歯周病治療剤
本発明は、歯周病病原菌の凝集阻害活性と白血球による殺菌促進活性とを併せ持ち、好ましくは、ヘミンの結合を阻害する４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するモノクローナル抗体であって、さらに、副作用等の心配のないヒトモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を含む抗歯周病剤の提供する。本発明は、（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性、および（３）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性の少なくとも一つを有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、抗歯周病剤に関する。具体的には、本発明は歯周病病原菌の凝集阻害活性と白血球による殺菌促進活性とを併せ持ち、好ましくは、４０−ｋＤａ ＯＭＰとヘミンの結合を阻害する４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するモノクローナル抗体であって、さらに、マウス等の非ヒト動物の抗体と比較して副作用を生じる可能性が低いヒトモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を含む抗歯周病剤に関する。
【背景技術】
歯周病は国民の約８０％以上が罹患する疾患であり、口腔内細菌の感染、歯周病病原性細菌の増加、細菌の組織内侵入及び感染に対する宿主免疫応答等が主たる原因と考えられている。歯周病は最終的には歯の喪失に至りＱｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅを損なう極めて重要な疾患である。さらに、近年、歯周病は歯牙喪失だけでなく、循環系疾患、低体重児出産・早産、糖尿病、心内膜炎、肺炎と因果関係があることが分かってきている（Ａｂｉｋｏ Ｙ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０００ Ｖｏｌ １１：１４０）。
歯周病の治療法は感染源の排除が治療上重要であることから、ブラッシングとスケーリングといった極めて原始的な方法や歯周外科等がいまだに主流である。しかし、これらの機械的除去療法のみでは歯周病病原菌を完全に駆逐するのは不可能であり、菌血症や病巣感染をも招くことから、全身疾患を有する患者に適用できないことがある。また、テトラサイクリン、ミノサイクリン等の抗生物質や抗菌剤の投与も歯周治療として有効とされてきたが、最近では複数の耐性菌、耐性関連遺伝子、副作用等の問題が指摘されており、薬物療法の限界も示唆されている。したがって、歯周病に対し未だ有効な治療法が確立されていないのが現状であり、人体への安全性が高く歯周病病原菌を完全に駆逐しうる新しい治療法の開発が期待されている。
口腔細菌の中でＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は成人型歯周病患者の歯周ポケットから高頻度で分離され、歯周病の病原菌として最も有力視されている。この菌は血液平板上で黒色コロニーを形成するグラム陰性の桿菌であり、本菌体表層成分や菌体外産物が歯周組織の破壊に関わると考えられている。このため、歯周病を効果的に予防また治療するためには、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの定着を抑え、歯周ポケット内から本菌体を排除することが重要である。
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ駆除の方法として抗体療法が考えられる。同療法は、歯周病病原菌の病原因子に対する特異抗体を作製し、歯周ポケットに投与することで、１）歯周ポケットへの病原菌定着の抑制、２）歯周ポケット白血球による殺菌促進、等を期待するものである。１）について抗原は未同定であるがＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する抗体を局所投与することで、９カ月間同細菌の歯周ポケット内再定着を抑制できたと報告されている（Ｂｏｏｔｈ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，１９９６ Ｖｏｌ ６４：４２２）。このように特異抗体により歯周病病原菌定着を抑制することで、歯周病はある程度克服できる可能性がある。さらに、重度な歯周感染症で観血的処置が不可能な場合には、歯周ポケット内の白血球による殺菌促進活性（貪食賦活活性）を積極的に期待するような抗体療法も必要であると考えられる。
近年、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに発現している抗原の一つとして、４０−ｋＤａ Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＭＰ）が報告されている（Ａｂｉｋｏ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｖｏｌ ３５：６８９，Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１ Ｖｏｌ ２３：１０５３）。４０−ｋＤａ ＯＭＰは、多くのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株間で保存され発現している（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ，１９９６．ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３８：１６７−１７２）。４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗原に対するモノクローナル抗体は Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓの共凝集を阻害することから、この抗原はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの定着に重要な因子である（Ａｂｉｋｏ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９７ Ｖｏｌ ６５：３９６６，Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２ Ｖｏｌ ３７：７１７，Ｓａｉｔｏ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７ Ｖｏｌ ２８：６７５）。さらに、抗４０−ｋＤａ ＯＭＰポリクローナル抗体が前骨髄球細胞株ＨＬ６０の貪食能を賦活化する活性があることも報告されている（Ｓａｉｔｏ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，１９９９ Ｖｏｌ ７０：６１０）。したがって、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害活性と白血球によるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ貪食賦活活性を有し、かつ、患者への応用を考えた場合に安全性や効果の持続性の点で優れているヒトモノクローナル抗体の提供は、新規歯周病治療法の開発に大きく貢献すると考えられる。しかし、そのような抗体は未だ全く報告されていない。一般にＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害活性を持つ全ての抗体が、白血球による殺菌促進活性を持つかは必ずしも明らかではない。さらに、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの生長や増殖さらには本菌の病原性発揮にヘミンの取り込みが必須であることが知られている。４０ｋＤａ−ＯＭＰタンパクにはヘミン結合部位として知られているｈｅｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆが存在し、実際、４０ｋＤａ−ＯＭＰはヘミンが結合するヘミン結合タンパクの一種であることが報告されている（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，２００３ Ｖｏｌ ３００：３５１）。４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミンの結合を阻害する抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの生長や増殖を阻害し本菌に強い傷害を与える可能性が高いと考えられる。
【発明の開示】
本発明は、歯周病病原菌として知られるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを歯周ポケット内から排除しながらも人体に安全と考えられる抗歯周病剤を提供することを目的とする。とくに本発明は、上記歯周病病原菌の凝集阻害活性と白血球による殺菌促進活性とを併せ持ち、好ましくは、ヘミンの結合を阻害する４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するモノクローナル抗体であって、さらに、マウス等の非ヒト動物の抗体と比較して副作用を生じる可能性が低いヒトモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
本発明は、上記従来の課題を解決することを目的とするものである。すなわち、本発明者は、歯周病病原菌として知られるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを歯周ポケット内から排除しながらも人体に安全と考えられる抗歯周病剤の開発を目的とし鋭意検討を行い、歯周病病原菌の凝集阻害活性と白血球による殺菌促進活性とを併せ持ち、好ましくは、ヘミンの結合を阻害する４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するモノクローナル抗体であって、さらにマウス等の非ヒト動物の抗体と比較して副作用を生じる可能性が低いヒトモノクローナル抗体が抗歯周病剤として優れた効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［２］（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［３］（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［４］（１）ヒト好中球貪食賦活活性、および（２）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［５］（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性、および（３）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［６］Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集が、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓの共凝集である、［２］、［３］および［５］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［７］歯槽骨の吸収抑制活性を有する、４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［８］抗体がヒト抗体である［１］〜［７］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［９］マウス−マウスハイブリドーマにより産生される［１］〜［８］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１０］抗体がモノクローナル抗体である、［１］から［９］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１１］治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、［１］〜［１０］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１２］治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、［１１］の抗体またはその機能的断片、
［１３］抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される［１２］の抗体またはその機能的断片、
［１４］抗体のクラスがＩｇＧである［１］〜［１３］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１５］ＩｇＧがＩｇＧ１である［１４］の抗体またはその機能的断片、
［１６］抗体のクラスがＩｇＡである［１］〜［１３］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１７］重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、［１］〜［１６］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１８］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［１９］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［２０］治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、［１８］または［１９］の抗体またはその機能的断片、
［２１］治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、［２０］の抗体またはその機能的断片、
［２２］抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される［２１］の抗体またはその機能的断片、
［２３］抗体のクラスがＩｇＧである［２８］〜［２２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［２４］ＩｇＧがＩｇＧ１である［２３］の抗体又はその機能的断片、
［２５］抗体のクラスがＩｇＡである［２８］〜［２２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［２６］重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、［２８］〜［２５］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［２７］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、
［２８］ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［２９］ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［３０］治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、［２８］または［２９］の抗体またはその機能的断片、
［３１］治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、［３０］の抗体またはその機能的断片、
［３２］抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される［３１］の抗体またはその機能的断片、
［３３］抗体のクラスがＩｇＧである［２８］〜［３２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［３４］ＩｇＧがＩｇＧ１である［３３］の抗体又はその機能的断片、
［３５］抗体のクラスがＩｇＡである［２８］〜［３２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［３６］重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、［２８］〜［３５］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［３７］ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）、
［３８］ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［３９］ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［４０］治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、［３８］または［３９］の抗体またはその機能的断片、
［４１］治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、［４０］の抗体またはその機能的断片、
［４２］抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される［４１］の抗体またはその機能的断片、
［４３］抗体のクラスがＩｇＧである［３８］〜［４２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［４４］ＩｇＧがＩｇＧ１である［４３］の抗体又はその機能的断片、
［４５］抗体のクラスがＩｇＡである［３８］〜［４２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［４６］重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、［３８］〜［４５］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［４７］ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）、
［４８］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）およびハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）からなる群から選択されるハイブリドーマの保有する核酸であって、前記ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域を含む抗体をコードする核酸または該抗体の機能的断片をコードする核酸、
［４９］［４８］の核酸によりコードされる、抗体またはその機能的断片である蛋白質、
［５０］［４８］の核酸を有する発現ベクター、
［５１］［５０］の発現ベクターを有する宿主、
［５２］大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞および植物細胞並びに哺乳動物からなる群から選ばれる［５１］の宿主、
［５３］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）およびハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）からなる群から選択されるハイブリドーマから４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して該抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上精または宿主の分泌物から該抗体を採取することを含む、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体の製造方法、
［５４］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯槽骨の吸収抑制剤、
［５５］抗４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯周病の予防、診断または治療剤、
［５６］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片の歯槽骨の吸収抑制剤の製造のための使用、
［５７］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯槽骨の吸収抑制方法、
［５８］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片の歯周病の予防、診断または治療剤の製造のための使用、
［５９］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯周病を診断、予防または治療する方法、
［６０］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯周病の予防、診断または治療剤、
［６１］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯槽骨の吸収抑制剤、
［６２］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片の歯周病の予防、診断または治療剤の製造のための使用、
［６３］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片の歯槽骨の吸収抑制剤の製造のための使用、
［６４］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯周病を診断、予防または治療する方法、ならびに
［６５］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯槽骨の吸収抑制方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０７２７１４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体のｒ４０ｋＤａ−ＯＭＰおよびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する反応性を示す図である。
図２は、各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体と歯周病患者血清のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する結合活性の比較を示す図である。
図３は、各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体とＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの反応解析結果を示す図である。
図４は、４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミン相互作用に各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体が及ぼす影響を示す図である。
図５は、ｈ１３−１７抗体の４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミン結合阻害活性を示す図である。
図６は、各種Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株への各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体の反応性を示す図である。
図７は、各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体のラット歯槽骨吸収抑制活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
４０−ｋＤａ ＯＭＰは、公知の塩基配列（日本ＤＮＡデータバンク：アクセッション番号ＡＢ０５９６５８）又はアミノ酸配列に基づいて、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる方法を適宜用いることにより製造することができる。４０−ｋＤａ ＯＭＰの塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。また４０−ｋＤａ ＯＭＰの部分配列は、後述する技術的分野において知られる方法に従って、遺伝子組換え技術又は化学的合成法により製造することもできるし、また４０−ｋＤａ ＯＭＰをタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することができる。
本発明の抗体またはその機能的断片には、以下のような反応性を有する各種の抗４０−ｋＤａ ＯＭＰモノクローナル抗体またはその機能的断片が包含される。すなわち、▲１▼ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性およびヒト好中球貪食賦活活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、▲２▼ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、ヒト好中球貪食賦活活性およびヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、▲３▼ ヒト好中球貪食賦活活性およびヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、▲４▼ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性およびヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、または▲５▼ ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、が包含される。
ここでＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集とは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓがＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ等の他の微生物と凝集することをいい、この凝集により歯周ポケットに病原菌がプラークとして定着する。従って、本発明の抗体のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの凝集阻害活性とは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓと他の菌との凝集を阻害し得る活性をいう。抗体がこのような凝集阻害活性を有しているか否かは、本明細書の実施例９に記載の方法により決定することができる。実施例９に記載の方法により凝集阻害活性を測定した場合、本発明の抗体のスコアは好ましくは２以下である。また、本発明の抗体の白血球による殺菌促進活性とは、好中球等の白血球のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ貪食の賦活化活性をいい、本明細書の実施例１０に記載の方法により決定することができる。実施例１０に記載の方法で貪食賦活化活性を測定した場合、本発明の抗体の貪食率はコントロール抗体に比べ有意に高い。さらに、本発明の抗体には、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミンとの結合を阻害する活性を有する抗体が包含される。抗体がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミンとの結合を阻害するか否かは、本明細書の実施例１４に記載の方法により決定することができる。実施例１４に記載の方法によりヘミン結合阻害活性を測定した場合、本発明の抗体の活性はコントロール抗体に比べて有意に高い。本発明の抗体の活性の検定にＰ．ｇａｎｇｉｖａｌｉｓを用いるが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは４０−ｋＤａ ＯＭＰを発現するものであればいずれでもよく、例えば本発明の実施例で用いたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ３８１あるいはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＷ５０（ＡＴＣＣ番号：５３９７８）が挙げられる。
該抗体またはその機能的断片の例には、後に記載されるような抗４０−ｋＤａ ＯＭＰモノクローナル抗体、あるいは、該抗体を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなるモノクローナル抗体であって、上記▲１▼から▲５▼のいずれかの反応性を有する抗体も包含される。前記のようなアミノ酸の「改変」（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。例えばこの塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（Ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて常法により導入することができる（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，，１９８４ ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。例えば、本発明において重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した抗体は、改変前の抗体に比べて、Ｆｃレセプターに対する親和性向上による、より強力な白血球によるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ貪食賦活化活性を有する可能性がある。
本発明の「抗体」には、いずれのイムノグロブリンクラス及びサブクラスを有する抗体も包含するが、好ましくはヒトイムノグロブリンクラス及びサブクラスを有する抗体であり、好ましいクラス、サブクラスはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）あるいはＩｇＡ、特にＩｇＧ１及びＩｇＡである。
本発明の抗体又はその断片の好ましい別の例は、４０−ｋＤａ ＯＭＰのアミノ酸配列中のエピトープを認識し、かつ、上記▲１▼から▲５▼のいずれかの反応性を有するモノクローナル抗体又はその断片からなる配列である。
本発明における抗体の断片とは、前記で定義した抗体の一部分を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ ＦＶ、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ ＦＶ（ｓｃＦＶ）及びこれらの重合体等が挙げられる（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８ Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）。このような抗体断片は慣用法、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、あるいは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。「機能的断片」とは、完全抗体が特異的に結合する抗原に対して、特異的に結合する抗体の断片を意味する。
本発明の抗体は、例えば、下記のような方法によって製造することができる。即ち、例えば、前記で定義したような４０−ｋＤａ ＯＭＰ若しくはその一部、又は抗原の抗原性を高めるための適当な物質（例えば、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ等）との結合物、又は４０−ｋＤａ ＯＭＰを細胞表面に多量に発現している細胞を、必要に応じて免疫賦活剤（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ等）とともに、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。あるいは、４０−ｋＤａ ＯＭＰを組み込んだ発現ベクターを非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫感作を行うことができる。モノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。また好ましくは、再配列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、免疫感作により当該免疫原に特異的なヒト抗体を産生する非ヒト動物を免疫に用いることにより、本発明の抗体をヒト抗体として得ることができる。該非ヒト動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作成方法は、国際公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されている。ここで、ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体、又はその機能的な断片を意味する。本発明のモノクローナル抗体として、例えば独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブダペスト条約の規定下で２００３年３月１１日付で国際寄託したハイブリドーマクローンｈ１３−１７（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、５−８９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）及びａ４４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生するモノクローナル抗体またはその機能的断片が挙げられる。また、これらのモノクローナル抗体のクラスまたはサブクラスを改変させた抗体も含まれる。さらに、これらのハイブリドーマの産生する抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した抗体またはその機能的断片も含まれる。
本発明は上記ハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域を含む抗体をコードする核酸または該抗体の機能的断片をコードする核酸も包含し、これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。さらに、本発明は前記のようにして得られる核酸がコードするタンパク質も含み、該タンパク質は上記▲１▼から▲５▼のいずれかの反応性をもつ。さらに、本発明は前記核酸を含む発現ベクター、該発現ベクターを含む宿主細胞も包含する。ベクター、及び宿主細胞は限定されず、宿主として例えば大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞のみならず昆虫個体、哺乳動物個体も含まれる。昆虫個体としては例えばカイコが挙げられ、哺乳動物個体としては例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等が挙げられるが、これらには限定されない。発現ベクターとしては、それぞれの宿主に対応した公知のベクター、市販のベクターを用いることができる。また、発現ベクターを用いての昆虫個体または哺乳動物個体のトランスフェクションも公知の方法により行うことができる。本発明は、さらに前記本発明の核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞または宿主個体において前記核酸を発現させ発現産物を宿主細胞の培養液または宿主個体の体液または乳汁等の分泌物から抗体またはその機能的断片を採取することを含む本発明の抗体またはその機能的断片の製造法をも包含する。
本発明の抗体またはその機能的断片は、具体的には下記のようにして製造することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ．，１９７５ Ｖｏｌ．２５６：４９５−４９７）及びそれに準じて行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄又は扁桃等、好ましくはリンパ節又は脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを、細胞融合させることにより調製される。細胞融合は例えば、ポリエチレングリコール（例えば分子量１５００〜６０００）等の高濃度ポリマー溶液中、通常約３０〜４０℃、約１〜１０分間、抗体産生細胞とミエローマ細胞を混合することによって行うことができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などの免疫学的方法を用いて測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養して培養上清から単離することにより行うことができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等の腹水中等でインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調製することができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
上記の方法で作製された本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、治療用薬剤とコンジュゲートすることによって、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体を形成できる。抗体へ結合させる治療用薬剤の例としては、以下のものに限定されないが、テトラサイクリン、ミノサイクリン等の抗生物質や抗菌剤等が挙げられる。抗体と治療用薬剤の結合は共有又は非共有結合（例えばイオン結合）のいずれでもよい。例えば、抗体分子中の反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等）又は配位性基を利用し、該反応性基と反応しうる官能基（細菌毒素、化学療法剤の場合）又は該配位性基との間で錯体を形成しうるイオン性基（放射性核種の場合）をもつ治療用薬剤と抗体とを接触させることによって、本発明の複合体を得ることができる。あるいは複合体の形成に際してビオチン−アビジン系の利用も可能であろう。また、治療用薬剤がタンパク質又はペプチドである場合は、遺伝子工学的手法により抗体と前記タンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として生産することも可能である。
また、本発明の抗４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体、あるいは上記治療用薬剤と結合した抗４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体を含有する歯周病の予防用、診断用または治療用医薬組成物もまた本発明の範囲内に含まれる。本発明の抗４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体の投与により口腔からＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを排除することができ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによる歯周組織の破壊を防止し、歯周病を予防、治療することができる。該組成物には治療上有効量の治療用薬剤が含まれているべきであり、経口、非経口投与用の種々の形態に製剤化される。ここで、治療上有効量とは、所与の症状や投与計画について治療効果を与える量をいう。本発明の組成物は、抗体に加えて、生理学的に許容され得る製剤上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体のうち１種又は複数を含むことができる。また、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物とすることもできる。適切な担体には、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに当該分野において周知であるアミノ酸、糖類、界面活性剤等の安定化剤、表面への吸着防止剤を含んでいてもよい。製剤の形態としては、ペースト、液体、凍結乾燥製剤（この場合上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用可能である。）、徐放製剤、腸溶性製剤、注射剤又は点滴剤などを含む製剤を、治療目的、治療計画に応じて選択可能である。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射又は配薬を含む非経腸的経路が考えられるが、動物を用いた試験により最適の経路が選択される。あるいは、患者の患部に直接本発明の組成物を接触させる方法も可能であろう。また直接歯周病患部への適用を考慮すると、口腔内あるいは歯周ポケットへの投与も好ましい。投与量は、動物を用いた試験、臨床試験の実施により適宜決定されるが、一般に患者の状態若しくは重篤度、年齢、体重、性別などが考慮されるべきである。
また、本発明の抗体またはその機能的断片を歯磨き用ペースト、口腔内洗浄剤に混合させて歯周病患部に適用してもよいし、また食品、飲料等に混合した機能性食品の形態で適用することもできる。
さらに、本発明の抗体またはその機能的断片を歯周病の診断剤としても使用することができる。例えば、本発明の抗体またはその機能的断片を用いて歯周ポケットにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが存在するか否かを検出することができる。該検出は、歯周ポケットのプラークを採取し、該プラーク中のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在を、ＥＩＡ、ＲＩＡ、免疫凝集法との公知の免疫測定法により検出することにより行うことができる。
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される態様のみに限定されるものではない。
（実施例１）組換体４０−ｋＤａ ＯＭＰ（ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ）の調製
組換体４０−ｋＤａ ＯＭＰ（ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ）は以下のように調製した。完全長ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ ＤＮＡ（日本ＤＮＡデータバンク：アクセッション番号ＡＢ０５９６５８）をベクター組み込んだ組み換えプラスミド ｐＭＤ１２５をもつ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２）を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（１％ ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ベクトン・ディッキンソン社製），０．５％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ベクトン・ディッキンソン社製），０．５％ ＮａＣｌ）で培養した。菌体を遠心機にて回収後、超音波処理により菌体を破壊した。遠心分離機を用いて菌体破壊上清を得た後、Ｋａｗａｍｏｔｏら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１ Ｖｏｌ ２３：１０５３）の方法に従いｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを精製した。調製されたｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰは透析膜（分子量１００００以下カット，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてＰＢＳ（−）に置換し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動で分子量４０，０００の単一バンドの精製タンパクを得た。
（実施例２）ヒト抗体産生マウスの作製
免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖破壊及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスは、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統（系統Ａ）のマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統（系統Ｂ）のマウスとの交配により作製した。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告（Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，２０００ Ｖｏｌ ９７：７２２）に記載されている。また、系統Ｂは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６ Ｖｏｌ １４：８４５）に記載されている。系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、あるいは系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される固体（Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＩＢＣ’ｓ １１ｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０００）を以下の免疫実験に用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウスは、契約を結ぶことによって、麒麟麦酒株式会社より入手可能である。
（実施例３）４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するヒトモノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行 １９９１）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としての４０−ｋＤａ ＯＭＰは、実施例１で調製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを用いた。被免疫動物は、実施例２で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。
ヒト抗体産生マウスに、実施例１で作製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをＲＩＢＩアジュバンド（Ｃｏｒｉｘａ社製）と混合し、２０μｇのｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを腹腔内投与することにより初回免疫した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰとＲＩＢＩアジュバンド混液を初回免疫から１週間〜２週間毎に腹腔内投与により４回追加免疫した。さらに、以下に述べる脾臓細胞の取得３日前にｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを尾静脈内注射により追加免疫した。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、回収した脾臓細胞をマウスミエローマＳＰ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．：ＣＲＬ１５８１）と５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて細胞融合させることにより多数のハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）とヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）を含有するＨＡＴ含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）中で培養することにより行った。さらに、ＨＴ含有ＤＭＥＭ培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。培養は、９６−ｗｅｌｌマイクロタイタープレート（ベクトンディッキンソン社製）中で行った。抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの選択（スクリーニング）及び各々のハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の特徴付けは、後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により測定することにより行った。
ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、以下に述べる Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）およびＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）により、ヒト免疫グロブリンγ鎖（ｈＩｇγ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖κを有し、かつ、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰに特異的な反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに実施例における試験結果として示した表又は図中においては、各々の本発明のヒト抗４０−ｋＤａ ＯＭＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは記号を用いて命名した。以下のハイブリドーマクローンはシングルクローンを表わす：ｈ１３−１７，５−８９−２，ａ４４−１又は１−８５−１６。それらの内３つのハイブリドーマクローンｈ１３−１７，５−８９−２及びａ４４−１を、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブダペスト条約の規定下で国際寄託した。ハイブリドーマクローンｈ１３−１７，５−８９−２及びａ４４−１は各々受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３及びＢＰ−８３２４である（２００３年３月１１日付）。
（実施例４）ヒト免疫グロブリンγ鎖を有するモノクローナル抗体の検出
実施例１で作製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ（１μｇ／ｍｌ ５０ｍＭＮａ２ＨＣＯ３）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに５０μｌ加え、室温で３０分インキュベートし、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートし、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰが結合していない部位をブロックした。このようにして、各ウェルをｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰでコーティングしたマイクロプレートを作製した。また、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１株を嫌気的に５μｇ／ｍＬヘミン（Ｓｉｇｍａ社製）、０．５μｇ／ｍＬビタミンＫ、０．５％ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）添加Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＢＢＬ社製）中にて３７℃で培養し、中期対数期までＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを増殖させた。その後、遠心分離（１０，０００ｘｇ，１０分，４℃）によって同細菌の細胞を回収し、６０℃、３０分で熱処理した。次にＰＢＳ中に再懸濁させ、超音波ホモジナイザー（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０）を使用し、氷上で１５分音波処理をした。この超音波処理物を遠心分離（１００，０００ｘｇ，３０分，４℃）し、上清を濾過（０．２２μｍ）した。超音波処理物の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．０Ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（Ｏ．Ｄ．）として算出した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ超音波処理物（５０μｇ／ｍｌ ５０ｍＭＮａ２ＨＣＯ３，５０μｌ／ウェル）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、室温で３０分インキュベートし、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ超音波処理物をマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートした。各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰあるいはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ超音波処理物をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え、室温下で３０分反応させた後、各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで、過酸化酵素で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を１０％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有ＰＢＳ−Ｔで２，０００倍に希釈した溶液５０μｌを、各ウェルに加え、室温下３０分インキュベートした。マイクロプレートを、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色基質液（ＴＭＢ、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μｌ加え、室温下で２０分間インキュベートした。各ウェルに２Ｍ硫酸５０μｌを加え反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。その結果、３００クローン以上の抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体が取得できた。その一部を図１に示す。
（実施例５）ヒト免疫グロブリン軽鎖κ（ＩｇＬκ）を有するモノクローナル抗体の検出
実施例１で作製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ（１μｇ／ｍｌ ５０ｍＭＮａ２ＨＣＯ３）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに５０μｌ加え、室温で３０分インキュベートし、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え３０分反応させた後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで各ウェルに過酸化酵素で標識したヤギ抗ヒトＩｇκ抗体（２，０００倍希釈、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を５０μｌ加え、室温下で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、基質緩衝液（ＴＭＢ、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μｌ加え、室温下で２０分間インキュベートした。次いで、２Ｍ硫酸５０μｌを各ウェルに加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。
（実施例６）各モノクローナル抗体のサブクラス同定
実施例１で作製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ（１μｇ／ｍｌ ５０ｍＭＮａ２ＨＣＯ３）をＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに５０μｌ加え、室温で３０分インキュベートしｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え３０分反応させた後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで、各ウェルにそれぞれ過酸化酵素で標識したヒツジ抗ヒトＩｇＧ１抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ２抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ３抗体又はヒツジ抗ヒトＩｇＧ４抗体（各２，０００倍希釈、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社製）を５０μｌ加え、室温下で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、基質緩衝液（ＴＭＢ、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μｌ加え、室温下で２０分間インキュベートした。次いで２Ｍ硫酸５０μｌを各ウェルに加え反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。
（実施例７）各抗体の調製
抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体を含む培養上清の調製は以下の方法にて行った。抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体産生ハイブリドーマをウシインシュリン（５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、エタノールアミン（０．０１ｍＭ、シグマ社製）、亜セレン酸ナトリウム（２．５ｘ１０−５ｍＭ、シグマ社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）に馴化した。スピナーフラスコにて培養し、ハイブリドーマの生細胞率が９０％になった時点で培養上清を回収した。回収した上清は、１０μｍと０．２μｍのフィルター（ゲルマンサイエンス社製）に供し、ハイブリドーマ等の雑排物を除去した。
上記培養上清からの抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体の精製は以下の方法で行った。抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体を含む培養上清をＨｙｐｅｒ Ｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（日本ガイシ社製）を用い、付属の説明書に従い吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（分子量１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてＰＢＳ（−）に置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）でろ過滅菌し、精製抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．４５Ｏ．Ｄ．として算出した。
（実施例８）アイソタイプコントロール抗体の調製
同様の方法にてヒト抗体産生マウスにＤＮＰ−ＫＬＨを免疫後、その脾臓細胞をマウスミエローマＳＰ２／０細胞融合させることにより多数のハイブリドーマを作製し、各々の抗ヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ４抗体を調製した。
（実施例９）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体によるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害試験は、Ｅｌｌｅｎ Ｒ．Ｐ．らの方法（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８９；５７：１６１８−１６２０）を改変し実施した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１（（１）〒２７１−８５８７ 千葉県松戸市栄町西２−８７０−１ 日本大学松戸歯学部口腔生化学講座 安孫子宜光教授、または（２）〒９５１−８５１４ 新潟市学校町通２番町５２７４番地 新潟大学大学院 医歯学総合研究科 摂食環境制御学講座 歯周診断・再建学分野 吉江弘正教授から分譲可能）のｖｅｓｉｃｌｅｓ（０．７ｎｇ／ｍＬ）をＨｉｒａｔｓｕｋａらの方法（Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２；３７：７１７−７２４）に従い調製し、各々の抗体と３７℃、３０分間反応させた。また、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ、ＡＴＣＣ１９２４６）を嫌気的に５ｍｇ／ｍＬ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＢＬ社製）添加３７ｍｇ／ｍＬ Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＢＬ社製）中、３７℃で培養し、ＰＢＳで吸光度が１．５（波長５００ｎｍ）になるよう調製した。調製されたＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ５０μＬを等量のＰＢＳで懸濁し、この溶液に各抗体と反応させたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１のｖｅｓｉｃｌｅｓ ５０μＬを添加し、フロキュレーションスライド上で３７℃、１０分間反応させた。反応後、肉眼あるいは光学顕微鏡下で凝集活性を評価した。阻害活性の基準（スコア０−４）はＣｉｓａｒ．Ｊ．Ｏ．らの方法に従った（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９７９ Ｖｏｌ ３３：４６７）。その結果、１３個の抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１のｖｅｓｉｃｌｅｓとＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓの共凝集阻害活性を示した。活性のある抗体の中で共凝集阻害活性が強いｈ１３−１７，５−８９−２，ａ４４−１および１−８５−１６を選抜した（表１）。以下の実験はこれら４つの抗体を用い実施した。
表１
各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体によるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害活性
（実施例１０）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体によるヒト好中球貪食の賦活化
貪食試験はＰｅｒｔｉｃａｒａｒｉ Ｓ．らの方法（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １９９１；１２：６８７−６９３）を改変し実施した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１株を嫌気的に５μｇ／ｍＬヘミン、０．５μｇ／ｍＬビタミンＫ、０．５％ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）添加Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＢＢＬ社製）中にて３７℃で培養し、中期対数期までＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを増殖させた。その後、遠心分離（１０，０００ｘｇ，１０分，４℃）によって同細菌の細胞を回収し、６０℃、３０分で熱処理しＰＢＳで２回洗浄後２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬに調製した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１懸濁液１ｍＬに、０．１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）で１ｍｇ／ｍＬに調製されたＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を１ｍＬ添加し、３７℃、３０分培養し、ＰＢＳで３回洗浄後、ＦＩＴＣ標識Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１を２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬに調製した。ＦＩＴＣ標識Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１への抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体の結合は、標識されていないＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１と同程度であった。ヒト好中球の分離法については、ヘパリンコート真空採血管によりヒト末梢静脈血を採取後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７と１１１９（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた２重密度勾配遠心法にて行った。更に、氷令した溶血液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４）にて残存赤血球を低張溶血し、ＰＢＳにて浸透圧を回復後、洗浄し、２ｘ１０６／ｍＬに調製した。調製された好中球は直ちに次の貪食試験に供した。
２ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬのＦＩＴＣ標識Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１を各々の抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体あるいはコントロール抗体を（１μｇ／ｍＬ，５μＬ）を加え、３７℃、３０分間反応させた。ＰＢＳで２回洗浄後、再懸濁した。ヒト好中球とＦＩＴＣ標識Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを１：２０の割合になるよう混合し、４℃あるいは３７℃で３０分間培養した。貪食反応後１０，０００個の好中球をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で取り込み、ＦＩＴＣの蛍光強度を測定することにより、貪食能を評価した。貪食した好中球の割合（貪食率）は以下の計算式により求めた。貪食率（％）＝（３７℃でのＦＩＴＣ陽性好中球の割合（％））−（４℃でのＦＩＴＣ陽性好中球の割合（％））その結果、何れの抗体もコントロール抗体と比較した場合、好中球の貪食活性を増強する効果があることが観察された（表２）。さらに、報告されているマウス４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体（Ｐｇ−ｏｍｐＡ３：Ｓｉｔｏ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９７ Ｖｏｌ ２８：６７５）とヒト４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体（ｈ１３−１７，５−８９−２，ａ４４−１）と活性を同じ評価系にて比較した。その結果、マウス抗体Ｐｇ−ｏｍｐＡ３はヒト好中球の貪食能を増強する活性は非常に弱く、ヒト抗体が優れていることが示された（図２）。
表２
各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体によるヒトｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ貪食賦活化活性
（実施例１１）ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体と患者血清のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓへの結合活性比較
４つのｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体と慢性歯周病患者血清のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓへの結合の強さを実施例４と同法のＥＬＩＳＡにて比較した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰあるいはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ超音波処理物をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々の抗体（１５０ｎｇ／ｍＬ）あるいは適宜希釈した患者血清由来ＩｇＧ抗体（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２００１ Ｖｏｌ ６９：２９３５）を５０μｌ加え反応させた。洗浄後、過酸化酵素標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体（免疫生物研究所社製）と発色基質液（ＴＭＢ）で結合抗体を検出した。その結果、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰと同等に結合する濃度で比較すると、全ての抗体が患者血清より、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに強い結合活性を有する抗体であることが判明した（図３）。
（実施例１２）各抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のヒト血液細胞交叉反応性
各モノクローナル抗体のヒト血液細胞への交叉反応性をＦＡＣＳ解析で調べた。１ｍＬヘパリン（Ｎｏｖｏ社製）入りヒト末梢血１０ｍＬを１０ｍＬのＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）上に重層した。１５００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心後単核球画分を回収し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。調製された細胞は１％ラット血清入り、０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に２ｘ１０６／ｍｌの濃度で浮遊させた。細胞浮遊液（１００μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。ｈ１３−１７，５−８９−２，ａ４４−１又は１−８５−１６の各々の抗体を５μｇ／ｍＬの濃度で氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各抗体の反応性を調べた。その結果、いずれの抗体もヒト末梢血細胞に結合しなかった。このことから全ての抗体がヒトに投与したときに副作用の生じにくい抗体であることが予想された。
（実施例１３）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する結合活性
各抗体のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する結合を表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ、ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて評価した。センサーチップ（ＣＭ５）を実験プロトコールに従い、アミンカップリング法で固定化した（固定化量：ｃＩｇＧ１＝９０９７ＲＵ，ａ４４−１＝７３５５ＲＵ，ｈ１３−１７＝７４７３ＲＵ，５−８９−２＝７５９５ＲＵ，１−８５−１６＝７８７０ＲＵ）。６０℃で３０分処理し死滅させたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０の緩衝液にてＯ．Ｄ．５５０ｎｍ＝０．４の濃度に調製し、流速１０μＬ／ｍｉｎで供給した。その結果５−８９−２は他の抗体と比べた場合解離速度が遅く、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに強く結合する抗体であることが分かった（図４）。歯周病の治療の際予想される唾液による抗体排除作用を考慮した場合、５−８９−２のような解離が遅い抗体が良い。このことから５−８９−２はヒトに投与したときに高い治療効果を示す抗体であることが予想された。
（実施例１４）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対するヘミン結合阻害活性
４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するヘミンの結合を抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体が阻害するか表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ、ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて評価した。アミンカップリング法でｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを固定化した（ＲＵ＝３５００）。図５は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０（Ｔ−Ｂ）の緩衝液にて２０μｇ／ｍＬに調製した各抗体を流速２０μＬ／ｍで供給し、さらに、Ｔ−Ｂの緩衝液にて調製した５μｇ／ｍＬのヘミン（シグマ社製）を供給した結果である。ヘミンの供給が開始された時間を０秒としたセンサグラムを示している。ｈ１３−１７をｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰに前結合させた場合、ヘミンの結合がｃＩｇＧに比べ優位に低下していることが観察された。一方、他の３クローンは、前結合させてもコントロールと同程度のｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰとヘミンの結合が観察された。これらの結果より、ｈ１３−１７は、ヘミンのｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰに対する結合を阻害することが示唆された。さらに、図６は、ｈ１３−１７とヘミンを同時に反応させｈ１３−１７がヘミンとｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰの結合を阻害するかを調べたものである。ｈ１３−１７とヘミンをＴ−Ｂ緩衝液にてそれぞれ２０μｇ／ｍＬと５μｇ／ｍＬに調製し、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ固定化センサーチップに流速２０μＬ／ｍで供給した。対象抗体としてｈ１３−１７と解離速度がほぼ同じ（図４参照）であるａ４４−１抗体を用いた。その結果、アナライト拡散後の平衡期に近い時点（３８０秒）でのシグナルを見ると、ｈ１３−１７存在下ではヘミンとｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰの結合シグナルは２５５ＲＵで、ｈ１３−１７単独のシグナル（２５２ＲＵ）とほぼ同じである。そのシグナルの差（２５５ＲＵ−２５２ＲＵ＝３ＲＵ）は、この時点でのコントロールＩｇＧ１＋ヘミンのシグナル（３０ＲＵ）より明らかに低く、ヘミンはｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合していない。一方、対象のａ４４−１の３８０秒時のシグナルはａ４４−１のシグナルとコントロールＩｇＧ１＋ヘミンのシグナルの総和が１８０ＲＵ（１４８ＲＵ＋３２ＲＵ）で、ａ４４−１＋ヘミンのシグナルは１７０ＲＵと抗体とヘミンが競合しない時の理論値（１８０ＲＵ）に近い値を示した。これらの結果より、ｈ１３−１７はヘミンとＯＭＰ４０の結合を強く阻害する抗体であることが示された。
（実施例１５）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のラット実験歯周炎に対する抑制効果
ラット末梢血よりラット好中球をＬｙｍｐｈｏｌｉｔｅ−Ｒａｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用い密度勾配遠心法により分離し、実施例１０と同様に各抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のラット好中球貪食賦活化活性の評価を行ったところ活性が観察された。そこで、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓをラット口腔に接種することにより歯槽骨の吸収を惹起する実験的歯周炎の系を用いて、試験管内実験においてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対して強い結合能、共凝集能阻害活性、好中球貪食賦活化活性を有する抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のラット実験歯周炎に対する抑制効果について検討した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ接種によるラット実験的歯周炎の惹起感染は、生後３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系のＳＰＦラットを使用し、１群６匹で行なった。健康状態を観察後、イオン交換水中に最終濃度１ｍｇ／ｍｌのサルファメトキサゾールと２００μｇ／ｍｌのトリメトプリムを混合したものを飲料水として１週間与えて口腔常在菌を減少させた。その後，３日間抗生物質を含まないイオン交換水を与えＰＢＳで作製した５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液で調製したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株（ＡＴＣＣ３３２７７）の菌液（１０９ＣＦＵ／ｍｌ）を２日毎に３回、ラット口腔内へ直接投与した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ未接種群（ｓｈａｍ）には５％ＣＭＣ溶液のみを与え、同条件で飼育した。抗体の投与は、ａ４４−１，ｈ１３−１７，５−８９−２抗体を各０．５ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し、３抗体を等量づつ混ぜ合わせ５％ＣＭＣ溶液で希釈した溶液の投与群とコントロールとしてＰＢＳで作製した５％ＣＭＣ溶液で０．５ｍｇ／ｍｌに調製したＤＮＰヒト抗体（ＩｇＧ１）投与群を用いた。投与回数は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの投与開始２日前から最終投与２日後まで毎日、計９回投与した。尚、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ接種時においては、菌接種１０分後に抗体を投与した。すべてのラットは、食事，飲料水を自由に摂取できるようにし、温度２３℃、湿度６０％および明暗１２時間サイクルの環境下で飼育した。
ラット口腔内のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在は、ＰＣＲ反応を行なって確認した。すなわち、綿棒でラット口腔内を３０秒間拭って、プラーク細菌を採取し、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを２０μＬのＴ１０Ｅ１溶液にて溶解し保存した。プライマーは、Ａｓｈｉｍｏｔｏらが報告（Ａｓｈｉｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６ Ｖｏｌ １１：２６６）した１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に基づいて作製し、ＰＣＲ反応は９５℃５分間加熱変性後、９５℃３０秒、６０℃１分、７２℃１分を３５サイクルで行った。
骨吸収の測定は以下の様に実施した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ接種最終日から４２日目にすべてのラットをエーテル麻酔下で断頭瀉血により屠殺した。歯槽骨吸収量の評価は、上顎臼歯部のセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を７個所測定して行なった。頭蓋骨を２気圧下で１０分間加熱後、３％次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬して軟組織を除去し、１％メチレンブルー溶液で歯槽骨を染色乾燥させた試料をキーエンス社製デジタルＨＤマイクロスコープ（実体顕微鏡）で４０倍の倍率で測定した。７個所の測定値を平均して個体当たりの骨吸収量とし、それぞれ６匹分の平均値を実験群の骨吸収量としてミリメートルで表示した。測定は、同一試料について３回実施し平均値と標準誤差（ＳＥ）を求めた。統計解析は、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ（ＳｔａｔＶｉｅｗ）にて行った。
その結果（図７）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを投与した群は、明らかに非投与群に比較して有意に骨吸収量の増加が認められた（ｐ＜０．０１）。また、抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体の投与により有意に骨吸収の抑制が確認され、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で使用した群ではＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ非投与群と同程度で、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ投与による骨吸収がほとんど認められなかった。コントロール抗体（ＤＮＰ抗体）を投与した群では、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのみを投与した群に比較して、多少骨吸収量が減少したが、有意差は認められなかった。以上の結果から、骨吸収を指標とした今回の実験では、ＯＭＰ４０抗原に対するモノクローナル抗体がラット歯槽骨の吸収を抑制できることが明らかになった。ＯＭＰ４０抗体の投与により、骨吸収量に明らかな減少が認められたことから、実験終了時におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのラット口腔内残存率をＰＣＲで検討の結果、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ接種群では、６匹すべてにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在が確認されたが、ＯＭＰ４０抗体を投与した群では、６匹中５匹においてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在が確認されなかった（表３）。
表３
以上の結果より、ＯＭＰ４０モノクローナル抗体は歯周病治療に有効であることが強く示唆された。
【産業上の利用可能性】
実施例に示すように、本発明の４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの凝集を阻害し、また白血球の貪食能を促進する。さらに、本発明の４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体は、口腔からＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを排除することがでる。このことより、本発明の抗体またはその機能的断片を歯周病の治療、診断に有効に用いることができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【技術分野】
本発明は、抗歯周病剤に関する。具体的には、本発明は歯周病病原菌の凝集阻害活性と白血球による殺菌促進活性とを併せ持ち、好ましくは、４０−ｋＤａ ＯＭＰとヘミンの結合を阻害する４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するモノクローナル抗体であって、さらに、マウス等の非ヒト動物の抗体と比較して副作用を生じる可能性が低いヒトモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を含む抗歯周病剤に関する。
【背景技術】
歯周病は国民の約８０％以上が罹患する疾患であり、口腔内細菌の感染、歯周病病原性細菌の増加、細菌の組織内侵入及び感染に対する宿主免疫応答等が主たる原因と考えられている。歯周病は最終的には歯の喪失に至りＱｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅを損なう極めて重要な疾患である。さらに、近年、歯周病は歯牙喪失だけでなく、循環系疾患、低体重児出産・早産、糖尿病、心内膜炎、肺炎と因果関係があることが分かってきている（Ａｂｉｋｏ Ｙ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０００ Ｖｏｌ １１：１４０）。
歯周病の治療法は感染源の排除が治療上重要であることから、ブラッシングとスケーリングといった極めて原始的な方法や歯周外科等がいまだに主流である。しかし、これらの機械的除去療法のみでは歯周病病原菌を完全に駆逐するのは不可能であり、菌血症や病巣感染をも招くことから、全身疾患を有する患者に適用できないことがある。また、テトラサイクリン、ミノサイクリン等の抗生物質や抗菌剤の投与も歯周治療として有効とされてきたが、最近では複数の耐性菌、耐性関連遺伝子、副作用等の問題が指摘されており、薬物療法の限界も示唆されている。したがって、歯周病に対し未だ有効な治療法が確立されていないのが現状であり、人体への安全性が高く歯周病病原菌を完全に駆逐しうる新しい治療法の開発が期待されている。
口腔細菌の中でＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は成人型歯周病患者の歯周ポケットから高頻度で分離され、歯周病の病原菌として最も有力視されている。この菌は血液平板上で黒色コロニーを形成するグラム陰性の桿菌であり、本菌体表層成分や菌体外産物が歯周組織の破壊に関わると考えられている。このため、歯周病を効果的に予防また治療するためには、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの定着を抑え、歯周ポケット内から本菌体を排除することが重要である。
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ駆除の方法として抗体療法が考えられる。同療法は、歯周病病原菌の病原因子に対する特異抗体を作製し、歯周ポケットに投与することで、１）歯周ポケットへの病原菌定着の抑制、２）歯周ポケット白血球による殺菌促進、等を期待するものである。１）について抗原は未同定であるがＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する抗体を局所投与することで、９カ月間同細菌の歯周ポケット内再定着を抑制できたと報告されている（Ｂｏｏｔｈ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，１９９６ Ｖｏｌ ６４：４２２）。このように特異抗体により歯周病病原菌定着を抑制することで、歯周病はある程度克服できる可能性がある。さらに、重度な歯周感染症で観血的処置が不可能な場合には、歯周ポケット内の白血球による殺菌促進活性（貪食賦活活性）を積極的に期待するような抗体療法も必要であると考えられる。
近年、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに発現している抗原の一つとして、４０−ｋＤａ Ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＭＰ）が報告されている（Ａｂｉｋｏ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０ Ｖｏｌ ３５：６８９，Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１ Ｖｏｌ ２３：１０５３）。４０−ｋＤａ ＯＭＰは、多くのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株間で保存され発現している（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ，１９９６．ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３８：１６７−１７２）。４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗原に対するモノクローナル抗体は Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓの共凝集を阻害することから、この抗原はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの定着に重要な因子である（Ａｂｉｋｏ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９７ Ｖｏｌ ６５：３９６６，Ｈｉｒａｔｓｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２ Ｖｏｌ ３７：７１７，Ｓａｉｔｏ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９７ Ｖｏｌ ２８：６７５）。さらに、抗４０−ｋＤａ ＯＭＰポリクローナル抗体が前骨髄球細胞株ＨＬ６０の貪食能を賦活化する活性があることも報告されている（Ｓａｉｔｏ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，１９９９ Ｖｏｌ ７０：６１０）。したがって、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害活性と白血球によるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ貪食賦活活性を有し、かつ、患者への応用を考えた場合に安全性や効果の持続性の点で優れているヒトモノクローナル抗体の提供は、新規歯周病治療法の開発に大きく貢献すると考えられる。しかし、そのような抗体は未だ全く報告されていない。一般にＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害活性を持つ全ての抗体が、白血球による殺菌促進活性を持つかは必ずしも明らかではない。さらに、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの生長や増殖さらには本菌の病原性発揮にヘミンの取り込みが必須であることが知られている。４０ｋＤａ−ＯＭＰタンパクにはヘミン結合部位として知られているｈｅｍｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆが存在し、実際、４０ｋＤａ−ＯＭＰはヘミンが結合するヘミン結合タンパクの一種であることが報告されている（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．，２００３ Ｖｏｌ ３００：３５１）。４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミンの結合を阻害する抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの生長や増殖を阻害し本菌に強い傷害を与える可能性が高いと考えられる。
【発明の開示】
本発明は、歯周病病原菌として知られるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを歯周ポケット内から排除しながらも人体に安全と考えられる抗歯周病剤を提供することを目的とする。とくに本発明は、上記歯周病病原菌の凝集阻害活性と白血球による殺菌促進活性とを併せ持ち、好ましくは、ヘミンの結合を阻害する４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するモノクローナル抗体であって、さらに、マウス等の非ヒト動物の抗体と比較して副作用を生じる可能性が低いヒトモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
本発明は、上記従来の課題を解決することを目的とするものである。すなわち、本発明者は、歯周病病原菌として知られるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを歯周ポケット内から排除しながらも人体に安全と考えられる抗歯周病剤の開発を目的とし鋭意検討を行い、歯周病病原菌の凝集阻害活性と白血球による殺菌促進活性とを併せ持ち、好ましくは、ヘミンの結合を阻害する４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するモノクローナル抗体であって、さらにマウス等の非ヒト動物の抗体と比較して副作用を生じる可能性が低いヒトモノクローナル抗体が抗歯周病剤として優れた効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［２］（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［３］（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［４］（１）ヒト好中球貪食賦活活性、および（２）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［５］（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性、および（３）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［６］Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集が、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓの共凝集である、［２］、［３］および［５］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［７］歯槽骨の吸収抑制活性を有する、４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［８］抗体がヒト抗体である［１］〜［７］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［９］マウス−マウスハイブリドーマにより産生される［１］〜［８］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１０］抗体がモノクローナル抗体である、［１］から［９］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１１］治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、［１］〜［１０］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１２］治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、［１１］の抗体またはその機能的断片、
［１３］抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される［１２］の抗体またはその機能的断片、
［１４］抗体のクラスがＩｇＧである［１］〜［１３］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１５］ＩｇＧがＩｇＧ１である［１４］の抗体またはその機能的断片、
［１６］抗体のクラスがＩｇＡである［１］〜［１３］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１７］重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、［１］〜［１６］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［１８］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［１９］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［２０］治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、［１８］または［１９］の抗体またはその機能的断片、
［２１］治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、［２０］の抗体またはその機能的断片、
［２２］抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される［２１］の抗体またはその機能的断片、
［２３］抗体のクラスがＩｇＧである［２８］〜［２２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［２４］ＩｇＧがＩｇＧ１である［２３］の抗体又はその機能的断片、
［２５］抗体のクラスがＩｇＡである［２８］〜［２２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［２６］重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、［２８］〜［２５］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［２７］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、
［２８］ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［２９］ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［３０］治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、［２８］または［２９］の抗体またはその機能的断片、
［３１］治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、［３０］の抗体またはその機能的断片、
［３２］抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される［３１］の抗体またはその機能的断片、
［３３］抗体のクラスがＩｇＧである［２８］〜［３２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［３４］ＩｇＧがＩｇＧ１である［３３］の抗体又はその機能的断片、
［３５］抗体のクラスがＩｇＡである［２８］〜［３２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［３６］重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、［２８］〜［３５］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［３７］ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）、
［３８］ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［３９］ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片、
［４０］治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、［３８］または［３９］の抗体またはその機能的断片、
［４１］治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、［４０］の抗体またはその機能的断片、
［４２］抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される［４１］の抗体またはその機能的断片、
［４３］抗体のクラスがＩｇＧである［３８］〜［４２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［４４］ＩｇＧがＩｇＧ１である［４３］の抗体又はその機能的断片、
［４５］抗体のクラスがＩｇＡである［３８］〜［４２］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［４６］重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、［３８］〜［４５］のいずれかの抗体またはその機能的断片、
［４７］ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）、
［４８］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）およびハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）からなる群から選択されるハイブリドーマの保有する核酸であって、前記ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域を含む抗体をコードする核酸または該抗体の機能的断片をコードする核酸、
［４９］［４８］の核酸によりコードされる、抗体またはその機能的断片である蛋白質、
［５０］［４８］の核酸を有する発現ベクター、
［５１］［５０］の発現ベクターを有する宿主、
［５２］大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞および植物細胞並びに哺乳動物からなる群から選ばれる［５１］の宿主、
［５３］ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）およびハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）からなる群から選択されるハイブリドーマから４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して該抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上精または宿主の分泌物から該抗体を採取することを含む、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体の製造方法、
［５４］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯槽骨の吸収抑制剤、
［５５］抗４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯周病の予防、診断または治療剤、
［５６］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片の歯槽骨の吸収抑制剤の製造のための使用、
［５７］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯槽骨の吸収抑制方法、
［５８］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片の歯周病の予防、診断または治療剤の製造のための使用、
［５９］４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯周病を診断、予防または治療する方法、
［６０］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯周病の予防、診断または治療剤、
［６１］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯槽骨の吸収抑制剤、
［６２］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片の歯周病の予防、診断または治療剤の製造のための使用、
［６３］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片の歯槽骨の吸収抑制剤の製造のための使用、
［６４］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯周病を診断、予防または治療する方法、ならびに
［６５］［１］〜［２６］、［２８］〜［３６］、［３８］〜［４６］および［４９］のいずれかの抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯槽骨の吸収抑制方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０７２７１４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体のｒ４０ｋＤａ−ＯＭＰおよびＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する反応性を示す図である。
図２は、各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体と歯周病患者血清のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する結合活性の比較を示す図である。
図３は、各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体とＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの反応解析結果を示す図である。
図４は、４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミン相互作用に各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体が及ぼす影響を示す図である。
図５は、ｈ１３−１７抗体の４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミン結合阻害活性を示す図である。
図６は、各種Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株への各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体の反応性を示す図である。
図７は、各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体のラット歯槽骨吸収抑制活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
４０−ｋＤａ ＯＭＰは、公知の塩基配列（日本ＤＮＡデータバンク：アクセッション番号ＡＢ０５９６５８）又はアミノ酸配列に基づいて、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような技術的分野において知られる方法を適宜用いることにより製造することができる。４０−ｋＤａ ＯＭＰの塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。また４０−ｋＤａ ＯＭＰの部分配列は、後述する技術的分野において知られる方法に従って、遺伝子組換え技術又は化学的合成法により製造することもできるし、また４０−ｋＤａ ＯＭＰをタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することができる。
本発明の抗体またはその機能的断片には、以下のような反応性を有する各種の抗４０−ｋＤａ ＯＭＰモノクローナル抗体またはその機能的断片が包含される。すなわち、▲１▼ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性およびヒト好中球貪食賦活活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、▲２▼ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、ヒト好中球貪食賦活活性およびヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、▲３▼ ヒト好中球貪食賦活活性およびヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、▲４▼ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性およびヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、または▲５▼ ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体もしくはその機能的断片、が包含される。
ここでＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集とは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓがＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ等の他の微生物と凝集することをいい、この凝集により歯周ポケットに病原菌がプラークとして定着する。従って、本発明の抗体のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの凝集阻害活性とは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓと他の菌との凝集を阻害し得る活性をいう。抗体がこのような凝集阻害活性を有しているか否かは、本明細書の実施例９に記載の方法により決定することができる。実施例９に記載の方法により凝集阻害活性を測定した場合、本発明の抗体のスコアは好ましくは２以下である。また、本発明の抗体の白血球による殺菌促進活性とは、好中球等の白血球のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ貪食の賦活化活性をいい、本明細書の実施例１０に記載の方法により決定することができる。実施例１０に記載の方法で貪食賦活化活性を測定した場合、本発明の抗体の貪食率はコントロール抗体に比べ有意に高い。さらに、本発明の抗体には、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミンとの結合を阻害する活性を有する抗体が包含される。抗体がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの４０ｋＤａ−ＯＭＰとヘミンとの結合を阻害するか否かは、本明細書の実施例１４に記載の方法により決定することができる。実施例１４に記載の方法によりヘミン結合阻害活性を測定した場合、本発明の抗体の活性はコントロール抗体に比べて有意に高い。本発明の抗体の活性の検定にＰ．ｇａｎｇｉｖａｌｉｓを用いるが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは４０−ｋＤａ ＯＭＰを発現するものであればいずれでもよく、例えば本発明の実施例で用いたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ３８１あるいはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＷ５０（ＡＴＣＣ番号：５３９７８）が挙げられる。
該抗体またはその機能的断片の例には、後に記載されるような抗４０−ｋＤａ ＯＭＰモノクローナル抗体、あるいは、該抗体を構成する重鎖及び／又は軽鎖の各々のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は軽鎖からなるモノクローナル抗体であって、上記▲１▼から▲５▼のいずれかの反応性を有する抗体も包含される。前記のようなアミノ酸の「改変」（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。例えばこの塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（Ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いて常法により導入することができる（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，，１９８４ ８１：５６６２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。例えば、本発明において重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した抗体は、改変前の抗体に比べて、Ｆｃレセプターに対する親和性向上による、より強力な白血球によるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ貪食賦活化活性を有する可能性がある。
本発明の「抗体」には、いずれのイムノグロブリンクラス及びサブクラスを有する抗体も包含するが、好ましくはヒトイムノグロブリンクラス及びサブクラスを有する抗体であり、好ましいクラス、サブクラスはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）あるいはＩｇＡ、特にＩｇＧ１及びＩｇＡである。
本発明の抗体又はその断片の好ましい別の例は、４０−ｋＤａ ＯＭＰのアミノ酸配列中のエピトープを認識し、かつ、上記▲１▼から▲５▼のいずれかの反応性を有するモノクローナル抗体又はその断片からなる配列である。
本発明における抗体の断片とは、前記で定義した抗体の一部分を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ ＦＶ、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ ＦＶ（ｓｃＦＶ）及びこれらの重合体等が挙げられる（Ｄ．Ｊ．Ｋｉｎｇ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，１９９８ Ｔ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ）。このような抗体断片は慣用法、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、あるいは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。「機能的断片」とは、完全抗体が特異的に結合する抗原に対して、特異的に結合する抗体の断片を意味する。
本発明の抗体は、例えば、下記のような方法によって製造することができる。即ち、例えば、前記で定義したような４０−ｋＤａ ＯＭＰ若しくはその一部、又は抗原の抗原性を高めるための適当な物質（例えば、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ等）との結合物、又は４０−ｋＤａ ＯＭＰを細胞表面に多量に発現している細胞を、必要に応じて免疫賦活剤（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ等）とともに、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等の非ヒト哺乳動物に免疫する。あるいは、４０−ｋＤａ ＯＭＰを組み込んだ発現ベクターを非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫感作を行うことができる。モノクローナル抗体は、免疫感作動物から得た抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。また好ましくは、再配列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、免疫感作により当該免疫原に特異的なヒト抗体を産生する非ヒト動物を免疫に用いることにより、本発明の抗体をヒト抗体として得ることができる。該非ヒト動物としてマウスが挙げられ、ヒト抗体を産生し得るマウスの作成方法は、国際公開ＷＯ０２／４３４７８に記載されている。ここで、ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体、又はその機能的な断片を意味する。本発明のモノクローナル抗体として、例えば独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブダペスト条約の規定下で２００３年３月１１日付で国際寄託したハイブリドーマクローンｈ１３−１７（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、５−８９−２（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）及びａ４４−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生するモノクローナル抗体またはその機能的断片が挙げられる。また、これらのモノクローナル抗体のクラスまたはサブクラスを改変させた抗体も含まれる。さらに、これらのハイブリドーマの産生する抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した抗体またはその機能的断片も含まれる。
本発明は上記ハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域を含む抗体をコードする核酸または該抗体の機能的断片をコードする核酸も包含し、これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。さらに、本発明は前記のようにして得られる核酸がコードするタンパク質も含み、該タンパク質は上記▲１▼から▲５▼のいずれかの反応性をもつ。さらに、本発明は前記核酸を含む発現ベクター、該発現ベクターを含む宿主細胞も包含する。ベクター、及び宿主細胞は限定されず、宿主として例えば大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞のみならず昆虫個体、哺乳動物個体も含まれる。昆虫個体としては例えばカイコが挙げられ、哺乳動物個体としては例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等が挙げられるが、これらには限定されない。発現ベクターとしては、それぞれの宿主に対応した公知のベクター、市販のベクターを用いることができる。また、発現ベクターを用いての昆虫個体または哺乳動物個体のトランスフェクションも公知の方法により行うことができる。本発明は、さらに前記本発明の核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞または宿主個体において前記核酸を発現させ発現産物を宿主細胞の培養液または宿主個体の体液または乳汁等の分泌物から抗体またはその機能的断片を採取することを含む本発明の抗体またはその機能的断片の製造法をも包含する。
本発明の抗体またはその機能的断片は、具体的には下記のようにして製造することができる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ．，１９７５ Ｖｏｌ．２５６：４９５−４９７）及びそれに準じて行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄又は扁桃等、好ましくはリンパ節又は脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物に由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを、細胞融合させることにより調製される。細胞融合は例えば、ポリエチレングリコール（例えば分子量１５００〜６０００）等の高濃度ポリマー溶液中、通常約３０〜４０℃、約１〜１０分間、抗体産生細胞とミエローマ細胞を混合することによって行うことができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中の培養上清の免疫抗原に対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法などの免疫学的方法を用いて測定することにより行なうことができる。
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロで培養して培養上清から単離することにより行うことができる。また、マウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等の腹水中等でインビボで培養し、腹水から単離することもできる。
また、ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換型抗体を調製することができる（Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ．，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ．，１９９７ ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．，２０００ ＯＸＦＯＲＤ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＰＲＥＳＳ，Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ．，１９９３ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ）。さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、そのトランスジェニック動物のミルク中からその抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。ハイブリドーマをインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地又は既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
上記の方法で作製された本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、治療用薬剤とコンジュゲートすることによって、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体を形成できる。抗体へ結合させる治療用薬剤の例としては、以下のものに限定されないが、テトラサイクリン、ミノサイクリン等の抗生物質や抗菌剤等が挙げられる。抗体と治療用薬剤の結合は共有又は非共有結合（例えばイオン結合）のいずれでもよい。例えば、抗体分子中の反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等）又は配位性基を利用し、該反応性基と反応しうる官能基（細菌毒素、化学療法剤の場合）又は該配位性基との間で錯体を形成しうるイオン性基（放射性核種の場合）をもつ治療用薬剤と抗体とを接触させることによって、本発明の複合体を得ることができる。あるいは複合体の形成に際してビオチン−アビジン系の利用も可能であろう。また、治療用薬剤がタンパク質又はペプチドである場合は、遺伝子工学的手法により抗体と前記タンパク質又はペプチドとの融合タンパク質として生産することも可能である。
また、本発明の抗４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体、あるいは上記治療用薬剤と結合した抗４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体を含有する歯周病の予防用、診断用または治療用医薬組成物もまた本発明の範囲内に含まれる。本発明の抗４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体の投与により口腔からＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを排除することができ、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによる歯周組織の破壊を防止し、歯周病を予防、治療することができる。該組成物には治療上有効量の治療用薬剤が含まれているべきであり、経口、非経口投与用の種々の形態に製剤化される。ここで、治療上有効量とは、所与の症状や投与計画について治療効果を与える量をいう。本発明の組成物は、抗体に加えて、生理学的に許容され得る製剤上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体のうち１種又は複数を含むことができる。また、他の抗体又は抗生物質のような他の薬剤との混合物とすることもできる。適切な担体には、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに当該分野において周知であるアミノ酸、糖類、界面活性剤等の安定化剤、表面への吸着防止剤を含んでいてもよい。製剤の形態としては、ペースト、液体、凍結乾燥製剤（この場合上記のような緩衝水溶液を添加することにより再構成して使用可能である。）、徐放製剤、腸溶性製剤、注射剤又は点滴剤などを含む製剤を、治療目的、治療計画に応じて選択可能である。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射又は配薬を含む非経腸的経路が考えられるが、動物を用いた試験により最適の経路が選択される。あるいは、患者の患部に直接本発明の組成物を接触させる方法も可能であろう。また直接歯周病患部への適用を考慮すると、口腔内あるいは歯周ポケットへの投与も好ましい。投与量は、動物を用いた試験、臨床試験の実施により適宜決定されるが、一般に患者の状態若しくは重篤度、年齢、体重、性別などが考慮されるべきである。
また、本発明の抗体またはその機能的断片を歯磨き用ペースト、口腔内洗浄剤に混合させて歯周病患部に適用してもよいし、また食品、飲料等に混合した機能性食品の形態で適用することもできる。
さらに、本発明の抗体またはその機能的断片を歯周病の診断剤としても使用することができる。例えば、本発明の抗体またはその機能的断片を用いて歯周ポケットにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが存在するか否かを検出することができる。該検出は、歯周ポケットのプラークを採取し、該プラーク中のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在を、ＥＩＡ、ＲＩＡ、免疫凝集法との公知の免疫測定法により検出することにより行うことができる。
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がその実施例に記載される態様のみに限定されるものではない。
（実施例１）組換体４０−ｋＤａ ＯＭＰ（ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ）の調製
組換体４０−ｋＤａ ＯＭＰ（ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ）は以下のように調製した。完全長ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ ＤＮＡ（日本ＤＮＡデータバンク：アクセッション番号ＡＢ０５９６５８）をベクター組み込んだ組み換えプラスミド ｐＭＤ１２５をもつ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２）を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（１％ ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ベクトン・ディッキンソン社製），０．５％ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ベクトン・ディッキンソン社製），０．５％ ＮａＣｌ）で培養した。菌体を遠心機にて回収後、超音波処理により菌体を破壊した。遠心分離機を用いて菌体破壊上清を得た後、Ｋａｗａｍｏｔｏら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１ Ｖｏｌ ２３：１０５３）の方法に従いｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを精製した。調製されたｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰは透析膜（分子量１００００以下カット，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてＰＢＳ（−）に置換し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動で分子量４０，０００の単一バンドの精製タンパクを得た。
（実施例２）ヒト抗体産生マウスの作製
免疫に用いたマウスは、内因性Ｉｇ重鎖破壊及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体の遺伝的背景を有しており、かつヒトＩｇ重鎖遺伝子座を含む１４番染色体断片（ＳＣ２０）及びヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を同時に保持する。このマウスは、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座を持つ系統（系統Ａ）のマウスと、ヒトＩｇκ鎖トランスジーンを持つ系統（系統Ｂ）のマウスとの交配により作製した。系統Ａは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、子孫伝達可能な１４番染色体断片（ＳＣ２０）を保持するマウス系統であり、例えば富塚らの報告（Ｔｏｍｉｚｕｋａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，２０００ Ｖｏｌ ９７：７２２）に記載されている。また、系統Ｂは、内因性Ｉｇ重鎖及びκ軽鎖破壊の両者についてホモ接合体であり、ヒトＩｇκ鎖トランスジーン（ＫＣｏ５）を保持するマウス系統であり、例えばＦｉｓｈｗｉｌｄらの報告（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６ Ｖｏｌ １４：８４５）に記載されている。系統Ａの雄マウスと系統Ｂの雌マウス、あるいは系統Ａの雌マウスと系統Ｂの雄マウスの交配により得られた、血清中にヒトＩｇ重鎖及びκ軽鎖が同時に検出される固体（Ｉｓｈｉｄａ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，ＩＢＣ’ｓ １１ｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０００）を以下の免疫実験に用いた。なお、前記ヒト抗体産生マウスは、契約を結ぶことによって、麒麟麦酒株式会社より入手可能である。
（実施例３）４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するヒトモノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行 １９９１）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。免疫原としての４０−ｋＤａ ＯＭＰは、実施例１で調製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを用いた。被免疫動物は、実施例２で作製したヒト免疫グロブリンを産生するヒト抗体産生マウスを用いた。
ヒト抗体産生マウスに、実施例１で作製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをＲＩＢＩアジュバンド（Ｃｏｒｉｘａ社製）と混合し、２０μｇのｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを腹腔内投与することにより初回免疫した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰとＲＩＢＩアジュバンド混液を初回免疫から１週間〜２週間毎に腹腔内投与により４回追加免疫した。さらに、以下に述べる脾臓細胞の取得３日前にｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを尾静脈内注射により追加免疫した。
免疫されたマウスから脾臓を外科的に取得し、回収した脾臓細胞をマウスミエローマＳＰ２／０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．：ＣＲＬ１５８１）と５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール１５００（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて細胞融合させることにより多数のハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの選択は、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）とヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ）を含有するＨＡＴ含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）中で培養することにより行った。さらに、ＨＴ含有ＤＭＥＭ培地を用いて限界希釈法によりシングルクローンにした。培養は、９６−ｗｅｌｌマイクロタイタープレート（ベクトンディッキンソン社製）中で行った。抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの選択（スクリーニング）及び各々のハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の特徴付けは、後述する酵素標識免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により測定することにより行った。
ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、以下に述べる Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）およびＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）により、ヒト免疫グロブリンγ鎖（ｈＩｇγ）及びヒト免疫グロブリン軽鎖κを有し、かつ、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰに特異的な反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。なお、本実施例を含め以下のいずれの実施例中、並びに実施例における試験結果として示した表又は図中においては、各々の本発明のヒト抗４０−ｋＤａ ＯＭＰモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンは記号を用いて命名した。以下のハイブリドーマクローンはシングルクローンを表わす：ｈ１３−１７，５−８９−２，ａ４４−１又は１−８５−１６。それらの内３つのハイブリドーマクローンｈ１３−１７，５−８９−２及びａ４４−１を、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブダペスト条約の規定下で国際寄託した。ハイブリドーマクローンｈ１３−１７，５−８９−２及びａ４４−１は各々受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５、ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３及びＢＰ−８３２４である（２００３年３月１１日付）。
（実施例４）ヒト免疫グロブリンγ鎖を有するモノクローナル抗体の検出
実施例１で作製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ（１μｇ／ｍｌ ５０ｍＭＮａ２ＨＣＯ３）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに５０μｌ加え、室温で３０分インキュベートし、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートし、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰが結合していない部位をブロックした。このようにして、各ウェルをｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰでコーティングしたマイクロプレートを作製した。また、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１株を嫌気的に５μｇ／ｍＬヘミン（Ｓｉｇｍａ社製）、０．５μｇ／ｍＬビタミンＫ、０．５％ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）添加Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＢＢＬ社製）中にて３７℃で培養し、中期対数期までＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを増殖させた。その後、遠心分離（１０，０００ｘｇ，１０分，４℃）によって同細菌の細胞を回収し、６０℃、３０分で熱処理した。次にＰＢＳ中に再懸濁させ、超音波ホモジナイザー（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０）を使用し、氷上で１５分音波処理をした。この超音波処理物を遠心分離（１００，０００ｘｇ，３０分，４℃）し、上清を濾過（０．２２μｍ）した。超音波処理物の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．０Ｏｐｔｉｍａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ（Ｏ．Ｄ．）として算出した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ超音波処理物（５０μｇ／ｍｌ ５０ｍＭＮａ２ＨＣＯ３，５０μｌ／ウェル）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに加え、室温で３０分インキュベートし、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ超音波処理物をマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て、各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートした。各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰあるいはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ超音波処理物をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え、室温下で３０分反応させた後、各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで、過酸化酵素で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を１０％ブロックエース（大日本製薬株式会社製）含有ＰＢＳ−Ｔで２，０００倍に希釈した溶液５０μｌを、各ウェルに加え、室温下３０分インキュベートした。マイクロプレートを、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色基質液（ＴＭＢ、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μｌ加え、室温下で２０分間インキュベートした。各ウェルに２Ｍ硫酸５０μｌを加え反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。その結果、３００クローン以上の抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体が取得できた。その一部を図１に示す。
（実施例５）ヒト免疫グロブリン軽鎖κ（ＩｇＬκ）を有するモノクローナル抗体の検出
実施例１で作製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ（１μｇ／ｍｌ ５０ｍＭＮａ２ＨＣＯ３）を、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに５０μｌ加え、室温で３０分インキュベートし、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え３０分反応させた後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで各ウェルに過酸化酵素で標識したヤギ抗ヒトＩｇκ抗体（２，０００倍希釈、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を５０μｌ加え、室温下で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、基質緩衝液（ＴＭＢ、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μｌ加え、室温下で２０分間インキュベートした。次いで、２Ｍ硫酸５０μｌを各ウェルに加え、反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。
（実施例６）各モノクローナル抗体のサブクラス同定
実施例１で作製したｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ（１μｇ／ｍｌ ５０ｍＭＮａ２ＨＣＯ３）をＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに５０μｌ加え、室温で３０分インキュベートしｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをマイクロプレートに吸着させた。次いで、上清を捨て各ウェルにブロッキング試薬（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ，ＰＩＥＲＣＥ社製）を加え室温で１０分間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰをコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え３０分反応させた後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次いで、各ウェルにそれぞれ過酸化酵素で標識したヒツジ抗ヒトＩｇＧ１抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ２抗体、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ３抗体又はヒツジ抗ヒトＩｇＧ４抗体（各２，０００倍希釈、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社製）を５０μｌ加え、室温下で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、基質緩衝液（ＴＭＢ、ＤＡＫＯ社製）を各ウェルに１００μｌ加え、室温下で２０分間インキュベートした。次いで２Ｍ硫酸５０μｌを各ウェルに加え反応を止めた。波長４５０ｎｍ（参照波長５７０ｎｍ）での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３００，コロナ電気社製）で測定した。
（実施例７）各抗体の調製
抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体を含む培養上清の調製は以下の方法にて行った。抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体産生ハイブリドーマをウシインシュリン（５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、エタノールアミン（０．０１ｍＭ、シグマ社製）、亜セレン酸ナトリウム（２．５ｘ１０−５ｍＭ、シグマ社製）含有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）に馴化した。スピナーフラスコにて培養し、ハイブリドーマの生細胞率が９０％になった時点で培養上清を回収した。回収した上清は、１０μｍと０．２μｍのフィルター（ゲルマンサイエンス社製）に供し、ハイブリドーマ等の雑排物を除去した。
上記培養上清からの抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体の精製は以下の方法で行った。抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体を含む培養上清をＨｙｐｅｒ Ｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（日本ガイシ社製）を用い、付属の説明書に従い吸着緩衝液としてＰＢＳ（−）、溶出緩衝液として０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）を用いてアフィニティー精製した。溶出画分は１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加してｐＨ７．２付近に調整した。調製された抗体溶液は、透析膜（分子量１００００カット、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてＰＢＳ（−）に置換し、孔径０．２２μｍのメンブランフィルターＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）でろ過滅菌し、精製抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体を得た。精製抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．４５Ｏ．Ｄ．として算出した。
（実施例８）アイソタイプコントロール抗体の調製
同様の方法にてヒト抗体産生マウスにＤＮＰ−ＫＬＨを免疫後、その脾臓細胞をマウスミエローマＳＰ２／０細胞融合させることにより多数のハイブリドーマを作製し、各々の抗ヒトＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ４抗体を調製した。
（実施例９）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体によるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害試験は、Ｅｌｌｅｎ Ｒ．Ｐ．らの方法（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８９；５７：１６１８−１６２０）を改変し実施した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１（（１）〒２７１−８５８７ 千葉県松戸市栄町西２−８７０−１ 日本大学松戸歯学部口腔生化学講座 安孫子宜光教授、または（２）〒９５１−８５１４ 新潟市学校町通２番町５２７４番地 新潟大学大学院 医歯学総合研究科 摂食環境制御学講座 歯周診断・再建学分野 吉江弘正教授から分譲可能）のｖｅｓｉｃｌｅｓ（０．７ｎｇ／ｍＬ）をＨｉｒａｔｓｕｋａらの方法（Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２；３７：７１７−７２４）に従い調製し、各々の抗体と３７℃、３０分間反応させた。また、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ（Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ、ＡＴＣＣ１９２４６）を嫌気的に５ｍｇ／ｍＬ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＢＬ社製）添加３７ｍｇ／ｍＬ Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＢＬ社製）中、３７℃で培養し、ＰＢＳで吸光度が１．５（波長５００ｎｍ）になるよう調製した。調製されたＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ ５０μＬを等量のＰＢＳで懸濁し、この溶液に各抗体と反応させたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１のｖｅｓｉｃｌｅｓ ５０μＬを添加し、フロキュレーションスライド上で３７℃、１０分間反応させた。反応後、肉眼あるいは光学顕微鏡下で凝集活性を評価した。阻害活性の基準（スコア０−４）はＣｉｓａｒ．Ｊ．Ｏ．らの方法に従った（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９７９ Ｖｏｌ ３３：４６７）。その結果、１３個の抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体がＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１のｖｅｓｉｃｌｅｓとＡ．ｖｉｓｃｏｓｕｓの共凝集阻害活性を示した。活性のある抗体の中で共凝集阻害活性が強いｈ１３−１７，５−８９−２，ａ４４−１および１−８５−１６を選抜した（表１）。以下の実験はこれら４つの抗体を用い実施した。
表１
各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体によるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの共凝集阻害活性
（実施例１０）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体によるヒト好中球貪食の賦活化
貪食試験はＰｅｒｔｉｃａｒａｒｉ Ｓ．らの方法（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １９９１；１２：６８７−６９３）を改変し実施した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１株を嫌気的に５μｇ／ｍＬヘミン、０．５μｇ／ｍＬビタミンＫ、０．５％ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）添加Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（ＢＢＬ社製）中にて３７℃で培養し、中期対数期までＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを増殖させた。その後、遠心分離（１０，０００ｘｇ，１０分，４℃）によって同細菌の細胞を回収し、６０℃、３０分で熱処理しＰＢＳで２回洗浄後２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬに調製した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１懸濁液１ｍＬに、０．１Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．６）で１ｍｇ／ｍＬに調製されたＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を１ｍＬ添加し、３７℃、３０分培養し、ＰＢＳで３回洗浄後、ＦＩＴＣ標識Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１を２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍＬに調製した。ＦＩＴＣ標識Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１への抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体の結合は、標識されていないＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１と同程度であった。ヒト好中球の分離法については、ヘパリンコート真空採血管によりヒト末梢静脈血を採取後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７と１１１９（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた２重密度勾配遠心法にて行った。更に、氷令した溶血液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４）にて残存赤血球を低張溶血し、ＰＢＳにて浸透圧を回復後、洗浄し、２ｘ１０６／ｍＬに調製した。調製された好中球は直ちに次の貪食試験に供した。
２ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬのＦＩＴＣ標識Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ３８１を各々の抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体あるいはコントロール抗体を（１μｇ／ｍＬ，５μＬ）を加え、３７℃、３０分間反応させた。ＰＢＳで２回洗浄後、再懸濁した。ヒト好中球とＦＩＴＣ標識Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを１：２０の割合になるよう混合し、４℃あるいは３７℃で３０分間培養した。貪食反応後１０，０００個の好中球をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で取り込み、ＦＩＴＣの蛍光強度を測定することにより、貪食能を評価した。貪食した好中球の割合（貪食率）は以下の計算式により求めた。貪食率（％）＝（３７℃でのＦＩＴＣ陽性好中球の割合（％））−（４℃でのＦＩＴＣ陽性好中球の割合（％））その結果、何れの抗体もコントロール抗体と比較した場合、好中球の貪食活性を増強する効果があることが観察された（表２）。さらに、報告されているマウス４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体（Ｐｇ−ｏｍｐＡ３：Ｓｉｔｏ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９７ Ｖｏｌ ２８：６７５）とヒト４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体（ｈ１３−１７，５−８９−２，ａ４４−１）と活性を同じ評価系にて比較した。その結果、マウス抗体Ｐｇ−ｏｍｐＡ３はヒト好中球の貪食能を増強する活性は非常に弱く、ヒト抗体が優れていることが示された（図２）。
表２
各抗４０ｋＤａ−ＯＭＰ抗体によるヒトｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ貪食賦活化活性
（実施例１１）ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体と患者血清のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓへの結合活性比較
４つのｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体と慢性歯周病患者血清のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓへの結合の強さを実施例４と同法のＥＬＩＳＡにて比較した。ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰあるいはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ超音波処理物をコーティングしたマイクロプレートの各ウェルに、各々の抗体（１５０ｎｇ／ｍＬ）あるいは適宜希釈した患者血清由来ＩｇＧ抗体（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２００１ Ｖｏｌ ６９：２９３５）を５０μｌ加え反応させた。洗浄後、過酸化酵素標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２抗体（免疫生物研究所社製）と発色基質液（ＴＭＢ）で結合抗体を検出した。その結果、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰと同等に結合する濃度で比較すると、全ての抗体が患者血清より、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに強い結合活性を有する抗体であることが判明した（図３）。
（実施例１２）各抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のヒト血液細胞交叉反応性
各モノクローナル抗体のヒト血液細胞への交叉反応性をＦＡＣＳ解析で調べた。１ｍＬヘパリン（Ｎｏｖｏ社製）入りヒト末梢血１０ｍＬを１０ｍＬのＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）上に重層した。１５００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間遠心後単核球画分を回収し、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。調製された細胞は１％ラット血清入り、０．１％ＮａＮ３、２％ＦＣＳ含有ＰＢＳのＳｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＢ）に２ｘ１０６／ｍｌの濃度で浮遊させた。細胞浮遊液（１００μｌ／ウェル）を９６−ｗｅｌｌ丸底プレート（ベクトンディッキンソン社製）に分注した。ｈ１３−１７，５−８９−２，ａ４４−１又は１−８５−１６の各々の抗体を５μｇ／ｍＬの濃度で氷温下３０分間インキュベートした。ＳＢで２回洗浄した後、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトンディッキンソン社製）で各抗体の反応性を調べた。その結果、いずれの抗体もヒト末梢血細胞に結合しなかった。このことから全ての抗体がヒトに投与したときに副作用の生じにくい抗体であることが予想された。
（実施例１３）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する結合活性
各抗体のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する結合を表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ、ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて評価した。センサーチップ（ＣＭ５）を実験プロトコールに従い、アミンカップリング法で固定化した（固定化量：ｃＩｇＧ１＝９０９７ＲＵ，ａ４４−１＝７３５５ＲＵ，ｈ１３−１７＝７４７３ＲＵ，５−８９−２＝７５９５ＲＵ，１−８５−１６＝７８７０ＲＵ）。６０℃で３０分処理し死滅させたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０の緩衝液にてＯ．Ｄ．５５０ｎｍ＝０．４の濃度に調製し、流速１０μＬ／ｍｉｎで供給した。その結果５−８９−２は他の抗体と比べた場合解離速度が遅く、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに強く結合する抗体であることが分かった（図４）。歯周病の治療の際予想される唾液による抗体排除作用を考慮した場合、５−８９−２のような解離が遅い抗体が良い。このことから５−８９−２はヒトに投与したときに高い治療効果を示す抗体であることが予想された。
（実施例１４）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対するヘミン結合阻害活性
４０−ｋＤａ ＯＭＰに対するヘミンの結合を抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体が阻害するか表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ、ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いて評価した。アミンカップリング法でｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰを固定化した（ＲＵ＝３５００）。図５は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０（Ｔ−Ｂ）の緩衝液にて２０μｇ／ｍＬに調製した各抗体を流速２０μＬ／ｍで供給し、さらに、Ｔ−Ｂの緩衝液にて調製した５μｇ／ｍＬのヘミン（シグマ社製）を供給した結果である。ヘミンの供給が開始された時間を０秒としたセンサグラムを示している。ｈ１３−１７をｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰに前結合させた場合、ヘミンの結合がｃＩｇＧに比べ優位に低下していることが観察された。一方、他の３クローンは、前結合させてもコントロールと同程度のｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰとヘミンの結合が観察された。これらの結果より、ｈ１３−１７は、ヘミンのｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰに対する結合を阻害することが示唆された。さらに、図６は、ｈ１３−１７とヘミンを同時に反応させｈ１３−１７がヘミンとｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰの結合を阻害するかを調べたものである。ｈ１３−１７とヘミンをＴ−Ｂ緩衝液にてそれぞれ２０μｇ／ｍＬと５μｇ／ｍＬに調製し、ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ固定化センサーチップに流速２０μＬ／ｍで供給した。対象抗体としてｈ１３−１７と解離速度がほぼ同じ（図４参照）であるａ４４−１抗体を用いた。その結果、アナライト拡散後の平衡期に近い時点（３８０秒）でのシグナルを見ると、ｈ１３−１７存在下ではヘミンとｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰの結合シグナルは２５５ＲＵで、ｈ１３−１７単独のシグナル（２５２ＲＵ）とほぼ同じである。そのシグナルの差（２５５ＲＵ−２５２ＲＵ＝３ＲＵ）は、この時点でのコントロールＩｇＧ１＋ヘミンのシグナル（３０ＲＵ）より明らかに低く、ヘミンはｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合していない。一方、対象のａ４４−１の３８０秒時のシグナルはａ４４−１のシグナルとコントロールＩｇＧ１＋ヘミンのシグナルの総和が１８０ＲＵ（１４８ＲＵ＋３２ＲＵ）で、ａ４４−１＋ヘミンのシグナルは１７０ＲＵと抗体とヘミンが競合しない時の理論値（１８０ＲＵ）に近い値を示した。これらの結果より、ｈ１３−１７はヘミンとＯＭＰ４０の結合を強く阻害する抗体であることが示された。
（実施例１５）抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のラット実験歯周炎に対する抑制効果
ラット末梢血よりラット好中球をＬｙｍｐｈｏｌｉｔｅ−Ｒａｔ（ｓｉｇｍａ社製）を用い密度勾配遠心法により分離し、実施例１０と同様に各抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のラット好中球貪食賦活化活性の評価を行ったところ活性が観察された。そこで、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓをラット口腔に接種することにより歯槽骨の吸収を惹起する実験的歯周炎の系を用いて、試験管内実験においてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対して強い結合能、共凝集能阻害活性、好中球貪食賦活化活性を有する抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体のラット実験歯周炎に対する抑制効果について検討した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ接種によるラット実験的歯周炎の惹起感染は、生後３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系のＳＰＦラットを使用し、１群６匹で行なった。健康状態を観察後、イオン交換水中に最終濃度１ｍｇ／ｍｌのサルファメトキサゾールと２００μｇ／ｍｌのトリメトプリムを混合したものを飲料水として１週間与えて口腔常在菌を減少させた。その後，３日間抗生物質を含まないイオン交換水を与えＰＢＳで作製した５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液で調製したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株（ＡＴＣＣ３３２７７）の菌液（１０９ＣＦＵ／ｍｌ）を２日毎に３回、ラット口腔内へ直接投与した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ未接種群（ｓｈａｍ）には５％ＣＭＣ溶液のみを与え、同条件で飼育した。抗体の投与は、ａ４４−１，ｈ１３−１７，５−８９−２抗体を各０．５ｍｇ／ｍｌ濃度に調製し、３抗体を等量づつ混ぜ合わせ５％ＣＭＣ溶液で希釈した溶液の投与群とコントロールとしてＰＢＳで作製した５％ＣＭＣ溶液で０．５ｍｇ／ｍｌに調製したＤＮＰヒト抗体（ＩｇＧ１）投与群を用いた。投与回数は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの投与開始２日前から最終投与２日後まで毎日、計９回投与した。尚、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ接種時においては、菌接種１０分後に抗体を投与した。すべてのラットは、食事，飲料水を自由に摂取できるようにし、温度２３℃、湿度６０％および明暗１２時間サイクルの環境下で飼育した。
ラット口腔内のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在は、ＰＣＲ反応を行なって確認した。すなわち、綿棒でラット口腔内を３０秒間拭って、プラーク細菌を採取し、ＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社製）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを２０μＬのＴ１０Ｅ１溶液にて溶解し保存した。プライマーは、Ａｓｈｉｍｏｔｏらが報告（Ａｓｈｉｍｏｔｏ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６ Ｖｏｌ １１：２６６）した１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列に基づいて作製し、ＰＣＲ反応は９５℃５分間加熱変性後、９５℃３０秒、６０℃１分、７２℃１分を３５サイクルで行った。
骨吸収の測定は以下の様に実施した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ接種最終日から４２日目にすべてのラットをエーテル麻酔下で断頭瀉血により屠殺した。歯槽骨吸収量の評価は、上顎臼歯部のセメントエナメル境から歯槽骨頂までの距離を７個所測定して行なった。頭蓋骨を２気圧下で１０分間加熱後、３％次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬して軟組織を除去し、１％メチレンブルー溶液で歯槽骨を染色乾燥させた試料をキーエンス社製デジタルＨＤマイクロスコープ（実体顕微鏡）で４０倍の倍率で測定した。７個所の測定値を平均して個体当たりの骨吸収量とし、それぞれ６匹分の平均値を実験群の骨吸収量としてミリメートルで表示した。測定は、同一試料について３回実施し平均値と標準誤差（ＳＥ）を求めた。統計解析は、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ＰＬＳＤ（ＳｔａｔＶｉｅｗ）にて行った。
その結果（図７）、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを投与した群は、明らかに非投与群に比較して有意に骨吸収量の増加が認められた（ｐ＜０．０１）。また、抗ｒ４０−ｋＤａ ＯＭＰ抗体の投与により有意に骨吸収の抑制が確認され、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で使用した群ではＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ非投与群と同程度で、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ投与による骨吸収がほとんど認められなかった。コントロール抗体（ＤＮＰ抗体）を投与した群では、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのみを投与した群に比較して、多少骨吸収量が減少したが、有意差は認められなかった。以上の結果から、骨吸収を指標とした今回の実験では、ＯＭＰ４０抗原に対するモノクローナル抗体がラット歯槽骨の吸収を抑制できることが明らかになった。ＯＭＰ４０抗体の投与により、骨吸収量に明らかな減少が認められたことから、実験終了時におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのラット口腔内残存率をＰＣＲで検討の結果、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ接種群では、６匹すべてにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在が確認されたが、ＯＭＰ４０抗体を投与した群では、６匹中５匹においてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存在が確認されなかった（表３）。
表３
以上の結果より、ＯＭＰ４０モノクローナル抗体は歯周病治療に有効であることが強く示唆された。
【産業上の利用可能性】
実施例に示すように、本発明の４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの凝集を阻害し、また白血球の貪食能を促進する。さらに、本発明の４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体は、口腔からＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを排除することがでる。このことより、本発明の抗体またはその機能的断片を歯周病の治療、診断に有効に用いることができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項２】
（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項３】
（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項４】
（１）ヒト好中球貪食賦活活性、および（２）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項５】
（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性、および（３）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項６】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集が、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓの共凝集である、請求項２、３および５のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項７】
歯槽骨の吸収抑制活性を有する、４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項８】
抗体がヒト抗体である請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項９】
マウス−マウスハイブリドーマにより産生される請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１１】
治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１２】
治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、請求項１１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１３】
抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される請求項１２記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１４】
抗体のクラスがＩｇＧである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１５】
ＩｇＧがＩｇＧ１である請求項１４記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１６】
抗体のクラスがＩｇＡである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１７】
重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１８】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項１９】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項２０】
治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、請求項１８または１９に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２１】
治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、請求項２０記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２２】
抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される請求項２１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２３】
抗体のクラスがＩｇＧである請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２４】
ＩｇＧがＩｇＧ１である請求項２３記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２５】
抗体のクラスがＩｇＡである請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２６】
重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２７】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）。
【請求項２８】
ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項２９】
ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項３０】
治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、請求項２８または２９に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３１】
治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、請求項３０記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３２】
抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される請求項３１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３３】
抗体のクラスがＩｇＧである請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３４】
ＩｇＧがＩｇＧ１である請求項３３記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３５】
抗体のクラスがＩｇＡである請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３６】
重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３７】
ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）。
【請求項３８】
ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項３９】
ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項４０】
治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、請求項４０または４１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４１】
治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、請求項４０記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４２】
抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される請求項４１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４３】
抗体のクラスがＩｇＧである請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４４】
ＩｇＧがＩｇＧ１である請求項４３記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項４５】
抗体のクラスがＩｇＡである請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４６】
重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４７】
ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）。
【請求項４８】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）およびハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）からなる群から選択されるハイブリドーマの保有する核酸であって、前記ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域を含む抗体をコードする核酸または該抗体の機能的断片をコードする核酸。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸によりコードされる、抗体またはその機能的断片である蛋白質。
【請求項５０】
請求項４８に記載の核酸を有する発現ベクター。
【請求項５１】
請求項５０に記載の発現ベクターを有する宿主。
【請求項５２】
大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞および植物細胞並びに哺乳動物からなる群から選ばれる請求項５１記載の宿主。
【請求項５３】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）およびハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）からなる群から選択されるハイブリドーマから４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して該抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上精または宿主の分泌物から該抗体を採取することを含む、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体の製造方法。
【請求項５４】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯槽骨の吸収抑制剤。
【請求項５５】
抗４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯周病の予防、診断または治療剤。
【請求項５６】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片の歯槽骨の吸収抑制剤の製造のための使用。
【請求項５７】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯槽骨の吸収抑制方法。
【請求項５８】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片の歯周病の予防、診断または治療剤の製造のための使用。
【請求項５９】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯周病を診断、予防または治療する方法。
【請求項６０】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯周病の予防、診断または治療剤。
【請求項６１】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯槽骨の吸収抑制剤。
【請求項６２】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片の歯周病の予防、診断または治療剤の製造のための使用。
【請求項６３】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片の歯槽骨の吸収抑制剤の製造のための使用。
【請求項６４】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯周病を診断、予防または治療する方法。
【請求項６５】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯槽骨の吸収抑制方法。
【請求項１】
ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項２】
（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項３】
（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項４】
（１）ヒト好中球貪食賦活活性、および（２）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項５】
（１）Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集阻害活性、および（２）ヒト好中球貪食賦活活性、および（３）ヘミンと４０−ｋＤａ ＯＭＰとの結合阻害活性を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項６】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ共凝集が、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓの共凝集である、請求項２、３および５のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項７】
歯槽骨の吸収抑制活性を有する、４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項８】
抗体がヒト抗体である請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項９】
マウス−マウスハイブリドーマにより産生される請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１１】
治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１２】
治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、請求項１１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１３】
抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される請求項１２記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１４】
抗体のクラスがＩｇＧである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１５】
ＩｇＧがＩｇＧ１である請求項１４記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１６】
抗体のクラスがＩｇＡである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１７】
重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項１８】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項１９】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項２０】
治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、請求項１８または１９に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２１】
治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、請求項２０記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２２】
抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される請求項２１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２３】
抗体のクラスがＩｇＧである請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２４】
ＩｇＧがＩｇＧ１である請求項２３記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項２５】
抗体のクラスがＩｇＡである請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２６】
重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項２７】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）。
【請求項２８】
ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項２９】
ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項３０】
治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、請求項２８または２９に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３１】
治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、請求項３０記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３２】
抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される請求項３１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３３】
抗体のクラスがＩｇＧである請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３４】
ＩｇＧがＩｇＧ１である請求項３３記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項３５】
抗体のクラスがＩｇＡである請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３６】
重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項３７】
ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）。
【請求項３８】
ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項３９】
ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）が産生する抗体の可変領域を有する、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項４０】
治療薬剤と共有的または非共有的に結合した、請求項４０または４１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４１】
治療薬剤が抗生物質または抗菌剤から選択される、請求項４０記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４２】
抗生物質または抗菌剤がテトラサイクリンまたはミノサイクリンから選択される請求項４１記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４３】
抗体のクラスがＩｇＧである請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４４】
ＩｇＧがＩｇＧ１である請求項４３記載の抗体又はその機能的断片。
【請求項４５】
抗体のクラスがＩｇＡである請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４６】
重鎖定常領域のアミノ酸配列を改変した、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項４７】
ハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）。
【請求項４８】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）およびハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）からなる群から選択されるハイブリドーマの保有する核酸であって、前記ハイブリドーマが産生する抗体の可変領域を含む抗体をコードする核酸または該抗体の機能的断片をコードする核酸。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸によりコードされる、抗体またはその機能的断片である蛋白質。
【請求項５０】
請求項４８に記載の核酸を有する発現ベクター。
【請求項５１】
請求項５０に記載の発現ベクターを有する宿主。
【請求項５２】
大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞および植物細胞並びに哺乳動物からなる群から選ばれる請求項５１記載の宿主。
【請求項５３】
ハイブリドーマｈ１３−１７（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２５）、ハイブリドーマ５−８９−２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２３）およびハイブリドーマａ４４−１（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３２４）からなる群から選択されるハイブリドーマから４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を有する発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して該抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上精または宿主の分泌物から該抗体を採取することを含む、４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体の製造方法。
【請求項５４】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯槽骨の吸収抑制剤。
【請求項５５】
抗４０−ｋＤａ ＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯周病の予防、診断または治療剤。
【請求項５６】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片の歯槽骨の吸収抑制剤の製造のための使用。
【請求項５７】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯槽骨の吸収抑制方法。
【請求項５８】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片の歯周病の予防、診断または治療剤の製造のための使用。
【請求項５９】
４０−ＫＤａＯＭＰと結合する抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯周病を診断、予防または治療する方法。
【請求項６０】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯周病の予防、診断または治療剤。
【請求項６１】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片を有効成分として含有する、歯槽骨の吸収抑制剤。
【請求項６２】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片の歯周病の予防、診断または治療剤の製造のための使用。
【請求項６３】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片の歯槽骨の吸収抑制剤の製造のための使用。
【請求項６４】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯周病を診断、予防または治療する方法。
【請求項６５】
請求項１〜２６、２８〜３６、３８〜４６および４９のいずれか１項に記載の抗体またはその機能的断片を調製し、動物に投与することを含む、歯槽骨の吸収抑制方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３４２５
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３７１９（Ｐ２００５−５０３７１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３５６９
【国際出願日】平成１６年３月１７日（２００４．３．１７）
【出願人】（０００２５３５０３）麒麟麦酒株式会社 (247)
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（５０５０７９７８５）学校法人神奈川歯科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【発行日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３５６９
【国際出願日】平成１６年３月１７日（２００４．３．１７）
【出願人】（０００２５３５０３）麒麟麦酒株式会社 (247)
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（５０５０７９７８５）学校法人神奈川歯科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
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