殺菌／浸透性が向上した安定なタンパク質生成物およびそれを含む薬剤組成物
【課題】新規で、生物学的に活性で、組換え生成したＢＰＩ（ｒＢＰＩ）タンパク質、および二量体とシステイン付加体の形成を抑止し、薬学用途に非常に有用な生成物をもたらすタンパク質断片生成物、ｒＢＰＩ生成物および類似体をコードする新規ＤＮＡ配列、このＤＮＡを含むプラスミドベクター、このプラスミドで安定に形質転換あるいは形質変換された宿主細胞、組換え調製法、安定な薬剤組成物、および治療方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、カルボキシ末端残基として第１９３位にロイシン残基を有する殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ。
【解決手段】本発明は、カルボキシ末端残基として第１９３位にロイシン残基を有する殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、殺菌性／浸透性が向上した新規なタンパク質生成物およびそれを含む薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の外膜の主要構成成分であり、コアオリゴ糖およびリピドＡの定常領域に結合する血清型に特異的な酸素側鎖多糖から構成される。非特許文献１。ＬＰＳは、米国での集中治療部での医療における主要な死因の一つである、グラム陰性敗血症ショックの病理における重要な媒体である。非特許文献２。
【０００３】
ＬＰＳ結合タンパク質は、多様な哺乳類組織にて同定されている。非特許文献３； 非特許文献４。最も広範に研究されているＬＰＳ結合タンパク質は、多形核白血球のアズール性顆粒に認められる基本タンパク質の、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質（ＢＰＩ）である。ヒトＢＰＩタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー［非特許文献５］あるいはＥ．ｃｏｌｉ親和性クロマトグラフィー［非特許文献６］のいずれかと酸抽出を組み合わせて、多形核好中球から単離され、そして、グラム陰性細菌の多様な菌に対して強い殺菌活性を有する。
【０００４】
ＢＰＩタンパク質は多くのグラム陰性細菌に対して細胞毒性を呈するが、グラム陽性細菌、カビ、あるいは哺乳類細胞に対する細胞毒性は報告されていない。ヒトＢＰＩの全タンパク質のアミノ酸配列ならびにそのタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１および２）は、本明細書に参考として引用する非特許文献７の図１にて解明されている。非特許文献７は、ヒト前骨髄細胞白血病ＨＬ−６０細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４０）のＤＭＳＯ誘発細胞から誘導したｃＤＮＡライブラリーからの、ｃＤＮＡをコードするヒトＢＰＩの単離を開示している。そのＤＭＳＯ誘発したＨＬ−６０細胞から誘導した新たに調製されたｃＤＮＡライブラリーからの度重なるＰＣＲ増幅は、第１５１位のアミノ酸が、バリンを特定するＧＴＣ（配列番号：１に示した）あるいはＧＴＧのいずれかのコドンである、ｃＤＮＡをコードするヒトＢＰＩの存在を示した。さらに、第１５１位にバリンを特定するＧＴＧを用いたｃＤＮＡが、第１８５位のアミノ酸がリシン（ＡＡＧ）（配列番号：１および２のように）あるいはグルタミン酸残基（ＧＡＧ）のいずれかを特定するものであることがわかっている。
【０００５】
ヒトＢＰＩホロタンパク質のＮ末端部分に対応するタンパク質分解断片は、自然に誘導された５５ｋＤａヒトＢＰＩホロタンパク質の抗菌効果を有している。Ｎ末端部分とは対照的に、単離したヒトＢＰＩタンパク質のＣ末端領域は、かすかに検出できるだけの抗菌活性を示すに過ぎないものであった。非特許文献８。ヒトＢＰＩホロタンパク質の最初の約１９９個のアミノ酸を含むＢＰＩＮ末端断片は、組換法により２３ｋＤａのタンパク質ろして生成された。非特許文献９。
【０００６】
ヒトのグラム陰性敗血症の治療のためのＢＰＩ生成物の計画された臨床応用では、安定で、均質な薬剤調製物への応用に適切な組換ＢＰＩ（ｒＢＰＩ）生成物を大量に生成するために相当の努力がなされている。
【０００７】
例えば、共同所有に係る、Ｇｒｉｎｎａによる係属中の米国特許出願Ｎｏ．０８／０７２，０６３は、培養基中での遺伝子的に形質転換された哺乳類宿主細胞で発現し、そこから分泌された組換ＢＰＩ生成物の精製のための方法を開示している。精製プロセスの効果は、ヒトＢＰＩの３１個のアミノ酸の「リーダー」配列と成熟タンパク質の最初の１９９個のアミノ末端残基（すなわち、配列番号：２の３１〜１９９のアミノ酸に対応する）をコードするＤＮＡを発現する形質転換したＣＨＯ細胞の生成物の程度にて立証されている。共同所有に係る、Ｔｈｅｏｆａｎ，ｅｔ ａｌによる係属中の米国特許出願Ｎｏ．０８／０６４，６９３は、ＢＰＩのリーダー配列と、免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするＤＮＡに融合したヒト ＢＰＩの１９１あるいは１９９位のアミノ末端残基のいずれかをコードするＤＮＡの発現の結果得られた、新規の、組換え生成したＢＰＩタンパク質類似体生成物に関する。
【０００８】
ヒトのグラム陰性敗血症の治療のための薬剤クラスのＢＰＩ生成物に向けた努力は、未だ満足の行く結果に至っていない。この主たる理由として、ヒトＢＰＩのアミノ酸配列固有の性質と生成物を生成する組換え宿主細胞が置かれた環境が挙げられる。一例として、形質転換したＣＨＯ宿主細胞の分泌物として生成される、ＢＰＩ［ｒＢＰＩ（１−１９９）］の最初の１９９残基を含む生物学的に活性なｒＢＰＩ生成物は、恐らく、良好な収率で精製されるであろう。しかしながら、単離したＢＰＩ生成物は、当初に、ＢＰＩの二量体形態ならびにシステイン付加物を含む。さらに、二量体および付加物の形成により、生理学的温度および ｐＨでの保管にて、ＢＰＩ生成物は不安定になる。生物学的活性は保持しているものの、かような二量体および付加物を、ヒトへ適用される薬剤組成物へ取り入れることは好ましくない。二量体の形成およびシステイン付加物の形成は、ＢＰＩの生物学的に活性なアミノ末端領域、すなわち、第１３２、１３５および１７５位に位置する、三つのシステインアミノ酸残基をＢＰＩが含んでいることによるものと思われる。三つのシステインの内の二つのシステインの間のジスルフィド単結合の形成は、宿主細胞の細胞質および／または細胞培養上清にてシステインを残さずに、二量体の形成およびシステイン付加物の形成を許容する。
【０００９】
単量体ｒＢＰＩ生成物であっても、かような生成物におけるカルボキシ末端残基の数に関して様々な微小不均質性の程度を示す。例えば、ｒＢＰＩ（１− １９９）をコードするＤＮＡで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞を含む培地にて、発現物質の全長を検出することは難しい。その代わりに、かような細胞から取得した発現生成物は、ｒＢＰＩのＮ末端断片のカルボキシ末端を切除した不均一な配置を示す。
【００１０】
実際のところ、予想される全長の生成物（１− １９９）は、不均一な配置におけるｒＢＰＩの中から検出されない場合の方が多い。ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物のカルボキシ末端アミノ酸配列の不均一性は、宿主細胞の細胞質および／または培養上清のカルボキシペプチダーゼの活性によるものと思われる。
【００１１】
薬剤レベルのＢＰＩ生成物の調製における他の問題点は、生成物の均質性ならびに活性を減少させる、肉眼で捉えられる粒子の形成にある。本発明のｒＢＰＩ生成物を含む好ましい薬剤組成物は、ポロキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー）界面活性剤とポリソルベート（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）界面活性剤の組み合わせを含む。かような組み合わせは、粒子形成に対して薬学的に
活性なポリペプチドを安定化せしめる相乗効果を得る目的で、共同所有に係る、係属中で、同時に出願された米国特許出願Ｎｏ．０８／０１２，３６０にて教示されている。ｒＢＰＩ生成物が、０．１重量％のポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８，ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，パルシパニィー、ニュージャージー州）および０．００２重量％のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０，ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．，ウィルミントン、デラウェア州）を含むクエン酸緩衝化生理食塩水（０．０２Ｍクエン酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）に、１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在させることが最も好ましい。
【００１２】
当該技術分野では、安定で均質な薬剤調製物に適切な改善されたｒＢＰＩ生成物が依然として必要とされている。かような生成物が形質転換した宿主細胞から高収率で理想的に取得でき、ＢＰＩの殺菌活性およびＬＰＳ−結合の生物学的活性を維持し、そして、二量体ならびにシステイン付加物の形成を抑止し、ひいては、カルボキシ末端の変異を限定する。
【非特許文献１】Ｒａｅｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０年）５９：ｐ．１２９−１７０
【非特許文献２】Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．（１９８７年）３８：ｐ．４１７−４３２
【非特許文献３】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９８９年）７：ｐ．３８９−３９８
【非特許文献４】Ｒｏｅｄｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．，Ｉｍｍｕｎ．（１９８９年）５７；ｐ．１０５４−１０５８
【非特許文献５】Ｅｌｓｂａｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７９年）２５４：ｐ．１１０００
【非特許文献６】Ｗｅｉｓｓ，ｅｔら，Ｂｌｏｏｄ，（１９８７年）６９：ｐ．６５２
【非特許文献７】Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９年）２６４：ｐ．９５０５
【非特許文献８】Ｏｏｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＥｘＰ．Ｍｅｄ．（１９９１年）１７４：ｐ．６４９
【非特許文献９】Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏｅｔ ａＬ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９２年）６０：ｐ．４７５４−４７６１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、以下の項を提供する：
項１．第１３２位あるいは第１３５位のシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質のポリペプチド類似体あるいはその生物学的に活性な断片；
項２．前記システイン残基を置換するアミノ酸が、アラニンおよびセリンからなるグループから選択された非極性アミノ酸である請求の範囲第１項に記載のポリペプチド類似体；項３．第１３２位のシステイン残基が、アラニンで置換される請求の範囲第１項に記載のポリペプチド類似体；
項４．第１３５位のシステイン残基が、セリンで置換される請求の範囲第１項に記載のポリペプチド類似体；
項５．殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の、第１３２位あるいは第１３５位のシステイン置換を除く、第１７６位から第１９９位の開始アミノ末端アミノ酸残基を含む請求の範囲第１項、第２項、第３項もしくは第４項に記載のポリペプチド類似体；
項６．殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の第１９３位のアミノ末端アミノ酸残基を含む請求の範囲第５項に記載のポリペプチド類似体；
項７．第１３２位あるいは第１３５位のシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質のポリペプチド類似体あるいはその生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ；
項８．３１個のアミノ酸リーダー配列ならびに殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の最初の１９３位のＮ−末端残基をコードし、第１９３位のロイシン残基のためのコドンの直後に続くコドンに続く停止コドンを有する請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ；
項９．３１個のアミノ酸リーダー配列ならびに殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の最初の１９９位のＮ−末端残基をコードし、第１９９位のイソロイシンのためのコドンの直後に続くコドンに続く停止コドンを有する請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ；
項１０．請求の範囲第７項に記載のＤＮＡを含む自律複製ＤＮＡ；
項１１．前記ポリペプチド類似体の宿主細胞での発現を許容する方法にて、請求の範囲第７項に記載のＤＮＡで安定的に形質変換あるいは形質転換された宿主細胞；
項１２．請求の範囲第１１項に記載の真核細胞；
項１３．ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１２４６およびＡＴＣＣ ＨＢ １１２４７からなるグループから選択されたＡＴＣＣ受託番号を有する請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞；
項１４．適切な培養培地で請求の範囲第１１項に記載の宿主細胞を生長させ、および前記宿主細胞あるいは前記培養培地からポリペプチド類似体を単離することを含む、殺菌性／
浸透性が向上したタンパク質のポリペプチド類似体あるいはその生物学的に活性な断片を製造する方法；
項１５．アミノ末端に請求の範囲第１項に記載の類似体ポリペプチドを、および、カルボキシ末端に免疫グロブリン重鎖あるいはその対立性変異体の少なくとも一つの定常領域を含むハイブリッド融合タンパク質；
項１６．請求の範囲第１５項に記載のハイブリッド融合タンパク質をコードするＤＮＡ；項１７．請求の範囲第１６項に記載のＤＮＡを含む自律複製ＤＮＡベクター；
項１８．前記融合タンパク質の宿主細胞での発現を許容する方法にて、請求の範囲第１６項に記載のＤＮＡで安定的に形質変換あるいは形質転換された宿主細胞；
項１９．適切な培養培地で請求の範囲第１８項に記載の宿主細胞を生長させ、および前記宿主細胞あるいは前記培養培地から前記類似体を単離することを含む、請求の範囲第１５項に記載のハイブリッド融合タンパク質を製造する方法；
項２０．請求の範囲第１項に記載のポリペプチド類似体および薬学的に許容される希釈剤、補助剤、あるいは担体を含む薬学的組成物；
項２１．請求の範囲第１５項に記載のハイブリッド融合タンパク質および薬学的に許容される希釈剤、補助剤、あるいは担体を含む薬学的組成物；
項２２．請求の範囲第２０項もしくは第２１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、細菌性疾患あるいはその後遺症を治療するための方法；
項２３．カルボキシ末端残基の第１９３位にロイシン残基を有する殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ；
項２４．３１個のアミノ酸リーダー配列ならびに殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の最初の１９３位のＮ−末端アミノ酸をコードし、第１９３位のロイシン残基のためのコドンの直後に続くコドンに続く停止コドンを有する請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡ；
項２５．請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡを含む自律複製ＤＮＡベクター；
項２６．宿主細胞での発現を許容する方法にて、請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡで安定的に形質変換あるいは形質転換された宿主細胞；
項２７．請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡで安定的に形質変換あるいは形質転換された宿主細胞を適切な培養培地で生長させ、および前記宿主細胞あるいは前記培養培地から前記断片を単離することを含む、生物学的に活性な殺菌性／浸透性が向上した断片を製造する方法。
【００１４】
本発明は、新規で、生物学的に活性で、組換え生成したＢＰＩ（ｒＢＰＩ）タンパク質、および二量体とシステイン付加体の形成を抑止し、薬学用途に非常に有用な生成物をもたらすタンパク質断片生成物を提供する。また、カルボキシ末端での低減した分子の不均一性によって特徴付けられたｒＢＰＩ生成物を提供される。ｒＢＰＩ生成物および類似体をコードする新規ＤＮＡ配列、このＤＮＡを含むプラスミドベクター、このプラスミドで安定に形質転換あるいは形質変換された宿主細胞、組換え調製法、安定な薬剤組成物、および治療方法もが本発明によって提供される。
【００１５】
本発明の一態様によると、第１３２あるいは１３５位のアミノ酸位置にあるシステインが、他のアミノ酸、好ましくは、セリンあるいはアラニンのような非極性アミノ酸で置換されたＢＰＩのＮ末端断片を含むｒＢＰＩタンパク質類似体が提供される。本発明の好ましい態様において、ＢＰＩの最初の１９９個のＮ末端残基を含むポリペプチドの第１３２位のシステイン残基が、「ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２」と称する組換え生成物のアラニン残基によって置換される。また、本発明の好ましい態様では、ＢＰＩの最初の１９９個のＮ末端残基を含むポリペプチドの第１３５位のシステイン残基が、「ｒＢＰＩ（１−１９９）ｓｅｒ１３５」と称する組換え生成物のセリンによって置換される。カルボキシ末端残基の同一性に関する低減された不均一性によって特徴付けられる、「ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２」と称する組換え生成物が非常に好ましい。また、本発明の好ましい態様では、ＢＰＩの最初の１９３個のアミノ末端残基を含み、第１９３位のロ
イシンのためのコドンの直後に停止コドンを有するポリペプチドが教示されている。
【００１６】
本発明の他の態様によると、上記したｒＢＰＩタンパク質および類似生成物を含めたタンパク質断片生成物をコードするＤＮＡ配列が提供される。かようなＤＮＡ配列は、３１残基のＢＰＩリーダー配列とＢＰＩポリアデニル化シグナルもコードする。
【００１７】
また、上記した生成物ならびに類似体をコードするＤＮＡを含む自律複製ＤＮＡプラスミドベクターと、そのＤＮＡが十分に発現を許容する方法で該ＤＮＡで安定に形質転換あるいは形質変換した宿主細胞も提供される。本発明による形質転換あるいは形質変換した宿主細胞は、本発明のｒＢＰＩタンパク質生成物の大規模製造において非常に有用な手段である。
【００１８】
本発明は、アミノ末端に本発明のｒＢＰＩタンパク質類似体、そしてカルボキシ末端に免疫グロブリンの重鎖の定常領域あるいはその対立性変異体を含む、融合タンパク質の形態のｒＢＰＩタンパク質類似体も意図している。ＢＰＩ／免疫グロブリン融合タンパク質の天然配列は、その開示を参考までに本明細書に取り込んだ、共同所有に係る、Ｔｈｅｏｆａｎ，ｅｔ ａｌによる係属中の米国特許出願Ｎｏ．０８／０６４，６９３にて教示されている。さらに、本発明は、上記した融合タンパク質の製造方法も意図している。
【００１９】
ＢＰＩのＮ末端アミノ酸の約１７６から約１９８のアミノ酸を有する生物学的に活性なｒＢＰＩタンパク質断片生成物をコードするＤＮＡも本発明の範疇にある。これらＤＮＡは、生成物がカルボキシ末端にて低減された不均一性を示すよう、ＣＨＯ細胞のような真核宿主細胞でのＢＰＩ生成物の生成を許容する。ＢＰＩの１９３個のＮ末端残をコードするＤＮＡ（例えば、ＢＰＩの３１個のアミノ酸リーダー配列、最初の１９３個のＮ末端アミノ酸、および１つ以上の停止コドンをコードするＤＮＡ）が目下のところ好ましい。第１３２位あるいは第１３５位のシステインのいずれかが置換されたタンパク質（例えば、ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２）を付加的にコードするＤＮＡが最も好ましい。
【００２０】
最後に、本発明は、薬学的に許容される希釈剤、補助剤および担体に、本発明のｒＢＰＩタンパク質生成物を含む、安定で、均質な薬剤組成物も提供する。かような薬剤組成物は、ｒＢＰＩ生成物粒子の形成を抑止する。このような組成物は、内毒素関連ショック症状、ならびに散在性血管凝固、貧血、血小板減少症、白血球減少症、成人呼吸障害症候群、腎不全、低血圧症、発熱、および代謝酸血症などのそれに関連する１種以上の症状を含む、グラム陰性細菌感染症およびその後遺症の治療において有用である。
【００２１】
本発明の無数の他の態様ならびに利点は、本発明の好ましい態様を記載した以下の発明の詳細な説明を考慮すれば、当業者であれば容易に想到できるものと思われる。
【００２２】
発明の詳細な説明 以下の詳細な説明は、システイン残基でのアミノ酸置換および／または高度に均質化されたカルボキシ末端を含む様々なｒＢＰＩ生成物の製造と特性に関する。具体的には、実施例１は、ＢＰＩタンパク質の例示的なＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列に塩基置換をもたらす例示的な手段、およびかように変異させた配列のプラスミドベクターへの導入に関する。実施例２は、適切な宿主細胞への実施例１のベクターの導入、および本発明の組換えＢＰＩタンパク質ポリペプチド生成物の発現についてさらに記述している。実施例３は、本発明のシステイン置換した類似体生成物をコードするＤＮＡの構築、およびｉｎｖｉｔｒｏでの転写／翻訳過程におけるその使用に関する。実施例４は、本発明のｒＢＰＩ生成物ポリペプチドの特性に関する。
【実施例】
【００２３】
（実施例１）
（ＢＰＩのシステイン置換類似体を含むベクターの構築）
（Ａ．プラスミドｐＩＮＧ４５１９とｐＩＮＧ４５２０の構築）
発現ベクターｐＩＮＧ４５０３を、ｒＢＰＩ（１−１９９）と称する組換え発現生成物をコードするＤＮＡ源として、すなわち、第１５１位のバリンがＧＴＣよりもむしろＧＴＧで特定され、また第１８５位の残基が（ＡＡＧで特定される）リシンよりむしろ（ＧＡＧで特定される）グルタミン酸であることを除いて、配列番号：１および２に説明したような、３１残基のシグナル配列と成熟したヒトＢＰＩのＮ末端の最初の１９９個のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ源として用いた。
【００２４】
プラスミドｐＩＮＧ４５０３は、本発明の背景に関する参照のために採用した、共同所有に係る、係属中のＴｈｅｏｆａｎ，ｅｔ ａｌによる米国特許出願Ｎｏ．０８／０６４，６９３に記載されている。要約すれば、ｐＩＮＧ４５０３の構築は、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサー要素、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウィルス（Ａ−ＭｕＬｖ）ＤＮＡからのＬＴＲエンハンサー・プロモーター要素、発現しようとする遺伝子の５’端のＳＶ４０ １９Ｓ／１６Ｓ連結ジャンクション、および発現しようとする遺伝子の３’端のヒトゲノミックガンマ−１ポリアデニル化部位を含むプラスミド ｐＩＮＧ２２３７Ｎに基づいている。プラスミドｐＩＮＧ２２３７Ｎは、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）での選択が可能なマーカーも有している。天然の５’非翻訳領域の３０ｂｐ、３１個のアミノ酸シグナル配列をコードする塩基、ならびにＢＰＩの１９９個のＮ末端アミノ酸を含んだ、ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡを、ｐＩＮＧ４５０３の独特のＳａｌＩおよびＳｓｔＩＩ制限部位の間に挿入した。
【００２５】
二つのベクター、ｐＩＮＧ４５１９およびｐＩＮＧ４５２０は、ＢＰＩの自然に発生した三つのシステイン残基の一つを他のアミノ酸と置換したｒＢＰＩ（１− １９９）システイン置換類似体の発現のためのｐＩＮＧ４５０３に基づいて構築した。ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡに一度だけ発生し、第１３２ 位のシステインと第１３５位のシステインの間に位置するＰｖｕＩＩ部位（ＣＡＧＣＴＧ）をこれらの構築に用いた。ｐＩＮＧ４５０３には他にも幾つかの ＰｖｕＩＩ部位があるので、ｐＩＮＧ４５０３から、ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードする挿入体を含んだＳａｌＩ−ＳｓｔＩＩ断片を、ＳａｌＩとＳｓｔＩＩ で消化することでまず単離する必要がある。精製したＳａｌＩ−ＳｓｔＩＩ ｒＢＰＩ（１−１９９）挿入体を、次に、ＰｖｕＩＩで消化し、個別に精製された、約５２９ｂｐのＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩ断片と、約２０９ｂｐのＰｖｕＩＩ− ＳｓｔＩＩが得られた。
【００２６】
プラスミドｐＩＮＧ４５１９は、アラニンのためのコドンが第１３２位の本来のシステインを特定するコドンに置換されているｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡ挿入体をｐＩＮＧ４５１９が含んでいる以外は、ｐＩＮＧ４５０３と同一である。上記したように、宿主細胞発現とその挿入体の分泌過程による組換え生成物を、「ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２」と称した。ｐＩＮＧ４５１９を生成するために、 ３０ｂｐのＢＰＩ非翻訳領域の５’端にＳａｌＩ制限部位を挿入したプライマーＢＰＩ−６：ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＧＴ（配列番号：３）、およびＰｖｕＩＩの半分と第１３２位にアラニンをコードするために必要な塩基置換を含んだＢＰＩ−１４：ＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧ （配列番号：４）を用いて、ＢＰＩＤＮＡ配列をｐＩＮＧ４５０３をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅は、製造業者の説明書に従って、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｒｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、ノウォーク、コネチカット州）を用いて行った。
【００２７】
得られたＰＣＲ断片はＳａｌＩで消化して、約５２９ｂｐのＳａｌＩ鈍化した断片が得られ、これは上記した約２０９ｂｐのＰｖｕＩＩ− ＳｓｔＩＩ断片とｐＩＮＧ４５０３のＳａｌＩとＳｓｔＩＩによる消化で得られた大きな断片と共に、ｐＩＮＧ４５１９を得
るために三片接合した。
【００２８】
プラスミドｐＩＮＧ４５２０は、セリンコドンが第１３５位の本来のシステインを特定するコドンに置換されているｒＢＰＩ（１−１９９）類似体をコードするＤＮＡ挿入体をｐＩＮＧ４５２０が含んでいる以外は、ｐＩＮＧ４５１９と同一である。上記したように、宿主細胞発現による組換え生成物を、「ｒＢＰＩ（１ −１９９）ｓｅｒ１３５」と称した。ｐＩＮＧ４５２０を生成するために、選択マーカーがＤＨＦＲに代えてｇｐｔであること、 ｃＤＮＡ挿入体がシグナル配列と、ｒＢＰＩ（１−１９９）の一部に代えてＢＰＩ全長（４５６残基）をコードすることを除けば、実質的にｐＩＮＧ４５０３と同様のプラスミドであるｐＩＮＧ４５１３からＢＰＩＤＮＡはＰＣＲ増幅される。
【００２９】
５’端に変異したＰｖｕＩＩ部位（”ＣＴＧ”が”ＣＴＣ”に変化している）の半分と第１３５位にセリンをコードするために必要な塩基置換を含んだプライマーＢＰＩ−１５：ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣ（配列番号：５）と、１９９位のＢＰＩ残基をコードする領域の下流に位置するｒＢＰＩをコードする配列を意味するプライマーＢＰＩ−７：ＧＡＡＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＧＴＣＧ（配列番号：６）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。このＰＣＲ断片を、 １３５位のシステインの変異部位の下流を切断するＢｓｔＢＩで消化し、得られた約１００ｂｐの切断したＢｓｔＢＩ断片をゲル精製した。上記した５２９ｂｐ のＳａｌＩ− ＰｖｕＩＩＢＰＩ制限断片、１００ｂｐの切断したＢｓｔＢＩ断片、およびｐＩＮＧ４５０３のＢｓｔＢＩ−ＳａｌＩ消化により得られた大きな断片を用いて、 ｐＩＮＧ４５２０を生成するために三片接合を行った。
【００３０】
（Ｂ．プラスミドｐＩＮＧ４５３０の構築）
ｐＩＮＧ４５１９のようにアラニンからシステインへの置換を含み、ｐＩＮＧ４５０３からｐＩＮＧ４５１９に運ばれたＤＨＦＲマーカーに代えて（マイコフェノール酸耐性を許容する）ｇｐｔ選択可能なマーカーを含む他のベクター、ｐＩＮＧ４５３０を構築した。ｐＩＮＧ４５３０を構築するために、１６２９ｂｐのＳａｌＩ−ＤｒａＩＩＩ制限断片が、ｐＩＮＧ４５１９から単離された。この断片は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２のコード領域をすべて、ならびにこのコード領域の３’末端での約８９５ｂｐのベクター配列を含んでいる。この断片は、ｐＩＮＧ４５３０を生成するために、ｐＩＮＧ４５１３から単離された大きな（約７２３０ｂｐ）ＤｒａＩＩＩ−ＳａｌＩベクター断片に接合した。
【００３１】
（Ｃ．プラスミドｐＩＮＧ４５３３の構築）
ＢＰＩシグナル配列の５番目のアミノ酸である、−２７位のメチオニン（ＡＴＧ）を特定するコドンを、Ｋｏｚａｋの定常翻訳開始配列 ＧＣＣＡＣＣＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号：７）［Ｋｏｚａｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１５：８１２５（１９８７）］との関連で置換し、ＢＰＩシグナルの最初の四つのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を削除して、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の発現のためのプラスミドｐＩＮＧ４５３３を構築した。ＢＰＩシグナルの−２７位のＡＴＧ（メチオニン）の前にＳａｌＩ制限部位およびヌクレオチドＧＣＣＡＣＣを組み込んだＰＣＲプライマーＢＰＩ−２３：ＡＣＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣ（配列番号：８）、およびｒＢＰＩ（１−１９９）コード配列の３’端に対応するプライマーＢＰＩ−２：ＣＣＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ（配列番号：９）を用いて、［ｐＧＥＭ−７ｚｆ （＋）中の］ヒトＢＰＩ ｃＤＮＡの全長を含むプラスミドからＢＰＩ配列のＰＣＲ増幅によって構築を行った。約７００ｂｐのＰＣＲ増幅したＤＮＡをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＢＰＩ（１−１９９）コード配列の約１／３を含む２７０ｂｐの得られた断片を精製した。このＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｇｐｔマーカーを含む ｐＩＮＧ４５３３を生成するために、（１）１３２位のシステインをアラニンで置換したＢＰＩ（１−１９９）の残部をコードするｐＩＮＧ４５１９からの ４２０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｓ
ｓｔＩＩ断片、および（２）ｐＩＮＧ４５０２からの約８０００ｂｐのＳｓｔＩＩ−ＳａｌＩベクター断片（３０ｂｐの５’非翻訳配列を含まず、ＤＨＦＲよりもむしろｇＰｔマーカーを有することを除けば実質的にｐＩＮＧ４５０３と同様のベクター）の二つの断片と接合した。
【００３２】
（Ｄ．プラスミドｐＩＮＧ４２２１、ｐＩＮＧ４２２２、およびｐＩＮＧ４２２３の構築）
シグナル配列の−２７位のメチオニン残基に対応する至適なＫｏｚａｋの翻訳開始部位と、システインからアラニンへの１３２位での置換を含む挿入体を有する ｐＩＮＧ４５３３と同様のベクターを構築した。しかしながら、これら構築体では１９３位残基にて、ＢＰＩ断片がコードする配列は終了している。上記したように、このＤＮＡの宿主発現から得られた組換え生成物は、「ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２」と称した。これら挿入体を含むベクターは、ＢＰＩのＤＮＡ挿入体の５’端を切断する、ＳａｌＩでまずｐＩＮＧ４５３３を消化し、１９２位残基の３’側に覆い被さる３ｂｐを残すＡｌｗＮＩ で消化することで作製される。そして、得られた約７００ｂｐの断片は精製された。この断片は、二つのアニールした相補性オリゴヌクレオチド、ＢＰＩ− ３０：ＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣ（配列番号：１０）およびＢＰＩ−３１：ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴ（配列番号：１１）によって、 ＳｓｔＩＩ−ＳａｌＩでのｐＩＮＧ４５３３消化から得られた大きな断片へ再接合された。これは、ＡｌｗＮＩとＳｓｔＩＩ部位の間の領域を、１９３位の残基（ロイシン）のためのコドン、停止コドン、およびＸｈｏＩ制限５’部位と共にＳｓｔＩＩ部位に置換し、ＡｌｗＮＩとＳｓｔＩＩ部位双方を再生し、また、１９３位のアミノ酸（ロイシン）のためのコドン（ＣＴＧ）の直後に停止コドンとＴＡＧを置くことになる。得られたプラスミドをｐＩＮＧ４２２３と称し、ｇＰｔマーカーを有していた。異なる選択マーカーを用いてベクターを生成するために、異なるＳｓｔＩＩ−ＳａｌＩベクター断片が用いられていることを除けば、ｐＩＮＧ４２２３のために記載された方法と同じくして同様の構築体が作製される。例えば、ｇｐｔマーカーの代わりに（ヒスチジノールに耐性を付与する）ｈｉｓマーカーを含むことを除けば、ｐＩＮＧ４２２１はｐＩＮＧ４２２３と同一であり、また、ｇｐｔの代わりにＤＨＦＲマーカーを含むことを除けば、ｐＩＮＧ４２２２はｐＩＮＧ４２２３と同一である。
【００３３】
（Ｅ．プラスミドｐＩＮＧ４５３７、ｐＩＮＧ４１４３、ｐＩＮＧ４１４６、 ｐＩＮＧ４１５０、およびｐＩＮＧ４１５４の構築）
ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードする挿入体、至適化されたＫｏｚａｋの翻訳開始部位、ＳｓｔＩＩ部位の３’端のヒトゲノミックガンマ１重鎖のポリアデニル化および転写終了領域が、ヒト軽鎖ポリアデニアル化配列、続いてマウス軽鎖（カッパ）ゲノミック転写終了配列で置換されていることを除いて実質的にｐＩＮＧ４２２１、 ｐＩＮＧ４２２２およびｐＩＮＧ４２２３と同一である異なる選択マーカーを含んだ一連のベクターが構築された。並行した遺伝子発現の研究にて、軽鎖ポリアデニアル化シグナルおよび転写終止領域は、Ｓｐ２／０およびＣＨ０−Ｋ１細胞でのＢＰＩ発現レベルの２．５〜５倍の増大に寄与しているものと思われる。
【００３４】
上記したベクターの構築は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２挿入体を含んだｐＩＮＧ４５３３と同様のベクターであるｐＩＮＧ４５３７をまず構築することから始めた。しかしながら、ｐＩＮＧ４５３７は、ヒト重鎖配列に代えて、ヒト軽鎖ポリアデニアル化配列を含んでいる。マウスカッパ３’配列は、ヒト軽鎖ｃＤＮＡをコードする発現ベクターであるｐＩＮＧ３１７０から取得され、マウスゲノミック軽鎖３’転写終止配列を含んでいる。これは、マウス軽鎖停止コドンの３５ｂｐ上流を切断するＳｓｔＩで消化し、切断端を作成するためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、マウスカッパ３’配列を含む約１３５０ｂｐ の断片を精製することで達成される。得られた断片は、ヒト軽鎖定常領域ｃＤＮＡの３’部分の約２５０ｂｐと、Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３９：３５２１（１９８７）にてΔ８と称されている構築体にて記載されているＢａｍ ＨＩリンカーが続くポリアデニル化シグナルから構成されている。約１３５０ｂｐ断片の残りの部分は、転写終止配列を供給するＢｇｌＩＩ−Ｂａｍ ＨＩマウスカッパ３’ゲノミック断片〔Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：３８３８（１９８６）の断片”Ｄ”〕から構成されている。この断片は、ＢＰＩ挿入体の全部とＳｓｔＩＩでの消化、Ｔ４ポリメラーゼ処理、および（ＢＰＩ挿入体の全部とベクターの一部を含む）ＮｏｔＩ消化により得られたベクターの一部を含む３０４４ｂｐ断片であるｐＩＮＧ４５３３と、約４５７４ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片の二つの断片による三片接合に用いた。得られたベクター、ｐＩＮＧ４５３７は、上記したゲノミック３’非翻訳領域の相違点を除いて ｐＩＮＧ４５３３と同一である。
【００３５】
カッパ３’非翻訳配列を含む他のベクターを、カッパ３’断片の入手源としてｐＩＮＧ４５３７を用いて構築した。カッパ３’非翻訳配列を、ＸｈｏＩ（ＢＰＩ 停止コドンの直後に生じる独特の部位）とＢａｍ ＨＩによるｐＩＮＧ４５３７の消化により単離された。ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードする挿入体をすべてが含み、また、シグナルの−２７位残基に至適化されたＫｏｚａｋの翻訳開始部位を有している以下の４つのベクターを生成するために、得られた約１３６０ｂｐのＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片を三片接合に用いた。すなわち、（１）４５７４ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片（ｇｐｔマーカー）であるｐＩＮＧ４２２３、約３０１９ｂｐの断片を含むＮｏｔＩ− ＸｈｏＩＢＰＩ挿入体であるｐＩＮＧ４２２３、およびＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片であるｐＩＮＧ４５３７の接合により得られたＰＩＮＧ４１４３（ｇｐｔマーカー）、（２）約４１５９ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片（ＤＨＦＲマーカー）であるｐＩＮＧ４２２２、約３０１９ｂｐの断片を含むＮｏｔＩ−ＸｈｏＩＢＰＩ挿入体であるｐＩＮＧ４２２３、およびＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片である ｐＩＮＧ４５３７の接合により得られたｐＩＮＧ４１４６（ＤＨＦＲマーカー）、（３）約４７７２ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片を含むｐＩＮＧ４２２１ ｈｉｓ、断片を含むＮｏｔＩ− ＸｈｏＩＢＰＩ挿入体であるｐＩＮＧ４２２２、およびＸｈｏＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片であるｐＩＮＧ４５３７の接合により得られたｐＩＮＧ４１５０（ｈｉｓマーカー）、および（４）約４０４２ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＢｓａＩ断片を含むｐＩＮＧ３１７４ ｎｅｏ、約３８８３ｂｐの断片を含むＢｓａＩ−ＸｈｏＩＢＰＩ挿入体であるｐＩＮＧ４２２１、およびＸｈｏＩ −Ｂａｍ ＨＩ断片であるｐＩＮＧ４５３７の接合により得られたｐＩＮＧ４１５４（ｎｅｏマーカー）である。プラスミドｐＩＮＧ３１７４は、抗体重鎖ＤＮＡをコードする挿入体ならびにｎｅｏマーカーを含んでいる。ｎｅｏ遺伝子とその開裂配列は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７（１９８２）にて報告されているｐＳｖ２ ｎｅｏプラスミドから取得した。
【００３６】
（Ｆ．プラスミドｐＩＮＧ４１１４およびｐＩＮＧ４１５１の構築）
ｒＢＰＩコード配列の発現が、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウィルス（Ａ−ＭｕＬｖ）ＬＴＲプロモーターに代えてヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）の直接の初期エンハンサー／プロモーターの制御下にあることを除けば、ｐＩＮＧ４１４３とｐＩＮＧ４１５０のそれぞれと同一であるｐＩＮＧ４１４４と ｐＩＮＧ４１５１の二つのプラスミドを構築した。よって、ｐＩＮＧ４１４４とｐＩＮＧ４１５１の双方は、第１３２位でのシステインからアラニンへの変異、至適化されたＫｏｚａｋ翻訳開始配列、およびヒト軽鎖ポリ−Ａ／マウスカッパゲノミック転写終止領域を含んでいる。当初のベクター（ｐＩＮＧ４１４３と ｐＩＮＧ４１５０）の第８７９位から第１７０８位のヌクレオチド領域を、本明細書に参考までに採り入れた、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ４１：５２１（１９８５）の図３に見られるように、第−５９８位から第＋１７４位のヌクレオチドに対応するｈＣＭＶエンハンサー／プロモーターの領域と置換した。ＢＰＩ発現ベクターにｈＣＭＶプロモーター領域に導入するために、抗体軽鎖挿入体の発現を進めるｈＣＭＶプロモーターを含むプラスミドｐＩＮＧ２２５０からの断片を含む約１０５４ｂｐのＥｃ
ｏＲＩ−ＳａｌＩ／ｈＣＭＶプロモーターで、ｐＩＮＧ４２２２の断片を含む約１１１７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ／Ａ−ＭｕＬｖ プロモーターでまず置換することで、プラスミドｐＩＮＧ４５３８を構築した。ｐＩＮＧ４１４４を構築するために、三つの断片を接合した。すなわち、（１） ｐＩＮＧ４５３８のＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片を含む約２９５５ｂｐのｒＢＰＩ（１−１９３）、（２）ｐＩＮＧ４５３７からの約１３６０ｂｐのＸｈｏＩ− Ｂａｍ ＨＩ、および（３）ｐＩＮＧ４２２１からのｈｉｓ遺伝子を含む約４７７０ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片である。
【００３７】
（Ｇ．プラスミドｐＩＮＧ４１４５、ｐＩＮＧ４１４８、およびｐＩＮＧ４１５２の構築）
第１３２位のアラニン置換に代えて野性型（自然配列）のシステインを含むことを除けば、ｐＩＮＧ４１４３、ｐＩＮＧ４１４６、およびｐＩＮＧ４１５０と同一である、プラスミドｐＩＮＧ４１４５、 ｐＩＮＧ４１４８、およびｐＩＮＧ４１５２を構築した。よって、これら三つのプラスミドは、ｒＢＰＩ（１−１９３）挿入体、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、およびヒト軽鎖ポリＡ／マウスカッパゲノミック転写終止領域を含んでいた。これら三つのプラスミドは、以下のようにして構築した。 ｐＩＮＧ４１４５を構築するために、三つの断片を接合した。すなわち、（１）（第１３２位に野性型システインが含まれていることを除けば、 ｐＩＮＧ４２２１と同一である）ｐＩＮＧ４１４０からの断片を含む約３０００ｂｐのＮｏｔ Ｉ−ＸｈｏＩＢＰＩ（１−１９３）、（２）ｐＩＮＧ４５３７からの約１３６０ｂｐのＸｈｏＩ− Ｂａｍ ＨＩ断片、および（３）ｐＩＮＧ４２２２からのＤＨＦＲ遺伝子を含む約４１５０ｂｐの Ｂａｍ ＨＩ− Ｎｏｔ Ｉ断片である。ｐＩＮＧ４１５２を構築するために、三つの断片を接合した。すなわち、（１）（第１３２位に野性型システインが含まれていることを除けば、ｐＩＮＧ４２２３と同一である）ｐＩＮＧ４１４２からの断片を含む約３０００ｂｐのＮｏｔＩ− ＸｈｏＩ断片、（２）ｐＩＮＧ４５３７からのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片、および（３）ｐＩＮＧ４２２１からのｈｉｓ遺伝子を含む約４７７０ｂｐのＢａｍ ＨＩ−Ｎｏｔ Ｉ断片である。
【００３８】
以下の表１は、上記ＡからＧの節にて記載したプラスミドの内容を要約したものである。
【００３９】
【表１−１】
【００４０】
【表１−２】
【００４１】
【表１−３】
【００４２】
【表１−４】
（実施例２）
（ｒＢＰＩのシステイン置換類似体の発現のための細胞の形質変換）
哺乳類細胞は、その好適な分泌、保持力、および発現タンパク質の翻訳後の修飾を許容
するので、哺乳類細胞は、本発明のｒＢＰＩタンパク質類似体の生成のための好適な宿主である。目下のところ、本発明の類似体の生成のための好適な哺乳類宿主細胞には、ＣＨ０−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）；ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、コロンビア大学のＬａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士よりいただいたＣＨＯ Ｔｏｒｏｎｔｏのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損［ＤＨＦＲ−］変異株、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士よりいただいたＣＨＯ−Ｋ１のＤＨＦＲ−変異株であるＣＨＯ−ＤＢＸ−１１、Ｖｅｌｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８１）、幼ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）およびＮＳＯ骨髄腫（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）のような、繊維芽細胞およびリンパ球由来の細胞が含まれる。
【００４３】
哺乳類細胞の形質変換は、様々な方法で実施できる。一般的な方法として、宿主細胞によって取り上げられる発現ベクターＤＮＡの燐酸カルシウム沈澱による方法がある。他の方法では、強力な電磁場で作られた膜孔を通してＤＮＡを採取する細胞を作り上げるエレクトロポレーション［（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１６．３０−１６．３１ １９８９）］がある。形質変換した細胞の選択は、選択された条件下で形質変換した細胞が生存し、生長することを許容する生成物の遺伝子の発現ベクターへの組み込みによって達成できる。 かような遺伝子のいくつかが同定されている。それには、次のようなものが含まれる。（１）ｎｅｏ、アミノグリコシド抗菌性Ｇ４１８への耐性をコードする原核細胞遺伝子、（２）キサンチンの存在下でマイコフェノール酸（ＭＰＡ）への耐性をコードするＥ．ｃｏｌｉグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、［Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２−２０７６（１９８１）］、（３）ヌクレオシドの欠乏下でのＤＨＦＲ−細胞の生長と、メトトレキセートの増大した濃度の下での遺伝子増幅を許容するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、（４）ヒスチジノルの存在下での生長を許容する Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｒｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの ｈｉｓＤ遺伝子［Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４７−８０５１（１９８８）］、（５）インドールの存在下で（トリプトファン無しに）の生長を許容するＥ．ｃｏｌｉのｔｒＰＢ遺伝子［Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４７−８０５１（１９８８）］、および（６）グルタミンを欠いた培地での生長を許容するグルタミンシンターゼ遺伝子などがある。
【００４４】
これら選択可能なマーカーの単独あるいは様々な組み合わせの利用は、高レベルでの組換え生成物の発現を許容する哺乳類細胞の調製を自在ならしめる。
【００４５】
（Ａ．ｐＩＮＧ４５３３でのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換）
プラスミドｐＩＮＧ４５３３は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２をコードする遺伝子配列、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、ヒトガンマ−１重鎖３’非翻訳領域、およびＭＰＡ−耐性細胞の選択のためのｇｐｔマーカーを含む。
【００４６】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞系は、グルタミン／ペニシリン／ストレトマイシン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、イルビン、カリフォルニア州）を補充し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を足したＨａｍのＦ１２培地で維持した。これら細胞は、 ＮｏｔＩでまず消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱したｐＩＮＧ４５３３
ＤＮＡの４０μｇでエレクトロポレーションして形質変換した。エレクトロポレーションに続いて、細胞を非選択性ＨａｍのＦ１２培地で２４時間かけて再生した。そして、この細胞をトリプシン処理し、ＭＰＡ（２５μｇ／ｍｌ）とキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ
）を補充したＨａｍのＦ１２培地で５×１０４細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、そして、９６ウェルプレートにて、１０４細胞／ウェルの割合で置いた。形質変換していないＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＭＰＡによるピリミジン合成の阻害のために、この培地では生長しなかった。
【００４７】
２週間後に、形質変換した細胞からなるコロニーが、９６ウェルプレートにて観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、標準としてｒＢＰＩ（１−１９９）を用いた抗ＢＰＩ ＥＬＩＳＡによるＢＰＩ反応性タンパク質の存在に関して分析を行った。
【００４８】
この分析にて、イムロン−ＩＩ ９６ウェルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社、チャンティリー、バージニア州）を、アフィニティー精製したウサギ抗ｒＢＰＩ（１−１９９）抗血清で前被覆した。上清試料を添加し、アフィニティー精製し、ビオチン化したウサギ抗ｒＢＰＩ（１−１９９）抗血清とペルオキシダーゼ標識したアビジンを用いて検出を行った。
【００４９】
この方法で、約８００のコロニーをスクリーニングした。 最大の生成が認められた３１個のコロニーを、生成効率の評価を行うために２４ウェルプレートに移した。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＨａｍのＦ１２培地を用いて２４ウェルプレートにて、集合体が形成されるまで生長させた。細胞が、一旦、集合体を形成すれば、ＨａｍのＦ１２培地を除去し、そして、共同所有に係る、係属中のＧｒｉｎｎａによる米国特許出願Ｎｏ．０８／０７２，０６３にあるように、殺菌したＳ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）の ４Ｏμｌを足した１ｍｌの血清を含まないＨＢ−ＣＨＯ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加した。この細胞を、７日間インキュベートしてから、Ｓ−セファロースビーズを除去し、１０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．５）中の０．１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。Ｔｒｉｓ緩衝液中の１．０Ｍ塩化ナトリウムを添加してビーズから生成物を溶出し、そして、上記したようにＥＬＩＳＡで定量した。Ａ１３５と命名した、最高の生成能力が認められた形質転換体は、この分析にて約３μｇ／ｍｌの転換体の分泌を示し、血清を含まないＥｘｃｅｌｌ３０１培地（ＪＲＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、レナクサ、カンサス州）での生長に適していた。適合する細胞は、Ｓ−セファロースビーズが入ったＥｘｃｅｌｌ３０１培地を用いた
１．５Ｌ醗酵にて生長した。Ｓ−セファロースビーズ（５０ｍｌ分画）から溶出した生成物のＣ４ ＨＰＬＣ分析により、生産効率を、１２０から１４０時間にわたって分析した。醗酵のこの段階での生産効率は、１５から２５μｇ／Ｌであった。
【００５０】
（Ｂ．ｐＩＮＧ４２２２でのＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の形質変換）
プラスミドｐＩＮＧ４２２２は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、ヒトガンマ−１重鎖３’非翻訳領域、およびヌクレオシドを含まない培地での形質転換した細胞の選択のためのマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【００５１】
ＣＨＯ ＤＧ４４細胞系は、グルタミン／ペニシリン／ストレトマイシンを補充し、１０％ＦＢＳを足したＨａｍのＦ１２培地で維持した。これら細胞は、 Ｗｅｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７）のカルシウム沈澱法を用いて、直線化したｐＩＮＧ４２２２ ＤＮＡ（ＰｖｕＩで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱した４０μｇ）で形質変換した。カルシウム沈澱に続いて、細胞を約１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置き、ヌクレオシド（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を欠いたαＭＥＭ培地、および透析したＦＢＳ（６０００−８０００の分子量基準で、４Ｌの冷たい０．１５Ｍ塩化ナトリウムに対して、１６時間、４℃で透析した１００ｍｌの血清）を足した選択培地で生長させることで形質転換体を得た。
【００５２】
形質変換していないＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、ＤＨＦＲ変異および透析した血清が足された培地にヌクレオシドが欠けていたため、この培地では生長しなかった。
【００５３】
２週間後に、約２から３個のコロニーが、各ウェルで観察された。９６ウェルプレートのウェルからの上清を、上記Ａ節で述べたＥＬＩＳＡにより、ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２の存在に関して分析した。２４個の生産効率の最も良好なクローンを、ＤＮＡをコードするｒＢＰＩ類似体の遺伝子増幅を誘発するために、０．０５Ｍのメトトレキセートを足した選択用αＭＥＭ培地が入った２４ウェルプレートに入れた。生長の観察過程にて、細胞を新しい２４ウェルプレートに移し、 ｐＩＮＧ４５３３／ＣＨＯ−Ｋ１形質転換体に関する上記Ａ節でのＳ−セファロース溶出物から生産効率を分析した。五つの最も高い生産効率を示すクローンが組み合わされ、９６ウェルプレートでの限定希釈によりサブクローニングした。単一コロニーを含む上清を、ＥＬＩＳＡにより、ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２のレベルに関して分析を行った。次に、２０個の生産効率の最も良好なサブクローンを２４ウェルプレートに入れ、０．４μＭのメトトレキセートの存在下でさらに増幅せしめ、そして、増幅した細胞による生成物の発現レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。最高の生成体である、クローン４、７５および８０は、Ｓ−セファロースを含む２４ウェルプレートにて、７日間で、２５から３７μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。
【００５４】
（Ｃ．ｐＩＮＧ４２２３およびｐＩＮＧ４２２１でのＳｐ２／Ｏ細胞の形質変換）
所望のｒＢＰＩ生成物の至適な発現を行うために適用する手法は、第一マーカーでの第一発現プラスミドを有する細胞の形質変換、最高の生成体のスクリーニング、および異なる第二マーカーを有する第二の発現プラスミドを用いたスクリーニングした生成体の形質変換を含む。この手法を、Ｓｐ２／Ｏ細胞を用いた場合について、下記する。
【００５５】
プラスミドｐＩＮＧ４２２３は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、ヒトガンマ−１重鎖３’非翻訳領域、およびＭＰＡ−耐性細胞の選択のためのｇｐｔマーカーを含む。
【００５６】
Ｓｐ２／Ｏ細胞系は、グルタミン／ペニシリン／ストレトマイシンを補充し、１０％ＦＢＳを足したＤＭＥＭ培地で維持した。これらＳｐ２／Ｏ細胞は、 ＮｏｔＩで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱したｐＩＮＧ４２２３ ＤＮＡの４０μｇを用いたエレクトロポレーションで形質変換した。エレクトロポレーションに続いて、非選択性ＤＭＥＭ培地で４８時間置いて再生した。細胞を遠心分離し、ＭＰＡ（６μｇ／ｍｌ）とキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ）を足したＤＭＥＭ培地中に５×１０４細胞／ｍｌの濃度にまで再懸濁し、そして、１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置いた。形質変換していないＳｐ２／Ｏ細胞は、ＭＰＡによるピリミジン合成の阻害のために、この培地では生長しなかった。１．５から２週間後に、形質転換した細胞を含むコロニーが、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルの上清を、ＥＬＩＳＡによって、生成物反応性タンパク質の存在に関して分析した。最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移し、グルココルチコイド受容体との相互作用の結果として、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターによる発現の増大を招く、１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェルプレートでの停止した細胞生長から生産効率を測定した。最高の生成体であるクローン２×３は、デキサメトサンの有無により、それぞれ、約２μｇ／ｍｌと７μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。
【００５７】
形質変換体の選択のためのｈｚｓ遺伝子を含むｐＩＮＧ４２２１を用いたエレクトロポレーションにより、クローン２×３を形質変換した。１０％ＦＢＳを足したＤＭＥＭ培地での４８時間にわたる再生に続いて、６μｇ／ｍｌ ＭＰＡ、２５０μｇ／ｍｌキサンチ
ン、および８ｍＭヒスチジノールを足したＤＭＥＭ／ＦＢＳ中に、約１０４個の細胞／ウェルになるように、９６ウェルプレートに細胞を置いた。形質変換していない細胞は、ＭＰＡおよびヒスチジノールの存在下では生長しなかった。 １．５から２週間後に、形質転換した細胞が、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ｒＢＰＩ反応性タンパク質の存在に関して分析した。
【００５８】
最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移した。１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェル培養での停止した細胞生長から生産効率を測定した。最高の生成体であるクローン２×３−１３０は、デキサメトサンの有無により、それぞれ、約１５μｇ／ｍｌと３０μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。次に、単離物を、９６ウェルプレートにて限界希釈法によってサブクローニングした。単一コロニーを含むウェルを、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、最高の生成体を、１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェル培養にて再試験した。最高の生成サブクローンであるＮｏ．２５は、デキサメトサンの有無により、それぞれ、約１６μｇ／ｍｌと３３μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。
【００５９】
（Ｄ．ｐＩＮＧ４１４３およびｐＩＮＧ４１５０でのＳｐ２／Ｏ細胞の形質変換）
プラスミドｐＩＮＧ４１４３は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、ヒトガンマ−１重鎖３’非翻訳領域、およびＭＰＡ−耐性細胞の選択のためのｇｐｔマーカーに沿ったマウスカッパ軽鎖３’非翻訳領域を含む。Ｓｐ２／Ｏ細胞は、ＮｏｔＩで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱したｐＩＮＧ４１４３ ＤＮＡの４０μｇを用いたエレクトロポレーションで形質変換した。エレクトロポレーションに続いて、非選択性ＤＭＥＭ培地で４８時間置いて再生した。細胞を遠心分離し、ＭＰＡ（６μｇ／ｍｌ）とキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ）を足したＤＭＥＭ培地中に５×１０４細胞／ｍｌの濃度にまで再懸濁し、そして、１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置いた。約２週間後に、形質転換した細胞を含むコロニーが、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移した。１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェルプレートでの停止した細胞生長から生産効率を測定した。最高の生成体であるクローン１３４は、デキサメトサンの有無により、それぞれ、約１２μｇ／ｍｌと２８μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。
【００６０】
Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、マウスガンマ−１軽鎖３’非翻訳領域、および形質転換体の選択のためのｈｉｓ遺伝子を含むプラスミドｐＩＮＧ４１５０をベクターとしたエレクトロポレーションでクローン１３４を形質変換した。エレクトロポレーションに先行して、ベクターをまず消化し、フェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱した。１０％ＦＢＳを足したＤＭＥＭ培地で４８時間置いて再生した後、６μｇ／ｍｌのＭＰＡ、２５０μｇ／ｍｌのキサンチン、および８ｍＭのヒスチジノールを足したＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地中に１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置いた。形質変換していない細胞は、ＭＰＡおよびヒスチジノールの存在下では生長しなかった。約２週間後に、形質転換した細胞が、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ反応性タンパク質の存在に関して分析した。最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移した。１０−７Ｍ のデキサメトサンの有無により、２４ウェル培養での停止した細胞生長から生産効率を測定した。最高の生成体であるクローン１３４−１１は、再消化した Ｃ１７７０であった。クローンＣ１７７０は、デキサメトサン欠乏下で、３６μｇ／ｍｌの生成物を分泌し、またデキサメトサン存在下で、４２μｇ／ｍｌを越える量の生成物を分泌した。このクローン（ｃ１７７０）は、受託番号ＨＢ １１２４７として、メリーランド州、２０８５２、ロックヴィル、１２３０１パークロウンドライブに所在のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。
【００６１】
（Ｅ．ｐＩＮＧ４１４３でのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を、ｐＩＮＧ４５３３によるＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換のための、上記Ａ節に記載した方法により、ｐＩＮＧ４１４３で形質変換した。約２週間後に、単一コロニーを含む約８００個のウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。約９から １３μｇ／ｍｌの生成物を分泌する最高の生成体は、醗酵時の生長のための血清を含まない培地に適用されうる。ｒＢＰＩ生成物を高レベルで生成する細胞系を提供するために、選択マーカーとしてｈｉｓあるいはｎｅｏを有するｐＩＮＧ４１５０あるいはｐＩＮＧ４１５４のようなベクターを用いて再度形質変換する。
【００６２】
（Ｆ．ｐＩＮＧ４１４４でのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換）
Ａ−ＭｕＬｖプロモーターの代わりにヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを含むことを除けば、プラスミドｐＩＮＧ４１４４は、ｐＩＮＧ４１４３と同様である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を、上記Ａ節に記載した方法により、ｐＩＮＧ４１４４で形質変換した。約２週間後に、単一コロニーを含む約２００個のウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最高の生成体を、２４ウェルプレートに移し、酪酸ナトリウムを入れた２４ウェルプレートにてｒＢＰＩ発現を決定した。この分析にて、最高の生成体（クローン１７４）は、酪酸塩の欠乏下で約３から５μｇ／ｍｌの生成物を、また５ｍＭ酪酸塩の存在下で約１５から１８μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。クローンＣ１７７１と改めて命名したこのクローンは、受託番号ＣＲＬ
１１２４６として、メリーランド州、２０８５２、ロックヴィル、１２３０１パークロウンドライブに所在のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。最高の生成体は、醗酵時の生長のための血清を含まない培地に適用されうる。 ＢＰＩ生成物を高レベルで生成する細胞系を提供するために、選択マーカーとしてｈｉｓあるいはｎｅｏを有する、ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのＢＰＩ遺伝子を含む、ｐＩＮＧ４１５１あるいはｐＩＮＧ４１５５のようなベクターを用いて再度形質変換されうる。
【００６３】
（Ｇ．ｐＩＮＧ４１４３でのＮＳＯ細胞の形質変換）
ＮＳＯ細胞を、ｐＩＮＧ４１４３を用いたエレクトロポレーションで形質変換した。
約３週間後に、形質変換した細胞からなるコロニーが、９６ウェルプレートにて観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、 ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最高の生成体を、２４ウェルプレートに移した。生産効率を、細胞の生長が停止した２４ウェル培養にて測定した。最高の生成体は、１５から１６μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。最高の生成体は、より生成能の優れた生成体を得るために、上記したようにして、ｐＩＮＧ４１５０のようなベクターで再度形質変換されうる。
【００６４】
（Ｈ．ｐＩＮＧ４１４３でのＮＳＯ細胞の形質変換）
ベクターｐＥＥ１３［Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９−１７５（１９９２）］にクローニングされた至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列に融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡを含むｐＩＮＧ４１３２を用いたエレクトロポレーションによってＮＳＯ細胞を形質変換した。ベクターｐＥＥ１３は、グルタミンが欠乏した培地でも生長できる形質変換体を選択するためのグルタミン合成遺伝子を含んでいる。
【００６５】
約３週間後に、形質変換した細胞からなるコロニーが、９６ウェルプレートにて観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって分析した。
最高の生成体を、２４ウェルプレートに移した。生産効率を、細胞の生長が停止した２４ウェル培養にて測定した。７から１５μｇ／ｍｌの生成物を２４ウェル培養で分泌した最
高の生成体は、様々な濃度のメチオニンスルホキシミンの存在下での増幅に適用されうる。
【００６６】
（Ｉ．ｐＩＮＧ４１４５でのＳｐ２／０細胞の形質変換）
プラスミドｐＩＮＧ４１４５は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、マウスカッパ軽鎖３’非翻訳領域、およびＭＰＡ−耐性細胞の選択のためのｇｐｔ遺伝子を含む。 Ｓｐ２／Ｏ細胞は、Ｎｏｔ Ｉで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱したｐＩＮＧ４１４５ ＤＮＡの４０μｇを用いたエレクトロポレーションで形質変換した。エレクトロポレーションに続いて、非選択性ＤＭＥＭ培地で４８時間置いて再生し、細胞を遠心分離し、ＭＰＡ（６μｇ／ｍｌ）とキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ）を足したＤＭＥＭ培地中に５×１０４細胞／ｍｌの濃度にまで再懸濁した。そして、１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置いた。約２週間後に、形質転換した細胞を含むコロニーが、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移し、１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェルプレートでの停止した細胞生長から生産効率を測定した。ＢＰＩの発現を最高ならしめるために、最高の生成体であるＳｐ２／Ｏ形質転換体は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードする遺伝子配列、および形質転換体の選択のためのｈｉｓ遺伝子を有するマウスカッパ軽鎖３’非翻訳領域を含むベクターを用いたエレクトロポレーションによって形質変換されうる。
【００６７】
（Ｊ．ｐＩＮＧ４１４５でのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を、上記Ａ節に記載した方法により、ｐＩＮＧ４１４５ＤＮＡで形質変換した。約２週間後に、単一コロニーを含む約５００から８００個のウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最高の生成体を２４ウェルプレートに移し、Ｓ−セファロースを含む２４ウェルプレートにてＢＰＩ発現を決定した。この最高の生成体は、次に、醗酵時の生長のための血清を含まない培地に適用されうる。ｒＢＰＩ生成物を高レベルで生成する細胞系を提供するために、異なる選択マーカーを含むベクターを用いて、これらは再度形質変換されうる。
【００６８】
（Ｋ．昆虫細胞からのｒＢＰＩ生成物の発現）
ｒＢＰＩ生成物が発現しうる他の真核細胞系は、ｒＢＰＩ生成物をコードするＤＮＡを含む組換えバキュロウィルスで感染した昆虫細胞である。組換えウィルスを生成し、またそこからの組換え生成物の発現を達成するシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）が、通常利用されている。 ３１個のアミノ酸シグナル配列を含むｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡは、ｐＢ１ｕｅＢａｃ転移ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＮｈｅＩ部位にクロ−ニングされる。Ｓｆ９昆虫細胞（ＢＲＬ社、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）を、このベクターと、野性型ＡｃＭＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ多核ポリヒドロシスウィルス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて共形質変換した。組換えウィルスプラークを同定し、精製し、そして、 ＢＲＬ社から入手した実験説明書に従って、より高い力価の組換えウィルス性株を生成するために用いた。
【００６９】
組換え生成したバキュロウィルスを、Ｓｆ９細胞をさらに感染するために用いた。これを行うために、８つの６０ｍｍ皿に置いたＳｆ９細胞を、バキュロウィルスで感染させた。感染した細胞を入れた皿から培地を回収することで、日中の間に、異なる時間に８つの各皿から試料を採取した。試料が回収されると、培地を １０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離し、その上清を４℃で保管した。４ｍｌのＰＢＳで一度細胞を洗浄し、そして、氷上で３０分間インキュベートして、 １００μｌ／皿のＮＰ４０溶菌緩衝液（１％ＮＰ４
０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０）で溶菌した。そして細胞を、細胞掻き取り器で、エッペンドルフ管に回収した。細胞溶解物を、２分間、マイクロ遠心分離した。溶解物の上清を、新しい管に移し、そして、−２０℃で保管した。毎日の採取時間に得られた培地試料は、ＥＬＩＳＡによってＢＰＩ含量が分析され、そして、溶解物を抗−ＢＰＩ抗体を用いたウェスターン法によって解析した。
【００７０】
感染後１から４日の培地のＥＬＩＳＡ分析においては、ｒＢＰＩ生成物は検出されなかった。しかしながら、感染後５から６日目では、培地試料から、２００− ５００ｎｇ／ｍｌのｒＢＰＩ生成物のピークが検出された。溶解物のウェスターン分析は、感染後２日目の試料にて、約２３ＫｄのＢＰＩ−反応性バンドが認められた。このバンドは、６日目の試料まで強度を高めながら認められた。
【００７１】
下記表２は、上記ＡからＪ節での形質変換の内容をまとめたものである。
【００７２】
【表２】
（実施例３）
（ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２およびｒＢＰＩ（１−１９９）Ｓｅｒ１３５のｉｎ ｖｉｔｒｏ での転写および翻訳のためのプラスミドの構築）
ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡの源としてのプラスミドｐＩＣ１２７を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳の研究を行った。ｐＩＣ１２７の構築は、以下のようにして行った。３１個のアミノ酸シグナル配列を含むｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡを、ｐＧＥＭ−７２ｆ（＋）にあるＢＰＩをコードするｃＤＮＡの全長を含んだプラスミドからＰＣＲ増幅した。プライマーＢＰＩ−３：ＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＣＧＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣ（配列番号：１２）およびＢＰＩ−２： ＣＣＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ（配列番号：９）を用いて、ｒＢＰＩをコードする配列の３’端にＸｈｏＩとＳｓｔＩＩ部位を、また、５’端にＳａｌＩ部位が組み込まれるようにして増幅を行った。得られたＰＣＲ増幅した断片は、ｐＩＣ１０２を生成するために、プラスミドｐＴ７Ｔ３ １８ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）のマルチプルクローニング領域のＳｍａＩ部位にその切断端をクローニングした。
【００７３】
ｒＢＰＩ（１−１９９）および３１個のアミノ酸シグナルをコードするｐＩＣ１０２挿入体を、Ｂａｍ ＨＩとＡｓＰ ７１８１を用いたプラスミドの消化により切り出した。
Ｂａｍ ＨＩ部位は、ｐＩＣ１０２のＳａｌＩ部位を、また、ＡｓＰ ７１８Ｉ部位はｐＩＣ１０２のＳｓｔＩＩ部位をそれぞれ切断した。切り出した断片の末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化され、そして、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩでまず消化され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化したプラスミドｐＧＥＭ１（ＰｒｏＭｅｇａ社、マジソン、ウィスコンシン州）へその平滑化断片はクローニングされる。得られた構築体はｐＩＣ１２４と命名され、５’端がｐＧＥＭ１のＳｐ６プロモーターに近接するよう置かれた挿入体をコードするｒＢＰＩ（１−１９９）を有している。
【００７４】
ｐＩＣ１２４挿入体の３１個のアミノ酸シグナル配列は、ｐＩＣ１２７を生成するために、ｐＩＣ１２４の二つのＨｉｎｃＩＩ部位の間の領域を削除することで切り出した。切り出した領域は、開始コドン（ＡＴＧ）とＢＰＩの最初のアミノ酸をコードする配列を復元するリンカーで置換した。ＨｉｎｃＩＩおよび ＳｓｔＩＩを用いたｐＩＣ１２４消化から二つの断片が単離された。すなわち、（１）最初のアミノ酸を除くｒＢＰＩ（１−１９９）コード領域を含む ＨｉｎｃＩＩ−ＳｓｔＩＩ断片、および（２）そのプラスミドの他の部分を含むＳｓｔＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片である。 ＢＰＩコード配列での最初のコドンならびにＢＰＩ配列の前のメチオニンのためのコドンを、二つの相補性ヌクレオチド、ＢＰＩ−２８： ＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣ（配列番号：１３）およびＢＰＩ−２９：ＧＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣ（配列番号：１４）から形成したリンカーを用いて挿入した。これら二つのオリゴヌクレオチドは、ｐＩＣ１２７を形成するために、ｐＩＣ１２４からのＨｉｎｃＩＩ−ＳｓｔＩＩ断片およびＳＳｔＩＩ− ＨｉｎｃＩＩ断片で共に連結した。
二つのプラスミド、ｐＭＬ１０１およびｐＭＬ１０２を、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２およびｒＢＰＩ（１−１９９）Ｓｅｒ１３５のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳のためにｐＩＣ１２７を用いて構築した。
【００７５】
これを行うために、ＳａｌＩとＥｃｏ ＲＩでｐＩＣ１２７を消化し、大きなＳｓｔＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片を精製した。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２挿入体を含むｐｍＬ１０１を構築するために、ｐＩＮＧ４５１９からのＥｃｏ ＲＩ−ＳｓｔＩＩを、ｐＩ１２７からのＳｓｔＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片に連結した。ｒＢＰＩ（１−１９９）Ｓｅｒ１３５挿入体を含むｐＭＬ１０２を構築するために、ｐＩＮＧ４５２０からのＥｃｏ ＲＩ−ＳｓｔＩＩを、ｐＩ１２７からのＳｓｔＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片に連結した。
【００７６】
ＰｒｏＭｅｇａ社（マジソン、ウィスコンシン州）の網状赤血球溶解システムと組み合わせたＴＮＴ ＳＰ６を用いて、ｒＢＰＩ（１−１９９）、ｒＢＰＩ（１−１９９）Ｓｅｒ１３５およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２を、 ｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミドｐＩＣ１２７、ｐＭＬ１０６、およびｐＭＬ１０２から発現させた。このシステムは、真核生物翻訳システムを用いて、クローニングした遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写と翻訳の組み合わせを可能ならしめる。組み合わせた転写／翻訳のそれぞれは、標識したタンパク質を生成するための３５Ｓ− メチオニンを含み、全量２５μｌ中の２μｇのプラスミドＤＮＡを用いて、製造業者の実験説明書に従って行った。標識したタンパク質を、５μｌずつ、 ２０μｌの尿素試料緩衝液に添加し、そして、９５℃で、３分間加熱した。各試料の画分（１０μｌ）を、ＤＤＴ（５０ｍＭ）を使用あるいは使用せずして、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルポリアミドゲルに適用した。ゲルを固定して乾燥した後、標識したタンパク質バンドを、オートラジオグラフィーで視覚化した。オートラジオグラフィーの結果は、ｒＢＰＩ（１−１９９）、ｒＢＰＩ（１−１９９）ｃｙｓ１３５およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２をコードするｃＤＮＡが、ＢＰＩＮ末端断片の約２３Ｋｄの予想された大きさのタンパク質生成物を発現したことを実証したのである。さらに、三つの発現したすべての生成物、ｒＢＰＩ（１−１９９）、ｒＢＰＩ（１−１９９）ｃｙｓ１３５およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２が、ＤＴＴによる還元で消失する、ＢＰＩ（１−１９９）の二量体に関して予想していた以上の大きな分子量ならびに分子種を
生成できる。ｒＢＰＩ（１−１９９）ｃｙｓ１３５およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２における二量体生成物の発現が、細胞を含まないｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳システムを用いた結果によるものと考えられる。
【００７７】
このようなシステムでは、細胞における翻訳にて通常発生する、適切な翻訳後の処理、保存等を維持できない。よって、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムでは適切なジスルフィド結合は形成されず、場合によっては、二量体の形成に至る可能性がある。
上記したｉｎ ｖｉｔｒｏ発現システムにて生成した標識付けしたタンパク質を、ＬＰＳ結合活性について試験した。マイクロタイタープレートのウェルを、ｐＨ ９．４の０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３／２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）中のＳａｌｍｏｎｒｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ７（Ｒｄ変異体）（メタノール保管培養基中の５ｍｇ／ｍｌ）からのＬＰＳ（５０μｌウェルの全量で２μｇのＬＰＳ）で被覆した。４℃で、一晩インキュベートした後、ウェルを水で洗浄し、３７℃で乾燥した。次に、ウェルを２１５μｌの Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを用いて、３７℃で、３時間ブロックした。ブロック溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ− ２０で洗浄した。ｒＢＰＩ試料を、ＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎに全量が５０μｌ（翻訳反応物の２μｌ）となるよう添加した。
【００７８】
４℃ で、一晩インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで三回洗浄し、各ウェルに残った標識したタンパク質の量を、液体シンチレーションカウンターで決定した。その結果は、ほぼ等価のＬＰＳ結合が、上記した三つのすべてのＢＰＩ種にとって代わっていたことが実証された。ｒＢＰＩ（１−１９９）は４８，６９０ｃｐｍの結合を、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２は５９，９１１ｃｐｍの結合を、またｒＢＰＩ（１−１９９）ｃｙｓ１３５は５２，５３７ｃｐｍの結合を示し、上記した数値のそれぞれは、３回の決定値の平均を示す。対照（ＤＮＡ無し）の平均結合値は、５，３９５ｃｐｍであった。
【００７９】
（実施例４）
（生成物の特徴）
（Ａ．物理的特徴）
ｒＢＰＩの生成物の特徴付けを、逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣ、陽イオン交換（ＭＡ７Ｃ）ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および電子噴射イオン化質量分光測定法（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて実施した。
【００８０】
特徴付けを行うｒＢＰＩ生成物を、ローラボトルあるいは１０Ｌの醗酵槽収穫機から、単段階精製手段あるいは多段階精製手段のいずれかによって特徴付けた。単段階精製手段は、本明細書にて参考として組み込んだ、共同所有に係る、係属中のＧｒｉｎｎａによる、第二洗浄工程も備えた、米国特許出願Ｎｏ． ０８／０７２，０６３にて実質的に開示されたものである。要約すれば、ｒＢＰＩ生成物を含む成長培地に、Ｓ−セファロースビーズが添加されている。Ｓ−セファロースは培地から除去され、ｐＨ４．０にて、２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムで洗浄される。第二の洗浄は、ｐＨ４．０にて、 ２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび７００ｍＭ塩化ナトリウムで行われる。精製したｒＢＰＩ生成物を、ｐＨ４．０にて、２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび １７００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出する。
【００８１】
多段階精製は、上記したようにしてまず個別に精製したｒＢＰＩ生成物の精製を含む。単段階精製法で２０のｒＢＰＩ生成物の各々を精製した後、各ｒＢＰＩ生成物を貯蔵し、２００ｍＭにまで貯蔵生成物の塩濃度を希釈する。そして、貯蔵した試料を、Ｓ−セファロースカラムに負荷し、ｐＨ４．０にて、２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２００ｍＭ塩化ナトリウムに続いて７００ｍＭ塩化ナトリウムで洗浄する。ｐＨ４．０にて、２０ｍＭ酢
酸ナトリウムおよび１０００ｍＭ塩化ナトリウムを用いて、ｒＢＰＩ生成物を溶出した。そして、精製したｒＢＰＩ生成物を、その物理的特徴を決定するために分析した。
【００８２】
（１．ｒＢＰＩ生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
ｒＢＰＩ生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、１４％ポリアクリルアミドゲルおよび、還元あるいは非還元条件下でのｔｒｉｓ−グリシン緩衝液システムを用いて実施した。視覚化のためにクーマシーブルーあるいは銀染色のいずれかによって、タンパク質バンドを染色した。
【００８３】
図１に示したように、非還元ｒＢＰＩ（１−１９９）は、約２３Ｋｄに主要なバンドが、また、約４０Ｋｄに小さなバンドが認められる。この主要なバンドは、同時に行った標準との比較からｒＢＰＩ（１−１９９）と同定され、また、小さなバンドは、免疫染色によってｒＢＰＩ（１−１９９）の二量体であると同定された。 ｒＢＰＩ（１−１９９）の個別の試料に１／２０容量の０．４Ｍジチオトレイトール（ＤＤＴ）を添加することで、上記したような非還元条件下にて同定された ｒＢＰＩ（１−１９９）の２３Ｋｄの二量体種に対応する単一の明確なバンドを示した。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、還元条件下で単一の２３Ｋｄ ｒＢＰＩ（１−１９９）と共に移動する単一のバンドを示された。非還元条件下では、（２３Ｋｄのバンドに対応する）ｒＢＰＩ（１−１９９）について認められる近接する二つのバンドの迅速な移動にあわせて、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２が移動した。図２に示したように、これら結果は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２が精製後には単量体の形態で存在することを示すものである。このように、システイン残基がアラニンで置換されたｒＢＰＩ生成物は、二量体の形成に対して顕著な抵抗性を示した。
【００８４】
（２．ｒＢＰＩ生成物の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析）
ＭＡ７Ｃカラムを用いた陽イオン交換ＨＰＬＣも、ｒＢＰＩ生成物の二量体の程度を測定するために使用した。４０％緩衝液Ｂ（２０ｍＭＭＥＳ、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ ５．５）で、１．０ｍｌ／分で平衡化したＢｉｏ−Ｒａｄ ＭＡ７Ｃカートリッジ（４．６×３０ｍｍ、Ｂｉｏ−ＲａｄカタログＮｏ．１２５−００５５６）を使用した。ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物を、１ｍｌの試料を、１００μｇ／ｍｌにまで希釈し、２００μｌの希釈試料をカラムに注入して分析した。ｒＢＰＩを、４０から１００％の緩衝液Ｂの勾配で、６分間にわたって溶出した。緩衝液Ａは、ｐＨ ５．５にて２０ｍＭ ＭＥＳを含んでいた。２２９ｎｍにて吸収度を測定した。
【００８５】
ｒＢＰＩ（１−１９９）の分析にて、二つのピークが現れた。最初のピークは、図３に示すように、約３分間の保持時間で溶出されたものであった。第二のやや小さいピークは、約６分間にて溶出されたものであった。図３に示すように、最初のピークは、ｒＢＰＩ（１−１９９）単量体であり、また、図３の第二のピークは、精製した単量体および二量体標準の保持時間との比較から、ｒＢＰＩ（１−１９９）の二量体であると決定された。カラムに注入する前にＤＴＴで試料を還元した場合には、第二の（二量体）ピークは認められなかった。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の溶出パターンを決定するために、同じ手順を踏んだ。 図４に示したように、ｒＢＰＩ（１−１９９）単量体ピークについて認められたピークに対応する保持時間にて、単一のピークが認められる。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２試料にて、二量体に関するデータは得られなかった。
【００８６】
（３．ｒＢＰＩ生成物の逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣおよび電子噴射）
イオン化質量分光測定法による分析 ｒＢＰＩ生成物の微小な不均一性が、逆相ＨＰＬＣおよび電子噴射イオン化質量分光測定法（ＥＳＩ−ＭＳ）によって示された。ＨＰＬＣ分析のために、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＢＵ−３００ Ｃ４カラムを、流速０．５ｍｌ／分で、３７％移動相Ｂ（８０％アセトニトリル／ ０．６５％ＴＦＡ）で平衡化した。ｒＢＰ
Ｉ（１−１９９）の試料（各１ｍｌ）を、１００μｌ／ｍｌにまで希釈し、その５０ｍｌを注入した。カラムを、 ２．５分間にわたって３７％移動相Ｂで洗浄し、３７から５０％の移動相Ｂの勾配で、２０分間にわたって溶出した。移動相Ａは、５％アセトニトリル
／０．１％ＴＦＡであり、２２０ｎｍで吸収度を測定した。
【００８７】
ｒＢＰＩ生成物の逆相ＨＰＬＣでの結果を、図５に示した。第二ピークの先端に部分的に崩れた第一（小さな）ピークを伴う第二（主要）ピークとして、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物は溶出した。第二ピークに対応するピークだけが、ＤＴＴで還元すれば、カラムから溶出した。
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物を分析するために、同じ手順を踏んだ。図６に示したように、上記した第二（主要）ピークに対応する単一ピークとして、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２は溶出した。
【００８８】
三つの異なるｒＢＰＩ（１−１９９）からの、上記した第一および第二ＨＰＬＣピークに対応する溶出液は単離され、ＥＳＩ−ＭＳによる含量の決定のために分析された。ｒＢＰＩ（１−１９９）からの第二（主要）ピークを生成する溶出液の分析では、１９９個のアミノ酸タンパク質について予想された質量よりもわずかに小さい質量が示された。これらデータは、第二ピーク溶出液に認められるほとんどの質量が、１−１９３ ｒＢＰＩタンパク質断片に対応していることを示している。しかしながら、１−１９８から１−１９４の大きさの他の種も認められる。
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２に関してＨＰＬＣから取得された単一ピークを生成する溶出液の分析は、上記した第二（主要）ピークを生成する溶出液から取得したデータと同様のものであった。これらデータは、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物の切り詰めたカルボキシ末端を示すペプチドマッピングのデータと符合する。
【００８９】
ｒＢＰＩ（１−１９３）生成物に関して同じ分析を行ったところ、顕著に低減されたＣ−末端の不均一性が認められた。ｒＢＰＩ（１−１９３）生成物に関して得られたＥＳＩ−ＭＳデータは、ＢＰＩＮ末端のアミノ酸の１９１、１９３、あるいは１９３（＋Ｎ末端アラニン）のアミノ酸のいずれかを含んだ、約８５％のタンパク質含量を示した。その結果を、下記表３に示した。
【００９０】
【表３】
ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡは全長のタンパク質（すなわち、ＢＰＩ Ｎ−末端の１−１９９のアミノ酸）を生成しないが、ｒＢＰＩ（１−１９３）をコードするＤＮＡは著量のｒＢＰＩ（１−１９３）タンパク質を生成することを、これらデータは実証している。これらデータおよび他のデータから、ｒＢＰＩをコードするＤＮＡを切り詰めた形態とすることで、不均一性の顕著な減少と、意図したタンパク質（すなわち、挿入したＤＮＡがコードしたもの）の生成が増大する一方で、至適な殺菌性とＬＰＳ−結合活性が維持される。第１７５位のアミノ酸残基であるシステインを越えないように、発現しようとするＤＮＡを切断することが、発現生成物の不均一性を顕著な低減をもたらすものと思われる。ＢＰＩ Ｎ−末端の最初の１７６個のアミノ酸からＢＰＩ Ｎ−末端の最初の１９３個のアミノ酸の範囲のｒＢＰＩをコードする切断したＤＮＡの発現生成物も、十分な殺菌性とＬＰＳ−結合活性を保持することが期待される。
ＥＳＩ−ＭＳデータも、ｒＢＰＩ生成物のアミノ末端での微小な不均一性の存在を示した。アミノ末端にアラニン残基を有するｒＢＰＩ生成物の形態が知見され、そして、トリプシンペプチドの配列決定によって確認された。
【００９１】
図５に示したように、第一（小さな）逆相ＨＰＬＣピークを生成した溶出液のＥＳＩ−
ＭＳ研究は、各質量値が約１１９−１２０ｋＤａ大きいことを除けば、それが、第二（主要）
ピークを形成するタンパク質と同様の質量分布を有するタンパク質であることを示した。これらデータは、上記した第一（小さな）逆相ＨＰＬＣピークを生成した溶出液が、質量値の均質な移動に寄与する、ジスルフィド結合したシステイン付加物を含むことを示唆している。
【００９２】
ｒＢＰＩ（１−１９９）によって形成された第一（小さな）逆相ＨＰＬＣピークがシステイン付加物によるものとする仮説を試験するために、モル数的にほぼ等価の遊離メルカプト基に結合するエルマン試薬（ジチオニトロ安息香酸、ＤＴＮＢ）にｒＢＰＩ（１−１９９）を曝した。かような処理をすることで、ｒＢＰＩ （１−１９９）の１モル当たりに１モルに満たない遊離メルカプト基があることが実証された。ＢＰＩ（の第１３２、１３５および１７５位）に、三つのシステイン残基があったと仮定した場合、ｒＢＰＩ生成物には分子間のジスルフィド結合もあるということ、あるいはメルカプト基の二つが立体的に利用できない、とする考えをこれら結果は支持することになる。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２は、エルマン試薬とは反応性を示さなかった。
【００９３】
（４．ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物の保存安定性）
２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液、０．１％ポロキサマー、および０．００２％ポリソルベート８０を含むｐＨ５．０の緩衝液中のｒＢＰＩ（１−１９９）の試料（１ｍｇ／ｍｌ）を、好ましいとされる保管温度２から８℃と、高めの保管温度２２℃と３７℃で、８週間にわたってその保存安定性を決定すべく分析を行った。
表４に示した、２から８℃での保存の結果は、二量体の割合の（１％から４％への）増大が示されているが、システイン付加物あるいは試料中の粒子形成において顕著な増大は認められなかった。
【００９４】
【表４】
しかしながら、２２℃と３７℃の高めの保管温度の場合、試料中の二量体と粒子が飛躍的に増大し、システイン付加物の量も緩やかながらも増えている。これら結果を、表５に示した。さらに、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２を２２から３７℃で保存した場合、二週間保存した後でも二量体は検出されなかった。同様の条件下で、ｒＢＰＩ（１−１９９）は顕著な増大を示した。
【００９５】
【表５】
（５．ｒＢＰＩ薬剤組成物の濁度）
薬剤組成物を含む様々なｒＢＰＩの濁度を決定するための実験を行った。この実施例にて、濁度とは薬剤組成物の崩れ（すなわち、タンパク質の三次元構造の喪失）、および／または粒子形成（大きな（＞１０μｍ）粒子を形成する各タンパク質間の相互作用）に関係する程度を指す。試験した薬剤組成物は、クエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）、あるいは０．１％ポロキサマー１８８（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーを含むポロキサマー界面活性剤）および０．００２％ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含むポリソルベート界面活性剤）を含むクエン酸緩衝液中のいずれかにある、ｒＢＰＩ（１−１９９）、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２あるいはｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２のいずれかを含んでいた。上述したように、ポロキサマー／ポリソルベート界面活性剤系の組み合わせの使用は、本明細書に参考までに取り入れた、共同所有に係る、ＭｃＧｒｅｇｏｒ，ｅｔ ａｌによる、係属中の、１９９３年２月１日に出願された米国特許出願Ｎｏ． （代理人整理番号２７１２９／３１１６２）に教示されたような薬剤組成物を安定ならしめるのである。
【００９６】
ｐＨ７．０あるいは５．０での上昇した温度にて、経時的な濁度を決定するために試料を分析した。分析に先駆けて、ｐＨ ７．０で、５０ｍＭ燐酸カリウムあるいは２０ｍＭクエン酸緩衝液のいずれかで、すべての試料を、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度にまで希釈した。循環水用水槽に温度制御したキュベットホルダーを備えた、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１６０ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、プラサントン、カリフォルニア州）に適用するために、試料を石英キュベットに置くことから濁度の測定は始まった。所望の温度（５７℃、６５℃あるいは８５℃、下記参照）にまでキュベットホルダーを平衡させ次第、試料が適当な濃度にまで希釈されたかどうかを確認するために、２８０ｎｍで吸
収度を測定した。これに続いて、吸収度の経時的な変化を決定するために、３５０ｎｍでの試料の吸収度を２分ごとに１時間にわたって計測した。
【００９７】
その結果を図７に示した。図７にて「製剤化した」とは、ｒＢＰＩ生成物が上記したポロキサマー／ポリソルベートの組み合わせを含むクエン酸緩衝液中にあること、そして、「非製剤化」とは、単にクエン酸緩衝液中にｒＢＰＩ化合物があることを意味する。濁度の低率での変化（すなわち、計測中の吸収度の低率での増大）は、粒子の崩壊と形成に対する安定性の増大を意味する。図７に示したように、上記した界面活性剤の組み合わせを添加することで、試験したすべての組成物の安定性（粒子形成と崩壊に対する抵抗性）がもたらす結果となった。 さらに、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２およびｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２は、先の界面活性剤の組み合わせの有無にかかわらず、野性型組成物の場合からして、粒子形成と崩壊に対する抵抗性が非常に改善されていた。ｐＨ５．０と６５℃、ｐＨ５．０と７５℃および８５℃の各条件でも、同様の結果が得られた。
【００９８】
総合すれば、界面活性剤の組み合わせおよび／またはシステインの削除は、野性型ＢＰＩ（１−１９９）Ｎ−末端構造を有し、および／または界面活性剤を含まない組成物と比較して、試験期間において、また温度上昇を伴っても、それによる安定性の顕著な増大が認められた。
【００９９】
（Ｂ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の特徴）
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、ＬＰＳへ生成物を結合することにより、ＬＡＬ阻害分析によって、また、生成物の殺菌性強度により決定した。
【０１００】
（１．ＬＰＳへのｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の結合）
Ｅ．ｃｏｌｉ（０１１１−Ｂ４株）あるいはＳ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（Ｒｄ変異体）リポ多糖（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、モンタナ州）の試料（それぞれ、２０μｇから６０μｇ）を、ＬＰＳへのｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物の結合能力を決定するために用いた。
【０１０１】
ＬＰＳ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥでサイズ分画化し、そして、視覚化のための銀染色、あるいは標準の適切な前染色を行ってからニトロセルロース膜（ＢＡ２５、 Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、キーン、ニューメキシコ州）に電気転移した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ塩化ナトリウム（ＴＢＳ）、および３０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．４の溶液に、３７℃で、３０分間にわたって浸すことでＬＰＳの痕跡を作成した。そして、部分的あるいは全体的に精製したｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の２から４μｇ、あるいは対照タンパク質（ｒＢＰＩ（１−１９９）またはｒＢＰＩホロタンパク質のいずれか）を含む溶液に、２１から４２℃で、１２から１８時間かけて、膜をインキュベートした。インキュベーションの後、膜をＴＢＳ−ＢＳＡで洗浄した。３０分間隔で、溶液を少なくとも３回交換した。洗浄した膜を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳで１：１０００に希釈したウサギ抗ｒＢＰＩ（１−１９９）で、３時間にわたってインキュベートした。膜をさらに少なくとも３回洗浄し、Ｉ−ブロックに代えて５×ＰＢＳおよび０．２５％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、製造業者の指示に従って、化学ルミネセンス検出システム（Ｔｒｏｐｉｘ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）に適用した。
【０１０２】
そして、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２が、ｒＢＰＩ（１−１９９）と同等あるいはそれ以上良好にニトロセルロースに固定したＬＰＳに結合する結果が得られた。
【０１０３】
（２．Ｅ．ｃｏｌｉ成長阻害の分析）
ｒＢＰＩ生成物の殺菌性強度を決定するために、Ｅ．ｃｏｌｉをｒＢＰＩ（１−１９９）またはｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体で処理し、殺菌性活性の測定として培地での成長阻害を観察することで、Ｅ．ｃｏｌｉの培地での成長阻害の分析を行った。Ｊ５（Ｅ．ｃｏｌｉ株 ０１１１：Ｂ４のＵＤＰ−４−エピメラーゼの少ない自然変異体）と命名された、短鎖ＬＰＳを有するＥ．ｃｏｌｉの「自然」株をこの分析にて用いた。ＢＰＩ に対する感受性をＥ．ｃｏｌｉに付与する、トリエタノールアミンで緩衝化した鉱物塩培地（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｚ，５１：８７７（１９６４））にて細胞を成長させた。 細胞を洗浄し、約５×１０８細胞／ｍｌの密度になるまで、０．９％塩化ナトリウム中で再懸濁を行った。
【０１０４】
約５×１０６から１×１０７のＥ．ｃｏｌｉ細胞を、２００から４００ｍｌの緩衝液（１０％ハンクス液、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、０．１％カザミノ酸）で、５μｇ／ｍｌの濃度のｒＢＰＩ（１−１９９）またはｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体のいずれかと共に、３０から６０分間にわたってインキュベートした。加えて、ｒＢＰＩ（１−１９９）またはｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体のいずれかと、１００ｍＭ塩化マグネシウムを用いて分析を個別に行った。インキュベーションに続いて、０．９％の塩化ナトリウムを足した１０倍量の栄養培地で細胞を希釈した。数時間にわたって、培地での成長を観察した。
【０１０５】
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体が、ｒＢＰＩ（１−１９９）と同等あるいはそれ以上の殺菌活性を有することを実証する結果が得られた。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体とｒＢＰＩ（１−１９９）の双方の殺菌性活性は、塩化マグネシウムによって、予想していた通り低減していた。
【０１０６】
（３．ＬＡＬ阻害の分析）
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の ＬＰＳへの結合性を決定するために、ＬＡＬ阻害検定を行った。ＬＡＬ阻害検定は、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０： ４７５４−４７６１（１９９２）に記載した方法を使用した。ＬＡＬ検定の結果は、ｒＢＰＩ（１−１９９）と同等の１０というＩＣ−５０値を、ｒＢＰＩ（１ −１９９）ａｌａ１３２が有していたことを実証するものであった。
これらデータは、ＬＰＳに結合するための野性型ｒＢＰＩ生成物に類似体が匹敵することを示すものである。
【０１０７】
（Ｃ．致命的な内毒素血症の動物モデルでのｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の効果）
内毒素血症の動物モデルを、内毒素ショックに対するｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体とｒＢＰＩ（１−１９９）の効果の比較を行うために用いた。
【０１０８】
雄のＩＣＲマウスに、８００μｇ／ｋｇのアクチノマイシン−Ｄと、０．５μｇ／ｋｇあるいは１．０μｇ／ｋｇのいずれかの内毒素（Ｅ．ｃｏｌｉ，０１１１：Ｂ４株）を静脈注射した。内毒素の注射後直ちに、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２あるいはｒＢＰＩ（１−１９９）のいずれか（０．５ｍｇ／ｋｇあるいは５．０ｍｇ／ｋｇ）を、マウスに静脈注射した。緩衝化した賦形剤を対照として用いた。７日間にわたってマウスの死を記録した。その結果を、下記表６に示した。
【０１０９】
【表６】
表６にあるように、ｒＢＰＩ（１−１９９）とｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の双方は、内毒素の致死作用に対して顕著な防御機能を呈する。本発明を好ましい実施態様に関して記載してきたが、当業者であれば、開示した範囲内で無数の修正と変更を想到できるものと思われる。例えば、ＢＰＩ Ｎ−末端断片の第１３２位あるいは第１３５位のシステインを、アラニンあるいはセリン以外の非極性アミノ酸と置換することも本発明では意図されている。従って、本発明の範疇に課すべき限定は、添付の請求の範囲および将来に補正した請求の範囲に記した限定にとどめるべきである。
【０１１０】
【表７−１】
【０１１１】
【表７−２】
【０１１２】
【表７−３】
【０１１３】
【表７−４】
【０１１４】
【表７−５】
【０１１５】
【表７−６】
【０１１６】
【表７−７】
【０１１７】
【表７−８】
【０１１８】
【表７−９】
【０１１９】
【表７−１０】
【０１２０】
【表７−１１】
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。
【図２−１】図２は、ｒＢＰＩ（１−１９３）およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。
【図２−２】図２は、ｒＢＰＩ（１−１９３）およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。
【図３】図３は、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析の結果を記載している。
【図４】図４は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析の結果を記載している。
【図５】図５は、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を記載している。
【図６】図６は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を記載している。
【図７】図７は、ｐＨ ７．０、５７℃での、ポロキサマー／ポリソルベート界面活性剤の有無による、ｒＢＰＩ生成物を含む薬剤組成物の濁度に関する研究結果を示している。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、殺菌性／浸透性が向上した新規なタンパク質生成物およびそれを含む薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の外膜の主要構成成分であり、コアオリゴ糖およびリピドＡの定常領域に結合する血清型に特異的な酸素側鎖多糖から構成される。非特許文献１。ＬＰＳは、米国での集中治療部での医療における主要な死因の一つである、グラム陰性敗血症ショックの病理における重要な媒体である。非特許文献２。
【０００３】
ＬＰＳ結合タンパク質は、多様な哺乳類組織にて同定されている。非特許文献３； 非特許文献４。最も広範に研究されているＬＰＳ結合タンパク質は、多形核白血球のアズール性顆粒に認められる基本タンパク質の、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質（ＢＰＩ）である。ヒトＢＰＩタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー［非特許文献５］あるいはＥ．ｃｏｌｉ親和性クロマトグラフィー［非特許文献６］のいずれかと酸抽出を組み合わせて、多形核好中球から単離され、そして、グラム陰性細菌の多様な菌に対して強い殺菌活性を有する。
【０００４】
ＢＰＩタンパク質は多くのグラム陰性細菌に対して細胞毒性を呈するが、グラム陽性細菌、カビ、あるいは哺乳類細胞に対する細胞毒性は報告されていない。ヒトＢＰＩの全タンパク質のアミノ酸配列ならびにそのタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１および２）は、本明細書に参考として引用する非特許文献７の図１にて解明されている。非特許文献７は、ヒト前骨髄細胞白血病ＨＬ−６０細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４０）のＤＭＳＯ誘発細胞から誘導したｃＤＮＡライブラリーからの、ｃＤＮＡをコードするヒトＢＰＩの単離を開示している。そのＤＭＳＯ誘発したＨＬ−６０細胞から誘導した新たに調製されたｃＤＮＡライブラリーからの度重なるＰＣＲ増幅は、第１５１位のアミノ酸が、バリンを特定するＧＴＣ（配列番号：１に示した）あるいはＧＴＧのいずれかのコドンである、ｃＤＮＡをコードするヒトＢＰＩの存在を示した。さらに、第１５１位にバリンを特定するＧＴＧを用いたｃＤＮＡが、第１８５位のアミノ酸がリシン（ＡＡＧ）（配列番号：１および２のように）あるいはグルタミン酸残基（ＧＡＧ）のいずれかを特定するものであることがわかっている。
【０００５】
ヒトＢＰＩホロタンパク質のＮ末端部分に対応するタンパク質分解断片は、自然に誘導された５５ｋＤａヒトＢＰＩホロタンパク質の抗菌効果を有している。Ｎ末端部分とは対照的に、単離したヒトＢＰＩタンパク質のＣ末端領域は、かすかに検出できるだけの抗菌活性を示すに過ぎないものであった。非特許文献８。ヒトＢＰＩホロタンパク質の最初の約１９９個のアミノ酸を含むＢＰＩＮ末端断片は、組換法により２３ｋＤａのタンパク質ろして生成された。非特許文献９。
【０００６】
ヒトのグラム陰性敗血症の治療のためのＢＰＩ生成物の計画された臨床応用では、安定で、均質な薬剤調製物への応用に適切な組換ＢＰＩ（ｒＢＰＩ）生成物を大量に生成するために相当の努力がなされている。
【０００７】
例えば、共同所有に係る、Ｇｒｉｎｎａによる係属中の米国特許出願Ｎｏ．０８／０７２，０６３は、培養基中での遺伝子的に形質転換された哺乳類宿主細胞で発現し、そこから分泌された組換ＢＰＩ生成物の精製のための方法を開示している。精製プロセスの効果は、ヒトＢＰＩの３１個のアミノ酸の「リーダー」配列と成熟タンパク質の最初の１９９個のアミノ末端残基（すなわち、配列番号：２の３１〜１９９のアミノ酸に対応する）をコードするＤＮＡを発現する形質転換したＣＨＯ細胞の生成物の程度にて立証されている。共同所有に係る、Ｔｈｅｏｆａｎ，ｅｔ ａｌによる係属中の米国特許出願Ｎｏ．０８／０６４，６９３は、ＢＰＩのリーダー配列と、免疫グロブリン重鎖の定常領域をコードするＤＮＡに融合したヒト ＢＰＩの１９１あるいは１９９位のアミノ末端残基のいずれかをコードするＤＮＡの発現の結果得られた、新規の、組換え生成したＢＰＩタンパク質類似体生成物に関する。
【０００８】
ヒトのグラム陰性敗血症の治療のための薬剤クラスのＢＰＩ生成物に向けた努力は、未だ満足の行く結果に至っていない。この主たる理由として、ヒトＢＰＩのアミノ酸配列固有の性質と生成物を生成する組換え宿主細胞が置かれた環境が挙げられる。一例として、形質転換したＣＨＯ宿主細胞の分泌物として生成される、ＢＰＩ［ｒＢＰＩ（１−１９９）］の最初の１９９残基を含む生物学的に活性なｒＢＰＩ生成物は、恐らく、良好な収率で精製されるであろう。しかしながら、単離したＢＰＩ生成物は、当初に、ＢＰＩの二量体形態ならびにシステイン付加物を含む。さらに、二量体および付加物の形成により、生理学的温度および ｐＨでの保管にて、ＢＰＩ生成物は不安定になる。生物学的活性は保持しているものの、かような二量体および付加物を、ヒトへ適用される薬剤組成物へ取り入れることは好ましくない。二量体の形成およびシステイン付加物の形成は、ＢＰＩの生物学的に活性なアミノ末端領域、すなわち、第１３２、１３５および１７５位に位置する、三つのシステインアミノ酸残基をＢＰＩが含んでいることによるものと思われる。三つのシステインの内の二つのシステインの間のジスルフィド単結合の形成は、宿主細胞の細胞質および／または細胞培養上清にてシステインを残さずに、二量体の形成およびシステイン付加物の形成を許容する。
【０００９】
単量体ｒＢＰＩ生成物であっても、かような生成物におけるカルボキシ末端残基の数に関して様々な微小不均質性の程度を示す。例えば、ｒＢＰＩ（１− １９９）をコードするＤＮＡで形質転換あるいは形質変換した宿主細胞を含む培地にて、発現物質の全長を検出することは難しい。その代わりに、かような細胞から取得した発現生成物は、ｒＢＰＩのＮ末端断片のカルボキシ末端を切除した不均一な配置を示す。
【００１０】
実際のところ、予想される全長の生成物（１− １９９）は、不均一な配置におけるｒＢＰＩの中から検出されない場合の方が多い。ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物のカルボキシ末端アミノ酸配列の不均一性は、宿主細胞の細胞質および／または培養上清のカルボキシペプチダーゼの活性によるものと思われる。
【００１１】
薬剤レベルのＢＰＩ生成物の調製における他の問題点は、生成物の均質性ならびに活性を減少させる、肉眼で捉えられる粒子の形成にある。本発明のｒＢＰＩ生成物を含む好ましい薬剤組成物は、ポロキサマー（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー）界面活性剤とポリソルベート（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）界面活性剤の組み合わせを含む。かような組み合わせは、粒子形成に対して薬学的に
活性なポリペプチドを安定化せしめる相乗効果を得る目的で、共同所有に係る、係属中で、同時に出願された米国特許出願Ｎｏ．０８／０１２，３６０にて教示されている。ｒＢＰＩ生成物が、０．１重量％のポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８，ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，パルシパニィー、ニュージャージー州）および０．００２重量％のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０，ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ．，ウィルミントン、デラウェア州）を含むクエン酸緩衝化生理食塩水（０．０２Ｍクエン酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）に、１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在させることが最も好ましい。
【００１２】
当該技術分野では、安定で均質な薬剤調製物に適切な改善されたｒＢＰＩ生成物が依然として必要とされている。かような生成物が形質転換した宿主細胞から高収率で理想的に取得でき、ＢＰＩの殺菌活性およびＬＰＳ−結合の生物学的活性を維持し、そして、二量体ならびにシステイン付加物の形成を抑止し、ひいては、カルボキシ末端の変異を限定する。
【非特許文献１】Ｒａｅｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０年）５９：ｐ．１２９−１７０
【非特許文献２】Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．（１９８７年）３８：ｐ．４１７−４３２
【非特許文献３】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９８９年）７：ｐ．３８９−３９８
【非特許文献４】Ｒｏｅｄｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．，Ｉｍｍｕｎ．（１９８９年）５７；ｐ．１０５４−１０５８
【非特許文献５】Ｅｌｓｂａｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７９年）２５４：ｐ．１１０００
【非特許文献６】Ｗｅｉｓｓ，ｅｔら，Ｂｌｏｏｄ，（１９８７年）６９：ｐ．６５２
【非特許文献７】Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９年）２６４：ｐ．９５０５
【非特許文献８】Ｏｏｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＥｘＰ．Ｍｅｄ．（１９９１年）１７４：ｐ．６４９
【非特許文献９】Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏｅｔ ａＬ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９２年）６０：ｐ．４７５４−４７６１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、以下の項を提供する：
項１．第１３２位あるいは第１３５位のシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質のポリペプチド類似体あるいはその生物学的に活性な断片；
項２．前記システイン残基を置換するアミノ酸が、アラニンおよびセリンからなるグループから選択された非極性アミノ酸である請求の範囲第１項に記載のポリペプチド類似体；項３．第１３２位のシステイン残基が、アラニンで置換される請求の範囲第１項に記載のポリペプチド類似体；
項４．第１３５位のシステイン残基が、セリンで置換される請求の範囲第１項に記載のポリペプチド類似体；
項５．殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の、第１３２位あるいは第１３５位のシステイン置換を除く、第１７６位から第１９９位の開始アミノ末端アミノ酸残基を含む請求の範囲第１項、第２項、第３項もしくは第４項に記載のポリペプチド類似体；
項６．殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の第１９３位のアミノ末端アミノ酸残基を含む請求の範囲第５項に記載のポリペプチド類似体；
項７．第１３２位あるいは第１３５位のシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質のポリペプチド類似体あるいはその生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ；
項８．３１個のアミノ酸リーダー配列ならびに殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の最初の１９３位のＮ−末端残基をコードし、第１９３位のロイシン残基のためのコドンの直後に続くコドンに続く停止コドンを有する請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ；
項９．３１個のアミノ酸リーダー配列ならびに殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の最初の１９９位のＮ−末端残基をコードし、第１９９位のイソロイシンのためのコドンの直後に続くコドンに続く停止コドンを有する請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ；
項１０．請求の範囲第７項に記載のＤＮＡを含む自律複製ＤＮＡ；
項１１．前記ポリペプチド類似体の宿主細胞での発現を許容する方法にて、請求の範囲第７項に記載のＤＮＡで安定的に形質変換あるいは形質転換された宿主細胞；
項１２．請求の範囲第１１項に記載の真核細胞；
項１３．ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１２４６およびＡＴＣＣ ＨＢ １１２４７からなるグループから選択されたＡＴＣＣ受託番号を有する請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞；
項１４．適切な培養培地で請求の範囲第１１項に記載の宿主細胞を生長させ、および前記宿主細胞あるいは前記培養培地からポリペプチド類似体を単離することを含む、殺菌性／
浸透性が向上したタンパク質のポリペプチド類似体あるいはその生物学的に活性な断片を製造する方法；
項１５．アミノ末端に請求の範囲第１項に記載の類似体ポリペプチドを、および、カルボキシ末端に免疫グロブリン重鎖あるいはその対立性変異体の少なくとも一つの定常領域を含むハイブリッド融合タンパク質；
項１６．請求の範囲第１５項に記載のハイブリッド融合タンパク質をコードするＤＮＡ；項１７．請求の範囲第１６項に記載のＤＮＡを含む自律複製ＤＮＡベクター；
項１８．前記融合タンパク質の宿主細胞での発現を許容する方法にて、請求の範囲第１６項に記載のＤＮＡで安定的に形質変換あるいは形質転換された宿主細胞；
項１９．適切な培養培地で請求の範囲第１８項に記載の宿主細胞を生長させ、および前記宿主細胞あるいは前記培養培地から前記類似体を単離することを含む、請求の範囲第１５項に記載のハイブリッド融合タンパク質を製造する方法；
項２０．請求の範囲第１項に記載のポリペプチド類似体および薬学的に許容される希釈剤、補助剤、あるいは担体を含む薬学的組成物；
項２１．請求の範囲第１５項に記載のハイブリッド融合タンパク質および薬学的に許容される希釈剤、補助剤、あるいは担体を含む薬学的組成物；
項２２．請求の範囲第２０項もしくは第２１項に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、細菌性疾患あるいはその後遺症を治療するための方法；
項２３．カルボキシ末端残基の第１９３位にロイシン残基を有する殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の生物学的に活性な断片をコードするＤＮＡ；
項２４．３１個のアミノ酸リーダー配列ならびに殺菌性／浸透性が向上したタンパク質の最初の１９３位のＮ−末端アミノ酸をコードし、第１９３位のロイシン残基のためのコドンの直後に続くコドンに続く停止コドンを有する請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡ；
項２５．請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡを含む自律複製ＤＮＡベクター；
項２６．宿主細胞での発現を許容する方法にて、請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡで安定的に形質変換あるいは形質転換された宿主細胞；
項２７．請求の範囲第２３項に記載のＤＮＡで安定的に形質変換あるいは形質転換された宿主細胞を適切な培養培地で生長させ、および前記宿主細胞あるいは前記培養培地から前記断片を単離することを含む、生物学的に活性な殺菌性／浸透性が向上した断片を製造する方法。
【００１４】
本発明は、新規で、生物学的に活性で、組換え生成したＢＰＩ（ｒＢＰＩ）タンパク質、および二量体とシステイン付加体の形成を抑止し、薬学用途に非常に有用な生成物をもたらすタンパク質断片生成物を提供する。また、カルボキシ末端での低減した分子の不均一性によって特徴付けられたｒＢＰＩ生成物を提供される。ｒＢＰＩ生成物および類似体をコードする新規ＤＮＡ配列、このＤＮＡを含むプラスミドベクター、このプラスミドで安定に形質転換あるいは形質変換された宿主細胞、組換え調製法、安定な薬剤組成物、および治療方法もが本発明によって提供される。
【００１５】
本発明の一態様によると、第１３２あるいは１３５位のアミノ酸位置にあるシステインが、他のアミノ酸、好ましくは、セリンあるいはアラニンのような非極性アミノ酸で置換されたＢＰＩのＮ末端断片を含むｒＢＰＩタンパク質類似体が提供される。本発明の好ましい態様において、ＢＰＩの最初の１９９個のＮ末端残基を含むポリペプチドの第１３２位のシステイン残基が、「ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２」と称する組換え生成物のアラニン残基によって置換される。また、本発明の好ましい態様では、ＢＰＩの最初の１９９個のＮ末端残基を含むポリペプチドの第１３５位のシステイン残基が、「ｒＢＰＩ（１−１９９）ｓｅｒ１３５」と称する組換え生成物のセリンによって置換される。カルボキシ末端残基の同一性に関する低減された不均一性によって特徴付けられる、「ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２」と称する組換え生成物が非常に好ましい。また、本発明の好ましい態様では、ＢＰＩの最初の１９３個のアミノ末端残基を含み、第１９３位のロ
イシンのためのコドンの直後に停止コドンを有するポリペプチドが教示されている。
【００１６】
本発明の他の態様によると、上記したｒＢＰＩタンパク質および類似生成物を含めたタンパク質断片生成物をコードするＤＮＡ配列が提供される。かようなＤＮＡ配列は、３１残基のＢＰＩリーダー配列とＢＰＩポリアデニル化シグナルもコードする。
【００１７】
また、上記した生成物ならびに類似体をコードするＤＮＡを含む自律複製ＤＮＡプラスミドベクターと、そのＤＮＡが十分に発現を許容する方法で該ＤＮＡで安定に形質転換あるいは形質変換した宿主細胞も提供される。本発明による形質転換あるいは形質変換した宿主細胞は、本発明のｒＢＰＩタンパク質生成物の大規模製造において非常に有用な手段である。
【００１８】
本発明は、アミノ末端に本発明のｒＢＰＩタンパク質類似体、そしてカルボキシ末端に免疫グロブリンの重鎖の定常領域あるいはその対立性変異体を含む、融合タンパク質の形態のｒＢＰＩタンパク質類似体も意図している。ＢＰＩ／免疫グロブリン融合タンパク質の天然配列は、その開示を参考までに本明細書に取り込んだ、共同所有に係る、Ｔｈｅｏｆａｎ，ｅｔ ａｌによる係属中の米国特許出願Ｎｏ．０８／０６４，６９３にて教示されている。さらに、本発明は、上記した融合タンパク質の製造方法も意図している。
【００１９】
ＢＰＩのＮ末端アミノ酸の約１７６から約１９８のアミノ酸を有する生物学的に活性なｒＢＰＩタンパク質断片生成物をコードするＤＮＡも本発明の範疇にある。これらＤＮＡは、生成物がカルボキシ末端にて低減された不均一性を示すよう、ＣＨＯ細胞のような真核宿主細胞でのＢＰＩ生成物の生成を許容する。ＢＰＩの１９３個のＮ末端残をコードするＤＮＡ（例えば、ＢＰＩの３１個のアミノ酸リーダー配列、最初の１９３個のＮ末端アミノ酸、および１つ以上の停止コドンをコードするＤＮＡ）が目下のところ好ましい。第１３２位あるいは第１３５位のシステインのいずれかが置換されたタンパク質（例えば、ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２）を付加的にコードするＤＮＡが最も好ましい。
【００２０】
最後に、本発明は、薬学的に許容される希釈剤、補助剤および担体に、本発明のｒＢＰＩタンパク質生成物を含む、安定で、均質な薬剤組成物も提供する。かような薬剤組成物は、ｒＢＰＩ生成物粒子の形成を抑止する。このような組成物は、内毒素関連ショック症状、ならびに散在性血管凝固、貧血、血小板減少症、白血球減少症、成人呼吸障害症候群、腎不全、低血圧症、発熱、および代謝酸血症などのそれに関連する１種以上の症状を含む、グラム陰性細菌感染症およびその後遺症の治療において有用である。
【００２１】
本発明の無数の他の態様ならびに利点は、本発明の好ましい態様を記載した以下の発明の詳細な説明を考慮すれば、当業者であれば容易に想到できるものと思われる。
【００２２】
発明の詳細な説明 以下の詳細な説明は、システイン残基でのアミノ酸置換および／または高度に均質化されたカルボキシ末端を含む様々なｒＢＰＩ生成物の製造と特性に関する。具体的には、実施例１は、ＢＰＩタンパク質の例示的なＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列に塩基置換をもたらす例示的な手段、およびかように変異させた配列のプラスミドベクターへの導入に関する。実施例２は、適切な宿主細胞への実施例１のベクターの導入、および本発明の組換えＢＰＩタンパク質ポリペプチド生成物の発現についてさらに記述している。実施例３は、本発明のシステイン置換した類似体生成物をコードするＤＮＡの構築、およびｉｎｖｉｔｒｏでの転写／翻訳過程におけるその使用に関する。実施例４は、本発明のｒＢＰＩ生成物ポリペプチドの特性に関する。
【実施例】
【００２３】
（実施例１）
（ＢＰＩのシステイン置換類似体を含むベクターの構築）
（Ａ．プラスミドｐＩＮＧ４５１９とｐＩＮＧ４５２０の構築）
発現ベクターｐＩＮＧ４５０３を、ｒＢＰＩ（１−１９９）と称する組換え発現生成物をコードするＤＮＡ源として、すなわち、第１５１位のバリンがＧＴＣよりもむしろＧＴＧで特定され、また第１８５位の残基が（ＡＡＧで特定される）リシンよりむしろ（ＧＡＧで特定される）グルタミン酸であることを除いて、配列番号：１および２に説明したような、３１残基のシグナル配列と成熟したヒトＢＰＩのＮ末端の最初の１９９個のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ源として用いた。
【００２４】
プラスミドｐＩＮＧ４５０３は、本発明の背景に関する参照のために採用した、共同所有に係る、係属中のＴｈｅｏｆａｎ，ｅｔ ａｌによる米国特許出願Ｎｏ．０８／０６４，６９３に記載されている。要約すれば、ｐＩＮＧ４５０３の構築は、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサー要素、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウィルス（Ａ−ＭｕＬｖ）ＤＮＡからのＬＴＲエンハンサー・プロモーター要素、発現しようとする遺伝子の５’端のＳＶ４０ １９Ｓ／１６Ｓ連結ジャンクション、および発現しようとする遺伝子の３’端のヒトゲノミックガンマ−１ポリアデニル化部位を含むプラスミド ｐＩＮＧ２２３７Ｎに基づいている。プラスミドｐＩＮＧ２２３７Ｎは、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）での選択が可能なマーカーも有している。天然の５’非翻訳領域の３０ｂｐ、３１個のアミノ酸シグナル配列をコードする塩基、ならびにＢＰＩの１９９個のＮ末端アミノ酸を含んだ、ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡを、ｐＩＮＧ４５０３の独特のＳａｌＩおよびＳｓｔＩＩ制限部位の間に挿入した。
【００２５】
二つのベクター、ｐＩＮＧ４５１９およびｐＩＮＧ４５２０は、ＢＰＩの自然に発生した三つのシステイン残基の一つを他のアミノ酸と置換したｒＢＰＩ（１− １９９）システイン置換類似体の発現のためのｐＩＮＧ４５０３に基づいて構築した。ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡに一度だけ発生し、第１３２ 位のシステインと第１３５位のシステインの間に位置するＰｖｕＩＩ部位（ＣＡＧＣＴＧ）をこれらの構築に用いた。ｐＩＮＧ４５０３には他にも幾つかの ＰｖｕＩＩ部位があるので、ｐＩＮＧ４５０３から、ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードする挿入体を含んだＳａｌＩ−ＳｓｔＩＩ断片を、ＳａｌＩとＳｓｔＩＩ で消化することでまず単離する必要がある。精製したＳａｌＩ−ＳｓｔＩＩ ｒＢＰＩ（１−１９９）挿入体を、次に、ＰｖｕＩＩで消化し、個別に精製された、約５２９ｂｐのＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩ断片と、約２０９ｂｐのＰｖｕＩＩ− ＳｓｔＩＩが得られた。
【００２６】
プラスミドｐＩＮＧ４５１９は、アラニンのためのコドンが第１３２位の本来のシステインを特定するコドンに置換されているｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡ挿入体をｐＩＮＧ４５１９が含んでいる以外は、ｐＩＮＧ４５０３と同一である。上記したように、宿主細胞発現とその挿入体の分泌過程による組換え生成物を、「ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２」と称した。ｐＩＮＧ４５１９を生成するために、 ３０ｂｐのＢＰＩ非翻訳領域の５’端にＳａｌＩ制限部位を挿入したプライマーＢＰＩ−６：ＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＧＴ（配列番号：３）、およびＰｖｕＩＩの半分と第１３２位にアラニンをコードするために必要な塩基置換を含んだＢＰＩ−１４：ＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧ （配列番号：４）を用いて、ＢＰＩＤＮＡ配列をｐＩＮＧ４５０３をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅は、製造業者の説明書に従って、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｒｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、ノウォーク、コネチカット州）を用いて行った。
【００２７】
得られたＰＣＲ断片はＳａｌＩで消化して、約５２９ｂｐのＳａｌＩ鈍化した断片が得られ、これは上記した約２０９ｂｐのＰｖｕＩＩ− ＳｓｔＩＩ断片とｐＩＮＧ４５０３のＳａｌＩとＳｓｔＩＩによる消化で得られた大きな断片と共に、ｐＩＮＧ４５１９を得
るために三片接合した。
【００２８】
プラスミドｐＩＮＧ４５２０は、セリンコドンが第１３５位の本来のシステインを特定するコドンに置換されているｒＢＰＩ（１−１９９）類似体をコードするＤＮＡ挿入体をｐＩＮＧ４５２０が含んでいる以外は、ｐＩＮＧ４５１９と同一である。上記したように、宿主細胞発現による組換え生成物を、「ｒＢＰＩ（１ −１９９）ｓｅｒ１３５」と称した。ｐＩＮＧ４５２０を生成するために、選択マーカーがＤＨＦＲに代えてｇｐｔであること、 ｃＤＮＡ挿入体がシグナル配列と、ｒＢＰＩ（１−１９９）の一部に代えてＢＰＩ全長（４５６残基）をコードすることを除けば、実質的にｐＩＮＧ４５０３と同様のプラスミドであるｐＩＮＧ４５１３からＢＰＩＤＮＡはＰＣＲ増幅される。
【００２９】
５’端に変異したＰｖｕＩＩ部位（”ＣＴＧ”が”ＣＴＣ”に変化している）の半分と第１３５位にセリンをコードするために必要な塩基置換を含んだプライマーＢＰＩ−１５：ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＡＡＣ（配列番号：５）と、１９９位のＢＰＩ残基をコードする領域の下流に位置するｒＢＰＩをコードする配列を意味するプライマーＢＰＩ−７：ＧＡＡＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＧＴＣＧ（配列番号：６）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。このＰＣＲ断片を、 １３５位のシステインの変異部位の下流を切断するＢｓｔＢＩで消化し、得られた約１００ｂｐの切断したＢｓｔＢＩ断片をゲル精製した。上記した５２９ｂｐ のＳａｌＩ− ＰｖｕＩＩＢＰＩ制限断片、１００ｂｐの切断したＢｓｔＢＩ断片、およびｐＩＮＧ４５０３のＢｓｔＢＩ−ＳａｌＩ消化により得られた大きな断片を用いて、 ｐＩＮＧ４５２０を生成するために三片接合を行った。
【００３０】
（Ｂ．プラスミドｐＩＮＧ４５３０の構築）
ｐＩＮＧ４５１９のようにアラニンからシステインへの置換を含み、ｐＩＮＧ４５０３からｐＩＮＧ４５１９に運ばれたＤＨＦＲマーカーに代えて（マイコフェノール酸耐性を許容する）ｇｐｔ選択可能なマーカーを含む他のベクター、ｐＩＮＧ４５３０を構築した。ｐＩＮＧ４５３０を構築するために、１６２９ｂｐのＳａｌＩ−ＤｒａＩＩＩ制限断片が、ｐＩＮＧ４５１９から単離された。この断片は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２のコード領域をすべて、ならびにこのコード領域の３’末端での約８９５ｂｐのベクター配列を含んでいる。この断片は、ｐＩＮＧ４５３０を生成するために、ｐＩＮＧ４５１３から単離された大きな（約７２３０ｂｐ）ＤｒａＩＩＩ−ＳａｌＩベクター断片に接合した。
【００３１】
（Ｃ．プラスミドｐＩＮＧ４５３３の構築）
ＢＰＩシグナル配列の５番目のアミノ酸である、−２７位のメチオニン（ＡＴＧ）を特定するコドンを、Ｋｏｚａｋの定常翻訳開始配列 ＧＣＣＡＣＣＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号：７）［Ｋｏｚａｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１５：８１２５（１９８７）］との関連で置換し、ＢＰＩシグナルの最初の四つのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を削除して、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の発現のためのプラスミドｐＩＮＧ４５３３を構築した。ＢＰＩシグナルの−２７位のＡＴＧ（メチオニン）の前にＳａｌＩ制限部位およびヌクレオチドＧＣＣＡＣＣを組み込んだＰＣＲプライマーＢＰＩ−２３：ＡＣＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣ（配列番号：８）、およびｒＢＰＩ（１−１９９）コード配列の３’端に対応するプライマーＢＰＩ−２：ＣＣＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ（配列番号：９）を用いて、［ｐＧＥＭ−７ｚｆ （＋）中の］ヒトＢＰＩ ｃＤＮＡの全長を含むプラスミドからＢＰＩ配列のＰＣＲ増幅によって構築を行った。約７００ｂｐのＰＣＲ増幅したＤＮＡをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＢＰＩ（１−１９９）コード配列の約１／３を含む２７０ｂｐの得られた断片を精製した。このＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｇｐｔマーカーを含む ｐＩＮＧ４５３３を生成するために、（１）１３２位のシステインをアラニンで置換したＢＰＩ（１−１９９）の残部をコードするｐＩＮＧ４５１９からの ４２０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｓ
ｓｔＩＩ断片、および（２）ｐＩＮＧ４５０２からの約８０００ｂｐのＳｓｔＩＩ−ＳａｌＩベクター断片（３０ｂｐの５’非翻訳配列を含まず、ＤＨＦＲよりもむしろｇＰｔマーカーを有することを除けば実質的にｐＩＮＧ４５０３と同様のベクター）の二つの断片と接合した。
【００３２】
（Ｄ．プラスミドｐＩＮＧ４２２１、ｐＩＮＧ４２２２、およびｐＩＮＧ４２２３の構築）
シグナル配列の−２７位のメチオニン残基に対応する至適なＫｏｚａｋの翻訳開始部位と、システインからアラニンへの１３２位での置換を含む挿入体を有する ｐＩＮＧ４５３３と同様のベクターを構築した。しかしながら、これら構築体では１９３位残基にて、ＢＰＩ断片がコードする配列は終了している。上記したように、このＤＮＡの宿主発現から得られた組換え生成物は、「ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２」と称した。これら挿入体を含むベクターは、ＢＰＩのＤＮＡ挿入体の５’端を切断する、ＳａｌＩでまずｐＩＮＧ４５３３を消化し、１９２位残基の３’側に覆い被さる３ｂｐを残すＡｌｗＮＩ で消化することで作製される。そして、得られた約７００ｂｐの断片は精製された。この断片は、二つのアニールした相補性オリゴヌクレオチド、ＢＰＩ− ３０：ＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣ（配列番号：１０）およびＢＰＩ−３１：ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴ（配列番号：１１）によって、 ＳｓｔＩＩ−ＳａｌＩでのｐＩＮＧ４５３３消化から得られた大きな断片へ再接合された。これは、ＡｌｗＮＩとＳｓｔＩＩ部位の間の領域を、１９３位の残基（ロイシン）のためのコドン、停止コドン、およびＸｈｏＩ制限５’部位と共にＳｓｔＩＩ部位に置換し、ＡｌｗＮＩとＳｓｔＩＩ部位双方を再生し、また、１９３位のアミノ酸（ロイシン）のためのコドン（ＣＴＧ）の直後に停止コドンとＴＡＧを置くことになる。得られたプラスミドをｐＩＮＧ４２２３と称し、ｇＰｔマーカーを有していた。異なる選択マーカーを用いてベクターを生成するために、異なるＳｓｔＩＩ−ＳａｌＩベクター断片が用いられていることを除けば、ｐＩＮＧ４２２３のために記載された方法と同じくして同様の構築体が作製される。例えば、ｇｐｔマーカーの代わりに（ヒスチジノールに耐性を付与する）ｈｉｓマーカーを含むことを除けば、ｐＩＮＧ４２２１はｐＩＮＧ４２２３と同一であり、また、ｇｐｔの代わりにＤＨＦＲマーカーを含むことを除けば、ｐＩＮＧ４２２２はｐＩＮＧ４２２３と同一である。
【００３３】
（Ｅ．プラスミドｐＩＮＧ４５３７、ｐＩＮＧ４１４３、ｐＩＮＧ４１４６、 ｐＩＮＧ４１５０、およびｐＩＮＧ４１５４の構築）
ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードする挿入体、至適化されたＫｏｚａｋの翻訳開始部位、ＳｓｔＩＩ部位の３’端のヒトゲノミックガンマ１重鎖のポリアデニル化および転写終了領域が、ヒト軽鎖ポリアデニアル化配列、続いてマウス軽鎖（カッパ）ゲノミック転写終了配列で置換されていることを除いて実質的にｐＩＮＧ４２２１、 ｐＩＮＧ４２２２およびｐＩＮＧ４２２３と同一である異なる選択マーカーを含んだ一連のベクターが構築された。並行した遺伝子発現の研究にて、軽鎖ポリアデニアル化シグナルおよび転写終止領域は、Ｓｐ２／０およびＣＨ０−Ｋ１細胞でのＢＰＩ発現レベルの２．５〜５倍の増大に寄与しているものと思われる。
【００３４】
上記したベクターの構築は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２挿入体を含んだｐＩＮＧ４５３３と同様のベクターであるｐＩＮＧ４５３７をまず構築することから始めた。しかしながら、ｐＩＮＧ４５３７は、ヒト重鎖配列に代えて、ヒト軽鎖ポリアデニアル化配列を含んでいる。マウスカッパ３’配列は、ヒト軽鎖ｃＤＮＡをコードする発現ベクターであるｐＩＮＧ３１７０から取得され、マウスゲノミック軽鎖３’転写終止配列を含んでいる。これは、マウス軽鎖停止コドンの３５ｂｐ上流を切断するＳｓｔＩで消化し、切断端を作成するためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、マウスカッパ３’配列を含む約１３５０ｂｐ の断片を精製することで達成される。得られた断片は、ヒト軽鎖定常領域ｃＤＮＡの３’部分の約２５０ｂｐと、Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３９：３５２１（１９８７）にてΔ８と称されている構築体にて記載されているＢａｍ ＨＩリンカーが続くポリアデニル化シグナルから構成されている。約１３５０ｂｐ断片の残りの部分は、転写終止配列を供給するＢｇｌＩＩ−Ｂａｍ ＨＩマウスカッパ３’ゲノミック断片〔Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：３８３８（１９８６）の断片”Ｄ”〕から構成されている。この断片は、ＢＰＩ挿入体の全部とＳｓｔＩＩでの消化、Ｔ４ポリメラーゼ処理、および（ＢＰＩ挿入体の全部とベクターの一部を含む）ＮｏｔＩ消化により得られたベクターの一部を含む３０４４ｂｐ断片であるｐＩＮＧ４５３３と、約４５７４ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片の二つの断片による三片接合に用いた。得られたベクター、ｐＩＮＧ４５３７は、上記したゲノミック３’非翻訳領域の相違点を除いて ｐＩＮＧ４５３３と同一である。
【００３５】
カッパ３’非翻訳配列を含む他のベクターを、カッパ３’断片の入手源としてｐＩＮＧ４５３７を用いて構築した。カッパ３’非翻訳配列を、ＸｈｏＩ（ＢＰＩ 停止コドンの直後に生じる独特の部位）とＢａｍ ＨＩによるｐＩＮＧ４５３７の消化により単離された。ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードする挿入体をすべてが含み、また、シグナルの−２７位残基に至適化されたＫｏｚａｋの翻訳開始部位を有している以下の４つのベクターを生成するために、得られた約１３６０ｂｐのＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片を三片接合に用いた。すなわち、（１）４５７４ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片（ｇｐｔマーカー）であるｐＩＮＧ４２２３、約３０１９ｂｐの断片を含むＮｏｔＩ− ＸｈｏＩＢＰＩ挿入体であるｐＩＮＧ４２２３、およびＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片であるｐＩＮＧ４５３７の接合により得られたＰＩＮＧ４１４３（ｇｐｔマーカー）、（２）約４１５９ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片（ＤＨＦＲマーカー）であるｐＩＮＧ４２２２、約３０１９ｂｐの断片を含むＮｏｔＩ−ＸｈｏＩＢＰＩ挿入体であるｐＩＮＧ４２２３、およびＸｈｏ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片である ｐＩＮＧ４５３７の接合により得られたｐＩＮＧ４１４６（ＤＨＦＲマーカー）、（３）約４７７２ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片を含むｐＩＮＧ４２２１ ｈｉｓ、断片を含むＮｏｔＩ− ＸｈｏＩＢＰＩ挿入体であるｐＩＮＧ４２２２、およびＸｈｏＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片であるｐＩＮＧ４５３７の接合により得られたｐＩＮＧ４１５０（ｈｉｓマーカー）、および（４）約４０４２ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＢｓａＩ断片を含むｐＩＮＧ３１７４ ｎｅｏ、約３８８３ｂｐの断片を含むＢｓａＩ−ＸｈｏＩＢＰＩ挿入体であるｐＩＮＧ４２２１、およびＸｈｏＩ −Ｂａｍ ＨＩ断片であるｐＩＮＧ４５３７の接合により得られたｐＩＮＧ４１５４（ｎｅｏマーカー）である。プラスミドｐＩＮＧ３１７４は、抗体重鎖ＤＮＡをコードする挿入体ならびにｎｅｏマーカーを含んでいる。ｎｅｏ遺伝子とその開裂配列は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７（１９８２）にて報告されているｐＳｖ２ ｎｅｏプラスミドから取得した。
【００３６】
（Ｆ．プラスミドｐＩＮＧ４１１４およびｐＩＮＧ４１５１の構築）
ｒＢＰＩコード配列の発現が、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウィルス（Ａ−ＭｕＬｖ）ＬＴＲプロモーターに代えてヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）の直接の初期エンハンサー／プロモーターの制御下にあることを除けば、ｐＩＮＧ４１４３とｐＩＮＧ４１５０のそれぞれと同一であるｐＩＮＧ４１４４と ｐＩＮＧ４１５１の二つのプラスミドを構築した。よって、ｐＩＮＧ４１４４とｐＩＮＧ４１５１の双方は、第１３２位でのシステインからアラニンへの変異、至適化されたＫｏｚａｋ翻訳開始配列、およびヒト軽鎖ポリ−Ａ／マウスカッパゲノミック転写終止領域を含んでいる。当初のベクター（ｐＩＮＧ４１４３と ｐＩＮＧ４１５０）の第８７９位から第１７０８位のヌクレオチド領域を、本明細書に参考までに採り入れた、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ４１：５２１（１９８５）の図３に見られるように、第−５９８位から第＋１７４位のヌクレオチドに対応するｈＣＭＶエンハンサー／プロモーターの領域と置換した。ＢＰＩ発現ベクターにｈＣＭＶプロモーター領域に導入するために、抗体軽鎖挿入体の発現を進めるｈＣＭＶプロモーターを含むプラスミドｐＩＮＧ２２５０からの断片を含む約１０５４ｂｐのＥｃ
ｏＲＩ−ＳａｌＩ／ｈＣＭＶプロモーターで、ｐＩＮＧ４２２２の断片を含む約１１１７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ／Ａ−ＭｕＬｖ プロモーターでまず置換することで、プラスミドｐＩＮＧ４５３８を構築した。ｐＩＮＧ４１４４を構築するために、三つの断片を接合した。すなわち、（１） ｐＩＮＧ４５３８のＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片を含む約２９５５ｂｐのｒＢＰＩ（１−１９３）、（２）ｐＩＮＧ４５３７からの約１３６０ｂｐのＸｈｏＩ− Ｂａｍ ＨＩ、および（３）ｐＩＮＧ４２２１からのｈｉｓ遺伝子を含む約４７７０ｂｐのＢａｍ ＨＩ−ＮｏｔＩ断片である。
【００３７】
（Ｇ．プラスミドｐＩＮＧ４１４５、ｐＩＮＧ４１４８、およびｐＩＮＧ４１５２の構築）
第１３２位のアラニン置換に代えて野性型（自然配列）のシステインを含むことを除けば、ｐＩＮＧ４１４３、ｐＩＮＧ４１４６、およびｐＩＮＧ４１５０と同一である、プラスミドｐＩＮＧ４１４５、 ｐＩＮＧ４１４８、およびｐＩＮＧ４１５２を構築した。よって、これら三つのプラスミドは、ｒＢＰＩ（１−１９３）挿入体、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、およびヒト軽鎖ポリＡ／マウスカッパゲノミック転写終止領域を含んでいた。これら三つのプラスミドは、以下のようにして構築した。 ｐＩＮＧ４１４５を構築するために、三つの断片を接合した。すなわち、（１）（第１３２位に野性型システインが含まれていることを除けば、 ｐＩＮＧ４２２１と同一である）ｐＩＮＧ４１４０からの断片を含む約３０００ｂｐのＮｏｔ Ｉ−ＸｈｏＩＢＰＩ（１−１９３）、（２）ｐＩＮＧ４５３７からの約１３６０ｂｐのＸｈｏＩ− Ｂａｍ ＨＩ断片、および（３）ｐＩＮＧ４２２２からのＤＨＦＲ遺伝子を含む約４１５０ｂｐの Ｂａｍ ＨＩ− Ｎｏｔ Ｉ断片である。ｐＩＮＧ４１５２を構築するために、三つの断片を接合した。すなわち、（１）（第１３２位に野性型システインが含まれていることを除けば、ｐＩＮＧ４２２３と同一である）ｐＩＮＧ４１４２からの断片を含む約３０００ｂｐのＮｏｔＩ− ＸｈｏＩ断片、（２）ｐＩＮＧ４５３７からのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片、および（３）ｐＩＮＧ４２２１からのｈｉｓ遺伝子を含む約４７７０ｂｐのＢａｍ ＨＩ−Ｎｏｔ Ｉ断片である。
【００３８】
以下の表１は、上記ＡからＧの節にて記載したプラスミドの内容を要約したものである。
【００３９】
【表１−１】
【００４０】
【表１−２】
【００４１】
【表１−３】
【００４２】
【表１−４】
（実施例２）
（ｒＢＰＩのシステイン置換類似体の発現のための細胞の形質変換）
哺乳類細胞は、その好適な分泌、保持力、および発現タンパク質の翻訳後の修飾を許容
するので、哺乳類細胞は、本発明のｒＢＰＩタンパク質類似体の生成のための好適な宿主である。目下のところ、本発明の類似体の生成のための好適な哺乳類宿主細胞には、ＣＨ０−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）；ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、コロンビア大学のＬａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士よりいただいたＣＨＯ Ｔｏｒｏｎｔｏのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損［ＤＨＦＲ−］変異株、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士よりいただいたＣＨＯ−Ｋ１のＤＨＦＲ−変異株であるＣＨＯ−ＤＢＸ−１１、Ｖｅｌｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ８１）、幼ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）およびＮＳＯ骨髄腫（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）のような、繊維芽細胞およびリンパ球由来の細胞が含まれる。
【００４３】
哺乳類細胞の形質変換は、様々な方法で実施できる。一般的な方法として、宿主細胞によって取り上げられる発現ベクターＤＮＡの燐酸カルシウム沈澱による方法がある。他の方法では、強力な電磁場で作られた膜孔を通してＤＮＡを採取する細胞を作り上げるエレクトロポレーション［（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１６．３０−１６．３１ １９８９）］がある。形質変換した細胞の選択は、選択された条件下で形質変換した細胞が生存し、生長することを許容する生成物の遺伝子の発現ベクターへの組み込みによって達成できる。 かような遺伝子のいくつかが同定されている。それには、次のようなものが含まれる。（１）ｎｅｏ、アミノグリコシド抗菌性Ｇ４１８への耐性をコードする原核細胞遺伝子、（２）キサンチンの存在下でマイコフェノール酸（ＭＰＡ）への耐性をコードするＥ．ｃｏｌｉグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、［Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２−２０７６（１９８１）］、（３）ヌクレオシドの欠乏下でのＤＨＦＲ−細胞の生長と、メトトレキセートの増大した濃度の下での遺伝子増幅を許容するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、（４）ヒスチジノルの存在下での生長を許容する Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｒｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの ｈｉｓＤ遺伝子［Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４７−８０５１（１９８８）］、（５）インドールの存在下で（トリプトファン無しに）の生長を許容するＥ．ｃｏｌｉのｔｒＰＢ遺伝子［Ｈａｒｔｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４７−８０５１（１９８８）］、および（６）グルタミンを欠いた培地での生長を許容するグルタミンシンターゼ遺伝子などがある。
【００４４】
これら選択可能なマーカーの単独あるいは様々な組み合わせの利用は、高レベルでの組換え生成物の発現を許容する哺乳類細胞の調製を自在ならしめる。
【００４５】
（Ａ．ｐＩＮＧ４５３３でのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換）
プラスミドｐＩＮＧ４５３３は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２をコードする遺伝子配列、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、ヒトガンマ−１重鎖３’非翻訳領域、およびＭＰＡ−耐性細胞の選択のためのｇｐｔマーカーを含む。
【００４６】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞系は、グルタミン／ペニシリン／ストレトマイシン（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、イルビン、カリフォルニア州）を補充し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を足したＨａｍのＦ１２培地で維持した。これら細胞は、 ＮｏｔＩでまず消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱したｐＩＮＧ４５３３
ＤＮＡの４０μｇでエレクトロポレーションして形質変換した。エレクトロポレーションに続いて、細胞を非選択性ＨａｍのＦ１２培地で２４時間かけて再生した。そして、この細胞をトリプシン処理し、ＭＰＡ（２５μｇ／ｍｌ）とキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ
）を補充したＨａｍのＦ１２培地で５×１０４細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、そして、９６ウェルプレートにて、１０４細胞／ウェルの割合で置いた。形質変換していないＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＭＰＡによるピリミジン合成の阻害のために、この培地では生長しなかった。
【００４７】
２週間後に、形質変換した細胞からなるコロニーが、９６ウェルプレートにて観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、標準としてｒＢＰＩ（１−１９９）を用いた抗ＢＰＩ ＥＬＩＳＡによるＢＰＩ反応性タンパク質の存在に関して分析を行った。
【００４８】
この分析にて、イムロン−ＩＩ ９６ウェルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社、チャンティリー、バージニア州）を、アフィニティー精製したウサギ抗ｒＢＰＩ（１−１９９）抗血清で前被覆した。上清試料を添加し、アフィニティー精製し、ビオチン化したウサギ抗ｒＢＰＩ（１−１９９）抗血清とペルオキシダーゼ標識したアビジンを用いて検出を行った。
【００４９】
この方法で、約８００のコロニーをスクリーニングした。 最大の生成が認められた３１個のコロニーを、生成効率の評価を行うために２４ウェルプレートに移した。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＨａｍのＦ１２培地を用いて２４ウェルプレートにて、集合体が形成されるまで生長させた。細胞が、一旦、集合体を形成すれば、ＨａｍのＦ１２培地を除去し、そして、共同所有に係る、係属中のＧｒｉｎｎａによる米国特許出願Ｎｏ．０８／０７２，０６３にあるように、殺菌したＳ−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）の ４Ｏμｌを足した１ｍｌの血清を含まないＨＢ−ＣＨＯ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加した。この細胞を、７日間インキュベートしてから、Ｓ−セファロースビーズを除去し、１０ｍｌのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７．５）中の０．１Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。Ｔｒｉｓ緩衝液中の１．０Ｍ塩化ナトリウムを添加してビーズから生成物を溶出し、そして、上記したようにＥＬＩＳＡで定量した。Ａ１３５と命名した、最高の生成能力が認められた形質転換体は、この分析にて約３μｇ／ｍｌの転換体の分泌を示し、血清を含まないＥｘｃｅｌｌ３０１培地（ＪＲＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、レナクサ、カンサス州）での生長に適していた。適合する細胞は、Ｓ−セファロースビーズが入ったＥｘｃｅｌｌ３０１培地を用いた
１．５Ｌ醗酵にて生長した。Ｓ−セファロースビーズ（５０ｍｌ分画）から溶出した生成物のＣ４ ＨＰＬＣ分析により、生産効率を、１２０から１４０時間にわたって分析した。醗酵のこの段階での生産効率は、１５から２５μｇ／Ｌであった。
【００５０】
（Ｂ．ｐＩＮＧ４２２２でのＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の形質変換）
プラスミドｐＩＮＧ４２２２は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、ヒトガンマ−１重鎖３’非翻訳領域、およびヌクレオシドを含まない培地での形質転換した細胞の選択のためのマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【００５１】
ＣＨＯ ＤＧ４４細胞系は、グルタミン／ペニシリン／ストレトマイシンを補充し、１０％ＦＢＳを足したＨａｍのＦ１２培地で維持した。これら細胞は、 Ｗｅｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７）のカルシウム沈澱法を用いて、直線化したｐＩＮＧ４２２２ ＤＮＡ（ＰｖｕＩで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱した４０μｇ）で形質変換した。カルシウム沈澱に続いて、細胞を約１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置き、ヌクレオシド（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を欠いたαＭＥＭ培地、および透析したＦＢＳ（６０００−８０００の分子量基準で、４Ｌの冷たい０．１５Ｍ塩化ナトリウムに対して、１６時間、４℃で透析した１００ｍｌの血清）を足した選択培地で生長させることで形質転換体を得た。
【００５２】
形質変換していないＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、ＤＨＦＲ変異および透析した血清が足された培地にヌクレオシドが欠けていたため、この培地では生長しなかった。
【００５３】
２週間後に、約２から３個のコロニーが、各ウェルで観察された。９６ウェルプレートのウェルからの上清を、上記Ａ節で述べたＥＬＩＳＡにより、ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２の存在に関して分析した。２４個の生産効率の最も良好なクローンを、ＤＮＡをコードするｒＢＰＩ類似体の遺伝子増幅を誘発するために、０．０５Ｍのメトトレキセートを足した選択用αＭＥＭ培地が入った２４ウェルプレートに入れた。生長の観察過程にて、細胞を新しい２４ウェルプレートに移し、 ｐＩＮＧ４５３３／ＣＨＯ−Ｋ１形質転換体に関する上記Ａ節でのＳ−セファロース溶出物から生産効率を分析した。五つの最も高い生産効率を示すクローンが組み合わされ、９６ウェルプレートでの限定希釈によりサブクローニングした。単一コロニーを含む上清を、ＥＬＩＳＡにより、ｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２のレベルに関して分析を行った。次に、２０個の生産効率の最も良好なサブクローンを２４ウェルプレートに入れ、０．４μＭのメトトレキセートの存在下でさらに増幅せしめ、そして、増幅した細胞による生成物の発現レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。最高の生成体である、クローン４、７５および８０は、Ｓ−セファロースを含む２４ウェルプレートにて、７日間で、２５から３７μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。
【００５４】
（Ｃ．ｐＩＮＧ４２２３およびｐＩＮＧ４２２１でのＳｐ２／Ｏ細胞の形質変換）
所望のｒＢＰＩ生成物の至適な発現を行うために適用する手法は、第一マーカーでの第一発現プラスミドを有する細胞の形質変換、最高の生成体のスクリーニング、および異なる第二マーカーを有する第二の発現プラスミドを用いたスクリーニングした生成体の形質変換を含む。この手法を、Ｓｐ２／Ｏ細胞を用いた場合について、下記する。
【００５５】
プラスミドｐＩＮＧ４２２３は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、ヒトガンマ−１重鎖３’非翻訳領域、およびＭＰＡ−耐性細胞の選択のためのｇｐｔマーカーを含む。
【００５６】
Ｓｐ２／Ｏ細胞系は、グルタミン／ペニシリン／ストレトマイシンを補充し、１０％ＦＢＳを足したＤＭＥＭ培地で維持した。これらＳｐ２／Ｏ細胞は、 ＮｏｔＩで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱したｐＩＮＧ４２２３ ＤＮＡの４０μｇを用いたエレクトロポレーションで形質変換した。エレクトロポレーションに続いて、非選択性ＤＭＥＭ培地で４８時間置いて再生した。細胞を遠心分離し、ＭＰＡ（６μｇ／ｍｌ）とキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ）を足したＤＭＥＭ培地中に５×１０４細胞／ｍｌの濃度にまで再懸濁し、そして、１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置いた。形質変換していないＳｐ２／Ｏ細胞は、ＭＰＡによるピリミジン合成の阻害のために、この培地では生長しなかった。１．５から２週間後に、形質転換した細胞を含むコロニーが、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルの上清を、ＥＬＩＳＡによって、生成物反応性タンパク質の存在に関して分析した。最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移し、グルココルチコイド受容体との相互作用の結果として、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターによる発現の増大を招く、１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェルプレートでの停止した細胞生長から生産効率を測定した。最高の生成体であるクローン２×３は、デキサメトサンの有無により、それぞれ、約２μｇ／ｍｌと７μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。
【００５７】
形質変換体の選択のためのｈｚｓ遺伝子を含むｐＩＮＧ４２２１を用いたエレクトロポレーションにより、クローン２×３を形質変換した。１０％ＦＢＳを足したＤＭＥＭ培地での４８時間にわたる再生に続いて、６μｇ／ｍｌ ＭＰＡ、２５０μｇ／ｍｌキサンチ
ン、および８ｍＭヒスチジノールを足したＤＭＥＭ／ＦＢＳ中に、約１０４個の細胞／ウェルになるように、９６ウェルプレートに細胞を置いた。形質変換していない細胞は、ＭＰＡおよびヒスチジノールの存在下では生長しなかった。 １．５から２週間後に、形質転換した細胞が、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ｒＢＰＩ反応性タンパク質の存在に関して分析した。
【００５８】
最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移した。１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェル培養での停止した細胞生長から生産効率を測定した。最高の生成体であるクローン２×３−１３０は、デキサメトサンの有無により、それぞれ、約１５μｇ／ｍｌと３０μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。次に、単離物を、９６ウェルプレートにて限界希釈法によってサブクローニングした。単一コロニーを含むウェルを、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、最高の生成体を、１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェル培養にて再試験した。最高の生成サブクローンであるＮｏ．２５は、デキサメトサンの有無により、それぞれ、約１６μｇ／ｍｌと３３μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。
【００５９】
（Ｄ．ｐＩＮＧ４１４３およびｐＩＮＧ４１５０でのＳｐ２／Ｏ細胞の形質変換）
プラスミドｐＩＮＧ４１４３は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、ヒトガンマ−１重鎖３’非翻訳領域、およびＭＰＡ−耐性細胞の選択のためのｇｐｔマーカーに沿ったマウスカッパ軽鎖３’非翻訳領域を含む。Ｓｐ２／Ｏ細胞は、ＮｏｔＩで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱したｐＩＮＧ４１４３ ＤＮＡの４０μｇを用いたエレクトロポレーションで形質変換した。エレクトロポレーションに続いて、非選択性ＤＭＥＭ培地で４８時間置いて再生した。細胞を遠心分離し、ＭＰＡ（６μｇ／ｍｌ）とキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ）を足したＤＭＥＭ培地中に５×１０４細胞／ｍｌの濃度にまで再懸濁し、そして、１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置いた。約２週間後に、形質転換した細胞を含むコロニーが、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移した。１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェルプレートでの停止した細胞生長から生産効率を測定した。最高の生成体であるクローン１３４は、デキサメトサンの有無により、それぞれ、約１２μｇ／ｍｌと２８μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。
【００６０】
Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、マウスガンマ−１軽鎖３’非翻訳領域、および形質転換体の選択のためのｈｉｓ遺伝子を含むプラスミドｐＩＮＧ４１５０をベクターとしたエレクトロポレーションでクローン１３４を形質変換した。エレクトロポレーションに先行して、ベクターをまず消化し、フェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱した。１０％ＦＢＳを足したＤＭＥＭ培地で４８時間置いて再生した後、６μｇ／ｍｌのＭＰＡ、２５０μｇ／ｍｌのキサンチン、および８ｍＭのヒスチジノールを足したＤＭＥＭ／ＦＢＳ培地中に１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置いた。形質変換していない細胞は、ＭＰＡおよびヒスチジノールの存在下では生長しなかった。約２週間後に、形質転換した細胞が、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ反応性タンパク質の存在に関して分析した。最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移した。１０−７Ｍ のデキサメトサンの有無により、２４ウェル培養での停止した細胞生長から生産効率を測定した。最高の生成体であるクローン１３４−１１は、再消化した Ｃ１７７０であった。クローンＣ１７７０は、デキサメトサン欠乏下で、３６μｇ／ｍｌの生成物を分泌し、またデキサメトサン存在下で、４２μｇ／ｍｌを越える量の生成物を分泌した。このクローン（ｃ１７７０）は、受託番号ＨＢ １１２４７として、メリーランド州、２０８５２、ロックヴィル、１２３０１パークロウンドライブに所在のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。
【００６１】
（Ｅ．ｐＩＮＧ４１４３でのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を、ｐＩＮＧ４５３３によるＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換のための、上記Ａ節に記載した方法により、ｐＩＮＧ４１４３で形質変換した。約２週間後に、単一コロニーを含む約８００個のウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。約９から １３μｇ／ｍｌの生成物を分泌する最高の生成体は、醗酵時の生長のための血清を含まない培地に適用されうる。ｒＢＰＩ生成物を高レベルで生成する細胞系を提供するために、選択マーカーとしてｈｉｓあるいはｎｅｏを有するｐＩＮＧ４１５０あるいはｐＩＮＧ４１５４のようなベクターを用いて再度形質変換する。
【００６２】
（Ｆ．ｐＩＮＧ４１４４でのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換）
Ａ−ＭｕＬｖプロモーターの代わりにヒトサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを含むことを除けば、プラスミドｐＩＮＧ４１４４は、ｐＩＮＧ４１４３と同様である。ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を、上記Ａ節に記載した方法により、ｐＩＮＧ４１４４で形質変換した。約２週間後に、単一コロニーを含む約２００個のウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最高の生成体を、２４ウェルプレートに移し、酪酸ナトリウムを入れた２４ウェルプレートにてｒＢＰＩ発現を決定した。この分析にて、最高の生成体（クローン１７４）は、酪酸塩の欠乏下で約３から５μｇ／ｍｌの生成物を、また５ｍＭ酪酸塩の存在下で約１５から１８μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。クローンＣ１７７１と改めて命名したこのクローンは、受託番号ＣＲＬ
１１２４６として、メリーランド州、２０８５２、ロックヴィル、１２３０１パークロウンドライブに所在のアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されている。最高の生成体は、醗酵時の生長のための血清を含まない培地に適用されうる。 ＢＰＩ生成物を高レベルで生成する細胞系を提供するために、選択マーカーとしてｈｉｓあるいはｎｅｏを有する、ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのＢＰＩ遺伝子を含む、ｐＩＮＧ４１５１あるいはｐＩＮＧ４１５５のようなベクターを用いて再度形質変換されうる。
【００６３】
（Ｇ．ｐＩＮＧ４１４３でのＮＳＯ細胞の形質変換）
ＮＳＯ細胞を、ｐＩＮＧ４１４３を用いたエレクトロポレーションで形質変換した。
約３週間後に、形質変換した細胞からなるコロニーが、９６ウェルプレートにて観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、 ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最高の生成体を、２４ウェルプレートに移した。生産効率を、細胞の生長が停止した２４ウェル培養にて測定した。最高の生成体は、１５から１６μｇ／ｍｌの生成物を分泌した。最高の生成体は、より生成能の優れた生成体を得るために、上記したようにして、ｐＩＮＧ４１５０のようなベクターで再度形質変換されうる。
【００６４】
（Ｈ．ｐＩＮＧ４１４３でのＮＳＯ細胞の形質変換）
ベクターｐＥＥ１３［Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９−１７５（１９９２）］にクローニングされた至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列に融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡを含むｐＩＮＧ４１３２を用いたエレクトロポレーションによってＮＳＯ細胞を形質変換した。ベクターｐＥＥ１３は、グルタミンが欠乏した培地でも生長できる形質変換体を選択するためのグルタミン合成遺伝子を含んでいる。
【００６５】
約３週間後に、形質変換した細胞からなるコロニーが、９６ウェルプレートにて観察された。単一コロニーを含むウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって分析した。
最高の生成体を、２４ウェルプレートに移した。生産効率を、細胞の生長が停止した２４ウェル培養にて測定した。７から１５μｇ／ｍｌの生成物を２４ウェル培養で分泌した最
高の生成体は、様々な濃度のメチオニンスルホキシミンの存在下での増幅に適用されうる。
【００６６】
（Ｉ．ｐＩＮＧ４１４５でのＳｐ２／０細胞の形質変換）
プラスミドｐＩＮＧ４１４５は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードするＤＮＡ、至適化したＫｏｚａｋの翻訳開始配列、マウスカッパ軽鎖３’非翻訳領域、およびＭＰＡ−耐性細胞の選択のためのｇｐｔ遺伝子を含む。 Ｓｐ２／Ｏ細胞は、Ｎｏｔ Ｉで消化し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱したｐＩＮＧ４１４５ ＤＮＡの４０μｇを用いたエレクトロポレーションで形質変換した。エレクトロポレーションに続いて、非選択性ＤＭＥＭ培地で４８時間置いて再生し、細胞を遠心分離し、ＭＰＡ（６μｇ／ｍｌ）とキサンチン（２５０μｇ／ｍｌ）を足したＤＭＥＭ培地中に５×１０４細胞／ｍｌの濃度にまで再懸濁した。そして、１０４細胞／ウェルの割合で９６ウェルプレートに置いた。約２週間後に、形質転換した細胞を含むコロニーが、９６ウェルプレートで観察された。単一コロニーを含むウェルの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最も良好な生成体を２４ウェルプレートに移し、１０−７Ｍのデキサメトサンの有無により、２４ウェルプレートでの停止した細胞生長から生産効率を測定した。ＢＰＩの発現を最高ならしめるために、最高の生成体であるＳｐ２／Ｏ形質転換体は、Ａ−ＭｕＬｖプロモーターに融合したｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２をコードする遺伝子配列、および形質転換体の選択のためのｈｉｓ遺伝子を有するマウスカッパ軽鎖３’非翻訳領域を含むベクターを用いたエレクトロポレーションによって形質変換されうる。
【００６７】
（Ｊ．ｐＩＮＧ４１４５でのＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質変換）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を、上記Ａ節に記載した方法により、ｐＩＮＧ４１４５ＤＮＡで形質変換した。約２週間後に、単一コロニーを含む約５００から８００個のウェルからの上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＢＰＩ−反応性タンパク質の存在に関して分析した。最高の生成体を２４ウェルプレートに移し、Ｓ−セファロースを含む２４ウェルプレートにてＢＰＩ発現を決定した。この最高の生成体は、次に、醗酵時の生長のための血清を含まない培地に適用されうる。ｒＢＰＩ生成物を高レベルで生成する細胞系を提供するために、異なる選択マーカーを含むベクターを用いて、これらは再度形質変換されうる。
【００６８】
（Ｋ．昆虫細胞からのｒＢＰＩ生成物の発現）
ｒＢＰＩ生成物が発現しうる他の真核細胞系は、ｒＢＰＩ生成物をコードするＤＮＡを含む組換えバキュロウィルスで感染した昆虫細胞である。組換えウィルスを生成し、またそこからの組換え生成物の発現を達成するシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）が、通常利用されている。 ３１個のアミノ酸シグナル配列を含むｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡは、ｐＢ１ｕｅＢａｃ転移ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＮｈｅＩ部位にクロ−ニングされる。Ｓｆ９昆虫細胞（ＢＲＬ社、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）を、このベクターと、野性型ＡｃＭＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ多核ポリヒドロシスウィルス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて共形質変換した。組換えウィルスプラークを同定し、精製し、そして、 ＢＲＬ社から入手した実験説明書に従って、より高い力価の組換えウィルス性株を生成するために用いた。
【００６９】
組換え生成したバキュロウィルスを、Ｓｆ９細胞をさらに感染するために用いた。これを行うために、８つの６０ｍｍ皿に置いたＳｆ９細胞を、バキュロウィルスで感染させた。感染した細胞を入れた皿から培地を回収することで、日中の間に、異なる時間に８つの各皿から試料を採取した。試料が回収されると、培地を １０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離し、その上清を４℃で保管した。４ｍｌのＰＢＳで一度細胞を洗浄し、そして、氷上で３０分間インキュベートして、 １００μｌ／皿のＮＰ４０溶菌緩衝液（１％ＮＰ４
０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０）で溶菌した。そして細胞を、細胞掻き取り器で、エッペンドルフ管に回収した。細胞溶解物を、２分間、マイクロ遠心分離した。溶解物の上清を、新しい管に移し、そして、−２０℃で保管した。毎日の採取時間に得られた培地試料は、ＥＬＩＳＡによってＢＰＩ含量が分析され、そして、溶解物を抗−ＢＰＩ抗体を用いたウェスターン法によって解析した。
【００７０】
感染後１から４日の培地のＥＬＩＳＡ分析においては、ｒＢＰＩ生成物は検出されなかった。しかしながら、感染後５から６日目では、培地試料から、２００− ５００ｎｇ／ｍｌのｒＢＰＩ生成物のピークが検出された。溶解物のウェスターン分析は、感染後２日目の試料にて、約２３ＫｄのＢＰＩ−反応性バンドが認められた。このバンドは、６日目の試料まで強度を高めながら認められた。
【００７１】
下記表２は、上記ＡからＪ節での形質変換の内容をまとめたものである。
【００７２】
【表２】
（実施例３）
（ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２およびｒＢＰＩ（１−１９９）Ｓｅｒ１３５のｉｎ ｖｉｔｒｏ での転写および翻訳のためのプラスミドの構築）
ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡの源としてのプラスミドｐＩＣ１２７を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳の研究を行った。ｐＩＣ１２７の構築は、以下のようにして行った。３１個のアミノ酸シグナル配列を含むｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡを、ｐＧＥＭ−７２ｆ（＋）にあるＢＰＩをコードするｃＤＮＡの全長を含んだプラスミドからＰＣＲ増幅した。プライマーＢＰＩ−３：ＧＴＣＧＡＣＧＣＡＴＧＣＧＡＧＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣ（配列番号：１２）およびＢＰＩ−２： ＣＣＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴ（配列番号：９）を用いて、ｒＢＰＩをコードする配列の３’端にＸｈｏＩとＳｓｔＩＩ部位を、また、５’端にＳａｌＩ部位が組み込まれるようにして増幅を行った。得られたＰＣＲ増幅した断片は、ｐＩＣ１０２を生成するために、プラスミドｐＴ７Ｔ３ １８ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）のマルチプルクローニング領域のＳｍａＩ部位にその切断端をクローニングした。
【００７３】
ｒＢＰＩ（１−１９９）および３１個のアミノ酸シグナルをコードするｐＩＣ１０２挿入体を、Ｂａｍ ＨＩとＡｓＰ ７１８１を用いたプラスミドの消化により切り出した。
Ｂａｍ ＨＩ部位は、ｐＩＣ１０２のＳａｌＩ部位を、また、ＡｓＰ ７１８Ｉ部位はｐＩＣ１０２のＳｓｔＩＩ部位をそれぞれ切断した。切り出した断片の末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化され、そして、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩでまず消化され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化したプラスミドｐＧＥＭ１（ＰｒｏＭｅｇａ社、マジソン、ウィスコンシン州）へその平滑化断片はクローニングされる。得られた構築体はｐＩＣ１２４と命名され、５’端がｐＧＥＭ１のＳｐ６プロモーターに近接するよう置かれた挿入体をコードするｒＢＰＩ（１−１９９）を有している。
【００７４】
ｐＩＣ１２４挿入体の３１個のアミノ酸シグナル配列は、ｐＩＣ１２７を生成するために、ｐＩＣ１２４の二つのＨｉｎｃＩＩ部位の間の領域を削除することで切り出した。切り出した領域は、開始コドン（ＡＴＧ）とＢＰＩの最初のアミノ酸をコードする配列を復元するリンカーで置換した。ＨｉｎｃＩＩおよび ＳｓｔＩＩを用いたｐＩＣ１２４消化から二つの断片が単離された。すなわち、（１）最初のアミノ酸を除くｒＢＰＩ（１−１９９）コード領域を含む ＨｉｎｃＩＩ−ＳｓｔＩＩ断片、および（２）そのプラスミドの他の部分を含むＳｓｔＩＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片である。 ＢＰＩコード配列での最初のコドンならびにＢＰＩ配列の前のメチオニンのためのコドンを、二つの相補性ヌクレオチド、ＢＰＩ−２８： ＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣ（配列番号：１３）およびＢＰＩ−２９：ＧＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＣ（配列番号：１４）から形成したリンカーを用いて挿入した。これら二つのオリゴヌクレオチドは、ｐＩＣ１２７を形成するために、ｐＩＣ１２４からのＨｉｎｃＩＩ−ＳｓｔＩＩ断片およびＳＳｔＩＩ− ＨｉｎｃＩＩ断片で共に連結した。
二つのプラスミド、ｐＭＬ１０１およびｐＭＬ１０２を、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２およびｒＢＰＩ（１−１９９）Ｓｅｒ１３５のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳のためにｐＩＣ１２７を用いて構築した。
【００７５】
これを行うために、ＳａｌＩとＥｃｏ ＲＩでｐＩＣ１２７を消化し、大きなＳｓｔＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片を精製した。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２挿入体を含むｐｍＬ１０１を構築するために、ｐＩＮＧ４５１９からのＥｃｏ ＲＩ−ＳｓｔＩＩを、ｐＩ１２７からのＳｓｔＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片に連結した。ｒＢＰＩ（１−１９９）Ｓｅｒ１３５挿入体を含むｐＭＬ１０２を構築するために、ｐＩＮＧ４５２０からのＥｃｏ ＲＩ−ＳｓｔＩＩを、ｐＩ１２７からのＳｓｔＩＩ−Ｅｃｏ ＲＩ断片に連結した。
【００７６】
ＰｒｏＭｅｇａ社（マジソン、ウィスコンシン州）の網状赤血球溶解システムと組み合わせたＴＮＴ ＳＰ６を用いて、ｒＢＰＩ（１−１９９）、ｒＢＰＩ（１−１９９）Ｓｅｒ１３５およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２を、 ｉｎ ｖｉｔｒｏでプラスミドｐＩＣ１２７、ｐＭＬ１０６、およびｐＭＬ１０２から発現させた。このシステムは、真核生物翻訳システムを用いて、クローニングした遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写と翻訳の組み合わせを可能ならしめる。組み合わせた転写／翻訳のそれぞれは、標識したタンパク質を生成するための３５Ｓ− メチオニンを含み、全量２５μｌ中の２μｇのプラスミドＤＮＡを用いて、製造業者の実験説明書に従って行った。標識したタンパク質を、５μｌずつ、 ２０μｌの尿素試料緩衝液に添加し、そして、９５℃で、３分間加熱した。各試料の画分（１０μｌ）を、ＤＤＴ（５０ｍＭ）を使用あるいは使用せずして、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルポリアミドゲルに適用した。ゲルを固定して乾燥した後、標識したタンパク質バンドを、オートラジオグラフィーで視覚化した。オートラジオグラフィーの結果は、ｒＢＰＩ（１−１９９）、ｒＢＰＩ（１−１９９）ｃｙｓ１３５およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２をコードするｃＤＮＡが、ＢＰＩＮ末端断片の約２３Ｋｄの予想された大きさのタンパク質生成物を発現したことを実証したのである。さらに、三つの発現したすべての生成物、ｒＢＰＩ（１−１９９）、ｒＢＰＩ（１−１９９）ｃｙｓ１３５およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２が、ＤＴＴによる還元で消失する、ＢＰＩ（１−１９９）の二量体に関して予想していた以上の大きな分子量ならびに分子種を
生成できる。ｒＢＰＩ（１−１９９）ｃｙｓ１３５およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２における二量体生成物の発現が、細胞を含まないｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳システムを用いた結果によるものと考えられる。
【００７７】
このようなシステムでは、細胞における翻訳にて通常発生する、適切な翻訳後の処理、保存等を維持できない。よって、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムでは適切なジスルフィド結合は形成されず、場合によっては、二量体の形成に至る可能性がある。
上記したｉｎ ｖｉｔｒｏ発現システムにて生成した標識付けしたタンパク質を、ＬＰＳ結合活性について試験した。マイクロタイタープレートのウェルを、ｐＨ ９．４の０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３／２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）中のＳａｌｍｏｎｒｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ７（Ｒｄ変異体）（メタノール保管培養基中の５ｍｇ／ｍｌ）からのＬＰＳ（５０μｌウェルの全量で２μｇのＬＰＳ）で被覆した。４℃で、一晩インキュベートした後、ウェルを水で洗浄し、３７℃で乾燥した。次に、ウェルを２１５μｌの Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを用いて、３７℃で、３時間ブロックした。ブロック溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎ− ２０で洗浄した。ｒＢＰＩ試料を、ＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎに全量が５０μｌ（翻訳反応物の２μｌ）となるよう添加した。
【００７８】
４℃ で、一晩インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで三回洗浄し、各ウェルに残った標識したタンパク質の量を、液体シンチレーションカウンターで決定した。その結果は、ほぼ等価のＬＰＳ結合が、上記した三つのすべてのＢＰＩ種にとって代わっていたことが実証された。ｒＢＰＩ（１−１９９）は４８，６９０ｃｐｍの結合を、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２は５９，９１１ｃｐｍの結合を、またｒＢＰＩ（１−１９９）ｃｙｓ１３５は５２，５３７ｃｐｍの結合を示し、上記した数値のそれぞれは、３回の決定値の平均を示す。対照（ＤＮＡ無し）の平均結合値は、５，３９５ｃｐｍであった。
【００７９】
（実施例４）
（生成物の特徴）
（Ａ．物理的特徴）
ｒＢＰＩの生成物の特徴付けを、逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣ、陽イオン交換（ＭＡ７Ｃ）ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および電子噴射イオン化質量分光測定法（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて実施した。
【００８０】
特徴付けを行うｒＢＰＩ生成物を、ローラボトルあるいは１０Ｌの醗酵槽収穫機から、単段階精製手段あるいは多段階精製手段のいずれかによって特徴付けた。単段階精製手段は、本明細書にて参考として組み込んだ、共同所有に係る、係属中のＧｒｉｎｎａによる、第二洗浄工程も備えた、米国特許出願Ｎｏ． ０８／０７２，０６３にて実質的に開示されたものである。要約すれば、ｒＢＰＩ生成物を含む成長培地に、Ｓ−セファロースビーズが添加されている。Ｓ−セファロースは培地から除去され、ｐＨ４．０にて、２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび１００ｍＭ塩化ナトリウムで洗浄される。第二の洗浄は、ｐＨ４．０にて、 ２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび７００ｍＭ塩化ナトリウムで行われる。精製したｒＢＰＩ生成物を、ｐＨ４．０にて、２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび １７００ｍＭ塩化ナトリウムで溶出する。
【００８１】
多段階精製は、上記したようにしてまず個別に精製したｒＢＰＩ生成物の精製を含む。単段階精製法で２０のｒＢＰＩ生成物の各々を精製した後、各ｒＢＰＩ生成物を貯蔵し、２００ｍＭにまで貯蔵生成物の塩濃度を希釈する。そして、貯蔵した試料を、Ｓ−セファロースカラムに負荷し、ｐＨ４．０にて、２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２００ｍＭ塩化ナトリウムに続いて７００ｍＭ塩化ナトリウムで洗浄する。ｐＨ４．０にて、２０ｍＭ酢
酸ナトリウムおよび１０００ｍＭ塩化ナトリウムを用いて、ｒＢＰＩ生成物を溶出した。そして、精製したｒＢＰＩ生成物を、その物理的特徴を決定するために分析した。
【００８２】
（１．ｒＢＰＩ生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）
ｒＢＰＩ生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、１４％ポリアクリルアミドゲルおよび、還元あるいは非還元条件下でのｔｒｉｓ−グリシン緩衝液システムを用いて実施した。視覚化のためにクーマシーブルーあるいは銀染色のいずれかによって、タンパク質バンドを染色した。
【００８３】
図１に示したように、非還元ｒＢＰＩ（１−１９９）は、約２３Ｋｄに主要なバンドが、また、約４０Ｋｄに小さなバンドが認められる。この主要なバンドは、同時に行った標準との比較からｒＢＰＩ（１−１９９）と同定され、また、小さなバンドは、免疫染色によってｒＢＰＩ（１−１９９）の二量体であると同定された。 ｒＢＰＩ（１−１９９）の個別の試料に１／２０容量の０．４Ｍジチオトレイトール（ＤＤＴ）を添加することで、上記したような非還元条件下にて同定された ｒＢＰＩ（１−１９９）の２３Ｋｄの二量体種に対応する単一の明確なバンドを示した。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、還元条件下で単一の２３Ｋｄ ｒＢＰＩ（１−１９９）と共に移動する単一のバンドを示された。非還元条件下では、（２３Ｋｄのバンドに対応する）ｒＢＰＩ（１−１９９）について認められる近接する二つのバンドの迅速な移動にあわせて、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２が移動した。図２に示したように、これら結果は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２が精製後には単量体の形態で存在することを示すものである。このように、システイン残基がアラニンで置換されたｒＢＰＩ生成物は、二量体の形成に対して顕著な抵抗性を示した。
【００８４】
（２．ｒＢＰＩ生成物の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析）
ＭＡ７Ｃカラムを用いた陽イオン交換ＨＰＬＣも、ｒＢＰＩ生成物の二量体の程度を測定するために使用した。４０％緩衝液Ｂ（２０ｍＭＭＥＳ、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ ５．５）で、１．０ｍｌ／分で平衡化したＢｉｏ−Ｒａｄ ＭＡ７Ｃカートリッジ（４．６×３０ｍｍ、Ｂｉｏ−ＲａｄカタログＮｏ．１２５−００５５６）を使用した。ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物を、１ｍｌの試料を、１００μｇ／ｍｌにまで希釈し、２００μｌの希釈試料をカラムに注入して分析した。ｒＢＰＩを、４０から１００％の緩衝液Ｂの勾配で、６分間にわたって溶出した。緩衝液Ａは、ｐＨ ５．５にて２０ｍＭ ＭＥＳを含んでいた。２２９ｎｍにて吸収度を測定した。
【００８５】
ｒＢＰＩ（１−１９９）の分析にて、二つのピークが現れた。最初のピークは、図３に示すように、約３分間の保持時間で溶出されたものであった。第二のやや小さいピークは、約６分間にて溶出されたものであった。図３に示すように、最初のピークは、ｒＢＰＩ（１−１９９）単量体であり、また、図３の第二のピークは、精製した単量体および二量体標準の保持時間との比較から、ｒＢＰＩ（１−１９９）の二量体であると決定された。カラムに注入する前にＤＴＴで試料を還元した場合には、第二の（二量体）ピークは認められなかった。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の溶出パターンを決定するために、同じ手順を踏んだ。 図４に示したように、ｒＢＰＩ（１−１９９）単量体ピークについて認められたピークに対応する保持時間にて、単一のピークが認められる。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２試料にて、二量体に関するデータは得られなかった。
【００８６】
（３．ｒＢＰＩ生成物の逆相（Ｃ４）ＨＰＬＣおよび電子噴射）
イオン化質量分光測定法による分析 ｒＢＰＩ生成物の微小な不均一性が、逆相ＨＰＬＣおよび電子噴射イオン化質量分光測定法（ＥＳＩ−ＭＳ）によって示された。ＨＰＬＣ分析のために、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＢＵ−３００ Ｃ４カラムを、流速０．５ｍｌ／分で、３７％移動相Ｂ（８０％アセトニトリル／ ０．６５％ＴＦＡ）で平衡化した。ｒＢＰ
Ｉ（１−１９９）の試料（各１ｍｌ）を、１００μｌ／ｍｌにまで希釈し、その５０ｍｌを注入した。カラムを、 ２．５分間にわたって３７％移動相Ｂで洗浄し、３７から５０％の移動相Ｂの勾配で、２０分間にわたって溶出した。移動相Ａは、５％アセトニトリル
／０．１％ＴＦＡであり、２２０ｎｍで吸収度を測定した。
【００８７】
ｒＢＰＩ生成物の逆相ＨＰＬＣでの結果を、図５に示した。第二ピークの先端に部分的に崩れた第一（小さな）ピークを伴う第二（主要）ピークとして、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物は溶出した。第二ピークに対応するピークだけが、ＤＴＴで還元すれば、カラムから溶出した。
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物を分析するために、同じ手順を踏んだ。図６に示したように、上記した第二（主要）ピークに対応する単一ピークとして、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２は溶出した。
【００８８】
三つの異なるｒＢＰＩ（１−１９９）からの、上記した第一および第二ＨＰＬＣピークに対応する溶出液は単離され、ＥＳＩ−ＭＳによる含量の決定のために分析された。ｒＢＰＩ（１−１９９）からの第二（主要）ピークを生成する溶出液の分析では、１９９個のアミノ酸タンパク質について予想された質量よりもわずかに小さい質量が示された。これらデータは、第二ピーク溶出液に認められるほとんどの質量が、１−１９３ ｒＢＰＩタンパク質断片に対応していることを示している。しかしながら、１−１９８から１−１９４の大きさの他の種も認められる。
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２に関してＨＰＬＣから取得された単一ピークを生成する溶出液の分析は、上記した第二（主要）ピークを生成する溶出液から取得したデータと同様のものであった。これらデータは、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物の切り詰めたカルボキシ末端を示すペプチドマッピングのデータと符合する。
【００８９】
ｒＢＰＩ（１−１９３）生成物に関して同じ分析を行ったところ、顕著に低減されたＣ−末端の不均一性が認められた。ｒＢＰＩ（１−１９３）生成物に関して得られたＥＳＩ−ＭＳデータは、ＢＰＩＮ末端のアミノ酸の１９１、１９３、あるいは１９３（＋Ｎ末端アラニン）のアミノ酸のいずれかを含んだ、約８５％のタンパク質含量を示した。その結果を、下記表３に示した。
【００９０】
【表３】
ｒＢＰＩ（１−１９９）をコードするＤＮＡは全長のタンパク質（すなわち、ＢＰＩ Ｎ−末端の１−１９９のアミノ酸）を生成しないが、ｒＢＰＩ（１−１９３）をコードするＤＮＡは著量のｒＢＰＩ（１−１９３）タンパク質を生成することを、これらデータは実証している。これらデータおよび他のデータから、ｒＢＰＩをコードするＤＮＡを切り詰めた形態とすることで、不均一性の顕著な減少と、意図したタンパク質（すなわち、挿入したＤＮＡがコードしたもの）の生成が増大する一方で、至適な殺菌性とＬＰＳ−結合活性が維持される。第１７５位のアミノ酸残基であるシステインを越えないように、発現しようとするＤＮＡを切断することが、発現生成物の不均一性を顕著な低減をもたらすものと思われる。ＢＰＩ Ｎ−末端の最初の１７６個のアミノ酸からＢＰＩ Ｎ−末端の最初の１９３個のアミノ酸の範囲のｒＢＰＩをコードする切断したＤＮＡの発現生成物も、十分な殺菌性とＬＰＳ−結合活性を保持することが期待される。
ＥＳＩ−ＭＳデータも、ｒＢＰＩ生成物のアミノ末端での微小な不均一性の存在を示した。アミノ末端にアラニン残基を有するｒＢＰＩ生成物の形態が知見され、そして、トリプシンペプチドの配列決定によって確認された。
【００９１】
図５に示したように、第一（小さな）逆相ＨＰＬＣピークを生成した溶出液のＥＳＩ−
ＭＳ研究は、各質量値が約１１９−１２０ｋＤａ大きいことを除けば、それが、第二（主要）
ピークを形成するタンパク質と同様の質量分布を有するタンパク質であることを示した。これらデータは、上記した第一（小さな）逆相ＨＰＬＣピークを生成した溶出液が、質量値の均質な移動に寄与する、ジスルフィド結合したシステイン付加物を含むことを示唆している。
【００９２】
ｒＢＰＩ（１−１９９）によって形成された第一（小さな）逆相ＨＰＬＣピークがシステイン付加物によるものとする仮説を試験するために、モル数的にほぼ等価の遊離メルカプト基に結合するエルマン試薬（ジチオニトロ安息香酸、ＤＴＮＢ）にｒＢＰＩ（１−１９９）を曝した。かような処理をすることで、ｒＢＰＩ （１−１９９）の１モル当たりに１モルに満たない遊離メルカプト基があることが実証された。ＢＰＩ（の第１３２、１３５および１７５位）に、三つのシステイン残基があったと仮定した場合、ｒＢＰＩ生成物には分子間のジスルフィド結合もあるということ、あるいはメルカプト基の二つが立体的に利用できない、とする考えをこれら結果は支持することになる。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２は、エルマン試薬とは反応性を示さなかった。
【００９３】
（４．ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物の保存安定性）
２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液、０．１％ポロキサマー、および０．００２％ポリソルベート８０を含むｐＨ５．０の緩衝液中のｒＢＰＩ（１−１９９）の試料（１ｍｇ／ｍｌ）を、好ましいとされる保管温度２から８℃と、高めの保管温度２２℃と３７℃で、８週間にわたってその保存安定性を決定すべく分析を行った。
表４に示した、２から８℃での保存の結果は、二量体の割合の（１％から４％への）増大が示されているが、システイン付加物あるいは試料中の粒子形成において顕著な増大は認められなかった。
【００９４】
【表４】
しかしながら、２２℃と３７℃の高めの保管温度の場合、試料中の二量体と粒子が飛躍的に増大し、システイン付加物の量も緩やかながらも増えている。これら結果を、表５に示した。さらに、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２を２２から３７℃で保存した場合、二週間保存した後でも二量体は検出されなかった。同様の条件下で、ｒＢＰＩ（１−１９９）は顕著な増大を示した。
【００９５】
【表５】
（５．ｒＢＰＩ薬剤組成物の濁度）
薬剤組成物を含む様々なｒＢＰＩの濁度を決定するための実験を行った。この実施例にて、濁度とは薬剤組成物の崩れ（すなわち、タンパク質の三次元構造の喪失）、および／または粒子形成（大きな（＞１０μｍ）粒子を形成する各タンパク質間の相互作用）に関係する程度を指す。試験した薬剤組成物は、クエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０）、あるいは０．１％ポロキサマー１８８（ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーを含むポロキサマー界面活性剤）および０．００２％ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含むポリソルベート界面活性剤）を含むクエン酸緩衝液中のいずれかにある、ｒＢＰＩ（１−１９９）、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２あるいはｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２のいずれかを含んでいた。上述したように、ポロキサマー／ポリソルベート界面活性剤系の組み合わせの使用は、本明細書に参考までに取り入れた、共同所有に係る、ＭｃＧｒｅｇｏｒ，ｅｔ ａｌによる、係属中の、１９９３年２月１日に出願された米国特許出願Ｎｏ． （代理人整理番号２７１２９／３１１６２）に教示されたような薬剤組成物を安定ならしめるのである。
【００９６】
ｐＨ７．０あるいは５．０での上昇した温度にて、経時的な濁度を決定するために試料を分析した。分析に先駆けて、ｐＨ ７．０で、５０ｍＭ燐酸カリウムあるいは２０ｍＭクエン酸緩衝液のいずれかで、すべての試料を、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度にまで希釈した。循環水用水槽に温度制御したキュベットホルダーを備えた、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−１６０ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、プラサントン、カリフォルニア州）に適用するために、試料を石英キュベットに置くことから濁度の測定は始まった。所望の温度（５７℃、６５℃あるいは８５℃、下記参照）にまでキュベットホルダーを平衡させ次第、試料が適当な濃度にまで希釈されたかどうかを確認するために、２８０ｎｍで吸
収度を測定した。これに続いて、吸収度の経時的な変化を決定するために、３５０ｎｍでの試料の吸収度を２分ごとに１時間にわたって計測した。
【００９７】
その結果を図７に示した。図７にて「製剤化した」とは、ｒＢＰＩ生成物が上記したポロキサマー／ポリソルベートの組み合わせを含むクエン酸緩衝液中にあること、そして、「非製剤化」とは、単にクエン酸緩衝液中にｒＢＰＩ化合物があることを意味する。濁度の低率での変化（すなわち、計測中の吸収度の低率での増大）は、粒子の崩壊と形成に対する安定性の増大を意味する。図７に示したように、上記した界面活性剤の組み合わせを添加することで、試験したすべての組成物の安定性（粒子形成と崩壊に対する抵抗性）がもたらす結果となった。 さらに、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２およびｒＢＰＩ（１−１９３）ａｌａ１３２は、先の界面活性剤の組み合わせの有無にかかわらず、野性型組成物の場合からして、粒子形成と崩壊に対する抵抗性が非常に改善されていた。ｐＨ５．０と６５℃、ｐＨ５．０と７５℃および８５℃の各条件でも、同様の結果が得られた。
【００９８】
総合すれば、界面活性剤の組み合わせおよび／またはシステインの削除は、野性型ＢＰＩ（１−１９９）Ｎ−末端構造を有し、および／または界面活性剤を含まない組成物と比較して、試験期間において、また温度上昇を伴っても、それによる安定性の顕著な増大が認められた。
【００９９】
（Ｂ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の特徴）
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、ＬＰＳへ生成物を結合することにより、ＬＡＬ阻害分析によって、また、生成物の殺菌性強度により決定した。
【０１００】
（１．ＬＰＳへのｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の結合）
Ｅ．ｃｏｌｉ（０１１１−Ｂ４株）あるいはＳ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（Ｒｄ変異体）リポ多糖（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、モンタナ州）の試料（それぞれ、２０μｇから６０μｇ）を、ＬＰＳへのｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物の結合能力を決定するために用いた。
【０１０１】
ＬＰＳ試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥでサイズ分画化し、そして、視覚化のための銀染色、あるいは標準の適切な前染色を行ってからニトロセルロース膜（ＢＡ２５、 Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、キーン、ニューメキシコ州）に電気転移した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ塩化ナトリウム（ＴＢＳ）、および３０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．４の溶液に、３７℃で、３０分間にわたって浸すことでＬＰＳの痕跡を作成した。そして、部分的あるいは全体的に精製したｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の２から４μｇ、あるいは対照タンパク質（ｒＢＰＩ（１−１９９）またはｒＢＰＩホロタンパク質のいずれか）を含む溶液に、２１から４２℃で、１２から１８時間かけて、膜をインキュベートした。インキュベーションの後、膜をＴＢＳ−ＢＳＡで洗浄した。３０分間隔で、溶液を少なくとも３回交換した。洗浄した膜を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳで１：１０００に希釈したウサギ抗ｒＢＰＩ（１−１９９）で、３時間にわたってインキュベートした。膜をさらに少なくとも３回洗浄し、Ｉ−ブロックに代えて５×ＰＢＳおよび０．２５％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、製造業者の指示に従って、化学ルミネセンス検出システム（Ｔｒｏｐｉｘ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）に適用した。
【０１０２】
そして、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２が、ｒＢＰＩ（１−１９９）と同等あるいはそれ以上良好にニトロセルロースに固定したＬＰＳに結合する結果が得られた。
【０１０３】
（２．Ｅ．ｃｏｌｉ成長阻害の分析）
ｒＢＰＩ生成物の殺菌性強度を決定するために、Ｅ．ｃｏｌｉをｒＢＰＩ（１−１９９）またはｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体で処理し、殺菌性活性の測定として培地での成長阻害を観察することで、Ｅ．ｃｏｌｉの培地での成長阻害の分析を行った。Ｊ５（Ｅ．ｃｏｌｉ株 ０１１１：Ｂ４のＵＤＰ−４−エピメラーゼの少ない自然変異体）と命名された、短鎖ＬＰＳを有するＥ．ｃｏｌｉの「自然」株をこの分析にて用いた。ＢＰＩ に対する感受性をＥ．ｃｏｌｉに付与する、トリエタノールアミンで緩衝化した鉱物塩培地（Ｓｉｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｚ，５１：８７７（１９６４））にて細胞を成長させた。 細胞を洗浄し、約５×１０８細胞／ｍｌの密度になるまで、０．９％塩化ナトリウム中で再懸濁を行った。
【０１０４】
約５×１０６から１×１０７のＥ．ｃｏｌｉ細胞を、２００から４００ｍｌの緩衝液（１０％ハンクス液、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、０．１％カザミノ酸）で、５μｇ／ｍｌの濃度のｒＢＰＩ（１−１９９）またはｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体のいずれかと共に、３０から６０分間にわたってインキュベートした。加えて、ｒＢＰＩ（１−１９９）またはｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体のいずれかと、１００ｍＭ塩化マグネシウムを用いて分析を個別に行った。インキュベーションに続いて、０．９％の塩化ナトリウムを足した１０倍量の栄養培地で細胞を希釈した。数時間にわたって、培地での成長を観察した。
【０１０５】
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体が、ｒＢＰＩ（１−１９９）と同等あるいはそれ以上の殺菌活性を有することを実証する結果が得られた。ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体とｒＢＰＩ（１−１９９）の双方の殺菌性活性は、塩化マグネシウムによって、予想していた通り低減していた。
【０１０６】
（３．ＬＡＬ阻害の分析）
ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の ＬＰＳへの結合性を決定するために、ＬＡＬ阻害検定を行った。ＬＡＬ阻害検定は、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６０： ４７５４−４７６１（１９９２）に記載した方法を使用した。ＬＡＬ検定の結果は、ｒＢＰＩ（１−１９９）と同等の１０というＩＣ−５０値を、ｒＢＰＩ（１ −１９９）ａｌａ１３２が有していたことを実証するものであった。
これらデータは、ＬＰＳに結合するための野性型ｒＢＰＩ生成物に類似体が匹敵することを示すものである。
【０１０７】
（Ｃ．致命的な内毒素血症の動物モデルでのｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の効果）
内毒素血症の動物モデルを、内毒素ショックに対するｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２類似体とｒＢＰＩ（１−１９９）の効果の比較を行うために用いた。
【０１０８】
雄のＩＣＲマウスに、８００μｇ／ｋｇのアクチノマイシン−Ｄと、０．５μｇ／ｋｇあるいは１．０μｇ／ｋｇのいずれかの内毒素（Ｅ．ｃｏｌｉ，０１１１：Ｂ４株）を静脈注射した。内毒素の注射後直ちに、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２あるいはｒＢＰＩ（１−１９９）のいずれか（０．５ｍｇ／ｋｇあるいは５．０ｍｇ／ｋｇ）を、マウスに静脈注射した。緩衝化した賦形剤を対照として用いた。７日間にわたってマウスの死を記録した。その結果を、下記表６に示した。
【０１０９】
【表６】
表６にあるように、ｒＢＰＩ（１−１９９）とｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２の双方は、内毒素の致死作用に対して顕著な防御機能を呈する。本発明を好ましい実施態様に関して記載してきたが、当業者であれば、開示した範囲内で無数の修正と変更を想到できるものと思われる。例えば、ＢＰＩ Ｎ−末端断片の第１３２位あるいは第１３５位のシステインを、アラニンあるいはセリン以外の非極性アミノ酸と置換することも本発明では意図されている。従って、本発明の範疇に課すべき限定は、添付の請求の範囲および将来に補正した請求の範囲に記した限定にとどめるべきである。
【０１１０】
【表７−１】
【０１１１】
【表７−２】
【０１１２】
【表７−３】
【０１１３】
【表７−４】
【０１１４】
【表７−５】
【０１１５】
【表７−６】
【０１１６】
【表７−７】
【０１１７】
【表７−８】
【０１１８】
【表７−９】
【０１１９】
【表７−１０】
【０１２０】
【表７−１１】
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。
【図２−１】図２は、ｒＢＰＩ（１−１９３）およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。
【図２−２】図２は、ｒＢＰＩ（１−１９３）およびｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。
【図３】図３は、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析の結果を記載している。
【図４】図４は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物の陽イオン交換ＨＰＬＣ分析の結果を記載している。
【図５】図５は、ｒＢＰＩ（１−１９９）生成物の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を記載している。
【図６】図６は、ｒＢＰＩ（１−１９９）ａｌａ１３２生成物の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を記載している。
【図７】図７は、ｐＨ ７．０、５７℃での、ポロキサマー／ポリソルベート界面活性剤の有無による、ｒＢＰＩ生成物を含む薬剤組成物の濁度に関する研究結果を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１３２位あるいは第１３５位のシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質のポリペプチド類似体あるいはその生物学的に活性な断片。
【請求項１】
第１３２位あるいは第１３５位のシステイン残基が異なるアミノ酸で置換されている、殺菌性／浸透性が向上したタンパク質のポリペプチド類似体あるいはその生物学的に活性な断片。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−３２１８１３（Ｐ２００６−３２１８１３Ａ）
【公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２０４００５（Ｐ２００６−２０４００５）
【出願日】平成１８年７月２６日（２００６．７．２６）
【分割の表示】特願２００４−１０８１３１（Ｐ２００４−１０８１３１）の分割
【原出願日】平成６年２月２日（１９９４．２．２）
【出願人】（５９４０７５８０２）ゾーマ・コーポレイション (4)
【氏名又は名称原語表記】ＸＯＭＡ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月３０日（２００６．１１．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２６日（２００６．７．２６）
【分割の表示】特願２００４−１０８１３１（Ｐ２００４−１０８１３１）の分割
【原出願日】平成６年２月２日（１９９４．２．２）
【出願人】（５９４０７５８０２）ゾーマ・コーポレイション (4)
【氏名又は名称原語表記】ＸＯＭＡ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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