機能性磁性細菌
【課題】磁性細菌の特有の性質を利用し、該磁性細菌が持つ細胞表層タンパク質に対して機能性ペプチドを融合し、更に機能的に優れた機能性磁性細菌を提供すること。
【解決手段】特定の磁性細菌を採択し、そのキャリアータンパク質のゲノム、プロテオーム解析結果に基づいて、遺伝子操作を行なうことにより、磁性細菌の細胞表層タンパク質に様々な機能性分子をディプレイすることを特徴とする。
【解決手段】特定の磁性細菌を採択し、そのキャリアータンパク質のゲノム、プロテオーム解析結果に基づいて、遺伝子操作を行なうことにより、磁性細菌の細胞表層タンパク質に様々な機能性分子をディプレイすることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性磁性細菌に関する。さらに詳しくは、重金属の回収能力に優れた機能性磁性細菌に関する。また、本発明は、上記機能性磁性細菌を利用した重金属の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、機能性微生物を産出する方法として、いわゆる細胞ディスプレイ技術が提案されている。例えば、金属結合性ペプチド、酵素及び抗原等を細胞表層にディスプレイすることにより微生物に機能を持たせることが可能となっている。
【０００３】
細胞ディスプレイ技術の一つであるファージディスプレイ法は、標的分子との特異的な物理的会合によってスクリーニングされるペプチドをコードするＤＮＡ配列を特定する方法である。このファージは、ファージゲノムを封入するキャプシド上のタンパク質にペプチドやタンパク質をディスプレイするものである（例えば、特許文献１）。
【０００４】
ミニ細胞ディスプレイ法としては、プラスミド又は発現ベクターがコードしたミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーによって、目的物質のスクリーニングをする方法が開示されている（例えば、特許文献２）。上記ディスプレイ法においては、所望の機能的特性及び結合特性を有するペプチドについてのミニ細胞ディスプレイライブラリーを作製し、目的のオリゴヌクレオチド又はペプチドを選択することができるものである。
【０００５】
また、酵素ディスプレイ法としては、例えばタンパク質−タンパク質結合に接近可能な形態でポリペプチドを酵母細胞の細胞壁に結合させるための遺伝子方法が開示されている。具体的には、酵母Ａｇａ２Ｐ細胞壁タンパク質のC末端に目的のポリペプチドを遺伝的に結合する方法が開示されている（例えば特許文献３）。これらの遺伝的結合方法により、表現型特徴を有するタンパク質を同定することができることが記載されている。
【０００６】
このように細胞ディスプレイ技術においては、機能性細胞に要求される機能に応じたディスプレイされる分子を選択し、かつその分子サイズの制御、さらには細胞ディスプレイ後の機能性微生物の安定性を勘案することが必要となる。つまり、機能性微生物そのものだけでなく目的に合ったキャリアータンパク質を選択することが極めて重要となる。
【０００７】
一方、磁性細菌は、菌体内に５０〜１００ｎｍの単磁区のマグネタイトからなる磁気微粒子（バイオマグネタイト）を２０個程度保持し、磁力線に沿って遊走する細菌であることが報告されている（例えば、非特許文献１）。かかる磁性細菌は、体内に磁気微粒子を有することから磁石等により磁場をかけることによって磁性細菌(菌体)を回収し濃縮することが可能であることが示唆されている（例えば、非特許文献２）。しかしながら、磁性細菌のこのような特性を活かし、磁性細菌の持つキャリアータンパク質を用いて、磁性細菌を機能性微生物として機能を更に向上させた報告例はなされていない。大腸菌由来のＯｍｐＡタンパク質については、すでにその立体構造が決定されており、細胞表層ディスプレイに用いられた例が報告されている (例えば、非特許文献３)。
【０００８】
また、磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．）ＡＭＢ−１由来の磁気微粒子膜特異的タンパク質であるMmｓ１６に機能性ペプチドを結合させた融合タンパク質が開示されており、この融合タンパク質が、GTPase活性能を有することが説明されている（例えば、特許文献４）。しかしながら、上記融合タンパク質であるMms１６をキャリアータンパク質として採用した際には、
機能性ペプチドが磁気微粒子上に発現するとされており、ライブラリー化する際に細胞破際、洗浄工程など処理時間に大きな問題がある。
【０００９】
なお、本発明に関連する先行技術文献としては、以下のものがある。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５,５７１,６９８号
【特許文献２】特開２００５−２１８４１５号公報
【特許文献３】特公表２００２−５０８９７７号公報
【特許文献４】特開２００２−１７６９８９号公報
【非特許文献１】「生命工学への招待」１０３頁、（松永是、竹山春子他編、朝倉書店株式会社）
【非特許文献２】特開２００４−２６１１６９号公報
【非特許文献３】特開２００４−２９００３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、磁性細菌の特有の性質を利用し、
磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸を挿入し、更に機能的に優れた機能性磁性細菌を提供することにある。また、本発明の課題は、上記機能性磁性細菌を使用した重金属の回収方法を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、上記機能性磁性細菌を使用して、水質環境汚染の原因となっている重金属の一つであるカドミウムを回収する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定の磁性細菌を採択し、そのキャリアータンパク質のゲノム、プロテオーム解析結果に基づいて、
磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域を特定し重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸を容易にディプレイできることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、以下の技術的事項から構成される。すなわち、
（１）磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に、重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とする機能性磁性細菌。
（２）配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、以下の部位又はその近傍に一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とする（１）に記載の機能性磁性細菌。
１４８番目 Val ,１６３番目 Asn ,２３８番目 Leu ,２６３番目 Phe ,
２８５番目 Ala
（３）前記複数のアミノ酸は、ヒスタグであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の機能性磁性細菌。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の機能性磁性細菌をコードする遺伝子。
（５）（４）に記載の遺伝子を含むベクター。
（６）重金属を含有する水溶液に（１）〜（３）の機能性磁性細菌を接触させ、
前記水溶液中の重金属を前記機能性磁性細菌に吸着させることを特徴とする重金属の回収方法。
（７）前記重金属は、カドミウムであることを特徴とする（７）に記載の重金属の回収方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、磁気微粒子（バイオマグネタイト）を生成する磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸がディプレイされた機能性磁性細菌が提供される。すなわち、本発明の機能性磁性細菌は、その磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に金属結合性ペプチド等の一又は複数のアミノ酸をディスプレイしてあるので、磁性細菌の特性に加えさらに機能性分子が有する機能を発揮することができる。たとえば、複数のアミノ酸が金属結合性ペプチドである場合には、これを磁気による回収可能な磁性細菌ホストとして用いて工業排水中のカドミウム、鉛、クロム等の重金属を簡易且つ容易に回収することができる。
【００１４】
また、本発明の重金属の回収方法は、上記機能性磁性細菌を使用しているので、汚水中の重金属を効率よくかつ安価に回収することができ、いわゆるバイオレメディエーションに、好適に適用することができる。特に、本発明の重金属の回収方法は、重金属の回収反応の際にエネルギーを必要としないことから、環境浄化のためのコストをきわめて抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１６】
本発明の機能性磁性細菌は、磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に、重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とするものである。本発明の機能性磁性細菌を構成する磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質としては、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる磁気微粒子特異的なタンパク質であるメンブランスペシフィックプロテイン１（以下、Ｍｓｐ１と略する。）や配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなるタンパク質を挙げることができる。これは、磁性細菌が保持する細胞膜に存在するタンパク質を網羅的に同定したことに起因するものであり、Ｍｓｐ１のほか、機能性ペプチドの性質に応じてキャリアータンパク質を選択できる。
【００１７】
上記磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の中でも、細胞外膜に局在し、磁性細菌の中でも最も発現量が多いことから前述したＭｓｐ１をキャリアータンパク質として使用することが好ましい。
【００１８】
また、本発明の磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質として、これらのタンパク質と特異的に結合する抗体が特異的に結合する組み換えタンパク質を挙げることができる。これらのタンパク質は、後述するようにＤＮＡ配列情報に基づき公知の方法で作製することができるほか、例えば、磁性細菌マグネトスピリラムマグネティカムＡＭＢ−１（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ ＡＭＢ−１、以下「ＡＭＢ−１」と略する。）等磁性細菌の細胞破砕液を三画分し、各タンパク質のＳＤＳ−PAGEプロフィールを比較することによっても容易に作製することができる。
【００１９】
また、本発明の対象となる遺伝子は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる磁性細菌に特異的な細胞膜に存在するタンパク質Mｓｐ１をコードする遺伝子、また、配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号２に記載された塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む遺伝子を例示することができる。
【００２０】
これらの遺伝子は、ＤＮＡ列情報に基づき、公知の方法によって調製することができる。また、配列番号２に記載された塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件でハイブリダイゼイションを行い、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、磁性細菌に特異的な細胞膜に存在するタンパク質であるMｓｐ１のＤＮＡと同様な活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼイションの条件としてはハイブリダイゼイションのストリンジェンシーに影響を与える要素に応じて適宜設定することができる。
【００２１】
本発明において、その細胞表層タンパク質の外膜にディスプレイされる一又は複数のアミノ酸としては、磁性細菌が本来有する機能を阻害することなく、一又は複数のアミノ酸が有する所定の機能を発揮することができれば特に制限されるものではない。例えば、ディスプレイすることができる複数のアミノ酸としては、６Ｈｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ）、HA（ヘマグルチニン）、FLAG（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、MYC（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）等のエピトープタグを用いることができる。親和性タグとしては、GST、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴビスチジン等を例示することができる。
【００２２】
上記複数のアミノ酸の中でも、金属親和性を有するタグであり、特に汚水中の重金属を容易に回収することができる観点からすれば、ヒスタグ（Ｈｉｓ：（ＨＨＨＨＨＨ）が特に好ましい。
【００２３】
さらに本発明の機能性磁性細菌は、汚水中の重金属を認識して結合することができる６〜１０個の複数のアミノ酸配列や５〜８の単糖の配列からなる構造単位である機能性ペプチドを磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域にディスプレイすることもできる。すなわち、カドミウム等の特定の重金属を認識することができるアミノ酸配列をコードする塩基配列を標識として、磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に導入し、機能性ペプチドにより重金属等を検出し、溶液中の重金属等を分離できるものである。なお、上記これらの機能性ペプチドは、常法に従い、容易に作製することができる。
【００２４】
次に、本発明の機能性磁性細菌の作製方法について説明する。まず、機能性磁性細菌を作製するに際して、上記機能性ペプチドを磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質を明らかにする必要がある。タンパク質の構造を明らかにする方法としては特に制限されるものではないが、後述する実施例に示すような二次構造予測プログラム等の公知の方法により膜タンパク質の構造情報を明らかにすることができる。このように磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の構造を明らかにした上で、一又は複数のアミノ酸の挿入位置を決定する。膜タンパクの構造解析により、細胞外領域（ループ）に相当する箇所を検出して、該箇所をアミノ酸の挿入位置として決定することができる。なお、アミノ酸の挿入箇所は１つに限定されるものではなく、必要に応じて挿入箇所を複数設定することができる。
【００２５】
本発明の機能性磁性細菌は、一又は複数のアミノ酸の挿入位置を磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域と定め、これをタンパク質の構造情報に基づき決定した後、各挿入位置に一又は複数のアミノ酸を挿入する。一又は複数のアミノ酸を挿入するためには、挿入に必要なプライマーセットをデザインし、機能性タグをＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法等の公知の方法によって挿入する。また同様に、相同性組み換えによっても一又は複数のアミノ酸を挿入することができる。
【００２６】
本発明は、磁気を利用した重金属の回収を目的としているので、宿主細胞として、磁性細菌を採択した点に特徴を有するものである。使用することができる
磁性細菌としては、その内部に磁性微粒子を有するものであれば、特に限定されるものでなく、例えばマグネトスピリラムマグネティカムＡＭＢ−１（FERM BP ５４５８）、デサルフォビブリオマグネティカス ＲＳ−１（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｓ ＲＳ−１、FERM P−１３２８３。）等の磁性細菌を使用することができる。なお、磁性細菌の培養は、磁性細菌を嫌気条件下で分離用培地に炭素源と酵母エキス等の酵素を添加して所定温度にて培養を行うことができる。
【００２７】
本発明において使用できる発現系としては、磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質を磁性細菌内で発現させることができる発現系であれば、特に制限されるものではないが、たとえば細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来等のパポバウイルス、ワシクニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス由来のベクター等を例示することができる。本発明においては、磁性細菌由来のプロモーターを有する組み換えプラスミドベクターが好ましい。
【００２８】
別の観点においては、本発明は機能性磁性細菌を利用した重金属の回収方法に関する。すなわち、本発明の機能性磁性細菌とカドミウム等の重金属を含有する汚水を接触させることにより、機能性磁性細菌の膜タンパク質上にディスプレイされた複数のアミノ酸により重金属が吸着され、汚水中の重金属を回収することができる。上記重金属の回収方法においては、膜タンパク質にディスプレイさせる一又は複数のアミノ酸により、回収する重金属を適宜選択することができる。回収可能な重金属は、特に制限されるものではないが、水質汚染の主要な原因となっているカドミウム、鉛等の重金属の他、テリウム、リチウム、セリウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛等を例示することができる。例えば、汚水中のカドミウム等の重金属を回収する機能を有する磁性細菌を産出する場合には、機能性ペプチドとして、ヒスタグを使用することが好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明について実施例を用いて詳細に説明するが、本発明は何らこれに制限されるものではない。
【００３０】
（実施例１）
＜発現ベクターの構築＞
本実施例においては、大腸菌と磁性細菌のシャトルベクターとして慣用的に使用されているｐＵＭＧを採択し、このシャトルベクターに、磁性細菌の中で最も高発現のＭｓｐ1タンパク質のプロモーター領域の配列をライゲーションし、発現ベクターであるｐＵＭＰ1を構築した。ｐＵＭＰ1を構築する概略を図１に示す。まず、Ｍｓｐ１タンパク質のプロモーター領域を、その３’末端にＮｓｉ１サイトを付加するプライマーセットを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、以下のプライマーを使用し、所定の条件で行なった。
forward primer : TTGACTGGCGGCGCCCATCATGGCGTG（配列番号３）
reverse primer : atgcatTGGCCGCGACCGCTATCCAAATGA（配列番号４)
なお、上記配列番号中、 大文字はテンプレートの相補配列を示し、 小文字は制限酵素サイトの配列を示す（以下に示す配列においても同様）。
【００３１】
上記ＰＣＲにより得られたＭｓｐ１のプロモーター領域の増幅遺伝子断片をｐＵＭＧ のＳｓｐ１サイトにライゲーションし、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、Ｓｓｐ１及び、Ｎｓｉ１を用いてインサートの確認及びシーケンサーによる配列の確認を行った。
【００３２】
Ｓｓｐ１及び、Ｎｓｉ１による制限酵素消化パターンから、ｐＵＭＧ のＳｓｐ１サイトにＭｓｐ１タンパク質のプロモーター配列がクローニングされ、その直後にＮｓｉ１サイトが挿入されていることが示めされた。さらに、ＤＮＡシーケンスによる配列の確認を行ったところ、正確にこれらの配列がクローニングされていることが確認された。
【００３３】
（実施例２）
＜膜タンパク質の選択及びクローニング＞
Ｍｓｐ１遺伝子の両末端にＮｓｉ１サイトを付加したプライマーセットを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、以下のプライマーを使用し、所定の条件で行なった。
forward primer : atgcatTTGGGGGTCGTTTTCGCAAAG（配列番号５）
reverse primer : atgcatTTAGAAGGACAGCGACAGAC（配列番号６）
【００３４】
ｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙベクターにＴＡクローニングした。得られたコロニーのプラスミドを抽出し、制限酵素消化及び、シーケンサーによって配列の確認を行った。Ｍｓｐ１遺伝子をＮｓｉ１消化し精製を行った後、ｐＵＭＰ１のＮｓｉ１サイトにライゲーションすることによって、融合タンパク質であるｐＵＭＰ１Ｍｓｐ１を構築した。構築されたＭＰ１Ｍｓｐ１を図２に示す。
【００３５】
(実施例３)
＜キャリアータンパク質遺伝子へのヒスタグ配列融合＞
Ｍｓｐ１は、その立体構造が決定されていないため、二次構造予測プログラムを用いて構造を予測し、Ｈｉｓｔａｇ（ヒスタグ）挿入部位を選択した。図３に、Ｍｓｐ１の２次元立体構造を示す。さらに表１に、図３の分析結果に基づいたＨｉｓｔａｇ（ヒスタグ）の挿入部位を示す。それぞれの挿入部位にＨｉｓｔａｇ（ヒスタグ）とＮｈｅ１サイトを挿入するためのプライマーセットをデザインした。上記表１にこれらのデザインしたプライマーセットを示す（配列番号７〜配列番号２９）。
【００３６】
【表１】
【００３７】
本実施例でキャリアータンパク質として用いるＭｓｐ１の二次構造を解析したところ、規則正しくβ-strand構造が並んでいることが示された。このことから、Ｍｓｐ１は、一般的なouter membrane protein (大腸菌由来のOmpAタンパク質) にも見られるβ-barrel構造を持つことが考えられた。予測されたβ-strandの間 (ループ部位) 、数箇所に連続してHis tagを挿入することによって、細胞外にHis tagが挿入できると考えられる。そこで、Ｍｓｐ１のループと考えられる部位１１箇所を選択し、ヒスタグを挿入することとした。Ｍｓｐ１の二次構造予測結果と、決定したヒスタグ挿入部位を図３に示す。
【００３８】
（実施例４）
＜磁性細菌形質転換体におけるプラスミドの保持確認＞
磁性細菌をＯＤ（６００）＝ ０.３まで好気培養し、８,０００×ｇ、４ ℃で１０分間遠心回収した。さらに、ＴＥＳバッファーで２回洗浄することによって磁性細菌のコンピテント細胞を調製した。その後、作製したHis tag挿入プラスミドを用い、調製したコンピテント細胞の形質転換を行った。継代培養した形質転換体のプラスミドを抽出し、Ｎｈｅ１及びＫｐｈ１で消化することにより、プラスミドを保持していることを確認した。結果を図４に示す。図４によれば、想定されるバンドパターン (5.0 kbp、3.0 kbp付近) が得られ、このとき、ヒスタグの挿入されている位置に応じて、それぞれのプラスミドにおける制限酵素消化断片の泳動度が少しずつ異なることが確認された。これよりMsp1は１１種のｐＵＭＰ１を保持する形質転換体が作製されたことが明らかとなった 。
【００３９】
（実施例５）
＜Ｈｉｓｔａｇ（ヒスタグ）融合タンパク質の発現確認＞
ｐＵＭＰ１Ｍｓｐ１−１２４Ｈ（Ｍｓｐ１タンパク質中124番目のValの直後にＨｉｓｔａｇ（ヒスタグ）が挿入されたプラスミド) を保持する磁性細菌をそれぞれ培養し、回収した菌体を超音波破砕した。
【００４０】
菌体破砕液を８,０００×ｇで10分間遠心することで未破砕物及び封入体を除去した後、１５２,０００×ｇで超遠心することによって水溶性画分と膜画分に分離した。分離の工程を図５に示す。
【００４１】
未破砕物及び封入体画分と膜画分を可溶化buffer (40 mM Tris base7 M urea、
2Mthiourea4%CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) )を用い、4 ℃で振とうして可溶化した。標準タンパク質としてBSAを用い、得られた各画分のタンパク質をBradford法により定量した。その後、各画分のアクリルアミド濃度12.5 %の分離ゲルを用いてSDS-PAGEを行った (Laemmli, UK., 1970) 。泳動後のゲルとPVDF膜をA液 (0.3 M Tris、20 % Methanol、0.02 % SDS、pH : 9.5) 、B液 (25 mM Tris、20 % Methanol、0.02 % SDS、pH : 9.3) 、C液 (25 mM Tris、0.04 M 6-amino-n-caproic acid、20 % Methanol、0.02 % SDS、pH : 9.5) に浸したろ紙の間に挟み1時間通電するセミドライ法 (Andersen, K., 1984) でブロッティングを行った。ブロッティング後の、PVDF膜を1 %BSAを含む PBST (10 mM PBS、0.1 % Tween20) 中で1時間以上ブロッキングした。PBSTで10分間洗浄した後、一次抗体として抗6×His tag抗体を室温で1時間反応させた。PBSTによる10分間の洗浄を3回繰り返した後、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG抗体 (invitrogen) を室温で1時間反応させた。さらに、PBSTによる10分間の洗浄を3回繰り返し、基質としてNBT/BCIP-Blue Liquid Substate (sigma) を加え発色させることによって抗原抗体反応の検出を行った。
【００４２】
pUMP1Msp1-124Hを保持する磁性細菌のタンパク質を分画し、6×His tag抗体を用いてWestern blottingを行った。その結果を図６に示す。それぞれプラスミドを保持する形質転換体において、43.4 kDa (Msp1-124H) のHis tag融合タンパク質の特異的なバンドが検出された 。また、それぞれ特異的なバンドは全細胞画分、封入体画分、細胞膜画分のみで見られ、水溶性画分には見られなかった。このことから、Msp1-124Hが発現し、細胞膜に局在していることが示唆された。
【００４３】
（実施例６）
＜ 磁性細菌におけるカドミウム回収能の評価＞
磁性細菌におけるカドミウムの細胞局在性の評価として、培養後の細胞をカドミウムに暴露し、分画してから各画分に含まれるカドミウム量を測定することで評価を行った 。評価方法の概略を図７に示す。まず、ＡＭＢ−１の野生株を１０10 cellsに調整し、１０ mM ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、終濃度１００μＭのカドミウムを添加した後、３時間室温で振とうしながらインキュベーションを行った。
【００４４】
その後、以下の方法で各画分に局在するカドミウムを評価した。菌体を８０００×ｇで５ 分間遠心回収した後、HEPES bufferで細胞を3回洗浄し、その上清を洗浄画分 (図７中の［1］) とした。残った細胞を１０ｍMEDTAで洗浄し、遠心回収後の上清を細胞表層画分、沈殿を細胞内画分とした (図７中の［2］及び［3］) 。それぞれの画分を酸洗浄した試験管に分注し、９．６規定の硝酸溶液を加えた。オイルバスを用い、１８０ ℃で有機物を分解すると共に乾燥させた。２ mlの硝酸 (０．１規定) を加えた後、３０℃で２０分間超音波による溶解を行った。その後、硝酸（０．１規定） を３ ml加え、全体量を５ mlにそろえ、それぞれの画分に含まれるカドミウムを原子分光吸光光度計で測定した。また、標準液として原子吸光分析用標準液、１０００ｐｐｍカドミウム (和光純薬業株式会社) を用い、硝酸（０．１規定）で適宜希釈して検量線を作成し、評価を行った。結果を図８に示す。
【００４５】
図８からわかるようにEDTA洗浄後も細胞に吸着しているカドミウム量が野生型の磁性細菌よりも形質転換体の方が多いことが示された。このことから、形質転換体はカドミウムをより強固に吸着し、細胞外膜に何かしらの影響を与え、カドミウムの取り込みを促進していることが示唆された。
【００４６】
（実施例７）
＜免疫染色によるHis Tagの細胞表層ディスプレイ技術評価＞
これまで作製してきた形質転換体を定常期まで培養した。得られた菌体を細胞数１．０×１０8にそろえ、一次抗体としてマウス由来抗6×His抗体 (１／１０００） をオーバーナイトでゆるやかに振とうしながら反応させた。遠心回収後、二次抗体としてPhycoerythrin (PE)標識goat由来抗mouse IgG (1/500) を用い、4 h振とうした。
【００４７】
その後、ＰＢＳで洗浄後、ＰＥ由来の蛍光強度を測定した (ex.: 550 nm, em.: 570 nm) 。さらに、野生株の菌体及び最も蛍光強度を示した株について蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００４８】
カドミウムの結合評価から作製された形質転換体において細胞表層にHisTagがディスプレイされている株及びされていない株の差異が観察された。そこで細胞表層へのディスプレイを確認するために免疫染色による評価を行った。作製された形質転換体を免疫染色し、蛍光強度の差をそれぞれ確認したところ、以下に示すような結果が得られた。結果を図９に示す。図９が示すとおり、Msp1の238残基目にHisTagを挿入した際に、最も効率よく細胞表層にディスプレイされることが示された。このことから、Msp1の238残基目にHisTagを挿入した形質転換体において、さらに重金属回収能の上昇が期待された。
【００４９】
また蛍光顕微鏡観察からも野生型の細胞に対してHisTag抗体が結合せず、Msp1の238残基目にHisTagを挿入した株にのみ特異的に結合することが示された。結果を図１０に示す。図１０からHisTagの細胞表層ディスプレイが行えていることが示された。
【００５０】
（実施例８）
＜ 磁性細菌形質転換体における生育への影響＞
形質転換体の生育曲線を作成したところ、野生株と比較して大きな差異は認められなかった。また、顕微鏡によって細胞の形態を観察した結果、同様に形質転換体と野生株に大きな差異は観察されなかった。結果を図１１に示す。このことから、ヒスタグ融合タンパク質の発現は磁性細菌の生育に影響しないことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の機能性磁性細菌は、カドミウム等の重金属の回収することができ、これを自然界に応用することによりバイオレメンディエーション等の環境技術の発展に大きく貢献することができる。同時に、エタノール生産、バイオパニング、特定分子のスクリーニング等の化学、医薬医療分野の発展に貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】発現ベクターｐＵＭＰ1Ｍｓｐ１を構築する工程の概略図を示す。
【図２】発現ベクターｐＵＭＰ1Ｍｓｐ１構造を示す。
【図３】Ｍｓｐ１の２次元構造及びヒスタグ挿入部位を示す。
【図４】制限酵素消化断片の泳動度の測定写真を示す。
【図５】ヒスタグ融合タンパク質の発現を確認する方法概略を示す。
【図６】Ｍｓｐ１―１２４Hのウエスタンブロティングの結果を示す。
【図７】カドミウム回収能の評価方法についての概略図を示す。
【図８】野生型と形質転換体におけるカドミウムの吸着量を示す。
【図９】Ｍｓｐ１の細胞ディスプレイ評価結果を示す。
【図１０】野生型と形質転換体における免疫染色後の蛍光顕微鏡観察をした観測写真を示す。
【図１１】野生型と形質転換体における育成への影響を評価した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性磁性細菌に関する。さらに詳しくは、重金属の回収能力に優れた機能性磁性細菌に関する。また、本発明は、上記機能性磁性細菌を利用した重金属の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、機能性微生物を産出する方法として、いわゆる細胞ディスプレイ技術が提案されている。例えば、金属結合性ペプチド、酵素及び抗原等を細胞表層にディスプレイすることにより微生物に機能を持たせることが可能となっている。
【０００３】
細胞ディスプレイ技術の一つであるファージディスプレイ法は、標的分子との特異的な物理的会合によってスクリーニングされるペプチドをコードするＤＮＡ配列を特定する方法である。このファージは、ファージゲノムを封入するキャプシド上のタンパク質にペプチドやタンパク質をディスプレイするものである（例えば、特許文献１）。
【０００４】
ミニ細胞ディスプレイ法としては、プラスミド又は発現ベクターがコードしたミニ細胞ディスプレイを用いるペプチドディスプレイライブラリーによって、目的物質のスクリーニングをする方法が開示されている（例えば、特許文献２）。上記ディスプレイ法においては、所望の機能的特性及び結合特性を有するペプチドについてのミニ細胞ディスプレイライブラリーを作製し、目的のオリゴヌクレオチド又はペプチドを選択することができるものである。
【０００５】
また、酵素ディスプレイ法としては、例えばタンパク質−タンパク質結合に接近可能な形態でポリペプチドを酵母細胞の細胞壁に結合させるための遺伝子方法が開示されている。具体的には、酵母Ａｇａ２Ｐ細胞壁タンパク質のC末端に目的のポリペプチドを遺伝的に結合する方法が開示されている（例えば特許文献３）。これらの遺伝的結合方法により、表現型特徴を有するタンパク質を同定することができることが記載されている。
【０００６】
このように細胞ディスプレイ技術においては、機能性細胞に要求される機能に応じたディスプレイされる分子を選択し、かつその分子サイズの制御、さらには細胞ディスプレイ後の機能性微生物の安定性を勘案することが必要となる。つまり、機能性微生物そのものだけでなく目的に合ったキャリアータンパク質を選択することが極めて重要となる。
【０００７】
一方、磁性細菌は、菌体内に５０〜１００ｎｍの単磁区のマグネタイトからなる磁気微粒子（バイオマグネタイト）を２０個程度保持し、磁力線に沿って遊走する細菌であることが報告されている（例えば、非特許文献１）。かかる磁性細菌は、体内に磁気微粒子を有することから磁石等により磁場をかけることによって磁性細菌(菌体)を回収し濃縮することが可能であることが示唆されている（例えば、非特許文献２）。しかしながら、磁性細菌のこのような特性を活かし、磁性細菌の持つキャリアータンパク質を用いて、磁性細菌を機能性微生物として機能を更に向上させた報告例はなされていない。大腸菌由来のＯｍｐＡタンパク質については、すでにその立体構造が決定されており、細胞表層ディスプレイに用いられた例が報告されている (例えば、非特許文献３)。
【０００８】
また、磁性細菌（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．）ＡＭＢ−１由来の磁気微粒子膜特異的タンパク質であるMmｓ１６に機能性ペプチドを結合させた融合タンパク質が開示されており、この融合タンパク質が、GTPase活性能を有することが説明されている（例えば、特許文献４）。しかしながら、上記融合タンパク質であるMms１６をキャリアータンパク質として採用した際には、
機能性ペプチドが磁気微粒子上に発現するとされており、ライブラリー化する際に細胞破際、洗浄工程など処理時間に大きな問題がある。
【０００９】
なお、本発明に関連する先行技術文献としては、以下のものがある。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５,５７１,６９８号
【特許文献２】特開２００５−２１８４１５号公報
【特許文献３】特公表２００２−５０８９７７号公報
【特許文献４】特開２００２−１７６９８９号公報
【非特許文献１】「生命工学への招待」１０３頁、（松永是、竹山春子他編、朝倉書店株式会社）
【非特許文献２】特開２００４−２６１１６９号公報
【非特許文献３】特開２００４−２９００３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、磁性細菌の特有の性質を利用し、
磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸を挿入し、更に機能的に優れた機能性磁性細菌を提供することにある。また、本発明の課題は、上記機能性磁性細菌を使用した重金属の回収方法を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、上記機能性磁性細菌を使用して、水質環境汚染の原因となっている重金属の一つであるカドミウムを回収する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定の磁性細菌を採択し、そのキャリアータンパク質のゲノム、プロテオーム解析結果に基づいて、
磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域を特定し重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸を容易にディプレイできることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、以下の技術的事項から構成される。すなわち、
（１）磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に、重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とする機能性磁性細菌。
（２）配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、以下の部位又はその近傍に一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とする（１）に記載の機能性磁性細菌。
１４８番目 Val ,１６３番目 Asn ,２３８番目 Leu ,２６３番目 Phe ,
２８５番目 Ala
（３）前記複数のアミノ酸は、ヒスタグであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の機能性磁性細菌。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の機能性磁性細菌をコードする遺伝子。
（５）（４）に記載の遺伝子を含むベクター。
（６）重金属を含有する水溶液に（１）〜（３）の機能性磁性細菌を接触させ、
前記水溶液中の重金属を前記機能性磁性細菌に吸着させることを特徴とする重金属の回収方法。
（７）前記重金属は、カドミウムであることを特徴とする（７）に記載の重金属の回収方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、磁気微粒子（バイオマグネタイト）を生成する磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸がディプレイされた機能性磁性細菌が提供される。すなわち、本発明の機能性磁性細菌は、その磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に金属結合性ペプチド等の一又は複数のアミノ酸をディスプレイしてあるので、磁性細菌の特性に加えさらに機能性分子が有する機能を発揮することができる。たとえば、複数のアミノ酸が金属結合性ペプチドである場合には、これを磁気による回収可能な磁性細菌ホストとして用いて工業排水中のカドミウム、鉛、クロム等の重金属を簡易且つ容易に回収することができる。
【００１４】
また、本発明の重金属の回収方法は、上記機能性磁性細菌を使用しているので、汚水中の重金属を効率よくかつ安価に回収することができ、いわゆるバイオレメディエーションに、好適に適用することができる。特に、本発明の重金属の回収方法は、重金属の回収反応の際にエネルギーを必要としないことから、環境浄化のためのコストをきわめて抑えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１６】
本発明の機能性磁性細菌は、磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に、重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とするものである。本発明の機能性磁性細菌を構成する磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質としては、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる磁気微粒子特異的なタンパク質であるメンブランスペシフィックプロテイン１（以下、Ｍｓｐ１と略する。）や配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなるタンパク質を挙げることができる。これは、磁性細菌が保持する細胞膜に存在するタンパク質を網羅的に同定したことに起因するものであり、Ｍｓｐ１のほか、機能性ペプチドの性質に応じてキャリアータンパク質を選択できる。
【００１７】
上記磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の中でも、細胞外膜に局在し、磁性細菌の中でも最も発現量が多いことから前述したＭｓｐ１をキャリアータンパク質として使用することが好ましい。
【００１８】
また、本発明の磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質として、これらのタンパク質と特異的に結合する抗体が特異的に結合する組み換えタンパク質を挙げることができる。これらのタンパク質は、後述するようにＤＮＡ配列情報に基づき公知の方法で作製することができるほか、例えば、磁性細菌マグネトスピリラムマグネティカムＡＭＢ−１（Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ ＡＭＢ−１、以下「ＡＭＢ−１」と略する。）等磁性細菌の細胞破砕液を三画分し、各タンパク質のＳＤＳ−PAGEプロフィールを比較することによっても容易に作製することができる。
【００１９】
また、本発明の対象となる遺伝子は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなる磁性細菌に特異的な細胞膜に存在するタンパク質Mｓｐ１をコードする遺伝子、また、配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号２に記載された塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む遺伝子を例示することができる。
【００２０】
これらの遺伝子は、ＤＮＡ列情報に基づき、公知の方法によって調製することができる。また、配列番号２に記載された塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件でハイブリダイゼイションを行い、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、磁性細菌に特異的な細胞膜に存在するタンパク質であるMｓｐ１のＤＮＡと同様な活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼイションの条件としてはハイブリダイゼイションのストリンジェンシーに影響を与える要素に応じて適宜設定することができる。
【００２１】
本発明において、その細胞表層タンパク質の外膜にディスプレイされる一又は複数のアミノ酸としては、磁性細菌が本来有する機能を阻害することなく、一又は複数のアミノ酸が有する所定の機能を発揮することができれば特に制限されるものではない。例えば、ディスプレイすることができる複数のアミノ酸としては、６Ｈｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ）、HA（ヘマグルチニン）、FLAG（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、MYC（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）等のエピトープタグを用いることができる。親和性タグとしては、GST、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴビスチジン等を例示することができる。
【００２２】
上記複数のアミノ酸の中でも、金属親和性を有するタグであり、特に汚水中の重金属を容易に回収することができる観点からすれば、ヒスタグ（Ｈｉｓ：（ＨＨＨＨＨＨ）が特に好ましい。
【００２３】
さらに本発明の機能性磁性細菌は、汚水中の重金属を認識して結合することができる６〜１０個の複数のアミノ酸配列や５〜８の単糖の配列からなる構造単位である機能性ペプチドを磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域にディスプレイすることもできる。すなわち、カドミウム等の特定の重金属を認識することができるアミノ酸配列をコードする塩基配列を標識として、磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に導入し、機能性ペプチドにより重金属等を検出し、溶液中の重金属等を分離できるものである。なお、上記これらの機能性ペプチドは、常法に従い、容易に作製することができる。
【００２４】
次に、本発明の機能性磁性細菌の作製方法について説明する。まず、機能性磁性細菌を作製するに際して、上記機能性ペプチドを磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質を明らかにする必要がある。タンパク質の構造を明らかにする方法としては特に制限されるものではないが、後述する実施例に示すような二次構造予測プログラム等の公知の方法により膜タンパク質の構造情報を明らかにすることができる。このように磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の構造を明らかにした上で、一又は複数のアミノ酸の挿入位置を決定する。膜タンパクの構造解析により、細胞外領域（ループ）に相当する箇所を検出して、該箇所をアミノ酸の挿入位置として決定することができる。なお、アミノ酸の挿入箇所は１つに限定されるものではなく、必要に応じて挿入箇所を複数設定することができる。
【００２５】
本発明の機能性磁性細菌は、一又は複数のアミノ酸の挿入位置を磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域と定め、これをタンパク質の構造情報に基づき決定した後、各挿入位置に一又は複数のアミノ酸を挿入する。一又は複数のアミノ酸を挿入するためには、挿入に必要なプライマーセットをデザインし、機能性タグをＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法等の公知の方法によって挿入する。また同様に、相同性組み換えによっても一又は複数のアミノ酸を挿入することができる。
【００２６】
本発明は、磁気を利用した重金属の回収を目的としているので、宿主細胞として、磁性細菌を採択した点に特徴を有するものである。使用することができる
磁性細菌としては、その内部に磁性微粒子を有するものであれば、特に限定されるものでなく、例えばマグネトスピリラムマグネティカムＡＭＢ−１（FERM BP ５４５８）、デサルフォビブリオマグネティカス ＲＳ−１（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｓ ＲＳ−１、FERM P−１３２８３。）等の磁性細菌を使用することができる。なお、磁性細菌の培養は、磁性細菌を嫌気条件下で分離用培地に炭素源と酵母エキス等の酵素を添加して所定温度にて培養を行うことができる。
【００２７】
本発明において使用できる発現系としては、磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質を磁性細菌内で発現させることができる発現系であれば、特に制限されるものではないが、たとえば細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来等のパポバウイルス、ワシクニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス由来のベクター等を例示することができる。本発明においては、磁性細菌由来のプロモーターを有する組み換えプラスミドベクターが好ましい。
【００２８】
別の観点においては、本発明は機能性磁性細菌を利用した重金属の回収方法に関する。すなわち、本発明の機能性磁性細菌とカドミウム等の重金属を含有する汚水を接触させることにより、機能性磁性細菌の膜タンパク質上にディスプレイされた複数のアミノ酸により重金属が吸着され、汚水中の重金属を回収することができる。上記重金属の回収方法においては、膜タンパク質にディスプレイさせる一又は複数のアミノ酸により、回収する重金属を適宜選択することができる。回収可能な重金属は、特に制限されるものではないが、水質汚染の主要な原因となっているカドミウム、鉛等の重金属の他、テリウム、リチウム、セリウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム、亜鉛等を例示することができる。例えば、汚水中のカドミウム等の重金属を回収する機能を有する磁性細菌を産出する場合には、機能性ペプチドとして、ヒスタグを使用することが好ましい。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明について実施例を用いて詳細に説明するが、本発明は何らこれに制限されるものではない。
【００３０】
（実施例１）
＜発現ベクターの構築＞
本実施例においては、大腸菌と磁性細菌のシャトルベクターとして慣用的に使用されているｐＵＭＧを採択し、このシャトルベクターに、磁性細菌の中で最も高発現のＭｓｐ1タンパク質のプロモーター領域の配列をライゲーションし、発現ベクターであるｐＵＭＰ1を構築した。ｐＵＭＰ1を構築する概略を図１に示す。まず、Ｍｓｐ１タンパク質のプロモーター領域を、その３’末端にＮｓｉ１サイトを付加するプライマーセットを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、以下のプライマーを使用し、所定の条件で行なった。
forward primer : TTGACTGGCGGCGCCCATCATGGCGTG（配列番号３）
reverse primer : atgcatTGGCCGCGACCGCTATCCAAATGA（配列番号４)
なお、上記配列番号中、 大文字はテンプレートの相補配列を示し、 小文字は制限酵素サイトの配列を示す（以下に示す配列においても同様）。
【００３１】
上記ＰＣＲにより得られたＭｓｐ１のプロモーター領域の増幅遺伝子断片をｐＵＭＧ のＳｓｐ１サイトにライゲーションし、大腸菌ＤＨ５ａを形質転換した。得られたコロニーからプラスミドを抽出し、Ｓｓｐ１及び、Ｎｓｉ１を用いてインサートの確認及びシーケンサーによる配列の確認を行った。
【００３２】
Ｓｓｐ１及び、Ｎｓｉ１による制限酵素消化パターンから、ｐＵＭＧ のＳｓｐ１サイトにＭｓｐ１タンパク質のプロモーター配列がクローニングされ、その直後にＮｓｉ１サイトが挿入されていることが示めされた。さらに、ＤＮＡシーケンスによる配列の確認を行ったところ、正確にこれらの配列がクローニングされていることが確認された。
【００３３】
（実施例２）
＜膜タンパク質の選択及びクローニング＞
Ｍｓｐ１遺伝子の両末端にＮｓｉ１サイトを付加したプライマーセットを用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、以下のプライマーを使用し、所定の条件で行なった。
forward primer : atgcatTTGGGGGTCGTTTTCGCAAAG（配列番号５）
reverse primer : atgcatTTAGAAGGACAGCGACAGAC（配列番号６）
【００３４】
ｐＧＥＭ−Ｔ ＥａｓｙベクターにＴＡクローニングした。得られたコロニーのプラスミドを抽出し、制限酵素消化及び、シーケンサーによって配列の確認を行った。Ｍｓｐ１遺伝子をＮｓｉ１消化し精製を行った後、ｐＵＭＰ１のＮｓｉ１サイトにライゲーションすることによって、融合タンパク質であるｐＵＭＰ１Ｍｓｐ１を構築した。構築されたＭＰ１Ｍｓｐ１を図２に示す。
【００３５】
(実施例３)
＜キャリアータンパク質遺伝子へのヒスタグ配列融合＞
Ｍｓｐ１は、その立体構造が決定されていないため、二次構造予測プログラムを用いて構造を予測し、Ｈｉｓｔａｇ（ヒスタグ）挿入部位を選択した。図３に、Ｍｓｐ１の２次元立体構造を示す。さらに表１に、図３の分析結果に基づいたＨｉｓｔａｇ（ヒスタグ）の挿入部位を示す。それぞれの挿入部位にＨｉｓｔａｇ（ヒスタグ）とＮｈｅ１サイトを挿入するためのプライマーセットをデザインした。上記表１にこれらのデザインしたプライマーセットを示す（配列番号７〜配列番号２９）。
【００３６】
【表１】
【００３７】
本実施例でキャリアータンパク質として用いるＭｓｐ１の二次構造を解析したところ、規則正しくβ-strand構造が並んでいることが示された。このことから、Ｍｓｐ１は、一般的なouter membrane protein (大腸菌由来のOmpAタンパク質) にも見られるβ-barrel構造を持つことが考えられた。予測されたβ-strandの間 (ループ部位) 、数箇所に連続してHis tagを挿入することによって、細胞外にHis tagが挿入できると考えられる。そこで、Ｍｓｐ１のループと考えられる部位１１箇所を選択し、ヒスタグを挿入することとした。Ｍｓｐ１の二次構造予測結果と、決定したヒスタグ挿入部位を図３に示す。
【００３８】
（実施例４）
＜磁性細菌形質転換体におけるプラスミドの保持確認＞
磁性細菌をＯＤ（６００）＝ ０.３まで好気培養し、８,０００×ｇ、４ ℃で１０分間遠心回収した。さらに、ＴＥＳバッファーで２回洗浄することによって磁性細菌のコンピテント細胞を調製した。その後、作製したHis tag挿入プラスミドを用い、調製したコンピテント細胞の形質転換を行った。継代培養した形質転換体のプラスミドを抽出し、Ｎｈｅ１及びＫｐｈ１で消化することにより、プラスミドを保持していることを確認した。結果を図４に示す。図４によれば、想定されるバンドパターン (5.0 kbp、3.0 kbp付近) が得られ、このとき、ヒスタグの挿入されている位置に応じて、それぞれのプラスミドにおける制限酵素消化断片の泳動度が少しずつ異なることが確認された。これよりMsp1は１１種のｐＵＭＰ１を保持する形質転換体が作製されたことが明らかとなった 。
【００３９】
（実施例５）
＜Ｈｉｓｔａｇ（ヒスタグ）融合タンパク質の発現確認＞
ｐＵＭＰ１Ｍｓｐ１−１２４Ｈ（Ｍｓｐ１タンパク質中124番目のValの直後にＨｉｓｔａｇ（ヒスタグ）が挿入されたプラスミド) を保持する磁性細菌をそれぞれ培養し、回収した菌体を超音波破砕した。
【００４０】
菌体破砕液を８,０００×ｇで10分間遠心することで未破砕物及び封入体を除去した後、１５２,０００×ｇで超遠心することによって水溶性画分と膜画分に分離した。分離の工程を図５に示す。
【００４１】
未破砕物及び封入体画分と膜画分を可溶化buffer (40 mM Tris base7 M urea、
2Mthiourea4%CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) )を用い、4 ℃で振とうして可溶化した。標準タンパク質としてBSAを用い、得られた各画分のタンパク質をBradford法により定量した。その後、各画分のアクリルアミド濃度12.5 %の分離ゲルを用いてSDS-PAGEを行った (Laemmli, UK., 1970) 。泳動後のゲルとPVDF膜をA液 (0.3 M Tris、20 % Methanol、0.02 % SDS、pH : 9.5) 、B液 (25 mM Tris、20 % Methanol、0.02 % SDS、pH : 9.3) 、C液 (25 mM Tris、0.04 M 6-amino-n-caproic acid、20 % Methanol、0.02 % SDS、pH : 9.5) に浸したろ紙の間に挟み1時間通電するセミドライ法 (Andersen, K., 1984) でブロッティングを行った。ブロッティング後の、PVDF膜を1 %BSAを含む PBST (10 mM PBS、0.1 % Tween20) 中で1時間以上ブロッキングした。PBSTで10分間洗浄した後、一次抗体として抗6×His tag抗体を室温で1時間反応させた。PBSTによる10分間の洗浄を3回繰り返した後、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG抗体 (invitrogen) を室温で1時間反応させた。さらに、PBSTによる10分間の洗浄を3回繰り返し、基質としてNBT/BCIP-Blue Liquid Substate (sigma) を加え発色させることによって抗原抗体反応の検出を行った。
【００４２】
pUMP1Msp1-124Hを保持する磁性細菌のタンパク質を分画し、6×His tag抗体を用いてWestern blottingを行った。その結果を図６に示す。それぞれプラスミドを保持する形質転換体において、43.4 kDa (Msp1-124H) のHis tag融合タンパク質の特異的なバンドが検出された 。また、それぞれ特異的なバンドは全細胞画分、封入体画分、細胞膜画分のみで見られ、水溶性画分には見られなかった。このことから、Msp1-124Hが発現し、細胞膜に局在していることが示唆された。
【００４３】
（実施例６）
＜ 磁性細菌におけるカドミウム回収能の評価＞
磁性細菌におけるカドミウムの細胞局在性の評価として、培養後の細胞をカドミウムに暴露し、分画してから各画分に含まれるカドミウム量を測定することで評価を行った 。評価方法の概略を図７に示す。まず、ＡＭＢ−１の野生株を１０10 cellsに調整し、１０ mM ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、終濃度１００μＭのカドミウムを添加した後、３時間室温で振とうしながらインキュベーションを行った。
【００４４】
その後、以下の方法で各画分に局在するカドミウムを評価した。菌体を８０００×ｇで５ 分間遠心回収した後、HEPES bufferで細胞を3回洗浄し、その上清を洗浄画分 (図７中の［1］) とした。残った細胞を１０ｍMEDTAで洗浄し、遠心回収後の上清を細胞表層画分、沈殿を細胞内画分とした (図７中の［2］及び［3］) 。それぞれの画分を酸洗浄した試験管に分注し、９．６規定の硝酸溶液を加えた。オイルバスを用い、１８０ ℃で有機物を分解すると共に乾燥させた。２ mlの硝酸 (０．１規定) を加えた後、３０℃で２０分間超音波による溶解を行った。その後、硝酸（０．１規定） を３ ml加え、全体量を５ mlにそろえ、それぞれの画分に含まれるカドミウムを原子分光吸光光度計で測定した。また、標準液として原子吸光分析用標準液、１０００ｐｐｍカドミウム (和光純薬業株式会社) を用い、硝酸（０．１規定）で適宜希釈して検量線を作成し、評価を行った。結果を図８に示す。
【００４５】
図８からわかるようにEDTA洗浄後も細胞に吸着しているカドミウム量が野生型の磁性細菌よりも形質転換体の方が多いことが示された。このことから、形質転換体はカドミウムをより強固に吸着し、細胞外膜に何かしらの影響を与え、カドミウムの取り込みを促進していることが示唆された。
【００４６】
（実施例７）
＜免疫染色によるHis Tagの細胞表層ディスプレイ技術評価＞
これまで作製してきた形質転換体を定常期まで培養した。得られた菌体を細胞数１．０×１０8にそろえ、一次抗体としてマウス由来抗6×His抗体 (１／１０００） をオーバーナイトでゆるやかに振とうしながら反応させた。遠心回収後、二次抗体としてPhycoerythrin (PE)標識goat由来抗mouse IgG (1/500) を用い、4 h振とうした。
【００４７】
その後、ＰＢＳで洗浄後、ＰＥ由来の蛍光強度を測定した (ex.: 550 nm, em.: 570 nm) 。さらに、野生株の菌体及び最も蛍光強度を示した株について蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００４８】
カドミウムの結合評価から作製された形質転換体において細胞表層にHisTagがディスプレイされている株及びされていない株の差異が観察された。そこで細胞表層へのディスプレイを確認するために免疫染色による評価を行った。作製された形質転換体を免疫染色し、蛍光強度の差をそれぞれ確認したところ、以下に示すような結果が得られた。結果を図９に示す。図９が示すとおり、Msp1の238残基目にHisTagを挿入した際に、最も効率よく細胞表層にディスプレイされることが示された。このことから、Msp1の238残基目にHisTagを挿入した形質転換体において、さらに重金属回収能の上昇が期待された。
【００４９】
また蛍光顕微鏡観察からも野生型の細胞に対してHisTag抗体が結合せず、Msp1の238残基目にHisTagを挿入した株にのみ特異的に結合することが示された。結果を図１０に示す。図１０からHisTagの細胞表層ディスプレイが行えていることが示された。
【００５０】
（実施例８）
＜ 磁性細菌形質転換体における生育への影響＞
形質転換体の生育曲線を作成したところ、野生株と比較して大きな差異は認められなかった。また、顕微鏡によって細胞の形態を観察した結果、同様に形質転換体と野生株に大きな差異は観察されなかった。結果を図１１に示す。このことから、ヒスタグ融合タンパク質の発現は磁性細菌の生育に影響しないことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の機能性磁性細菌は、カドミウム等の重金属の回収することができ、これを自然界に応用することによりバイオレメンディエーション等の環境技術の発展に大きく貢献することができる。同時に、エタノール生産、バイオパニング、特定分子のスクリーニング等の化学、医薬医療分野の発展に貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】発現ベクターｐＵＭＰ1Ｍｓｐ１を構築する工程の概略図を示す。
【図２】発現ベクターｐＵＭＰ1Ｍｓｐ１構造を示す。
【図３】Ｍｓｐ１の２次元構造及びヒスタグ挿入部位を示す。
【図４】制限酵素消化断片の泳動度の測定写真を示す。
【図５】ヒスタグ融合タンパク質の発現を確認する方法概略を示す。
【図６】Ｍｓｐ１―１２４Hのウエスタンブロティングの結果を示す。
【図７】カドミウム回収能の評価方法についての概略図を示す。
【図８】野生型と形質転換体におけるカドミウムの吸着量を示す。
【図９】Ｍｓｐ１の細胞ディスプレイ評価結果を示す。
【図１０】野生型と形質転換体における免疫染色後の蛍光顕微鏡観察をした観測写真を示す。
【図１１】野生型と形質転換体における育成への影響を評価した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に、重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とする機能性磁性細菌。
【請求項２】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、以下の部位又はその近傍に一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とする請求項１に記載の機能性磁性細菌。
１４８番目 Val ,１６３番目 Asn ,２３８番目 Leu ,２６３番目 Phe ,
２８５番目 Ala
【請求項３】
前記複数のアミノ酸は、ヒスタグであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の機能性磁性細菌。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の機能性磁性細菌をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
重金属を含有する水溶液に
請求項１〜請求項３記載の機能性磁性細菌を接触させ、
前記水溶液中の重金属を前記機能性磁性細菌に吸着させることを特徴とする重金属の回収方法。
【請求項７】
前記重金属は、カドミウムであることを特徴とする請求項７に記載の重金属の回収方法。
【請求項１】
磁性細菌の細胞膜に存在するタンパク質の細胞外領域に、重金属と結合する能力を有する一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とする機能性磁性細菌。
【請求項２】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、以下の部位又はその近傍に一又は複数のアミノ酸が挿入されたことを特徴とする請求項１に記載の機能性磁性細菌。
１４８番目 Val ,１６３番目 Asn ,２３８番目 Leu ,２６３番目 Phe ,
２８５番目 Ala
【請求項３】
前記複数のアミノ酸は、ヒスタグであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の機能性磁性細菌。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の機能性磁性細菌をコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
重金属を含有する水溶液に
請求項１〜請求項３記載の機能性磁性細菌を接触させ、
前記水溶液中の重金属を前記機能性磁性細菌に吸着させることを特徴とする重金属の回収方法。
【請求項７】
前記重金属は、カドミウムであることを特徴とする請求項７に記載の重金属の回収方法。
【図１】
【図２】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図１０】
【図２】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−２６３８１７（Ｐ２００８−２６３８１７Ａ）
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０９３５３（Ｐ２００７−１０９３５３）
【出願日】平成１９年４月１８日（２００７．４．１８）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【出願人】（０００１５６９３８）関西電力株式会社 (1,442)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月６日（２００８．１１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１８日（２００７．４．１８）
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【出願人】（０００１５６９３８）関西電力株式会社 (1,442)
【Ｆターム（参考）】
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