殺虫ポリペプチドおよびその使用方法
アトラクス（Ａｔｒａｘ）属およびハドロニュケ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ）属のクモの毒腺で発現される殺虫ポリペプチドのファミリーを記述した。前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび発現ベクターならびに前記ポリペプチドを発現する昆虫ウィルスおよび細胞も含まれる。殺虫ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物および昆虫も記述した。殺虫ポリペプチドは、昆虫、昆虫の幼虫、および植物を処理するための方法および組成物に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
殺虫ポリペプチドおよびその使用方法に関する。
【０００２】
（相互参照文献）
本発明は、全内容を参照として本明細書に組み込まれる２００４年１１月４日に出願された米国仮出願第６０／６２５，２９７号による優先権を主張する。
【０００３】
（連邦政府の支援による研究および開発に関する声明）
米国政府は、米国国立科学財団助成金番号ＭＣＢ０２３４６３８に基づき、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
昆虫の極一部が有害生物と分類されているが、それにも拘らず、それらは世界の食糧供給の約２０％を無効にして、しかも多種多様なヒトおよび動物の病原体を伝染させる。それゆえ、有害昆虫の制御は世界中の農業上および医学上の重要事項である。昆虫などの有害節足動物は、１９４０年代におけるＤＤＴの導入以来、主として化学的殺虫剤で制御されてきた。しかしながら、米国および世界の他の地域における有害昆虫の制御は、幾つかの理由のために、複雑性が増大してきている。第１に、化学的制御は、昆虫集団をダーウィン的選別にかけ、結果として、５００種を超える節足動物が、１種以上の化学的殺虫剤に対する耐性を発達させた。第２に、対象でない生命体への毒性など、化学的殺虫剤の望ましくない環境的および生態学的結果に対する意識の高まりが、殺虫剤の危険性評価に対してより大きい要求を入れた政府の規制改訂をもたらした。耐性発達または登録抹消に基づく殺虫剤種目全体の減少は、新規殺虫剤に対するますます厳しくなる登録規制と相俟って、近い将来における有効な化学的殺虫剤の備えを減少させることになりそうである。
【０００５】
過去１０年間にわたり、多くの「環境を守る」生物殺虫剤戦略が、高度に耐性の有害昆虫と戦うために提案されてきた。最近導入され、したがって大いに成功している１つの手法は、バチルスチューリンゲンシスという土壌細菌からのデルタエンドトキシンを発現する遺伝子操作したジャガイモ、トウモロコシ、およびワタ作物など、殺虫毒素を発現するトランスジェニック作物の生産である。野外実験に成功しており、食物供給に外来性タンパク質を導入する問題を取り除く別の生物殺虫剤戦略は、殺虫ペプチド神経毒を発現するように操作した昆虫特異的ウィルスの放出である。
【０００６】
多くの研究者が、クモ毒素を、農業用途のための昆虫特異的毒素の可能な資源として認めている。オメガ−アトラコトキシンとして知られるペプチド毒素の１種が、「抗ワタミノムシ」活性の毒液をスクリーニングすることによりオーストラリアのじょうご形の巣を作るクモから単離されて、米国特許第５，７６３，５６８号に開示されている。これらの化合物の１つで、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと命名されたものは、哺乳動物とは対照的に、昆虫の電位作動型カルシウムチャネル電流を選択的に阻害することが示されている。第２の、昆虫特異的ペプチド性カルシウムチャネル遮断薬の無関係なファミリーが、同じファミリーのクモから単離されて、米国特許第６，５８３，２６４号に開示されている。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，７６３，５６８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５８３，２６４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
サソリおよびクモから単離された幾つかの殺虫ペプチド毒素が殺虫剤の開発に対する有望な先駆けのように思われるとはいえ、一方、昆虫に対して迅速かつ強力に作用するが、昆虫と脊椎動物の間で異なる毒性を発揮する化合物に対する大なる必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態において、精製されたポリペプチドは、配列番号２、６、９、１２、１５、１８および２７のいずれか１つを含む。他の実施形態において、精製されたポリペプチドは、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そのポリペプチドは殺虫活性を有する。
【００１０】
さらに他の実施形態において、殺虫組成物は、殺虫剤として有効量の前出の精製ポリペプチドと農業にとって許容し得る担体とを含む。
【００１１】
他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする。さらにまた他の実施形態においては、単離されたポリヌクレオチドが、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードしている。
【００１２】
他の実施形態においては、発現ベクターが、発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
さらにまた他の実施形態においては、宿主細胞が、発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【００１４】
一実施形態においては、昆虫ウィルスが、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
一実施形態においては、トランスジェニックな昆虫が、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、昆虫または昆虫の幼虫を処理する方法は、昆虫または昆虫の幼虫と、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの殺虫に有効な量とを接触させることを含む。一態様において、植物を処理する方法は、植物と、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの殺虫に有効な量とを接触させることを含む。
【００１７】
さらに他の態様においては、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するトランスジェニック植物が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上記のおよび他の特徴は、以下の詳細な説明、図面、および付随の特許請求の範囲から、当業者により認識され、理解されるであろう。
【００１９】
本発明は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ポリペプチドはアトラクス（Ａｔｒａｘ）属またはハドロニュケ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ）属のクモ毒成分である。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドは、単独で、または他の殺虫ポリペプチドもしくはそれらの遺伝子と併用してのいずれでも殺虫剤として使用することができる。殺虫剤または殺虫剤組成物は、１種以上の昆虫に対して毒性であるものである。殺虫活性とは、昆虫を殺すかもしくは麻痺させるか、または、例えば、農業用途において、昆虫が植物に与える損害が減少し、しかも植物収量は有意な副作用を受けないように、昆虫の発生もしくは成長を阻止するポリペプチドの能力を指す。殺虫活性を有するポリペプチドは、昆虫に対して毒性であることも意味している。殺虫特異性とは、１種以上の昆虫種の対するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの特異性のことである。ＬＤ５０は、試験した昆虫の５０％の死を生ずるＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの用量である。
【００２０】
本明細書で使用するＵ−ＡＣＴＸまたはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたはそのホモログを含む。一実施形態において、成虫および／または幼虫の昆虫に毒性である殺虫ポリペプチドが提供され、該ポリペプチドは約４，３００ダルトンの分子量および３８から３９アミノ酸残基の長さを有する。一実施形態において、ポリペプチドは、３つの鎖内ジスルフィド結合を形成することができる。殺虫活性は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを注入された昆虫における、最終的には死に至る無制御の過剰な興奮の昂進により示すことができる。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、イエバエ Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、イエコオロギ Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、および他の昆虫種などの昆虫に注入されたときに、非可逆的毒性を惹起することができる。
【００２１】
成熟Ｕ−ＡＣＴＸ配列は、例えば、オーストラリアのじょうご形の巣を作るクモの毒から前もって単離された昆虫毒素のオメガ−ＡＣＴＸ−１ファミリーなど以前に単離された昆虫ペプチド毒素と５０％未満の配列同一性を示す。オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを注入された昆虫が痙攣性麻痺に続く死を示すのに対して、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは注入された昆虫に、麻痺と死に先行する無制御の過剰興奮を誘起する。このように、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、以前にキャラクタライズされているオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと相違する様式の作用を有する。
【００２２】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、成熟ポリペプチドまたはプレプロポリペプチドの形態をとることができる。学説に捉われず、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの生物活性形は、成熟ポリペプチドを生成する、プレプロポリペプチド前駆体の翻訳後のタンパク質分解プロセシング（例えば、切断）により生成すると考えられる。切断は、プレプロポリペプチド中の特定の共通アミノ酸配列を認識するプロテアーゼによるプレプロポリペプチドの内部タンパク質分解切断でよい。プレプロポリペプチドの「プレ」の部分は、プレプロポリペプチドのシグナルペプチド部分を指す。学説に捉われず、そのシグナル配列が、プレプロポリペプチドを、Ｕ−ＡＣＴＸを産生する細胞内の小胞体膜に向かわせ、それだけでなく、それを越えて移行させる原因であると考えられる。一実施形態において、シグナルペプチド配列は配列番号３８ ＭＮＴＸ１ＴＧＦＩＶＸ２ＬＶＬＡＴＸ３ＬＧＧＸ４ＥＡを含み、式中、Ｘ１はＡまたはＴ、Ｘ２はＬまたはＦ、Ｘ３はＩまたはＶ、およびＸ４はＩまたはＶである。同様に機能する他のシグナル配列も使用することができる。プレプロポリペプチドの「プロ」の部分は、配列番号３９ Ｘ５ＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲを指し、式中、Ｘ５はＧもしくはＲ、または成熟Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの上流に共有結合で結合した他の配列である。学説に捉われず、プロ配列にとって可能と考えられる役割には、小胞体からの毒素の輸出を促進すること、成熟毒素配列の酵素触媒による酸化的折りたたみを促進すること、およびタンパク質分解プロセシングおよび翻訳後の変形に関与する酵素にシグナルを送ることが含まれる。プロ配列中のＲＲ共通配列はエンドプロテアーゼ切断部位であると考えられる。したがって、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを含む精製ポリペプチドは、さらに、シグナルペプチド配列、プロ配列、または前記の配列の１つ以上を含む組合せを含むことができる。Ｕ−ＡＣＴＸ毒素のプレプロポリペプチドの構造は、オーストラリアのじょうご形の巣を作るクモの毒腺中で発現する他の毒素について本発明者らが決定したものに類似しているように思われる。
【００２３】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、配列、
配列番号１：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＶＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
を有するブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）からのプレプロペプチドである。
【００２４】
配列番号１のプレプロポリペプチドの切断により形成される成熟ポリペプチドはＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである。
【００２５】
配列番号２：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
【００２６】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、本明細書で定義したｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号３）である。
配列番号３：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＧＳＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
【００２７】
ｒＵ−ＡＣＴＸ−ＨＶ１ａ（配列番号３）は、推定される成熟毒素配列（配列番号２）の最初の２残基（Ｇｌｎ−Ｔｙｒ）がジペプチド配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒにより置換されたＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの成熟形の組換え版である。
【００２８】
配列番号２をコードするポリヌクレオチドは、
配列番号４：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００２９】
本発明には、毒腺ｃＤＮＡライブラリの分析によって単離されたＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの８つのホモログも含まれる。プレプロポリペプチド配列（配列番号５、８、１１、１４、１７、２０、２３、および２６）、成熟ポリペプチド配列（配列番号６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７）ならびにそれらをコードするＤＮＡ（配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、および２８）が含まれる。
【００３０】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第１のホモログのプレプロポリペプチドは、
配列番号５：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＩＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲ）
である。
【００３１】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第１のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号６：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲ）
である。
【００３２】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第１のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号７：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧ
である。
【００３３】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第２のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号８：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲ）
である。
【００３４】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第２のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号９：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲ）
である。
【００３５】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第２のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号１０：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧ
である。
【００３６】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第３のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号１１：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＩＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００３７】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第３のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号１２：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００３８】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第３のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号１３：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００３９】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第４のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号１４：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＡＮＰＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４０】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第４のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号１５：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＡＮＰＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４１】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第４のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号１６：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＣＣＡＡＴＡＴＴＡＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００４２】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第５のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号１７：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＴＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＩＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４３】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第５のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号１８：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４４】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第５のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号１９：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００４５】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第６のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号２０：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４６】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第６のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号２１：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４７】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第６のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号２２：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００４８】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第７のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号２３：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＦＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４９】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第７のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号２４：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００５０】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第７のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号２５：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００５１】
シドニージョウゴグモ（Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）の第８のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号２６：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＲＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００５２】
シドニージョウゴグモ（Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）からの第８のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号２７：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００５３】
シドニージョウゴグモ（Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）からの第８のホモログをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号２８：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００５４】
本発明は、単離された、または精製されたＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを含む。「単離された（isolated）」もしくは「精製された（purified）」ポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、タンパク質が由来する細胞、組織供給源もしくは毒液からの細胞材料または他の汚染ポリペプチドを実質的に含まず、あるいは、化学的に合成されたときには、化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない（substantially free of cellular material）」という語句は、ポリペプチドがそこから単離されたか、または組換えで産生された細胞の細胞成分から分離されたポリペプチドの調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、（乾燥重量で）約３０％、約２０％、約１０％、または約５％未満の異種ポリペプチド（以後、本明細書において「汚染ポリペプチド（contaminating polypeptide）」と称する）を有するポリペプチドの調製物を含む。一実施形態において、調製物は少なくとも約７５重量％純粋、より具体的には少なくとも約９０重量％純粋、および最も具体的には少なくとも約９５重量％純粋である。実質的に純粋なＵ−ＡＣＴＸポリペプチドは、例えば、天然資源（例えば、昆虫細胞）からの抽出により、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、またはポリペプチドを化学的に合成することにより得ることができる。純度は、任意の適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析法、または高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析によって測定することができる。
【００５５】
本発明はＵ−ＡＣＴＸのホモログも含む。「ホモログ（homologs）」は、当技術において使用される、問題にしている配列に高度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する総称である。そのような関連性は、比較される配列間の同一性および／または類似性の程度を測定することにより定量化することができる。この総称の中に入る用語に「オルソログ（ortholog）」があり、他の種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに機能的に同等なポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味し、また「パラログ（paralog）」は同種内で考慮したときに機能的に類似した配列を意味する。Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子の、同種に存在するパラログまたは他種にあるオルソログは、当技術において周知の分子生物学的技法により、必要以上の実験をせずに、容易に同定することができる。
【００５６】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の、本明細書で使用する「相同率（percent homology）（％）」は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９０年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７，２２６４〜２２６８頁のアルゴリズムを使用して定量することができる。上記のアルゴリズムは、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３〜４１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに導入されている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で実施される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２）に相同性のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実施される。比較目的のギャップを考慮したアラインメントを得るために、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９〜３４０２頁に記載されているように、ギャップ付きＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、通常は初期設定のパラメーターが使用される。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）
【００５７】
種々の欠失、置換および他の変形に相同性の程度を割り当てることにより、関係するポリペプチドがＵ−ＡＣＴＸとアラインされる。ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの全体に沿って、または隣接残基の部分集合に沿って、相同性を定量することができる。同一性（％）は、２つの配列を比較したときに同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの百分率である。類似性（％）は、２つの配列を比較したときに化学的に類似しているアミノ酸またはヌクレオチドの百分率である。成熟Ｕ−ＡＣＴＸと相同性のポリペプチドとは、好ましくは、約７０％以上、特に約８０％以上、さらに特に約９０％以上、および最も特別には約９５％以上の同一性を有する。配列番号２を参照ポリペプチドとして使用することができる。
【００５８】
特定のポリペプチドが、確定した長さの参照ポリペプチドに対して特定の同一性（％）を有するという場合、同一性（％）は参照ペプチドと比較してのことである。したがって、１００アミノ酸の長さの参照ポリペプチドと５０％の同一性を有するポリペプチドは、参照ポリペプチドの５０アミノ酸の長さ部分と完全に同一である５０アミノ酸のポリペプチドであり得る。それは、その全長にわたって参照ポリペプチドと５０％の同一性を有する１００アミノ酸の長さのポリペプチドであってもよい。勿論、他の多くのポリペプチドが同じ基準に合致するであろう。
【００５９】
主要なアミノ酸配列の「変更（modification）」は、「欠失（deletion）」（すなわち、１つ以上のアミノ酸残基が存在しないポリペプチド）、「付加（addition）」（すなわち、特定したポリペプチドに比較して１つ以上の追加されたアミノ酸残基を有するポリペプチド）、「置換（substitution）」（すなわち、１つ以上のアミノ酸残基の置換の結果として生ずるポリペプチド）、および「フラグメント（fragment）」（すなわち、特定されたポリペプチドの主要配列の一部に同一である主要アミノ酸配列からなるポリペプチド）を含むことを意味する。「変更」は、例えば、グリコシル化、アミド化（例えば、Ｃ末端アミド化）、脂質化様式、またはポリペプチドの１次、２次、もしくは３次構造を変化させる翻訳後事象の結果として変化したポリペプチドを含むことも意味する。Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾が可能である。
【００６０】
本明細書におけるＵ−ＡＣＴＸのヌクレオチドまたはアミノ酸いずれかの配列への参照は、これらの配列の天然に生ずる変異体への参照も含む。プレプロポリペプチドに対する配列番号１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、および２６および成熟ポリペプチドに対する配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７と異なり、かつ生物活性を保持している非天然生成変異体も本願に含まれる。変異体は、保存的アミノ酸置換、すなわち、同様に荷電または非荷電のアミノ酸の交替を有するこれらのポリペプチドを含む。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる。（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）である。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは時により合わせて芳香族アミノ酸と分類される。ファミリーの各メンバーは、同じファミリーの他のメンバーと類似した物理的および化学的性質を有するので、ロイシンをイソロイシンもしくはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、トレオニンをセリンで独立に置換すること、またはアミノ酸を構造的に近縁のアミノ酸で同様に置換することが、その結果生ずる分子の結合特性に大きい影響は有しないと期待することは理にかなっている。アミノ酸置換が機能性ポリペプチドを生ずるかどうかは、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の殺虫活性をアッセイすることにより容易に決定することができる。
【００６１】
Ｕ−ＡＣＴＸへの参照は、Ｕ−ＡＣＴＸのポリペプチド誘導体への参照でもある。本明細書で使用する「ポリペプチド誘導体」は、天然に生ずるＵ−ＡＣＴＸと長さが異なり、かつＵ−ＡＣＴＸに見出されるのと同じ１次配列で約１５以上のアミノ酸を含むこれらのポリペプチドを含む。ポリペプチド誘導体は、殺虫活性を有する限り、Ｕ−ＡＣＴＸより長くてもよく、Ｕ−ＡＣＴＸより短くてもよい（例えば、活性フラグメント）。Ｕ−ＡＣＴＸと実質的に同じアミノ酸配列を有するが、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の殺虫活性に実質的に影響しない少数のアミノ酸置換を有するポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の定義内にある。
【００６２】
Ｕ−ＡＣＴＸのホモログは数通りの方法で同定することができる。１つの方法では、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログの前駆体をコードする天然ｍＲＮＡ配列を、そのようなオルソログに対するクモ毒腺ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする標準的分子生物学的技法を使用することにより同定することができる。成熟毒素を生ずるプロペプチドの内部タンパク質分解的切断が、成熟毒素の直前にあるＡｒｇ−Ａｒｇプロセシング部位のＣ末端側（図１の２番目の矢印を参照されたい）で最も起こり易いことに注目することにより、成熟Ｕ−ＡＣＴＸオルソログのアミノ酸配列を、同定されたｃＤＮＡ配列の翻訳から得ることができる。次に、天然成熟Ｕ−ＡＣＴＸオルソログを毒液からクロマトグラフ分画により単離し、続いて、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログｃＤＮＡ配列から予測した質量一致判定によってペプチド毒性を同定し、精製することができる。他の方法では、合成成熟毒素をＵ−ＡＣＴＸ配列の固相ペプチド合成により作製し、続いて、合成Ｊ−アトラコトキシン−Ｈｖ１ｃの作製のために以前に記載されたように（ワン（Ｗａｎｇ）ら（２０００年），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，５０５〜５１３頁）、システイン酸化により天然ジスルフィド異性体を形成させることができる。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、還元、凍結乾燥されたペプチドをグルタチオンレドックス緩衝液中でインキュベートすることにより、酸化されて、その天然の３次元構造に折りたたまれることが可能である。適当なグルタチオンレドックス緩衝液は、ｐＨ７．３の２００ｍＭ ３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ 還元グルタチオン（ＧＳＨ）および２ｍＭ 酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含むが、当業者には多くの変法が周知である。この反応混合物を、例えば、４℃、室温、または３７℃で一晩インキュベートしてから、逆相ＨＰＬＣを使用して分画し、個々のジスルフィド異性体を分離する。画分を収集して殺虫活性をアッセイすることができる。さらに他の方法では、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログを、化学的に、または、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログをコードするｃＤＮＡから組換えＤＮＡ技法により合成することができる。他の方法では、当技術において知られている方法によりＵ−ＡＣＴＸ配列をコードする合成遺伝子を構築することにより、組換えＤＮＡ技法を使用して、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログを、調製することができる。
【００６３】
本発明は、例えば、配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、および２８などの単離されたＵ−ＡＣＴＸポリヌクレオチドを含む。「単離されたポリヌクレオチド（isolated polynucleotide）」という用語は、核酸の天然資源中に存在する他の核酸分子から分離されたポリヌクレオチドを含む。例えばゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語は、ゲノムＤＮＡが自然界で関連している染色体から分離されたポリヌクレオチドを含む。「単離された」ポリヌクレオチドは、核酸が由来する生命体のゲノムＤＮＡ中の核酸に自然界で隣接する配列（すなわち、核酸の５’および／または３’末端に位置する配列）を含まない。例えば種々の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に自然界で隣接する、約５ｋｂ、約４ｋｂ、約３ｋｂ、約２ｋｂ、約１ｋｂ、約０．５ｋｂ、約０．１ｋｂ未満の５’および／または３’ヌクレオチド配列を含んでいてよい。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」ポリヌクレオチドが、組換え技法により作製されたときに他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まない、または化学的に合成されたときに化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことは可能である。他の細胞材料を含まないということは、単離されたポリヌクレオチドが、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約９９％以上純粋であることを意味する。
【００６４】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ヌクレオチドの少なくとも５塩基の長さのポリマー形を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの変形であってよい。変形には、５−メチルシトシンなどの変形塩基、２’−メトキシおよび２’−フルオロ糖などの変形糖、ならびにホスホロチオエートおよびメチルホスホネートなどの変形骨格による、天然に生ずる塩基、糖またはヌクレオシド間結合（骨格）の、知られている置換が含まれるが、これらに限定はされない。本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し、それはコード領域に先行および後続する領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコード領域（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子であってよい。ＤＮＡまたはＲＮＡとしてのポリヌクレオチドは、ＴがＵであってもよい配列を含む。ポリヌクレオチドはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５および２８）に相補的であってよく、ここで相補的とは２つのヌクレオチド間の厳密な対形成能力を指す。例えば、あるポリヌクレオチドのある位置のヌクレオチドがあるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、そのときそのポリヌクレオチドとそのＤＮＡまたはＲＮＡ分子とはその位置で互いに相補的である。各分子中において、所望のプロセスを達成するために十分な数の対応位置が、相互にハイブリダイズできるヌクレオチドにより占められているときには、ポリヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは実質上互いに相補的である。本明細書で使用するハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合であって、それはワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であってよい。
【００６６】
さらに、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号７、１０、１３、１６、１９、２１、２５および２８）と実質的な同一性を有するかまたは配列番号２と実質的な同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。「実質的な同一性を有する」は、参照するアミノ酸配列または核酸配列と少なくとも約８５％、特に約９０％、およびさらに特に９５％以上の同一性を有する配列を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチドについて、参照ポリペプチド配列の長さは、通常、少なくとも約１６アミノ酸、または特に少なくとも約２０アミノ酸、さらに特に少なくとも約２５アミノ酸、および最も特別には少なくとも約３５アミノ酸であろう。核酸について、参照核酸配列の長さは、通常、少なくとも約５０ヌクレオチド、特に少なくとも約６０ヌクレオチド、さらに特に少なくとも約７５ヌクレオチド、および最も特別には約１１０ヌクレオチドであろう。
【００６７】
相同性配列は、典型的には、ハイブリダイゼーションにより確認されることができ、その際、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク所在）中に記載されているようなストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションが好ましい。サムブルックらに概略が記載されているストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して（すなわち、核酸フラグメントを２回洗浄し、その際各洗浄は、２×塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム（ＳＣＣ）および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により室温で３０分間であり；続いて、２×ＳＣＣおよび０．１％ＳＤＳにより５０℃で３０分間１回洗浄し；次に、２×ＳＣＣによる室温各１０分間の洗浄を２回行う）、最大で約２５から約３０％の塩基対ミスマッチ、または約１５から約２５％の塩基対ミスマッチ、または約５から約１５％の塩基対ミスマッチを含む相同性配列を確認することができる。
【００６８】
相同性のポリペプチドは、例えば、従来法のポリヌクレオチドの部位指定変異（これは、分子の残基が機能的に重要であるかないかを日常的に同定するための１つの手段である）により、ランダム変異により、化学的合成により、またはポリペプチドの化学的もしくは酵素的切断により作製することができる。
【００６９】
Ｕ−ＡＣＴＸ配列をコードするポリヌクレオチドは、そのような遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列の調製を可能にする。短い核酸配列は、与えられた試料中の相補的配列の存在を検出するためのプローブとして使用することができ、またはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の確定したセグメントを検出し、増幅し、または変異させるプライマとして使用することができる。ハイブリダイゼーション検討のために使用される核酸配列は、フラグメントが、安定で選択的な二重鎖分子を形成するために十分な長さのものであることを確実にする約１４ヌクレオチド以上の長さであるとよい。そのようなフラグメントは、例えば、化学的手段によりフラグメントを直接合成することにより、ＰＣＲ技法などの核酸複製技法の応用により、または適当な挿入物および適当な制限部位を含む組換えプラスミドから選択した核酸フラグメントを切り取ることにより調製することができる。
【００７０】
Ｕ−ＡＣＴＸおよびホモログのポリヌクレオチドは、１つの組換え発現ベクターまたは複数のベクターに挿入することができる。「組換え発現ベクター（recombinant expression vector）」という用語は、Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子配列の挿入または導入により操作されたプラスミド、ウィルス、または当技術において知られた他の手段を指す。「プラスミド（plasmid）」の名称は、本明細書では、通常、当業者によく知られている標準的命名慣行に従って、小文字のｐとそれに先行および／または後続する大文字および／または数字により命名する。本明細書で開示するプラスミドは、市販されているか、制限されない基準で公に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから周知の公表された手順の応用により構築することができるかのいずれかである。多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターが周知であり、容易に入手できるか、または当業者が、使用に適した他のプラスミドをいくらでも容易に構築することができる。これらのベクターを適当な宿主細胞中に入れて形質転換して、ポリペプチドの産生のための宿主細胞ベクター系を形成することができる。
【００７１】
Ｕ−ＡＣＴＸポリヌクレオチドは、細菌、植物、酵母、昆虫、両生類、または哺乳動物細胞中での発現に適合させたベクター中に挿入することができ、これらの細胞は、細菌、酵母、昆虫、両生類、植物、または哺乳動物細胞中での核酸分子の発現に必要な制御エレメントを、Ｕ−ＡＣＴＸをコードする核酸分子に作動可能に連結してさらに含む。「作動可能に連結した（operatively linked）」は、そのように記載された成分が、それらに意図されたように機能することを可能にする関係にある近位にあることを指す。コード配列に作動可能に連結した発現制御配列は、発現制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように、連結される。本明細書で使用する「発現制御配列（expression control sequence）」という用語は、それが作動可能に連結された核酸配列の発現を制御する核酸配列を指す。発現制御配列が、核酸配列の転写および場合により翻訳を制御し調節しているときには、発現制御配列は核酸配列に作動可能に連結している。したがって発現制御配列は、適当なプロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコードする遺伝子の前にある開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル（イントロンが存在する場合）、ｍＲＮＡの適当な翻訳を可能にするその遺伝子の正確な読み枠の維持、および終止コドンを含むことができる。「制御配列」という用語の意味は、最小限、その存在が発現に影響することができる構成要素を含むことであり、また、存在が有利である付加的構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。発現制御配列は、プロモータを含むことができる。「プロモータ（promoter）」は、転写を指示するに十分な最小限の配列を意味する。プロモータ依存性の遺伝子発現を細胞タイプ特異的誘導、組織特異的誘導、または外来のシグナルもしくは作用剤により誘導され得るプロモータに対して制御可能にするのに十分なこれらのプロモータエレメントも含まれる。そのようなエレメントは、遺伝子の５’または３’領域に位置することができる。構成的および誘導性両方のプロモータが含まれる。
【００７２】
発現ベクターが植物を形質転換するために使用される場合は、植物中で発現を推進する能力を有するプロモータを選択することができる。植物中で機能するプロモータは当技術において周知である。典型的な組織特異的植物プロモータは、トウモロコシショトウシンターゼ−１プロモータ、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモータ、Ｓ−Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモータ、およびトウモロコシヒートショックタンパク質プロモータである。
【００７３】
どの発現ベクターを選択するか、およびポリペプチドをコードする領域を最終的にどのプロモータに作動可能に連結するかは、所望の機能特性、例えば、タンパク質発現の位置およびタイミングならびに形質転換すべき宿主細胞に直接依存する。一実施形態において、ポリペプチドを発現するために使用するベクターは、植物細胞中で効果的な選択マーカを含む。植物を形質転換するために使用する形質転換ベクターおよびこれらのベクターの製法は、例えば、米国特許第４，９７１，９０８号、第４，９４０，８３５号、第４，７６９，０６１号および第４，７５７，０１１号に記載されている。
【００７４】
発現系は、毒素遺伝子の発現および／または毒素の折りたたみを促進するシグナルペプチドおよびプロポリペプチド配列も含むことができる。これらは、本明細書で開示した天然Ｕ−ＡＣＴＸシグナルおよびプロペプチド配列または同じ目的に役立つ他のシグナルおよび／もしくはプロペプチド配列であってよい。
【００７５】
昆虫ウィルスは天然に生ずる昆虫の病原体である。ウィルス感染に罹り易い昆虫は昆虫ウィルスの標的になり得る。それらはＤＮＡウィルスでもＲＮＡウィルスでもよい。多くの昆虫ウィルスおよびそれらの宿主の範囲は、当技術において知られていて、宿主特異的でかつ環境的に安全であるウィルスを含む。昆虫ウィルスの殺虫有効性は、米国特許第６，０９６，３０４号で開示された方法と同様な方法を使用して、昆虫毒素をコードする遺伝子をそのゲノムに導入することにより、増強することができる。適当な昆虫ウィルスは、バキュロウィルス（核多角体ウィルスおよびグラニュロウィルス）および昆虫ポックスウィルスなどの、害虫に対する生物制御剤として伝統的に使用されてきたＤＮＡウィルスである。適当なＤＮＡウィルスの他の例は、米国特許第６，５２１，４５４号に開示された蚊特異的バキュロウィルスである。適当なＲＮＡウィルスはシポウイルスを含むが、これに限定はされない。
【００７６】
高等植物における遺伝子発現のために有用なベクターは、当技術において周知であって、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターおよびｐＣａＭＶＣＮトランスファーコントロールベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ所在）から入手可能）を含む。
【００７７】
発現ベクターまたは他のＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の技法により実施することができる。「形質転換（transformation）」は、新規ＤＮＡ（すなわち、細胞にとって外因性のＤＮＡ）の導入に続いて細胞内に誘導される永久的または一過性の遺伝子の変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞である場合、永久的な遺伝子の変化は、一般的に、細胞ゲノム中へのＤＮＡ導入により達成される。「形質転換細胞（transformed cell）」すなわち「宿主細胞（host cell）」は、本発明のポリペプチド（すなわち、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド）またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子を、（細胞または原細胞に）組換えＤＮＡ技法により導入した細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）を意味する。
【００７８】
宿主が原核細胞であるときは、リン酸カルシウム共沈殿などのＤＮＡによるトランスフェクションの方法、マイクロインジェクションなどの機械的操作、電気穿孔法、リポソームに封入したプラスミド、またはウィルスベクターの挿入、ならびに当技術分野において知られている他の方法を使用することができる。宿主が植物細胞であるときは、細胞中に遺伝子を導入する他の手段も使用することができ、例えば、プロトプラストのポリエチレングリコール媒介形質転換、乾燥／阻止媒介ＤＮＡ取込み、炭化ケイ素繊維と一緒にしての撹拌、ＤＮＡコートした粒子の加速、生殖器官への注入、および未成熟胚への注入などである。
【００７９】
真核細胞には、本発明開示のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子とを同時形質移入することもできる。適当なマーカには、例えば、哺乳動物細胞が取込むことのできるネオマイシンおよびハイグロマイシン等が挙げられる。マーカへの耐性は、例えば、遺伝子が適当な真核細胞プロモータを有するときには、ネオマイシン遺伝子またはハイグロマイシン遺伝子により付与することができる。他の方法は、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス、またはウシパピローマウィルスなどの真核細胞ウィルスベクターを使用して、真核細胞を一過性に感染すなわちトランスフェクトしてタンパク質を発現させることである（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）編，１９８２年）。一実施形態において、真核細胞宿主が、本明細書に記載した宿主細胞として使用される。真核細胞は酵母細胞（例えば、サッカロマイセスセレヴィシエ）でもよく、またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞でもよい。
【００８０】
発現を指示する組換えウィルスまたはウィルス構成要素を利用する哺乳動物細胞系は操作することができる。例えば、アデノウィルス発現ベクターを使用するとき、外来性タンパク質をコードする核酸配列をアデノウィルス転写／翻訳制御コンプレックス、例えば、後期プロモータおよび３連リーダー配列（tripartite leader sequence）に連結することができる。次にこのキメラ遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの組換えによりアデノウィルスゲノムに挿入することができる。ウィルスゲノムの非必須領域への挿入は、感染した宿主中で生存可能でＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現することができる組換えウィルスを生ずるであろう（例えば、ローガン（Ｌｏｇａｎ）およびシェンク（Ｓｈｅｎｋ）（１９８４年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，３６５５〜３６５９頁）。
【００８１】
組換えポリペプチドの長期の高収率産生のためには、安定した発現が好ましい。複製のウィルス起源を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適当な発現制御成分（例えば、プロモータ配列、エンハンサ配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）により制御されるＵ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡおよび選択可能なマーカにより形質転換することができる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカは、選択に対する耐性を付与して、細胞が染色体にプラスミドを安定に組み込み、成長して感染巣を形成することを可能にし、次にその細胞はクローン化して細胞ラインに拡張することができる。例えば、外来ＤＮＡの導入に続いて、操作した細胞を強化培地中で１から２日の間成長させ、次に選択培地に切り替えることができる。多くの選択系を使用することができ、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら（１９７７年），Ｃｅｌｌ，１１，２２３〜３２頁）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（スチバルスカ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ）およびスチバルスキ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ）（１９６２年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，４８，２０２６〜２０３４頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ロウィー（Ｌｏｗｙ）ら（１９８０年），Ｃｅｌｌ，２２，８１７〜８２３頁）が含まれるが、これらに限定はされない。
【００８２】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、例えば、カラムでの捕集または抗体の使用による精製を容易にする付加したＣ末端またはＮ末端アミノ酸をコードする配列などの付加配列を提供するように設計することもできる。そのようなタグには、例えば、ニッケルカラム上でのポリペプチドの精製を可能にするヒスチジンリッチタグが挙げられる。そのような遺伝子変形技法および適当な付加配列は、分子生物学技術において周知である。
【００８３】
Ｕ−ＡＣＴＸタンパク質、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体は、当技術において知られている方法により精製することができる。これらの方法には、サイズ排除クロマトグラフィ、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、再結晶、等電点電気泳動、分取電気泳動、および前記の方法の１つ以上を含む組合せが含まれるが、これらに限定はされない。精製は、当業者に知られた方法により実施することができ、他のポリペプチドを実質的に含まず、かつ炭水化物、脂質、または細胞小器官を実質的に含まないＵ−ＡＣＴＸの調製物を生ずるであろう。純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当技術において知られた手段によって評価することができる。
【００８４】
Ｕ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドも提供され、天然では結合しないであろうポリペプチドに共有結合で結合したＵ−ＡＣＴＸポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、種々のアッセイ系での使用に有用である。例えば、融合ポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸ発現を検出するために使用することができる。例えば、Ｕ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸタンパク質と相互作用して、その機能に影響するタンパク質を同定するために使用することができる。この相互作用は、Ｕ−ＡＣＴＸの他のタンパク質を制御する能力に特異性を付与することがあるか、またはＵ−ＡＣＴＸの機能の効果を増大もしくは減少させることがある。タンパク質アフィニティクロマトグラフィなどの物理的方法、または酵母ツーハイブリッド法、細菌ツーハイブリッド法、もしくはファージディスプレイ法などタンパク質間相互作用のためのライブラリに基づくアッセイを、この目的のために使用することができる。そのような方法は当技術において周知である。
【００８５】
融合ポリペプチドは、ペプチド結合により融合して合体した少なくとも２つの異種ポリペプチドセグメントを含む。第１のポリペプチドセグメントは切れ目のないアミノ酸Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを全体としてまたは部分的に含むことができる。部分的な場合は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの少なくとも約８つの連続したアミノ酸が使用され、特に少なくとも約１０、さらに特に約１５、最も特別には約２０のアミノ酸が使用される。第１のポリペプチドセグメントは全長のＵ−ＡＣＴＸタンパク質であってもよい。第２のポリペプチドセグメントは、β−ガラクトシダーゼまたは当技術において知られている他の酵素など検出可能な生成物を生ずる酵素を含むことができる。あるいは、第２のポリペプチドセグメントは、緑色の蛍光性タンパク質、ＨｃＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）または当技術において知られている他の蛍光性タンパク質などの蛍光性タンパク質を含むことができる。さらに、融合タンパク質は、放射性マーカ、蛍光性マーカ、化学発光性マーカ、ビオチン化マーカ等などの検出可能なマーカで標識することができる。
【００８６】
組換え的に、または２つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、融合ポリペプチドを作製する技法は周知である。組換えＤＮＡ法は、例えば、Ｕ−ＡＣＴＸをコードする配列を第２のポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチドとともに適当なリーディングフレームに含むＤＮＡ構築物を作製して、宿主細胞中でＤＮＡ構築物を発現させることにより、Ｕ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドを構築するために使用することができる。ＤＮＡ構築物は、タンパク質産生を促進する配列（すなわち、プロモータ等）に作動可能に連結することができる。
【００８７】
融合ポリペプチドに加えて、Ｕ−ＡＣＴＸは、当技術において知られている方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで標識することができる。Ｕ−ＡＣＴＸは、テキサスレッド、ローダミン色素、フルオレッセインおよび当技術において知られている他の色素などの色素に結合することができる。結合化学反応剤には、スクシンイミドエステル、イソチオシアネートおよびマレイミドが挙げられる。結合可能な色素および結合化学反応剤に関する詳細な情報は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ所在）に見出される。そのような融合ポリペプチドは、短いアミノ酸配列に対して生じた抗体よりも大きい特異性および感度を有することができる抗体を産生するために使用することができる。それに加えて、融合ポリペプチドは、組織培養アッセイにおいて、細胞の生存、増殖および分化に効果を及ぼすそれらの能力を調べるために使用することができる。
【００８８】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドまたは毒素のプレポリペプチドもしくはプレプロポリペプチド形を発現するトランスジェニック植物を構築することができる。「トランスジェニック植物（transgenic plant）」は、「形質転換植物（transformed plant）」細胞またはプロトプラストから誘導された植物またはそれらの子孫を意味し、その場合植物ＤＮＡ（核または葉緑体）は、同系統の天然の非トランスジェニック植物中に元来存在しない導入された外来ＤＮＡ分子を含む。
【００８９】
単一の植物プロトプラストまたは種々の移植片のいずれかからの植物の発生または再生は、当技術において周知である。この再生および成長プロセスは、典型的には、形質転換細胞の選択および個別化された細胞の培養から通常の胚発生段階を通して根付き小植物段階までを含む。トランスジェニック胚および種子は同様にして再生することができる。その後、生じたトランスジェニック根付き苗条は、土壌などの適当な植物成長培地に植えることができる。
【００９０】
再生した植物は自家受粉して、ホモ接合トランスジェニック植物を提供することができる。そうでなければ、再生した植物から得た花粉を、種子から成長した農業的に重要な近交系の植物に交配させることができる。逆にこれらの重要な系統の植物からの花粉を、再生植物を受粉させるために使用することができる。所望のポリペプチドを含むトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を使用して栽培することができる。
【００９１】
適当なトランスジェニック植物は、Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子とその活性とをその子孫に伝えることができる独立の分離個体を含む。一実施形態において、トランスジェニック植物はＵ−ＡＣＴＸ遺伝子についてホモ接合であり、その遺伝子を性交配で全ての子孫に伝える。トランスジェニック植物からの種子は温室または畠で成長させることができて、その結果生じた性的に成熟したトランスジェニック植物は自家受粉して真の育種植物を生ずる。これらの植物の子孫は真の育種系統になり、それらは、実施例の方法により、１種以上の昆虫に対して種々の環境条件下に、好ましくは農場において、向上した殺虫能力を評価される。トランスジェニック植物は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、コムギ、カラスムギ、オオムギ、他の穀類、野菜、果実、果樹、漿果、芝草、観賞植物、低木および樹木等であってよい。
【００９２】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の遺伝形質を有するトランスジェニック昆虫を作製するために使用することができる。トランスジェニック動物および昆虫を作製する技法は、当業者に周知である。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、転移因子を使用して昆虫ゲノム中に挿入することができる。組込み（遺伝子転移）は、酵素トランスポザーゼにより促進され、また転移因子は、トランスポザーゼを正しい位置に向かわせて切り取りを開始させるように機能する逆方向反復を含むことができる。ヘテロ接合遺伝子と（遺伝子融合で）組み合わせられた転移因子を含む遺伝子構築物を、従来の技法を使用して調製し、トランスジェニック昆虫を作製するために昆虫の卵に挿入することができる。転移因子は、Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子に加えて、発現がうまく起こることを確実にする調節因子を含むことができる。
【００９３】
適当な転移因子には、例えば、イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来のヘル雌、Ｄ．マウリタニア（Ｄ．Ｍａｕｒｉｔａｎｉａ）由来のマリーナ、ピギーバック、およびカスリショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｉｄｅｉ）に見出されるミノスが挙げられる。転移因子ミノスは、Ｕ−ＡＣＴＸポリヌクレオチドを、場合によりミノストランスポザーゼの存在下に、昆虫の胚のゲノムに組み込むために使用することができる。転移因子は、外来遺伝子と合体し、さらに調節配列、例えばプロモータを含むプラスミドベクターの形態にすることができる。一実施形態において、プロモータはキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のアクチン５ｃプロモータである。一実施形態において、ミノストランスポザーゼ遺伝子は、胚に別に導入するために別の補助プラスミド上に位置する。
【００９４】
転移因子は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる異種遺伝子を昆虫の胚に組み込むために使用することができる。あるいは、転移因子の組込みは、特定の遺伝子の発現を妨害するために使用することができる異種ポリヌクレオチドを組み込むために使用することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、遺伝子サイレンシングのために使用することができる。
【００９５】
Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子は、遺伝的防除の手段として放出することができる生殖不能の雄を作製するために使用することができる。生殖不能昆虫技法においては、それらが放出される前に、多数の昆虫が調達され不能化される。十分な数の昆虫が放出されれば、野生の雌は放出された不能雄と交配して、生存可能な子孫を産しないであろう。この技法は、不能雄だけが放出されるときに最も効果がある。不能雄のみを放出する手段は、ある条件下で雌には致死的であるが雄にはそうでない遺伝子（すなわち、毒素遺伝子）を利用することである。致死的遺伝子の発現は、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｙｐ１（ショウジョウバエ卵黄タンパク質１）遺伝子由来の雌特異的エンハンサまたはＹｐ３肥満体エンハンサにより制御することができる。性特異的プロモータの使用は、ショウジョウバエにおける使用に対して提案された（ハインリッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０００年），９７，８２２９〜８２３２頁、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年），２８７，２４７４〜２４７６頁）。ある化学物質への曝露により活性化される自殺遺伝子も導入することができる。
【００９６】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの活性を有する殺虫ポリペプチドも本発明に含まれる。昆虫ニューロンの活性は、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、およびカルシウム活性化カリウムチャネルを含むイオンチャネルの開閉の精密な調節により生ずる。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの活性は、昆虫の急速な麻痺、昆虫の電位作動型カルシウムチャネルの阻害、または高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルの阻害により示される。カルシウムチャネルの阻害およびカルシウム活性化カリウムチャネルの阻害は、単離された昆虫のニューロンで、前記の１つのチャネルまたは１つ以上を含む組合せを発現している組換え細胞で検討することができる。一実施形態において、カルシウムチャネルおよび／または高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルは、昆虫のニューロン系中に天然に見出されるものである。一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、高伝導電位作動型カルシウムチャネル、およびカルシウム活性化カリウムチャネルの両方を阻害する。
【００９７】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、昆虫の電位作動型カルシウムチャネルにおけるカルシウム電流の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９５％以上を遮断する。一実施形態において、昆虫の電位作動型カルシウムチャネルは、アメリカゴキブリＰｅｒｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａの背側非対性正中（ＤＵＭ）ニューロンにおいて発現したものである。
【００９８】
他の実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、昆虫の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルの活性の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９５％以上を遮断する。一実施形態において、昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルは、アメリカゴキブリ（Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルを含む。他の実施形態において、チャネルは、以前に記載されたＰ．ａｍｅｒｉｃａｎａ ｐＳｌｏチャネルのαサブユニットである（デルスト（Ｄｅｒｓｔ）ら（２００３年），Ｅｕｐ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，１１９７〜１２１２頁）。
【００９９】
さらに他の実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、昆虫の電位作動型カルシウムチャネルにおけるカルシウム電流の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９５％以上、および昆虫の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルの活性の約７０％、７５％、８０％、８５％または９５％以上を遮断する。
【０１００】
殺虫ポリペプチドは、以下でより詳細に説明する広く種々の方法において使用することができる。
【０１０１】
スクリーニング目的のための変異した殺虫ポリペプチドのライブラリは、無関係なタンパク質について前に記載したようにして、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたは変異体の遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける進化によって得ることができる。ライブラリは、全Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ遺伝子もしくは変異体遺伝子の誤りがちなＰＣＲまたはＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ遺伝子もしくは変異体遺伝子の適当な酵素による消化とそれに続く全遺伝子配列の誤りがちなＰＣＲ再構成を使用して作製することができる。これらの誤りがちなＰＣＲ手順は、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたは変異体の完全なプレプロポリペプチド遺伝子配列に応用することもできる。次に、変異Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａすなわち変異体の遺伝子配列のライブラリは、一連のＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ変異体アンタゴニストを生じさせるために使用することができる。次に、これらのアンタゴニストは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたはその選択された変異体のその分子状標的への結合を阻止する能力についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、変異遺伝子ライブラリのファージディスプレイに続いて、Ｕ−ＡＣＴＸの分子状標的に堅く結合するファージ粒子、またはＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａもしくはその選択された変異体のＵ−ＡＣＴＸの分子状標的への結合を阻止するファージ粒子を選択することにより実施することができる。当業者により理解されるように、変異遺伝子ライブラリは、オリゴヌクレオチドカセット式変異誘発またはあるヌクレオチド位置を無秩序化した合成遺伝子の構築などの他の標準的分子生物学的方法によって構築することもできる。
【０１０２】
Ｕ−ＡＣＴＸまたはそのホモログは、Ｕ−ＡＣＴＸとして昆虫チャネルの同じ位置に結合する殺虫性分子について、化合物ライブラリをスクリーニングするために使用することができる。一実施形態において、スクリーニングは、Ｕ−ＡＣＴＸの昆虫の電位作動型カルシウムチャネルへの結合と競合するかまたは昆虫の電位作動型カルシウムチャネルに予め結合しているＵ−ＡＣＴＸの遊離を惹起する化合物の選択によって実施することができる。他の実施形態において、スクリーニングは、Ｕ−ＡＣＴＸの昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルへの結合と競合するかまたは昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルに予め結合しているＵ−ＡＣＴＸの遊離を惹起する化合物の選択によって実施することができる。さらに他の実施形態において、スクリーニングは、例えば、Ｕ−ＡＣＴＸの昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルへの結合を防止し、かつＵ−ＡＣＴＸの電位作動型昆虫カルシウムチャネルへの結合も防止する化合物の選択により、または昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルに予め結合しているＵ−ＡＣＴＸの遊離を惹起し、かつ昆虫の電位作動型カルシウムチャネルに予め結合しているＵ−ＡＣＴＸの遊離を惹起する化合物の選択によって実施することができる。
【０１０３】
昆虫のチャネルに結合する試験化合物を選択する方法は、昆虫の電位作動型カルシウムチャネル、昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネル、または前記の昆虫のチャネルの１つ以上を含む組合せである昆虫のチャネルを提供すること、および試験化合物が、配列番号２と約７０％以上の同一性を有し、かつ殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸペプチドの昆虫チャネルへの結合と競合するかどうかを決定することを含む。その方法は、試験化合物の昆虫カルシウムチャネル遮断薬または昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルの遮断薬、またはこれら両タイプのチャネルの遮断薬として作用する能力を試験することをさらに含んでもよい。
【０１０４】
昆虫のチャネルに結合する試験化合物を選択する方法は、昆虫の電位作動型カルシウムチャネル、昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネル、または前記の昆虫のチャネルの１つ以上を含む組合せである昆虫のチャネルを提供すること、および試験化合物が、昆虫チャネルに予め結合している、配列番号２と約７０％以上の同一性を有し、かつ殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸペプチドの少なくとも一部を遊離させるかどうかを決定することを含む。その方法は、試験化合物の昆虫のカルシウムチャネル遮断薬または昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルの遮断薬、またはこれら両タイプのチャネルの遮断薬として作用する能力を試験することをさらに含んでもよい。
【０１０５】
Ｕ−ＡＣＴＸペプチドとの競合または予め結合しているＵ−ＡＣＴＸペプチドの遊離は、標識Ｕ−ＡＣＴＸペプチドを使用して決定することができる。例えば、蛍光で標識したＵ−ＡＣＴＸから得られる蛍光シグナルは、標識されたペプチドの結合状態対非結合状態に依存して変化するであろう。あるいは、カルシウムチャネルに結合した放射性標識Ｕ−ＡＣＴＸの、試験化合物の結合による遊離は、放射性標識Ｕ−ＡＣＴＸの、チャネルから、例えば周囲の緩衝溶液中への遊離として測定することができる。
【０１０６】
昆虫を制御する方法は、昆虫または昆虫の幼虫と殺虫に有効な量のＵ−ＡＣＴＸポリペプチドとを接触させることを含む。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、精製ポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードする、場合により発現ベクター中のポリヌクレオチド、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する昆虫ウィルス、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する植物細胞もしくは細菌細胞などの細胞、またはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するトランスジェニック植物の形態であってよい。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、マツユキソウレクチンなど、昆虫により摂取されたときにＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの活性を増強する作用剤と、融合させるか、または併用して送達することもできる。接触させることには、例えば、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの注入、外的接触、あるいはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドまたはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するポリヌクレオチドもしくはウィルスの摂取が含まれる。
【０１０７】
植物を処理する方法は、植物と殺虫に有効な量のＵ−ＡＣＴＸポリペプチドとを接触させることを含む。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、精製ポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードする、場合により発現ベクター中のポリヌクレオチド、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するウィルス、またはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する植物細胞もしくは細菌細胞などの細胞の形態であってよい。
【０１０８】
一実施形態において、精製Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドおよび農業的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含む殺虫組成物が提供される。他の実施形態において、殺虫組成物は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するウィルスを含む。昆虫ウィルスは、ひとたびウィルスが宿主昆虫に感染すると宿主昆虫の内部で複製され発現され得る。昆虫に昆虫ウィルスを感染させることは、摂取、吸入、昆虫または昆虫幼虫と昆虫ウィルスとの直接接触等を含む在来の方法によって達成することができる。
【０１０９】
殺虫組成物は、水溶液または水性懸濁液などの流動可能な溶液または懸濁液の形態であってよい。そのような水溶液または懸濁液は、適用に先立って希釈する濃縮保存溶液として、または別法として、そのまま使用する希釈溶液として提供することができる。他の実施形態において、殺虫組成物は、水に分散可能な顆粒を含む。さらに他の実施形態において、殺虫組成物は、水和剤、粉剤、ペレット剤、またはコロイド濃縮剤を含む。そのような乾燥形態の殺虫組成物は、濡らすとただちに溶解するか、または別の選択肢として、制御放出、徐放、もしくは他の時間依存性の様式で溶解するように製剤化することができる。
【０１１０】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを昆虫ウィルスにより発現させることができるとき、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する昆虫ウィルスを、保護されるべき作物に適用することができる。ウィルスはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを、単独でまたは１種類もしくは数種類の他のＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと組み合わせて、または増強された、もしくは相乗的殺虫活性を生じ得る他の殺虫ポリペプチド毒素などの他の殺虫薬と組み合わせて発現するように操作することができる。適当なウィルスには、バキュロウィルスが含まれるが、これに限定はされない。
【０１１１】
殺虫組成物がＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する完全な細胞（例えば、細菌細胞）を含むとき、そのような細胞は、種々の方法で製剤化することができる。それらは、水和剤、顆粒剤または粉剤として、無機鉱物（層状珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）または植物材料（製粉したトウモロコシの穂軸、もみ殻、胡桃の殻等）、および１つ以上の前記材料を含む組合せなどの種々の不活性材料と混合することにより利用することができる。製剤は、展着剤−粘着剤助剤、安定剤、他の殺虫性添加剤、界面活性剤、および１つ以上の前記添加剤を含む組合せを含んでよい。液体製剤は、水系または非水系であってよく、泡沫、懸濁液、乳化可能濃縮液等として利用することができる。成分には、流動剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、ポリマー、リポソーム、および１つ以上の前記成分を含む組合せが含まれてもよい。
【０１１２】
あるいは、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させて次の野外応用のために単離することができる。そのようなポリペプチドは、活性な殺虫製剤に製剤化する前には、粗細胞溶解物、懸濁液、コロイド等の形態であってよく、または精製し、純化し、緩衝し、および／またはさらに加工することができる。
【０１１３】
応用の方法にかかわらず、１つまたは複数の活性成分の量は、例えば、制御されるべき特定の昆虫、処理されるべき特定の植物または作物、環境条件、ならびに殺虫有効組成物適用の方法、速度および量などの要因に依存して変化するであろう殺虫に有効な量で適用される。
【０１１４】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、ベクター等を含む殺虫組成物は、農業的に許容可能な担体とともに製剤化することができる。組成物は、投与に先立って、凍結乾燥する（lyophilized）、凍結乾燥する（freeze-dried）、乾燥するなどの適当な手段で、または食塩水、もしくは他の適当な緩衝液などの水性担体、媒体もしくは適当な希釈剤中で製剤化することができる。製剤化した組成物は、粉状もしくは顆粒状材料、または油中（植物性または鉱物性）もしくは水中懸濁液、または油／水乳濁液の形態で、あるいは水和物散剤として、あるいは農業用途に適したもう１つの他の担体材料との組合せであってよい。適当な農業用担体は、固体または液体であってよく、当技術において周知である。「農業的に許容可能な担体」という用語は、全ての補助剤を包含し、例えば、殺虫剤製剤技法で通常使用されている不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着性付与剤、結合剤等などであり、これらは殺虫剤製剤における当業者に周知である。製剤は、１つ以上の固体または液体の補助剤と混合することができ、例えば、在来の製剤化技法を使用して、殺虫組成物を適当な補助剤と、均一に混合する、ブレンドする、および／または破砕するなどの種々の手段により調製することができる。
【０１１５】
殺虫組成物は、標的とする昆虫のいる環境に、例えば、保護されるべき植物または作物の葉群上に、従来の方法により、好ましくは噴霧により適用することができる。殺虫剤適用の強度と期間は、特定の１つまたは複数の害虫、処理されるべき１つまたは複数の作物および特定の環境条件に固有の条件を考慮して設定することができる。有効成分の担体に対する比率は、殺虫組成物の化学的性質、溶解性、および安定性、ならびに考慮されている特定の製剤に当然依存するであろう。
【０１１６】
他の適用技法、例えば、散粉、散水、浸漬、土壌注入、種子被覆、実生被覆、スプレー、通気、ミスチング、噴霧等も実行可能であり、ある状況下、例えば、根もしくは茎での害虫発生において、または繊細な成長過程もしくは観賞植物への適用のために必要になることもある。これらの適用手順は当技術において周知である。
【０１１７】
殺虫組成物は、単独で、または限定にはならない他の殺虫剤を含む他の化合物と併用して使用することができる。それらは、界面活性剤、洗浄剤、ポリマーまたは徐放性製剤などの他の処理剤と併用して使用することができる。殺虫組成物は昆虫誘引物質を含むことができる。殺虫組成物は全身性または局所的使用のいずれのためにも製剤化することができる。そのような作用剤は昆虫に直接適用することもできる。
【０１１８】
環境的、全身性、または葉面処理に使用される殺虫組成物の濃度は、特定の製剤の性質、適用手段、環境条件、および殺生活性の程度によって変わり得る。
【０１１９】
あるいは、Ｕ−ＡＣＴＸを単独で、または増強された、もしくは相乗的殺虫活性を生ずる他の殺虫ポリペプチド毒性と組み合わせて発現するように作物を遺伝子操作することができる。この手法が役に立つ作物には、ワタ、トマト、スイートコーン、ムラサキウマゴヤシ、ダイズ、モロコシ、サヤエンドウ、アマニ、ベニバナ、アブラナ、ヒマワリ、および白花ルピナス（field lupin）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１２０】
殺虫ポリペプチドで処理するのに適当な農業的、家庭および／または医学的／獣医学的重要性のある節足動物には、例えば、次の綱および目のメンバーが含まれる。アメリカマメゾウムシＡｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ、ハムシＡｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ、コメツキムシ（Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ヒラタムシＡｈａｓｖｅｒｕｓ ａｄｖｅｎａ、サマーシェファーＡｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ、ケブトヒラタキクイムシＡｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｓｐｐ．（ゾウムシ）、ピグミーマンゴールドビートルＡｔｏｍａｒｉａ ｌｉｎｅａｒｉｓ、カツオブシムシ（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ ｓｐｐ．、Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｓｐｐ．）、ヨツモンマメゾウムシＣａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ、クリヤケシキスイＣａｒｐｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ、キャベツシードポッドウィービルＣｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｓｓｉｍｉｌｉｓ、レイプウィンターステムウィービルＣｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｐｉｃｉｔａｒｓｉｓ、根切り虫の類Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｖｅｓｐｅｒｔｉｎｕｓおよびＣｏｎｏｄｅｒｕｓ ｆａｌｌｉ、バショウオサゾウムシＣｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ ｓｏｒｄｉｄｕｓ、コガネムシ幼虫Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ、コガネムシＣｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ、サンフラワーステムウィービルＣｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ａｄｓｐｅｒｓｕｓ、トビカツオブシムシＤｅｒｍｅｓｔｅｓ ｌａｒｄａｒｉｕｓ、根切り虫Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａおよびＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、インゲンテントウＥｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ、オールドハウスボアラーＨｙｌｏｔｒｏｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ、アルファルファタコゾウムシＨｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ、セマルヒョウホンムシＧｉｂｂｉｕｍ ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ、タバコシバンムシＬａｓｉｏｄｅｒｍａ ｓｅｒｒｉｃｏｒｎｅ、コロラドハムシＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ヒラタキクイムシ（Ｌｙｃｔｕｓ ｓｐｐ）、チビケシキスイＭｅｌｉｇｅｔｈｅｓ ａｅｎｅｕｓ、ヨーロッパコフキコガネＭｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ、アメリカスパイダービートルＭｅｚｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、ゴールデンスパイダービートルＮｉｐｔｕｓ ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ、ノコギリヒラタムシおよびオオノコギリヒラタムシＯｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓおよびＯｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｍｅｒｃａｔｏｒ、キンケクチブドウムシＯｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｕｌｃａｔｕｓ、マツノザイセンチュウＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ、クルシファーフリービートルＰｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、キスジノミハムシＰｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ、キャベツステムフリービートルＰｓｙｌｌｉｏｄｅｓ ｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ、Ｐｔｉｎｕｓ ｓｐｐ．（ニセセマルヒョウホンムシ）、コナナガシンクイＲｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ、アカアシチビコフキゾウムシＳｉｔｏｎａ ｌｉｎｅａｔｕｓ、ココクゾウムシおよびグラナリアコクゾウＳｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅおよびＳｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｕｓ、レッドサンフラワーシードウィービルＳｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ、ジンサンシバンムシＳｔｅｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｃｅｕｍ、チャイロコメノゴミムシダマシＴｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ、コクヌストモドキおよびヒラタコクヌストモドキＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍおよびＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃｏｎｆｕｓｕｍ、ウェアハウスアンドキャビネットビートル（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、およびサンフラワービートルＺｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓなどの甲虫目；ヨーロッパクギヌキハサミムシＦｏｒｆｉｃｕｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａおよびオオハサミムシムシＬａｂｉｄｕｒａ ｒｉｐａｒｉａなどのハサミムシ目（はさみ虫）；東洋ゴキブリＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、チャバネゴキブリＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ、マデラゴキブリＬｅｕｃｏｐｈａｅａ ｍａｄｅｒａｅ、ワモンゴキブリＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ、およびクロゴキブリＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｆｕｌｉｇｉｎｏｓａなどの網翅目；スポットスネークミリピードＢｌａｎｉｕｌｕｓ ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ、フラットバックヤスデＢｒａｃｈｙｄｅｓｍｕｓ ｓｕｐｅｒｕｓ、およびヤケヤスデＯｘｉｄｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｓなどの倍脚綱；ヒトクイバエ（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、ヌカカ（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、ビーラウス（Ｂｒａｕｌａ ｓｐｐ．）、ビートフライＰｅｇｏｍｙｉａ ｂｅｔａｅ、ブユ科（Ｃｎｅｐｈｉａ ｓｐｐ．、Ｅｕｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ウシバエ（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ ｓｐｐ．、Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｅｓｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ガガンボ（Ｔｉｐｕｌａ ｓｐｐ．）、キモグリバエの１種（Ｈｉｐｐｅｌａｔｅｓ ｓｐｐ．）、フィフスブリーディングフライ類（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｓｐｐ．、Ｆａｎｎｉａ ｓｐｐ．、Ｈｅｒｍｅｔｉａ ｓｐｐ．、Ｌｕｃｉｌｉａ ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃａ ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃｉｎａ ｓｐｐ．、Ｐｈａｅｎｉｃｉａ ｓｐｐ． 、Ｐｈｏｒｍｉａ ｓｐｐ．）、ニクバエ類（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｓｐｐ．、Ｗｏｈｌｆａｈｒｔｉａ ｓｐｐ．）；フリツフライＯｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ、ショウジョウバエ（Ｄａｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、ヘッドアンドカリオンフライ（Ｈｙｄｒｏｔｅａ ｓｐｐ．）、ヘシアンバエＭａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、ホーンアンドバッファローフライ（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ ｓｐｐ．）、アブおよびメクラアブ（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ ｓｐｐ．、Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ ｓｐｐ．、Ｔａｂａｎｕｓ ｓｐｐ．）、シラミバエ（Ｌｉｐｏｐｔｅｎａ ｓｐｐ．、Ｌｙｎｃｈｉａ ｓｐｐ．、およびＰｓｅｕｄｏｌｙｎｃｈｉａ ｓｐｐ．）、地中海ミバ（Ｃｅｒａｔｉｔｕｓ ｓｐｐ．）、カ類（Ａｅｄｅｓ ｓｐｐ．、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．、Ｃｕｌｅｘ ｓｐｐ．、Ｐｓｏｒｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、スナバエ（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ ｓｐｐ．）、ラセンウジバエ（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ ｂｅｚｚｉａｎａ およびＣｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、シープケッズ（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ ｓｐｐ．）；サシバエ（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｓｐｐ．）、ツエツエバエ（Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｓｐｐ．）、およびウシバエ（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）などの双翅目；シュウカクシロアリ科（Ｈｏｄｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、レイビシロアリ科（Ｋａｌｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、ムカシシロアリ科（Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、ミゾガシラシロアリ科（Ｒｈｉｎｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、ノコギリシロアリ科（Ｓｅｒｒｉｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、シロアリ科（Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、オオシロアリ科（Ｔｅｒｍｏｐｓｉｄａｅ）からの種を含む等翅目（シロアリ）；トコジラミＣｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ、ホシカメムシＤｙｓｄｅｒｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、サンペストＥｕｒｙｇａｓｔｅｒ ｉｎｔｅｇｒｉｃｅｐｓ、メクラカメムシＬｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、アオクサカメムシＮｅｚａｒａ ａｎｔｅｎｎａｔａ、ミナミアオカメムシＮｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ、およびオオサシガメＰａｎｓｔｒｏｇｙｌｕｓ ｍｅｇｉｓｔｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐａｌｌｅｓｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｄｉｍｉｄｉａｔａ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、およびＴｒｉａｔｏｍａ ｓｏｒｄｉｄａなどのカメムシ亜目；アカマルカイガラムシＡｏｎｉｄｉｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉｉ、マメクロアブラムシＡｐｈｉｓ ｆａｂａｅ、ワタアブラムシＡｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、リンゴアブラムシＡｐｈｉｓ ｐｏｍｉ、ミカントゲコナジラミＡｌｅｕｒｏｃａｎｔｈｕｓ ｓｐｉｎｉｆｅｒｕｓ、シロマルカイガラムシＡｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｈｅｄｅｒａｅ、タバココナジラミＢｅｍｅｓｉａ ｔａｂａｃｉ、ダイコンアブラムシＢｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、セイヨウナシキジラミＣａｃｏｐｓｙｌｌａ ｐｙｒｉｃｏｌａ、カラントアフィドＣｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ ｒｉｂｉｓ、グレープフィロキセラＤａｋｔｕｌｏｓｐｈａｉｒａ ｖｉｔｉｆｏｌｉａｅ、ミカンキジラミＤｉａｐｈｏｒｉｎａ ｃｉｔｒｉ、ジャガイモヒメヨコバイＥｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ、ビーンリーフホッパーＥｍｐｏａｓｃａ ｓｏｌａｎａ、ワインリーフホッパーＥｍｐｏａｓｃａ ｖｉｔｉｓ、リンゴワタムシＥｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ、ヨーロッパフルーツスケールＥｕｌｅｃａｎｉｕｍ ｃｏｒｎｉ、モモコフキアブラムシＨｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ、ヒメトビウンカＬａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ、ジャガイモヒゲナガアブラムシＭａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ、モモアカアブラムシＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、ツマグロヨコバイＮｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ、トビイロウンカＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ、ゴールフォーミングアフィッド（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｓｐｐ．）、ホップイボアブラムシＰｈｏｒｏｄｏｎ ｈｕｍｕｌｉ、ムギクビレアブラムシＲｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ、オリーブカタカイガラムシＳａｉｓｓｅｔｉａ ｏｌｅａｅ、ムギミドリアブラムシＳｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、ムギヒゲナガアブラムシＳｉｔｏｂｉｏｎ ａｖｅｎａｅ、オンシツコナジラミＴｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍなどの同翅目；普通のダンゴムシＡｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅおよび普通のワラジムシＯｎｉｓｃｕｓ ａｓｅｌｌｕｓなどの等脚目；Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ（リンゴコカクモンハマキ）、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｏｌｏｎ（タマナヤガ）、Ａｒｃｈｉｐｓ ｐｏｄａｎａ（ハマキガの１種）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｐｙｒｉｖｏｒｅｌｌａ（ナシチビガ）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ（ハモグリガ科の１種）、Ｂｕｐａｌｕｓ ｐｉｎｉａｒｉｕｓ（パインルーパー）、Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（コドリンガ）、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ）、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（トウヒノシントメハマキ）、Ｃｏｃｈｙｌｉｓ ｈｏｓｐｅｓ（ホソハマキガ科の１種）、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（サウスウエスタンコーンボーラー）、Ｅａｒｉｓ ｉｎｓｕｌａｎａ（エジプトボールワーム）、Ｅｕｐｈｅｓｔｉａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ（スジコナマダラメイガ）、Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ（ブドウホソハマキ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ（モンシロドクガ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｓｕｂｆｌａｖａ（ドクガ）、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ（ハチノスツヅリガ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ（オオタバコガ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ（タバコガ）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（オオタバコガ）、Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｔｅｌｌａ（ブラウンハウスモス）、Ｈｏｍｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ（サンフラワーモス）、Ｈｏｍｏｎａ ｍａｇｎａｎｉｍａ（チャハマキ）、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ（スポッ
トテンチフォームリーフマイナー）、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ（マイマイガ）、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ（オビカレハ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（ヨトウガ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ（バーサアーミーワーム）、ホーンワームＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａおよびＭａｎｕｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ、Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ（ナミスジフユエダシャク）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（アワノメイガ）、Ｐａｎｏｌｉｓ ｆｌａｍｍｅａ（マツキリガ）、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ワタアカミムシガ）、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ（ミカンハモグリガ）、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（オオモンシロチョウ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｉ（アオムシ類）、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ（イェローベアモス）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ（シロイチモジヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ（ハスモンヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ（ハスモンヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｐｒａｅｆｉｃａ（イェローストライプドアーミーワーム）、Ｓｙｌｅｐｔａ ｄｅｒｏｇａｔａ（ワタノメイガ）、Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（コイガ）、Ｔｉｎｅｏｌａ ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ（イガ）、Ｔｏｒｔｒｉｘ ｖｉｒｉｄａｎａ（ヨーロッパオークリーフローラー）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（イラクサギンウワバ）、Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ（ヨーロッパリンゴスガ）などの鱗翅目；普通のコウロギＡｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、ツリーローカスト（Ａｎａｃｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、トノサマバッタＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、ツーストライプドグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ、ディフェレンシャルグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、レッドレッグドグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、マイグラトリーグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ノーザンモルクリケットＮｅｏｃｕｒｔｉｌｌａ ｈｅｘａｄｅｃｔｙｌａ、アカトビバッタＮｏｍａｄａｃｒｉｓ ｓｅｐｔｅｍｆａｓｃｉａｔａ、ショートウィングルドモルクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ、サザンモルクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｂｏｒｅｌｌｉｉ、トーニィモルクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｖｉｃｉｎｕｓ、およびサバクトビバッタＳｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａなどの直翅目；ウシハジラミＢｏｖｉｃｏｌａ ｂｏｖｉｓ、バイティングラウス（Ｄａｍａｌｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ネコシラミＦｅｌｉｃｏｌａ ｓｕｂｒｏｓｔｒａｔａ、ウシジラミＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｅｕｒｙｓｔｅｒｎｕｓ、テールスィッチラウスＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｑｕａｄｒｉｐｅｒｔｕｓｓｕｓ、ブタジラミＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｓｕｉｓ、フェイスラウスＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｏｖｉｌｌｕｓ、フットラウスＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｐｅｄａｌｉｓ、イヌジラミＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｓｅｔｏｓｕｓ、ウシホソジラミＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｖｉｔｕｌｉ、ニワトリオオハジラミＭｅｎａｃａｎｔｈｕｓ ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ、ニワトリハジラミＭｅｎｏｐｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、ヒトジラミＰｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ、ケジラミＰｈｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ、リトルブルーキャットルラウスＳｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ、およびイヌハジラミＴｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ ｃａｎｉｓなどのシラミ目；チャタテムシ類Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｂｏｓｔｒｙｃｈｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｄｅｃｏｌｏｒ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、およびＴｒｏｇｉｕｍ ｐｕｌｓａｔｏｒｉｕｍなどのチャタテムシ目；トリノミＣｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ、イヌノミＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｃａｎｉｓ、ネコノミＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｉｓ、ヒトノミＰｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ、およびケオピスネヅミノミＸｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓなどのノミ目；ガーデンシンフィランＳｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａなどのコムカデ目；オナガシミＣｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔａ、フォアラインシルバーフィッシュＣｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｑｕａｄｒｉｓｅｒｉａｔａ、普通のシミＬｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、およびマダラシミＴｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａなどのシミ目；タバコスリップＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、ヒラズハナアザミウマＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｉｎｔｏｎｓａ、ミカンキイロアザミウマＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、コットンバッドスリップＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｓｃｈｕｌｔｚｅｉ、クリバネアザミウマＨｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ、ソイビーンスリップＮｅｏｈｙｄａｔｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ケリーシトルススリップＰｅｚｏｔｈｒｉｐｓ ｋｅｌｌｙａｎｕｓ、アボカドスリップＳｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ ｐｅｒｓｅａｅ、ミナミキイロアザミウマＴｈｒｉｐｓ ｐａｌｍｉ、およびネギアザミウマＴｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉなどのアザミウマ目等および前記の昆虫の１つ以上を含む組合せ。
【０１２１】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、ベクターその他を含む殺虫組成物は、外寄生生物を処理するために使用することができる。外寄生生物には、例えば、ノミ、マダニ、疥癬、ダニ、カ、有害なサシバエ、シラミ、および前記の外寄生生物の１つ以上を含む組合せが挙げられる。ノミという用語は、ノミ目の寄生的ノミの普通の、すなわち偶生種、特にイヌノミ属の種、特にネコノミおよびイヌノミ、ネズミノミ（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓ）およびヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）を含む。家畜（例えば、ウシ）、愛玩動物（例えば、イヌおよびネコ）およびヒトについた外寄生生物を処理することができる。家畜および飼育されている動物の場合、処理は、首輪に含浸させまたは限局した部位に局所適用して、それに続いて動物の真皮を通して拡散させることを含んでよい。ヒトの場合、処理には、ヒトにおけるシラミの処理に適した組成物を挙げることができる。そのような組成物は、シャンプーまたはコンディショナーなどヒトの頭皮への適用に適したものにすることができる。
【０１２２】
次の実施例により本発明をさらに例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【０１２３】
＜実施例１＞
（Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａおよびホモログの同定）
雌のブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）を、オーストラリアのニューサウスウェールス州のブルーマウテン地域から入手した。雄および雌のシドニージョウゴグモ（Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）は、オーストラリアのニューサウスウェールス州のシドニー都市圏地域から収集した。検体は、毒腺の抽出まで気密な収集用広口びん中に入れておいた。これらのジョウゴグモを、−２０℃に４０から６０分間冷却した。毒腺は各検体から独立に切り出した。各一対の毒腺は、独立に抽出緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に入れた。
【０１２４】
毒腺の単離に続いてすぐに、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを調製した。精製したｍＲＮＡ試料を８０％エタノールで洗浄し、Ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥した。１０μｌのＲＮＡｓｅを含まない蒸留水を使用して、ｍＲＮＡ試料を再水和した。精製したｍＲＮＡ試料は−２０℃で保存した。
【０１２５】
その後、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリを構築した。簡単に述べると、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを単離し、それから二本鎖ｃＤＮＡを形成させた。ｃＤＮＡをアダプタＤＮＡに連結して、アダプタｃＤＮＡ分子のライブラリを形成させた。適合させたｍＲＮＡテンプレートから、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩリバーストランスクリプターゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）およびＥｃｈｏｃｌｏｎａｎｃｈ−２プライマ、ポリ（ｄＴ）アンカープライマ（ＧＧＧＣＡＧＧＴ１７）を使用して、一本鎖ｃＤＮＡを構築した。第２鎖の合成は、キットの仕様書に従って実施した。ｃＤＮＡ生成物は、Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット、高収率精製カートリッジ（ＧＩＢＣＯ）を使用して精製した。５０μｌのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で二本鎖ｃＤＮＡを溶出させた。
【０１２６】
次に、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎアダプタ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、二本鎖ｃＤＮＡに連結した。連結反応は、１６℃で一晩進行させた。一晩の連結反応の後、１から２０倍希釈したグリコーゲンの１０μｌ、ｐＨ５．２の３Ｍ酢酸ナトリウムの１０μｌ、および１００％冷エタノールの１００μｌを使用して、試料を沈殿させた。それに続いて、試料を８０％エタノールで洗浄し、１０分間乾燥させた後、２００μｌのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁させた。
【０１２７】
リーダー配列の情報は、５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ；フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら（１９８８年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，８９９３〜９００２頁参照）を使用して得た。重複性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマをこの技法のために設計した。未知のリーダー配列情報を得る目的で、重複性プライマを５’共通アダプタプライマ（ＥｃｈｏＡＰ１）と組み合わせて使用した。３’ＲＡＣＥのためのプライマを、５’ＲＡＣＥから得たｃＤＮＡリーダー配列から設計した。３’ＲＡＣＥプライマを共通アダプタオリゴｄ（Ｔ）プライマ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）と組み合わせて使用して、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのシグナル配列と相同性のシグナル配列を有する遺伝子産物を生成させた。キットに含まれていないプライマは全てＰＲＯＬＩＧＯ Ｌｔｄにより構築された。５’ＲＡＣＥプライマは、
配列番号２９：ＣＡＣＣＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
配列番号３０：（Ａ／Ｇ）ＴＴＮＣＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡ
であった。
【０１２８】
３’ＲＡＣＥプライマは、
配列番号３１：ＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣ
配列番号３２：ＧＧＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
であった。
【０１２９】
ＰＣＲ反応は、５μｌの二本鎖ｃＤＮＡ、２７μｌのＭｉｌｌｉＱ水、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０×ＰＣＲ緩衝液、５０×ｄＮＴＰｓ、および５μｌのＡＭＰＬＩＧＯＬＤＴＡＱ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＧｅｎｅＡｍｐキットに伴うＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）を使用して実施した。ＰＣＲ反応は、次のプロトコル（表１）を使用して、サーマルサイクラで実施した。
【０１３０】
【表１】
【０１３１】
増幅されたｃＤＮＡ生成物は、１．５％アガロースゲルで電気泳動して、サイズを確認するために臭化エチジウムで染色した。
【０１３２】
確認したＰＣＲ生成物は、ＧＩＢＣＯのゲル精製キットを使用してアガロースゲルから抽出し、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐａｉｎｔ Ｃｏ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して沈殿させた。沈殿させたら、ｃＤＮＡをクローニングに備えてキナーゼでリン酸化した。試料をｐＳＭＡＲＴベクターに連結して、Ｌｕｃｉｇｅｎ ＣｌｏｎｅＳｍａｒｔ Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用して、Ｅ．ｃｌｏｎｉ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に入れて形質転換した。形質転換が成功したクローンを、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中で１時間培養してから、プレートへ移し一晩増殖させた。
【０１３３】
試料は、ＰＣＲとゲル電気泳動により、正しい挿入サイズか検査した。正しい挿入サイズを含む試料をＤＮＡ配列決定にかけた。Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）のプレプロポリペプチド形およびその８つのホモログ（配列番号５、８、１１、１４、１７、２０、２３および２６）をコードする完全なｃＤＮＡ配列が、配列決定する多数のクローンから得られた。
【０１３４】
プレプロポリペプチド配列を図１にまとめてある。これらのプレプロポリペプチドにおけるシグナルペプチドの切断部位を、ＳｉｇｎａｌＰプログラムのバージョン３．０（ドリロフ（Ｄｒｙｌφｖ）ら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年），３４０，７８３〜７９５頁；プログラムはｗｅｂのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＩＰ／で入手できる）を使用して予測した。成熟ポリペプチドは、同じクモにより産生されるω−ＡＣＴＸ−１ポリペプチド中で知られているプロポリペプチド切断部位と同じ３６−３７の位置で２塩基Ａｒｇ−Ａｒｇ配列によるプロポリペプチドの切断から生ずると予測される。これら２つの内部タンパク質分解切断部位を、図１中に矢印により示す。
【０１３５】
＜実施例２＞
（Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの組換え形の調製）
Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの予測された成熟ポリペプチド領域の残基３から３９をコードする合成遺伝子を、重なるオリゴヌクレオチドのアニーリング、伸長、および増幅により設計した（図２を参照されたい）。最初の段階で、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの残基３から３９をコードする４つのオリゴヌクレオチドをアニールして、Ｐｆｕポリメラーゼで伸長させた。４つのオリゴヌクレオチドのコドンの使用は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での最適発現に対して最適化した。４つのオリゴヌクレオチドは、
ＦＷ１７８−１（配列番号３３）：
ＴＧＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＧ、
ＦＷ１７８−２（配列番号３４）：
ＣＧＴＴＡＣＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＴＣＧＴＣＧＣＡＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣ、
ＦＷ１７８−３（配列番号３５）：
ＣＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＴＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴＣＡＣＡＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＧ、および
ＦＷ１７８−Ｒ（配列番号３６）：
ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡＡＡＣＧＧ
と命名した。
【０１３６】
４つのオリゴヌクレオチドは、５０μｌの反応緩衝液中の最終濃度２μＭで加えた。反応液は、４００μＭのｄＮＴＰ混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も含んでいた。アニーリング反応は６０℃、１５分間で進行した。次に温度を７２℃に上げ、２．５ユニットのＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加したのち、混合物をさらに３０分間インキュベートした。
【０１３７】
第２段階で、２０μｌの反応混合物を、全コード配列の標準的ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして、プライマＦＷ１７８−Ｆ（配列番号３７：ｃｇｇｇａｔｃｃＴＧＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＣＣＡＧＣＣＧ）およびＦＷ１７８−Ｒ（配列番号３４）とともに使用した（図２を参照されたい）。これらのプライマは、クローニングの目的のために、それぞれ５’ＢａｍＨＩおよび３’ＥｃｏＲＩ部位を含む。増幅されたＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化されたＰＧＥＸ−２Ｔベクターに、標準的な方法を使用してサブクローニングした。生じたプラスミド（ｐＢＬＳ１）は、日本住血吸虫グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端へのフレーム内融合としてＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの成熟ポリペプチド配列の残基３から３９をコードしている。ＧＳＴおよびＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａをコードする領域の間に位置するトロンビン切断部位は、ポリペプチドが融合タンパク質からトロンビン切断により遊離することを可能にする。遊離したポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの残基３から３９のＮ末端に付いているジペプチド配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（トロンビン切断部位の痕跡）を含む。本発明者らはこの３９残基ポリペプチドをｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに属するものと解釈する。
【０１３８】
ＧＳＴ：ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ融合タンパク質の過剰産生のために、大腸菌ＢＬ２１細胞をｐＢＬＳ１で形質転換した。細胞をＬＢ培地中３７℃でＯＤ６００が０．６から０．８になるまで増殖させてから、３００μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とともに融合タンパク質を導入した。細胞を遠心により１．９〜２．２のＯＤ６００で捕集し、次に超音波により破砕した。組換え融合ポリペプチドを、ＧＳＨ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのアフィニティクロマトグラフィを使用して、可溶性細胞分画から精製し、次いでカラム上で、ウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ）の添加により約２４時間かけて切断させた。結合していないＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを、カラムからトリス緩衝食塩水（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で溶出させ、ただちに逆相高速液体クロマトグラフィ（ｒｐＨＰＬＣ）を使用して精製した。組換えＵ−ＡＣＴＸポリペプチドおよび汚染物質は、ＶｙｄａｃＣ１８分析用ｒｐＨＰＬＣカラム（４．６×２５０ｍｍ、孔径５μｍ）から、１０〜３２％アセトニトリルのリニアグラジエントを使用して１ｍｌ／分の流量で２０分かけて溶出させた。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対応する単一の主ピークが、約９分の保持時間で溶出した。ｒｐＨＰＬＣで精製したＵ−ＡＣＴＸポリペプチドのエレクトロスプレイ質量分析は、４２７３Ｄａの分子質量を与え、これは完全に酸化されて６つのシステインが３つのジスルフィド結合を形成しているｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの予測分子質量に等しい。
【０１３９】
＜実施例３＞
（組換えＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは昆虫にとって致死的である）
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの殺虫活性は、昆虫生理食塩水に溶解したポリペプチドのＭｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）への直接注入により、定量的に測定した。性未確認のハエ（体重１０から２５ｍｇ）に、１０から１０５ｐｍｏｌ／ｇの範囲の濃度で１から２μｌのポリペプチドを注入した。対照のハエには２μｌの昆虫生理食塩水を注入した。１０匹のハエに各濃度のポリペプチドを注入した。２９ゲージ針を備えたＡｒｎｏｌｄマイクロアプリケーター（Ｂｕｒｋａｒｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｕｐｐｌｙ、イングランド、Ｒｉｃｋｍａｎｓｗｏｒｔｈ所在）を、胸背注入投与に使用した。注入するために、検体は４℃で一時的に動けなくして、それからただちに室温（２４℃）に戻した。
【０１４０】
図３は、この方法を使用して得られたｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対する用量応答曲線を示す。各点は、異なる日に実施した３つの独立した測定の平均を表わす。ＬＤ５０値（すなわち、注入後２４時間までに５０％のハエを殺すｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの用量）は、次の式を用量応答の対数曲線に当てはめることにより計算した。
ｙ＝（ａ−ｂ）／［１＋（ｘ／ＬＤ５０）ｎ］
式中、ｙは注入後２４時間における試料集団中の死亡率（％）であり、ｘはｐｍｏｌ・ｇ−１での毒素用量であり、ｎは可変勾配係数であり、ａは最大応答であり、ｂは最小応答である。１００±４ｐｍｏｌ／ｇのＬＤ５０計算値によれば、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、これまでに発見された最も強力な殺虫ペプチド毒素の１つである。
【０１４１】
＜実施例４＞
（ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの分子状標的の決定−アメリカゴキブリＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａのＤＵＭニューロンでの実験）
[プロトコル]
Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａのＤＵＭニューロンはカルシウムチャネルを含み、そこからのＣａＶチャネル電流（ＩＣａ）は、全細胞パッチ−クランプ記録技法を使用して記録することができる。ＤＵＭニューロン細胞本体は、Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａの神経索の末端腹部神経節（ＴＡＧ）の正中から単離した。ゴキブリは、−２０℃に約５分間冷却することにより麻酔した。次に、それらを切開用シャーレ上に背面側を上にしてピンでとめ、背面角質、消化管内容物、および縦走筋を取り出した。神経節の神経索を確認し、ＴＡＧを注意深く取り出して、２００ｍＭ ＮａＣｌ、３．１ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、５０ｍＭスクロースを含み、５容量％の仔ウシ血清および５０ＩＵ・ｍｌ−１ペニシリンおよび５０μｇ・ｍｌ−１ストレプトマイシン（Ｔｒａｃｅ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ、オーストラリアＮｏｂｌｅ Ｐａｒｋ所在）を添加し、ＮａＯＨを使用してｐＨを７．４に調節した、通常の昆虫生理食塩水（ＮＩＳ）に入れた。
【０１４２】
ＴＡＧを注意して切開し、２００ｍＭ ＮａＣｌ、３．１ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６０ｍＭスクロース、５０ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび５０ＩＵ／ｍｌストレプトマイシンを含み、ＮａＯＨを使用してｐＨを７．４に調節した、無菌のＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない昆虫生理食塩水に入れた。次に、神経節を脱鞘神経にして１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含み、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない昆虫生理食塩水中で２０分間インキュベートした。神経節は、通常の昆虫生理食塩水中で３回ゆすいだ。生じた懸濁液を２４ウェルのクラスタープレートの８ウェルに分注した。各ウェルには、コンカナバリンＡ（２ｍｇ／ｍｌ）で予めコートしておいた、直径１２ｍｍのカバーガラスを入れておいた。単離した細胞はインキュベータ（相対湿度１００％、３７℃）中で、一晩かけてカバーガラスに付着させた。
【０１４３】
電気生理学的実験では、ゴキブリＤＵＭニューロンからの電位作動型ナトリウム、カリウム、およびカルシウム電流を測定するために、全細胞コンフィグレーションでパッチ−クランプ記録技法を使用した。単離した細胞のついたカバーガラスを、位相差顕微鏡のステージに乗せた１ｍｌのガラス底灌流チェンバーに移した。Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ａ−積分増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ所在）を使用して、ナトリウム、カリウム、およびカルシウム電流の全細胞記録を行った。単回使用記録マイクロピペットをひくために、ホウケイ酸ガラス毛細管チュービング（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｌｔｄ、ＵＫケント州所在）を使用した。
【０１４４】
細胞外液（external solution）および細胞内液（internal solution）の内容は、企画した記録手順および特に研究するイオン電流のタイプにより変化させた。電位固定電気生理学的研究で使用した全ての細胞内および細胞外液の内容は、表２から表４に詳細を示した。全ての実験において、固定電位は−８０ｍＶであった。電極チップの抵抗は常に０．８〜４．０ＭΩの範囲にあった。細胞外液および細胞内液両方のモル浸透圧濃度は、浸透圧ストレスを低下させるためにスクロースで、３１０ｍｏｓｍｏｌ／リットルに調節した。細胞内液および細胞外液の間の液間電位差を、ＪＰＣａｌｃプログラム（Ｂａｒｒｙ（１９９４年），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄ，５１，１０７〜１１６頁）を使用して測定し、全てのデータをこの値に対して補正した。
【０１４５】
【表２】
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
４５μｍを超える直径の大きい涙形ＤＵＮニューロンを実験のために選択した。反転した固定電位司令パルスを、Ａｇ／ＡｇＣｌペレット／３Ｍ ＫＣｌ 寒天ブリッジを通してバスに適用した。ギガオーム密封の形成後、膜を貫通するために吸引を適用した。望ましくない電流を完全に遮断するために、５から１０分の時間をおいて、実験を開始した。個々の実験で、大きい漏洩電流あった場合、または比較的小さい脱分極パルスによる突発的電流上昇など空間固定が不十分なことを電流が示す場合には、それらの実験を除外した。全ての化学薬品は、分析規格のもので、テトロドトキシンがＡｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ（イスラエル、エルサレム所在）から供給されたのを例外として、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓにより供給された。データは、定量化したときは、平均±標準誤差として表わした。
【０１４９】
刺激および記録は両方とも、アップルのマッキントッシュコンピュータで作動するＡｘｏＤａｔａデータ取得システム（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により制御した。データは５ｋＨｚでフィルタし（低域Ｂｅｓｓｅｌフィルタ）、デジタルサンプリングレートは、電位プロトコルの長さに依存して１５ｋＨｚと２５ｋＨｚの間であった。漏洩電流および容量性電流は、Ｐ−Ｐ／４手順で、デジタルに差し引いた。データ分析は、実験終了後オフラインで行った。Ｉ／Ｖのデータは、次式のデータへの非線形回帰により適合させた。
Ｉ＝ｇｍａｘ｛１−（１／（１＋ｅｘｐ［Ｖ−Ｖ１／２）／ｓ］））｝（Ｖ−Ｖｒｅｖ）
式中、Ｉは与えられた電位Ｖにおけるピーク電流の大きさ、ｇｍａｘは最大コンダクタンス、Ｖ１／２は最大半量活性における電位差、ｓは勾配係数、およびＶｒｅｖは逆転電位である。
【０１５０】
[結果]
Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａＤＵＭニューロンからのＣａＶチャネル電流（ＩＣａ）は、全細胞パッチクランプ記録技法を使用して記録した。ＤＵＭニューロンは、脱分極試験パルスに続き、内向きのテトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性ナトリウムチャネル電流（ＩＮａ）および多くの電位作動性カリウムチャネル電流（ＩＫ）を生ずる。これらの電流は、ＴＴＸ、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、およびＣｓの組合せを使用して遮断され、ＣａＶチャネルを通して流れる本来の電流が残る。
【０１５１】
ＣａＶチャネル電流が単離されたところで、種々の濃度のｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａがＤＵＭニューロンに適用された。１μＭの濃度で、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、ＤＵＭニューロンにおける大部分のＣａＶ電流を遮断した。用量応答曲線（図４）は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａがＤＵＭニューロンにおけるＣａＶ電流を、４０９ｎＭのＩＣ５０で遮断することを示す。電流−電位差（Ｉｃａ／Ｖ）プロットにより明らかなように、チャネル活性化の電位差依存性に明確な脱分極シフトはなく、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、チャネル開閉変形剤とは反対に細孔遮断薬であることが示された。
【０１５２】
カルシウム電流への影響と対照的に、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、１μＭまでの濃度でＤＵＭニューロンにおけるナトリウム電流に影響しないことが見出された。
【０１５３】
＜実施例５＞
（ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの分子状標的の決定−異種発現したゴキブリｐＳＩｏチャネルでの実験）
[プロトコル]
ヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国ミズーリ州Ｂｅｔｈｅｓｄａ所在）を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ／高変形、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カンザス州Ｌｅｎｅｘａ所在）に１０％仔ウシ血清を補完した培地中で維持した。ｐＳＩｏチャネル（Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａの高コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル）の発現は、Ｇ４１８耐性遺伝子も有する発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢＶ、米国カリフォルニア州、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ所在）中にクローン化したｐＳＩｏコード領域を含む構築物によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにより実施した。３５ｍｍ２のシャーレ中のＨＥＫ２９３単層を、９μｌのリポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）および５μｇのＤＮＡを使用してトランスフェクトした。次いで、安定にトランスフェクトされた細胞を１０００μｇ ｍｌ−１のＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ，米国ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ所在）で選択した。これらの細胞を、上記の通常の成長培地中に維持して、以下に記載するパッチクランプ実験に使用する無菌カバーガラス上で培養した。
【０１５４】
全細胞ｐＳＩｏチャネル電流は、ホウケイ酸ガラスピペット（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｌｔｄ、ＵＫ、ケント州所在）を使用して、２〜４ＭΩの抵抗で室温で測定した。Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ａ−積分増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ所在）を使用して、電流測定を行った。全ての実験で、固定電位は−９０ｍＶであった。ｐＳＩｏ全細胞電流を記録するために、４ｍＭ ＮａＣｌ、１４０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＡＴＰ−Ｍｇ２、０．６ｍＭ ＣａＣｌ２、および１０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）を含み、２Ｍ ＫＯＨでｐＨを７．２５に調節した溶液でピペットを満たした。細胞外液は、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．３３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭグルコース、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、２Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７．４に調節した。モル浸透圧濃度は、約２９０ｍｏｓｍｏｌ／Ｌであった。膜を貫通した後、２ＭΩを超える絶縁が形成されるまでの１０〜１５分の時間をおいて、実験を開始した。
【０１５５】
[結果]
Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａの高コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（ｐＳＩｏ）のαサブユニットを発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるＩＫ（Ｃａ）に対するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの効果を試験した。ｐＳＩｏチャネル発現ＨＥＫ２９３細胞に対する１μＭ ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの添加は、約７７％のＩＫ（Ｃａ）遮断を惹起した。この結果は、ｐＳＩｏチャネルを発現しているＨＥＫ２９３細胞に対する１μＭのカリブドトキシン添加について以前に報告された約８０％遮断（ダースト（Ｄｅｒｓｔ）ら（２００３年），Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７，１１９７〜１２１２頁）と同様である。用量応答曲線（図５）は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａが、５７９ｎＭのＩＣ５０でｐＳＩｏ電流を遮断することを示す。したがって、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、昆虫のＣａＶおよびＫＣａ両チャネルを標的にすると思われる。チャネル活性化の電位差依存性に明確な脱分極シフトはなかったので、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、チャネル開閉変形剤であるよりもむしろ細孔遮断薬として作用するようである。
【０１５６】
学説にとらわれず、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの顕著な性能は昆虫のＣａＶおよびＫＣａチャネルへの相乗的効果から生ずると考えられる。これらのチャネルは、生理的に関連していることが前々から知られていたが、最近の証拠はそれらが膜中で実際物理的に関連していることを示唆している。昆虫のＫＣａチャネルの細孔を直接遮断することに加えて、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、ＣａＶチャネルを通る内向きのカルシウムの流れを遮断することにより、これらのチャネルを通る電流を間接的に減少させることができて、その結果、ＫＣａチャネルの活性化に使用することができる細胞内カルシウムの局所貯留を減少させる。このように、ＣａＶチャネルに対するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの作用は、昆虫のＫＣａチャネルの遮断を強化する。
【０１５７】
殺虫活性を有する新規ポリペプチドを説明した。このポリペプチドは、プレプロポリペプチド、プロポリペプチド、または成熟ポリペプチドの形態であってよい。ポリペプチド、ポリペプチドを場合により発現ベクター中でコードするポリヌクレオチド、昆虫ウィルス、ポリペプチドをコードするウィルスベクター、およびポリペプチドを発現する細胞を、殺虫剤として使用することができる。開示したポリペプチドの在来の殺虫剤に対する優位性は、昆虫と脊椎動物との間で相違する毒性と両立する殺虫剤の効能を含む。
【０１５８】
本明細書における「第１」、「第２」等の用語は、如何なる順序、品質、または重要性を意味するものでもなくて、ある要素を他の要素から区別するために使用され、また、本明細書において、「ａ」および「ａｎ」という用語は、量の限定を意味せず、言及された項目の少なくとも１つの存在を意味する。本明細書で開示した全ての範囲は、包括的で組合せ可能である。
【０１５９】
本発明を、好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更をなすことができ、また同等のもので本発明の要素を置き換え得ることは、当業者により理解されるであろう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の教えるところに適合させるために、多くの変形をなすことができる。それゆえ、本発明は、本発明を実施するために熟考した最良の様式として開示した特定の実施形態に限定されず、本発明は、付随の特許請求の範囲内に入る全ての実施形態を含むことになるということを意図している。
【０１６０】
引用した特許、特許出願、および他の引用文献は全て、それらの全内容を本願に引用して援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】９つのＵ−ＡＣＴＸホモログの完全プレプロポリペプチド配列のアラインメントを示す図である。
【図２】組換えＵ−ＡＣＴＸの産生のための合成遺伝子を構築する方法を示す図である。
【図３】Ｕ−ＡＣＴＸをイエバエに注入した結果の用量応答曲線を示す図である。
【図４】ＩＣａとして測定した、ＤＵＭニューロンにおけるカルシウム電流に対するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの効果を示す用量応答曲線を示す図である。
【図５】ＩＫ（Ｃａ）として測定した、ＨＥＫ２９３細胞中で発現したｐＳｌｏチャネルに対するＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの効果を示す用量応答曲線を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
殺虫ポリペプチドおよびその使用方法に関する。
【０００２】
（相互参照文献）
本発明は、全内容を参照として本明細書に組み込まれる２００４年１１月４日に出願された米国仮出願第６０／６２５，２９７号による優先権を主張する。
【０００３】
（連邦政府の支援による研究および開発に関する声明）
米国政府は、米国国立科学財団助成金番号ＭＣＢ０２３４６３８に基づき、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
昆虫の極一部が有害生物と分類されているが、それにも拘らず、それらは世界の食糧供給の約２０％を無効にして、しかも多種多様なヒトおよび動物の病原体を伝染させる。それゆえ、有害昆虫の制御は世界中の農業上および医学上の重要事項である。昆虫などの有害節足動物は、１９４０年代におけるＤＤＴの導入以来、主として化学的殺虫剤で制御されてきた。しかしながら、米国および世界の他の地域における有害昆虫の制御は、幾つかの理由のために、複雑性が増大してきている。第１に、化学的制御は、昆虫集団をダーウィン的選別にかけ、結果として、５００種を超える節足動物が、１種以上の化学的殺虫剤に対する耐性を発達させた。第２に、対象でない生命体への毒性など、化学的殺虫剤の望ましくない環境的および生態学的結果に対する意識の高まりが、殺虫剤の危険性評価に対してより大きい要求を入れた政府の規制改訂をもたらした。耐性発達または登録抹消に基づく殺虫剤種目全体の減少は、新規殺虫剤に対するますます厳しくなる登録規制と相俟って、近い将来における有効な化学的殺虫剤の備えを減少させることになりそうである。
【０００５】
過去１０年間にわたり、多くの「環境を守る」生物殺虫剤戦略が、高度に耐性の有害昆虫と戦うために提案されてきた。最近導入され、したがって大いに成功している１つの手法は、バチルスチューリンゲンシスという土壌細菌からのデルタエンドトキシンを発現する遺伝子操作したジャガイモ、トウモロコシ、およびワタ作物など、殺虫毒素を発現するトランスジェニック作物の生産である。野外実験に成功しており、食物供給に外来性タンパク質を導入する問題を取り除く別の生物殺虫剤戦略は、殺虫ペプチド神経毒を発現するように操作した昆虫特異的ウィルスの放出である。
【０００６】
多くの研究者が、クモ毒素を、農業用途のための昆虫特異的毒素の可能な資源として認めている。オメガ−アトラコトキシンとして知られるペプチド毒素の１種が、「抗ワタミノムシ」活性の毒液をスクリーニングすることによりオーストラリアのじょうご形の巣を作るクモから単離されて、米国特許第５，７６３，５６８号に開示されている。これらの化合物の１つで、オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと命名されたものは、哺乳動物とは対照的に、昆虫の電位作動型カルシウムチャネル電流を選択的に阻害することが示されている。第２の、昆虫特異的ペプチド性カルシウムチャネル遮断薬の無関係なファミリーが、同じファミリーのクモから単離されて、米国特許第６，５８３，２６４号に開示されている。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，７６３，５６８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５８３，２６４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
サソリおよびクモから単離された幾つかの殺虫ペプチド毒素が殺虫剤の開発に対する有望な先駆けのように思われるとはいえ、一方、昆虫に対して迅速かつ強力に作用するが、昆虫と脊椎動物の間で異なる毒性を発揮する化合物に対する大なる必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態において、精製されたポリペプチドは、配列番号２、６、９、１２、１５、１８および２７のいずれか１つを含む。他の実施形態において、精製されたポリペプチドは、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そのポリペプチドは殺虫活性を有する。
【００１０】
さらに他の実施形態において、殺虫組成物は、殺虫剤として有効量の前出の精製ポリペプチドと農業にとって許容し得る担体とを含む。
【００１１】
他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする。さらにまた他の実施形態においては、単離されたポリヌクレオチドが、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードしている。
【００１２】
他の実施形態においては、発現ベクターが、発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
さらにまた他の実施形態においては、宿主細胞が、発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【００１４】
一実施形態においては、昆虫ウィルスが、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
一実施形態においては、トランスジェニックな昆虫が、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む。
【００１６】
さらなる実施形態において、昆虫または昆虫の幼虫を処理する方法は、昆虫または昆虫の幼虫と、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの殺虫に有効な量とを接触させることを含む。一態様において、植物を処理する方法は、植物と、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの殺虫に有効な量とを接触させることを含む。
【００１７】
さらに他の態様においては、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するトランスジェニック植物が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上記のおよび他の特徴は、以下の詳細な説明、図面、および付随の特許請求の範囲から、当業者により認識され、理解されるであろう。
【００１９】
本発明は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ポリペプチドはアトラクス（Ａｔｒａｘ）属またはハドロニュケ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ）属のクモ毒成分である。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドは、単独で、または他の殺虫ポリペプチドもしくはそれらの遺伝子と併用してのいずれでも殺虫剤として使用することができる。殺虫剤または殺虫剤組成物は、１種以上の昆虫に対して毒性であるものである。殺虫活性とは、昆虫を殺すかもしくは麻痺させるか、または、例えば、農業用途において、昆虫が植物に与える損害が減少し、しかも植物収量は有意な副作用を受けないように、昆虫の発生もしくは成長を阻止するポリペプチドの能力を指す。殺虫活性を有するポリペプチドは、昆虫に対して毒性であることも意味している。殺虫特異性とは、１種以上の昆虫種の対するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの特異性のことである。ＬＤ５０は、試験した昆虫の５０％の死を生ずるＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの用量である。
【００２０】
本明細書で使用するＵ−ＡＣＴＸまたはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたはそのホモログを含む。一実施形態において、成虫および／または幼虫の昆虫に毒性である殺虫ポリペプチドが提供され、該ポリペプチドは約４，３００ダルトンの分子量および３８から３９アミノ酸残基の長さを有する。一実施形態において、ポリペプチドは、３つの鎖内ジスルフィド結合を形成することができる。殺虫活性は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを注入された昆虫における、最終的には死に至る無制御の過剰な興奮の昂進により示すことができる。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、イエバエ Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、イエコオロギ Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、および他の昆虫種などの昆虫に注入されたときに、非可逆的毒性を惹起することができる。
【００２１】
成熟Ｕ−ＡＣＴＸ配列は、例えば、オーストラリアのじょうご形の巣を作るクモの毒から前もって単離された昆虫毒素のオメガ−ＡＣＴＸ−１ファミリーなど以前に単離された昆虫ペプチド毒素と５０％未満の配列同一性を示す。オメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａを注入された昆虫が痙攣性麻痺に続く死を示すのに対して、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは注入された昆虫に、麻痺と死に先行する無制御の過剰興奮を誘起する。このように、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、以前にキャラクタライズされているオメガ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａと相違する様式の作用を有する。
【００２２】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、成熟ポリペプチドまたはプレプロポリペプチドの形態をとることができる。学説に捉われず、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの生物活性形は、成熟ポリペプチドを生成する、プレプロポリペプチド前駆体の翻訳後のタンパク質分解プロセシング（例えば、切断）により生成すると考えられる。切断は、プレプロポリペプチド中の特定の共通アミノ酸配列を認識するプロテアーゼによるプレプロポリペプチドの内部タンパク質分解切断でよい。プレプロポリペプチドの「プレ」の部分は、プレプロポリペプチドのシグナルペプチド部分を指す。学説に捉われず、そのシグナル配列が、プレプロポリペプチドを、Ｕ−ＡＣＴＸを産生する細胞内の小胞体膜に向かわせ、それだけでなく、それを越えて移行させる原因であると考えられる。一実施形態において、シグナルペプチド配列は配列番号３８ ＭＮＴＸ１ＴＧＦＩＶＸ２ＬＶＬＡＴＸ３ＬＧＧＸ４ＥＡを含み、式中、Ｘ１はＡまたはＴ、Ｘ２はＬまたはＦ、Ｘ３はＩまたはＶ、およびＸ４はＩまたはＶである。同様に機能する他のシグナル配列も使用することができる。プレプロポリペプチドの「プロ」の部分は、配列番号３９ Ｘ５ＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲを指し、式中、Ｘ５はＧもしくはＲ、または成熟Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの上流に共有結合で結合した他の配列である。学説に捉われず、プロ配列にとって可能と考えられる役割には、小胞体からの毒素の輸出を促進すること、成熟毒素配列の酵素触媒による酸化的折りたたみを促進すること、およびタンパク質分解プロセシングおよび翻訳後の変形に関与する酵素にシグナルを送ることが含まれる。プロ配列中のＲＲ共通配列はエンドプロテアーゼ切断部位であると考えられる。したがって、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを含む精製ポリペプチドは、さらに、シグナルペプチド配列、プロ配列、または前記の配列の１つ以上を含む組合せを含むことができる。Ｕ−ＡＣＴＸ毒素のプレプロポリペプチドの構造は、オーストラリアのじょうご形の巣を作るクモの毒腺中で発現する他の毒素について本発明者らが決定したものに類似しているように思われる。
【００２３】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、配列、
配列番号１：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＶＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
を有するブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）からのプレプロペプチドである。
【００２４】
配列番号１のプレプロポリペプチドの切断により形成される成熟ポリペプチドはＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである。
【００２５】
配列番号２：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
【００２６】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、本明細書で定義したｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号３）である。
配列番号３：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＧＳＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
【００２７】
ｒＵ−ＡＣＴＸ−ＨＶ１ａ（配列番号３）は、推定される成熟毒素配列（配列番号２）の最初の２残基（Ｇｌｎ−Ｔｙｒ）がジペプチド配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒにより置換されたＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの成熟形の組換え版である。
【００２８】
配列番号２をコードするポリヌクレオチドは、
配列番号４：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００２９】
本発明には、毒腺ｃＤＮＡライブラリの分析によって単離されたＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの８つのホモログも含まれる。プレプロポリペプチド配列（配列番号５、８、１１、１４、１７、２０、２３、および２６）、成熟ポリペプチド配列（配列番号６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７）ならびにそれらをコードするＤＮＡ（配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、および２８）が含まれる。
【００３０】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第１のホモログのプレプロポリペプチドは、
配列番号５：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＩＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲ）
である。
【００３１】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第１のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号６：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲ）
である。
【００３２】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第１のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号７：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧ
である。
【００３３】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第２のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号８：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲ）
である。
【００３４】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第２のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号９：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲ）
である。
【００３５】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第２のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号１０：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧ
である。
【００３６】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第３のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号１１：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＩＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００３７】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第３のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号１２：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００３８】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第３のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号１３：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００３９】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第４のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号１４：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＡＮＰＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４０】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第４のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号１５：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＡＮＰＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４１】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第４のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号１６：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＣＣＡＡＴＡＴＴＡＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００４２】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第５のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号１７：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＴＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＩＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４３】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第５のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号１８：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４４】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第５のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号１９：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００４５】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第６のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号２０：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４６】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第６のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号２１：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４７】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第６のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号２２：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００４８】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第７のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号２３：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＦＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＧＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００４９】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第７のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号２４：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００５０】
ブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）の第７のホモログからの成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号２５：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００５１】
シドニージョウゴグモ（Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）の第８のホモログからのプレプロポリペプチドは、
配列番号２６：Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＭＮＴＡＴＧＦＩＶＬＬＶＬＡＴＶＬＧＧＩＥＡＲＥＳＨＭＲＫＤＡＭＧＲＶＲＲＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００５２】
シドニージョウゴグモ（Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）からの第８のホモログからの成熟ポリペプチドは、
配列番号２７：Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ
（ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＬＮＥＮＤＮＴＶＹＹＣＲＡ）
である。
【００５３】
シドニージョウゴグモ（Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）からの第８のホモログをコードするポリヌクレオチドは、
配列番号２８：
ＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＡＴＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＣＴ
である。
【００５４】
本発明は、単離された、または精製されたＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを含む。「単離された（isolated）」もしくは「精製された（purified）」ポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、タンパク質が由来する細胞、組織供給源もしくは毒液からの細胞材料または他の汚染ポリペプチドを実質的に含まず、あるいは、化学的に合成されたときには、化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない（substantially free of cellular material）」という語句は、ポリペプチドがそこから単離されたか、または組換えで産生された細胞の細胞成分から分離されたポリペプチドの調製物を含む。したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドは、（乾燥重量で）約３０％、約２０％、約１０％、または約５％未満の異種ポリペプチド（以後、本明細書において「汚染ポリペプチド（contaminating polypeptide）」と称する）を有するポリペプチドの調製物を含む。一実施形態において、調製物は少なくとも約７５重量％純粋、より具体的には少なくとも約９０重量％純粋、および最も具体的には少なくとも約９５重量％純粋である。実質的に純粋なＵ−ＡＣＴＸポリペプチドは、例えば、天然資源（例えば、昆虫細胞）からの抽出により、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、またはポリペプチドを化学的に合成することにより得ることができる。純度は、任意の適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析法、または高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析によって測定することができる。
【００５５】
本発明はＵ−ＡＣＴＸのホモログも含む。「ホモログ（homologs）」は、当技術において使用される、問題にしている配列に高度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する総称である。そのような関連性は、比較される配列間の同一性および／または類似性の程度を測定することにより定量化することができる。この総称の中に入る用語に「オルソログ（ortholog）」があり、他の種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに機能的に同等なポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味し、また「パラログ（paralog）」は同種内で考慮したときに機能的に類似した配列を意味する。Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子の、同種に存在するパラログまたは他種にあるオルソログは、当技術において周知の分子生物学的技法により、必要以上の実験をせずに、容易に同定することができる。
【００５６】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の、本明細書で使用する「相同率（percent homology）（％）」は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９０年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７，２２６４〜２２６８頁のアルゴリズムを使用して定量することができる。上記のアルゴリズムは、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３〜４１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに導入されている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で実施される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、参照ポリペプチド（例えば、配列番号２）に相同性のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実施される。比較目的のギャップを考慮したアラインメントを得るために、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９７年），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９〜３４０２頁に記載されているように、ギャップ付きＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、通常は初期設定のパラメーターが使用される。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）
【００５７】
種々の欠失、置換および他の変形に相同性の程度を割り当てることにより、関係するポリペプチドがＵ−ＡＣＴＸとアラインされる。ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの全体に沿って、または隣接残基の部分集合に沿って、相同性を定量することができる。同一性（％）は、２つの配列を比較したときに同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの百分率である。類似性（％）は、２つの配列を比較したときに化学的に類似しているアミノ酸またはヌクレオチドの百分率である。成熟Ｕ−ＡＣＴＸと相同性のポリペプチドとは、好ましくは、約７０％以上、特に約８０％以上、さらに特に約９０％以上、および最も特別には約９５％以上の同一性を有する。配列番号２を参照ポリペプチドとして使用することができる。
【００５８】
特定のポリペプチドが、確定した長さの参照ポリペプチドに対して特定の同一性（％）を有するという場合、同一性（％）は参照ペプチドと比較してのことである。したがって、１００アミノ酸の長さの参照ポリペプチドと５０％の同一性を有するポリペプチドは、参照ポリペプチドの５０アミノ酸の長さ部分と完全に同一である５０アミノ酸のポリペプチドであり得る。それは、その全長にわたって参照ポリペプチドと５０％の同一性を有する１００アミノ酸の長さのポリペプチドであってもよい。勿論、他の多くのポリペプチドが同じ基準に合致するであろう。
【００５９】
主要なアミノ酸配列の「変更（modification）」は、「欠失（deletion）」（すなわち、１つ以上のアミノ酸残基が存在しないポリペプチド）、「付加（addition）」（すなわち、特定したポリペプチドに比較して１つ以上の追加されたアミノ酸残基を有するポリペプチド）、「置換（substitution）」（すなわち、１つ以上のアミノ酸残基の置換の結果として生ずるポリペプチド）、および「フラグメント（fragment）」（すなわち、特定されたポリペプチドの主要配列の一部に同一である主要アミノ酸配列からなるポリペプチド）を含むことを意味する。「変更」は、例えば、グリコシル化、アミド化（例えば、Ｃ末端アミド化）、脂質化様式、またはポリペプチドの１次、２次、もしくは３次構造を変化させる翻訳後事象の結果として変化したポリペプチドを含むことも意味する。Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾が可能である。
【００６０】
本明細書におけるＵ−ＡＣＴＸのヌクレオチドまたはアミノ酸いずれかの配列への参照は、これらの配列の天然に生ずる変異体への参照も含む。プレプロポリペプチドに対する配列番号１、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、および２６および成熟ポリペプチドに対する配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、および２７と異なり、かつ生物活性を保持している非天然生成変異体も本願に含まれる。変異体は、保存的アミノ酸置換、すなわち、同様に荷電または非荷電のアミノ酸の交替を有するこれらのポリペプチドを含む。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる。（１）酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）である。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは時により合わせて芳香族アミノ酸と分類される。ファミリーの各メンバーは、同じファミリーの他のメンバーと類似した物理的および化学的性質を有するので、ロイシンをイソロイシンもしくはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、トレオニンをセリンで独立に置換すること、またはアミノ酸を構造的に近縁のアミノ酸で同様に置換することが、その結果生ずる分子の結合特性に大きい影響は有しないと期待することは理にかなっている。アミノ酸置換が機能性ポリペプチドを生ずるかどうかは、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の殺虫活性をアッセイすることにより容易に決定することができる。
【００６１】
Ｕ−ＡＣＴＸへの参照は、Ｕ−ＡＣＴＸのポリペプチド誘導体への参照でもある。本明細書で使用する「ポリペプチド誘導体」は、天然に生ずるＵ−ＡＣＴＸと長さが異なり、かつＵ−ＡＣＴＸに見出されるのと同じ１次配列で約１５以上のアミノ酸を含むこれらのポリペプチドを含む。ポリペプチド誘導体は、殺虫活性を有する限り、Ｕ−ＡＣＴＸより長くてもよく、Ｕ−ＡＣＴＸより短くてもよい（例えば、活性フラグメント）。Ｕ−ＡＣＴＸと実質的に同じアミノ酸配列を有するが、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の殺虫活性に実質的に影響しない少数のアミノ酸置換を有するポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド誘導体の定義内にある。
【００６２】
Ｕ−ＡＣＴＸのホモログは数通りの方法で同定することができる。１つの方法では、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログの前駆体をコードする天然ｍＲＮＡ配列を、そのようなオルソログに対するクモ毒腺ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする標準的分子生物学的技法を使用することにより同定することができる。成熟毒素を生ずるプロペプチドの内部タンパク質分解的切断が、成熟毒素の直前にあるＡｒｇ−Ａｒｇプロセシング部位のＣ末端側（図１の２番目の矢印を参照されたい）で最も起こり易いことに注目することにより、成熟Ｕ−ＡＣＴＸオルソログのアミノ酸配列を、同定されたｃＤＮＡ配列の翻訳から得ることができる。次に、天然成熟Ｕ−ＡＣＴＸオルソログを毒液からクロマトグラフ分画により単離し、続いて、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログｃＤＮＡ配列から予測した質量一致判定によってペプチド毒性を同定し、精製することができる。他の方法では、合成成熟毒素をＵ−ＡＣＴＸ配列の固相ペプチド合成により作製し、続いて、合成Ｊ−アトラコトキシン−Ｈｖ１ｃの作製のために以前に記載されたように（ワン（Ｗａｎｇ）ら（２０００年），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７，５０５〜５１３頁）、システイン酸化により天然ジスルフィド異性体を形成させることができる。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、還元、凍結乾燥されたペプチドをグルタチオンレドックス緩衝液中でインキュベートすることにより、酸化されて、その天然の３次元構造に折りたたまれることが可能である。適当なグルタチオンレドックス緩衝液は、ｐＨ７．３の２００ｍＭ ３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、４ｍＭ 還元グルタチオン（ＧＳＨ）および２ｍＭ 酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含むが、当業者には多くの変法が周知である。この反応混合物を、例えば、４℃、室温、または３７℃で一晩インキュベートしてから、逆相ＨＰＬＣを使用して分画し、個々のジスルフィド異性体を分離する。画分を収集して殺虫活性をアッセイすることができる。さらに他の方法では、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログを、化学的に、または、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログをコードするｃＤＮＡから組換えＤＮＡ技法により合成することができる。他の方法では、当技術において知られている方法によりＵ−ＡＣＴＸ配列をコードする合成遺伝子を構築することにより、組換えＤＮＡ技法を使用して、Ｕ−ＡＣＴＸオルソログを、調製することができる。
【００６３】
本発明は、例えば、配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、および２８などの単離されたＵ−ＡＣＴＸポリヌクレオチドを含む。「単離されたポリヌクレオチド（isolated polynucleotide）」という用語は、核酸の天然資源中に存在する他の核酸分子から分離されたポリヌクレオチドを含む。例えばゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語は、ゲノムＤＮＡが自然界で関連している染色体から分離されたポリヌクレオチドを含む。「単離された」ポリヌクレオチドは、核酸が由来する生命体のゲノムＤＮＡ中の核酸に自然界で隣接する配列（すなわち、核酸の５’および／または３’末端に位置する配列）を含まない。例えば種々の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に自然界で隣接する、約５ｋｂ、約４ｋｂ、約３ｋｂ、約２ｋｂ、約１ｋｂ、約０．５ｋｂ、約０．１ｋｂ未満の５’および／または３’ヌクレオチド配列を含んでいてよい。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」ポリヌクレオチドが、組換え技法により作製されたときに他の細胞材料もしくは培地を実質的に含まない、または化学的に合成されたときに化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことは可能である。他の細胞材料を含まないということは、単離されたポリヌクレオチドが、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約９９％以上純粋であることを意味する。
【００６４】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ヌクレオチドの少なくとも５塩基の長さのポリマー形を指す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの変形であってよい。変形には、５−メチルシトシンなどの変形塩基、２’−メトキシおよび２’−フルオロ糖などの変形糖、ならびにホスホロチオエートおよびメチルホスホネートなどの変形骨格による、天然に生ずる塩基、糖またはヌクレオシド間結合（骨格）の、知られている置換が含まれるが、これらに限定はされない。本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡのセグメントを意味し、それはコード領域に先行および後続する領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコード領域（エクソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子であってよい。ＤＮＡまたはＲＮＡとしてのポリヌクレオチドは、ＴがＵであってもよい配列を含む。ポリヌクレオチドはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５および２８）に相補的であってよく、ここで相補的とは２つのヌクレオチド間の厳密な対形成能力を指す。例えば、あるポリヌクレオチドのある位置のヌクレオチドがあるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、そのときそのポリヌクレオチドとそのＤＮＡまたはＲＮＡ分子とはその位置で互いに相補的である。各分子中において、所望のプロセスを達成するために十分な数の対応位置が、相互にハイブリダイズできるヌクレオチドにより占められているときには、ポリヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ分子とは実質上互いに相補的である。本明細書で使用するハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の水素結合であって、それはワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であってよい。
【００６６】
さらに、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号７、１０、１３、１６、１９、２１、２５および２８）と実質的な同一性を有するかまたは配列番号２と実質的な同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。「実質的な同一性を有する」は、参照するアミノ酸配列または核酸配列と少なくとも約８５％、特に約９０％、およびさらに特に９５％以上の同一性を有する配列を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチドについて、参照ポリペプチド配列の長さは、通常、少なくとも約１６アミノ酸、または特に少なくとも約２０アミノ酸、さらに特に少なくとも約２５アミノ酸、および最も特別には少なくとも約３５アミノ酸であろう。核酸について、参照核酸配列の長さは、通常、少なくとも約５０ヌクレオチド、特に少なくとも約６０ヌクレオチド、さらに特に少なくとも約７５ヌクレオチド、および最も特別には約１１０ヌクレオチドであろう。
【００６７】
相同性配列は、典型的には、ハイブリダイゼーションにより確認されることができ、その際、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク所在）中に記載されているようなストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションが好ましい。サムブルックらに概略が記載されているストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して（すなわち、核酸フラグメントを２回洗浄し、その際各洗浄は、２×塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム（ＳＣＣ）および０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により室温で３０分間であり；続いて、２×ＳＣＣおよび０．１％ＳＤＳにより５０℃で３０分間１回洗浄し；次に、２×ＳＣＣによる室温各１０分間の洗浄を２回行う）、最大で約２５から約３０％の塩基対ミスマッチ、または約１５から約２５％の塩基対ミスマッチ、または約５から約１５％の塩基対ミスマッチを含む相同性配列を確認することができる。
【００６８】
相同性のポリペプチドは、例えば、従来法のポリヌクレオチドの部位指定変異（これは、分子の残基が機能的に重要であるかないかを日常的に同定するための１つの手段である）により、ランダム変異により、化学的合成により、またはポリペプチドの化学的もしくは酵素的切断により作製することができる。
【００６９】
Ｕ−ＡＣＴＸ配列をコードするポリヌクレオチドは、そのような遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する比較的短いＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列の調製を可能にする。短い核酸配列は、与えられた試料中の相補的配列の存在を検出するためのプローブとして使用することができ、またはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の確定したセグメントを検出し、増幅し、または変異させるプライマとして使用することができる。ハイブリダイゼーション検討のために使用される核酸配列は、フラグメントが、安定で選択的な二重鎖分子を形成するために十分な長さのものであることを確実にする約１４ヌクレオチド以上の長さであるとよい。そのようなフラグメントは、例えば、化学的手段によりフラグメントを直接合成することにより、ＰＣＲ技法などの核酸複製技法の応用により、または適当な挿入物および適当な制限部位を含む組換えプラスミドから選択した核酸フラグメントを切り取ることにより調製することができる。
【００７０】
Ｕ−ＡＣＴＸおよびホモログのポリヌクレオチドは、１つの組換え発現ベクターまたは複数のベクターに挿入することができる。「組換え発現ベクター（recombinant expression vector）」という用語は、Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子配列の挿入または導入により操作されたプラスミド、ウィルス、または当技術において知られた他の手段を指す。「プラスミド（plasmid）」の名称は、本明細書では、通常、当業者によく知られている標準的命名慣行に従って、小文字のｐとそれに先行および／または後続する大文字および／または数字により命名する。本明細書で開示するプラスミドは、市販されているか、制限されない基準で公に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから周知の公表された手順の応用により構築することができるかのいずれかである。多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターが周知であり、容易に入手できるか、または当業者が、使用に適した他のプラスミドをいくらでも容易に構築することができる。これらのベクターを適当な宿主細胞中に入れて形質転換して、ポリペプチドの産生のための宿主細胞ベクター系を形成することができる。
【００７１】
Ｕ−ＡＣＴＸポリヌクレオチドは、細菌、植物、酵母、昆虫、両生類、または哺乳動物細胞中での発現に適合させたベクター中に挿入することができ、これらの細胞は、細菌、酵母、昆虫、両生類、植物、または哺乳動物細胞中での核酸分子の発現に必要な制御エレメントを、Ｕ−ＡＣＴＸをコードする核酸分子に作動可能に連結してさらに含む。「作動可能に連結した（operatively linked）」は、そのように記載された成分が、それらに意図されたように機能することを可能にする関係にある近位にあることを指す。コード配列に作動可能に連結した発現制御配列は、発現制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように、連結される。本明細書で使用する「発現制御配列（expression control sequence）」という用語は、それが作動可能に連結された核酸配列の発現を制御する核酸配列を指す。発現制御配列が、核酸配列の転写および場合により翻訳を制御し調節しているときには、発現制御配列は核酸配列に作動可能に連結している。したがって発現制御配列は、適当なプロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコードする遺伝子の前にある開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル（イントロンが存在する場合）、ｍＲＮＡの適当な翻訳を可能にするその遺伝子の正確な読み枠の維持、および終止コドンを含むことができる。「制御配列」という用語の意味は、最小限、その存在が発現に影響することができる構成要素を含むことであり、また、存在が有利である付加的構成要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。発現制御配列は、プロモータを含むことができる。「プロモータ（promoter）」は、転写を指示するに十分な最小限の配列を意味する。プロモータ依存性の遺伝子発現を細胞タイプ特異的誘導、組織特異的誘導、または外来のシグナルもしくは作用剤により誘導され得るプロモータに対して制御可能にするのに十分なこれらのプロモータエレメントも含まれる。そのようなエレメントは、遺伝子の５’または３’領域に位置することができる。構成的および誘導性両方のプロモータが含まれる。
【００７２】
発現ベクターが植物を形質転換するために使用される場合は、植物中で発現を推進する能力を有するプロモータを選択することができる。植物中で機能するプロモータは当技術において周知である。典型的な組織特異的植物プロモータは、トウモロコシショトウシンターゼ−１プロモータ、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモータ、Ｓ−Ｅ９小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼプロモータ、およびトウモロコシヒートショックタンパク質プロモータである。
【００７３】
どの発現ベクターを選択するか、およびポリペプチドをコードする領域を最終的にどのプロモータに作動可能に連結するかは、所望の機能特性、例えば、タンパク質発現の位置およびタイミングならびに形質転換すべき宿主細胞に直接依存する。一実施形態において、ポリペプチドを発現するために使用するベクターは、植物細胞中で効果的な選択マーカを含む。植物を形質転換するために使用する形質転換ベクターおよびこれらのベクターの製法は、例えば、米国特許第４，９７１，９０８号、第４，９４０，８３５号、第４，７６９，０６１号および第４，７５７，０１１号に記載されている。
【００７４】
発現系は、毒素遺伝子の発現および／または毒素の折りたたみを促進するシグナルペプチドおよびプロポリペプチド配列も含むことができる。これらは、本明細書で開示した天然Ｕ−ＡＣＴＸシグナルおよびプロペプチド配列または同じ目的に役立つ他のシグナルおよび／もしくはプロペプチド配列であってよい。
【００７５】
昆虫ウィルスは天然に生ずる昆虫の病原体である。ウィルス感染に罹り易い昆虫は昆虫ウィルスの標的になり得る。それらはＤＮＡウィルスでもＲＮＡウィルスでもよい。多くの昆虫ウィルスおよびそれらの宿主の範囲は、当技術において知られていて、宿主特異的でかつ環境的に安全であるウィルスを含む。昆虫ウィルスの殺虫有効性は、米国特許第６，０９６，３０４号で開示された方法と同様な方法を使用して、昆虫毒素をコードする遺伝子をそのゲノムに導入することにより、増強することができる。適当な昆虫ウィルスは、バキュロウィルス（核多角体ウィルスおよびグラニュロウィルス）および昆虫ポックスウィルスなどの、害虫に対する生物制御剤として伝統的に使用されてきたＤＮＡウィルスである。適当なＤＮＡウィルスの他の例は、米国特許第６，５２１，４５４号に開示された蚊特異的バキュロウィルスである。適当なＲＮＡウィルスはシポウイルスを含むが、これに限定はされない。
【００７６】
高等植物における遺伝子発現のために有用なベクターは、当技術において周知であって、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミドに由来するベクターおよびｐＣａＭＶＣＮトランスファーコントロールベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ所在）から入手可能）を含む。
【００７７】
発現ベクターまたは他のＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の技法により実施することができる。「形質転換（transformation）」は、新規ＤＮＡ（すなわち、細胞にとって外因性のＤＮＡ）の導入に続いて細胞内に誘導される永久的または一過性の遺伝子の変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞である場合、永久的な遺伝子の変化は、一般的に、細胞ゲノム中へのＤＮＡ導入により達成される。「形質転換細胞（transformed cell）」すなわち「宿主細胞（host cell）」は、本発明のポリペプチド（すなわち、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド）またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子を、（細胞または原細胞に）組換えＤＮＡ技法により導入した細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）を意味する。
【００７８】
宿主が原核細胞であるときは、リン酸カルシウム共沈殿などのＤＮＡによるトランスフェクションの方法、マイクロインジェクションなどの機械的操作、電気穿孔法、リポソームに封入したプラスミド、またはウィルスベクターの挿入、ならびに当技術分野において知られている他の方法を使用することができる。宿主が植物細胞であるときは、細胞中に遺伝子を導入する他の手段も使用することができ、例えば、プロトプラストのポリエチレングリコール媒介形質転換、乾燥／阻止媒介ＤＮＡ取込み、炭化ケイ素繊維と一緒にしての撹拌、ＤＮＡコートした粒子の加速、生殖器官への注入、および未成熟胚への注入などである。
【００７９】
真核細胞には、本発明開示のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子とを同時形質移入することもできる。適当なマーカには、例えば、哺乳動物細胞が取込むことのできるネオマイシンおよびハイグロマイシン等が挙げられる。マーカへの耐性は、例えば、遺伝子が適当な真核細胞プロモータを有するときには、ネオマイシン遺伝子またはハイグロマイシン遺伝子により付与することができる。他の方法は、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス、またはウシパピローマウィルスなどの真核細胞ウィルスベクターを使用して、真核細胞を一過性に感染すなわちトランスフェクトしてタンパク質を発現させることである（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）編，１９８２年）。一実施形態において、真核細胞宿主が、本明細書に記載した宿主細胞として使用される。真核細胞は酵母細胞（例えば、サッカロマイセスセレヴィシエ）でもよく、またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞でもよい。
【００８０】
発現を指示する組換えウィルスまたはウィルス構成要素を利用する哺乳動物細胞系は操作することができる。例えば、アデノウィルス発現ベクターを使用するとき、外来性タンパク質をコードする核酸配列をアデノウィルス転写／翻訳制御コンプレックス、例えば、後期プロモータおよび３連リーダー配列（tripartite leader sequence）に連結することができる。次にこのキメラ遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの組換えによりアデノウィルスゲノムに挿入することができる。ウィルスゲノムの非必須領域への挿入は、感染した宿主中で生存可能でＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現することができる組換えウィルスを生ずるであろう（例えば、ローガン（Ｌｏｇａｎ）およびシェンク（Ｓｈｅｎｋ）（１９８４年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，３６５５〜３６５９頁）。
【００８１】
組換えポリペプチドの長期の高収率産生のためには、安定した発現が好ましい。複製のウィルス起源を含む発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適当な発現制御成分（例えば、プロモータ配列、エンハンサ配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）により制御されるＵ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡおよび選択可能なマーカにより形質転換することができる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカは、選択に対する耐性を付与して、細胞が染色体にプラスミドを安定に組み込み、成長して感染巣を形成することを可能にし、次にその細胞はクローン化して細胞ラインに拡張することができる。例えば、外来ＤＮＡの導入に続いて、操作した細胞を強化培地中で１から２日の間成長させ、次に選択培地に切り替えることができる。多くの選択系を使用することができ、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら（１９７７年），Ｃｅｌｌ，１１，２２３〜３２頁）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（スチバルスカ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ）およびスチバルスキ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ）（１９６２年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，４８，２０２６〜２０３４頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ロウィー（Ｌｏｗｙ）ら（１９８０年），Ｃｅｌｌ，２２，８１７〜８２３頁）が含まれるが、これらに限定はされない。
【００８２】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、例えば、カラムでの捕集または抗体の使用による精製を容易にする付加したＣ末端またはＮ末端アミノ酸をコードする配列などの付加配列を提供するように設計することもできる。そのようなタグには、例えば、ニッケルカラム上でのポリペプチドの精製を可能にするヒスチジンリッチタグが挙げられる。そのような遺伝子変形技法および適当な付加配列は、分子生物学技術において周知である。
【００８３】
Ｕ−ＡＣＴＸタンパク質、ポリペプチド、またはポリペプチド誘導体は、当技術において知られている方法により精製することができる。これらの方法には、サイズ排除クロマトグラフィ、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、再結晶、等電点電気泳動、分取電気泳動、および前記の方法の１つ以上を含む組合せが含まれるが、これらに限定はされない。精製は、当業者に知られた方法により実施することができ、他のポリペプチドを実質的に含まず、かつ炭水化物、脂質、または細胞小器官を実質的に含まないＵ−ＡＣＴＸの調製物を生ずるであろう。純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当技術において知られた手段によって評価することができる。
【００８４】
Ｕ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドも提供され、天然では結合しないであろうポリペプチドに共有結合で結合したＵ−ＡＣＴＸポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、種々のアッセイ系での使用に有用である。例えば、融合ポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸ発現を検出するために使用することができる。例えば、Ｕ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸタンパク質と相互作用して、その機能に影響するタンパク質を同定するために使用することができる。この相互作用は、Ｕ−ＡＣＴＸの他のタンパク質を制御する能力に特異性を付与することがあるか、またはＵ−ＡＣＴＸの機能の効果を増大もしくは減少させることがある。タンパク質アフィニティクロマトグラフィなどの物理的方法、または酵母ツーハイブリッド法、細菌ツーハイブリッド法、もしくはファージディスプレイ法などタンパク質間相互作用のためのライブラリに基づくアッセイを、この目的のために使用することができる。そのような方法は当技術において周知である。
【００８５】
融合ポリペプチドは、ペプチド結合により融合して合体した少なくとも２つの異種ポリペプチドセグメントを含む。第１のポリペプチドセグメントは切れ目のないアミノ酸Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを全体としてまたは部分的に含むことができる。部分的な場合は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの少なくとも約８つの連続したアミノ酸が使用され、特に少なくとも約１０、さらに特に約１５、最も特別には約２０のアミノ酸が使用される。第１のポリペプチドセグメントは全長のＵ−ＡＣＴＸタンパク質であってもよい。第２のポリペプチドセグメントは、β−ガラクトシダーゼまたは当技術において知られている他の酵素など検出可能な生成物を生ずる酵素を含むことができる。あるいは、第２のポリペプチドセグメントは、緑色の蛍光性タンパク質、ＨｃＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）または当技術において知られている他の蛍光性タンパク質などの蛍光性タンパク質を含むことができる。さらに、融合タンパク質は、放射性マーカ、蛍光性マーカ、化学発光性マーカ、ビオチン化マーカ等などの検出可能なマーカで標識することができる。
【００８６】
組換え的に、または２つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、融合ポリペプチドを作製する技法は周知である。組換えＤＮＡ法は、例えば、Ｕ−ＡＣＴＸをコードする配列を第２のポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチドとともに適当なリーディングフレームに含むＤＮＡ構築物を作製して、宿主細胞中でＤＮＡ構築物を発現させることにより、Ｕ−ＡＣＴＸ融合ポリペプチドを構築するために使用することができる。ＤＮＡ構築物は、タンパク質産生を促進する配列（すなわち、プロモータ等）に作動可能に連結することができる。
【００８７】
融合ポリペプチドに加えて、Ｕ−ＡＣＴＸは、当技術において知られている方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏで標識することができる。Ｕ−ＡＣＴＸは、テキサスレッド、ローダミン色素、フルオレッセインおよび当技術において知られている他の色素などの色素に結合することができる。結合化学反応剤には、スクシンイミドエステル、イソチオシアネートおよびマレイミドが挙げられる。結合可能な色素および結合化学反応剤に関する詳細な情報は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ所在）に見出される。そのような融合ポリペプチドは、短いアミノ酸配列に対して生じた抗体よりも大きい特異性および感度を有することができる抗体を産生するために使用することができる。それに加えて、融合ポリペプチドは、組織培養アッセイにおいて、細胞の生存、増殖および分化に効果を及ぼすそれらの能力を調べるために使用することができる。
【００８８】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドまたは毒素のプレポリペプチドもしくはプレプロポリペプチド形を発現するトランスジェニック植物を構築することができる。「トランスジェニック植物（transgenic plant）」は、「形質転換植物（transformed plant）」細胞またはプロトプラストから誘導された植物またはそれらの子孫を意味し、その場合植物ＤＮＡ（核または葉緑体）は、同系統の天然の非トランスジェニック植物中に元来存在しない導入された外来ＤＮＡ分子を含む。
【００８９】
単一の植物プロトプラストまたは種々の移植片のいずれかからの植物の発生または再生は、当技術において周知である。この再生および成長プロセスは、典型的には、形質転換細胞の選択および個別化された細胞の培養から通常の胚発生段階を通して根付き小植物段階までを含む。トランスジェニック胚および種子は同様にして再生することができる。その後、生じたトランスジェニック根付き苗条は、土壌などの適当な植物成長培地に植えることができる。
【００９０】
再生した植物は自家受粉して、ホモ接合トランスジェニック植物を提供することができる。そうでなければ、再生した植物から得た花粉を、種子から成長した農業的に重要な近交系の植物に交配させることができる。逆にこれらの重要な系統の植物からの花粉を、再生植物を受粉させるために使用することができる。所望のポリペプチドを含むトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を使用して栽培することができる。
【００９１】
適当なトランスジェニック植物は、Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子とその活性とをその子孫に伝えることができる独立の分離個体を含む。一実施形態において、トランスジェニック植物はＵ−ＡＣＴＸ遺伝子についてホモ接合であり、その遺伝子を性交配で全ての子孫に伝える。トランスジェニック植物からの種子は温室または畠で成長させることができて、その結果生じた性的に成熟したトランスジェニック植物は自家受粉して真の育種植物を生ずる。これらの植物の子孫は真の育種系統になり、それらは、実施例の方法により、１種以上の昆虫に対して種々の環境条件下に、好ましくは農場において、向上した殺虫能力を評価される。トランスジェニック植物は、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、コムギ、カラスムギ、オオムギ、他の穀類、野菜、果実、果樹、漿果、芝草、観賞植物、低木および樹木等であってよい。
【００９２】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定の遺伝形質を有するトランスジェニック昆虫を作製するために使用することができる。トランスジェニック動物および昆虫を作製する技法は、当業者に周知である。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、転移因子を使用して昆虫ゲノム中に挿入することができる。組込み（遺伝子転移）は、酵素トランスポザーゼにより促進され、また転移因子は、トランスポザーゼを正しい位置に向かわせて切り取りを開始させるように機能する逆方向反復を含むことができる。ヘテロ接合遺伝子と（遺伝子融合で）組み合わせられた転移因子を含む遺伝子構築物を、従来の技法を使用して調製し、トランスジェニック昆虫を作製するために昆虫の卵に挿入することができる。転移因子は、Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子に加えて、発現がうまく起こることを確実にする調節因子を含むことができる。
【００９３】
適当な転移因子には、例えば、イエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来のヘル雌、Ｄ．マウリタニア（Ｄ．Ｍａｕｒｉｔａｎｉａ）由来のマリーナ、ピギーバック、およびカスリショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｉｄｅｉ）に見出されるミノスが挙げられる。転移因子ミノスは、Ｕ−ＡＣＴＸポリヌクレオチドを、場合によりミノストランスポザーゼの存在下に、昆虫の胚のゲノムに組み込むために使用することができる。転移因子は、外来遺伝子と合体し、さらに調節配列、例えばプロモータを含むプラスミドベクターの形態にすることができる。一実施形態において、プロモータはキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のアクチン５ｃプロモータである。一実施形態において、ミノストランスポザーゼ遺伝子は、胚に別に導入するために別の補助プラスミド上に位置する。
【００９４】
転移因子は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる異種遺伝子を昆虫の胚に組み込むために使用することができる。あるいは、転移因子の組込みは、特定の遺伝子の発現を妨害するために使用することができる異種ポリヌクレオチドを組み込むために使用することができる。例えば、ＲＮＡ分子は、遺伝子サイレンシングのために使用することができる。
【００９５】
Ｕ−ＡＣＴＸ遺伝子は、遺伝的防除の手段として放出することができる生殖不能の雄を作製するために使用することができる。生殖不能昆虫技法においては、それらが放出される前に、多数の昆虫が調達され不能化される。十分な数の昆虫が放出されれば、野生の雌は放出された不能雄と交配して、生存可能な子孫を産しないであろう。この技法は、不能雄だけが放出されるときに最も効果がある。不能雄のみを放出する手段は、ある条件下で雌には致死的であるが雄にはそうでない遺伝子（すなわち、毒素遺伝子）を利用することである。致死的遺伝子の発現は、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｙｐ１（ショウジョウバエ卵黄タンパク質１）遺伝子由来の雌特異的エンハンサまたはＹｐ３肥満体エンハンサにより制御することができる。性特異的プロモータの使用は、ショウジョウバエにおける使用に対して提案された（ハインリッヒ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２０００年），９７，８２２９〜８２３２頁、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年），２８７，２４７４〜２４７６頁）。ある化学物質への曝露により活性化される自殺遺伝子も導入することができる。
【００９６】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの活性を有する殺虫ポリペプチドも本発明に含まれる。昆虫ニューロンの活性は、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネル、およびカルシウム活性化カリウムチャネルを含むイオンチャネルの開閉の精密な調節により生ずる。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの活性は、昆虫の急速な麻痺、昆虫の電位作動型カルシウムチャネルの阻害、または高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルの阻害により示される。カルシウムチャネルの阻害およびカルシウム活性化カリウムチャネルの阻害は、単離された昆虫のニューロンで、前記の１つのチャネルまたは１つ以上を含む組合せを発現している組換え細胞で検討することができる。一実施形態において、カルシウムチャネルおよび／または高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルは、昆虫のニューロン系中に天然に見出されるものである。一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、高伝導電位作動型カルシウムチャネル、およびカルシウム活性化カリウムチャネルの両方を阻害する。
【００９７】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、昆虫の電位作動型カルシウムチャネルにおけるカルシウム電流の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９５％以上を遮断する。一実施形態において、昆虫の電位作動型カルシウムチャネルは、アメリカゴキブリＰｅｒｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａの背側非対性正中（ＤＵＭ）ニューロンにおいて発現したものである。
【００９８】
他の実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、昆虫の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルの活性の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９５％以上を遮断する。一実施形態において、昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルは、アメリカゴキブリ（Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルを含む。他の実施形態において、チャネルは、以前に記載されたＰ．ａｍｅｒｉｃａｎａ ｐＳｌｏチャネルのαサブユニットである（デルスト（Ｄｅｒｓｔ）ら（２００３年），Ｅｕｐ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７，１１９７〜１２１２頁）。
【００９９】
さらに他の実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、昆虫の電位作動型カルシウムチャネルにおけるカルシウム電流の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％または９５％以上、および昆虫の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルの活性の約７０％、７５％、８０％、８５％または９５％以上を遮断する。
【０１００】
殺虫ポリペプチドは、以下でより詳細に説明する広く種々の方法において使用することができる。
【０１０１】
スクリーニング目的のための変異した殺虫ポリペプチドのライブラリは、無関係なタンパク質について前に記載したようにして、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたは変異体の遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける進化によって得ることができる。ライブラリは、全Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ遺伝子もしくは変異体遺伝子の誤りがちなＰＣＲまたはＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ遺伝子もしくは変異体遺伝子の適当な酵素による消化とそれに続く全遺伝子配列の誤りがちなＰＣＲ再構成を使用して作製することができる。これらの誤りがちなＰＣＲ手順は、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたは変異体の完全なプレプロポリペプチド遺伝子配列に応用することもできる。次に、変異Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａすなわち変異体の遺伝子配列のライブラリは、一連のＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ変異体アンタゴニストを生じさせるために使用することができる。次に、これらのアンタゴニストは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａまたはその選択された変異体のその分子状標的への結合を阻止する能力についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、変異遺伝子ライブラリのファージディスプレイに続いて、Ｕ−ＡＣＴＸの分子状標的に堅く結合するファージ粒子、またはＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａもしくはその選択された変異体のＵ−ＡＣＴＸの分子状標的への結合を阻止するファージ粒子を選択することにより実施することができる。当業者により理解されるように、変異遺伝子ライブラリは、オリゴヌクレオチドカセット式変異誘発またはあるヌクレオチド位置を無秩序化した合成遺伝子の構築などの他の標準的分子生物学的方法によって構築することもできる。
【０１０２】
Ｕ−ＡＣＴＸまたはそのホモログは、Ｕ−ＡＣＴＸとして昆虫チャネルの同じ位置に結合する殺虫性分子について、化合物ライブラリをスクリーニングするために使用することができる。一実施形態において、スクリーニングは、Ｕ−ＡＣＴＸの昆虫の電位作動型カルシウムチャネルへの結合と競合するかまたは昆虫の電位作動型カルシウムチャネルに予め結合しているＵ−ＡＣＴＸの遊離を惹起する化合物の選択によって実施することができる。他の実施形態において、スクリーニングは、Ｕ−ＡＣＴＸの昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルへの結合と競合するかまたは昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルに予め結合しているＵ−ＡＣＴＸの遊離を惹起する化合物の選択によって実施することができる。さらに他の実施形態において、スクリーニングは、例えば、Ｕ−ＡＣＴＸの昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルへの結合を防止し、かつＵ−ＡＣＴＸの電位作動型昆虫カルシウムチャネルへの結合も防止する化合物の選択により、または昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルに予め結合しているＵ−ＡＣＴＸの遊離を惹起し、かつ昆虫の電位作動型カルシウムチャネルに予め結合しているＵ−ＡＣＴＸの遊離を惹起する化合物の選択によって実施することができる。
【０１０３】
昆虫のチャネルに結合する試験化合物を選択する方法は、昆虫の電位作動型カルシウムチャネル、昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネル、または前記の昆虫のチャネルの１つ以上を含む組合せである昆虫のチャネルを提供すること、および試験化合物が、配列番号２と約７０％以上の同一性を有し、かつ殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸペプチドの昆虫チャネルへの結合と競合するかどうかを決定することを含む。その方法は、試験化合物の昆虫カルシウムチャネル遮断薬または昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルの遮断薬、またはこれら両タイプのチャネルの遮断薬として作用する能力を試験することをさらに含んでもよい。
【０１０４】
昆虫のチャネルに結合する試験化合物を選択する方法は、昆虫の電位作動型カルシウムチャネル、昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネル、または前記の昆虫のチャネルの１つ以上を含む組合せである昆虫のチャネルを提供すること、および試験化合物が、昆虫チャネルに予め結合している、配列番号２と約７０％以上の同一性を有し、かつ殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸペプチドの少なくとも一部を遊離させるかどうかを決定することを含む。その方法は、試験化合物の昆虫のカルシウムチャネル遮断薬または昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネルの遮断薬、またはこれら両タイプのチャネルの遮断薬として作用する能力を試験することをさらに含んでもよい。
【０１０５】
Ｕ−ＡＣＴＸペプチドとの競合または予め結合しているＵ−ＡＣＴＸペプチドの遊離は、標識Ｕ−ＡＣＴＸペプチドを使用して決定することができる。例えば、蛍光で標識したＵ−ＡＣＴＸから得られる蛍光シグナルは、標識されたペプチドの結合状態対非結合状態に依存して変化するであろう。あるいは、カルシウムチャネルに結合した放射性標識Ｕ−ＡＣＴＸの、試験化合物の結合による遊離は、放射性標識Ｕ−ＡＣＴＸの、チャネルから、例えば周囲の緩衝溶液中への遊離として測定することができる。
【０１０６】
昆虫を制御する方法は、昆虫または昆虫の幼虫と殺虫に有効な量のＵ−ＡＣＴＸポリペプチドとを接触させることを含む。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、精製ポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードする、場合により発現ベクター中のポリヌクレオチド、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する昆虫ウィルス、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する植物細胞もしくは細菌細胞などの細胞、またはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するトランスジェニック植物の形態であってよい。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、マツユキソウレクチンなど、昆虫により摂取されたときにＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの活性を増強する作用剤と、融合させるか、または併用して送達することもできる。接触させることには、例えば、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドの注入、外的接触、あるいはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドまたはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するポリヌクレオチドもしくはウィルスの摂取が含まれる。
【０１０７】
植物を処理する方法は、植物と殺虫に有効な量のＵ−ＡＣＴＸポリペプチドとを接触させることを含む。Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、精製ポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドをコードする、場合により発現ベクター中のポリヌクレオチド、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するウィルス、またはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する植物細胞もしくは細菌細胞などの細胞の形態であってよい。
【０１０８】
一実施形態において、精製Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドおよび農業的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含む殺虫組成物が提供される。他の実施形態において、殺虫組成物は、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現するウィルスを含む。昆虫ウィルスは、ひとたびウィルスが宿主昆虫に感染すると宿主昆虫の内部で複製され発現され得る。昆虫に昆虫ウィルスを感染させることは、摂取、吸入、昆虫または昆虫幼虫と昆虫ウィルスとの直接接触等を含む在来の方法によって達成することができる。
【０１０９】
殺虫組成物は、水溶液または水性懸濁液などの流動可能な溶液または懸濁液の形態であってよい。そのような水溶液または懸濁液は、適用に先立って希釈する濃縮保存溶液として、または別法として、そのまま使用する希釈溶液として提供することができる。他の実施形態において、殺虫組成物は、水に分散可能な顆粒を含む。さらに他の実施形態において、殺虫組成物は、水和剤、粉剤、ペレット剤、またはコロイド濃縮剤を含む。そのような乾燥形態の殺虫組成物は、濡らすとただちに溶解するか、または別の選択肢として、制御放出、徐放、もしくは他の時間依存性の様式で溶解するように製剤化することができる。
【０１１０】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを昆虫ウィルスにより発現させることができるとき、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する昆虫ウィルスを、保護されるべき作物に適用することができる。ウィルスはＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを、単独でまたは１種類もしくは数種類の他のＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと組み合わせて、または増強された、もしくは相乗的殺虫活性を生じ得る他の殺虫ポリペプチド毒素などの他の殺虫薬と組み合わせて発現するように操作することができる。適当なウィルスには、バキュロウィルスが含まれるが、これに限定はされない。
【０１１１】
殺虫組成物がＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現する完全な細胞（例えば、細菌細胞）を含むとき、そのような細胞は、種々の方法で製剤化することができる。それらは、水和剤、顆粒剤または粉剤として、無機鉱物（層状珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）または植物材料（製粉したトウモロコシの穂軸、もみ殻、胡桃の殻等）、および１つ以上の前記材料を含む組合せなどの種々の不活性材料と混合することにより利用することができる。製剤は、展着剤−粘着剤助剤、安定剤、他の殺虫性添加剤、界面活性剤、および１つ以上の前記添加剤を含む組合せを含んでよい。液体製剤は、水系または非水系であってよく、泡沫、懸濁液、乳化可能濃縮液等として利用することができる。成分には、流動剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤、ポリマー、リポソーム、および１つ以上の前記成分を含む組合せが含まれてもよい。
【０１１２】
あるいは、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させて次の野外応用のために単離することができる。そのようなポリペプチドは、活性な殺虫製剤に製剤化する前には、粗細胞溶解物、懸濁液、コロイド等の形態であってよく、または精製し、純化し、緩衝し、および／またはさらに加工することができる。
【０１１３】
応用の方法にかかわらず、１つまたは複数の活性成分の量は、例えば、制御されるべき特定の昆虫、処理されるべき特定の植物または作物、環境条件、ならびに殺虫有効組成物適用の方法、速度および量などの要因に依存して変化するであろう殺虫に有効な量で適用される。
【０１１４】
Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、ベクター等を含む殺虫組成物は、農業的に許容可能な担体とともに製剤化することができる。組成物は、投与に先立って、凍結乾燥する（lyophilized）、凍結乾燥する（freeze-dried）、乾燥するなどの適当な手段で、または食塩水、もしくは他の適当な緩衝液などの水性担体、媒体もしくは適当な希釈剤中で製剤化することができる。製剤化した組成物は、粉状もしくは顆粒状材料、または油中（植物性または鉱物性）もしくは水中懸濁液、または油／水乳濁液の形態で、あるいは水和物散剤として、あるいは農業用途に適したもう１つの他の担体材料との組合せであってよい。適当な農業用担体は、固体または液体であってよく、当技術において周知である。「農業的に許容可能な担体」という用語は、全ての補助剤を包含し、例えば、殺虫剤製剤技法で通常使用されている不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着性付与剤、結合剤等などであり、これらは殺虫剤製剤における当業者に周知である。製剤は、１つ以上の固体または液体の補助剤と混合することができ、例えば、在来の製剤化技法を使用して、殺虫組成物を適当な補助剤と、均一に混合する、ブレンドする、および／または破砕するなどの種々の手段により調製することができる。
【０１１５】
殺虫組成物は、標的とする昆虫のいる環境に、例えば、保護されるべき植物または作物の葉群上に、従来の方法により、好ましくは噴霧により適用することができる。殺虫剤適用の強度と期間は、特定の１つまたは複数の害虫、処理されるべき１つまたは複数の作物および特定の環境条件に固有の条件を考慮して設定することができる。有効成分の担体に対する比率は、殺虫組成物の化学的性質、溶解性、および安定性、ならびに考慮されている特定の製剤に当然依存するであろう。
【０１１６】
他の適用技法、例えば、散粉、散水、浸漬、土壌注入、種子被覆、実生被覆、スプレー、通気、ミスチング、噴霧等も実行可能であり、ある状況下、例えば、根もしくは茎での害虫発生において、または繊細な成長過程もしくは観賞植物への適用のために必要になることもある。これらの適用手順は当技術において周知である。
【０１１７】
殺虫組成物は、単独で、または限定にはならない他の殺虫剤を含む他の化合物と併用して使用することができる。それらは、界面活性剤、洗浄剤、ポリマーまたは徐放性製剤などの他の処理剤と併用して使用することができる。殺虫組成物は昆虫誘引物質を含むことができる。殺虫組成物は全身性または局所的使用のいずれのためにも製剤化することができる。そのような作用剤は昆虫に直接適用することもできる。
【０１１８】
環境的、全身性、または葉面処理に使用される殺虫組成物の濃度は、特定の製剤の性質、適用手段、環境条件、および殺生活性の程度によって変わり得る。
【０１１９】
あるいは、Ｕ−ＡＣＴＸを単独で、または増強された、もしくは相乗的殺虫活性を生ずる他の殺虫ポリペプチド毒性と組み合わせて発現するように作物を遺伝子操作することができる。この手法が役に立つ作物には、ワタ、トマト、スイートコーン、ムラサキウマゴヤシ、ダイズ、モロコシ、サヤエンドウ、アマニ、ベニバナ、アブラナ、ヒマワリ、および白花ルピナス（field lupin）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１２０】
殺虫ポリペプチドで処理するのに適当な農業的、家庭および／または医学的／獣医学的重要性のある節足動物には、例えば、次の綱および目のメンバーが含まれる。アメリカマメゾウムシＡｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ、ハムシＡｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ、コメツキムシ（Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｌｉｎｅａｔｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ、Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ヒラタムシＡｈａｓｖｅｒｕｓ ａｄｖｅｎａ、サマーシェファーＡｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ、ケブトヒラタキクイムシＡｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ、Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｓｐｐ．（ゾウムシ）、ピグミーマンゴールドビートルＡｔｏｍａｒｉａ ｌｉｎｅａｒｉｓ、カツオブシムシ（Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ ｓｐｐ．、Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｓｐｐ．）、ヨツモンマメゾウムシＣａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ、クリヤケシキスイＣａｒｐｏｐｈｉｌｕｓ ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ、キャベツシードポッドウィービルＣｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｓｓｉｍｉｌｉｓ、レイプウィンターステムウィービルＣｅｕｔｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｐｉｃｉｔａｒｓｉｓ、根切り虫の類Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｖｅｓｐｅｒｔｉｎｕｓおよびＣｏｎｏｄｅｒｕｓ ｆａｌｌｉ、バショウオサゾウムシＣｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ ｓｏｒｄｉｄｕｓ、コガネムシ幼虫Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ、コガネムシＣｏｔｉｎｉｓ ｎｉｔｉｄａ、サンフラワーステムウィービルＣｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ａｄｓｐｅｒｓｕｓ、トビカツオブシムシＤｅｒｍｅｓｔｅｓ ｌａｒｄａｒｉｕｓ、根切り虫Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａおよびＤｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ、インゲンテントウＥｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ、オールドハウスボアラーＨｙｌｏｔｒｏｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ、アルファルファタコゾウムシＨｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ、セマルヒョウホンムシＧｉｂｂｉｕｍ ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ、タバコシバンムシＬａｓｉｏｄｅｒｍａ ｓｅｒｒｉｃｏｒｎｅ、コロラドハムシＬｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ、ヒラタキクイムシ（Ｌｙｃｔｕｓ ｓｐｐ）、チビケシキスイＭｅｌｉｇｅｔｈｅｓ ａｅｎｅｕｓ、ヨーロッパコフキコガネＭｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ、アメリカスパイダービートルＭｅｚｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、ゴールデンスパイダービートルＮｉｐｔｕｓ ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ、ノコギリヒラタムシおよびオオノコギリヒラタムシＯｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓおよびＯｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｍｅｒｃａｔｏｒ、キンケクチブドウムシＯｔｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｕｌｃａｔｕｓ、マツノザイセンチュウＰｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ、クルシファーフリービートルＰｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ、キスジノミハムシＰｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｓｔｒｉｏｌａｔａ、キャベツステムフリービートルＰｓｙｌｌｉｏｄｅｓ ｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ、Ｐｔｉｎｕｓ ｓｐｐ．（ニセセマルヒョウホンムシ）、コナナガシンクイＲｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ、アカアシチビコフキゾウムシＳｉｔｏｎａ ｌｉｎｅａｔｕｓ、ココクゾウムシおよびグラナリアコクゾウＳｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅおよびＳｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｕｓ、レッドサンフラワーシードウィービルＳｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ、ジンサンシバンムシＳｔｅｇｏｂｉｕｍ ｐａｎｉｃｅｕｍ、チャイロコメノゴミムシダマシＴｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ、コクヌストモドキおよびヒラタコクヌストモドキＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍおよびＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃｏｎｆｕｓｕｍ、ウェアハウスアンドキャビネットビートル（Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）、およびサンフラワービートルＺｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓなどの甲虫目；ヨーロッパクギヌキハサミムシＦｏｒｆｉｃｕｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａおよびオオハサミムシムシＬａｂｉｄｕｒａ ｒｉｐａｒｉａなどのハサミムシ目（はさみ虫）；東洋ゴキブリＢｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、チャバネゴキブリＢｌａｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ、マデラゴキブリＬｅｕｃｏｐｈａｅａ ｍａｄｅｒａｅ、ワモンゴキブリＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ、およびクロゴキブリＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ｆｕｌｉｇｉｎｏｓａなどの網翅目；スポットスネークミリピードＢｌａｎｉｕｌｕｓ ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ、フラットバックヤスデＢｒａｃｈｙｄｅｓｍｕｓ ｓｕｐｅｒｕｓ、およびヤケヤスデＯｘｉｄｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｓなどの倍脚綱；ヒトクイバエ（Ｃｏｒｄｙｌｏｂｉａ ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈａｇａ）、ヌカカ（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．）、ビーラウス（Ｂｒａｕｌａ ｓｐｐ．）、ビートフライＰｅｇｏｍｙｉａ ｂｅｔａｅ、ブユ科（Ｃｎｅｐｈｉａ ｓｐｐ．、Ｅｕｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．）、ウシバエ（Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ ｓｐｐ．、Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｅｓｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ガガンボ（Ｔｉｐｕｌａ ｓｐｐ．）、キモグリバエの１種（Ｈｉｐｐｅｌａｔｅｓ ｓｐｐ．）、フィフスブリーディングフライ類（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｓｐｐ．、Ｆａｎｎｉａ ｓｐｐ．、Ｈｅｒｍｅｔｉａ ｓｐｐ．、Ｌｕｃｉｌｉａ ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃａ ｓｐｐ．、Ｍｕｓｃｉｎａ ｓｐｐ．、Ｐｈａｅｎｉｃｉａ ｓｐｐ． 、Ｐｈｏｒｍｉａ ｓｐｐ．）、ニクバエ類（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｓｐｐ．、Ｗｏｈｌｆａｈｒｔｉａ ｓｐｐ．）；フリツフライＯｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ、ショウジョウバエ（Ｄａｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．）、ヘッドアンドカリオンフライ（Ｈｙｄｒｏｔｅａ ｓｐｐ．）、ヘシアンバエＭａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、ホーンアンドバッファローフライ（Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ ｓｐｐ．）、アブおよびメクラアブ（Ｃｈｒｙｓｏｐｓ ｓｐｐ．、Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ ｓｐｐ．、Ｔａｂａｎｕｓ ｓｐｐ．）、シラミバエ（Ｌｉｐｏｐｔｅｎａ ｓｐｐ．、Ｌｙｎｃｈｉａ ｓｐｐ．、およびＰｓｅｕｄｏｌｙｎｃｈｉａ ｓｐｐ．）、地中海ミバ（Ｃｅｒａｔｉｔｕｓ ｓｐｐ．）、カ類（Ａｅｄｅｓ ｓｐｐ．、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．、Ｃｕｌｅｘ ｓｐｐ．、Ｐｓｏｒｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、スナバエ（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ ｓｐｐ．）、ラセンウジバエ（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ ｂｅｚｚｉａｎａ およびＣｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、シープケッズ（Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ ｓｐｐ．）；サシバエ（Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｓｐｐ．）、ツエツエバエ（Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｓｐｐ．）、およびウシバエ（Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．）などの双翅目；シュウカクシロアリ科（Ｈｏｄｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、レイビシロアリ科（Ｋａｌｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、ムカシシロアリ科（Ｍａｓｔｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、ミゾガシラシロアリ科（Ｒｈｉｎｏｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、ノコギリシロアリ科（Ｓｅｒｒｉｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、シロアリ科（Ｔｅｒｍｉｔｉｄａｅ）、オオシロアリ科（Ｔｅｒｍｏｐｓｉｄａｅ）からの種を含む等翅目（シロアリ）；トコジラミＣｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ、ホシカメムシＤｙｓｄｅｒｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、サンペストＥｕｒｙｇａｓｔｅｒ ｉｎｔｅｇｒｉｃｅｐｓ、メクラカメムシＬｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ、アオクサカメムシＮｅｚａｒａ ａｎｔｅｎｎａｔａ、ミナミアオカメムシＮｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ、およびオオサシガメＰａｎｓｔｒｏｇｙｌｕｓ ｍｅｇｉｓｔｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐａｌｌｅｓｃａｎｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ、Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｄｉｍｉｄｉａｔａ、Ｔｒｉａｔｏｍａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、およびＴｒｉａｔｏｍａ ｓｏｒｄｉｄａなどのカメムシ亜目；アカマルカイガラムシＡｏｎｉｄｉｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉｉ、マメクロアブラムシＡｐｈｉｓ ｆａｂａｅ、ワタアブラムシＡｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、リンゴアブラムシＡｐｈｉｓ ｐｏｍｉ、ミカントゲコナジラミＡｌｅｕｒｏｃａｎｔｈｕｓ ｓｐｉｎｉｆｅｒｕｓ、シロマルカイガラムシＡｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｈｅｄｅｒａｅ、タバココナジラミＢｅｍｅｓｉａ ｔａｂａｃｉ、ダイコンアブラムシＢｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、セイヨウナシキジラミＣａｃｏｐｓｙｌｌａ ｐｙｒｉｃｏｌａ、カラントアフィドＣｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ ｒｉｂｉｓ、グレープフィロキセラＤａｋｔｕｌｏｓｐｈａｉｒａ ｖｉｔｉｆｏｌｉａｅ、ミカンキジラミＤｉａｐｈｏｒｉｎａ ｃｉｔｒｉ、ジャガイモヒメヨコバイＥｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ、ビーンリーフホッパーＥｍｐｏａｓｃａ ｓｏｌａｎａ、ワインリーフホッパーＥｍｐｏａｓｃａ ｖｉｔｉｓ、リンゴワタムシＥｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ、ヨーロッパフルーツスケールＥｕｌｅｃａｎｉｕｍ ｃｏｒｎｉ、モモコフキアブラムシＨｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ、ヒメトビウンカＬａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ、ジャガイモヒゲナガアブラムシＭａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ、モモアカアブラムシＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ、ツマグロヨコバイＮｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｃｉｎｔｉｃｅｐｓ、トビイロウンカＮｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ、ゴールフォーミングアフィッド（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｓｐｐ．）、ホップイボアブラムシＰｈｏｒｏｄｏｎ ｈｕｍｕｌｉ、ムギクビレアブラムシＲｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ、オリーブカタカイガラムシＳａｉｓｓｅｔｉａ ｏｌｅａｅ、ムギミドリアブラムシＳｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ、ムギヒゲナガアブラムシＳｉｔｏｂｉｏｎ ａｖｅｎａｅ、オンシツコナジラミＴｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍなどの同翅目；普通のダンゴムシＡｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅおよび普通のワラジムシＯｎｉｓｃｕｓ ａｓｅｌｌｕｓなどの等脚目；Ａｄｏｘｏｐｈｙｅｓ ｏｒａｎａ（リンゴコカクモンハマキ）、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｏｌｏｎ（タマナヤガ）、Ａｒｃｈｉｐｓ ｐｏｄａｎａ（ハマキガの１種）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｐｙｒｉｖｏｒｅｌｌａ（ナシチビガ）、Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ（ハモグリガ科の１種）、Ｂｕｐａｌｕｓ ｐｉｎｉａｒｉｕｓ（パインルーパー）、Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ（コドリンガ）、Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ）、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（トウヒノシントメハマキ）、Ｃｏｃｈｙｌｉｓ ｈｏｓｐｅｓ（ホソハマキガ科の１種）、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（サウスウエスタンコーンボーラー）、Ｅａｒｉｓ ｉｎｓｕｌａｎａ（エジプトボールワーム）、Ｅｕｐｈｅｓｔｉａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ（スジコナマダラメイガ）、Ｅｕｐｏｅｃｉｌｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ（ブドウホソハマキ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ（モンシロドクガ）、Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｓｕｂｆｌａｖａ（ドクガ）、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ（ハチノスツヅリガ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ（オオタバコガ）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ（タバコガ）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（オオタバコガ）、Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｔｅｌｌａ（ブラウンハウスモス）、Ｈｏｍｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ（サンフラワーモス）、Ｈｏｍｏｎａ ｍａｇｎａｎｉｍａ（チャハマキ）、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ（スポッ
トテンチフォームリーフマイナー）、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ（マイマイガ）、Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ（オビカレハ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（ヨトウガ）、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ（バーサアーミーワーム）、ホーンワームＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａおよびＭａｎｕｄｕｃａ ｑｕｉｎｑｕｅｍａｃｕｌａｔａ、Ｏｐｅｒｏｐｈｔｅｒａ ｂｒｕｍａｔａ（ナミスジフユエダシャク）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（アワノメイガ）、Ｐａｎｏｌｉｓ ｆｌａｍｍｅａ（マツキリガ）、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ワタアカミムシガ）、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ（ミカンハモグリガ）、Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ（オオモンシロチョウ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｎｉ（アオムシ類）、Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ ｖｉｒｇｉｎｉｃａ（イェローベアモス）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ（シロイチモジヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ（ハスモンヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ（ハスモンヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｐｒａｅｆｉｃａ（イェローストライプドアーミーワーム）、Ｓｙｌｅｐｔａ ｄｅｒｏｇａｔａ（ワタノメイガ）、Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ（コイガ）、Ｔｉｎｅｏｌａ ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ（イガ）、Ｔｏｒｔｒｉｘ ｖｉｒｉｄａｎａ（ヨーロッパオークリーフローラー）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（イラクサギンウワバ）、Ｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ（ヨーロッパリンゴスガ）などの鱗翅目；普通のコウロギＡｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ、ツリーローカスト（Ａｎａｃｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、トノサマバッタＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、ツーストライプドグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ、ディフェレンシャルグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ、レッドレッグドグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ、マイグラトリーグラスホッパーＭｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ、ノーザンモルクリケットＮｅｏｃｕｒｔｉｌｌａ ｈｅｘａｄｅｃｔｙｌａ、アカトビバッタＮｏｍａｄａｃｒｉｓ ｓｅｐｔｅｍｆａｓｃｉａｔａ、ショートウィングルドモルクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ、サザンモルクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｂｏｒｅｌｌｉｉ、トーニィモルクリケットＳｃａｐｔｅｒｉｓｃｕｓ ｖｉｃｉｎｕｓ、およびサバクトビバッタＳｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａなどの直翅目；ウシハジラミＢｏｖｉｃｏｌａ ｂｏｖｉｓ、バイティングラウス（Ｄａｍａｌｉｎｉａ ｓｐｐ．）、ネコシラミＦｅｌｉｃｏｌａ ｓｕｂｒｏｓｔｒａｔａ、ウシジラミＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｅｕｒｙｓｔｅｒｎｕｓ、テールスィッチラウスＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｑｕａｄｒｉｐｅｒｔｕｓｓｕｓ、ブタジラミＨａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｓｕｉｓ、フェイスラウスＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｏｖｉｌｌｕｓ、フットラウスＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｐｅｄａｌｉｓ、イヌジラミＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｓｅｔｏｓｕｓ、ウシホソジラミＬｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｖｉｔｕｌｉ、ニワトリオオハジラミＭｅｎａｃａｎｔｈｕｓ ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ、ニワトリハジラミＭｅｎｏｐｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、ヒトジラミＰｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ、ケジラミＰｈｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ、リトルブルーキャットルラウスＳｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ ｃａｐｉｌｌａｔｕｓ、およびイヌハジラミＴｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ ｃａｎｉｓなどのシラミ目；チャタテムシ類Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｂｏｓｔｒｙｃｈｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｄｅｃｏｌｏｒ、Ｌｉｐｏｓｃｅｌｉｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、およびＴｒｏｇｉｕｍ ｐｕｌｓａｔｏｒｉｕｍなどのチャタテムシ目；トリノミＣｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ、イヌノミＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｃａｎｉｓ、ネコノミＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｆｅｌｉｓ、ヒトノミＰｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ、およびケオピスネヅミノミＸｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓなどのノミ目；ガーデンシンフィランＳｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａなどのコムカデ目；オナガシミＣｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｌｏｎｇｉｃａｕｄａｔａ、フォアラインシルバーフィッシュＣｔｅｎｏｌｅｐｉｓｍａ ｑｕａｄｒｉｓｅｒｉａｔａ、普通のシミＬｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ、およびマダラシミＴｈｅｒｍｏｂｉａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａなどのシミ目；タバコスリップＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ、ヒラズハナアザミウマＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｉｎｔｏｎｓａ、ミカンキイロアザミウマＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、コットンバッドスリップＦｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｓｃｈｕｌｔｚｅｉ、クリバネアザミウマＨｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ、ソイビーンスリップＮｅｏｈｙｄａｔｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、ケリーシトルススリップＰｅｚｏｔｈｒｉｐｓ ｋｅｌｌｙａｎｕｓ、アボカドスリップＳｃｉｒｔｏｔｈｒｉｐｓ ｐｅｒｓｅａｅ、ミナミキイロアザミウマＴｈｒｉｐｓ ｐａｌｍｉ、およびネギアザミウマＴｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉなどのアザミウマ目等および前記の昆虫の１つ以上を含む組合せ。
【０１２１】
一実施形態において、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、ベクターその他を含む殺虫組成物は、外寄生生物を処理するために使用することができる。外寄生生物には、例えば、ノミ、マダニ、疥癬、ダニ、カ、有害なサシバエ、シラミ、および前記の外寄生生物の１つ以上を含む組合せが挙げられる。ノミという用語は、ノミ目の寄生的ノミの普通の、すなわち偶生種、特にイヌノミ属の種、特にネコノミおよびイヌノミ、ネズミノミ（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓ）およびヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）を含む。家畜（例えば、ウシ）、愛玩動物（例えば、イヌおよびネコ）およびヒトについた外寄生生物を処理することができる。家畜および飼育されている動物の場合、処理は、首輪に含浸させまたは限局した部位に局所適用して、それに続いて動物の真皮を通して拡散させることを含んでよい。ヒトの場合、処理には、ヒトにおけるシラミの処理に適した組成物を挙げることができる。そのような組成物は、シャンプーまたはコンディショナーなどヒトの頭皮への適用に適したものにすることができる。
【０１２２】
次の実施例により本発明をさらに例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【０１２３】
＜実施例１＞
（Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａおよびホモログの同定）
雌のブルーマウンテンジョウゴグモ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ ｖｅｒｓｕｔａ）を、オーストラリアのニューサウスウェールス州のブルーマウテン地域から入手した。雄および雌のシドニージョウゴグモ（Ａｔｒａｘ ｒｏｂｕｓｔｕｓ）は、オーストラリアのニューサウスウェールス州のシドニー都市圏地域から収集した。検体は、毒腺の抽出まで気密な収集用広口びん中に入れておいた。これらのジョウゴグモを、−２０℃に４０から６０分間冷却した。毒腺は各検体から独立に切り出した。各一対の毒腺は、独立に抽出緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に入れた。
【０１２４】
毒腺の単離に続いてすぐに、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを調製した。精製したｍＲＮＡ試料を８０％エタノールで洗浄し、Ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥した。１０μｌのＲＮＡｓｅを含まない蒸留水を使用して、ｍＲＮＡ試料を再水和した。精製したｍＲＮＡ試料は−２０℃で保存した。
【０１２５】
その後、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用して、ｃＤＮＡライブラリを構築した。簡単に述べると、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを単離し、それから二本鎖ｃＤＮＡを形成させた。ｃＤＮＡをアダプタＤＮＡに連結して、アダプタｃＤＮＡ分子のライブラリを形成させた。適合させたｍＲＮＡテンプレートから、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩリバーストランスクリプターゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）およびＥｃｈｏｃｌｏｎａｎｃｈ−２プライマ、ポリ（ｄＴ）アンカープライマ（ＧＧＧＣＡＧＧＴ１７）を使用して、一本鎖ｃＤＮＡを構築した。第２鎖の合成は、キットの仕様書に従って実施した。ｃＤＮＡ生成物は、Ｃｏｎｃｅｒｔ Ｒａｐｉｄ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット、高収率精製カートリッジ（ＧＩＢＣＯ）を使用して精製した。５０μｌのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で二本鎖ｃＤＮＡを溶出させた。
【０１２６】
次に、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎアダプタ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、二本鎖ｃＤＮＡに連結した。連結反応は、１６℃で一晩進行させた。一晩の連結反応の後、１から２０倍希釈したグリコーゲンの１０μｌ、ｐＨ５．２の３Ｍ酢酸ナトリウムの１０μｌ、および１００％冷エタノールの１００μｌを使用して、試料を沈殿させた。それに続いて、試料を８０％エタノールで洗浄し、１０分間乾燥させた後、２００μｌのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁させた。
【０１２７】
リーダー配列の情報は、５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ；フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら（１９８８年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，８９９３〜９００２頁参照）を使用して得た。重複性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマをこの技法のために設計した。未知のリーダー配列情報を得る目的で、重複性プライマを５’共通アダプタプライマ（ＥｃｈｏＡＰ１）と組み合わせて使用した。３’ＲＡＣＥのためのプライマを、５’ＲＡＣＥから得たｃＤＮＡリーダー配列から設計した。３’ＲＡＣＥプライマを共通アダプタオリゴｄ（Ｔ）プライマ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）と組み合わせて使用して、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａのシグナル配列と相同性のシグナル配列を有する遺伝子産物を生成させた。キットに含まれていないプライマは全てＰＲＯＬＩＧＯ Ｌｔｄにより構築された。５’ＲＡＣＥプライマは、
配列番号２９：ＣＡＣＣＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
配列番号３０：（Ａ／Ｇ）ＴＴＮＣＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ（Ｔ／Ｃ）ＴＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡ
であった。
【０１２８】
３’ＲＡＣＥプライマは、
配列番号３１：ＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＧＡＡＴＡＣＣＧＣ
配列番号３２：ＧＧＧＣＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
であった。
【０１２９】
ＰＣＲ反応は、５μｌの二本鎖ｃＤＮＡ、２７μｌのＭｉｌｌｉＱ水、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０×ＰＣＲ緩衝液、５０×ｄＮＴＰｓ、および５μｌのＡＭＰＬＩＧＯＬＤＴＡＱ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＧｅｎｅＡｍｐキットに伴うＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）を使用して実施した。ＰＣＲ反応は、次のプロトコル（表１）を使用して、サーマルサイクラで実施した。
【０１３０】
【表１】
【０１３１】
増幅されたｃＤＮＡ生成物は、１．５％アガロースゲルで電気泳動して、サイズを確認するために臭化エチジウムで染色した。
【０１３２】
確認したＰＣＲ生成物は、ＧＩＢＣＯのゲル精製キットを使用してアガロースゲルから抽出し、Ｐｅｌｌｅｔ Ｐａｉｎｔ Ｃｏ−Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して沈殿させた。沈殿させたら、ｃＤＮＡをクローニングに備えてキナーゼでリン酸化した。試料をｐＳＭＡＲＴベクターに連結して、Ｌｕｃｉｇｅｎ ＣｌｏｎｅＳｍａｒｔ Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用して、Ｅ．ｃｌｏｎｉ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中に入れて形質転換した。形質転換が成功したクローンを、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ中で１時間培養してから、プレートへ移し一晩増殖させた。
【０１３３】
試料は、ＰＣＲとゲル電気泳動により、正しい挿入サイズか検査した。正しい挿入サイズを含む試料をＤＮＡ配列決定にかけた。Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ（配列番号１）のプレプロポリペプチド形およびその８つのホモログ（配列番号５、８、１１、１４、１７、２０、２３および２６）をコードする完全なｃＤＮＡ配列が、配列決定する多数のクローンから得られた。
【０１３４】
プレプロポリペプチド配列を図１にまとめてある。これらのプレプロポリペプチドにおけるシグナルペプチドの切断部位を、ＳｉｇｎａｌＰプログラムのバージョン３．０（ドリロフ（Ｄｒｙｌφｖ）ら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｉｇｎａｌＰ ３．０、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年），３４０，７８３〜７９５頁；プログラムはｗｅｂのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＩＰ／で入手できる）を使用して予測した。成熟ポリペプチドは、同じクモにより産生されるω−ＡＣＴＸ−１ポリペプチド中で知られているプロポリペプチド切断部位と同じ３６−３７の位置で２塩基Ａｒｇ−Ａｒｇ配列によるプロポリペプチドの切断から生ずると予測される。これら２つの内部タンパク質分解切断部位を、図１中に矢印により示す。
【０１３５】
＜実施例２＞
（Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの組換え形の調製）
Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの予測された成熟ポリペプチド領域の残基３から３９をコードする合成遺伝子を、重なるオリゴヌクレオチドのアニーリング、伸長、および増幅により設計した（図２を参照されたい）。最初の段階で、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの残基３から３９をコードする４つのオリゴヌクレオチドをアニールして、Ｐｆｕポリメラーゼで伸長させた。４つのオリゴヌクレオチドのコドンの使用は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）での最適発現に対して最適化した。４つのオリゴヌクレオチドは、
ＦＷ１７８−１（配列番号３３）：
ＴＧＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＧ、
ＦＷ１７８−２（配列番号３４）：
ＣＧＴＴＡＣＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＴＣＧＴＣＧＣＡＧＣＡＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣ、
ＦＷ１７８−３（配列番号３５）：
ＣＧＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＧＴＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴＣＡＣＡＣＣＧＴＴＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＧ、および
ＦＷ１７８−Ｒ（配列番号３６）：
ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＴＡＧＴＡＡＡＣＧＧ
と命名した。
【０１３６】
４つのオリゴヌクレオチドは、５０μｌの反応緩衝液中の最終濃度２μＭで加えた。反応液は、４００μＭのｄＮＴＰ混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も含んでいた。アニーリング反応は６０℃、１５分間で進行した。次に温度を７２℃に上げ、２．５ユニットのＰｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加したのち、混合物をさらに３０分間インキュベートした。
【０１３７】
第２段階で、２０μｌの反応混合物を、全コード配列の標準的ＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして、プライマＦＷ１７８−Ｆ（配列番号３７：ｃｇｇｇａｔｃｃＴＧＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＣＣＡＧＣＣＧ）およびＦＷ１７８−Ｒ（配列番号３４）とともに使用した（図２を参照されたい）。これらのプライマは、クローニングの目的のために、それぞれ５’ＢａｍＨＩおよび３’ＥｃｏＲＩ部位を含む。増幅されたＰＣＲ生成物はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化されたＰＧＥＸ−２Ｔベクターに、標準的な方法を使用してサブクローニングした。生じたプラスミド（ｐＢＬＳ１）は、日本住血吸虫グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端へのフレーム内融合としてＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの成熟ポリペプチド配列の残基３から３９をコードしている。ＧＳＴおよびＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａをコードする領域の間に位置するトロンビン切断部位は、ポリペプチドが融合タンパク質からトロンビン切断により遊離することを可能にする。遊離したポリペプチドは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの残基３から３９のＮ末端に付いているジペプチド配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（トロンビン切断部位の痕跡）を含む。本発明者らはこの３９残基ポリペプチドをｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに属するものと解釈する。
【０１３８】
ＧＳＴ：ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ融合タンパク質の過剰産生のために、大腸菌ＢＬ２１細胞をｐＢＬＳ１で形質転換した。細胞をＬＢ培地中３７℃でＯＤ６００が０．６から０．８になるまで増殖させてから、３００μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）とともに融合タンパク質を導入した。細胞を遠心により１．９〜２．２のＯＤ６００で捕集し、次に超音波により破砕した。組換え融合ポリペプチドを、ＧＳＨ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのアフィニティクロマトグラフィを使用して、可溶性細胞分画から精製し、次いでカラム上で、ウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ）の添加により約２４時間かけて切断させた。結合していないＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを、カラムからトリス緩衝食塩水（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）で溶出させ、ただちに逆相高速液体クロマトグラフィ（ｒｐＨＰＬＣ）を使用して精製した。組換えＵ−ＡＣＴＸポリペプチドおよび汚染物質は、ＶｙｄａｃＣ１８分析用ｒｐＨＰＬＣカラム（４．６×２５０ｍｍ、孔径５μｍ）から、１０〜３２％アセトニトリルのリニアグラジエントを使用して１ｍｌ／分の流量で２０分かけて溶出させた。ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対応する単一の主ピークが、約９分の保持時間で溶出した。ｒｐＨＰＬＣで精製したＵ−ＡＣＴＸポリペプチドのエレクトロスプレイ質量分析は、４２７３Ｄａの分子質量を与え、これは完全に酸化されて６つのシステインが３つのジスルフィド結合を形成しているｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの予測分子質量に等しい。
【０１３９】
＜実施例３＞
（組換えＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは昆虫にとって致死的である）
ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの殺虫活性は、昆虫生理食塩水に溶解したポリペプチドのＭｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（イエバエ）への直接注入により、定量的に測定した。性未確認のハエ（体重１０から２５ｍｇ）に、１０から１０５ｐｍｏｌ／ｇの範囲の濃度で１から２μｌのポリペプチドを注入した。対照のハエには２μｌの昆虫生理食塩水を注入した。１０匹のハエに各濃度のポリペプチドを注入した。２９ゲージ針を備えたＡｒｎｏｌｄマイクロアプリケーター（Ｂｕｒｋａｒｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｕｐｐｌｙ、イングランド、Ｒｉｃｋｍａｎｓｗｏｒｔｈ所在）を、胸背注入投与に使用した。注入するために、検体は４℃で一時的に動けなくして、それからただちに室温（２４℃）に戻した。
【０１４０】
図３は、この方法を使用して得られたｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａに対する用量応答曲線を示す。各点は、異なる日に実施した３つの独立した測定の平均を表わす。ＬＤ５０値（すなわち、注入後２４時間までに５０％のハエを殺すｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの用量）は、次の式を用量応答の対数曲線に当てはめることにより計算した。
ｙ＝（ａ−ｂ）／［１＋（ｘ／ＬＤ５０）ｎ］
式中、ｙは注入後２４時間における試料集団中の死亡率（％）であり、ｘはｐｍｏｌ・ｇ−１での毒素用量であり、ｎは可変勾配係数であり、ａは最大応答であり、ｂは最小応答である。１００±４ｐｍｏｌ／ｇのＬＤ５０計算値によれば、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、これまでに発見された最も強力な殺虫ペプチド毒素の１つである。
【０１４１】
＜実施例４＞
（ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの分子状標的の決定−アメリカゴキブリＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａのＤＵＭニューロンでの実験）
[プロトコル]
Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａのＤＵＭニューロンはカルシウムチャネルを含み、そこからのＣａＶチャネル電流（ＩＣａ）は、全細胞パッチ−クランプ記録技法を使用して記録することができる。ＤＵＭニューロン細胞本体は、Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａの神経索の末端腹部神経節（ＴＡＧ）の正中から単離した。ゴキブリは、−２０℃に約５分間冷却することにより麻酔した。次に、それらを切開用シャーレ上に背面側を上にしてピンでとめ、背面角質、消化管内容物、および縦走筋を取り出した。神経節の神経索を確認し、ＴＡＧを注意深く取り出して、２００ｍＭ ＮａＣｌ、３．１ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、５０ｍＭスクロースを含み、５容量％の仔ウシ血清および５０ＩＵ・ｍｌ−１ペニシリンおよび５０μｇ・ｍｌ−１ストレプトマイシン（Ｔｒａｃｅ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ、オーストラリアＮｏｂｌｅ Ｐａｒｋ所在）を添加し、ＮａＯＨを使用してｐＨを７．４に調節した、通常の昆虫生理食塩水（ＮＩＳ）に入れた。
【０１４２】
ＴＡＧを注意して切開し、２００ｍＭ ＮａＣｌ、３．１ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、６０ｍＭスクロース、５０ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび５０ＩＵ／ｍｌストレプトマイシンを含み、ＮａＯＨを使用してｐＨを７．４に調節した、無菌のＣａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない昆虫生理食塩水に入れた。次に、神経節を脱鞘神経にして１．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含み、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない昆虫生理食塩水中で２０分間インキュベートした。神経節は、通常の昆虫生理食塩水中で３回ゆすいだ。生じた懸濁液を２４ウェルのクラスタープレートの８ウェルに分注した。各ウェルには、コンカナバリンＡ（２ｍｇ／ｍｌ）で予めコートしておいた、直径１２ｍｍのカバーガラスを入れておいた。単離した細胞はインキュベータ（相対湿度１００％、３７℃）中で、一晩かけてカバーガラスに付着させた。
【０１４３】
電気生理学的実験では、ゴキブリＤＵＭニューロンからの電位作動型ナトリウム、カリウム、およびカルシウム電流を測定するために、全細胞コンフィグレーションでパッチ−クランプ記録技法を使用した。単離した細胞のついたカバーガラスを、位相差顕微鏡のステージに乗せた１ｍｌのガラス底灌流チェンバーに移した。Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ａ−積分増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ所在）を使用して、ナトリウム、カリウム、およびカルシウム電流の全細胞記録を行った。単回使用記録マイクロピペットをひくために、ホウケイ酸ガラス毛細管チュービング（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｌｔｄ、ＵＫケント州所在）を使用した。
【０１４４】
細胞外液（external solution）および細胞内液（internal solution）の内容は、企画した記録手順および特に研究するイオン電流のタイプにより変化させた。電位固定電気生理学的研究で使用した全ての細胞内および細胞外液の内容は、表２から表４に詳細を示した。全ての実験において、固定電位は−８０ｍＶであった。電極チップの抵抗は常に０．８〜４．０ＭΩの範囲にあった。細胞外液および細胞内液両方のモル浸透圧濃度は、浸透圧ストレスを低下させるためにスクロースで、３１０ｍｏｓｍｏｌ／リットルに調節した。細胞内液および細胞外液の間の液間電位差を、ＪＰＣａｌｃプログラム（Ｂａｒｒｙ（１９９４年），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄ，５１，１０７〜１１６頁）を使用して測定し、全てのデータをこの値に対して補正した。
【０１４５】
【表２】
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
４５μｍを超える直径の大きい涙形ＤＵＮニューロンを実験のために選択した。反転した固定電位司令パルスを、Ａｇ／ＡｇＣｌペレット／３Ｍ ＫＣｌ 寒天ブリッジを通してバスに適用した。ギガオーム密封の形成後、膜を貫通するために吸引を適用した。望ましくない電流を完全に遮断するために、５から１０分の時間をおいて、実験を開始した。個々の実験で、大きい漏洩電流あった場合、または比較的小さい脱分極パルスによる突発的電流上昇など空間固定が不十分なことを電流が示す場合には、それらの実験を除外した。全ての化学薬品は、分析規格のもので、テトロドトキシンがＡｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ（イスラエル、エルサレム所在）から供給されたのを例外として、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓにより供給された。データは、定量化したときは、平均±標準誤差として表わした。
【０１４９】
刺激および記録は両方とも、アップルのマッキントッシュコンピュータで作動するＡｘｏＤａｔａデータ取得システム（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により制御した。データは５ｋＨｚでフィルタし（低域Ｂｅｓｓｅｌフィルタ）、デジタルサンプリングレートは、電位プロトコルの長さに依存して１５ｋＨｚと２５ｋＨｚの間であった。漏洩電流および容量性電流は、Ｐ−Ｐ／４手順で、デジタルに差し引いた。データ分析は、実験終了後オフラインで行った。Ｉ／Ｖのデータは、次式のデータへの非線形回帰により適合させた。
Ｉ＝ｇｍａｘ｛１−（１／（１＋ｅｘｐ［Ｖ−Ｖ１／２）／ｓ］））｝（Ｖ−Ｖｒｅｖ）
式中、Ｉは与えられた電位Ｖにおけるピーク電流の大きさ、ｇｍａｘは最大コンダクタンス、Ｖ１／２は最大半量活性における電位差、ｓは勾配係数、およびＶｒｅｖは逆転電位である。
【０１５０】
[結果]
Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａＤＵＭニューロンからのＣａＶチャネル電流（ＩＣａ）は、全細胞パッチクランプ記録技法を使用して記録した。ＤＵＭニューロンは、脱分極試験パルスに続き、内向きのテトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性ナトリウムチャネル電流（ＩＮａ）および多くの電位作動性カリウムチャネル電流（ＩＫ）を生ずる。これらの電流は、ＴＴＸ、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、およびＣｓの組合せを使用して遮断され、ＣａＶチャネルを通して流れる本来の電流が残る。
【０１５１】
ＣａＶチャネル電流が単離されたところで、種々の濃度のｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａがＤＵＭニューロンに適用された。１μＭの濃度で、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、ＤＵＭニューロンにおける大部分のＣａＶ電流を遮断した。用量応答曲線（図４）は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａがＤＵＭニューロンにおけるＣａＶ電流を、４０９ｎＭのＩＣ５０で遮断することを示す。電流−電位差（Ｉｃａ／Ｖ）プロットにより明らかなように、チャネル活性化の電位差依存性に明確な脱分極シフトはなく、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、チャネル開閉変形剤とは反対に細孔遮断薬であることが示された。
【０１５２】
カルシウム電流への影響と対照的に、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、１μＭまでの濃度でＤＵＭニューロンにおけるナトリウム電流に影響しないことが見出された。
【０１５３】
＜実施例５＞
（ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの分子状標的の決定−異種発現したゴキブリｐＳＩｏチャネルでの実験）
[プロトコル]
ヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国ミズーリ州Ｂｅｔｈｅｓｄａ所在）を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ／高変形、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カンザス州Ｌｅｎｅｘａ所在）に１０％仔ウシ血清を補完した培地中で維持した。ｐＳＩｏチャネル（Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａの高コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル）の発現は、Ｇ４１８耐性遺伝子も有する発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢＶ、米国カリフォルニア州、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ所在）中にクローン化したｐＳＩｏコード領域を含む構築物によるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにより実施した。３５ｍｍ２のシャーレ中のＨＥＫ２９３単層を、９μｌのリポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）および５μｇのＤＮＡを使用してトランスフェクトした。次いで、安定にトランスフェクトされた細胞を１０００μｇ ｍｌ−１のＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ，米国ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ所在）で選択した。これらの細胞を、上記の通常の成長培地中に維持して、以下に記載するパッチクランプ実験に使用する無菌カバーガラス上で培養した。
【０１５４】
全細胞ｐＳＩｏチャネル電流は、ホウケイ酸ガラスピペット（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｌｔｄ、ＵＫ、ケント州所在）を使用して、２〜４ＭΩの抵抗で室温で測定した。Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ａ−積分増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ所在）を使用して、電流測定を行った。全ての実験で、固定電位は−９０ｍＶであった。ｐＳＩｏ全細胞電流を記録するために、４ｍＭ ＮａＣｌ、１４０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＡＴＰ−Ｍｇ２、０．６ｍＭ ＣａＣｌ２、および１０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）を含み、２Ｍ ＫＯＨでｐＨを７．２５に調節した溶液でピペットを満たした。細胞外液は、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．３３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭグルコース、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、２Ｍ ＮａＯＨでｐＨを７．４に調節した。モル浸透圧濃度は、約２９０ｍｏｓｍｏｌ／Ｌであった。膜を貫通した後、２ＭΩを超える絶縁が形成されるまでの１０〜１５分の時間をおいて、実験を開始した。
【０１５５】
[結果]
Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａの高コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル（ｐＳＩｏ）のαサブユニットを発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるＩＫ（Ｃａ）に対するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの効果を試験した。ｐＳＩｏチャネル発現ＨＥＫ２９３細胞に対する１μＭ ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの添加は、約７７％のＩＫ（Ｃａ）遮断を惹起した。この結果は、ｐＳＩｏチャネルを発現しているＨＥＫ２９３細胞に対する１μＭのカリブドトキシン添加について以前に報告された約８０％遮断（ダースト（Ｄｅｒｓｔ）ら（２００３年），Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１７，１１９７〜１２１２頁）と同様である。用量応答曲線（図５）は、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａが、５７９ｎＭのＩＣ５０でｐＳＩｏ電流を遮断することを示す。したがって、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、昆虫のＣａＶおよびＫＣａ両チャネルを標的にすると思われる。チャネル活性化の電位差依存性に明確な脱分極シフトはなかったので、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、チャネル開閉変形剤であるよりもむしろ細孔遮断薬として作用するようである。
【０１５６】
学説にとらわれず、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの顕著な性能は昆虫のＣａＶおよびＫＣａチャネルへの相乗的効果から生ずると考えられる。これらのチャネルは、生理的に関連していることが前々から知られていたが、最近の証拠はそれらが膜中で実際物理的に関連していることを示唆している。昆虫のＫＣａチャネルの細孔を直接遮断することに加えて、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、ＣａＶチャネルを通る内向きのカルシウムの流れを遮断することにより、これらのチャネルを通る電流を間接的に減少させることができて、その結果、ＫＣａチャネルの活性化に使用することができる細胞内カルシウムの局所貯留を減少させる。このように、ＣａＶチャネルに対するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの作用は、昆虫のＫＣａチャネルの遮断を強化する。
【０１５７】
殺虫活性を有する新規ポリペプチドを説明した。このポリペプチドは、プレプロポリペプチド、プロポリペプチド、または成熟ポリペプチドの形態であってよい。ポリペプチド、ポリペプチドを場合により発現ベクター中でコードするポリヌクレオチド、昆虫ウィルス、ポリペプチドをコードするウィルスベクター、およびポリペプチドを発現する細胞を、殺虫剤として使用することができる。開示したポリペプチドの在来の殺虫剤に対する優位性は、昆虫と脊椎動物との間で相違する毒性と両立する殺虫剤の効能を含む。
【０１５８】
本明細書における「第１」、「第２」等の用語は、如何なる順序、品質、または重要性を意味するものでもなくて、ある要素を他の要素から区別するために使用され、また、本明細書において、「ａ」および「ａｎ」という用語は、量の限定を意味せず、言及された項目の少なくとも１つの存在を意味する。本明細書で開示した全ての範囲は、包括的で組合せ可能である。
【０１５９】
本発明を、好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の変更をなすことができ、また同等のもので本発明の要素を置き換え得ることは、当業者により理解されるであろう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の教えるところに適合させるために、多くの変形をなすことができる。それゆえ、本発明は、本発明を実施するために熟考した最良の様式として開示した特定の実施形態に限定されず、本発明は、付随の特許請求の範囲内に入る全ての実施形態を含むことになるということを意図している。
【０１６０】
引用した特許、特許出願、および他の引用文献は全て、それらの全内容を本願に引用して援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】９つのＵ−ＡＣＴＸホモログの完全プレプロポリペプチド配列のアラインメントを示す図である。
【図２】組換えＵ−ＡＣＴＸの産生のための合成遺伝子を構築する方法を示す図である。
【図３】Ｕ−ＡＣＴＸをイエバエに注入した結果の用量応答曲線を示す図である。
【図４】ＩＣａとして測定した、ＤＵＭニューロンにおけるカルシウム電流に対するｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの効果を示す用量応答曲線を示す図である。
【図５】ＩＫ（Ｃａ）として測定した、ＨＥＫ２９３細胞中で発現したｐＳｌｏチャネルに対するＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａの効果を示す用量応答曲線を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫の電位作動型カルシウムチャネルにおけるカルシウム電流の約５０％以上および昆虫の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルの活性の約５０％以上を遮断することを特徴とする殺虫ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の殺虫ポリペプチドであって、アトラクス（Ａｔｒａｘ）属またはハドロニュケ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ）属のクモ毒成分であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の殺虫ポリペプチドであって、前記昆虫の電位作動型カルシウムチャネルが、ワモンゴキブリ（Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）のＤＵＭニューロン由来のものであることを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の殺虫ポリペプチドであって、前記昆虫の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルが、ワモンゴキブリ（Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルを含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載の精製したポリペプチドであって、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載の精製したポリペプチドであって、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つを含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載の精製したポリペプチドであって、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、またはそれらの組合せをさらに含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
殺虫に有効な量の、請求項１に記載の精製したポリペプチドと、農業的に許容し得る担体とを含むことを特徴とする殺虫組成物。
【請求項９】
配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つを含むポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１２】
発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１３】
配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする昆虫ウィルス。
【請求項１４】
昆虫、昆虫の幼虫、または植物を処理する方法であって、前記昆虫、昆虫の幼虫、または植物と、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの殺虫に有効な量とを接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドが、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２４、２４および２７のいずれか１つを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現することを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項１７】
配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とするトランスジェニック昆虫。
【請求項１８】
昆虫のチャネルに結合する試験化合物を選択する方法であって、
昆虫の電位作動型カルシウムチャネル、昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネル、または前記昆虫のチャネルの１つ以上を含む組合せである昆虫のチャネルを提供すること、および、
配列番号２と約７０％以上の同一性を有し、かつ殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸペプチドの前記昆虫のチャネルへの結合と、前記試験化合物が競合するかどうかを決定すること、または前記昆虫のチャネルに予め結合している、配列番号２と約７０％以上の同一性を有し、かつ殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸペプチドの少なくとも一部を、前記試験化合物が遊離させるかどうかを決定すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１】
昆虫の電位作動型カルシウムチャネルにおけるカルシウム電流の約５０％以上および昆虫の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルの活性の約５０％以上を遮断することを特徴とする殺虫ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の殺虫ポリペプチドであって、アトラクス（Ａｔｒａｘ）属またはハドロニュケ（Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ）属のクモ毒成分であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の殺虫ポリペプチドであって、前記昆虫の電位作動型カルシウムチャネルが、ワモンゴキブリ（Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）のＤＵＭニューロン由来のものであることを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の殺虫ポリペプチドであって、前記昆虫の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルが、ワモンゴキブリ（Ｐ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）の高伝導カルシウム活性化カリウムチャネルを含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載の精製したポリペプチドであって、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載の精製したポリペプチドであって、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つを含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載の精製したポリペプチドであって、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、またはそれらの組合せをさらに含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
殺虫に有効な量の、請求項１に記載の精製したポリペプチドと、農業的に許容し得る担体とを含むことを特徴とする殺虫組成物。
【請求項９】
配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つを含むポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１２】
発現制御配列に作動可能に連結した、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２１、２４および２７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項１３】
配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする昆虫ウィルス。
【請求項１４】
昆虫、昆虫の幼虫、または植物を処理する方法であって、前記昆虫、昆虫の幼虫、または植物と、配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドの殺虫に有効な量とを接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチドが、配列番号２、６、９、１２、１５、１８、２４、２４および２７のいずれか１つを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸポリペプチドを発現することを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項１７】
配列番号２と約７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、殺虫活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とするトランスジェニック昆虫。
【請求項１８】
昆虫のチャネルに結合する試験化合物を選択する方法であって、
昆虫の電位作動型カルシウムチャネル、昆虫のカルシウム活性化カリウムチャネル、または前記昆虫のチャネルの１つ以上を含む組合せである昆虫のチャネルを提供すること、および、
配列番号２と約７０％以上の同一性を有し、かつ殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸペプチドの前記昆虫のチャネルへの結合と、前記試験化合物が競合するかどうかを決定すること、または前記昆虫のチャネルに予め結合している、配列番号２と約７０％以上の同一性を有し、かつ殺虫活性を有するＵ−ＡＣＴＸペプチドの少なくとも一部を、前記試験化合物が遊離させるかどうかを決定すること、
を含むことを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５１８６２４（Ｐ２００８−５１８６２４Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４００９８（Ｐ２００７−５４００９８）
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０１３９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２８０６
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５００４８９９５６）ユニバーシティ オブ コネチカット (3)
【出願人】（５０２０７８１６９）ユニバーシティ オブ テクノロジー，シドニー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月４日（２００５．１１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０１３９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５２８０６
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（５００４８９９５６）ユニバーシティ オブ コネチカット (3)
【出願人】（５０２０７８１６９）ユニバーシティ オブ テクノロジー，シドニー (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]