への応答における遊走する能力、自発的に遊走する能力を保持し、軽度のＩＬ−１０分泌を伴う又は伴わない、高いＩＬ−１２産生を示し；そしてＴ−ｒｅｇの活性化を引き起こさずに、Ｔ細胞の細胞障害性応答及びＴ−ｍｅｍ応答を向上させる。
【００６０】
本発明の別の実施形態にしたがって、未成熟の樹状細胞は、取り込み時又は取り込み後において、及びタンパク質抗原の取り込み中に成熟される。
【００６１】
樹状細胞は、好ましくは、Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＮＦ−γを添加することによって成熟される。
【００６２】
本発明の別の態様は、本発明において記載された方法に従って分化転換され、及び／又は培養され、取り込まれ、及び成熟がなされた樹状細胞に関する。
【００６３】
本発明の樹状細胞が医薬／臨床グレードの調製物中において提供され得るため、本発明のさらに別の態様は、本発明の樹状細胞を含む、医薬／臨床グレードの調製物である。前記調製物は、実質的に任意のタイプの固形癌及び血液癌の治療又は予防において使用される。二重取り込み成熟ＤＣは、好ましくは一週間に一回、又は二週間に一回接種される。この製造物は、自家産物から成り、したがって多くの個別の成分を示し得るため、継続的なモニタリングの間に患者において観察される結果に従って、投与経路は一週間に一回から一か月に一回の投与の間で変化し得る。ＤＣは、好ましくは皮内投与又は節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）投与される。代わりにそれらは、治療される癌に依存して、傍絞輪部に（ｐａｒａｎｏｄａｌｌｙ）、結節周囲に（ｐｅｒｉｎｏｄａｌｌｙ）、皮下に、又は静脈内に投与される。
【００６４】
ＤＣは、好ましくはできる限り腫瘍近辺で投与される。標準的投与量は、好ましくは約７〜１３×１０6個のＤＣであり、そしてそれは最終容積０．５〜１ｍＬの凍結培地に溶解される。
【００６５】
当該治療は、２〜２０回に含まれる注入回数でなされる。当該産物は、限定されないが、１０％グリセロール又は１０％ＤＭＳＯ中で貯蔵され、最大で１０分間（１０’）、室温で解凍され、そして速やかに投与される。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態に従って、当該産物の投与は、免疫刺激剤及び／又はアジュバントの投与を伴い得る。その使用は、化学療法に付随して、及び化学療法の間の休止期間中において同様に好適であるが、免疫抑制療法及び／又はＴ細胞（癌に対する免疫応答の、ＤＣによる活性化の好ましい標的）の著しい減少下において好適ではない。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、個人における癌を治療又は予防するためのワクチンの製造のための、本発明の樹状細胞の使用に関する。
【００６８】
腫瘍関連抗原（上記参照）をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び腫瘍関連抗原（上記参照）である少なくとも一つのタンパク質分子を取り込む、本発明の樹状細胞は、癌を患う個人を治療するため、又は個人が癌を発症することを予防するために好適に使用され得る。
【００６９】
本発明は、以下の図及び実施例によってさらに説明されるが、それらに限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
１．前臨床パイロット実験
単球を、患者の白血球除去物（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓａｔｅ）から単離し、そして以下のマーカーで観測した：
【００７１】
【表１】
【００７２】
続いて、白血球除去により回収したＰＢＭＮＣをフィコライズ（ｆｉｃｏｌｉｚｅｄ）し、再集計し、そして先に記載した通りに観測した。この点について、フィコライズされた細胞又は水簸由来の細胞を、吸着のために２時間ＣｅｌｌＧｒｏ中において固定し、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００〜２５００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加した。その後、上清と共に非吸着細胞を除去し、そして吸着細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００〜２５００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で、１〜２Ｍｉｏ／ｍＬで５〜６日間、単球を未成熟ＤＣへと分化転換するためにさらに培養した。その後、当該細胞にｍＲＮＡを取り込んだ。簡単に、ＤＣをＰＢＳで二度洗浄し、集計し、そして３００ｘｇで１０分間回転させた。それらをＣｅｌｌＧｒｏ培地中で再懸濁し、そして３７℃／５％ＣＯ2の加湿インキュベーター中、２〜４時間、ｍＲＮＡ含有溶液（０．１〜１００μｇＲＮＡ／１×１０6ＤＣ）中でインキュベートした。洗浄することなく、当該培地をその後、３７℃／５％ＣＯ2の加湿インキュベーター中、２〜１２時間、タンパク質抗原溶液（０．１〜１００μｇペプチド／１×１０6ＤＣ）と共にインキュベートした。その後、洗浄することなく、当該培地にＲｉｂｏｍｕｎｙｌ（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）及びＩＮＦ−γ（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加し、そして８〜２４時間成熟させた。グリセロール（水溶液）１０％中、各々少なくとも１０００万個のＤＣの分割量で成熟ＤＣを貯蔵した。
【００７３】
品質管理（ＱＣ）を下記の通りに行った：１分割量の細胞を解凍し、そして培地中に４８時間置いた。
【００７４】
表現型：
【００７５】
【表２】
【００７６】
成熟ＤＣは、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲの上方制御を示した。
【００７７】
細胞の生存率を、ＧＭＰ遵守ソフトウェアと共にＣａｓｙ Ｃｏｕｎｔｅｒによって測定し、そしてそれは少なくとも７０％以上でなければならない。
【００７８】
Ｔ細胞及びＢ細胞による汚染を、ＦＡＣＳを通じてＣＤ３及びＣＤ１９陽性細胞を検出することによって観測した。汚染は常に２５％未満に維持された。
【００７９】
機能性：
免疫活性試験を、ＩＳＯ９００２認証されたＥＬＩＳＡアッセイを通じた、ＩＬ１２対ＩＬ１０の産生の分析を通じて、及び混合白血球反応を経由した白血球増殖の誘導の分析を通じて行った。
【００８０】
ｄｌ−ＤＣの食作用及び遊走活性を、ＦＩＴＣ−デキストラン摂取及びＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイのそれぞれによって観測した。
【００８１】
２．臨床試験計画
表題：「アジュバント療法終了後８週間である進行性卵巣上皮癌の対象において、ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡ及びサバイビン−ペプチド二重取り込み完全成熟ＤＣを用いた、活性な免疫療法の安全性を調査するための、フェーズＩ無作為化オープン試験」
【００８２】
フェーズ：フェーズＩ
適応：進行性卵巣上皮癌
【００８３】
試験目的：アジュバント療法終了後８週間である進行性卵巣上皮癌の患者において、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）−ｍＲＮＡ及びサバイビン−ペプチド二重取り込み完全成熟ＤＣ（樹状細胞）を用いた、活性な免疫療法の安全性を調査するため。播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）減少の観点における有効性は、第二の目的として調査される予定である。
【００８４】
試験計画：これは、進行性卵巣上皮癌の患者におけるオープンフェーズＩ試験である。患者は、１週間に１回投与での治療アームＡ対２週間に１回投与での治療アームＢへと無作為化された。個々の患者は、全体で８回の皮内注射を受けることとなる。当該治療コースは、治療群Ａに関する週１回の８回注射、及び治療群Ｂに関する２週間に１回の８回注射を含む。
【００８５】
患者は安全性パラメータを調査され、そして腫瘍状態を１２、２４、３６、４８、７２、及び９６週目において疾患の増悪まで評価される。治療の終了後（治療アームＡにおいては７週目、治療アームＢにおいては１４週目）、患者は、疾患増悪、死亡又は試験の終了まで２４ヶ月間調査される。疾患増悪後、患者は、死亡又は試験終了まで調査されることとなる。
【００８６】
ｃＧＣＰガイドラインルールを準拠するために、最初の６人の患者は、管理された条件下において４８時間観察されることになる。
【００８７】
予定されるサンプルサイズ：２５人の患者
【００８８】
治療継続期間：各々の患者は、合計８回の皮内注射を受け、臍傍に投与されることになる。治療コースは、８回の注射サイクル（１サイクルにつき１回注射）を含み、治療アームＡにおいては１週間に１回、そして治療アームＢにおいては２週間に１回である。
【００８９】
試験治療：ＩＭＰは、５％グルコースの生理水（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｗａｔｅｒ）溶液中に溶解された１０％ＤＭＳＯから構成される、０．５ｍＬ標準凍結溶液中で希釈された、ＧＣＰ準拠の標識付き２ｍＬクライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中に含まれる、ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡ及びサバイビン−ペプチドを二重取り込みした、１×１０7±３０％の自己の完全成熟ＤＣからなる。ＩＭＰは、凍結されて提供され、そして一旦ＲＴにて最大１０分間解凍された場合、それは速やかに投与されなければならない。
【００９０】
ＩＭＰの製造は下記の通りに行われる：
【００９１】
患者は白血球除去を受け、そして回収されたＰＢＭＮＣを２４時間以内に２〜２０℃で清潔な室内施設へと輸送し、ここで単球画分を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）濃度勾配遠心分離を通じて濃縮する。フィコールの後、当該単球の純度は、生じた細胞を単純ＣｅｌｌＧｒｏ中に播種し、そしてそれらを２時間、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートすることによって増大される。この時点において、非吸着細胞（リンパ球）を洗い流し、そして吸着細胞（単球）を、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを追加したＣｅｌｌＧｒｏ中、１〜２×１０6／ｍＬの最終濃度でさらに培養する。
【００９２】
ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で播種された後、当該細胞を５日間培養する。この時点で、それらを洗浄し、単純ＣｅｌｌＧｒｏ中に播種し、そして初めにＴＥＲＴ−ｍＲＮＡと共に２時間インキュベートする。この時点で、洗浄ステップをすることなく、Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＮＦ−γを追加したＣｅｌｌＧｒｏ中、３７℃／５％ＣＯ2で１６時間、それらをインキュベートすることによって当該細胞は完全に成熟される。この時点において、吸着成熟細胞を一度ＰＢＳ中で洗浄し、そして最終的にサバイビン−ペプチドと３７℃／５％ＣＯ2で２時間、合わされた。その後、当該細胞を採取し、集計し、そして生存率及び純度を検定し、その後バイアルへ１×１０7±３０％の細胞ずつのバイアルへと等分し、そして、５％グルコースの生理水溶液中に溶解された１０％ＤＭＳＯから構成される、０．５ｍＬの凍結溶液中で凍結される。
【００９３】
ＩＭＰの採取は、患者へ注射されるべき、８個のＩＭＰバイアルの貯蔵物を含む；１個の滅菌サンプル；１個の維持サンプル；３〜５個のＥＰＣサンプル、及び潜在的な過剰サンプル。当該産物の放出は、滅菌性、生存率、表現型、純度、機能性及び安定性に関するＥＰＣ基準で厳格に条件付けされる。当該バッチを正式に放出した後、各々のＩＭＰバイアルは、ドライアイス中で、密閉された輸送ボックス中で最大２４時間貯蔵され得る試験場へ単独で輸送される。一旦、室温で最大で１０分間解凍された場合、ＩＭＰは、１０分間以内で皮内、及び臍傍を通じて速やかに患者へ注射されなければならない。
【００９４】
３．原理検証
健常対照の白血球除去物から単離された単球は、水簸を通じてその後濃縮され、その後以下のマーカーを使用して観測され、そして集計される：
【００９５】
【表３】
【００９６】
この時点において、単球は、その後バイアルへ５×１０7個の細胞ずつの分割量へと分けられ、そして、５％グルコースの水溶液で希釈された１０％ＤＭＳＯで、１．８ｍＬの最終容量で凍結される。当該分割量を、−１５０℃にて、使用がなされるまで貯蔵した。同一バッチに属する少なくとも１４個の分割量を同時に解凍し、そして貯蔵して各々の実験を実施する。解凍後、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、前記マーカー、生存率及び量を観測する。その後それらを、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００〜２５００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中へ播種した。その後、非吸着細胞を上清と共に捨て、そして吸着細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で、１〜２Ｍｉｏ／ｍＬの濃度で５日間、単球を未成熟ＤＣへと分化転換するために、さらに培養する。その後、当該細胞にｍＲＮＡを取り込ませる。簡単に、ＤＣを一度ＰＢＳ中で洗浄し、集計し、そして１０００ｒｐｍで１０分間回転させた。それらをＣｅｌｌＧｒｏ培地中で再懸濁し、そしてｍＲＮＡ含有溶液（５０ｎｇ ＲＮＡ／１×１０6ＤＣ）中で、３７℃／５％ＣＯ2で２時間、加湿インキュベーター中でインキュベートする。洗浄することなく、その後当該培地へ、Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ（１００μｇ／ｍＬ）及びＩＮＦ−γ（１０００Ｕ／ｍＬ）を添加し、そして１６時間成熟させる。この時点で、当該細胞をＰＢＳ中で一度洗浄し、そしてタンパク質抗原溶液を添加した（１〜１０μｇペプチド／１×１０6ＤＣ）単純ＣｅｌｌＧｒｏ中に再播種し、そして３７℃／５％ＣＯ2で２時間、加湿インキュベーター中でインキュベートする。実験セットに依存して、当該ペプチドは成熟前に、又は成熟化カクテルと同時に代替的に取り込まれた。その後、当該細胞をＰＢＳ中で一度洗浄し、そして吸着細胞を採取し、そして速やかに処理するか、又は、５％グルコースの水溶液で希釈されたＤＭＳＯ １０％で、０．５ｍＬの最終容量となるように１×１０7個のＤＣの分割量へと分けられる。
【００９７】
品質管理（ＱＣ）を下記の通りに行う。
【００９８】
播種時、又は凍結／解凍サイクル時において、細胞を培地中において１２〜２４時間置く。
【００９９】
ＱＣの開始時、及び特定の時点（０〜４〜１２／１４及び２４時間）おいて、細胞を以下のパラメータに関して観測する：
【０１００】
【表４】
【０１０１】
形態に加えて、生存率、及びＩＬ−１０及びＩＬ−１２の分泌。
【０１０２】
原料及び方法
１．前臨床パイロット実験
１．１ 細胞の単離
白血球除去及び水簸を、ＧＡＭＢＲＯ装置を用いて、及び製造指示書に従って行う。
【０１０３】
１．２ フィコール精製
１０ｍＬの血液／ａｐｈｅｒｅｓａｔｅを３０ｍＬのＰＢＳ＋１０％クエン酸バッファーと共に混合する。その後、３０ｍＬの当該混合物を２０ｍＬのフィコールへ加え、そして２０分間２０００ｒｐｍで、ＲＴにて遠心分離する。その後、界面を回収し、そして１０分間１２００ｒｐｍで、ＲＴにて遠心分離する。最終的に、沈殿物をＰＢＳ中で再懸濁し、１０分間１２００ｒｐｍで、ＲＴにて二回洗浄し、そしてＣｅｌｌＧｒｏ中で再懸濁する。
【０１０４】
１．３ 細胞培養
ＤＣを、プラスチック製のフラスコ内で、ＧＭ−ＣＳＦ（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（１００〜４００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で５〜６日間培養し、そしてＲｉｂｏｍｕｎｙｌ（０．５〜１μｇ／ｍＬ）及びＩＮＦ−γ（２００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加し、２４時間成熟させる。
【０１０５】
１．４ ＦＡＣＳ
５０μＬの全血、又は５０μＬの細胞懸濁液（解凍されたＤＣ、１×１０6細胞／ｍＬＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3の最終濃度）を、製造業者の推奨に従って、１５分間室温にて、好適な量のＦＡＣＳ抗体と共にインキュベートし（全血の赤血球は化学的に溶解され）、８００ｒｐｍ（ＲＴ）で、各々１．５ｍＬ又は０．８ｍＬのＰＢＳを用いて洗浄し、０．５ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁し、固定剤を追加し、そしてさらにＦＡＣＳ（登録商標）によってさらに処理する。
【０１０６】
１．５ ＥＬＩＳＡ
凍結されたＤＣを解凍し、そして２％ＨＳを添加したＲＰＭＩ中で、１×１０6細胞／ｍＬの最終濃度で再培養する。２４時間後、上清を採取し、そしてＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ ＩＳＯ９００２を使用して、及び製造指示書に従って、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０について分析する。
【０１０７】
１．６ 混合白血球反応
凍結ＤＣを解凍し、そして２％ヒト血清（凝固の避けられた、ＡＢ）、１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）を添加したＲＰＭＩ中において、１×１０6細胞／ウェルの最終濃度である、健常者由来のフィコール分離されたＰＢＭＮＣの非吸着画分と共に、１×１０4細胞／ウェルの最終濃度で、１５０μＬの最終容量で、９６ウェルＵボトムプレート中、共培養する。増殖は、酸化型（非蛍光、青）から還元型（蛍光、赤）へと変化する染色剤の還元を引き起こす。２〜７日間、４時間ごとに吸光度を５９５ｎｍにて、参考波長である６２０ｎｍと共に、プレートリーダーで測定する。
【０１０８】
１．７ ＤＴＣの単離
ＤＴＣの単離を、ＯｎｃｏＱｕｉｃｋキット（Ｇｅｎｔｅｃｈ）で提供されている手順に従って行われる。
【０１０９】
１．８ サバイビンｍＲＮＡの転写及び精製
サバイビンｍＲＮＡ及び精製を、製造業者の手順に従って、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７／Ｔ３キット（Ａｍｂｉｏｎ）及びＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡミニ・キット（Ｑｉａｇｅｎ）の各々の使用を通じて行う。
【０１１０】
１．９ タンパク質合成
使用される腫瘍特異的タンパク質／ペプチドの全てを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃによる、又はＧＭＰグレードのペプチドを臨床使用のために製造する、同様に認定された会社によるＧＭＰ遵守規則に従って合成される。指示書に従って、及び研究グレードである「ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、タンパク質抗原を比較ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｉｎｅ）から出発して製造する。
【０１１１】
１．１０ ウェスタンブロット
当該細胞をＦｒａｃｋｅｌｔｏｎバッファー中２０分間氷中にて溶解し、そして１０００ｇにて１０分間４℃で遠心分離する。上清を回収後、タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて測定し、そして青色サンプルバッファーを、各サンプルへ４：１の比率で添加する。ポリアクリルアミドゲルを調製した後、タンパク質を流し、そしてニトロセルロース膜上にブロットする。その後、当該膜をＴＢＳ−Ｔ中で洗浄し、そして最初に１時間、０．５ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０及びミルク５％を添加したＴＢＳ−Ｔ １Ｘで構成される、約１０ｍＬのブロッキング溶液中でインキュベートし、その後、３％ＢＳＡ及び０．０２％ＮａＮｓを添加したＴＢＳ−Ｔ ｗ／ｏミルクで希釈された１０ｍＬの第一抗体中、ｏ／ｎでインキュベートする。その後、当該膜をＴＢＳ−Ｔ中、三回洗浄し、そして第二抗体と共に４０分間ＲＴでインキュベートする。最終的に、タンパク質の発現を、ＥＣＬキットを用いて検出する。
【０１１２】
２．臨床試験及び原理検証
１．１ 細胞の単離
白血球除去及び水簸を、ＧＡＭＢＲＯ装置を用いて、及び製造指示書に従って行った。
【０１１３】
１．２ 単球の凍結
水簸により得られた細胞を集計し、そしてＦＡＣＳにより特徴付けを行う。最終的に、単球を３×１０7細胞ずつの分割量に分け、そして１．８ｍＬの最終容量となるように、５％グルコース水溶液で希釈したＤＭＳＯ１０％中で凍結される。当該分割量は、使用の時まで−１５０℃で貯蔵される。
【０１１４】
１．３ 細胞培養
ＤＣを、プラスチック製のフラスコ内で、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で５日間培養し、そしてＲｉｂｏｍｕｎｙｌ（１００μｇ／ｍＬ）及びＩＮＦ−γ（１０００Ｕ／ｍＬ）を添加し、１６時間成熟させる。
【０１１５】
１．４ ＦＡＣＳ
５０μＬの細胞懸濁液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを加えた、又は加えていないＰＢＳ中において、最終濃度１×１０6細胞／ｍＬに達するサンプル由来）を、１５分間、冷却装置中でインキュベートし、そして製造業者の推奨に従って、暗所にて、好適な量のＦＡＣＳ抗体と一緒にし、１．０ｍＬのＰＢＳを用い、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを用いて、又は用いずに約４℃、１０００ｒｐｍで洗浄し、固定剤を添加した０．５ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁し、ＦＡＣＳ（登録商標）でさらに処理する。
【０１１６】
１．５ ＥＬＩＳＡ
採取された、又は凍結されたＤＣを解凍し、そしてＣＤ４０Ｌの存在下、又は不在下において、１×１０6細胞／ｍＬの最終濃度で、ＣｅｌｌＧｒｏ中で再培養する。特定のチェックポイントにおいて、２４時間かけて散乱させ、上清を採取し、そしてＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ ＩＳＯ９００２を使用して、及び製造指示書に従って、ヒトＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０に関して分析する。
【０１１７】
１．６ ＴＥＲＴ ｍＲＮＡ転写及び精製
ＴＥＲＴ ｍＲＮＡ転写を、製造業者の手順に従って、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７／Ｔ３キット（Ａｍｂｉｏｎ）の使用を通じて行う。
【０１１８】
１．７ サバイビンペプチド
サバイビンペプチドは、Ｇｌｏｂａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃによって、凍結乾燥（ｌｉｏｐｈｙｌｉｚｅｄ）産物として供給された。一旦、水中で戻されると、それは１００μｇ／ｍＬずつと等しい分割量で、−８０℃で貯蔵された。
【０１１９】
結果
・前臨床パイロット実験
この節において示される全ての結果は、先に記載された通りに培養され、そしてグリセロール１０％中において凍結されたＤＣで行われた。解凍後の細胞生存率は７５％超であった。１０％グリセロール溶液を用いて得られた結果は、ＤＭＳＯ１０％で凍結したときに示されるものと同程度か、又は若干優れている。グリセロール中における細胞の凍結は、それが、毒性物質（ＤＭＳＯ）を除去する遠心分離ステップを必要とせず、したがってそれにより、特別な道具及び装置（遠心分離、層流、無菌環境）の必要性無しに、ＤＣを患者へより容易に注射することが可能であるという点で、細胞をＤＭＳＯと共に凍結させる場合よりも大きな利点を有する。
【０１２０】
サバイビンｍＲＮＡ及びタンパク質抗原（ＰＳＡ）と共にインキュベートされたＤＣが実際に取り込んだことを認めるために、食作用により取り込まれたｍＲＮＡが、同様に転写されたか否か、及びタンパク質抗原がＤＣによって発現されたか否かを決定するためのウェスタンブロットが行われた。
【０１２１】
１Ｍｉｏの細胞をＰＢＳ中で２度洗浄し、Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎバッファー中で溶解し、そしてウェスタンブロットで処理した。図１で報告された結果は、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）及び取り込みされていない半成熟ＤＣ（ｓｍＤＣ）は、サバイビン及びＰＳＡのいずれも発現しないことを示している。サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ（ｍＤＣ）は、この抗原の発現を示すが、ＰＳＡの発現は示さず、そしてサバイビン及びＰＳＡを取り込んだ成熟ＤＣ（ｄｍＤＣ）は、両方の抗原の発現を示す。これらの結果は、取り込み手順が、担体又は活性トランスフェクション手段の必要性無しでｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の取り込みに関して有効であり、そしてそれは非常に効率的であることを裏付ける。
【０１２２】
１０人の患者において、本発明の手順中において記載された通りに培養されたＤＣは、異なる段階の変異に従って、それらの表面上に異なるＣＤ群を発現したことが示された。刺激されていないＤＣは、成熟マーカー、例えばＣＤ８０及びＣＤ８３を発現しなかったが、未成熟マーカー、例えばＣＣＲ３を発現した。取り込みをしていない半成熟ＤＣは、ＣＣＲ３のような未成熟マーカー、及び少ないＣＤ８０、並びにＣＤ８３のような成熟マーカーの組み合わせを示す。サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ完全成熟ＤＣは、成熟マーカー、例えばＣＤ８０及びＣＤ８３のみを示し、未成熟マーカー、例えばＣＣＲ３を示さなかった（図２）。
【０１２３】
本手順によって、ＤＣの表現型における変異のみならず機能的変異が可能か否かを決定するために、上清におけるＩＬ−１０及びＩＬ−１２の分泌が分析された。ＩＬ−１２は、腫瘍細胞を死滅させる免疫系の能力を向上させることが知られており、そして腫瘍への血流を阻害し得る。ＩＬ−１２は、細胞障害性Ｔ細胞の活性化を刺激することにより、腫瘍除去を向上させる。他の面において、ＩＬ−１０は、ＤＣの機能の幾つかの特徴、例えば共刺激性分子の発現、及びＩＬ−１２を合成する能力において著しい阻害効果を有することが示された。重要なことに、ＩＬ−１０で処理されたＤＣは、寛容原性となる。通常、ｉＤＣは、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のいずれも産生せず（又はＩＬ１０に関して非常に少量産生され）、一方でｍＤＣは高レベルのＩＬ−１２、及び存在するのであれば、非常に低いレベルのＩＬ−１０を分泌する。
【０１２４】
予想された通り、ｉＤＣは、ＩＬ−１２を産生せず、そして最少量のＩＬ−１０のみを産生し、一方で我々の手順に従って培養された、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ、及びサバイビンｍＲＮＡ＋タンパク質を取り込んだ成熟ＤＣは、高レベルのＩＬ−１２及び非常に低レベルのＩＬ−１０を産生した（図３）。
【０１２５】
本発明のＤＣが機能的に活性であることをさらに実証するために、混合白血球反応を通じた異種Ｔ細胞の増殖に対するそれらの効果が評価される。
【０１２６】
取り込みをしていない半成熟ＤＣ、及びサバイビンｍＲＮＡ／サバイビンｍＲＮＡ＋タンパク質を取り込んだ成熟ＤＣのインキュベーションにより、Ｔ細胞増殖が増大し、このことは本発明の実施例において記載されたように培養されたＤＣが、腫瘍の除去において潜在的な利益を示す、免疫系の主役（Ｔ細胞）の少なくとも一つに対して、高いプラスの効果のあることを示す。予想された通り、Ｔ細胞とのｉＤＣのインキュベーションは、それらの増殖率を増加させなかった（図４）。
【０１２７】
ｉＤＣは、強い遊走能力によって特徴付けられ、そしてそれは、ｉＤＣにおけるＣＸＣＲ４／ＣＣＲ７発現の欠如のために、ＣＣＬ１９の付加によっては誘導できない。逆に、半成熟ＤＣは、ＣＣＬ１９の誘導に応答するが、より少ない程度であったとしても、ｉＤＣと比較して自発的遊走能力をなお保持している。取り込みを行った成熟ＤＣは、（ほぼ）完全に自発的に遊走する能力を失うが、それらは、ＣＣＬ１９の誘導時に遊走する（図５）。これは、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、及びサバイビンｍＲＮＡ＋タンパク質を取り込んだ成熟ＤＣは、注射部位から刺激源（すなわち、腫瘍部位）へと移動することができ、したがってそれらは節内に（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）直接的に投与される必要はないが、それらは同様に、腫瘍周囲に注射され得る。この事実は、ＤＣワクチンが正確にリンパ節の位置を決定するために、特定の道具、例えば超音波装置を必要としないため、ＤＣワクチンの使用をより容易にする。
【０１２８】
最終的に、当該手順中において記載された通りに培養されたＤＣが、自発的に、又はＣＣＬ１９に対する応答において、活動的になお食作用を行うことができるか否かが調査された。
【０１２９】
ｉＤＣは、強い食作用能力によって特徴付けられ、そしてそれは、ｉＤＣにおけるＣＸＣＲ４／ＣＣＲ７の発現の欠如のために、ＣＣＬ１９によって誘導することができない。半成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡを取り込んだＤＣは、反対に、ＣＣＬ１９誘導に応答するが、例えば低い程度であっても、ｉＤＣと比較して、自発的な食作用能力をなお保持する。サバイビンｍＲＮＡ及びタンパク質を取り込んだ成熟ＤＣは、自発的な及びＣＣＬ１９誘導に基づくものの両方における、食作用能力を完全に失う。
【０１３０】
これは、本発明の手順に従って製造された、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、及びｍＲＮＡを取り込んだＤＣは、腫瘍抗原に対して食作用を行う準備ができており、そしてそれは、腫瘍に対する直接的な免疫応答を強く増大させる、非常に活性の強い表現型を示し、一方で二重取り込み（ｍＲＮＡ＋タンパク質）のなされた完全成熟ＤＣは、Ｔ細胞の増殖及び活性化を誘導する準備ができているが、腫瘍組織に対してさらに食作用を行う能力を失っており、既に取り込まれた抗原への免疫応答の特異性を増大させる（図６）。
【０１３１】
最終的に、ｍＲＮＡ及びタンパク質の二重取り込みがなされたＤＣは、異種リンパ球と共にインビトロにてインキュベーションされるとき、Ｔ−ｒｅｇの活性化を引き起こすことなく、高い細胞障害性及びメモリー応答を誘導することができることが示された（図７）。
【０１３２】
２．原理検証
本節において示される全ての結果は、健常対照の水簸由来の凍結単球から培養されるＤＣから出発して行われた。以下のバッチは比較された：
・バッチ１：単球は、５日間で未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）へと分化転換され、ＴＥＲＴ ｍＲＮＡを取り込み、成熟され、そして最終的にサバイビンを取り込んだ。当該細胞は凍結されないで、そして採取時、及び２４時間の再培養における以下の時点：０時間（採取）；４時間及び２４時間に速やかに分析された；
・バッチ２：単球は、５日間で未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）へと分化転換され、ＴＥＲＴ ｍＲＮＡを取り込み、成熟され、そして同時にサバイビンを取り込んだ。当該細胞はＤＭＳＯ中で凍結され、そして採取時、解凍時、及び再培養後４時間及び２４時間において分析された；
・バッチ３：単球は、６日間で未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）へと分化転換され、ＴＥＲＴ ｍＲＮＡを取り込み、成熟され、そして最終的にサバイビンを取り込んだ。当該細胞はＤＭＳＯ中で凍結され、そして解凍時、及び再培養後１２時間及び２４時間において分析された。
【０１３３】
解凍時における単球の生存率は、常に７０％以上であった。原理検証の間、異なる取り込み法が比較された：
・バッチ１：５０ｎｇ／ｍＬ ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡと共に２時間インキュベーションし、その後１６時間成熟化を行い、その後１０μｇ／ｍＬ サバイビン−ペプチドと共に２時間インキュベーションした；
・バッチ２：５０ｎｇ／ｍＬ ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡと共に２時間インキュベーションし、その後、同時に投与される１０μｇ／ｍＬ サバイビン−ペプチド及び成熟化カクテルと共に１６時間インキュベーションした；
・バッチ３：５０ｎｇ／ｍＬ ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡと共に２時間インキュベーションし、その後、１６時間成熟化を行い、その後１０μｇ／ｍＬ サバイビン−ペプチドと共に２時間インキュベーションした。
【０１３４】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で５日間培養し、５０％超の初期量の単球が未成熟ＤＣとなり、それらの半分が付着性の表現型を示した。反対に、当該細胞を６日間培養した場合、当該細胞の１０％のみが付着性であった。
【０１３５】
ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡの存在下、２時間のインキュベーションの後、少なくとも７０％の細胞が付着性となった。サバイビン−ペプチドが成熟化カクテルと共に投与されたとき、当該細胞は優れたクラスターを形成し、一方でサバイビンペプチドが成熟化カクテルの後に投与された場合、当該細胞は、より長い樹状突起を示す傾向に、及び固いクラスターの形成を避ける傾向にあった。
【０１３６】
（任意の形態における）取り込み及び成熟化の完結後、当該細胞は、９５％超で吸着性であった。当該細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で、５日間の代わりに６日間培養された場合、当該付着細胞は全体量の約５０％を構成した。
【０１３７】
採取時、細胞生存率は、３つのバッチ中において同程度であり、分化転換の時間、取り込み方法、及び成熟化計画は、このパラメータに影響を与えず、常に限界の７０％超で維持された（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【０１３８】
凍結／解凍サイクルにおいて、細胞生存率は、分析された２つのバッチ間において同程度であり、そして採取時において得られる結果と比較して微かに減少するのみであった。先の場合と同様に、取り込み方法及び成熟化計画は、生存率に影響を与えず、そしてそれは、常に限界の７０％超で維持された。
【０１３９】
主な手順の異なる変形に従って培養されたバッチの生存率は、採取時及び解凍時において同程度である。
【０１４０】
【表５】
【０１４１】
取り込まれた抗原であるＴＥＲＴ及びサバイビンは、ＦＡＣＳによって、細胞表面上において、採取時又は解凍直後において検出されなかった。再培養時、２つの抗原の表面発現は、４時間〜１２時間の間で増加した。１２時間から２４時間まで、それは安定に維持された。細胞がＣＤ４０Ｌを用いて刺激された場合、４時間の再培養後、２つのマーカーの表面発現は、単純培地（ｐｌａｉｎ ｍｅｄｉｕｍ）中で培養された細胞において検出されるものと比較して増加した。しかし、１２時間後、当該２つの抗原の発現が停滞期に到達したとき、ＣＤ４０Ｌの効果は検出不能となった：
ａ）採取時及び単純培地中での２４時間再培養との間における、取り込まれた抗原（ＴＥＲＴ及びサバイビン）の検出
【０１４２】
【表６】
【０１４３】
ｂ）採取時、及びＣＤ４０Ｌ刺激の存在下での２４時間再培養との間における、取り込まれた抗原（ＴＥＲＴ及びサバイビン）の検出。
【０１４４】
【表７】
【０１４５】
これらの結果は、本明細書において記載された方法の異なるバリエーションに従って培養されたＤＣが、取り込まれた抗原の表面発現率を増加させることによって、生理学的刺激因子、例えばＣＤ４０Ｌに応答することができ、したがって、前記抗原を発現する細胞に対する免疫応答を引き起こすＴ細胞を誘導する能力を増大させることを示した。
【０１４６】
採取時において、バッチ１及び２の両方は、機能的ＤＣに対する標準マーカーの発現に従って、成熟表現型を示し、すなわち、ＣＤ１４（未成熟ＤＣ）、並びにＣＤ３（Ｔ細胞）及びＣＤ１９（Ｂ細胞）の低発現、又は発現しないことと対になる、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲの高い発現を示し、そしてそれは、潜在的なリンパ球の汚染のレベルを決定するために使用された。したがって、異なる取り込み法及び成熟化計画は、最終産物の表現型に影響を与えず、そしてそれは文献中において報告された基準を達成していると思われた（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【０１４７】
凍結／解凍のサイクルの直後に得られた結果は、最終産物が、表現型に従って安定なままであることを示した（バッチ２における、採取時の表現型と解凍時の表現型との間の比較を参照）：
【０１４８】
ａ）採取時及び単純培地中での２４時間再培養との間における、バッチ１のＤＣの表現型の検出
【０１４９】
【表８】
【０１５０】
ｂ）採取時及びＣＤ４０Ｌ刺激下での２４時間再培養との間における、バッチ２のＤＣの表現型の検出
【０１５１】
【表９】
【０１５２】
ｃ）採取時及びＣＤ４０Ｌ刺激下での２４時間再培養との間における、バッチ３のＤＣの表現型の検出
【０１５３】
【表１０】
【０１５４】
興味深いことに、当該細胞が５日間の代わりに６日間分化転換された場合、それらの表現型は、非機能的表現型と相関し、すなわち、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８３の表面発現は、基準レベルの３分の１に減少し、一方で、ＨＬＡ−ＤＲにおいては基準レベルの２分の１に減少した。２４時間再培養後、５日間で分化転換された細胞の表現型は、全体的に安定なままであったが、一方でそれらが６日間分化転換されたとき、それらは成熟表現型マーカーのレベルを緩やかに増加させたが（図１０）、それらの基準レベルには達することができないままであった。
【０１５５】
少なくとも本明細書において記載された方法に従って培養されるＤＣにおいては、５日よりも長い期間での分化転換は、非機能的表現型を誘導し得、その結果、より低いＤＣの活性（ＣＤ８３の発現の減少）及びＴ細胞と結合する能力の減少（ＣＤ８０の発現の減少）をもたらし、そしてそれはＣＤ４+Ｔ細胞へのあまり有効ではない提示を伴う（ＨＬＡ−ＤＲの発現の減少）ことを、当該結果は示した。これらの特徴は、形態の変化、すなわち細胞付着の消失を伴い、そしてそれは機能的及び表現型的に成熟していないＤＣに対応する。本明細書において記載された同一の方法における変形の使用は、ＤＣの表現型における成熟化に影響を与えず、最新の形態的及び表現型的の両方で成熟したＤＣを提供する。
【０１５６】
再培養時において、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２の産生は増加し、興味深いことに、ＩＬ−１２の分泌のみがＣＤ４０Ｌによってプラスに影響されると思われ、一方で、ＩＬ−１０の分泌はこの種の刺激とは独立していた。ＩＬ−１２の分泌は、ＩＬ−１０のものと比較して常に少なくとも２倍であった。Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００５の文献に従って、かかるパターンは、（ＩＬ−１２を用いた）細胞障害性応答、及び（ＩＬ−１０を用いた）適応応答の両方を活性化するその両立性のために、単一のＩＬ−１２の分泌と比較して、癌に対する免疫系の活性化についてより有効であろう：
【０１５７】
ａ）単純培地中における２４時間再培養時の、ＩＬ−１０分泌の分析
【０１５８】
【表１１】
【０１５９】
ｂ）ＣＤ４０Ｌ刺激下における２４時間再培養時の、ＩＬ−１０分泌の分析
【０１６０】
【表１２】
【０１６１】
ｃ）単純培地中における２４時間再培養時の、ＩＬ−１２分泌の分析
【０１６２】
【表１３】
【０１６３】
ｄ）ＣＤ４０Ｌ刺激下における２４時間再培養時の、ＩＬ−１２分泌の分析
【０１６４】
【表１４】
【０１６５】
反対に、６日間分化転換された細胞は、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のいずれも分泌することができなくなっており、このことは、形態及び表現型に関して既に観察された、成熟しすぎた（ｏｕｔ−ｍａｔｕｒｅｄ）パターンを確認する。
【０１６６】
結論
実施例に記載された方法は、主要な目的に従って、異なる変形において適用され得る。例えば、臨床ツールとしてのＤＣの使用のために必要とされる、臨床グレードの調製物を得ることが重要であるとき、ＧＭＰ遵守ペプチドの価格及び入手可能性が、対応するＧＭＰタンパク質に関するものよりも好適であるという事実のために、タンパク質抗原は、ペプチドによって構成され得る。個々のペプチドは、その長さ及びその免疫原性に従って、ｍＲＮＡ抗原と成熟化カクテルとの組み合わされた投与に関して、異なる配列で投与され得る。一般的に、タンパク質抗原と組み合されたｍＲＮＡ抗原の取り込みが５日間又は６日間の培養されたＤＣのいずれかで行われ得るが、ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡ及びサバイビンの特異的な同時使用では、５日間分化転換されたＤＣにおいて優れた結果を与える。
【０１６７】
現在までに行われた実験は、特異的な抗原の使用が、最も優れた結果を得るための手順の小さな調節／変形を必要とし得ることを示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の誘導及び調節の両方において重要な役割を果たす、骨髄由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ヒトＤＣのインビトロでの生成及び操作は、癌に対する免疫系を刺激するために特に有効であり得、腫瘍との戦いにおいて新規の強力なツールであると記載された。実際、異なる種類の癌、例えば、限定されないが、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、頭頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、腎腫瘍、肝細胞癌及び悪性黒色腫を患っている患者において、宿主の免疫系が癌形成を効果的に攻撃する能力の無いことは、ＤＣ機能の低下と完全に相関することが示された。これらの変化は、主に血液中、浸潤性癌の細胞中、及びリンパ節（ＬＮ）中において主に検出された。さらに、大部分の化学療法は、ＤＣ機能を著しく害し、一方で患者のＴ細胞が効果的な免疫応答を引き起こす能力は、健常人において観察されるものと同程度であることが実証されている。この観察は、癌患者の免疫系によって提示された腫瘍形成への開放が、大部分において、ＤＣにおける機能的な欠陥の存在、例えば、未成熟な表現型の維持、及び／又は、ＩＬ−１２分泌とＩＬ−１０分泌との間の不正確なバランスによるものであることを示唆している。したがって、ＩＬ−１０の血清レベルが、癌を患う患者において、健常な同一年齢かつ同一性別の対照においてよりも著しく高いことが示された。ＩＬ−１０は、ＤＣ機能の幾つかの態様、例えば、共刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の発現、及びＩＬ−１２を合成する能力に対して、著しい阻害効果を有することが示されている。重要なことに、ＩＬ−１０で処理されたＤＣは、寛容原性となる。さらに、徐々に腫瘍が増殖している患者において、ＤＣは未成熟であり、かつスイッチがオフの状態であることが報告された。ＤＣの抗腫瘍効果は、それらの活性レベル及び成熟レベルに依存するため、細胞障害性応答を促進する腫瘍特異的Ｔ細胞の誘導の失敗は、ＩＬ−１０とＩＬ−１２との間の誤ったバランス、及び期待されたＴ細胞の活性化を引き起こすために必要とされる成熟マーカーの不在に基づく。実際には、ＩＬ−１０の免疫抑制機能は、ＩＬ−１２の同時産生によって調節され得る。例えば、単球由来の成熟ＤＣは通常、ＣＤ４０Ｌを用いて刺激したとき、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０の両方を分泌することが明らかとされている。この場合において、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０の連動した分泌は、ＩＬ−１２単体の分泌で観察されるもの以上に、癌に対してより効果的な免疫応答を誘導する。ＩＬ−１２産生の軽−高レベルの存在下において、ＩＬ−１０分泌は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+Ｔ細胞）の活性化を促進し、したがって免疫系の適応力（ａｄａｐｔｉｖｅ ａｒｍ）を引き起こす。
【０００３】
現在の免疫治療法の主な目的の一つは、癌に対する宿主の免疫系を効果的に活性化することである。それらの中で、インビトロにおいて培養かつ修飾された、ＤＣ及びＴ細胞の使用は、最も一般的な方法である。多くの小規模なインビトロにおける試験、動物モデル、及び臨床試験が、特に、ＣＤ８+Ｔ細胞によって媒介される強い細胞障害性応答を引き起こすことに関して部分的な成功を示したが、それらは全て、強力な適応応答の確立を示すことができず、そして当該治療が終了して数年後においてでさえ、任意の腫瘍の再発と戦うことができなかった。
【０００４】
ワクチン用にＤＣを使用する最も一般的な手法は、多くの自己の成熟したミエロイドＤＣ（ＭＤＣ）をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）において調製し、それらに癌特異的抗原（単数又は複数）を取り込み（ｌｏａｄ）、そしてそれらを対象へと注射して戻すことである。単球から成熟ＤＣへの分化転換率が低いため、成熟ＤＣの大規模産生に対応するＤＣ前駆体量を得ることが重要である。この目的は通常、（１）ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を有する、又はＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１３を有する、白血球分離／水簸由来の単球と、ＤＣとを区別することによって、あるいは（２）密度勾配遠心分離法によって、又は免疫磁性ビーズの使用に基づく市販の閉鎖系を用いて、白血球分離産物から直接的に単離することによって、代替的に達成される。
【０００５】
単球から分化転換された後、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）は取り込みがなされ、そしてインビトロにおいて成熟がなされるべきである。取り込み（ｌｏａｄｉｎｇ）ステップは、幾つかの方法に従って、単一の天然又は修飾タンパク質抗原、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、腫瘍溶解物などとして行われ得るが、成熟化は通常、以下のカクテルの一つの添加によって行われる：（ａ）ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＰＧＥ２；（ｂ）ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ；（ｃ）Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＦＮ−γ。当技術分野において、ＰＧＥ２を含むカクテルを用いて成熟したＤＣはＣＣＲ７をなお発現し、そしてＴｈ１及びＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導するが、ＬＰＳ／Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＦＮ−γを用いて成熟されたＤＣとは対照的に、それらは検出可能に生物活性ＩＬ−１２ｐ７０を分泌することができない。
【０００６】
Ｚｈｏｕ Ｙ．他（Ｊ．Ｉｍｍｕ．Ｔｈｅｒａ．２５（２００２）：２８９−３０３）において、樹状細胞に腫瘍抗原を取り込むための方法が記載されている。この刊行物の著者は、当該取り込みがペプチド若しくはタンパク質、又は代替的に前記ペプチド及びタンパク質をコードする核酸分子を用いて起こり得ると報告している。
【０００７】
Ｏｎａｉｔｉｓ Ｍ．他（Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍ．１１（２００２）：６４５−６６０）において、樹状細胞に抗原を取り込むための幾つかの方法が開示されている。
【０００８】
Ｏｓａｄａ Ｔ．他（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（２００６）：３７７−４１３）の総説において、樹状細胞に基づく免疫療法が記載されている。これらの方法において使用される樹状細胞は、腫瘍関連抗原を取り込み得る。
【０００９】
Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ Ｈ−Ｇ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８４（２００６）：２９０−２９４）において、ワクチン接種の目的のために、ペプチド又はＲＮＡ分子のいずれかを取り込んだ樹状細胞の利点が記載されている。
【００１０】
国際公開第２００６／０２０８８９号において、樹状細胞への、ＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡ分子又はその断片の取り込みが開示されている。
【００１１】
Ｃｉｅｓｉｅｌｓｋｉ Ｍ．Ｊ．他（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５５（２００６）：１４９１−１５０３）において、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）をコードするＤＮＡを取り込んだ樹状細胞を産生するための方法が開示されている。かかる細胞は、前記樹状細胞中においてサバイビンを発現することができる。
【００１２】
Ｏｔｔｏ Ｋ．他（Ｖａｃｃｉｎｅ ２３ （２００５）：８８４−８８９）において、腫瘍の予防接種のための、サバイビンのエピトープを取り込んだ樹状細胞の有用性が調べられた。
【００１３】
Ｈｓｕ Ａ．Ｋ．Ｗ．他（Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１２（２００６）：８５５−８６７）において、サバイビンをコードするｍＲＮＡ分子を取り込んだ樹状細胞が開示されている。
【００１４】
Ｍｏｒｓｅ Ｍ．Ａ．他（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１９９８）：２９６５−２９６８）において、樹状細胞への、腫瘍関連抗原であるＣＥＡに由来するペプチド又はそれをコードするＲＮＡの取り込みが開示されている。
【００１５】
同様にＮａｉｒ Ｓ．Ｋ．他（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８２（１９９９）：１２１−１２４）において、腫瘍関連抗原であるＣＥＡを取り込んだ樹状細胞が開示されている。
【００１６】
Ｆｕｅｓｓｅｌ Ｓ．他（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ６６（２００６）：８１１−８２１）において、ＰＳＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、サバイビン、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）及び一過性受容体電位ｐ８（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐ８）を取り込んだ樹状細胞を８人の患者へ投与する臨床試験が開示されている。
【００１７】
これらの全ての文献は、タンパク質抗原（単数若しくは複数）又はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ抗原（単数又は複数）のいずれかに基づく取り込み方法を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
向上した免疫学的特性を示す樹状細胞を提供することが、本発明の目的である。
【００１９】
これらのＤＣは、（ａ）ｉＤＣと比較して、少なくとも８０％減少した食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｎｇ）の能力；（ｂ）刺激（例えば、限定されないが、ＣＣＬ１９及び／又はＣＤ４０Ｌ）に応答して遊走する能力；（ｃ）成熟した表現型、すなわち、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＨＬＡ−ＤＲの高い表面発現；（ｄ）ＩＬ１０分泌を伴うか又は伴わない、軽〜高レベルのＩＬ−１２分泌；（ｅ）ＣＤ４０Ｌを用いた刺激に基づく、取り込んだ抗原（単数又は複数）の表面発現、を好ましくは示すはずである。
【００２０】
ＣＤ８+Ｔ細胞（細胞障害性）による短期間免疫応答、及びＣＤ４+Ｔ細胞（適応性）による長期間免疫応答の両方の活性化かつ確立が、これらのＤＣによって達成されるさらなる目的である。
【００２１】
本発明は、腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び少なくとも一つの腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片を取り込んだ樹状細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣ中の、サバイビン及びＰＳＡの発現を示す。
【図２】図２は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣの表現型を示す。
【図３】図３は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣによるＩＬ−１０及びＩＬ−１２の分泌を示す。
【図４】図４は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣと共にインキュベーションしたときにおけるＴ細胞の増加誘導を示す。
【図５】図５は、実施例に記載した通りに培養された、取り込みをしていない未成熟ＤＣ、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡ＋ペプチドを取り込んだ成熟ＤＣにより示される、自発的な及び（ＣＣＬ１９によって）誘導された細胞遊走を示す。
【図６】図６は、実施例に記載した通りに培養された、未成熟、半成熟の、取り込みしていないＤＣ／ｍＲＮＡを取り込んだＤＣ、及びサバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣにより示される、自発的な及び（ＣＣＬ１９によって）誘導された食作用を示す。
【図７】図７は、二重取り込みしたＤＣと共にインキュベーションした時における、細胞障害性Ｔ細胞及びＴ−ｍｅｍの刺激を示す。一方で、Ｔ−ｒｅｇの数が、二重取り込みしたＤＣを用いたインキュベーション時において強く下方制御された。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
少なくとも一つの核酸分子によってコードされた抗原は、内因性タンパク質へと翻訳され、したがってＤＣによって処理され、そしてＭＨＣ−Ｉと複合化してそれらの細胞膜上において曝される。このようにして、ＭＨＣ−ＩがＣＤ８+のみに抗原を曝すという事実のために、それは細胞障害性応答を誘発する。一方、ＤＣへと取り込まれたタンパク質抗原は、前記ＤＣによって外来性のタンパク質抗原として処理され、そしてＭＨＣ-ＩＩと複合化されてそれらの細胞膜上に曝されるであろう。このようにして、ＭＨＣ−ＩＩがＣＤ４+のみに抗原を曝すという事実のために、それは適応性応答（ａｄａｐｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発する。したがって、少なくとも一つの核酸分子及び腫瘍抗原タンパク質の二重の取り込みは、以下を保証する：（ａ）ＭＨＣ−Ｉを通じて曝された抗原の認識に基づく、細胞障害性Ｔ細胞、ＮＫ、及びＮＫＴを通じた細胞障害性を活性化することによる免疫系の短期間応答；（ｂ）ＭＨＣ−ＩＩを通じて曝された抗原の認識に基づく、ＣＤ４+依存性持続的ＣＤ８+活性化による、細胞障害性応答の安定性；（ｃ）ＭＨＣ−ＩＩを通じて曝された抗原の認識に基づく、メモリーＴ細胞及びＢ細胞のカスケード活性化による、抗体媒介性メモリー応答の活性化。
【００２４】
簡潔に言えば、二重取り込み法は、（ａ）最初の効果的な腫瘍除去に必要とされる、短期間での細胞障害性応答を活性化し；（ｂ）ヘルパーＴ細胞を活性化することによって、一般的に遷移するものであり、したがって高度に効率的ではない細胞障害性応答期間を拡張し；（ｃ）長期間必要であるが、細胞障害性とは異なり、治療の終了から数年後でさえ腫瘍に対して免疫系を活性化する適応免疫応答の活性を促進し、そしてその確立を維持する。
【００２５】
本発明のＤＣは、好ましくは（ａ）万能性腫瘍関連抗原（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｕｍｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ）（又はｕＴＡＡ、そしてそれは、２個超、好ましくは５個超、より好ましくは１０個超、さらにより好ましくは２０個超、特に３０個超の異なるタイプの腫瘍中に存在する）を取り込み、及び／又は、（ｂ）タイプ特異的（ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）腫瘍抗原（ＴＡＡ；単一の腫瘍タイプ、及び／又は単一の腫瘍ファミリータイプの特性）を取り込む。例えば、本方法は、２つの最も一般的なｕＴＡＡ：サバイビン及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥｌｏｍｅｒａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ＴＥＲＴ）との併用での使用に適用され得る。実際、これら２つの抗原の発現は腫瘍細胞において限定されており、一方で健常細胞／組織において全く発現していないか、又はごく少量のレベルで発現している。実際、サバイビンはアポトーシス（プログラム細胞死）から細胞を救出し、そしてＴＥＲＴは細胞の不死化を促進し、これら２つの特徴は健常細胞よりも制限が解除されているのが典型的である。したがって、サバイビンは、ほとんど胚及び胎児発達の間においてのみ発現されるが、最終的に分化した正常な成人組織において検出不能となり、一方でそれは、腫瘍細胞株及び幾つかのヒト癌細胞において、３４〜１００％の頻度で再発現する。同様にＴＥＲＴタンパク質は、そのＲＮＡサブユニットからではないのだが、腫瘍形成の非常に早期の段階においてさえ、ほとんど腫瘍細胞においてのみ発現されている。予後因子として、サバイビン及びＴＥＲＴの発現は、癌、例えば乳癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、結腸直腸癌、肺癌及び食道癌における芳しくない臨床転帰と非常に関連がある。サバイビン及びＴＥＲＴは、正常組織と比較して腫瘍組織において優先的に発現されているため、正常な分化細胞における副作用は起こり得ない。実際、サバイビンペプチド又はＴＥＲＴ ｍＲＮＡ若しくはペプチドを取り込んだＤＣで処理された患者は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されるような、サバイビン又はＴＥＲＴに対する優れた免疫反応性の誘導にもかかわらず、ワクチン接種部位における局所的反応以外で、免疫療法と関連する任意の有害事象へと発展しないことが、最近の研究において実証された。さらに、腫瘍応答時における、サバイビン及びＴＥＲＴに対する強い免疫応答は、ワクチン接種後における腫瘍退縮を強調する。
【００２６】
代替的に、本発明のＤＣは、特定の腫瘍を処置及び／又は予防するために使用され得る。例えば乳癌の場合において、ＤＣは、Ｈｅｒ２−タンパク質及びＭｕｃ−１ ｍＲＮＡを取り込んでもよい。
【００２７】
ＤＣに取り込まれるべき抗原の別の可能な組み合わせは、前立腺癌の場合において、ＰＳＡタンパク質及びサバイビン−ｍＲＮＡである。
【００２８】
最終的に、ＤＣに核酸分子の混合物及びタンパク質抗原の混合物を同時に取り込ませることが可能である。
【００２９】
特定の腫瘍細胞によって特異的に発現される腫瘍関連抗原は、当業者に既知である。したがって当業者は、別個のタイプの癌を患う個人、又は癌となるリスクを有する個人を治療するために、または予防的にワクチン接種するために使用され得る、取り込みを行う樹状細胞を製造するために必要とされる抗原を選択し得る。
【００３０】
したがって、本発明のＤＣは、２つの異なるタイプの分子：核酸分子（単数又は複数）及びタンパク質分子（単数又は複数）を取り込む。
【００３１】
免疫増強性ＤＣを製造する場合において、核酸、特にｍＲＮＡのトランスフェクションは、他の抗原取り込み技術よりも優れていることを比較試験は示唆している。さらに、ＤＣへの、例えばｍＲＮＡの取り込みは単純かつ効果的である。微少量の腫瘍組織から核酸分子を増幅する能力は、各々の癌患者へのＤＣワクチン接種の使用を拡張する。
【００３２】
ＤＣへの、核酸をコードする限定された腫瘍抗原の取り込みは、単純であり、再生産性があり、そして有効である。配列が既知である、遺伝子産物に対応する核酸分子は、好適なプライマー及びポリメラーゼ連鎖反応、ｍＲＮＡの場合においては、転写反応と連動された逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、インビトロにおいて速やかに生成され得る。インビトロにおいて製造される非細胞由来産物の臨床的使用のための核酸の製造は、費用効果があるように、そして定められた方法で行われ、したがって規制認可行程を合理化かつ簡素化する。これは、試験研究における利用可能性を限定し、そしてそれらの臨床的評価を制限する、ウィルスベクターの使用の複雑性及び制限と対比される。さらに、特にＲＮＡ手法は、この種の治療において遭遇する一般的な問題：大部分の場合において、癌患者に対する有効かつ持続的な免疫プロトコルのために必要とされる抗原の量を発生させるために十分な腫瘍組織を得ることが可能ではないという事実、に対する実用的な解決を提供する。実際、当該ＲＮＡ手法によって、微少量の腫瘍組織由来の対象の抗原の、単純かつ直接的なＰＣＲ型増幅が可能であり、そしてそれは実質上、無尽蔵の抗原を提供する。未成熟ヒト単球由来ＤＣの、抗原ｍＲＮＡとの、培地のみ中におけるインキュベーションは、抗原特異的ＣＴＬ応答を刺激するために、ＤＣを感作するために十分であり、脂質の存在中においてトランスフェクトされたＤＣに関連するものほど優れていないとしても、同程度のものであることが示された。
【００３３】
本明細書において使用される用語「腫瘍関連抗原タンパク質」は、タンパク性構造、例えばポリペプチド、タンパク質及びペプチドを含むか、又はからなる、腫瘍関連抗原のことである。本発明の腫瘍関連抗原タンパク質の断片は、少なくとも１０個の、好ましくは少なくとも２０個の、より好ましくは少なくとも３０個の、さらにより好ましくは少なくとも５０個の、前記腫瘍関連抗原の連続したアミノ酸残基を有する。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態に従って、少なくとも一つの核酸分子によってコードされた腫瘍関連抗原又はその断片は、（ａ）ｕＴＡＡの群、例えば、限定されないが、サバイビン及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、並びに／又は、（ｂ）腫瘍特異的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば、限定されないが、ＰＳＡ、ｍｕｃ−１などから選択される。特定の好ましい実施形態において、少なくとも一つの核酸分子によってコードされる腫瘍関連抗原又はその断片は、サバイビン及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の樹状細胞は、当技術分野において既知である、取り込みされた樹状細胞を超える幾つかの利点を有する：（ａ）たとえ原発腫瘍が、続発性の転移とは異なる（ｕ）ＴＡＡ発現パターンを示すとしても、及び／又は、腫瘍の進行によって、一つ以上の腫瘍病巣における（ｕ）ＴＡＡ発現パターンの変化を伴うとき、より多くの抗原の同時使用によって、標的範囲を増加させることが可能である；（ｂ）場合によりＴＡＡとの併用によるｕＴＡＡの使用は、実質的に任意の腫瘍への治療の適用性を拡張する；（ｃ）発現が腫瘍細胞にほぼ完全に制限され、一方で治療の有効性を増大させる、ｕＴＡＡの使用は、任意の（深刻な）副作用の増大を著しく減少させる；（ｄ）核酸分子によってコードされる少なくとも１つの（ｕ）ＴＡＡ、及び少なくとも一つのタンパク質ｕＴＡＡの使用は、短期間の遷移性細胞障害性応答、及び長期間の安定性適応応答の両方の確立を誘発し、そして維持する。
【００３６】
特に、核酸（例えばＲＮＡ）及びタンパク質取り込みの同時使用は、外因性タンパク質抗原の処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及び存在（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を通じた、ＭＨＣ−ＩＩの活性化のみによって誘発され得るＴ−ｒｅｇの応答を引き起こす危険性を回避し、一方で、２つの異なる応答を引き起こす：（ａ）ＭＨＣ−Ｉ分子と結合した抗原を認識する、ＣＤ８+Ｔ細胞によって媒介される、細胞障害性の、早期及び短期間応答。これらの細胞は、それらの表面上にＤＣ提示抗原を保持する他の細胞を直接攻撃する。この種の応答は、厳密に制御され、そして一般的に非常に強いＭＨＣ／抗原活性化シグナル、及び／又は「ヘルパーＴ」細胞によって提供される追加の活性化シグナルを必要とする；（ｂ）マクロファージ、ＣＴＬ及び抗体を産生するＢ細胞の活性を刺激するＣＤ４+Ｔ細胞（Ｔｈ）によって媒介される、メモリー性の、安定かつ長期間応答。実際、ヘルパーＴ細胞は、先天性及び適応性の両方の免疫応答を制御し、そしてどのタイプの免疫応答を身体が産生するかを決定することを助ける。長期間活性メモリーは、Ｂ及びＴ細胞の特異的な活性化によってのみ獲得され、かかる活性化を誘発する抗原が非常に免疫原性であることを必要とする。核酸分子によってコードされる少なくとも一つの（ｕ）ＴＡＡ、及び少なくとも一つの（ｕ）ＴＡＡタンパク質抗原を取り込んだ本発明のＤＣは、（ａ）大部分が食作用の能力を失っている。この特徴は、取り込まれた抗原に対する独占的なＴ細胞の特異的活性化を保証するために重要である；（ｂ）刺激要因、例えばＣＣＬ１９及び／又はＣＤ４０Ｌに対する応答で遊走する能力を保持している。この特徴によって、ＤＣは注入部位からリンパ節、及び／又は高濃度のＴ細胞が存在する場所へと遊走することができる；（ｃ）成熟した表現型、すなわち、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲの高い表面発現を示す。適切な数のＴ細胞を減少させ、及び活性化するために重要である；（ｄ）軽〜高レベルのＩＬ−１２、及び軽〜無のＩＬ−１０を分泌する。この特徴は、ＤＣが細胞障害性応答を維持し（ＩＬ−１２）、そしてヘルパーＴ細胞の活性化を潜在的に増加させる（ＩＬ−１０）ことを保証する；（ｅ）ＣＤ４０Ｌを用いた刺激に基づいて、取り込まれた抗原（単数又は複数）の表面発現を示す。この特徴は、Ｔ細胞のＤＣ刺激の特異性を決定するために重要である；（ｆ）凍結／解凍サイクルの後に採取及び再培養する場合、小円形細胞から伸長する幾つかの指状のものの接着及び存在によって、及び細胞集団の存在によって特徴付けられる、典型的な樹状形態を示す。この特徴は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてのＤＣ機能の特質を構成する；（ｇ）それらの活性表現型及び／又は機能を失わせることなく、−８０℃〜−１８０℃で貯蔵され得る。
【００３７】
さらに、本発明はまた、異なる固形癌及び血液癌を患う患者の治療における、異なるタンパク質腫瘍抗原又はその断片との併用での、ＴＥＲＴ及び／又はサバイビンｍＲＮＡを取り込んだ、成熟ＤＣの使用に関し、好ましくは、遊走できるが食作用の無い前記成熟ＤＣの使用に関する。
【００３８】
本発明、特にその好ましい実施形態は、先行技術を超える多くの利点、例えば、患者のＰＢＭＮＣ由来の純粋な単球の多量の単離、末梢血単球（ｐＭｏｓ）から成熟ＤＣへの、４０〜８０％の形質転換率、ＧＭＰ及びｒｅ−ｖｉｖｏにおける使用準拠プロトコル、ＧＭＰ準拠実験室における標準的な製造、無血清プロセスの可能性、任意のタイプの固形及び液体腫瘍に実質的に適用可能な治療、表現型的及び機能的に成熟した、大量のＤＣの利用可能性、数年間貯蔵され得る、すぐに使用可能な製造物、非常に増大された細胞障害性応答、非常に増大された適応性応答、Ｔ−ｒｅｇ応答の阻害、最少の細胞操作を用いた技術、腫瘍組織／細胞の不要性、タンパク質形態で投与された抗原との併用の結果としての、ＭＨＣ−ＩＩの同時活性化と一緒になった、ｍＲＮＡ取り込みの結果としての、ＭＨＣ−Ｉを用いて腫瘍抗原を曝す可能性、万能に発現される抗原、及び癌特異的抗原の組み合わせ、凍結／解凍サイクルの後の高い細胞生存率、及び凍結／解凍サイクルの後における細胞の機能及び表現型の完全な保存を提供する。
【００３９】
本明細書において使用される用語「断片」は、少なくとも一つの野生型タンパク質のエピトープを保持する、万能性又はタイプ特異的腫瘍関連抗原の一部又は一続き（ｓｔｒｅｃｈ）のことである。結果的に、樹状細胞に組み込まれるために使用された、万能性又はタイプ特異的腫瘍関連抗原の「断片」は、少なくとも一つのＴ細胞受容体と結合し、そしてそれは、かかる万能性又はタイプ特異的腫瘍関連抗原を発現する細胞に対して非常に特異的な免疫応答を促進する。当該「断片」は、同様に、その免疫活性を増加させるために、インビトロで修飾かつ合成された、万能性又はタイプ特異的腫瘍関連抗原の一部又は一続きのことである。
【００４０】
用語「断片」は、ＲＮＡ及びタンパク質抗原の両方のことである。
【００４１】
同様に、「タンパク質腫瘍抗原」の定義は、単離された、又は化学的に／組み換えにより製造された、タンパク質及びペプチドの全体及び一部に加えて、腫瘍滲出物及び溶解物を含む。本発明にしたがって、アミノ酸修飾（欠失、置換、挿入）を含む腫瘍関連抗原及びその断片は、本明細書において使用されるように、腫瘍関連抗原及びその断片の定義に含まれる。これは、これらの修飾分子がなお、野生型腫瘍関連抗原又はその断片と類似の又は同一の機能を示すという条件下においてである。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態に従って、核酸分子はリボ核酸、好ましくはｍＲＮＡである。
【００４３】
ｍＲＮＡ及び腫瘍特異的タンパク質／ペプチドを同時に取り込んだＤＣは、ほぼ完全に食作用の能力を失っているが、刺激因子への応答おける遊走能力を保持し；軽度のＩＬ−１０分泌を伴うか、又は伴わずに、高いＩＬ−１２産生を示し；Ｔ細胞の細胞障害性応答を向上させ；ｍＲＮＡによってコードされた抗原が、ＤＣによって内因性タンパク質として処理されるため、したがってＭＨＣ−Ｉと複合化され；外因性タンパク質がＭＨＣ−ＩＩと共に複合化されたＤＣによって処理されるという事実のために、ＭＨＣ−ＩＩを通じたＴ−ｍｅｍ応答を誘導し；Ｔ−ｒｅｇを活性化しない。
【００４４】
ＤＣは、ｍＲＮＡをコードした抗原を、以下の理由で取り込む：
・ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣは、インビトロにおけるＣＴＬ応答を刺激するときにおいて、ペプチドパルス（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ）ＤＣと同等、又はより強力である（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０（４）：１０２８−３４）；
・ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＤＣは、最も効果的なＡＰＣであり、インビトロにおいてＣＤ８+応答を刺激することができる（Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ．ａｎｄ Ｊ．Ｖｉｅｗｅｇ（２００４）．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９：２５１−６３）；
・ｍＲＮＡトランスフェクションは、非常に有効であるため、それはＤＣ変異工程を誘導し及び貢献することができる（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５（８）：４７１０−７ ａｎｄ Ｈｅｉｓｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０９（３）：４０９−１７）；
・ｍＲＮＡは、ＣＴＬ応答として測定されるように、受動的トランスフェクションを経由して、非常に効率的にＤＣに組み込まれ得る（Ｎａｉｒ，Ｓ．Ｋ．（１９９８）．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５（１１）：１４４５−６）。
【００４５】
ｍＲＮＡ及び核酸分子を取り込む方法は、他の取り込み技術に対して幾つかの利点を示すが、この手法はまた、少なくとも１つの弱点がある：それは、ＣＤ８+細胞の活性化を通じて強力なＣＴＬ応答を引き起こすが、たとえかかる応答が腫瘍に対する効率的な免疫応答の確立に重要であることが示されているとしても、それは効果的なＣＤ４+応答を誘導することができない。実際、ＣＤ４+細胞は、ＣＤ８+ＣＴＬの拡張及び持続のために重要な機能を提供し；腫瘍部位における免疫系の固有の力を刺激し、そして局所的な血管新生を阻害する。最適な抗腫瘍免疫応答は、したがって、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞が引き起こす免疫応答の両方の同時の活性化を必要とする。
【００４６】
この目的を達成するために、ｍＲＮＡ取り込み手法に加えて、第二の取り込みステップ：受動的インキュベーションによるタンパク質抗原の取り込み、が導入された。ｍＲＮＡインキュベーションによって刺激されたＤＣは、例えば、短いペプチドを食作用により取り込む（ｐｈａｇｏｃｙｔｅ）能力の増大を示す。したがって、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の免疫応答力を誘導するための二重取り込み（ｄｏｕｂｌｅ−ｌｏａｄｉｎｇ）法の使用が有利であることが判明した。この方法は、それが、ＣＤ８+の活性化による短期間応答、及びＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を通じた長期に渡るメモリー応答を同時に誘導することができるため、ＤＣをベースとした癌免疫治療の大きな改善を構成する。
【００４７】
この二重取り込み法は、当技術分野において既知の他の方法に対して、幾つかの利点を有する：
・免疫系の細胞障害性及びメモリー力の両方の特異的活性化；
・Ｔ−ｒｅｇ応答の不在；
・刺激因子の感受性及び力の両方において結果的に生じる利益を有する、個々の免疫系の力の活性化を目的とする異なる抗原の使用；
・固形腫瘍及び血液腫瘍の任意のタイプに実質的に利用可能な治療；
・万能性及びタイプ特異的腫瘍抗原の組み合わせ；
・ＧＭＰ及びｒｅ−ｖｉｖｏ使用における全準拠性；
・数年間貯蔵可能である使用準備済みの製造物；
・最少の細胞操作；
・腫瘍組織／細胞の不要性；
・核酸分子（単数又は複数）によってコードされた（ｕ）ＴＡＡ（単数又は複数）及び（ｕ）ＴＡＡ（単数又は複数）タンパク質抗原（単数又は複数）のそれぞれを取り込む時における、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ複合体の同時活性化；
・凍結／解凍サイクルの後における、細胞の高い生存率；
・凍結／解凍サイクルの後における、細胞の機能及び表現型の高い保存；
・当該方法の多用途性。
【００４８】
本発明の別の好ましい実施形態に従って、核酸分子は、完全長野生型ｍＲＮＡ、当該野生型ｍＲＮＡの断片、完全長インビトロ修飾ｍＲＮＡ、当該インビトロ修飾ｍＲＮＡの断片、２つ以上の完全長、断片、野生型、又は修飾型のｍＲＮＡの混合物をさらに含む。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態に従って、タンパク質抗原は、完全長野生型ｍＲＮＡ；当該野生型ｍＲＮＡの断片；完全長インビトロ修飾ｍＲＮＡ；当該インビトロ修飾ｍＲＮＡの断片、２つ以上の完全長、断片、野生型、又は修飾型のｍＲＮＡの混合物；異種抗原と結合した、完全長抗原又は抗原断片、例えば、限定されないが、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）；単離された又は化学的／組み換えによって産生された腫瘍溶解物及びペプチドを含む。用語、タンパク質抗原は、抗原、タンパク質、ペプチド及び溶解物の混合物を同様に含む。
【００５０】
本発明の樹状細胞の製造は、任意の種類の腫瘍関連抗原を取り込んでなされ得る。しかし、当該腫瘍関連抗原は、好ましくは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン（ＭＵＣ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＢＲＣＡ及びｒａｓからなる群から選択される特異的腫瘍関連抗原、並びに／或いはサバイビン及びＴＥＲＴからなる群から選択される万能性腫瘍関連抗原である。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態に従って、樹状細胞は、ヒト又は動物由来である。
【００５２】
本発明の樹状細胞は、好ましくは、ヒト個人の末梢血からの自己ＤＣの拡張に基づく。末梢血単核細胞（ＰＢＭ−ＮＣ）を、白血球分離を通じて回収し、その後、選択されたＤＣ前駆体を構成する単球（Ｍｏ）画分を増大させるために、水簸又は勾配遠心分離（すなわち、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離）を行う。個人からＭｏを得るために、この方法は、したがって、中間ステップ、例えば、一方でＧＭＰに準拠しない、及び他方で汚染源となり得るビーズの使用を通じた濃縮の必要性無しに、速やかに培養され得る、高純度かつ大量のＤＣ前駆体を保証する。Ｍｏをその後、ＧＭＰ準拠実験室において、ＧＭＰのみならず無血清かつｒｅ−ｖｉｖｏ順応した培養培地を用いてＤＣへと分化させる。
【００５３】
ＤＣは、好ましくは、それらがまだ未成熟であるときに核酸分子（単数又は複数）を取り込み、成熟され、そしてその後タンパク質抗原（単数又は複数）を取り込む。代替的に、ＤＣは、それらがまだ未成熟のときに、核酸分子（単数又は複数）を第一に取り込み、そしてその後タンパク質抗原（単数又は複数）を取り込み得、そしてその後成熟される。さらに、ＤＣは、核酸分子（単数又は複数）を第一に取り込み、その後成熟され、そして同時にタンパク質抗原（単数又は複数）を取り込み得る。最終的に、核酸分子（単数又は複数）が最初であり、タンパク質抗原（単数又は複数）がその後であるという取り込みの順番は、逆にされ得る。使用される方法に従って、取り込んだＤＣによってなされる免疫応答を調節することが可能である。
【００５４】
ＤＣは、現在利用可能である標準的なカクテルの一つを添加することによって成熟され得るが、好ましくはＲｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＦＮ−γの使用によってなされ得る。
【００５５】
成熟したＤＣは、それらの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％が二重に取り込んでいる場合にのみ、好ましくは患者へと注射される。
【００５６】
本発明の別の態様は、腫瘍関連抗原をコードする少なくとも一つの核酸分子、又はその断片、及び腫瘍関連抗原であるタンパク質分子、又はその断片を取り込んだ樹状細胞の製造方法に関し、好ましくは、本発明に従って、以下のステップ：
・樹状細胞を提供し；
・上記の通り、前記細胞に腫瘍関連抗原をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び腫瘍関連抗原であるタンパク質分子、又はその断片を取り込み；そして場合により
・前記ＤＣを成熟させること
を含む、前記製造方法に関する。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態に従って、樹状細胞源は、それらの自己前駆体、すなわちＰＢＭＮＣ由来単球からなる。当該単球は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で５〜６日かけて、未成熟ＤＣへと分化変換される。
【００５８】
樹状細胞は、代わりに、直接的に全血から単離され得る。樹状細胞の直接的な単離、及び単球の樹状細胞への分化転換の手順は、当技術分野において既知である。本発明の手順は、４０〜８０％の初期ＭｏがＤＣとなることを保証するが、普及している手順は約１０〜２０％保証する。
【００５９】
ＤＣは、共刺激分子のレベルを増大させるために、及び強力かつ持続的な腫瘍特異的Ｔ細胞の細胞障害性応答を引き起こすために、最終的にインビトロで成熟される。本発明の成熟化カクテルは完全にＧＭＰに準拠したものであり、そして現在普及して行われている方法と比較して、軽度のＩＬ−１０分泌を伴わない又は伴う、長期のＩＬ−１２産生を保証する。さらに、これらのＤＣは、ＣＤ４０Ｌを用いた刺激で、高レベルのＩＬ−１２及び低量のＩＬ−１０を産生することができ、そして凍結／解凍サイクルにおいて、ＤＭＳＯ１０％中、又はグリセロール１０％中において１年間の冷凍保存（−１５０℃）された後でさえ、生存可能で、表現型において、形態学的に、そして機能的に活性であり続ける。本明細書において記載された方法がＧＭＰ準拠最終生産物の製造のために使用される時、その放出は、生存率、表現型的、形態学的、及び機能的活性、冷凍保存及び冷凍／解凍サイクルにおける安定性、患者へ適用されなければならないＤＣの純度及び滅菌度を完全に決定するために設計された、厳密な最終生産物調節（Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＥＰＣ）の成功する通過への条件である。最終生産物は、好ましくはグリセロール（１０％）又はＤＭＳＯ（１０％）中で、すなわち、その質を長期間保存することによって当該生産物をすぐに使用可能とするものであり、ＧＭＰに準拠しており、そして使用された濃度において副作用を引き起こさない凍結培地中で保存される。これらの冷凍培地は同様に、当該製造物の長期に渡る活性（ＩＬ−１２分泌、Ｔ細胞刺激及び遊走）を供与する。二重取り込みされたＤＣは、ほぼ完全にそれらの食作用を行う能力を失っているが、刺激因子及び非常に低い温度への応答における遊走する能力、自発的に遊走する能力を保持し、軽度のＩＬ−１０分泌を伴う又は伴わない、高いＩＬ−１２産生を示し；そしてＴ−ｒｅｇの活性化を引き起こさずに、Ｔ細胞の細胞障害性応答及びＴ−ｍｅｍ応答を向上させる。
【００６０】
本発明の別の実施形態にしたがって、未成熟の樹状細胞は、取り込み時又は取り込み後において、及びタンパク質抗原の取り込み中に成熟される。
【００６１】
樹状細胞は、好ましくは、Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＮＦ−γを添加することによって成熟される。
【００６２】
本発明の別の態様は、本発明において記載された方法に従って分化転換され、及び／又は培養され、取り込まれ、及び成熟がなされた樹状細胞に関する。
【００６３】
本発明の樹状細胞が医薬／臨床グレードの調製物中において提供され得るため、本発明のさらに別の態様は、本発明の樹状細胞を含む、医薬／臨床グレードの調製物である。前記調製物は、実質的に任意のタイプの固形癌及び血液癌の治療又は予防において使用される。二重取り込み成熟ＤＣは、好ましくは一週間に一回、又は二週間に一回接種される。この製造物は、自家産物から成り、したがって多くの個別の成分を示し得るため、継続的なモニタリングの間に患者において観察される結果に従って、投与経路は一週間に一回から一か月に一回の投与の間で変化し得る。ＤＣは、好ましくは皮内投与又は節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）投与される。代わりにそれらは、治療される癌に依存して、傍絞輪部に（ｐａｒａｎｏｄａｌｌｙ）、結節周囲に（ｐｅｒｉｎｏｄａｌｌｙ）、皮下に、又は静脈内に投与される。
【００６４】
ＤＣは、好ましくはできる限り腫瘍近辺で投与される。標準的投与量は、好ましくは約７〜１３×１０6個のＤＣであり、そしてそれは最終容積０．５〜１ｍＬの凍結培地に溶解される。
【００６５】
当該治療は、２〜２０回に含まれる注入回数でなされる。当該産物は、限定されないが、１０％グリセロール又は１０％ＤＭＳＯ中で貯蔵され、最大で１０分間（１０’）、室温で解凍され、そして速やかに投与される。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態に従って、当該産物の投与は、免疫刺激剤及び／又はアジュバントの投与を伴い得る。その使用は、化学療法に付随して、及び化学療法の間の休止期間中において同様に好適であるが、免疫抑制療法及び／又はＴ細胞（癌に対する免疫応答の、ＤＣによる活性化の好ましい標的）の著しい減少下において好適ではない。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、個人における癌を治療又は予防するためのワクチンの製造のための、本発明の樹状細胞の使用に関する。
【００６８】
腫瘍関連抗原（上記参照）をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び腫瘍関連抗原（上記参照）である少なくとも一つのタンパク質分子を取り込む、本発明の樹状細胞は、癌を患う個人を治療するため、又は個人が癌を発症することを予防するために好適に使用され得る。
【００６９】
本発明は、以下の図及び実施例によってさらに説明されるが、それらに限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
１．前臨床パイロット実験
単球を、患者の白血球除去物（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓａｔｅ）から単離し、そして以下のマーカーで観測した：
【００７１】
【表１】
【００７２】
続いて、白血球除去により回収したＰＢＭＮＣをフィコライズ（ｆｉｃｏｌｉｚｅｄ）し、再集計し、そして先に記載した通りに観測した。この点について、フィコライズされた細胞又は水簸由来の細胞を、吸着のために２時間ＣｅｌｌＧｒｏ中において固定し、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００〜２５００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加した。その後、上清と共に非吸着細胞を除去し、そして吸着細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００〜２５００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で、１〜２Ｍｉｏ／ｍＬで５〜６日間、単球を未成熟ＤＣへと分化転換するためにさらに培養した。その後、当該細胞にｍＲＮＡを取り込んだ。簡単に、ＤＣをＰＢＳで二度洗浄し、集計し、そして３００ｘｇで１０分間回転させた。それらをＣｅｌｌＧｒｏ培地中で再懸濁し、そして３７℃／５％ＣＯ2の加湿インキュベーター中、２〜４時間、ｍＲＮＡ含有溶液（０．１〜１００μｇＲＮＡ／１×１０6ＤＣ）中でインキュベートした。洗浄することなく、当該培地をその後、３７℃／５％ＣＯ2の加湿インキュベーター中、２〜１２時間、タンパク質抗原溶液（０．１〜１００μｇペプチド／１×１０6ＤＣ）と共にインキュベートした。その後、洗浄することなく、当該培地にＲｉｂｏｍｕｎｙｌ（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）及びＩＮＦ−γ（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加し、そして８〜２４時間成熟させた。グリセロール（水溶液）１０％中、各々少なくとも１０００万個のＤＣの分割量で成熟ＤＣを貯蔵した。
【００７３】
品質管理（ＱＣ）を下記の通りに行った：１分割量の細胞を解凍し、そして培地中に４８時間置いた。
【００７４】
表現型：
【００７５】
【表２】
【００７６】
成熟ＤＣは、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲの上方制御を示した。
【００７７】
細胞の生存率を、ＧＭＰ遵守ソフトウェアと共にＣａｓｙ Ｃｏｕｎｔｅｒによって測定し、そしてそれは少なくとも７０％以上でなければならない。
【００７８】
Ｔ細胞及びＢ細胞による汚染を、ＦＡＣＳを通じてＣＤ３及びＣＤ１９陽性細胞を検出することによって観測した。汚染は常に２５％未満に維持された。
【００７９】
機能性：
免疫活性試験を、ＩＳＯ９００２認証されたＥＬＩＳＡアッセイを通じた、ＩＬ１２対ＩＬ１０の産生の分析を通じて、及び混合白血球反応を経由した白血球増殖の誘導の分析を通じて行った。
【００８０】
ｄｌ−ＤＣの食作用及び遊走活性を、ＦＩＴＣ−デキストラン摂取及びＴｒａｎｓｗｅｌｌアッセイのそれぞれによって観測した。
【００８１】
２．臨床試験計画
表題：「アジュバント療法終了後８週間である進行性卵巣上皮癌の対象において、ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡ及びサバイビン−ペプチド二重取り込み完全成熟ＤＣを用いた、活性な免疫療法の安全性を調査するための、フェーズＩ無作為化オープン試験」
【００８２】
フェーズ：フェーズＩ
適応：進行性卵巣上皮癌
【００８３】
試験目的：アジュバント療法終了後８週間である進行性卵巣上皮癌の患者において、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）−ｍＲＮＡ及びサバイビン−ペプチド二重取り込み完全成熟ＤＣ（樹状細胞）を用いた、活性な免疫療法の安全性を調査するため。播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）減少の観点における有効性は、第二の目的として調査される予定である。
【００８４】
試験計画：これは、進行性卵巣上皮癌の患者におけるオープンフェーズＩ試験である。患者は、１週間に１回投与での治療アームＡ対２週間に１回投与での治療アームＢへと無作為化された。個々の患者は、全体で８回の皮内注射を受けることとなる。当該治療コースは、治療群Ａに関する週１回の８回注射、及び治療群Ｂに関する２週間に１回の８回注射を含む。
【００８５】
患者は安全性パラメータを調査され、そして腫瘍状態を１２、２４、３６、４８、７２、及び９６週目において疾患の増悪まで評価される。治療の終了後（治療アームＡにおいては７週目、治療アームＢにおいては１４週目）、患者は、疾患増悪、死亡又は試験の終了まで２４ヶ月間調査される。疾患増悪後、患者は、死亡又は試験終了まで調査されることとなる。
【００８６】
ｃＧＣＰガイドラインルールを準拠するために、最初の６人の患者は、管理された条件下において４８時間観察されることになる。
【００８７】
予定されるサンプルサイズ：２５人の患者
【００８８】
治療継続期間：各々の患者は、合計８回の皮内注射を受け、臍傍に投与されることになる。治療コースは、８回の注射サイクル（１サイクルにつき１回注射）を含み、治療アームＡにおいては１週間に１回、そして治療アームＢにおいては２週間に１回である。
【００８９】
試験治療：ＩＭＰは、５％グルコースの生理水（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｗａｔｅｒ）溶液中に溶解された１０％ＤＭＳＯから構成される、０．５ｍＬ標準凍結溶液中で希釈された、ＧＣＰ準拠の標識付き２ｍＬクライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）中に含まれる、ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡ及びサバイビン−ペプチドを二重取り込みした、１×１０7±３０％の自己の完全成熟ＤＣからなる。ＩＭＰは、凍結されて提供され、そして一旦ＲＴにて最大１０分間解凍された場合、それは速やかに投与されなければならない。
【００９０】
ＩＭＰの製造は下記の通りに行われる：
【００９１】
患者は白血球除去を受け、そして回収されたＰＢＭＮＣを２４時間以内に２〜２０℃で清潔な室内施設へと輸送し、ここで単球画分を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）濃度勾配遠心分離を通じて濃縮する。フィコールの後、当該単球の純度は、生じた細胞を単純ＣｅｌｌＧｒｏ中に播種し、そしてそれらを２時間、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートすることによって増大される。この時点において、非吸着細胞（リンパ球）を洗い流し、そして吸着細胞（単球）を、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを追加したＣｅｌｌＧｒｏ中、１〜２×１０6／ｍＬの最終濃度でさらに培養する。
【００９２】
ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で播種された後、当該細胞を５日間培養する。この時点で、それらを洗浄し、単純ＣｅｌｌＧｒｏ中に播種し、そして初めにＴＥＲＴ−ｍＲＮＡと共に２時間インキュベートする。この時点で、洗浄ステップをすることなく、Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ及びＩＮＦ−γを追加したＣｅｌｌＧｒｏ中、３７℃／５％ＣＯ2で１６時間、それらをインキュベートすることによって当該細胞は完全に成熟される。この時点において、吸着成熟細胞を一度ＰＢＳ中で洗浄し、そして最終的にサバイビン−ペプチドと３７℃／５％ＣＯ2で２時間、合わされた。その後、当該細胞を採取し、集計し、そして生存率及び純度を検定し、その後バイアルへ１×１０7±３０％の細胞ずつのバイアルへと等分し、そして、５％グルコースの生理水溶液中に溶解された１０％ＤＭＳＯから構成される、０．５ｍＬの凍結溶液中で凍結される。
【００９３】
ＩＭＰの採取は、患者へ注射されるべき、８個のＩＭＰバイアルの貯蔵物を含む；１個の滅菌サンプル；１個の維持サンプル；３〜５個のＥＰＣサンプル、及び潜在的な過剰サンプル。当該産物の放出は、滅菌性、生存率、表現型、純度、機能性及び安定性に関するＥＰＣ基準で厳格に条件付けされる。当該バッチを正式に放出した後、各々のＩＭＰバイアルは、ドライアイス中で、密閉された輸送ボックス中で最大２４時間貯蔵され得る試験場へ単独で輸送される。一旦、室温で最大で１０分間解凍された場合、ＩＭＰは、１０分間以内で皮内、及び臍傍を通じて速やかに患者へ注射されなければならない。
【００９４】
３．原理検証
健常対照の白血球除去物から単離された単球は、水簸を通じてその後濃縮され、その後以下のマーカーを使用して観測され、そして集計される：
【００９５】
【表３】
【００９６】
この時点において、単球は、その後バイアルへ５×１０7個の細胞ずつの分割量へと分けられ、そして、５％グルコースの水溶液で希釈された１０％ＤＭＳＯで、１．８ｍＬの最終容量で凍結される。当該分割量を、−１５０℃にて、使用がなされるまで貯蔵した。同一バッチに属する少なくとも１４個の分割量を同時に解凍し、そして貯蔵して各々の実験を実施する。解凍後、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、前記マーカー、生存率及び量を観測する。その後それらを、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００〜２５００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中へ播種した。その後、非吸着細胞を上清と共に捨て、そして吸着細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で、１〜２Ｍｉｏ／ｍＬの濃度で５日間、単球を未成熟ＤＣへと分化転換するために、さらに培養する。その後、当該細胞にｍＲＮＡを取り込ませる。簡単に、ＤＣを一度ＰＢＳ中で洗浄し、集計し、そして１０００ｒｐｍで１０分間回転させた。それらをＣｅｌｌＧｒｏ培地中で再懸濁し、そしてｍＲＮＡ含有溶液（５０ｎｇ ＲＮＡ／１×１０6ＤＣ）中で、３７℃／５％ＣＯ2で２時間、加湿インキュベーター中でインキュベートする。洗浄することなく、その後当該培地へ、Ｒｉｂｏｍｕｎｙｌ（１００μｇ／ｍＬ）及びＩＮＦ−γ（１０００Ｕ／ｍＬ）を添加し、そして１６時間成熟させる。この時点で、当該細胞をＰＢＳ中で一度洗浄し、そしてタンパク質抗原溶液を添加した（１〜１０μｇペプチド／１×１０6ＤＣ）単純ＣｅｌｌＧｒｏ中に再播種し、そして３７℃／５％ＣＯ2で２時間、加湿インキュベーター中でインキュベートする。実験セットに依存して、当該ペプチドは成熟前に、又は成熟化カクテルと同時に代替的に取り込まれた。その後、当該細胞をＰＢＳ中で一度洗浄し、そして吸着細胞を採取し、そして速やかに処理するか、又は、５％グルコースの水溶液で希釈されたＤＭＳＯ １０％で、０．５ｍＬの最終容量となるように１×１０7個のＤＣの分割量へと分けられる。
【００９７】
品質管理（ＱＣ）を下記の通りに行う。
【００９８】
播種時、又は凍結／解凍サイクル時において、細胞を培地中において１２〜２４時間置く。
【００９９】
ＱＣの開始時、及び特定の時点（０〜４〜１２／１４及び２４時間）おいて、細胞を以下のパラメータに関して観測する：
【０１００】
【表４】
【０１０１】
形態に加えて、生存率、及びＩＬ−１０及びＩＬ−１２の分泌。
【０１０２】
原料及び方法
１．前臨床パイロット実験
１．１ 細胞の単離
白血球除去及び水簸を、ＧＡＭＢＲＯ装置を用いて、及び製造指示書に従って行う。
【０１０３】
１．２ フィコール精製
１０ｍＬの血液／ａｐｈｅｒｅｓａｔｅを３０ｍＬのＰＢＳ＋１０％クエン酸バッファーと共に混合する。その後、３０ｍＬの当該混合物を２０ｍＬのフィコールへ加え、そして２０分間２０００ｒｐｍで、ＲＴにて遠心分離する。その後、界面を回収し、そして１０分間１２００ｒｐｍで、ＲＴにて遠心分離する。最終的に、沈殿物をＰＢＳ中で再懸濁し、１０分間１２００ｒｐｍで、ＲＴにて二回洗浄し、そしてＣｅｌｌＧｒｏ中で再懸濁する。
【０１０４】
１．３ 細胞培養
ＤＣを、プラスチック製のフラスコ内で、ＧＭ−ＣＳＦ（４００〜１０００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（１００〜４００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で５〜６日間培養し、そしてＲｉｂｏｍｕｎｙｌ（０．５〜１μｇ／ｍＬ）及びＩＮＦ−γ（２００〜１０００Ｕ／ｍＬ）を添加し、２４時間成熟させる。
【０１０５】
１．４ ＦＡＣＳ
５０μＬの全血、又は５０μＬの細胞懸濁液（解凍されたＤＣ、１×１０6細胞／ｍＬＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3の最終濃度）を、製造業者の推奨に従って、１５分間室温にて、好適な量のＦＡＣＳ抗体と共にインキュベートし（全血の赤血球は化学的に溶解され）、８００ｒｐｍ（ＲＴ）で、各々１．５ｍＬ又は０．８ｍＬのＰＢＳを用いて洗浄し、０．５ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁し、固定剤を追加し、そしてさらにＦＡＣＳ（登録商標）によってさらに処理する。
【０１０６】
１．５ ＥＬＩＳＡ
凍結されたＤＣを解凍し、そして２％ＨＳを添加したＲＰＭＩ中で、１×１０6細胞／ｍＬの最終濃度で再培養する。２４時間後、上清を採取し、そしてＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ ＩＳＯ９００２を使用して、及び製造指示書に従って、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０について分析する。
【０１０７】
１．６ 混合白血球反応
凍結ＤＣを解凍し、そして２％ヒト血清（凝固の避けられた、ＡＢ）、１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）を添加したＲＰＭＩ中において、１×１０6細胞／ウェルの最終濃度である、健常者由来のフィコール分離されたＰＢＭＮＣの非吸着画分と共に、１×１０4細胞／ウェルの最終濃度で、１５０μＬの最終容量で、９６ウェルＵボトムプレート中、共培養する。増殖は、酸化型（非蛍光、青）から還元型（蛍光、赤）へと変化する染色剤の還元を引き起こす。２〜７日間、４時間ごとに吸光度を５９５ｎｍにて、参考波長である６２０ｎｍと共に、プレートリーダーで測定する。
【０１０８】
１．７ ＤＴＣの単離
ＤＴＣの単離を、ＯｎｃｏＱｕｉｃｋキット（Ｇｅｎｔｅｃｈ）で提供されている手順に従って行われる。
【０１０９】
１．８ サバイビンｍＲＮＡの転写及び精製
サバイビンｍＲＮＡ及び精製を、製造業者の手順に従って、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７／Ｔ３キット（Ａｍｂｉｏｎ）及びＯｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡミニ・キット（Ｑｉａｇｅｎ）の各々の使用を通じて行う。
【０１１０】
１．９ タンパク質合成
使用される腫瘍特異的タンパク質／ペプチドの全てを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃによる、又はＧＭＰグレードのペプチドを臨床使用のために製造する、同様に認定された会社によるＧＭＰ遵守規則に従って合成される。指示書に従って、及び研究グレードである「ＥａｓｙＸｐｒｅｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、タンパク質抗原を比較ｃＤＮＡ（Ｏｒｉｇｉｎｅ）から出発して製造する。
【０１１１】
１．１０ ウェスタンブロット
当該細胞をＦｒａｃｋｅｌｔｏｎバッファー中２０分間氷中にて溶解し、そして１０００ｇにて１０分間４℃で遠心分離する。上清を回収後、タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて測定し、そして青色サンプルバッファーを、各サンプルへ４：１の比率で添加する。ポリアクリルアミドゲルを調製した後、タンパク質を流し、そしてニトロセルロース膜上にブロットする。その後、当該膜をＴＢＳ−Ｔ中で洗浄し、そして最初に１時間、０．５ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０及びミルク５％を添加したＴＢＳ−Ｔ １Ｘで構成される、約１０ｍＬのブロッキング溶液中でインキュベートし、その後、３％ＢＳＡ及び０．０２％ＮａＮｓを添加したＴＢＳ−Ｔ ｗ／ｏミルクで希釈された１０ｍＬの第一抗体中、ｏ／ｎでインキュベートする。その後、当該膜をＴＢＳ−Ｔ中、三回洗浄し、そして第二抗体と共に４０分間ＲＴでインキュベートする。最終的に、タンパク質の発現を、ＥＣＬキットを用いて検出する。
【０１１２】
２．臨床試験及び原理検証
１．１ 細胞の単離
白血球除去及び水簸を、ＧＡＭＢＲＯ装置を用いて、及び製造指示書に従って行った。
【０１１３】
１．２ 単球の凍結
水簸により得られた細胞を集計し、そしてＦＡＣＳにより特徴付けを行う。最終的に、単球を３×１０7細胞ずつの分割量に分け、そして１．８ｍＬの最終容量となるように、５％グルコース水溶液で希釈したＤＭＳＯ１０％中で凍結される。当該分割量は、使用の時まで−１５０℃で貯蔵される。
【０１１４】
１．３ 細胞培養
ＤＣを、プラスチック製のフラスコ内で、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−４（４００Ｕ／ｍＬ）を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で５日間培養し、そしてＲｉｂｏｍｕｎｙｌ（１００μｇ／ｍＬ）及びＩＮＦ−γ（１０００Ｕ／ｍＬ）を添加し、１６時間成熟させる。
【０１１５】
１．４ ＦＡＣＳ
５０μＬの細胞懸濁液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを加えた、又は加えていないＰＢＳ中において、最終濃度１×１０6細胞／ｍＬに達するサンプル由来）を、１５分間、冷却装置中でインキュベートし、そして製造業者の推奨に従って、暗所にて、好適な量のＦＡＣＳ抗体と一緒にし、１．０ｍＬのＰＢＳを用い、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを用いて、又は用いずに約４℃、１０００ｒｐｍで洗浄し、固定剤を添加した０．５ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁し、ＦＡＣＳ（登録商標）でさらに処理する。
【０１１６】
１．５ ＥＬＩＳＡ
採取された、又は凍結されたＤＣを解凍し、そしてＣＤ４０Ｌの存在下、又は不在下において、１×１０6細胞／ｍＬの最終濃度で、ＣｅｌｌＧｒｏ中で再培養する。特定のチェックポイントにおいて、２４時間かけて散乱させ、上清を採取し、そしてＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ ＩＳＯ９００２を使用して、及び製造指示書に従って、ヒトＩＬ−１０及びＩＬ−１２ｐ７０に関して分析する。
【０１１７】
１．６ ＴＥＲＴ ｍＲＮＡ転写及び精製
ＴＥＲＴ ｍＲＮＡ転写を、製造業者の手順に従って、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７／Ｔ３キット（Ａｍｂｉｏｎ）の使用を通じて行う。
【０１１８】
１．７ サバイビンペプチド
サバイビンペプチドは、Ｇｌｏｂａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃによって、凍結乾燥（ｌｉｏｐｈｙｌｉｚｅｄ）産物として供給された。一旦、水中で戻されると、それは１００μｇ／ｍＬずつと等しい分割量で、−８０℃で貯蔵された。
【０１１９】
結果
・前臨床パイロット実験
この節において示される全ての結果は、先に記載された通りに培養され、そしてグリセロール１０％中において凍結されたＤＣで行われた。解凍後の細胞生存率は７５％超であった。１０％グリセロール溶液を用いて得られた結果は、ＤＭＳＯ１０％で凍結したときに示されるものと同程度か、又は若干優れている。グリセロール中における細胞の凍結は、それが、毒性物質（ＤＭＳＯ）を除去する遠心分離ステップを必要とせず、したがってそれにより、特別な道具及び装置（遠心分離、層流、無菌環境）の必要性無しに、ＤＣを患者へより容易に注射することが可能であるという点で、細胞をＤＭＳＯと共に凍結させる場合よりも大きな利点を有する。
【０１２０】
サバイビンｍＲＮＡ及びタンパク質抗原（ＰＳＡ）と共にインキュベートされたＤＣが実際に取り込んだことを認めるために、食作用により取り込まれたｍＲＮＡが、同様に転写されたか否か、及びタンパク質抗原がＤＣによって発現されたか否かを決定するためのウェスタンブロットが行われた。
【０１２１】
１Ｍｉｏの細胞をＰＢＳ中で２度洗浄し、Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎバッファー中で溶解し、そしてウェスタンブロットで処理した。図１で報告された結果は、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）及び取り込みされていない半成熟ＤＣ（ｓｍＤＣ）は、サバイビン及びＰＳＡのいずれも発現しないことを示している。サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ（ｍＤＣ）は、この抗原の発現を示すが、ＰＳＡの発現は示さず、そしてサバイビン及びＰＳＡを取り込んだ成熟ＤＣ（ｄｍＤＣ）は、両方の抗原の発現を示す。これらの結果は、取り込み手順が、担体又は活性トランスフェクション手段の必要性無しでｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の取り込みに関して有効であり、そしてそれは非常に効率的であることを裏付ける。
【０１２２】
１０人の患者において、本発明の手順中において記載された通りに培養されたＤＣは、異なる段階の変異に従って、それらの表面上に異なるＣＤ群を発現したことが示された。刺激されていないＤＣは、成熟マーカー、例えばＣＤ８０及びＣＤ８３を発現しなかったが、未成熟マーカー、例えばＣＣＲ３を発現した。取り込みをしていない半成熟ＤＣは、ＣＣＲ３のような未成熟マーカー、及び少ないＣＤ８０、並びにＣＤ８３のような成熟マーカーの組み合わせを示す。サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ完全成熟ＤＣは、成熟マーカー、例えばＣＤ８０及びＣＤ８３のみを示し、未成熟マーカー、例えばＣＣＲ３を示さなかった（図２）。
【０１２３】
本手順によって、ＤＣの表現型における変異のみならず機能的変異が可能か否かを決定するために、上清におけるＩＬ−１０及びＩＬ−１２の分泌が分析された。ＩＬ−１２は、腫瘍細胞を死滅させる免疫系の能力を向上させることが知られており、そして腫瘍への血流を阻害し得る。ＩＬ−１２は、細胞障害性Ｔ細胞の活性化を刺激することにより、腫瘍除去を向上させる。他の面において、ＩＬ−１０は、ＤＣの機能の幾つかの特徴、例えば共刺激性分子の発現、及びＩＬ−１２を合成する能力において著しい阻害効果を有することが示された。重要なことに、ＩＬ−１０で処理されたＤＣは、寛容原性となる。通常、ｉＤＣは、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のいずれも産生せず（又はＩＬ１０に関して非常に少量産生され）、一方でｍＤＣは高レベルのＩＬ−１２、及び存在するのであれば、非常に低いレベルのＩＬ−１０を分泌する。
【０１２４】
予想された通り、ｉＤＣは、ＩＬ−１２を産生せず、そして最少量のＩＬ−１０のみを産生し、一方で我々の手順に従って培養された、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、サバイビンｍＲＮＡを取り込んだ成熟ＤＣ、及びサバイビンｍＲＮＡ＋タンパク質を取り込んだ成熟ＤＣは、高レベルのＩＬ−１２及び非常に低レベルのＩＬ−１０を産生した（図３）。
【０１２５】
本発明のＤＣが機能的に活性であることをさらに実証するために、混合白血球反応を通じた異種Ｔ細胞の増殖に対するそれらの効果が評価される。
【０１２６】
取り込みをしていない半成熟ＤＣ、及びサバイビンｍＲＮＡ／サバイビンｍＲＮＡ＋タンパク質を取り込んだ成熟ＤＣのインキュベーションにより、Ｔ細胞増殖が増大し、このことは本発明の実施例において記載されたように培養されたＤＣが、腫瘍の除去において潜在的な利益を示す、免疫系の主役（Ｔ細胞）の少なくとも一つに対して、高いプラスの効果のあることを示す。予想された通り、Ｔ細胞とのｉＤＣのインキュベーションは、それらの増殖率を増加させなかった（図４）。
【０１２７】
ｉＤＣは、強い遊走能力によって特徴付けられ、そしてそれは、ｉＤＣにおけるＣＸＣＲ４／ＣＣＲ７発現の欠如のために、ＣＣＬ１９の付加によっては誘導できない。逆に、半成熟ＤＣは、ＣＣＬ１９の誘導に応答するが、より少ない程度であったとしても、ｉＤＣと比較して自発的遊走能力をなお保持している。取り込みを行った成熟ＤＣは、（ほぼ）完全に自発的に遊走する能力を失うが、それらは、ＣＣＬ１９の誘導時に遊走する（図５）。これは、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、及びサバイビンｍＲＮＡ＋タンパク質を取り込んだ成熟ＤＣは、注射部位から刺激源（すなわち、腫瘍部位）へと移動することができ、したがってそれらは節内に（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）直接的に投与される必要はないが、それらは同様に、腫瘍周囲に注射され得る。この事実は、ＤＣワクチンが正確にリンパ節の位置を決定するために、特定の道具、例えば超音波装置を必要としないため、ＤＣワクチンの使用をより容易にする。
【０１２８】
最終的に、当該手順中において記載された通りに培養されたＤＣが、自発的に、又はＣＣＬ１９に対する応答において、活動的になお食作用を行うことができるか否かが調査された。
【０１２９】
ｉＤＣは、強い食作用能力によって特徴付けられ、そしてそれは、ｉＤＣにおけるＣＸＣＲ４／ＣＣＲ７の発現の欠如のために、ＣＣＬ１９によって誘導することができない。半成熟ＤＣ及びサバイビンｍＲＮＡを取り込んだＤＣは、反対に、ＣＣＬ１９誘導に応答するが、例えば低い程度であっても、ｉＤＣと比較して、自発的な食作用能力をなお保持する。サバイビンｍＲＮＡ及びタンパク質を取り込んだ成熟ＤＣは、自発的な及びＣＣＬ１９誘導に基づくものの両方における、食作用能力を完全に失う。
【０１３０】
これは、本発明の手順に従って製造された、取り込みをしていない半成熟ＤＣ、及びｍＲＮＡを取り込んだＤＣは、腫瘍抗原に対して食作用を行う準備ができており、そしてそれは、腫瘍に対する直接的な免疫応答を強く増大させる、非常に活性の強い表現型を示し、一方で二重取り込み（ｍＲＮＡ＋タンパク質）のなされた完全成熟ＤＣは、Ｔ細胞の増殖及び活性化を誘導する準備ができているが、腫瘍組織に対してさらに食作用を行う能力を失っており、既に取り込まれた抗原への免疫応答の特異性を増大させる（図６）。
【０１３１】
最終的に、ｍＲＮＡ及びタンパク質の二重取り込みがなされたＤＣは、異種リンパ球と共にインビトロにてインキュベーションされるとき、Ｔ−ｒｅｇの活性化を引き起こすことなく、高い細胞障害性及びメモリー応答を誘導することができることが示された（図７）。
【０１３２】
２．原理検証
本節において示される全ての結果は、健常対照の水簸由来の凍結単球から培養されるＤＣから出発して行われた。以下のバッチは比較された：
・バッチ１：単球は、５日間で未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）へと分化転換され、ＴＥＲＴ ｍＲＮＡを取り込み、成熟され、そして最終的にサバイビンを取り込んだ。当該細胞は凍結されないで、そして採取時、及び２４時間の再培養における以下の時点：０時間（採取）；４時間及び２４時間に速やかに分析された；
・バッチ２：単球は、５日間で未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）へと分化転換され、ＴＥＲＴ ｍＲＮＡを取り込み、成熟され、そして同時にサバイビンを取り込んだ。当該細胞はＤＭＳＯ中で凍結され、そして採取時、解凍時、及び再培養後４時間及び２４時間において分析された；
・バッチ３：単球は、６日間で未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）へと分化転換され、ＴＥＲＴ ｍＲＮＡを取り込み、成熟され、そして最終的にサバイビンを取り込んだ。当該細胞はＤＭＳＯ中で凍結され、そして解凍時、及び再培養後１２時間及び２４時間において分析された。
【０１３３】
解凍時における単球の生存率は、常に７０％以上であった。原理検証の間、異なる取り込み法が比較された：
・バッチ１：５０ｎｇ／ｍＬ ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡと共に２時間インキュベーションし、その後１６時間成熟化を行い、その後１０μｇ／ｍＬ サバイビン−ペプチドと共に２時間インキュベーションした；
・バッチ２：５０ｎｇ／ｍＬ ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡと共に２時間インキュベーションし、その後、同時に投与される１０μｇ／ｍＬ サバイビン−ペプチド及び成熟化カクテルと共に１６時間インキュベーションした；
・バッチ３：５０ｎｇ／ｍＬ ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡと共に２時間インキュベーションし、その後、１６時間成熟化を行い、その後１０μｇ／ｍＬ サバイビン−ペプチドと共に２時間インキュベーションした。
【０１３４】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を添加したＣｅｌｌＧｒｏ中で５日間培養し、５０％超の初期量の単球が未成熟ＤＣとなり、それらの半分が付着性の表現型を示した。反対に、当該細胞を６日間培養した場合、当該細胞の１０％のみが付着性であった。
【０１３５】
ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡの存在下、２時間のインキュベーションの後、少なくとも７０％の細胞が付着性となった。サバイビン−ペプチドが成熟化カクテルと共に投与されたとき、当該細胞は優れたクラスターを形成し、一方でサバイビンペプチドが成熟化カクテルの後に投与された場合、当該細胞は、より長い樹状突起を示す傾向に、及び固いクラスターの形成を避ける傾向にあった。
【０１３６】
（任意の形態における）取り込み及び成熟化の完結後、当該細胞は、９５％超で吸着性であった。当該細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で、５日間の代わりに６日間培養された場合、当該付着細胞は全体量の約５０％を構成した。
【０１３７】
採取時、細胞生存率は、３つのバッチ中において同程度であり、分化転換の時間、取り込み方法、及び成熟化計画は、このパラメータに影響を与えず、常に限界の７０％超で維持された（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【０１３８】
凍結／解凍サイクルにおいて、細胞生存率は、分析された２つのバッチ間において同程度であり、そして採取時において得られる結果と比較して微かに減少するのみであった。先の場合と同様に、取り込み方法及び成熟化計画は、生存率に影響を与えず、そしてそれは、常に限界の７０％超で維持された。
【０１３９】
主な手順の異なる変形に従って培養されたバッチの生存率は、採取時及び解凍時において同程度である。
【０１４０】
【表５】
【０１４１】
取り込まれた抗原であるＴＥＲＴ及びサバイビンは、ＦＡＣＳによって、細胞表面上において、採取時又は解凍直後において検出されなかった。再培養時、２つの抗原の表面発現は、４時間〜１２時間の間で増加した。１２時間から２４時間まで、それは安定に維持された。細胞がＣＤ４０Ｌを用いて刺激された場合、４時間の再培養後、２つのマーカーの表面発現は、単純培地（ｐｌａｉｎ ｍｅｄｉｕｍ）中で培養された細胞において検出されるものと比較して増加した。しかし、１２時間後、当該２つの抗原の発現が停滞期に到達したとき、ＣＤ４０Ｌの効果は検出不能となった：
ａ）採取時及び単純培地中での２４時間再培養との間における、取り込まれた抗原（ＴＥＲＴ及びサバイビン）の検出
【０１４２】
【表６】
【０１４３】
ｂ）採取時、及びＣＤ４０Ｌ刺激の存在下での２４時間再培養との間における、取り込まれた抗原（ＴＥＲＴ及びサバイビン）の検出。
【０１４４】
【表７】
【０１４５】
これらの結果は、本明細書において記載された方法の異なるバリエーションに従って培養されたＤＣが、取り込まれた抗原の表面発現率を増加させることによって、生理学的刺激因子、例えばＣＤ４０Ｌに応答することができ、したがって、前記抗原を発現する細胞に対する免疫応答を引き起こすＴ細胞を誘導する能力を増大させることを示した。
【０１４６】
採取時において、バッチ１及び２の両方は、機能的ＤＣに対する標準マーカーの発現に従って、成熟表現型を示し、すなわち、ＣＤ１４（未成熟ＤＣ）、並びにＣＤ３（Ｔ細胞）及びＣＤ１９（Ｂ細胞）の低発現、又は発現しないことと対になる、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢＣ、及びＨＬＡ−ＤＲの高い発現を示し、そしてそれは、潜在的なリンパ球の汚染のレベルを決定するために使用された。したがって、異なる取り込み法及び成熟化計画は、最終産物の表現型に影響を与えず、そしてそれは文献中において報告された基準を達成していると思われた（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【０１４７】
凍結／解凍のサイクルの直後に得られた結果は、最終産物が、表現型に従って安定なままであることを示した（バッチ２における、採取時の表現型と解凍時の表現型との間の比較を参照）：
【０１４８】
ａ）採取時及び単純培地中での２４時間再培養との間における、バッチ１のＤＣの表現型の検出
【０１４９】
【表８】
【０１５０】
ｂ）採取時及びＣＤ４０Ｌ刺激下での２４時間再培養との間における、バッチ２のＤＣの表現型の検出
【０１５１】
【表９】
【０１５２】
ｃ）採取時及びＣＤ４０Ｌ刺激下での２４時間再培養との間における、バッチ３のＤＣの表現型の検出
【０１５３】
【表１０】
【０１５４】
興味深いことに、当該細胞が５日間の代わりに６日間分化転換された場合、それらの表現型は、非機能的表現型と相関し、すなわち、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８３の表面発現は、基準レベルの３分の１に減少し、一方で、ＨＬＡ−ＤＲにおいては基準レベルの２分の１に減少した。２４時間再培養後、５日間で分化転換された細胞の表現型は、全体的に安定なままであったが、一方でそれらが６日間分化転換されたとき、それらは成熟表現型マーカーのレベルを緩やかに増加させたが（図１０）、それらの基準レベルには達することができないままであった。
【０１５５】
少なくとも本明細書において記載された方法に従って培養されるＤＣにおいては、５日よりも長い期間での分化転換は、非機能的表現型を誘導し得、その結果、より低いＤＣの活性（ＣＤ８３の発現の減少）及びＴ細胞と結合する能力の減少（ＣＤ８０の発現の減少）をもたらし、そしてそれはＣＤ４+Ｔ細胞へのあまり有効ではない提示を伴う（ＨＬＡ−ＤＲの発現の減少）ことを、当該結果は示した。これらの特徴は、形態の変化、すなわち細胞付着の消失を伴い、そしてそれは機能的及び表現型的に成熟していないＤＣに対応する。本明細書において記載された同一の方法における変形の使用は、ＤＣの表現型における成熟化に影響を与えず、最新の形態的及び表現型的の両方で成熟したＤＣを提供する。
【０１５６】
再培養時において、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２の産生は増加し、興味深いことに、ＩＬ−１２の分泌のみがＣＤ４０Ｌによってプラスに影響されると思われ、一方で、ＩＬ−１０の分泌はこの種の刺激とは独立していた。ＩＬ−１２の分泌は、ＩＬ−１０のものと比較して常に少なくとも２倍であった。Ｌｏｐｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００５の文献に従って、かかるパターンは、（ＩＬ−１２を用いた）細胞障害性応答、及び（ＩＬ−１０を用いた）適応応答の両方を活性化するその両立性のために、単一のＩＬ−１２の分泌と比較して、癌に対する免疫系の活性化についてより有効であろう：
【０１５７】
ａ）単純培地中における２４時間再培養時の、ＩＬ−１０分泌の分析
【０１５８】
【表１１】
【０１５９】
ｂ）ＣＤ４０Ｌ刺激下における２４時間再培養時の、ＩＬ−１０分泌の分析
【０１６０】
【表１２】
【０１６１】
ｃ）単純培地中における２４時間再培養時の、ＩＬ−１２分泌の分析
【０１６２】
【表１３】
【０１６３】
ｄ）ＣＤ４０Ｌ刺激下における２４時間再培養時の、ＩＬ−１２分泌の分析
【０１６４】
【表１４】
【０１６５】
反対に、６日間分化転換された細胞は、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のいずれも分泌することができなくなっており、このことは、形態及び表現型に関して既に観察された、成熟しすぎた（ｏｕｔ−ｍａｔｕｒｅｄ）パターンを確認する。
【０１６６】
結論
実施例に記載された方法は、主要な目的に従って、異なる変形において適用され得る。例えば、臨床ツールとしてのＤＣの使用のために必要とされる、臨床グレードの調製物を得ることが重要であるとき、ＧＭＰ遵守ペプチドの価格及び入手可能性が、対応するＧＭＰタンパク質に関するものよりも好適であるという事実のために、タンパク質抗原は、ペプチドによって構成され得る。個々のペプチドは、その長さ及びその免疫原性に従って、ｍＲＮＡ抗原と成熟化カクテルとの組み合わされた投与に関して、異なる配列で投与され得る。一般的に、タンパク質抗原と組み合されたｍＲＮＡ抗原の取り込みが５日間又は６日間の培養されたＤＣのいずれかで行われ得るが、ＴＥＲＴ−ｍＲＮＡ及びサバイビンの特異的な同時使用では、５日間分化転換されたＤＣにおいて優れた結果を与える。
【０１６７】
現在までに行われた実験は、特異的な抗原の使用が、最も優れた結果を得るための手順の小さな調節／変形を必要とし得ることを示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び少なくとも一つの腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片を取り込んだ樹状細胞。
【請求項２】
前記少なくとも一つの核酸分子によってコードされた、前記腫瘍関連抗原又はその断片が、サバイビン及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群から選択されることで特徴付けられる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記核酸分子が、リボ核酸、好ましくはｍＲＮＡ、及び／又はデスオキシリボ核酸（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）であることで特徴付けられる、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記腫瘍関連抗原が、癌タイプ特異的腫瘍関連抗原、好ましくは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン（ＭＵＣ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＢＲＣＡ及びｒａｓ、並びに／又は、サバイビン及びＴＥＲＴからなる群から選択される万能性腫瘍関連抗原、からなる群から選択されることで特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記樹状細胞がヒト又は動物由来であることで特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記樹状細胞が成熟されることで特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
腫瘍関連抗原又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び腫瘍関連抗原又はその断片である少なくとも一つのタンパク質分子を取り込んだ樹状細胞、好ましくは請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞を製造するための方法であって、以下のステップ：
・樹状細胞を提供し；
・前記細胞が、腫瘍関連抗原又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び腫瘍関連抗原又はその断片である少なくとも一つのタンパク質分子を取り込む
ことを含む、前記方法。
【請求項８】
樹状細胞が、単球を未成熟樹状細胞へと分化転換することによって提供されることで特徴付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記未成熟細胞が、取り込み時又は取り込み後に、及び前記タンパク質抗原の取り込みの間に成熟されることで特徴付けられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法によって得られる樹状細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の樹状細胞、又は請求項１０に記載の樹状細胞を含む、医薬調製物。
【請求項１２】
少なくとも一つの医薬賦形剤、少なくとも一つの免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、少なくとも一つのアジュバントをさらに含むことで特徴付けられる、請求項１１に記載の調製物。
【請求項１３】
個人における癌を治療又は予防するためのワクチンの製造のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の樹状細胞、又は請求項１０に記載の樹状細胞の使用。
【請求項１】
腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び少なくとも一つの腫瘍関連抗原タンパク質又はその断片を取り込んだ樹状細胞。
【請求項２】
前記少なくとも一つの核酸分子によってコードされた、前記腫瘍関連抗原又はその断片が、サバイビン及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群から選択されることで特徴付けられる、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記核酸分子が、リボ核酸、好ましくはｍＲＮＡ、及び／又はデスオキシリボ核酸（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）であることで特徴付けられる、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記腫瘍関連抗原が、癌タイプ特異的腫瘍関連抗原、好ましくは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン（ＭＵＣ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＢＲＣＡ及びｒａｓ、並びに／又は、サバイビン及びＴＥＲＴからなる群から選択される万能性腫瘍関連抗原、からなる群から選択されることで特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記樹状細胞がヒト又は動物由来であることで特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記樹状細胞が成熟されることで特徴付けられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
腫瘍関連抗原又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び腫瘍関連抗原又はその断片である少なくとも一つのタンパク質分子を取り込んだ樹状細胞、好ましくは請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞を製造するための方法であって、以下のステップ：
・樹状細胞を提供し；
・前記細胞が、腫瘍関連抗原又はその断片をコードする少なくとも一つの核酸分子、及び腫瘍関連抗原又はその断片である少なくとも一つのタンパク質分子を取り込む
ことを含む、前記方法。
【請求項８】
樹状細胞が、単球を未成熟樹状細胞へと分化転換することによって提供されることで特徴付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記未成熟細胞が、取り込み時又は取り込み後に、及び前記タンパク質抗原の取り込みの間に成熟されることで特徴付けられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法によって得られる樹状細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の樹状細胞、又は請求項１０に記載の樹状細胞を含む、医薬調製物。
【請求項１２】
少なくとも一つの医薬賦形剤、少なくとも一つの免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、少なくとも一つのアジュバントをさらに含むことで特徴付けられる、請求項１１に記載の調製物。
【請求項１３】
個人における癌を治療又は予防するためのワクチンの製造のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の樹状細胞、又は請求項１０に記載の樹状細胞の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５３６３３０（Ｐ２０１０−５３６３３０Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２０５７９（Ｐ２０１０−５２０５７９）
【出願日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０６６８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２１９８２
【国際公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【出願人】（５１００４１４３０）セル メト リサーチ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６０６６８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２１９８２
【国際公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【出願人】（５１００４１４３０）セル メト リサーチ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1)
【Ｆターム（参考）】
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